VERORDNUNG (EWG) Nr. 2188/81 DER KOMMISSION vom 28. Juli 1981 zur Änderung der Verordnung (EWG) Nr. 625/78 über Durchführungsbestimmungen für die öffentliche Lagerhaltung von Magermilchpulver

DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN -

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft,

gestützt auf die Verordnung (EWG) Nr. 804/68 des Rates vom 27. Juni 1968 über die gemeinsame Marktorganisation für Milch und Milcherzeugnisse (1), zuletzt geändert durch die Akte über den Beitritt Griechenlands, insbesondere auf Artikel 7 Absatz 5,

in Erwägung nachstehender Gründe:

Im Anhang I zur Verordnung (EWG) Nr. 625/78 der Kommission (2), zuletzt geändert durch die Verordnung (EWG) Nr. 2937/80 (3), sind die Qualitätsbedingungen, denen das Magermilchpulver entsprechen muß, um der Intervention angeboten werden zu können, definiert ; darunter befinden sich insbesondere bestimmte Vorschriften für die Analyseverfahren zum Molkenachweis durch die Bestimmung bestimmter Bestandteile in dem Magermilchpulver. Die Fußnote (2) des genannten Anhangs sieht nach einer bestimmten Versuchszeit in den Mitgliedstaaten die Festsetzung von Grenzwerten für die Gemeinschaft in bezug auf die genannten Bestandteile vor.

Es ist nunmehr möglich, auf Gemeinschaftsebene ein Analyseverfahren einzuführen, das den Nachweis der Labmolke im Magermilchpulver durch Bestimmung der freien Sialinsäure erlaubt. Dieses Kontrollverfahren sollte jedoch erst nach Ablauf eines bestimmten Zeitraums, in dem die Kontrollstellen sowie die Hersteller sich mit diesem Analyseverfahren vertraut machen können, verbindlich werden.

Die in dieser Verordnung vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Verwaltungsausschusses für Milch und Milcherzeugnisse -

HAT FOLGENDE VERORDNUNG ERLASSEN:

Artikel 1

(1) Anhang I der Verordnung (EWG) Nr. 625/78 wird wie folgt geändert: a) In Punkt 2 Buchstabe b) erhält der zweite Gedankenstrich folgende Fassung:

"- Molkenachweis:

Bestimmung der freien Sialinsäure (2) und/oder des Cystein-Cystin-Komplexes, sofern wenigstens eine der drei verbindlichen Untersuchungen, und zwar die Untersuchung des (durch vereinfachte Probe ermittelten) Gehaltes an Molke-Glykomakropeptiden, die Untersuchung des Laktatengehalts oder die Untersuchung des Aschegehalts mehr als 3 %, 150 mg/100 g bzw. 8 % ergibt."

b) Die Fußnote (2) erhält folgende Fassung:

"(2) Bei dem Nachweis der Labmolke durch Bestimmung der freien Sialinsäure wird ab 1. Januar 1982 die im Anhang IV zu dieser Verordnung festgelegte Analysemethode verwendet."

(2) Der Anhang dieser Verordnung wird als Anhang IV der Verordnung (EWG) Nr. 625/78 angefügt.

Artikel 2

Diese Verordnung tritt am dritten Tag nach ihrer Veröffentlichung im Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften in Kraft. (1) ABl. Nr. L 148 vom 28.6.1968, S. 13. (2) ABl. Nr. L 84 vom 31.3.1978, S. 19. (3) ABl. Nr. L 305 vom 14.11.1980, S. 13.

Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmittelbar in jedem Mitgliedstaat.

Brüssel, den 28. Juli 1981

Für die Kommission

Der Präsident

Gaston THORN

ANHANG

"ANHANG IV NACHWEIS VON LABMOLKE IN ZUR ÖFFENTLICHEN LAGERHALTUNG BESTIMMTEM MAGERMILCHPULVER DURCH DIE QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER FREIEN SIALINSÄURE

1. Ziel und Anwendungsbereich

Diese Methode ermöglicht die Bestimmung von Labmolke in zur öffentlichen Lagerhaltung bestimmtem Magermilchpulver.

2. Prinzip der Methode

Bei der Gerinnung der Milch durch Labeinwirkung werden Glykomakropeptide des Kaseins freigesetzt, die einen hohen Sialinsäuregehalt aufweisen. Die quantitative Bestimmung der Sialinsäure (N-Acetylneuraminsäure) ermöglicht es, in Magermilchpulver gegebenenfalls enthaltene Labmolke nachzuweisen. Nach Rekonstituierung der Milch werden die Sialinsäure enthaltenden Glykomakropeptide mit Phosphorwolframsäure aus einem 12 % igen Trichloressigsäure-Filtrat präzipitiert. Die durch Hydrolyse mittels Säure freigesetzte Sialinsäure bildet mit Resorcin einen Farbkomplex, der durch ein spektrophotometrisches Verfahren bei einer Wellenlänge von 580 nm bestimmt wird.

3. Reagenzien

Alle Reagenzien müssen analytisch rein sein. Das Wasser muß destilliert oder deionisiert sein. 3.1. Trichloressigsäurelösung (TCA)

240 g Trichloressigsäure in Wasser lösen und auf 1 000 ml auffuellen.

3.2. Phosphorwolframsäurelösung

20 g Phosphorwolframsäure in Wasser lösen und auf 100 ml auffuellen.

3.3. Ethanol 95 % (v/v)

3.4. Schwefelsäurelösung, etwa 0,1 N

28,1 ml konzentrierte Schwefelsäure (95 % H2SO4) mit Wasser auf 1 000 ml verdünnen, um eine 1 N Schwefelsäure herzustellen. 100 ml der 1 N Schwefelsäure mit Wasser auf 1 000 ml verdünnen, um die 0,1 N Schwefelsäurelösung herzustellen.

3.5. Acetatpufferlösung, pH 4,8

19,7 g wasserfreies Natriumacetat in Wasser lösen, 9 ml Eisessig hinzufügen und mit Wasser auf 1 000 ml auffuellen. Den pH-Wert kontrollieren und ggf. einstellen.

3.6. Kupfersulfatlösung, 0,1 M

2,497 g Kupfersulfat (CuSO4 7 5 H2O) in Wasser losen und auf 100 ml auffuellen.

3.7. 2 % ige Resorcinlösung

2 g Resorcin in Wasser lösen und auf 100 ml auffuellen. Die Lösung ist bei 5-8 ºC 4 Monate lang stabil.

3.8. Resorcinolreagenz

10 ml der Resorcinlösung (3.7), 80 ml konzentrierte Salzsäure (D20 ºC = 1,19 g/l) und 0,25 ml Kupfersulfatlösung (3.6) mischen und mit Wasser auf 100 ml auffuellen. Die Lösung ist am Tag der Verwendung zuzubereiten.

3.9. Isoamylalkohol

3.10. N-Acetylneuraminsäurelösung (Sialinsäure)

20 mg N-Acetylneuraminsäure in Wasser lösen und auf 100 ml auffuellen. Diese Lösung kann höchstens 1 Woche bei + 4 ºC aufbewahrt werden.

4. Geräte 4.1. Analytische Waage

4.2. Magnetrührer, 2 cm langer Magnetbarren, teflonbeschichtet

4.3. pH-Meter

4.4. Zentrifuge mit einer Zentrifugalkraft von 3 000 g

4.5. Zentrifugengläser mit etwa 75 ml Fassungsvermögen

4.6. Wasserbad, thermostatisch regelbar für 80 ºC

4.7. Siedendes Wasserbad

4.8. Filterpapier 125 mm Durchmesser (Schleicher und Schüll, Nr. 5892, "Weißband" oder gleichwertige Qualität)

4.9. Glastrichter, Durchmesser etwa 7 cm

4.10. Becher 100 ml und 150 ml Fassungsvermögen

4.11. Meßkolben 50, 100 und 1 000 ml Fassungsvermögen

4.12. Reagenzgläser mit Schraubdeckel mit 10 ml Fassungsvermögen

4.13. Spektrophotometer

4.14. Glasküvetten für Spektrophotometer (4.13), 10 mm Schichtdicke

4.15. Pipetten mit Masseinteilung (1, 2, 5, 10, 20, 25 und 50 ml)

4.16. Glasstäbe

4.17. Trockenofen, thermostatisch regelbar auf 35 ºC

5. Probenvorbereitung

Nachdem die Probe homogenisiert wurde, wird sie nach den Angaben in Ziffer 6 ff. untersucht.

6. Verfahren 6.1. Abtrennung der freien Sialinsäure 6.1.1. 5 ± 0,005 g Magermilchpulver in ein 150 ml Becherglas wiegen.

50 ml Wasser hinzugeben. Gut umrühren mit dem Magnetrührer (4.2) bis zur vollständigen Auflösung.

Anschließend unter Rühren langsam 50 ml TCA-Lösung (3.1) hinzugeben.

Danach 30 Min. bei Raumtemperatur stehen lassen.

6.1.2. Noch einmal kurz aufrühren und auschließend filtrieren (4.8).

6.1.3. Innerhalb 60 Min. nach Beginn der Filtration 50 ml des Filtrats in ein Zentrifugenglas (4.5) einfuellen. 1 ml Phosphorwolframsäurelösung (3.2) dazugeben. Die Lösung durch Rühren vollständig homogenisieren und 10 Min. bei Raumtemperatur stehenlassen. Bei 3 000 g und 10 Min. zentrifugieren.

6.1.4. Der Überstand wird abgegossen. Das Sediment wird 2 × mit 5 ml Ethanol (3.3) gewaschen ; auf gutes Vermischen mit einem Magnetrührer oder Glasstab (4.16) ist zu achten. (Sofern ein Glasstab verwendet wird, werden zuerst 2 ml in das Zentrifugenglas eingefuellt, und mit den verbleibenden 3 ml wird der Glasstab abgespült). Jedesmal bei 3 000 g 10 Min. zentrifugieren.

Das Sediment wird über Nacht bei Raumtemperatur oder 90 Min. bei 35 ºC getrocknet.

6.1.5. Auf das trockene Sediment 4 ml 0,1 N Schwefelsäurelösung (3.4) geben und zwecks gleichmässiger Verteilung gut aufrühren. Das Zentrifugenglas verschließen und für 40 Min. in ein Wasserbad bei 80 ºC stellen und von Zeit zu Zeit umrühren, um eine gute Verteilung zu gewährleisten. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur 4 ml Acetatpufferlösung (3.5) hinzugeben und sorgfältig vermischen.

6.1.6. 10 Min, bei 3 000 g zentrifugieren. Die quantitative Bestimmung der Sialinsäure oder N-Acetylneuraminsäure wird mit der oberen Schicht ausgeführt.

6.2. Spektrophotometrische Bestimmung der freien Sialinsäure 6.2.1. 2 ml der oberen Schicht in ein Reagenzglas geben (4.12) und 2 ml Resorcinolreagenz (3.8) hinzugeben.

6.2.2. Nach dem Verschließen der Gläser sorgfältig mischen und die Gläser für genau 15 Min. in ein siedendes Wasserbad bei 100 ºC (4.7) stellen. Danach in fließendem Wasser auf Raumtemperatur abkühlen.

6.2.3. 5 ml Isoamylalkohol (3.9) hinzufügen, die Reagenzgläser verschließen und durch kräftiges Schütteln sorgfältig mischen und dann für 15 Min. in Eiswasser stellen

6.2.4. Zentrifugieren bei 1 000 g für 2 Min. für eine gute Trennung beider Phasen.

6.2.5. Etwa 3 ml der oberen Schicht (Alkoholphase) in eine Meßküvette geben und die Extinktion bei 580 nm gegen den Blindwert innerhalb 30 Min. nach Entnahme aus dem Eiswasser messen.

6.3. Blindwert

Einen Blindwert entsprechend 6.2.1 bis 6.2.5 durchführen, unter Verwendung von 1 ml 0,1 N Schwefelsäurelösung (3.4) und 1 ml Acetatpufferlösung (3.5) anstelle von 2 ml Filtrat wie es unter 6.2.1 eingesetzt wird.

6.4. Eichkurve 6.4.1. Genau 0-2-5-10-20 und 30 ml der Lösung (3.10), entsprechend 0-0,4-1-2-4-6 mg Sialinsäure, in Meßkolben von 50 ml Fassungsvermögen geben, mit 0,1 N Schwefelsäurelösung (3.4) auf 50 ml auffuellen und sorgfältig mischen.

6.4.2. Von jedem Meßkolben 1 ml in ein Reagenzglas (4.12) geben. 1 ml Acetatpufferlösung (3.5) hinzufügen, um eine Serie von Referenzlösungen zu erhalten, die 0 (Nullwert) 8, 20, 40, 80 120 Mikrogramm Sialinsäure enthalten. Nach sorgfältigem Mischen die Bestimmung gemäß 6.2.2 bis 6.2.5 durchführen.

6.4.3. Zur Erstellung der Eichkurve werden die unter Ziffer 6.4.2 erhaltenen Extinktionswerte und die entsprechenden Sialinsäure-Mengenwerte in Mikrogramm gemäß 6.4.2 auf ein Diagramm eingetragen.

7. Darstellung der Ergebnisse 7.1. Berechnungsmethode

Der Gehalt an Sialinsäure, ausgedrückt in Mikrogramm je Gramm, wird unter Verwendung folgender Formel berechnet: >PIC FILE= "T0020412">

wobei C die Masse der Sialinsäure in Mikrogramm, abgelesen von der Eichkurve, die mit der unter Ziffer 6.2.5 erhaltenen Extinktionsmessung übereinstimmt, und E die Masse der Probenahme (6.1.1) in Gramm darstellt. Das Ergebnis auf 1 Mikrogramm genau angeben.

7.2. Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen Ergebnissen von Doppelbestimmungen, die gleichzeitig oder in rascher Folge vom selben Untersucher erhalten werden, soll nicht mehr als 5 % des arithmetischen Mittels der Ergebnisse betragen.

8. Auslegung der Ergebnisse

Diese Methode ermöglicht die mengenmässige Bestimmung von gegebenenfalls in Magermilchpulver vorhandener Molke. 8.1. Berechnung des Durchschnittswerts von freier Sialinsäure in Mikrogramm je Gramm der Probe, bezogen auf den in Prozent ausgedrückten Eiweißgehalt (m/m)

Y = 40 + 3 (X - 34)2

wobei

40 der durchschnittliche Sialinsäuregehalt in Mikrogramm je Gramm für ein Magermilchpulver mit einem Eiweißgehalt von mindestens 34 % ist:

X der Gesamteiweißgehalt ist, ermittelt nach der Kieldahl-Methode FIL IDF 20 : 1962.

8.2. Berechnung des eventuell vorhandenen Molkenpulvergehalts >PIC FILE= "T0020413">

wobei

Z Der Sialinsäuregehalt der Probe, bestimmt gemäß Ziffer 7.1 in Mikrogramm je Gramm, ist,

Y der durchschnittliche Gehalt an freier Sialinsäure der Probe, berechnet nach Ziffer 8.1, ist,

10 vereinbarungsgemäß den Gehalt an freier Sialinsäure von einem Gramm Labmolkenpulver darstellt, ausgedrückt in Mikrogramm.

8.3. Aufgrund der durch die Methode bedingten Fehler und der natürlichen Schwankungen der Probenzusammensetzung kann man endgültig auf ein Nichtvorhandensein von Molke schließen, wenn der nach Ziffer 8.2 erhaltene Wert 2,0 oder weniger beträgt.

Ein höherer Wert als 2,0 führt zu der Schlußfolgerung, daß Molke vorhanden ist. In diesem Fall wird die Menge nach der Formel von Ziffer 8.2 berechnet."