a) „Tiere“: Landsäugetiere der zu den Ordnungen der Rüsseltiere (Proboscidae) und Paarhufer (Artiodactyla) und ihren Kreuzungen gehörenden Arten;

b) „Betrieb“: ein landwirtschaftlicher Betrieb oder ein anderes amtlich überwachtes landwirtschaftliches, industrielles oder gewerbliches Unternehmen, einschließlich Zoos, Vergnügungsparks, Wild- und Jagdgehege, in denen Tieren üblicherweise gehalten oder aufgezogen werden;

c) „Zugerichtete Innereien“: Innereien, die von Knochen, Knorpel, Luftröhre und Hauptbronchien, Lymphknoten und anhaftendem Bindegewebe, Fett und Schleimhäuten vollständig befreit wurden, sowie — im Fall von Fleisch von Hausrindern — die gesamte gemäß Anhang I Kapitel VIII Nummer 41 Buchstabe a) der Richtlinie 64/433/EWG angeschnittene Kaumuskulatur.

i) Tiere, die zur sofortigen Schlachtung bestimmt sind, sind unverzüglich zum Bestimmungsschlachthof zu befördern, um dort innerhalb von fünf Arbeitstagen geschlachtet zu werden;

ii) Tiere, die zu Zucht-, Nutz- oder Mastzwecken bestimmt sind, und Tiere für Zoos, Vergnügungsparks sowie Jagd- oder Wildgehege sind unverzüglich zum Bestimmungsbetrieb zu befördern, in dem sie vor einer etwaigen Weiterbeförderung mindestens 30 Tage lang verbleiben müssen, es sei denn, sie werden auf direktem Weg zu einem Schlachthof befördert.

a) nicht enthäutete Körper freilebender Klauentiere, die nach der weiteren Bearbeitung zum Genuss für Menschen bestimmt sind;

b) zugerichtete Innereien von Hausrindern, die als Fleischerzeugnisse nach einer weiteren Erhitzung auf eine Kerntemperatur von mindestens 80 °C zum Genuss für Menschen bestimmt sind oder die in hermetisch verschlossenen Behältnissen auf einen Fo-Wert von ≥ 3 sterilisiert werden.

a) die Namen und Anschriften der Betriebe gemäß Absatz 2 und der für die Überwachung dieser Betriebe zuständigen örtlichen Behörde sowie

b) die Erzeugniskategorien, für die diese Betriebe zugelassen und eingetragen sind.

a) Sie stammen aus dem Hoheitsgebiet eines Drittlands oder Teils eines Drittlands, das in der Liste in Anhang II Teil 1 dieser Entscheidung für die Einfuhr von frischem Fleisch der betreffenden Art aufgeführt ist;

b) sie erfüllen die besonderen Tiergesundheitsbedingungen für die betreffende Art gemäß dem entsprechenden Muster der Tiergesundheitsbescheinigung in Anhang II Teil 2;

c) sie müssen von einer Tiergesundheitsbescheinigung begleitet sein, die gemäß dem Muster in Anhang III erstellt und von einem amtlichen Tierarzt der zuständigen Veterinärbehörden des betreffenden Drittlands unterzeichnet wurde;

d) sie werden von dem für die Grenzkontrollstelle zuständigen Amtstierarzt auf dem Gemeinsamen Veterinärdokument für die Einfuhr als für die Durchfuhr oder (gegebenenfalls) die Lagerung zugelassen zertifiziert.

a) Die Sendung wurde von den Veterinärdiensten der zuständigen Behörde an der Grenzkontrollstelle bei Eintritt in die EU mit einem mit einer Seriennummer versehenen Siegel versiegelt;

b) die die Sendung begleitenden Dokumente gemäß Artikel 7 der Richtlinie 97/78/EG werden von dem Amtstierarzt der für die Grenzkontrollstelle zuständigen Behörde auf jeder Seite mit dem Stempel „NUR FÜR DIE DURCHFUHR DURCH DIE EG NACH RUSSLAND“ versehen;

c) die Verfahrensvorschriften gemäß Artikel 11 der Richtlinie 97/78/EG werden eingehalten;

d) die Sendung wird von dem für die Grenzkontrollstelle zuständigen Amtstierarzt auf dem Gemeinsamen Veterinärdokument für die Einfuhr als für die Durchfuhr zugelassen zertifiziert.

a) Das Ausfuhrland stellt die Veterinärbescheinigungen nach den in Anhang I Teil 2 für die betreffenden Tiere vorgesehenen Mustern aus. Die Bescheinigungen enthalten (in der im Muster vorgegebenen Reihenfolge) die für das betreffende Drittland verlangten amtlichen Bestätigungen sowie gegebenenfalls die für das Ausfuhrdrittland oder ein Gebiet des Ausfuhrdrittlands verlangten zusätzlichen Garantien.

Wenn der Bestimmungsmitgliedstaat dies für die betreffenden Tiere verlangt, ist die Erfüllung etwaiger zusätzlicher Anforderungen ebenfalls in der Originalbescheinigung zu bestätigen.

b) Für Tiere, die nur aus einem der Gebiete gemäß Anhang I Teil 1 Spalten 2 und 3 ausgeführt und in ein und demselben Eisenbahnwaggon, Lastkraftwagen, Flugzeug oder Schiff an ein und denselben Bestimmungsort befördert werden, ist eine einzige, separate Bescheinigung auszustellen.

c) Das Bescheinigungsoriginal besteht aus einem einzelnen Blatt, beidseitig bedruckt oder, soweit mehr Text erforderlich ist, so formatiert, dass alle erforderlichen Seiten ein einheitliches, zusammenhängendes Ganzes bilden.

d) Die Bescheinigung ist in mindestens einer der Amtssprachen des Mitgliedstaats, in dem die Grenzkontrolle stattfindet, und des Bestimmungsmitgliedstaats auszustellen. Diese Mitgliedstaaten können jedoch, wenn dies für erforderlich gehalten wird, andere Gemeinschaftssprachen als ihre eigenen zulassen, soweit eine offizielle Übersetzung beiliegt.

e) Werden der Bescheinigung zwecks Identifizierung der die Sendung ausmachenden Waren (Stückverzeichnis gemäß Ziffer 8.2 der Musterbescheinigung) weitere Seiten beigefügt, so gelten auch diese als Teil des Bescheinigungsoriginals, und jede einzelne dieser Seiten muss mit Unterschrift und Stempel des bescheinigungsbefugten amtlichen Tierarztes versehen sein.

f) Umfasst die Bescheinigung, einschließlich zusätzlicher Stückverzeichnisse gemäß Buchstabe e), mehrere Seiten, so ist jede Seite am Seitenende als Seite … (Seite 1, 2, 3 usw.) von … (Gesamtseitenzahl) zu nummerieren und trägt am Seitenkopf die von der zuständigen Behörde zugeteilte Codenummer.

g) Das Bescheinigungsoriginal ist innerhalb von 24 Stunden vor dem Verladen der Sendung zwecks Ausfuhr in die Gemeinschaft von einem amtlichen Tierarzt auszufüllen und zu unterzeichnen. Dabei tragen die zuständigen Behörden des Ausfuhrlands dafür Sorge, dass die angewandten Bescheinigungsvorschriften den diesbezüglichen Vorschriften der Richtlinie 96/93/EG des Rates gleichwertig sind.

Die Unterschrift muss sich farblich von der Druckfarbe der Bescheinigung absetzen. Diese Vorschrift gilt auch für Amtssiegel, bei denen es sich nicht um Trockenstempel oder ein Wasserzeichen handelt.

h) Das Bescheinigungsoriginal muss die Sendung bis zur Ankunft an der Grenzkontrollstelle der Gemeinschaft begleiten.

i) Die Bescheinigung gilt ab dem Tag ihrer Ausstellung für die Dauer von zehn Tagen.

Im Fall des Schiffstransports wird die Gültigkeitsdauer um die Dauer der Beförderung an Bord verlängert. Zu diesem Zweck ist der Veterinärbescheinigung das Original einer entsprechenden Erklärung des Schiffskapitäns gemäß dem Addendum nach Anhang I Teil 3 dieser Entscheidung beizufügen.

j) Die Tiere dürfen auf keinen Fall zusammen mit anderen Tieren befördert werden, die nicht für die Europäische Gemeinschaft bestimmt sind oder einen niedrigeren Gesundheitsstatus aufweisen.

k) Während ihrer Beförderung in die Europäische Gemeinschaft dürfen die Tiere auf keinen Fall in einem Drittland oder einem Gebiet eines Drittlands entladen werden, das in Bezug auf die betreffende Tierart nicht zur Einfuhr in die Gemeinschaft zugelassen ist.

I. Sie stehen unter der Überwachung eines amtlichen Tierarztes.

II. Sie liegen inmitten eines Gebiets von 20 km Durchmesser, in dem nach amtlicher Feststellung zumindest in den 30 Tagen vor ihrer Inanspruchnahme als zugelassene Sammelstellen kein Fall von Maul- und Klauenseuche aufgetreten ist.

III. Sie werden vor ihrer Inanspruchnahme als zugelassene Sammelstellen mit einem von der zuständigen Behörde des Ausfuhrlandes offiziell zur Abtötung der Erreger der Krankheit gemäß Ziffer II zugelassenen Desinfektionsmittel gereinigt und desinfiziert.

IV. Sie umfassen, unter Berücksichtigung ihrer Aufnahmekapazität: a) ein eigens dem Zusammenführen von Tieren vorbehaltenes Gelände, b) angemessene, leicht zu reinigende und zu desinfizierende Anlagen zum Ver- und Entladen, zur artgerechten Unterbringung, zum Füttern und Tränken und erforderlichenfalls Behandeln der Tiere, c) geeignete Untersuchungsräume und Quarantäneställe, d) geeignete Ausrüstungen zum Reinigen und Desinfizieren von Räumen und LKWs, e) angemessene Lagerräume für Trockenfutter, Einstreu und Mist, f) ein angemessenes System zur Sammlung und Ableitung von Abwässern, g) ein Büro für den amtlichen Tierarzt.

V. Bei Betrieb sind genügend Tierärzte anwesend, um alle Aufgaben zu bewältigen.

VI. Es werden nur Tiere angenommen, die individuell so gekennzeichnet sind, dass ihre Herkunft ermittelt werden kann. In diesem Sinne müssen sich Besitzer oder Betreiber von Sammelstellen bei der Annahme von Tieren vergewissern, dass die Tiere ordnungsgemäß gekennzeichnet und von den für die betreffende Tierart und Tierkategorie erforderlichen Gesundheitspapieren oder Gesundheitsbescheinigungen begleitet sind. Darüber hinaus sind Besitzer oder Betreiber von Sammelstellen verpflichtet, die Namen der Tiereigentümer, die Herkunft der Tiere, die Zugangs- und Abgangsdaten, die Kennnummern und Kennzeichen der Tiere oder die Registernummer des Herkunftsbestands, die Bestimmung der Tiere sowie die Zulassungsnummer des Spediteurs und die amtlichen Kennzeichen der die Tiere anliefernden oder abholenden LKWs für die Dauer von mindestens drei Jahren in einem Register oder einer Datenbank zu erfassen.

VII. Alle Sammelstellen passierenden Tiere erfüllen die zur Einfuhr der betreffenden Tierkategorie in die Europäische Gemeinschaft geltenden Gesundheitsanforderungen.

VIII. Tiere, die in die Europäische Gemeinschaft ausgeführt werden sollen und dabei Sammelstellen passieren, müssen anschließend innerhalb von sechs Tagen nach ihrer Ankunft verladen und unter folgenden Bedingungen auf direktem Weg an die Grenze des Ausfuhrlandes befördert werden: a) Sie kommen auf keinen Fall mit Klauentieren in Berührung, die die Bedingungen für die Einfuhr der betreffenden Tierkategorie in die Europäische Gemeinschaft nicht erfüllen; b) sie werden so aufgeteilt, dass keine Sendung gleichzeitig Zucht-/Nutztiere und Schlachttiere enthält; c) sie werden in Transportmitteln oder Containern befördert, die vor ihrer Verwendung mit einem von der zuständigen Behörde des Ausfuhrlandes amtlich zur Abtötung der Erreger der Krankheit gemäß Ziffer II zugelassenen Desinfektionsmittel gereinigt und desinfiziert wurden und die so geebaut sind, dass Kot, Urin, Einstreu oder Trockenfutter während der Fahrt nicht aus dem Transportmittel ausfließen oder herausfallen können.

IX. Ist hinsichtlich der Ausfuhr von Tieren in die Europäische Gemeinschaft vorgesehen, dass die Tiere innerhalb eines bestimmten Zeitraums vor dem Verladen getestet werden müssen, so umfasst dieser Zeitraum eine Frist von maximal sechs Tagen, ab der Ankunft der Tiere in der zugelassenen Sammelstelle an gerechnet, während der Tiere gesammelt werden.

X. Das Ausfuhrland bestimmt die Sammelstellen, die für Zucht- und Nutztiere zugelassen werden, sowie diejenigen, die für Schlachttiere zugelassen werden, und teilt der Kommission und den zuständigen Zentralbehörden der Mitgliedstaaten Namen und Anschriften dieser Sammelstellen sowie jede spätere Änderung ihrer Koordinaten mit.

XI. Das Ausfuhrland regelt die amtliche Überwachung zugelassener Sammelstellen und trägt dafür Sorge, dass die Überwachung ordnungsgemäß erfolgt.

XII. Sammelstellen werden regelmäßig inspiziert, damit gewährleistet ist, dass die Zulassungsbedingungen auch weiterhin erfüllt sind. Bei Nichterfüllung der Zulassungsbedingungen und bei Aussetzung der Zulassung darf die Zulassung erst wieder erteilt werden, wenn sich die zuständige Behörde vergewissert hat, dass die vorgenannten Bedingungen insgesamt erfüllt sind.

A. Blocking-ELISA oder kompetitiver ELISA nach folgendem Testprotokoll:

Material und Reagenzien

Testformat

Cc: Konjugatkontrolle (kein Serum/kein monoklonaler Antikörper); C++: stark positive Serumkontrolle; C+: schwach positive Serumkontrolle; C-: negative Serumkontrolle; Cm: Mab-Kontrolle (kein Serum).

Testprotokoll

Konjugatkontrolle (Cc)

:

Vertiefungen 1A und 1B sind Blindkontrollen, bestehend aus BTV-Antigen und Konjugat. Kann als Blindwert für das ELISA-Lesegerät verwendet werden.

Mab-Kontrolle (Cm)

:

Spalten 1 und 2, Reihen G und H sind die Mab-Kontrolle und enthalten BTV-Antigen, monoklonale Antikörper und Konjugat. Diese Vertiefungen entsprechen der stärksten Farbkonzentration. Der Durchschnittswert der OD-Ergebnisse (optische Dichte) dieser Kontrolle entspricht 0 % des Hemmungswerts.

Positive Kontrolle (C++, C+)

:

Spalten 1 und 2, Reihen C-D-E-F. Diese Vertiefungen enthalten BTV-Antigen, BTV-stark bzw. -schwach positive Antiseren, Mab und Konjugat.

Negative Kontrolle (C-)

:

Vertiefungen 2A und 2B sind die negativen Kontrollen; sie enthalten BTV-Antigen, BTV-negatives Antiserum, Mab und Konjugat.

Testseren

:

Für großangelegte serologische Untersuchungen und schnelle Reihenuntersuchungen könnten Seren in einer einzigen Verdünnung von 1:5 (Anlage 1) getestet werden. Alternativ können 10 Seren in einer Verdünnungsreihe von 1:5 bis 1:640 (Anlage 2) getestet werden. Dies dürfte einen Anhaltspunkt für den Antikörpertiter in den Testseren geben.

Verfahren

Ergebnisanalyse

Mittels geeigneter Software die OD-Werte und, ausgehend von dem für die Antigenkontrollvertiefungen verzeichneten Durchschnittswert, den Hemmungsprozentsatz (percentage inhibition — PI) für Test- und Kontrollseren, ausdrucken. Anhand der als OD- und PI-Werte ausgedrückten Daten lässt sich bestimmen, ob der Test innerhalb akzeptabler Grenzen durchgeführt wurde. Die oberen Kontrollgrenzen (upper control limits — UCL) und die unteren Kontrollgrenzen (lower control limits — LCL) für die Mab-Kontrolle (in Ermangelung von Testseren Antigen plus Mab) liegen zwischen den OD-Werten 0,4 und 1,4. Platten, die die genannten Kriterien nicht erfüllen, werden verworfen.

Ist keine geeignete Computersoftware vorhanden, OD-Werte mit einem ELISA-Drucker ausdrucken. Durchschnittlichen OD-Wert für die Antigenkontrollvertiefungen (der dem 100%-Wert entspricht) berechnen. 50%-OD-Wert bestimmen und die Positivität und Negativität jeder Probe manuell berechnen.

Hemmungsprozentsatz (PI-Wert) = 100 − ( OD jeder Testkontrolle / durchschnittlicher OD von Cm) × 100.

Die Vertiefungen der Negativkontrolle und der Blindkontrolle (jeweils Doppelbestimmung) sollten PI-Werte zwischen + 25 % und − 25 % bzw. zwischen + 95 und + 105 % zeigen. Werte außerhalb dieser Grenzbereiche machen das Plattenergebnis zwar nicht ungültig, lassen jedoch vermuten, dass sich eine Hintergrundverfärbung ausbildet. Die stark und schwach positiven Kontrollseren sollen PI-Werte zwischen + 81 % und + 100 % bzw. zwischen + 51 % und + 80 % zeigen.

Der diagnostische Schwellenwert für Testseren ist 50 % (PI 50 % oder OD 50 %). Proben mit PI-Werten > 50 % sind negativ, Proben mit PI-Werten über oder unter dem Schwellenwert für die Doppelbestimmung gelten als unschlüssig und können durch Serumeinfachverdünnung (Tüpfelprobe) und/oder Serumtitration neu analysiert werden. Positive Proben können ebenfalls titriert werden, um einen Anhaltspunkt für den Grad der Positivität zu erhalten.

Visuelles Ablesen: Positive und negative Proben lassen sich leicht mit bloßem Auge ablesen; schwach positive oder stark negative Proben sind mitunter mit bloßem Auge schwerer zu interpretieren.

Aufbereitung des BTV-ELISA-Antigens

Titration von BTV ELISA-Antigen

Zur Titration von Bluetongue-ELISA-Antigen wird der indirekte ELISA angewandt. Zweifache Antigenverdünnungen werden gegen eine konstante Verdünnung (1:100) monoklonaler Antikörper 3-17-A3 titriert. Protokoll:

Beim kompetitiven ELISA müssen die monoklonalen Antikörper überschüssig sein. Daher wird eine Antigenverdünnung gewählt, die auf der Titrationskurve (und nicht auf dem Plateau) liegt, die nach 10 Minuten ungefähr 0,8 OD ergibt.

B. Der Agargelimmundiffusionstest wird nach folgendem Protokoll durchgeführt:

Antigen

Das präzipitierende Antigen kann in jeder Zellkultur vorbereitet werden, in der sich ein Referenzstamm des Bluetonguevirus schnell vermehren kann. Es werden BHK- oder Verozellen empfohlen. Das Antigen ist am Ende des Viruswachstums im Überstand vorhanden, erfordert jedoch eine 50- bis 100-fache Konzentration, um wirksam zu sein. Dies kann mit jedem Standard-Proteinkonzentrationsverfahren erreicht werden; Viren im Antigen können durch Zugabe von 0,3 % (v/v) Beta-Propiolacton inaktiviert werden.

Bekanntes positives Kontrollserum

Unter Verwendung des internationalen Referenzserums und -antigens wird ein nationales Standardserum hergestellt, für ein optimales Volumenverhältnis zum internationalen Referenzserum standardisiert, gefriergetrocknet und bei jedem Test als das bekannte Kontrollserum verwendet.

Testserum

Verfahren

:

1 % Agarose, in Borat oder Natriumbarbitolpuffer (pH 8,5 bis 9,0) vorbereitet, in eine Petrischale gießen (Mindesttiefe 3,0 mm). Ein Testschema von sieben feuchtigkeitsfreien Löchern von jeweils 5,0 mm Durchmesser in den Agar stanzen. Das Schema besteht aus einem zentralen Loch und sechs (im Radius von 3 cm) kreisförmig angeordneten peripheren Löchern. Das Standardantigen in das Zentralloch einpipettieren. In die peripheren Löcher 2, 4 und 6 das bekannte positive Serum, in die Löcher 1, 3 und 5 die Testseren geben. Die so vorbereitete Platte bis zu 72 Stunden bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubieren.

Interpretation

:

Ein Testserum ist positiv, wenn sich gegen das Antigen eine dünne Präzipitationslinie und gegen das Kontrollserum eine zusammenfließende Identitätslinie ausbildet. Ein Testserum ist negativ, wenn sich keine sichtbare Präzipitationslinie mit dem Antigen ausbildet und die Linie des Kontrollserum nicht gebogen ist. Die Petrischalen sollten gegen einen dunklen Hintergrund schräg beleuchtet untersucht werden.

A. Der Serumneutralisationstest wird nach folgendem Protokoll durchgeführt:

Serum

:

Alle Seren vor der Verwendung 30 Minuten bei 56 °C inaktivieren.

Verfahren

:

Für den konstant virusverändernden Serumneutralisationstest auf Mikrotiterplatten MDBK- oder andere empfängliche Zellen verwenden. Den Colorado-, Oxford- oder einen anderen Referenzstamm des Virus bei 100 TCID50 je 0,025 ml verwenden. Inaktivierte unverdünnte Serumproben mit einer gleichen Menge (0,025 ml) Virussuspension mischen. Vor Zugabe der MDBK-Zellen die Virus-Serum-Mischungen 24 Stunden bei 37 °C auf den Mikrotiterplatten inkubieren. Die Zellen in einer Konzentration verwenden, die gewährleistet, dass sich nach 24 Stunden eine Monolayer-Kultur bildet.

Kontrollen

:

i) Prüfung der Virusinfektiosität, ii) Kontrollen der Serumtoxizität, iii) Kontrollen der unbeimpften Zellkulturen, iv) Referenzantiseren.

Interpretation

:

Die Ergebnisse des Neutralisationstests und die Titerwerte des im Test verwendeten Virus werden nach drei bis sechs Tagen Inkubation bei 37 °C abgelesen. Serumtiter gelten als negativ, wenn bei einer Verdünnung von 1:2 (unverdünntes Serum) keine Neutralisationsreaktion eintritt.

B. Jeder andere Test, der in der Entscheidung 93/42/EG der Kommission über ergänzende Garantien hinsichtlich der infektiösen bovinen Rhinotracheitis bei Rindern, die für seuchenfreie Mitgliedstaaten oder Regionen von Mitgliedstaaten bestimmt sind, anerkannt ist.

A. Speiseröhren-/Rachenabstrichproben werden nach folgendem Protokoll entnommen und getestet:

Reagenzien

:

Vor der Entnahme das Transportmedium vorbereiten. Mengen von jeweils 2 ml in so viele Behältnisse geben, wie Tiere zu untersuchen sind. Die Behältnisse sollten gefrierfest und zur Beförderung über festem CO2 oder Flüssigstickstoff geeignet sein. Proben werden mit einem speziell konzipierten Sputumschabelöffel oder „Probang“-Probengerät entnommen. Zur Entnahme das Probengerät durch das Maul über den Zungenrücken in die obere Speiseröhre einführen. Es sollte versucht werden, das Oberflächenepithel der oberen Speiseröhre und des Rachens durch direkte Seitwärts- und Rückwärtsbewegungen abzuschaben. Das Probang-Gerät herausnehmen, möglichst nachdem das Tier geschluckt hat. Der Schabelöffel sollte voll sein und ein Gemisch aus Schleim, Speichel, Speiseröhrenflüssigkeit und Zelldebris enthalten. Es sollte sichergestellt werden, dass jede Probe eine gewisse Menge sichtbares Zellmaterial enthält. Jede grobe Behandlung des Tieres, die Bluten verursachen könnte, ist tunlichst zu vermeiden. Bei bestimmten Tieren sind die Proben möglicherweise stark mit Panseninhalt kontaminiert und sollten verworfen werden. Das Maul des betreffenden Tieres ist mit Wasser oder vorzugsweise physiologischer Kochsalzlösung auszuspülen, bevor eine weitere Probe entnommen wird.

Behandlung der Proben

:

Jede Probe, die mit dem Probang-Gerät entnommen wurde, ist auf Qualität zu prüfen. 2 ml Probenmaterial werden mit gleicher Menge Transportmedium in ein gefrierfestes Röhrchen gegeben. Die Röhrchen fest verschrauben, verplomben, desinfizieren und etikettieren. Die Proben kühl (+ 4 °C) aufbewahren und innerhalb von drei bis vier Stunden untersuchen oder bis zur Untersuchung auf Trockeneis (− 69 °C) oder Flüssigstickstoff gefroren halten. Nach jeder Beprobung ist das Probang-Gerät zu desinfizieren und dreimal mit sauberen Wasser abzuspülen.

MKSV-Testung

:

Primärkulturen aus Rinderschilddrüsenzellen mit den Proben beimpfen (mindestens drei Röhrchen je Probe). Es können auch andere empfängliche Zellen wie beispielsweise primäre Rinder- oder Schweinenierenzellen verwendet werden. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass Letztere für bestimmte MKS-Virusstämme weniger empfindlich sind. Die Röhrchen bei 37 °C im Rollerapparat inkubieren und 48 Stunden lang täglich auf Auftreten eines zytopathischen Effekts (CPE) untersuchen. Negative Kulturen nach 48 Stunden auf frische Gewebekulturen übertragen (Blindpassage) und erneut untersuchen. Die Spezifität jedes CPE ist zu bestätigen.

Empfohlene Transportmedien:

B. Der Serumneutralisationstest wird nach folgendem Potokoll durchgeführt:

Reagenzien

:

MKSV-Antigen in Zellkulturen oder auf Rinderzungen vorbereiten und bei − 70 °C oder weniger oder nach Zugabe von 50 % Glycerol bei − 20 °C aufbewahren und als Vorratsantigen verwenden. MKSV ist unter diesen Bedingungen stabil, und Titerwerte sind über Monate hinweg wenig veränderlich.

Verfahren

:

Der Test wird mit empfänglichen Zellen wie IB-RS-2, BHK-21 oder Kälbernierenzellen in flachgrundigen Mikrotiterplatten durchgeführt. Testseren werden 1:4 in serumfreiem Zellkulturmedium unter Zugabe von 100 IE/ml Neomycin oder anderer geeigneter Antibiotika verdünnt. Seren werden 30 Minuten bei 56 °C inaktiviert, und 0,05-ml-Mengen werden verwendet, um mit 0,05 ml Ösen zweifache Verdünnungsreihen auf Mikrotiterplatten anzulegen. Vortitrierte Viren, die ebenfalls in serumfreiem Kulturmedium verdünnt wurden und 100 TCID 50/0,05 ml aufweisen, in jede Vertiefung geben. Nach einer für die Neutralisation erforderlichen Inkubation von 1 Stunde bei 37 °C 0,05 ml Suspensionszellen mit 0,5 bis 1,0 × 106 Zellen je 1 ml in Zellkulturmedium, das MKSV-antikörperfreies Serum enthält, in jede Vertiefung geben und die Platten versiegeln. Platten bei 37 °C inkubieren. Monolayer konfluieren normalerweise innerhalb von 24 Stunden. Der zytopathische Effekt ist nach 48 Stunden in der Regel ausgeprägt genug, um unter dem Mikroskop abgelesen werden zu können. Zu diesem Zeitpunkt kann ein endgültiges mikroskopisches Ergebnis abgelesen werden, oder die Platten können fixiert und zum makroskopischen Lesen beispielsweise mit 10 % Formol-Kochsalzlösung und 0,05 % Methylenblau angefärbt werden.

Kontrollen

:

Die Kontrollen bei jedem Test umfassen homogenes Antiserum mit einem bekannten Titer, eine Zellkontrolle, eine Kontrolle der Serumtoxizität, eine Mediumkontrolle und eine Virustitration, auf deren Grundlage die eigentliche Virusmenge im Test berechnet wird.

Interpretation

:

Vertiefungen mit eindeutigem zytopathischen Effekt gelten als infiziert, und Neutralisationstiter werden ausgedrückt als Reziprokwert der in den Serum-Virus-Mischungen beim 50%-Endpunkt (geschätzt nach der Spearman-Karber-Methode) (Karber, G., 1931, Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie, 162, 480.) vorhandenen Serumendverdünnung. Testergebnisse sind gültig, wenn im Test die tatsächlich verwendete Virusmenge je Vertiefung zwischen 101,5 und 102,5 TCID50 und der Titer des Referenzserums mindestens das Zweifache des erwarteten Titerwerts beträgt (geschätzt aus früheren Titrationen). Liegen die Kontrollen außerhalb dieser Ergebnisse, muss der Test wiederholt werden. Ein Endpunkttiter von 1:11 oder weniger gilt als negativ.

C. Nachweis und Quantifizierung von Antikörpern erfolgen nach folgendem ELISA-Testprotokoll:

Reagenzien

:

Kaninchen-Antiseren gegen 146S-Antigen von sieben MKSV-Typen, verwendet in vorbestimmter optimaler Konzentration in Karbonat-Bicarbonat-Puffer mit einem pH-Wert von 9,6. Antigene aus selektierten Virusstämmen, auf Monolayern von BHK-21-Zellen angezüchtet, vorbereiten. Die ungereinigten Überstände nach dem vorgegebenen Protokoll, jedoch ohne Serum, verwenden und vortitrieren, um eine Verdünnung zu erhalten, die nach Zugabe einer identischen Menge PBST (phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 0,05 % Tween-20 und Phenolrot-Indikator) ein OD-Ergebnis von 1,2 bis 1,5 gewährleistet. Die Viren können inaktiviert verwendet werden. PBST als Verdünnungsmittel verwenden. Meerschweinchen-Antiseren durch Beimpfung von Meerschweinchen mit 146S-Antigen jedes Serotyps vorbereiten. In PBST mit 10 % normalem Rinderserum und 5 % normalem Kaninchenserum eine vorbestimmte optimale Konzentration herstellen. An Meerrettichperoxidase konjugiertes Kaninchen-anti-Meerschweinchen-Immunglobulin in vorbestimmter optimaler Konzentration in PBST mit 10 % normalem Rinderserum und 5 % normalem Kaninchenserum verwenden. Testseren in PBST verdünnen.

Verfahren:

Platten spektrophotometrisch bei 492 nm auf einem an einen Mikrocomputer angeschlossenen ELISA-Lesegerät ablesen.

Kontrollen

:

Für jedes verwendete Antigen 40 serumfreie Vertiefungen mit in PBST verdünntem Antigen. Eine doppelte zweifache Verdünnungsreihe mit homologem Rinderreferenzantiserum. Eine doppelte zweifache Verdünnungsreihe mit negativem Rinderserum.

Interpretation

:

Antikörpertiter werden ausgedrückt als Endverdünnung von Testseren, die 50 % des durchschnittlichen OD-Wertes in den serumfreien Viruskontrollvertiefungen ergeben. Titerwerte über 1:40 gelten als positiv.

Referenzen

:

Hamblin C, Barnett ITR und Hedger RS (1986): „A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. Journal of Immunological Methods, 93“, 115 bis 121.11.

A. Der Serumneutralisationstest wird nach folgendem Potokoll durchgeführt:

Serum

:

Alle Seren vor der Verwendung 30 Minuten bei 56 °C inaktivieren.

Verfahren

:

Für den konstant virusverändernden Serumneutralisationstest auf Mikrotiterplatten Verozellen oder andere empfängliche Zellen verwenden. Den AK-Virus bei 100 TCID50 je 0,025 ml verwenden. Inaktivierte unverdünnte Serumproben mit einer gleichen Menge (0,025 ml) Virussuspension mischen. Vor Zugabe der geeigneten Zellen die Virus-Serum-Mischungen 24 Stunden bei 37 °C auf den Mikrotiterplatten inkubieren. Die Zellen in einer Konzentration verwenden, die gewährleistet, dass sich nach 24 Stunden eine Monolayer-Kultur bildet.

Kontrollen

:

i) Prüfung der Virusinfektiosität, ii) Kontrollen der Serumtoxizität, iii) Kontrollen der unbeimpften Zellkulturen, iv) Referenzantiseren.

Interpretation

:

Die Ergebnisse des Neutralisationstests und die Titerwerte des im Test verwendeten Virus werden nach drei bis sieben Tagen Inkubation bei 37 °C abgelesen. Serumtiter von weniger als 1:2 (unverdünntes Serum) gelten als negativ.

B. Jeder andere Test, der in der Entscheidung 2001/618/EG der Kommission über ergänzende Garantien für den innergemeinschaftlichen Handel mit Schweinen, die für bestimmte Teile der Gemeinschaft bestimmt sind, hinsichtlich der Aujeszky' Krankheit, anerkannt ist.

1. Tiere, die nach Saint Pierre und Miquelon eingeführt werden, müssen vor der Ausfuhr in die Europäische Gemeinschaft während mindestens 60 Tagen in einer zugelassenen Quarantänestation gehalten werden. Dieser Zeitraum kann für bestimmte Tierarten je nach Testanforderungen verlängert werden. Darüber hinaus müssen die Tiere folgende Anforderungen erfüllen:

2. Die Quarantäneeinrichtungen müssen zumindest die Mindestanforderungen gemäß Anhang B der Richtlinie 91/496/EWG sowie die folgenden Bedingungen erfüllen:

a) Testverfahren: komparative Intrakutanreaktion: Applikation von PPD-Rinder- und Geflügeltuberkulin in Einklang mit den Standards für die Herstellung von Rinder- und Geflügeltuberkulinen gemäß Anhang B der Richtlinie 64/432/EWG des Rates. Injiziert wird hinter der Schulterblattgräte (Achselgegend) nach dem Verfahren gemäß Anhang B der Richtlinie 64/432/EWG des Rates.

b) Zeitplan: Die Tiere sind zu testen innerhalb von zwei Tagen nach ihrer Einstellung in die Quarantänestation sowie 42 Tage nach dem ersten Test.

c) Ergebnisauswertung:

Die Reaktion gilt als

d) Mögliche Maßnahmen nach dem Test

Reagiert ein Tier auf die Intrakutan-Injektion von Rinder-PPD positiv, so wird dieses Tier aus der Gruppe ausgeschlossen, und die anderen Tiere sind frühestens 42 Tage nach dem ersten positiven Test einem neuen Test zu unterziehen, der als dann als erster Test gemäß Buchstabe b) anzusehen ist.

Reagieren mehrere Tier der Gruppe positiv, so wird die gesamte Gruppe von der Ausfuhr in die EU ausgeschlossen.

Zeigen ein oder mehrere Tiere unschlüssige Reaktionen, so ist die gesamte Gruppe nach 42 Tagen einem neuen Test zu unterziehen, der als dann als erster Test gemäß Buchstabe b) anzusehen ist.

a) Testverfahren:

b) Zeitplan: Die Tiere sind zu testen innerhalb von zwei Tagen nach ihrer Einstellung in die Quarantänestation sowie 42 Tage nach dem ersten Test.

c) Ergebnisauswertung:

Eine positive Testreaktion ist eine Reaktion im Sinne von Anhang C der Richtlinie 64/432/EWG.

d) Mögliche Maßnahmen nach dem Test:

Reagiert ein Tier auf einen der Tests positiv, so wird dieses Tier aus der Gruppe ausgeschlossen, und die anderen Tiere sind frühestens 42 Tage nach dem ersten positiven Test einem neuen Test zu unterziehen, der als dann als erster Test gemäß Buchstabe b) anzusehen ist.

Nur Tiere, die auf zwei aufeinander folgende Tests gemäß Buchstabe b) negativ reagiert haben, werden zur Ausfuhr in die EU zugelassen.

a) Testverfahren: AGID-Test gemäß Anhang I Teil 3 Abschnitt C der Entscheidung 79/542/EWG.

Bei positiver Reaktion sind die Tiere gemäß Anhang I Teil 3 Abschnitt C der Entscheidung 79/542/EWG einem kompetitiven ELISA zu unterziehen, um zwischen den beiden Krankheiten zu differenzieren.

b) Zeitplan:

Die Tiere müssen auf zwei Tests negativ reagieren, wobei der erste Test innerhalb von zwei Tagen nach ihrer Einstellung in die Quarantänestation und der zweite frühestens 21 Tage nach dem ersten Test stattfindet.

c) Mögliche Maßnahmen nach dem Test:

a) Testverfahren: Diagnosetests (Probang-Test und serologische Untersuchungen) mittels ELISA und NV-Techniken nach den Protokollen gemäß Anhang I Teil 3 Abschnitt C der Entscheidung 79/542/EWG des Rates.

b) Zeitplan: Die Tiere müssen auf zwei Tests negativ reagieren, wobei der erste Test innerhalb von zwei Tagen nach ihrer Einstellung in die Quarantänestation und der zweite frühestens 42 Tage nach dem ersten Test stattfindet.

c) Mögliche Maßnahmen nach dem Test: Reagiert ein Tier beim MKSV-Nachweisverfahren positiv, so kommt kein Tier in der Quarantänestation für eine Einfuhr in die EU in Frage.

Anmerkung: Jeder Nachweis von Antikörpern gegen strukturelle oder nicht strukturelle Proteine des MKS-Virus werden unbeschadet des Impfstatus als Folge einer früheren MKS-Infektion angesehen.

a) Testverfahren: Der kompetitive ELISA gemäß den Verfahrensvorschriften des OIE-Handbuchs ist obligatorisch für den internationalen Handel und ist der gängigste Test. Der Serumneutralisationstest oder andere anerkannte Testmethoden gemäß den in den einschlägigen Kapiteln des OIE-Handbuchs beschriebenen Protokollen können ebenfalls angewandt werden.

b) Zeitplan: Die Tiere müssen zwei Mal getestet werden, wobei der erste Test innerhalb von zwei Tagen nach ihrer Einstellung in die Quarantänestation und der zweite frühestens 42 Tage nach dem ersten Test stattfindet.

c) Mögliche Maßnahmen nach dem Test: Reagiert ein Tier im RPV-Nachweisverfahren positiv, so kommt kein Tier in der Quarantänestation für eine Einfuhr in die EU in Frage.

a) Testverfahren: Der ELISA, der Virusneutralisationstest oder andere anerkannte Testmethoden gemäß den in den einschlägigen Kapiteln des OIE-Handbuchs beschriebenen Protokollen.

b) Zeitplan: Die Tiere müssen zwei Mal getestet werden, wobei der erste Test innerhalb von zwei Tagen nach ihrer Einstellung in die Quarantänestation und der zweite frühestens 42 Tage nach dem ersten Test stattfindet.

c) Mögliche Maßnahmen nach dem Test: Reagiert ein Tier beim VSV-Nachweisverfahren positiv, so kommt kein Tier in der Quarantänestation für eine Einfuhr in die EU in Frage.

a) Testverfahren: Der ELISA, der Virusneutralisationstest oder andere anerkannte Testmethoden gemäß den in den einschlägigen Kapiteln des OIE-Handbuchs beschriebenen Protokollen.

b) Zeitplan: Die Tiere müssen zwei Mal getestet werden, wobei der erste Test innerhalb von zwei Tagen nach ihrer Einstellung in die Quarantänestation und der zweite frühestens 42 Tage nach dem ersten Test stattfindet.

c) Mögliche Maßnahmen nach dem Test: Reagiert ein Tier im RTFV-Nachweisverfahren positiv, so kommt kein Tier in der Quarantänestation für eine Einfuhr in die EU in Frage.

a) Testverfahren: Serologische Nachweisverfahren (ELISA, Virusneutralisationstest oder andere anerkannte Testmethoden gemäß den in den einschlägigen Kapiteln des OIE-Handbuchs beschriebenen Protokollen).

b) Zeitplan: Die Tiere müssen zwei Mal getestet werden, wobei der erste Test innerhalb von zwei Tagen nach ihrer Einstellung in die Quarantänestation und der zweite frühestens 42 Tage nach dem ersten Test stattfindet.

c) Mögliche Maßnahmen nach dem Test: Reagiert ein Tier im LSDV-Nachweisverfahren positiv, so kommt kein Tier in der Quarantänestation für eine Einfuhr in die EU in Frage.

a) Testverfahren: ELISA, Virusneutralisationstest, Immunofluoreszenztest oder andere anerkannte Testmethoden.

b) Zeitplan: Die Tiere müssen zwei Mal getestet werden, wobei der erste Test innerhalb von zwei Tagen nach ihrer Einstellung in die Quarantänestation und der zweite frühestens 42 Tage nach dem ersten Test stattfindet.

c) Mögliche Maßnahmen nach dem Test: Zeigt ein Tier Anzeichen einer Exposition gegenüber dem Erreger des hämorrhagischen Krim-Kongo-Fiebers, so wird es aus der Gruppe ausgeschlossen.

a) Testverfahren: Der Parasit kann in konzentrierten Butproben gemäß den in den einschlägigen Kapiteln des OIE-Handbuchs beschriebenen Protokollen nachgewiesen werden.

b) Zeitplan: Die Tiere müssen zwei Mal getestet werden, wobei der erste Test innerhalb von zwei Tagen nach ihrer Einstellung in die Quarantänestation und der zweite frühestens 42 Tage nach dem ersten Test stattfindet.

c) Mögliche Maßnahmen nach dem Test: Werden bei einem Tier Anzeichen von T. evansi festgestellt, so wird es aus der Gruppe ausgeschlossen. Die verbleibende Gruppe sollte innerlich und äußerlich mit geeigneten Mitteln antiparasitär behandelt werden.

a) Testverfahren: Der Nachweis viraler DNA zur Erregeridentifizierung durch Immunofluoreszenz oder Immunozytochemie nach den in den einschlägigen Abschnitten des OIE-Handbuchs beschriebenen Protokollen ist die gängigste Methode.

b) Zeitplan: Die Tiere müssen zwei Mal getestet werden, wobei der erste Test innerhalb von zwei Tagen nach ihrer Einstellung in die Quarantänestation und der zweite frühestens 42 Tage nach dem ersten Test stattfindet.

c) Mögliche Maßnahmen nach dem Test: Zeigt ein Tier Anzeichen einer Exposition gegenüber dem Katarrhalfiebererreger, so wird die gesamte Gruppe von der Ausfuhr in die EU ausgeschlossen.

a) Testverfahren: AGID-Test oder Blocking-ELISA nach den im OIE-Handbuch beschriebenen Protokollen.

b) Zeitplan: Die Tiere müssen zwei Mal getestet werden, wobei der erste Test innerhalb von zwei Tagen nach ihrer Einstellung in die Quarantänestation und der zweite frühestens 42 Tage nach dem ersten Test stattfindet.

c) Mögliche Maßnahmen nach dem Test: Tiere mit positiver Testreaktion werden aus der Gruppe ausgeschlossen, und die verbleibenden Tiere sind frühestens 21 Tage nach dem ersten positiven Test einem Wiederholungstest zu unterziehen, der in diesem Falle als erster Test gemäß Buchstabe b) anzusehen ist.

a) Das Ausfuhrland stellt die Veterinärbescheinigungen nach den in Anhang II Teil 2 für das betreffende Fleisch vorgesehenen Mustern aus. Die Bescheinigungen enthalten (in der im Muster vorgegebenen Reihenfolge) die für das betreffende Drittland verlangten amtlichen Bestätigungen sowie gegebenenfalls die für das Ausfuhrdrittland oder ein Gebiet des Ausfuhrdrittlands verlangten zusätzlichen Garantien.

b) Für Fleisch, das nur aus einem der Gebiete gemäß Anhang II Teil 1 Spalten 2 und 3 ausgeführt und in ein und demselben Eisenbahnwaggon, Lastkraftwagen, Flugzeug oder Schiff an ein und denselben Bestimmungsort befördert wird, ist eine einzige, separate Bescheinigung auszustellen.

c) Das Bescheinigungsoriginal besteht aus einem einzelnen Blatt, beidseitig bedruckt oder, soweit mehr Text erforderlich ist, so formatiert, dass alle erforderlichen Seiten ein einheitliches, zusammenhängendes Ganzes bilden.

d) Die Bescheinigung ist in mindestens einer der Amtssprachen des Mitgliedstaats, in dem die Grenzkontrolle stattfindet, und des Bestimmungsmitgliedstaats auszustellen. Diese Mitgliedstaaten können jedoch, wenn dies für erforderlich gehalten wird, andere Sprachen zulassen, soweit eine offizielle Übersetzung beiliegt.

e) Werden der Bescheinigung zwecks Identifizierung der die Sendung ausmachenden Waren (Stückverzeichnis gemäß Ziffer 8.3 der Musterbescheinigung) zusätzliche Seiten beigefügt, so gelten auch diese als Teil des Bescheinigungsoriginals, und jede einzelne dieser Seiten muss mit Unterschrift und Stempel des bescheinigungsbefugten amtlichen Tierarztes versehen sein.

f) Umfasst die Bescheinigung, einschließlich zusätzlicher Stückverzeichnisse gemäß Buchstabe e), mehrere Seiten, so ist jede Seite am Seitenende als Seite … (Seite 1, 2, 3 usw.) von … (Gesamtseitenzahl) zu nummerieren und trägt am Seitenkopf die von der zuständigen Behörde zugeteilte Codenummer.

g) Das Bescheinigungsoriginal ist innerhalb von 24 Stunden vor dem Verladen der Sendung zwecks Ausfuhr in die Gemeinschaft von einem amtlichen Tierarzt auszufüllen und zu unterzeichnen. Dabei tragen die zuständigen Behörden des Ausfuhrlandes dafür Sorge, dass die angewandten Bescheinigungsvorschriften den diesbezüglichen Vorschriften der Richtlinie 96/93/EG des Rates gleichwertig sind.

Die Unterschrift muss sich farblich von der Druckfarbe der Bescheinigung absetzen. Diese Vorschrift gilt auch für Amtssiegel, bei denen es sich nicht um Trockenstempel oder ein Wasserzeichen handelt.

h) Das Bescheinigungsoriginal muss die Sendung bis zur Ankunft an der Grenzkontrollstelle der Gemeinschaft begleiten.