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Document 32019R1390

Verordnung (EU) 2019/1390 der Kommission vom 31. Juli 2019 zur Änderung — zwecks Anpassung an den technischen Fortschritt — des Anhangs der Verordnung (EG) Nr. 440/2008 zur Festlegung von Prüfmethoden gemäß der Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe (REACH) (Text von Bedeutung für den EWR)

OJ L 247, 26.9.2019, p. 1–508 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2019/1390/oj

26.9.2019   

DE

Amtsblatt der Europäischen Union

L 247/1


VERORDNUNG (EU) 2019/1390 DER KOMMISSION

vom 31. Juli 2019

zur Änderung — zwecks Anpassung an den technischen Fortschritt — des Anhangs der Verordnung (EG) Nr. 440/2008 zur Festlegung von Prüfmethoden gemäß der Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe (REACH)

(Text von Bedeutung für den EWR)

DIE EUROPÄISCHE KOMMISSION —

gestützt auf den Vertrag über die Arbeitsweise der Europäischen Union,

gestützt auf die Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 18. Dezember 2006 zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe (REACH), zur Schaffung einer Europäischen Chemikalienagentur, zur Änderung der Richtlinie 1999/45/EG und zur Aufhebung der Verordnung (EWG) Nr. 793/93 des Rates, der Verordnung (EG) Nr. 1488/94 der Kommission, der Richtlinie 76/769/EWG des Rates sowie der Richtlinien 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/EG und 2000/21/EG der Kommission (1), insbesondere auf Artikel 13 Absatz 2,

in Erwägung nachstehender Gründe:

(1)

In der Verordnung (EG) Nr. 440/2008 der Kommission (2) sind die zum Zwecke der Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 anzuwendenden Prüfmethoden zur Bestimmung der physikalisch-chemischen Eigenschaften, der Toxizität und der Ökotoxizität von Chemikalien festgelegt.

(2)

Für die Prüfung von Chemikalien zu Regulierungszwecken erarbeitet die Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) harmonisierte und international vereinbarte Prüfrichtlinien. Unter Berücksichtigung des wissenschaftlichen Fortschritts in diesem Bereich veröffentlicht die OECD regelmäßig neue und überarbeitete Prüfrichtlinien.

(3)

Um dem technischen Fortschritt Rechnung zu tragen und nach Möglichkeit die Zahl der für Versuchszwecke verwendeten Tiere gemäß Artikel 13 Absatz 2 der Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 zu verringern, sollten nach der Annahme der einschlägigen OECD-Prüfrichtlinien zwei neue Prüfmethoden zur Bewertung der Ökotoxizität sowie neun neue Prüfmethoden zur Bestimmung der Toxizität für die menschliche Gesundheit festgelegt und sieben Prüfmethoden aktualisiert werden. Elf dieser Prüfmethoden betreffen In-vitro-Prüfungen auf Reizung/Verätzung der Haut und der Augen, Sensibilisierung der Haut, Genotoxizität und endokrine Effekte. Die Interessenträger wurden zu der vorgeschlagenen Änderung konsultiert.

(4)

Die Verordnung (EG) Nr. 440/2008 sollte daher entsprechend geändert werden.

(5)

Die in dieser Verordnung vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des nach Artikel 133 der Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 eingesetzten Ausschusses —

HAT FOLGENDE VERORDNUNG ERLASSEN:

Artikel 1

Der Anhang der Verordnung (EG) Nr. 440/2008 wird nach Maßgabe des Anhangs der vorliegenden Verordnung geändert.

Artikel 2

Diese Verordnung tritt am zwanzigsten Tag nach ihrer Veröffentlichung im Amtsblatt der Europäischen Union in Kraft.

Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmittelbar in jedem Mitgliedstaat.

Brüssel, den 31. Juli 2019.

Für die Kommission

Der Präsident

Jean-Claude JUNCKER


(1)  ABl. L 396 vom 30.12.2006, S. 1.

(2)  Verordnung (EG) Nr. 440/2008 der Kommission vom 30. Mai 2008 zur Festlegung von Prüfmethoden gemäß der Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe (REACH) (ABl. L 142 vom 31.5.2008, S. 1).


ANHANG

Der Anhang der Verordnung (EG) Nr. 440/2008 wird wie folgt geändert:

(1)

In Teil B erhält Kapitel B.4 folgende Fassung:

„B.4   AKUTE HAUTREIZUNG/-VERÄTZUNG

EINLEITUNG

1.

Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 404 (2015). Die OECD-Richtlinien für die Prüfung von Chemikalien werden regelmäßig überprüft, um sicherzustellen, dass sie auf den besten verfügbaren wissenschaftlichen Erkenntnissen beruhen. Bei der Prüfung der OECD TG 404 wurde besonderes Augenmerk auf mögliche Verbesserungen im Hinblick auf Belange des Tierschutzes und auf die Auswertung aller bereits vorhandenen Angaben über die Chemikalie gelegt, um unnötige Versuche an Labortieren zu vermeiden. Die aktualisierte Fassung der OECD TG 404 (1981 ursprünglich angenommen und 1992, 2002 und 2015 geändert) enthält Verweise auf das IATA-Leitliniendokument (Integrated Approaches to Testing and Assessment = integrierte Prüfungs- und Bewertungsansätze) zu Hautreizungen/-verätzungen (1), in dem ein modularer Ansatz für Prüfungen auf Hautreizungen und -verätzungen vorgeschlagen wird. Die IATA beschreiben mehrere Module, in denen Informationsquellen und Analyseinstrumente zu Gruppen zusammengefasst werden. Sie enthalten i) Leitlinien dazu, wie vorhandene Daten aus Versuchen und aus anderen Quellen integriert und verwendet werden können, um das Hautreizungs- und das Hautverätzungspotenzial von Chemikalien zu bewerten, und ii) einen Vorschlag zur Durchführung ggf. erforderlicher weiterer Versuche (1). Zudem wird in dieser Leitlinie empfohlen, beim In-vivo-Vorversuch erforderlichenfalls die drei Mullläppchen, mit denen die Prüfchemikalie aufgetragen wird, nacheinander und nicht gleichzeitig am Körper des Tieres zu fixieren.

2.

Definitionen der Begriffe Hautreizung und Hautverätzung sind der Anlage zu dieser Prüfmethode zu entnehmen.

AUSGANGSÜBERLEGUNGEN

3.

Im Interesse wissenschaftlicher Verlässlichkeit und des Tierschutzes sollten In-vivo-Prüfungen erst dann in Erwägung gezogen werden, wenn alle für das Hautverätzungs-/-reizungspotenzial der Prüfchemikalie verfügbaren einschlägigen Daten auf Basis ihrer Beweiskraft (weight-of-evidence, WoE) ausgewertet worden sind, wie in den integrierten Prüfungs- und Bewertungsansätzen für Hautverätzungen und -reizungen (d. h. in den drei Teilen dieses Leitliniendokuments und in den betreffenden Modulen) beschrieben (1). In Teil 1 werden vorhandene Daten in sieben Modulen unter Berücksichtigung von Humandaten, In-vivo-Daten, In-vitro-Daten und Daten zu physikalisch-chemischen Eigenschaften (pH-Wert, insbesondere starke Azidität oder Alkalität, usw.) sowie von Daten behandelt, die nicht auf der Verwendung von Prüfmethoden beruhen. In Teil 2 wird die Durchführung einer WoE-Analyse beschrieben. Wenn diese WoE-Analyse noch nicht zu einem schlüssigen Ergebnis führt, sollten weitere Prüfungen durchgeführt werden, wie in Teil 3 beschrieben. Dabei sollte mit In- vitro-Methoden begonnen werden. In-vivo-Prüfungen sollten erst als letzte Möglichkeit in Betracht gezogen werden. Diese Analyse soll somit dazu führen, dass weniger In-vivo-Prüfungen zum Hautverätzungs-/-reizungspotenzial von Prüfchemikalien durchgeführt werden, wenn aus anderen Studien zu diesen beiden Endpunkten bereits ausreichende Belege verfügbar sind.

PRINZIP DER IN-VIVO-PRÜFUNG

4.

Die Prüfchemikalie wird in einmaliger Dosierung auf die Haut eines Versuchstiers aufgetragen; nicht behandelte Hautareale dienen als Kontrolle. Der Grad der Reizung/Verätzung wird in zuvor festgelegten Zeitabständen bestimmt und bewertet und anschließend beschrieben, um eine umfassende Beurteilung der Wirkung vornehmen zu können. Die Beobachtungsdauer sollte ausreichend sein, um die Reversibilität bzw. Irreversibilität der Wirkungen vollständig zu erfassen,

5.

Tiere mit starken und anhaltenden Anzeichen von Leiden und/oder Schmerzen sollten jederzeit während des Versuchs human getötet werden, wobei die Prüfchemikalie entsprechend einzustufen ist. Kriterien für die Entscheidung über die humane Tötung moribunder Tiere mit starken Leidensanzeichen sind Gegenstand eines gesonderten Leitfadens (2).

VORBEREITUNG DER IN-VIVO-PRÜFUNG

Auswahl von Versuchstierarten

6.

Das bevorzugte Labortier ist das Albino-Kaninchen. Für diese Prüfung sind gesunde junge geschlechtsreife Kaninchen zu verwenden. Die Verwendung anderer Spezies ist zu begründen.

Vorbereitung der Versuchstiere

7.

Etwa 24 Stunden vor dem Versuch wird das Fell auf dem Rücken der Versuchstiere gründlich geschoren. Dabei ist darauf zu achten, dass die Haut nicht verletzt wird. Es sind nur Tiere mit gesunder, unverletzter Haut zu verwenden.

8.

Einige Kaninchenrassen haben Stellen mit dichtem Fellbewuchs, die zu bestimmten Zeiten im Jahr deutlicher hervortreten. An diesen Stellen sollte keine Prüfung durchgeführt werden.

Haltungs- und Fütterungsbedingungen

9.

Die Tiere sollten einzeln gehalten werden. Die Temperatur im Versuchstierraum sollte für Kaninchen 20 °C (± 3 °C) betragen. Obwohl die relative Luftfeuchtigkeit mindestens 30 % betragen und außer bei der Reinigung vorzugsweise nicht über 70 % liegen sollte, ist ein Wert von 50-60 % anzustreben. Für die Beleuchtung ist Kunstlicht zu verwenden und so zu schalten, dass sich 12 Stunden Licht mit 12 Stunden Dunkelheit abwechseln. An die Versuchstiere kann herkömmliches Laborfutter verfüttert werden, wobei eine unbegrenzte Trinkwasserversorgung zu gewährleisten ist.

PRÜFVERFAHREN

Applikation der Prüfchemikalie

10.

Die Prüfchemikalie sollte auf eine kleine Hautfläche (etwa 6 cm2) aufgetragen und mit einem Mullläppchen abgedeckt werden, das mit einem nicht reizenden Pflaster fixiert wird. Wenn eine direkte Applikation nicht möglich ist (z. B. bei Flüssigkeiten oder bestimmten Pasten), sollte die Prüfchemikalie zunächst auf das Mullläppchen gegeben werden, das anschließend auf der Haut fixiert wird. Für die Dauer der Exposition sollte das Läppchen mit einem geeigneten Semi-Okklusiv-Verband lose auf der Haut gehalten werden. Wird die Prüfchemikalie auf ein Läppchen aufgebracht, so ist dieses so auf der Haut zu fixieren, dass ein guter Hautkontakt und die gleichmäßige Verteilung der Prüfchemikalie auf der Haut gewährleistet sind. Es ist dafür zu sorgen, dass das Tier nicht an das Mullläppchen gelangt und die Prüfchemikalie nicht oral aufnehmen oder inhalieren kann.

11.

Flüssige Prüfchemikalien werden gewöhnlich unverdünnt verwendet. Wird der Versuch mit Feststoffen durchgeführt (die im Bedarfsfall pulverisiert werden können), sollte die Prüfchemikalie mit gerade so viel Wasser (bzw. gegebenenfalls mit einem anderen geeigneten Vehikel) angefeuchtet werden, dass ein guter Kontakt mit der Haut sichergestellt ist. Bei Verwendung eines anderen Vehikels als Wasser sollte dessen möglicher Einfluss auf eine Reizung der Haut durch die Prüfchemikalie minimal sein.

12.

Nach Ablauf der Expositionszeit, die in der Regel 4 Stunden beträgt, wird die restliche Prüfchemikalie möglichst mit Wasser oder einem geeigneten Lösungsmittel entfernt, ohne die bestehende Reaktion oder die Integrität der Epidermis zu beeinträchtigen.

Dosierung

13.

Bei Flüssigkeiten werden 0,5 ml und bei Feststoffen oder Pasten 0,5 g auf die vorbereitete Hautstelle aufgetragen.

Vorversuch (In-vivo-Prüfung auf Hautreizung/-verätzung an einem Tier)

14.

Wenn eine Prüfchemikalie aufgrund einer WoE-Analyse oder früherer In-vitro-Prüfungen entweder als ätzend oder reizend oder als nicht klassifiziert eingestuft wurde, sind weitere In-vivo-Prüfungen im Allgemeinen nicht erforderlich. Erscheint allerdings die Ermittlung zusätzlicher Daten gerechtfertigt, wird die In-vivo-Prüfung zunächst mit nur einem Versuchstier wie im Folgenden beschrieben durchgeführt. Dem Tier werden dann bis zu drei Mullläppchen nacheinander appliziert. Das erste Läppchen wird nach drei Minuten entfernt. Wird keine schwere Hautreaktion festgestellt, wird ein zweites Läppchen an einer anderen Stelle appliziert, das nach einer Stunde entfernt wird. Lassen die Beobachtungen zu diesem Zeitpunkt den Schluss zu, dass eine Exposition für die Dauer von vier Stunden ethisch verantwortbar ist, wird ein drittes Läppchen appliziert und nach vier Stunden entfernt. Anschließend wird die Reaktion bewertet.

15.

Der Versuch wird sofort abgebrochen, falls nach einer der drei sequenziellen Expositionen eine ätzende Wirkung beobachtet wird. Ist nach der Entfernung des letzten Läppchens keine Verätzung feststellbar, wird das Tier 14 Tage lang beobachtet, sofern nicht vor Ablauf dieser Zeit Verätzungen auftreten.

16.

Geht man davon aus, dass die Prüfchemikalie zwar keine hautätzende Wirkung hat, aber Hautreizungen hervorrufen kann, sollte nur ein Tier verwendet werden, dem ein einziges Läppchen für die Dauer von vier Stunden appliziert wird.

Bestätigungsprüfung (In-vivo-Prüfung auf hautreizende Wirkungen an zusätzlichen Tieren)

17.

Wird im Vorversuch keine ätzende Wirkung beobachtet, sollte die Reizungsreaktion bzw. die negative Reaktion an bis zu zwei weiteren Tieren mit jeweils einem Läppchen bei einer Expositionsdauer von vier Stunden bestätigt werden. Ergibt der Vorversuch eine Reizungswirkung, kann die Bestätigungsprüfung als sequenzieller Versuch bzw. durch gleichzeitige Exposition von zwei weiteren Tieren durchgeführt werden. Findet ausnahmsweise kein Vorversuch statt, können zwei bzw. drei Tiere mit einem Läppchen behandelt werden, das nach vier Stunden entfernt wird. Bei Verwendung von zwei Versuchstieren, die beide die gleiche Reaktion zeigen, erübrigen sich weitere Untersuchungen. Andernfalls wird auch das dritte Tier geprüft. Unklare Reaktionen könnten möglicherweise bewertet werden, indem Versuche mit weiteren Tieren durchgeführt werden.

Beobachtungszeitraum

18.

Der Beobachtungszeitraum sollte so bemessen sein, dass die Reversibilität der festgestellten Wirkungen vollständig bewertet werden kann. Allerdings sollte der Versuch abgebrochen werden, sobald das betreffende Tier starke und anhaltende Anzeichen von Leiden und Schmerzen zeigt. Um feststellen zu können, ob die Wirkungen reversibel sind, sollten die Tiere für die Dauer von bis zu 14 Tagen nach Entfernung der Läppchen beobachtet werden. Bilden sich die Schäden vor Ablauf dieser 14 Tage zurück, sollte der Versuch zum betreffenden Zeitpunkt beendet werden.

Klinische Beobachtungen und Bewertung von Hautreaktionen

19.

Die Tiere sind auf Anzeichen von Hautrötungen und Ödemen zu untersuchen, wobei die Reaktion 60 Minuten sowie 24, 48 und 72 Stunden nach Entfernen des Läppchens bewertet wird. Beim Vorversuch an einem Tier wird die behandelte Stelle auch unmittelbar nach Entfernen des Läppchens untersucht. Die Hautreaktionen werden bewertet und anhand der Punkteskala in der unten stehenden Tabelle dokumentiert. Bei Hautschädigungen, die nach 72 Stunden weder als Reizung noch als Verätzung eingestuft werden können, ist unter Umständen die Beobachtung bis zum 14. Tag erforderlich, um Aussagen zur Reversibilität der Wirkungen treffen zu können. Neben Hautreizungen sollten alle lokal begrenzten toxischen Wirkungen (z. B. Entfettung der Haut) und alle negativen systemischen Wirkungen (z. B. klinische Anzeichen für Toxizität und Veränderungen des Körpergewichts) vollständig beschrieben und dokumentiert werden. Unklare Reaktionen sollen gegebenenfalls durch eine histopathologische Untersuchung abgeklärt werden.

20.

Die Bewertung von Hautreaktionen ist zwangsläufig subjektiv. Um die Einstufung von Hautreaktionen stärker zu vereinheitlichen und den Prüflabors und allen an den Versuchen und an der Auswertung der Versuchsergebnisse Beteiligten die Arbeit zu erleichtern, müssen die Prüfer im Umgang mit der Bewertungsskala (siehe unten stehende Tabelle) entsprechend geschult werden. Dabei könnte sich ein Leitfaden mit Abbildungen zur Bewertung von Hautreizungen und anderen Schädigungen als hilfreich erweisen (3).

DATEN UND BERICHTERSTATTUNG

21.

Die Untersuchungsergebnisse sollten im Abschlussbericht in Tabellenform dargestellt werden und alle in Nummer 24 genannten Punkte umfassen.

Auswertung der Ergebnisse

22.

Die Bewertung der Hautreizung sollte anhand der Art und des Schweregrads der Schädigung und deren Reversibilität bzw. Irreversibilität vorgenommen werden. Die einzelnen ermittelten Schweregrade stellen keinen allein gültigen Maßstab für die reizenden Eigenschaften eines Stoffs dar, denn es werden auch andere Effekte der Prüfchemikalie beurteilt. Vielmehr sollten diese einzelnen Graduierungswerte als Referenzwerte betrachtet werden, die zusammen mit allen anderen Ergebnissen der Studie zu beurteilen sind.

23.

Bei der Bewertung von hautreizenden Reaktionen spielt auch die Reversibilität der Hautschädigung eine Rolle. Treten Reaktionen wie (begrenzter) Haarausfall, Hyperkeratose, Hyperplasie und Schuppung bis zum Ende des 14-tägigen Beobachtungszeitraums auf, ist die Prüfchemikalie als hautreizende Chemikalie zu betrachten.

Prüfbericht

24.

Der Prüfbericht muss die folgenden Angaben enthalten:

 

Begründung für die In-vivo-Prüfung:

WoE-Analyse von Daten aus früheren Versuchen unter Einbeziehung von Ergebnissen aus der sequenziellen Prüfstrategie;

Beschreibung aller einschlägigen Daten aus früheren Versuchen;

Daten, die in den einzelnen Stufen der Prüfstrategie erhoben wurden;

Beschreibung der durchgeführten In-vitro-Prüfungen mit Einzelheiten zu den angewendeten Verfahren sowie zu den Ergebnissen für Prüf-/Referenzstoffe;

WoE-Analyse als Grundlage für die Durchführung einer In-vivo-Studie.

 

Prüfchemikalie:

Einkomponentiger Stoff: chemische Bezeichnung, wie z. B. IUPAC- oder CAS-Bezeichnung, CAS-Nummer, SMILES- oder InChI-Code, Strukturformel, Reinheit, chemische Zusammensetzung von Verunreinigungen, soweit zutreffend und praktisch durchführbar, usw.

Mehrkomponentiger Stoff: Gemische und Stoffe mit unbekannter oder schwankender Zusammensetzung, komplexe Reaktionsprodukte oder biologische Materialien (UVCB): so weit wie möglich charakterisiert durch die chemische Zusammensetzung (siehe oben), das quantitative Vorkommen und die relevanten physikalisch-chemischen Eigenschaften der einzelnen Komponenten;

physikalisches Erscheinungsbild, Wasserlöslichkeit und weitere relevante physikalisch-chemische Eigenschaften;

Herkunft, Chargennummer, sofern vorhanden;

Behandlung der Prüfchemikalien/Kontrollstoffe vor der Prüfung, sofern relevant (z. B. Erwärmen, Mahlen);

Stabilität der Prüfchemikalie, letztes Verwendungsdatum oder Datum für erneute Analyse, soweit bekannt;

Lagerungsbedingungen.

 

Vehikel:

Angaben zur Identität, (gegebenenfalls) Konzentration; Einsatzvolumen;

Begründung der Auswahl des Vehikels.

 

Versuchstier(e):

verwendete Spezies/Rasse, Begründung für den Verzicht auf die Verwendung von Albino- Kaninchen und die Nutzung anderer Tiere;

Anzahl der Versuchstiere pro Geschlecht;

Gewicht der einzelnen Tiere bei Versuchsbeginn und -ende;

Alter der Tiere bei Beginn der Studie;

Herkunft der Tiere, Haltungsbedingungen, Futter usw.

 

Prüfbedingungen:

Methode der Vorbereitung der Applikationsstelle;

Angaben zur Art der verwendeten Läppchen sowie zur Patching-Technik;

Angaben zur Herstellung, Applikation und Entfernung der Prüfchemikalie.

 

Ergebnisse:

Tabellarische Erfassung der Bewertung des Schweregrades von Hautreizungs-/-verätzungsreaktionen zu allen Messzeitpunkten für jedes einzelne Versuchstier;

Beschreibungen aller beobachteten Schädigungen;

ausführliche Beschreibung von Art und Schwere der festgestellten Hautreizung bzw. -verätzung sowie Angaben zu eventuellen histopathologischen Befunden;

Beschreibung anderer lokal begrenzter negativer (z. B. Entfettung der Haut) und systemischer Wirkungen neben den Hautreizungen bzw. -verätzungen.

 

Diskussion der Ergebnisse

 

Schlussfolgerungen

LITERATUR

(1)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung, Paris.

(2)

OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 19), Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung, Paris.

Tabelle

Bewertung Von Hautreaktionen

Kein Erythem…

0

Sehr leichtes Erythem (kaum wahrnehmbar)…

1

Klar abgegrenztes Erythem…

2

Mäßiges bis ausgeprägtes Erythem…

3

Ausgeprägtes Erythem (dunkelrot) bis hin zur Schorfbildung, so dass eine Bewertung nicht möglich ist…

4

Höchstmögliche Punktzahl: 4

Kein Ödem…

0

Sehr leichtes Ödem (kaum wahrnehmbar)…

1

Leichtes Ödem (Ränder des betroffenen Areals durch deutliche Schwellung klar abgegrenzt)…

2

Mäßiges Ödem (Schwellung etwa 1 mm)…

3

Ausgeprägtes Ödem (Schwellung mehr als 1 mm und über den Expositionsbereich hinaus)…

4

Höchstmögliche Punktzahl: 4

Zur Klärung unklarer Reaktionen kann eine histopathologische Untersuchung erfolgen.

Anlage

BEGRIFFSBESTIMMUNGEN

Chemikalie: Ein Stoff oder Gemisch.

Hautreizung: Das Auslösen einer reversiblen Hautschädigung nach Applikation einer Prüfchemikalie für die Dauer von bis zu 4 Stunden.

Hautverätzung: Das Auslösen einer irreversiblen Hautschädigung, d. h. einer sichtbaren, bis in das Corium reichenden Nekrose der Epidermis nach Applikation einer Prüfchemikalie für die Dauer von bis zu 4 Stunden. Verätzungsreaktionen sind gekennzeichnet durch Geschwüre, Blutungen, blutige Verschorfungen und am Ende des Beobachtungszeitraums von 14 Tagen durch eine auf ein Ausbleichen der Haut zurückzuführende Verfärbung, komplett haarlose Bereiche und Narben. Bei der Beurteilung fragwürdiger Schädigungen ist die Histopathologie mit zu berücksichtigen.

Prüfchemikalie: Ein beliebiger Stoff oder eine beliebige Mischung, der/die nach dieser Methode geprüft wird.

(2)

In Teil B erhält Kapitel B.17 folgende Fassung:

„B.17    IN VITRO-GENMUTATIONSPRÜFUNG AN SÄUGETIERZELLEN ANHAND DES HPRT- UND DES XPRT-GENS

EINLEITUNG

1.

Diese Prüfmethode (PM) entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 476 (2016). Die Prüfmethoden werden regelmäßig überarbeitet, um dem wissenschaftlichen Fortschritt, sich ändernden Rechtsvorgaben und Belangen des Tierschutzes gerecht zu werden. Diese überarbeitete Fassung der Prüfmethode B.17 beruht auf fast 30-jähriger Erfahrung mit dieser Prüfung sowie auf der Entwicklung einer eigenen neuen Methode für In-vitro-Genmutationsprüfungen an Säugetierzellen anhand des Thymidin-Kinase-Gens. Sie ist Teil einer Reihe von Prüfmethoden zur genetischen Toxikologie. Die OECD hat ein Dokument erstellt, das kurz gefasste und hilfreiche Informationen zu Untersuchungen zur genetischen Toxikologie sowie eine Übersicht über die jüngsten Änderungen der OECD-Prüfrichtlinien zur genetischen Toxikologie enthält (1).

2.

Die In-vitro-Genmutationsprüfung an Säugetierzellen wird zum Nachweis von chemisch induzierten Genmutationen verwendet. Mit den bei dieser Prüfung verwendeten Zelllinien werden Vorwärtsmutationen in Reporter-Genen gemessen, insbesondere im endogenen Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Gen (Hprt bei Zelllinien von Nagern und HPRT bei menschlichen Zellen, bei dieser Prüfmethode gemeinsam als Hprt-Gen und als HPRT-Prüfung bezeichnet) und im Transgen von Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (gpt) (im Folgenden XPRT-Prüfung genannt). Durch die HPRT- und XPRT-Mutationsprüfung lassen sich unterschiedliche Spektren genetischer Ereignisse ermitteln. Neben den mit der HPRT-Prüfung nachgewiesenen Mutationsereignissen (z. B. Basenpaarsubstitutionen, Rasterverschiebungen, kleine Deletionen und Insertionen) kann die Autosomenlokation des gpt-Transgens den Nachweis von Mutationen infolge umfangreicher Deletionen und u. U. mitotischer Rekombinationen ermöglichen, die in der HPRT-Prüfung nicht erkannt wurden, weil das Hprt-Gen sich auf dem X-Chromosom befindet (2) (3) (4) (5) (6) (7). Aus rechtlichen Gründen ist die XPRT-Prüfung gegenwärtig weniger verbreitet als die HPRT-Prüfung.

3.

Es gelten die Begriffsbestimmungen in Anlage 1.

AUSGANGSÜBERLEGUNGEN UND BEGRENZUNGEN

4.

In vitro durchgeführte Prüfungen erfordern in der Regel den Zusatz eines exogenen Fremdstoff-Metabolisierungssystems. Mit diesem exogenen Stoffwechselaktivierungssystem lassen sich die In-vivo-Bedingungen jedoch nicht gänzlich nachvollziehen.

5.

Es sind unbedingt Bedingungen zu vermeiden, die zu künstlich verursachten Positivergebnissen führen könnten (d. h. mögliche Wechselwirkungen mit dem Prüfsystem), die nicht von einer direkten Interaktion zwischen den Prüfchemikalien und dem genetischen Material der Zelle herrühren; zu solchen Bedingungen gehören Veränderungen des pH-Wertes bzw. der Osmolalität (8) (9) (10), eine Interaktion mit einzelnen Komponenten des Mediums (11) (12) oder eine hochgradige Zytotoxizität (13). Zytotoxizitätswerte, die die empfohlenen Höchstwerte nach Nummer 19 überschreiten, werden mit Blick auf die HPRT-Prüfung als zu hoch betrachtet.

6.

Bevor die Prüfmethode an einem Gemisch für die Generierung von Daten für einen bestimmten Regulierungszweck verwendet wird, ist zu prüfen, ob sie für den beabsichtigten Zweck angemessene Ergebnisse liefern kann und, wenn dem so ist, warum. Solche Erwägungen entfallen, wenn die Prüfung des Gemischs gesetzlich vorgeschrieben ist.

PRINZIP DER PRÜFMETHODE

7.

Mutierte Zellen, bei denen in der HPRT-Prüfung keine Aktivität des Hprt-Enzyms bzw. in der XPRT-Prüfung keine Aktivität des xprt-Enzyms nachgewiesen wird, sind resistent gegenüber den zytostatischen Wirkungen des purinanalogen 6-Thioguanins (TG). Bei Anwesenheit von Hprt (bei der HPRT-Prüfung) bzw. von gpt (bei der XPRT-Prüfung) sind Zellen hingegen empfindlich gegenüber TG, das die Hemmung des Zellstoffwechsels verursacht und eine weitere Zellteilung verhindert. So können die Mutantenzellen bei Anwesenheit von TG proliferieren, während die normalen Zellen, die das Hprt-Enzym (bei der HPRT-Prüfung) bzw. das gpt-Enzym (bei der XPRT-Prüfung) enthalten, nicht dazu in der Lage sind.

8.

Zellen in Suspensions- oder Monoschichtkultur werden über einen angemessenen Zeitraum (3-6 Stunden) mit und ohne exogenes Fremdstoff-Metabolisierungssystem (Nummer 14) mit der Prüfchemikalie behandelt und anschließend subkultiviert, um die Zytotoxizität zu bestimmen und vor der Mutantenselektion die Expression des Phänotyps zu ermöglichen (14) (15) (16) (17). Die Zytotoxizität wird anhand der relativen Überlebensrate (RS). d. h. der Klonierungseffizienz, ermittelt unmittelbar nach der Behandlung und bereinigt um Zellverluste während der Behandlung im Vergleich zur Negativkontrolle bestimmt (Nummer 18 und Anlage 2). Die behandelten Kulturen werden für einen ausreichenden Zeitraum (in der Regel mindestens 7-9 Tage), der für den jeweils gewählten Zelltyp charakteristisch ist, in einem Wachstumsmedium gehalten, um eine annähernd optimale phänotypische Expression der induzierten Mutationen zu ermöglichen. Nach der Expression des Phänotyps wird die Mutantenhäufigkeit bestimmt, indem eine bekannte Anzahl von Zellen auf ein Medium mit dem selektierenden Agens zur Bestimmung der Mutantenkolonien und auf ein Medium ohne selektierendes Agens zur Bestimmung der Klonierungseffizienz (Lebensfähigkeit) aufgeimpft wird. Nach einer geeigneten Inkubationszeit werden die Kolonien gezählt. Die Mutantenhäufigkeit wird anhand der Anzahl der Mutantenkolonien bereinigt um die Klonierungseffizienz bei der Mutantenselektion berechnet.

BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE

Vorbereitungen

Zellen

9.

Die bei der HPRT- und der XPRT-Prüfung verwendeten Zelltypen sollten nachweislich eine Empfindlichkeit für chemische Mutagene, eine hohe Klonierungseffizienz, einen stabilen Karyotyp und eine geringe Spontanmutationshäufigkeit aufweisen. Für die HPRT-Prüfung werden meist die Zelllinien CHO, CHL und V79 des chinesischen Hamsters, Maus-Lymphomazellen L5178Y und menschliche Lymphoblastoidzellen TK6 verwendet (18) (19). Für die XPRT-Prüfung werden AS52-Zellen (CHO-Zellen) mit dem gpt-Transgen (nach Deletion des Hprt-Gens) verwendet (20) (21); die HPRT-Prüfung kann bei AS52-Zellen nicht durchgeführt werden, weil das Hprt-Gen deletiert wurde. Die Verwendung anderer Zelllinien sollte gerechtfertigt und validiert sein.

10.

Zelllinien sind routinemäßig auf Stabilität der modalen Chromosomenzahl und Mycoplasma-Verunreinigung zu überprüfen (22) (23); bei Verunreinigung oder bei veränderter modaler Chromosomenzahl sollten Zellen nicht verwendet werden. Die normale Dauer des Zellzyklus im Prüflabor sollte bekannt sein und mit den veröffentlichten Zelleigenschaften übereinstimmen. Außerdem sollte die Spontanmutationshäufigkeit der Master-Zellenbestände geprüft werden, und bei nicht annehmbarer Mutationshäufigkeit sollten die Bestände nicht verwendet werden.

11.

Vor der Verwendung bei dieser Prüfung sind die Kulturen ggf. von bereits vorhandenen Mutantenzellen zu reinigen, z. B. durch Kultivierung im HAT-Medium bei HPRT-Prüfungen und im MPA-Medium bei der XPRT-Prüfung (5) (24) (siehe Anlage 1). Die gereinigten Zellen können kryokonserviert und anschließend zur Verwendung als Arbeitsstämme wieder aufgetaut werden. Nach Erreichen der normalen Verdopplungszeiten können die frisch aufgetauten Arbeitsstämme für die Prüfungen verwendet werden. Bei Durchführung der XPRT-Prüfung sollten bei Routinekulturen von AS52-Zellen Bedingungen hergestellt werden, bei denen die Erhaltung des gpt-Transgens gewährleistet ist (20).

Medien und Kulturbedingungen

12.

Die Kultivierung erfordert geeignete Kulturmedien und Inkubationsbedingungen (Kulturgefäße, befeuchtete Atmosphäre mit einer CO2-Konzentration von 5 % und eine Inkubationstemperatur von 37 °C). Die Zellkulturen sollten immer unter Bedingungen gehalten werden, bei denen das Wachstum in der Log-Phase sichergestellt ist. Vor allem ist für Medien- und Kulturbedingungen zu sorgen, die ein optimales Zellwachstum während der Expressionszeit und eine optimale Klonierungseffizienz der mutierenden und nichtmutierenden Zellen gewährleisten.

Vorbereitung der Kulturen

13.

Zelllinien werden aus Stammkulturen gewonnen und im Kulturmedium in einer solchen Dichte überimpft, dass die Zellen in Suspensions- oder Monolayerkultur während der Behandlung und der Expressionszeit weiterhin exponentiell wachsen (z. B. sollte eine Konfluenz bei in Monolayerkultur gezüchteten Zellen vermieden werden).

Stoffwechselaktivierung

14.

Bei Zellen mit unzulänglicher endogener Stoffwechselkapazität sollten exogene metabolisierende Systeme verwendet werden. Das gängigste und, sofern nicht anders begründet, standardmäßig empfohlene System, ist eine durch Ko-Faktoren ergänzte post-mitochondriale Fraktion (S9) aus der Leber von Nagern (in der Regel Ratten), die mit enzyminduzierenden Agenzien wie Aroclor 1254 (25) (26) (27) (28) oder einer Kombination aus Phenobarbiton und β-Naphtoflavon (29) (30) (31) (32) vorbehandelt wurde. Das letztgenannte Gemisch verstößt nicht gegen das Stockholmer Übereinkommen über persistente organische Schadstoffe (33) und hat sich bei der Induktion von Mischfunktionsoxidasen als ebenso wirksam wie Aroclor 1254 erwiesen (29) (31). Die S9-Fraktion wird im Endmedium in der Regel in Konzentrationen von 1 bis 2 % v/v verwendet, kann jedoch auf 10 % v/v erhöht werden. Die Wahl der Art und Konzentration des exogenen Metabolisierungssystems oder metabolischen Agens ist möglicherweise von der geprüften Stoffklasse abhängig (34) (35) (36).

Vorbereitung der Prüfchemikalie

15.

Feste Prüfchemikalien sollten vor der Zellbehandlung in geeigneten Lösungsmitteln gelöst und ggf. verdünnt werden (Nummer 16). Flüssige Prüfchemikalien können dem Versuchssystem vor der Behandlung direkt beigegeben und/oder verdünnt werden. Gasförmige oder flüchtige Prüfchemikalien sind durch entsprechende Modifikationen der Standardprotokolle zu prüfen, z. B. durch Behandlung in hermetisch verschlossenen Kulturgefäßen (37) (38). Zubereitungen der Prüfchemikalie sollten kurz vor der Behandlung hergestellt werden, es sei denn, die Stabilität der Chemikalie bei Lagerung wird nachgewiesen.

PRÜFBEDINGUNGEN

Lösungsmittel

16.

Das Lösungsmittel sollte so gewählt werden, dass eine optimale Löslichkeit der Prüfchemikalien gewährleistet ist, ohne dass die Durchführung der Prüfung beeinträchtigt wird, z. B. durch Veränderung des Zellwachstums, Beeinträchtigung der Integrität der Prüfchemikalie, Reaktion mit Kulturgefäßen oder Behinderung des Metabolisierungssystems. Nach Möglichkeit sollte ein wässriges Lösungsmittel (oder Kulturmedium) verwendet werden. Gründlich erprobte Lösungsmittel sind z. B. Wasser und Dimethylsulfoxid. Organische Lösungsmittel sollten 1 % v/v und wässrige Lösungsmittel (Kochsalzlösung oder Wasser) 10 % v/v im Endmedium möglichst nicht überschreiten. Kommen weniger gründlich erprobte Lösungsmittel zur Verwendung (z. B Ethanol oder Aceton), ist deren Verwendung durch Daten zu stützen, die belegen, dass sie mit den Prüfchemikalien und mit dem Prüfsystem verträglich und in der verwendeten Konzentration nicht gentoxisch sind. Sind keine entsprechenden Belege verfügbar, sollten unbedingt unbehandelte Kontrollen (siehe Anlage 1) einbezogen werden, um nachzuweisen, dass durch die gewählten Lösungsmittel keine schädlichen oder mutagenen Wirkungen ausgelöst werden.

Messung der Zytotoxizität und Auswahl der Expositionskonzentrationen

17.

Bei der Bestimmung der höchsten Konzentration der Prüfchemikalie sind Konzentrationen zu vermeiden, die zu künstlich positiven Reaktionen führen können, z. B. zu übermäßiger Zytotoxizität (Nummer 20), Ausfällungen im Kulturmedium (Nummer 21) oder ausgeprägten Veränderungen des pH-Werts oder der Osmolalität (Nummer 5). Sofern die Prüfchemikalie zum Zeitpunkt der Zugabe den pH-Wert des Mediums erheblich verändert, lässt sich der pH-Wert auch durch Anwendung eines Puffers im Endmedium einstellen, damit künstlich positive Reaktionen vermieden und geeignete Kulturbedingungen aufrechterhalten werden.

18.

Die Konzentrationen werden u. a. nach der Zytotoxizität ausgewählt (Nummern 20-22). Wenngleich die Bewertung der Zytotoxizität im Rahmen eines Vorversuchs nützlich sein kann, um eine bessere Bestimmung der im Hauptversuch verwendeten Konzentrationen vornehmen zu können, ist ein Vorversuch nicht erforderlich. Auch wenn die anfängliche Zytotoxizität bewertet wird, ist im Hauptversuch die Zytotoxizität jeder einzelnen Kultur zu messen. Die Zytotoxizität sollte anhand der relativen Überlebensrate (RS) (d. h. der Klonierungseffizienz (CE)) von Zellen ermittelt werden, die nach der Behandlung umgehend plattiert werden; dabei ist eine Bereinigung um Zellverluste während der Behandlung auf der Grundlage der Zellzahl im Vergleich zur bereinigten Klonierungseffizienz bei Negativkontrollen (mit einer Überlebensrate von 100 %) vorzunehmen (Formel siehe Anlage 2).

19.

Es sollten mindestens vier Prüfkonzentrationen (ausgenommen das Lösungsmittel und Positivkontrollen) ausgewertet werden, die die Akzeptanzkriterien erfüllen (geeignete Zytotoxizität, Anzahl der Zellen usw.). Die Verwendung von Zweifachkulturen ist zu empfehlen, doch können für jede überprüfte Konzentration auch Replikat- oder Einfachkulturen herangezogen werden. Die Ergebnisse aus den unabhängigen Replikatkulturen bei einer gegebenen Konzentration sollten getrennt angegeben werden, können zu Datenanalysezwecken aber auch gepoolt werden (17). Bei Prüfchemikalien mit geringer Zytotoxizität oder ohne zytotoxische Wirkung sind in der Regel Konzentrationsintervalle mit zwei- bis dreifacher Konzentration geeignet. Wenn zytotoxische Wirkungen auftreten, sollten die Prüfkonzentrationen einen Bereich ausgehend vom Wert, bei dem die Zytotoxizität deutlich wird, bis zu Konzentrationen mit mäßiger oder geringer oder nicht vorhandener Toxizität umfassen. Viele Prüfchemikalien zeigen steile Konzentrations-Wirkungs-Kurven. Um Daten zu mäßiger oder geringer Toxizität zu erhalten oder um die Dosis-Wirkungs-Beziehungen im Einzelnen auszuwerten, kann es daher erforderlich sein, Konzentrationen mit kleineren Abständen und/oder mehr als vier Konzentrationen zu verwenden, insbesondere in Fällen, in denen ein Wiederholungsversuch erforderlich ist (Nummer 43). Die Verwendung von mehr als 4 Konzentrationen kann besonders bei Verwendung von Einfachkulturen wichtig sein.

20.

Wenn die Höchstkonzentration auf der Zytotoxizität beruht, sollte bei der Höchstkonzentration eine relative Überlebensrate von 10-20 % erreicht werden. Besondere Sorgfalt ist dann geboten, wenn positive Ergebnisse nur bei relativen Überlebensraten von höchstens 10 % zu verzeichnen sind (Nummer 43).

21.

Im Falle schwer löslicher Chemikalien, die bei Konzentrationen unterhalb der niedrigsten unlöslichen Konzentration nicht zytotoxisch sind, sollte die höchste analysierte Konzentration am Ende der Behandlung mit der Prüfchemikalie eine Trübung oder eine mit bloßem Auge oder mithilfe eines Inversmikroskops erkennbare Ausfällung bewirken. Auch wenn die Zytotoxizität oberhalb der niedrigsten unlöslichen Konzentration auftritt, ist es ratsam, nur eine Konzentration zu testen, bei der es zu einer Trübung oder sichtbaren Ausfällung kommt, da künstliche Wirkungen eine Folge dieser Ausfällung sein könnten. Bei der Konzentration, bei der es zu einer Ausfällung kommt, ist unbedingt sicherzustellen, dass die Ausfällung nicht die Durchführung des Versuchs beeinträchtigt. Es ist möglicherweise sinnvoll, die Löslichkeit im Kulturmedium vor dem Versuch zu bestimmen.

22.

Wird keine Ausfällung bzw. keine grenzwertige Zytotoxizität beobachtet, sollte die höchste Versuchskonzentration 10 mM, 2 mg/ml oder 2 μl/ml entsprechen, je nachdem, welcher Wert der niedrigere ist (39) (40). Sofern die Zusammensetzung der Prüfchemikalie nicht genau definiert ist, z. B. ein Stoff mit unbekannter oder schwankender Zusammensetzung, komplexe Reaktionsprodukte oder biologische Materialien (UVCB) (41), Umweltextrakte usw., muss die höchste Konzentration möglicherweise höher angesetzt werden (z. B. bei 5 mg/ml), sofern keine ausreichende Zytotoxizität vorhanden ist, um die Konzentration der einzelnen Bestandteile zu erhöhen. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass diese Anforderungen sich von denen für Humanpharmazeutika unterscheiden können (42).

Kontrollen

23.

Bei allen Versuchsbedingungen sind jeweils gleichzeitige Negativkontrollen (Nummer 16) anzulegen, bei denen das Behandlungsmedium lediglich Lösungsmittel enthält, die ansonsten aber auf die gleiche Weise behandelt wurden wie die Behandlungskulturen.

24.

Gleichzeitige Positivkontrollen müssen angelegt werden, um die Eignung des Labors zum Nachweis von Mutagenen unter den Bedingungen des verwendeten Prüfprotokolls sowie ggf. die Wirksamkeit des exogenen Metabolisierungssystems nachzuweisen. Beispiele für Positivkontrollen sind der folgenden Tabelle 1 zu entnehmen. Es können andere geeignete Positivkontrollstoffe verwendet werden, sofern dies begründet ist. Da In-vitro-Prüfungen an Säugetierzellen auf genetische Toxizität hinreichend standardisiert sind, können Prüfungen anhand von Behandlungen mit und ohne exogene Stoffwechselaktivierung mit einer einzelnen Positivkontrolle durchgeführt werden, bei der eine Stoffwechselaktivierung erforderlich ist. In diesem Fall wird durch die Reaktion einer einzelnen Positivkontrolle sowohl die Aktivität des Stoffwechselaktivierungssystems als auch die Reaktionsfähigkeit des Prüfsystems nachgewiesen. Jede Positivkontrolle sollte bei einer oder mehreren Konzentrationen durchgeführt werden, die voraussichtlich eine reproduzierbare und erkennbare Zunahme gegenüber dem Hintergrund ergeben, womit sich die Empfindlichkeit des Versuchssystems nachweisen lässt, und die Wirkung sollte nicht durch einen Zytotoxizitätswert beeinträchtigt werden, der die in dieser Prüfmethode vorgegebenen Grenzen überschreitet (Nummer 20).

Tabelle 1

Zur Beurteilung der Eignung des Labors und zur Wahl der Positivkontrollen empfohlene Referenzstoffe

Stoffwechselaktivierungsstatus

Lage

Stoff und CAS-Nr.

Ohne exogene Stoffwechselaktivierung

Hprt

Ethylmethansulfonat [CAS-Nr. 62-50-0] Ethylnitrosoharnstoff (ENU) [CAS-Nr. 759-73-9] 4-Nitroquinolin-1-Oxid (CAS-Nr. 56-57-5)

 

xprt

Streptonigrin [CAS-Nr. 3930-19-6] Mitomycin C [CAS-Nr. 50-07-7]

Mit exogener Stoffwechselaktivierung

Hprt

3-Methylcholanthren [CAS-Nr. 56-49-5] 7,12-Dimethylbenzanthracen [CAS-Nr. 57-97-6] Benzo[a]pyren (CAS-Nr. 50-32-8)

 

xprt

Benzo[a]pyren (CAS-Nr. 50-32-8)

VERFAHREN

Behandlung mit der Prüfchemikalie

25.

Proliferierende Zellen werden mit und ohne Stoffwechselaktivierungssystem mit der Prüfchemikalie behandelt. Die Exposition sollte über einen geeigneten Zeitraum (gewöhnlich 3 bis 6 Stunden) erfolgen.

26.

Die Mindestzahl der für jede Prüfung und im jeweiligen Stadium der Prüfung verwendeten Zellen (Kontrolle und behandelte Kultur) sollte auf der Spontanmutationshäufigkeit beruhen. Als Faustregel ist anzunehmen, dass die Anzahl an behandelten Zellen und an Passagen so groß sein muss, dass in jeder einzelnen Kultur und in allen Phasen der Prüfung ständig 10 Spontanmutationen zu verzeichnen sind (17). Die Spontanmutationshäufigkeit liegt in der Regel zwischen 5 und 20 × 10-6. Um eine hinreichende Anzahl an Spontanmutationen (mindestens 10) bei einer Spontanmutationshäufigkeit von 5 × 10-6 zu erhalten, müssten selbst bei Kulturen, die mit Konzentrationen behandelt wurden, bei denen sich eine Zytotoxizität von 90 % (relative Überlebensrate 10 %) ergibt, mindestens 20 × 106 Zellen behandelt werden. Außerdem muss während der Expressionszeit eine hinreichende Anzahl an Zellen (mindestens 2 Millionen) kultiviert und zur Mutantenselektion plattiert werden (17).

Expressionszeit des Phänotyps und Messung der Mutationshäufigkeit

27.

Nach der Dauer der Behandlung werden die Zellen kultiviert, um die Expression des Mutantenphänotyps zu ermöglichen. Im Allgemeinen sind mindestens 7-9 Tage hinreichend für eine annähernd optimale phänotypische Expression neu induzierter Hprt- und xprt-Mutanten (43) (44). In diesem Zeitraum werden Zellen regelmäßig subkultiviert, um ein exponentielles Wachstum aufrechtzuerhalten. Nach der phänotypischen Expression werden die Zellen im Medium mit und ohne selektierendes Agens (6-Tioguanin) nochmals plattiert, um die Anzahl der Mutanten bzw. die Klonierungseffizienz zum Zeitpunkt der Selektierung zu bestimmen. Diese Plattierung kann mit Schalen für Monoschichtkulturen oder mit Mikrotiterplatten für Zellen in Suspensionskultur vorgenommen werden. Für die Mutantenselektion sollten die Zellen mit einer Dichte plattiert werden, bei der eine optimale Wiederfindung der Mutanten gewährleistet ist (d. h. eine metabolische Kooperation vermieden wird) (17). Die Platten werden über einen angemessenen Zeitraum für ein optimales Koloniewachstum (z. B. 7-12 Tage) inkubiert. Anschließend werden die Kolonien gezählt. Die Mutantenhäufigkeit wird anhand der Anzahl der Mutantenkolonien bereinigt um die Klonierungseffizienz bei der Mutantenselektion berechnet (Formeln siehe Anlage 2).

Kompetenz des Labors

28.

Um ausreichende Erfahrungen mit der Prüfung zu sammeln, bevor routinemäßige Prüfungen erfolgen, sollte das Labor eine Reihe von Versuchen mit positiven Referenzstoffen durchgeführt haben, die sich unterschiedlicher Mechanismen (mindestens ein aktiver Mechanismus mit und ein aktiver Mechanismus ohne Stoffwechselaktivierung, ausgewählt aus den in Tabelle 1 aufgeführten Stoffen) und verschiedener Negativkontrollen (unter Verwendung verschiedener Lösungsmittel/Vehikel) bedienen. Die Reaktionen dieser Positiv- und Negativkontrollen sollten mit der Literatur im Einklang stehen. Dies gilt nicht für erfahrene Labors, d. h. für Labors, die über eine Datenbank mit historischen Daten gemäß der Definition unter den Nummern 30 bis 33 verfügen.

29.

Unabhängig davon, ob eine Stoffwechselaktivierung gegeben ist, sollte eine Auswahl von Positivkontrollstoffen (siehe Tabelle 1 in Nummer 25) untersucht werden, um die Fähigkeit zur Erkennung mutagener Chemikalien nachzuweisen und die Wirksamkeit des Stoffwechselaktivierungssystems zu ermitteln und zum einen die Eignung der Bedingungen für das Zellwachstum während der Behandlung sowie für die phänotypische Expression und für die Mutantenselektion und zum anderen die Eignung der Auswertungsverfahren zu belegen. Zum Nachweis der Empfindlichkeit und dynamischen Bandbreite des Versuchssystems sollte eine Spanne der Konzentrationen der ausgewählten Stoffe festgelegt werden, um reproduzierbare und konzentrationsbezogene Zunahmen gegenüber dem Hintergrund zu erhalten.

Historische Kontrolldaten

30.

Das Labor sollte Folgendes bestimmen:

Bereich und Verteilung historischer Positivkontrollen und

Bereich und Verteilung historischer Negativkontrollen (unbehandelt, Lösungsmittel).

31.

Beim erstmaligen Erwerb von Daten zur Verteilung einer historischen Negativkontrolle sollten gleichzeitige Negativkontrollen veröffentlichten Kontrolldaten entsprechen (22). Werden weitere Versuchsdaten zur Verteilung der Kontrollen hinzugefügt, sollten gleichzeitige Negativkontrollen idealerweise innerhalb von 95 % der Kontrollgrenzen der gewählten Verteilung liegen (17) (45) (46).

32.

Die Datenbank des Labors zu historischen Negativkontrollen sollte zunächst mit mindestens 10 Versuchen angelegt werden. Vorzugsweise sollte sie jedoch aus mindestens 20 Versuchen bestehen, die unter vergleichbaren Versuchsbedingungen durchgeführt wurden. Labors sollten Qualitätskontrollverfahren anwenden, wie z. B. Qualitätsregelkarten (z. B. C-Karten oder X-Bar-Karten (47)), um zu ermitteln, wie variabel ihre Positiv- und Negativkontrolldaten sind, und um nachzuweisen, dass die Methodik in ihrem Labor kontrolliert wird (46). Weitere Empfehlungen zum Aufbau und zur Verwendung von Sammlungen historischer Daten (d. h. Kriterien für die Aufnahme und den Ausschluss von Daten in bzw. aus historischen Datensätzen und die Akzeptanzkriterien für einen bestimmten Versuch) sind den Literaturangaben zu entnehmen (45).

33.

Negativkontrolldaten sollten die Mutantenhäufigkeit aus einer Einzelkultur oder vorzugsweise aus Replikatkulturen erfassen, wie in Nummer 23 beschrieben. Gleichzeitige Negativkontrollen sollten idealerweise innerhalb der Kontrollgrenzen von 95 % der gewählten Verteilung in der Datenbank des Labors zu historischen Negativkontrollen liegen (17) (45) (46). Sofern gleichzeitige Negativkontrolldaten außerhalb der Kontrollgrenzen von 95 % liegen, ist es zulässig, sie in die historische Kontrollverteilung aufzunehmen, solange es sich bei den Daten nicht um „extreme Ausreißer“ handelt und nachgewiesen werden kann, dass das Prüfsystem kontrolliert wird (siehe oben) und nachweislich kein technisches oder menschliches Versagen vorliegt.

34.

Sämtliche Änderungen am Versuchsprotokoll sind auf ihre Übereinstimmung mit den bereits vorhandenen Datenbanken historischer Kontrolldaten des Labors zu prüfen. Bei größeren Inkonsistenzen sollte eine neue Datenbank historischer Kontrolldaten erstellt werden.

DATEN UND BERICHTERSTATTUNG

Darstellung der Prüfergebnisse

35.

Die Darstellung der Prüfergebnisse sollte sämtliche für die Berechnung der Zytotoxizität (ausgedrückt als relative Überlebensrate) erforderlichen Daten beinhalten. Die Daten für behandelte Kulturen und für Kontrollkulturen sollten die Anzahl der Zellen am Ende der Behandlung, die Anzahl der unmittelbar nach der Behandlung plattierten Zellen und die Koloniezahlen (bzw. bei der Mikrotitermethode die Anzahl der Vertiefungen ohne Kolonien) beinhalten. Die relative Überlebensrate der Kulturen sollten jeweils als Prozentanteil der gleichzeitigen Lösungsmittelkontrolle ausgedrückt werden (Begriffsbestimmungen siehe Anlage 1).

36.

Die Darstellung der Prüfergebnisse sollte zudem sämtliche für die Berechnung der Mutantenhäufigkeit erforderlichen Daten beinhalten. Die Daten für behandelte Kulturen und Kontrollkulturen sollten Folgendes umfassen: (1) die Anzahl der mit und ohne selektierendes Agens plattierten Zellen (zum Zeitpunkt der Plattierung der Zellen zur Mutantenselektion) und (2) die ermittelte Koloniezahl (bzw. bei der Mikrotitermethode die Anzahl der Vertiefungen ohne Kolonien) auf den Platten mit und ohne selektierendes Agens. Die Mutantenhäufigkeit wird anhand der Anzahl der Mutantenkolonien (auf den Platten mit dem selektierenden Agens) bereinigt um die Klonierungseffizienz (auf den Platten ohne selektierendes Agens) berechnet. Die Mutantenhäufigkeit sollte als Anzahl der Mutantenzellen pro Million lebensfähiger Zellen ausgedrückt werden (Begriffsbestimmungen siehe Anlage 1).

37.

Die Daten der einzelnen Kulturen sind zu dokumentieren. Zusätzlich sollten alle Daten in tabellarischer Form zusammengefasst werden.

Akzeptanzkriterien

38.

Die Akzeptanz eines Versuchs beruht auf folgenden Kriterien:

Die Daten der gleichzeitigen Negativkontrolle gelten als zulässig für die Aufnahme in die Datenbank des Labors mit historischen Negativkontrolldaten (Nummer 33).

Gleichzeitige Positivkontrollen (Nummer 24) sollten Reaktionen hervorrufen, die mit den Reaktionen kompatibel sind, die in der Datenbank für historische Positivkontrollen erzeugt werden, und, verglichen mit den gleichzeitigen Negativkontrollen, eine statistisch signifikante Zunahme aufweisen.

Zwei Versuchsbedingungen (d. h. mit und ohne Stoffwechselaktivierung) wurden geprüft, wenn nicht bei einem Versuch positive Ergebnisse ermittelt wurden (Nummer 25).

Eine angemessene Zahl an Zellen und Konzentrationen ist analysierbar (Nummern 25, 26 und 19).

Die Kriterien für die Auswahl der höchsten Konzentration entsprechen den Kriterien unter den Nummern 20, 21 und 22.

Beurteilung und Auswertung

39.

Unter der Voraussetzung, dass alle Akzeptanzkriterien erfüllt sind, gilt eine Prüfchemikalie als eindeutig positiv, wenn bei einer der getesteten Versuchsbedingungen

mindestens eine der Versuchskonzentrationen, verglichen mit der gleichzeitigen Negativkontrolle, eine statistisch signifikante Zunahme aufweist,

ein geeigneter Trendtest zeigt, dass die Zunahme konzentrationsabhängig ist,

Ergebnisse außerhalb der Verteilung der historischen Negativkontrolldaten liegen (z. B. Kontrollgrenze von 95 % beruhend auf einer Poisson-Verteilung, siehe Nummer 33).

Sind all diese Kriterien erfüllt, wird davon ausgegangen, dass die Prüfchemikalie in diesem Versuchssystem Genmutationen in Säugerzellkulturen auslösen kann. Für Empfehlungen zu den am besten geeigneten statistischen Methoden siehe Literaturhinweise (46) (48).

40.

Unter der Voraussetzung, dass alle Akzeptanzkriterien erfüllt sind, gilt eine Prüfchemikalie als eindeutig negativ, wenn unter allen untersuchten Versuchsbedingungen

keine der Versuchskonzentrationen eine statistisch signifikante Zunahme gegenüber der gleichzeitigen Negativkontrolle aufweist,

die Bewertung anhand einer geeigneten Trendprüfung keine konzentrationsabhängige Zunahme ergibt, alle Ergebnisse innerhalb der Verteilung der historischen Negativkontrolldaten liegen (z. B. Kontrollgrenze von 95 % beruhend auf einer Poisson-Verteilung, siehe Nummer 33).

Es wird dann davon ausgegangen, dass die Prüfchemikalie keine Genmutationen in Säugerzellkulturen in diesem Versuchssystem auslösen kann.

41.

Bei einer eindeutig positiven oder negativen Reaktion ist eine Verifizierung nicht erforderlich.

42.

In den Fällen, in denen die Reaktion, wie oben beschrieben, weder eindeutig negativ noch eindeutig positiv ist, oder um die biologische Relevanz eines Ergebnisses zu untermauern, sollten die Daten durch eine fachkundige Beurteilung und/oder anhand weiterer Untersuchungen bewertet werden. Die Durchführung eines Wiederholungsversuchs, möglicherweise unter veränderten Versuchsbedingungen (z. B. Abstände der Konzentrationen, andere Metabolisierungsbedingungen (d. h. Konzentration (S9) oder Herkunft (S9)), könnten hilfreich sein.

43.

In seltenen Fällen erlaubt der Datensatz selbst nach weiteren Untersuchungen keine definitive Aussage zu positiven oder negativen Ergebnissen. Daher sollte die Reaktion der Prüfchemikalie als nicht eindeutig eingestuft werden (d. h. für ein positives und für ein negatives Ergebnis besteht die gleiche Wahrscheinlichkeit).

Prüfbericht

44.

Der Prüfbericht sollte folgende Angaben enthalten:

 

Prüfchemikalie:

Herkunft, Chargennummer, ggf. begrenztes Verwendungsdatum;

Stabilität der Prüfchemikalie, falls bekannt;

Löslichkeit und Stabilität der Prüfchemikalie im Lösungsmittel, falls bekannt;

Messung des pH-Werts, Osmolalität und ggf. Niederschlag im Kulturmedium, dem die Prüfchemikalie zugegeben wurde.

 

Einkomponentiger Stoff:

physikalisches Erscheinungsbild, Wasserlöslichkeit und weitere relevante physikalisch-chemische Eigenschaften;

chemische Bezeichnung, wie z. B. IUPAC- oder CAS-Bezeichnung, CAS-Nummer, SMILES- oder InChI-Code, Strukturformel, Reinheit, chemische Zusammensetzung von Verunreinigungen, soweit zutreffend und praktisch durchführbar, usw.

 

Mehrkomponentiger Stoff, UVCB-Stoffe und Gemische:

so weit wie möglich charakterisiert durch die chemische Zusammensetzung (siehe oben), das quantitative Vorkommen und die relevanten physikalisch-chemischen Eigenschaften der einzelnen Komponenten.

 

Lösungsmittel:

Begründung der Auswahl des Lösungsmittels;

Anteil des Lösungsmittels im endgültigen Kulturmedium.

 

Zellen:

 

Bei Labor-Masterkulturen:

Art, Herkunft der Zelllinien;

Passagenanzahl (wenn verfügbar) und Laborgeschichte;

Karyotypmerkmale und/oder Modalzahl der Chromosomen;

zum Erhalt der Zellkultur verwendete Verfahren;

Nichtvorhandensein von Mycoplasma;

Verdopplungszeit der Zellen.

 

Prüfbedingungen:

Begründung der Wahl der Konzentrationen und der Anzahl der Kulturen, darunter z. B. Angaben zur Zytotoxizität und Löslichkeitsgrenze;

Medienzusammensetzung, CO2-Konzentration, Feuchtigkeit;

Konzentration der Prüfchemikalie, ausgedrückt als Endkonzentration im Kulturmedium (z. B. μg oder mg/ml oder mM des Kulturmediums);

Konzentration (und/oder Volumen) des Lösungsmittels und der beigegebenen Prüfchemikalie im Kulturmedium;

Inkubationstemperatur;

Inkubationszeit;

Behandlungsdauer;

Zelldichte während der Behandlung;

Art und Zusammensetzung des Stoffwechselaktivierungssystems (Herkunft von S9, Zubereitungsmethode des S9-Gemisches, Konzentration oder Volumen des S9-Gemisches und S9 im Endmedium, Qualitätskontrollen von S9);

Positiv- und Negativkontrollstoffe, Endkonzentrationen für die jeweiligen Behandlungsbedingungen;

Dauer der Expressionszeit (ggf. einschließlich Anzahl der überimpften Zellen, Subkulturen und Medienwechsel);

Bezeichnung und Konzentration des selektierenden Agens;

Akzeptanzkriterien der Prüfungen;

Methoden zur Zählung der lebensfähigen und mutierten Zellen;

Methoden zur Bestimmung der Zytotoxizität;

evtl. zusätzliche Angaben zur Zytotoxizität und zum verwendeten Verfahren;

Inkubationszeiten nach dem Plattieren;

Kriterien zur Einstufung der Studien als positiv, negativ oder nicht eindeutig;

Methoden zur Bestimmung von pH-Wert, Osmolalität und Ausfällung.

 

Ergebnisse:

Anzahl der behandelten Zellen und Anzahl der subkultivierten Zellen der einzelnen Kulturen;

Bestimmung der Zytotoxizität und ggf. sonstige Beobachtungen;

Ausfällungszeichen und Bestimmungszeit;

Anzahl der plattierten Zellen im selektiven und im nicht selektiven Medium;

Anzahl der Kolonien im nicht selektiven Medium und Anzahl der resistenten Kolonien im selektiven Medium sowie entsprechende Mutantenhäufigkeiten;

nach Möglichkeit Dosis-Wirkungs-Verhältnis;

Daten zu gleichzeitigen Negativ-(Lösungsmittel-)Kontrollen und Positivkontrollen (Konzentrationen und Lösungsmittel);

Daten zu historischen Negativ-(Lösungsmittel-)Kontrollen und Positivkontrollen mit Bereichen, Mittelwerten und Standardabweichungen und Konfidenzintervall (z. B. 95 %) sowie Anzahl der Datensätze;

statistische Analysen (für einzelne Kulturen und (ggf.) für gepoolte Replikatkulturen) sowie ggf. p-Werte.

 

Diskussion der Ergebnisse.

 

Schlussfolgerung

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Anlage 1

BEGRIFFSBESTIMMUNGEN

Basenpaaraustauschmutagene: Chemikalien, die den Austausch von Basenpaaren in der DNA verursachen.

Chemikalie: Ein Stoff oder ein Gemisch.

Expressionszeit des Phänotyps: Die Zeit nach der Behandlung, in der sich die genetische Alteration im Genom ausprägt und bereits vorhandene Genprodukte so weit abgebaut werden, dass die phänotypischen Eigenschaften verändert werden.

Genotoxisch: Ein allgemeiner Begriff, der alle Typen von DNA- oder Chromosomenschädigungen umfasst, einschließlich DNA-Brüchen, Addukt-Neubildungen, Mutationen, Chromosomenaberrationen sowie Aneuploidie. Nicht alle genotoxischen Effekte führen zu Mutationen oder stabilen Chromosomenschäden.

HAT-Medium: Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält und verwendet wird, um Kulturen von Hprt-Mutanten zu reinigen.

Klonierungseffizienz: Der Prozentanteil der mit einer niedrigen Dichte plattierten Zellen, die sich zu einer zählbaren Kolonie entwickeln können.

Konzentrationen: Endkonzentrationen der Prüfchemikalie im Kulturmedium

Lösungsmittelkontrolle: Allgemeiner Begriff zur Bezeichnung der Kontrollkulturen, die nur mit dem Lösungsmittel behandelt werden, das verwendet wird, um die Prüfchemikalie zu lösen.

Mitotische Rekombination: Während der Mitose Rekombination homologer Chromatiden, die zur Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen oder einem Verlust der Heterozygotie führen kann.

MPA-Medium: Medium, das Xanthin, Adenin, Thymidin, Aminopterin und Mycophenolsäure enthält und verwendet wird, um Kulturen von Xprt-Mutanten zu reinigen.

Mutagen: Auslöser einer Erbgutveränderung der DNA-Basenpaarsequenz(en) in Genen oder in der Chromosomenstruktur (Chromosomenaberrationen).

Mutationshäufigkeit: Anzahl der ermittelten Mutantenkolonien geteilt durch die Anzahl der im selektierenden Medium plattierten Zellen, bereinigt um die Klonierungseffizienz (oder die Lebensfähigkeit) zum Zeitpunkt der Selektierung.

Prüfchemikalie: Stoff oder Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode untersucht wird.

Rasterschubmutagene: Chemikalien, die die Addition oder Deletion eines oder mehrerer Basenpaare im DNA-Molekül verursachen.

Relative Überlebensrate: Die relative Überlebensrate ist ein Maß der behandlungsbedingten Zytotoxizität. Sie ist identisch mit Klonierungseffizienz von Zellen, die nach der Behandlung umgehend plattiert werden; dabei ist eine Bereinigung um Zellverluste während der Behandlung im Vergleich zur Klonierungseffizienz bei Negativkontrollen (mit einer Überlebensrate von 100 %) vorzunehmen.

S9-Gemisch: Gemisch aus der S9-Leberfraktion und für die metabolische Enzymaktivität notwendigen Ko-Faktoren.

S9-Leberfraktionen: Überstand des Leberhomogenats nach Zentrifugieren bei 9 000 g, d. h. Rohleberextrakt.

Unbehandelte Kontrolle: Kulturen, die nicht behandelt werden (d. h. weder mit der Prüfchemikalie noch mit Lösungsmittel), jedoch gleichzeitig in gleicher Weise aufgearbeitet werden wie die Kulturen, die mit der Prüfchemikalie behandelt werden.

UVCB: Chemische Stoffe mit unbekannter oder schwankender Zusammensetzung, komplexe Reaktionsprodukte oder biologische Materialien.

Vorwärtsmutation: Genmutation vom Elterntyp zur mutierten Form, die eine Veränderung oder den Ausfall der Enzymaktivität oder der Funktion des kodierten Proteins bewirkt.

Zytotoxizität: Bei den Versuchen im Zusammenhang mit dieser Prüfmethode wird Zytotoxizität definiert als eine Reduzierung der relativen Überlebensrate der behandelten Zellen gegenüber der Negativkontrolle (siehe einschlägige Nummer).

Anlage 2

FORMELN ZUR BEWERTUNG DER ZYTOTOXIZITÄT UND DER MUTANTENHÄUFIGKEIT

Die Zytotoxizität wird anhand der relativen Überlebensrate ermittelt, d. h. anhand der Klonierungseffizienz (CE) von Zellen, die nach der Behandlung umgehend plattiert werden; dabei ist eine Bereinigung um Zellverluste während der Behandlung im Vergleich zur bereinigten Klonierungseffizienz bei Negativkontrollen (mit einer Überlebensrate von 100 %) vorzunehmen (siehe folgende Formel zur Berechnung der relativen Überlebensrate).

Die bereinigte CE einer mit einer Prüfmethode behandelten Kultur wird wie folgt berechnet:

Formula

Die relative Überlebensrate (RS) einer mit einer Prüfmethode behandelten Kultur wird wie folgt berechnet:

Formula

Als Mutantenhäufigkeit wird die Klonierungseffizienz von Mutantenkolonien im selektierenden Medium geteilt durch die zum Zeitpunkt der Selektierung in einem nicht selektierenden Medium für dieselbe Kultur ermittelte Klonierungseffizienz bezeichnet.

Formula

Verwendung von Platten zur Ermittlung der Klonierungseffizienz:

CE = Anzahl der plattierten Kolonien/Zellen.

Verwendung von Mikrotiterplatten zur Ermittlung der Klonierungseffizienz:

Die Anzahl der Kolonien je Vertiefung auf den Mikrotiterplatten entwickelt sich entsprechend der Poisson-Verteilung.

Klonierungseffizienz = -LnP(0) / Anzahl der pro Vertiefung plattierten Zellen

Wobei -LnP(0) = wahrscheinliche Anzahl leerer überimpfter Vertiefungen; diese Anzahl wird mit der folgenden Formel beschrieben:

LnP(0) = -Ln (Anzahl leerer Vertiefungen / Anzahl plattierter Vertiefungen)

(3)

In Teil B erhält Kapitel B.22 folgende Fassung:

„B.22   DOMINANT-LETAL-PRÜFUNG AN NAGERN

EINLEITUNG

1.

Diese Prüfmethode (PM) entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 478 (2016). Die Prüfmethoden werden regelmäßig überarbeitet, um dem wissenschaftlichen Fortschritt, sich ändernden Rechtsvorgaben und Belangen des Tierschutzes gerecht zu werden. Diese modifizierte Fassung der Prüfmethode beruht auf mehr als 30-jähriger Erfahrung mit dieser Prüfung und trägt der Tatsache Rechnung, dass die Prüfung in andere Toxizitätsprüfungen eingebunden oder mit anderen Toxizitätsprüfungen kombiniert werden kann (z. B. mit Untersuchungen der Entwicklungs-, Reproduktions- und Genotoxizität); aufgrund ihrer Beschränkungen und der Verwendung einer großen Anzahl an Versuchstieren, soll diese Prüfmethode jedoch nicht als primäre Methode, sondern eher als ergänzende Prüfmethode angewendet werden, die nur dann zum Einsatz kommt, wenn aus rechtlichen Gründen keine Alternative besteht. Durch die Kombination von Toxizitätsprüfungen kann die Anzahl der für Toxizitätsprüfungen zu verwendenden Versuchstiere erheblich reduziert werden. Die OECD hat ein Dokument erstellt, das kurz gefasste und hilfreiche Informationen zu Untersuchungen zur genetischen Toxikologie sowie eine Übersicht über die jüngsten Änderungen der OECD-Prüfrichtlinien zur genetischen Toxikologie enthält (1).

2.

Mit der Dominant-Letal-Prüfung (DL-Prüfung) soll untersucht werden, ob Chemikalien aufgrund von Chromosomenaberrationen in Keimzellen Mutationen auslösen. Außerdem ist die Dominant-Letal-Prüfung für die Bewertung von Genotoxizität von Bedeutung, da trotz artenspezifischer Unterschiede Faktoren des In-vivo-Stoffwechsels, der Pharmakokinetik und von DNA-Reparaturprozessen aktiv sind und zu den Reaktionen beitragen. Die Induktion einer DL-Mutation durch Behandlung mit einer Prüfchemikalie weist darauf hin, dass die Chemikalie das Keimgewebe des Versuchstiers geschädigt hat.

3.

DL-Mutationen bewirken den Tod des Embryos bzw. des Fötus. Die Induktion einer DL-Mutation durch Behandlung mit einer Prüfchemikalie weist darauf hin, dass die Chemikalie die Keimzellen des Versuchstiers geschädigt hat.

4.

Eine DL-Prüfung ist hilfreich für die Bestätigung positiver Prüfergebnisse mit somatischen In-vivo-Endpunkten und stellt einen relevanten Endpunkt für die Abschätzung der Gefahren für den Menschen und des Risikos genetischer Erkrankungen dar, die über die Keimbahn übertragen werden. Dieser Versuch erfordert jedoch eine große Anzahl an Versuchstieren und ist arbeitsintensiv; daher ist die Durchführung dieses Versuchs sehr teuer und zeitaufwändig. Wegen der verhältnismäßig großen spontanen Häufigkeit von DL-Mutationen besteht bei diesem Versuch im Allgemeinen nur eine beschränkte Empfindlichkeit im Hinblick auf die Erkennung geringer Erhöhungen der Mutationshäufigkeit.

5.

Die Definitionen der Schlüsselbegriffe sind Anlage 1 zu entnehmen.

AUSGANGSÜBERLEGUNGEN

6.

Meist wird die Prüfung an Mäusen durchgeführt (2) (3) (4). Andere Arten (beispielsweise Ratten) (5) (6) (7) (8) kommen manchmal möglicherweise ebenfalls in Betracht, wenn dies wissenschaftlich gerechtfertigt ist. Dominante Letalgene sind im Allgemeinen auf starke Chromosomenaberrationen (strukturelle und numerische Anomalien) zurückzuführen (9) (10) (11), Genmutationen können jedoch nicht ausgeschlossen werden. DL-Mutationen sind Mutationen, die per se in einer Keimzelle oder nach der Befruchtung im frühen Embryonalstadium auftreten; sie verursachen keine Funktionsstörung der Gameten, sind aber für das befruchtete Ei oder den sich entwickelnden Embryo tödlich.

7.

Einzelne männliche Tiere werden in angemessenen Abständen der Behandlung mit jungfräulichen weiblichen Tieren verpaart. Die Anzahl der Paarungen nach der Behandlung richtet sich nach dem eigentlichen Zweck der DL-Untersuchung (Nummer 23); sie muss ausreichen, um alle Stadien der Reifung männlicher Keimzellen einer Untersuchung auf dominante Letalgene unterziehen zu können (12).

8.

Wenn Anzeichen dafür bestehen, dass die Prüfchemikalie oder ein reaktiver Metabolit bzw. reaktive Metaboliten die Hoden nicht erreicht bzw. erreichen, ist diese Prüfung nicht geeignet.

PRINZIP DER PRÜFMETHODE

9.

Im Allgemeinen werden die männlichen Tiere über einen geeigneten Expositionsweg mit einer Prüfchemikalie behandelt und dann mit unbehandelten jungfräulichen weiblichen Tieren verpaart. Verschiedene Keimzellarten können durch Verwendung aufeinander folgender Paarungsintervalle geprüft werden. Nach einer angemessenen Zeit nach der Paarung werden die weiblichen Tiere getötet und die Uteri der Tiere einer Untersuchung unterzogen, um die Anzahl der Implantate sowie der lebenden und der toten Embryonen zu ermitteln. Der dominante Letaleffekt einer Prüfchemikalie wird anhand des Vergleichs der lebenden Implantate pro weibliches Tier in der behandelten Gruppe mit der Anzahl lebender Implantate pro weibliches Tier in der Vehikel-/Lösungsmittel-Kontrollgruppe bestimmt. Die Differenz zwischen der Anzahl toter Implantate pro weibliches Tier in der behandelten Gruppe und der Anzahl toter Implantate pro weibliches Tier in der Kontrollgruppe entspricht dem durch die Prüfchemikalie induzierten Postimplantationsverlust. Der Postimplantationsverlust wird durch Ermittlung des Verhältnisses toter Implantate zur Gesamtzahl der Implantate in der behandelten Gruppe im Vergleich zum Verhältnis toter Implantate zur Gesamtzahl der Implantate in der Kontrollgruppe ermittelt. Der Präimplantationsverlust kann anhand des Vergleichs der Anzahl der Corpora lutea abzüglich der Gesamtzahl der Implantate bzw. der Anzahl der Gesamtimplantate pro weibliches Tier in der behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe abgeschätzt werden.

ÜBERPRÜFUNG DER EIGNUNG DES LABORS

10.

Die Kompetenz zur Durchführung dieses Versuchs sollte durch den Nachweis der Fähigkeit zur Reproduktion der Häufigkeiten dominanter Letalgene aus veröffentlichten Daten (z. B. (13) (14) (15) (16) (17) (18)) mit Positivkontrollstoffen (einschließlich schwacher Reaktionen) (wie beispielsweise in Tabelle 1 genannt) sowie mit Vehikeln und durch die Ermittlung von Häufigkeiten bei Negativkontrollen in einem annehmbaren Datenbereich (siehe vorstehende Literatur) oder – wenn verfügbar – durch die historische Kontrollverteilung des jeweiligen Labors belegt werden.

BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE

Vorbereitungen

Auswahl von Versuchstierarten

11.

Es sollten junge gesunde und geschlechtsreife Tiere üblicher Labortierstämme zum Einsatz kommen. Gewöhnlich werden Mäuse verwendet, doch kommen auch Ratten in Betracht. Außerdem können andere geeignete Säugetierarten verwendet werden, sofern dies im Bericht wissenschaftlich begründet wird.

Haltungs- und Fütterungsbedingungen

12.

Bei Nagern sollte die Temperatur im Versuchstierraum 22 °C (± 3 °C) betragen. Die relative Luftfeuchtigkeit sollte vorzugsweise bei 50 bis 60 % liegen, mindestens aber 40 % betragen und außer bei der Reinigung des Raumes 70 % nicht übersteigen. Der Raum sollte künstlich beleuchtet sein, wobei die Beleuchtung im 12-Stunden-Rhythmus ein- und ausgeschaltet werden sollte. An die Versuchstiere kann herkömmliches Laborfutter verfüttert werden, wobei eine unbegrenzte Trinkwasserversorgung zu gewährleisten ist. Die Auswahl des Futters wird eventuell dadurch beeinflusst, dass eine geeignete Beimischung einer Prüfchemikalie gewährleistet werden muss, wenn diese über das Futter verabreicht wird. Vor der Behandlung bzw. der Paarung sollten die Nager in kleinen gleichgeschlechtlichen Gruppen (höchstens fünf Tiere) gehalten werden, sofern kein aggressives Verhalten zu erwarten ist oder festgestellt wird, vorzugsweise in Käfigen mit festem Boden und angemessener Ausstattung des Lebensumfelds. Sie können auch einzeln gehalten werden, wenn dies wissenschaftlich gerechtfertigt ist.

Vorbereitung der Versuchstiere

13.

Gesunde und geschlechtsreife männliche und weibliche adulte Tiere werden randomisiert und den einzelnen Kontroll- bzw. Behandlungsgruppen zugeteilt. Es erfolgt eine Einzelidentifizierung der Tiere unter Verwendung einer humanen, minimalinvasiven Methode (z. B. durch Anbringen von Ringen, Marken oder Mikrochips oder durch biometrische Identifizierung, nicht jedoch durch Kupieren der Zehen oder Ohren). Die Tiere werden über einen Zeitraum von mindestens fünf Tagen unter Laborbedingungen eingewöhnt. Die Käfige sind so aufzustellen, dass etwaige standortbedingte Auswirkungen möglichst gering sind. Eine gegenseitige Kontamination durch die Positivkontrolle und die Prüfchemikalie ist zu vermeiden. Zu Beginn des Versuchs sollte die Abweichung des Körpergewichts der Tiere vom Mittelwert so gering wie möglich sein und bei beiden Geschlechtern nicht mehr als ± 20 % betragen.

Vorbereitung der Dosierung

14.

Feste Prüfchemikalien sollten vor der Verabreichung an die Tiere in geeigneten Lösungsmitteln oder Vehikeln gelöst oder suspendiert oder in das Futter bzw. das Trinkwasser gegeben werden. Flüssige Prüfchemikalien können direkt verabreicht oder zuvor verdünnt werden. Bei Exposition durch Inhalation können die Prüfchemikalien je nach ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften als Gase, Dämpfe oder festes/flüssiges Aerosol verabreicht werden. Es sind frische Zubereitungen der Prüfchemikalie zu verwenden, es sei denn, die Stabilität der Chemikalie bei Lagerung wird nachgewiesen, und die entsprechenden Lagerbedingungen werden definiert.

Prüfbedingungen

Lösungsmittel/Vehikel

15.

Das Lösungsmittel/Vehikel sollte in der verwendeten Dosierung keine toxischen Wirkungen hervorrufen und nicht im Verdacht stehen, mit der Prüfchemikalie eine chemische Reaktion einzugehen. Werden keine allgemein bekannten Lösungsmittel/Vehikel verwendet, so sind Referenzdaten zur Kompatibilität beizubringen. Nach Möglichkeit sollte ein wässriges Lösungsmittel/Vehikel verwendet werden. Beispiele für üblicherweise verwendete, kompatible Lösungsmittel/Vehikel sind Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Methylcelluloselösung, Carboxymethylcellulose-Natriumsalzlösung, Olivenöl und Maisöl.

Positivkontrollen

16.

Grundsätzlich sind parallel Positivkontrolltiere zu verwenden, wenn das Labor nicht seine Befähigung zur Durchführung der Prüfung nachgewiesen und die Prüfung in letzter Zeit (beispielsweise in den letzten 5 Jahren) nicht regelmäßig durchgeführt hat. Allerdings brauchen Positivkontrolltiere nicht auf demselben Expositionsweg wie die mit der Prüfchemikalie behandelten Tiere behandelt und nicht für alle Paarungsintervalle Proben genommen zu werden. Die Positivkontrollstoffe sollten unter den in der Prüfung bestehenden Bedingungen bekanntermaßen dominante Letalgene induzieren. Bis auf die Verabreichung der Prüfchemikalie sind die Tiere der Kontrollgruppen ebenso zu behandeln wie die Tiere der Behandlungsgruppen.

17.

Die Dosen der Positivkontrollstoffe sind so auszuwählen, dass sie schwache oder moderate Wirkungen hervorrufen, mit denen die Leistung und Empfindlichkeit des Versuchs kritisch bewertet werden können, gleichzeitig aber konsistent positive dominante Letaleffekte induziert werden. Beispiele für Positivkontrollstoffe und für geeignete Dosierungen sind Tabelle 1 zu entnehmen.

Tabelle 1

Beispiele für Positivkontrollstoffe

Stoff [CAS-Nr.]

(Referenznummer)

Effektiver Dosisbereich (mg/kg)

(Nagetierarten)

Verabreichungsdauer (Tage)

Triethylenmelamin [51-18-3] (15)

0,25 (Mäuse)

1

Cyclophosphamid [50-18-0] (19)

50-150 (Mäuse)

5

Cyclophosphamid [50-18-0] (5)

25-100 (Ratten)

1

Ethylmethansulfonat [62-50-0] (13)

100-300 (Mäuse)

5

Monomeres Acrylamid [79-06-1] (17)

50 (Mäuse)

5

Chlorambucil [305-03-3] (14)

25 (Mäuse)

1

Negativkontrollen

18.

In jede Probenahme sind Negativkontrolltiere einzubeziehen, die nur ein Lösungsmittel oder ein Vehikel erhalten und ansonsten in derselben Weise behandelt werden wie die Behandlungsgruppen (20). Um die Eignung der Vehikelkontrolle festzustellen, sollten darüber hinaus in jede Probenahme auch unbehandelte Kontrolltiere einbezogen werden, soweit keine historischen oder veröffentlichten Kontrolldaten vorliegen, aus denen hervorgeht, dass das gewählte Lösungsmittel/Vehikel keine dominanten Letalgene und keine sonstigen schädlichen Wirkungen induziert.

VERFAHREN

Anzahl der Versuchstiere

19.

Einzelne männliche Tiere werden nacheinander in geeigneten zuvor festgelegten Intervallen (z. B. wöchentlich, Nummern 21 und 23) vorzugsweise mit einem jungfräulichen weiblichen Tier verpaart. Die Anzahl der männlichen Tiere pro Gruppe sollte so gewählt werden, dass sie (in Verbindung mit der Anzahl der verpaarten weiblichen Tiere in den einzelnen Paarungsintervallen) ausreichend ist, um die erforderliche statistische Aussagekraft für den Nachweis mindestens einer Verdopplung der Häufigkeit dominanter Letalgene (Nummer 44) sicherzustellen.

20.

Die Anzahl der weiblichen Tiere pro Paarungsintervall sollte anhand von Berechnungen der statistischen Aussagekraft so gewählt werden, dass mindestens eine Verdopplung der Häufigkeit dominanter Letalgene nachgewiesen werden kann (d. h. ausreichend trächtige weibliche Tiere zur Hervorbringung von insgesamt mindestens 400 Implantaten) (20) (21) (22) (23) und dass mindestens ein totes Implantat pro Analyseeinheit (d. h. Paarungsgruppe pro Dosis) zu erwarten ist (24).

Verabreichungsdauer und Paarungsintervalle

21.

Die Anzahl der Paarungsintervalle nach der Behandlung richtet sich nach dem Behandlungsplan; sie sollte gewährleisten, dass alle Stadien der Reifung männlicher Keimzellen auf die Induzierung dominanter Letalgene untersucht werden (12) (25). Bei einer Einzelbehandlung unter Verabreichung von bis zu fünf Tagesdosen sollten nach der letzten Behandlung in wöchentlichen Abständen 8 (Mäuse) bzw. 10 (Ratten) Paarungen vorgenommen werden. Bei Mehrfachdosierungen kann die Anzahl der Paarungsintervalle entsprechend dem Anteil der längeren Dauer des Verabreichungszeitraums reduziert werden, sofern alle Phasen der Spermatogenese wie vorgesehen evaluiert werden können (nach einer Expositionsdauer von 28 Tagen beispielsweise sind bei Mäusen bereits 4 wöchentliche Paarungen zur Evaluierung aller Phasen der Spermatogenese ausreichend). Alle Behandlungs- und Paarungspläne sollten wissenschaftlich begründet sein.

22.

Weibliche Tiere sollten mindestens für die Dauer eines Östruszyklus (bei Mäusen und Ratten jeweils eine Woche) mit den männlichen Tieren zusammenbleiben. Weibliche Tiere, die sich innerhalb dieser Woche nicht gepaart haben, können für ein späteres Paarungsintervall verwendet werden. Alternativ können die Tiere zusammenbleiben, bis die Paarung erfolgt ist (was durch die Feststellung von Spermien in der Vagina oder das Vorliegen eines Vaginalpropfs nachzuweisen ist).

23.

Die Exposition und der Paarungsplan hängen vom eigentlichen Zweck der DL-Untersuchung ab. Wenn das Ziel in der Feststellung besteht, ob eine bestimmte Chemikalie per se DL-Mutationen induziert, besteht die akzeptierte Methode in der Exposition eines vollständigen Spermatogenesezyklus (beispielsweise 7 Wochen bei Mäusen und 5-7 Behandlungen wöchentlich) und einer Paarung am Ende des Zyklus. Besteht das Ziel jedoch in der Ermittlung des Keimzellentyps, in dem dominante Letalgene induziert werden können, ist eine einmalige Exposition (über 5 Tage) mit einer anschließenden Paarungszeit von einer Woche vorzuziehen.

Dosierungen

24.

Wenn zunächst eine Dosisfindungsstudie durchgeführt wird, da keine geeigneten Daten zur Dosierungswahl verfügbar sind, sollte diese im gleichen Labor unter Verwendung des/der gleichen Spezies, Rasse, Geschlechts und Behandlungsverfahrens wie im Hauptversuch stattfinden (26). Ziel der Studie sollte sein, die maximal verträgliche Dosis (MTD) zu ermitteln, die definiert ist als die höchste Dosierung, die vertragen wird, ohne dass Anzeichen von Toxizität auftreten, die die Studie, bezogen auf den Untersuchungszeitraum, begrenzen würden (z. B. durch Abweichungen in Verhalten oder Reaktionen, geringen Rückgang des Körpergewichts oder Zytotoxizität des blutbildenden Systems, ausgenommen jedoch Tod oder Anzeichen von Schmerzen und Leiden, die eine humane Tötung erforderlich machen würden (27)).

25.

Die maximal verträgliche Dosis (MTD) darf zudem den Paarungserfolg nicht beeinträchtigen (21).

26.

Prüfchemikalien mit spezifischen biologischen Aktivitäten bei niedrigen, nicht toxischen Dosen (wie Hormone und Mitogene) und Chemikalien mit gesättigten toxikokinetischen Eigenschaften können als Ausnahmen von den Kriterien zur Dosisfestsetzung angesehen werden und sind auf Fallbasis zu bewerten.

27.

Um Dosis-Wirkungs-Informationen zu erhalten, sollte eine vollständige Studie eine Negativkontrollgruppe und mindestens drei Dosierungen enthalten, die sich in der Regel um einen Faktor von 2 (maximal von 4) unterscheiden. Ruft die Prüfchemikalie in einer Dosisfindungsstudie oder nach bereits vorhandenen Daten keine Toxizität hervor, so sollte die Höchstdosis für eine Einzelgabe 2 000 mg/kg Körpergewicht betragen. Wirkt die Prüfchemikalie jedoch toxisch, sollte die MTD die höchste verabreichte Dosierung sein und die Dosierung vorzugsweise einen Bereich vom Höchstwert bis zu einer Dosierung abdecken, die wenig oder keine Toxizität erzeugt. Bei nicht toxischen Chemikalien beträgt die Grenzdosis für einen Verabreichungszeitraum von mindestens 14 Tagen 1 000 mg/kg Körpergewicht/Tag und bei Verabreichungszeiträumen von weniger als 14 Tagen 2 000 mg/kg Körpergewicht/Tag.

Verabreichung der Dosen

28.

Bei der Versuchsplanung ist der zu erwartende Expositionsweg beim Menschen zu berücksichtigen. Daher können mit entsprechender Begründung Verabreichungswege wie etwa eine Aufnahme über die Nahrung, über das Trinkwasser, eine subkutane, intravenöse, topische oder orale (über eine Magensonde) Verabreichung oder eine Verabreichung durch Inhalation oder Implantation gewählt werden. In jedem Fall sollte der Verabreichungsweg so gewählt werden, dass das bzw. die Zielgewebe eine angemessene Exposition erfährt bzw. erfahren. Eine intraperitoneale Injektion wird in der Regel nicht empfohlen, da diese nicht als Verabreichungsweg beim Menschen vorgesehen ist, und sollte nur mit spezieller wissenschaftlicher Begründung angewandt werden. Sofern die Prüfchemikalie der Nahrung oder dem Trinkwasser beigemischt wird, ist insbesondere im Fall von Einzeldosierungen darauf zu achten, dass ein ausreichender Abstand zwischen der Nahrungsmittel- und Trinkwasseraufnahme und der Paarung eingehalten wird, damit ein Nachweis der Wirkungen möglich ist (Nummer 31). Welches Flüssigkeitsvolumen jeweils höchstens durch Sonde oder Injektion verabreicht werden kann, hängt von der Größe des Versuchstiers ab. Das Volumen sollte im Normalfall 1 ml/100 g Körpergewicht nicht überschreiten, bei wässrigen Lösungen kommen aber auch 2 ml/100 g in Betracht. Werden größere Volumina verwendet (sofern nach Tierschutzvorschriften erlaubt), ist dies zu begründen. Schwankungen der Prüfvolumina sind durch entsprechende Dosierung so gering wie möglich zu halten, damit bei allen Dosen ein gemessen am Körpergewicht gleich bleibendes Volumen gewährleistet ist.

Beobachtungen

29.

Mindestens einmal täglich – vorzugsweise zum gleichen Zeitpunkt und unter Berücksichtigung des Zeitraums, in dem der Wirkungsgipfel nach Verabreichung der Dosis zu erwarten ist – sollten allgemeine klinische Beobachtungen der Versuchstiere vorgenommen und protokolliert werden. Mindestens zweimal täglich während der Verabreichungszeit sind alle Tiere auf Morbidität und Mortalität zu überprüfen. Alle Tiere sollten zu Studienbeginn und mindestens einmal pro Woche während Studien mit Wiederholungsdosen sowie bei humaner Tötung gewogen werden. Die Futteraufnahme wird mindestens wöchentlich gemessen. Wenn die Prüfchemikalie über das Trinkwasser verabreicht wird, sollte auch die Wasseraufnahme bei jedem Wasserwechsel und mindestens einmal wöchentlich gemessen werden. Tiere mit Anzeichen von übermäßiger, jedoch nicht tödlich wirkender Toxizität sollten vor Ende des Prüfzeitraums human getötet werden (27).

Gewebeentnahme und -verarbeitung

30.

Weibliche Tiere werden in der zweiten Hälfte der Gravidität am Trächtigkeitstag (GD) 13 bei Mäusen bzw. an GD 14-15 bei Ratten human getötet. Die Uteri werden auf dominante Letaleffekte untersucht, um die Anzahl der Implantate, der lebenden und toten Embryonen und der Corpora lutea zu ermitteln.

31.

Die Uterushörner und die Ovarien werden freigelegt, um die Corpora lutea zählen zu können, und die Feten werden entfernt, gezählt und gewogen. Die Uteri sind sorgfältig auf durch lebende Feten verdeckte Resorptionen zu prüfen. Dabei sollte sichergestellt werden, dass alle Resorptionen gezählt werden. Die Fötusmortalität wird dokumentiert. Die Anzahl der erfolgreich befruchteten weiblichen Tiere und die Gesamtzahl der Implantate sowie die Präimplantationsverluste und die Postimplantationsmortalität (einschließlich Früh- und Spätresorptionen) sind ebenfalls zu erfassen. Außerdem können die sichtbaren Feten mindestens 2 Wochen in Bouinscher Lösung fixiert und anschließend auf schwere äußerliche Fehlbildungen untersucht werden (28), um weitere Informationen über die reproduktions- und entwicklungsbezogenen Auswirkungen der Prüfchemikalie zu erhalten.

DATEN UND BERICHTERSTATTUNG

Auswertung der Ergebnisse

32.

Die Daten sind in tabellarischer Form unter Angabe der Anzahl der verpaarten männlichen Tiere, der Anzahl der trächtigen weiblichen Tiere und der Anzahl nicht trächtiger weiblicher Tiere darzustellen. Die Ergebnisse jeder Paarung einschließlich der Identität aller männlichen und weiblichen Tiere sind einzeln anzugeben. Für behandelte männliche Tiere sollten das Paarungsintervall und die Dosierung und für die einzelnen weiblichen Tiere die Anzahl lebender sowie toter Implantate dokumentiert werden.

33.

Der Postimplantationsverlust wird durch Ermittlung des Verhältnisses toter Implantate zur Gesamtzahl der Implantate in der behandelten Gruppe im Vergleich zum Verhältnis toter Implantate zur Gesamtzahl der Implantate in der Vehikel-/Lösungsmittelkontrollgruppe ermittelt.

34.

Der Präimplantationsverlust wird als Differenz zwischen der Anzahl der Corpora lutea und der Anzahl der Implantate oder als Verringerung der Durchschnittsanzahl der Implantate pro weibliches Tier gegenüber den Kontrollpaarungen berechnet. Wird der Präimplantationsverlust berechnet, ist er anzugeben.

35.

Der DL-Faktor wird wie folgt berechnet: (Postimplantationsmortalität/Gesamtzahl der Implantate pro weibliches Tier) × 100.

36.

Daten zur Toxizität und klinische Anzeichen (gemäß Nummer 29) sind zu dokumentieren.

Akzeptanzkriterien

37.

Die folgenden Kriterien entscheiden über die Gültigkeit eines Versuchs:

Die gleichzeitige Negativkontrolle wird im Einklang mit veröffentlichten Normen für historische Negativkontrolldaten und mit den historischen Kontrolldaten des Labors (sofern verfügbar) durchgeführt (Nummern 10 und 18).

Gleichzeitige Positivkontrollen induzieren Reaktionen, die im Einklang mit veröffentlichten Normen für historische Positivkontrolldaten bzw. mit den historischen Kontrolldaten des Labors (sofern verfügbar) stehen und bewirken eine statistisch signifikante Erhöhung im Vergleich zur Negativkontrolle (Nummern 17 und 18).

Eine angemessene Gesamtzahl an Implantaten und Dosierungen wurde analysiert (Nummer 20).

Die Kriterien für die Auswahl der Höchstdosis entsprechen den Kriterien unter den Nummern 24 und 27.

Bewertung und Auswertung der Ergebnisse

38.

Es sind mindestens drei behandelte Dosisgruppen zu analysieren, um ausreichende Daten für Dosis-Wirkungs-Analysen zu liefern.

39.

Unter der Voraussetzung, dass alle Akzeptanzkriterien erfüllt sind, gilt eine Prüfchemikalie als eindeutig positiv, wenn

mindestens eine der Versuchsdosierungen eine statistisch signifikante Zunahme gegenüber der gleichzeitigen Negativkontrolle aufweist,

die Zunahme im Hinblick auf mindestens eine Versuchsbedingung (z. B. ein Paarungsintervall von einer Woche) bei Auswertung mit einer geeigneten Prüfung dosisabhängig ist und

Ergebnisse außerhalb des akzeptablen Bereichs für Negativkontrolldaten bzw. der Verteilung der historischen Negativkontrolldaten des Labors (z. B. der auf einer Poisson-Verteilung beruhenden Kontrollgrenze von 95 %) liegen (sofern verfügbar).

Wenn diese Voraussetzungen erfüllt sind, wird angenommen, dass die Prüfchemikalie in Keimzellen der Versuchstiere DL-Mutationen induziert. Empfehlungen zu den am besten geeigneten statistischen Methoden sind Nummer 44 zu entnehmen; weitere statistische Ansätze werden in der Fachliteratur empfohlen (20) (21) (22) (24) (29). Bei durchgeführten statistischen Prüfungen sollte das Tier als Versuchseinheit zugrunde gelegt werden.

40.

Unter der Voraussetzung, dass alle Akzeptanzkriterien erfüllt sind, gilt eine Prüfchemikalie als eindeutig negativ, wenn

keine der Versuchsdosierungen eine statistisch signifikante Zunahme gegenüber der gleichzeitigen Negativkontrolle hervorruft,

bei keiner Versuchsbedingung eine dosisabhängige Zunahme festzustellen ist und

alle Ergebnisse innerhalb eines akzeptablen Bereichs der historischen Negativkontrolldaten des Labors (z. B. der auf einer Poisson-Verteilung beruhenden Kontrollgrenze von 95 %) liegen (sofern verfügbar).

Wenn diese Voraussetzungen erfüllt sind, wird angenommen, dass die Prüfchemikalie nicht geeignet ist, in Keimzellen der Versuchstiere DL-Mutationen zu induzieren.

41.

Bei einer eindeutig positiven oder negativen Reaktion ist eine Verifizierung nicht erforderlich.

42.

In den Fällen, in denen die Reaktion weder eindeutig negativ noch eindeutig positiv ist, oder um die biologische Relevanz eines Ergebnisses zu untermauern (z. B. eine geringe oder grenzwertige Zunahme), sollten die Daten durch eine fachkundige Beurteilung und/oder anhand weiterer Untersuchungen der vorliegenden abgeschlossenen Versuche bewertet werden (beispielsweise wenn beurteilt werden soll, ob das positive Ergebnis außerhalb des akzeptablen Bereichs von Negativkontrolldaten oder der historischen Negativdaten des betreffenden Labors liegt) (30).

43.

In seltenen Fällen erlaubt der Datensatz selbst nach weiteren Untersuchungen keine definitive Aussage zu positiven oder negativen Ergebnissen, so dass die Reaktion als nicht eindeutig eingestuft wird.

44.

Bei durchgeführten statistischen Prüfungen sollte das männliche Tier als Versuchseinheit zugrunde gelegt werden. Die Zähldaten (z. B. die Anzahl der Implantate pro weibliches Tier) können auf einer Poisson-Verteilung beruhen, und/oder Anteile (etwa der Anteil toter Implantate) können eine Binomialverteilung ergeben; diese Daten weisen häufig jedoch eine übermäßige Verteilung auf (31). Daher sollte bei der statistischen Analyse zunächst mithilfe von Varianztests wie z. B. des Cochran-Tests zur Ermittlung der binomialen Varianz (32) oder des Tarone-C(α)-Tests zur Ermittlung einer binomialen übermäßigen Verteilung (31) (33) eine Untersuchung auf übermäßige oder zu geringe Verteilung vorgenommen werden. Wenn keine Abweichungen von der Binomialverteilung festgestellt wird, kann mit dem Cochran-Armitage-Trendtest (34) und mit paarweisen Vergleichen mit der Kontrollgruppe mit dem exakten Test nach Fischer (35) eine Untersuchung auf die Entwicklung von Anteilen bei verschiedenen Dosierungen vorgenommen werden. Ähnlich können dann, wenn keine Abweichungen von der Poisson-Verteilung festgestellt werden, Entwicklungen der Zahlen durch Poisson-Regression untersucht (36) und paarweise Vergleiche mit der Kontrollgruppe vor dem Hintergrund des Poisson-Modells mithilfe von Kontrastpaaren vorgenommen werden (36). Wenn eine signifikant übermäßig starke oder geringe Verteilung festgestellt wird, werden parameterfreie Methoden empfohlen. (23) (31). Dazu zählen rangbezogene Prüfungen wie der Jonckheere-Terpstra-Trendtest (37) und Mann-Whitney-Tests (38) für paarweise Vergleiche mit der Vehikel-/Lösungsmittel-Kontrollgruppe sowie Permutations-, Resampling- oder Bootstrap-Trendtests und paarweise Vergleiche mit der Kontrollgruppe (31) (39).

45.

Eine DL-Prüfung mit positivem Ergebnis ist ein Nachweis für die Genotoxizität der Prüfchemikalie an den Keimzellen der behandelten männlichen Tiere der Versuchstierart.

46.

Indem ermittelt wird, ob die gemessenen Werte innerhalb oder außerhalb des historischen Kontrollbereichs liegen, lassen sich Leitlinien für die Bewertung der biologischen Signifikanz der Reaktion herleiten (40).

Prüfbericht

47.

Der Prüfbericht sollte folgende Angaben enthalten:

Zusammenfassung

 

Prüfchemikalie:

Herkunft, Chargennummer, ggf. begrenztes Verwendungsdatum;

Stabilität der Prüfchemikalie, falls bekannt;

Löslichkeit und Stabilität der Prüfchemikalie im Lösungsmittel, falls bekannt;

Messung des pH-Werts, der Osmolalität und ggf. des Niederschlags im Kulturmedium, dem die Prüfchemikalie zugegeben wurde.

 

Einkomponentiger Stoff:

physikalisches Erscheinungsbild, Wasserlöslichkeit und weitere relevante physikalisch-chemische Eigenschaften;

chemische Bezeichnung, wie z. B. IUPAC- oder CAS-Bezeichnung, CAS-Nummer, SMILES- oder InChI-Code, Strukturformel, Reinheit, chemische Zusammensetzung von Verunreinigungen, soweit zutreffend und praktisch durchführbar, usw.

 

Mehrkomponentiger Stoff, UVCB-Stoffe und Gemische:

so weit wie möglich charakterisiert durch die chemische Zusammensetzung (siehe oben), das quantitative Vorkommen und die relevanten physikalisch-chemischen Eigenschaften der einzelnen Komponenten.

 

Zubereitung der Prüfchemikalie:

Begründung der Auswahl des Vehikels;

Löslichkeit und Stabilität der Prüfchemikalie im Lösungsmittel/Vehikel, falls bekannt;

Zubereitung von Formulierungen für Nahrung, Trinkwasser oder Inhalationspräparaten;

analytische Bestimmung der Formulierungen (z. B. Stabilität, Homogenität, nominale Konzentrationen), wenn erfolgt.

 

Versuchstiere:

Art/Stamm und Begründung der getroffenen Wahl;

Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere;

Herkunft der Tiere, Haltungsbedingungen, Futter usw.;

Methode zur eindeutigen Identifizierung der Tiere;

bei Kurzzeitstudien: individuelles Körpergewicht der männlichen Tiere zu Beginn und am Ende der Studie; bei Studien über einer Woche: individuelles Körpergewicht während der Studie und Futteraufnahme. Bereich des Körpergewichts, Mittelwert und Standardabweichung für jede Gruppe.

 

Prüfbedingungen:

Daten zu den Positiv- und Negativkontrollen (Vehikel/Lösungsmittel),

Daten aus der Dosisfindungsstudie,

Begründung der gewählten Dosisstufen;

Angaben zur Zubereitung der Prüfchemikalie;

Angaben zur Verabreichung der Prüfchemikalie;

Begründung des Verabreichungswegs;

Methoden zur Toxizitätsmessung beim Tier, einschließlich, soweit verfügbar, histopathologischer oder hämatologischer Analysen, sowie Angaben zur Häufigkeit, mit der die Tiere beobachtet und ihre Körpergewichte gemessen wurden;

Methoden zur Überprüfung, ob die Prüfchemikalie ins Zielgewebe oder in den allgemeinen Kreislauf gelangt ist, im Falle negativer Ergebnisse;

tatsächliche Dosis (mg/kg Körpergewicht/Tag), berechnet aus der Konzentration der Prüfchemikalie im Futter/Wasser (ppm) und der Futter- bzw. Wasseraufnahme, falls zutreffend;

Angaben über Futter- und Wasserqualität;

Angaben zur Ausgestaltung der Käfigumgebung;

detaillierte Beschreibung der Behandlungs- und Probenahmepläne und Begründung der jeweils getroffenen Wahl;

Analgesiemethode;

Tötungsmethode;

Verfahren zur Isolierung und Konservierung der Gewebe;

Herkunft und Chargennummern aller Laborkits und Reagenzien (soweit zutreffend);

Methoden zur Auszählung von dominanten Letalgenen;

Paarungsplan;

Verfahren zur Feststellung, ob die Paarung erfolgt ist;

Tötungszeitpunkt;

Kriterien für die Auswertung von DL-Effekten einschließlich Corpora lutea, Implantaten, Resorptionen und Präimplantationsverlusten, lebenden Implantaten und toten Implantaten.

 

Ergebnisse:

Zustand des Tiers vor und während des Prüfzeitraums, einschließlich Anzeichen von Toxizität;

Körpergewicht der männlichen Tiere während der Behandlung und während der Paarungszeit;

Zahl der verpaarten weiblichen Tiere;

gegebenenfalls Dosis-Wirkungsverhältnis;

Daten über Negativkontrolltiere, die gleichzeitig in den Versuch einbezogen waren, und historische Kontrolldaten aus Negativkontrollen mit Angaben zu Bereichen, Mittelwerten und Standardabweichungen;

Daten zu gleichzeitigen Positivkontrollen;

tabellarische Daten zu den einzelnen Muttertieren, Anzahl der Corpora lutea pro Muttertier, Anzahl der Implantate pro Muttertier, Anzahl der Resorptionen und der Präimplantationsverluste pro Muttertier, Anzahl lebender Implantate pro Muttertier, Anzahl toter Implantate pro Muttertier, Gewicht der Feten;

die vorstehenden Daten aggregiert für die einzelnen Paarungszeiten und Dosierungen mit Häufigkeiten dominanter Letalgene;

statistische Analysen und angewandte Methoden.

 

Diskussion der Ergebnisse:

 

Schlussfolgerung.

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Anlage 1

BEGRIFFSBESTIMMUNGEN

Chemikalie: Ein Stoff oder ein Gemisch.

Corpus luteum (Corpora lutea): Endokrines System im Ovarium, das jeweils an einem Follikel entsteht, aus dem eine Eizelle freigesetzt wurde. Die Anzahl der Corpora lutea (Gelbkörper) in den Ovarien (Eierstöcken) entspricht der Anzahl der beim Eisprung ausgestoßenen Eizellen.

DL-Mutation: Eine Mutation, die in der Keimzelle bzw. nach der Befruchtung auftritt und zum Tod des Embryos bzw. des Fötus führt.

Fertilitätsrate: Anzahl der verpaarten trächtigen weiblichen Tiere bezogen auf die Gesamtzahl der verpaarten weiblichen Tiere.

Paarungsintervall: Zeitraum zwischen dem Ende der Exposition und der Paarung behandelter männlicher Tiere. Durch die Steuerung dieses Intervalls können chemische Auswirkungen auf verschiedene Keimzellenarten beurteilt werden. In der Paarungszeit der Mäuse in der 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. und 8. Woche nach Ende der Exposition werden die Auswirkungen auf Spermien, kondensierte Spermatiden, runde Spermatiden, pachytene Spermatozyten, frühe Spermatozyten, differenzierte Spermatogonien und Spermatogoniestammzellen gemessen.

Präimplantationsverluste: Differenz zwischen der Anzahl der Implantate und der Anzahl der Corpora lutea. Die Präimplantationsverluste können auch anhand der Gesamtzahl der Implantate pro weibliches Tier in der behandelten Gruppe und in der Kontrollgruppe berechnet werden.

Postimplantationsverlust: Anteil der toten Implantate in der behandelten Gruppe im Vergleich zum Anteil der toten Implantate bezogen auf die Gesamtzahl der Implantate in der Kontrollgruppe.

Prüfchemikalie: Stoff oder Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode untersucht wird.

UVCB: Chemische Stoffe mit unbekannter oder schwankender Zusammensetzung, komplexe Reaktionsprodukte oder biologische Materialien.

Anlage 2

ZEITLICHER ABLAUF DER SPERMATOGENESE BEI SÄUGETIEREN

Image 1

Abb. 1: Übersicht über die Dauer (in Tagen) der Entwicklung männlicher Keimzellen bei Mäusen und Ratten und beim Menschen. In den grau dargestellten Zeiträumen kommt es nicht zu DNA-Reparaturen.

In der vorstehenden Abbildung wird die Spermatogenese bei Mäusen und Ratten sowie beim Menschen schematisch dargestellt (entnommen aus Adler, 1996). Zu den nicht differenzierten Spermatogonien zählen: Spermatogonien der Typen A single, A paired und A aligned (Hess und de Franca, 2008). Der Typ A single wird als echter Stammzellentyp betrachtet; um die Auswirkungen auf Stammzellen zu beurteilen, müssen daher mindestens 49 Tage (bei Mäusen) zwischen der letzten Injektion der Prüfchemikalie und der Paarung vergehen.

LITERATUR

Adler, I.D. (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans. Mutat Res, 352:169-172.

Hess, R.A., Moore, B.J. (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Hrsg.), Landes Biosciences and Springer Science&Business Media:1-15.

(4)

In Teil B erhält Kapitel B.23 folgende Fassung:

„B.23   SPERMATOGONIEN-PRÜFUNG AUF CHROMOSOMENABERRATIONEN BEI SÄUGETIEREN

EINLEITUNG

1.

Diese Prüfmethode (PM) entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 483 (2016). Die Prüfmethoden werden regelmäßig überarbeitet, um dem wissenschaftlichen Fortschritt, sich ändernden Rechtsvorgaben und Belangen des Tierschutzes gerecht zu werden. Diese modifizierte Fassung der Prüfmethode beruht auf langjähriger Erfahrung mit diesem Versuch und trägt der Tatsache Rechnung, dass die Prüfung in andere Toxizitäts- oder Genotoxizitätsuntersuchungen eingebunden oder mit anderen Toxizitäts- oder Genotoxizitätsuntersuchungen kombiniert werden kann. Durch die Kombination von Toxizitätsuntersuchungen kann die Anzahl der Versuchstiere in Toxizitätsprüfungen verringert werden. Diese Prüfmethode ist Bestandteil einer Reihe von Prüfmethoden zur genetischen Toxikologie. Die OECD hat ein Dokument erstellt, das kurz gefasste und hilfreiche Informationen zu Untersuchungen zur genetischen Toxikologie sowie eine Übersicht über die jüngsten Änderungen der OECD-Prüfrichtlinien zur genetischen Toxikologie enthält (1).

2.

Die In-vivo-Spermatogenienprüfung auf Chromosomenaberrationen bei Säugetieren dient zum Nachweis von Chemikalien, die bei Säugetieren strukturelle Chromosomenaberrationen in den Spermatogonien auslösen (2) (3) (4). Außerdem ist diese Prüfung insbesondere für die Bewertung der Genotoxizität relevant, da trotz artenspezifischer Unterschiede Faktoren des In-vivo-Stoffwechsels, der Pharmakokinetik und von DNA-Reparaturprozessen aktiv sind und zu den Reaktionen beitragen. Allerdings ist diese Methode nicht zur Messung numerischer Anomalien bestimmt und wird folglich auch nicht routinemäßig dafür eingesetzt.

3.

Mit dieser Prüfung werden strukturelle Chromosomenaberrationen (sowohl Chromosomentyp- als auch Chromatidtypaberrationen) bei der Teilung von Spermatogonien festgestellt, so dass Prognosen zur Auslösung vererbbarer Mutationen in Keimzellen getroffen werden können.

4.

Definitionen der Schlüsselbegriffe sind der Anlage zu entnehmen.

AUSGANGSÜBERLEGUNGEN

5.

Bei dieser Prüfung werden routinemäßig Nager eingesetzt, aber auch andere Arten können in einigen Fällen geeignet sein, sofern dies wissenschaftlich gerechtfertigt wird. Normalerweise entwickeln sich während der Zytogenese von Nagetierhoden mitotische (Spermatogonien) und meiotische (Spermatozyten) Metaphasen. Mitotische und meiotische Metaphasen werden nach der Chromosomenmorphologie bestimmt (4). Mit dieser zytogenetischen In-vivo-Prüfung werden strukturelle Chromosomenaberrationen in Mitosen von Spermatogonien ermittelt. Andere Zielzellen sind nicht Gegenstand dieser Prüfmethode.

6.

Zum Nachweis von Chromatidentypaberrationen in Spermatogonien ist die erste mitotische Zellteilung nach der Behandlung zu untersuchen, bevor diese Aberrationen sich bei anschließenden Zellteilungen zu Chromosomentypaberrationen entwickeln. Die meiotische Chromosomenanalyse der Spermatozyten in der Diakinese-Metaphase I und der Metaphase II auf Aberrationen der Chromosomenstruktur kann weitere nützliche Informationen liefern.

7.

In den Hoden finden sich mehrere Generationen von Spermatogonien (5); diese verschiedenen Keimzellenarten reagieren unterschiedlich empfindlich auf die Behandlung mit Chemikalien. Die festgestellten Aberrationen stellen also eine Gesamtreaktion der behandelten Spermatogoniepopulationen dar. Die meisten mitotischen Zellen in Hodenpräperaten sind B-Spermatogonien mit einem Zellzyklus von 26 h (3).

8.

Wenn Anzeichen dafür bestehen, dass die Prüfchemikalie oder ein reaktiver Metabolit bzw. reaktive Metaboliten die Hoden nicht erreicht bzw. erreichen, ist diese Prüfung nicht geeignet.

PRINZIP DER PRÜFMETHODE

9.

Im Allgemeinen werden die Tiere über einen geeigneten Expositionsweg mit einer Prüfchemikalie behandelt und zu geeigneten Zeitpunkten nach der Behandlung getötet. Vor der Tötung werden die Tiere mit einem Spindelgift (z. B. Colchicin oder Colcemid®) behandelt. Aus den Keimzellen werden dann Chromosomen präpariert und gefärbt, und die Metaphasezellen werden auf Chromosomenaberrationen untersucht.

ÜBERPRÜFUNG DER EIGNUNG DES LABORS

10.

Die Kompetenz zur Durchführung dieses Versuchs sollte durch den Nachweis der Fähigkeit zur Reproduktion der erwarteten Ergebnisse in Bezug auf die Häufigkeit struktureller Chromosomenaberrationen bei Spermatogonien mit Positivkontrollstoffen (einschließlich schwacher Reaktionen) wie in Tabelle 1 genannt und durch Ermittlung von Häufigkeiten bei Negativkontrollen in einem annehmbaren Kontrolldatenbereich (siehe vorstehende Literatur, z. B. (2)(3)(6)(7)(8)(9)(10)) oder – wenn verfügbar – durch die historische Kontrollverteilung des jeweiligen Labors belegt werden.

BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE

Vorbereitungen

Auswahl von Versuchstierarten

11.

Es sollten junge gesunde und geschlechtsreife Tiere üblicher Labortierstämme zum Einsatz kommen. Im Allgemeinen werden männliche Mäuse verwendet; allerdings können auch männliche Tiere sonstiger geeigneter Säugetierarten zum Einsatz kommen, wenn dies wissenschaftlich gerechtfertigt ist und diese Prüfung dann in Verbindung mit einer anderen Prüfmethode durchgeführt werden kann. Die wissenschaftliche Begründung für die Verwendung anderer Versuchstiere als Nager sollte in den Bericht aufgenommen werden.

Haltungs- und Fütterungsbedingungen

12.

Bei Nagern sollte die Temperatur im Versuchstierraum 22 °C (± 3 °C) betragen. Die relative Luftfeuchtigkeit sollte vorzugsweise bei 50 bis 60 % liegen, mindestens aber 40 % betragen und außer bei Reinigung des Raumes 70 % nicht übersteigen. Der Raum sollte künstlich beleuchtet sein, wobei die Beleuchtung im 12-Stunden-Rhythmus ein- und ausgeschaltet werden sollte. An die Versuchstiere kann herkömmliches Laborfutter verfüttert werden, wobei eine unbegrenzte Trinkwasserversorgung zu gewährleisten ist. Die Auswahl des Futters wird eventuell dadurch beeinflusst, dass eine geeignete Beimischung einer Prüfchemikalie gewährleistet werden muss, wenn diese über das Futter verabreicht wird. Nager sollten in kleinen Gruppen (maximal fünf pro Käfig) untergebracht werden, sofern kein aggressives Verhalten zu erwarten ist, vorzugsweise in Käfigen mit festem Boden und angemessener Ausgestaltung des Lebensumfelds. Sie können auch einzeln gehalten werden, wenn dies wissenschaftlich gerechtfertigt ist.

Vorbereitung der Versuchstiere

13.

Gewöhnlich werden gesunde, adulte männliche Tiere (zu Beginn der Behandlung 8-12 Wochen alt) nach dem Zufallsprinzip in die Kontroll- bzw. Behandlungsgruppen eingeteilt. Es erfolgt eine Einzelidentifizierung der Tiere unter Verwendung einer humanen, minimalinvasiven Methode (z. B. durch Anbringen von Ringen, Marken oder Mikrochips oder durch biometrische Identifizierung, nicht jedoch durch Kupieren der Ohren oder Zehen). Die Tiere werden über einen Zeitraum von mindestens fünf Tagen unter Laborbedingungen eingewöhnt. Die Käfige sind so aufzustellen, dass etwaige standortbedingte Auswirkungen möglichst gering sind. Eine gegenseitige Kontamination durch die Positivkontrolle und die Prüfchemikalie ist zu vermeiden. Zu Beginn des Versuchs sollte die Abweichung des Körpergewichts der einzelnen Tiere möglichst gering sein und nicht mehr als ± 20 % betragen.

Vorbereitung der Dosierung

14.

Feste Prüfchemikalien sollten vor der Verabreichung an die Tiere in geeigneten Lösungsmitteln oder Vehikeln gelöst oder suspendiert oder in das Futter bzw. das Trinkwasser gegeben werden. Flüssige Prüfchemikalien können direkt verabreicht oder zuvor verdünnt werden. Bei Exposition durch Inhalation können die Prüfchemikalien je nach ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften als Gase, Dämpfe oder festes/flüssiges Aerosol verabreicht werden. Es sind frische Zubereitungen der Prüfchemikalie zu verwenden, es sei denn, die Stabilität der Chemikalie bei Lagerung wird nachgewiesen, und die entsprechenden Lagerbedingungen werden definiert.

Prüfbedingungen – Lösungsmittel/Vehikel

15.

Das Lösungsmittel/Vehikel sollte bei den gewählten Dosierungen keine toxischen Wirkungen hervorrufen und mit den Prüfchemikalien keine chemische Reaktion eingehen. Werden keine allgemein bekannten Lösungsmittel/Vehikel verwendet, so sind Referenzdaten zur Kompatibilität beizubringen. Nach Möglichkeit sollte ein wässriges Lösungsmittel/Vehikel verwendet werden. Beispiele für üblicherweise verwendete, kompatible Lösungsmittel/Vehikel sind Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Methylcelluloselösung, Carboxymethylcellulose-Natriumsalzlösung, Olivenöl und Maisöl. Liegen keine historischen oder veröffentlichten Kontrolldaten vor, aus denen hervorgeht, dass keine strukturellen Chromosomenaberrationen und keine anderen schädlichen Wirkungen von einem gewählten, nicht gängigen Lösungsmittel/Vehikel ausgehen, sollte die Eignung des Lösungsmittels/Vehikels in einem Vorversuch nachgewiesen werden.

Positivkontrollen

16.

Grundsätzlich sind parallel Positivkontrolltiere zu verwenden, wenn das Labor nicht seine Befähigung zur Durchführung der Prüfung nachgewiesen und die Prüfung in letzter Zeit (beispielsweise in den letzten 5 Jahren) nicht regelmäßig durchgeführt hat. Umfasst der Versuch keine gleichzeitige Positivkontrolle, sollten Auswertungskontrollen (fixierte und nicht angefärbte Objektträger) einbezogen werden. Dazu eignen sich Referenzproben, die im Rahmen eines gesonderten Positivkontrollversuchs in dem Labor entnommen und gelagert wurden, das den Versuch in regelmäßigen Zeitabständen (z. B. alle 6 bis 18 Monate) durchführt (z. B. bei Eignungsprüfungen und danach ggf. auf regelmäßiger Basis).

17.

Positivkontrollstoffe sollten zuverlässig bewirken, dass die Häufigkeiten der Zellen mit Chromosomenaberrationen gemessen an den spontan entstehenden Zellmengen nachweislich zunehmen. Positivkontrolldosen sollten so gewählt werden, dass die Wirkungen eindeutig sind, die Labortechniker die kodierten Proben aber nicht identifizieren können. Beispiele für Positivkontrollstoffe sind Tabelle 1 zu entnehmen.

Tabelle 1

Beispiele für Positivkontrollstoffe

Stoffe [CAS-Nr.] (Referenznummer)

Cyclophosphamid(monohydrat) [CAS-Nr. 50-18-0 (CAS-Nr. 6055-19-2)] (9)

Cyclohexylamin [CAS-Nr. 108-91-8] (7)

Mitomycin C [CAS-Nr. 50-07-7] (6)

Monomeres Acrylamid [CAS 79-06-1] (10)

Triethylenmelamin [CAS-Nr. 51-18-3] (8)

Negativkontrollen

18.

In jede Probenahme sind Negativkontrolltiere einzubeziehen, die nur ein Lösungsmittel oder ein Vehikel erhalten und ansonsten in derselben Weise behandelt wurden wie die Behandlungsgruppen. Um die Eignung der Vehikelkontrolle festzustellen, sollten darüber hinaus in jede Probenahme auch unbehandelte Kontrolltiere einbezogen werden, soweit keine historischen oder veröffentlichten Kontrolldaten vorliegen, aus denen hervorgeht, dass das gewählte Lösungsmittel/Vehikel keine Chromosomenaberrationen und keine sonstigen schädlichen Wirkungen induziert.

VERFAHREN

Anzahl der Versuchstiere

19.

Zu Beginn der Studie sollten die Gruppengrößen so bestimmt werden, dass pro Gruppe mindestens 5 männliche Tiere einbezogen werden. Diese Anzahl der Tiere pro Gruppe gilt als ausreichend für eine angemessene statistische Aussagekraft (d. h. für den Nachweis mindestens einer Verdopplung der Häufigkeit einer Chromosomenaberration bei einer Konzentration der Negativkontrolle von mindestens 1,0 % bei einer Wahrscheinlichkeit von 80 % und einer Signifikanz von 0,05) (3) (11). Als typische Höchstmenge an Versuchstieren bei einer Untersuchung mit zwei Probenahmezeitpunkten, drei Dosisgruppen und einer gleichzeitigen Negativkontrollgruppe zuzüglich einer Positivkontrollgruppe (wobei jede Gruppe aus fünf Tieren besteht) kann von maximal 45 Versuchstieren ausgegangen werden.

Behandlungsplan

20.

Die Prüfchemikalien werden gewöhnlich einmal verabreicht (d. h. als Einzelbehandlung); wenn wissenschaftlich gerechtfertigt, können auch andere Dosierungspläne verwendet werden.

21.

In der Gruppe mit der höchsten Dosis wird zu zwei verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung eine Stichprobe entnommen. Da die für die Aufnahme und Metabolisierung der Prüfchemikalie(n) sowie für die Wirkung auf die Zellzykluskinetik benötigte Zeit den optimalen Zeitpunkt für die Feststellung von Chromosomenaberrationen beeinflussen kann, erfolgen eine frühe Probenahme und eine weitere Probenahme etwa 24 bzw. 48 Stunden nach der Behandlung. Wenn nicht die Höchstdosis verabreicht wird, sollte die erste Probe 24 Stunden nach der Behandlung (d. h. spätestens bei Ablauf des Zellzyklus der B-Spermatogonien zur Maximierung der Wahrscheinlichkeit der Bewertung der ersten Metaphasen nach der Behandlung) entnommen werden, wenn nicht ein anderer Zeitpunkt für die Probenahme als besser geeignet bekannt und gerechtfertigt ist.

22.

Für die Probenahme kommen auch andere Zeitpunkte in Frage. Bei Chemikalien, die beispielsweise S-unabhängige Effekte auslösen, ist möglicherweise eine Probenahme zu früheren Zeitpunkten (d. h. nach weniger als 24 h) angebracht.

23.

Ein Behandlungsverfahren mit Wiederholungsdosis kann zur Anwendung kommen, beispielsweise in Verbindung mit einer Prüfung mit einem anderen Endpunkt und einem Verabreichungszeitraum von 28 Tagen (z. B. PM B.58); in diesem Fall werden jedoch weitere Tiergruppen benötigt, damit Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten genommen werden können. Die Eignung eines solchen Verfahrens muss jedoch in jedem Einzelfall wissenschaftlich gerechtfertigt sein.

24.

Vor der Tötung wird den Tieren intraperitoneal eine geeignete Dosis eines Spindelgifts (z. B. Colcemid® oder Colchicin) verabreicht. Die Tiere werden dann zu einem geeigneten Zeitpunkt aufgearbeitet. Bei Mäusen und Ratten beträgt die betreffende Zeitspanne 3-5 Stunden.

Dosierungen

25.

Wenn zunächst eine Dosisfindungsstudie durchgeführt wird, da noch keine geeigneten Daten aus anderen einschlägigen Studien zur Dosierungswahl vorliegen, sollte diese im selben Labor unter Verwendung von Tieren derselben Art und Rasse sowie nach demselben Behandlungsverfahren stattfinden, die nach den Empfehlungen für die Durchführung von Dosisfindungsstudien in der Hauptstudie durchzuführen sind (12). Ziel der Studie sollte sein, die maximal verträgliche Dosis (MTD) zu ermitteln, die als die Dosis definiert ist, die für die Dauer der Studie leichte toxische Wirkungen (z. B. Abweichungen in Verhalten oder Reaktionen, einen geringen Rückgang des Körpergewichts oder Zytotoxizität des blutbildenden Systems) induziert, jedoch weder zum Tod führt noch Anzeichen von Schmerzen, Leiden oder Ängsten hervorruft, die eine Tötung erforderlich machen würden (13).

26.

Die Höchstdosis kann auch als jene Dosis definiert werden, die bestimmte Anzeichen von Toxizität in den Spermatogonien hervorruft (z. B. eine Reduzierung des Verhältnisses der Spermatogonienmitosen zur ersten und zweiten meiotischen Metaphase). Diese Reduzierung sollte nicht mehr als 50 % betragen.

27.

Prüfchemikalien mit spezifischen biologischen Aktivitäten bei niedrigen, nicht toxischen Dosen (wie Hormone und Mitogene) und Chemikalien mit gesättigten toxikokinetischen Eigenschaften können als Ausnahmen von den Kriterien zur Dosisfestsetzung angesehen werden und sind auf Fallbasis zu bewerten.

28.

Um Dosis-Wirkungs-Informationen zu erhalten, sollte eine vollständige Studie eine Negativkontrollgruppe (Nummer 18) und mindestens drei Dosierungen enthalten, die sich in der Regel um einen Faktor von 2 (maximal von 4) unterscheiden. Ruft die Prüfchemikalie in einer Dosisfindungsstudie oder nach bereits vorhandenen Daten keine Toxizität hervor, so sollte die Höchstdosis für eine Einzelgabe 2 000 mg/kg Körpergewicht betragen. Ruft die Prüfchemikalie jedoch Toxizität hervor, sollte die MTD die höchste verabreichte Dosierung sein und die Dosierung vorzugsweise einen Bereich vom Höchstwert bis zu einer Dosierung abdecken, die wenig oder keine Toxizität erzeugt. Wenn bei allen untersuchten Dosierungen toxische Wirkungen im Zielgewebe (d. h. in den Hoden) beobachtet werden, sind weitere Untersuchungen bei nichttoxischen Dosierungen anzuraten. Studien zur ausführlicheren Charakterisierung der quantitativen Dosis-Wirkungs-Informationen erfordern gegebenenfalls weitere Dosisgruppen. Bei bestimmten Arten von Prüfchemikalien (z. B. Humanpharmazeutika), für die spezielle Anforderungen gelten, können die Grenzen variieren. Wenn die Prüfchemikalie keine toxische Wirkung induziert, sollten die Grenzdosis sowie zwei geringere Dosen (wie oben beschrieben) ausgewählt werden. Die Grenzdosis für einen Verabreichungszeitraum von mindestens 14 Tagen beträgt 1 000 mg/kg Körpergewicht/Tag und bei Verabreichungszeiträumen von weniger als 14 Tagen 2 000 mg/kg Körpergewicht/Tag.

Verabreichung der Dosen

29.

Bei der Versuchsplanung ist der zu erwartende Expositionsweg beim Menschen zu berücksichtigen. Daher können mit entsprechender Begründung Verabreichungswege wie etwa eine Aufnahme über die Nahrung, über das Trinkwasser, eine topische, subkutane, intravenöse oder orale (über eine Magensonde) Verabreichung oder eine Verabreichung durch Inhalation oder Implantation gewählt werden. In jedem Fall sollte der Verabreichungsweg so gewählt werden, dass eine angemessene Exposition des Zielgewebes sichergestellt ist. Eine Intraperitonealinjektion wird in der Regel nur in wissenschaftlich gerechtfertigten Fällen empfohlen, weil sie beim Menschen gewöhnlich keinen physiologisch relevanten Expositionsweg darstellt. Sofern die Prüfchemikalie der Nahrung oder dem Trinkwasser beigemischt wird, insbesondere im Fall von Einzeldosierungen, ist darauf zu achten, einen ausreichenden Abstand zwischen der Nahrungsmittel- und Trinkwasseraufnahme und der Probenahme einzuhalten, damit ein Nachweis der Wirkungen möglich ist (Nummer 33). Welches Flüssigkeitsvolumen jeweils höchstens durch Sonde oder Injektion verabreicht werden kann, hängt von der Größe des Versuchstiers ab. Das Volumen sollte im Normalfall 1 ml/100 g Körpergewicht nicht überschreiten, bei wässrigen Lösungen kommen aber auch 2 ml/100 g Körpergewicht in Betracht. Werden größere Volumina verwendet (sofern nach Tierschutzvorschriften erlaubt), ist dies zu begründen. Schwankungen der Prüfvolumina sind durch entsprechende Dosierung so gering wie möglich zu halten, damit bei allen Dosen ein gemessen am Körpergewicht gleich bleibendes Volumen gewährleistet ist.

Anmerkungen

30.

Mindestens einmal täglich – vorzugsweise zum gleichen Zeitpunkt und unter Berücksichtigung des Zeitraums, in dem der Wirkungsgipfel nach Verabreichung der Dosis zu erwarten ist – sollten allgemeine klinische Beobachtungen der Versuchstiere vorgenommen und protokolliert werden. Mindestens zweimal täglich sind alle Tiere auf Morbidität und Mortalität zu überprüfen. Alle Tiere sollten zu Studienbeginn und mindestens einmal pro Woche bei Studien mit wiederholter Verabreichung sowie bei der Tötung gewogen werden. In Studien von mindestens einwöchiger Dauer sollten mindestens wöchentlich Messungen der Futteraufnahme vorgenommen werden. Wenn die Prüfchemikalie über das Trinkwasser verabreicht wird, sollte auch die Wasseraufnahme bei jedem Wasserwechsel und mindestens einmal wöchentlich gemessen werden. Tiere mit Anzeichen von übermäßiger, jedoch nicht tödlich wirkender Toxizität sollten vor Ende des Prüfzeitraums getötet werden (13).

Chromosomenpräparation

31.

Unmittelbar nach der Tötung werden aus einem oder beiden Hoden Keimzellsuspensionen gewonnen, mit hypotoner Lösung behandelt und nach festgelegten Protokollen (z. B. (2) (14) (15)) fixiert. Die Zellen werden dann auf Objektträger aufgetropft und gefärbt (16) (17). Alle Objektträger sollten kodiert werden, damit sie bei der Auswertung nicht identifiziert werden können.

Analyse

32.

Bei jedem Tier sollten mindestens 200 gut gespreizte Metaphasen analysiert werden (3)(11). Wenn die historische Häufigkeit bei Negativkontrollen < 1 % ist, sollten mehr als 200 Zellen pro Tier ausgewertet werden, um die statistische Aussagekraft zu erhöhen (3). Die angewendeten Färbemethoden sollten eine Identifizierung der Zentromere ermöglichen.

33.

Chromosomentyp- und Chromatidentypaberrationen sollten gesondert erfasst und Subtypen zugeordnet werden (Brüche, Austausche). Bei der Prüfung, ob eine Chemikalie signifikante Erhöhungen der Inzidenz von Zellen mit Chromosomenaberrationen induziert, sollten Gaps erfasst, aber nicht berücksichtigt werden. Die Laborpraxis sollte gewährleisten, dass die Chromosomenaberrationen von gut ausgebildeten Labortechnikern analysiert werden. Da es bei der Präparation der Objektträger häufig zum Bruch eines Teils der Metaphasezellen und zum Verlust von Chromosomen kommt, sollten die ausgewerteten Zellen eine Zentromerzahl enthalten, die der Zahl 2n ± 2 entspricht, wobei n die haploide Chromosomenzahl für diese Spezies ist.

34.

Obwohl es bei der Prüfung um den Nachweis struktureller Chromosomenaberrationen geht, sind die Häufigkeiten von polyploiden Zellen und von Zellen mit endoreduplizierten Chromosomen bei Feststellung zu vermerken (Nummer 44).

DATEN UND BERICHTERSTATTUNG

Behandlung der Ergebnisse

35.

Die Daten für die einzelnen Tiere sind in tabellarischer Form darzustellen. Für jedes Tier sind die Anzahl der Zellen mit strukturellen Chromosomenaberrationen und die Anzahl der Chromosomenaberrationen je Zelle anzugeben. Chromatidentyp- und Chromosomentypaberrationen, die Subtypen zugeordnet sind (Brüche, Austausche), sollten dabei unter Angabe ihrer Anzahl und Häufigkeit für Versuchs- und Kontrollgruppen getrennt erfasst werden. Gaps werden gesondert vermerkt. Die Häufigkeit der Gaps ist anzugeben, wird in der Regel bei der Analyse der Gesamthäufigkeit der Chromosomenaberrationen jedoch nicht berücksichtigt. Der Anteil der Zellen mit Polyploidie und der Zellen mit endoreduplizierten Chromosomen wird angegeben, sofern beobachtet.

36.

Daten zur Toxizität und klinische Anzeichen (gemäß Nummer 30) sind zu dokumentieren.

Akzeptanzkriterien

37.

Die folgenden Kriterien entscheiden über die Gültigkeit eines Versuchs:

Die gleichzeitige Negativkontrolle wird im Einklang mit veröffentlichten Normen für historische Negativkontrolldaten (die im Allgemeinen bei > 0 % und ≤ 1,5 % Zellen mit Chromosomenaberrationen liegen sollten) und (sofern verfügbar) mit den historischen Kontrolldaten des Labors durchgeführt (Nummern 10 und 18).

Gleichzeitige Positivkontrollen induzieren Reaktionen, die im Einklang mit veröffentlichten Normen für historische Positivkontrolldaten bzw. mit den historischen Kontrolldaten des Labors (sofern verfügbar) stehen und bewirken eine statistisch signifikante Erhöhung im Vergleich zur Negativkontrolle (Nummern 17 und 18).

Eine angemessene Zahl an Zellen und Dosierungen wurde analysiert (Nummern 28 und 32).

Die Kriterien für die Auswahl der Höchstdosis entsprechen den Kriterien unter den Nummern 25 und 26.

38.

Werden sowohl Mitosen als auch Meiosen beobachtet, ist das Verhältnis der Spermatogonienmitosen zur ersten und zweiten meiotischen Metaphase als Gradmesser der Zytotoxizität bei allen behandelten Tieren und bei Tieren der Negativkontrolle in einer Gesamtstichprobe von 100 sich teilenden Zellen zu bestimmen, um eine mögliche zytotoxische Wirkung festzustellen. Werden nur Mitosen beobachtet, so ist der Mitoseindex für mindestens 1 000 Zellen je Tier zu bestimmen.

Beurteilung und Auswertung

39.

Es sind mindestens drei behandelte Dosisgruppen zu analysieren, um ausreichende Daten für Dosis-Wirkungs-Analysen zu liefern.

40.

Unter der Voraussetzung, dass alle Akzeptanzkriterien erfüllt sind, gilt eine Prüfchemikalie als eindeutig positiv, wenn

mindestens eine der Versuchsdosierungen eine statistisch signifikante Zunahme gegenüber der gleichzeitigen Negativkontrolle aufweist,

die Zunahme zumindest bei einer Probenahme dosisabhängig ist, und

Ergebnisse außerhalb des akzeptablen Bereichs für Negativkontrolldaten bzw. der Verteilung der historischen Negativkontrolldaten des Labors (z. B. der auf einer Poisson-Verteilung beruhenden Kontrollgrenze von 95 %) liegen (sofern verfügbar).

Wenn diese Voraussetzungen erfüllt sind, wird angenommen, dass die Prüfchemikalie in Keimzellen der Versuchstiere Chromosomenaberrationen induziert. Empfehlungen zu den am besten geeigneten statistischen Methoden sind der Literatur zu entnehmen (11) (18). Die verwendeten statistischen Prüfungen müssen das Tier als Versuchseinheit berücksichtigen.

41.

Unter der Voraussetzung, dass alle Akzeptanzkriterien erfüllt sind, gilt eine Prüfchemikalie als eindeutig negativ, wenn

keine der Versuchsdosierungen eine statistisch signifikante Zunahme gegenüber der gleichzeitigen Negativkontrolle aufweist,

bei keiner Versuchsbedingung eine dosisabhängige Zunahme festzustellen ist und

alle Ergebnisse innerhalb eines akzeptablen Bereichs der historischen Negativkontrolldaten des Labors (z. B. der auf einer Poisson-Verteilung beruhenden Kontrollgrenze von 95 %) liegen (sofern verfügbar).

Wenn diese Voraussetzungen erfüllt sind, wird angenommen, dass die Prüfchemikalie in Keimzellen der Versuchstiere keine Chromosomenaberrationen induziert. Empfehlungen zu den am besten geeigneten statistischen Methoden sind der Literatur zu entnehmen (11) (18). Ein negatives Ergebnis schließt nicht aus, dass die Chemikalie Chromosomenaberrationen in späteren Entwicklungsphasen induzieren könnte, die noch nicht untersucht wurden, oder dass sie Genmutationen auslöst.

42.

Bei einer eindeutig positiven oder negativen Reaktion ist eine Verifizierung nicht erforderlich.

43.

In den Fällen, in denen die Reaktion weder eindeutig negativ noch eindeutig positiv ist, oder um die biologische Relevanz eines Ergebnisses zu untermauern (z. B. eine geringe oder grenzwertige Zunahme), sollten die Daten durch eine fachkundige Beurteilung und/oder anhand weiterer Untersuchungen der vorliegenden abgeschlossenen Versuche bewertet werden (beispielsweise wenn beurteilt werden soll, ob das positive Ergebnis außerhalb des akzeptablen Bereichs von Negativkontrolldaten oder der historischen Negativdaten des betreffenden Labors liegt) (19).

44.

In seltenen Fällen erlaubt der Datensatz selbst nach weiteren Untersuchungen keine definitive Aussage zu positiven oder negativen Ergebnissen, so dass die Reaktion als nicht eindeutig eingestuft wird.

45.

Eine zahlenmäßige Zunahme der polyploiden Zellen deutet möglicherweise darauf hin, dass die Prüfchemikalie mitotische Prozesse zu hemmen und numerische Chromosomenaberrationen hervorzurufen vermag (20). Eine zahlenmäßige Zunahme der Zellen mit endoreduplizierten Chromosomen ist möglicherweise ein Anzeichen dafür, dass die Prüfchemikalie die Zellzyklusprogression zu hemmen vermag (21) (22), die neben der Hemmung mitotischer Prozesse ebenfalls ein Mechanismus der Induzierung numerischer Chromosomenänderungen ist (Nummer 2). Die Inzidenz von polyploiden Zellen und Zellen mit endoreduplizierten Chromosomen sollte daher getrennt erfasst werden.

Prüfbericht

46.

Der Prüfbericht sollte folgende Angaben enthalten:

 

Zusammenfassung

 

Prüfchemikalie:

Herkunft, Chargennummer, ggf. begrenztes Verwendungsdatum;

Stabilität der Prüfchemikalie, falls bekannt;

Löslichkeit und Stabilität der Prüfchemikalie im Lösungsmittel, falls bekannt;

Messung des pH-Werts, der Osmolalität und ggf. des Niederschlags im Kulturmedium, dem die Prüfchemikalie zugegeben wurde.

 

Einkomponentiger Stoff:

physikalisches Erscheinungsbild, Wasserlöslichkeit und weitere relevante physikalisch-chemische Eigenschaften;

chemische Bezeichnung, wie z. B. IUPAC- oder CAS-Bezeichnung, CAS-Nummer, SMILES- oder InChI-Code, Strukturformel, Reinheit, chemische Zusammensetzung von Verunreinigungen, soweit zutreffend und praktisch durchführbar, usw.

 

Mehrkomponentiger Stoff, UVCB-Stoffe und Gemische:

so weit wie möglich charakterisiert durch die chemische Zusammensetzung (siehe oben), das quantitative Vorkommen und die relevanten physikalisch-chemischen Eigenschaften der einzelnen Komponenten.

 

Zubereitung der Prüfchemikalie:

Begründung der Auswahl des Vehikels.

Löslichkeit und Stabilität der Prüfchemikalie im Lösungsmittel/Vehikel, falls bekannt;

Zubereitung von Formulierungen für Nahrung, Trinkwasser oder Inhalationspräparaten;

analytische Bestimmungen der Formulierungen (z. B. Stabilität, Homogenität, nominale Konzentrationen), wenn durchgeführt.

 

Versuchstiere:

verwendete(r) Spezies/Stamm, Begründung für deren Verwendung;

Anzahl und Alter der Tiere;

Herkunft der Tiere, Haltungsbedingungen, Futter usw.;

Methode zur eindeutigen Identifizierung der Tiere;

bei Kurzzeitstudien: individuelles Gewicht der Tiere zu Beginn und am Ende der Studie; bei Studien über einer Woche: individuelles Körpergewicht während der Studie und Futteraufnahme. Bereich des Körpergewichts, Mittelwert und Standardabweichung für jede Gruppe.

 

Prüfbedingungen:

Daten zu den Positiv- und Negativkontrollen (Vehikel/Lösungsmittel),

Daten aus einer gegebenenfalls durchgeführten Dosisfindungsstudie;

Begründung der gewählten Dosisstufen;

Begründung des Verabreichungswegs;

Angaben zur Zubereitung der Prüfchemikalie;

Angaben zur Verabreichung der Prüfchemikalie;

Begründung für die Tötungszeiten;

Methoden zur Toxizitätsmessung beim Tier, einschließlich, soweit verfügbar, histopathologischer oder hämatologischer Analysen, sowie Angaben zur Häufigkeit, mit der die Tiere beobachtet und ihre Körpergewichte gemessen wurden,

Methoden zur Überprüfung, ob die Prüfchemikalie ins Zielgewebe oder in den allgemeinen Kreislauf gelangt ist, im Falle negativer Ergebnisse;

tatsächliche Dosis (mg/kg Körpergewicht/Tag), berechnet aus der Konzentration der Prüfchemikalie im Futter/Wasser (ppm) und der Futter- bzw. Wasseraufnahme, falls zutreffend;

Angaben über Futter- und Wasserqualität;

detaillierte Beschreibung der Behandlungs- und Probenahmepläne und Begründung der jeweils getroffenen Wahl;

Tötungsmethode;

Analgesiemethode (sofern angewandt);

Verfahren zur Isolierung von Geweben;

Bezeichnung des Spindelgifts, Konzentration und Behandlungsdauer;

Methode für die Präparation der Objektträger;

Kriterien für die Auswertung der Aberrationen;

Anzahl der analysierten Zellen pro Tier;

Kriterien zur Einstufung der Studien als positiv, negativ oder nicht eindeutig.

 

Ergebnisse:

Zustand des Tiers vor und während des Prüfungszeitraums, einschließlich Anzeichen von Toxizität;

Körper- und Organgewichte bei der Tötung (bei Mehrfachbehandlungen Körpergewichte während des Behandlungsverfahrens);

Toxizitätszeichen;

Mitoseindex;

Verhältnis von Spermatogonienmitosen zur ersten und zweiten meiotischen Metaphase oder sonstige Anzeichen einer Exposition des Zielgewebes;

Typ und Anzahl der Aberrationen, für jedes Tier gesondert anzugeben;

Gesamtzahl der Aberrationen pro Gruppe mit Mittelwerten und Standardabweichungen;

Anzahl der Zellen mit Aberrationen pro Gruppe mit Mittelwerten und Standardabweichungen;

gegebenenfalls Dosis-Wirkungsverhältnis;

statistische Analysen und angewandte Methoden.

Daten zu gleichzeitigen Negativkontrollen;

historische Negativkontrolldaten mit Bereichen, Mittelwerten und Standardabweichungen und 95-%-Grenzen für die Verteilung (wenn verfügbar) oder für die Bewertung der Annehmbarkeit der Prüfergebnisse berücksichtigte veröffentliche historische Negativkontrolldaten;

Daten zu gleichzeitigen Positivkontrollen;

ggf. beobachtete Veränderungen der Ploidie, einschließlich Häufigkeiten von polyploiden und/oder endoreduplizierten Zellen;

 

Erörterung der Ergebnisse

 

Schlussfolgerung

LITERATUR

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(22)

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Anlage

BEGRIFFSBESTIMMUNGEN

Aneuploidie: Abweichung von der normalen diploiden (oder haploiden) Chromosomenzahl durch ein einziges Chromosom oder mehr, nicht aber durch einen ganzen (oder mehrere) Chromosomensatz/-sätze (Polyploidie).

Chemikalie: Ein Stoff oder ein Gemisch.

Chromatidentypaberration: Strukturelle Chromosomenanomalie, gekennzeichnet durch Bruch einzelner Chromatiden oder Bruch und Reunion von Chromatiden.

Chromosomentypaberration: Strukturelle Chromosomenanomalie, gekennzeichnet durch Bruch oder Bruch und Reunion beider Chromatiden an gleicher Position.

Chromosomenvielfalt: Vielfalt der Formen (metazentrisch, akrozentrisch usw.) und Größen von Chromosomen.

Clastogen: Jede Chemikalie, die strukturelle Chromosomenaberrationen in Zell- oder Organismenpopulationen verursacht.

Genotoxisch: Allgemeiner Begriff, der alle Typen von DNA- oder Chromosomenschädigungen umfasst, einschließlich Brüchen, Deletionen, Addukten, Nukleotidmodifikationen und -verknüpfungen, Rearrangements, Mutationen, Chromosomenaberrationen sowie Aneuploidie. Nicht alle genotoxischen Effekte führen zu Mutationen oder stabilen Chromosomenschäden.

Gap: Achromatische Läsion von geringerer Breite als eine Chromatide und mit minimaler Verlagerung der Chromatiden.

Mitose: Teilung des Zellkerns, die in der Regel in Prophase, Prometaphase, Metaphase, Anaphase und Telophase gegliedert ist.

Mitoseindex (MI): Anteil der Zellen einer Zellpopulation, die sich zum Beobachtungszeitpunkt in der Metaphase befinden: Gradmesser für den Vermehrungsgrad dieser Population.

Mutagen: Auslöser einer Erbgutveränderung der DNA-Basenpaarsequenz(en) in Genen oder in der Chromosomenstruktur (Chromosomenaberrationen).

Numerische Anomalie: Abweichung der Chromosomenzahl vom Normalwert, der für die verwendeten Tiere charakteristisch ist.

Polyploidie: Vorhandensein von mehr als zwei haploiden Chromosomensätzen (n) (z. B. 3n, 4n usw.).

Prüfchemikalie: Stoff oder Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode untersucht wird.

Strukturelle Aberration: Veränderung der Chromosomenstruktur, nachweisbar durch mikroskopische Untersuchung des Metaphase-Stadiums der Zellteilung, äußert sich in Form von Deletionen und Fragmenten, Austauschen.

UVCB: Chemische Stoffe mit unbekannter oder schwankender Zusammensetzung, komplexe Reaktionsprodukte oder biologische Materialien.

Zentromer: Region(en) eines Chromosoms, an die während der Zellteilung die Spindelfasern anhaften, wodurch die ordnungsgemäße Beförderung der Tochterchromosomen zu den Polen der Tochterzellen ermöglicht wird.

(5)

In Teil B erhält Kapitel B.40 folgende Fassung:

„B.40    IN VITRO-HAUTVERÄTZUNG: TER-PRÜFMETHODE

EINLEITUNG

1.

Diese Prüfmethode (PM) entspricht der OECD-Prüfrichtlinie 430 (2015). Als Hautverätzung wird das Auslösen einer irreversiblen Hautschädigung, d. h. einer sichtbaren, bis in das Corium reichenden Nekrose der Epidermis nach Applikation einer Prüfchemikalie [im Sinne der Definition des Global harmonisierten Systems zur Einstufung und Kennzeichnung von Gefahrstoffen der UN (GHS) (1) und der Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 über die Einstufung, Kennzeichnung und Verpackung von Stoffen und Gemischen (CLP-Verordnung) (1)] bezeichnet. Diese aktualisierte Prüfmethode B.40 besteht in einem In-vitro-Verfahren zur Identifizierung nicht hautätzender und hautätzender Stoffe und Gemische nach dem UN GHS (1) und nach der CLP-Verordnung.

2.

Die Bewertung von Hautverätzungen erfolgte in der Regel unter Verwendung von Labortieren (PM B.4, entsprechend OECD TG 404, ursprünglich angenommen im Jahr 1981 und geändert in den Jahren 1992, 2002 und 2015) (2). Neben dieser PM B.40 wurden noch weitere In-vitro-Prüfmethoden zur Untersuchung des Hautverätzungspotenzials von Chemikalien als PM B.40bis (entsprechend OECD TG 431) (3) und PM B.65 (entsprechend OECD TG 435) validiert und angenommen (4), mit denen ggf. ebenfalls Unterkategorien ätzender Chemikalien identifiziert werden können. Mehrere validierte In-vitro-Prüfmethoden wurden als PM B.46 (entsprechend OECD TG 439 (5) angenommen, die zur Untersuchung von Hautreizungen verwendet werden können. In einem OECD-Leitliniendokument über integrierte Prüfungs- und Bewertungsansätze (IATA = Integrated Approaches to Testing and Assessment) zur Untersuchung von Hautverätzungen und -reizungen werden mehrere Module beschrieben, in denen mehrere Informationsquellen und Analyseinstrumente zu Gruppen zusammengefasst werden. Sie enthalten i) Leitlinien dazu, wie existierende Daten aufgrund von Versuchen und aus sonstigen Quellen integriert und verwendet werden können, um das Hautreizungs- und das Hautverätzungspotenzial von Chemikalien zu bewerten, und ii) einen Vorschlag zur Durchführung ggf. erforderlicher weiterer Versuche (6).

3.

Mit dieser Prüfmethode werden Hautverätzungen mit dem Endpunkt der menschlichen Gesundheit untersucht. Sie beruht auf der Methode zur Messung des elektrischen Widerstands der Haut (TER-Prüfung), bei der ätzende Chemikalien anhand ihrer Fähigkeit ermittelt werden, einen Verlust der normalen Beschaffenheit und Barrierefunktion der Hornhaut (stratum corneum) herbeizuführen. Die entsprechende OECD-Prüfrichtlinie wurde ursprünglich im Jahr 2004 angenommen und 2015 unter Berücksichtigung des IATA-Leitliniendokuments aktualisiert.

4.

Um In-vitro-Prüfungen auf Hautverätzungen für rechtliche Zwecke zu evaluieren, wurden Vorvalidierungsstudien (7) mit anschließender formeller Validierungsstudie der TER-Prüfung mit Rattenhaut zur Bewertung von Hautverätzungen durchgeführt (8) (9) (10) (11). Die Ergebnisse dieser Studien führten zu der Empfehlung, dass die TER-Prüfmethode (auch als validierte Referenzmethode (VRM) bezeichnet) für rechtliche Zwecke zur Bewertung von In-vivo-Hautverätzungen verwendet werden kann (12) (13) (14).

5.

Bevor eine vorgeschlagene ähnliche oder modifizierte In-vitro-TER-Prüfmethode zur Untersuchung auf Hautverätzungen außer der VRM für rechtliche Zwecke verwendet werden kann, sollten nach den Anforderungen der Leistungsstandards (15) Verlässlichkeit, Relevanz (Genauigkeit) und die Grenzen des Verfahrens für den vorgeschlagenen Verwendungszweck bestimmt werden, um sicherzustellen, dass es mit der VRM vergleichbar ist. Die gegenseitige Anerkennung der Daten gemäß dem OECD-Übereinkommen wird erst dann garantiert, wenn vorgeschlagene neue oder aktualisierte Prüfmethoden auf der Grundlage der Leistungsstandards überprüft und in die entsprechende OECD-Prüfrichtlinie aufgenommen wurden.

BEGRIFFSBESTIMMUNGEN

6.

Es gelten die Begriffsbestimmungen der Anlage.

AUSGANGSÜBERLEGUNGEN

7.

In einer Validierungsstudie (10) und in anderen veröffentlichten Studien (16) (17) wurde festgestellt, dass die TER-Prüfmethode zur Untersuchung von Rattenhaut geeignet ist, mit einer Gesamtempfindlichkeit von 94 % (51/54) und einer Spezifizität von 71 % (48/68) zwischen bekannten hautätzenden Chemikalien und nicht hautätzenden Chemikalien aus einer Datenbank mit 122 Stoffen zu unterscheiden.

8.

Gegenstand dieser Prüfmethode sind In-vitro-Hautverätzungen. Mit der Prüfmethode können nicht ätzende und ätzende Prüfchemikalien nach dem UN GHS bzw. der CLP-Verordnung festgestellt werden. Eine Einschränkung bei dieser Prüfmethode besteht den Validierungsstudien (8) (9) (10) (11) zufolge darin, dass eine Unterkategorisierung ätzender Stoffe und Gemische nach Maßgabe des UN GHS bzw. der CLP-Verordnung nicht möglich ist. Mit dem geltenden Rechtsrahmen wird festgelegt, wie diese Prüfmethode zu verwenden ist. Diese Prüfmethode vermittelt keine geeigneten Informationen über Hautreizungen; mit PM B.46 werden jedoch gezielt die gesundheitlichen Auswirkungen von Hautreizungen in vitro untersucht (5). Eine umfassende Evaluierung lokaler Auswirkungen auf die Haut nach einer einmaligen dermalen Exposition ist dem OECD-Leitliniendokument über integrierte Prüfungs- und Bewertungsansätze (IATA) zu entnehmen (6).

9.

In der dieser Prüfmethode zugrunde liegenden Validierung wurden zahlreiche Chemikalien (in erster Linie Stoffe) geprüft, und die empirische Datenbank der Validierungsstudie umfasste 60 Stoffe aus zahlreichen Chemikalienklassen (8) (9). Auf der Grundlage der insgesamt verfügbaren Daten ist festzustellen, dass die Prüfmethode bei zahlreichen Chemikalienklassen und Aggregatzuständen (u. a. Flüssigkeiten, halbfeste Stoffe, Feststoffe und Wachse) anwendbar ist. Da für bestimmte Aggregatzustände jedoch nicht ohne Weiteres Prüfstoffe mit geeigneten Referenzdaten verfügbar sind, ist darauf hinzuweisen, dass bei der Validierung eine vergleichsweise geringe Anzahl an Wachsen und ätzenden Feststoffen bewertet wurde. Flüssigkeiten können wässrig oder nicht wässrig und Feststoffe in Wasser löslich oder unlöslich sein. Wenn nachgewiesen werden kann, dass die Prüfmethode bei einer bestimmten Kategorie von Stoffen nicht anwendbar ist, sollte sie bei diesen nicht verwendet werden. Diese Prüfmethode kann jedoch nicht nur bei Stoffen verwendet werden, sondern wird auch als für Gemische geeignet betrachtet. Da Gemische jedoch vielfältigen Kategorien zuzurechnen sein und unterschiedliche Zusammensetzungen haben können, und da gegenwärtig nur begrenzte Informationen über die Prüfung von Gemischen verfügbar sind, sollten Prüfmethoden, bei denen nachgewiesen werden kann, dass sie für eine bestimmte Kategorie von Gemischen nicht geeignet sind (beispielsweise durch ein Verfahren entsprechend dem von Eskes u. a. (2012) vorgeschlagenen Verfahren) (18), für die betreffende Kategorie von Gemischen nicht verwendet werden. Bevor die Prüfmethode für die Generierung von Daten für einen bestimmten Regulierungszweck verwendet wird, ist zu prüfen, ob sie für den beabsichtigten Zweck angemessene Ergebnisse liefern kann und, wenn dem so ist, warum. Solche Erwägungen entfallen, wenn die Prüfung des Gemischs rechtlich vorgeschrieben ist. Gase und Aerosole wurden bislang noch nicht in Validierungsstudien bewertet (8)(9). Obwohl deren Prüfung mit der TER-Prüfmethode prinzipiell vorstellbar ist, erlaubt die vorliegende Prüfmethode das Untersuchen von Gasen und Aerosolen nicht.

PRINZIP DER PRÜFMETHODE

10.

Die Prüfchemikalie wird in einem Zweikammersystem bis zu 24 Stunden lang auf den Epidermisflächen von Hautstücken aufgebracht, wobei die Hautstücke als Trennwand zwischen den beiden Kammern fungieren. Die Hautstücke werden 28-30 Tage alten Ratten entnommen, die zuvor tierschutzgerecht getötet wurden. Hautätzende Chemikalien werden anhand ihrer Fähigkeit ermittelt, einen Verlust der normalen Beschaffenheit und Barrierefunktion der Hornhaut (stratum corneum) herbeizuführen, welcher als Senkung des TER unter einen bestimmten Schwellenwert (16) gemessen wird (Nummer 32). Beim TER der Haut von Ratten wurde ein Schwellenwert von 5 kΩ auf der Grundlage umfangreicher Datenbestände für ein breites Spektrum unterschiedlicher Chemikalien gewählt, wobei die überwiegende Mehrzahl der Werte entweder eindeutig deutlich oberhalb dieses Schwellenwerts (oft > 10 kΩ) oder aber deutlich unterhalb dieses Werts (oft < 3 kΩ) lag (16). Im Allgemeinen sinkt der TER bei Prüfchemikalien, die bei Tieren nicht hautätzend wirken, aber hautreizende bzw. nicht hautreizende Eigenschaften aufweisen, nicht bis unter diesen Schwellenwert. Außerdem kann sich durch die Verwendung anderer Hautherstellungen oder anderer Prüfgeräte der Schwellenwert verändern, wodurch eine zusätzliche Validierung notwendig wird.

11.

Im Prüfverfahren ist zur Bestätigung der Prüfungen auf positive Ergebnisse im TER (einschließlich Werten um ca. 5 kΩ) ein Farbbindungsschritt vorgesehen. Durch den Farbbindungsschritt wird festgestellt, ob die steigende Ionenpermeabilität auf die materielle Zerstörung der Hornhaut (stratum corneum) zurückzuführen ist. Durch die TER-Methode mit Rattenhaut konnte eine gute Vorhersagegenauigkeit der hautätzenden In-vivo-Wirkung bei dem nach Prüfmethode B.4 (2) untersuchten Kaninchen nachgewiesen werden.

NACHWEIS DER LEISTUNGFÄHIGKEIT

12.

Vor der routinemäßigen Anwendung der TER-Prüfmethode mit Rattenhaut nach dieser Prüfmethode sollten Labors die erforderliche technische Befähigung durch eine ordnungsgemäße Klassifizierung der zwölf in Tabelle 1 empfohlenen Leistungsstoffe nachweisen. Wenn ein dort genannter Stoff nicht verfügbar ist bzw. wenn dies gerechtfertigt ist, kann ein anderer Stoff verwendet werden, für den geeignete In-vivo- und In-vitro-Referenzdaten verfügbar sind (z. B. aus der Liste der Referenzchemikalien (16)), sofern die in Tabelle 1 beschriebenen Auswahlkriterien angewendet werden.

Tabelle 1

Liste der Leistungsstoffe  (2)

Stoff

CAS-Nr.

Chemikalienklasse (3)

UN GHS/CLP Kat. nach In-vivo-Ergebnissen (4)

VRM Kat. nach In-vitro-Ergebnissen

Aggregatzustand

pH (5)

In vivo ätzende Chemikalien

N,N’-Dimethyl dipropylenetriamin

10563-29-8

organische Base

1A

6 × C

L

8,3

1,2-Diaminopropan

78-90-0

organische Base

1A

6 × C

L

8,3

Chlorwasserstoffsäure (10 %)

7664-93-9

anorganische Säure

(1A/)1B/1C

5 × C 1 × NC

L

1,2

Kaliumhydroxid (10 % aq.)

1310-58-3

anorganische Base

(1A/)1B/1C

6 × C

L

13,2

Octansäure (Caprylsäure)

124-07-2

organische Säure

1B/1C

4 × C 2 × NC

L

3,6

2-tert-Butylphenol

88-18-6

Phenol

1B/1C

4 × C 2 × NC

L

3,9

In Vivo nicht ätzende Chemikalien

Isostearinsäure

2724-58-5

organische Säure

NC

6 × NC

L

3,6

4-Amino-1,2,4-Triazol

584-13-4

organische Base

NC

6 × NC

S

5,5

Phenethylbromid

103-63-9

Elektrophil

NC

6 × NC

L

3,6

4-(Methylthio)-Benzaldehyd

3446-89-7

Elektrophil

NC

6 × NC

L

6,8

1,9-Decadien

1647-16-1

neutral organisch

NC

6 × NC

L

3,9

Tetrachlorethylen

127-18-4

neutral organisch

NC

6 × NC

L

4,5

Abkürzungen: aq = wässrig; CAS-Nr. (CAS Registry Number = CAS-Registrierungsnummer); VRM = validierte Referenzmethode; C = ätzend; NC = nicht ätzend.

VERFAHREN

13.

Für die TER-Prüfmethode zur Feststellung der Ätzwirkung bei Rattenhaut sind Standardarbeitsanweisungen (SOPs) verfügbar (19). Die in dieser Prüfmethode verwendeten TER-Prüfmethoden mit Rattenhaut sollten die folgenden Anforderungen erfüllen:

Versuchstiere

14.

Für die Prüfung sollten Ratten verwendet werden, weil die Empfindlichkeit von Rattenhaut gegenüber den bei dieser Prüfmethode verwendeten Stoffen bereits nachgewiesen wurde (12) und weil nur Rattenhaut bislang förmlich validiert wurde (8) (9). Alter (wenn sich die Haut vollständig gebildet hat) und Abstammung der Ratten sind von besonderer Bedeutung, damit gewährleistet ist, dass sich die Fellfollikel in der Ruhephase befinden, bevor das Fellwachstum der erwachsenen Tiere beginnt.

15.

An den jungen, ca. 22 Tage alten männlichen oder weiblichen Ratten (Wistar-Ratten oder vergleichbare Abstammung) wird das Fell am Rücken und an den Flanken mit einem geeigneten Instrument sorgfältig geschoren. Anschließend werden die Tiere mit vorsichtigen Wischbewegungen gewaschen, wobei die geschorenen Flächen in eine Antibiotikalösung getaucht werden (die Lösung enthält beispielsweise Streptomycin, Penicillin, Chloramphenicol und Amphotericin in Konzentrationen, die ein bakterielles Wachstum verhindern). Die Tiere werden dann am dritten oder vierten Tag nach dem ersten Waschvorgang erneut gewaschen und innerhalb von 3 Tagen nach dem zweiten Waschvorgang verwendet, wenn sich die Hornhaut vom Schervorgang erholt hat.

Gewinnung der Hautstücke

16.

Die Versuchstiere werden im Alter von 28-30 Tagen tierschutzgerecht getötet; dieses Alter ist von entscheidender Bedeutung. Die dorsal-laterale Haut der Tiere wird entfernt und von überschüssigem subkutanem Fett befreit, das von der Haut sorgfältig abgeschält wird. Es werden Hautstücke mit einem Durchmesser von je ca. 20 mm entnommen. Die Haut kann vor der Verwendung der Hautstücke eingelagert werden, wenn sich zeigt, dass die positiven und negativen Kontrolldaten mit den an frischer Haut ermittelten Daten übereinstimmen.

17.

Jedes Hautstück wird so über das Ende eines PTFE-(Polytetrafluorethylen)-Rohres gelegt, dass die Epidermisoberfläche auf dem Ende des Rohres aufliegt. Zur Fixierung des Hautstücks wird ein O-Ring aus Gummi straff über das Rohrende gezogen, so dass die Haut fixiert wird. Überflüssiges Hautgewebe wird abgeschnitten. Der O-Ring wird sodann mit gereinigter Naturvaseline zum Ende des PTFE-Rohrs hin gründlich abgedichtet. Das Rohr wird durch eine Federklemme in einer Rezeptorkammer gehalten, die MgSO4-Lösung (154 mM) enthält (Abbildung 1). Das Hautstück ist vollständig in die MgSO4-Lösung einzutauchen. Aus einer einzigen Rattenhaut können bis zu 10-15 Hautstücke entnommen werden. Die Abmessungen des Rohrs und des O-Rings sind in Abbildung 2 angegeben.

18.

Vor Beginn der Prüfung wird zu Qualitätssicherungszwecken bei jeder Tierhaut der TER an zwei Hautstücken gemessen. Beide Hautstücke müssen einen Widerstand von mehr als 10 kΩ aufweisen, damit sie für die Prüfmethode verwendet werden können. Liegt der Widerstand unter 10 kΩ, sind die übrigen Hautstücke der betreffenden Tierhaut zu vernichten.

Applikation der Prüfchemikalie und Kontrollstoffe

19.

Zu jedem Prüflauf (Versuch) sind gleichzeitige Positiv- und Negativkontrollen durchzuführen, damit eine angemessene Eignung des Experimentalmodells gewährleistet ist. Bei jedem Prüflauf (Versuch) sind Hautstücke eines einzigen Tieres zu verwenden. Als Prüfchemikalien für die Positiv- und Negativkontrolle sind 10 M Chlorwasserstoffsäure bzw. destilliertes Wasser zu verwenden.

20.

Die flüssigen Prüfchemikalien (150 μl) werden im Rohrinneren gleichmäßig auf die epidermale Oberfläche aufgebracht. Bei Prüfungen an Feststoffen wird eine ausreichende Menge des Feststoffs gleichmäßig auf das Hautstück aufgebracht, so dass gewährleistet ist, dass die gesamte Epidermisoberfläche bedeckt ist. Auf den Feststoff wird entionisiertes Wasser (150 μl) aufgebracht und das Rohr vorsichtig bewegt. Um optimalen Kontakt der Prüfchemikalien mit der Haut zu erreichen, müssen einige Feststoffe gegebenenfalls auf 30 °C erwärmt werden, so dass die Prüfchemikalie schmilzt oder weich wird, oder die Prüfchemikalie muss zu einem Granulat oder Pulver zermahlen werden.

21.

Für jede Prüf- und Kontrollchemikalie werden bei jedem Prüflauf (Versuch) je drei Hautstücke verwendet. Die Prüfchemikalien werden für 24 h bei 20-23 °C aufgebracht. Anschließend wird die Prüfchemikalie mit fließendem Leitungswasser höchstens mit Raumtemperatur gewaschen, bis kein weiteres Material mehr entfernt werden kann.

TER-Messungen

22.

Der Hautwiderstand wird als TER mit einer Wheatstone’schen Wechselstrom-Messbrücke mit niedriger Spannung gemessen (18). Die Kenndaten der Messbrücke lauten: Betriebsspannung 1-3 V, sinus- oder rechteckförmiger Wechselstrom mit 50-1 000 Hz, Messbereich mindestens 0,1-30 kΩ. Die in der Validierungsstudie verwendete Datenbrücke misst Induktivität, Kapazität und Widerstand bis 2 000 H, 2 000 μF bzw. 2 MΩ bei Frequenzen von 100 Hz oder 1 kHz unter Verwendung serieller oder paralleler Werte. Für die TER-Messungen werden Messungen der hautätzenden Wirkung in Widerständen bei einer Frequenz von 100 Hz und unter Verwendung serieller Werte verwendet. Vor der Messung des elektrischen Widerstands wird die Oberflächenspannung der Haut verringert, indem so viel 70 %iges Ethanol hinzugegeben wird, dass die Epidermis bedeckt ist. Nach einigen Sekunden wird das Ethanol aus dem Rohr entfernt und das Hautgewebe durch Hinzufügen von 3 ml MgSO4-Lösung (154 mM) befeuchtet. Zur Messung des Widerstands in kΩ/Hautstück (Abbildung 1) werden die Elektroden der Datenbrücke auf beiden Seiten des Hautstücks angebracht. Die Gesamtabmessungen der Elektroden sowie die Länge der Elektrode unterhalb der Abgreifklemmen sind in Abbildung 2 dargestellt. Die an der Innenelektrode angebrachte Abgreifklemme liegt während der Widerstandsmessung oben auf dem PTFE-Rohr auf, so dass stets eine gleich bleibende Elektrodenlänge in die MgSO4-Lösung eingetaucht bleibt. Die äußere Elektrode ist in der Rezeptorkammer so angeordnet, dass sie am Kammerboden ansteht. Der Abstand zwischen der Federklemme und dem unteren Ende des PTFE-Rohrs bleibt konstant (Abbildung 2), da dieser Abstand den erzielten Widerstandswert beeinflusst. Folglich muss auch der Abstand zwischen der Innenelektrode und dem Hautstück konstant und möglichst gering sein (1-2 mm).

23.

Ist der gemessene Widerstand größer als 20 kΩ, so kann dies daran liegen, dass ein Rest der Prüfchemikalie die Epidermisoberfläche des Hautstücks bedeckt. Zur weiteren Entfernung dieser Schicht kann beispielsweise versucht werden, das PTFE-Rohr mit dem Daumen (geschützt durch einen Gummihandschuh) zu verschließen und das Rohr ca. 10 Sekunden lang zu schütteln; anschließend wird die MgSO4-Lösung weggeschüttet und die Widerstandsmessung mit frischer MgSO4-Lösung wiederholt.

24.

Eigenschaften und Abmessungen der Prüfapparatur und das verwendete Versuchsverfahren können die ermittelten TER-Werte beeinflussen. Der Schwellenwert von 5 kΩ für hautätzende Wirkung wurde aus Daten abgeleitet, die mit der/dem in dieser Methode beschriebenen speziellen Versuchsanordnung und Versuchsverfahren ermittelt wurden. Abweichende Schwellen- und Kontrollwerte gelten möglicherweise, wenn sich die Prüfbedingungen ändern oder eine andere Versuchsanordnung verwendet wird. Daher müssen die Schwellenwerte für die Methodik und den Widerstand durch Prüfung einer Reihe von Leistungsstoffen kalibriert werden, die aus den in der Validierungsstudie (8) (9) verwendeten Stoffen oder aus Chemikalienklassen, die den untersuchten Stoffen ähneln, ausgewählt wurden. Tabelle 1 gibt eine Übersicht über geeignete Leistungsstoffe.

Farbbindungsmethoden

25.

Bei bestimmten nicht hautätzenden Materialien, denen die Haut ausgesetzt ist, kann der Widerstand unter den Schwellenwert von 5 kΩ sinken, wodurch es zum Ionendurchtritt durch die Hornhaut kommt und der elektrische Widerstand absinkt (9). So können beispielsweise neutrale organische Stoffe und Chemikalien mit oberflächenaktiven Eigenschaften (u. a. Detergenzien, Emulgatoren und andere Tenside) die Hautlipide entziehen, wodurch die Trennschicht ionendurchlässiger wird. Liegen die TER-Werte dieser Prüfchemikalien also unter oder um 5 kΩ und sind keine optischen Anzeichen einer Schädigung der Hautstücke zu erkennen, ist eine Beurteilung des Farbeindringvermögens an den behandelten Hautgeweben und den Kontrollgeweben durchzuführen, um festzustellen, ob die ermittelten TER-Werte durch gestiegene Hautpermeabilität oder durch hautätzende Wirkung zustande kamen (7) (9). In letzterem Fall dringt, wenn eine Unterbrechung der Hornhaut vorliegt, der auf die Hautoberfläche aufgetragene Farbstoff Sulforhodamin B rasch ein und verursacht eine Verfärbung des darunter liegenden Hautgewebes. Dieser Farbstoff ist gegenüber einer breiten Palette von Stoffen stabil und wird durch das nachstehend beschriebene Extraktionsverfahren nicht beeinflusst.

Anwendung und Entfernung von Sulforhodamin-B-Farbstoff

26.

Nach der Beurteilung der TER-Prüfungen wird das Magnesiumsulfat aus dem Rohr abgeschüttet und die Haut sorgfältig auf erkennbare Schäden untersucht. Wenn keine offensichtliche größere Schädigung (z. B. eine Perforation) zu erkennen ist, werden 150 μl einer 10 %igen (w/v) Verdünnung des Farbstoffs Sulforhodamin B (Acid Red 52, CI-Nr. 45100; CAS-Nr. 3520-42-1) 2 h in destilliertem Wasser auf die Epidermis der einzelnen Hautstücke aufgetragen. Diese Hautstücke werden anschließend höchstens bei Raumtemperatur unter fließendem Wasser ca. 10 Sekunden lang abgewaschen, um überschüssige/ungebundene Farbe zu entfernen. Jedes Hautstück wird sorgfältig vom PTFE-Rohr entfernt und in ein Gefäß (z. B. ein 20-ml-Szintillationsfläschchen) eingelegt, das entionisiertes Wasser (8 ml) enthält. Die Fläschchen werden 5 Minuten lang vorsichtig geschüttelt, um restliche ungebundene Farbe zu entfernen. Nach Wiederholung des Spülvorgangs werden die Hautstücke entnommen und in Fläschchen eingelegt, die 5 ml 30 %iges (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) in destilliertem Wasser enthalten, und über Nacht bei 60 °C aufbewahrt.

27.

Nach dieser Inkubation werden die einzelnen Hautstücke entnommen und entsorgt und die verbleibende Lösung 8 Minuten lang bei 21 °C zentrifugiert (relative Zentrifugalkraft ~175 × g). Eine 1-ml-Probe des oberflächenaktiven Stoffs wird im Verhältnis 1:5 (v/v) (d. h. 1 ml + 4 ml) mit 30 %igem (w/v) SDS in destilliertem Wasser verdünnt. Die optische Dichte (OD) der Lösung wird bei 565 nm gemessen.

Berechnung des Farbgehalts

28.

Der Gehalt an Sulforhodamin-B-Farbstoff je Hautstück wird mittels der OD-Werte (9) berechnet (molarer Extinktionskoeffizient von Sulforhodamin B bei 565 nm = 8,7 × l04, Molekulargewicht = 580). Der Farbstoffgehalt wird für jedes der drei Hautstücke durch eine entsprechende Kalibrierungskurve bestimmt und dann der mittlere Farbstoffgehalt für die Wiederholungs-Gleichtests berechnet.

Akzeptanzkriterien

29.

Die mittleren TER-Werte werden akzeptiert, wenn die Ergebnisse der gleichzeitigen Positiv- und Negativkontrollen innerhalb der akzeptablen Bereiche für die Methode im Prüflabor liegen. Die akzeptablen Widerstandsbereiche für die oben beschriebene Methode und Versuchsanordnung lauten wie folgt:

Kontrolle

Stoff

Widerstandsbereich (kΩ)

Positivkontrolle

10 M Chlorwasserstoffsäure

0,5-1,0

Negativkontrolle

Destilliertes Wasser

10-25

30.

Die ermittelten Mittelwerte der Farbbindung werden nur akzeptiert, wenn die Ergebnisse der gleichzeitig geprüften Kontrollen innerhalb definierter Akzeptanzgrenzen der betreffenden Methode liegen. Die für die Kontrollstoffe der oben beschriebenen Methodik und Versuchsanordnung vorgeschlagenen Akzeptanzspannen sind der folgenden Tabelle zu entnehmen:

Kontrolle

Stoff

Farbgehaltsbereich (μg/Hautstück)

Positivkontrolle

10 M Chlorwasserstoffsäure

40-100

Negativkontrolle

Destilliertes Wasser

15-35

Auswertung der Ergebnisse

31.

Der TER-Schwellenwert zur Unterscheidung zwischen ätzenden und nicht ätzenden Prüfchemikalien wurde bei der Optimierung der Prüfmethode ermittelt, in einer Vorvalidierungsphase geprüft und in einer förmlichen Validierungsstudie bestätigt.

32.

Im Folgenden wird das Vorhersagemodell für die TER-Prüfmethode zur Feststellung von Hautätzungen bei Rattenhaut (9)(19) in Verbindung mit dem Klassifizierungssystem des UN GHS bzw. der CLP-Verordnung erläutert:

Die Prüfchemikalie gilt als ‚nicht hautätzend‘:

i)

wenn der Mittelwert des für die Prüfchemikalie ermittelten TER-Werts größer als 5 kΩ ist oder

ii)

wenn der Mittelwert des für die Prüfchemikalie ermittelten TER-Werts gleich 5 kΩ oder kleiner ist und

die Hautstücke keine wahrnehmbaren Veränderungen (z. B. Perforationen) erkennen lassen, und

der mittlere Farbstoffgehalt des Hautstücks unter (<) dem mittleren Farbstoffgehalt des Hautstücks der gleichzeitig mit 10M HCl durchgeführten Positivkontrolle liegt (siehe Nummer 30 zu Werten der Positivkontrolle).

Die Prüfchemikalie gilt als ‚hautätzend‘:

i)

wenn der für die Prüfchemikalie ermittelte Mittelwert des TER-Werts gleich 5 kΩ oder kleiner ist (≤) und das Hautstück offensichtliche Schädigungen aufweist (z. B. eine Perforation) oder

ii)

wenn der Mittelwert des für die Prüfchemikalie ermittelten TER-Werts gleich 5 kΩ oder kleiner ist, und

die Hautstücke keine wahrnehmbaren Veränderungen (z. B. Perforationen) erkennen lassen, aber

der mittlere Farbstoffgehalt des Hautstücks größer oder gleich (≥) dem mittleren Farbstoffgehalt des Hautstücks der gleichzeitig mit 10M HCl durchgeführten Positivkontrolle ist (siehe Nummer 30 zu Werten der Positivkontrolle).

33.

Vorausgesetzt die Prüfung liefert ein eindeutiges Ergebnis, genügt ein einziger Prüflauf (Versuch) mit drei parallel geprüften Replikat-Hautstücken. Bei Grenzergebnissen, wie z. B. nicht übereinstimmenden Replikatmessungen und/oder einer mittleren TER-Werten von 5 ± 0,5 kΩ, sollte ein zweiter unabhängiger Prüflauf (Versuch) in Betracht gezogen werden bzw. ein dritter bei abweichenden Ergebnissen der ersten beiden Prüfläufe (Versuche).

DATEN UND BERICHTERSTATTUNG

Daten

34.

Die Widerstandswerte (k) und ggf. die Farbstoffgehalte (μg/Hautstück) für die Prüfchemikalie sowie für Positiv- und Negativkontrollen sind in Tabellenform einschließlich der Daten für die einzelnen Replikat-Hautstücke pro Prüflauf (Versuch) und der Mittelwerte ± Standardabweichung in Berichten zusammenzufassen. Alle Wiederholungsversuche sollten vermerkt werden. Für jede Prüfchemikalie sind festgestellte Schädigungen der Hautstücke zu vermerken.

Prüfbericht

35.

Der Prüfbericht sollte folgende Angaben enthalten:

 

Prüfchemikalien und Kontrollchemikalien:

Einkomponentiger Stoff: chemische Bezeichnung, wie z. B. IUPAC- oder CAS-Bezeichnung, CAS-Nummer, SMILES- oder InChI-Code, Strukturformel, Reinheit, chemische Zusammensetzung von Verunreinigungen, soweit zutreffend und praktisch durchführbar, usw.;

mehrkomponentiger Stoff, UVCB und Gemische: So weit wie möglich charakterisiert durch die chemische Zusammensetzung (siehe oben), das quantitative Vorkommen und die relevanten physikalisch-chemischen Eigenschaften der einzelnen Komponenten;

physikalisches Erscheinungsbild, Wasserlöslichkeit und weitere relevante physikalisch-chemische Eigenschaften;

Herkunft, Chargennummer, sofern vorhanden;

Behandlung der Prüfchemikalien/Kontrollstoffe vor der Prüfung, sofern relevant (z. B. Erwärmen, Mahlen);

Stabilität der Prüfchemikalie, letztes Verwendungsdatum oder Datum für erneute Analyse, soweit bekannt;

Lagerungsbedingungen.

 

Versuchstiere:

Abstammung und Geschlecht;

Alter der Tiere zum Zeitpunkt der Verwendung als Spendertiere;

Herkunft der Tiere, Haltungsbedingungen, Futter usw.;

Details zur Herstellung der Hautstücke.

 

Prüfbedingungen:

Eichkurven für die Versuchsapparaturen;

Eichkurven für die Durchführung der Farbbindungsprüfungen, verwendete Bandbreite für die Messung von OD-Werten und die OD-Linearitätsspanne des Messgeräts (z. B. eines Spektrophotometers) (sofern relevant);

Details des Prüfverfahrens für die TER-Messungen;

Details des Prüfverfahrens für die Beurteilung der Farbbindefähigkeit (sofern relevant);

verwendete Prüfdosierungen, Expositionszeitraum (-zeiträume) und -temperatur(en);

Details zum verwendeten Waschverfahren nach dem Expositionszeitraum;

Anzahl der je Prüfchemikalie und Kontrolle (Positiv- und Negativkontrolle) verwendeten Replikat-Hautstücke;

Beschreibung etwaiger Änderungen am Prüfverfahren;

Verweis auf historische Modelldaten. Dabei sollten unter anderem die folgenden Aspekte berücksichtigt werden:

i)

Akzeptanz der TER-Werte der Positiv- und Negativkontrolle (in kΩ) mit Verweis auf die Spannen der Widerstandswerte der Positiv- und Negativkontrollen,

ii)

Akzeptanz der Farbstoffgehaltwerte der Positiv- und Negativkontrolle (in μg/Hautstück) mit Verweis auf die Spannen der Farbstoffgehaltwerte der Positiv- und Negativkontrollen,

iii)

Akzeptanz der Prüfergebnisse mit Verweis auf die historischen Schwankungen zwischen Replikat-Hautstücken;

Beschreibung der berücksichtigten Entscheidungskriterien und des verwendeten Vorhersagemodells.

 

Ergebnisse:

Tabellarische Darstellung der Daten der Versuche zur Beurteilung der TER-Werte und der Farbbindefähigkeit (wenn relevant) für die einzelnen Prüfchemikalien und Kontrollen, für jeden einzelnen Prüflauf (Versuch) und für jedes Replikat-Hautstück (einzelne Tiere und einzelne Hautproben), Mittel, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten;

Beschreibung etwaiger beobachteter Wirkungen;

abgeleitete Einstufung mit Bezug auf das Vorhersagemodell und/oder angewandte Entscheidungskriterien.

 

Erörterung der Ergebnisse

 

Schlussfolgerungen

LITERATUR

(1)

Vereinte Nationen (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), fünfte überarbeitete Ausgabe, UN New York und Genf, 2013. Abrufbar unter:[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].

(2)

Kapitel B.4 dieses Anhangs, Akute Hautreizung/-verätzung.

(3)

Kapitel B.40bis dieses Anhangs, In-vitro-Hautmodell.

(4)

Kapitel B.65 dieses Anhangs, In-vitro-Methode zur Untersuchung der Membranbarriere.

(5)

Kapitel B.46 dieses Anhangs, In-vitro-Hautreizung: Prüfmethode mit rekonstruierter humaner Epidermis.

(6)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung, Paris.

(7)

Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.ATLA 23, 219-255.

(8)

Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, A.P. und Worth, A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxic.In Vitro 12, 471-482.

(9)

Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, H.-G., and Liebsch, M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests For Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxic.In Vitro12, 483- 524.

(10)

Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, CA., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, H. und Zucco, F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops.ATLA23, 129-147.

(11)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(12)

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), herausgegeben vom Wissenschaftlich Beratenden Ausschuss (ESAC) des ECVAM (ESAC10), 3. April 1998.

(13)

ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.

(14)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(15)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 218. Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung, Paris.

(16)

Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A. und Rhodes, C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test -Modifications and Validation. Fd. Chem. Toxicol. 24, 507-512.

(17)

Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J. und Gardner, J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial. Toxicol. In Vitro 6,191-194.

(18)

Eskes, C., Detappe, V., Koëter, H., Kreysa, J., Liebsch, M., Zuang, V., Amcoff, P., Barroso, J., Cotovio, J., Guest, R., Hermann, M., Hoffmann, S., Masson, P., Alépée, N., Arce, L.A., Brüschweiler, B., Catone, T., Cihak, R., Clouzeau, J., D’Abrosca, F., Delveaux, C., Derouette, J.P., Engelking, O., Facchini, D., Fröhlicher, M., Hofmann, M., Hopf, N., Molinari, J., Oberli, A., Ott, M., Peter, R., Sá-Rocha, V.M., Schenk, D., Tomicic, C., Vanparys, P., Verdon, B., Wallenhorst, T., Winkler, G.C. und Depallens, O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403.

(19)

TER SOP (December 2008). INVITTOX Protocol (No 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.

(20)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 34), Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung, Paris.

Abbildung 1

Apparatur Für Die Ter-Prüfung Mit Rattenhaut

Image 2

Abbildung 2

Abmessungen Der Polytetrafluorethylen- (PTFE-) und Rezeptorrohre und Der Verwendeten Elektroden

Image 3

Kritische Faktoren der obigen Apparaturen:

Innendurchmesser des PTFE-Rohrs,

Länge der Elektroden in Relation zum PTFE-Rohr und zum Rezeptorrohr, so dass die Hautscheibe nicht mit den Elektroden in Kontakt kommen sollte und die Elektrode auf einer Standardlänge mit der MgSO4-Lösung in Kontakt steht,

die Menge an MgSO4-Lösung im Rezeptorrohr muss in Relation zum Füllstand im PTFE-Rohr den in Abbildung 1 dargestellten Flüssigkeitsstand ergeben,

das Hautstück muss so am PTFE-Rohr befestigt sein, dass der elektrische Widerstand ein richtiges Maß für die Hauteigenschaften darstellt.

Anlage

BEGRIFFSBESTIMMUNGEN

C : Hautätzend

Chemikalie : Ein Stoff oder ein Gemisch.

Einkomponentiger Stoff : Ein nach seiner quantitativen Zusammensetzung definierter Stoff, bei dem mehr als ein Hauptbestandteil in einer Konzentration von mindestens 80 % w/w vorliegt.

Gemisch : Ein Gemisch oder eine Lösung, die aus zwei oder mehr Stoffen besteht.

Genauigkeit : Der Grad an Übereinstimmung zwischen Testergebnissen und akzeptierten Referenzwerten. Die Genauigkeit ist ein Maß der Leistung der Prüfmethode und ein Aspekt der Relevanz. Der Begriff wird oft im Sinne von ‚Übereinstimmung‘ verwendet und bezeichnet den Anteil der korrekten Ergebnisse einer Prüfmethode (20).

GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals = Global harmonisiertes System zur Einstufung und Kennzeichnung) (UN) : Ein System zur Klassifizierung von Chemikalien (Stoffen und Gemischen) nach standardisierten Typen und Stufen physikalischer, gesundheitlicher und ökologischer Gefahren und zur entsprechenden Kennzeichnung durch Piktogramme, Signalwörter, Gefahrenhinweise, Sicherheitshinweise und Sicherheitsdatenbögen, um zum Schutz des Menschen (einschließlich Arbeitgeber, Arbeiter, Spediteure, Verbraucher und Notfall-Einsatzkräfte) und der Umwelt Informationen über die schädlichen Wirkungen der betreffenden Chemikalien zu verbreiten (1).

Hautverätzung, in vivo : Das Auslösen einer irreversiblen Hautschädigung, d. h. einer sichtbaren, bis in das Corium reichenden Nekrose der Epidermis nach Applikation einer Prüfchemikalie für die Dauer von bis zu 4 Stunden. Verätzungsreaktionen sind gekennzeichnet durch Geschwüre, Blutungen, blutige Verschorfungen und am Ende des Beobachtungszeitraums von 14 Tagen durch eine auf ein Ausbleichen der Haut zurückzuführende Verfärbung, komplett haarlose Bereiche und Narben. Bei der Beurteilung fragwürdiger Schädigungen ist die Histopathologie mit zu berücksichtigen.

IATA : Integrated Approach to Testing and Assessment = integrierter Prüfungs- und Bewertungsansatz.

Leistungsstandards (PS) : Auf einer validierten Prüfmethode beruhende Normen, auf deren Grundlage die Vergleichbarkeit einer vorgeschlagenen, mechanistisch und funktionell ähnlichen Prüfmethode bewertet werden kann. Sie umfassen (i) wesentliche Elemente der Prüfmethode; (ii) ein Mindestverzeichnis von Referenzchemikalien, ausgewählt aus den Chemikalien, die zum Nachweis der akzeptablen Leistung der validierten Referenzmethode verwendet werden; und (iii) je nach den für die validierte Referenzmethode erzielten Ergebnissen die vergleichbaren Zuverlässigkeits- und Genauigkeitswerte, die die vorgeschlagene Prüfmethode bei der Bewertung anhand des Mindestverzeichnisses von Referenzchemikalien demonstrieren sollte.

Mehrkomponentiger Stoff : Ein nach seiner quantitativen Zusammensetzung definierter Stoff, bei dem mehr als ein Hauptbestandteil in einer Konzentration von mindestens ≥ 10 % w/w und < 80 % w/w vorliegt. Ein mehrkomponentiger Stoff ist das Ergebnis eines Herstellungsprozesses. Der Unterschied zwischen einem Gemisch und einem mehrkomponentigen Stoff besteht darin, dass ein Gemisch durch die Mischung von zwei oder mehr Stoffen ohne chemische Reaktion entsteht. Ein mehrkomponentiger Stoff wird durch eine chemische Reaktion gebildet.

NC : Nicht hautätzend

OD : Optische Dichte.

PK : Positivkontrolle, ein Replikat, das alle Komponenten eines Prüfsystems enthält und mit einem Stoff behandelt wird, der bekanntermaßen eine positive Reaktion hervorruft. Um sicherzustellen, dass Abweichungen bei der Positivkontrollreaktion im Zeitverlauf bewertet werden können, sollte die Reaktion nicht zu heftig sein.

Prüfchemikalie : Stoff oder Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode untersucht wird.

Prüflauf : Eine einzelne Prüfchemikalie, die gleichzeitig an mindestens drei Replikat-Hautstücken geprüft wird.

Relevanz : Dieser Begriff bezieht sich auf das Verhältnis zwischen der Prüfmethode und der betreffenden Wirkung und auf die Frage, ob er aussagekräftig und nützlich für einen bestimmten Zweck ist. Er beschreibt das Ausmaß, in dem die Prüfmethode die untersuchte biologische Wirkung korrekt misst oder vorhersagt. Die Relevanz schließt eine Beurteilung der Genauigkeit (Übereinstimmung) einer Prüfmethode ein (20).

Sensitivität : Der Anteil aller positiven/wirkenden Chemikalien, die durch die Prüfmethode korrekt eingestuft werden. Die Sensitivität ist ein Maß der Genauigkeit einer Prüfmethode mit kategorialen Ergebnissen und ein wichtiger Aspekt bei der Bewertung ihrer Relevanz (20).

Spezifizität : Der Anteil aller negativen/wirkungslosen Chemikalien, die durch die Prüfmethode korrekt eingestuft werden. Die Spezifität ist ein Maß der Genauigkeit einer Prüfmethode mit kategorialen Ergebnissen und ein wichtiger Aspekt bei der Bewertung ihrer Relevanz (20).

Stoff : Ein chemisches Element und seine Verbindungen in natürlicher Form oder gewonnen durch ein Herstellungsverfahren, einschließlich der zur Wahrung seiner Stabilität notwendigen Zusatzstoffe und der durch das angewandte Verfahren bedingten Verunreinigungen, aber mit Ausnahme von Lösungsmitteln, die von dem Stoff ohne Beeinträchtigung seiner Stabilität und ohne Änderung seiner Zusammensetzung abgetrennt werden können.

TER (Transcutaneous Electrical Resistance) : Ein Maß für den elektrischen Widerstand der Haut, angegeben als Widerstand in Ohm. Ein einfaches und stabiles Verfahren zur Beurteilung der Barriere funktion, indem der Ionendurchtritt durch die Haut mithilfe einer Wheatstone-Messbrücke aufgezeichnet wird.

Übereinstimmung : Die Übereinstimmung ist ein Maß der Leistung einer Prüfmethode für Prüfverfahren mit kategorialen Ergebnissen und ein Aspekt der Relevanz. Der Begriff wird gelegentlich gleichbedeutend mit Genauigkeit verwendet und als Anteil aller geprüften Chemikalien definiert, die korrekt als positiv oder negativ eingestuft werden. Die Übereinstimmung hängt in hohem Maße von der Prävalenz positiver Ergebnisse bei den Typen der untersuchten Prüfchemikalien ab (20).

UVCB : Stoffe mit unbekannter oder schwankender Zusammensetzung, komplexe Reaktionsprodukte oder biologische Materialien.

Zuverlässigkeit : Maß der Verlässlichkeit der Reproduzierbarkeit der Prüfmethode innerhalb von und zwischen Laboratorien in einem bestimmten Zeitintervall bei einheitlichem Protokoll. Die Zuverlässigkeit wird durch Berechnung der Intra- und Interlabor-Reproduzierbarkeit bewertet (20).

(6)

In Teil B erhält Kapitel B.40bis folgende Fassung:

„B.40bis    IN-VITRO-PRÜFUNG AUF HAUTÄTZENDE WIRKUNG: PRÜFMETHODE MIT REKONSTRUIERTER HUMANER EPIDERMIS (RHE)

EINLEITUNG

1.

Diese Prüfmethode (PM) entspricht der OECD-Prüfrichtlinie 431 (2016). Als Hautverätzung wird das Auslösen einer irreversiblen Hautschädigung, d. h. einer sichtbaren, bis in das Corium reichenden Nekrose der Epidermis nach Applikation einer Prüfchemikalie [im Sinne der Definition des Global harmonisierten Systems zur Einstufung und Kennzeichnung von Gefahrstoffen der UN (GHS) (1) und der Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 über die Einstufung, Kennzeichnung und Verpackung von Stoffen und Gemischen (CLP-Verordnung) (6)] bezeichnet. Diese aktualisierte Prüfmethode B.40bis besteht in einem In-vitro-Verfahren zur Identifizierung nicht ätzender und ätzender Stoffe und Gemische nach dem UN GHS und der CLP-Verordnung. Sie ermöglicht auch eine partielle Unterkategorisierung ätzender Chemikalien.

2.

Die Bewertung des Hautverätzungspotenzials von Chemikalien erfolgte in der Regel unter Verwendung von Labortieren (PM B.4, entsprechend OECD TG 404, ursprünglich angenommen im Jahr 1981 und geändert in den Jahren 1992, 2002 und 2015) (2). Neben dieser Prüfmethode B.40bis wurden noch zwei weitere In-vitro-Prüfmethoden zur Untersuchung des Verätzungspotenzials von Chemikalien als Prüfmethode B.40 (entsprechend OECD TG 430) (3) und PM B.65 (entsprechend OECD TG 435) validiert und angenommen (4). Außerdem wurde die In-vitro-Prüfmethode B.46 (entsprechend OECD TG 439) (5) als Methode zur Untersuchung des Hautreizungspotenzials angenommen. In einem OECD-Leitliniendokument über integrierte Prüfungs- und Bewertungsansätze (IATA = Integrated Approaches to Testing and Assessment) zur Untersuchung von Hautverätzungen und -reizungen werden mehrere Module beschrieben, in denen Informationsquellen und Analyseinstrumente zu Gruppen zusammengefasst werden. Sie enthalten i) Leitlinien dazu, wie vorhandene Daten aus Untersuchungen und aus anderen Quellen integriert und verwendet werden können, um das Hautreizungs- und das Hautverätzungspotenzial von Chemikalien zu bewerten, und ii) einen Vorschlag zur Durchführung ggf. erforderlicher weiterer Untersuchungen (6).

3.

Mit dieser Prüfmethode werden Hautverätzungen mit dem Endpunkt der menschlichen Gesundheit untersucht. Für die Prüfmethode wird (aus menschlichen, nicht transformierten Keratinozyten) rekonstruierte humane Epidermis (RhE) verwendet, die die histologischen, morphologischen, biochemischen und physiologischen Eigenschaften der menschlichen Oberhaut, d. h. der Epidermis weitgehend widerspiegelt. Die entsprechende OECD-Prüfrichtlinie wurde ursprünglich 2004 angenommen und 2013 unter Berücksichtigung weiterer Prüfmethoden unter Verwendung der RhE-Modelle und der Möglichkeit zur Verwendung der Methoden zur Unterstützung der Unterkategorisierung ätzender Chemikalien zunächst im Jahr 2013 und anschließend nochmals im Jahr 2015 unter Verweis auf das IATA-Leitliniendokument und unter Einführung der Verwendung eines alternativen Verfahrens zur Messung der Viabilität aktualisiert.

4.

Bei dieser Prüfmethode kommen vier validierte im Handel erhältliche RhE-Modelle zum Einsatz. Nach Vorvalidierungsstudien (7) wurde an zwei dieser im Handel erhältichen Prüfmodelle – dem EpiSkin™-Standardmodell (SM) und dem EpiDerm™ Skin Corrosivity Test (SCT) (EPI-200) (im Folgenden ‚validierte Referenzmodelle‘ (VRM) – eine förmliche Validierungsstudie zur Bewertung der Hautverätzung (8)(9)(10) durchgeführt (11) (12). Die Ergebnisse dieser Studien führten zur Empfehlung, dass die beiden genannten VRM für rechtliche Zwecke zur Unterscheidung zwischen ätzenden (C) und nicht ätzenden (NC) Stoffen verwendet werden können und dass mit EpiSkin™ zudem die Unterkategorisierung ätzender Stoffe unterstützt werden kann (13)(14)(15). Zwei weitere im Handel erhältliche In-vitro-Verfahren auf der Grundlage von RhE-Modellen zeigten nach Validierungsstudien auf Basis der Leistungsstandards ähnliche Ergebnisse wie das VRM EpiDerm™ (16)(17)(18): die RhE-Modelle SkinEthic™ (7) und epiCS® (früher auch als EST-1000 bezeichnet), die auch für rechtliche Zwecke zur Unterscheidung zwischen ätzenden und nicht ätzenden Stoffen verwendet werden können (19)(20). Post-Validierungsstudien der Hersteller des RhE-Modells in den Jahren 2012 bis 2014 mit einem verbesserten Protokoll, bei dem Interferenzen durch unspezifische MTT-Reduktion durch die Prüfchemikalien korrigiert werden, ermöglichten zum einen eine bessere Unterscheidung zwischen den Wirkungen C und NC und unterstützten zum anderen die Unterkategorisierung ätzender Chemikalien (21)(22). Die in der Post-Validierung mit dem EpiDerm™ SCT, der SkinEthic™ RHE und EpiCS® gewonnenen Daten wurden weiteren statistischen Analysen unterzogen, um alternative Vorhersagemodelle mit besserer Vorhersagefähigkeit für Unterkategorisierungen zu entwickeln (23).

5.

Bevor eine vorgeschlagene ähnliche oder modifizierte In-vitro-RhE-Prüfmethode zur Untersuchung auf Hautverätzungen außer den VRM für rechtliche Zwecke verwendet werden kann, sollten nach den Anforderungen der nach den Grundsätzen des OECD-Leitliniendokuments Nr. 34 (25) entwickelten Leistungsstandards (24) die Verlässlichkeit, die Relevanz (Genauigkeit) und die Grenzen des Verfahrens für den vorgeschlagenen Verwendungszweck bestimmt werden, um sicherzustellen, dass es mit den VRM vergleichbar ist. Die gegenseitige Anerkennung der Daten wird erst dann garantiert, wenn vorgeschlagene neue oder aktualisierte Prüfmethoden auf der Grundlage der Leistungsstandards überprüft und in die entsprechende Prüfrichtlinie aufgenommen wurden. Die in diese Prüfrichtlinie aufgenommenen Prüfmodelle können verwendet werden, um sowohl länderbezogene Anforderungen an die Prüfergebnisse der In-vitro-Prüfmethode zur Untersuchung von Hautverätzungen zu erfüllen als auch die gegenseitige Anerkennung von Daten beanspruchen zu können.

BEGRIFFSBESTIMMUNGEN

6.

Es gelten die Begriffsbestimmungen in Anlage 1.

AUSGANGSÜBERLEGUNGEN

7.

Diese Prüfmethode ermöglicht die Identifizierung nicht ätzender und ätzender Stoffe und Gemische nach dem UN GHS und der CLP-Verordnung. Außerdem unterstützt diese Prüfmethode die Zuordnung ätzender Stoffe und Gemische zur optionalen Unterkategorie 1A nach Maßgabe des UN GHS (1) sowie eine Kombination der Unterkategorien 1B und 1C (21)(22)(23). Eine Einschränkung bei dieser Prüfmethode besteht darin, dass bei Hautverätzungen wegen der begrenzten Auswahl gut bekannter Chemikalien der Unterkategorie 1C in In-vivo-Untersuchungen nicht zwischen den Unterkategorien 1B und 1C nach dem UN GHS und der CLP-Verordnung unterschieden werden kann. Mithilfe der Prüfmodelle EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE und epiCS® können Unterkategorisierungen (d. h. Unterscheidungen zwischen 1A und 1B-und-1C gegenüber NC) vorgenommen werden.

8.

In der Validierung zur Unterstützung der in diese Prüfmethode einbezogenen Prüfmodelle zur Identifizierung nicht ätzender und ätzender Chemikalien wurden zahlreiche Chemikalien (in erster Linie Stoffe) geprüft, und die empirische Datenbank der Validierungsstudie umfasste 60 Chemikalien aus zahlreichen Chemikalienklassen (8)(9)(10). Zum Nachweis der Sensitivität, der Spezifizität, der Genauigkeit und der laborinternen Reproduzierbarkeit des Versuchs zur Unterkategorisierung haben die Entwickler der Prüfungen Untersuchungen durchgeführt; die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden von der OECD geprüft (21)(22)(23). Auf der Grundlage der insgesamt verfügbaren Daten ist festzustellen, dass die Prüfmethode bei zahlreichen Chemikalienklassen und Aggregatzuständen (u. a. Flüssigkeiten, halbfeste Stoffe, Feststoffe und Wachse) anwendbar ist. Flüssigkeiten können wässrig oder nicht wässrig und Feststoffe in Wasser löslich oder unlöslich sein. Sofern möglich, sollten Feststoffe vor der Applikation zu Feinpulver gemahlen werden; eine weitere Vorbehandlung der Probe ist nicht nötig. Wenn nachgewiesen werden kann, dass die in diese Prüfmethode einbezogenen Prüfmodelle bei einer bestimmten Kategorie von Prüfchemikalien nicht anwendbar sind, sollten sie bei dieser Kategorie von Prüfchemikalien nicht verwendet werden. Diese Prüfmethode kann jedoch nicht nur bei Stoffen verwendet werden, sondern wird auch als für Gemische geeignet betrachtet. Da Gemische allerdings vielfältigen Kategorien zuzurechnen sein und unterschiedliche Zusammensetzungen haben können, und da gegenwärtig nur begrenzte Informationen über die Prüfung von Gemischen verfügbar sind, sollten Prüfmethoden, bei denen nachgewiesen werden kann, dass sie für eine bestimmte Kategorie von Gemischen nicht geeignet sind (beispielsweise durch ein Verfahren entsprechend dem in (26) vorgeschlagenen Verfahren), für die betreffende Kategorie von Gemischen nicht verwendet werden. Bevor die Prüfmethode für die Generierung von Daten für einen bestimmten Regulierungszweck verwendet wird, ist zu prüfen, ob sie für den beabsichtigten Zweck angemessene Ergebnisse liefern kann und, wenn dem so ist, warum. Solche Erwägungen entfallen, wenn die Prüfung des Gemischs rechtlich vorgeschrieben ist. Gase und Aerosole wurden bislang noch nicht in Validierungsstudien bewertet (8)(9)(10). Obwohl deren Prüfung mit der RhE-Technologie prinzipiell vorstellbar ist, erlaubt die vorliegende Prüfmethode das Untersuchen von Gasen und Aerosolen nicht.

9.

Prüfchemikalien, die Licht im selben Spektrum absorbieren können wie MTT-Formazan, und Prüfchemikalien, die in der Lage sind, den lebenswichtigen Farbstoff MTT zu reduzieren (zu MTT-Formazan), können die Messungen der Gewebeviabilität stören und erfordern die Verwendung geeigneter Kontrollen zur Korrektur. Die Art der möglicherweise erforderlichen geeigneten Kontrollen hängt von der Art der durch die Prüfchemikalie ausgelösten Interferenzen und vom Verfahren zur Messung von MTT-Formazan ab (Nummern 25-31).

10.

Diese Prüfmethode vermittelt keine geeigneten Informationen über Hautreizungen; mit PM B.46, die auf demselben RhE-Prüfsystem (allerdings mit einem anderen Protokoll) beruht, werden jedoch gezielt die gesundheitlichen Auswirkungen von Hautreizungen in vitro untersucht (5). Eine umfassende Evaluierung lokaler Auswirkungen auf die Haut nach einer einmaligen dermalen Exposition ist dem OECD-Leitliniendokument über integrierte Prüfungs- und Bewertungsansätze (IATA) zu entnehmen (6). Dieser IATA-Ansatz umfasst die Durchführung von In-vitro-Prüfungen auf hautätzende Wirkung (wie sie in dieser Methode beschrieben werden) und auf Hautreizungen, bevor Prüfungen an lebenden Tieren in Betracht gezogen werden. Die Verwendung menschlicher Haut unterliegt anerkanntermaßen ethischen Überlegungen und Bedingungen auf nationaler und internationaler Ebene.

PRINZIP DER PRÜFMETHODE

11.

Die Prüfchemikalie wird oberflächlich auf ein dreidimensionales RhE-Modell aufgetragen, das aus nicht veränderten humanen epidermalen Keratinozyten besteht, die zu einem mehrschichtigen, ausdifferenzierten Modell humaner Epidermis kultiviert wurden. Das Modell besteht aus geordneten Basal-, Stachel- und Körnerzellschichten und einer mehrlagigen Hornschicht (stratum corneum), die interzelluläre lamellare Fettschichten enthält, deren dominierende Lipidklassen dem in vivo gefundenen Lipidmuster entsprechen.

12.

Diese RhE-Prüfmethode basiert auf der Voraussetzung, dass ätzende Chemikalien in der Lage sind, durch Diffusion oder Erosion die Hornhaut zu durchdringen, und darüber hinaus eine zytotoxische Wirkung auf die darunter liegenden Zellschichten ausüben. Die Zellviabilität wird durch Enzymkonversion des Vitalfarbstoffs MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid, Thiazolyl-Blau-Tetrazoliumbromid; CAS-Nummer 298-93-1] zu einem blauen Formazan-Salz gemessen, das nach seiner Extraktion aus Geweben quantifiziert wird (27). Ätzende Chemikalien werden anhand ihrer Fähigkeit erkannt, die Zellviabilität unter vorgegebene Schwellenwerte zu senken (Nummern 35 und 36). Die Prüfmethode auf der Grundlage von RhE-Modellen zur Untersuchung von Hautverätzungen hat sich bei der Prüfung von Kaninchen nach PM B.4 (2) als für die Vorhersage von In-vivo-Hautkorrosionswirkungen geeignet erwiesen.

NACHWEIS DER LEISTUNGFÄHIGKEIT

13.

Vor der routinemäßigen Anwendung eines der vier validierten RhE-Prüfmodelle nach dieser Prüfmethode sollten Labors die erforderliche technische Befähigung durch eine ordnungsgemäße Klassifizierung der zwölf in Tabelle 1 empfohlenen Leistungsstoffe nachweisen. Bei Verwendung der Methode zur Unterklassifizierung konnten zudem die richtigen Unterkategorien nachgewiesen werden. Wenn ein dort genannter Stoff nicht verfügbar ist bzw. wenn dies gerechtfertigt ist, kann ein anderer Stoff verwendet werden, für den geeignete In-vivo- und In-vitro-Referenzdaten verfügbar sind (z. B. aus der Liste der Referenzchemikalien (24)), sofern die in Tabelle 1 beschriebenen Auswahlkriterien angewendet werden.

Tabelle 1

Liste der Leistungsstoffe  (8)

Stoff

CAS-Nr.

Chemikalienklasse (9)

UN-GHS-/CLP-Kat. nach In-vivo-Ergebnissen (10)

VRM Kat. nach In-vitro-Ergebnissen (11)

MTT-Reduktionsmittel (12)

Aggregat-zustand

Unterkategorie 1A In vivo ätzende Chemikalien

Bromessigsäure

79-08-3

Organische Säure

1A

(3) 1A

S

Bortrifluoriddihydrat

13319-75-0

Anorganische Säure

1A

(3) 1A

L

Phenol

108-95-2

Phenol

1A

(3) 1A

S

Dichloracetylchlorid

79-36-7

Elektrophil

1A

(3) 1A

L

Kombination von in vivo ätzenden Chemikalien der Unterkategorien 1B-und-1C

Glyoxylsäure-Monohydrat

563-96-2

Organische Säure

1B-und-1C

(3) 1B-und-1C

S

Milchsäure

598-82-3

Organische Säure

1B-und-1C

(3) 1B-und-1C

L

Ethanolamin

141-43-5

Organische Base

1B

(3) 1B-und-1C

Y

Viskose

Chlorwasserstoffsäure (14,4 %)

7647-01-0

Anorganische Säure

1B-und-1C

(3) 1B-und-1C

L

In Vivo nicht ätzende Chemikalien

Phenethylbromid

103-63-9 CIPAC-Nr.

Elektrophil

NC

(3) NC

Y

L

4-Amino-1,2,4-triazol

584-13-4

Organische Base

NC

(3) NC

S

4-(Methylthio)-Benzaldehyd

3446-89-7

Elektrophil

NC

(3) NC

Y

L

Laurinsäure

143-07-7

Organische Säure

NC

(3) NC

S

Abkürzungen: CAS-Nr. (CAS Registry Number = CAS-Registrierungsnummer); VRM = validierte Referenzmethode; NC = nicht ätzend; Y = Ja; S = fest; L = flüssig.

14.

Im Rahmen des Nachweises der Leistungsfähigkeit sollte der Benutzer die vom Hersteller des Hautmodells spezifizierten Barriereeigenschaften der Gewebe nach Erhalt überprüfen. Dies ist besonders dann wichtig, wenn die Gewebe über große Entfernungen/Zeiträume transportiert werden. Sobald eine Methode erfolgreich etabliert und ihre Leistungsfähigkeit demonstriert wurde, ist diese Überprüfung nicht mehr routinemäßig erforderlich. Allerdings empfiehlt es sich auch bei routinemäßig angewandten Prüfmethoden, die Barriereeigenschaften in regelmäßigen Abständen zu kontrollieren.

VERFAHREN

15.

Im Folgenden werden die Elemente und die Verfahren der in dieser Prüfmethode verwendeten RhE-Prüfmodelle zur Bewertung von Hautverätzungen allgemein beschrieben. Die als zur Verwendung im Rahmen dieser Prüfmethode wissenschaftlich fundiert bewerteten und unterstützten RhE-Modelle (d. h. die Modelle EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE und epiCS®) (16)(17)(19)(28)(29)(30)(31)(32)(33) sind im Handel erhältlich. Standardarbeitsanweisungen (SOPs) für diese vier RhE-Modelle sind verfügbar (34)(35)(36)(37), und die jeweiligen wesentlichen Elemente der Prüfmethoden werden in Anlage 2 kurz beschrieben. Bei der Einführung und Verwendung eines dieser Modelle im Labor sollten die relevanten SOPs berücksichtigt werden. Die vier RhE-Prüfmodelle dieser Prüfmethode sollten die folgenden Anforderungen erfüllen:

ELEMENTE DER RHE-PRÜFMETHODE

Allgemeine Bedingungen

16.

Die Epithelschicht sollte aus normalen menschlichen Keratinozyten gebildet werden. Unter der funktionsfähigen Hornschicht (stratum corneum) sollten mehrere Lagen lebensfähiger Epithelzellen (Basalzellschicht, stratum spinosum, stratum granulosum) vorhanden sein. Die Hornschicht sollte mehrlagig sein und das zur Erzeugung einer funktionsfähigen Barriere essenzielle Lipidprofil aufweisen und muss robust genug sein, um das schnelle Eindringen zytotoxischer Referenzchemikalien wie Natriumdodecylsulfat (SDS) oder Triton X-100 zu verhindern. Die Barrierefunktion kann entweder durch Bestimmung der Konzentration, bei der eine Referenzchemikalie die Viabilität der Gewebe nach einer vorgegebenen Expositionsdauer um 50 % verringert (IC50), oder durch die Bestimmung der Expositionszeit bewertet werden, die erforderlich ist, um die Zellviabilität bei Anwendung der Referenzchemikalie in einer vorgegebenen festen Konzentration um 50 % zu reduzieren (ET50) (Nummer 18). Die Rückhalteeigenschaften des RhE-Modells müssen ausschließen, dass Material rund um die Hornschicht in lebensfähiges Gewebe eindringt und die Modellierung der Hautexposition beeinträchtigt. Das RhE-Modell sollte nicht mit Bakterien, Viren, Mykoplasma oder Pilzen kontaminiert sein.

Funktionale Bedingungen

Viabilität

17.

Die Größenordnung der Viabilität der Gewebe wird mit der MTT-Prüfung bestimmt (27). Die lebensfähigen Zellen des RhE-Gewebemodells reduzieren den lebenswichtigen Farbstoff MTT zu einem blauen MTT-Formazan-Niederschlag, der dann mit Isopropanol (oder einem ähnlichen Lösungsmittel) aus dem Gewebe extrahiert wird. Die optische Dichte (OD) des Extraktionslösungsmittels allein sollte ausreichend gering sein, d. h. OD < 0,1. Das extrahierte MTT-Formazan kann durch eine Standard-(OD)-Absorptionsmessung oder mit einem HPLC/UPLC-Spektrometrieverfahren (38) quantifiziert werden. Die Anwender des RhE-Modells sollten sicherstellen, dass jede Charge des verwendeten Modells die vorgegebenen Kriterien für die Negativkontrolle erfüllt. Der Entwickler/Hersteller des Hautmodells sollte eine Akzeptanzspanne (oberer und unterer Grenzwert) für die OD-Werte der Negativkontrolle festlegen. Die Akzeptanzspanne der OD-Werte der Negativkontrolle für die vier validierten RhE-Prüfmodelle dieser Prüfmethode sind Tabelle 2 zu entnehmen. Bei Durchführung einer HPLC/UPLC-Spektrophotometrie sollten die in Tabelle 2 genannten OD-Spannen der Negativkontrolle als Akzeptanzkriterium für die Negativkontrolle verwendet werden. Es sollte dokumentiert werden, dass die mit der Negativkontrolle behandelten Gewebe über die gesamte Dauer der Exposition stabil bleiben (bzw. vergleichbare OD-Messungen ergeben).

Tabelle 2

Akzeptanzspannen für OD-Werte der Negativkontrolle zur Kontrolle der Chargenqualität

 

Untere Akzeptanzgrenze

Obere Akzeptanzgrenze

EpiSkin™ (SM)

> 0,6

< 1,5

EpiDerm™ SCT (EPI-200)

> 0,8

< 2,8

SkinEthic™ RHE

> 0,8

< 3,0

epiCS®

> 0,8

< 2,8

Barrierefunktion

18.

Das stratum corneum und die Zusammensetzung seiner Fette sollten das schnelle Eindringen bestimmter zytotoxischer Referenzchemikalien wie z. B. SDS oder Triton X-100 verhindern. Dies wird durch die Ermittlung von IC50 oder ET50 bestimmt (Tabelle 3). Die Barrierefunktion der einzelnen Chargen des verwendeten RhE-Modells sollte nach der Lieferung der Gewebe an den Endverwender vom Entwickler/Hersteller des RhE-Modells nachgewiesen werden (Nummer 21).

Morphologie

19.

Die histologische Untersuchung des RhE-Modells sollte unter Nachweis einer aus mehreren Lagen bestehenden und der menschlichen Hornschicht (epidermis) ähnelnden Struktur mit stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum und stratum corneum erfolgen; das Modell sollte ein Lipidprofil ähnlich dem Lipidprofil der menschlichen Epidermis aufweisen. Die histologische Untersuchung der einzelnen zum Nachweis einer geeigneten Morphologie der Gewebe verwendeten Chargen des RhE-Modells sollte jeweils nach der Lieferung der Gewebe an den Endverwender vom Entwickler/Hersteller des RhE-Modells nachgewiesen werden (Nummer 21).

Reproduzierbarkeit.

20.

Die Anwender der Prüfmethode sollten die Reproduzierbarkeit der Prüfmethoden mit den Positiv- und den Negativkontrollen über längere Zeit nachweisen. Außerdem sollte die Prüfmethode nur dann verwendet werden, wenn der Entwickler/Hersteller des RhE-Modells Daten vorlegt, die die Reproduzierbarkeit mit ätzenden und mit nicht ätzenden Chemikalien z. B. aus der Liste der Leistungsstoffe (Tabelle 1) über längere Zeit belegen. Bei Verwendung einer Prüfmethode zur Unterkategorisierung sollte zudem die Reproduzierbarkeit in Bezug auf Unterkategorien nachgewiesen werden.

Qualitätskontrolle (QK)

21.

Das RhE-Modell sollte nur dann verwendet werden, wenn der Entwickler/Hersteller nachweist, dass jede Charge des verwendeten Hautmodells bestimmten Freigabekriterien genügt, von denen die Kriterien der Viabilität (Nummer 17), der Barrierefunktion (Nummer 18) und der Morphologie (Nummer 19) die wichtigsten sind. Diese Daten werden den Anwendern der Prüfmethode zur Verfügung gestellt werden, damit diese sie in den Prüfbericht aufnehmen können. Nur mit freigegebenen Gewebechargen erzielte Ergebnisse können für eine zuverlässige Vorhersage für die Einstufung von Verätzungen akzeptiert werden. Der Entwickler/Hersteller des Hautmodells (oder – bei Verwendung eines hauseigenen Modells – der Prüfer) legt eine Akzeptanzspanne (oberer und unterer Grenzwert) für IC50 bzw. ET50 fest. Die Akzeptanzspannen der vier validierten Prüfmodelle sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 3

Chargenfreigabekriterien im Rahmen der Qualitätskontrolle

 

Untere Akzeptanzgrenze

Obere Akzeptanzgrenze

EpiSkin™ (SM) (18-stündige Behandlung mit SDS) (33)

IC50 = 1,0 mg/ml

IC50 = 3,0 mg/ml

EpiDerm™ SCT (EPI-200) (1 % Triton X-100) (34)

ET50 = 4,0 h

ET50 = 8,7 h

SkinEthic™ RHE (1 % Triton X-100) (35)