ANHANG I

PROBENAHMEVERFAHREN

1.   ZWECK UND ANWENDUNGSBEREICH

Die zur amtlichen Untersuchung bestimmten Futtermittelproben werden gemäß den nachstehenden Verfahren entnommen. Die dabei erhaltenen Proben gelten als repräsentativ für die betreffende Partie.

2.   PROBENAHMEPERSONAL

Die Probenahme erfolgt durch die von den Mitgliedstaaten zu diesem Zweck bevollmächtigten Personen.

3.   BEGRIFFSBESTIMMUNGEN

Partie: Futtermittelmenge, die eine Einheit bildet und von der angenommen wird, dass sie einheitliche Merkmale besitzt.

Einzelprobe: Menge, die an einer Stelle der Partie entnommen wird.

Sammelprobe: Gesamtmenge von aus einer Partie entnommenen Einzelproben.

Reduzierte Sammelprobe: Repräsentative Teilmenge der Sammelprobe, die nach mengenmäßiger Verringerung erhalten wird.

Endprobe: Teilmenge der reduzierten Sammelprobe oder der homogenisierten Sammelprobe.

4.   GERÄTE

4.1.	Die Geräte zur Probenahme müssen aus einem Material bestehen, das die zu beprobenden Erzeugnisse nicht beeinflusst. Diese Geräte können von den Mitgliedstaaten zugelassen werden.

4.2.   Empfohlene Geräte für die Probenahme fester Futtermittel

4.2.1.   Manuelle Probenahme

4.2.1.1.

Schaufel mit ebenem Boden und rechteckig hochgebogenem Rand.

4.2.1.2.

Probestecher mit langem Schlitz oder Kammerstecher. Die Größe des Probestechers ist den Merkmalen der Partie (Tiefe des Behälters, Größe des Sacks usw.) und der Größe der Futtermittelteilchen anzupassen.

4.2.2.   Mechanische Probenahme

Zugelassene mechanische Geräte dürfen zur Probenahme aus in Bewegung befindlichen Futtermitteln verwendet werden.

4.2.3.   Probenteiler

Zur Zerlegung der Probe in ungefähr gleiche Teile bestimmte Geräte dürfen zur Herstellung der Einzelproben sowie zur Vorbereitung von reduzierten Sammelproben und Endproben verwendet werden.

5.   MENGENMÄSSIGE ANFORDERUNGEN

5.A.	Bei der Untersuchung auf Stoffe oder Erzeugnisse, die gleichmäßig im Futtermittel verteilt sind
5.A.1.	Partie Die Partie darf nur so groß sein, dass von allen Teilen, aus denen die Partie besteht, Proben entnommen werden können.
5.A.2.	Einzelproben
5.A.2.1.	Lose Futtermittel:	Mindestanzahl der Einzelproben:
5.A.2.1.1.	Partien bis zu 2,5 t	7
5.A.2.1.2.	Partien von mehr als 2,5 t	√ 20 Mal die Zahl der Tonnen, aus denen die Partie besteht (1), begrenzt auf höchstens 40 Einzelproben
5.A.2.2.	Verpackte Futtermittel:	Mindestanzahl der zu beprobenden Packungen (2):
5.A.2.2.1.	Packungen von mehr als 1 kg Inhalt
5.A.2.2.1.1.	Partien aus 1-4 Packungen	Alle Packungen
5.A.2.2.1.2.	Partien aus 5-16 Packungen	4
5.A.2.2.1.3.	Partien aus mehr als 16 Packungen	√ Anzahl der Packungen, aus denen die Partie besteht (1), begrenzt auf höchstens 20 Packungen
5.A.2.2.2.	Packungen bis 1 kg Inhalt	4
5.A.2.3.	Flüssige oder halbflüssige Futtermittel:	Mindestanzahl der zu beprobenden Behälter (2):
5.A.2.3.1.	Behälter von mehr als 1 l Inhalt
5.A.2.3.1.1.	Partien aus 1-4 Behältern	Alle Behälter
5.A.2.3.1.2.	Partien aus 5-16 Behältern	4
5.A.2.3.1.3.	Partien aus mehr als 16 Behältern	√ Anzahl der Behälter, aus denen die Partie besteht (1), begrenzt auf höchstens 20 Behälter
5.A.2.3.2.	Behälter bis zu 1 l Inhalt	4
5.A.2.4.	Futterblöcke und Lecksteine	Mindestanzahl der zu beprobenden Futterblöcke oder Lecksteine (2): 1 Futterblock oder Leckstein je Partie von 25 Einheiten, begrenzt auf höchstens 4 Futterblöcke oder Lecksteine
5.A.3.	Sammelproben Je Partie ist eine einzige Sammelprobe erforderlich. Die Gesamtmenge der Einzelproben, aus denen sich die Sammelprobe zusammensetzt, darf nicht unter den nachstehend festgesetzten Mindestmengen liegen:
5.A.3.1.	Lose Futtermittel:	4 kg
5.A.3.2.	Verpackte Futtermittel:
5.A.3.2.1.	Packungen von mehr als 1 kg	4 kg
5.A.3.2.2.	Packungen bis zu 1 kg	Gewicht des Inhalts von 4 Originalpackungen
5.A.3.3.	Flüssige oder halbflüssige Futtermittel:
5.A.3.3.1.	Behälter von mehr als 1 l Inhalt	4 l
5.A.3.3.2.	Behälter bis zu 1 l Inhalt	Volumen des Inhalts von 4 Originalbehältern
5.A.3.4.	Futterblöcke oder Lecksteine:
5.A.3.4.1.	mit einem Einzelgewicht von mehr als 1 kg	4 kg
5.A.3.4.2.	mit einem Einzelgewicht bis zu 1 kg	Gewicht von 4 Originalblöcken oder -steinen
5.A.4.	Endprobe Die Sammelprobe dient, sofern erforderlich nach Reduzierung, der Herstellung der Endproben. Mindestens eine Endprobe ist zu untersuchen. Die Menge jeder zur Untersuchung bestimmten Endprobe darf nicht unter den nachstehend festgesetzten Mindestmengen liegen:
	Feste Futtermittel	500 g
	Flüssige oder halbflüssige Futtermittel	500 ml
5.B.	Bei der Untersuchung auf unerwünschte Stoffe oder Erzeugnisse, die ungleichmäßig im Futtermittel verteilt sein können, wie z. B. Aflatoxine, Mutterkorn, Ricinus und Crotalaria in Einzelfuttermitteln (3)
5.B.1.	Partie: siehe 5.A.1
5.B.2.	Einzelproben
5.B.2.1.	Lose Futtermittel: siehe 5.A.2.1
5.B.2.2.	Verpackte Futtermittel:	Mindestanzahl der zu beprobenden Packungen:
5.B.2.2.1.	Partien aus 1-4 Packungen	Alle Packungen
5.B.2.2.2.	Partien aus 5-16 Packungen:	4
5.B.2.2.3.	Partien aus mehr als 16 Packungen	√ Anzahl der Packungen, aus der die Partie besteht (1), begrenzt auf höchstens 40 Packungen
5.B.3.	Sammelproben Die Anzahl der Sammelproben hängt von der Größe der Partie ab. Die Mindestanzahl der Sammelproben je Partie ist nachstehend angegeben. Die Gesamtmenge der Einzelproben, aus denen sich die Sammelprobe zusammensetzt, darf nicht unter 4 kg liegen.
5.B.3.1.	Lose Futtermittel:
	Gewicht der Partie (t)	Mindestanzahl der Sammelproben je Partie:
	bis zu 1 t	1
	mehr als 1 bis 10 t	2
	mehr als 10 bis 40 t	3
	mehr als 40 t	4
5.B.3.2.	Verpackte Futtermittel:
	Anzahl der Packungen, die die Partie bilden:	Mindestanzahl der Sammelproben je Partie:
	von 1 bis 16	1
	17 bis 200	2
	201 bis 800	3
	mehr als 800	4
5.B.4.	Endprobe Jede Sammelprobe ergibt nach Reduzierung die Endproben. Mindestens eine Endprobe je Sammelprobe ist zu untersuchen. Das Gewicht der zur Untersuchung bestimmten Endproben darf nicht unter 500 g liegen.

6.   VORSCHRIFTEN FÜR DIE ENTNAHME, VORBEREITUNG UND VERPACKUNG DER PROBEN

6.1.   Allgemeines

Die Proben sind so schnell wie möglich zu entnehmen und vorzubereiten, wobei mit der angemessenen Sorgfalt vorzugehen ist, damit das Erzeugnis weder verändert noch verunreinigt wird. Die für die Probenahme bestimmten Geräte, Flächen und Behälter müssen sauber und trocken sein.

6.2.   Einzelproben

6.2.A.   Bei der Untersuchung auf Stoffe oder Erzeugnisse, die gleichmäßig im Futtermittel verteilt sind

Die Einzelproben sind nach dem Zufallsprinzip aus der gesamten Partie zu entnehmen. Ihre Größe muss ungefähr gleich sein.

6.2.A.1.   Lose Futtermittel

Die Partie ist künstlich in ungefähr gleiche Teile aufzuteilen. Nach dem Zufallsprinzip ist entsprechend der Anzahl der unter 5.A.2 vorgesehenen Einzelproben eine Anzahl Teile zu wählen und jedem dieser Teile mindestens eine Probe zu entnehmen.

Die Probenahme kann auch bei einer Partie erfolgen, die sich in Bewegung (Aufladen bzw. Abladen) befindet.

6.2.A.2.   Verpackte Futtermittel

Die erforderliche Anzahl der zu beprobenden Packungen ist nach 5.A.2 festgelegt; aus jeder dieser Packungen ist ein Teil des Inhalts mit einem Probestecher oder einer Schaufel zu entnehmen. Gegebenenfalls sind die Proben zu entnehmen, nachdem die Packungen getrennt entleert worden sind. Wenn erforderlich, sind bei jeder einzelnen Sammelprobe Klumpen zu zerdrücken; dazu werden diese gegebenenfalls von dem übrigen Material abgetrennt und anschließend wieder untergemischt.

6.2.A.3.   Flüssige oder halbflüssige homogene oder homogenisierbare Futtermittel

Die erforderliche Anzahl der zu beprobenden Behälter ist nach 5.A.2 festgelegt; aus jedem dieser Behälter ist eine Probe zu entnehmen, nachdem sein Inhalt, falls nötig, homogenisiert worden ist.

Die Einzelproben können auch beim Ablassen des Erzeugnisses entnommen werden.

6.2.A.4.   Flüssige oder halbflüssige nicht homogenisierbare Futtermittel

Die erforderliche Anzahl der zu beprobenden Behälter ist nach 5.A.2 festgelegt; die Proben sind verschiedenen Höhen zu entnehmen.

Die Proben können ebenfalls während des Ablassens eines Erzeugnisses nach Beseitigung der ersten Bestandteile entnommen werden.

In beiden Fällen muss das Gesamtvolumen der entnommenen Proben mindestens 10 l betragen.

6.2.A.5.   Futterblöcke und Lecksteine

Die erforderliche Anzahl der zu beprobenden Futterblöcke oder Lecksteine ist nach 5.A.2 festgelegt; jedem Block oder Stein ist ein Teil zu entnehmen.

6.2.B.   Bei der Untersuchung auf unerwünschte Stoffe oder Erzeugnisse, die ungleichmäßig im Futtermittel verteilt sein können, wie z. B. Aflatoxine, Mutterkorn, Ricinus und Crotalaria in Futtermittel-Ausgangserzeugnissen

Die Partie ist entsprechend der Anzahl der unter 5.B.3 vorgesehenen Sammelproben künstlich in eine Anzahl ungefähr gleicher Teile aufzuteilen. Falls diese Anzahl größer als 1 ist, ist die Gesamtanzahl der unter 5.B.2 vorgesehenen Einzelproben ungefähr gleich auf die verschiedenen Teile zu verteilen. Anschließend sind Proben ungefähr gleicher Größe (4) dergestalt zu ziehen, dass das Gesamtgewicht der Proben jedes Teiles nicht unter 4 kg liegt, wie dies für jede Sammelprobe erforderlich ist. Die aus verschiedenen Teilen stammenden Einzelproben dürfen nicht miteinander vereinigt werden.

6.3.   Vorbereitung der Sammelproben

6.3.A.   Bei der Untersuchung auf Stoffe oder Erzeugnisse, die gleichmäßig im Futtermittel verteilt sind

Die Einzelproben sind zu einer einzigen Sammelprobe zusammenzufassen.

6.3.B.   Bei der Untersuchung auf unerwünschte Stoffe oder Erzeugnisse, die ungleichmäßig im Futtermittel verteilt sein können, wie z. B. Aflatoxine, Mutterkorn, Ricinus und Crotalaria in Futtermittel-Ausgangserzeugnissen

Die Einzelproben aus jedem Teil der Partie sind zu mischen, und daraus ist die in 5.B.3 vorgesehene Anzahl Sammelproben herzustellen. Dabei ist darauf zu achten, dass die Herkunft jeder Sammelprobe angegeben wird.

6.4.   Vorbereitung der Endproben

Jede Sammelprobe ist sorgfältig zu mischen, bis sie homogen ist (5). Wenn nötig, wird die Sammelprobe zuerst auf bis zu mindestens 2 kg bzw. 2 l entweder mittels eines mechanischen oder automatischen Probenteilers oder durch das Vierteilungsverfahren reduziert (reduzierte Sammelprobe).

Dann werden mindestens 3 ungefähr gleich große Endproben entsprechend den mengenmäßigen Anforderungen unter 5.A.4 oder 5.B.4 hergestellt. Jede Probe ist in einen geeigneten Behälter zu füllen. Es sind alle notwendigen Vorkehrungen zu treffen, damit jede Veränderung der Zusammensetzung bzw. jede Verunreinigung oder Verfälschung der Probe während des Transports oder der Lagerung vermieden wird.

6.5.   Verschließung und Kennzeichnung der Endproben

Die Behälter oder Packungen sind so zu versiegeln/zu plombieren und zu kennzeichnen, dass sie nicht ohne Beschädigung des Siegels/der Plombe geöffnet werden können, wobei die gesamte Kennzeichnung von dem Siegel/der Plombe mit erfasst werden muss.

7.   PROBENAHMEPROTOKOLL

Für jede Probenahme ist ein Probenahmeprotokoll zu erstellen, aus dem die Identität der beprobten Partie eindeutig hervorgeht.

8.   VERWENDUNG DER PROBEN

Für jede Sammelprobe wird so schnell wie möglich mindestens eine Endprobe — zusammen mit den Angaben, die für die Untersuchung erforderlich sind — an das zugelassene Laboratorium gesandt.

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(1)  Wenn die Zahl einen Bruch ergibt, ist dieser auf die nächsthöhere ganze Zahl aufzurunden.

(2)  Für Packungen oder Behälter bis zu 1 kg oder 1 l Inhalt sowie für Futterblöcke oder Lecksteine bis zu 1 kg bildet der Inhalt einer Originalverpackung oder eines Originalbehälters, ein Futterblock oder ein Leckstein eine Einzelprobe.

(3)  Die unter 5.A vorgesehenen Methoden sind bestimmt für die Untersuchung auf Aflatoxine, Mutterkorn, Ricinus und Crotalaria in Allein- und Ergänzungsfuttermitteln.

(4)  Bei den verpackten Futtermitteln ist ein Teil des zu beprobenden Inhalts mittels eines Probestechers oder einer Schaufel zu entnehmen, nachdem die Packungen gegebenenfalls getrennt geleert wurden.

(5)  Wenn erforderlich, sind bei jeder einzelnen Sammelprobe Klumpen zu zerdrücken; dazu werden diese gegebenenfalls von dem übrigen Material abgetrennt und anschließend wieder untergemischt.

ANHANG II

ALLGEMEINE BESTIMMUNGEN HINSICHTLICH DER METHODEN ZUR ANALYSE VON FUTTERMITTELN

A.   VORBEREITUNG DER PROBEN ZUR ANALYSE

1.   Zweck

Die nachfolgend beschriebenen Verfahren beziehen sich auf die Vorbereitung der zur Analyse bestimmten Endproben, die nach der Probenahme gemäß den Bestimmungen von Anhang I an die Kontrolllaboratorien gesandt wurden.

Die Vorbereitung dieser Proben ist so vorzunehmen, dass die in den Analysemethoden vorgesehenen Einwaagen homogen und repräsentativ für die Endproben sind.

2.   Vorsichtsmaßnahmen

Die Wahl des Verfahrens für die Probenvorbereitung hängt von der Art der angewandten Analysemethode ab. Daher ist es von größter Bedeutung, sicherzustellen, dass das angewandte Probenvorbereitungsverfahren für die jeweilige Analysemethode geeignet ist.

Alle notwendigen Schritte sind so durchzuführen, dass eine Verunreinigung der Probe und eine Veränderung ihrer Zusammensetzung so weit wie möglich vermieden werden.

Das Zerkleinern, Mischen und Sieben ist möglichst rasch durchzuführen, wobei die Probe möglichst wenig Luft und Licht ausgesetzt wird. Die Verwendung von Mühlen oder Zerkleinerungsgeräten, die zu einer merklichen Erwärmung der Probe führen könnten, ist zu vermeiden.

Für besonders hitzeempfindliche Futtermittel wird manuelles Zerkleinern empfohlen. Es ist außerdem darauf zu achten, dass die verwendeten Geräte keine Kontaminationsquelle für Spurenelemente bilden.

Kann die Probe nicht ohne eine signifikante Veränderung ihres Feuchtigkeitsgehalts vorbereitet werden, so ist dieser vor und nach der Vorbereitung gemäß dem in Anhang III Teil A festgelegten Verfahren zu bestimmen.

3.   Verfahren

Die Probe ist für Analyse- bzw. Referenzzwecke mittels angemessener Teilungsmethoden wie alternierendes Schaufeln, Riffel- oder Rotationsteilung in geeignete Teilproben zu teilen. Das Kegeln und das Vierteilungsverfahren werden nicht empfohlen, da mit diesen eine hohe Teilungsfehlerquote bei den Teilproben einhergehen kann. Die Referenzproben sind in einem geeigneten sauberen und trockenen, luftdicht verschließbaren Behälter aufzubewahren. Die für die Analyse bestimmten Teilproben von mindestens 100 g sind wie nachfolgend angegeben vorzubereiten.

3.1.   Futtermittel, die direkt gemahlen werden können

Sofern keine besonderen Angaben in der Analysemethode gemacht werden, wird die gesamte Probe nach dem Zerkleinern erforderlichenfalls durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 1 mm Seitenlänge (entsprechend der Empfehlung ISO R 565) passiert. Zu starkes Zerkleinern ist zu vermeiden.

Die gesiebte Probe wird gemischt und in einen geeigneten sauberen, trockenen, luftdicht verschließbaren Behälter abgefüllt. Unmittelbar vor der Einwaage muss die Probe erneut gemischt werden.

3.2.   Futtermittel, die nach Trocknung gemahlen werden können

Sofern keine besonderen Angaben in der Analysemethode gemacht werden, wird die Probe bis auf einen Feuchtigkeitsgehalt von 8 bis 12 % unter Anwendung des unter Nummer 4.3 der Methode zur Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts (siehe Anhang III Teil A) vorgesehenen Vortrocknungsverfahrens getrocknet. Die weitere Vorbereitung erfolgt gemäß Nummer 3.1.

3.3.   Flüssige oder halbflüssige Futtermittel

Die Probe wird in einen geeigneten sauberen, trockenen, luftdicht verschließbaren Behälter abgefüllt und unmittelbar vor der Einwaage gründlich gemischt.

3.4.   Andere Futtermittel

Proben, die nach keinem der oben genannten Verfahren vorbereitet werden können, sind durch ein anderes Verfahren zu behandeln, das eine homogene und repräsentative Einwaage der Endprobe gestattet.

4.   Aufbewahrung der Proben

Die Proben müssen bei einer Temperatur gelagert werden, die ihre Zusammensetzung nicht beeinflusst. Für Proben, die zur Analyse von Vitaminen oder besonders lichtempfindlichen Stoffen bestimmt sind, werden braune Glasgefäße verwendet.

B.   BESTIMMUNGEN ÜBER IN ANALYSEVERFAHREN VERWENDETE REAGENZIEN UND GERÄTE

1.

Vorbehaltlich besonderer Angaben in den Analysemethoden müssen alle zur Analyse verwendeten Reagenzien von analysenreiner (p. a.) Qualität sein. Bei der Analyse von Spurenelementen muss die Reinheit der Reagenzien in einem Reagenzienblindversuch überprüft werden. Je nach dem erhaltenen Wert kann eine weitere Reinigung der Reagenzien erforderlich sein.

2.

Bei jedem in den Analysemethoden erwähnten Lösungs-, Verdünnungs-, Spül- oder Auswaschvorgang, bei dem keine Angabe über die Art des zu verwendenden Lösungs- oder Verdünnungsmittels gemacht wird, ist Wasser zu verwenden. Im Allgemeinen wird destilliertes oder demineralisiertes Wasser verwendet. In besonderen in den Analysemethoden angegebenen Fällen muss das Wasser speziellen Reinigungsverfahren unterzogen werden.

3.

Da die übliche Ausstattung von Kontrolllaboratorien vorausgesetzt wird, werden nur besondere Instrumente und Geräte oder solche, die speziellen Anforderungen entsprechen müssen, in den Analysemethoden aufgeführt. Sie müssen gut gereinigt sein, vor allem bei der Bestimmung von sehr geringen Stoffmengen.

C.   ANWENDUNG VON ANALYSEMETHODEN UND FORMULIERUNG DER ERGEBNISSE

1.   Extraktionsverfahren

Einige Methoden geben ein spezifisches Extraktionsverfahren vor. Generell können andere Extraktionsverfahren als das in der Methode genannte angewandt werden unter der Bedingung, dass das verwendete Extraktionsverfahren für die analysierte Matrix eine vergleichbare Extraktionseffizienz aufweist wie das in der Methode genannte Verfahren.

2.   Clean-up-Verfahren

Einige Methoden geben ein spezifisches Clean-up-Verfahren vor. Generell können andere Clean-up-Verfahren als das in der Methode genannte angewandt werden unter der Bedingung, dass das verwendete Clean-up-Verfahren für die analysierte Matrix zu vergleichbaren Analyseergebnissen führt wie das in der Methode genannte Verfahren.

3.   Berichterstattung über die angewandte Analysemethode

Im Allgemeinen wird zur Bestimmung eines Stoffes in Futtermitteln eine einzige Analysemethode festgelegt. Werden mehrere Methoden genannt, muss die vom Kontrolllaboratorium angewandte Methode im Analysebericht angegeben werden.

4.   Anzahl der Bestimmungen

Das im Analysebericht angegebene Ergebnis soll den Mittelwert aus mindestens 2 Bestimmungen von separaten Einwaagen der Probe mit ausreichender Wiederholbarkeit darstellen.

Allerdings sind bei der Analyse auf unerwünschte Stoffe — sofern das Ergebnis der ersten Bestimmung deutlich (> 50 %) unter dem zu kontrollierenden Sollwert liegt — keine weiteren Bestimmungen erforderlich unter der Bedingung, dass die geeigneten Qualitätsverfahren angewandt werden.

Bei der Kontrolle des angegebenen Gehalts an einem Stoff oder einer Zutat sind — sofern das Ergebnis der ersten Bestimmung den angegebenen Gehalt bestätigt, d. h., wenn das Analyseergebnis innerhalb des akzeptablen Toleranzbereichs für den angegebenen Gehalt liegt — keine weiteren Bestimmungen erforderlich unter der Bedingung, dass die geeigneten Qualitätsverfahren angewandt werden.

In einigen Fällen ist dieser Toleranzbereich in Rechtsvorschriften wie beispielsweise in der Richtlinie 79/373/EWG des Rates (1) definiert.

5.   Bericht über die Analyseergebnisse

Das Ergebnis ist gemäß den Angaben in den Analysemethoden mit einer angemessenen Zahl an signifikanten Ziffern anzugeben und, falls nötig, auf den Feuchtigkeitsgehalt der Endprobe vor deren Vorbereitung umzurechnen.

6.   Messunsicherheit und Wiederfindungsrate bei der Analyse auf unerwünschte Stoffe

Hinsichtlich unerwünschter Stoffe im Sinne der Richtlinie 2002/32/EG, einschließlich Dioxinen und dioxinähnlichen PCB, erfüllt ein zur Verfütterung bestimmtes Erzeugnis die Bestimmung bezüglich des festgelegten Höchstgehalts nicht, wenn das Analyseergebnis unter Berücksichtigung der erweiterten Messunsicherheit und der Berichtigung um die Wiederfindungsrate den Höchstgehalt überschreitet. Zur Beurteilung, ob die Höchstgehalte eingehalten werden, wird die um die Wiederfindungsrate berichtigte gemessene Konzentration sowie die vom Analyseergebnis subtrahierte erweiterte Messunsicherheit herangezogen. Dieses Verfahren wird nur dann angewandt, wenn die Analysemethode die Schätzung der Messunsicherheit und die Berichtigung um die Wiederfindungsrate ermöglicht (z. B. nicht möglich bei mikroskopischer Analyse).

Das Analyseergebnis ist wie folgt anzugeben (soweit die verwendete Analysemethode die Schätzung der Messunsicherheit und der Wiederfindungsrate ermöglicht):

a)	Berichtigung um die Wiederfindungsrate, wobei diese anzugeben ist. Eine Berichtigung um die Wiederfindungsrate ist nicht erforderlich, wenn Letztere zwischen 90 und 110 % beträgt;

b)	als „x +/– U“, wobei x das Analyseergebnis und U die erweiterte Messunsicherheit bezeichnen und ein Faktor von 2 verwendet wird, der zu einem Konfidenzniveau von ca. 95 % führt.

Liegt jedoch das Analyseergebnis deutlich (> 50 %) unter dem zu kontrollierenden Sollwert — und unter der Bedingung, dass die geeigneten Qualitätsverfahren angewandt werden und die Analyse lediglich dem Zweck der Überprüfung der Einhaltung der Rechtsvorschriften dient —, können die Analyseergebnisse ohne Berichtigung um die Wiederfindungsrate angegeben werden, und die Angabe der Wiederfindungsrate und der Messunsicherheit kann in diesen Fällen entfallen.

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(1)  ABl. L 86 vom 6.4.1979, S. 30.

ANHANG III

ANALYSEMETHODEN ZUR UNTERSUCHUNG DER ZUSAMMENSETZUNG VON FUTTERMITTEL-AUSGANGSERZEUGNISSEN UND MISCHFUTTERMITTELN

A.   BESTIMMUNG DES FEUCHTIGKEITSGEHALTS

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Diese Methode erlaubt die Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts von Futtermitteln. Bei Futtermitteln, die flüchtige Stoffe wie z. B. organische Säuren enthalten, ist zu beachten, dass zusammen mit dem Feuchtigkeitsgehalt auch bedeutende Mengen an flüchtigen Stoffen bestimmt werden.

Sie betrifft nicht die Untersuchung von Milcherzeugnissen als Futtermittel-Ausgangserzeugnisse, die Untersuchung von Mineralstoffen und Mischungen, die überwiegend aus Mineralstoffen bestehen, die Untersuchung von tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen oder die Untersuchung von Ölsaaten und Ölfrüchten.

2.   Prinzip

Die Probe wird unter definierten Bedingungen getrocknet, die von der Art des Futtermittels abhängen. Der Gewichtsverlust wird durch Wiegen bestimmt. Bei festen Futtermitteln mit einem hohen Feuchtigkeitsgehalt ist eine zusätzliche Vortrocknung erforderlich.

3.   Geräte

3.1.

Zerkleinerungsgerät aus einem Material, das keine Feuchtigkeit absorbiert, leicht zu reinigen ist, eine schnelle und gleichmäßige Zerkleinerung ermöglicht, ohne eine merkliche Erwärmung hervorzurufen, das so weit wie möglich den Kontakt mit der Außenluft verhindert und den unter 4.1.1 und 4.1.2 gestellten Anforderungen entspricht (z. B. Mikroschlagkreuzmühlen, Mikrozerkleinerer mit Wasserkühlung, zerlegbare Kegelmühlen, langsam laufende Kegelmühlen oder Zahnscheibenmühlen).

3.2.	Analysenwaage, Genauigkeit 1 mg.

3.3.	Trockene Gefäße aus korrosionsbeständigem Metall oder Glas, mit luftdicht schließenden Deckeln; die Nutzfläche muss eine Verteilung der Probe von ca. 0,3 g/cm2 ermöglichen.

3.4.	Elektrisch beheizter, temperaturgeregelter Trockenschrank (± 2 oC), der eine schnelle Regelung der Temperatur gewährleistet und eine gute Lüftung besitzt (1).

3.5.	Elektrisch beheizter regulierbarer Vakuumtrockenschrank mit einer Ölpumpe, der entweder mit einer Vorrichtung für die Zufuhr warmer und getrockneter Luft oder mit einem Trocknungsmittel (z. B. Calciumoxid) ausgestattet ist.

3.6.	Exsikkator mit dicker, perforierter Platte aus Metall oder Porzellan, der ein wirksames Trocknungsmittel enthält.

4.   Verfahren

Anmerkung

:

Die Verfahren, die in diesem Abschnitt beschrieben werden, müssen unverzüglich nach dem Öffnen der Packungen, die die Proben enthalten, durchgeführt werden. Die Analysen sind mindestens doppelt auszuführen.

4.1.   Vorbereitung

4.1.1.   Futtermittel, außer den unter 4.1.2 und 4.1.3 genannten

Mindestens 50 g der Probe werden entnommen und erforderlichenfalls unter Vermeidung von Feuchtigkeitsänderungen entsprechend zerkleinert oder geteilt (siehe 6).

4.1.2.   Getreide und Grütze

Mindestens 50 g der Probe werden entnommen. Diese Menge wird so gemahlen, dass zumindest 50 % der Teilchen durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,5 mm passiert werden können und dass beim Passieren durch ein Rundlochsieb mit einem Lochdurchmesser von 1 mm ein Rückstand von höchstens 10 % verbleibt.

4.1.3.   Flüssige oder breiige Futtermittel; Futtermittel, die überwiegend aus Ölen und Fetten bestehen

Etwa 25 g der Probe, auf 10 mg genau gewogen, werden entnommen, mit einer entsprechenden, auf 10 mg genau gewogenen Menge wasserfreiem Sand vermischt, bis ein homogenes Produkt entsteht.

4.2.   Trocknung

4.2.1.   Futtermittel, außer den unter 4.2.2 und 4.2.3 genannten

Ein Gefäß (3.3) wird mit seinem Deckel auf 1 mg genau gewogen. Etwa 5 g der Probe werden auf 1 mg genau in das tarierte Gefäß eingewogen und gleichmäßig verteilt. Das Gefäß wird ohne Deckel in den auf 103 oC vorgeheizten Trockenschrank gestellt. Damit die Temperatur des Trockenschranks nicht zu stark abfällt, ist das Gefäß möglichst rasch hineinzustellen. Es wird 4 h lang getrocknet, wobei die Trocknungszeit von dem Zeitpunkt an gerechnet wird, an dem die Temperatur im Trockenschrank erneut 103 oC erreicht hat. Nach Öffnen des Trockenschranks wird das Gefäß sofort mit dem Deckel verschlossen, aus dem Schrank genommen, 30 bis 45 min lang zum Abkühlen in den Exsikkator (3.6) gestellt und anschließend auf 1 mg genau gewogen.

Bei Futtermitteln, die überwiegend aus Ölen und Fetten bestehen, wird eine zusätzliche Trocknung von 30 min im Trockenschrank bei 130 oC vorgenommen. Der Unterschied zwischen den beiden Wägeergebnissen darf höchstens 0,1 % Feuchtigkeit betragen.

4.2.2.   Getreide, Mehl, Grütze und Grieß

Ein Gefäß (3.3) wird mit seinem Deckel auf 0,5 mg genau gewogen. Etwa 5 g der zerkleinerten Probe werden auf 1 mg genau in das tarierte Gefäß eingewogen und gleichmäßig verteilt. Das Gefäß wird ohne Deckel in den auf 130 oC vorgeheizten Trockenschrank gestellt. Damit die Temperatur des Trockenschranks nicht zu stark abfällt, ist das Gefäß möglichst rasch hineinzustellen. Es wird 2 h lang getrocknet, wobei die Trocknungszeit von dem Zeitpunkt an gerechnet wird, an dem die Temperatur im Trockenschrank erneut 130 oC erreicht hat. Nach Öffnen des Trockenschranks wird das Gefäß sofort mit dem Deckel verschlossen, aus dem Schrank genommen, 30 bis 45 min lang zum Abkühlen in den Exsikkator (3.6) gestellt und anschließend auf 1 mg genau gewogen.

4.2.3.

Mischfuttermittel mit einem Saccharose- oder Lactosegehalt von mehr als 4 %: Futtermittel-Ausgangserzeugnisse wie z. B. Johannisbrotschrot, hydrolysierte Getreideerzeugnisse, Malzkeime, Zuckerrübenschnitzel, Fisch- und Zuckerpresssäfte; Mischfuttermittel mit einem Gehalt an kristallwasserhaltigen Mineralstoffen von mehr als 25 %. Ein Gefäß (3.3) wird mit seinem Deckel auf 0,5 mg genau gewogen. Etwa 5 g der Probe werden auf 1 mg genau in das tarierte Gefäß eingewogen und gleichmäßig verteilt. Das Gefäß wird ohne Deckel in den auf 80 bis 85 oC vorgeheizten Vakuumtrockenschrank (3.5) gestellt. Damit die Temperatur des Vakuumtrockenschranks nicht zu stark abfällt, ist das Gefäß möglichst rasch hineinzustellen. Der Druck wird auf 100 Torr eingestellt. Die Probe wird 4 h lang bei diesem Druck entweder unter Zufuhr von heißer trockener Luft oder mittels eines Trocknungsmittels (etwa 300 g für 20 Proben) getrocknet. Im letzteren Fall wird beim Erreichen des vorgeschriebenen Drucks die Verbindung zur Vakuumpumpe unterbrochen. Die Trocknungszeit wird von dem Zeitpunkt an gerechnet, an dem die Temperatur im Trockenschrank erneut 80 bis 85 oC erreicht hat. Nach Ablauf der Trocknungszeit wird der Vakuumtrockenschrank vorsichtig wieder auf atmosphärischen Druck gebracht. Nach Öffnen des Vakuumtrockenschranks wird das Gefäß sofort mit dem Deckel verschlossen, aus dem Schrank genommen, zum Abkühlen 30 bis 45 min lang in den Exsikkator (3.6) gestellt und anschließend auf 1 mg genau gewogen. Es wird im Vakuumtrockenschrank weitere 30 min bei 80 bis 85 oC getrocknet und erneut gewogen. Der Unterschied zwischen den beiden Wägeergebnissen darf höchstens 0,1 % Feuchtigkeit betragen.

4.3.   Vortrocknung

4.3.1.   Futtermittel, außer den unter 4.3.2 genannten

Bei festen Futtermitteln mit einem hohen Feuchtigkeitsgehalt, deren Zerkleinerung schwierig ist, ist eine Vortrocknung wie folgt vorzunehmen:

Von der nicht zerkleinerten Probe (sofern erforderlich können gepresste oder klumpenhaltige Futtermittel grob zerkleinert werden) werden 50 g auf 10 mg genau in ein geeignetes Gefäß (z. B. eine Aluminiumschale von 20 × 12 cm mit einem Rand von 0,5 cm) eingewogen und in einem Trockenschrank bei einer Temperatur von 60 bis 70 oC getrocknet, bis der Feuchtigkeitsgehalt einen Wert zwischen 8 und 12 % erreicht hat. Anschließend wird das Gefäß aus dem Trockenschrank genommen, im Labor 1 h lang offen abkühlen gelassen und dann auf 10 mg genau gewogen. Im Folgenden wird die Probe unverzüglich, wie unter 4.1.1 angegeben, zerkleinert und je nach Art des Futtermittels entsprechend den Angaben unter 4.2.1 oder 4.2.3 getrocknet.

4.3.2.   Getreide

Körner, deren Feuchtigkeitsgehalt höher als 17 % ist, müssen wie folgt vorgetrocknet werden:

Von den nicht gemahlenen Körnern werden 50 g auf 10 mg genau in ein geeignetes Gefäß (z. B. in eine Aluminiumschale von 20 × 12 cm mit einem Rand von 0,5 cm) eingewogen und in einem Trockenschrank bei einer Temperatur von 130 oC 5 bis 7 min getrocknet. Anschließend wird das Gefäß aus dem Trockenschrank genommen, im Labor 2 h lang offen abkühlen gelassen und dann auf 10 mg genau gewogen. Im Folgenden wird die Probe unverzüglich, wie unter 4.1.2 angegeben, gemahlen und entsprechend den Angaben unter 4.2.2 getrocknet.

5.   Berechnung der Ergebnisse

Der Feuchtigkeitsgehalt (X) der Probe als Prozentsatz wird nach folgenden Formeln berechnet:

5.1.   Trocknung ohne Vortrocknung

wobei:

m	=	Anfangsgewicht der Probe in g,
m0	=	Gewicht der trockenen Probe in g.

5.2.   Trocknung mit Vortrocknung

wobei:

m	=	Anfangsgewicht der Probe in g,
m1	=	Gewicht der Probe nach der Vortrocknung in g,
m2	=	Gewicht der Probe nach der Zerkleinerung oder dem Zermahlen in g,
m0	=	Gewicht der trockenen Probe in g.

5.3.   Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 0,2 % Feuchtigkeit (absolut) nicht überschreiten.

6.   Bemerkung

Wenn eine Zerkleinerung sich als notwendig erweist und dabei mit einer Änderung des Feuchtigkeitsgehalts des Materials gerechnet werden muss, so sind die Analyseergebnisse, die die Bestandteile des Futtermittels betreffen, auf den Feuchtigkeitsgehalt der Originalprobe umzurechnen.

B.   BESTIMMUNG DES FEUCHTIGKEITSGEHALTS IN TIERISCHEN UND PFLANZLICHEN FETTEN UND ÖLEN

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Wasser und flüchtigen Stoffen in tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen.

2.   Prinzip

Die Probe wird bei 103 oC getrocknet, bis kein Gewichtsverlust mehr eintritt (der Gewichtsverlust zwischen 2 aufeinanderfolgenden Wägungen darf 1 mg nicht überschreiten). Der Gewichtsverlust wird durch Wiegen bestimmt.

3.   Geräte

3.1.	Schale mit flachem Boden, aus korrosionsbeständigem Material, Durchmesser: 8 bis 9 cm, Höhe ca. 3 cm.

3.2.	Thermometer mit verstärkter Kugel und Ausdehnungsraum am oberen Ende, von ca. 80 bis mindestens 110 oC graduiert, Länge ca. 10 cm.

3.3.	Sandbad oder elektrische Heizplatte.

3.4.	Exsikkator, der ein wirksames Trocknungsmittel enthält.

3.5.	Analysenwaage.

4.   Verfahren

Etwa 20 g der homogenisierten Probe werden auf 1 mg genau in die trockene, gewogene Schale (3.1.) eingewogen, die das Thermometer (3.2) enthält, und auf dem Sandbad oder der elektrischen Heizplatte (3.3) unter ständigem Rühren mit dem Thermometer so erhitzt, dass in ca. 7 min eine Temperatur von 90 oC erreicht wird.

Entsprechend der Häufigkeit, mit der Gasblasen vom Boden der Schale aufsteigen, wird die Heizintensität verringert. Die Temperatur darf 105 oC nicht überschreiten. Unter ständigem Abkratzen des Bodens der Schale wird weiter umgerührt, bis sich keine Blasen mehr bilden.

Um sicherzustellen, dass keine Feuchtigkeit mehr vorhanden ist, wird mehrmals auf 103 oC ± 2 oC erhitzt und zwischen aufeinanderfolgenden Erhitzungen jeweils auf 93 oC gekühlt. Anschließend wird bis zur Raumtemperatur im Exsikkator (3.4) abkühlen gelassen und gewogen. Dieses Verfahren ist so oft zu wiederholen, bis der Gewichtsverlust zwischen 2 aufeinanderfolgenden Wägungen 2 mg nicht mehr überschreitet.

Anmerkung

:

Eine Gewichtserhöhung der Probe nach wiederholter Erwärmung zeigt eine Oxidation des Fettes an. In diesem Fall wird der Berechnung das Ergebnis der Wägung zugrunde gelegt, die unmittelbar vor dem Auftreten der Gewichtszunahme ausgeführt wurde.

5.   Berechnung der Ergebnisse

Der Feuchtigkeitsgehalt (X) der Probe als Prozentsatz wird nach folgender Formel berechnet:

wobei:

m	=	Probeneinwaage in g,
m1	=	Gewicht der Schale mit Inhalt in g vor dem Erhitzen,
m2	=	Gewicht der Schale mit Inhalt in g nach dem Erhitzen.

Ergebnisse unter 0,05 % sollten mit der Bezeichnung „weniger als 0,05 %“ angegeben werden.

Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 0,05 % Feuchtigkeit (absolut) nicht überschreiten.

C.   BESTIMMUNG DES ROHPROTEINGEHALTS

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Berechnung des Rohproteingehalts von Futtermitteln anhand des nach Kjeldahl bestimmten Stickstoffgehalts.

2.   Prinzip

Die Probe wird durch Schwefelsäure in Anwesenheit eines Katalysators aufgeschlossen. Der saure Aufschluss wird durch eine Natriumhydroxidlösung alkalisiert. Das Ammoniak wird durch Destillation abgetrennt und in einer definierten Menge Schwefelsäure aufgefangen, deren Überschuss durch eine Standard-Natriumhydroxidlösung titriert wird.

Alternativ wird das freigesetzte Ammoniak in überschüssiger Borsäurelösung destilliert, gefolgt von einer Titration mit Salz- oder Schwefelsäurelösung.

3.   Reagenzien

3.1.	Kaliumsulfat.

3.2.	Katalysator: Kupfer(II)-oxid, CuO, oder Kupfer(II)-sulfatpentahydrat, CuSO4 5H2O.

3.3.	Zinkgranulat.

3.4.	Schwefelsäure, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5.	Schwefelsäure, volumetrische Standardlösung, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6.	Schwefelsäure, volumetrische Standardlösung, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7.	Schwefelsäure, volumetrische Standardlösung, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8.	Methylrot-Indikator; 300 mg Methylrot werden in 100 ml Ethanol (σ = 95 bis 96 %) gelöst.

3.9.	Natriumhydroxidlösung (Verwendung technischer Qualität möglich), β = 40 g/100 ml (40 %).

3.10.

Natriumhydroxid, volumetrische Standardlösung, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11.

Natriumhydroxid, volumetrische Standardlösung, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12.

Bimssteinkörner, mit Salzsäure gewaschen und geglüht.

3.13.

Acetanilid (Schmelzpunkt = 114 oC, N-Gehalt = 10,36 %).

3.14.

Saccharose (stickstofffrei).

3.15.

Borsäure (H3BO3).

3.16.

Methylrot-Indikatorlösung: 100 mg Methylrot werden in 100 ml Ethanol oder Methanol gelöst.

3.17.

Bromkresolgrünlösung: 100 mg Bromkresolgrün werden in 100 ml Ethanol oder Methanol gelöst.

3.18.

Borsäurelösung (10 bis 40 g/l in Abhängigkeit vom eingesetzten Gerät) Bei einer kolorimetrischen Endpunktbestimmung sind der Borsäurelösung Methylrot- und Bromkresolindikatoren zuzufügen. Wird 1 l Borsäurelösung zubereitet, sind vor dem Auffüllen zur Marke 7 ml Methylrot-Indikatorlösung (3.16) und 10 ml Bromkresolgrünlösung (3.17) zuzufügen. In Abhängigkeit von dem verwendeten Wasser kann sich der pH-Wert von einer Borsäurelösung zur anderen unterscheiden. Häufig ist eine Einstellung des pH-Werts mithilfe einer geringen Menge Alkali erforderlich, um eine positive Blindprobe zu erhalten. Anmerkung : Eine Zugabe von rund 3 ml NaOH (3.11) zu 1 l Borsäure von 10 g/l führt in der Regel zu guten Einstellungen. Die Lösung ist bei Raumtemperatur aufzubewahren und während der Aufbewahrung vor Lichteinfall und Ammoniakdämpfen zu schützen.

3.19.

Salzsäure, volumetrische Standardlösung, c(HCl) = 0,10 mol/l. Anmerkung : Andere Konzentrationen volumetrischer Lösungen (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 und 3.19) können verwendet werden, sofern die Berechnungen entsprechend berichtigt werden. Die Konzentrationen sind stets auf 4 Dezimalstellen genau anzugeben.

4.   Geräte

Für Aufschluss, Destillation und Titration nach dem Kjeldahl-Verfahren geeignete Geräte.

5.   Verfahren

5.1.   Aufschluss

Von der Probe wird 1 g auf 0,001 g genau gewogen und in den Kolben des Aufschlussgeräts gegeben. Anschließend werden 15 g Kaliumsulfat (3.1), eine geeignete Katalysatormenge (3.2) (0,3 bis 0,4 g Kupfer(II)-oxid oder 0,9 bis 1,2 g Kupfer(II)-sulfatpentahydrat), 25 ml Schwefelsäure (3.4) und ggf. einige Bimssteinkörnchen (3.12) zugesetzt und vermischt.

Der Kolben wird, wenn notwendig, unter regelmäßigem Schwenken zunächst mäßig erhitzt, bis die Substanz verkohlt ist und das Schäumen aufgehört hat. Dann wird die Flüssigkeit stärker erhitzt und gleichmäßig am Sieden gehalten. Bei korrekter Erhitzung kondensiert die siedende Säure auf der Kolbenwand. Ein Überhitzen der Kolbenwände und Ansetzen organischer Partikel ist zu vermeiden.

Sobald die Lösung klar ist und sich hellgrün färbt, wird sie noch weitere 2 h am Sieden gehalten und danach abkühlen gelassen.

5.2.   Destillation

Es wird vorsichtig so viel Wasser zugegeben, dass die Sulfate vollständig gelöst werden. Nach dem Abkühlen werden ggf. einige Körner Zinkgranulat (3.3) zugesetzt. Es wird entweder gemäß 5.2.1 oder 5.2.2 weiterverfahren.

5.2.1.   Destillation von Schwefelsäure

In den Auffangkolben des Destillationsapparats werden je nach dem zu erwartenden Stickstoffgehalt genau 25 ml Schwefelsäure (3.5 oder 3.7) gebracht und einige Tropfen Methylrot-Indikator (3.8) hinzugefügt.

Der Aufschlusskolben wird mit dem Kühler des Destillationsapparats verbunden und das Ende des Kühlers mindestens 1 cm tief in die Flüssigkeit des Auffangkolbens gesenkt (siehe Bemerkung 8.3). Dann werden 100 ml Natriumhydroxidlösung (3.9) langsam in den Aufschlusskolben eingefüllt, wobei kein Ammoniak entweichen darf (siehe Bemerkung 8.1). Der Kolben wird so lange erhitzt, bis alles Ammoniak überdestilliert ist.

5.2.2.   Destillation von Borsäure

Wird der Ammoniakgehalt des Destillats von Hand titriert, findet das im Folgenden beschriebene Verfahren Anwendung. Bei einem voll automatisierten Destilliergerät, das auch die Titration des Ammoniakgehalts des Destillats vornimmt, ist die Betriebsanleitung des Herstellers zu befolgen.

Ein Auffangkolben mit 25 bis 30 ml Borsäurelösung (3.18) wird so unter den Ablauf des Kühlers gestellt, dass sich das Ablaufrohr unter der Oberfläche der überschüssigen Borsäurelösung befindet. Das Destilliergerät wird so eingestellt, dass es 50 ml Natriumhydroxidlösung (3.9) abgibt. Die Bedienung des Destilliergeräts erfolgt entsprechend den Anleitungen des Herstellers. Anschließend wird das durch die Zugabe der Natriumhydroxidlösung freigesetzte Ammoniak abdestilliert. Das Destillat wird in der Borsäure (Auffangsäure) aufgefangen. Die Destillatmenge (Dauer der Dampfdestillation) hängt von der in der Probe enthaltenen Menge Stickstoff ab. Hierbei sind die Anleitungen des Herstellers zu befolgen.

Anmerkung

:

In einem halbautomatischen Destilliergerät erfolgen die Zugabe von überschüssigem Natriumhydroxid und die Dampfdestillation automatisch.

5.3.   Titration

Es wird entweder gemäß 5.3.1 oder 5.3.2 weiterverfahren.

5.3.1.   Schwefelsäure

Die überschüssige Schwefelsäure im Auffangkolben wird mit Natriumhydroxidlösung (3.10 oder 3.11) in Abhängigkeit von der Konzentration der verwendeten Schwefelsäure) titriert, bis der Endpunkt erreicht ist.

5.3.2.   Borsäure

Der Inhalt des Auffangkolbens wird mit der volumetrischen Standardlösung der Salzsäure (3.19) oder mit der volumetrischen Standardlösung der Schwefelsäure (3.6) unter Verwendung einer Bürette titriert und die Menge des eingesetzten Titrationsmittels abgelesen.

Bei der kolorimetrischen Endpunktbestimmung ist der Endpunkt erreicht, wenn sich der Inhalt erstmals pink verfärbt. Die Bürette ist auf 0,05 ml genau abzulesen. Eine beleuchtete Magnetrührplatte oder ein fotometrischer Detektor können bei der Visualisierung des Endpunkts hilfreich sein.

Dies kann automatisch erfolgen bei Verwendung eines Wasserdampfdestillators mit automatischer Titration.

Hinsichtlich des Betriebs des jeweiligen Destillators bzw. des Destillier-/Titriergeräts sind die Anleitungen des Herstellers zu befolgen.

Anmerkung

:

Bei Verwendung eines automatischen Titrationssystems beginnt die Titration unmittelbar mit dem Start der Destillation, und es wird die 1 %ige Borsäurelösung (3.18) eingesetzt. Wird ein vollautomatisches Destilliergerät eingesetzt, kann die automatische Titration des Ammoniaks auch mittels Endpunktbestimmung unter Verwendung eines potenziometrischen pH-Systems durchgeführt werden. In diesem Fall wird eine automatische Titriervorrichtung mit einem pH-Meter verwendet. Das pH-Meter ist nach dem üblichen Labor-pH-Kalibrierverfahren ordnungsgemäß im Bereich pH 4 bis ph 7 zu kalibrieren. Der pH-Endpunkt der Titration ist bei einem pH-Wert von 4,6 erreicht, dem steilsten Punkt der Titrationskurve (Wendepunkt).

5.4.   Blindversuch

Zur Bestätigung, dass die Reagenzien stickstofffrei sind, wird ein Blindversuch (Aufschluss, Destillation und Titration) mit 1 g Saccharose (3.14) anstelle der Probe durchgeführt.

6.   Berechnung der Ergebnisse

Die Berechnungen werden gemäß 6.1 oder 6.2 durchgeführt.

6.1.   Berechnung für die Titration nach 5.3.1

Der Rohproteingehalt, ausgedrückt als Massenanteil, wird nach folgender Formel berechnet:

wobei:

V0	=	Volumen NaOH (3.10 oder 3.11), das im Blindversuch eingesetzt wurde, in ml,
V1	=	Volumen NaOH (3.10 oder 3.11), das in der Titration der Probe eingesetzt wurde, in ml,
c	=	Konzentration des Natriumhydroxids (3.10 oder 3.11), in mol/l,
m	=	Probeneinwaage in g.

6.2.   Berechnung für die Titration nach 5.3.2

6.2.1.   Titration mit Salzsäure

Der Rohproteingehalt, ausgedrückt als Massenanteil, wird nach folgender Formel berechnet:

wobei:

m	=	Probeneinwaage in g,
c	=	Konzentration der volumetrischen Standardlösung von Salzsäure (3.19), in mol/l,
V0	=	Volumen der Salzsäure, die im Blindversuch eingesetzt wurde, in ml,
V1	=	Volumen der Salzsäure, die für die Probenmenge eingesetzt wurde, in ml.

6.2.2.   Titration mit Schwefelsäure

Der Rohproteingehalt, ausgedrückt als Massenanteil, wird nach folgender Formel berechnet:

wobei:

m	=	Probeneinwaage in g,
c	=	Konzentration der volumetrischen Standardlösung von Schwefelsäure (3.6), in mol/l,
V0	=	Volumen der Schwefelsäure (3.6), die im Blindversuch eingesetzt wurde, in ml,
V1	=	Volumen der Schwefelsäure (3.6), die für die Probenmenge eingesetzt wurde, in ml.

7.   Beurteilung des Verfahrens

7.1.   Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

—	0,2 % absolut bei Gehalten von weniger als 20 % Rohprotein,

—	1,0 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 20 bis 40 % Rohprotein,

—	0,4 % absolut bei Gehalten von mehr als 40 % Rohprotein.

7.2.   Genauigkeit

Die Analyse (Aufschluss, Destillation und Titration) wird mit 1,5 bis 2,0 g Acetanilid (3.13) in Gegenwart von 1 g Saccharose (3.14) durchgeführt; 1 g Acetanilid verbraucht 14,80 ml Schwefelsäure (3.5). Die Wiederfindung muss mindestens 99 % betragen.

8.   Bemerkungen

8.1.

Es können manuelle, halbautomatische oder automatische Geräte verwendet werden. Bei Geräten, die ein Umfüllen zwischen Aufschluss und Destillation erfordern, ist darauf zu achten, dass dies verlustlos geschieht. Verfügt der Destillationsapparat nicht über einen Tropftrichter, so erfolgt die Zugabe der Natriumhydroxidlösung unmittelbar vor dem Anschließen des Kolbens an den Kühler; die Flüssigkeit ist in diesem Fall langsam an den Kolbenwänden entlang laufen zu lassen.

8.2.	Kommt es während des Aufschlusses zur Verfestigung der Mischung, ist mit der Bestimmung von vorn zu beginnen und eine größere als die oben genannte Menge an Schwefelsäure (3.4) zu verwenden.

8.3.	Bei stickstoffarmen Proben kann die in den Auffangkolben einzufüllende Menge Schwefelsäure (3.7) gegebenenfalls auf 10 oder 15 ml verringert und mit Wasser auf 25 ml aufgefüllt werden.

8.4.

Für Routineanalysen können auch andere Methoden zur Bestimmung des Rohproteins herangezogen werden; die in diesem Teil C beschriebene Kjeldahl-Methode ist jedoch die Referenzmethode. Die Gleichwertigkeit der Ergebnisse der alternativen Methode (z. B. DUMAS) im Vergleich zur Referenzmethode muss für jede Matrix einzeln nachgewiesen werden. Da die Ergebnisse einer alternativen Methode auch nach Feststellung ihrer Gleichwertigkeit leicht von den Ergebnissen der Referenzmethode abweichen können, muss im Analysebericht angegeben werden, welche Analyse zur Bestimmung des Rohproteins verwendet wurde.

D.   BESTIMMUNG DES HARNSTOFFGEHALTS

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Harnstoffgehalts von Futtermitteln.

2.   Prinzip

Die Probe wird unter Zusatz eines Klärungsmittels in Wasser suspendiert. Die Suspension wird filtriert. Nach Zugabe von 4-Dimethylaminobenzaldehyd (4-DMAB) wird der Gehalt an Harnstoff im Filtrat durch Messung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 420 nm bestimmt.

3.   Reagenzien

3.1.	4-Dimethylaminobenzaldehydlösung: 1,6 g 4-DMAB werden in 100 ml 96 %igen Ethanols gelöst und 10 ml Salzsäure (ρ20 = 1,19 g/ml) hinzugefügt. Das Reagenz ist höchstens 2 Wochen haltbar.

3.2.	Carrez-Lösung I: 21,9 g Zinkazetat, Zn(CH3COO)2·2H2O und 3 g Eisessig werden in Wasser gelöst und auf 100 ml mit Wasser aufgefüllt.

3.3.	Carrez-Lösung II: 10,6 g Kaliumhexacyanoferrat (II), K4Fe(CN)6·3H2O, werden in Wasser gelöst und auf 100 ml mit Wasser aufgefüllt.

3.4.	Aktivkohle, keinen Harnstoff adsorbierend (zu prüfen).

3.5.	Harnstofflösung (Massenkonzentration = 0,1 %).

4.   Geräte

4.1.	Mechanisches Schüttelgerät, ca. 35 bis 40 min-1.

4.2.	Reagenzgläser: 160 × 16 mm, mit Schliffstopfen.

4.3.	Spektralfotometer.

5.   Verfahren

5.1.   Analysengang der Probe

Von der Probe werden 2 g auf 1 mg genau eingewogen und mit 1 g Aktivkohle (3.4) in einen 500-ml-Messkolben gebracht. Hierzu werden 400 ml Wasser und 5 ml Carrez-Lösung I (3.2) gegeben, ca. 30 s gemischt und dann 5 ml Carrez-Lösung II (3.3) zugesetzt. Das Ganze wird 30 min lang im Schüttelgerät rotiert. Dann wird mit Wasser zur Marke aufgefüllt, geschüttelt und filtriert.

Von den klaren und farblosen Filtraten werden je 5 ml in je ein Reagenzglas mit Schliffstopfen pipettiert, 5 ml 4-DMAB-Lösung (3.1) zugesetzt und gemischt. Die Gläser werden in einem Wasserbad bei 20 oC (+/– 4 oC) temperiert. Nach 15 min wird die Extinktion der Probenlösung im Vergleich mit der Blindprobenlösung der Reagenzien im Spektralfotometer bei 420 nm gemessen.

5.2.   Kalibrationskurve

Volumen von 1, 2, 4, 5 bzw. 10 ml Harnstofflösung (3.5) werden entnommen, in je 100-ml-Messkolben gebracht und mit Wasser zur Marke aufgefüllt. Von jeder Lösung werden 5 ml mit je 5 ml 4-DMAB-Lösung (3.1) gemischt. Die Extinktion wird, wie oben angegeben, im Vergleich mit einer Lösung, die 5 ml 4-DMAB und 5 ml harnstofffreies Wasser enthält, gemessen. Es wird eine Kalibrationskurve aufgestellt.

6.   Berechnung der Ergebnisse

Mithilfe der Kalibrationskurve ist die Menge an Harnstoff in der Versuchsprobe zu bestimmen.

Das Ergebnis ist als Prozentsatz der Probe auszudrücken.

7.   Bemerkungen

7.1.	Bei einem Harnstoffgehalt von mehr als 3 % ist die Einwaage auf 1 g zu reduzieren bzw. die Anfangslösung so weit zu verdünnen, dass in 500 ml höchstens 50 mg Harnstoff enthalten sind.

7.2.	Bei niedrigen Harnstoffgehalten wird die Einwaage erhöht, soweit das Filtrat klar und farblos bleibt.

7.3.	Enthält die Probe einfache Stickstoffverbindungen, insbesondere Aminosäuren, so ist die Extinktion bei 435 nm zu messen.

E.   BESTIMMUNG DES GEHALTS AN FLÜCHTIGEN STICKSTOFFHALTIGEN BASEN

I.   DURCH MIKRODIFFUSION

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an flüchtigen stickstoffhaltigen Basen, ausgedrückt als Ammoniak, in Futtermitteln.

2.   Prinzip

Die Probe wird mit Wasser extrahiert, die Lösung geklärt und filtriert. Die flüchtigen stickstoffhaltigen Basen werden nach Zusatz von Kaliumcarbonatlösung durch Mikrodiffusion abgetrennt, in einer Borsäurelösung aufgefangen und mit Schwefelsäure titriert.

3.   Reagenzien

3.1.	Trichloressigsäurelösung (Massenkonzentration = 20 %).

3.2.	Indikator: 33 mg Bromkresolgrün und 65 mg Methylrot werden in 100 ml Ethanol (Volumenkonzentration = 95 bis 96 %) gelöst.

3.3.

Borsäurelösung: 10 g Borsäure werden in einem 1-l-Messkolben in 200 ml Ethanol (Volumenkonzentration = 95 bis 96 %) und 700 ml Wasser gelöst. Vom Indikator (3.2) werden 10 ml hinzugefügt. Die Lösung wird gemischt und nötigenfalls unter Zusatz von Natriumhydroxidlösung auf eine hellrote Farbe gebracht. Von dieser Lösung kann 1 ml bis zu 300 μg NH3 binden.

3.4.	Gesättigte Kaliumkarbonatlösung: 100 g Kaliumcarbonat werden in 100 ml siedendem Wasser gelöst. Nach dem Abkühlen wird die Lösung filtriert.

3.5.	0,01 mol/l Schwefelsäure.

4.   Geräte

4.1.	Mechanisches Schüttelgerät, ca. 35 bis 40 min-1.

4.2.	Conwayschalen (vgl. Skizze) aus Glas oder Plastik.

4.3.	Mikrobüretten mit 0,01-ml-Einteilung.

5.   Verfahren

Von der Probe werden 10 g auf 1 mg genau gewogen, mit 100 ml Wasser in einen 200-ml-Messkolben gegeben und 30 min lang im Schüttelgerät gemischt oder verrührt. Dann werden 50 ml Trichloressigsäurelösung (3.1) hinzugefügt, mit Wasser zur Marke aufgefüllt, kräftig geschüttelt und durch einen Faltenfilter filtriert.

In die Mitte der Conwayschale wird 1 ml Borsäurelösung (3.3) und in den Ring der Schale 1 ml des Probenfiltrats pipettiert. Die Schale wird mit dem angefetteten Deckel teilweise bedeckt; dann wird schnell 1 ml der gesättigten Kaliumcarbonatlösung (3.4) in den Ring gegeben und die Schale luftdicht verschlossen. Um mit Sicherheit eine Mischung der beiden Reagenzien zu erreichen, wird die Schale vorsichtig in waagerechter Stellung gedreht. Darauf lässt man das Ganze mindestens 4 h lang bei Raumtemperatur oder 1 h lang bei 40 oC stehen.

Die in der Borsäurelösung enthaltenen flüchtigen Basen werden anschließend mit Schwefelsäure (3.5) unter Verwendung einer Mikrobürette (4.3) titriert.

Nach demselben Verfahren ist ein Blindversuch ohne die zu analysierende Probe durchzuführen.

6.   Berechnung der Ergebnisse

1 ml H2SO4 (0,01 mol/l) entspricht 0,34 mg Ammoniak.

Das Ergebnis ist als Prozentsatz der Probe auszudrücken.

Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

—	10 % relativ bei Ammoniakgehalten von weniger als 1,0 %,

—	0,1 % absolut bei Ammoniakgehalten von 1,0 % oder mehr.

7.   Bemerkung

Enthält die Probe mehr als 0,6 % Ammoniak, ist das ursprüngliche Filtrat zu verdünnen.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II.   DURCH DESTILLATION

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an flüchtigen stickstoffhaltigen Basen, ausgedrückt als Ammoniak, in Fischmehl, das praktisch keinen Harnstoff enthält. Sie ist nur anzuwenden bei Gehalten < 0,25 % Ammoniak.

2.   Prinzip

Die Probe wird mit Wasser extrahiert, die Lösung geklärt und filtriert. Die flüchtigen stickstoffhaltigen Basen werden nach Zusatz von Magnesiumoxid in der Siedehitze abgetrennt und in einer definierten Menge Schwefelsäure aufgefangen, deren Überschuss durch Natriumhydroxidlösung zurücktitriert wird.

3.   Reagenzien

3.1.	Trichloressigsäurelösung (Massenkonzentration = 20 %).

3.2.	Magnesiumoxid.

3.3.	Antischaumemulsion (z. B. Silikon).

3.4.	0,05 mol/l Schwefelsäure.

3.5.	0,1 mol/l Natriumhydroxidlösung.

3.6.	Methylrotlösung 0,3 %, in Ethanol (Volumenkonzentration = 95 bis 96 %).

4.   Geräte

4.1.	Mechanisches Schüttelgerät, ca. 35 bis 40 min-1.

4.2.	Destillationsapparatur nach Kjeldahl.

5.   Verfahren

Von der Probe werden 10 g auf 1 mg genau gewogen, mit 100 ml Wasser in einen 200-ml-Messkolben gegeben und 30 min lang im Schüttelgerät gemischt oder gerührt. Dann werden 50 ml Trichloressigsäurelösung (3.1) hinzugefügt, es wird mit Wasser zur Marke aufgefüllt, kräftig geschüttelt und durch einen Faltenfilter filtriert.

Je nach dem vermuteten Gehalt an flüchtigen stickstoffhaltigen Basen wird eine entsprechende Menge (im Allgemeinen 100 ml) des klaren Filtrats auf 200 ml verdünnt und 2 g Magnesiumoxid (3.2) sowie einige Tropfen Antischaumemulsion (3.3) hinzugefügt. Die Lösung muss gegen Lackmuspapier alkalisch reagieren; anderenfalls ist noch Magnesiumoxid (3.2) zuzusetzen. Es ist gemäß 5.2 und 5.3 der Analysenmethode zur Bestimmung des Rohproteingehalts (Teil C dieses Anhangs) weiterzuverfahren.

Nach demselben Verfahren ist ein Blindversuch ohne die zu analysierende Probe durchzuführen.

6.   Berechnung der Ergebnisse

1 ml H2SO4 (0,05 mol/l) entspricht 1,7 mg Ammoniak.

Das Ergebnis ist als Prozentsatz der Probe auszudrücken.

Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 10 % (relativ) Ammoniak nicht überschreiten.

F.   BESTIMMUNG DES GEHALTS AN AMINOSÄUREN (AUSSER TRYPTOPHAN)

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an freien (synthetischen und natürlichen) sowie der gesamten (peptidgebundenen und freien) Aminosäuren in Futtermitteln unter Verwendung eines Aminosäureanalysators. Die Methode ist für folgende Aminosäuren anwendbar: Cyst(e)in, Methionin, Lysin, Threonin, Alanin, Arginin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Tyrosin und Valin.

Die Methode unterscheidet nicht zwischen Salzen von Aminosäuren und dient auch nicht zur Unterscheidung der D- und L-Formen der Aminosäuren. Sie ist nicht zur Bestimmung des Gehalts an Tryptophan oder Hydroxyanaloga der Aminosäuren anwendbar.

2.   Prinzip

2.1.   Freie Aminosäuren

Die freien Aminosäuren werden mit verdünnter Salzsäure extrahiert. Mitextrahierte stickstoffhaltige Makromoleküle werden mit Sulfosalicylsäure ausgefällt und durch Filtrieren entfernt. Die filtrierte Lösung wird auf einen pH-Wert von 2,20 eingestellt. Die Aminosäuren werden durch Ionenaustauschchromatografie getrennt und nach Reaktion mit Ninhydrin durch fotometrischen Nachweis bei 570 nm bestimmt.

2.2.   Gesamtaminosäuren

Die gewählte Methode hängt von den zu untersuchenden Aminosäuren ab. Cyst(e)in und Methionin müssen vor der Hydrolyse zu Cysteinsäure bzw. Methioninsulfon oxidiert werden. Tyrosin muss im Hydrolysat der nicht oxidierten Probe bestimmt werden. Alle übrigen unter 1 genannten Aminosäuren können aus dem Hydrolysat der oxidierten oder der nicht oxidierten Probe bestimmt werden.

Die Oxidation wird bei 0 oC mit einer Perameisensäure-Phenol-Mischung durchgeführt. Überschüssiges Oxidationsreagenz wird mit Natriumdisulfit zerstört. Die oxidierte bzw. die nicht oxidierte Probe wird mit Salzsäure (3.20) 23 h lang hydrolysiert. Das Hydrolysat wird auf einen pH-Wert von 2,20 eingestellt. Die Aminosäuren werden durch Ionenaustauschchromatografie getrennt und nach Reaktion mit Ninhydrin fotometrisch bei 570 nm (bei Prolin 440 nm) bestimmt.

3.   Reagenzien

Es ist bidestilliertes Wasser oder Wasser gleichwertiger Qualität zu verwenden (Leitfähigkeit < 10 μS/cm).

3.1.	Wasserstoffperoxid, w (Massenanteil) = 30 %.

3.2.	Ameisensäure, w (Massenanteil) = 98 bis 100 %.

3.3.

Phenol.

3.4.	Natriumdisulfit.

3.5.	Natriumhydroxid.

3.6.	5-Sulfosalicylsäure-Dihydrat.

3.7.	Salzsäure, Dichte ca. 1,18 g/ml.

3.8.	Tri-Natriumcitrat-Dihydrat.

3.9.	2,2′-Thiodiethanol (Thiodiglycol).

3.10.

Natriumchlorid.

3.11.

Ninhydrin.

3.12.

Petrolether, Siedeintervall 40 bis 60 oC.

3.13.

Norleucin oder sonstige für die Verwendung als interner Standard geeignete Verbindung.

3.14.

Stickstoffgas (< 10 ppm Sauerstoff).

3.15.

1-Octanol.

3.16.

Aminosäuren.

3.16.1.

Standardstoffe gemäß Auflistung unter 1. Es dürfen nur reine Verbindungen ohne Kristallwasser verwendet werden. Sie sind vor der Verwendung im Vakuum über P2O5 oder H2SO4 1 Woche lang zu trocknen.

3.16.2.

Cysteinsäure.

3.16.3.

Methioninsulfon.

3.17.

Natriumhydroxidlösung, c = 7,5 mol/l: 300 g NaOH (3.5) in Wasser lösen und auf 1 l auffüllen.

3.18.

Natriumhydroxidlösung, c = 1 mol/l: 40 g NaOH (3.5) in Wasser lösen und auf 1 l auffüllen.

3.19.

Phenolhaltige Ameisensäurelösung: 889 g Ameisensäure (3.2) werden mit 111 g Wasser gemischt; anschließend werden 4,73 g Phenol (3.3) hinzugefügt.

3.20.

Hydrolysemischung, c = 6 mol HCl/l unter Zusatz von 1 g Phenol/l: Zu 492 ml HCl (3.7) wird 1 g Phenol (3.3) hinzugefügt und mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

3.21.

Extraktionslösung, c = 0,1 mol HCl/l, 2 % Thiodiglycol enthaltend: 8,2 ml HCl (3.7) werden in ca. 900 ml Wasser gegeben, 20 ml Thiodiglycol (3.9) hinzugefügt, und es wird mit Wasser auf 1 l aufgefüllt (3.7 und 3.9 dürfen nicht unmittelbar gemischt werden).

3.22.

5-Sulfosalicylsäurelösung, β = 6 %: 60 g 5-Sulfosalicylsäure (3.6) in Wasser lösen und mit Wasser auf 1 l auffüllen.

3.23.

Oxidationsmischung (Perameisensäure-Phenol): 0,5 ml Wasserstoffperoxid (3.1) werden mit 4,5 ml phenolhaltiger Ameisensäurelösung (3.19) in einem kleinen Becherglas gemischt. Es wird bei 20 bis 30 oC 1 h stehen gelassen, um die Bildung von Perameisensäure zu bewirken. Anschließend wird die Lösung 15 min in ein Eisbad gestellt, bevor sie der Probe zugegeben wird. Vorsicht: Hautkontakt vermeiden und Schutzkleidung tragen.

3.24.

Citratpufferlösung, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: 19,61 g Natriumcitrat (3.8), 5 ml Thiodiglycol (3.9), 1 g Phenol (3.3) und 16,50 ml HCl (3.7) werden in ca. 800 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert wird auf 2,20 eingestellt. Mit Wasser auf 1 l auffüllen.

3.25.

Elutionspuffer entsprechend den Anforderungen des verwendeten Gerätes (4.9).

3.26.

Ninhydrinreagenz entsprechend den Bedingungen des verwendeten Gerätes (4.9).

3.27.

Aminosäuren-Standardlösungen: Diese Lösungen sind bei < 5 oC aufzubewahren.

3.27.1.

Aminosäuren-Standard-Stammlösung (3.16.1): c = 2,5 μmol/ml je Aminosäure in Salzsäure Diese Lösung ist im Handel erhältlich.

3.27.2.

Standard-Stammlösung von Cysteinsäure und Methioninsulfon, c = 1,25 μmol/ml: 0,2115 g Cysteinsäure (3.16.2) und 0,2265 g Methioninsulfon (3.16.3) werden in Citratpufferlösung (3.24) in einem 1 000-ml-Messkolben gelöst, und es wird mit Citratpufferlösung zur Marke aufgefüllt. Die Lösung ist bei < 5 oC höchstens 12 Monate haltbar. Sie wird nicht benötigt, falls die Standard-Stammlösung (3.27.1) bereits Cysteinsäure und Methioninsulfon enthält.

3.27.3.

Stammlösung des internen Standards, z. B. Norleucin, c = 20 μmol/ml: 0,6560 g Norleucin (3.13) werden in Citratpufferlösung (3.24) in einem Messkolben gelöst, und es wird mit Citratpufferlösung auf 250 ml aufgefüllt. Diese Lösung ist bei < 5 oC höchstens 6 Monate haltbar.

3.27.4.

Aminosäurenkalibrierlösung zur Verwendung bei Hydrolysaten, c = 5 nmol/50 μl Cysteinsäure und Methioninsulfon und c = 10 nmol/50 μl der übrigen Aminosäuren: 2,2 g Natriumchlorid (3.10) werden in einem 100-ml-Becherglas in 30 ml Citratpufferlösung (3.24) gelöst. Es werden 4,00 ml Standard-Stammlösung der Aminosäuren (3.27.1), 4,00 ml Standard-Stammlösung von Cysteinsäure und Methinoninsulfon (3.27.2), und, falls verwendet, 0,50 ml Stammlösung des internen Standards (3.27.3) hinzugefügt. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid (3.18) auf 2,20 eingestellt. Die Lösung wird quantitativ in einen 50-ml-Messkolben überführt, und es wird mit Citratpufferlösung (3.24) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Die Lösung ist bei < 5 oC höchstens 3 Monate haltbar. Siehe auch Bemerkungen unter 9.1.

3.27.5.

Aminosäurenkalibrierlösung zur Verwendung bei Hydrolysaten gemäß 5.3.3.1 und bei Extrakten gemäß 5.2. Die Kalibrierlösung wird gemäß 3.27.4 hergestellt, jedoch ohne Zugabe von Natriumchlorid. Die Lösung ist bei < 5 oC höchstens 3 Monate haltbar.

4.   Geräte

4.1.	100- oder 250-ml-Rundkolben mit Rückflusskühler.

4.2.	100-ml-Borosilikat-Glasflaschen mit Schraubverschluss mit Gummidichtung/teflonbeschichteter Dichtung (z. B. Duran, Schott).

4.3.	Trockenschrank mit forcierter Umluft, auf ± 2 oC regelbar.

4.4.	pH-Meter (auf drei Dezimalstellen genau).

4.5.	Membranfilter, 0,22 μm Porengröße.

4.6.	Zentrifuge.

4.7.	Vakuum-Rotationsverdampfer.

4.8.	Mechanischer Schüttler oder Magnetrührer.

4.9.

Aminosäureanalysator oder HPLC-Einrichtung mit Ionenaustauschersäule, Einrichtung für Ninhydrin-Nachsäulenderivatisierung und Fotometer. Die Säule wird mit sulfoniertem Polystyrolharz gefüllt, das die Trennung der einzelnen Aminosäuren und deren Abtrennung von sonstigen Ninhydrin-positiven Substanzen ermöglicht. Die Pumpen für die Ninhydrin- und für die Pufferlösungen müssen über den Zeitraum des Kalibrationslaufes und des Probenlaufes eine Flussstabilität von ±0,5 % gewährleisten. Bei einigen Aminosäureanalysatoren können auch Hydrolyseverfahren angewandt werden, wenn die Hydrolysate Natriumionenkonzentrationen von c = 0,8 mol/l aufweisen und die restliche Ameisensäure des Oxidationsschrittes enthalten. Andere Analysatoren bieten keine befriedigende Abtrennung bestimmter Aminosäuren, falls das Hydrolysat überschüssige Ameisensäure und/oder hohe Natriumionenkonzentrationen aufweist. In diesem Fall wird das Säurevolumen nach der Hydrolyse und vor der pH-Wert-Einstellung durch Einengen auf ca. 5 ml reduziert. Das Einengen ist unter Vakuum bei höchstens 40 oC vorzunehmen.

5.   Verfahren

5.1.   Vorbereitung der Probe

Die Probe wird so fein vermahlen, dass sie ein Sieb mit 0,5 mm Maschenweite passieren kann. Proben mit hohem Feuchtigkeitsgehalt müssen vor dem Vermahlen entweder bei einer Temperatur von höchstens 50 oC luftgetrocknet oder aber gefriergetrocknet werden. Proben mit hohem Fettgehalt sind vor dem Vermahlen mit Petrolether (3.12) zu extrahieren.

5.2.   Bestimmung des Gehalts an freien Aminosäuren in Futtermitteln und Vormischungen

Eine geeignete Menge (1 bis 5 g) der vorbereiteten Probe (5.1) auf 0,2 mg genau in einen Erlenmeyerkolben einwiegen und 100,0 ml Extraktionslösung (3.21) hinzufügen. Mit einem mechanischen Schüttler 60 min schütteln bzw. mit einem Magnetrührer (4.8) rühren. Nach dem Absetzen lassen werden mit einer Pipette 10,0 ml der überstehenden Lösung in ein 100-ml-Becherglas gegeben.

Es werden 5,0 ml Sulfosalicylsäurelösung (3.22) unter Rühren hinzugefügt, und mithilfe des Magnetrührers wird 5 min weitergerührt. Die überstehende Lösung wird filtriert oder zentrifugiert, um alle Ausfällungen zu entfernen. Von der klaren Lösung werden 10,0 ml in ein 100-ml-Becherglas gegeben, und unter Verwendung von Natriumhydroxidlösung (3.18) wird der pH-Wert auf 2,20 eingestellt. Die Lösung wird mit Citratpufferlösung (3.24) in einen Messkolben geeigneter Größe überführt und mit Citratpufferlösung (3.24) zur Marke aufgefüllt.

Bei Verwendung eines internen Standards werden vor dem Auffüllen 1,00 ml der Stammlösung des internen Standards (3.27.3) für jeweils 100 ml Endlösung hinzugefügt und mit Citratpufferlösung (3.24) zur Marke aufgefüllt.

Anschließend wird die Chromatografie gemäß 5.4 durchgeführt.

Werden die Extrakte nicht am selben Tag chromatografiert, sind sie bei < 5 oC aufzubewahren.

5.3.   Bestimmung des Gehalts an Gesamtaminosäuren

5.3.1.   Oxidation

0,1 bis 1 g der vorbereiteten Probe (5.1) werden auf 0,2 mg genau eingewogen

—	in einen 100-ml-Rundkolben (4.1) für die offene Hydrolyse (5.3.2.3) oder

—	in einen 250-ml-Rundkolben (4.1), falls eine niedrige Natriumionenkonzentration (5.3.3.1) erforderlich ist, oder

—	in eine 100-ml-Flasche mit Schraubverschluss (4.2) für die geschlossene Hydrolyse (5.3.2.4).

Die Einwaage muss einen Stickstoffgehalt von etwa 10 mg und einen Feuchtigkeitsgehalt von höchstens 100 mg haben.

Der Kolben/die Flasche wird in ein Eisbad gestellt und auf 0 oC abgekühlt. Dann werden 5 ml der Oxidationsmischung (3.23) hinzugefügt, und es wird mithilfe eines Glasspatels mit gebogener Spitze gemischt. Der Behälter, der den Spatel enthält, wird mit einer luftdichten Folie verschlossen, das Eiswasserbad mit dem verschlossenen Behälter in einen Kühlschrank mit einer Temperatur von 0 oC gestellt und 16 h stehen gelassen. Nach 16 h wird der Behälter aus dem Kühlschrank genommen und das überschüssige Oxidationsreagenz durch Zusatz von 0,84 g Natriumdisulfit (3.4) zersetzt.

Es wird gemäß 5.3.2.1 weiterverfahren.

5.3.2.   Hydrolyse

5.3.2.1.    Hydrolyse der oxidierten Proben

Zu der oxidierten Probe (die gemäß 5.3.1 vorbereitet wurde) werden 25 ml Hydrolysemischung (3.20) gegeben. Dabei ist darauf zu achten, dass alle Probenrückstände, die an den Seitenwänden des Gefäßes sowie am Spatel haften, abgewaschen werden.

Je nach dem verwendeten Hydrolyseverfahren wird gemäß 5.3.2.3 oder 5.3.2.4 weiterverfahren.

5.3.2.2.    Hydrolyse der nicht oxidierten Proben

In einen 100-ml- oder 250-ml-Rundkolben (4.1) bzw. in eine 100-ml-Flasche mit Schraubverschluss (4.2) werden 0,1 bis 1 g der vorbereiteten Probe (5.1) auf 0,2 mg genau eingewogen. Die Einwaage muss einen Stickstoffgehalt von ca. 10 mg aufweisen. Vorsichtig 25 ml Hydrolysemischung (3.20) hinzufügen und mit der Probe vermischen. Es wird entweder gemäß 5.3.2.3 oder gemäß 5.3.2.4 weiterverfahren.

5.3.2.3.    Offene Hydrolyse (Rückflusshydrolyse)

Zu der nach 5.3.2.1 oder 5.3.2.2 hergestellten Mischung werden 3 Glasperlen hinzugegeben. Sie wird zum Sieden erhitzt und unter Rückfluss genau 23 h am Sieden gehalten. Nach Beendigung der Hydrolyse wird der Rückflusskühler mit 5 ml Citratpufferlösung (3.24) gespült und der abgehängte Kolben im Eisbad gekühlt.

Es wird gemäß 5.3.3 weiterverfahren.

5.3.2.4.    Geschlossene Hydrolyse

Die Flasche mit der nach 5.3.2.1 oder 5.3.2.2 vorbereiteten Mischung wird bei 110 oC in den Trockenschrank (4.3) gestellt. Um einen durch Gasentwicklung hervorgerufenen Druckaufbau zu vermeiden und eine Explosion zu verhindern, wird der Schraubverschluss während der ersten Stunde nur lose auf die Flasche gelegt. Die Flasche darf nicht verschlossen werden. Nach 1 h wird die Flasche mit dem Deckel fest verschlossen und 23 h im Trockenschrank (4.3) belassen. Nach Beendigung der Hydrolyse wird die Flasche aus dem Trockenschrank genommen, der Verschluss vorsichtig geöffnet, die Flasche in ein Eisbad gestellt und abkühlen gelassen.

Je nach dem Verfahren für die pH-Wert-Einstellung (5.3.3) wird der Inhalt der Flasche quantitativ mit Citratpufferlösung (3.24) in ein 250-ml-Becherglas oder in einen 250-ml-Rundkolben überführt.

Es wird gemäß 5.3.3 weiterverfahren.

5.3.3.   pH-Wert-Einstellung

Je nach der Natriumionentoleranz des Aminosäureanalysators (4.9) wird die pH-Wert-Einstellung gemäß 5.3.3.1 oder 5.3.3.2 vorgenommen.

5.3.3.1.    Für Aminosäureanalysatoren oder HPLC-Einrichtungen (4.9), die eine niedrige Natriumionenkonzentration erfordern

Werden Aminosäureanalysatoren verwendet, bei denen eine geringe Natriumionenkonzentration erforderlich ist (wenn also das Säurevolumen reduziert werden muss), wird die Verwendung einer Stammlösung eines internen Standards (3.27.3) empfohlen.

In diesem Fall sind dem Hydrolysat vor dem Verdampfen 2,00 ml der internen Standardlösung (3.27.3) hinzuzufügen.

Zu dem nach 5.3.2.3 oder 5.3.2.4 erhaltenen Hydrolysat werden 2 Tropfen 1-Octanol (3.15) gegeben.

Das Volumen wird am Rotationsverdampfer (4.7) unter Vakuum bei 40 oC auf 5 bis 10 ml reduziert. Wurde das Volumen beim Einengen versehentlich auf weniger als 5 ml reduziert, wird das Hydrolysat verworfen und die Analyse wiederholt.

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxidlösung (3.18) auf 2,20 eingestellt, und es wird gemäß 5.3.4 weiterverfahren.

5.3.3.2.    Für alle sonstigen Aminosäureanalysatoren (4.9)

Die nach 5.3.2.3 oder 5.3.2.4 erhaltenen Hydrolysate werden durch vorsichtige Zugabe unter Rühren von 17 ml Natriumhydroxidlösung (3.17) teilweise neutralisiert, wobei eine Temperatur von unter 40 oC eingehalten werden muss.

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxidlösung (3.17 und anschließend 3.18) bei Raumtemperatur auf 2,20 eingestellt, und es wird gemäß 5.3.4 weiterverfahren.

5.3.4.   Probenlösung für die Chromatografie

Das auf pH 2,20 eingestellte Hydrolysat (5.3.3.1 oder 5.3.3.2) wird mit Citratpufferlösung (3.24) quantitativ in einen 200-ml-Messkolben überführt und mit Citratpufferlösung (3.24) zur Marke aufgefüllt.

Falls bisher noch kein interner Standard hinzugefügt worden ist, werden vor dem Auffüllen 2,00 ml des internen Standards (3.27.3) hinzugegeben und dann mit Citratpufferlösung (3.24) zur Marke aufgefüllt. Es wird sorgfältig gemischt.

Anschließend wird die Chromatografie gemäß 5.4 durchgeführt.

Falls die Probenlösungen nicht am selben Tag chromatografiert werden, sind sie bei < 5 oC aufzubewahren.

5.4.   Chromatografie

Falls erforderlich, wird der Extrakt (5.2) oder das Hydrolysat (5.3.4) vor der Chromatografie auf Raumtemperatur gebracht. Die Mischung wird geschüttelt und eine geeignete Menge durch einen 0,22-μm-Membranfilter (4.5) filtriert. Die so erhaltene klare Lösung wird der Ionenaustauschchromatografie unter Verwendung eines Aminosäureanalysators bzw. einer HPLC-Einrichtung (4.9) unterzogen.

Die Einspritzung kann von Hand oder automatisch erfolgen. Wesentlich ist, dass jeweils die gleiche Menge ±0,5 % der Standardlösung und der Probenlösung eingespritzt wird, es sei denn, es wird ein interner Standard verwendet. Das Verhältnis der Konzentrationen von Natriumionen und Aminosäuren sollte in der Standard- und der Probenlösung so ähnlich wie möglich sein.

Die Häufigkeit von Kalibrationsläufen hängt von der Stabilität des Ninhydrinreagenzes und des Analysatorsystems ab. Die Standardlösung oder die Probenlösung wird mit Citratpufferlösung (3.24) so verdünnt, dass die Peakfläche des Standards etwa 30 bis 200 % der Peakfläche der einzelnen Aminosäuren in der Probenlösung ausmacht.

Die Chromatografie der Aminosäuren unterscheidet sich leicht je nach Art des verwendeten Analysators und des eingesetzten Harzes. Das System muss in der Lage sein, die Aminosäuren vollständig voneinander und von den sonstigen Ninhydrin-positiven Substanzen zu trennen. Im Betriebsbereich muss das chromatografische System bei Änderungen der Aminosäuremengen, die der Säule hinzugefügt wird, eine lineare Reaktion aufweisen.

Wird eine equimolare Lösung der zu bestimmenden Aminosäuren analysiert, sollten bei der Chromatografie die unten angegebenen Verhältnisse von Tal zu Peakhöhe zwischen den überlappenden Peaks erreicht werden. Diese equimolare Lösung muss mindestens 30 % der maximalen Menge jeder Aminosäure enthalten, die mit dem jeweiligen Aminosäureanalysator (4.9) noch präzise bestimmt werden kann.

Für die Trennung von Threonin-Serin darf das Verhältnis von Tal zur Peakhöhe des niedrigeren der 2 sich überlappenden Peaks auf dem Chromatogramm nicht mehr als 2:10 betragen (wenn nur Cyst(e)in, Methionin, Threonin und Lysin bestimmt werden, beeinträchtigt eine unzureichende Trennung von angrenzenden Peaks die Bestimmung). Für alle übrigen Aminosäuren sollte die Trennung besser als 1:10 sein.

Das System muss gewährleisten, dass Lysin von „Lysinartefakten“ und Omithin abgetrennt wird.

6.   Berechnung der Ergebnisse

Die Flächen der Proben- und der Kalibrationsstandardpeaks werden für jede einzelne Aminosäure bestimmt und der Gehalt (X) in g Aminosäure je kg Probe berechnet:

Bei Verwendung eines internen Standards ist zu multiplizieren mit

A	=	Peakfläche, Hydrolysat oder Extrakt
B	=	Peakfläche, Kalibrierstandardlösung
C	=	Peakfläche, interner Standard im Hydrolysat oder Extrakt
D	=	Peakfläche, interner Standard, Kalibrierstandardlösung
M	=	Molmasse der zu bestimmenden Aminosäure
c	=	Konzentration des Standards in μmol/ml
m	=	Probeneinwaage (auf Originalgewicht berichtigt, falls getrocknet oder entfettet), in g
V	=	Gesamtvolumen des Hydrolysats (5.3.4) in ml oder errechnetes Gesamtverdünnungsvolumen des Extrakts (6.1) in ml

Sowohl Cystin als auch Cystein werden im Hydrolysat der oxidierten Probe als Cysteinsäure bestimmt, jedoch als Cystin (C6H12N2O4S2, M = 240,30 g/mol) unter Verwendung der Molmasse von 120,15 g/mol (0,5 × 240,30 g/mol) berechnet.

Methionin wird als Methioninsulfon in Hydrolysaten der oxidierten Probe bestimmt, aber unter Verwendung des M von Methionin (149,21 g/mol) als Methionin berechnet.

Zugesetztes freies Methionin wird nach Extraktion als Methionin bestimmt, wobei für die Berechnung das gleiche M verwendet wird.

6.1.	Das Gesamtverdünnungsvolumen der Extrakte (F) für die Bestimmung des Gehalts an freien Aminosäuren (5.2) wird wie folgt berechnet: V = Volumen des Endextrakts.

7.   Beurteilung des Verfahrens

Das Verfahren ist in einem auf internationaler Ebene im Jahr 1990 durchgeführten Vergleichstest an 4 verschiedenen Futtermitteln (Mischfuttermittel für Schweine, Mischfuttermittel für Mastküken, Eiweißkonzentrat und einer Vormischung) erprobt worden. Die nach der Eliminierung von Ausreißern erhaltenen Ergebnisse (Mittelwerte und Standardabweichungen) sind in den Tabellen unter diesem Punkt dargestellt.

Mittelwerte in g/kg

Referenzmaterial	Aminosäure
	Threonin	Cyst(e)in	Methionin	Lysin
Schweinemischfutter	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Mastkükenmischfutter	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Eiweißkonzentrat	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Vormischung	58,42 n = 16	—	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n = Anzahl der beteiligten Laboratorien.

7.1.   Wiederholbarkeit

Für die untersuchten Aminosäuren wurde die Wiederholbarkeit ermittelt. Sie ist, ausgedrückt als Standardabweichung der Wiederholbarkeit, für den oben genannten Vergleichstest in der folgenden Tabelle dargestellt.

Standardabweichung der Wiederholbarkeit (sr) in g/kg

Referenzmaterial	Aminosäure
	Threonin	Cyst(e)in	Methionin	Lysin
Schweinemischfutter	0,13 n = 15	0,10 n = 17	0,11 n = 17	0,26 n = 13
Mastkükenmischfutter	0,20 n = 16	0,11 n = 18	0,16 n = 18	0,28 n = 16
Eiweißkonzentrat	0,48 n = 16	0,13 n = 17	0,27 n = 17	0,99 n = 15
Vormischung	1,30 n = 16	—	2,19 n = 16	2,06 n = 16
n = Anzahl der beteiligten Laboratorien.

Variationskoeffizient (%) für die Standardabweichung der Wiederholbarkeit (sr)

Referenzmaterial	Aminosäure
	Threonin	Cyst(e)in	Methionin	Lysin
Schweinemischfutter	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Mastkükenmischfutter	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Eiweißkonzentrat	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Vormischung	2,2 n = 16	—	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n = Anzahl der beteiligten Laboratorien.

7.2.   Vergleichbarkeit

Die Ergebnisse hinsichtlich der Standardabweichung der Vergleichbarkeit, die sich aus den oben genannten Untersuchungen ergeben, sind in nachstehender Tabelle dargestellt.

Standardabweichung der Vergleichbarkeit (sR) in g/kg

Referenzmaterial	Aminosäure
	Threonin	Cyst(e)in	Methionin	Lysin
Schweinemischfutter	0,28 n = 15	0,30 n = 17	0,23 n = 17	0,30 n = 13
Mastkükenmischfutter	0,48 n = 16	0,34 n = 18	0,55 n = 18	0,75 n = 16
Eiweißkonzentrat	0,85 n = 16	0,62 n = 17	1,57 n = 17	1,24 n = 15
Vormischung	2,49 n = 16	—	6,20 n = 16	6,62 n = 16
n = Anzahl der beteiligten Laboratorien.

Variationskoeffizient (%) für die Standardabweichung der Vergleichbarkeit (sR)

Referenzmaterial	Aminosäure
	Threonin	Cyst(e)in	Methionin	Lysin
Schweinemischfutter	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Mastkükenmischfutter	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Eiweißkonzentrat	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Vormischung	4,3 n = 16	—	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n = Anzahl der beteiligten Laboratorien.

8.   Verwendung von Referenzmaterialien

Die korrekte Anwendung der Methode ist durch Mehrfachbestimmungen an zertifizierten Referenzmaterialien (soweit verfügbar) zu überprüfen. Für die Kalibration wird die Verwendung einer zertifizierten Aminosäurestandardlösung empfohlen.

9.   Bemerkungen

9.1.

Wegen der Unterschiede zwischen den Aminosäureanalysatoren sind die Endkonzentrationen der Aminosäurenkalibrierlösungen (3.27.4 und 3.27.5) und der Hydrolysate (5.3.4) als Richtwerte anzusehen. Der lineare Reaktionsbereich des Geräts muss für alle Aminosäuren geprüft werden. Die Standardlösung wird mit Citratpufferlösung verdünnt, um Peakflächen in der Mitte des Bereichs zu erhalten.

9.2.	Falls Geräte für die Hochleistungsflüssigkeitschromatografie zur Analyse der Hydrolysate eingesetzt werden, sind die Versuchsbedingungen gemäß den Empfehlungen des Herstellers zu optimieren.

9.3.	Wird diese Methode für Futtermittel angewandt, die mehr als 1 % Chlorid enthalten (Kraftfuttermittel, Mineralfuttermittel, Ergänzungsfuttermittel), so könnte der Methioningehalt unterschätzt werden, und es ist eine modifizierte Oxidation erforderlich.

G.   BESTIMMUNG DES TRYPTOPHANGEHALTS

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gesamtgehalts an Tryptophan und des Gehalts an freiem Tryptophan in Futtermitteln. Sie dient nicht zur Unterscheidung zwischen D- und L-Formen.

2.   Prinzip

Zur Bestimmung des Gesamtgehalts an Tryptophan wird die Probe unter alkalischen Bedingungen mit gesättigter Bariumhydroxid-Lösung hydrolysiert, auf 110 oC erhitzt und 20 h auf dieser Temperatur gehalten. Nach der Hydrolyse wird ein interner Standard zugegeben.

Zur Bestimmung des Gehalts an freiem Tryptophan wird die Probe unter leicht sauren Bedingungen in Gegenwart eines internen Standards extrahiert.

Tryptophan und der interne Standard im Hydrolysat bzw. im Extrakt werden durch HPLC mit Fluoreszenzdetektor bestimmt.

3.   Reagenzien

3.1.	Es ist bidestilliertes Wasser oder Wasser gleichwertiger Qualität zu verwenden (Leitfähigkeit < 10 μS/cm).

3.2.	Standardsubstanz: Tryptophan (Reinheit/Gehalt ≥ 99 %), im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.

3.3.	Interner Standard: α-Methyl-Tryptophan (Reinheit/Gehalt ≥ 99 %), im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.

3.4.	Bariumhydroxid-Octahydrat (das Ba(OH)2·8H2O darf nicht übermäßig der Luft ausgesetzt werden, um die Bildung von BaCO3 zu vermeiden, das die Bestimmung beeinträchtigen könnte) (siehe Bemerkung 9.3).

3.5.	Natriumhydroxid.

3.6.	Orthophosphorsäure, w (Massenanteil) = 85 %.

3.7.	Salzsäure, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8.	Methanol, HPLC-Qualität.

3.9.	Petrolether, Siedeintervall 40 bis 60 oC.

3.10.

Natriumhydroxidlösung, c = 1 mol/l: 40,0 g NaOH (3.5) in Wasser lösen und mit Wasser (3.1) auf 1 l auffüllen.

3.11.

Salzsäure, c = 6 mol/l: 492 ml HCl (3.7) mit Wasser auf 1 l auffüllen.

3.12.

Salzsäure, c = 1 mol/l: 82 ml HCl (3.7) mit Wasser auf 1 l auffüllen.

3.13.

Salzsäure, c = 0,1 mol/l: 8,2 ml HCl (3.7) mit Wasser auf 1 l auffüllen.

3.14.

Orthophosphorsäure, c = 0,5 mol/l: 34 ml Orthophosphorsäure (3.6) mit Wasser (3.1) auf 1 l auffüllen.

3.15.

Konzentrierte Tryptophanlösung (3.2), c = 2,50 μmol/ml: 0,2553 g Tryptophan (3.2) in einem 500-ml-Messkolben in Salzsäure (3.13) lösen und mit Salzsäure (3.13) zur Marke auffüllen. Bei — 18 oC höchstens 4 Wochen aufbewahren.

3.16.

Konzentrierte interne Standardlösung, c = 2,50 μmol/ml: 0,2728 g α-Methyl-Tryptophan (3.3) in einem 500-ml-Messkolben in Salzsäure (3.13) lösen und mit Salzsäure (3.13) zur Marke auffüllen. Bei — 18 oC höchstens 4 Wochen aufbewahren.

3.17.

Kalibrierstandardlösung von Tryptophan und internem Standard: 2,00 ml konzentrierte Tryptophanlösung (3.15) und 2,00 ml konzentrierte interne Standardlösung (α-Methyl-Tryptophan) (3.16) mit Wasser (3.1) und Methanol (3.8) auf etwa dasselbe Volumen und etwa dieselbe Methanolkonzentration (10 bis 30 %) wie das fertige Hydrolysat verdünnen. Diese Lösung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden. Während der Zubereitung vor direktem Sonnenlicht schützen.

3.18.

Essigsäure.

3.19.

1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol.

3.20.

Ethanolamin, w (Massenanteil) > 98 %.

3.21.

Lösung von 1 g 1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol (3.19) in 100 ml Methanol (3.8).

3.22.

Mobile Phase für die HPLC: 3,00 g Essigsäure (3.18) + 900 ml Wasser (3.1) +50,0 ml Lösung (3.21) von 1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol (3.19) in Methanol (3.8) (1g/100ml). Der pH-Wert wird mit Ethanolamin (3.20) auf 5,00 eingestellt. Mit Wasser (3.1) auf 1 l auffüllen.

4.   Geräte

4.1.	HPLC-Einrichtung mit Fluoreszenzdetektor.

4.2.	HPLC-Trennsäule, 125 × 4 mm, C18, 3 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule.

4.3.

pH-Meter.

4.4.	Polypropylen-Kolben, 125 ml, Weithals mit Schraubverschluss.

4.5.	Membranfilter, 0,45 μm Porengröße.

4.6.	Autoklav, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar.

4.7.	Mechanischer Schüttler oder Magnetrührer.

4.8.	Vortex-Schüttelgerät.

5.   Verfahren

5.1.   Vorbereitung der Proben

Die Probe wird so fein vermahlen, dass sie ein Sieb mit 0,5 mm Maschenweite passieren kann. Proben mit hohem Feuchtigkeitsgehalt müssen vor dem Vermahlen entweder bei einer Temperatur von höchstens 50 oC luftgetrocknet oder aber gefriergetrocknet werden. Proben mit hohem Fettgehalt sind vor dem Vermahlen mit Petrolether (3.9) zu extrahieren.

5.2.   Bestimmung des Gehalts an freiem Tryptophan (Extrakt)

Eine geeignete Menge (1 bis 5 g) der vorbereiteten Probe (5.1) auf 1 mg genau in einen Erlenmeyerkolben einwiegen. 100,0 ml Salzsäure (3.13) und 5,00 ml konzentrierte interne Standardlösung (3.16) zugeben. Mit einem mechanischen Schüttler oder einem Magnetrührer (4.7) 60 min schütteln bzw. mischen. Absetzen lassen und 10,0 ml der überstehenden Lösung in ein Becherglas pipettieren. 5 ml Orthophosphorsäure (3.14) zugeben. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxidlösung (3.10) auf 3 eingestellt. Ausreichend Methanol (3.8) für eine Methanolkonzentration von 10 bis 30 % im Endvolumen zugeben. In einen Messkolben mit ausreichendem Volumen überführen und mit Wasser auf das für die Chromatografie notwendige Volumen verdünnen (entspricht etwa dem Volumen der Kalibrierstandardlösung (3.17)).

Einige ml der Lösung werden vor der Einspritzung in die HPLC-Säule durch einen 0,45-μm-Membranfilter (4.5) filtriert. Die Chromatografie gemäß 5.4 durchführen.

Standardlösung und Extrakte sind vor direktem Sonnenlicht zu schützen. Falls es nicht möglich ist, die Extrakte am selben Tag zu analysieren, können sie bei 5 oC maximal 3 Tage aufbewahrt werden.

5.3.   Bestimmung des Gehalts an Gesamttryptophan (Hydrolysat)

0,1 bis 1 g der vorbereiteten Probe (5.1) werden auf 0,2 mg genau in den Polypropylenkolben (4.4) eingewogen. Die Einwaage muss einen Stickstoffgehalt von ca. 10 mg aufweisen. 8,4 g Bariumhydroxid-Octahydrat (3.4) und 10 ml Wasser zugeben. Mithilfe eines Vortex-Schüttelgeräts (4.8) oder Magnetrührgeräts (4.7) mischen. Den teflonbeschichteten Magneten in der Mischung lassen. Die Gefäßwände mit 4 ml Wasser abspülen. Schraubkappe aufsetzen und Kolben locker verschließen. In einem Autoklaven (4.6) 30 bis 60 min mit kochendem Wasser erhitzen. Den Autoklaven schließen und 20 h bei 110 (+/– 2) oC autoklavieren.

Vor dem Öffnen des Autoklaven ist die Temperatur auf knapp unter 100 oC zu senken. Um Kristallisation des Ba(OH)2·8HO2 zu vermeiden, sind der warmen Mischung 30 ml Wasser mit Zimmertemperatur zuzugeben. Leicht schütteln oder rühren. 2,00 ml konzentrierte interne Standardlösung (α-Methyl-Tryptophan) (3.16) zugeben. Die Gefäße im Wasser-/Eisbad 15 min kühlen.

Anschließend 5 ml Orthophosphorsäure (3.14) zugeben. Das Gefäß im Kühlbad belassen und unter Rühren mit HCl (3.11) neutralisieren; der pH-Wert wird mit HCl (3.12) auf 3,0 eingestellt. Ausreichend Methanol für eine Methanolkonzentration von 10 bis 30 % im Endvolumen zugeben. In einen Messkolben mit ausreichendem Volumen überführen und mit Wasser auf das für die Chromatografie notwendige Volumen verdünnen (z. B. 100 ml). Die Zugabe von Methanol darf keine Präzipitation verursachen.

Einige ml der Lösung werden vor der Einspritzung in die HPLC-Säule durch einen 0,45-μm-Membranfilter (4.5) filtriert. Die Chromatografie gemäß 5.4 durchführen.

Standardlösung und Extrakte sind vor direktem Sonnenlicht zu schützen. Falls es nicht möglich ist, die Hydrolysate am selben Tag zu analysieren, können sie bei 5 oC höchstens 3 Tage aufbewahrt werden.

5.4.   HPLC-Bestimmung

Die folgenden Angaben für eine isokratische Trennung sind Richtwerte; andere Parameter können verwendet werden, sofern sie zu vergleichbaren Ergebnissen führen (siehe auch Bemerkungen 9.1 und 9.2):

HPLC-Trennsäule (4.2):	125 × 4 mm, C18, 3 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule
Säulentemperatur:	Raumtemperatur
Mobile Phase (3.22):	3,00 g Essigsäure (3.18) + 900 ml Wasser (3.1) +50,0 ml Lösung (3.21) von 1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol (3.19) in Methanol (3.8) (1 g/100 ml). Den pH-Wert mit Ethanolamin (3.20) auf 5,0 einstellen. Mit Wasser (3.1) auf 1 l auffüllen.
Durchflussrate:	1 ml/min
Gesamtlaufzeit:	ca. 34 min
Detektionswellenlänge:	Anregung: 280 nm, Emission: 356 nm
Einspritzvolumen:	20 μl

6.   Berechnung der Ergebnisse

Die Menge von Tryptophan (X) in g je 100 g Probe wird wie folgt berechnet:

A	=	Peakfläche des internen Standards; Kalibrierstandardlösung (3.17)
B	=	Peakfläche von Tryptophan, Extrakt (5.2) oder Hydrolysat (5.3)
V1	=	Volumen der konzentrierten Tryptophanlösung (3.15), das der Kalibrierlösung (3.17) zugegeben wurde, in ml (2 ml)
c	=	Konzentration der konzentrierten Tryptophanlösung (3.15), die der Kalibrierlösung (3.17) zugegeben wurde, in μmol/ml (= 2,50)
V2	=	Volumen der konzentrierten internen Standardlösung (3.16), das bei der Extraktion (5.2) (= 5,00 ml) oder dem Hydrolysat (5.3) (= 2,00 ml) zugegeben wurde, in ml
C	=	Peakfläche des internen Standards, Extrakt (5.2) oder Hydrolysat (5.3)
D	=	Peakfläche von Tryptophan, Kalibrierstandardlösung (3.17)
V3	=	Volumen der konzentrierten internen Standardlösung (3.16), das der Kalibrierstandardlösung (3.17) zugegeben wurde, in ml (2,00 ml)
m	=	Probeneinwaage (korrigiert auf Originalgewicht, falls getrocknet und/oder entfettet), in g
M	=	Molmasse von Tryptophan (= 204,23 g/mol)

7.   Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 10 % des höheren Werts nicht überschreiten.

8.   Ergebnisse eines Ringversuchs

Es wurde ein EG-Ringversuch (4. Vergleichstest) durchgeführt, bei dem 3 Proben von bis zu 12 Laboratorien analysiert wurden, um die Hydrolysemethode zu zertifizieren. Jede Probe wurde mehrfach (5-mal) analysiert. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle zusammengefasst:

	Probe 1 Schweinefutter	Probe 2 Schweinefutter mit Zusatz von L-Tryptophan	Probe 3 Kraftfutter für Schweine
L	12	12	12
n	50	55	50
Mittelwert [g/kg]	2,42	3,40	4,22
sr [g/kg]	0,05	0,05	0,08
r [g/kg]	0,14	0,14	0,22
VKr [ %]	1,9	1,6	1,9
sR [g/kg]	0,15	0,20	0,09
R [g/kg]	0,42	0,56	0,25
VKR [ %]	6,3	6,0	2,2

L	=	Zahl der Laboratorien, die Ergebnisse übermittelt haben
n	=	Zahl der Einzelergebnisse ohne Ausreißer (Ausreißertest von Cochran, Dixon)
sr	=	Standardabweichung der Wiederholbarkeit
sR	=	Standardabweichung der Vergleichbarkeit
r	=	Wiederholbarkeit
R	=	Vergleichbarkeit
VKr	=	Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit, in %
VKR	=	Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit, in %

Es wurde ein weiterer EG-Ringversuch (3. Vergleichstest) durchgeführt, bei dem 2 Proben von bis zu 13 Laboratorien analysiert wurden, um die Methode zur Extraktion von freiem Tryptophan zu zertifizieren. Jede Probe wurde mehrfach (5-mal) analysiert. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle zusammengefasst:

	Probe 4 Mischung aus Weizen und Soja	Probe 5 Mischung aus Weizen und Soja (= Probe 4) mit Tryptophan-Zusatz (0,457 g/kg)
L	12	12
n	55	60
Mittelwert [g/kg]	0,391	0,931
sr [g/kg]	0,005	0,012
r [g/kg]	0,014	0,034
VKr [ %]	1,34	1,34
sR [g/kg]	0,018	0,048
R [g/kg]	0,050	0,134
VKR [ %]	4,71	5,11

L	=	Zahl der Laboratorien, die Ergebnisse übermittelt haben
n	=	Zahl der Einzelergebnisse ohne Ausreißer (Ausreißertest von Cochran, Dixon)
sr	=	Standardabweichung der Wiederholbarkeit
sR	=	Standardabweichung der Vergleichbarkeit
r	=	Wiederholbarkeit
R	=	Vergleichbarkeit
VKr	=	Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit
VKR	=	Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit

Es wurde ein weiterer EG-Vergleichstest durchgeführt, bei dem 4 Proben von bis zu 7 Laboratorien analysiert wurden, um die Tryptophan-Hydrolyse zu zertifizieren. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle zusammengefasst. Jede Probe wurde mehrfach (5-mal) analysiert.

	Probe 1 Schweine mischfuttermittel (CRM 117)	Probe 2 Fischmehl mit geringem Fettgehalt (CRM 118)	Probe 3 Sojamehl (CRM 119)	Probe 4 Magermilch pulver (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Mittelwert [g/kg]	2,064	8,801	6,882	5,236
sr [g/kg]	0,021	0,101	0,089	0,040
r [g/kg]	0,059	0,283	0,249	0,112
VKr [ %]	1,04	1,15	1,30	0,76
sR [g/kg]	0,031	0,413	0,283	0,221
R [g/kg]	0,087	1,156	0,792	0,619
VKR [ %]	1,48	4,69	4,11	4,22

L	=	Zahl der Laboratorien, die Ergebnisse übermittelt haben
n	=	Zahl der Einzelergebnisse ohne Ausreißer (Ausreißertest von Cochran, Dixon)
sr	=	Standardabweichung der Wiederholbarkeit
sR	=	Standardabweichung der Vergleichbarkeit
r	=	Wiederholbarkeit
R	=	Vergleichbarkeit
VKr	=	Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit
VKR	=	Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit

9.   Bemerkungen

9.1.

Mit den folgenden besonderen Chromatografiebedingungen kann eine bessere Trennung von Tryptophan und α-Methyl-Tryptophan erreicht werden. Isokratische Trennung, gefolgt von der Reinigung der Gradientensäule: HPLC-Trennsäule: 125 × 4 mm, C18, 5 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule Säulentemperatur: 32 oC Mobile Phase: A: 0,01 mol/l KH2PO4/Methanol, 95 + 5 (V+V). B: Methanol Gradientenprogramm: 0 min 100 % A 0 % B   15 min 100 % A 0 % B   17 min 60 % A 40 % B   19 min 60 % A 40 % B   21 min 100 % A 0 % B   33 min 100 % A 0 % B Durchflussrate: 1,2 ml/min Gesamtlaufzeit: ca. 33 min

9.2.

Die Durchführung der Chromatografie variiert je nach Art der HPLC und der verwendeten Säulenpackung. Das System muss so gewählt werden, dass eine Grundlinientrennung zwischen Tryptophan und dem internen Standard möglich ist. Die Abbauprodukte müssen deutlich von Tryptophan und dem internen Standard getrennt werden. Zur Untersuchung der Grundlinie unter dem internen Standard auf Verunreinigungen sind Hydrolysate ohne internen Standard zu analysieren. Die Laufzeit muss lang genug sein, dass alle Abbauprodukte eluiert werden, andernfalls können späte Elutionspeaks anschließende Chromatografiedurchgänge beeinträchtigen. Im Betriebsbereich muss das Chromatografiesystem eine lineare Reaktion ergeben. Die lineare Reaktion ist bei einer konstanten (der normalen) Konzentration des internen Standards und unterschiedlichen Tryptophankonzentrationen zu messen. Die Größe des Tryptophan- und des internen Standardpeaks müssen sich innerhalb des linearen Bereichs des HPLC-/Fluoreszenzsystems befinden. Sollten der Tryptophan- und/oder der interne Standardpeak/die internen Standardpeaks zu klein oder zu hoch sein, ist die Analyse mit einer anderen Probengröße und/oder einem anderen Endvolumen zu wiederholen.

9.3.	Bariumhydroxid Älteres Bariumhydroxid ist schwerer löslich. Dies kann zur Folge haben, dass die Lösung für die HPLC-Bestimmung nicht klar ist und zu niedrigen Tryptophan-Werten führen kann.

H.   BESTIMMUNG DES GEHALTS AN ROHÖLEN UND -FETTEN

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Rohöl- und Rohfettgehalts von Futtermitteln. Sie erstreckt sich nicht auf die Analyse von Ölsaaten und Ölfrüchten.

Je nach Art und Zusammensetzung des Futtermittels sowie in Abhängigkeit vom Zweck der Untersuchung ist eines der beiden nachstehend beschriebenen Verfahren anzuwenden.

1.1.   Verfahren A — Direkt extrahierbare Rohöle und Rohfette

Das Verfahren ist anzuwenden bei Futtermittel-Ausgangserzeugnissen pflanzlicher Herkunft mit Ausnahme derjenigen, die in den Anwendungsbereich von Verfahren B fallen.

1.2.   Verfahren B — Gesamtgehalt an Rohölen und Rohfetten

Das Verfahren ist anzuwenden bei Futtermittel-Ausgangserzeugnissen tierischen Ursprungs und bei allen Mischfuttermitteln. Es ist außerdem bei allen Erzeugnissen anzuwenden, aus denen Öle und Fette ohne vorherige Hydrolyse nicht vollständig extrahiert werden können (z. B. Kleber, Hefen, Kartoffeleiweiß und Erzeugnisse, die Verfahren unterzogen wurden wie Extrudieren, Flockieren und Erhitzen).

1.3.   Auswertung der Ergebnisse

In allen Fällen, in denen mit Verfahren B ein höheres Ergebnis erzielt wird als mit Verfahren A, gilt das mit Verfahren B erhaltene Ergebnis als der richtige Wert.

2.   Prinzip

2.1.   Verfahren A

Die Probe wird mit Petrolether extrahiert. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand getrocknet und gewogen.

2.2.   Verfahren B

Die Probe wird unter Erhitzen mit Salzsäure behandelt. Die Mischung wird abgekühlt und filtriert. Der gewaschene und getrocknete Rückstand wird nach Verfahren A weiterbehandelt.

3.   Reagenzien

3.1.	Petrolether, Siedeintervall 40 bis 60 oC. Die Bromzahl muss weniger als 1 und der Abdampfrückstand weniger als 2 mg/100 ml betragen.

3.2.	Natriumsulfat, wasserfrei.

3.3.	Salzsäure, c = 3 mol/l.

3.4.	Filterhilfsmittel, z. B. Kieselgur, Hyflo-Supercel.

4.   Geräte

4.1.	Extraktionsapparat: Sofern das Gerät mit einem Siphon (Soxhletapparat) ausgestattet ist, muss die Rückflussmenge so bemessen sein, dass das Lösungsmittel mindestens 10-mal in der Stunde abläuft. Wenn es sich um ein Gerät ohne Siphon handelt, muss die Rückflussmenge etwa 10 ml/min betragen.

4.2.	Extraktionshülsen: Diese müssen frei sein von petroletherlöslichen Stoffen und eine Porosität besitzen, die den Anforderungen nach 4.1 Genüge leistet.

4.3.	Trockenschrank: Vakuumtrockenschrank, eingestellt auf 75 oC (± 3 oC,) oder Lufttrockenschrank, eingestellt auf 100 oC (± 3 oC).

5.   Verfahren

5.1.   Verfahren A (siehe Bemerkung 8.1)

Von der Probe werden 5 g auf 1 mg genau abgewogen, dann in eine Extraktionshülse (4.2) überführt und mit einem fettfreien Wattebausch abgedeckt.

Die Hülse wird in einen Extraktionsapparat (4.1) eingesetzt und 6 h lang mit Petrolether (3.1) extrahiert. Der Petroletherextrakt wird in einem trockenen, mit einigen Körnern Bimsstein (2) versehenen, tarierten Kolben aufgefangen.

Nach beendeter Extraktion wird das Lösungsmittel abdestilliert. Anschließend wird der Rückstand mit Kolben 1,5 h im Trockenschrank (4.3) getrocknet und nach dem Abkühlen in einem Exsikkator gewogen. Durch eine zweite Trocknung von 30 min Dauer ist zu prüfen, ob das Gewicht der Öle und Fette konstant geblieben ist (der Gewichtsverlust zwischen 2 aufeinanderfolgenden Wägungen darf 1 mg nicht überschreiten).

5.2.   Verfahren B

Von der Probe (siehe Bemerkung 8.2) werden 2,5 g auf 1 mg genau abgewogen und in ein 400-ml-Becherglas oder einen 300-ml-Erlenmeyerkolben gebracht. Anschließend werden 100 ml Salzsäure (3.3) und einige Körner Bimsstein hinzugefügt. Das Becherglas wird mit einem Uhrglas abgedeckt, bzw. dem Erlenmeyerkolben wird ein Rückflusskühler aufgesetzt. Das Gemisch wird auf kleiner Flamme oder auf einer Heizplatte bis zum Siedepunkt erhitzt und 1 h schwach sieden gelassen. Es ist zu verhindern, dass das Material sich an den Wänden des Gefäßes festsetzt.

Dann wird abgekühlt und so viel vom Filterhilfsmittel (3.4) zugesetzt, dass beim Filtrieren kein Öl- bzw. Fettverlust eintritt. Filtriert wird unter Verwendung eines feuchten, fettfreien doppelten Filterpapiers. Der Rückstand wird bis zur neutralen Reaktion mit kaltem Wasser gewaschen. Danach ist zu überprüfen, dass das Filtrat keine Öle und Fette mehr enthält. Bei Vorhandensein von Ölen oder Fetten muss vor der Hydrolyse eine Extraktion der Probe mit Petrolether nach Verfahren A vorgenommen werden.

Das doppelte Filterpapier mit dem Rückstand ist auf ein Uhrglas zu legen und ca. 1,5 h bei 100 oC (± 3 oC) im Lufttrockenschrank (4.3) zu trocknen.

Das doppelte Filterpapier mit dem trockenen Rückstand wird in eine Extraktionshülse (4.2) überführt und mit einem fettfreien Wattebausch abgedeckt. Die Hülse wird in einen Extraktionsapparat (4.1) eingesetzt. Dann wird, wie unter 5.1 Absätze 2 und 3 beschrieben, weiterverfahren.

6.   Berechnung der Ergebnisse

Das Gewicht des Rückstands wird als Prozentsatz der Probe ausgedrückt.

7.   Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen eines Analytikers darf bei ein und derselben Probe die folgenden Werte nicht überschreiten:

—	0,2 % absolut bei Gehalten an Rohölen und -fetten von unter 5 %,

—	4,0 % relativ zum höchsten Wert bei Gehalten von 5 bis 10 %,

—	0,4 % absolut bei Gehalten über 10 %.

8.   Bemerkungen

8.1.

Bei Erzeugnissen mit hohem Öl- und Fettgehalt, die schwer zu zerkleinern sind oder sich zur Entnahme einer reduzierten homogenen Probe nicht eignen, ist folgendermaßen zu verfahren: Von der Probe werden 20 g auf 1 mg genau abgewogen und mit 10 g oder mehr wasserfreiem Natriumsulfat (3.2) gemischt. Dann wird mit Petrolether (3.1), wie unter 5.1 beschrieben, extrahiert. Der dabei aufgefangene Extrakt wird mit Petrolether (3.1) auf 500 ml aufgefüllt und gemischt. Von der Lösung werden 50 ml entnommen und in einen kleinen, trockenen, mit Bimssteinkörnchen versehenen und tarierten Kolben gebracht. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und dann wird, wie unter 5.1 letzter Absatz beschrieben, getrocknet und weiterverfahren. Der Extraktionsrückstand in der Hülse wird vom Lösungsmittel befreit, auf 1 mm zerkleinert und wieder zurück in die Extraktionshülse gebracht (ohne Zugabe von Natriumsulfat). Dann wird, wie unter 5.1 Absätze 2 und 3 beschrieben, fortgefahren. Der Gehalt an Ölen und Fetten, ausgedrückt als Prozentsatz der Probe, wird nach folgender Formel berechnet: (10 m1 + m2) × 5 wobei: m1 = Gewicht des Rückstands in g nach der ersten Extraktion (aliquoter Teil des Extrakts), m2 = Gewicht des Rückstands in g nach der zweiten Extraktion.

8.2.	Bei öl- und fettarmen Erzeugnissen kann mit einer Einwaage von 5 g gearbeitet werden.

8.3.	Heimtierfutter mit hohem Wassergehalt muss vor der Hydrolyse und Extraktion nach Verfahren B möglicherweise mit wasserfreiem Natriumsulfat gemischt werden.

8.4.	Bei dem Verfahren nach 5.2 kann die Verwendung von heißem statt kaltem Wasser zum Waschen des Rückstands nach der Filtration möglicherweise wirksamer sein.

8.5.	Die Trocknungszeit von 1,5 h muss bei einigen Futtermitteln möglicherweise verlängert werden. Übermäßiges Trocknen ist zu vermeiden, da dies zu niedrigen Ergebnissen führen kann. Es kann auch ein Mikrowellengerät verwendet werden.

8.6.	Bei einem Rohöl/-fettgehalt von mehr als 15 % wird vor der Hydrolyse eine Extraktion nach Verfahren A und danach eine erneute Extraktion nach Verfahren B empfohlen. Dies hängt zum Teil von der Art des Futtermittels und der Art des Rohfetts im Futtermittel ab.

I.   BESTIMMUNG DES ROHFASERGEHALTS

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an säure- und alkaliunlöslichen, fettfreien organischen Bestandteilen in Futtermitteln, herkömmlicherweise als Rohfaser bezeichnet.

2.   Prinzip

Die gegebenenfalls entfettete Probe wird nacheinander mit kochender Schwefelsäurelösung und kochender Kaliumhydroxidlösung definierter Konzentrationen behandelt. Der Rückstand wird durch Filtration auf einem gesinterten Glasfilter getrennt, gewaschen, getrocknet, gewogen und bei 475 bis 500 oC verascht. Der Gewichtsverlust bei dieser Veraschung entspricht der Rohfaser der Einwaage.

3.   Reagenzien

3.1.	Schwefelsäure, c = 0,13 mol/l.

3.2.	Antischaummittel (z. B. n-Oktanol).

3.3.	Filterhilfsmittel (Celite 545 oder gleichwertiges Mittel), 4 h auf 500 oC erhitzt (8.6).

3.4.

Aceton.

3.5.	Petrolether, Siedeintervall 40 bis 60 oC.

3.6.	Salzsäure, c = 0,5 mol/l.

3.7.	Kaliumhydroxidlösung, c = 0,23 mol/l.

4.   Geräte

4.1.

Heizvorrichtung für den Aufschluss mit Schwefelsäure und Kaliumhydroxidlösung, ausgestattet mit einer Halterung für den Glasfiltertiegel (4.2) und einem Abflussrohr mit Hahn zum Flüssigkeitsablauf, für den Vakuumanschluss und, sofern möglich, auch mit einem Anschluss für die Zufuhr von Druckluft. Vor der täglichen Inbetriebnahme muss die gesamte Apparatur mit Wasser 5 min erhitzt werden.

4.2.	Glasfiltertiegel mit eingeschmolzenem gesintertem Glasfilter (Porengröße 40 bis 90 μm). Vor dem erstmaligen Gebrauch wird der Tiegel einige Minuten bei 500 oC geglüht und dann abkühlen gelassen (8.6).

4.3.	Siedezylinder (mindestens 270 ml) mit einem Rückflusskühler.

4.4.	Trockenschrank mit Thermostat.

4.5.	Muffelofen mit Thermostat.

4.6.	Extraktionsvorrichtung mit einer Halterung für den Glasfiltertiegel (4.2) und einem Abflussrohr mit Hahn für den Flüssigkeitsablauf und den Vakuumanschluss.

4.7.	Verbindungsringe zur Verbindung von Heizvorrichtung (4.1), Filtertiegel (4.2) und Siedezylinder (4.3), Verbindungsringe zur Verbindung von Kaltextraktionsvorrichtung (4.6) und Filtertiegel.

5.   Verfahren

Von der vorbereiteten Probe werden 1 g auf 1 mg genau in den Glasfiltertiegel (4.2) eingewogen (siehe Bemerkungen 8.1, 8.2 und 8.3), und es wird 1 g Filterhilfsmittel (3.3) hinzugefügt.

Der Glasfiltertiegel (4.2) wird in die Heizvorrichtung (4.1) eingesetzt und mit dem Siedezylinder (4.3) verbunden. 150 ml auf Siedetemperatur erhitzte Schwefelsäure (3.1) werden in den mit dem Tiegel verbundenen Siedezylinder überführt, und es werden erforderlichenfalls einige Tropfen Antischaummittel (3.2) hinzugefügt.

Die Flüssigkeit wird innerhalb von 5 ± 2 min zum Sieden erhitzt und genau 30 min im kräftigen Sieden gehalten.

Der Hahn im Abflussrohr (4.1) wird geöffnet und die Schwefelsäure mithilfe von Vakuum durch den Glasfiltertiegel abgesaugt. Der Filterrückstand wird 3-mal mit je 30 ml kochendem Wasser gewaschen. Nach jedem Waschvorgang ist der Rückstand trocken zu saugen.

Der Auslaufhahn wird geschlossen, und es werden 150 ml siedende Kaliumhydroxidlösung (3.7) und einige Tropfen Antischaummittel (3.2) in den mit dem Siedezylinder verbundenen Glasfiltertiegel gegeben. Die Flüssigkeit wird innerhalb von 5 ± 2 min zum Sieden erhitzt und genau 30 min im kräftigen Sieden gehalten. Die Filtration und das Waschen des Rückstands werden in der gleichen Weise durchgeführt wie nach der Behandlung mit Schwefelsäure.

Nach dem letzten Waschen wird der Rückstand trocken gesaugt und der Tiegel mit Inhalt vom Siedezylinder gelöst und an die Kaltextraktionsvorrichtung (4.6) angeschlossen. Unter Anlegen von Vakuum wird der Rückstand 3-mal mit je 25 ml Aceton (3.4) gewaschen, wobei der Rückstand nach jedem Waschvorgang trocken zu saugen ist.

Der Filtertiegel mit Inhalt wird im Trockenschrank bei 130 oC bis zur Massekonstanz getrocknet, in einem Exsikkator abgekühlt und anschließend rasch gewogen. Danach wird der Filtertiegel mit Inhalt in einen Muffelofen gebracht und mindestens 30 min bei einer Temperatur von 475 bis 500 oC bis zur Massekonstanz verascht (der Gewichtsverlust in 2 aufeinanderfolgenden Wägungen darf 2 mg nicht überschreiten).

Nach dem Erhitzen wird der Tiegel zunächst im Muffelofen und dann im Exsikkator abgekühlt und anschließend gewogen.

Es wird ein Blindversuch ohne Probe durchgeführt. Der beim Veraschen auftretende Gewichtsverlust darf 4 mg nicht überschreiten.

6.   Berechnung der Ergebnisse

Der Gehalt an Rohfaser als Prozentsatz der Probe wird nach folgender Formel berechnet:

wobei:

m	=	Einwaage in g,
m0	=	Gewichtsverlust nach dem Veraschen während der Bestimmung, in g,
m1	=	Gewichtsverlust nach dem Veraschen während des Blindversuchs, in g.

7.   Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

—	0,6 % absolut bei einem Rohfasergehalt von weniger als 10 %,

—	6 % relativ zum höheren Wert bei einem Rohfasergehalt von 10 % und mehr.

8.   Bemerkungen

8.1.

Futtermittel, welche mehr als 10 % Rohfett enthalten, müssen vor der Bestimmung mit Petrolether (3.5) entfettet werden. Dazu wird der Glasfiltertiegel (4.2) mit Inhalt an die Kaltextraktionsvorrichtung (4.6) angeschlossen und unter Anlegen von Vakuum 3-mal mit je 30 ml Petrolether gewaschen, wobei sichergestellt wird, dass der Rückstand trocken ist. Der Tiegel mit Inhalt wird an die Heizvorrichtung (4.1) angeschlossen. Danach ist gemäß 5 fortzufahren.

8.2.

Futtermittel, die Fette enthalten, welche nicht direkt mit Petrolether (3.5) extrahiert werden können, müssen, wie unter 8.1 angegeben, entfettet werden und nach dem Sieden mit Säure ein weiteres Mal entfettet werden. Nach dem Sieden mit Säure und dem anschließenden Waschvorgang wird der Tiegel mit Inhalt an die Kaltextraktionsvorrichtung (4.6) angeschlossen und 3-mal mit je 30 ml Aceton und danach weitere 3-mal mit je 30 ml Petrolether entfettet. Der Filtertiegel (4.2) wird trocken gesaugt und die Analyse, wie unter 5 beschrieben, fortgesetzt, beginnend mit der Behandlung mit Kaliumhydroxidlösung.

8.3.

Bei Futtermitteln, die mehr als 5 % Carbonate, ausgedrückt als Calciumcarbonat, enthalten, wird der Tiegel (4.2) mit der eingewogenen Probemenge an die Heizvorrichtung (4.1) angeschlossen. Die Probe wird 3-mal mit je 30 ml Salzsäure (3.6) gewaschen. Nach jeder Zugabe wird die Probe vor dem Absaugen etwa 1 min stehen gelassen. Anschließend wird 1-mal mit 30 ml Wasser gewaschen. Danach ist, wie unter 5 angegeben, fortzufahren.

8.4.	Wenn ein Gerät benutzt wird, bei dem mehrere Glasfiltertiegel an derselben Heizvorrichtung gleichzeitig befestigt sind, dürfen 2 Einzelbestimmungen derselben Probe nicht in derselben Untersuchungsreihe vorgenommen werden.

8.5.	Wenn nach dem Sieden mit Säure bzw. Lauge Schwierigkeiten bei der Filtration eintreten, wird Druckluft durch das Auslassrohr der Heizvorrichtung zugeführt und anschließend die Filtration fortgesetzt.

8.6.	Die Veraschungstemperatur darf 500 oC nicht überschreiten, um die Haltbarkeit der Glasfiltertiegel zu verlängern. Beim Erhitzen und Abkühlen sind vor allem übermäßige Temperatursprünge zu vermeiden.

J.   BESTIMMUNG DES ZUCKERGEHALTS

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an reduzierenden Zuckern und des Gesamtzuckers nach Inversion, ausgedrückt als Glucose oder gegebenenfalls nach Multiplikation mit dem Faktor 0,95 als Saccharose. Sie wird bei Mischfuttermitteln angewendet. Für andere Futtermittel sind besondere Verfahren vorgesehen. Gegebenenfalls muss der Gehalt an Lactose getrennt bestimmt und dieses Ergebnis bei der Berechnung berücksichtigt werden.

2.   Prinzip

Die Zucker werden in verdünntem Ethanol gelöst; die Lösung wird mit den Lösungen Carrez I und II geklärt. Nach dem Verdunsten des Ethanols werden vor und nach der Inversion die Bestimmungen nach der Luff-Schoorl-Methode durchgeführt.

3.   Reagenzien

3.1.	Ethanollösung (Volumenkonzentration = 40 %), Dichte: 0,948 g/ml bei 20 oC, auf den Umschlagspunkt von Phenolphthalein eingestellt.

3.2.	Carrez-Lösung I: 21,9 g Zinkacetat, Zn(CH3COO)2·2H2O, und 3 g Eisessig werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.3.	Carrez-Lösung II: 10,6 g Kaliumhexacyanoferrat (II), K4Fe(CN)6·3H2O, werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.4.	Methylorangelösung (Massenkonzentration = 0,1 %).

3.5.	Salzsäure 4 mol/l.

3.6.	Salzsäure 0,1 mol/l.

3.7.	Natriumhydroxidlösung 0,1 mol/l.

3.8.

Reagenz nach Luff-Schoorl: Die Zitronensäurelösung (3.8.2) ist unter vorsichtigem Rühren in die Natriumcarbonatlösung (3.8.3) zu gießen. Nach Zugabe der Kupfersulfatlösung (3.8.1) ist mit Wasser auf 1 l aufzufüllen. Über Nacht absetzen lassen und dann filtrieren. Die Konzentration des so erhaltenen Reagenz (Cu 0,05 mol/l; Na2CO3 1 mol/l) muss geprüft werden, siehe 5.4 letzter Absatz. Der pH-Wert der Lösung muss bei etwa 9,4 liegen.

3.8.1.

Kupfersulfatlösung: 25 g Kupfersulfat, CuSO4·5H2O, eisenfrei, werden in 100 ml Wasser gelöst.

3.8.2.

Zitronensäurelösung: 50 g Zitronensäure, C6H8O7·H2O, werden in 50 ml Wasser gelöst.

3.8.3.

Natriumcarbonatlösung: 143,8 g Natriumcarbonat, wasserfrei, werden in ca. 300 ml warmem Wasser gelöst. Die Lösung wird abkühlen gelassen.

3.9.	Natriumthiosulfatlösung 0,1 mol/l.

3.10.

Stärkelösung: eine Aufschlämmung von 5 g löslicher Stärke in 30 ml Wasser wird zu 1 l siedendem Wasser hinzugefügt und 3 min lang im Sieden gehalten; dann wird abkühlen gelassen und gegebenenfalls 10 mg Quecksilberiodid als Konservierungsmittel hinzugefügt.

3.11.

Schwefelsäure 3 mol/l.

3.12.

Kaliumiodidlösung (Massenkonzentration = 30 %).

3.13.

Bimssteinkörner, mit Salzsäure ausgekocht, mit Wasser gewaschen und getrocknet.

3.14.

3-Methylbutan-1-ol.

4.   Geräte

Mechanisches Schüttelgerät, ca. 35 bis 40 min-1.

5.   Verfahren

5.1.   Extraktion der Probe

Von der Probe werden 2,5 g auf 1 mg genau in einen 250-ml-Messkolben eingewogen. Nach Zugabe von 200 ml Ethanol (3.1) wird der Kolben 1 h lang im Schüttelgerät gemischt. Anschließend werden 5 ml Carrez-Lösung I (3.2) hinzugefügt, und es wird ca. 30 s lang gerührt. Dann werden 5 ml Carrez-Lösung II (3.3) hinzugefügt und 1 min lang gerührt; nun wird mit Ethanol (3.1) zur Marke aufgefüllt, homogenisiert und filtriert. Vom Filtrat werden 200 ml abpipettiert und auf ungefähr die Hälfte des Volumens eingeengt, um den größten Teil des Ethanols zur Verdunstung zu bringen. Der Abdampfrückstand wird mit warmem Wasser in einen 200-ml-Messkolben übergespült, abgekühlt, mit Wasser zur Marke aufgefüllt, homogenisiert und, falls erforderlich, filtriert. Diese Lösung wird für die Bestimmung des Gehalts an reduzierenden Zuckern und nach Inversion zur Bestimmung des Gesamtzuckers verwendet.

5.2.   Bestimmung des Gehalts an reduzierenden Zuckern

Eine Menge von höchstens 25 ml der Lösung, die weniger als 60 mg reduzierende Zucker, ausgedrückt als Glucose, enthält, wird abpipettiert, falls erforderlich mit destilliertem Wasser auf 25 ml aufgefüllt und der Gehalt an reduzierendem Zucker nach der Luff-Schoorl-Methode bestimmt. Das Ergebnis wird als Prozentsatz Glucose in der Probe ausgedrückt.

5.3.   Bestimmung des Gehalts an Gesamtzucker nach Inversion

Von der Lösung werden 50 ml in einen 100-ml-Messkolben pipettiert, einige Tropfen Methylorangelösung (3.4) hinzugefügt und dann vorsichtig unter ständigem Rühren Salzsäure (3.5) bis zum eindeutigen Umschlag nach Rot hinzugegeben. Dann werden 15 ml Salzsäure (3.6) hinzugefügt, und der Kolben wird 30 min lang in ein Bad mit kräftig siedendem Wasser gestellt, dann schnell auf die Temperatur von etwa 20 oC abgekühlt und 15 ml Natriumhydroxidlösung (3.7) hinzugegeben. Der Kolben wird mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt, geschüttelt und eine Menge von höchstens 25 ml entnommen, die weniger als 60 mg reduzierende Zucker, ausgedrückt als Glucose, enthält. Falls erforderlich, wird mit destilliertem Wasser auf 25 ml aufgefüllt und der Gehalt an reduzierenden Zuckern nach der Luff-Schoorl-Methode bestimmt. Das Ergebnis wird als Prozentsatz Glucose oder gegebenenfalls nach Multiplikation mit dem Faktor 0,95 als Saccharose ausgedrückt.

5.4.   Titration nach Luff-Schoorl

In einen 300-ml-Erlenmeyerkolben werden 25 ml Reagenz nach Luff-Schoorl (3.8) pipettiert und anschließend genau 25 ml der geklärten Zuckerlösung hinzugefügt. Nach Zugabe von 2 Körnchen Bimsstein (3.13) wird unter Schütteln mit der Hand über freier Flamme von mittlerer Höhe erhitzt, so dass die Flüssigkeit in etwa 2 min zum Sieden kommt. Anschließend wird der Erlenmeyerkolben sofort auf ein Drahtnetz mit einer Asbestscheibe, in die ein Loch von etwa 6 cm Durchmesser gestanzt wurde, gestellt; vorher wird unter dem Drahtnetz eine Flamme entzündet und so eingestellt, dass der Kolben nur am Boden erhitzt wird. Dann wird der Kolben mit einem Rückflusskühler verbunden. Von diesem Augenblick an wird der Kolben genau 10 min sieden gelassen und anschließend sofort in kaltem Wasser abgekühlt. Nach etwa 5 min wird wie folgt titriert:

Der Flüssigkeit werden 10 ml Kaliumiodidlösung (3.12) und unmittelbar danach, aber vorsichtig (wegen der Gefahr des übermäßigen Schäumens), 25 ml Schwefelsäure (3.11) zugegeben. Dann wird mit Natriumthiosulfatlösung (3.9) zunächst bis zum Auftreten einer mattgelben Farbe titriert und nach Zugabe von Stärkelösung (3.10) als Indikator die Titration zu Ende geführt.

Die gleiche Titration wird in einer Mischung aus genau 25 ml Reagenz nach Luff-Schoorl (3.8) und 25 ml Wasser nach Zugabe von 10 ml Kaliumiodidlösung (3.12) und 25 ml Schwefelsäure (3.11) durchgeführt, jedoch ohne vorheriges Erhitzen.

6.   Berechnung der Ergebnisse

Aus der unten angeführten Tabelle wird die Menge Glucose in mg abgelesen, die der Differenz der Ergebnisse beider Titrationen, ausgedrückt in ml Natriumthiosulfatlösung (0,1 mol/l), entspricht. Das Ergebnis wird als Prozentsatz der Probe angegeben.

7.   Sonderverfahren

7.1.

Bei sehr stark melassehaltigen Futtermitteln und anderen wenig homogenen Futtermitteln werden 20 g in einen 1-l-Messkolben eingewogen, 500 ml Wasser hinzugefügt und 1 h lang im Schüttelgerät gemischt. Danach wird — jedoch mit jeweils der 4-fachen Menge der Carrez-Lösungen I (3.2) und II (3.3) — wie unter 5.1 beschrieben geklärt. Anschließend wird mit Ethanol (Volumenkonzentration = 80 %) zur Marke aufgefüllt. Die Lösung wird homogenisiert und filtriert. Das Ethanol wird, wie unter 5.1 beschrieben, entfernt. Bei Abwesenheit verkleisterter Stärke wird mit Wasser zur Marke aufgefüllt.

7.2.

Bei Melasse und Futtermittel-Ausgangserzeugnissen, die reich an Zucker, aber praktisch stärkefrei sind (Johannisbrot, Zuckerrübentrockenschnitzel usw.), werden 5 g in einen 250-ml-Messkolben eingewogen und 200 ml destilliertes Wasser hinzugefügt. Dann wird 1 h lang oder, falls erforderlich, länger im Schüttelgerät gemischt. Danach wird mit den Carrez-Lösungen I (3.2) und II (3.3), wie unter 5.1 beschrieben, geklärt und anschließend mit Wasser zur Marke aufgefüllt, homogenisiert und filtriert. Zur Bestimmung des Gesamtzuckergehalts wird, wie unter 5.3 beschrieben, verfahren.

8.   Bemerkungen

8.1.	Es wird empfohlen, vor dem Erhitzen mit dem Luff-Schoorl-Reagenz (unabhängig vom Volumen) etwa 1 ml 3-Methylbutan-1-ol (3.14) hinzuzufügen, um die Schaumbildung zu vermeiden.

8.2.	Die Differenz zwischen dem Gehalt an Gesamtzucker nach Inversion, ausgedrückt als Glucose, und dem Gehalt an reduzierenden Zuckern, ausgedrückt als Glucose, ergibt nach Multiplikation mit dem Faktor 0,95 das Ergebnis als Prozentsatz Saccharose.

8.3.	Zur Bestimmung des Gehalts an reduzierenden Zuckern, mit Ausnahme von Milchzucker (Lactose), gibt es 2 Möglichkeiten:

8.3.1.

Für eine annähernde Berechnung wird der aus einer getrennten Bestimmung ermittelte Lactosegehalt mit 0,675 multipliziert und das Ergebnis von dem Gehalt an reduzierenden Zuckern abgezogen.

8.3.2.

Für eine genaue Berechnung der reduzierenden Zucker (mit Ausnahme von Lactose) ist es notwendig, dass beiden endgültigen Bestimmungen die gleiche Menge der Einwaage zugrunde liegt. Die eine Bestimmung wird in einem Teil der nach 5.1. hergestellten Lösung durchgeführt, die zweite Bestimmung in einem Teil der Lösung, die bei der Bestimmung des Lactosegehalts mittels der für diesen Zweck vorgesehenen Methode (nach Vergärung der anderen Zuckerarten und Klärung) hergestellt wird. In beiden Fällen wird der anwesende Zucker nach der Luff-Schoorl-Methode bestimmt und in mg Glucose berechnet. Diese beiden Werte werden voneinander subtrahiert und die Differenz wird als Prozentsatz der Probe ausgedrückt. Beispiel: Die beiden abpipettierten Mengen entsprechen bei jeder Bestimmung einer Probeneinwaage von 250 mg. Im ersten Fall werden 17 ml Natriumthiosulfatlösung 0,1 mol/l, entsprechend 44,2 mg Glucose, verbraucht; im zweiten Fall werden 11 ml, entsprechend 27,6 mg Glucose, verbraucht. Die Differenz beträgt also 16,6 mg Glucose. Der Gehalt an reduzierenden Zuckern (mit Ausnahme von Lactose), berechnet als Glucose, ist demnach

Tabelle für 25 ml Reagenz nach Luff-Schoorl

ml Na2 S2 O30,1 mol/l, 2 min erhitzen, 10 min sieden

Na2 S2 O3 0,1 mol/l	Glucose, Fructose, Invertzucker C6 H12 O6		Lactose C12 H22 O11		Maltose C12 H22 O11		Na2 S2 O3 0,1 mol/l
ml	mg	Differenz	mg	Differenz	Mg	Differenz	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6	3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

K.   BESTIMMUNG DES LACTOSEGEHALTS

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Lactosegehalts von Futtermitteln, die mehr als 0,5 % Lactose enthalten.

2.   Prinzip

Die Zucker werden in Wasser gelöst. Die Lösung wird mit Hefe — Saccharomyces cerevisiae — vergoren, wobei die Lactose nicht angegriffen wird. Nach Klärung und Filtration wird der Gehalt an Lactose im Filtrat nach der Luff-Schoorl-Methode bestimmt.

3.   Reagenzien

3.1.	Saccharomyces-cerevisiae-Suspension: 25 g frische Hefe werden in 100 ml Wasser suspendiert. Im Kühlschrank ist die Suspension höchstens 1 Woche haltbar.

3.2.	Carrez-Lösung I: 21,9 g Zinkacetat, Zn (CH3COO)2·2H2O, und 3 g Eisessig werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.3.	Carrez-Lösung II: 10,6 g Kaliumhexacyanoferrat (II), K4Fe(CN)6·3H2O, werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.4.

Reagenz nach Luff-Schoorl: Die Zitronensäurelösung (3.4.2) wird unter vorsichtigem Rühren in die Natriumcarbonatlösung (3.4.3) gegossen. Nach Zugabe der Kupfersulfatlösung (3.4.1) wird auf 1 l mit Wasser aufgefüllt. Über Nacht absetzen lassen und dann filtrieren. Die Konzentration des so erhaltenen Reagenz (Cu 0,05 mol/l; Na2CO3 1 mol/l) muss geprüft werden. Der pH-Wert muss bei etwa 9,4 liegen.

3.4.1.

Kupfersulfatlösung: 25 g Kupfersulfat, CuSO4·5H2O, eisenfrei, werden in 100 ml Wasser gelöst,

3.4.2.

Zitronensäurelösung: 50 g Zitronensäure, C6H8O7·H2O, werden in 50 ml Wasser gelöst,

3.4.3.

Natriumcarbonatlösung: 143,8 g Natriumcarbonat, wasserfrei, werden in ca. 300 ml warmem Wasser gelöst. Die Lösung wird abkühlen gelassen.

3.5.	Bimssteinkörner mit Salzsäure ausgekocht, mit Wasser gewaschen und getrocknet.

3.6.	Kaliumiodidlösung (Massenkonzentration = 30 %).

3.7.	Schwefelsäure 3 mol/l.

3.8.	Natriumthiosulfatlösung 0,1 mol/l.

3.9.	Stärkelösung: Eine Aufschlämmung von 5 g löslicher Stärke in 30 ml Wasser wird zu 1 l siedendem Wasser hinzugefügt und 3 min lang im Sieden gehalten; dann wird abgekühlt und gegebenenfalls 10 mg Quecksilberiodid als Konservierungsmittel hinzugefügt.

4.   Geräte

Wasserbad mit Thermostat, auf 38 bis 40 oC eingestellt.

5.   Verfahren

Von der Probe wird 1 g auf 1 mg genau eingewogen und mit 25 bis 30 ml Wasser in einen 100-ml-Messkolben gebracht. Der Messkolben wird 30 min lang in ein Bad mit siedendem Wasser gestellt und auf eine Temperatur von etwa 35 oC abgekühlt. Anschließend werden 5 ml Hefesuspension (3.1) zugefügt. Dann wird der Kolben geschüttelt, 2 h lang in einem Wasserbad bei 38 bis 40 oC stehen gelassen und auf etwa 20 oC abgekühlt.

Danach werden 2,5 ml Carrez-Lösung I (3.2) hinzugefügt, und es wird 30 s lang gerührt. Dann werden 2,5 ml Carrez-Lösung II (3.3) hinzugefügt, und es wird nochmals 30 s lang gerührt. Nun wird mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt, gemischt und filtriert. Vom Filtrat wird eine Menge von höchstens 25 ml, die möglichst 40 bis 80 mg Lactose enthält, in einen 300-ml-Erlenmeyerkolben abpipettiert. Gegebenenfalls wird mit Wasser auf 25 ml aufgefüllt.

Auf dieselbe Weise wird ein Blindversuch mit 5 ml Hefesuspension (3.1) ausgeführt. Dann wird der Gehalt an Lactose nach der Luff-Schoorl-Methode wie folgt bestimmt: Nach Zugabe von genau 25 ml des Reagenz nach Luff-Schoorl (3.4) und von 2 Körnchen Bimsstein (3.5) wird unter Schütteln mit der Hand über freier Flamme von mittlerer Höhe erhitzt, so dass die Flüssigkeit in etwa 2 min zum Sieden kommt. Anschließend wird der Erlenmeyerkolben sofort auf ein Drahtnetz mit einer Asbestscheibe, in die ein Loch von etwa 6 cm Durchmesser gestanzt wurde, gestellt; vorher wird unter dem Drahtnetz eine Flamme entzündet und so eingestellt, dass der Kolben nur am Boden erhitzt wird. Dann wird der Kolben mit einem Rückflusskühler verbunden. Von diesem Augenblick an wird der Kolben genau 10 min sieden gelassen und anschließend sofort in kaltem Wasser abgekühlt. Nach etwa 5 min wird wie folgt titriert:

Zu der Flüssigkeit werden 10 ml Kaliumiodidlösung (3.6) und unmittelbar danach, aber vorsichtig (wegen der Gefahr des übermäßigen Schäumens), 25 ml Schwefelsäure (3.7) hinzugegeben. Dann wird mit Natriumthiosulfatlösung (3.8) zunächst bis zum Auftreten einer mattgelben Farbe titriert und nach Zugabe von Stärkelösung (3.9) als Indikator die Titration zu Ende geführt.

Die gleiche Titration wird in einer Mischung aus genau 25 ml Reagenz nach Luff-Schoorl (3.4) und 25 ml Wasser nach Zugabe von 10 ml Kaliumiodidlösung (3.6) und 25 ml Schwefelsäure (3.7) durchgeführt, jedoch ohne vorheriges Erhitzen.

6.   Berechnung der Ergebnisse

Aus der unten angeführten Tabelle wird die Menge Lactose in mg abgelesen, die der Differenz der Ergebnisse beider Titrationen, ausgedrückt in ml Natriumthiosulfatlösung (0,1 mol/l), entspricht.

Das Ergebnis entspricht dem Gehalt an wasserfreier Lactose und wird als Prozentsatz der Probe ausgedrückt.

7.   Bemerkung

Wenn mehr als 40 % vergärbare Zucker vorhanden sind, werden mehr als 5 ml Hefesuspension (3.1) verwendet.

Tabelle für 25 ml Reagenz nach Luff-Schoorl

ml Na2 S2 O30,1 mol/l, 2 min erhitzen, 10 min sieden

Na2 S2 O3 0,1 mol/l	Glucose, Fructose, Invertzucker C6 H12 O6		Lactose C12 H22 O11		Maltose C12 H22 O11		Na2 S2 O3 0,1 mol/l
ml	mg	Differenz	mg	Differenz	Mg	Differenz	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6	3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

L.   BESTIMMUNG DES STÄRKEGEHALTS

POLARIMETRISCHES VERFAHREN

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Stärke und ihrer Abbauprodukte mit hoher Molmasse in Futtermitteln zum Zweck der Prüfung ihrer Übereinstimmung mit dem angegebenen Energiegehalt (Anhang VII) und mit der Richtlinie 96/25/EG des Rates (3).

2.   Prinzip

Die Methode basiert auf einer doppelten Bestimmung. Bei der ersten Bestimmung wird die Probe mit verdünnter Salzsäure behandelt. Nach Klärung und Filtration wird die optische Drehung der Lösung polarimetrisch gemessen.

Bei der zweiten Bestimmung wird die Probe mit 40 %igem Ethanol extrahiert. Nach Behandlung des Filtrats mit Salzsäure wird geklärt, filtriert und die optische Drehung unter den gleichen Bedingungen wie bei der ersten Bestimmung gemessen.

Der Unterschied zwischen den beiden Messungen, multipliziert mit einem bekannten Faktor, ergibt den Stärkegehalt der Probe.

3.   Reagenzien

3.1.	Salzsäure, Lösung (Massenanteil = 25 %) Dichte: 1,126 g/ml.

3.2.

Salzsäure, Lösung (Massenkonzentration = 1,13 %). Die Konzentration muss durch Titration mit Natriumhydroxidlösung (0,1 mol/l) in Gegenwart von Methylrot (Massenkonzentration = 0,1 %) in Ethanol (Volumenkonzentration = 94 %) geprüft werden. Für die Neutralisierung von 10 ml werden 30,94 ml NaOH (0,1 mol/l) benötigt.

3.3.	Carrez-Lösung I: 21,9 g Zinkacetat, Zn (CH3COO)2·2H2O, und 3 g Eisessig werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.4.	Carrez-Lösung II: 10,6 g Kaliumhexacyanoferrat (II), K4Fe(CN)6·3H2O, werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.5.	Ethanol, Lösung (Volumenkonzentration = 40 %), Dichte: 0,948 g/ml bei 20 oC.

4.   Geräte

4.1.	250-ml-Erlenmeyerkolben mit Schliffstopfen und Rückflusskühler.

4.2.	Polarimeter oder Saccharimeter.

5.   Verfahren

5.1.   Vorbereitung der Probe

Die Probe muss so fein gemahlen werden, dass sie vollständig durch ein Rundlochsieb mit einem Lochdurchmesser von 0,5 mm passiert werden kann.

5.2.   Bestimmung der gesamten optischen Drehung (P oder S) (siehe Bemerkung 7.1)

Von der Probe werden 2,5 g auf 1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen und 25 ml Salzsäure (3.2) hinzugefügt. Der Kolben wird geschüttelt, bis sich der Stoff gleichmäßig verteilt hat; dann werden weitere 25 ml Salzsäure (3.2) hinzugegeben. Der Kolben wird in ein Bad mit kochendem Wasser gestellt und während der ersten 3 min kräftig und regelmäßig geschüttelt, um die Bildung von Klumpen zu verhindern. Die in dem Wasserbad enthaltene Wassermenge muss ausreichen, um das Wasser auch dann noch über dem Siedepunkt zu halten, wenn der Kolben eingetaucht wird. Während des Schüttelns darf der Kolben nicht aus dem Wasser herausgenommen werden. Nach genau 15 min wird der Kolben aus dem Wasserbad entfernt, 30 ml kaltes Wasser hinzugefügt und unverzüglich auf 20 oC abgekühlt.

Danach werden 5 ml Carrez-Lösung I (3.3) hinzugefügt, und es wird ca. 30 s lang geschüttelt. Anschließend werden 5 ml Carrez-Lösung II (3.4) hinzugefügt, und es wird nochmals 30 s geschüttelt. Dann wird mit Wasser zur Marke aufgefüllt, gemischt und filtriert. Ist das Filtrat nicht vollständig klar (was selten vorkommt), muss die Bestimmung mit größeren Mengen Carrez-Lösungen I und II, z. B. 10 ml, wiederholt werden.

Anschließend wird die optische Drehung der Lösung in einem 200-mm-Rohr mit einem Polarimeter oder einem Saccharimeter gemessen.

5.3.   Bestimmung der optischen Drehung (P' oder S') der in 40 %igem Ethanol löslichen Substanzen

Von der Probe werden 5 g auf 1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen und etwa 80 ml Ethanol (3.5) hinzugefügt (siehe Bemerkung 7.2). Anschließend wird der Kolben 1 h bei Raumtemperatur stehen gelassen und währenddessen 6-mal kräftig geschüttelt, damit sich die Testprobe gründlich mit dem Ethanol vermischt. Dann wird mit Ethanol (3.5) zur Marke aufgefüllt, geschüttelt und filtriert.

Von dem Filtrat werden 50 ml (= 2,5 g der Probe) in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben abpipettiert und 2,1 ml Salzsäure (3.1) hinzugefügt; der Kolben wird kräftig geschüttelt, an einen Rückflusskühler angeschlossen und in ein Bad mit siedendem Wasser gestellt. Nach genau 15 min wird der Erlenmeyerkolben aus dem Wasserbad herausgenommen und der Inhalt in einen 100-ml-Messkolben mit einer kleinen Menge von kaltem Wasser überspült; anschließend wird auf eine Temperatur von 20 oC abgekühlt.

Danach wird mit den Carrez-Lösungen I (3.3) und II (3.4) geklärt, mit Wasser zur Marke aufgefüllt, geschüttelt und filtriert und die optische Drehung gemessen, wie unter 5.2 zweiter und dritter Absatz beschrieben.

6.   Berechnung der Ergebnisse

Der Stärkegehalt (%) wird wie folgt berechnet:

6.1.   Polarimetrische Messung

P	=	Optische Drehung insgesamt in Winkelgrad
P'	=	Optische Drehung in Winkelgrad der in 40 %igem Ethanol löslichen Substanzen
	=	Spezifische optische Drehung von reiner Stärke. Für diesen Faktor D werden die nachstehenden, allgemein anerkannten Werte angewendet: + 185,9o: Reisstärke, + 185,7o: Kartoffelstärke, + 184,6o: Maisstärke, + 182,7o: Weizenstärke, + 181,5o: Gerstenstärke, + 181,3o: Haferstärke, + 184,0o: sonstige Stärkearten sowie Stärkegemische in Mischfuttermitteln.

6.2.   Saccharimetrische Messung

S	=	Optische Drehung insgesamt in Saccharimeter-Grad
S'	=	Optische Drehung in Saccharimeter-Grad der in 40 %igem Ethanol löslichen Substanzen
N	=	Gewicht (g) von Saccharose in 100 ml Wasser, das bei Messung mit einem 200-mm-Rohr eine optische Drehung von 100 Saccharimeter-Grad bewirkt: 16,29 g für die französischen Saccharimeter, 26,00 g für die deutschen Saccharimeter, 20,00 g für gemischte Saccharimeter,
	=	Spezifische optische Drehung von reiner Stärke (siehe 6.1).

6.3.   Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 0,4 % (absolut) bei Stärkegehalten von weniger als 40 % und 1 % (relativ) bei Stärkegehalten von 40 % und mehr nicht überschreiten.

7.   Bemerkungen

7.1.	Enthält die Probe mehr als 6 % Carbonate, berechnet als Calciumcarbonat, so müssen diese vor der Bestimmung der gesamten optischen Drehung durch Behandlung mit der genau notwendigen Menge verdünnter Schwefelsäure zerstört werden.

7.2.

Bei Erzeugnissen mit hohem Lactosegehalt, z. B. bei Molkenpulver oder Magermilchpulver, wird nach Zusatz von 80 ml Ethanol (3.5) wie folgt verfahren: Der Messkolben wird an einen Rückflusskühler angeschlossen und 30 min lang in ein Wasserbad von 50 oC gestellt. Nach dem Abkühlen wird das Verfahren, wie unter 5.3 beschrieben, fortgeführt.

7.3.

Folgende Futtermittel-Ausgangserzeugnisse führen, sofern sie in größeren Mengen in Futtermitteln vorhanden sind, erwiesenermaßen zu Interferenzen bei der Bestimmung des Stärkegehalts durch das polarimetrische Verfahren und könnten so falsche Ergebnisse zur Folge haben: — (Zucker-)Rübenerzeugnisse wie (Zucker-)Rübenschnitzel, (Zucker-) Rübenmelasse, (Zucker-)Rübenmelasseschnitzel, (Zucker-)Rübenvinasse, (Rüben-)Zucker, — Zitrustrester, — Leinsamen; Leinkuchen; Leinextraktionsschrot, — Rapssamen; Rapskuchen; Rapsextraktionsschrot; Rapsschalen, — Sonnenblumenkerne; Sonnenblumenextraktionsschrot; Sonnenblumenextraktionsschrot aus teilgeschälter Saat, — Kokoskuchen; Kokosextraktionsschrot, — Kartoffelpülpe, — Trockenhefe, — Erzeugnisse mit hohem Inulingehalt (z. B. Topinambur-Chips und -Mehl), — Grieben/Grammeln.

M.   BESTIMMUNG DES ROHASCHEGEHALTS

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Rohaschegehalts von Futtermitteln.

2.   Prinzip

Die Probe wird bei 550 oC verascht; der Rückstand wird gewogen.

3.   Reagenzien

Ammoniumnitrat, Lösung (Massenkonzentration = 20 %).

4.   Geräte

4.1.	Heizplatte.

4.2.	Elektrischer Muffelofen mit Thermostat.

4.3.	Veraschungsschale aus Quarzglas, Porzellan oder Platin, entweder rechteckig (ca. 60 × 40 × 25 mm) oder rund (Durchmesser: 60 bis 75 mm, Höhe: 20 bis 40 mm).

5.   Verfahren

Etwa 5 g (2,5 g bei Stoffen, die zur Blasenbildung neigen) der Probe werden auf 1 mg genau in eine vorher bei 550 oC geglühte, abgekühlte und tarierte Veraschungsschale eingewogen. Die Schale wird auf der Heizplatte allmählich bis zum Verkohlen des Stoffes erhitzt. Die Veraschung erfolgt gemäß 5.1 oder 5.2.

5.1.

Die Schale wird in den auf 550 oC eingestellten Muffelofen gebracht und darin bei dieser Temperatur so lange gehalten, bis sich eine weiße, hellgraue oder rötliche Asche bildet, die offensichtlich frei von Kohlepartikeln ist. Dann wird die Schale in einen Exsikkator gestellt und unmittelbar nach dem Abkühlen gewogen.

5.2.

Die Schale wird 3 h lang in den auf 550 oC eingestellten Muffelofen gebracht. Dann wird die Schale in einen Exsikkator gestellt und unmittelbar nach dem Abkühlen gewogen. Anhand einer zweiten Veraschung von 30 min ist zu prüfen, ob das Gewicht der Asche konstant geblieben ist (der Gewichtsverlust zwischen 2 aufeinanderfolgenden Wägungen darf 1 mg nicht überschreiten).

6.   Berechnung der Ergebnisse

Das Gewicht des Rückstands wird berechnet, indem das Leergewicht abgezogen wird.

Das Ergebnis ist als Prozentsatz der Probe auszudrücken.

7.   Bemerkungen

7.1.

Bei schwer zerstörbaren Stoffen werden der abgekühlten Rohasche nach einer ersten Veraschung von mindestens 3 h einige Tropfen 20 %iger Ammoniumnitratlösung oder Wasser zugefügt (jedoch vorsichtig, um ein Zerstäuben oder Verkleben der Asche zu vermeiden). Nach Trocknung im Trockenschrank wird die Veraschung weitergeführt. Der Vorgang wird gegebenenfalls bis zur vollständigen Veraschung wiederholt.

7.2.

Bei Stoffen, die der unter 7.1 beschriebenen Behandlung widerstehen, ist wie folgt vorzugehen: Nach einer Veraschung von 3 h wird die Asche mit warmem Wasser aufgenommen und durch einen kleinen aschefreien Filter abfiltriert. In der ursprünglichen Schale werden Filter und dessen Inhalt verascht. Das Filtrat wird in die abgekühlte Schale gebracht, bis zur Trockne eingedampft, verascht und gewogen.

7.3.

Bei Ölen und Fetten wird eine Probe von 25 g in eine Schale entsprechender Abmessung genau eingewogen. Es wird dann durch Anzünden des Stoffes mit einem Streifen aus aschefreiem Filterpapier verkohlt. Nach der Verkohlung wird mit möglichst geringer Menge Wasser angefeuchtet. Anschließend wird getrocknet und die Veraschung, wie unter 5 beschrieben, zu Ende geführt.

N.   BESTIMMUNG DES GEHALTS AN IN SALZSÄURE UNLÖSLICHER ASCHE

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an in Salzsäure unlöslichen, mineralischen Bestandteilen von Futtermitteln. Abhängig von der Art der Probe sind 2 Verfahren vorgesehen.

1.1.	Verfahren A: anzuwenden bei organischen Futtermittel-Ausgangserzeugnissen und bei den meisten Mischfuttermitteln.

1.2.	Verfahren B: anzuwenden bei Mineralstoffen und Mineralstoffmischungen sowie bei allen Mischfuttermitteln, deren Gehalt an in Salzsäure unlöslicher Asche bei der Bestimmung nach Verfahren A mehr als 1 % beträgt.

2.   Prinzip

2.1.	Verfahren A: Die Probe wird verascht. Die Asche wird in Salzsäure zum Sieden gebracht und der unlösliche Rückstand abfiltriert und gewogen.

2.2.	Verfahren B: Die Probe wird mit Salzsäure behandelt. Die Lösung wird abfiltriert, der Rückstand wird verascht, und die so erhaltene Asche nach Verfahren A weiterbehandelt.

3.   Reagenzien

3.1.	Salzsäure 3 mol/l.

3.2.	Trichloressigsäure, Lösung (Massenkonzentration = 20 %).

3.3.	Trichloressigsäure, Lösung (Massenkonzentration = 1 %).

4.   Geräte

4.1.	Heizplatte.

4.2.	Elektrischer Muffelofen mit Thermostat.

4.3.	Veraschungsschalen aus Quarzglas, Porzellan oder Platin, entweder rechteckig (ca. 60 × 40 × 25 mm) oder rund (Durchmesser: 60 bis 75 mm, Höhe: 20 bis 40 mm).

5.   Verfahren

5.1.   Verfahren A

Die Einwaage wird unter den Bedingungen, die für die Bestimmung des Rohaschegehalts beschrieben sind, verascht. Es kann auch die bei dieser Analyse erhaltene Asche verwendet werden.

Die Asche wird zusammen mit 75 ml Salzsäure (3.1) in ein Becherglas von 250 bis 400 ml Inhalt überführt. Es wird vorsichtig zum Sieden erhitzt und 15 min weiter in schwachem Sieden gehalten. Die warme Lösung wird durch einen aschefreien Papierfilter filtriert und der Rückstand mit warmem Wasser bis zum Ausbleiben der sauren Reaktion ausgewaschen. Der Filter mit dem Rückstand wird nach dem Trocknen bei einer Temperatur von mindestens 550 oC und höchstens 700 oC in einer tarierten Veraschungsschale verascht und anschließend im Exsikkator gekühlt und gewogen.

5.2.   Verfahren B

Von der Analysenprobe werden 5 g auf 1 mg genau in ein Becherglas von 250 bis 400 ml Fassungsvermögen eingewogen. Dann werden nacheinander 25 ml Wasser und 25 ml Salzsäure (3.1) zugegeben, gemischt, und es wird bis zum Nachlassen des Aufbrausens gewartet. Zuletzt werden weitere 50 ml Salzsäure (3.1) zugegeben. Nach dem Nachlassen der eventuell erneut auftretenden Gasentwicklung wird das Becherglas 30 min lang oder, wenn notwendig, länger in ein siedendes Wasserbad gestellt, bis die vollständige Hydrolyse eventuell vorhandener Stärke eingetreten ist. Es wird warm durch einen aschefreien Filter filtriert. Der Filter wird mit etwa 50 ml warmem Wasser ausgewaschen (siehe Bemerkung 7). Anschließend wird der Filter mit Rückstand in eine Veraschungsschale gestellt, getrocknet und bei einer Temperatur von mindestens 550 oC und höchstens 700 oC verascht. Die Asche wird mit 75 ml Salzsäure (3.1) in ein Becherglas von 250 bis 400 ml Fassungsvermögen überführt und anschließend, wie unter 5.1 zweiter Absatz beschrieben, weiterbehandelt.

6.   Berechnung der Ergebnisse

Das Gewicht des Rückstands wird berechnet, indem das Leergewicht abgezogen wird. Das Ergebnis ist als Prozentsatz der Probe auszudrücken.

7.   Bemerkung

Treten bei der Filtration Schwierigkeiten auf, so wird die Bestimmung wiederholt. Hierbei werden anstelle von 50 ml Salzsäure (3.1) 50 ml 20 %iger Trichloressigsäurelösung (3.2) zugegeben; der Filter wird mit einer warmen 1 %igen Trichloressigsäurelösung (3.3) ausgewaschen.

O.   BESTIMMUNG DES GEHALTS AN CARBONATEN

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt es, in den meisten Futtermitteln den Gehalt an Carbonaten, herkömmlicherweise als Calciumcarbonat bezeichnet, zu bestimmen.

In bestimmten Fällen (z. B. bei Eisencarbonat) ist jedoch eine besondere Methode anzuwenden.

2.   Prinzip

Die Carbonate werden mit Salzsäure zersetzt; die frei gewordene Kohlensäure wird in einem graduierten Rohr aufgefangen. Das erhaltene Gasvolumen wird mit demjenigen verglichen, welches unter den gleichen Bedingungen von einer bekannten Menge Calciumcarbonat freigesetzt wird.

3.   Reagenzien

3.1.	Salzsäure, Dichte 1,10 g/ml.

3.2.	Calciumcarbonat.

3.3.	Schwefelsäure, etwa 0,05 mol/l, mit Methylrot angefärbt.

4.   Geräte

Apparatur nach Scheibler-Dietrich (siehe Skizze) oder gleichwertiges Gerät.

5.   Verfahren

Je nach dem Carbonatgehalt der Probe wird eine Einwaage wie folgt eingewogen:

—	0,5 g bei Erzeugnissen mit einem Anteil von 50 bis 100 % Carbonaten, ausgedrückt als Calciumcarbonat,

—	1 g bei Erzeugnissen mit einem Anteil von 40 bis 50 % Carbonaten, ausgedrückt als Calciumcarbonat,

—	2 bis 3 g bei anderen Erzeugnissen.

Die Einwaage wird in die Spezialflasche (4) der Apparatur gebracht, die mit einem Röhrchen aus unzerbrechlichem Material versehen ist, das 10 ml Salzsäure (3.1) enthält. Anschließend wird die Flasche an die Apparatur angeschlossen. Dann wird der Drei-Weg-Hahn (5) so gedreht, dass das Rohr (1) mit der Außenluft in Verbindung steht. Mit dem beweglichen Rohr (2), das mit angefärbter Schwefelsäure (3.3) gefüllt und mit dem graduierten Rohr (1) verbunden ist, wird das Niveau der Flüssigkeit auf den Nullpunkt der Skala eingestellt. Der Hahn (5) wird so gedreht, dass das Rohr (1) mit dem Rohr (3) verbunden ist. Anschließend wird der Nullpunkt kontrolliert.

Die Salzsäure (3.1) wird durch Kippen der Flasche (4) langsam über die Einwaage laufen gelassen. Durch Absenken des beweglichen Rohrs (2) wird der Druck ausgeglichen. Die Flasche (4) wird so lange hin und her bewegt, bis die Kohlensäureentwicklung ganz aufgehört hat.

Der Druckausgleich erfolgt, indem die Flüssigkeit in den Rohren (1) und (2) wieder auf gleiches Niveau gebracht wird. Nach einigen Minuten — sobald das Volumen konstant ist — kann abgelesen werden.

Es ist ein Vergleichsversuch mit 0,5 g Calciumcarbonat (3.2) unter denselben Bedingungen durchzuführen.

6.   Berechnung der Ergebnisse

Der Gehalt an Carbonaten, ausgedrückt als Calciumcarbonat, wird nach folgender Formel berechnet:

wobei!

X	=	Massenanteil (%) an Carbonaten in der Probe, ausgedrückt als Calziumkarbonat,
V	=	ml CO2, von der Einwaage freigesetzt,
V1	=	ml CO2, aus 0,5 g CaCO3 freigesetzt,
m	=	Probeneinwaage in g.

7.   Bemerkungen

7.1.	Beträgt die Einwaage mehr als 2 g, werden vor Beginn des Versuchs 15 ml destilliertes Wasser in die Flasche (4) zugegeben und gemischt. Beim Vergleichsversuch ist dieselbe Wassermenge zu verwenden.

7.2.	Bei Verwendung eines Apparats, dessen Volumen von dem der Scheibler-Dietrich-Apparatur abweicht, sind die Einwaage, die Vergleichsmenge und die Berechnung der Ergebnisse entsprechend anzupassen.

P.   BESTIMMUNG DES GESAMTPHOSPHORGEHALTS

FOTOMETRISCHE METHODE

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Gesamtphosphor in Futtermitteln. Sie ist besonders für die Untersuchung von Futtermitteln mit einem geringen Gehalt an Phosphor geeignet. In bestimmten Fällen (phosphorreiche Erzeugnisse) kann eine gravimetrische Methode angewandt werden.

2.   Prinzip

Die Probe wird entweder auf trockenem Wege (bei organischen Futtermitteln) oder auf nassem Wege (bei Mineralstoffen und flüssigen Futtermitteln) aufgeschlossen und in Säure gelöst. Die Lösung wird mit dem Vanadat-Molybdat-Reagenz behandelt. Die Extinktion der gelb gefärbten Lösung wird bei 430 nm im Spektralfotometer gemessen.

3.   Reagenzien

3.1.	Calciumcarbonat.

3.2.	Salzsäure, ρ20 = 1,10 g/ml (ca. 6 mol/l).

3.3.	Salpetersäure, ρ20 = 1,045 g/ml.

3.4.	Salpetersäure, ρ20 = 1,38 bis 1,42 g/ml.

3.5.	Schwefelsäure, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.6.	Vanadat-Molybdat-Reagenz: 200 ml Ammoniumheptamolybdatlösung (3.6.1) werden mit 200 ml Ammoniummonovanadatlösung (3.6.2) und 134 ml Salpetersäure (3.4) in einem l-l-Messkolben gemischt und mit Wasser zur Marke aufgefüllt.

3.6.1.

Ammoniumheptamolybdatlösung: 100 g Ammoniumheptamolybdat, (NH4) 6Mo7O24 4H2O, werden in heißem Wasser gelöst. 10 ml Ammoniakwasser (D: 0,91 g/ml) werden hinzugefügt, und das Volumen wird mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

3.6.2.

Ammoniummonovanadatlösung: 2,35 g Ammoniummonovanadat, NH4VO3, werden in 400 ml heißem Wasser gelöst. 20 ml verdünnte Salpetersäure (7 ml HNO3 (3.4) + 13 ml H2O) werden unter ständigem Rühren langsam hinzugefügt, und das Volumen wird mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

3.7.	Phosphor-Standardlösung 1 mg je ml: 4,387 g Kaliumdihydrogenphosphat, KH2PO4, werden in Wasser gelöst. Das Volumen wird mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

4.   Geräte

4.1.	Veraschungsschalen aus Quarzglas, Platin oder Porzellan.

4.2.	Elektrischer Muffelofen mit Thermostat auf 550 oC eingestellt.

4.3.	Kjeldahl-Kolben, 250 ml.

4.4.	Messkolben und Präzisions-Pipetten.

4.5.	Spektralfotometer.

4.6.	Reagenzgläser, ca. 16 mm Durchmesser, mit Stopfen graduiert bis zu 14,5 mm Durchmesser; Fassungsvermögen: 25 bis 30 ml.

5.   Verfahren

5.1.   Vorbereitung der Lösung

Je nach der Art der Probe wird die Lösung, wie unter 5.1.1 oder 5.1.2 angegeben, vorbereitet.

5.1.1.   Allgemeines Verfahren

Von der Probe werden 1 g oder mehr auf 1 mg genau in einen Kjeldahl-Kolben eingewogen und mit 20 ml Schwefelsäure (3.5) versetzt; dann wird geschüttelt, um das Material vollständig mit der Säure zu benetzen und um zu verhindern, dass es an den Wandungen des Kolbens anhaftet; anschließend wird der Kolben erhitzt und 10 min im Sieden gehalten. Nach geringem Abkühlen werden 2 ml Salpetersäure (3.4) hinzugefügt; es wird schwach erhitzt und wieder etwas abgekühlt. Dann wird noch ein wenig Salpetersäure (3.4) hinzugegeben und erneut zum Sieden erhitzt. Das Verfahren wird so oft wiederholt, bis die Lösung farblos geworden ist. Hierauf wird abgekühlt, etwas Wasser zugesetzt und die Flüssigkeit in einen 500-ml-Messkolben überführt, wobei der Kjeldahl-Kolben mit heißem Wasser ausgespült wird. Nach Abkühlen wird mit Wasser zur Marke aufgefüllt, homogenisiert und filtriert.

5.1.2.   Verfahren für Proben, die organische Stoffe enthalten, aber frei sind von Calcium- bzw. Magnesiumdihydrogenphosphaten

Von der Probe werden 2,5 g auf 1 mg genau in eine Veraschungsschale eingewogen und mit 1 g Calciumcarbonat (3.1) vollständig vermischt. Im Muffelofen wird bei 550 oC verascht, bis die Asche weiß oder grau ist (kleine Mengen Kohle stören nicht). Die Asche wird in ein 250-ml-Becherglas gebracht, 20 ml Wasser und so viel Salzsäure (3.2) zugefügt, bis das Aufbrausen ausbleibt. Zuletzt werden weitere 10 ml Salzsäure (3.2) zugegeben. Dann wird das Becherglas auf ein Sandbad gestellt und bis zur Trockne eingedampft, um die Kieselsäure unlöslich zu machen. Der Rückstand wird in 10 ml Salpetersäure (3.3) aufgenommen und 5 min lang auf dem Sandbad oder der Heizplatte zum Sieden erhitzt, wobei der Rückstand nicht ganz trocken werden darf. Die Flüssigkeit wird in einen 500-ml-Messkolben übergespült, wobei das Becherglas mehrmals mit heißem Wasser ausgewaschen wird. Nach Abkühlen wird mit Wasser zur Marke aufgefüllt, homogenisiert und filtriert.

5.2.   Entwicklung der Färbung und Messung der Extinktion

Ein aliquoter Teil des nach 5.1.1 oder 5.1.2 erhaltenen Filtrats wird verdünnt, um eine Konzentration an Phosphor von höchstens 40 μg/ml zu erhalten. Von dieser Lösung werden 10 ml in ein Reagenzglas (4.6) pipettiert und 10 ml Vanadat-Molybdat-Reagenz (3.6) hinzugefügt. Das Reagenzglas wird geschüttelt und dann mindestens 10 min bei einer Temperatur von 20 oC stehen gelassen. Anschließend wird die Extinktion im Spektralfotometer bei 430 nm gegen eine Lösung von 10 ml Wasser und 10 ml Vanadat-Molybdat-Reagenz (3.6) gemessen.

5.3.   Kalibrationskurve

Aus der Standardlösung (3.7) werden Lösungen hergestellt, die 5, 10, 20, 30 bzw. 40 μg Phosphor je ml enthalten. Zu jeweils 10 ml dieser Lösungen werden 10 ml Vanadat-Molybdat-Reagenz (3.6) hinzugefügt. Das Reagenzglas wird geschüttelt und dann mindestens 10 min bei einer Temperatur von 20 oC stehen gelassen. Dann wird die Extinktion entsprechend den unter 5.2 genannten Bedingungen gemessen. Die Kalibrationskurve wird aufgestellt, indem die Extinktionswerte auf der Ordinate und die entsprechende Phosphormenge auf der Abszisse aufgetragen werden. Bei Phosphorkonzentrationen von 0 bis 40 μg/ml ist die Kurve linear.

6.   Berechnung der Ergebnisse

Der Phosphorgehalt der Analysenprobe wird mithilfe der Kalibrationskurve bestimmt.

Das Ergebnis ist als Prozentsatz der Probe auszudrücken.

Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

—	3 % relativ zum höheren Wert bei einem Phosphorgehalt von unter 5 %,

—	0,15 % absolut bei einem Phosphorgehalt von mehr als 5 %.

Q.   BESTIMMUNG DES CHLORGEHALTS AUS CHLORIDEN

1.   Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Chlorsgehalts aus wasserlöslichen Chloriden, herkömmlicherweise als Natriumchlorid bezeichnet. Sie ist bei allen Futtermitteln anwendbar.

2.   Prinzip

Die Chloride werden in Wasser gelöst. Handelt es sich um Erzeugnisse, die organische Stoffe enthalten, wird eine Klärung vorgenommen. Die Lösung wird mittels Salpetersäure schwach angesäuert, und die Chloride werden mit einer Silbernitratlösung als Silberchlorid gefällt. Der Silbernitratüberschuss wird mit einer Ammoniumthiocyanatlösung nach der Volhard-Methode zurücktitriert.

3.   Reagenzien

3.1.	Ammoniumthiocyanatlösung 0,1 mol/l.

3.2.	Silbernitratlösung 0,1 mol/l.

3.3.	Gesättigte Ammonium-Eisen(III)-Sulfatlösung (NH4)Fe(SO4)2.

3.4.	Salpetersäure, Dichte: 1,38 g/ml.

3.5.	Diethylether.

3.6.

Aceton.

3.7.	Carrez-Lösung I: 21,9 g Zinkacetat, Zn (CH3COO)2·2H2O, und 3 g Eisessig werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.8.	Carrez-Lösung II: 10,6 g Kaliumhexacyanoferrat(II), K4Fe(CN)6·3H2O, werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.9.	Aktivkohle, chloridfrei und keine Chloride adsorbierend.

4.   Geräte

Mechanisches Schüttelgerät, ca. 35 bis 40 min-1.

5.   Verfahren

5.1.   Vorbereitung der Lösung

Je nach der Art der Probe wird, wie unter 5.1.1, 5.1.2 oder 5.1.3 beschrieben, eine Lösung hergestellt.

Gleichzeitig ist ein Blindversuch ohne die zu analysierende Probe durchzuführen.

5.1.1.   Proben, die frei von organischen Stoffen sind

Eine Menge von höchstens 10 g der Analysenprobe mit einem Gehalt von höchstens 3 g Chlor in Form von Chloriden wird auf 1 mg genau abgewogen und in einen 500-ml-Messkolben mit 400 ml Wasser von etwa 20 oC gebracht. Dann wird 30 min lang in dem Schüttelgerät rotiert, zur Marke aufgefüllt, homogenisiert und filtriert.

5.1.2.   Proben, die organische Stoffe enthalten (mit Ausnahme der unter 5.1.3 angeführten Erzeugnisse)

Etwa 5 g der Analysenprobe werden auf 1 mg genau eingewogen und mit 1 g Aktivkohle in einen 500-ml-Messkolben gebracht. Hierzu werden 400 ml Wasser von etwa 20 oC und 5 ml Carrez-Lösung I (3.7) gegeben, 30 s gerührt und anschließend 5 ml Carrez-Lösung II (3.8) zugesetzt. Dann wird 30 min lang in dem Schüttelgerät rotiert, zur Marke aufgefüllt, homogenisiert und filtriert.

5.1.3.   Backfutter, Leinkuchen und Leinmehl, Erzeugnisse mit einem hohen Leinmehlgehalt oder sonstige Erzeugnisse mit einem hohen Gehalt an Pflanzenschleim oder kolloidalen Stoffen (z. B. verkleisterte Stärke)

Die Lösung wird, wie unter 5.1.2 beschrieben, zubereitet, jedoch nicht filtriert. Es wird dekantiert (falls erforderlich, zentrifugiert); dann werden 100 ml der überstehenden Lösung in einen 200-ml-Messkolben pipettiert. Es wird mit Aceton (3.6) gemischt und mit demselben Lösungsmittel zur Marke aufgefüllt, homogenisiert und filtriert.

5.2.   Titration

Von dem Filtrat, das nach 5.1.1, 5.1.2 oder 5.1.3 erhalten wurde, werden (je nach dem zu erwartenden Chlorgehalt) 25 bis 100 ml in einen Erlenmeyerkolben pipettiert. Die aliquote Menge darf höchstens 150 mg Chlor (Cl) enthalten. Falls erforderlich, wird mit Wasser auf mindestens 50 ml verdünnt. Dann werden 5 ml Salpetersäure (3.4), 20 ml der gesättigten Ammonium-Eisen(III)-Sulfatlösung (3.3) und 2 Tropfen Ammoniumthiocyanatlösung (3.1) aus einer bis zum Nullpunkt gefüllten Bürette hinzugesetzt. Anschließend wird aus einer Bürette Silbernitratlösung (3.2) zugegeben, bis ein Überschuss von 5 ml vorhanden ist. Dann werden 5 ml Diethylether (3.5) zugegeben, und es wird kräftig geschüttelt, um den Niederschlag zum Ausflocken zu bringen. Der Überschuss an Silbernitrat wird mit Ammoniumthiocyanatlösung (3.1) titriert, bis eine rotbraune Farbe auftritt, die 1 min beständig ist.

6.   Berechnung der Ergebnisse

Die Menge Chlor (X), ausgedrückt als % Natriumchlorid, wird nach folgender Formel berechnet:

wobei:

V1	=	zugegebene Silbernitratlösung 0,1 mol/l, in ml,
V2	=	Ammoniumthiocyanatlösung 0,1 mol/l, die für die Titration verbraucht werden, in ml,
m	=	Probeneinwaage in g.

Falls der Blindversuch einen Verbrauch an Silbernitratlösung 0,1 mol/l anzeigt, wird dieser Wert von dem Volumen (V1-V2) abgezogen.

7.   Bemerkungen

7.1.	Die Titration kann auch mit der potenziometrischen Methode erfolgen.

7.2.	Bei sehr fettreichen Erzeugnissen ist eine vorherige Entfettung mit Diethylether oder Petrolether durchzuführen.

7.3.	Bei Fischmehl kann die Titration nach der Mohr-Methode durchgeführt werden.

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(1)  Für die Trocknung von Getreide, Mehl, Grütze und Grieß muss der Trockenschrank eine Wärmekapazität haben, mit der er nach Beladung mit der Höchstzahl gleichzeitig zu trocknender Proben die voreingestellte Temperatur von 131 oC in weniger als 45 min wieder erreicht. Die Lüftung muss so beschaffen sein, dass die Ergebnisse nach 2-stündiger Trocknung einer sein gesamtes Fassungsvermögen auslastenden Anzahl an Weichweizenproben von den Ergebnissen nach 4-stündiger Trocknung um weniger als 0,15 % abweichen.

(2)  Soll das Öl oder Fett später einer Qualitätsprüfung unterzogen werden, sind die Bimssteinkörner durch Glasperlen zu ersetzen.

(3)  ABl. L 125 vom 23.5.1996, S. 35.