ISSN 1977-0634

Den Europæiske Unions

Tidende

L 247

European flag  

Dansk udgave

Retsforskrifter

62. årgang
26. september 2019


Indhold

 

II   Ikke-lovgivningsmæssige retsakter

Side

 

 

FORORDNINGER

 

*

Kommissionens forordning (EU) 2019/1390 af 31. juli 2019 om ændring med henblik på tilpasning til den tekniske udvikling af bilaget til forordning (EF) nr. 440/2008 om fastlæggelse af forsøgsmetoder i henhold til Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1907/2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for kemikalier (REACH) ( 1 )

1

 


 

(1)   EØS-relevant tekst

DA

De akter, hvis titel er trykt med magre typer, er løbende retsakter inden for rammerne af landbrugspolitikken og har normalt en begrænset gyldighedsperiode.

Titlen på alle øvrige akter er trykt med fede typer efter en asterisk.


II Ikke-lovgivningsmæssige retsakter

FORORDNINGER

26.9.2019   

DA

Den Europæiske Unions Tidende

L 247/1


KOMMISSIONENS FORORDNING (EU) 2019/1390

af 31. juli 2019

om ændring med henblik på tilpasning til den tekniske udvikling af bilaget til forordning (EF) nr. 440/2008 om fastlæggelse af forsøgsmetoder i henhold til Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1907/2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for kemikalier (REACH)

(EØS-relevant tekst)

EUROPA-KOMMISSIONEN HAR —

under henvisning til traktaten om Den Europæiske Unions funktionsmåde,

under henvisning til Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1907/2006 af 18. december 2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for kemikalier (REACH), om oprettelse af et europæisk kemikalieagentur og om ændring af direktiv 1999/45/EF og ophævelse af Rådets forordning (EØF) nr. 793/93 og Kommissionens forordning (EF) nr. 1488/94 samt Rådets direktiv 76/769/EØF og Kommissionens direktiv 91/155/EØF, 93/67/EØF, 93/105/EF og 2000/21/EF (1), særlig artikel 13, stk. 2, og

ud fra følgende betragtninger:

(1)

Kommissionens forordning (EF) nr. 440/2008 (2) indeholder de forsøgsmetoder, der skal anvendes til at bestemme kemikaliers fysisk-kemiske egenskaber, toksicitet og økotoksicitet med henblik på forordning (EF) nr. 1907/2006.

(2)

Organisationen for Økonomisk Samarbejde og Udvikling (OECD) udarbejder harmoniserede og internationalt anerkendte testvejledninger om testning af kemikalier i reguleringsøjemed. OECD udsteder regelmæssigt nye og reviderede testvejledninger, som tager højde for den videnskabelige udvikling på området.

(3)

For at tage højde for den tekniske udvikling og om muligt mindske antallet af dyr, der anvendes til forsøg, i overensstemmelse med artikel 13, stk. 2, i forordning (EF) nr. 1907/2006 bør der efter vedtagelsen af relevante OECD-testvejledninger fastlægges to nye forsøgsmetoder til vurdering af økotoksicitet og ni nye forsøgsmetoder til bestemmelse af toksiciteten for menneskers sundhed, og syv forsøgsmetoder bør opdateres. 11 af disse forsøgsmetoder vedrører in vitro-test for øjen- og hudirritation/-ætsning, hudsensibilisering, genotoksicitet og endokrine virkninger. De interesserede parter er blevet hørt om den foreslåede ændring.

(4)

Forordning (EF) nr. 440/2008 bør derfor ændres i overensstemmelse hermed.

(5)

Foranstaltningerne i denne forordning er i overensstemmelse med udtalelse fra det udvalg, der er nedsat ved artikel 133 i forordning (EF) nr. 1907/2006 —

VEDTAGET DENNE FORORDNING:

Artikel 1

Bilaget til forordning (EF) nr. 440/2008 ændres som angivet i bilaget til denne forordning.

Artikel 2

Denne forordning træder i kraft på tyvendedagen efter offentliggørelsen i Den Europæiske Unions Tidende.

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat.

Udfærdiget i Bruxelles, den 31. juli 2019.

På Kommissionens vegne

Jean-Claude JUNCKER

Formand


(1)  EUT L 396 af 30.12.2006, s. 1.

(2)  Kommissionens forordning (EF) nr. 440/2008 af 30. maj 2008 om fastlæggelse af forsøgsmetoder i henhold til Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1907/2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for kemikalier (REACH) (EUT L 142 af 31.5.2008, s. 1).


BILAG

I bilaget til forordning (EF) nr. 440/2008 foretages følgende ændringer:

(1)

Del B, kapitel B.4, affattes således:

"B.4   AKUT HUDIRRITATION/-ÆTSNING

INDLEDNING

1.

Denne forsøgsmetode svarer til OECD-testvejledning (Test Guideline (TG)) 404 (2015). OECD-vejledningerne om testning af kemikalier (Guidelines for Testing of Chemicals) revideres regelmæssigt for at sikre, at de afspejler den bedste tilgængelige viden. Ved revisionen af OECD TG 404 er der lagt særlig vægt på forbedringer i relation til betænkeligheder omkring dyrenes velfærd og vurdering af alle foreliggende oplysninger om testkemikaliet med henblik på at undgå unødvendige forsøg med laboratoriedyr. Den opdaterede version af OECD TG 404 (der oprindeligt blev vedtaget i 1981 og revideret i 1992, 2002 og 2015) indeholder en henvisning til det vejledende dokument om integrerede tilgange til testning og vurdering (IATA) for hudirritation/-ætsning (1), som foreslår en modulær tilgang til testning for hudirritation og -ætsning. IATA beskriver flere moduler, som grupperer informationskilder og analyseværktøjer, og i) vejleder i, hvordan eksisterende forsøgsdata og ikke-forsøgsdata integreres i og anvendes til vurdering af kemikaliers hudirritations-/hudætsningspotentiale, og ii) foreslår en tilgang, når der er behov for yderligere testning (1). Når det er nødvendigt, anbefales det desuden i vejledningen, at man i den indledende in vivo-test anbringer de tre testlapper successivt i stedet for samtidigt på dyret.

2.

Definitionerne af hudirritation og -ætsning findes i tillægget til denne forsøgsmetode.

INDLEDENDE OVERVEJELSER

3.

Både den videnskabelige kvalitet og dyrenes velfærd fremmes ved, at in vivo-testning ikke udføres, før alle relevante data om testkemikaliets potentielle hudætsende eller hudirriterende egenskaber er vurderet ved en weight-of-the-evidence-analyse (WoE) som nævnt i det vejledende dokument om integrerede tilgange til testning og vurdering for hudætsning og -irritation, dvs. gennem det vejledende dokuments tre dele og deres tilsvarende moduler (1). Kort fortalt ses der i del 1 på eksisterende data gennem syv moduler, som omfatter data fra mennesker, in vivo-data, in vitro-data, data om fysisk-kemiske egenskaber (f.eks. pH, navnlig kemikaliets stærkt sure eller basiske egenskaber) og ikke-forsøgsmetoder. I del 2 udføres WoE-analysen. Hvis denne WoE-analyse stadig er usikker, bør del 3 udføres med yderligere testning startende med in vitro-metoder, og in vivo-testning anvendes som en sidste udvej. Analysen bør derfor mindske behovet for in vivo-testning til bestemmelse af testkemikaliers hudætsende/-irriterende egenskaber, for hvilke der allerede foreligger tilstrækkelig dokumentation fra andre undersøgelser vedrørende disse to endepunkter.

IN VIVO-TESTENS PRINCIP

4.

En enkelt dosis af testkemikaliet påføres på huden af et forsøgsdyr. De ubehandlede hudområder på dyret tjener som kontrol. Graden af irritation/ætsning bestemmes og klassificeres med de foreskrevne intervaller og beskrives yderligere med henblik på at give en fuldstændig evaluering af virkningerne. Undersøgelsen skal strække sig over tilstrækkelig lang tid til, at de iagttagne virkningers reversibilitet eller irreversibilitet kan vurderes.

5.

Dyr, som viser vedvarende tegn på stærk lidelse og/eller smerte i en hvilken som helst del af forsøget, aflives humant, og testkemikaliet vurderes tilsvarende. Kriterierne for beslutningen om human aflivning af døende og stærkt lidende dyr kan findes i et separat vejledende dokument (2).

FORBEREDELSE AF IN VIVO-TESTEN

Valg af dyreart

6.

Det foretrukne forsøgsdyr er albinokaninen, og der anvendes raske unge voksne dyr. Anvendes andre arter, skal dette valg begrundes.

Klargøring af dyrene

7.

Ca. 24 timer før forsøget fjernes pelsen ved tæt klipning af dyrenes ryg. Der drages omsorg for ikke at beskadige huden, og kun dyr med sund, intakt hud må anvendes.

8.

Visse kaninstammer har pletter med tæt hårvækst, som er mere eller mindre fremtrædende, afhængigt af årstiden. Sådanne områder med tæt hårvækst bør ikke anvendes som testområder.

Miljø og fodringsbetingelser

9.

Dyrene bør holdes i hvert sit bur. Temperaturen i forsøgslokalet bør være 20 °C (± 3 °C) for kaniner. Den relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og helst ikke over 70 %, hvilket dog ikke gælder under rengøring af lokalet, men 50-60 % bør tilstræbes. Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder og fri adgang til drikkevand.

TESTPROCEDURE

Påføring af testkemikaliet

10.

Testkemikaliet påføres på et lille område (ca. 6 cm2) af huden og dækkes med en gazelap, som holdes på plads med en ikke-hudirriterende klæbestrimmel. Hvis der anvendes testkemikalier i væskeform eller pastaform, kan det være nødvendigt at påføre testkemikaliet på gazelappen og derefter placere lappen på huden. I eksponeringsperioden bør testkemikaliet holdes i løs kontakt med huden ved hjælp af en passende semiokklusiv forbinding. Hvis testkemikaliet påføres på gazelappen, bør denne fastgøres til huden, således at der er god kontakt og ensartet fordeling af testkemikaliet på huden. Dyret må ikke have adgang til gazelappen og skal være forhindret i at kunne indtage eller inhalere testkemikaliet.

11.

Testkemikalier i væskeform anvendes sædvanligvis ufortyndet. Ved testning af faste stoffer, som – hvis det er hensigtsmæssigt – kan pulveriseres, skal testkemikaliet fugtes tilstrækkeligt med den mindst mulige mængde vand eller om nødvendigt med et passende bærestof for at sikre god kontakt med huden. Anvendes andre bærestoffer end vand, må dette kun have minimal indflydelse på testkemikaliets hudirriterende virkning.

12.

Ved slutningen af eksponeringsperioden, som normalt er 4 timer, fjernes tilbagesiddende testkemikalie så vidt muligt ved hjælp af vand eller et egnet opløsningsmiddel, idet det undgås at påvirke den fremkomne respons eller beskadige epidermis.

Dosisniveau

13.

Testarealet påføres 0,5 ml flydende eller 0,5 g fast eller halvflydende testkemikalie.

Indledende test (in vivo-test af hudirritation/-ætsning i ét dyr)

14.

Når et testkemikalie er bedømt som ætsende, irriterende eller ikke-klassificeret på grundlag af en weight-of-the-evidence-analyse eller forudgående in vitro-testning, er der sædvanligvis ikke behov for yderligere in vivo-testning. I tilfælde, hvor der menes at være behov for yderligere data, udføres in vivo-testen først i ét dyr efter følgende fremgangsmåde: Der anbringes successivt op til tre testlapper på dyret. Den første lap fjernes efter tre minutter. Ses ingen alvorlig hudreaktion, anbringes en ny testlap på et andet område, som fjernes efter en time. Viser observationerne på dette trin, at eksponeringen humant kan udvides til 4 timer, anbringes en tredje lap, som fjernes efter 4 timer, hvorpå responsen vurderes.

15.

Iagttages en ætsende virkning efter en af de tre successive eksponeringer, afsluttes testen straks. Iagttages ingen ætsende virkning, efter at den sidste lap er fjernet, observeres dyret i 14 dage, medmindre der udvikler sig ætsning på et tidligere tidspunkt.

16.

I tilfælde, hvor testkemikaliet ikke forventes at frembringe ætsning, men kan være irriterende, anbringes en enkelt lap på ét dyr i 4 timer.

Verifikationstest (in vivo-hudirritationstest i flere dyr)

17.

Er der ikke iagttaget ætsende virkning i den indledende test, skal den irriterende eller negative respons verificeres i indtil to yderligere dyr, hver gang med én lap, i en eksponeringsperiode på 4 timer. Iagttages en irriterende virkning i den indledende test, kan verifikationstesten udføres sekventielt eller ved eksponering af yderligere to dyr samtidigt. Er den indledende test undtagelsesvis ikke udført, kan to eller tre dyr behandles med én enkelt lap, som fjernes efter 4 timer. Anvendes to dyr, som begge udviser samme respons, er yderligere testning unødvendig. I modsat fald testes også det tredje dyr. Er responsen usikker, kan det være nødvendigt at evaluere resultaterne ved brug af flere dyr.

Observationsperiode

18.

Observationsperioden bør strække sig over tilstrækkelig lang tid til, at de iagttagne virkningers reversibilitet kan vurderes fuldt ud. Forsøget skal imidlertid afsluttes, når som helst dyrene viser vedvarende tegn på stærk smerte eller lidelse. For at bestemme virkningernes reversibilitet skal dyrene observeres i indtil 14 dage efter lappernes fjernelse. Observeres der reversibilitet inden for 14 dage, afsluttes forsøget på dette tidspunkt.

Kliniske observationer og klassificering af hudreaktioner

19.

Alle dyr undersøges for tegn på erythem og ødem, og responsen tildeles score-værdi ved 60 minutter og derefter ved 24, 48 og 72 timer efter lappernes fjernelse. I den indledende test i ét dyr undersøges testområdet desuden straks efter lappernes fjernelse. Hudreaktioner klassificeres og registreres efter klassificeringen i nedenstående tabel. Er der hudskade, som ikke kan identificeres som irritation eller ætsning ved 72 timer, kan det være nødvendigt at fortsætte observationen indtil dag 14 for at fastslå virkningernes reversibilitet. Foruden observationen for irritation skal alle lokale toksiske virkninger, såsom tab af hudens fedtindhold, og alle systemiske bivirkninger (f.eks. kliniske symptomer på toksicitet samt kropsvægt) beskrives fuldstændigt og registreres. Til afklaring af en usikker respons bør histopatologisk undersøgelse indgå i vurderingen.

20.

Klassificering af hudrespons er nødvendigvis subjektiv. For at give en mere ensartet klassificering af hudresponsen og for at bistå testlaboratorierne og dem, som foretager og fortolker observationerne, skal observationerne foretages af personer, som er tilstrækkeligt fortrolige med det anvendte score-system (se nedenstående tabel). Det kan være nyttigt at anvende en illustreret vejledning i klassificering af hudirritation og andre læsioner (3).

DATA OG RAPPORTERING

21.

Undersøgelsens resultater, som sammenfattes i tabelform i den endelige testrapport, skal dække alle de punkter, der er oplistet i punkt 24.

Vurdering af resultater

22.

Score-værdierne for hudirritation vurderes sammen med læsionernes art, sværhedsgrad og reversibilitet eller manglende reversibilitet. De enkelte score-værdier repræsenterer ikke en absolut standard for et kemikalies irritationsfremkaldende egenskaber, da andre virkninger af testkemikaliet ligeledes vurderes. I stedet må de enkelte score-værdier betragtes som referenceværdier, som skal evalueres sammen med alle undersøgelsens øvrige observationer.

23.

Hudlæsionernes reversibilitet skal tages i betragtning ved evaluering af irritationsrespons. Hvis respons som alopeci (af et begrænset område), hyperkeratose, hyperplasi og skældannelse varer ved frem til afslutningen af den 14-dages observationsperiode, anses testkemikaliet for at være irriterende.

Testrapport

24.

Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:

 

Begrundelse for in vivo-testning:

Weight-of-the-evidence-analyse af allerede foreliggende testdata, herunder resultater af den sekventielle teststrategi

beskrivelse af relevante data fra tidligere forsøg

data fra de enkelte trin i teststrategien

beskrivelse af udførte in vitro-test med detaljeret beskrivelse af de anvendte procedurer og resultater opnået med test- og referencestof

weight-of-the-evidence-analyse med henblik på udførelse af in vivo-undersøgelse.

 

Testkemikalie:

Stof med kun én bestanddel: kemisk identifikation, f.eks. IUPAC-navn eller CAS-navn, CAS-nummer, SMILES- eller InChI-kode, strukturformel, renhed, kemisk identitet af urenheder, i det omfang det er relevant og praktisk muligt, osv.

Stof med flere bestanddele, blandinger og stoffer med ukendt eller variabel sammensætning, komplekse reaktionsprodukter eller biologiske materialer (UVCB): så vidt muligt kendetegnet ved kemisk identitet (jf. ovenfor), kvantitativ forekomst og bestanddelenes relevante fysisk-kemiske egenskaber

fysisk udseende, vandopløselighed og yderligere relevante fysisk-kemiske egenskaber

oprindelse, evt. batchnummer

behandling af testkemikaliet/kontrolstoffet inden testning, hvis det er relevant (f.eks. opvarmning, formaling)

testkemikaliets stabilitet, sidste anvendelsesdato eller dato for ny analyse, hvis dette er kendt

opbevaringsforhold.

 

Bærestof:

identifikation, koncentration (hvis relevant), anvendt mængde

begrundelse for valg af bærestof.

 

Forsøgsdyr:

anvendt art/stamme, begrundelse for anvendelse af andre dyr end albinokaniner

antal dyr af hvert køn

de enkelte dyrs vægt ved testens begyndelse og afslutning

alder ved undersøgelsens begyndelse

dyrenes oprindelse, miljøbetingelser, foder osv.

 

Testbetingelser:

metode til forberedelse af det sted, hvor lappen skal anbringes

oplysninger om anvendte lapmaterialer og metode til anbringelse af lapper

oplysninger om testkemikaliets forberedelse, påføring og fjernelse.

 

Resultater:

opstilling i tabelform af score-værdier for irritation/ætsning for hvert dyr på alle måletidspunkter

beskrivelse af alle iagttagne læsioner

forklarende beskrivelse af art og grad af den iagttagne irritation eller ætsning samt eventuelle histopatologiske fund

beskrivelse af andre skadelige lokale (f.eks. tab af hudens fedtindhold) og systemiske virkninger foruden hudirritation eller -ætsning.

 

Diskussion af resultater

 

Konklusioner

LITTERATUR

(1)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(2)

OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

Tabel

Klassificering Af Hudreaktioner

Intet erythem…

0

Meget let erythem (knapt synligt)…

1

Veldefineret erythem…

2

Moderat til svært erythem…

3

Svært erythem (oksekødsfarvet) til escharadannelse, som umuliggør klassificering af erythemet ……

4

Maksimumsværdi: 4

Intet ødem…

0

Meget let ødem (knapt synligt)…

1

Let ødem (tydeligt afgrænset hævet område)…

2

Moderat ødem (hævet ca. 1 mm)…

3

Svært ødem (hævet mere end 1 mm og udstrækning ud over det eksponerede område)…

4

Maksimumsværdi: 4

Til afklaring af en usikker respons kan histopatologisk undersøgelse indgå i vurderingen.

Tillæg

DEFINITIONER

Kemikalie: et stof eller en blanding.

Hudirritation: fremkaldelse af reversibel skade på huden ved påføring af et testkemikalie i indtil 4 timer.

Hudætsning: fremkaldelse af irreversibel skade på huden, dvs. synlig nekrose gennem epidermis og ned i dermis efter påføring af et testkemikalie i indtil 4 timer. Typiske ætsningsreaktioner er sår, blødning og blodige skorper og efter 14 dages observation affarvning som følge af blegning af huden, hele områder med alopeci samt ardannelse. Tvivlsomme læsioner bør overvejes vurderet ved histopatologisk undersøgelse.

Testkemikalie: et stof eller en blanding, der testes med denne forsøgsmetode.

"

(2)

Del B, kapitel B.17, affattes således:

"B.17   IN VITRO-TEST FOR GENMUTATION I PATTEDYRCELLER VED ANVENDELSE AF HPRT- OG XPRT-GENER

INDLEDNING

1.

Denne forsøgsmetode (TM) svarer til OECD’s testvejledning (Test Guideline) 476 (2016). Forsøgsmetoderne revideres regelmæssigt på baggrund af den videnskabelige udvikling, skiftende reguleringsbehov og dyrevelfærdshensyn. Den aktuelle reviderede version af TM B.17 afspejler næsten 30 års erfaring med denne test og er desuden et resultat af udviklingen af en ny separat metode til in vitro-test for genmutation i pattedyrceller ved anvendelse af thymidin-kinase-genet. TM B.17 er en del af en række forsøgsmetoder vedrørende genetisk toksikologi. OECD har udarbejdet et dokument, som indeholder kortfattede oplysninger om testning for genetisk toksikologi og en oversigt over de seneste ændringer af OECD’s testvejledning om genetisk toksicitet (1).

2.

Formålet med in vitro-testen for genmutation i pattedyrceller er at påvise genmutationer, som induceres af kemikalier. De cellelinjer, der anvendes i disse test, måler fremadmutation i reportergener, mere specifikt det endogene hypoxanthin-guanin-phosphoribosyl-transferase-gen (Hprt i gnaverceller og HPRT i humane celler, kollektivt benævnt Hprt-gen og HPRT-test i denne forsøgsmetode) og transgenet af xanthin-guanin-phosphoribosyl-transferase (gpt) (benævnt XPRT-testen). I HPRT- og XPRT-mutationstestene påvises forskellige spektre af genetiske hændelser. Ud over de mutationshændelser, der påvises ved HPRT-testen (f.eks. baseparsubstitutioner, frameshifts, små deletioner og insertioner), kan den autosomale placering af gpt-transgenet muliggøre påvisning af mutationer som følge af større deletioner og muligvis mitotisk rekombination, som ikke kan påvises ved HPRT-test, da Hprt-genet er placeret på X-kromosomet (2) (3) (4) (5) (6) (7). XPRT anvendes for øjeblikket ikke så meget som HPRT-testen i lovgivningsøjemed.

3.

De anvendte definitioner er forklaret i tillæg 1.

INDLEDENDE OVERVEJELSER OG BEGRÆNSNINGER

4.

Normalt kræver en in vitro-test, at der benyttes en eksogen kilde til metabolismeaktivering. Det eksogene metabolismeaktiveringssystem efterligner ikke helt in vivo-betingelserne.

5.

Der bør omhyggeligt undgås betingelser, som kunne føre til et artefakt positivt resultat (dvs. eventuel interaktion med testsystemet), der ikke skyldes direkte interaktion mellem testkemikalierne og cellens genetiske materiale. Disse betingelser omfatter ændringer i pH eller osmolalitet (8) (9) (10), interaktion med mediets komponenter (11) (12) eller for høje cytotoksicitetsniveauer (13). En cytotoksisk effekt, der er højere end det højst anbefalede cytotoksicitetsniveau, jf. punkt 19, anses for at være for højt til HPRT-testen.

6.

Før forsøgsmetoden bruges på en blanding for at generere data i lovgivningsøjemed, bør det overvejes, om den vil give resultater, som er egnede til formålet, og i givet fald hvorfor. Sådanne overvejelser er ikke nødvendige, når der foreligger et myndighedskrav om testning af blandingen.

PRINCIP FOR TESTEN

7.

Mutantceller, der mangler Hprt-enzymaktivitet i HPRT-testen eller xprt-enzymaktivitet i XPRT-testen, er resistente over for de cytostatiske virkninger af purinanalogen 6-thioguanin (TG). Celler, som har Hprt (i HPRT-testen) eller gpt (i XPRT-testen), er følsomme over for TG, som inhiberer cellemetabolismen og standser den videre celledeling. Det betyder, at mutantceller kan formere sig under tilstedeværelse af TG, mens normale celler, der indeholder Hprt- (i HPRT-testen) eller gpt-enzymet (i XPRT-testen), ikke kan.

8.

Celler i suspensionskultur eller enkeltlagskultur eksponeres for testkemikaliet både med og uden eksogen kilde til metabolisk aktivering (jf. punkt 14) i et passende tidsrum (3-6 timer), hvorefter der ved dyrkning i subkultur påvises cytotoksisk effekt og gives mulighed for fænotypeekspression, inden mutanterne udvælges (14) (15) (16) (17). Den cytotoksiske effekt bestemmes ved den relative overlevelse (RS), dvs. kloningseffektiviteten målt umiddelbart efter behandlingsperioden og justeret for ethvert celletab under behandlingen sammenlignet med den negative kontrol (punkt 18 og tillæg 2). Afhængigt af de enkelte celletyper holdes de behandlede kulturer så lang tid i dyrkningsmediet, at fænotypeekspressionen af inducerede mutationer bliver næsten optimal (typisk mindst 7-9 dage). Efter fænotypeekspressionen bestemmes mutantfrekvensen ved udsåning af et kendt antal celler i et medium, der indeholder det selektive stof, til påvisning af mutantkolonier, og i et medium uden selektivt stof til bestemmelse af kloningseffektiviteten (levedygtigheden). Efter en passende inkuberingstid tælles kolonierne. Mutantfrekvensen beregnes ud fra antallet af mutantkolonier korrigeret for kloningseffektiviteten på tidspunktet for mutantudvælgelsen.

BESKRIVELSE AF METODEN

Forberedelser

Celler

9.

For de celletyper, der benyttes i HPRT- og XPRT-test, bør der være påvist følsomhed over for kemiske mutagener, høj kloningseffektivitet, stabil karyotype og stabil spontan mutationsfrekvens. De celler, der sædvanligvis anvendes i HPRT-test, er cellelinjerne CHO, CHL og V79 fra kinesisk hamster, L5178Y-muselymfomceller og de humane lymfoblastceller TK6 (18) (19). CHO-afledte AS52-celler, som indeholder gpt-transgenet (og hvor Hprt-genet er deleteret), anvendes til XPRT-testen (20) (21). HPRT-testen kan ikke udføres i AS52-celler, da hprt-genet er deleteret. Anvendelse af andre cellelinjer bør begrundes og valideres.

10.

Cellelinjerne bør kontrolleres regelmæssigt for et stabilt normalt kromosomtal og fravær af mykoplasmakontaminering (22) (23), og i tilfælde af kontaminering, eller hvis det normale kromosomtal har ændret sig, bør cellerne ikke anvendes. Den normale cyklustid for celler, der benyttes i testlaboratoriet, fastslås og bør være i overensstemmelse med de offentliggjorte celleegenskaber. Den spontane mutantfrekvens i stamcellekulturen bør også kontrolleres, og kulturen bør ikke anvendes, hvis ikke mutantfrekvensen er acceptabel.

11.

Det kan være nødvendigt at rense kulturerne for allerede eksisterende mutantceller, inden de benyttes i denne test, f.eks. ved dyrkning i HAT-medium for HPRT-test og MPA-medium for XPRT-test (5) (24) (jf. tillæg 1). De rensede celler kan kryopræserveres og derefter tøs op og benyttes som arbejdsceller. De nyoptøede arbejdsceller kan benyttes til testen, når den normale fordoblingstid er nået. Ved udførelsen af XPRT-testen bør en rutinemæssig dyrkning af AS52-celler ske under betingelser, der sikrer, at gpt-transgenet bevares (20).

Medier og dyrkningsbetingelser

12.

Til vedligeholdelse af kulturerne benyttes egnede dyrkningsmedier og inkubationsbetingelser (dyrkningsskåle, fugtig atmosfære på 5 % CO2 og inkubationstemperatur på 37 °C). Cellekulturer bør altid vedligeholdes under betingelser, der sikrer, at de vokser i log-fase. Det er især vigtigt at vælge medier og dyrkningsbetingelser, som sikrer, at cellerne vokser optimalt i ekspressionsperioden, og at både mutantcellers og ikke-mutantcellers kloningseffektivitet er optimal.

Fremstilling af kulturer

13.

Cellelinjer opformeres fra stamkulturer og udsås i dyrkningsmedium med en sådan tæthed, at cellerne i suspension eller i encellede lag vil fortsætte med at vokse eksponentielt under behandlings- og ekspressionsperioden (f.eks. bør konfluens undgås for celler, der vokser i encellede lag).

Metabolismeaktivering

14.

Der bør anvendes eksogene metaboliserende systemer, når der benyttes celler med utilstrækkelige endogene metaboliske egenskaber. Det mest almindeligt anvendte system, der som standard anbefales, medmindre der er begrundelse for andet, er en cofaktorsuppleret postmitochondriefraktion (S9), som fremstilles af levere fra gnavere (normalt rotter), der har været behandlet med enzyminducerende stoffer såsom Aroclor 1254 (25) (26) (27) (28) eller en blanding af phenobarbiton og β-naphthoflavon (29) (30) (31) (32). Sidstnævnte blanding er ikke i strid med Stockholmkonventionen om persistente organiske miljøgifte (33) og har vist sig at være lige så effektiv som Aroclor 1254 til induktion af oxidaser med blandet funktion (29) (31). S9-fraktionen anvendes normalt i en koncentration på 1-2 % (v/v), men kan øges til 10 % (v/v) i det færdige testmedium. Valget af type og koncentration af det eksogene metabolismeaktiveringssystem eller det anvendte metaboliske inducerende stof kan afhænge af, hvilken kemisk klasse de testede stoffer tilhører (34) (35) (36).

Præparering af testkemikaliet

15.

Testkemikalier i fast form bør præpareres i passende opløsningsmidler og eventuelt fortyndes inden behandling af cellerne (jf. punkt 16). Testkemikalier i væskeform kan enten tilsættes testsystemet direkte og/eller fortyndes inden behandlingen i testsystemet. Gasser og flygtige testkemikalier bør testes ved passende ændring af standardprotokollerne, f.eks. i forseglede dyrkningsskåle (37) (38). Testkemikaliet bør præpareres umiddelbart inden behandlingen, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabelt.

TESTBETINGELSER

Opløsningsmidler

16.

Opløsningsmidlet vælges for at optimere testkemikaliets opløselighed uden at påvirke testforløbet negativt, f.eks. ved ændring af cellevækst, påvirkning af testkemikaliets integritet, reaktion med dyrkningsskåle eller blokering af metabolismeaktiveringssystemet. Det anbefales så vidt muligt først at overveje at anvende et vandigt opløsningsmiddel (eller dyrkningsmedium). Veletablerede opløsningsmidler er f.eks. vand og dimethylsulfoxid. Generelt bør organiske opløsningsmidler ikke overstige 1 % (v/v), og vandige opløsningsmidler (fysiologisk saltopløsning eller vand) bør ikke overstige 10 % (v/v) af det færdige behandlingsmedium. Hvis ikke de anvendte opløsningsmidler er veletablerede (f.eks. ethanol eller acetone), bør de underbygges af data, der påviser deres kompatibilitet med testkemikaliet og testsystemet og fraværet af genetisk toksicitet ved den anvendte koncentration. Hvis ikke der foreligger sådanne understøttende data, er det vigtigt at medtage ubehandlede kontroller (jf. tillæg 1) for at påvise, at det valgte opløsningsmiddel ikke forårsager skadevirkninger eller mutagene virkninger.

Måling af cytotoksisk effekt og valg af eksponeringskoncentrationer

17.

Ved valg af højeste koncentration af testkemikaliet bør der undgås koncentrationer, som kan frembringe artefakt positive responser, f.eks. koncentrationer, der frembringer for høj cytotoksisk effekt (jf. punkt 20), udfældning i dyrkningsmediet (jf. punkt 21) eller væsentlige ændringer i pH eller osmolalitet (jf. punkt 5). Hvis testkemikaliet frembringer en væsentlig ændring i mediets pH på tilsætningstidspunktet, kan pH-værdien justeres ved bufring af det endelige behandlingsmedium for at undgå artefakt positive resultater og for at opretholde passende dyrkningsbetingelser.

18.

Valget af koncentration baseres på cytotoksisk effekt og andre betragtninger (jf. punkt 20-22). Evaluering af cytotoksisk effekt i en indledende test kan være nyttig for at sikre en bedre definition af de koncentrationer, der skal anvendes i hovedforsøget, men en indledende test er ikke påkrævet. Selv om der foretages en indledende evaluering af den cytotoksiske effekt, skal den cytotoksiske effekt på hver enkelt kultur stadig måles i hovedforsøget. Den cytotoksiske effekt bør evalueres ved anvendelse af RS, dvs. cellernes kloningseffektivitet (CE), når de udplades umiddelbart efter behandling, justeret for ethvert celletab under behandlingen baseret på celletal sammenlignet med den justerede kloningseffektivitet i negative kontroller (med en overlevelsesprocent på 100 %) (jf. formlerne i tillæg 2).

19.

Mindst fire testkoncentrationer (bortset fra opløsningsmiddel og positive kontroller), der opfylder acceptkriterierne (egnet cytotoksisk effekt, antal celler mv.), bør vurderes. Selv om det anbefales at benytte duplikate kulturer, kan der ved hver af de testede koncentrationer også anvendes replikate kulturer eller enkeltkulturer. De resultater, der opnås i uafhængige replikate kulturer ved en given koncentration, bør rapporteres separat, men kan samles med henblik på dataanalyse (17). For testkemikalier, der udviser ringe eller ingen cytotoksisk effekt, vil koncentrationsintervaller på ca. to til tre gange normalt være egnede. Hvis der forekommer cytotoksisk effekt, bør de valgte testkoncentrationer dække et interval fra den koncentration, der frembringer cytotoksisk effekt, til de koncentrationer, hvor der er moderat og ringe eller ingen cytotoksisk effekt. Mange testkemikalier udviser kraftige koncentration/respons-kurver, og for at dække hele cytotoksicitetsintervallet eller undersøge koncentration/respons-forholdet nærmere kan det være nødvendigt at bruge koncentrationer, der ligger tættere på hinanden, og mere end fire koncentrationer, navnlig i situationer, hvor der er behov for at gentage forsøget (jf. punkt 43). Det kan være særligt vigtigt at bruge mere end fire koncentrationer, når der anvendes enkeltkulturer.

20.

Hvis den højeste koncentration er baseret på cytotoksisk effekt, bør den højeste koncentration sigte mod at opnå mellem 20 og 10 % RS. Der bør udvises forsigtighed ved fortolkning af positive resultater, der kun findes ved 10 % RS eller derunder (punkt 43).

21.

For tungtopløselige testkemikalier, der ikke er cytotoksiske ved lavere koncentrationer end den laveste uopløselige koncentration, bør den højeste analyserede koncentration producere uklarheder eller bundfald, som er synligt med det blotte øje eller i et inverteret mikroskop efter afslutningen af behandlingen med testkemikaliet. Selv om der forekommer cytotoksisk effekt over den laveste uopløselige koncentration, tilrådes det at gennemføre testen ved kun én koncentration, der frembringer uklarhed eller synligt bundfald, fordi artefakte virkninger kan skyldes bundfaldet. Ved den koncentration, der frembringer bundfald, bør det omhyggeligt sikres, at bundfaldet ikke griber forstyrrende ind i testens forløb. Det kan være nyttigt at bestemme opløseligheden i dyrkningsmediet inden forsøget.

22.

Hvis ikke der observeres bundfald eller begrænsende cytotoksisk effekt, bør den højeste testkoncentration være 10 mM, 2 mg/ml eller 2 μl/ml (den laveste af de tre) (39) (40). Hvis testkemikaliets sammensætning ikke er defineret, f.eks. et stof af ukendt eller variabel sammensætning, komplekse reaktionsprodukter eller biologiske materialer (dvs. kemiske stoffer af ukendt eller variabel sammensætning (UVCB’er)) (41), miljømæssige udtræk osv., kan det være nødvendigt at øge den højeste koncentration (f.eks. 5 mg/ml) ved manglende tilstrækkelig cytotoksisk effekt for at øge koncentrationen af hver af komponenterne. Det bør dog bemærkes, at disse krav kan variere for humanlægemidler (42).

Kontroller

23.

Der bør under alle forsøgsbetingelser indgå sideløbende negative kontroller (jf. punkt 16), hvor behandlingsmediet kun består af opløsningsmiddel, idet prøverne ellers behandles på samme måde som behandlingskulturerne.

24.

Der skal gennemføres sideløbende positive kontroller for at påvise, at laboratoriet er i stand til at identificere mutagener i henhold til den anvendte testprotokol og effektiviteten af det eksogene metabolismeaktiveringssystem, hvor det er relevant. Eksempler på positive kontroller er anført i tabel 1 nedenfor. Alternative positive kontrolstoffer kan anvendes, hvis der er belæg for det. Fordi in vitro-test af pattedyrceller for genetisk toksicitet er tilstrækkeligt standardiserede, kan der udføres test med behandlinger med eller uden eksogen metabolismeaktivering ved brug af kun én positiv kontrol, som kræver metabolismeaktivering. I dette tilfælde vil denne ene positive kontrolrespons påvise såvel aktiviteten i metabolismeaktiveringssystemet som testsystemets reaktionsevne. Hver positiv kontrol bør anvendes ved en eller flere koncentrationer, der forventes at give reproducerbare og påviselige forøgelser i forhold til baggrundsværdierne, for at påvise testsystemets følsomhed, og responsen bør ikke bringes i fare på grund af cytotoksisk effekt, der overskrider de grænser, som er fastsat i forsøgsmetoden (jf. punkt 20).

Tabel 1

Anbefalede referencestoffer til vurdering af laboratoriets kompetence og udvælgelse af positive kontroller

Metabolismeaktivering

Locus

Stof og CAS-nr.

Ingen eksogen metabolismeaktivering

Hprt

Ethylmethansulfonat [CAS-nr. 62-50-0] Ethylnitrosourea [CAS-nr. 759-73-9] 4-nitroquinolin-1-oxid [CAS-nr. 56-57-5]

 

xprt

Streptonigrin [CAS-nr. 3930-19-6] Mitomycin C [CAS-nr. 50-07-7]

Eksogen metabolismeaktivering

Hprt

3-methylcholanthren [CAS-nr. 56-49-5] 7,12-dimethylbenzanthracen [CAS-nr. 57-97-6] Benzo[a]pyren [CAS-nr. 50-32-8]

 

xprt

Benzo[a]pyren [CAS-nr. 50-32-8]

FREMGANGSMÅDE

Behandling med testkemikalie

25.

Celler under formering behandles med testkemikaliet med og uden tilstedeværelse af et metabolismeaktiveringssystem. Eksponeringen skal vare et passende stykke tid (normalt er 3-6 timer passende).

26.

Det antal celler, der mindst skal anvendes til hver testkultur (kontrol og behandling) i hver enkelt testfase, bør baseres på den spontane mutantfrekvens. En generel retningslinje er at behandle og passere et tilstrækkeligt antal celler til at bevare 10 spontane mutanter i hver kultur i alle testfaser (17). Den spontane mutantfrekvens ligger generelt mellem 5 og 20 × 10-6. For en spontan mutantfrekvens på 5 × 10-6 og for også at opretholde et tilstrækkeligt antal spontane mutanter (10 eller flere) i de kulturer, der behandles ved koncentrationer, som forårsager 90 % cytotoksisk effekt under behandling (10 % RS), skal der behandles mindst 20 × 106 celler. Derudover skal der dyrkes et tilstrækkeligt antal celler (men aldrig under 2 mio.) i ekspressionsperioden, som udplades til mutantudvælgelse (17).

Fænotypeekspressionsperiode og måling af mutantfrekvens

27.

Efter endt behandling dyrkes cellerne med henblik på ekspression af den mutante fænotype. Generelt er et minimum på 7-9 dage tilstrækkeligt til at sikre nær optimal fænotypeekspression af nyligt inducerede Hprt- og xprt-mutanter (43) (44). I denne periode dyrkes cellerne regelmæssigt i subkultur for at opretholde deres eksponentielle vækst. Efter fænotypeekspression udplades cellerne igen i mediet med og uden selektivt stof (6-thioguanin) til bestemmelse af henholdsvis antallet af mutanter og kloningseffektiviteten på udvælgelsestidspunktet. Denne udpladning kan foretages ved anvendelse af skåle til celler i enkeltlagskultur eller mikrotiterplader til celler i suspension. Med henblik på udvælgelse af mutanter bør cellerne udplades med en sådan tæthed, at der sikres optimal mutantrestitution (dvs. at der undgås metabolisk samarbejde) (17). Pladerne inkuberes i et passende tidsrum med henblik på optimal kolonivækst (f.eks. 7-12 dage), og kolonierne tælles. Mutantfrekvensen beregnes ud fra antallet af mutantkolonier korrigeret for kloningseffektiviteten på tidspunktet for mutantudvælgelsen (jf. formlerne i tillæg 2).

Laboratoriets kompetence

28.

For at påvise tilstrækkelig erfaring med testen, før den bruges rutinemæssigt, bør laboratoriet have udført en række forsøg med positive referencekemikalier, som virker via forskellige mekanismer (mindst et aktivt med og et aktivt uden metabolismeaktivering udvalgt blandt stofferne i tabel 1), og forskellige negative kontroller (ved anvendelse af forskellige opløsningsmidler/bærestoffer). Disse positive og negative kontrolresponser bør være i overensstemmelse med litteraturen. Dette gælder ikke for laboratorier, der har erfaring, dvs. som har en historisk database til rådighed som defineret i punkt 30-33.

29.

Et udvalg af positive kontrolstoffer (jf. tabel 1 i punkt 25) bør undersøges med og uden metabolismeaktivering med henblik på at påvise evnen til at påvise mutagene kemikalier, vurdere effektiviteten af metabolismeaktiveringssystemet og påvise egnetheden af cellevækstbetingelserne under behandling, fænotypeekspression og mutantudvælgelse samt af score-proceduren. Der bør vælges en række koncentrationer af de udvalgte stoffer, som giver en reproducerbar og koncentrationsafhængig stigning i forhold til baggrundsværdierne for at påvise testsystemets følsomhed og dynamiske rækkevidde.

Historiske kontroldata

30.

Laboratoriet bør fastlægge:

et historisk positivt kontrolinterval og en historisk positiv kontrolfordeling

et historisk negativt (ubehandlet, opløsningsmiddel) kontrolinterval og en historisk negativ kontrolfordeling.

31.

Når der første gang indhentes data til en historisk negativ kontrolfordeling, bør de sideløbende negative kontroller stemme overens med offentliggjorte kontroldata (22). Efterhånden som der føjes flere forsøgsdata til kontrolfordelingen, bør de sideløbende negative kontroller ideelt set ligge inden for kontrolgrænsen på 95 % af denne fordeling (17) (45) (46).

32.

Laboratoriets database over historiske negative kontroller bør i første omgang opbygges med mindst 10 forsøg, men skal helst bestå af mindst 20 forsøg udført under sammenlignelige forsøgsbetingelser. Laboratorierne bør anvende kvalitetskontrolmetoder som f.eks. kontroldiagrammer (f.eks. C-diagrammer eller X-søjlediagrammer (47)) til at fastslå, hvor variable deres positive og negative kontroldata er, samt vise, at metodologien er "under kontrol" i deres laboratorium (46). Yderligere anbefalinger til, hvordan man opbygger og anvender de historiske data (dvs. kriterier for optagelse og udelukkelse af historiske data og acceptkriterier for et givet forsøg), kan findes i litteraturen (45).

33.

Negative kontroldata bør bestå af mutantfrekvenser fra enkeltkulturer, dog fortrinsvis fra replikate kulturer som beskrevet i punkt 23. Sideløbende negative kontroller bør ideelt set ligge inden for kontrolgrænsen på 95 % af fordelingen i laboratoriets historiske negative kontroldatabase (17) (45) (46). Såfremt dataene for sideløbende negative kontroller falder uden for kontrolgrænsen på 95 %, kan de eventuelt optages i den historiske kontrolfordeling, så længe disse data ikke er ekstreme afvigende værdier, og der er dokumentation for, at testsystemet er "under kontrol" (jf. ovenfor) og for, at der ikke er begået tekniske eller menneskelige fejl.

34.

Der bør i forbindelse med eventuelle ændringer af forsøgsprotokollen tages hensyn til, om de stemmer overens med laboratoriets eksisterende historiske kontroldatabaser. Ved større uoverensstemmelser bør der etableres en ny historisk kontroldatabase.

DATA OG RAPPORTERING

Præsentation af resultaterne

35.

Præsentationen af resultaterne bør omfatte alle de data, der er nødvendige for at beregne den cytotoksiske effekt (udtrykt som RS). Dataene for såvel behandlede kulturer som kontrolkulturer bør omfatte antallet af celler efter endt behandling, antallet af celler, der blev udpladet umiddelbart efter behandlingen, og antallet af kolonier (eller antallet af brønde uden kolonier ved mikrobrøndmetoden). RS for hver kultur bør udtrykkes som en procentdel i forhold til den sideløbende kontrol med opløsningsmiddel (jf. definitioner i tillæg 1).

36.

Præsentationen af resultaterne bør endvidere omfatte alle de data, der er nødvendige for at beregne mutantfrekvensen. Dataene for såvel behandlede kulturer som kontrolkulturer bør omfatte: 1) antallet af celler ved udpladning med og uden selektivt stof (på det tidspunkt, hvor cellerne udplades til mutantudvælgelse) og 2) antallet af optalte kolonier (eller antallet af brønde uden kolonier ved mikrobrøndmetoden) på pladerne med og uden selektivt stof. Mutantfrekvensen beregnes ud fra antallet af mutantkolonier (på pladerne med selektivt stof) korrigeret for kloningseffektiviteten (på pladerne uden selektivt stof). Mutantfrekvensen bør udtrykkes som antal mutantceller pr. million levedygtige celler (jf. definitioner i tillæg 1).

37.

Der anføres data for hver enkelt kultur. Desuden sammenfattes alle data i tabelform.

Acceptkriterier

38.

Accept af en test er baseret på følgende kriterier:

Den sideløbende negative kontrol anses for at kunne føjes til laboratoriets historiske negative kontroldatabase som beskrevet i punkt 33.

Sideløbende positive kontroller (jf. punkt 24) bør fremkalde responser, der er kompatible med responserne i den historiske positive kontroldatabase, og medføre en statistisk signifikant stigning sammenlignet med den sideløbende negative kontrol.

Der blev testet under to forsøgsbetingelser (dvs. med og uden metabolismeaktivering), medmindre en af dem gav positive resultater (jf. punkt 25).

Antallet af analyserbare celler og koncentrationer er tilstrækkeligt (punkt 25, 26 og 19).

Kriterierne for valg af højeste koncentration er i overensstemmelse med kriterierne i punkt 20, 21 og 22.

Vurdering og fortolkning af resultater

39.

Såfremt alle acceptkriterier er opfyldt, anses et testkemikalie for at være klart positivt, hvis følgende er opfyldt under en af de undersøgte forsøgsbetingelser:

Mindst en af testkoncentrationerne udviser en statistisk signifikant stigning sammenlignet med den sideløbende negative kontrol.

Stigningen er koncentrationsafhængig, når den evalueres med en passende trend-test.

Et eller flere af resultaterne ligger uden for fordelingen af de historiske negative kontroldata (f.eks. den Poisson-baserede kontrolgrænse på 95 %, jf. punkt 33).

Når alle disse kriterier er opfyldt, anses testkemikaliet for at kunne fremkalde genmutationer i de dyrkede pattedyrceller i dette testsystem. Anbefalinger til de mest hensigtsmæssige statistiske metoder kan findes i litteraturen (46) (48).

40.

Såfremt alle acceptkriterier er opfyldt, anses et testkemikalie for at være klart negativt, hvis følgende er opfyldt under alle de undersøgte forsøgsbetingelser:

Ingen af testkoncentrationerne udviser en statistisk signifikant stigning sammenlignet med den sideløbende negative kontrol.

Der indtræder ikke en koncentrationsafhængig stigning, når der foretages en evaluering med en passende trend-test.

Alle resultaterne ligger inden for fordelingen af de historiske negative kontroldata (f.eks. den Poisson-baserede kontrolgrænse på 95 %, jf. punkt 33).

Testkemikaliet anses derefter for ikke at kunne fremkalde genmutationer i de dyrkede pattedyrceller i dette testsystem.

41.

Der stilles ikke krav om verifikation af en klart positiv eller negativ respons.

42.

Hvis responsen hverken er klart negativ eller klart positiv som beskrevet ovenfor, eller for at bidrage til at fastslå den biologiske relevans af et resultat, bør dataene evalueres af eksperter, og/eller der bør foretages yderligere undersøgelser. Det kan være nyttigt at gennemføre et nyt forsøg, eventuelt med ændrede forsøgsbetingelser (f.eks. koncentrationsinterval, andre metabolismeaktiveringsbetingelser (dvs. S9-koncentration eller S9-oprindelse).

43.

I sjældne tilfælde giver dataene selv efter yderligere undersøgelser ikke mulighed for at konkludere, om resultaterne er positive eller negative. Konklusionen er derfor, at testkemikalieresponsen er usikker (fortolkes på den måde, at der er lige stor sandsynlighed for, at det er positivt og negativt).

Testrapport

44.

Testrapporten bør indeholde følgende oplysninger:

 

Testkemikalie:

oprindelse, batchnummer, sidste anvendelsesdato, hvis dette foreligger

testkemikaliets stabilitet, hvis denne er kendt

testkemikaliets opløselighed og stabilitet i opløsningsmidlet, hvis dette er kendt

måling af pH-værdi, osmolalitet og bundfald i det dyrkningsmedium, som testkemikaliet blev tilsat, hvor det er relevant.

 

Stof med kun én bestanddel:

fysisk udseende, vandopløselighed og yderligere relevante fysisk-kemiske egenskaber

kemisk identifikation, f.eks. IUPAC-navn eller CAS-navn, CAS-nummer, SMILES- eller InChI-kode, strukturformel, renhed, kemisk identitet af urenheder, i det omfang det er relevant og praktisk muligt, osv.

 

Stof med flere bestanddele, UVCB-stoffer og blandinger:

kendetegnet så vidt muligt ved kemisk identitet (jf. ovenfor), kvantitativ forekomst og bestanddelenes relevante fysisk-kemiske egenskaber.

 

Opløsningsmiddel:

begrundelse for valg af opløsningsmiddel

procentdel af opløsningsmiddel i det endelige dyrkningsmedium.

 

Celler:

 

For laboratoriets stamkulturer:

celletype, cellelinjernes oprindelse

eventuelt antal generationer og historien i laboratoriet

karyotypiske karakteristika og/eller normalt kromosomtal

metoder til vedligeholdelse af cellekulturer

fravær af mykoplasma

cellernes fordoblingstid.

 

Testbetingelser:

begrundelse for valg af koncentrationer og antal kulturer, herunder f.eks. cytotoksicitetsdata og opløselighedsbegrænsninger

mediesammensætning, CO2-koncentration, fugtighedsniveau

testkemikaliets koncentration udtrykt som endelig koncentration i dyrkningsmediet (f.eks. μg eller mg/ml eller mM af dyrkningsmediet)

koncentration (og/eller volumen) af opløsningsmiddel og tilsat testkemikalie i dyrkningsmediet

inkubationstemperatur

inkubationstid

behandlingens varighed

celletæthed under behandlingen

metabolismeaktiveringssystemets type og sammensætning (oprindelse for S9, metode til fremstilling af S9-blanding, koncentration eller mængde af S9-blanding og S9 i det endelige dyrkningsmedium, kvalitetskontrol af S9)

positive og negative kontrolstoffer, endelige koncentrationer for hver behandlingsbetingelse

ekspressionsperiodens længde (herunder antal udsåede celler, subkulturer og eventuel feeding)

det selektive stofs identitet og koncentration

kriterier for accept af test

metoder til tælling af levedygtige celler og mutantceller

metoder anvendt til måling af cytotoksisk effekt

eventuelle supplerende oplysninger vedrørende cytotoksisk effekt og anvendt metode

inkubationstidens varighed efter udpladning

kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv, negativ eller usikker

metoder anvendt til bestemmelse af pH, osmolalitet og bundfald.

 

Resultater:

antal behandlede celler og antal celler dyrket i subkultur for hver kultur

cytotoksicitetsmålinger og eventuelt andre observationer

tegn på bundfald og tidspunkt for bestemmelse

antal celler udpladet i selektivt og ikke-selektivt medium

antal kolonier i det ikke-selektive medium og antal resistente kolonier i det selektive medium samt den tilhørende mutantfrekvens

koncentration/respons-forhold, når det er muligt

data fra sideløbende negative (opløsningsmiddel) og positive (koncentrationer og opløsningsmidler) kontroller

historiske negative (opløsningsmiddel) og positive kontroldata med angivelse af intervaller, gennemsnit og standardafvigelser og konfidensinterval (f.eks. 95 %) samt mængden af data

statistiske analyser (for de enkelte kulturer og eventuelt for samlede replikater) og eventuelle P-værdier.

 

Diskussion af resultater

 

Konklusion

LITTERATUR

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.

(2)

Moore M.M., DeMarini D.M., DeSerres F.J. og Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, New York.

(3)

Chu E.H.Y. og Malling H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306-1312.

(4)

Moore M.M., Harrington-Brock K., Doerr C.L. og Dearfield K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagen. Res., 4, 394-403.

(5)

Aaron C.S. og Stankowski Jr. L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223, 121-128.

(6)

Aaron C.S., Bolcsfoldi G., Glatt H.R., Moore M., Nishi Y., Stankowski L., Theiss J. og Thompson E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, 235-239.

(7)

Li A.P., Gupta R.S., Heflich R.H. og Wasson J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program. Mutation Res., 196, 17-36.

(8)

Scott D., Galloway S.M., Marshall R.R., Ishidate M., Brusick D., Ashby J. og Myhr B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A Report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147-204.

(9)

Morita T., Nagaki T., Fukuda I. og Okumura K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297-305.

(10)

Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886.

(11)

Nesslany F., Simar-Meintieres S., Watzinger M., Talahari I. og Marzin D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutation Res., 49, 439-452.

(12)

Long L.H., Kirkland D., Whitwell J. og Halliwell B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634, 177-183.

(13)

Kirkland D., Aardema M., Henderson L., og Müller L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutation Res., 5841-256.

(14)

Li A.P., Carver J.H., Choy W.N., Hsie A.W., Gupta R.S., Loveday K.S., O’Neill J.P., Riddle J.C., Stankowski L.F. Jr. og Yang L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135-141.

(15)

Liber H.L., Yandell D.W. og Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17.

(16)

Stankowski L.F. Jr., Tindall K.R. og Hsie A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147.

(17)

Arlett C.F., Smith D.M., Clarke G.M., Green M.H.L., Cole J., McGregor D.B. og Asquith J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Eds.), Cambridge University Press, s. 66-101.

(18)

Hsie A.W., Casciano D.A., Couch D.B., Krahn D.F., O’Neill J.P., og Whitfield B.L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program, Mutation Res., 86, 193-214.

(19)

Li A.P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures, Mutation Res., 85, 165-175.

(20)

Tindall K.R., Stankowski Jr., L.F., Machanoff R., og Hsie A.W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells, Mol. Cell. Biol., 4, 1411-1415.

(21)

Hsie A. W., Recio L., Katz D. S., Lee C. Q., Wagner M., og Schenley R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc Natl Acad Sci., 83(24):9616–9620.

(22)

Lorge E., Moore M., Clements J., Donovan M. O., Honma M., Kohara A., Van Benthem J., Galloway S., Armstrong M.J., Thybaud V., Gollapudi B., Aardema M., Kim J., Sutter A., Kirkland D.J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing (manuskript under udarbejdelse).

(23)

Coecke S., Balls M., Bowe G., Davis J., Gstraunthaler G., Hartung T., Hay R., Merten O.W., Price A., Schechtman L., Stacey G. og Stokes W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33, 261-287.

(24)

Rosen M.P., San R.H.C. og Stich H.F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures, Can. Lett. 8, 299-305.

(25)

Natarajan A.T., Tates A.D, Van Buul P.P.W., Meijers M. og de Vogel N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83-90.

(26)

Abbondandolo A., Bonatti S., Corti G., Fiorio R., Loprieno N. og Mazzaccaro A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373.

(27)

Ames B.N., McCann J. og Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.

(28)

Maron D.M. og Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173, 215.

(29)

Elliott B.M., Combes R.D., Elcombe C.R., Gatehouse D.G., Gibson G.G., Mackay J.M. og Wolf R.C. (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen. 7, 175-177.

(30)

Matsushima T., Sawamura M., Hara K. og Sugimura T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres F.J., Fouts J.R., Bend J.R. og Philpot R.M. (Eds), Elsevier, North-Holland, s. 85-88.

(31)

Ong T.-m., Mukhtar M., Wolf C.R. og Zeiger E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65.

(32)

Johnson T.E., Umbenhauer D.R. og Galloway S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.

(33)

UNEP. (2001). Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Tilgængelig på: [http://www.pops.int.html].

(34)

Tan E.-L. og Hsie A.W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutation Res., 84, 147-156.

(35)

O’Neill J.P., Machanoff R., San Sebastian J.R., Hsie A.W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Mammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mol. Mutation., 4, 7-18.

(36)

Li, A.P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation, 4, 7-18.

(37)

Krahn D.F., Barsky F.C. og McCooey K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds.) Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, s. 91-103.

(38)

Zamora P.O., Benson J.M., Li A.P. og Brooks A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen., 5, 795-801.

(39)

OECD (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In Vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). Available upon request from the Organisation for Economic Cooperation and Development.

(40)

Brookmire L., Chen J.J. og Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environ. Mol. Mutation, 54, 36-43.

(41)

EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances.

(42)

USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. Tilgængelig på: [https://federalregister.gov/a/2012-13774].

(43)

O’Neill J.P. og Hsie A.W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109-118.

(44)

Chiewchanwit T., Ma H., El Zein R., Hallberg L., og Au W.W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutation, Res., 1335(2):121-8.

(45)

Hayashi M., Dearfield K., Kasper P., Lovell D., Martus H.J., og Thybaud V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation, Res., 723, 87-90.

(46)

OECD (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines. Environmental, Health and Safety, Series on testing and assessment (No 199), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(47)

Richardson C., Williams D.A., Allen J.A., Amphlett G., Chanter D.O., og Phillips B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (Ed) Cambridge University Press, Cambridge, s. 141-154.

(48)

Fleiss J. L., Levin B., og Paik M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, Third Edition, New York: John Wiley & Sons.

Tillæg 1

DEFINITIONER

Baseparsubstitutionsmutagener: kemikalier, der forårsager substitution af basepar i DNA.

Kemikalie: et stof eller en blanding.

Kloningseffektivitet: procentdel af celler udpladet ved lav tæthed, som er i stand til at vokse til en koloni, der kan tælles.

Koncentrationer: henviser til endelige koncentrationer af testkemikaliet i dyrkningsmediet.

Cytotoksisk effekt: for de assays, der er omfattet af denne forsøgsmetode, identificeres cytotoksisk effekt som en reduktion i de behandlede cellers relative overlevelse sammenlignet med den negative kontrol (jf. det specifikke punkt).

Fremadmutation: en genmutation fra forældretypen til mutantformen, som medfører ændring i eller tab af det kodede proteins enzymaktivitet eller funktion.

Frameshift-mutagener: kemikalier, der fremkalder addition eller deletion af et eller flere basepar i DNA-molekylet.

Genotoksisk: et generelt udtryk, der omfatter alle former for DNA- eller kromosombeskadigelse, herunder DNA-brud, addukter, omlejringer, mutationer, kromosomaberrationer og aneuploidi. Det er ikke alle former for genotoksiske virkninger, der forårsager mutationer eller stabil kromosomskade.

HAT-medium: medium indeholdende hypoxanthin, aminopterin og thymidin, der anvendes til rensning af Hprt-mutanter.

Mitotisk rekombination: under mitosen, rekombination mellem homologe kromatider, der muligvis medfører brud på DNA-dobbeltstrenge eller tab af heterozygoti.

MPA-medium: medium indeholdende xanthin, adenin, thymidin, aminopterin og mycophenolinsyre, der anvendes til rensning af Xprt-mutanter.

Mutagen: forårsager arvelige ændringer af DNA-baseparsekvens(er) i gener eller i kromosomstrukturen (kromosomaberrationer).

Mutantfrekvens (MF): antal observerede mutantkolonier divideret med antal celler, som er udpladet i selektivt medium, korrigeret for kloningseffektiviteten (eller levedygtigheden) på udvælgelsestidspunktet.

Fænotypeekspressionsperiode: det tidsrum efter behandling, hvor den genetiske ændring fikseres i genomet, og alle eksisterende genprodukter forsvinder, således at det fænotypiske karakteristikum ændres.

Relativ overlevelse (RS): RS bruges til at måle behandlingsrelateret cytotoksisk effekt. RS er cellernes kloningseffektivitet (CE), når de udplades umiddelbart efter behandling, justeret for ethvert celletab under behandlingen sammenlignet med kloningseffektiviteten i negative kontroller (med en overlevelsesprocent på 100 %).

S9-leverfraktioner: supernatant fra leverhomogenat efter 9 000 g centrifugering, dvs. ekstrakt fra rå lever.

S9-blanding: blanding af S9-leverfraktionen og andre cofaktorer, som er nødvendige for at skabe metabolisk enzymaktivitet.

Kontrolkultur med opløsningsmiddel: generelt udtryk, der angiver de kontrolkulturer, som kun modtager det opløsningsmiddel, der anvendes til at opløse testkemikaliet.

Testkemikalie: alle stoffer eller blandinger, der testes ved hjælp af denne forsøgsmetode.

Ubehandlet kontrol: kulturer, der ikke modtager behandling (dvs. hverken testkemikalie eller opløsningsmiddel), men behandles sideløbende og på samme måde som de kulturer, der modtager testkemikaliet.

UVCB: kemiske stoffer af ukendt eller variabel sammensætning, komplekse reaktionsprodukter og biologiske materialer.

Tillæg 2

FORMLER FOR VURDERING AF CYTOTOKSISK EFFEKT OG MUTANTFREKVENS

Cytotoksisk effekt evalueres ved den relative overlevelse, dvs. cellernes kloningseffektivitet (CE), når de udplades umiddelbart efter behandling, justeret for ethvert celletab under behandlingen sammenlignet med den justerede kloningseffektivitet i de negative kontroller (med en overlevelsesprocent på 100 %) (jf. RS-formlen nedenfor).

Den justerede CE for en kultur, som er behandlet med et testkemikalie, beregnes som:

Formula

RS for en kultur, som er behandlet med et testkemikalie, beregnes som:

Formula

Mutantfrekvensen er mutantkoloniers kloningseffektivitet i selektivt medium divideret med kloningseffektiviteten i ikke-selektivt medium målt for den samme kultur på udvælgelsestidspunktet.

Formula

Når der anvendes plader til kloningseffektivitet:

CE = antal kolonier / antal celler ved udpladning.

Når der anvendes mikrotiterplader til kloningseffektivitet:

Antallet af kolonier pr. brønd på mikrotiterplader følger en Poisson-fordeling.

Kloningseffektivitet = -LnP(0) / antal celler pr. brønd ved udpladning

Hvor -LnP(0) er det sandsynlige antal tomme brønde ud af de udsåede brønde og beskrives ved følgende formel:

LnP(0) = -Ln (antal tomme brønde / antal celler ved udpladning).

"

(3)

Del B, kapitel B.22, affattes således:

"B.22   TEST TIL PÅVISNING AF DOMINERENDE DØDELIG MUTATION – GNAVERE

INDLEDNING

1.

Denne forsøgsmetode (TM) svarer til OECD’s testvejledning (Test Guideline (TG)) 478 (2016). Forsøgsmetoderne revideres regelmæssigt på baggrund af den videnskabelige udvikling, skiftende reguleringsbehov og dyrevelfærdshensyn. Denne ændrede udgave af forsøgsmetoden afspejler mere end 30 års erfaring med denne test og potentialet for testens integration i eller kombination med andre toksicitetstest såsom udviklings-, reproduktionstoksicitets- og genotoksicitetsundersøgelser. Som følge af dets begrænsninger og anvendelsen af et stort antal dyr er assayet dog ikke egnet som primær metode, men snarere som en supplerende forsøgsmetode, der kun anvendes, når der af lovgivningsmæssige hensyn ikke er noget alternativ. Kombinerede toksicitetstest har potentiale til at skåne et stort antal dyr mod at blive anvendt i toksicitetstest. OECD har udarbejdet et dokument, som indeholder kortfattede oplysninger om testning for genetisk toksikologi og en oversigt over de seneste ændringer af OECD’s testvejledning om genetisk toksicitet (1).

2.

Formålet med metoden til påvisning af dominerende dødelig (DL) mutation er at undersøge, hvorvidt kemikalier forårsager mutationer, der skyldes kromosomaberrationer i kønsceller. Derudover er metoden til påvisning af dominerende dødelig mutation relevant ved vurdering af genotoksicitet, da faktorer for in vivo-metabolisme, farmakokinetik og DNA-reparationsprocesser er aktive og bidrager til responsen, selv om de kan være forskellige fra art til art. Induktion af DL-mutation efter eksponering for et testkemikalie viser, at kemikaliet har påvirket forsøgsdyrets kønscellevæv.

3.

DL-mutationer forårsager embryon- eller fosterdød. Induktion af DL-mutation efter eksponering for et testkemikalie viser, at kemikaliet har påvirket forsøgsdyrets kønsceller.

4.

Et DL-assay er nyttigt til bekræftelse af positive resultater fra test ved anvendelse af somatiske in vivo-endepunkter og er et relevant endepunkt til forudsigelse af farligheden for mennesker og risikoen for genetiske sygdomme, som overføres via kønscellelinjen. Dette assay kræver imidlertid et stort antal dyr og er arbejdskraftintensivt og derfor meget dyrt og tidskrævende at udføre. Da den spontane frekvens af dominerende dødelige mutationer er relativt høj, er assayets følsomhed til påvisning af små stigninger i mutationsfrekvensen generelt begrænset.

5.

Definitioner af nøgletermer findes i tillæg 1.

INDLEDENDE OVERVEJELSER

6.

Denne test udføres oftest i mus (2) (3) (4), men andre arter såsom rotter (5) (6) (7) (8) kan i nogle tilfælde anvendes, hvis dette er sagligt begrundet. DL opstår generelt på grund af store kromosomaberrationer (strukturelle anomalier og antalsaberrationer) (9) (10) (11), men genmutationer kan ikke udelukkes. En DL-mutation er en mutation, der opstår i en kønscelle per se eller efter befrugtning fikseres i det tidlige embryon, som ikke forårsager dysfunktion hos gameten, men er dødelig for det befrugtede æg eller embryonet.

7.

Hanner parres individuelt med jomfruelige hunner med passende på hinanden følgende intervaller. Antallet af parringer efter behandlingen afhænger af det ultimative formål med DL-undersøgelsen (punkt 23) og bør sikre, at alle faser af hannernes kønscellemodning evalueres for DL (12).

8.

Hvis der er grund til at tro, at testkemikaliet eller dets metabolit(ter) ikke vil nå frem til testiklerne, er denne test ikke egnet.

PRINCIP FOR TESTEN

9.

Normalt eksponeres hanner for et testkemikalie ad en egnet eksponeringsvej, hvorefter de parres med ubehandlede jomfruelige hunner. De forskellige typer kønsceller kan testes ved anvendelse af på hinanden følgende parringsintervaller. Hunnerne aflives et passende stykke tid efter parring, hvorefter deres uterus undersøges med henblik på bestemmelse af antallet af implantater og levende og døde embryoner. Et testkemikalies dominerende dødelighed bestemmes ved sammenligning af de levende implantater pr. hun i den behandlede gruppe med de levende implantater pr. hun i gruppen af kontrolkulturer med bærestof/opløsningsmiddel. Forøgelsen af antallet af døde implantater pr. hun i den behandlede gruppe i forhold til antallet af døde implantater pr. hun i kontrolgruppen er udtryk for det tab, som testkemikaliet har forårsaget efter implantation. Tabet efter implantation beregnes ved bestemmelse af forholdet mellem antallet af døde implantater og det samlede antal implantater i den behandlede gruppe sammenlignet med forholdet mellem antallet af døde implantater og det samlede antal implantater i kontrolgruppen. Tabet før implantation kan vurderes ved sammenligning af corpora lutea-antallet minus det samlede antal implantater eller det samlede antal implantater pr. hun i den behandlede gruppe og kontrolgruppen.

KONTROL AF LABORATORIETS KOMPETENCE

10.

Laboratoriets kompetence til udførelse af dette assay bør fastslås ved dets påvisning af, at det kan reproducere frekvensen af dominerende dødelige virkninger fra offentliggjorte data (f.eks. (13) (14) (15) (16) (17) (18)) med positive kontrolstoffer (herunder svage responser) som dem, der er anført i tabel 1, og kontroller med bærestof, og opnå negative kontrolfrekvenser, der er i overensstemmelse med en acceptabel mængde data (jf. referencer ovenfor) eller eventuelt med laboratoriets historiske kontrolfordeling.

BESKRIVELSE AF METODEN

Forberedelser

Valg af dyreart

11.

Der bør anvendes sunde kønsmodne dyr af sædvanligt benyttede laboratoriestammer. Der anvendes sædvanligvis mus, men rotter kan også anvendes. En hvilken som helst anden egnet pattedyrsart kan anvendes, hvis dette begrundes sagligt i rapporten.

Miljø og fodringsbetingelser

12.

Temperaturen i forsøgslokalet bør for gnavere være 22 °C (± 3 °C). Den relative luftfugtighed bør ideelt set være 50-60 %, dog mindst 40 % og helst ikke over 70 %, hvilket dog ikke gælder under rengøring af lokalet. Belysningen bør være kunstig og bestå af 12 timers lys efterfulgt af 12 timers mørke. For så vidt angår fodring, kan der anvendes konventionelt laboratoriefoder med ubegrænset adgang til vand. Valget af foder kan påvirkes af behovet for at sikre en passende iblanding af et testkemikalie, når dette indgives ad denne vej. Forud for behandling eller parring bør gnavere opbevares i små grupper (højst fem dyr) af samme køn, såfremt der ikke forventes eller observeres aggressiv adfærd, fortrinsvist i solide bure med passende miljøberigelse. Dyr bør kun opbevares individuelt, hvis dette er sagligt begrundet.

Klargøring af dyrene

13.

Der udvælges tilfældigt sunde kønsmodne voksne hanner og hunner til kontrol- og behandlingsgrupperne. De enkelte dyr identificeres entydigt ved hjælp af en human og minimalt invasiv metode (f.eks. med ring, mærke, mikrochip eller biometrisk identifikation, men ikke tå- eller øreklipning) og tilvænnes laboratorieforholdene i mindst fem dage. Burene anbringes på en sådan måde, at de mulige følger af burenes placering minimeres. Krydskontaminering mellem den positive kontrol og testkemikaliet bør undgås. Ved undersøgelsens start bør variationen i dyrenes vægt være minimal og ikke overstige ± 20 % af gennemsnitsvægten for hvert køn.

Fremstilling af doser

14.

Faste testkemikalier opløses eller suspenderes i passende opløsningsmidler eller bærestoffer eller iblandes foder eller drikkevand før indgivelse i dyrene. Flydende testkemikalier kan indgives direkte eller opløses før indgivelse. Til inhalationseksponering kan testkemikalier indgives som gas, damp eller en fast/flydende aerosol, afhængigt af deres fysisk-kemiske egenskaber. Der bør anvendes friske præparater af testkemikaliet, medmindre stabilitetsdata påviser, at opbevaring er acceptabelt, og definerer hensigtsmæssige opbevaringsbetingelser.

Testbetingelser

Opløsningsmiddel/bærestof

15.

Opløsningsmidlet/bærestoffet må ikke have toksiske virkninger ved de benyttede doser og må ikke mistænkes for at reagere kemisk med testkemikaliet. Hvis der anvendes andre opløsningsmidler/bærestoffer end de velkendte, bør deres anvendelse understøttes af referencedata om deres kompatibilitet. Det anbefales så vidt muligt først at overveje at anvende vandige opløsningsmidler/bærestoffer. Eksempler på almindeligt anvendte kompatible opløsningsmidler/bærestoffer omfatter vand, fysiologisk saltopløsning, methylcelluloseopløsning, saltopløsning af carboxymethylcellulosenatrium, olivenolie og majsolie.

Positive kontroller

16.

Der bør altid benyttes dyr til sideløbende positiv kontrol, medmindre laboratoriet har påvist, at det er kompetent til at udføre testen og på det seneste har anvendt testen rutinemæssigt (f.eks. inden for de sidste fem år). Det er imidlertid ikke nødvendigt at behandle dyr til positiv kontrol ad samme vej som de dyr, der modtager testkemikaliet, eller udtage prøver i forbindelse med alle parringsintervaller. De positive kontrolstoffer bør være kendt som stoffer, der frembringer DL under de betingelser, der anvendes i testen. Bortset fra behandlingen bør dyrene i kontrolgrupperne behandles på samme måde som dyrene i behandlingsgrupperne.

17.

Doserne af de positive kontrolstoffer bør vælges, således at de frembringer svage eller moderate virkninger med henblik på en kritisk vurdering af assayets ydeevne og følsomhed, men konsekvent frembringer positive dominerende dødelige virkninger. Eksempler på positive kontrolstoffer og hensigtsmæssige doser findes i tabel 1.

Tabel 1

Eksempler på positive kontrolstoffer

Stof [CAS-nummer]

(referencenr.)

Effektivt dosisinterval (mg/kg)

(gnaverarter)

Indgivelsestid (dage)

Triethylenmelamin [51-18-3] (15)

0,25 (mus)

1

Cyclophosphamid [50-18-0] (19)

50-150 (mus)

5

Cyclophosphamid [50-18-0] (5)

25-100 (rotter)

1

Ethylmethansulfonat [62-50-0] (13)

100-300 (mus)

5

Monomer acrylamid [79-06-1] (17)

50 (mus)

5

Chlorambucil [305-03-3] (14)

25 (mus)

1

Negative kontroller

18.

Der bør ved hver prøvetagning indgå negative kontroldyr, som kun behandles med opløsningsmiddel eller bærestof og ellers behandles på samme måde som behandlingsgrupperne (20). Hvis der ikke foreligger historiske eller offentliggjorte kontroldata, som viser, at det valgte opløsningsmiddel/bærestof ikke medfører DL eller andre skadelige virkninger, bør der også indgå ubehandlede kontroldyr i hver prøvetagning for at fastslå, at kontrollen med bærestof kan accepteres.

FREMGANGSMÅDE

Antal dyr

19.

Hannerne parres individuelt, helst med én jomfruelig hun, med på hinanden følgende og forud fastsatte intervaller af passende længde (f.eks. hver uge, punkt 21 og 23). Antallet af hanner pr. gruppe bør (i kombination med det antal hunner, der parres under hver parringsperiode) være tilstrækkeligt til at sikre den statistiske styrke, der er nødvendig for at påvise mindst en fordobling af DL-frekvensen (punkt 44).

20.

Antallet af hunner pr. parringsperiode bør også fastlægges ud fra beregninger af den statistiske styrke, der muliggør påvisning af mindst en fordobling af DL-frekvensen (dvs. tilstrækkeligt mange drægtige hunner til, at der fremkommer mindst 400 implantater i alt) (20) (21) (22) (23), og idet der forventes mindst et dødt implantat pr. analyseenhed (dvs. parringsgruppe pr. dosis) (24).

Indgivelsesperiode og parringsintervaller

21.

Antallet af parringsintervaller efter behandlingen bestemmes af behandlingsplanen og bør sikre, at alle faser af hannernes kønscellemodning evalueres for DL-induktion (12) (25). Ved indgivelse af en enkelt dosis og op til 5 daglige doser bør der efter den sidste behandling gennemføres 8 parringer (mus) eller 10 parringer (rotter) med ugentlige intervaller. Ved indgivelse af flere doser kan antallet af parringsintervaller reduceres i forhold til den længere indgivelsesperiode, men det skal fortsat være muligt at evaluere alle faser af spermatogenesen (efter 28 dages eksponering er det f.eks. tilstrækkeligt med kun 4 ugentlige parringer for at evaluere alle faser af spermatogenesen i musen). Alle behandlings- og parringsplaner skal begrundes sagligt.

22.

Hunnerne placeres hos hannerne i en periode svarende til mindst en brunstcyklus (en uge dækker f.eks. en brunstcyklus hos både mus og rotter). De hunner, der ikke har parret sig i løbet af en uge, kan benyttes til en efterfølgende parringsperiode, eller de kan blive hos hannerne, indtil parringen har fundet sted, hvilket konstateres ved tilstedeværelse af sperma i vagina eller en vaginalprop.

23.

Eksponerings- og parringsbetingelserne afhænger af det ultimative formål med DL-undersøgelsen. Hvis formålet er at bestemme, om et givet kemikalie fremkalder DL-mutationer per se, ville den accepterede metode bestå i at eksponere en hel spermatogeneserunde (f.eks. 7 uger i mus, 5-7 behandlinger om ugen) med en efterfølgende parring. Men hvis formålet er at identificere den kønscelletype, der er følsom over for DL-induktion, foretrækkes en enkelt eksponering eller eksponering over 5 dage efterfulgt af ugentlig parring.

Dosisniveauer

24.

Hvis der gennemføres en forundersøgelse til bestemmelse af dosisinterval, fordi der ikke foreligger egnede data, der kan bruges til at vælge dosis, bør den udføres i samme laboratorium med samme art, stamme, køn og behandlingsmåde, som agtes benyttet i hovedundersøgelsen (26). Formålet med undersøgelsen bør være at identificere den maksimalt tolererede dosis (MTD) defineret som den maksimale dosis, der tolereres uden dokumentation for undersøgelsesbegrænsende toksicitet, i forhold til undersøgelsesperiodens varighed (f.eks. unormal adfærd eller unormale reaktioner, et mindre fald i kropsvægt eller cytotoksisk effekt i det hæmatopoietiske system), men ikke død eller tegn på smerte eller lidelse, der kræver human aflivning (27).

25.

MTD må heller ikke have negativ indvirkning på parringsresultatet (21).

26.

Testkemikalier med specifik biologisk aktivitet ved lav ikke-toksisk dosis (f.eks. hormoner og mitogener) og kemikalier, der udviser mætning af toksikokinetiske egenskaber, kan være undtagelser fra dosisfastsættelseskriterierne og bør evalueres individuelt.

27.

For at opnå dosis/respons-oplysninger bør en fuldstændig undersøgelse omfatte en negativ kontrolgruppe og mindst tre dosisniveauer generelt adskilt af en faktor på 2, men ikke over 4. Hvis testkemikaliet ikke frembringer toksicitet i en forundersøgelse eller baseret på eksisterende data, bør den højeste dosis for en enkelt indgivelse være 2 000 mg/kg kropsvægt. Hvis testkemikaliet frembringer toksicitet, bør MTD imidlertid være den højeste indgivne dosis, og de anvendte dosisniveauer bør fortrinsvis dække et interval fra den højeste dosis til en dosis, der frembringer ringe eller ingen toksicitet. For ikke-toksiske kemikalier er grænsedosis for en indgivelsesperiode på 14 dage eller derover 1 000 mg/kg kropsvægt/dag, og for indgivelsesperioder på under 14 dage er grænsedosis 2 000 mg/kg kropsvægt/dag.

Indgivelse af doser

28.

Den forventede indgivelsesmåde for mennesker bør tages i betragtning i forbindelse med udformningen af et assay. Andre indgivelsesmåder såsom foder, drikkevand, subkutant, intravenøst, topisk, inhalation, oralt (med sonde) eller implantation kan vælges, hvis de kan begrundes. Under alle omstændigheder bør der vælges en indgivelsesmåde, som sikrer tilstrækkelig eksponering af målvævet. Intraperitoneal injektion anbefales normalt ikke, eftersom det ikke er en tilsigtet metode til human eksponering, og bør kun anvendes med en specifik saglig begrundelse. Hvis testkemikaliet iblandes foder eller drikkevand, navnlig i forbindelse med enkeltdosering, bør det sikres, at tidsrummet mellem indtagelse af foder og drikkevand og parring er tilstrækkelig stort til, at virkningerne kan påvises (punkt 31). Hvor stor en væskemængde, der kan indgives ad gangen med sonde eller ved injektion, afhænger af forsøgsdyrenes størrelse. Mængden må normalt højst være 1 ml/100 g kropsvægt, bortset fra vandige opløsninger, hvor der højst må anvendes 2 ml/100 g kropsvægt. Anvendelse af større mængder (hvis dette er tilladt ifølge lovgivningen om dyrevelfærd) bør begrundes. Testmængden bør variere så lidt som muligt, idet koncentrationen justeres, så indgivelsen sker ved samme mængde i forhold til kropsvægt ved alle dosisniveauer.

Observationer

29.

Der bør foretages generelle kliniske observationer af forsøgsdyrene, og de kliniske tegn bør registreres mindst en gang om dagen, fortrinsvis på samme tidspunkt(er) hver dag og under hensyntagen til det tidspunkt, hvor de forventede virkninger efter dosering topper. Alle dyr bør observeres mindst to gange dagligt i doseringsperioden for morbiditet og dødelighed. Alle dyr bør vejes ved undersøgelsens start og mindst en gang om ugen i undersøgelser med gentagen dosering samt ved aflivning. Foderindtag bør måles mindst en gang ugentligt. Hvis testkemikaliet indgives via drikkevandet, bør vandindtaget måles ved hvert vandskift og mindst en gang ugentligt. Dyr, der udviser ikke-dødelig indikation for for høj toksicitet, bør aflives før testperiodens udløb (27).

Indsamling og behandling af væv

30.

Hunnerne aflives i anden halvdel af drægtighedsperioden på drægtighedsdag (GD) 13 for mus og GD 14-15 for rotter. Uterus undersøges for dominerende dødelige virkninger med henblik på bestemmelse af antallet af implantater, levende og døde embryoner og corpora lutea.

31.

Livmoderhorn og ovarier blotlægges til bestemmelse af antallet af corpora lutea, og fostre fjernes, tælles og vejes. Uterus bør undersøges omhyggeligt for resorptioner, der er skjult af levende fostre, og det skal sikres, at alle resorptioner bliver optalt. Fosterdødeligheden registreres. Antallet af befrugtede hunner og det samlede antal implantationer samt antallet af tab før implantation og dødeligheden efter implantation (herunder tidlig og sen resorption) registreres tilsvarende. Desuden kan de synlige fostre præserveres i Bouins væske i mindst to uger, hvorefter de undersøges for væsentlige eksterne misdannelser (28) for at opnå yderligere oplysninger om testkemikaliets reproduktions- og udviklingsvirkninger.

DATA OG RAPPORTERING

Behandling af resultater

32.

Data bør opstilles i tabelform med angivelse af antal parrede hanner samt antal drægtige og ikke-drægtige hunner. Resultaterne af hver enkelt parring, herunder identiteten af hver enkelt han og hun, anføres individuelt. Parringsperioderne og dosisniveauet for de behandlede hanner samt antallet af levende implantater og døde implantater bør anføres for hver enkelt hun.

33.

Tabet efter implantation beregnes ved bestemmelse af forholdet mellem antallet af døde implantater og det samlede antal implantater i den behandlede gruppe sammenholdt med forholdet mellem antallet af døde implantater og det samlede antal implantater i gruppen af kontrolkulturer med bærestof/opløsningsmiddel.

34.

Tabet før implantation beregnes som forskellen mellem antallet af corpora lutea og antallet af implantater eller som et lavere gennemsnitligt antal implantater pr. hun i forhold til kontrolparringerne. Hvis der foretages vurdering af tabet før implantation, bør dette anføres.

35.

Den dominerende dødelige faktor vurderes som: (antal døde før implantation/samlet antal implantationer pr. hun) × 100.

36.

Data om toksicitet og kliniske tegn bør anføres (jf. punkt 29).

Acceptkriterier

37.

Følgende kriterier bestemmer, om en test kan accepteres:

Den sideløbende negative kontrol er i overensstemmelse med offentliggjorte normer for historiske negative kontroldata og laboratoriets historiske kontroldata, hvis sådanne foreligger (jf. punkt 10 og 18).

Sideløbende positive kontroller fremkalder responser, der er i overensstemmelse med offentliggjorte normer for historiske positive kontroldata eller laboratoriets historiske positive kontroldatabase, hvis en sådan foreligger, og medfører en statistisk signifikant stigning sammenlignet med den negative kontrol (jf. punkt 17 og 18).

Et tilstrækkeligt antal implantater og doser er blevet analyseret (punkt 20).

Kriterierne for valg af højeste dosis er i overensstemmelse med kriterierne i punkt 24 og 27.

Vurdering og fortolkning af resultater

38.

Mindst tre behandlede doseringsgrupper bør analyseres for at tilvejebringe tilstrækkelige data til dosis/respons-analyse.

39.

Såfremt alle acceptkriterier er opfyldt, anses et testkemikalie for at være klart positivt, hvis:

mindst en af testdoserne udviser en statistisk signifikant stigning sammenlignet med den sideløbende negative kontrol

stigningen er dosisafhængig ved mindst en forsøgsbetingelse (f.eks. ugentlig parring), når den vurderes med en hensigtsmæssig test, og

et eller flere af resultaterne ligger uden for det acceptable interval for negative kontroldata eller fordelingen af laboratoriets historiske negative kontroldata (f.eks. Poisson-baseret kontrolgrænse på 95 %), hvis disse foreligger.

Testkemikaliet anses derefter for at kunne fremkalde dominerende dødelige mutationer i forsøgsdyrenes kønsceller. Anbefalinger til de mest hensigtsmæssige statistiske metoder er beskrevet i punkt 44. Andre anbefalede statistiske metoder findes i litteraturen (20) (21) (22) (24) (29). I de anvendte statistiske test skal dyret betragtes som forsøgsenheden.

40.

Såfremt alle acceptkriterier er opfyldt, anses et testkemikalie for at være klart negativt, hvis:

ingen af testdoserne udviser en statistisk signifikant stigning sammenlignet med den sideløbende negative kontrol

der ikke indtræder en dosisafhængig stigning ved en af forsøgsbetingelserne, og

alle resultaterne ligger inden for det acceptable interval for negative kontroldata eller laboratoriets historiske negative kontroldata (f.eks. Poisson-baseret kontrolgrænse på 95 %), hvis disse foreligger.

Testkemikaliet anses derefter for ikke at kunne fremkalde dominerende dødelige mutationer i forsøgsdyrenes kønsceller.

41.

Der stilles ikke krav om verifikation af en klart positiv eller klart negativ respons.

42.

Hvis responsen hverken er klart negativ eller positiv, og for at bidrage til at fastslå den biologiske relevans af et resultat (f.eks. en svag eller usikker stigning), bør dataene evalueres af eksperter, og/eller der bør foretages yderligere undersøgelser på baggrund af eksisterende forsøgsdata, herunder undersøgelse af, om det positive resultat ligger uden for det acceptable interval for negative kontroldata eller laboratoriets historiske negative kontroldata (30).

43.

I sjældne tilfælde giver dataene selv efter yderligere undersøgelser ikke mulighed for at konkludere, om resultaterne er positive eller negative. Konklusionen er derfor, at testkemikalieresponsen er usikker.

44.

I de anvendte statistiske test skal hannen betragtes som forsøgsenheden. Selv om det er muligt at fordele optællingsbaserede data (f.eks. antallet af implantater pr. hun) efter Poisson-metoden, og/eller fordele andelene (f.eks. andelen af døde implantater) efter binomialteorien, bliver sådanne data ofte overdispergeret (31). Tilsvarende bør der ved statistiske analyser først foretages en test for over-/underdispersion ved anvendelse af varianstest såsom Cochrans binomiale varianstest (32) eller Tarones C(α)-test for binomial overdispersion (31) (33). Hvis ikke der påvises nogen afvigelse fra den binomiale dispersion, kan andelsrelaterede tendenser på tværs af dosisniveauer testes ved anvendelse af Cochran-Armitage-trend-testen (34), og parvise sammenligninger med kontrolgruppen kan testes ved anvendelse af Fishers eksakte test (35). Hvis ikke der påvises nogen afvigelse fra Poisson-dispersionen, kan optællingsbaserede tendenser tilsvarende testes ved anvendelse af Poisson-regression (36), og parvise sammenligninger med kontrolgruppen kan testes inden for rammerne af Poisson-modellen ved anvendelse af parvise kontraster (36). Hvis der påvises signifikant overdispersion eller underdispersion, anbefales ikke-parametriske metoder (23) (31). Disse omfatter klassificeringsbaserede test, såsom Jonckheere-Terpstra-testen for tendenser (37) og Mann-Whitney-testene (38) for parvise sammenligninger med gruppen af kontrolkulturer med bærestof/opløsningsmiddel samt permutations-, resamplings- eller bootstrap-testene for tendenser og parvise sammenligninger med kontrolgruppen (31) (39).

45.

Et positivt DL-assay dokumenterer testkemikaliets genotoksicitet i kønsceller hos den eksponerede han fra den testede dyreart.

46.

Det kan være nyttigt at undersøge, om de observerede værdier ligger inden for eller uden for det historiske kontrolinterval, ved vurderingen af responsens biologiske signifikans (40).

Testrapport

47.

Testrapporten bør indeholde følgende oplysninger:

Resumé

 

Testkemikalie:

oprindelse, batchnummer, sidste anvendelsesdato, hvis dette foreligger

testkemikaliets stabilitet, hvis denne er kendt

testkemikaliets opløselighed og stabilitet i opløsningsmidlet, hvis dette er kendt

måling af pH-værdi, osmolalitet og bundfald i det dyrkningsmedium, som testkemikaliet blev tilsat, hvor det er relevant.

 

Stof med kun én bestanddel:

fysisk udseende, vandopløselighed og yderligere relevante fysisk-kemiske egenskaber

kemisk identifikation, f.eks. IUPAC-navn eller CAS-navn, CAS-nummer, SMILES- eller InChI-kode, strukturformel, renhed, kemisk identitet af urenheder, i det omfang det er relevant og praktisk muligt, osv.

 

Stof med flere bestanddele, UVCB-stoffer og blandinger:

kendetegnet så vidt muligt ved kemisk identitet (jf. ovenfor), kvantitativ forekomst og bestanddelenes relevante fysisk-kemiske egenskaber.

 

Præparering af testkemikaliet:

begrundelse for valg af bærestof

testkemikaliets opløselighed og stabilitet i opløsningsmidlet/bærestoffet, hvis dette er kendt

fastlæggelse af sammensætning af foder, drikkevand eller inhalationsformulering

analytiske bestemmelser af formuleringer (f.eks. stabilitet, homogenitet og nominelle koncentrationer), når disse foretages.

 

Forsøgsdyr:

anvendt art/stamme og begrundelse herfor

dyrenes antal, alder og køn

oprindelse, miljøbetingelser, foder mv.

metode til entydig identifikation af dyr

for kortvarige undersøgelser: de enkelte hanners kropsvægt ved testens start og afslutning. For undersøgelser af mere end en uges varighed: individuel kropsvægt under undersøgelsen og fødeindtagelse. Kropsvægtinterval, gennemsnit og standardafvigelse for hver enkelt gruppe bør medtages.

 

Testbetingelser:

positive og negative kontroldata (bærestof/opløsningsmiddel)

data fra forundersøgelse til bestemmelse af dosisinterval

begrundelse for valg af dosisniveau

oplysninger om præparering af testkemikaliet

oplysninger om indgivelse af testkemikaliet

begrundelse for indgivelsesvej

metoder til måling af dyretoksicitet, herunder om muligt histopatologiske eller hæmatologiske analyser samt frekvensen for observationer og vejning af dyrene

metoder til kontrol af, at testkemikaliet er nået frem til målvævet eller det almindelige kredsløb, hvis der er opnået negative resultater

faktisk dosis (mg/kg kropsvægt/dag) beregnet på baggrund af testkemikaliets koncentration i foder/drikkevand (ppm) og indtagelse, hvis relevant

oplysninger om foder- og vandkvalitet

oplysninger om berigelse af miljøet i burene

detaljeret beskrivelse af behandlings- og prøvetagningsplaner samt begrundelser for valg

analgesimetode

aflivningsmetode

procedurer til isolering og præservering af væv

oprindelse og batchnummer for alle kits og reagenser (hvis relevant)

metoder til kvantitativ bestemmelse af DL

parringsplan

metoder til konstatering af, om parring har fundet sted

aflivningstidspunkt

kriterier for scoring af DL-virkninger, herunder corpora lutea, implantationer, resorptioner og tab før implantation, levende implantater, døde implantater.

 

Resultater:

dyrenes tilstand før og i løbet af testperioden, herunder tegn på toksicitet

hannernes kropsvægt under behandling og i parringsperioder

antal parrede hunner

dosis/respons-forhold, hvor muligt

data for sideløbende negative kontroller og historiske negative kontroldata med angivelse af intervaller, gennemsnit og standardafvigelser

data for sideløbende positive kontroller

data i tabelform for hvert moderdyr, herunder: antal corpora lutea pr. moderdyr, antal implantationer pr. moderdyr, antal resorptioner og tab før implantation pr. moderdyr, antal levende implantater pr. moderdyr, antal døde implantater pr. moderdyr, fostrenes vægt

sammenfatning af ovenstående oplysninger for hver parringsperiode og dosis med angivelse af frekvensen for dominerende dødelige virkninger

anvendte statistiske analyser og metoder.

 

Diskussion af resultater

 

Konklusion

LITTERATUR

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.

(2)

Bateman, A.J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, in Handbook of Mutagenicity Test Procedures B.J. Kilbey et. al. (Eds.) s. 235-334, Elsevier, Amsterdam.

(3)

Ehling U.H., Ehling, U.H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M., og Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice. Set up by the Work Group »Dominant« lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics, Arch. Toxicol., 39, 173-185.

(4)

Shelby M.D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutation Res,. 352:159-167.

(5)

Knudsen I., Knudsen, I., Hansen, E.V., Meyer, O.A. og Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutation Res., 48:267-270.

(6)

Anderson D., Hughes, J.A., Edwards, A.J. og Brinkworth, M.H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutation Res., 397:77-74.

(7)

Shively C.A., C.A., White, D.M., Blauch, J.L. og Tarka, S.M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20:325-329.

(8)

Rao K.S., Cobel-Geard, S.R., Young, J.T., Hanley, T.R. Jr., Hayes, W.C., John, J.A. og Miller, R.R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol., 3:80-85.

(9)

Brewen J.G., Payne, H.S., Jones, K.P., og Preston, R.J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells, Mutation Res., 33, 239-249.

(10)

Marchetti F., Bishop, J.B., Cosentino, L., Moore II, D. og Wyrobek, A.J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod., 70:616-624.

(11)

Marchetti F. og Wyrobek, A.J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res., C 75:112-129.

(12)

Adler I.D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutation Res., 352:169-172.

(13)

Favor J., og Crenshaw J.W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, Mutation Res., 53: 21–27.

(14)

Generoso W.M., Witt, K.L., Cain, K.T., Hughes, L. Cacheiro, N.L.A, Lockhart, A.M.C. og Shelby, M.D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutation Res., 345:167-180.

(15)

Hastings S.E., Huffman K.W. og Gallo M.A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine, Mutation Res., 40:371-378.

(16)

James D.A. og Smith D.M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, Mutation Res., 99:303-314.

(17)

Shelby M.D., Cain, K.T., Hughes, L.A., Braden, P.W. og Generoso, W.M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutation Res., 173:35-40.

(18)

Sudman P.D., Rutledge, J.C., Bishop, J.B. og Generoso W.M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice, Mutation Res., 296: 143-156.

(19)

Holstrom L.M., Palmer A.K. og Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland D.J. og Fox M. (Eds.), Cambridge University Press, s. 129-156.

(20)

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. og Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417:19–30.

(21)

Adler I.D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. og Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312:313-318.

(22)

Generoso W.M. og Piegorsch W.W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Methods, Toxicol., 3A:124-141.

(23)

Haseman J.K. og Soares E.R. (1976). The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutation. Res., 41: 277-288.

(24)

Whorton E.B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality, Teratogen. Carcinogen. Mutagen., 1:353 – 360.

(25)

Anderson D., Anderson, D., Hodge, M.C.E., Palmer, S., og Purchase, I.F.H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutation. Res., 85:417-429.

(26)

Fielder R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. og Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagen., 7:313-319.

(27)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No.19.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(28)

Barrow M.V., Taylor W.J og Morphol J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, 127, 291–306.

(29)

Kirkland D.J., (Ed.)(1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Cambridge University Press.

(30)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper P., Lovell D., Martus H.-J. og Thybaud V. (2011). »Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data«, Mutation. Res., 723:87-90.

(31)

Lockhart A.C., Piegorsch W.W. og Bishop J.B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutation. Res., 272:35-58.

(32)

Cochran W.G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ2 Tests. Biometrics, 10: 417-451.

(33)

Tarone R.E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika, 66: 585-590.

(34)

Margolin B.H. (1988). Test for Trend in Proportions. In Encyclopedia of Statistical Sciences, Volume 9, Kotz S. og Johnson N. L. (Eds.), s. 334-336. John Wiley and Sons, New York.

(35)

Cox D.R., Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, London (1970).

(36)

Neter J.M., Kutner, H.C., Nachtsheim, J. og Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models, Fourth Edition, Chapters 14 and 17. McGraw-Hill, Boston.

(37)

Jonckheere R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika, 41:133-145.

(38)

Conover W.J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley and Sons, New York.

(39)

Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, PA.

(40)

Fleiss J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley and Sons, New York.

Tillæg 1

DEFINITIONER

Kemikalie: et stof eller en blanding.

Corpora luteum (lutea): den hormonudskillende struktur, der dannes på ovariet på det sted, hvor et follikel har løsnet et æg. Antallet af corpora lutea i ovarierne svarer til antallet af ovulerede æg.

Dominerende dødelig mutation: en mutation, der opstår i en kønscelle, eller som fikseres efter befrugtning, og som medfører embryon- eller fosterdød.

Fertilitetsgrad: antal parrede drægtige hunner divideret med antal parrede hunner.

Parringsinterval/-periode: tiden mellem eksponeringens afslutning og parringen af de behandlede hanner. Ved at styre dette interval/denne periode er det muligt at vurdere de kemiske virkninger på forskellige typer kønsceller. I mus er det ved parring i henholdsvis første, anden, tredje, fjerde, femte, sjette, syvende og ottende uge efter eksponeringens afslutning muligt at måle virkningerne i sperma, kondenserede spermatider, runde spermatider, pakyteniske spermatocytter, tidlige spermatocytter, differentierede spermatogonier, differentierende spermatogonier og stamcellespermatogonier.

Tab før implantation: forskellen mellem antallet af implantater og antallet af corpora lutea. Kan også estimeres ved at sammenligne det samlede antal implantater pr. hun i de behandlede grupper og kontrolgrupperne.

Tab efter implantation: andelen af døde implantater i den behandlede gruppe sammenlignet med andelen af døde implantater i forhold til det samlede antal implantater i kontrolgruppen.

Testkemikalie: alle stoffer eller blandinger, der testes ved hjælp af denne forsøgsmetode.

UVCB: kemiske stoffer af ukendt eller variabel sammensætning, komplekse reaktionsprodukter og biologiske materialer.

Tillæg 2

TIDSPUNKT FOR SPERMATOGENESE I PATTEDYR

Image 1

Figur 1: Sammenligning af varigheden (i dage) af hanners kønscelleudvikling i mus, rotter og mennesker. Der sker ingen DNA-reparation i de perioder, der er skraveret.

Ovenfor vises et skema over spermatogenese i mus, rotter og mennesker (taget fra Adler, 1996). Udifferentierede spermatogonier omfatter: A-single, A-paired og A-aligned spermatogonier (Hess og de Franca, 2008). A-single anses for at være de ægte stamceller. Derfor skal der gå mindst 49 dage (i mus) mellem den sidste injektion af testkemikalie og parringen, hvis man vil vurdere virkningerne på stamceller.

Referencer

Adler, ID (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans. Mutat Res, 352:169-172.

Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Ed), Landes Biosciences and Springer Science&Business Media:1-15.

"

(4)

Del B, kapitel B.23, affattes således:

"B.23   TEST FOR KROMOSOMABERRATIONER I SPERMATOGONIER HOS PATTEDYR

INDLEDNING

1.

Denne forsøgsmetode (TM) svarer til OECD’s testvejledning (Test Guideline) 483 (2016). Forsøgsmetoderne revideres regelmæssigt på baggrund af den videnskabelige udvikling, skiftende reguleringsbehov og dyrevelfærdshensyn. Denne ændrede udgave af forsøgsmetoden afspejler mange års erfaring med dette assay og potentialet for testens integration i eller kombination med andre toksicitets- eller genotoksicitetsundersøgelser. Kombinerede toksicitetsundersøgelser har potentiale til at mindske det antal dyr, der anvendes i toksicitetstest. Denne forsøgsmetode er en del af en række forsøgsmetoder vedrørende genetisk toksikologi. OECD har udarbejdet et dokument, som indeholder kortfattede oplysninger om testning for genetisk toksikologi og en oversigt over de seneste ændringer af OECD’s testvejledning om genetisk toksicitet (1).

2.

Formålet med in vivo-testen for kromosomaberrationer i spermatogonier hos pattedyr er at påvise, om et kemikalie forårsager strukturelle kromosomaberrationer i spermatogonier hos pattedyr (2) (3) (4). Derudover er testen relevant ved vurdering af genotoksicitet, da faktorer for in vivo-metabolisme, farmakokinetik og DNA-reparationsprocesser er aktive og bidrager til responsen, selv om de kan være forskellige fra art til art. Denne forsøgsmetode er ikke beregnet til at måle antalsafvigelser. Assayet anvendes ikke rutinemæssigt til dette formål.

3.

Ved denne test måles strukturelle kromosomaberrationer (af både kromosom- og kromatidtypen) i spermatogonier, der er ved at dele sig, og den forventes derfor at kunne forudsige induktion af arvelige mutationer i disse kønsceller.

4.

Definitioner af nøgletermer findes i tillægget.

INDLEDENDE OVERVEJELSER

5.

Der benyttes rutinemæssigt gnavere i denne test, men andre arter kan i nogle tilfælde anvendes, hvis dette er videnskabeligt begrundet. Almindelige cytogenetiske præparater fra gnavertestikler skaber mitotiske (spermatogonier) og meiotiske (spermatocytter) metafaser. Mitotiske og meiotiske metafaser identificeres med udgangspunkt i kromosomernes morfologi (4). Ved denne cytogenetiske in vivo-test påvises strukturelle kromosomaberrationer i spermatogoniers mitose. Forsøgsmetoden omfatter ikke andre målceller.

6.

For at påvise aberrationer af kromatidtypen i spermatogonier skal den første mitotiske celledeling efter behandlingen undersøges, inden disse aberrationer omdannes til aberrationer af kromosomtypen ved efterfølgende celledelinger. Der kan indhentes yderligere information fra behandlede spermatocytter ved meiotisk kromosomanalyse for strukturelle kromosomaberrationer ved diakinese-metafase I og -metafase II.

7.

Testiklerne (5) indeholder flere generationer af spermatogonier, og disse forskellige kønscelletyper kan udvise forskellig følsomhed over for kemisk behandling. På denne måde repræsenterer de påviste aberrationer en samlet respons fra behandlede spermatogonpopulationer. Størstedelen af de mitotiske celler i testikelpræparater er B-spermatogonier, som har en cellecyklus på ca. 26 timer (3).

8.

Hvis der er grund til at tro, at testkemikaliet eller dets metabolit(ter) ikke vil nå frem til testiklerne, er denne test ikke egnet.

PRINCIPPET FOR FORSØGSMETODEN

9.

Normalt eksponeres dyrene for testkemikaliet ad en passende indgivelsesvej, og de aflives et passende tidsrum efter behandling. Inden aflivning behandles dyrene med et metafasestandsende stof (f.eks. colchicin eller Colcemid®). Der fremstilles derefter kromosompræparater af kønscellerne, som farves, og metafasecellerne analyseres for kromosomaberrationer.

KONTROL AF LABORATORIETS KOMPETENCE

10.

Laboratoriets kompetence til udførelse af dette assay bør fastslås ved dets påvisning af, at det kan frembringe de forventede resultater for frekvensen af strukturelle kromosomaberrationer i spermatogonier med positive kontrolstoffer (herunder svage responser) som dem, der er anført i tabel 1, og opnå negative kontrolfrekvenser, der er i overensstemmelse med en acceptabel mængde kontroldata i litteraturen (f.eks. (2) (3) (6) (7) (8) (9) (10)) eller eventuelt med laboratoriets historiske kontrolfordeling.

BESKRIVELSE AF METODEN

Forberedelser

Valg af dyreart

11.

Der bør anvendes sunde unge voksne dyr af sædvanligt benyttede laboratoriestammer. Der benyttes sædvanligvis hanmus, men hanner af andre egnede pattedyrsarter kan ligeledes anvendes, når det er sagligt begrundet, og for at gøre det muligt at køre denne test sammen med en anden forsøgsmetode. Den saglige begrundelse for at bruge andre arter end gnavere bør anføres i rapporten.

Miljø og fodringsbetingelser

12.

Temperaturen i forsøgslokalet bør være 22 °C (±3 °C) for gnavere. Den relative luftfugtighed bør ideelt set være 50-60 %, dog mindst 40 % og helst ikke over 70 %, hvilket dog ikke gælder under rengøring af lokalet. Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke. For så vidt angår fodring, kan der anvendes konventionelt laboratoriefoder med ubegrænset adgang til vand. Valget af foder kan påvirkes af behovet for at sikre en passende iblanding af et testkemikalie, når dette indgives ad denne vej. Gnavere bør opbevares i små grupper (højst fem dyr pr. bur), såfremt der ikke forventes aggressiv adfærd, fortrinsvist i solide gulvbure med passende miljøberigelse. Dyr bør kun opbevares individuelt, hvis dette er sagligt begrundet.

Klargøring af dyrene

13.

Der anvendes normalt sunde unge voksne hanner (8-12 uger ved behandlingsstart), som udvælges vilkårligt til kontrol- og behandlingsgrupperne. De enkelte dyr identificeres entydigt ved hjælp af en human og minimalt invasiv metode (f.eks. med ring, mærke, mikrochip eller biometrisk identifikation, men ikke øre- eller tåklipning) og tilvænnes laboratoriebetingelserne i mindst fem dage. Burene anbringes på en sådan måde, at de mulige følger af burenes placering minimeres. Krydskontaminering mellem den positive kontrol og testkemikaliet bør undgås. Ved undersøgelsens start bør vægtvariationen mellem dyrene være mindst mulig og ikke over ± 20 %.

Fremstilling af doser

14.

Faste testkemikalier opløses eller suspenderes i passende opløsningsmidler eller bærestoffer eller iblandes foder eller drikkevand før indgivelse i dyrene. Flydende testkemikalier kan indgives direkte eller opløses før indgivelse. Til inhalationseksponering kan testkemikalier indgives som gas, damp eller en fast/flydende aerosol, afhængigt af deres fysisk-kemiske egenskaber. Der bør anvendes friske præparater af testkemikaliet, medmindre stabilitetsdata påviser, at opbevaring er acceptabelt, og definerer hensigtsmæssige opbevaringsbetingelser.

Testbetingelser – opløsningsmiddel/bærestof

15.

Opløsningsmidlet/bærestoffet må ikke have toksiske virkninger ved de benyttede doser og må ikke kunne reagere kemisk med testkemikaliet. Hvis der anvendes andre opløsningsmidler/bærestoffer end de velkendte, bør deres anvendelse understøttes af referencedata om deres kompatibilitet. Det anbefales så vidt muligt først at overveje at anvende vandige opløsningsmidler/bærestoffer. Eksempler på almindeligt anvendte kompatible opløsningsmidler/bærestoffer omfatter vand, fysiologisk saltopløsning, methylcelluloseopløsning, saltopløsning af carboxymethylcellulosenatrium, olivenolie og majsolie. Hvis ikke der foreligger historiske eller offentliggjorte kontroldata, der viser, at et valgt atypisk opløsningsmiddel/bærestof ikke frembringer strukturelle kromosomaberrationer eller andre skadelige virkninger, bør der foretages en indledende undersøgelse for at fastslå, om kontrollen med opløsningsmiddel/bærestof kan accepteres.

Positive kontroller

16.

Der bør altid benyttes dyr til sideløbende positiv kontrol, medmindre laboratoriet har påvist, at det er kompetent til at udføre testen og på det seneste har anvendt testen rutinemæssigt (f.eks. inden for de sidste fem år). Såfremt der ikke indgår en sideløbende positiv kontrolgruppe, bør hvert enkelt forsøg omfatte scoringskontroller (fikserede og ufarvede objektglas). Disse kan opnås ved i scoringen af undersøgelsen at inkludere passende referenceprøver, som er hentet og opbevaret fra et særskilt positivt og periodisk udført kontrolforsøg (f.eks. hver 6.-18. måned) i det laboratorium, hvor testen udføres, f.eks. under kompetencetest og derefter regelmæssigt, hvor det er nødvendigt.

17.

Positive kontrolstoffer bør frembringe en påviselig forøgelse af frekvensen af celler med strukturelle kromosomaberrationer over det spontane niveau. Der bør vælges sådanne doser i de positive kontroller, at virkningerne er tydelige, uden dog at de kodede prøvers identitet umiddelbart afsløres for den, der bedømmer dem. Eksempler på positive kontrolstoffer findes i tabel 1.

Tabel 1

Eksempler på positive kontrolstoffer

Stoffer [CAS-nr.] (referencenr.)

Cyclophosphamidmonohydrat [CAS-nr. 50-18-0 (CAS-nr. 6055-19-2)] (9)

Cyclohexylamin [CAS-nr. 108-91-8] (7)

Mitomycin C [CAS-nr. 50-07-7] (6)

Monomer acrylamid [CAS 79-06-1] (10)

Triethylenmelamin [CAS 51-18-3] (8)

Negative kontroller

18.

Der bør ved hver prøvetagning indgå negative kontroldyr, som kun behandles med opløsningsmiddel eller bærestof og ellers behandles på samme måde som behandlingsgrupperne. Hvis ikke der foreligger historiske eller offentliggjorte kontroldata, som viser, at det valgte opløsningsmiddel/bærestof ikke medfører kromosomaberrationer eller andre skadelige virkninger, bør der også indgå ubehandlede kontroldyr i hver prøvetagning for at fastslå, at kontrollen med bærestof kan accepteres.

FREMGANGSMÅDE

Antal dyr

19.

Gruppernes størrelse ved undersøgelsens start bør fastlægges for at få mindst fem hanner pr. gruppe. Dette antal dyr pr. gruppe anses for at være tilstrækkeligt til at sikre passende statistisk styrke (generelt mulighed for påvisning af mindst en fordobling af frekvensen af kromosomaberrationer, når det negative kontrolniveau er på 1,0 % eller derover med 80 % sandsynlighed ved et signifikansniveau på 0,05) (3) (11). Vejledende vil en undersøgelse med to prøvetagningstidspunkter og tre dosisgrupper og en sideløbende negativ kontrolgruppe samt en positiv kontrolgruppe (som hver består af fem dyr) typisk højst kræve 45 dyr.

Behandlingsplan

20.

Testkemikalier indgives normalt som enkeltdosis (dvs. som en enkelt behandling), men kan indgives efter andre doseringsskemaer, forudsat at de er sagligt begrundet.

21.

I gruppen med højeste dosis udtages der prøver to gange efter behandling. Da det optimale tidspunkt for påvisning af kromosomaberrationer kan afhænge af, hvor lang tid der er påkrævet for optagelse og metabolisme af testkemikaliet, og af testkemikaliets indvirkning på cellecyklussens kinetik, udtages der en tidlig prøve og en sen prøve ca. 24 og 48 timer efter behandling. For andre doser end den højeste dosis bør der udtages en tidlig prøve 24 timer efter behandling (mindre end eller lig med cyklustiden for B-spermatogonier for at optimere sandsynligheden for at score de første metafaser efter behandling), medmindre et andet prøvetagningstidspunkt er kendt som værende bedre egnet og mere berettiget.

22.

Der kan udtages prøver på andre tidspunkter. For kemikalier, der kan have S-uafhængige virkninger, kan tidligere prøvetagning (dvs. inden 24 timer) f.eks. være hensigtsmæssigt.

23.

Der kan benyttes en behandlingsplan med gentagne doser, f.eks. sammen med en test vedrørende et andet endepunkt, hvor der anvendes en 28-dages indgivelsesperiode (f.eks. TM B.58). Der skal dog anvendes yderligere grupper af dyr for at tilgodese de forskellige prøvetagningstidspunkter. Egnetheden af sådanne planer skal tilsvarende begrundes sagligt i hvert enkelt tilfælde.

24.

Inden aflivning gives dyrene en intraperitoneal injektion med en passende dosis metafasestandsende stof (f.eks. Colcemid® eller colchicin). Der udtages prøver af forsøgsdyrene efter et passende tidsrum. For mus og rotter er dette tidsrum ca. 3-5 timer.

Dosisniveauer

25.

Hvis der gennemføres en forundersøgelse til bestemmelse af dosisinterval, fordi der ikke foreligger egnede data, der kan bruges til at vælge dosis, bør den udføres i samme laboratorium med samme art, stamme og behandlingsmåde, som agtes benyttet i hovedundersøgelsen, i henhold til anbefalingerne om gennemførelse af undersøgelser til bestemmelse af dosisinterval (12). Formålet med undersøgelsen bør være at identificere den maksimalt tolererede dosis (MTD) defineret som den dosis, der medfører lette toksiske virkninger i forhold til undersøgelsesperiodens varighed (f.eks. unormal adfærd eller unormale reaktioner, mindre fald i kropsvægt eller cytotoksisk effekt i det hæmatopoietiske system), men ikke død eller tegn på smerte eller lidelse, der kræver, at dyrene aflives (13).

26.

Højeste dosis kan også defineres som en dosis, der i nogen grad fremkalder tegn på toksicitet i spermatogonier (f.eks. et lavere forhold mellem spermatogonmitoser og første og anden meiotiske metafase). Dette lavere forhold må ikke overstige 50 %.

27.

Testkemikalier med specifik biologisk aktivitet ved lav ikke-toksisk dosis (f.eks. hormoner og mitogener) og kemikalier, der udviser mætning af toksikokinetiske egenskaber, kan være undtagelser fra dosisfastsættelseskriterierne og bør evalueres individuelt.

28.

For at opnå dosis/respons-oplysninger bør en fuldstændig undersøgelse omfatte en negativ kontrolgruppe (punkt 18) og mindst tre dosisniveauer generelt adskilt af en faktor på 2, men ikke over 4. Hvis ikke testkemikaliet frembringer toksicitet i en forundersøgelse eller baseret på eksisterende data, bør den højeste dosis for en enkelt indgivelse være 2 000 mg/kg kropsvægt. Hvis testkemikaliet frembringer toksicitet, bør MTD imidlertid være den højeste indgivne dosis, og de anvendte dosisniveauer bør fortrinsvis dække et interval fra den højeste dosis til en dosis, der frembringer ringe eller ingen toksicitet. Når der observeres toksicitet i målvævet (dvs. testiklen) på alle de testede dosisniveauer, tilrådes det at foretage yderligere undersøgelser ved ikke-toksiske doser. Undersøgelser, der skal give en mere fuldstændig karakteristik af de kvantitative dosis/respons-oplysninger, kan kræve yderligere dosisgrupper. For visse typer testkemikalier (f.eks. humanlægemidler), som er omfattet af særlige krav, kan disse grænser variere. Hvis testkemikaliet frembringer toksicitet, bør grænsedosis plus to lavere doser (som beskrevet ovenfor) vælges. Grænsedosis for en indgivelsesperiode på 14 dage eller derover er 1 000 mg/kg kropsvægt/dag, og for indgivelsesperioder på under 14 dage er grænsedosis 2 000 mg/kg kropsvægt/dag.

Indgivelse af doser

29.

Den forventede indgivelsesmåde for mennesker bør tages i betragtning i forbindelse med udformningen af et assay. Andre indgivelsesmåder såsom foder, drikkevand, topisk, subkutant, intravenøst, oralt (med sonde), inhalation eller implantation kan vælges, hvis de kan begrundes. Under alle omstændigheder bør der vælges en indgivelsesmåde, som sikrer tilstrækkelig eksponering af målvævet. Intraperitoneal injektion anbefales normalt ikke, medmindre det er sagligt begrundet, da det normalt ikke er en fysiologisk relevant måde for human eksponering. Hvis testkemikaliet iblandes foder eller drikkevand, navnlig i forbindelse med enkeltdosering, bør det sikres, at tidsrummet mellem indtagelse af foder og drikkevand og prøvetagning er tilstrækkelig stort til, at virkningerne kan påvises (jf. punkt 33). Hvor stor en væskemængde, der kan indgives ad gangen med sonde eller ved injektion, afhænger af forsøgsdyrenes størrelse. Denne mængde må normalt højst være 1 ml/100 g kropsvægt, bortset fra vandige opløsninger, hvor der højst må anvendes 2 ml/100 g kropsvægt. Anvendelse af større mængder (hvis dette er tilladt ifølge lovgivningen om dyrevelfærd) bør begrundes. Testmængden bør variere så lidt som muligt, idet koncentrationen justeres, så indgivelsen sker ved samme mængde i forhold til kropsvægt ved alle dosisniveauer.

Observationer

30.

Der bør foretages generelle kliniske observationer af forsøgsdyrene, og de kliniske tegn bør registreres mindst en gang om dagen, fortrinsvis på samme tidspunkt(er) hver dag og under hensyntagen til det tidspunkt, hvor de forventede virkninger efter dosering topper. Alle dyr observeres mindst to gange dagligt for morbiditet og dødelighed. Alle dyr bør vejes ved undersøgelsens start og mindst en gang om ugen i undersøgelser med gentagne doser samt ved aflivning. Ved undersøgelser af mindst en uges varighed bør foderindtag måles mindst en gang ugentligt. Hvis testkemikaliet indgives via drikkevandet, bør vandindtaget måles ved hvert vandskift og mindst en gang ugentligt. Dyr, der udviser ikke-dødelig indikation for for høj toksicitet, bør aflives før testperiodens udløb (13).

Præparering af kromosomer

31.

Umiddelbart efter aflivning udtages der kønscellesuspensioner fra en eller begge testikler, som eksponeres for hyptonisk væske og fikseres ifølge etablerede protokoller (f.eks. (2) (14) (15)). Derefter stryges cellerne ud på objektglas og farves (16) (17). Alle objektglas bør kodes, så den, der bedømmer dem, ikke kender deres identitet.

Analyse

32.

Der bør scores mindst 200 velpræparerede metafaser pr. dyr (3) (11). Hvis den historiske negative kontrolfrekvens er < 1 %, bør der scores over 200 celler/dyr for at øge den statistiske styrke (3). Der bør anvendes farvningsmetoder, som gør det muligt at identificere centromeren.

33.

Aberrationer af kromosom- og kromatidtypen bør registreres særskilt og klassificeres i undertyper (brud, udveksling). Gaps bør registreres, men ikke tages i betragtning ved bestemmelsen af, hvorvidt et kemikalie fremkalder væsentlige stigninger i forekomsten af celler med kromosomaberrationer. De procedurer, der anvendes i laboratoriet, bør sikre, at analyser af kromosomaberrationer udføres af veluddannede bedømmere. Da præpareringen af objektglas ofte medfører, at en del af metafasecellerne går i stykker, og kromosomerne dermed går tabt, bør scorede celler indeholde et antal centromerer på mindst 2n± 2, hvor n er haploidtallet for kromosomer af den pågældende art.

34.

Selv om testens formål er at påvise ændringer i kromosomstrukturen, er det vigtigt også at notere frekvensen af polyploide celler og celler med endofordoblede kromosomer, hvis dette konstateres (jf. punkt 44).

DATA OG RAPPORTERING

Behandling af resultater

35.

Data fra de enkelte dyr præsenteres i tabelform. For hvert dyr registreres antallet af celler med strukturelle kromosomaberrationer, og antallet af kromosomaberrationer pr. celle bedømmes. Aberrationer af kromatid- og kromosomtypen klassificeret efter undertyper (brud, udvekslinger) bør anføres særskilt med antal og frekvens for forsøgs- og kontrolgrupperne. Gaps registreres særskilt. Frekvensen for gaps anføres, men medtages generelt ikke i analysen af den samlede frekvens for strukturel kromosomaberration. Procentdelen af polyploidi og celler med endofordoblede kromosomer rapporteres, når den observeres.

36.

Data om toksicitet og kliniske tegn bør anføres (jf. punkt 30).

Acceptkriterier

37.

Følgende kriterier bestemmer, om en test kan accepteres:

Den sideløbende negative kontrol er i overensstemmelse med offentliggjorte normer for historiske negative kontroldata, som generelt forventes at være > 0 % og ≤ 1,5 % celler med kromosomaberrationer, og laboratoriets historiske kontroldata, hvis sådanne foreligger (jf. punkt 10 og 18).

Sideløbende positive kontroller fremkalder responser, der er i overensstemmelse med offentliggjorte normer for historiske positive kontroldata eller laboratoriets historiske positive kontroldatabase, hvis en sådan foreligger, og medfører en statistisk signifikant stigning sammenlignet med den negative kontrol (jf. punkt 17 og 18).

Et tilstrækkeligt antal celler og doser er blevet analyseret (jf. punkt 28 og 32).

Kriterierne for valg af højeste dosis er i overensstemmelse med kriterierne i punkt 25 og 26.

38.

Hvis der iagttages såvel mitose som meiose, bestemmes forholdet mellem spermatogonmitoser og første og anden meiotiske metafase som et mål for den cytotoksiske effekt på alle behandlede dyr og negative kontroldyr i en samlet prøve på 100 celler under deling for hvert dyr. Hvis der kun iagttages mitose, bestemmes mitoseindekset i mindst 1 000 celler for hvert dyr.

Vurdering og fortolkning af resultater

39.

Mindst tre behandlede doseringsgrupper bør analyseres for at tilvejebringe tilstrækkelige data til dosis/respons-analyse.

40.

Såfremt alle acceptkriterier er opfyldt, anses et testkemikalie for at være klart positivt, hvis:

mindst en af testdoserne udviser en statistisk signifikant stigning sammenlignet med den sideløbende negative kontrol

stigningen er dosisafhængig i mindst en udtaget prøve, og

et eller flere af resultaterne ligger uden for det acceptable interval for negative kontroldata eller fordelingen af laboratoriets historiske negative kontroldata (f.eks. Poisson-baseret kontrolgrænse på 95 %), hvis disse foreligger.

Testkemikaliet anses derefter for at kunne fremkalde kromosomaberrationer i forsøgsdyrenes spermatogonier. Anbefalinger til de mest hensigtsmæssige statistiske metoder kan også findes i litteraturen (11) (18). I de anvendte statistiske test skal dyret betragtes som forsøgsenheden.

41.

Såfremt alle acceptkriterier er opfyldt, anses et testkemikalie for at være klart negativt, hvis:

ingen af testdoserne udviser en statistisk signifikant stigning sammenlignet med den sideløbende negative kontrol

der ikke indtræder en dosisafhængig stigning ved en af forsøgsbetingelserne, og

alle resultaterne ligger inden for det acceptable interval for negative kontroldata eller laboratoriets historiske negative kontroldata (f.eks. Poisson-baseret kontrolgrænse på 95 %), hvis disse foreligger.

Testkemikaliet anses derefter for ikke at kunne fremkalde kromosomaberrationer i forsøgsdyrenes spermatogonier. Anbefalinger til de mest hensigtsmæssige statistiske metoder kan også findes i litteraturen (11) (18). Et negativt resultat udelukker ikke, at kemikaliet kan fremkalde kromosomaberrationer på senere udviklingsstadier, som ikke indgår i undersøgelsen, eller genmutationer.

42.

Der stilles ikke krav om verifikation af en klart positiv eller klart negativ respons.

43.

Hvis responsen hverken er klart negativ eller klart positiv, og for at bidrage til at fastslå den biologiske relevans af et resultat (f.eks. en svag eller usikker stigning), bør dataene evalueres af eksperter, og/eller der bør foretages yderligere undersøgelser på baggrund af eksisterende forsøgsdata, herunder undersøgelse af, om det positive resultat ligger uden for det acceptable interval for negative kontroldata eller laboratoriets historiske negative kontroldata (19).

44.

I sjældne tilfælde giver dataene selv efter yderligere undersøgelser ikke mulighed for at konkludere, om resultaterne er positive eller negative. Konklusionen er derfor, at testkemikalieresponsen er usikker.

45.

En forøgelse af antallet af polyploide celler kan være tegn på, at testkemikaliet er i stand til at inhibere mitoseprocesser og fremkalde kromosomantalsaberrationer (20). En forøgelse af antallet af celler med endofordoblede kromosomer kan være tegn på, at testkemikaliet er i stand til at inhibere cellecyklussens forløb (21) (22), hvilket er en anden måde at fremkalde kromosomantalsændringer på end ved inhibering af mitoseprocesser (jf. punkt 2). Forekomsten af polyploide celler og celler med endofordoblede kromosomer bør derfor registreres særskilt.

Testrapport

46.

Testrapporten bør indeholde følgende oplysninger:

 

Resumé

 

Testkemikalie:

oprindelse, batchnummer, sidste anvendelsesdato, hvis dette foreligger

testkemikaliets stabilitet, hvis denne er kendt

testkemikaliets opløselighed og stabilitet i opløsningsmidlet, hvis dette er kendt

måling af pH-værdi, osmolalitet og bundfald i det dyrkningsmedium, som testkemikaliet blev tilsat, hvor det er relevant.

 

Stof med kun én bestanddel:

fysisk udseende, vandopløselighed og yderligere relevante fysisk-kemiske egenskaber

kemisk identifikation, f.eks. IUPAC-navn eller CAS-navn, CAS-nummer, SMILES- eller InChI-kode, strukturformel, renhed, kemisk identitet af urenheder, i det omfang det er relevant og praktisk muligt, osv.

 

Stof med flere bestanddele, UVCB-stoffer og blandinger:

kendetegnet så vidt muligt ved kemisk identitet (jf. ovenfor), kvantitativ forekomst og bestanddelenes relevante fysisk-kemiske egenskaber.

 

Præparering af testkemikaliet:

begrundelse for valg af bærestof

testkemikaliets opløselighed og stabilitet i opløsningsmidlet/bærestoffet

fastlæggelse af sammensætning af foder, drikkevand eller inhalationsformulering

analytiske bestemmelser af formuleringer (f.eks. stabilitet, homogenitet og nominelle koncentrationer), når disse foretages.

 

Forsøgsdyr:

anvendt art/stamme og begrundelse herfor

antal dyr og deres alder

oprindelse, miljøbetingelser, foder mv.

metode til entydig identifikation af dyr

for kortvarige undersøgelser: de enkelte dyrs vægt ved testens begyndelse og afslutning. For undersøgelser af mere end en uges varighed: individuel kropsvægt under undersøgelsen og fødeindtagelse. Kropsvægtinterval, gennemsnit og standardafvigelse for hver enkelt gruppe bør medtages.

 

Testbetingelser:

positive og negative kontroldata (bærestof/opløsningsmiddel)

data fra en eventuel forundersøgelse til bestemmelse af dosisinterval

begrundelse for valg af dosisniveau

begrundelse for indgivelsesvej

oplysninger om præparering af testkemikaliet

oplysninger om indgivelse af testkemikaliet

begrundelse for aflivningstidspunkter

metoder til måling af dyretoksicitet, herunder om muligt histopatologiske eller hæmatologiske analyser samt frekvensen for observationer og vejning af dyrene

metoder til kontrol af, at testkemikaliet er nået frem til målvævet eller det almindelige kredsløb, hvis der er opnået negative resultater

faktisk dosis (mg/kg kropsvægt/dag) beregnet på baggrund af testkemikaliets koncentration i foder/drikkevand (ppm) og indtagelse, hvis relevant

oplysninger om foder- og vandkvalitet

detaljeret beskrivelse af behandlings- og prøvetagningsplaner samt begrundelser for valg

aflivningsmetode

analgesimetode (hvis anvendt)

procedurer for isolering af væv

det metafasestandsende kemikalies identitet og koncentration og behandlingens varighed

metoder til præparering af objektglas

kriterier for scoring af aberrationer

antal analyserede celler pr. dyr

kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv, negativ eller usikker.

 

Resultater:

dyrenes tilstand før og i løbet af testperioden, herunder tegn på toksicitet

krops- og organvægt ved aflivning (hvis der benyttes flere behandlinger, kropsvægt under behandlingerne)

tegn på toksicitet

mitoseindeks

forhold mellem spermatogonmitoser og første og anden meiotiske metafase eller anden dokumentation for eksponering af målvævet

antal aberrationer og type, anført særskilt for hvert dyr

samlet antal aberrationer pr. gruppe med gennemsnit og standardafvigelser

antal celler med aberrationer pr. gruppe med gennemsnit og standardafvigelser

dosis/respons-forhold, hvor muligt

anvendte statistiske analyser og metoder

data for sideløbende negative kontroller

historiske negative kontroldata med intervaller, gennemsnit, standardafvigelser og konfidensinterval på 95 % (hvor det er muligt) eller offentliggjorte historiske negative kontroldata, der anvendes til at bestemme, om testresultaterne kan accepteres

data for sideløbende positive kontroller

eventuelt observerede ploidiændringer, herunder frekvensen for polyploide og/eller endofordoblede celler.

 

Diskussion af resultaterne

 

Konklusion

LITTERATUR

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.

(2)

Adler, I.-D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt og J. M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, s. 275-306.

(3)

Adler I.-D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. og Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313-318.

(4)

Russo, A. (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutation Res., 455, 167-189.

(5)

Hess, R.A. og de Franca L.R. (2008). Spermatogenesis and Cycle of the Seminiferous Epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, Cheng C.Y. (Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, s. 1-15.

(6)

Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C, Mutation. Res., 23(3): 368-379. Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel C., Lambert B. og Magnusson J. (Eds.) Liss, New York, s. 477-484.

(7)

Cattanach, B.M., og Pollard C.E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse, Mutation Res., 12, 472-474.

(8)

Cattanach, B.M., og Williams, C.E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens, Mutation Res., 13, 371-375.

(9)

Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia, Humangenetik 29, 135-140.

(10)

Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice, Mutation Res., 57(3): 313–324.

(11)

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. og Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417, 19–30.

(12)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. og Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319.

(13)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, (No 19.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(14)

Yamamoto, K. og Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, 207-209.

(15)

Hsu, T.C., Elder, F. og Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Environ. Mutagen., 1, 291-294.

(16)

Evans, E.P., Breckon, G., og Ford, C.E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289-294.

(17)

Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. og Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 115-141.

(18)

Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. og Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 184-232.

(19)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. og Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutation Res., 723, 87-90.

(20)

Warr T.J., Parry E.M. og Parry J.M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens, Mutation Res., 287, 29-46.

(21)

Huang, Y., Change, C. og Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res., 43, 1362-1364.

(22)

Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403-413.

Tillæg

DEFINITIONER

Aneuploidi: enhver afvigelse fra det normale diploide (eller haploide) kromosomtal for et eller flere kromosomer, men ikke for et eller flere komplette kromosomsæt (polyploidi).

Centromer: region(er) af et kromosom, hvortil tentrådene påhæftes under celledeling, således at datterkromosomerne kan bevæge sig korrekt i forhold til dattercellernes poler.

Kemikalie: et stof eller en blanding.

Kromosomdiversitet: kromosomformernes diversitet (f.eks. metacentrisk, akrocentrisk osv.) og størrelse.

Aberration af kromatidtypen: beskadigelse af kromosomstrukturen i form af brud på enkeltkromatider eller brud på og sammenføjning af kromatider.

Aberration af kromosomtypen: beskadigelse af kromosomstrukturen i form af brud på – eller brud på og sammenføjning af – begge kromatider på samme sted.

Klastogen: alle kemikalier, der forårsager strukturelle kromosomaberrationer i populationer af celler eller organismer.

Gap: en akromatisk beskadigelse, som er mindre end bredden af et kromatid, og hvor forskydningen af kromatiderne er minimal.

Genotoksisk: et generelt udtryk, der omfatter alle former for DNA- eller kromosombeskadigelse, herunder brud, deletioner, addukter, ændringer af nukleotider og koblinger, omlejringer, mutationer, kromosomaberrationer og aneuploidi. Det er ikke alle former for genotoksiske virkninger, der forårsager mutationer eller stabil kromosomskade.

Mitoseindeks (MI): forholdet mellem antallet af celler i metafase og det samlede antal celler i en population. Viser populationens formeringsgrad.

Mitose: deling af cellekernen, der normalt inddeles i profase, prometafase, metafase, anafase og telofase.

Mutagen: forårsager arvelige ændringer af DNA-baseparsekvens(er) i gener eller i kromosomstrukturen (kromosomaberrationer).

Antalsafvigelse: ændring af kromosomtallet i forhold til det for de pågældende dyr normale antal.

Polyploidi: et multiplum af det haploide kromosomtal (n), som ikke er det diploide tal (dvs. 3n, 4n osv.).

Strukturel aberration: ændring i kromosomstrukturen, som kan iagttages ved mikroskopisk undersøgelse i celledelingens metafase i form af deletioner og fragmenter, udvekslinger.

Testkemikalie: alle stoffer eller blandinger, der testes ved hjælp af denne forsøgsmetode.

UVCB: kemiske stoffer af ukendt eller variabel sammensætning, komplekse reaktionsprodukter og biologiske materialer.

"

(5)

Del B, kapitel B.40, affattes således:

"B.40   IN VITRO-HUDÆTSNING: FORSØGSMETODE TIL MÅLING AF TRANSKUTAN ELEKTRISK MODSTAND (TER)

INDLEDNING

1.

Denne forsøgsmetode svarer til OECD’s testvejledning (Test Guideline (TG)) 430 (2015). Hudætsning defineres som fremkomsten af irreversibel ødelæggelse af huden, der viser sig som en synlig nekrose gennem epidermis til dermis efter påføring af et testkemikalie [som defineret i De Forenede Nationers (FN’s) globale harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier (GHS) (1) og Den Europæiske Unions (EU’s) forordning 1272/2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger (CLP) (1)]. Den opdaterede forsøgsmetode B.40 indeholder en in vitro-procedure, som gør det muligt at identificere ikke-ætsende og ætsende stoffer og blandinger i overensstemmelse med UN GHS (1) og CLP.

2.

Vurderingen af hudætsning har typisk omfattet brug af laboratoriedyr (TM B.4, som svarer til OECD TG 404, der oprindeligt blev vedtaget i 1981 og revideret i 1992, 2002 og 2015) (2). Ud over nærværende TM B.40 er der blevet valideret og vedtaget andre in vitro-forsøgsmetoder til testning af kemikaliers hudætsningspotentiale som TM B.40.A (der svarer til OECD TG 431) (3) og TM B.65 (der svarer til OECD TG 435) (4), der også er i stand til at identificere underkategorier af ætsende kemikalier, når dette er nødvendigt. Der er blevet vedtaget flere validerede in vitro-forsøgsmetoder som TM B.46 (der svarer til OECD TG 439) (5), som kan anvendes til testning af hudirritation. Et vejledende dokument fra OECD om integrerede tilgange til testning og vurdering (IATA) vedrørende hudætsning og -irritation beskriver flere moduler, som grupperer informationskilder og analyseværktøjer, og vejleder i, i) hvordan eksisterende forsøgsdata og ikke-forsøgsdata integreres i og anvendes til vurdering af kemikaliers hudirritations- og hudætsningspotentiale, og ii) foreslår en tilgang, når der er behov for yderligere testning (6).

3.

Denne forsøgsmetodes endepunkt for menneskers sundhed er hudætsning. Den er baseret på forsøgsmetoden til måling af den transkutane elektriske modstand (TER) i rottehud, hvor der anvendes hudlapper til identificering af ætsende stoffer ved deres evne til at beskadige stratum corneum og svække dets barrierefunktion. Den tilsvarende OECD-testvejledning blev oprindeligt vedtaget i 2004 og opdateret i 2015 for at referere til det vejledende IATA-dokument.

4.

For at evaluere in vitro-testning af hudætsning i lovgivningsøjemed blev der gennemført prævalideringsundersøgelser (7) efterfulgt af en formel valideringsundersøgelse af TER-forsøgsmetoden med rottehud til vurdering af hudætsning (8) (9) (10) (11). På baggrund af resultatet af disse undersøgelser blev det henstillet, at TER-forsøgsmetoden (betegnet som den validerede referencemetode – VRM) blev anvendt til vurdering af in vivo-hudætsning i lovgivningsøjemed (12) (13) (14).

5.

Inden der kan anvendes en foreslået lignende eller ændret in vitro-TER-forsøgsmetode end VRM’en til vurdering af hudætsning i lovgivningsøjemed, skal dens pålidelighed og relevans (nøjagtighed) og grænserne for dens påtænkte anvendelse bestemmes for at sikre, at den er sammenlignelig med VRM’en, i overensstemmelse med kravene om ydeevnestandarder (15). OECD-aftalen om gensidig anerkendelse af data vil først være garanteret, når en foreslået ny eller opdateret forsøgsmetode i henhold til ydeevnestandarderne er blevet gennemgået og medtaget i den tilsvarende OECD-testvejledning.

DEFINITIONER

6.

De anvendte definitioner er forklaret i tillægget.

INDLEDENDE OVERVEJELSER

7.

I henhold til en valideringsundersøgelse (10) og andre offentliggjorte undersøgelser (16) (17) kan forsøgsmetoden vedrørende måling af TER i rottehud skelne mellem stoffer, der er hudætsende, og stoffer, der ikke er hudætsende, med en overordnet følsomhed på 94 % (51/54) og specificitet på 71 % (48/68) for en database med 122 stoffer.

8.

Denne forsøgsmetode vedrører in vitro-test af hudætsning. Den gør det muligt at identificere ikke-ætsende og ætsende testkemikalier i henhold til UN GHS/CLP. Som det fremgår af valideringsundersøgelserne (8) (9) (10) (11), er denne forsøgsmetode begrænset derved, at den ikke gør det muligt at inddele de ætsende stoffer og blandinger i underkategorier i henhold til UN GHS/CLP. Den gældende lovramme afgør, hvordan denne forsøgsmetode anvendes. Forsøgsmetoden giver ikke fyldestgørende oplysninger om hudirritation, men det skal bemærkes, at TM B.46 specifikt vedrører in vitro-test af hudirritation (5). For fuldt ud at kunne vurdere de lokale virkninger på huden efter en enkelt dermal eksponering bør OECD’s vejledende dokument om IATA følges (6).

9.

Der er blevet testet en lang række forskellige kemikalier, som primært repræsenterer stoffer, i forbindelse med valideringen af denne forsøgsmetode, og den empiriske database for valideringsundersøgelsen omfatter 60 kemikalier i alt, som dækker en lang række kemiske grupper (8) (9). På baggrund af alle tilgængelige data kan forsøgsmetoden anvendes på en lang række kemiske grupper og fysiske tilstande, herunder væsker, halvfaste stoffer, faste stoffer og voks. Da det ikke altid er muligt at få fat i testemner med egnede referencedata i specifikke fysiske tilstande, skal det bemærkes, at et forholdsvis lille antal vokser og ætsende stoffer i fast form er blevet vurderet under valideringen. Væsker kan være vandige eller ikke-vandige, og faste stoffer kan være opløselige eller uopløselige i vand. I de tilfælde, hvor det kan påvises, at forsøgsmetoden ikke er egnet til en specifik kategori af stoffer, bør forsøgsmetoden ikke anvendes til forsøg med denne specifikke kategori af stoffer. Eftersom forsøgsmetoden kan anvendes på stoffer, forventes den desuden at kunne anvendes på blandinger. Da blandinger imidlertid omfatter et vidt spektrum af kategorier og sammensætninger, og da der for øjeblikket kun foreligger begrænsede oplysninger om testning af blandinger, bør forsøgsmetoden i de tilfælde, hvor det kan påvises, at den ikke er egnet til en specifik kategori af blandinger (f.eks. efter en strategi som fremsat af Eskes et al., 2012) (18), ikke anvendes til forsøg med denne specifikke kategori af blandinger. Før forsøgsmetoden bruges på en blanding for at generere data i lovgivningsøjemed, bør det overvejes, om den vil give resultater, som er egnede til formålet, og i givet fald hvorfor. Sådanne overvejelser er ikke nødvendige, når der foreligger et myndighedskrav om test af blandingen. Gasser og aerosoler er endnu ikke vurderet ved en valideringsundersøgelse (8) (9). Selv om det er tænkeligt, at disse kan testes ved hjælp af TER-forsøgsmetoden, muliggør den nuværende forsøgsmetode ikke test af gasser og aerosoler.

PRINCIP FOR TESTEN

10.

Testkemikaliet påføres i op til 24 timer på den epidermale overflade af hudlapper i et testsystem med to rum, hvor hudlapperne fungerer som adskillelse mellem de to rum. Hudlapperne tages fra 28-30 dage gamle rotter, der er aflivet på en human måde. Ætsende kemikalier identificeres ved deres evne til at beskadige stratum corneum og svække dets barrierefunktion, hvilket kan måles som et fald i den naturlige TER under en tærskelværdi (16) (jf. punkt 32). For TER i rottehud er der valgt en tærskelværdi på 5 kΩ på baggrund af omfattende data om en lang række stoffer, hvor langt de fleste værdier var enten langt over (ofte > 10 kΩ) eller langt under (ofte < 3 kΩ) denne værdi (16). Testkemikalier, som ikke er ætsende hos dyr, men som er irriterende eller ikke-irriterende, medfører generelt ikke en TER under denne tærskelværdi. Brugen af andre hudpræparater eller andet udstyr kan endvidere ændre tærskelværdien og nødvendiggøre yderligere validering.

11.

Testproceduren omfatter et farvebindingstrin til bekræftende testning af positive resultater i TER-metoden, herunder værdier omkring 5 kΩ. Farvebindingstrinnet viser, om stigningen i gennemtrængeligheden for ioner skyldes fysisk ødelæggelse af stratum corneum. TER-metoden med rottehud har vist sig at kunne forudsige in vivo-ætsningen hos kaniner vurderet i henhold til TM B.4 (2).

PÅVISNING AF KOMPETENCE

12.

Inden laboratorierne påbegynder rutinemæssig brug af TER-forsøgsmetoden med rottehud, som er i overensstemmelse med denne forsøgsmetode, bør de påvise deres tekniske kompetence ved korrekt klassificering af de 12 anbefalede kompetencestoffer i tabel 1. I situationer, hvor et stof på listen ikke kan fås, eller hvor det er berettiget, kan et andet stof anvendes, hvis der foreligger tilstrækkelige in vivo- og in vitro-referencedata herfor (f.eks. fra listen over referencekemikalier (16)), forudsat at der benyttes de samme udvælgelseskriterier som beskrevet i tabel 1.

Tabel 1

Liste over kompetencestoffer (2)

Stof

CAS RN

Kemisk gruppe (3)

UN GHS-/CLP-kat. baseret på in vivo-resultater (4)

VRM-kat. baseret på in vitro-resultater

Fysisk tilstand

pH (5)

In vivo– ætsende stoffer

N,N’-dimethyl dipropylentriamin

10563-29-8

organisk base

1A

6 × C

Flyd.

8,3

1,2-diaminopropan

78-90-0

organisk base

1A

6 × C

Flyd.

8,3

Svovlsyre (10 %)

7664-93-9

uorganisk syre

(1A/)1B/1C

5 × C 1 × NC

Flyd.

1,2

Kaliumhydroxid (10 % aq.)

1310-58-3

uorganisk base

(1A/)1B/1C

6 × C

Flyd.

13,2

Octansyre (kaprylsyre)

124-07-2

organisk syre

1B/1C

4 × C 2 × NC

Flyd.

3,6

2-tert-butylphenol

88-18-6

phenol

1B/1C

4 × C 2 × NC

Flyd.

3,9

In vivo – ikke-ætsende stoffer

Isostearinsyre

2724-58-5

organisk syre

NC

6 × NC

Flyd.

3,6

4-amino-1,2,4-triazol

584-13-4

organisk base

NC

6 × NC

Fast

5,5

Phenethylbromid

103-63-9

elektrofil

NC

6 × NC

Flyd.

3,6

4-(methylthio)-benzaldehyd

3446-89-7

elektrofil

NC

6 × NC

Flyd.

6,8

1,9-decadien

1647-16-1

neutralt organisk

NC

6 × NC

Flyd.

3,9

Tetrachlorethylen

127-18-4

neutralt organisk

NC

6 × NC

Flyd.

4,5

Forkortelser: aq. = vandig; CAS RN = Registernummer i Chemical Abstracts Service VRM = valideret referencemetode; C = ætsende; NC = ikke-ætsende.

FREMGANGSMÅDE

13.

Der findes standardprocedurer (SOP’er) for TER-forsøgsmetoden til testning for hudætsning med rottehud (19). De TER-forsøgsmetoder med rottehud, der er omfattet af denne forsøgsmetode, bør overholde følgende betingelser:

Dyr

14.

Der bør anvendes rotter, fordi deres huds følsomhed over for stoffer med denne forsøgsmetode tidligere er påvist (12), og fordi de er den eneste kilde til hud, der er formelt valideret (8) (9). Rottens alder (når hudprøven tages) og stamme er særligt vigtig for at sikre, at hårfolliklerne er i hvile, inden væksten af voksenhår begynder.

15.

Hårene på ryggen og flanken af unge (ca. 22 dage gamle) han- eller hunrotter (af Wistar-stammen eller lignende stamme) fjernes omhyggeligt med en lille dyresaks. Dyrene vaskes dernæst omhyggeligt, idet der gnubbes let, og det pågældende hudområde holdes neddyppet i en opløsning af antibiotika, som f.eks. indeholder streptomycin, penicillin, chloramphenicol og amphotericin i koncentrationer, der er høje nok til at inhibere bakterievækst. Dyrene vaskes igen med antibiotika på tredje- eller fjerdedagen efter den første vask og skal anvendes senest tre dage efter den anden vask, når stratum corneum har regenereret sig efter fjernelsen af hår.

Fremstilling af hudlapper

16.

Dyrene aflives på human måde, når de er 28-30 dage gamle. Alderen er kritisk. Ryghuden fjernes fra hvert dyr, og overflødigt fedtvæv fjernes omhyggeligt, idet det skrælles af huden. Hudlapper med en diameter på ca. 20 mm udtages. Huden kan gemmes, indtil lapperne skal anvendes, hvis det er påvist, at positive og negative kontroldata svarer til de data, der opnås med frisk hud.

17.

Hver hudlap anbringes for enden af et rør af PTFE (polytetrafluorethylen), idet det sikres, at den epidermale overflade er i kontakt med røret. En O-ring af gummi sættes tætsluttende omkring rørets ende for at holde huden på plads, og overflødigt væv klippes af. O-ringen af gummi forsegles derefter omhyggeligt til enden af PTFE-røret med vaseline. Røret fastholdes ved hjælp af fjederklemmer i et receptorkammer, som indeholder en MgSO4-opløsning (154 mM) (figur 1). Hudlappen skal være fuldstændigt dækket af MgSO4-opløsningen. Der kan fremstilles op til 10-15 hudlapper af huden fra en enkelt rotte. Rørets og O-ringens dimensioner fremgår af figur 2.

18.

Inden testen indledes, måles TER i to hudlapper for at kontrollere den enkelte dyrehuds kvalitet. For begge hudlapper skal den elektriske modstand være større end 10 kΩ, hvis resten af lapperne skal kunne anvendes i forsøgsmetoden. Hvis modstanden er mindre end 10 kΩ, kasseres resten af lapperne fra den pågældende hud.

Påføring af testkemikalier og kontrolstoffer

19.

Der bør anvendes sideløbende positive og negative kontroller i hver analyseserie (hvert forsøg) for at sikre, at forsøgsmodellen fungerer korrekt. Der skal anvendes hudlapper fra et enkelt dyr i hver analyseserie (hvert forsøg). Som testkemikalier til de positive og negative kontroller foreslås henholdsvis 10 M saltsyre og destilleret vand.

20.

Flydende testkemikalier (150 μl) påføres på den epidermale overflade inde i røret. Ved faste teststoffer skal en tilstrækkelig mængde stof påføres hudlappen, så hele epidermisoverfladen er dækket af stoffet. Der tilsættes deioniseret vand (150 μl) oven på det faste stof, og røret rystes forsigtigt. For at sikre maksimal kontakt med huden kan det være nødvendigt at opvarme visse faste stoffer til 30 °C, så de smelter eller blødgøres, eller formale dem til granulat eller pulver.

21.

Der bruges tre hudlapper til hvert test- og kontrolkemikalie i hver analyseserie (hvert forsøg). Testkemikalierne skal sidde på huden i 24 timer ved 20-23 °C. Testkemikaliet fjernes under rindende ledningsvand, der højst må have stuetemperatur, indtil der ikke kan fjernes mere af stoffet.

TER-målinger

22.

Hudens impedans måles som TER ved hjælp af en wheatstone-lavvoltvekselstrømsmålebro (18). De generelle specifikationer for broen er en driftsspænding på 1-3 V, en sinusformet eller rektangulært formet vekselstrøm på 50-1 000 Hz og et måleområde på mindst 0,1-30 kΩ. Den målebro, der anvendes i valideringsundersøgelsen, målte induktans, kapacitet og modstand op til værdier på henholdsvis 2 000 H, 2 000 μF og 2 MΩ ved frekvenser på 100 Hz eller 1 kHz ved hjælp af serieværdier eller parallelle værdier. I forbindelse med TER-ætsningsassayet registreres målingerne af modstand ved en frekvens på 100 Hz og ved hjælp af serieværdier. Før den elektriske modstand måles, reduceres hudens overfladespænding ved tilsætning af 70 % ethanol i så tilstrækkelig mængde, at hele epidermis dækkes. Efter nogle få sekunder fjernes ethanolen fra røret, og vævet fugtes ved tilsætning af 3 ml MgSO4-opløsning (154 mM). Elektroderne fra målebroen anbringes på hver sin side af hudlappen for at måle modstanden i kΩ/hudlap (figur 1). Elektrodedimensioner og længden af elektroderne under krokodillenæbbene ses i figur 2. Krokodillenæbbet på den indre elektrode hviler på toppen af PTFE-røret under modstandsmålingen, hvorved det sikres, at et konstant stykke af elektroden er nede i MgSO4-opløsningen. Den ydre elektrode er anbragt inde i receptorkammeret, så den rører ved kammerbunden. Afstanden mellem fjederklemmen og bunden af PTFE-røret skal holdes konstant (figur 2), da den har indflydelse på den målte modstand. Det betyder, at afstanden mellem den indre elektrode og hudlappen skal være konstant og så lille som mulig (1-2 mm).

23.

Hvis den målte modstand er større end 20 kΩ, kan det skyldes, at rester af testkemikaliet ligger som en belægning på hudlappens epidermale overflade. Man kan forsøge at fjerne denne belægning ved at holde en tommelfinger iført en gummitut for PTFE-røret og ryste røret i ca. 10 sekunder. Derefter kasseres MgSO4-opløsningen, og målingen gentages med en ny MgSO4-opløsning.

24.

Testapparaturets egenskaber og dimensioner og den anvendte forsøgsprocedure kan have indflydelse på de opnåede TER-værdier. Tærskelværdien for ætsning, 5 kΩ, blev bestemt med det apparatur og den procedure, der er beskrevet i denne forsøgsmetode. Hvis testbetingelserne ændres, eller der anvendes andet apparatur, kan der blive tale om andre tærskel- og kontrolværdier. Det anbefales derfor, at metoden og tærskelværdierne for modstand kalibreres ved at teste en række kompetencestoffer, der vælges blandt de stoffer, som blev anvendt i valideringsundersøgelsen (8) (9), eller blandt kemiske grupper, der svarer til de undersøgte stoffer. Tabel 1 viser et sæt relevante kompetencestoffer.

Farvebindingsmetoder

25.

Eksponering for visse ikke-ætsende stoffer kan bevirke, at modstanden falder til under tærskelværdien på 5 kΩ, hvorved ioner kan passere gennem stratum corneum, hvilket sænker den elektriske modstand (9). Neutrale organiske stoffer og stoffer med overfladeaktive egenskaber (herunder rengøringsmidler, emulgatorer og andre overfladeaktive stoffer) kan fjerne hudfedt og gøre barrieren gennemtrængelig for ioner. Hvis TER-værdierne for disse kemikalier er mindre end eller omkring 5 kΩ, og der ikke forekommer synlige ødelæggelser af hudlapperne, skal farvestoffets evne til at trænge ned i kontrolvævet og det behandlede væv vurderes med henblik på at afgøre, om de opnåede TER-værdier skyldes øget hudgennemtrængelighed eller hudætsning (7) (9). I sidstnævnte tilfælde, hvor stratum corneum er ødelagt, trænger farvestoffet sulforhodamin B efter påføring på hudoverfladen hurtigt ned og farver det underliggende væv. Netop dette farvestof er stabilt i forbindelse med en lang række stoffer og påvirkes ikke af den ekstraktionsprocedure, der er beskrevet i det følgende.

Påføring og fjernelse af farvestoffet sulforhodamin B

26.

Efter TER-undersøgelsen fjernes magnesiumsulphatopløsningen fra røret, og huden undersøges omhyggeligt for synlige ødelæggelser. Hvis ikke der forekommer større synlig ødelæggelse (f.eks. perforation), påføres 150 μl af en 10 % (w/v)-opløsning af sulforhodamin B (Acid Red 52; C.I. 45100; CAS-nummer 3520-42-1) i destilleret vand på den epidermale overflade af hver hudlap i to timer. Disse hudlapper vaskes derefter i ca. 10 sekunder med ledningsvand, der ikke er varmere end stuetemperatur, for at fjerne overskydende/ikke-bundetfarvestof. Hver hudlap fjernes omhyggeligt fra PTFE-røret og anbringes i et glas (f.eks. et 20 ml-glas til scintillationsmålinger) indeholdende deioniseret vand (8 ml). Glasset rystes forsigtigt i fem minutter for at fjerne yderligere ikke-bundet farvestof. Denne skylning gentages, hvorefter hudlapperne fjernes og anbringes i glas, der indeholder 5 ml af en 30 % (w/v)-opløsning af natriumdodecylsulphat (SDS) i destilleret vand. Glassene inkuberes ved 60 °C til næste dag.

27.

Efter inkubationen fjernes og kasseres hudlapperne, og den tilbageværende opløsning centrifugeres i otte minutter ved 21 °C (relativ centrifugalkraft ~ 175 × g). 1 ml af supernatanten fortyndes 5 gange (v/v) [dvs. 1 ml + 4 ml] med en 30 % (w/v) SDS-opløsning i destilleret vand. Opløsningens optiske tæthed (OD) måles ved 565 nm.

Beregning af farveindhold

28.

Mængden af sulforhodamin B pr. hudlap beregnes ud fra OD-værdierne (9) (sulforhodamin B’s molære ekstinktionskoefficient ved 565 nm = 8,7 × l04; molekylvægten = 580). Farveindholdet bestemmes for hver hudlap ved hjælp af en passende kalibreringskurve, hvorefter et gennemsnitligt farveindhold beregnes for replikaterne.

Acceptkriterier

29.

De gennemsnitlige TER-resultater godkendes, hvis værdierne for de sideløbende positive og negative kontroller falder inden for de acceptable intervaller for metoden i testlaboratoriet. De acceptable modstandsintervaller for den metode og det apparatur, der er beskrevet ovenfor, er anført i nedenstående tabel:

Kontrol

Stof

Modstandsinterval (kΩ)

Positiv

10 M saltsyre

0,5-1,0

Negativ

Destilleret vand

10-25

30.

De gennemsnitlige resultater for farvebinding godkendes, hvis værdierne for de sideløbende kontroller falder inden for de acceptable intervaller for metoden. De foreslåede acceptable intervaller for farveindhold for de kontrolstoffer, den metode og det apparatur, der er beskrevet ovenfor, er anført i nedenstående tabel:

Kontrol

Stof

Interval af farveindhold (μg/hudlap)

Positiv

10 M saltsyre

40-100

Negativ

Destilleret vand

15-35

Fortolkning af resultater

31.

Den TER-tærskelværdi, hvorved der skelnes mellem ætsende og ikke-ætsende testkemikalier, blev opstillet under forsøgsmetodeoptimeringen, testet forud for validering og bekræftet i en formel valideringsundersøgelse.

32.

Forudsigelsesmodellen for TER-forsøgsmetoden til testning for hudætsning med rottehud (9) (19), der hidrører fra UN GHS-/CLP-klassificeringssystemet, vises nedenfor:

Testkemikaliet betragtes ikke som værende hudætsende:

i)

hvis den gennemsnitlige TER-værdi for testkemikaliet er større end (>) 5 kΩ, eller

ii)

hvis den gennemsnitlige TER-værdi for testkemikaliet er mindre end eller lig med (≤) 5 kΩ, og

hudlappen ikke udviser synlig ødelæggelse (f.eks. perforation), og

det gennemsnitlige farveindhold er mindre end (>) det gennemsnitlige farveindhold, der samtidig er målt i den positive kontrol på 10 M HCl (jf. punkt 30 vedrørende positive kontrolværdier).

Testkemikaliet betragtes som værende hudætsende:

i)

hvis den gennemsnitlige TER-værdi for testkemikaliet er mindre end eller lig med (≤) 5 kΩ, og hudlappen er synligt beskadiget (f.eks. perforation), eller

ii)

hvis den gennemsnitlige TER-værdi for testkemikaliet er mindre end eller lig med (≤) 5 kΩ, og

hudlappen ikke udviser synlig ødelæggelse (f.eks. perforation), men

det gennemsnitlige farveindhold er større end eller lig med (≥) det gennemsnitlige farveindhold, der samtidig er målt i den positive kontrol på 10 M HCl (jf. punkt 30 vedrørende positive kontrolværdier).

33.

En analyseserie (et forsøg) bestående af mindst tre hudlapsreplikater bør være tilstrækkelig for et testkemikalie, når klassificeringen er entydig. I tilfælde af tvetydige resultater, såsom diskordante replikatmålinger og/eller en gennemsnitlig TER på 5 ± 0,5 kΩ, bør det overvejes at gennemføre en anden uafhængig analyseserie (et andet forsøg) samt en tredje, hvis resultaterne af de første to analyseserier (forsøg) er diskordante.

DATA OG RAPPORTERING

Data

34.

De målte resultater for modstand (kΩ) og eventuelt farveindhold (μg/hudlap) i testkemikaliet og i positive og negative kontroller bør fremlægges i tabelform, herunder også data fra de enkelte hudlapsreplikater i hver analyseserie (hvert forsøg) og gennemsnitsværdier ± standardafvigelser. Alle gentagne forsøg bør rapporteres. Iagttagne ødelæggelser af hudlapperne bør rapporteres for hvert testkemikalie.

Testrapport

35.

Testrapporten bør indeholde følgende oplysninger:

 

Testkemikalie og kontrolstoffer:

Stof med kun én bestanddel: kemisk identifikation, f.eks. IUPAC-navn eller CAS-navn, CAS-nummer, SMILES- eller InChI-kode, strukturformel, renhed, kemisk identitet af urenheder, i det omfang det er relevant og praktisk muligt, osv.

Stof med flere bestanddele, UVCB-stoffer og blandinger: så vidt muligt kendetegnet ved kemisk identitet (jf. ovenfor), kvantitativ forekomst og bestanddelenes relevante fysisk-kemiske egenskaber

fysisk udseende, vandopløselighed og yderligere relevante fysisk-kemiske egenskaber

oprindelse, evt. batchnummer

behandling af testkemikaliet/kontrolstoffet inden testning, hvis det er relevant (f.eks. opvarmning, formaling)

testkemikaliets stabilitet, sidste anvendelsesdato eller dato for ny analyse, hvis dette er kendt

opbevaringsforhold.

 

Forsøgsdyr:

anvendt stamme og køn

alder på dyr anvendt som donordyr

oprindelse, miljøbetingelser, foder osv.

oplysninger om fremstillingen af hudlapper.

 

Testbetingelser:

kalibreringskurver for testapparatur

kalibreringskurver for farvebindingstestens ydeevne, båndpas anvendt til måling af OD-værdier og måleudstyrets OD-lineraritetsinterval (f.eks. spektrofotometer), hvis relevant

detaljer om den testprocedure, der blev anvendt til TER-målinger

detaljer om den testprocedure, der eventuelt blev anvendt til måling af farvebinding

anvendte testdoser, eksponeringsperiodens/-periodernes varighed og eksponeringstemperatur(er)

detaljer om den vaskeprocedure, der blev anvendt efter eksponeringsperioden

antal anvendte hudlapsreplikater pr. testkemikalie og kontrol (positiv og negativ kontrol)

beskrivelse af eventuelle ændringer i testproceduren

reference til historiske data for modellen. Der bør bl.a. gives oplysninger om:

i)

hvorvidt positive og negative TER-kontrolværdier (i kΩ) kan accepteres, sammenlignet med modstandsintervaller for positive og negative kontroller

ii)

hvorvidt positive og negative farveindholdskontrolværdier (i μg/hudlap) kan accepteres, sammenlignet med farveindholdsintervaller for positive og negative kontroller

iii)

hvorvidt testresultaterne kan accepteres, sammenlignet med den historiske variabilitet mellem hudlapsreplikater

beskrivelse af beslutningskriterier/forudsigelsesmodel.

 

Resultater:

angivelse i tabelform af data fra TER- og eventuelt farvebindingsassay for hvert enkelt testkemikalie og hver enkelt kontrol, for hver analyseserie (hvert forsøg) og hvert hudlapsreplikat (de enkelte dyr og hudlapper), gennemsnit, standardafvigelser og variationskoefficienter

beskrivelse af andre observerede virkninger

den afledte klassificering med henvisning til den anvendte forudsigelsesmodel og/eller de anvendte beslutningskriterier.

 

Diskussion af resultaterne

 

Konklusioner

LITTERATUR

(1)

United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second Revised Edition, UN New York and Geneva, 2013. Tilgængelig på: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].

(2)

Kapitel B.4 i dette bilag, Akut hudirritation/-ætsning.

(3)

Kapitel B.40.A i dette bilag, In vitro-hudmodel.

(4)

Kapitel B.65 i dette bilag, In vitro-membranbarriereforsøgsmetode.

(5)

Kapitel B.46 i dette bilag, In vitro-hudirritation: forsøgsmetode med rekonstrueret human epidermis.

(6)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(7)

Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., og Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219-255.

(8)

Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., og Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxic. In Vitro 12, 471-482.

(9)

Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhütter H.-G., og Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests For Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxic. In Vitro 12, 483-524.

(10)

Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H., og Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops. ATLA 23, 129-147.

(11)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(12)

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3 April 1998.

(13)

ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.

(14)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(15)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 218. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(16)

Oliver G.J.A., Pemberton M.A., og Rhodes C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test -Modifications and Validation. Fd. Chem. Toxicol. 24, 507-512.

(17)

Botham P.A., Hall T.J., Dennett R., McCall J.C., Basketter D.A., Whittle E., Cheeseman M., Esdaile D.J., og Gardner J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial. Toxicol. In Vitro 6,191-194.

(18)

Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D’Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. og Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 62, 393-403.

(19)

TER SOP (December 2008). INVITTOX Protocol (No 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.

(20)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

Figur 1

Apparatur Til Ter-Assay Med Rottehud

Image 2

Figur 2

Dimensioner På Anvendte Polytetrafluorethylen-Rør (Ptfe), Receptorrør Og Elektroder

Image 3

Kritiske faktorer for det ovenfor viste apparatur:

PTFE-rørets indvendige diameter

længden af elektroderne i forhold til PTFE-røret og receptorrøret, så hudlappen ikke berøres af elektroderne, og så en konstant længde af elektroden er i kontakt med MgSO4-opløsningen

mængden af MgSO4-opløsning i receptorrøret bør sikre en væskedybde i forhold til niveauet i PTFE-røret som vist i figur 1

hudlappen bør være tilstrækkeligt fastgjort til PTFE-røret, så den elektriske modstand er et sandt mål for hudens egenskaber.

Tillæg

DEFINITIONER

Nøjagtighed : overensstemmelsen mellem forsøgsmetodens resultater og accepterede referenceværdier. Den er et mål for forsøgsmetodens ydeevne og et af aspekterne af relevans. Udtrykket benyttes ofte som synonym for "konkordans", forstået som den andel af korrekte udfald, forsøgsmetoden fører til (20).

C : ætsende.

Kemikalie : et stof eller en blanding.

Konkordans : et mål for ydeevnen af en forsøgsmetode, der fører til kategoriske resultater, og et af aspekterne af relevans. Udtrykket benyttes af og til som synonym for nøjagtighed og defineres som andelen af alle kemikalier, der klassificeres korrekt som positive eller negative. Konkordansen afhænger i høj grad af forekomsten af positiver i de undersøgte typer testkemikalier (20).

GHS (det globale harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier (UN)) : et system til klassificering af kemikalier (stoffer og blandinger) efter standardiserede typer og niveauer af fysisk fare, sundhedsfare og miljøfare med tilhørende kommunikationselementer såsom piktogrammer, signalord, faresætninger, sikkerhedssætninger og sikkerhedsdatablade, således at oplysninger om kemikaliernes skadelige virkninger kan videreformidles med henblik på at beskytte mennesker (f.eks. arbejdsgivere, arbejdstagere, transportører, forbrugere og redningspersonel) og miljøet (1).

IATA : integreret tilgang til testning og vurdering.

Blanding : blanding eller opløsning, der er sammensat af to eller flere stoffer.

Stof med kun én bestanddel : et stof, der defineres af sin mængdemæssige sammensætning, hvori en hovedbestanddel udgør mindst 80 % (w/w).

Stof med flere bestanddele : et stof, der defineres af sin mængdemæssige sammensætning, hvori flere end én hovedbestanddel er til stede i en koncentration på ≥ 10 % (w/w) og < 80 % (w/w). Et stof, der består af flere forskellige bestanddele, er resultatet af en fremstillingsproces. Forskellen mellem en blanding og et stof med flere bestanddele er, at blandingen er fremstillet ved blanding af to eller flere stoffer uden kemisk reaktion. Et stof, der består af flere forskellige bestanddele, er resultatet af en kemisk reaktion.

NC : Ikke-ætsende.

OD : optisk tæthed.

PC : positiv kontrol, et replikat, som indeholder alle komponenterne fra et testsystem og er behandlet med et stof, som vides at inducere en positiv respons. For at sikre, at det er muligt at vurdere variabiliteten i den positive kontrolrespons over tid, bør den positive respons ikke være overdrevent stor.

Ydeevnestandarder (PS) : standarder, der med udgangspunkt i en valideret forsøgsmetode danner grundlag for at vurdere, om en foreslået forsøgsmetode, som er mekanistisk og funktionelt tilsvarende, er sammenlignelig. De omfatter bl.a. i) de centrale dele af forsøgsmetoden, ii) en minimumsliste med referencekemikalier, som er udvalgt blandt de kemikalier, der er benyttet til at påvise, at den validerede forsøgsmetodes ydeevne er acceptabel, og iii) de tilsvarende niveauer af pålidelighed og nøjagtighed, som er fastsat efter, hvad der er opnået med den validerede forsøgsmetode, og som det skal påvises, at den foreslåede forsøgsmetode kan yde, ved vurdering ud fra minimumslisten med referencekemikalier.

Relevans : beskrivelse af sammenhængen mellem forsøgsmetoden og den pågældende virkning og dens meningsfuldhed og brugbarhed til et bestemt formål. Det angives, i hvilket omfang forsøgsmetoden måler eller forudsiger den pågældende biologiske virkning korrekt. Forsøgsmetodens nøjagtighed (konkordans) indgår i vurderingen af dens relevans (20).

Pålidelighed : mål for, i hvilken grad en forsøgsmetode kan reproduceres i og mellem laboratorier over en længere periode, når den udføres efter samme protokol. Den bedømmes ved beregning af reproducerbarhed inden for og mellem laboratorier (20).

Følsomhed : andelen af alle positive/aktive kemikalier, der klassificeres korrekt ved forsøgsmetoden. Den er et mål for nøjagtigheden af en forsøgsmetode, som giver kategoriske resultater, og er et vigtigt kriterium ved vurderingen af en forsøgsmetodes relevans (20).

In vivo-hudætsning : fremkaldelse af irreversibel skade på huden, dvs. synlig nekrose gennem epidermis og ned i dermis efter påføring af et testkemikalie i indtil 4 timer. Typiske ætsningsreaktioner er sår, blødning, blodige skorper, efter 14 dages observation affarvning som følge af blegning af huden, hele områder med alopeci samt ardannelse. Tvivlsomme læsioner bør overvejes vurderet ved histopatologisk undersøgelse.

Specificitet : andelen af alle negative/inaktive kemikalier, der klassificeres korrekt ved forsøgsmetoden. Den er et mål for nøjagtigheden af en forsøgsmetode, som giver kategoriske resultater, og er et vigtigt kriterium ved vurderingen af en forsøgsmetodes relevans (20).

Stof : et grundstof og forbindelser heraf, i naturlig tilstand eller industrielt fremstillet, herunder sådanne tilsætningsstoffer, som er nødvendige til bevarelse af stoffets stabilitet, og sådanne urenheder, som følger af fremstillingsprocessen, bortset fra opløsningsmidler, der kan udskilles, uden at det påvirker stoffets stabilitet eller ændrer dets sammensætning.

Analyseserie : Et enkelt testkemikalie, der på samme tid testes i mindst tre hudlapsreplikater.

Testkemikalie : alle stoffer eller blandinger, der testes ved hjælp af denne forsøgsmetode.

Transkutan elektrisk modstand (TER) : et mål for hudens elektriske impedans som en modstand i kiloohm. En simpel og robust metode til vurdering af barrierefunktion, hvor ionernes passering gennem huden registreres ved hjælp af en wheatstone-bro.

UVCB : stoffer med ukendt eller variabel sammensætning, komplekse reaktionsprodukter eller biologiske materialer.

"

(6)

Del B, kapitel B.40.A, affattes således:

"B.40.A   IN VITRO-HUDÆTSNING: FORSØGSMETODE MED REKONSTRUERET HUMAN EPIDERMIS (RhE)

INDLEDNING

1.

Denne forsøgsmetode svarer til OECD’s testvejledning (Test Guideline (TG)) 431 (2016). Hudætsning defineres som fremkomsten af irreversibel ødelæggelse af huden, der viser sig som en synlig nekrose gennem epidermis til dermis efter påføring af et testkemikalie [som defineret i De Forenede Nationers (FN’s) globale harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier (GHS) (1) og Den Europæiske Unions (EU’s) forordning 1272/2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger (CLP) (6)]. Den opdaterede forsøgsmetode B.40.A indeholder en in vitro-procedure, som gør det muligt at identificere ikke-ætsende og ætsende stoffer og blandinger i overensstemmelse med UN GHS og CLP. Den muliggør endvidere delvis underkategorisering af ætsende stoffer.

2.

Vurderingen af kemikaliers hudætsningspotentiale har typisk omfattet brug af laboratoriedyr (TM B.4, som svarer til OECD TG 404, der oprindeligt blev vedtaget i 1981 og revideret i 1992, 2002 og 2015) (2). Ud over nærværende forsøgsmetode B.40.A er der blevet valideret og vedtaget to andre in vitro-forsøgsmetoder til testning af kemikaliers hudætsningspotentiale som TM B.40 (der svarer til OECD TG 430) (3) og TM B.65 (der svarer til OECD TG 435) (4). Derudover er in vitro-forsøgsmetoden B.46 (der svarer til OECD TG 439) (5) blevet vedtaget til testning af hudirritationspotentiale. Et vejledende dokument fra OECD om integrerede tilgange til testning og vurdering (IATA) vedrørende hudætsning og -irritation beskriver flere moduler, som grupperer informationskilder og analyseværktøjer, og vejleder i, i) hvordan eksisterende forsøgsdata og ikke-forsøgsdata integreres i og anvendes til vurdering af kemikaliers hudirritations- og hudætsningspotentiale, og ii) foreslår en tilgang, når der er behov for yderligere testning (6).

3.

Denne forsøgsmetodes endepunkt for menneskers sundhed er hudætsning. Den gør brug af rekonstrueret human epidermis (RhE) (fremstillet af humant afledte ikke-transformerede epidermiskeratinocytter), som ret nøje efterligner de histologiske, morfologiske, biokemiske og fysiologiske egenskaber af menneskehudens øverste lag, dvs. epidermis. Den tilsvarende OECD-testvejledning blev oprindeligt vedtaget i 2004 og opdateret i 2013 for at medtage yderligere forsøgsmetoder, der bruger RhE-modeller, og muligheden for at benytte metoderne til at understøtte underkategorisering af ætsende kemikalier. Endelig blev den opdateret i 2015 for at referere til det vejledende IATA-dokument og medtage anvendelsen af en alternativ procedure til måling af levedygtighed.

4.

Fire validerede RhE-modeller, der kan fås i handelen, er inkluderet i denne forsøgsmetode. En række prævalideringsundersøgelser (7) efterfulgt af en formel valideringsundersøgelse til vurdering af hudætsning (8) (9) (10) er blevet gennemført (11) (12) for to af disse testmodeller, der kan fås i handelen, nemlig EpiSkin™ Standard Model (SM) og EpiDerm™ Skin Corrosivity Test (SCT) (EPI-200) (er i det følgende betegnet som de validerede referencemetoder – VRM). På baggrund af resultatet af disse undersøgelser henstilles det, at de to ovenfor nævnte VRM’er anvendes i lovgivningsøjemed til skelnen mellem ætsende (C) og ikke-ætsende (NC) stoffer, og at EpiSkin™ desuden anvendes til at understøtte underkategoriseringen af ætsende stoffer (13) (14) (15). To andre in vitro-RhE-testmodeller til vurdering af hudætsning, der også findes i handelen, har udvist resultater, som svarer til den validerede referencemetode (VRM) EpiDerm™ ifølge en PS-baseret validering (16) (17) (18). Det drejer sig om SkinEthic™ RHE (7) og epiCS® (tidligere benævnt EST-1000), der også kan benyttes i lovgivningsøjemed til skelnen mellem ætsende og ikke-ætsende stoffer (19) (20). Undersøgelser, som producenterne af RhE-modeller udførte efter validering i perioden 2012-2014 med en mere detaljeret protokol, der korrigerer for interferens som følge af testkemikaliernes uspecificerede MTT-reduktion, forbedrede ydeevnen både med hensyn til skelnen mellem C og NC og understøtning af underkategoriseringen af ætsende stoffer (21) (22). Der er foretaget yderligere statistiske analyser af de data, der blev genereret efter validering med EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE og EpiCS®, for at identificere alternative forudsigelsesmodeller, som har forbedret forudsigelsesevnen i forbindelse med underkategorisering (23).

5.

Inden der kan anvendes en foreslået lignende eller ændret in vitro-RhE-forsøgsmetode end VRM’erne til vurdering af hudætsning i lovgivningsøjemed, bør dens pålidelighed og relevans (nøjagtighed) og begrænsningerne for dens påtænkte anvendelse bestemmes for at sikre, at den er sammenlignelig med VRM’erne, i overensstemmelse med ydeevnestandarderne (PS) (24), der opstilles i henhold til principperne i OECD’s vejledende dokument nr. 34 (25). Den gensidige anerkendelse af data vil først være garanteret, når en foreslået ny eller opdateret forsøgsmetode i henhold til ydeevnestandarderne er blevet gennemgået og medtaget i den tilsvarende testvejledning. De testmodeller, der er medtaget i testvejledningen, kan anvendes til at opfylde forskellige landes krav til testresultater for in vitro-forsøgsmetoder til vurdering af hudætsning og drager samtidig fordel af den gensidige anerkendelse af data.

DEFINITIONER

6.

De anvendte definitioner er forklaret i tillæg 1.

INDLEDENDE OVERVEJELSER

7.

Denne forsøgsmetode gør det muligt at identificere ikke-ætsende og ætsende stoffer og blandinger i henhold til UN GHS og CLP. Denne forsøgsmetode understøtter endvidere underkategoriseringen af ætsende stoffer og blandinger i den valgfrie underkategori 1A, jf. UN GHS (1), samt en kombination af underkategorierne 1B og 1C (21) (22) (23). Forsøgsmetoden er begrænset derved, at den ikke gør det muligt at skelne mellem underkategorierne for hudætsende stoffer 1B og 1C, jf. UN GHS og CLP, på grund af det begrænsede antal velkendte kemikalier, der tilhører underkategorien 1C for in vivo-ætsende stoffer. Testmodellerne EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE og epiCS® gør det muligt at foretage denne underkategorisering (dvs. 1A versus 1B/1C versus NC).

8.

En lang række kemikalier, der primært repræsenterer enkeltstoffer, er blevet testet under den validering, der understøtter de testmodeller, som er medtaget i denne forsøgsmetode, når de anvendes til identifikation af ikke-ætsende og ætsende stoffer. Valideringsundersøgelsens empiriske database indeholdt 60 kemikalier fra en bred vifte af kemiske grupper (8) (9) (10). Forsøgsmetodens udviklere gennemførte forsøg til påvisning af følsomhed, specificitet, nøjagtighed og assayets reproducerbarhed internt i laboratoriet med henblik på underkategorisering, og resultaterne blev gennemgået af OECD (21) (22) (23). På baggrund af alle tilgængelige data kan forsøgsmetoden anvendes på en lang række kemiske grupper og fysiske tilstande, herunder væsker, halvfaste stoffer, faste stoffer og voks. Væsker kan være vandige eller ikke-vandige, og faste stoffer kan være opløselige eller uopløselige i vand. Faste stoffer skal males til et fint pulver, før de påføres, når det overhovedet er muligt. Der kræves ingen anden forbehandling af teststoffet. I de tilfælde, hvor det kan påvises, at de testmodeller, der er medtaget i denne forsøgsmetode, ikke er egnede til en specifik kategori af testkemikalier, bør de ikke anvendes til forsøg med denne specifikke kategori af testkemikalier. Eftersom forsøgsmetoden kan anvendes på stoffer, forventes den desuden at kunne anvendes på blandinger. Da blandinger imidlertid omfatter et vidt spektrum af kategorier og sammensætninger, og da der for øjeblikket kun foreligger begrænsede oplysninger om testning af blandinger, bør forsøgsmetoden i de tilfælde, hvor det kan påvises, at den ikke er egnet til en specifik kategori af blandinger (f.eks. efter en strategi som foreslået i (26)), ikke anvendes til forsøg med denne specifikke kategori af blandinger. Før forsøgsmetoden bruges på en blanding for at generere data i lovgivningsøjemed, bør det overvejes, om den vil give resultater, som er egnede til formålet, og i givet fald hvorfor. Sådanne overvejelser er ikke nødvendige, når der foreligger et myndighedskrav om test af blandingen. Gasser og aerosoler er endnu ikke vurderet ved en valideringsundersøgelse (8) (9) (10). Selv om det er tænkeligt, at gasser og aerosoler kan undersøges ved hjælp af RhE-teknologi, muliggør den nuværende forsøgsmetode det ikke.

9.

Testkemikalier, der absorberer lys i det samme område som MTT-formazan, og testkemikalier, som direkte kan reducere vitalfarvestoffet MTT (til MTT-formazan), kan interferere med målinger af vævets levedygtighed og kræve anvendelse af tilpassede kontroller med henblik på korrektioner. Hvilken type af tilpassede kontroller, der kan være nødvendig, vil variere alt efter den type interferens, testkemikaliet fremkalder, og den procedure, der benyttes til at måle MTT-formazan (jf. punkt 25-31).

10.

Denne forsøgsmetode giver ikke fyldestgørende oplysninger om hudirritation, men det skal bemærkes, at TM B.46 specifikt vedrører in vitro-test af hudirritationer og er baseret på det samme RhE-testsystem, dog med en anden protokol (5). For fuldt ud at kunne vurdere de lokale virkninger på huden efter en enkelt dermal eksponering bør OECD’s vejledende dokument om integrerede tilgange til testning og vurdering (IATA) følges (6). Denne IATA-strategi omfatter gennemførelse af in vitro-test for hudætsning (som beskrevet i forbindelse med denne forsøgsmetode) og hudirritation, inden test i levende dyr overvejes. Det anerkendes, at brugen af human hud er underlagt nationale og internationale etiske hensyn og betingelser.

PRINCIP FOR TESTEN

11.

Testkemikaliet påføres på en tredimensional RhE-model, som består af ikke-transformerede humant afledte epidermiskeratinocytter, som ved dyrkning har dannet en stærkt differentieret flerlagsmodel af den humane epidermis. Den består af velordnede basallag, stratum spinosum og stratum granulosum og et flerlaget stratum corneum med intercellulære lamellære lipidlag fra samme lipidklasser som dem, man finder in vivo.

12.

RhE-forsøgsmetoden er baseret på den præmis, at kemikalier er ætsende, når de er i stand til at trænge gennem stratum corneum ved diffusion eller erosion og er cytotoksiske for cellerne i de underliggende lag. Cellernes levedygtighed måles ved, at enzym omdanner vitalfarvestoffet MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, thiazolylblåt tetrazolium-bromid; CAS-nummer 298-93-1) til et blåt formazansalt, der måles kvantitativt efter ekstraktion fra vævene (27). Ætsende kemikalier identificeres ved deres evne til at nedsætte cellernes levedygtighed til under en bestemt tærskelværdi (jf. punkt 35 og 36). Den RhE-baserede forsøgsmetode til vurdering af hudætsning har vist sig at kunne forudsige in vivo-hudætsning hos kaniner vurderet i henhold til TM B.4 (2).

PÅVISNING AF KOMPETENCE

13.

Inden laboratorierne påbegynder rutinemæssig brug af en eller flere af de fire validerede RhE-testmodeller, som er i overensstemmelse med denne forsøgsmetode, bør de påvise deres tekniske kompetence ved korrekt identifikation af de 12 kompetencestoffer, der står opført i tabel 1. Såfremt der anvendes en metode til underklassificering, bør også den korrekte underkategorisering påvises. I situationer, hvor et stof på listen ikke kan fås, eller hvor det er berettiget, kan et andet stof anvendes, hvis der foreligger tilstrækkelige in vivo- og in vitro-referencedata herfor (f.eks. fra listen over referencekemikalier (24)), forudsat at der benyttes de samme udvælgelseskriterier som beskrevet i tabel 1.

Tabel 1

Liste over kompetencestoffer  (8)

Stof

CAS RN

Kemisk gruppe (9)

UN GHS-/CLP-kat. baseret på in vivo-resultater (10)

VRM-kat. baseret på in vitro-resultater (11)

MTT-reduktionsmiddel (12)

Fysisk tilstand

Underkategori 1A in vivo – ætsende stoffer

Bromeddikesyre

79-08-3

Organisk syre

1A

(3) 1A

S

Bortrifluoriddihydrat

13319-75-0

Uorganisk syre

1A

(3) 1A

L

Phenol

108-95-2

Phenol

1A

(3) 1A

S

Dichloracetylchlorid

79-36-7

Elektrofil

1A

(3) 1A

L

Kombination af underkategorierne 1B og 1C in vivo – ætsende stoffer

Glyoxylsyremonohydrat

563-96-2

Organisk syre

1B/1C

(3) 1B/1C

S

Mælkesyre

598-82-3

Organisk syre

1B/1C

(3) 1B/1C

L

Ethanolamin

141-43-5

Organisk base

1B

(3) 1B/1C

Y

Viskøs

Saltsyre (14,4 %)

7647-01-0

Uorganisk syre

1B/1C

(3) 1B/1C

L

In vivo – ikke-ætsende stoffer

Phenethylbromid

103-63-9

Elektrofil

NC

(3) NC

Y

L

4-amino-1,2,4-triazol

584-13-4

Organisk base

NC

(3) NC

S

4-(methylthio)-benzaldehyd

3446-89-7

Elektrofil

NC

(3) NC

Y

L

Laurinsyre

143-07-7

Organisk syre

NC

(3) NC

S

Forkortelser: CAS RN = Registernummer i Chemical Abstracts Service; VRM = valideret referencemetode; NC = Ikke ætsende; Y = ja; S = fast; L = flydende

14.

Som led i påvisningen af kompetence anbefales det, at brugeren kontrollerer vævenes barriereegenskaber efter modtagelse som beskrevet af RhE-modellens fabrikant. Det er navnlig vigtigt, hvis vævene sendes over lang afstand/lange perioder. Når en forsøgsmetode er blevet helt fastlagt, og kompetencen er blevet påvist, er det ikke nødvendigt at kontrollere disse egenskaber rutinemæssigt. Ved rutinemæssig brug af en forsøgsmetode anbefales det imidlertid at kontrollere barriereegenskaberne med jævne mellemrum.

FREMGANGSMÅDE

15.

Følgende er en generisk beskrivelse af komponenter og procedurer i RhE-testmodellerne til vurdering af hudætsning, som er omfattet af denne forsøgsmetode. De RhE-modeller, der er godkendt som videnskabeligt egnede til brug inden for denne forsøgsmetode, dvs. modellerne EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE og epiCS® (16) (17) (19) (28) (29) (30) (31) (32) (33), kan købes i handelen. Der findes standardprocedurer (SOP’er) for disse fire RhE-modeller (34) (35) (36) (37), og de vigtigste komponenter i forsøgsmetoden er opsummeret i tillæg 2. Det anbefales at følge de relevante standardprocedurer, når en af disse modeller implementeres og anvendes i laboratoriet. Testning med de fire RhE-testmodeller, der er omfattet af denne forsøgsmetode, bør overholde følgende betingelser:

KOMPONENTER I RHE-FORSØGSMETODEN

Almindelige betingelser

16.

Der skal anvendes ikke-transformerede humane keratinocytter til at rekonstruere epithel. Der skal være flere lag af levedygtige epithelceller (basallag, stratum spinosum, stratum granulosum) til stede under et fungerende stratum corneum. Stratum corneum skal være flerlaget og have den lipidprofil, der gør den til en effektiv barriere, som kan modstå hurtig gennemtrængning af cytotoksiske referencekemikalier, f.eks. natriumdodecylsulphat (SDS) eller Triton X-100. Barrierefunktionen bør påvises og kan vurderes enten ved at bestemme den koncentration, ved hvilken et referencekemikalie nedsætter vævets levedygtighed med 50 % (IC50) efter en fast eksponeringstid, eller ved at bestemme den eksponeringstid, der er nødvendig for at reducere cellernes levedygtighed med 50 % (ET50), når referencekemikaliet påføres i en nærmere angivet fast koncentration (jf. punkt 18). RhE-modellens fysiske udformning skal forhindre, at stof passerer uden om stratum corneum til det levedygtige væv, hvilket ville forringe modelleringen af hudens eksponering. RhE-modellen skal være fri for kontamination med bakterier, virus, mykoplasma og svampe.

Funktionsmæssige betingelser

Levedygtighed

17.

MTT-assayet foretrækkes til kvantificering af vævslevedygtigheden (27). Levedygtige celler i RhE-modellen reducerer vitalfarvestoffet MTT til blåt MTT-formazanbundfald, som herefter ekstraheres fra vævet ved anvendelse af isopropanol (eller et lignende opløsningsmiddel). OD af ekstraktionsmidlet alene bør være tilstrækkeligt lille, dvs. OD < 0,1. Det ekstraherede MTT-formazan kan kvantificeres enten ved måling af standardabsorbans (OD) eller en HPLC-/UPLC-spektrofotometriprocedure (38). Brugerne af RhE-modellen bør sikre, at hver batch af den anvendte RhE-model overholder de fastlagte kriterier for den negative kontrol. Udvikleren/leverandøren af RhE-modellen bør fastsætte et interval (øvre og nedre grænse) for acceptable OD-værdier for negativ kontrol. Intervallerne for de acceptable OD-værdier for negativ kontrol for de fire validerede RhE-testmodeller, der er omfattet af denne forsøgsmetode, er anført i tabel 2. En bruger af HPLC-/UPLC-spektrofotometri bør anvende de OD-intervaller for negativ kontrol, der er anført i tabel 2, som acceptkriterier for den negative kontrol. Det skal godtgøres, at det væv, der er behandlet med det negative kontrolstof, har stabil kultur (giver enslydende OD-målinger) i hele eksponeringsperioden.

Tabel 2

Intervaller for acceptable OD-værdier for negativ kontrol ved kontrol af batchkvalitet

 

Nedre acceptgrænse

Øvre acceptgrænse

EpiSkin™ (SM)

> 0,6

< 1,5

EpiDerm™ SCT (EPI-200)

> 0,8

< 2,8

SkinEthic™ RHE

> 0,8

< 3,0

epiCS®

> 0,8

< 2,8

Barrierefunktion

18.

Stratum corneum og dets lipidsammensætning bør være tilstrækkelig til at modstå hurtig gennemtrængning af visse cytotoksiske referencekemikalier (f.eks. SDS eller Triton X-100), bestemt ved IC50 eller ET50 (tabel 3). Udvikleren/leverandøren af den anvendte RhE-model bør påvise barrierefunktionen for hver batch af RhE-modellen ved levering af vævene til slutbrugeren (jf. punkt 21).

Morfologi

19.

Der foretages en histologisk undersøgelse af RhE-modellen, som påviser en flerlaget human epidermis-lignende struktur indeholdende stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum og stratum corneum og udviser en lipidprofil som den, man finder i human epidermis. Udvikleren/leverandøren af RhE-modellen bør ved levering af vævene til slutbrugeren forelægge en histologisk undersøgelse af hver batch af den anvendte RhE-model, som påviser vævenes egnede morfologi (jf. punkt 21).

Reproducerbarhed

20.

Brugerne af forsøgsmetoderne skal påvise forsøgsmetodernes reproducerbarhed over tid med positive og negative kontroller. Derudover bør en forsøgsmetode kun anvendes, hvis udvikleren/leverandøren af RhE-modellen forelægger data, som påviser reproducerbarheden over tid med ætsende og ikke-ætsende kemikalier fra f.eks. listen over kompetencestoffer (tabel 1). Hvis en forsøgsmetode anvendes til underkategorisering, skal reproducerbarheden med hensyn til underkategorisering også påvises.

Kvalitetskontrol (QC)

21.

RhE-modellen bør kun anvendes, hvis udvikleren/leverandøren påviser, at hver batch af den anvendte RhE-model overholder veldefinerede produktionsgodkendelseskriterier, hvoraf levedygtighed (punkt 17), barrierefunktion (punkt 18) og morfologi (punkt 19) er de vigtigste. Brugerne af forsøgsmetoden gives adgang til disse data, således at de kan medtage disse oplysninger i testrapporten. Kun resultater, der er fremkommet med QC-accepterede batcher af væv, kan accepteres til at forudsige de ætsende stoffers klassificering på pålidelig vis. Udvikleren/leverandøren af RhE-modellen fastsætter et acceptinterval (øvre og nedre grænse) for IC50 eller ET50. Acceptintervallerne for de fire validerede testmodeller er angivet i tabel 3.

Tabel 3

QC-batchgodkendelseskriterier

 

Nedre acceptgrænse

Øvre acceptgrænse

EpiSkin™ (SM) (behandling i 18 timer med SDS) (33)

IC50 = 1,0 mg/ml

IC50 = 3,0 mg/ml

EpiDerm™ SCT (EPI-200) (1 % Triton X-100) (34)

ET50 = 4,0 timer

ET50 = 8,7 timer

SkinEthic™ RHE (1 % Triton X-100) (35)

ET50 = 4,0 timer

ET50 = 10,0 timer

epiCS® (1 % Triton X-100) (36)

ET50 = 2,0 timer

ET50 = 7,0 timer

Påføring af testkemikaliet og kontrolkemikalier

22.

Der anvendes mindst to vævsprøver for hvert testkemikalie og hver kontrol i hver eksponeringsperiode. For både flydende og faste kemikalier gælder det, at der bør påføres tilstrækkelig meget testkemikalie til, at epidermisoverfladen dækkes med et jævnt lag, samtidig med at ubegrænsede doser undgås, dvs. mindst 70 μl/cm2 eller 30 mg/cm2. Alt efter modellerne fugtes epidermisoverfladen med deioniseret eller destilleret vand inden påføring af faste kemikalier for at forbedre kontakten mellem testkemikaliet og epidermisoverfladen (34) (35) (36) (37). Faste stoffer bør testes som fint pulver, når det overhovedet er muligt. Påføringsmetoden skal være egnet til det pågældende testkemikalie (se f.eks. henvisning (34-37)). Efter eksponeringsperiodenskal testkemikaliet omhyggeligt vaskes af epidermis med en vandig buffer eller 0,9 % NaCl. Alt efter hvilken af de fire validerede RhE-testmodeller der benyttes, anvendes to eller tre eksponeringsperioder pr. testkemikalie (for alle fire gyldige RhE-modeller: 3 min. og 1 time; for EpiSkin™ en yderligere eksponeringstid på fire timer). Alt efter den anvendte RhE-testmodel og den vurderede eksponeringsperiode kan inkubationstemperaturen under eksponering variere mellem stuetemperatur og 37 °C.

23.

Der bør i hver analyseserie anvendes sideløbende negative og positive kontroller (PC), så det påvises, at levedygtigheden (med negative kontroller), barrierefunktionen og vævets deraf følgende følsomhed (med PC) ligger inden for et forud fastsat acceptinterval. De foreslåede PC-kemikalier er iseddikesyre og 8N KOH, alt afhængigt af den anvendte RhE-model. Det skal bemærkes, at 8N KOH er et direkte MTT-reduktionsmiddel, der kan kræve tilpassede kontroller som beskrevet i punkt 25 og 26. Som negativt kontrolstof foreslås 0,9 % (w/v) NaCl eller vand.

Måling af cellelevedygtighed

24.

MTT-assayet, som er et kvantitativt assay, skal benyttes til måling af cellelevedygtigheden i forbindelse med denne forsøgsmetode (27). Vævsprøven anbringes i en MTT-opløsning af passende koncentration (0,3 eller 1 mg/ml) i tre timer. Det udfældede blå formazan ekstraheres fra vævet med et opløsningsmiddel (f.eks. isopropanol eller sur isopropanol), og formazankoncentrationen måles ved bestemmelse af OD ved 570 nm i et højst ± 30 nm bredt filterbånd eller ved en HPLC-/UPLC-spektrofotometriprocedure (jf. punkt 30 og 31) (38).

25.

Testkemikalier kan interferere med MTT-assayet enten ved direkte reduktion af MTT til blåt formazan og/eller ved farveinterferens, hvis testkemikaliet naturligt eller på grund af behandlingsprocedurer absorberer i det samme OD-interval som formazan (570 ± 30 nm, primært blå og violette kemikalier). Der bør anvendes yderligere kontroller til at påvise og korrigere for testkemikaliernes potentielle interferens, såsom kontrol af ikke-specifik MTT-reduktion (NSMTT) og kontrol af ikke-specifik farve (NSC) (jf. punkt 26-30). Dette er især vigtigt, når et bestemt testkemikalie ikke fjernes helt fra vævet ved skylning, eller når det trænger igennem epidermis og derfor er til stede i vævet, når MTT-levedygtighedstesten udføres. Det er nærmere beskrevet, hvordan der korrigeres for direkte MTT-reduktion og farvestoffernes interferens, i SOP’erne for testmodellerne (34) (35) (36) (37).

26.

For at identificere direkte MTT-reduktionsmidler bør hvert testkemikalie tilsættes til et frisklavet MTT-medium (34) (35) (36) (37). Hvis MTT-blandingen, når den indeholder testkemikaliet, bliver blå/violet, formodes testkemikaliet at reducere MTT direkte, og der bør udføres yderligere funktionsmæssig kontrol på ikke-levedygtig epidermis, uanset om der anvendes måling af standardabsorbans (OD) eller en HPLC-/UPLC-spektrofotometriprocedure. Ved denne yderligere funktionsmæssige kontrol anvendes dødt væv, der kun har metabolisk residualaktivitet, men absorberer testkemikaliet på samme måde som levedygtigt væv. Hvert MTT-reducerende kemikalie påføres på mindst to døde vævsprøver pr. eksponeringsperiode, som gennemgår hele hudætsningstesten. Derefter beregnes den faktiske vævslevedygtighed som procenten for vævslevedygtighed opnået med levende væv eksponeret for MTT-reduktionsmiddel minus procenten for ikke-specifik MTT-reduktion opnået med dødt væv eksponeret for det samme MTT-reduktionsmiddel, set i forhold til den negative kontrol, som køres sideløbende med den test, der korrigeres (% NSMTT).

27.

For at identificere potentiel interferens fra farvede testkemikalier eller testkemikalier, der bliver farvet, når de kommer i kontakt med vand eller isopropanol, og afgøre, om der skal iværksættes yderligere kontrol, bør der foretages spektralanalyse af testkemikaliet i vand (miljø under eksponering) og/eller isopropanol (ekstraktionsopløsning). Hvis testkemikaliet i vand og/eller isopropanol absorberer lys i intervallet 570 ± 30 nm, bør der foretages yderligere kontroller med farvestof, eller der kan anvendes en HPLC-/UPLC-spektrofotometriprocedure, i hvilket tilfælde disse kontroller ikke er nødvendige (jf. punkt 30 og 31). Når der foretages en måling af standardabsorbansen (OD), påføres hvert interfererende farvet testkemikalie på mindst to levedygtigevævsprøver pr. eksponeringsperiode, som gennemgår hele hudætsningstesten, men inkuberes med medium i stedet for MTT-opløsning under MTT-inkubationstrinnet for at generere en kontrol af en ikke-specifik farve (NSCliving). NSCliving-kontrollen skal udføres sideløbende pr. eksponeringsperiode pr. farvet testkemikalie (i hver analyseserie) som følge af det levende vævs iboende biologiske variabilitet. Derefter beregnes den faktiske vævslevedygtighed som procenten for vævslevedygtighed opnået med levende væv eksponeret for det interfererende testkemikalie og inkuberet med MTT-opløsning minus procenten for ikke-specifik farve opnået med levende væv eksponeret for det interfererende testkemikalie og inkuberet med medium uden MTT foretaget sideløbende med den test, der korrigeres (%NSCliving).

28.

Når der foretages en måling af standardabsorbansen (OD), vil testkemikalier, der identificeres som fremkaldende både direkte MTT-reduktion (jf. punkt 26) og farveinterferens (jf. punkt 27), også kræve en tredje kontrol ud over NSMTT- og NSCliving-kontrollerne, der er beskrevet ovenfor. Dette er sædvanligvis tilfældet med mørke testkemikalier, der interfererer med MTT-assayet (f.eks. blå, violette, sorte), fordi deres egen farve forstyrrer vurderingen af deres evne til direkte at reducere MTT, som beskrevet i punkt 26. Disse testkemikalier kan binde sig til både levende og dødt væv, og derfor kan NSMTT-kontrollen ikke blot korrigere for testkemikaliets potentielle direkte MTT-reduktion, men også for den farveinterferens, der opstår, når testkemikaliet binder sig til dødt væv. Dette kan medføre dobbeltkorrektion for farveinterferens, da NSCliving-kontrollen allerede korrigerer for farveinterferens, som opstår, når testkemikaliet binder sig til levende væv. For at undgå eventuel dobbeltkorrektion for farveinterferens skal der gennemføres en tredje kontrol for ikke-specifik farve i dødt væv (NSCkilled). I denne yderligere kontrol påføres testkemikaliet på mindst to døde vævsprøver pr. eksponeringsperiode, som gennemgår hele testproceduren, men inkuberes med medium i stedet for MTT-opløsning under MTT-inkubationstrinnet. En enkelt NSCkilled-kontrol er tilstrækkelig pr. testkemikalie, uanset hvor mange uafhængige test/analyseserier der er udført, men bør udføres sideløbende med NSMTT-kontrollen og om muligt med den samme vævsbatch. Derefter beregnes den faktiske vævslevedygtighed som procenten for vævslevedygtighed opnået med levende væv eksponeret for testkemikaliet minus % NSMTT minus % NSCliving plus procenten for ikke-specifik farve opnået med dødt væv eksponeret for det interfererende testkemikalie og inkuberet med medium uden MTT, set i forhold til den negative kontrol, som køres sideløbende med den test, der korrigeres (% NSCkilled).

29.

Det er vigtigt at bemærke, at ikke-specifik MTT-reduktion og ikke-specifik farveinterferens kan øge de aflæste værdier for vævsekstraktet til over spektrofotometrets linearitetsinterval. På denne baggrund bør laboratorierne fastlægge linearitetsintervallet for deres spektrofotometer med MTT-formazan (CAS-nr. 57360-69-7), der er købt i handelen, inden de begynder at undersøge testkemikalier i lovgivningsøjemed. Måling af standardabsorbans (OD) ved hjælp af et spektrofotometer er især egnet til at vurdere direkte MTT-reduktionsmidler og farveinterfererende testkemikalier, når OD-værdierne af vævsekstrakter opnået med testkemikaliet uden nogen korrektion for direkte MTT-reduktion og/eller farveinterferens ligger inden for spektrofotometrets lineære interval, eller når den ikke-korrigerede levedygtighedsprocent opnået med testkemikaliet allerede definerer det som ætsende (jf. punkt 35 og 36). Ikke desto mindre bør resultaterne for testkemikalier, der fremkalder %NSMTT og/eller %NSCliving på > 50 % af den negative kontrol, tages med forsigtighed.

30.

For farvede testkemikalier, som ikke er kompatible med måling af standardabsorbans (OD) som følge af deres for kraftige interferens i MTT-assayet, kan den alternative HPLC-/UPLC-spektrofotometriprocedure til måling af MTT-formazan anvendes (jf. punkt 31) (37). HPLC-/UPLC-spektrofotometrisystemet giver mulighed for at separere MTT-formazan fra testkemikaliet før kvantificering (38). Af denne grund kræves NSCliving- eller NSCkilled-kontroller aldrig, når der anvendes HPLC-/UPLC-spektrofotometri, uafhængigt af det testede kemikalie. NSMTT-kontroller bør dog benyttes, hvis testkemikaliet mistænkes for at være direkte MTT-reducerende eller har en farve, som forhindrer vurderingen af dets evne til direkte at reducere MTT (som beskrevet i punkt 26). Ved benyttelse af HPLC-/UPLC-spektrofotometri til at måle MTT-formazan beregnes procenten for vævslevedygtighed som procentdelen af toparealet for MTT-formazan opnået med levende væv, som eksponeresfor testkemikaliet, set i forhold til toparealet for MTT-formazan opnået med den sideløbende negative kontrol. For testkemikalier, der er direkte MTT-reducerende, beregnes den faktiske vævslevedygtighed som procenten for vævslevedygtighed opnået med levende væv eksponeret for testkemikaliet minus %NSMTT. Endelig bør det bemærkes, at direkte MTT-reduktionsmidler, der også kan være farveinterfererende, og som tilbageholdes i vævet efter behandling og reducerer MTT så kraftigt, at de fører til OD-værdier (ved måling af standard-OD) eller toparealer (ved UPLC/HPLC-spektrofotometri) for de testede vævsekstrakter, der falder uden for spektrofotometrets linearitetsinterval, ikke kan vurderes, skønt dette kun forventes at forekomme i meget sjældne situationer.

31.

HPLC-/UPLC-spektrofotometri kan også anvendes med alle typer af testkemikalier (farvede, ikke-farvede, MTT-reducerende og ikke-MTT-reducerende) til måling af MTT-formazan (38). Da der findes mange forskellige HPLC-/UPLC-spektrofotometrisystemer, bør HPLC-/UPLC-spektrofotometrisystemets kvalificering påvises før anvendelsen heraf til at kvantificere MTT-formazan fra vævsekstrakter ved at opfylde acceptkriterierne for en række parametre for standardkvalificering baseret på dem, der er beskrevet i retningslinjerne for industrien for bioanalytisk metodevalidering fra den amerikanske Food and Drug Administration (FDA) (38) (39). Disse centrale parametre og deres acceptkriterier er vist i tillæg 4. Når acceptkriterierne i tillæg 4 er opfyldt, anses HPLC-/UPLC-spektrofotometrisystemet for at være kvalificeret og klar til at måle MTT-formazan under de forsøgsbetingelser, som er beskrevet i denne forsøgsmetode.

Acceptkriterier

32.

For hver forsøgsmetode med egnede RhE-modeller bør væv behandlet med den negative kontrol udvise OD-værdier, der afspejler vævets kvalitet som beskrevet i tabel 2 og ikke er lavere end de forud fastsatte grænser. Væv behandlet med PC, dvs. iseddikesyre eller 8N KOH, bør afspejle vævets evne til at reagere på et ætsende kemikalie under de betingelser, der gælder for testmodellen (jf. tillæg 2). Variabiliteten mellem vævsprøver til testkemikalie og/eller kontrolkemikalier bør ligge inden for de accepterede grænser for hver egnet RhE-model (jf. tillæg 2) (f.eks. bør forskellen i levedygtighed mellem de to vævsprøver ikke overstige 30 %). Hvis enten den negative kontrol eller PC i en analyseserie falder uden for de accepterede intervaller, anses analyseserien for ikke at være kvalificeret, og den bør gentages. Hvis testkemikaliernes variabilitet falder uden for det opstillede interval, bør de testes på ny.

Fortolkning af resultater og forudsigelsesmodel

33.

De OD-værdier, der opnås for hvert testkemikalie, anvendes til beregning af den procentvise levedygtighed i forhold til den negative kontrol, som sættes til 100 %. Hvis der benyttes HPLC-/UPLC-spektrofotometri, beregnes procenten for vævslevedygtighed som procenten af toparealet for MTT-formazan opnået med levende væv, som eksponeres for testkemikaliet, i forhold til toparealet for MTT-formazan opnået med den sideløbende negative kontrol. De procentvise tærskelværdier for cellelevedygtighed, som adskiller ætsende fra ikke-ætsende testkemikalier (eller som skelner mellem forskellige underkategorier for ætseevne), defineres nedenfor i punkt 35 og 36 for hver af de testmodeller, der er omfattet af denne forsøgsmetode, og bør anvendes til at fortolke resultaterne.

34.

En analyseserie bestående af mindst to vævsprøver bør være tilstrækkelig for et testkemikalie, når klassificeringsresultatet er entydigt. I tilfælde af tvetydige resultater såsom diskordante gentagne målinger kan det overvejes at gennemføre en anden analyseserie samt en tredje, hvis resultaterne af de første to analyseserier er diskordante.

35.

Forudsigelsesmodellen for EpiSkin™-testmodellen til vurdering af hudætsning (9) (34) (22), der hidrører fra UN GHS-/CLP-klassificeringssystemet, vises i tabel 4:

Tabel 4

EpiSkin™-forudsigelsesmodel

Levedygtighed målt efter eksponeringstid (t=3, 60 og 240 minutter)

Forudsigelse, der skal tages i betragtning

< 35 % efter 3 min. eksponering

Ætsende:

Valgfri underkategori 1A (*1)

≥ 35 % efter 3 min. eksponering OG

< 35 % efter 60 min. eksponering

ELLER

≥ 35 % efter 60 min. eksponering OG

< 35 % efter 240 min. eksponering

Ætsende:

En kombination af de valgfrie underkategorier 1B/ 1C

≥ 35 % efter 240 min. eksponering

Ikke-ætsende

36.

Forudsigelsesmodellerne for testmodellerne til vurdering af hudætsning EpiDerm™ SCT (10) (23) (35), SkinEthic™ RHE (17) (18) (23) (36) og epiCS® (16) (23) (37), der hidrører fra UN GHS-/CLP-klassificeringssystemet, vises i tabel 5:

Tabel 5

EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE og epiCS®

Levedygtighed målt efter eksponeringstid (t=3 og 60 minutter)

Forudsigelse, der skal tages i betragtning

TRIN 1 for EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE og epiCS®

< 50 % efter 3 min. eksponering

Ætsende

≥ 50 % efter 3 min. eksponering OG < 15 % efter 60 min. eksponering

Ætsende

≥ 50 % efter 3 min. eksponering OG ≥ 15 % efter 60 min. eksponering

Ikke-ætsende

TRIN 2 for EpiDerm™ SCT – for stoffer/blandinger, der blev identificeret som ætsende i trin 1

< 25 % efter 3 min. eksponering

Valgfri underkategori 1A*

≥ 25 % efter 3 min. eksponering

En kombination af de valgfrie underkategorier 1B og 1C

TRIN 2 for SkinEthic™ RHE – for stoffer/blandinger, der blev identificeret som ætsende i trin 1

< 18 % efter 3 min. eksponering

Valgfri underkategori 1A*

≥ 18 % efter 3 min eksponering

En kombination af de valgfrie underkategorier 1B og 1C

TRIN 2 for epiCS® – for stoffer/blandinger, der blev identificeret som ætsende i trin 1

< 15 % efter 3 min. eksponering

Valgfri underkategori 1A*

≥ 15 % efter 3 min. eksponering

En kombination af de valgfrie underkategorier 1B og 1C

DATA OG RAPPORTERING

Data

37.

For hver test bør data fra de enkelte vævsprøver (f.eks. OD-værdier og beregnet cellelevedygtighedsprocent for hvert testkemikalie samt klassificeringen) fremlægges i tabelform, herunder data fra eventuelle gentagelser af forsøget. Derudover bør gennemsnitsværdier og intervaller for levedygtighed og variationskoefficienter mellem vævsprøverne for hver enkelt test fremlægges. For hvert testet kemikalie fremlægges de direkte MTT-reduktionsmidlers eller farvede testkemikaliers iagttagne interaktioner med MTT-reagenset.

Testrapport

38.

Testrapporten bør indeholde følgende oplysninger:

 

Testkemikalie og kontrolkemikalier:

Stof med kun én bestanddel: kemisk identifikation, f.eks. IUPAC-navn eller CAS-navn, CAS-nummer, SMILES- eller InChI-kode, strukturformel, renhed, kemisk identitet af urenheder, i det omfang det er relevant og praktisk muligt, osv.

Stof med flere bestanddele, UVCB-stoffer og blandinger: kendetegnet så vidt muligt ved kemisk identitet (jf. ovenfor), kvantitativ forekomst og bestanddelenes relevante fysisk-kemiske egenskaber

fysisk udseende, vandopløselighed og eventuelle yderligere relevante fysisk-kemiske egenskaber

oprindelse, evt. batchnummer

behandling af testkemikaliet/kontrolstoffet inden testning, hvis det er relevant (f.eks. opvarmning, formaling)

testkemikaliets stabilitet, sidste anvendelsesdato eller dato for ny analyse, hvis dette er kendt

opbevaringsforhold.

 

Anvendt RhE-model og protokol og begrundelse herfor (hvis relevant)

 

Testbetingelser:

anvendt RhE-model (herunder batchnummer)

kalibreringsoplysninger for måleudstyr (f.eks. spektrofotometer), bølgelængde og båndpas (hvis relevant) anvendt til kvantificering af MTT-formazan og måleudstyrets linearitetsinterval

beskrivelse af den metode, der blev anvendt til kvantificering af MTT-formazan

eventuelt beskrivelse af kvalificeringen af HPLC-/UPLC-spektrofotometrisystemet

komplet dokumentation for den anvendte RhE-model, herunder om dens ydeevne. Der bør bl.a. gives oplysninger om:

i)

levedygtighed

ii)

barrierefunktion

iii)

morfologi

iv)

reproducerbarhed og forudsigelsesevne

v)

kvalitetskontroller (QC) af modellen

reference til historiske data for modellen. Der bør bl.a. gives oplysning om, hvorvidt QC-dataene kan accepteres, sammenlignet med historiske batchdata

påvisning af kompetence til at anvende forsøgsmetoden inden rutinemæssig brug ved at teste kompetencestofferne.

 

Testprocedure:

detaljer om den anvendte testprocedure (herunder anvendte vaskeprocedurer efter eksponering)

anvendte doser af testkemikalie og kontrolkemikalier

eksponeringsperiodens/-periodernes varighed og eksponeringstemperatur(er)

eventuel angivelse af kontroller anvendt til direkte MTT-reduktionsmidler og/eller farvede testkemikalier

antal vævsprøver anvendt pr. testkemikalie og kontrol (PC, negativ kontrol og NSMTT, NSCliving og NSCkilled, hvis relevant) pr. eksponeringsperiode

beskrivelse af beslutningskriterier/forudsigelsesmodel baseret på den anvendte RhE-model

beskrivelse af eventuelle ændringer i forsøgsmetoden (herunder vaskeprocedurer).

 

Acceptkriterier for analyseserier og test:

middelværdier for positive og negative kontroller og acceptintervaller på grundlag af historiske data

acceptabel variabilitet mellem vævsprøver til positiv og negativ kontrol

acceptabel variabilitet mellem vævsprøver til testkemikaliet.

 

Resultater:

angivelse i tabelform af data for hvert enkelt testkemikalie og hver enkelt kontrol, for hver eksponeringsperiode, hver analyseserie og hver gentagen måling, herunder OD-værdier eller topareal for MTT-formazan, vævslevedygtighedsprocent, gennemsnitlig vævslevedygtighedsprocent, vævsprøveforskelle, eventuelle standardafvigelser og/eller variationskoefficienter

eventuelle resultater af kontroller anvendt til direkte MTT-reduktionsmidler og/eller farvende testkemikalier, herunder OD-værdier eller topareal for MTT-formazan, %NSMTT, %NSCliving, %NSCkilled, vævsprøveforskelle, eventuelle standardafvigelser og/eller CV’er og endelig korrekt vævslevedygtighedsprocent

resultater opnået med testkemikaliet/-kemikalierne og kontrolkemikalierne i forhold til de fastlagte acceptkriterier for analyseserier og test

beskrivelse af andre observerede virkninger

den afledte klassificering med henvisning til den anvendte forudsigelsesmodel og/eller de anvendte beslutningskriterier.

 

Diskussion af resultaterne

 

Konklusioner

LITTERATUR

(1)

UN (2013). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth Revised Edition, UN New York og Geneva. Tilgængelig på: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html

(2)

Kapitel B.4 i dette bilag, Akut hudirritation/-ætsning.

(3)

Kapitel B.40 i dette bilag, In vitro-hudætsning.

(4)

Kapitel B.65 i dette bilag, In vitro-membranbarriereforsøgsmetode.

(5)

Kapitel B.46 i dette bilag, In vitro-hudirritation: forsøgsmetode med rekonstrueret human epidermis.

(6)

OECD (2014). Guidance Document on Integrated Approaches to Testing and Assessment of Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203) Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(7)

Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., og Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The report and Recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23:219-255.

(8)

Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., og Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and distribution of the Test Chemicals. Toxicol. In Vitro 12:471-482.

(9)

Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhutter H.-G., og Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxicol. in Vitro 12:483-524.

(10)

Liebsch M., Traue D., Barrabas C., Spielmann H., Uphill, P., Wilkins S., Wiemann C., Kaufmann T., Remmele M. og Holzhütter H. G. (2000). The ECVAM Prevalidation Study on the Use of EpiDerm for Skin Corrosivity Testing, ATLA 28: 371-401.

(11)

Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H. og Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops, ATLA 23:129-147.

(12)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological TestMethods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(13)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(14)

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the EpiSkin™ Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3 April 1998.

(15)

EC-ECVAM (2000). Statement on the Application of the EpiDerm™ Human Skin Model for Skin Corrosivity Testing, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC14), 21 March 2000.

(16)

Hoffmann J., Heisler E., Karpinski S., Losse J., Thomas D., Siefken W., Ahr H.J., Vohr H.W. og Fuchs H.W. (2005). Epidermal-Skin-Test 1000 (EST-1000)-A New Reconstructed Epidermis for In Vitro Skin Corrosivity Testing. Toxicol. In Vitro 19: 925-929.

(17)

Kandárová H., Liebsch M., Spielmann,H., Genschow E., Schmidt E., Traue D., Guest R., Whittingham A., Warren N, Gamer A.O., Remmele M., Kaufmann T., Wittmer E., De Wever B., og Rosdy M. (2006). Assessment of the Human Epidermis Model SkinEthic RHE for In Vitro Skin Corrosion Testing of Chemicals According to New OECD TG 431. Toxicol.In Vitro 20: 547-559.

(18)

Tornier C., Roquet M. og Fraissinette A.B. (2010). Adaptation of the Validated SkinEthic™ Reconstructed Human Epidermis (RHE) Skin Corrosion Test Method to 0,5 cm2 Tissue Sample. Toxicol. In Vitro 24: 1379-1385.

(19)

EC-ECVAM (2006). Statement on the Application of the SkinEthic™ Human Skin Model for Skin Corrosivity Testing, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC25), 17 November 2006.

(20)

EC-ECVAM (2009). ESAC Statement on the Scientific Validity of an In-Vitro Test Method for Skin Corrosivity Testing: the EST-1000, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 12 June 2009.

(21)

OECD (2013). Summary Document on the Statistical Performance of Methods in OECD Test Guideline 431 for Sub-categorisation. Environment, Health, and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 190). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(22)

Alépée N., Grandidier M.H., og Cotovio J. (2014). Sub-Categorisation of Skin Corrosive Chemicals by the EpiSkin™ Reconstructed Human Epidermis Skin Corrosion Test Method According to UN GHS: Revision of OECD Test Guideline 431. Toxicol. In Vitro 28:131-145.

(23)

Desprez B., Barroso J., Griesinger C., Kandárová H., Alépée N., og Fuchs, H. (2015). Two Novel Prediction Models Improve Predictions of Skin Corrosive Sub-categories by Test Methods of OECD Test Guideline No 431. Toxicol. In Vitro 29:2055-2080.

(24)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Reconstructed Human Epidermis (RHE) Test Methods For Skin Corrosion in Relation to OECD TG 431. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 219). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris

(25)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(26)

Eskes C. et al. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62:393-403.

(27)

Mosmann T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Methods 65:55-63.

(28)

Tinois E., et al. (1994). The Episkin Model: Successful Reconstruction of Human Epidermis In Vitro. In: In Vitro Skin Toxicology. Rougier A., Goldberg A.M og Maibach H.I. (Eds): 133-140.

(29)

Cannon C. L., Neal P.J., Southee J.A., Kubilus J. og Klausner M. (1994), New Epidermal Model for Dermal Irritancy Testing. Toxicol. in Vitro 8:889-891.

(30)

Ponec M., Boelsma E, Weerheim A, Mulder A, Bouwstra J og Mommaas M. (2000). Lipid and Ultrastructural Characterization of Reconstructed Skin Models. Inter. J. Pharmaceu. 203:211-225.

(31)

Tinois E., Tillier, J., Gaucherand, M., Dumas, H., Tardy, M. og Thivolet J. (1991). In Vitro and Post - Transplantation Differentiation of Human Keratinocytes Grown on the Human Type IV Collagen Film of a Bilayered Dermal Substitute. Exp. Cell Res. 193:310-319.

(32)

Parenteau N.L., Bilbo P, Nolte CJ, Mason VS og Rosenberg M. (1992). The Organotypic Culture of Human Skin Keratinocytes and Fibroblasts to Achieve Form and Function. Cytotech. 9:163-171.

(33)

Wilkins L.M., Watson SR, Prosky SJ, Meunier SF og Parenteau N.L. (1994). Development of a Bilayered Living Skin Construct for Clinical Applications. Biotech. Bioeng. 43/8:747-756.

(34)

EpiSkin™ SOP (December 2011). INVITTOX Protocol (No 118). EpiSkin™ Skin Corrosivity Test.

(35)

EpiDerm™ SOP (February 2012). Version MK-24-007-0024 Protocol for: In Vitro EpiDerm™ Skin Corrosion Test (EPI-200-SCT), for Use with MatTek Corporation’s Reconstructed Human Epidermal Model EpiDerm.

(36)

SkinEthic™ RHE SOP (January 2012). INVITTOX Protocol SkinEthic™ Skin Corrosivity Test.

(37)

EpiCS® SOP (January 2012). Version 4.1 In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test Epidermal Skin Test 1000 (epiCS® ) CellSystems.

(38)

Alépée N., Barroso J., De Smedt A., De Wever B., Hibatallah J., Klaric M., Mewes K.R., Millet M., Pfannenbecker U., Tailhardat M., Templier M., og McNamee P. Use of HPLC/UPLC-spectrophotometry for Detection of MTT Formazan in In Vitro Reconstructed Human Tissue (RhT)-based Test Methods Employing the MTT Assay to Expand their Applicability to Strongly Coloured Test Chemicals. Toxicol. In Vitro 29: 741-761.

(39)

US FDA (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. (May 2001). Tilgængelig på: [http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm070107.pdf].

Tillæg 1

DEFINITIONER

Nøjagtighed : overensstemmelsen mellem forsøgsmetodens resultater og accepterede referenceværdier. Den er et mål for forsøgsmetodens ydeevne og et af aspekterne af relevans. Udtrykket benyttes ofte som synonym for "konkordans", forstået som den andel af korrekte udfald, forsøgsmetoden fører til (25).

Cellelevedygtighed : en parameter, der måler den samlede aktivitet i en cellepopulation, f.eks. udtrykt ved de cellulære mitochondriedehydrogenasers evne til at reducere vitalfarvestoffet MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, thiazolylblåt], og som, afhængigt af det valgte endepunkt og testens udformning, korrelerer med det totale antal levende celler og/eller deres levedygtighed.

Kemikalie : et stof eller en blanding.

Konkordans : et mål for ydeevnen af en forsøgsmetode, der fører til kategoriske resultater, og et af aspekterne af relevans. Udtrykket benyttes af og til som synonym for nøjagtighed og defineres som andelen af alle kemikalier, der klassificeres korrekt som positive eller negative. Konkordansen afhænger i høj grad af forekomsten af positiver i de undersøgte typer testkemikalier (25).

ET50 : kan bedømmes ved at bestemme den eksponeringstid, der er nødvendig for at nedsætte cellernes levedygtighed med 50 % ved påføring af referencekemikaliet i en nærmere angivet fast koncentration, se også IC50.

GHS (det globale harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier) : et system til klassificering af kemikalier (stoffer og blandinger) efter standardiserede typer og niveauer af fysisk fare, sundhedsfare og miljøfare med tilhørende kommunikationselementer såsom piktogrammer, signalord, faresætninger, sikkerhedssætninger og sikkerhedsdatablade, således at oplysninger om kemikaliernes skadelige virkninger kan videreformidles med henblik på at beskytte mennesker (f.eks. arbejdsgivere, arbejdstagere, transportører, forbrugere og redningspersonel) og miljøet (1).

HPLC : High Performance Liquid Chromatography (højtryksvæskekromatografi)

IATA : integreret tilgang til testning og vurdering.

IC50 : kan bedømmes ved at bestemme den koncentration, ved hvilken et referencekemikalie nedsætter vævets levedygtighed med 50 % (IC50) efter en fast eksponeringstid, se også ET50.

Ubegrænset dosis : den mængde testkemikalie, som er påført på epidermis ud over den mængde, der er nødvendig for helt at dække epidermisoverfladen på ensartet måde.

Blanding : en blanding eller opløsning, der er sammensat af to eller flere stoffer, hvori de ikke reagerer.

Stof med kun én bestanddel : et stof, der defineres af sin mængdemæssige sammensætning, hvori en hovedbestanddel udgør mindst 80 % (w/w).

MTT : 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, thiazolylblåt tetrazoliumbromid.

Stof med flere bestanddele: et stof, der defineres ved dets mængdemæssige sammensætning, hvori flere end én hovedbestanddel er til stede i en koncentration på > 10 % (w/w) og < 80 % (w/w). Et stof, der består af flere forskellige bestanddele, er resultatet af en fremstillingsproces. Forskellen mellem en blanding og et stof med flere bestanddele er, at blandingen er fremstillet ved blanding af to eller flere stoffer uden kemisk reaktion. Et stof, der består af flere forskellige bestanddele, er resultatet af en kemisk reaktion.

NC : Ikke-ætsende.

NSCkilled-kontrol : kontrol af ikke-specifik farve i dødt væv.

NSCliving-kontrol : kontrol af ikke-specifik farve i levende væv.

NSMTT : ikke-specifik MTT-reduktion.

OD : optisk tæthed.

PC : positiv kontrol, et replikat, som indeholder alle komponenterne fra et testsystem og er behandlet med et kemikalie, som vides at inducere en positiv respons. For at sikre, at det er muligt at vurdere variabiliteten i den positive kontrolrespons over tid, bør den positive respons ikke være overdrevent stor.

Ydeevnestandarder (PS) : standarder, der med udgangspunkt i en valideret forsøgsmetode danner grundlag for at vurdere, om en foreslået forsøgsmetode, som er mekanistisk og funktionelt tilsvarende, er sammenlignelig. De omfatter bl.a. i) de centrale dele af forsøgsmetoden, ii) en minimumsliste med referencekemikalier, som er udvalgt blandt de kemikalier, der er benyttet til at påvise, at den validerede forsøgsmetodes ydeevne er acceptabel, og iii) de tilsvarende niveauer af pålidelighed og nøjagtighed, som er fastsat efter, hvad der er opnået med den validerede forsøgsmetode, og som det bør påvises, at den foreslåede forsøgsmetode kan yde, ved vurdering ud fra minimumslisten med referencekemikalier (25).

Relevans : beskrivelse af sammenhængen mellem forsøgsmetoden og den pågældende virkning og dens meningsfuldhed og brugbarhed til et bestemt formål. Det angives, i hvilket omfang forsøgsmetoden måler eller forudsiger den pågældende biologiske virkning korrekt. Forsøgsmetodens nøjagtighed (konkordans) indgår i vurderingen af dens relevans (25).

Pålidelighed : mål for, i hvilken grad en forsøgsmetode kan reproduceres i og mellem laboratorier over en længere periode, når den udføres efter samme protokol. Den bedømmes ved beregning af reproducerbarhed inden for og mellem laboratorier (25).

Analyseserie : en analyseserie består af et eller flere testkemikalier, der testes samtidig med en negativ kontrol og en PC.

Følsomhed : andelen af alle positive/aktive kemikalier, der klassificeres korrekt ved forsøgsmetoden. Den er et mål for nøjagtigheden af en forsøgsmetode, som giver kategoriske resultater, og er et vigtigt kriterium ved vurderingen af en forsøgsmetodes relevans (25).

Hudætsning : in vivo: fremkaldelse af irreversibel skade på huden, dvs. synlig nekrose gennem epidermis og ned i dermis efter påføring af et testkemikalie i indtil fire timer. Typiske ætsningsreaktioner er sår, blødning, blodige skorper, efter 14 dages observation affarvning som følge af blegning af huden, hele områder med alopeci samt ardannelse. Tvivlsomme læsioner bør overvejes vurderet ved histopatologisk undersøgelse.

Specificitet : andelen af alle negative/inaktive kemikalier, der klassificeres korrekt ved forsøgsmetoden. Den er et mål for nøjagtigheden af en forsøgsmetode, som giver kategoriske resultater, og er et vigtigt kriterium ved vurderingen af en forsøgsmetodes relevans (25).

Stof : et grundstof og forbindelser heraf, naturlige eller industrielt fremstillede, indeholdende sådanne tilsætningsstoffer, som er nødvendige til bevarelse af stoffets stabilitet, og sådanne urenheder, som følger af fremstillingsprocessen, bortset fra opløsningsmidler, som kan udskilles, uden at det påvirker stoffets stabilitet eller ændrer dets sammensætning.

Testkemikalie : alle stoffer eller blandinger, der testes ved hjælp af denne forsøgsmetode.

UPLC : Ultra-High Performance Liquid Chromatography (ultra-højtryksvæskekromatografi).

UVCB : stoffer med ukendt eller variabel sammensætning, komplekse reaktionsprodukter eller biologiske materialer.

Tillæg 2

VIGTIGSTE KOMPONENTER I RHE-TESTMODELLER, SOM ER VALIDERET TIL VURDERING AF HUDÆTSNING

Testmodellernes komponenter

EpiSkinTM

EpiDermTM SCT

SkinEthicTM RHE

epiCS®

Modelareal

0,38 cm2

0,63 cm2

0,5 cm2

0,6 cm2

Antal vævsprøver

Mindst to pr. eksponeringsperiode

To-tre pr. eksponeringsperiode

Mindst to pr. eksponeringsperiode

Mindst to pr. eksponeringsperiode

Behandlingsdoser og påføring

Væsker og viskøse stoffer: 50 μl ± 3 μl (131,6 μl/cm2)

Faste stoffer: 20 ± 2 mg (52,6 mg/cm2) + 100 μl ± 5 μl NaCl-opløsning (9 g/l)

Voks/klæbrige stoffer: 50 ± 2 mg (131,6 mg/cm2) med et nylonnet

Væsker: 50 μl (79,4 μl/cm2) med eller uden et nylonnet

Forudgående test af testkemikaliets kompatibilitet med nylonnet

Halvfaste stoffer: 50 μl (79,4 μl/cm2)

Faste stoffer: 25 μl H2O (eller mere om nødvendigt) + 25 mg (39,7 mg/cm2)

Voks: flad "småkage" med en diameter på ca. 8 mm anbragt oven på vævet og befugtet med 15 μl H2O.

Væsker og viskøse stoffer: 40 μl ± 3 μl (80 μl/cm2) ved anvendelse af nylonnet

Forudgående test af testkemikaliets kompatibilitet med nylonnet

Faste stoffer: 20 μl ± 2 μl H2O + 20 ± 3 mg (40 mg/cm2)

Voks/klæbrige stoffer: 20 ± 3 mg (40 mg/cm2) ved anvendelse af nylonnet

Væsker: 50 μl (83,3 μl/cm2) ved anvendelse af nylonnet

Forudgående test af testkemikaliets kompatibilitet med nylonnet

Halvfaste stoffer: 50 μl (83,3 μl/cm2)

Faste stoffer: 25 mg (41,7 mg/cm2) + 25 μl H2O (eller mere om nødvendigt)

Voks: flad "småkage" med en diameter på ca. 8 mm anbragt oven på vævet og befugtet med 15 μl H2O.

Forhåndskontrol for direkte MTT-reduktion

50 μl (væske) eller 20 mg (fast stof)+ 2 ml MTT

0,3 mg/ml opløsning i 180 ± 5 min. ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH

→ Hvis opløsningen bliver blå/violet, bør der gennemføres tilpassede "water-killed"-kontroller.

50 μl (væske) eller 25 mg (fast stof)+ 1 ml MTT

1 mg/ml opløsning i 60 min. ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH

→ Hvis opløsningen bliver blå/violet, bør der gennemføres tilpassede "freeze-killed"-kontroller.

40 μl (væske) eller 20 mg (fast stof)+ 1 ml MTT

1 mg/ml opløsning i 180 ± 15 min ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH

→ Hvis opløsningen bliver blå/violet, bør der gennemføres tilpassede "freeze-killed"-kontroller.

50 μl (væske) eller 25 mg (fast stof)+ 1 ml MTT

1 mg/ml opløsning i 60 min. ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH

→ Hvis opløsningen bliver blå/violet, bør der gennemføres tilpassede "freeze-killed"-kontroller.

Forhåndskontrol for farveinterferens

10 μl (væske) eller 10 mg (fast stof) + 90 μl H2O blandet i 15 min. ved stuetemperatur

→ Hvis opløsningen bliver farvet, bør der gennemføres tilpassede "living"-kontroller.

50 μl (væske) eller 25 mg (fast stof) + 300 μl H2O i 60 min. ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH

→ Hvis opløsningen bliver farvet, bør der gennemføres tilpassede "living"-kontroller.

40 μl (væske) eller 20 mg (fast stof) + 300 μl H2O blandet i 60 min. ved stuetemperatur

→ Hvis testkemikaliet er farvet, bør der gennemføres tilpassede "living"-kontroller.

50 μl (væske) eller 25 mg (fast stof) + 300 μl H2O i 60 min. ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH

→ Hvis opløsningen bliver farvet, bør der gennemføres tilpassede "living"-kontroller.

Eksponering – tid og temperatur

3 min, 60 min (± 5 min) og 240 min (± 10 min)

i et ventileret kammer stuetemperatur (RT, 18-28 °C)

3 min ved RT og 60 min ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH

3 min ved RT og 60 min ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH

3 min ved RT og 60 min ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH

Skylning

25 ml 1x PBS (2 ml/ad gangen)

20 gange med en jævn blid stråle af 1x PBS

20 gange med en jævn blid stråle af 1x PBS

20 gange med en jævn blid stråle af 1x PBS

Negativ kontrol

50 μl NaCl-opløsning (9 g/l)

Testet med hver eksponeringstid

50 μl H2O

Testet med hver eksponeringstid

40 μl H2O

Testet med hver eksponeringstid

50 μl H2O

Testet med hver eksponeringstid

Positiv kontrol

50 μl iseddikesyre

Kun testet i fire timer

50 μl 8N KOH

Testet med hver eksponeringstid

40 μl 8N KOH

Kun testet i en time

50 μl 8N KOH

Testet med hver eksponeringstid

MTT-opløsning

2 ml 0,3 mg/ml

300 μl 1 mg/ml

300 μl 1 mg/ml

300 μl 1 mg/ml

MTT-inkubation – tid og temperatur

180 min (± 15 min) ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH

180 min ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH

180 min (± 15 min) ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH

180 min ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH

Ekstraktionsopløsningsmiddel

500 μl sur isopropanol

(0,04 N HCl i isopropanol)

(det isolerede væv er helt nedsænket)