Kommissionens forordning (EF) nr. 535/2002

af 21. marts 2002

om ændring af bilag C til Rådets direktiv 64/432/EØF og om ændring af beslutning 2000/330/EF

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europæiske Fællesskab,

under henvisning til Rådets direktiv 64/432/EØF af 26. juni 1964 om veterinærpolitimæssige problemer ved handel inden for Fællesskabet med kvæg og svin(1), senest ændret ved Kommissionens beslutning 2001/298/EF(2), særlig artikel 16, stk. 1, andet afsnit, og

ud fra følgende betragtninger:

(1) Den 11. oktober 1999 vedtog Den Videnskabelige Komité for Dyrs Sundhed og Trivsel en rapport(3) om ændring af de tekniske bilag til direktiv 64/432/EØF for at tage hensyn til den videnskabelige udvikling med hensyn til tuberkulose, brucellose og enzootisk kvægleukose.

(2) Ifølge ovennævnte rapport bør brucellosetest udføres i henhold til Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 3. udgave, 1996, fra Det Internationale Kontor for Epizootier (OIE).

(3) I august 2001 offentliggjorde OIE 4. udgave, 2000, af denne manual, som indeholder ændringer af beskrivelsen af brucellosetest.

(4) Det er derfor nødvendigt at ændre bilag C til direktiv 64/432/EØF for at fastlægge testprocedurer, der skal gælde i forbindelse med kontrol og handel inden for EF, og som så vidt muligt afspejler OIE-standarderne, men som også er baseret på råd fra den videnskabelige komité og medlemsstaternes nationale referencelaboratorier, der samarbejder inden for Den Europæiske Unions netværk af nationale referencelaboratorier for brucellose.

(5) Kommissionens beslutning 2000/330/EF af 18. april 2000 om godkendelse af test til påvisning af antistoffer mod kvægbrucellose som led i Rådets direktiv 64/432/EØF(4) bør ændres i overensstemmelse hermed.

(6) De i denne forordning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den Stående Veterinærkomité -

UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING:

Artikel 1

Bilag C til direktiv 64/432/EØF affattes som angivet i bilaget til denne forordning.

Artikel 2

I beslutning 2000/330/EF foretages følgende ændringer:

1) Artikel 1 affattes således: "Artikel 1

Komplementbindingstest, brucella-stødpudeantigentest og ELISA-test, som udføres i henhold til bilag C til direktiv 64/432/EØF, godkendes med henblik på udstedelse af certifikat."

2) Bilaget udgår.

Artikel 3

Denne forordning træder i kraft på tyvendedagen efter offentliggørelsen i De Europæiske Fællesskabers Tidende.

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat.

Udfærdiget i Bruxelles, den 21. marts 2002.

På Kommissionens vegne

David Byrne

Medlem af Kommissionen

(1) EFT 121 af 29.7.1964, s. 1977/64.

(2) EFT L 102 af 12.4.2001, s. 63.

(3) SANCO/B3/R10/1999.

(4) EFT L 114 af 13.5.2000, s. 37.

BILAG

"BILAG C

BRUCELLOSE

1. IDENTIFIKATION AF AGENS

Påvises der organismer med brucella morfologi i abortmateriale, vaginalflåd eller mælk ved hjælp af modificeret syrefast eller immunspecifik farvning, er der stor sandsynlighed for, at der er tale om brucellose, især hvis diagnosen støttes af serologiske test.

Efter isolation bør art og biovar identificeres ved hjælp af faglysis og/eller oxidative stofskifteundersøgelser, dyrkningskriterier og biokemiske og serologiske kriterier.

De anvendte teknikker og medier, standardiseringen af dem og fortolkningen af resultaterne skal være i overensstemmelse med OIE's Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 4. udgave, 2000, kapitel 2.3.1 (kvægbrucellose), kapitel 2.4.2 (fåre- og gedebrucellose) og kapitel 2.6.2 (svinebrucellose).

2. IMMUNOLOGISKE TEST

2.1. Standarder

2.1.1. Der skal bruges Brucella abortus biovar 1 Weybridge-stamme nr. 99 eller USDA-stamme 1119-3 til fremstilling af alle antigener, der anvendes i Rose Bengal-test (RBT), serum-agglutinationstest (SAT), komplementbindingstest (CFT) og mælkeringtest (MRT).

2.1.2. Standardreferenceserum til RBT, SAT, CFT og MRT er OIE's internationale standardreferenceserum (OIEISS), der tidligere blev kaldt WHO's andet internationale anti-brucella abortus-serum (ISAbS).

2.1.3. Standardreferencesera for ELISA-test er:

- OIEISS

- det svagt positive OIE ELISA-standardserum (OIEELISAWPSS)

- det stærkt positive OIE ELISA-standardserum (OIEELISASPSS)

- det negative OIE ELISA-standardserum (OIEELISANSS).

2.1.4. Ovennævnte standardsera kan fås hos Veterinary Laboratories Agency (VLA), Weybridge, Det Forenede Kongerige.

2.1.5. OIEISS, OIEELISAWPSS, OIEELISASPSS og OIEELISANSS er internationale primære standarder, ud fra hvilke der skal etableres nationale sekundære referencestandarder ("arbejdsstandarder") for hver test i de enkelte medlemsstater.

2.2. Prøver med brug af enzymmærket antistof (ELISA-test) eller andre immunbindingsanalyser til påvisning af kvægbrucellose i serum eller mælk

2.2.1. Materialer og reagenser

Den teknik, der anvendes, og fortolkningen af resultaterne skal være godkendt efter principperne i kapitel 1.1.3 i OIE's Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 4. udgave, 2000, og bør mindst indbefatte laboratorieundersøgelser og diagnostiske undersøgelser.

2.2.2. Teststandardisering

2.2.2.1. Standardisering af testproceduren for individuelle serumprøver:

a) En forfortynding af OIEISS i forholdet 1:150(1) eller en forfortynding af OIEELISAWPSS i forholdet 1:2 eller en forfortynding af OIEELISASPSS i forholdet 1:16 i et negativt serum (eller i en negativ serumpulje) skal give en positiv reaktion.

b) En forfortynding af OIEISS i forholdet 1:600 eller en forfortynding af OIEELISAWPSS i forholdet 1:8 eller en forfortynding af OIEELISASPSS i forholdet 1:64 i et negativt serum (eller i en negativ serumpulje) skal give en negativ reaktion.

c) OIEELISANSS skal altid give en negativ reaktion.

2.2.2.2. Standardisering af testproceduren for puljede serumprøver:

a) En forfortynding af OIEISS i forholdet 1:150 eller en forfortynding af OIEELISAWPSS i forholdet 1:2 eller en forfortynding af OIEELISASPSS i forholdet 1:16 i et negativt serum (eller i en negativ serumpulje), der igen er fortyndet i negative sera med antallet af prøver, der indgår i puljen, skal give en positiv reaktion.

b) OIEELISANSS skal altid give en negativ reaktion.

c) Testen skal kunne bruges til at påvise infektion hos et enkelt dyr i den gruppe af dyr, som serumprøverne, der indgår i puljen, er taget fra.

2.2.2.3. Standardisering af testproceduren for puljede mælke- eller valleprøver:

a) En forfortynding af OIEISS i forholdet 1:1000 eller en forfortynding af OIEELISAWPSS i forholdet 1:16 eller en forfortynding af OIEELISASPSS i forholdet 1:125 i et negativt serum (eller i en negativ serumpulje), der igen er fortyndet i forholdet 1:10 i negativ mælk, skal give en positiv reaktion.

b) OIEELISANSS fortyndet i forholdet 1:10 i negativ mælk skal altid give en negativ reaktion.

c) Testen skal kunne bruges til at påvise infektion hos et enkelt dyr i den gruppe af dyr, som mælke- eller valleprøverne, der indgår i puljen, er taget fra.

2.2.3. Betingelser for anvendelse af ELISA-test til diagnosticering af kvægbrucellose

2.2.3.1. Ved anvendelsen af ovennævnte kalibreringsbetingelser for ELISA'er på serumprøver skal ELISA-testen diagnostisk være mindst lige så sensitiv som RBT eller CFT, idet der tages hensyn til den epidemiologiske situation, som testen anvendes i.

2.2.3.2. Ved anvendelsen af ovennævnte kalibreringsbetingelser for ELISA på puljede mælkeprøver skal ELISA-testen diagnostisk være mindst lige så sensitiv som MRT, idet der ikke blot tages hensyn til den epidemiologiske situation, men også til de gennemsnitlige og forventede ekstremer af husdyrbrugssystemer.

2.2.3.3. Anvendes der ELISA'er med henblik på udstedelse af certifikat i henhold til artikel 6, stk. 1, eller med henblik på etablering og bevarelse af en besætningsstatus i henhold til bilag A, afsnit II, punkt 10, skal serumprøverne puljes på en sådan måde, at testresultaterne med sikkerhed kan henføres til det individuelle dyr i puljen. Eventuelle verifikationstest skal udføres på serumprøver fra individuelle dyr.

2.2.3.4. Der kan anvendes ELISA'er på en mælkeprøve taget fra mælk, der er indsamlet fra en bedrift med mindst 30 % lakterende malkekøer. Anvendes denne metode, skal der træffes foranstaltninger til at sikre, at de prøver, der er udtaget til undersøgelse, med sikkerhed kan henføres til de individuelle dyr, som mælken stammer fra. Eventuelle verifikationstest skal udføres på serumprøver fra individuelle dyr.

2.3. Komplementbindingstest (CFT)

2.3.1. Antigenet består af en bakterieopløsning i fenol-kogsaltopløsning (NaCl 0,85 % (m/v) med tilsætning af fenol 0,5 % (v/v)) eller i en veronalbufferopløsning. Antigenerne kan leveres i koncentreret stand, såfremt den fortyndingsfaktor, som skal anvendes, er angivet på flaskens etiket. Antigenet opbevares ved 4 °C og ikke i frossen stand.

2.3.2. Sera skal inaktiveres på følgende måde:

- kvægserum: 56 til 60 °C i 30 til 50 minutter

- svineserum: 60 °C i 30 til 50 minutter.

2.3.3. For at opnå en sand testreaktion skal der anvendes en komplementdosis, der ligger over det nødvendige minimum for en total hæmolyse.

2.3.4. Ved gennemførelse af komplementbindingstesten foretages hver gang følgende kontrol:

a) kontrol af serumets antikomplementære virkning

b) kontrol af antigenet

c) kontrol af de sensibiliserede røde blodlegemer

d) kontrol af komplementet

e) kontrol af sensitiviteten ved reaktionens begyndelse ved hjælp af et positivt serum

f) kontrol af reaktionens specificitet ved hjælp af et negativt serum.

2.3.5. Beregning af resultater

OIEISS indeholder 1000 internationale CFT-enheder (ICFTU) pr. ml. Hvis OIEISS testes efter en given metode, angives resultatet som en titer (TOIEISS). Testresultatet for testserum angivet som titer (TTESTSERUM) skal udtrykkes i ICFTU pr. ml. Til omregning af en titer til ICFTU kan den faktor (F), der kræves for at omregne titeren for et ukendt testserum (TTESTSERUM), der er testet efter denne metode, til ICFTU, findes ved hjælp af formlen:

>PIC FILE= "L_2002080DA.002501.TIF">

og indholdet af internationale CFT-enheder pr. ml testserum (ICFTUTESTSERUM) kan findes ved hjælp af formlen:

>PIC FILE= "L_2002080DA.002502.TIF">

2.3.6. Fortolkning af resultater

Et serum, der indeholder 20 ICFTU pr. ml eller derover, betragtes som positivt.

2.4. Mælkeringtest (MRT)

2.4.1. Antigenet består af en bakterieopløsning i fenol-kogsaltopløsning (NaCl 0,85 % (m/v) med tilsætning af fenol 0,5 % (v/v)) farvet med hæmatoxylin. Antigenet opbevares ved 4 °C og ikke i frossen stand.

2.4.2. Antigensensitiviteten skal standardiseres i forhold til OIEISS på en sådan måde, at antigenet giver en positiv reaktion med en fortynding af OIEISS i forholdet 1:500 i negativ mælk og en negativ reaktion med en fortynding i forholdet 1:1000

2.4.3. Ringtesten skal udføres på prøver, der er repræsentative for indholdet i hver transportspand eller samletank fra bedriften.

2.4.4. Mælkeprøverne må ikke have været frosset, opvarmet eller være blevet rystet kraftigt.

2.4.5. Reaktionen udføres efter en af følgende metoder:

- på en mindst 25 mm høj mælkesøjle og en mælkemængde på 1 ml, som er tilsat 0,03 eller 0,05 ml af et af de standardiserede, farvede antigener

- på en mindst 25 mm høj mælkesøjle og en mælkemængde på 2 ml, som er tilsat 0,05 ml af et af de standardiserede, farvede antigener

- på en mælkemængde på 8 ml, som er tilsat 0,08 ml af et af de standardiserede, farvede antigener.

2.4.6 Blandingen af mælk og antigen skal henstå ved 37 °C i 60 minutter sammen med positive og negative arbejdsstandarder. Henstår blandingen i yderligere 16 til 24 timer ved 4 °C, øges testens sensitivitet.

2.4.7. Fortolkning af resultater

a) negativ reaktion: mælken farvet, fløden farveløs

b) positiv reaktion:

- mælk og fløde farvet på samme måde, eller

- mælken farveløs og fløden farvet.

2.5. Rose Bengal-test (RBT)

2.5.1. Antigenet består af en bakterieopløsning i "buffered" brucella-antigenfortynder med en pH på 3,65 ± 0,05 farvet med Rose Bengal-farvestof. Antigenet skal leveres brugsklart og skal opbevares ved 4 °C og ikke i frossen stand.

2.5.2. Antigenet tilberedes uden hensyntagen til cellekoncentrationen, men dets sensitivitet skal standardiseres i forhold til OIEISS på en sådan måde, at antigenet giver en positiv reaktion med en serumfortynding i forholdet 1:45 og en negativ reaktion med en fortynding i forholdet 1:55.

2.5.3. RBT udføres således:

a) Serum (20-30 μl) blandes med en tilsvarende mængde antigen på en hvid eller emaljeret plade, så der dannes en flade med en diameter på ca. 2 cm. Blandingen vippes blidt i 4 minutter ved stuetemperatur og aflæses derefter i god belysning for agglutination.

b) Der kan anvendes en automatiseret metode, men den skal være mindst lige så sensitiv og nøjagtig som den manuelle metode.

2.5.4. Fortolkning af resultater

Enhver synlig reaktion betragtes som positiv, medmindre kanterne er stærkt udtørrede.

Der skal medtages positive og negative arbejdsstandarder i hver testrække.

2.6. Serum-agglutinationstest (SAT)

2.6.1. Antigenet består af en bakterieopløsning i fenol-kogsaltopløsning (NaCl 0,85 % (m/v) med tilsætning af fenol 0,5 % (v/v)). Der må ikke anvendes formaldehyd.

Antigenerne kan leveres i koncentreret stand, såfremt den fortyndingsfaktor, som skal anvendes, er angivet på flaskens etiket.

For at reducere antallet af falske positive testresultater kan antigenopløsningen tilsættes EDTA til en endelig testkoncentration på 5 mM. Antigenopløsningens pH justeres derpå igen til 7,2.

2.6.2. OIEISS indeholder 1000 internationale agglutinationsenheder.

2.6.3. Antigenet tilberedes uden hensyntagen til cellekoncentrationen, men dets sensitivitet skal standardiseres i forhold til OIEISS på en sådan måde, at antigenet enten giver 50 % agglutination med en endelig serumfortynding på mellem 1:600 og 1:1000 eller 75 % agglutination med en endelig serumfortynding på mellem 1:500 og 1:750.

Det kan også være tilrådeligt at sammenligne nye og tidligere standardiserede antigenbatchers reaktivitet ved hjælp af et panel af definerede sera.

2.6.4. Testen udføres enten i reagensglas eller på mikroplader. Blandingen af antigen og serumfortyndinger skal henstå i 16 til 24 timer ved 37 °C.

Der tilberedes mindst tre fortyndinger for hvert serum. Fortyndinger af mistænkt serum laves på en sådan måde, at reaktionen ved positivitetsgrænsen aflæses i det midterste reagensglas (eller den midterste fordybning på mikroplader).

2.6.5. Fortolkning af resultater

Indholdet af brucella-agglutininer i et serum skal udtrykkes i IE pr. ml.

Et serum, der indeholder 30 IE pr. ml eller derover, betragtes som positivt.

3. SUPPLERENDE TEST

3.1. Brucellose-kutantest (BST)

3.1.1. Betingelser for anvendelse af BST

a) Brucellose-kutantesten må ikke anvendes med henblik på udstedelse af certifikat til handel inden for EF.

b) Brucellose-kutantesten er en af de mest specifikke test til påvisning af brucellose hos uvaccinerede dyr, men diagnosen bør ikke stilles alene på grundlag af positive intradermale reaktioner.

c) Kvæg, der har reageret negativt på en af de serologiske test, der er defineret i dette bilag, og som reagerer positivt på BST, betragtes som inficeret.

d) Kvæg, der har reageret positivt på en af de serologiske test, der er defineret i dette bilag, kan underkastes en BST til støtte for fortolkningen af de serologiske testresultater, især hvis der i brucellosefri eller officielt brucellosefri besætninger ikke kan udelukkes en krydsreaktion med antistoffer mod andre bakterier.

3.1.2. Testen udføres ved hjælp af et standardiseret og defineret brucellose-allergenpræparat, der ikke indeholder glat lipoplysaccharid (LPS)-antigen, da det kan fremkalde uspecifikke betændelsesreaktioner eller forstyrre senere serologiske test.

Brucellin INRA er et sådant præparat, der er fremstillet af en ru B. melitensis-stamme. Fremstillingskravene er beskrevet i afsnit B 2 i kapitel 2.4.2 i OIE's Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 4. udgave, 2000.

3.1.3. Testprocedure

3.1.3.1. 0,1 ml brucellose-allergen injiceres intradermalt i halefolden, flanken eller siden af halsen.

3.1.3.2. Testen aflæses efter 48 til 72 timer.

3.1.3.3. Hudtykkelsen på injektionsstedet måles med en skydelære før injektionen og ved den efterfølgende undersøgelse.

3.1.3.4. Fortolkning af resultater:

Stærke reaktioner erkendes let ved lokal hævelse og induration.

En hudfortykkelse på 1,5 til 2 mm betragtes som en positiv reaktion på BST.

3.2. Kompetitiv prøve med brug af enzymmærket antistof (cELISA)

3.2.1. Betingelser for anvendelse af cELISA:

a) cELISA-testen må ikke anvendes med henblik på udstedelse af certifikat til handel inden for EF.

b) cELISA-testen har vist sig at være mere specifik end f.eks. den indirekte ELISA-test og kan derfor anvendes til støtte for fortolkningen af de serologiske testresultater.

3.2.2. Testprocedure

Testen skal foretages i overensstemmelse med forskrifterne i OIE's Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 4. udgave, 2000, kapitel 2.3.1, punkt 2.a).

4. NATIONALE REFERENCELABORATORIER

4.1. Opgaver og ansvar

De nationale referencelaboratorier er ansvarlige for følgende:

a) godkendelse af resultaterne af valideringsundersøgelser, der dokumenterer, at den testmetode, der anvendes i medlemsstaten, er pålidelig

b) fastsættelse af det maksimale antal prøver, der kan puljes i de ELISA-kits, der anvendes

c) kalibrering af de nationale sekundære referencestandardsera ("arbejdsstandarder") i forhold til det internationale primære standardserum, der er nævnt i punkt 2.1

d) kvalitetskontrol af alle antigener og batcher af ELISA-kits, der anvendes i medlemsstaten

e) samarbejde inden for EU-netværket af nationale referencelaboratorier for brucellose.

4.2. Liste over nationale referencelaboratorier

BELGIEN

Centre d'étude et de recherches vétérinaires et agrochimiques (CERVA/CODA) Groeselenberg 99 B - 1180 Bruxelles/Brussel

DANMARK

Danmarks Veterinærinstitut Bülowsvej 27 DK - 1790 København

TYSKLAND

Bundesinstitut für Gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BGVV) Nationales Veterinärmedizinisches Referenzlabor für Brucellose Postfach 33 00 13 D - 14191 Berlin

GRÆKENLAND

Veterinary Laboratory of Larissa Department of Microbiology 6th km of National Road Larissa-Trikala GR - 4111 10 Larissa

SPANIEN

Laboratorio Central de Veterinaria de Santa Fe Camino del Jau S/N E - 18320 Santa Fe ( Granada )

FRANKRIG

Laboratoire national et OIE/FAO de référence pour la brucellose Agence française de sécurité sanitaire des aliments (AFSSA) BP 67 F - 94703 Maisons-Alfort Cedex

IRLAND

Brucellosis Laboratory Model Farm Road Cork Irland

ITALIEN

Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Abruzzo e del Molise Via Campo Boario I - 64100 Teramo

LUXEMBOURG

State Laboratory for Veterinarian Medicine 54, av. Gaston Diderich BP 2081 L - 1020 Luxembourg

NEDERLANDENE

Centraal Instituut voor Dierziekte Controle

CIDC-Lelystad

Houtribweg 39 PO Box 2004 8203 AA Lelystad Nederlandene

ØSTRIG

Bundesanstalt für veterinärmedizinische Untersuchungen Robert-Koch-Gasse 17 A - 2340 Modling

PORTUGAL

Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (LNIV) Estrada de Benfica, nr. 701 P - 1549-011 Lisboa

FINLAND

National Veterinary and Food Research Institute Hämeentie 57 PO Box 45 FIN - 00581 Helsinki

SVERIGE

Statens veterinärmedicinska anstalt S - 751 89 Uppsala

DET FORENEDE KONGERIGE

1) FAO/WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Brucellosis

Veterinary Laboratories Agency

New Haw Addlestone Surrey KT15 3NB United Kingdom

2) Immunodiagnostics Department

Veterinary Sciences Division

Stoney Road Stormont Belfast BT4 3SD United Kingdom

(1) Fortyndinger, der anvendes til at skabe flydende reagenser, udtrykkes i dette bilag som f.eks. 1:150, hvilket betyder en fortynding på 1 til 150."