2009R0152 — DA — 17.07.2014 — 004.002

Dette dokument er et dokumentationsredskab, og institutionerne påtager sig intet ansvar herfor

Ændret ved:

Berigtiget ved:

▼B

KOMMISSIONENS FORORDNING (EF) NR152/2009

af 27. januar 2009

om prøveudtagnings- og analysemetoder til offentlig kontrol af foder

(EØS-relevant tekst)

▼M3

Artikel 1

Udtagning af prøver som led i den offentlige kontrol af foder, navnlig for så vidt angår bestemmelse af bestanddele, herunder materiale, der indeholder eller består af eller er fremstillet af genetisk modificerede organismer, fodertilsætningsstoffer som defineret i Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1831/2003 ( 20 ), uønskede stoffer som defineret i Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2002/32/EF ( 21 ), foretages efter de metoder, der er anført i bilag I.

Den prøveudtagningsmetode, der er anført i bilag I, finder anvendelse på kontrol af foder, for så vidt angår bestemmelse af pesticidrester som defineret i Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 396/2005 ( 22 ) og kontrol af overensstemmelse med forordning (EU) nr. 619/2011.

▼B

Artikel 2

Klargøring af prøver til analyse og angivelse af resultater foretages efter de metoder, der er beskrevet i bilag II.

Artikel 3

Analyser som led i den offentlige kontrol af foder foretages efter de metoder, der er beskrevet i bilag III (Analysemetoder til kontrol af sammensætningen af fodermidler og foderblandinger), bilag IV (Analysemetoder til kontrol af indholdet af godkendte tilsætningsstoffer i foder), bilag V (Analysemetoder til kontrol for uønskede stoffer i foder) og bilag VI (Analysemetoder til bestemmelse af animalske bestanddele som led i den offentlige kontrol af foder).

Artikel 4

Næringsværdien af foderblandinger til fjerkræ beregnes som angivet i bilag VII.

Artikel 5

De i bilag VIII beskrevne analysemetoder til kontrol for ulovlig forekomst af fodertilsætningsstoffer, der ikke længere er tilladt, anvendes til verifikationsformål.

Artikel 6

Direktiv 71/250/EØF, 71/393/EØF, 72/199/EØF, 73/46/EØF, 76/371/EØF, 76/372/EØF, 78/633/EØF, 81/715/EØF, 84/425/EØF, 86/174/EØF, 93/70/EØF, 93/117/EF, 98/64/EF, 1999/27/EF, 1999/76/EF, 2000/45/EF, 2002/70/EF og 2003/126/EF ophæves.

Henvisninger til de ophævede direktiver gælder som henvisninger til nærværende forordning og læses efter sammenligningstabellerne i bilag IX.

Artikel 7

Denne forordning træder i kraft på tyvendedagen efter offentliggørelsen i Den Europæiske Unions Tidende.

Den anvendes fra den 26. august 2009

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat.

▼M3

BILAG I

PRØVEUDTAGNINGSMETODER

1.   FORMÅL OG ANVENDELSESOMRÅDE

Prøver, der er bestemt til offentlig kontrol af foder, udtages i overensstemmelse med de nedenfor anførte metoder. De således fremkomne prøver skal betragtes som repræsentative for de portioner, der prøvetages af.

Formålet med repræsentativ prøveudtagning er at udtage en brøkdel af et parti på en sådan måde, at fastlæggelsen af de særlige karakteristika ved denne brøkdel repræsenterer gennemsnitsværdien af partiets karakteristika. Der udtages prøver af partiet ved gentagne gange at udtage enkeltprøver på forskellige steder i partiet. Disse enkeltprøver kombineres ved sammenblanding, så de udgør en samleprøve, hvorfra der klargøres repræsentative slutprøver ved hjælp af repræsentativ prøveneddeling.

Hvis det ved en visuel kontrol viser sig, at en del af det foder, der skal udtages prøver af, er af en anden kvalitet end resten af foderet i samme parti, adskilles de pågældende dele fra resten af foderet og behandles som et særskilt delparti. Hvis det ikke er muligt at opdele foderet i særskilte delpartier, udtages prøver som fra et parti. I sådanne tilfælde nævnes dette i prøveudtagningsrapporten.

Såfremt det konstateres, at foder, der udtages prøver af i overensstemmelse med bestemmelserne i denne forordning, og som ikke opfylder EU's krav, udgør en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse, antages det, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU's krav.

2.   DEFINITIONER

3.   ALMINDELIGE BESTEMMELSER

4.   APPARATUR

5.   KVANTITATIVE KRAV FOR SÅ VIDT ANGÅR ANTAL ENKELTPRØVER

5.1.    Kvantitative krav for så vidt angår enkeltprøver i forbindelse med kontrol af stoffer og produkter, der er homogent fordelt i foderet

5.1.1.    Uemballeret foder i fast form

5.1.2.    Uemballeret foder i flydende form

5.1.3.    Emballeret foder

Foder (i fast og flydende form) kan være emballeret i sække, poser, dåser, tønder mv., der i tabellen er omhandlet som enheder. Af store enheder (≥ 500 kg eller liter) udtages prøver i overensstemmelse med bestemmelserne for uemballeret foder (jf. punkt 5.1.1 og 5.1.2).

5.1.4.    Foderblokke og mineralske sliksten

▼C1

For hver 25 enheder, der prøvetages, udtages mindst én blok eller sliksten, dog højst 4 blokke eller sliksten.

▼M3

For blokke eller sliksten, der ikke vejer over 1 kg stykket, udgøres en enkeltprøve af indholdet af én blok eller én sliksten.

5.1.5.    Grovfoder/foderplanter

5.2.    Kvantitative krav for så vidt angår enkeltprøver i forbindelse med kontrol af bestanddele eller stoffer, der sædvanligvis er uhomogent fordelt i foderet

Disse kvantitative krav for så vidt angår enkeltprøver skal anvendes i følgende situationer:

Hvis kontrolmyndigheden har stærk mistanke om, at der forekommer en uhomogen fordeling, og i tilfælde af krydsforurening fra en bestanddel eller et stof i en foderblanding, kan de kvantitative krav i nedenstående tabel anvendes.

5.3.    Kvantitative krav for så vidt angår enkeltprøverne i tilfælde af meget store partier

I tilfælde af store portioner, der prøvetages af (> 500 tons), er antallet af enkeltprøver, der skal udtages = 40 enkeltprøver + kvadratroden af antal tons i forbindelse med kontrol af stoffer og produkter, der er homogent fordelt i foderet, eller 100 enkeltprøver + kvadratroden af antal tons i forbindelse med kontrol af bestanddele eller stoffer, der sædvanligvis er uhomogent fordelt i fodermidler.

6.   KVANTITATIVE KRAV FOR SÅ VIDT ANGÅR SAMLEPRØVER

7.   KVANTITATIVE KRAV FOR SÅ VIDT ANGÅR SLUTPRØVER

Slutprøver

Der kræves analyse af mindst én slutprøve. Mængden af slutprøven, der skal analyseres, må ikke være mindre end:

8.   PRØVEUDTAGNINGSMETODE FOR MEGET STORE PARTIER ELLER PARTIER, SOM OPBEVARES ELLER TRANSPORTERES PÅ EN MÅDE, SÅ PRØVEUDTAGNING I HELE PARTIET IKKE ER MULIG

8.1.    Generelle principper

Hvis transport eller opbevaring af et parti forhindrer udtagning af enkeltprøver i hele partiet, bør prøveudtagning af sådanne partier foretages, når partiet er i flow.

I tilfælde af store lagerbygninger, der er bestemt til oplagring af foder, bør virksomhederne opfordres til at installere udstyr i lagerbygningerne, som (automatisk) foretager prøveudtagning i hele det oplagrede parti.

Ved anvendelse af de fremgangsmåder for prøveudtagning, som er omhandlet i dette afsnit 8, underrettes lederen af foderstofvirksomheden eller dennes repræsentant om den pågældende fremgangsmåde for prøveudtagning. Hvis lederen af foderstofvirksomheden eller dennes repræsentant anfægter denne fremgangsmåde for prøveudtagning, skal lederen af foderstofvirksomheden eller dennes repræsentant give den kompetente myndighed mulighed for at udtage prøver af hele det pågældende parti for vedkommendes regning.

8.2.    Store partier, som transporteres med skib

8.2.1.    Dynamisk prøveudtagning af store partier, som transporteres med skib

Prøveudtagning af store partier i skibe foretages bedst, mens produktet er i flow (dynamisk prøveudtagning).

Prøveudtagningen skal foretages pr. lastrum (enhed, der fysisk kan adskilles). Lastrummene tømmes imidlertid ikke hver for sig, så den oprindelige fysiske adskillelse eksisterer ikke længere efter overførslen til lagerfaciliteter. Prøveudtagning kan derfor foretages enten på baggrund af den oprindelige fysiske adskillelse eller på baggrund af opdelingen efter overførslen til lagerfaciliteterne.

Losningen af et skib kan vare flere dage. Normalt gennemføres prøveudtagningen med regelmæssige mellemrum under hele losningens varighed. Det er dog ikke altid muligt eller hensigtsmæssigt, at en officiel inspektør er til stede med henblik på prøveudtagning i løbet af hele lossearbejdet. Det er derfor tilladt at gennemføre prøveudtagning på en del af hele partiet. Antallet af enkeltprøver bestemmes under hensyntagen til størrelsen af den portion, der prøvetages af.

Hvis der er udtaget prøver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse, og det konstateres, at denne del af partiet ikke opfylder EU's krav, antages det, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU’s krav.

Selv om den officielle prøve udtages automatisk, skal der være en inspektør til stede. Såfremt den automatiske prøveudtagning gennemføres med forudindstillede parametre, som ikke kan ændres under prøveudtagningen, og enkeltprøverne indsamles i en plomberet beholder, som forhindrer eventuelt svig, er inspektørens tilstedeværelse kun nødvendig ved påbegyndelsen af prøveudtagningen, hver gang prøvebeholderen skal udskiftes og ved afslutningen af prøveudtagningen.

8.2.2.    Prøveudtagning af partier, som transporteres med skib ved statisk prøveudtagning

Hvis prøveudtagningen udføres på en statisk måde, anvendes den samme fremgangsmåde som den, der gælder for lagerfaciliteter (siloer), som er tilgængelige ovenfra (jf. punkt 8.4.1).

Prøveudtagningen gennemføres på den tilgængelige del (ovenfra) af partiet/lastrummet. Antallet af enkeltprøver bestemmes under hensyntagen til størrelsen af den portion, der prøvetages af. Hvis der er udtaget prøver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse, og det konstateres, at denne del af partiet ikke opfylder EU's krav, antages det, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU’s krav.

8.3.    Prøveudtagning af store partier, der er oplagret i lagerbygninger

Prøveudtagningen gennemføres på den tilgængelige del af partiet. Antallet af enkeltprøver bestemmes under hensyntagen til størrelsen af den portion der prøvetages af. Hvis der er udtaget prøver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse, og det konstateres, at denne del af partiet ikke opfylder EU's krav, antages det, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU’s krav.

8.4.    Udtagning af prøver fra lagerfaciliteter (siloer)

8.4.1.    Udtagning af prøver fra siloer, som er (let) tilgængelige ovenfra

Prøveudtagningen gennemføres på den tilgængelige del af partiet. Antallet af enkeltprøver bestemmes under hensyntagen til størrelsen af den portion, der prøvetages af. Hvis der er udtaget prøver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse, og det konstateres, at denne del af partiet ikke opfylder EU's krav, antages det, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU’s krav.

8.4.2.    Udtagning af prøver fra siloer, som ikke er tilgængelige ovenfra (lukkede siloer)

8.4.2.1.    Siloer, som ikke er tilgængelige ovenfra (lukkede siloer) med en størrelse på > 100 tons

Der kan ikke udtages prøver af foder, der er oplagret i sådanne siloer, på en statisk måde. Hvis der skal udtages prøver af foder i en sådan silo, og det ikke er muligt at flytte partiet, skal der derfor træffes aftale med virksomhedslederen om, at vedkommende meddeler inspektøren, hvornår den pågældende silo vil blive tømt, så der kan udtages prøver, mens foderet er i flow.

8.4.2.2.    Siloer, som ikke er tilgængelige ovenfra (lukkede siloer) med størrelse på < 100 tons

Fremgangsmåden for prøveudtagning indebærer overførsel til en beholder af en størrelse på 50-100 kg, hvorfra prøven udtages. Størrelsen af samleprøven skal svare til hele partiet, og antallet af enkeltprøver skal beregnes på baggrund af mængden i den silo, hvorfra der overføres foder til en beholder med henblik på prøveudtagning. Hvis der er udtaget prøver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse, og det konstateres, at denne del af partiet ikke opfylder EU's krav, antages det, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU’s krav.

8.5.    Udtagning af prøver af uemballeret foder i store lukkede beholdere

Der kan som regel kun udtages prøver af sådanne partier, når beholderne aflæsses. Det er i visse tilfælde ikke muligt at aflæsse beholderne ved indførsel eller kontrol, og prøveudtagningen bør derfor gennemføres, når beholderne aflæsses.

9.   FREMGANGSMÅDE VED UDTAGNING, KLARGØRING OG EMBALLERING AF PRØVERNE

9.1.    Generelt

Prøverne udtages og klargøres så hurtigt som muligt under hensyntagen til de forholdsregler, som er nødvendige for at undgå, at produktet forandres eller forurenes. Instrumenter og også overflader og beholdere, som er beregnet til at rumme prøverne, skal være rene og tørre.

9.2.    Enkeltprøver

Enkeltprøver skal udtages tilfældigt fra hele den portion, der prøvetages af. Deres størrelse skal være tilnærmelsesvis ens.

Enkeltprøvens størrelse skal være på mindst 100 g eller 25 g i tilfælde af grovfoder eller foderplanter med lav massefylde.

I tilfælde af at der i henhold til den fremgangsmåde for prøveudtagning, der er fastsat i afsnit 8, skal udtages færre end 40 enkeltprøver, fastlægges størrelsen af enkeltprøverne på baggrund af den størrelse, der kræves for samleprøver (jf. afsnit 6).

I tilfælde af prøveudtagning af prøver af mindre partier af emballeret foder, hvor der i henhold til de kvantitative krav skal udtages et begrænset antal enkeltprøver, skal en enkeltprøve udgøres af indholdet af én original enhed, hvis indhold ikke overstiger 1 kg eller 1 liter.

I tilfælde af prøveudtagning af emballeret foder, der består af små enheder (f.eks. < 250 g), afhænger antallet af enkeltprøver af enhedernes størrelse.

9.2.1.    Uemballeret foder

Hvor det er passende, kan prøveudtagningen foretages, mens partiet er i bevægelse (pålæsning eller aflæsning).

9.2.2.    Emballeret foder

Efter at det i afsnit 5 fastsatte antal enheder til prøveudtagning er udvalgt, udtages en del af indholdet af hver enhed ved hjælp af spyd eller skovl. Om nødvendigt skal prøverne udtages, efter at enhederne er tømt hver for sig.

9.2.3.    Flydende eller halvflydende foder, som er homogent eller kan gøres homogent

Efter at det i afsnit 5 fastsatte antal enheder til prøveudtagning er udvalgt, homogeniseres indholdet om nødvendigt, og der udtages en mængde fra hver enhed.

Enkeltprøverne kan eventuelt udtages under aftapning af partiet.

9.2.4.    Flydende eller halvflydende foder, som ikke kan gøres homogent

Efter at det i afsnit 5 fastsatte antal enheder til prøveudtagning er udvalgt, udtages prøver fra forskellige niveauer.

Enkeltprøver kan ligeledes udtages, når partiet aftappes, men de første fraktioner kasseres.

Under alle omstændigheder må den samlede udtagne mængde ikke være mindre end 10 liter.

9.2.5.    Foderblokke og mineralske sliksten

Efter at det i afsnit 5 fastsatte antal blokke eller sliksten til prøveudtagning er udvalgt, kan der udtages en del af hver blok eller sliksten. I tilfælde af mistanke om en uhomogen blok eller sliksten, kan hele blokken eller slikstenen udtages som prøve.

For blokke eller sliksten, der ikke vejer over 1 kg stykket, udgøres en enkeltprøve af indholdet af én blok eller én sliksten.

9.3.    Klargøring af samleprøver

Enkeltprøverne sammenblandes, så de udgør en enkelt samleprøve.

9.4.    Klargøring af slutprøver

Samleprøven blandes omhyggeligt ( 23 ).

9.5.    Emballering af prøver

Beholdere eller pakninger plomberes og forsynes med etiketter på en sådan måde, at de ikke kan åbnes, uden at plomben beskadiges. Hele etiketten skal anbringes inden for plomben.

9.6.    Forsendelse af prøver til laboratoriet

Prøven sendes så hurtigt som muligt til det udpegede analyselaboratorium sammen med de for analysen nødvendige oplysninger.

10.   REGISTRERING AF PRØVEUDTAGNING

Hver prøve skal registreres, således at portionen, der prøvetages af, og dens størrelse utvetydigt kan identificeres.

Desuden skal enhver afvigelse fra den fremgangsmåde for prøveudtagning, der er fastsat i denne forordning, registreres.

De registrerede oplysninger stilles til rådighed for det officielle kontrollaboratorium samt for lederen af foderstofvirksomheden og/eller det laboratorium, som er udpeget af foderstofvirksomheden.

BILAG II

ALMINDELIGE BESTEMMELSER VEDRØRENDE ANALYSEMETODER FOR FODER

A.   KLARGØRING AF PRØVER TIL ANALYSE

1.    Formål

De nedenfor beskrevne fremgangsmåder omhandler klargøring til analyse af prøver, der efter udtagning sendes til kontrollaboratorierne i overensstemmelse med bilag I.

Laboratorieprøverne klargøres således, at de i henhold til analysemetoderne afvejede mængder er homogene og repræsentative for slutprøverne.

2.    Forholdsregler

Fremgangsmåden for klargøring af prøven afhænger af, hvilke analysemetoder der skal anvendes, og hvilke bestanddele eller stoffer der skal kontrolleres. Det er derfor yderst vigtigt at sikre, at den fremgangsmåde for klargøring af prøven, der følges, passer til den anvendte analysemetode og til de bestanddele eller stoffer, der skal kontrolleres.

Alle nødvendige arbejdsgange udføres, så det så vidt muligt undgås at forurene prøven og ændre dens sammensætning.

Formaling, blanding og sigtning gennemføres så hurtigt som muligt, og således at prøven udsættes mindst muligt for luft og lys. Der anvendes ikke kværne og andre formalingsapparater med væsentlig tilbøjelighed til at frembringe varme i prøven.

Særligt varmefølsomt foder bør formales manuelt. Det sikres tillige, at apparaturet i sig selv ikke forurener.

Kan klargøringen ikke foretages uden væsentlige ændringer af prøvens vandindhold, bestemmes vandindholdet før og efter klargøringen efter den metode, der er fastsat i del A i bilag III.

3.    Fremgangsmåde

3.1.    Generel fremgangsmåde

Testdelprøven udtages af slutprøven. Neddeling efter keglemetoden og firdeling (kvartning) kan ikke anbefales, da disse metoder giver risiko for uhomogene delprøver.

3.1.1.    Foder, der kan formales direkte

3.1.2.    Foder, der kan formales efter tørring

3.1.3.    Flydende eller halvflydende foder

3.1.4.    Andet foder

3.2.    Særlig fremgangsmåde i tilfælde af undersøgelse ved visuel eller ved mikroskopisk kontrol eller i tilfælde, hvor samleprøven er homogeniseret

4.    Opbevaring af prøverne

Prøverne opbevares ved en temperatur, der ikke ændrer deres sammensætning. Prøver, der er bestemt til analyse af vitaminer eller særligt lysfølsomme stoffer, opbevares under sådanne betingelser, at prøven ikke påvirkes negativt af lys.

B.   KRAV TIL REAGENSER OG APPARATUR, DER ANVENDES I FORBINDELSE MED ANALYSEMETODERNE

C.   ANVENDELSE AF ANALYSEMETODERNE OG ANGIVELSE AF RESULTATER

1.    Ekstraktionsprocedure

Der er flere metoder, der omfatter en specifik ekstraktionsprocedure. Som hovedregel kan der anvendes andre ekstraktionsprocedurer end den i metoden angivne, under forudsætning af at den anvendte ekstraktionsprocedure bevisligt frembyder en ekstraktionseffektivitet for den analyserede matrix, der svarer til effektiviteten af den i metoden omtalte fremgangsmåde.

2.    Oprensningsprocedure

Der er flere metoder, der omfatter en specifik oprensningsprocedure. Som hovedregel kan der anvendes andre oprensningsprocedurer end den i metoden angivne, under forudsætning af at den anvendte oprensningsprocedure bevisligt giver analyseresultater for den analyserede matrix, der svarer til de resultater, som opnås med den i metoden omtalte fremgangsmåde.

3.    Antal bestemmelser

I forbindelse med analyse af uønskede stoffer gælder det, at hvis resultatet af den første bestemmelse er væsentligt (> 50 %) lavere end den specifikation, der skal kontrolleres, er yderligere bestemmelser ikke påkrævet, såfremt der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer. I andre tilfælde er det nødvendigt at foretage en ekstra analyse (anden bestemmelse) for at udelukke muligheden for intern krydsforurening eller utilsigtet sammenblanding af prøver. Gennemsnittet af de to bestemmelser, hvor der tages hensyn til måleusikkerheden, anvendes til at verificere, om kravene er opfyldt.

Ved kontrol af det angivne indhold af et stof eller en ingrediens gælder det, at hvis resultatet af den første bestemmelse bekræfter det angivne indhold, dvs. hvis analyseresultatet ligger inden for det acceptable variationsområde for det angivne indhold, er yderligere bestemmelser ikke påkrævet, såfremt der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer. I andre tilfælde er det nødvendigt at foretage en ekstra analyse (anden bestemmelse) for at udelukke muligheden for intern krydsforurening eller utilsigtet sammenblanding af prøver. Gennemsnittet af de to bestemmelser, hvor der tages hensyn til måleusikkerheden, anvendes til at verificere, om kravene er opfyldt.

I visse tilfælde er det acceptable variationsområde fastsat i lovgivningen, som f.eks. i Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 767/2009 af 13. juli 2009 om markedsføring og anvendelse af foder, om ændring af Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1831/2003, og om ophævelse af Rådets direktiv 79/373/EØF, Kommissionens direktiv 80/511/EØF, Rådets direktiv 82/471/EØF, 83/228/EØF, 93/74/EØF, 93/113/EF og 96/25/EF og Kommissionens beslutning 2004/217/EF ( 26 ).

4.    Afrapportering af anvendt analysemetode

Analyserapporten skal angive den anvendte analysemetode.

5.    Afrapportering af analyseresultater

Analyseresultatet angives som anført i analysemetoden med et tilstrækkeligt antal betydende cifre og korrigeres om nødvendigt til samme vandindhold, som slutprøven havde før prøveklargøringen.

6.    Måleusikkerhed og genfindingsprocent i forbindelse med analyse af uønskede stoffer

For så vidt angår uønskede stoffer som omhandlet i direktiv 2002/32/EF bør et produkt til foderbrug anses for ikke at overholde det fastsatte maksimumsindhold, hvis analyseresultatet beregnet ved et vandindhold på 12 % vurderes at overstige maksimumsindholdet under hensyntagen til den ekspanderede måleusikkerhed og korrektion for genfinding. Det vurderes, om maksimumsindholdet er overholdt, ved at vurdere analyseresultatet korrigeret for genfinding og fratrukket ekspanderet måleusikkerhed. Dette gælder kun i tilfælde, hvor analysemetoden tillader vurdering af måleusikkerheden og korrektion for genfinding (hvilket f.eks. ikke er tilfældet ved mikroskopering).

Analyseresultatet skal afrapporteres som følger (hvis den anvendte analysemetode tillader vurdering af måleusikkerhed og genfindingsprocent):

Analyseresultatet kan dog, hvis resultatet af analysen er væsentligt (> 50 %) lavere end den specifikation, der skal kontrolleres, hvis der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer, og hvis analysen udelukkende har til formål at kontrollere, at gældende lovgivning er overholdt, indberettes uden korrektion for genfinding, ligesom det i sådanne tilfælde kan undlades at indberette genfindingsprocent og måleusikkerhed.

▼B

BILAG III

ANALYSEMETODER TIL KONTROL AF SAMMENSÆTNINGEN AF FODERMIDLER OG FODERBLANDINGER

A.   BESTEMMELSE AF VANDINDHOLD

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme vandindholdet i foder. For så vidt angår foder indeholdende flygtige stoffer, såsom organiske syrer, skal det bemærkes, at der sammen med vandindholdet også bestemmes betydelige mængder flygtige stoffer.

Metoden er ikke beregnet på analyse af mejeriprodukter, der anvendes som fodermidler, analyse af mineralske stoffer og blandinger, der overvejende består af mineralske stoffer, analyse af animalsk og vegetabilsk fedt eller analyse af olieholdige frø og frugter.

2.   Princip

Prøven tørres under nærmere angivne betingelser, som er afhængige af foderets art. Vægttabet bestemmes ved vejning. For fast foder med højt vandindhold er yderligere fortørring nødvendig.

3.   Apparatur

4.   Fremgangsmåde

4.1.   Klargøring

4.1.1.    Foder, bortset fra det under punkt 4.1.2 og 4.1.3 nævnte

Der udtages mindst 50 g af prøven, som — om nødvendigt — formales eller neddeles på fornøden vis for at undgå varierende fugtighedsgrader (se punkt 6).

4.1.2.    Korn og gryn

Der udtages mindst 50 g af prøven. Den formales, så kornstørrelsen ved sigtning med masker på 0,5 mm tillader passage af mindst 50 %, og at der ved sigtning med runde masker på 1 mm bliver højst 10 % tilbage.

4.1.3.    Flydende eller grødagtigt foder; foder overvejende bestående af fedt

Der udtages ca. 25 g af prøven, afvejet med 10 mg nøjagtighed, som blandes med en tilsvarende mængde vandfrit sand, afvejet med 10 mg nøjagtighed, indtil der fremkommer en homogen vare.

4.2.   Tørring

4.2.1.    Foder, bortset fra det under punkt 4.2.2 og 4.2.3 nævnte

Et vejekar med låg (3.3) vejes med 1 mg nøjagtighed. Ca. 5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i det tarerede kar og fordeles jævnt. Karret stilles efter aftagning af låget ind i et til 103 oC opvarmet tørreskab. For at temperaturen i tørreskabet ikke skal falde for stærkt, skal karret stilles hurtigt ind i skabet. Der tørres i 4 timer, idet tørringstiden regnes fra det tidspunkt, hvor temperaturen i tørreskabet atter er kommet op på 103 oC. Efter åbning af tørreskabet lukkes karret med låget, tages ud af skabet, henstilles til afkøling i 30-45 minutter i ekssikkatoren (3.6) og vejes derefter med 1 mg nøjagtighed.

For prøver af foder overvejende bestående af fedt foretages yderligere en tørring på 30 minutter i tørreskabet ved 130 oC. Forskellen mellem de to vejeresultater må ikke overstige 0,1 % vandindhold.

4.2.2.    Korn, mel, gryn og grutning

Et vejekar med låg (3.3) vejes med 0,5 mg nøjagtighed. Ca. 5 g af den formalede prøve afvejes med 1 mg nøjagtighed i det tarerede kar og fordeles jævnt. Karret stilles efter aftagning af låget ind i et til 130 oC opvarmet tørreskab. For at temperaturen i tørreskabet ikke skal falde for stærkt, skal karret stilles hurtigt ind i skabet. Der tørres i 2 timer, idet tørringstiden regnes fra det tidspunkt, hvor temperaturen i tørreskabet atter er kommet op på 130 oC. Efter åbning af tørreskabet lukkes karret med låget, tages ud af skabet, henstilles til afkøling i 30–45 minutter i ekssikkatoren (3.6) og vejes derefter med 1 mg nøjagtighed.

4.3.   Fortørring

4.3.1.    Foder, bortset fra det under punkt 4.3.2 nævnte

Fast foder med højt vandindhold, og hvis formaling er vanskelig, skal fortørres som følger:

50 g af den ikke-formalede prøve (om nødvendigt foretages en grov neddeling af presset eller klumpet foder) afvejes med 10 mg nøjagtighed i en egnet beholder (f. eks. en aluminiumskål på 20 × 12 cm med en kant på 0,5 cm). Der tørres i tørreskab ved 60-70 oC, indtil vandindholdet er reduceret til mellem 8 og 12 %. Beholderen tages ud af tørreskabet og henstilles utildækket til afkøling i laboratoriet i 1 time, hvorefter der vejes med 10 mg nøjagtighed. Alt efter foderets art foretages, som beskrevet i punkt 4.1.1, derefter straks en formaling, og der tørres som beskrevet i punkt 4.2.1 eller 4.2.3.

4.3.2.    Korn

Korn med et vandindhold på over 17 % skal fortørres som følger:

50 g af de ikke-formalede korn afvejes med 10 mg nøjagtighed i en egnet beholder (f. eks. en aluminiumskål på 20 × 12 cm med en kant på 0,5 cm) og tørres i tørreskab i 5-7 minutter ved 130 oC, hvorefter prøven tages ud af tørreskabet. Prøven henstilles utildækket til afkøling i laboratoriet i 2 timer, hvorefter der vejes med 10 mg nøjagtighed. Straks efter formales som beskrevet i punkt 4.1.2 og tørres som beskrevet i punkt 4.2.2.

5.   Beregning af resultater

Prøvens vandindhold (X) i procent beregnes efter følgende formler:

5.1.   Tørring uden fortørring

hvor:

5.2.   Tørring med fortørring

hvor:

5.3.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 0,2 % vandindhold i absolut værdi.

6.   Bemærkning

Hvis det viser sig at være nødvendigt med formaling og der i den forbindelse må påregnes en ændring af materialets vandindhold, skal analyseresultaterne for foderets bestanddele korrigeres i overensstemmelse med originalprøvens vandindhold.

B.   BESTEMMELSE AF VANDINDHOLDET I ANIMALSK OG VEGETABILSK FEDT

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme animalske og vegetabilske fedtstoffers og oliers vandindhold (vand og flygtige stoffer).

2.   Princip

Prøven tørres ved 103 °C, indtil vægten ikke mere formindskes (vægttabet mellem to på hinanden følgende vejninger må højst være på 1 mg). Vægttabet bestemmes ved vejning.

3.   Apparatur

4.   Fremgangsmåde

Ca. 20 g af den homogeniserede prøve afvejes med 1 mg nøjagtighed i den tørre, tarerede beholder (3.1), hvori termometret (3.2) er anbragt. Prøven opvarmes på sandbadet eller varmepladen (3.3) under stadig omrøring med termometret, så den når en temperatur på 90 °C i løbet af ca. 7 minutter.

Varmen dæmpes efter den hyppighed, med hvilken boblerne stiger op fra beholderens bund. Temperaturen må ikke overstige 105 °C. Bliv ved med at røre og skrabe bunden, indtil der ikke dannes flere bobler.

For at sikre, at fugtigheden helt er fjernet, gentages opvarmningen til 103 °C ± 2 ° flere gange, med afkøling til 93 °C mellem de på hinanden følgende opvarmninger. Derefter henstilles til afkøling til rumtemperatur i ekssikkatoren (3.4) og vejes. Denne proces gentages, indtil vægttabet mellem to afvejninger ikke overstiger 2 mg.

5.   Beregning af resultater

Prøvens vandindhold (X) i procent beregnes efter følgende formel:

hvor:

Resultater på under 0,05 % opføres som »mindre end 0,05 %«.

Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 0,05 % vandindhold i absolut værdi.

C.   BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF RÅPROTEIN

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af råprotein i foder på basis af nitrogenindholdet (Kjeldahls metode).

2.   Princip

Prøven destrueres med svovlsyre under tilstedeværelse af en katalysator. Syreopløsningen gøres alkalisk med en natriumhydroxidopløsning. Ammoniakken destilleres og opsamles i en nøjagtigt afmålt mængde svovlsyre, idet den overskydende mængde svovlsyre titreres med en standardnatriumhydroxidopløsning.

Alternativt destilleres den frigjorte ammoniak i et overskud af borsyreopløsning, hvorefter der titreres med en saltsyre- eller svovlsyreopløsning.

3.   Reagenser

4.   Apparatur

Apparat egnet til destruktion, destillation og titrering efter Kjeldahls metode.

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Destruktion

1 g af prøven afvejes med 0,001 g nøjagtighed og overføres til destruktionskolben. Der tilsættes 15 g kaliumsulfat (3.1), en passende mængde katalysator (3.2) (0,3 –0,4 g kobber(II)oxid eller 0,9 –1,2 g kobber(II)sulfatpentahydrat), 25 ml svovlsyre (3.4) og eventuelt nogle få korn pimpsten (3.12) og blandes.

Kolben opvarmes, forsigtigt i begyndelsen, og omrystes om nødvendigt af og til forsigtigt, indtil prøven er forkullet og skummet forsvundet. Derefter opvarmes kraftigere, indtil væsken koger jævnt. Opvarmningen er tilstrækkelig, hvis den kogende syre fortætter sig på kolbens væg. Det må forhindres, at siderne bliver overophedet, og at organiske partikler klæber til dem.

Når opløsningen bliver klar og lysegrøn, fortsættes kogningen i yderligere to timer. Derefter henstilles kolben til afkøling.

5.2.   Destillation

Der tilsættes forsigtigt tilstrækkeligt vand til, at sulfaterne opløses fuldstændigt. Kolben henstår til afkøling, hvorefter der om nødvendigt tilsættes nogle få zinkkorn (3.3). Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.2.1 eller 5.2.2.

5.2.1.    Destillation i svovlsyre

I destillationsapparatets opsamlingskolbe anbringes en nøjagtigt afmålt mængde på 25 ml svovlsyre (3.5 eller 3.7) afhængigt af det formodede nitrogenindhold. Der tilsættes nogle få dråber indikator af methylrødt (3.8).

Destruktionskolben forbindes med destillationsapparatets svaler, og svalerens nederste del nedsænkes i væsken i opsamlingskolben til en dybde af mindst 1 cm (se bemærkning 8.3). 100 ml natriumhydroxidopløsning (3.9) overføres forsigtigt til destruktionskolben, uden at der mistes ammoniak (se bemærkning 8.1). Kolben opvarmes, indtil ammoniakken er destilleret over.

5.2.2.    Destillation i borsyre

Foretages titreringen af destillatets ammoniakindhold manuelt, følges den nedenfor beskrevne fremgangsmåde. Er destillationsenheden fuldt automatiseret, så også titreringen af destillatets ammoniakindhold sker automatisk, følges brugsanvisningen til destillationsenheden.

En opsamlingskolbe med 25-30 ml af borsyreopløsningen (3.18) anbringes under svalerens afløbsåbning, således at tilførselsrøret befinder sig under overfladen i den overskydende borsyreopløsning. Destillationsenheden indstilles til at give 50 ml natriumhydroxidopløsning (3.9). Destillationsenheden betjenes i overensstemmelse med brugsanvisningen, og den ammoniak, der er frigivet ved tilførslen af natriumhydroxidopløsningen, afdampes. Destillatet opsamles i forlaget med borsyre. Destillatmængden (dampdestillationstiden) afhænger af mængden af nitrogen i prøven. Brugsanvisningen følges.

5.3.   Titrering

Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.1 eller 5.3.2.

5.3.1.    Svovlsyre

Den overskydende svovlsyre i opsamlingskolben titreres med natriumhydroxidopløsning (3.10 eller 3.11) afhængigt af koncentrationen af den anvendte svovlsyre, indtil ækvivalenspunktet er nået.

5.3.2.    Borsyre

Med en burette titreres opsamlingskolbens indhold med standardsaltsyreopløsningen (3.19) eller med standardsvovlsyreopløsningen (3.6), og den anvendte titrantmængde aflæses.

Anvendes kolorimetrisk endpointbestemmelse, er ækvivalenspunktet nået ved det første tegn på pinkfarvning af indholdet. Buretteaflæsningen anslås med 0,05 ml nøjagtighed. En oplyst magnetisk omrørerplade eller en fotometrisk detektor vil kunne lette visualiseringen af ækvivalenspunktet.

Processen kan gøres automatisk ved anvendelse af en dampdestillationsenhed med automatisk titrering.

Brugsanvisningen til den enkelte destillationsenhed eller destillationsenhed/titrator følges.

5.4.   Blindprøve

For at sikre, at reagenserne er nitrogenfrie, foretages der en blindprøve (destruktion, destillation og titrering) ved brug af 1 g saccharose (3.14) i stedet for prøven.

6.   Beregning af resultater

Beregningerne foretages som beskrevet i punkt 6.1 eller 6.2.

6.1.   Titreringsberegning, jf. 5.3.1

Indholdet af råprotein, udtrykt i vægtprocent, beregnes efter følgende formel:

hvor:

6.2.   Titreringsberegning, jf. 5.3.2

6.2.1.    Titrering med saltsyre

Indholdet af råprotein, udtrykt i vægtprocent, beregnes efter følgende formel:

hvor:

6.2.2.    Titrering med svovlsyre

Indholdet af råprotein, udtrykt i vægtprocent, beregnes efter følgende formel:

hvor:

7.   Kontrol af metoden

7.1.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige:

7.2.   Nøjagtighed

Analysen (destruktion, destillation og titrering) foretages på 1,5 –2,0 g acetanilid (3.13) under tilstedeværelse af 1 g saccharose (3.14). 1 g acetanilid kræver 14,80 ml svovlsyre (3.5). Genfindingsprocenten skal være mindst 99 %.

8.   Bemærkninger

D.   BESTEMMELSE AF URINSTOF

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af urinstof i foder.

2.   Princip

Prøven opslæmmes i vand under tilsætning af et klaringsmiddel. Suspensionen filtreres. Filtratets indhold af urinstof bestemmes, efter tilsætning af 4-dimethylaminobenzaldehyd (4-DMAB), ved måling af ekstinktionen ved en bølgelængde på 420 nm.

3.   Reagenser

4.   Apparatur

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Analyse af prøven

2 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og kommes sammen med 1 g aktivt kul (3.4) i en 500 ml målekolbe. Der tilsættes 400 ml vand og 5 ml Carrez-reagens I (3.2) og blandes i ca. 30 sekunder, hvorefter der tilsættes 5 ml Carrez-reagens II (3.3). Væsken blandes i 30 minutter i rysteapparatet. Der fyldes op med vand til mærket, omrystes og filtreres.

5 ml af de klare og farveløse filtrater udtages med pipette og hældes i reagensglassene med slibprop, hvorefter der tilsættes 5 ml 4-DMAB-opløsning (3.1) og blandes. Glassene anbringes i vandbad ved 20 oC (+/- 4 oC). Efter 15 minutter måles ekstinktionen i prøveopløsningen i spektrofotometret ved 420 nm ved sammenligning med reagensernes blindprøveopløsning.

5.2.   Kalibreringskurve

Der udtages volumener på 1, 2, 4, 5 og 10 ml af urinstofopløsningen (3.5), disse hældes i 100 ml målekolber, og der fyldes op med vand til mærket. Der udtages 5 ml af hver opløsning, hver af dem tilsættes 5 ml 4-DMAB-opløsning (3.1), der homogeniseres, og ekstinktionen måles, som angivet ovenfor, ved sammenligning med en kontrolopløsning, som indeholder 5 ml 4-DMAB og 5 ml vand uden urinstof. Kalibreringskurven tegnes.

6.   Beregning af resultater

Bestem mængden af urinstof i prøven ved benyttelse af kalibreringskurven.

Resultatet angives i procent af prøven.

7.   Bemærkninger

E.   BESTEMMELSE AF FLYGTIGE KVÆLSTOFHOLDIGE BASER

I.   BESTEMMELSE VED MIKRODIFFUSION

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af flygtige kvælstofholdige baser, udtrykt som ammoniak, i foder.

2.   Princip

Prøven ekstraheres med vand, og opløsningen klares og filtreres. De flygtige kvælstofholdige baser udskilles efter tilsætning af kaliumcarbonatopløsning ved mikrodiffusion, opfanges i en borsyreopløsning og titreres med svovlsyre.

3.   Reagenser

4.   Apparatur

5.   Fremgangsmåde

10 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed, kommes sammen med 100 ml vand i en 200 ml målekolbe og blandes eller omrystes i 30 minutter i rysteapparatet. Der tilsættes 50 ml trichloreddikesyreopløsning (3.1), fyldes op med vand til mærket, omrystes kraftigt og filtreres gennem et foldefilter.

1 ml borsyreopløsning (3.3) afpipetteres i Conwayskålens midte, hvorefter 1 ml af prøvefiltratet overføres til skålens ring. Skålen tildækkes delvist med det let indfedtede låg. 1 ml af den mættede kaliumcarbonatopløsning (3.4) kommes hurtigt ned i ringen, og skålen lukkes, så den er lufttæt. Skålen drejes forsigtigt i vandret stilling, så de to reagenser blandes. Der inkuberes i mindst 4 timer ved rumtemperatur eller i 1 time ved 40 oC.

De i borsyreopløsningen indeholdte flygtige baser titreres derefter med svovlsyre (3.5) ved anvendelse af en mikroburette (4.3).

På samme måde udføres en blindprøve under udeladelse af analyseprøven.

6.   Beregning af resultater

1 ml 0,01 mol/liter svovlsyre svarer til 0,34 mg ammoniak.

Resultatet angives i procent af prøven.

Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige:

7.   Bemærkning

Har prøven et indhold på mere end 0,6 % ammoniak, fortyndes det oprindelige filtrat.

II.   BESTEMMELSE VED DESTILLATION

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af flygtige kvælstofholdige baser, udtrykt som ammoniak, i fiskemel, som praktisk talt ikke indeholder urinstof. Metoden anvendes kun ved indhold på mindre end 0,25 % ammoniak.

2.   Princip

Prøven ekstraheres med vand, og opløsningen klares og filtreres. De flygtige kvælstofholdige baser udskilles efter tilsætning af magnesiumoxid ved kogetemperatur og opfanges i en bestemt mængde svovlsyre, idet den overskydende mængde svovlsyre tilbagetitreres med en natriumhydroxidopløsning.

3.   Reagenser

4.   Apparatur

5.   Fremgangsmåde

10 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og kommes sammen med 100 ml vand i en 200 ml målekolbe og blandes eller omrystes i 30 minutter i rysteapparatet. Der tilsættes 50 ml trichloreddikesyreopløsning (3.1), fyldes op med vand til mærket, omrystes kraftigt og filtreres gennem et foldefilter.

Afhængigt af det formodede indhold af flygtige kvælstofholdige baser udtages en mængde af det klare filtrat (normalt 100 ml). Det fortyndes til 200 ml, og der tilsættes 2 g magnesiumoxid (3.2) samt nogle få dråber skumdæmpende emulsion (3.3). Opløsningen skal reagere alkalisk over for lakmuspapir; i modsat fald tilsættes yderligere magnesiumoxid (3.2). Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.2 og 5.3 for analysemetoden til bestemmelse af indholdet af råprotein (del C i dette bilag).

På samme måde udføres en blindprøve under udeladelse af analyseprøven.

6.   Beregning af resultater

1 ml 0,05 mol/liter svovlsyre svarer til 1,7 mg ammoniak.

Resultatet angives i procent af prøven.

Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 10 % ammoniak i relativ værdi.

F.   BESTEMMELSE AF AMINOSYRER (BORTSET FRA TRYPTOPHAN)

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af frie (syntetiske og naturlige) og totale (peptidbundne og frie) aminosyrer i foder ved brug af en aminosyreanalysator. Metoden kan anvendes til følgende aminosyrer: cyst(e)in, methionin, lysin, threonin, alanin, arginin, asparaginsyre, glutaminsyre, glycin, histidin, isoleucin, leucin, phenylalanin, prolin, serin, tyrosin og valin.

Metoden skelner ikke mellem salte af aminosyrer og kan ikke differentiere mellem D- og L-former af aminosyrer. Den er ikke anvendelig til bestemmelse af tryptophan- eller hydroxyanaloger af aminosyrer.

2.   Princip

2.1.   Frie aminosyrer

Frie aminosyrer ekstraheres med fortyndet saltsyre. Kvælstofholdige makromolekyler, der ekstraheres samtidig, udfældes med sulfosalicylsyre og fjernes ved filtrering. Den filtrerede opløsnings pH-værdi justeres til 2,20 . Aminosyrerne adskilles ved ionbytningskromatografi og bestemmes ved reaktion med ninhydrin ved fotometrisk påvisning ved 570 nm.

2.2.   Totale aminosyrer

Den valgte metode afhænger af de aminosyrer, der skal undersøges. Cyst(e)in og methionin skal oxideres til henholdsvis cysteinsyre og methioninsulfon inden hydrolyse. Tyrosin skal bestemmes i hydrolysater af uoxiderede prøver. Alle de øvrige aminosyrer, der er nævnt i punkt 1, kan bestemmes i enten den oxiderede eller den uoxiderede prøve.

Oxidering sker ved 0 oC med en phenolholdig permyresyre. Overskydende oxideringsreagens destrueres med natriumdisulfit. Den oxiderede eller uoxiderede prøve hydrolyseres med saltsyre (3.20) i 23 timer. Hydrolysatets pH-værdi justeres til 2,20 . Aminosyrerne adskilles ved ionbytningskromatografi og bestemmes ved reaktion med ninhydrin ved fotometrisk påvisning ved 570 nm (440 nm for prolin).

3.   Reagenser

Der skal anvendes dobbeltdestilleret vand eller vand af tilsvarende kvalitet (ledningsevne: < 10 μS).

4.   Apparatur

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Klargøring af prøven

Prøven formales, så den kan passere gennem en 0,5 mm sigte. Meget fugtige prøver skal inden formalingen enten lufttørres ved højst 50 oC eller frysetørres. Prøver med et højt fedtindhold ekstraheres med petroleumsether (3.12) inden formaling.

5.2.   Bestemmelse af frie aminosyrer i foder og forblandinger

En passende mængde (1–5 g) af den klargjorte prøve (5.1) afvejes med en nøjagtighed på 0,2 mg i en konisk kolbe, og der tilsættes 100,0 ml ekstraktionsopløsning (3.21). Blandingen rystes i 60 minutter på mekanisk rysteapparat eller magnetomrører (4.8). Efter henstand og bundfældning afpipetteres 10,0 ml af supernatanten i et 100 ml bægerglas.

Der tilsættes 5,0 ml sulfosalicylsyreopløsning (3.22) under omrøring, og der omrøres fortsat med magnetomrører i 5 minutter. Supernatanten filtreres eller centrifugeres for at fjerne eventuelt bundfald. 10,0 ml af den klarede opløsning kommes i et 100 ml bægerglas, og pH justeres til 2,20 med natriumhydroxidopløsning (3.18). Opløsningen overføres med citratbuffer (3.24) til en målekolbe af passende størrelse, og der fyldes op til mærket med citratbufferopløsningen (3.24).

Hvis der bruges en intern standard, tilsættes 1,00 ml intern standard (3.27.3) for hver 100 ml slutopløsning, og der fyldes op til mærket med bufferopløsningen (3.24).

Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4.

Hvis ekstraktet ikke kromatograferes samme dag, skal det opbevares ved < 5 oC.

5.3.   Bestemmelse af totale aminosyrer

5.3.1.    Oxidering

0,1 –1 g af den klargjorte prøve (5.1) afvejes med en nøjagtighed på 0,2 mg i:

Den afvejede prøveportion skal have et kvælstofindhold på ca. 10 mg og et vandindhold på højst 100 mg.

Kolben/flasken anbringes i isbad og nedkøles til 0 oC, hvorefter der tilsættes 5 ml oxideringsblanding (3.23) og omrøres ved hjælp af en glasspatel med bøjet spids. Kolben/flasken, der indeholder spatelen, lukkes med lufttæt film. Isbadet med den lukkede beholder anbringes i et køleskab ved 0 oC og henstår i 16 timer. Efter 16 timer tages det ud af køleskabet, og det overskydende oxideringsreagens destrueres ved tilsætning af 0,84 g natriumdisulfit (3.4).

Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.2.1.

5.3.2.    Hydrolyse

5.3.2.1.    Hydrolyse af oxiderede prøver

Den oxiderede prøve (5.3.1) tilsættes 25 ml hydrolyseblanding (3.20). Alle prøverester, der måtte sidde fast på beholderen og spatelen, skal omhyggeligt vaskes ned.

Alt efter den benyttede hydrolysemetode fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4.

5.3.2.2.    Hydrolyse af uoxiderede prøver

0,1 –1 g af den klargjorte prøve (5.1) afvejes med en nøjagtighed på 0,2 mg i en 100 ml eller 250 ml rundbundet kolbe (4.1) eller en 100 ml flaske med skruelåg (4.2). Den afvejede prøveportion skal have et kvælstofindhold på ca. 10 mg. Der tilsættes forsigtigt 25 ml hydrolyseblanding (3.20), som blandes med prøven. Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4.

5.3.2.3.    Åben hydrolyse

Der tilsættes tre glasperler til blandingen i kolben (klargjort som beskrevet i punkt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2). Den opvarmes til kogning og holdes under konstant kogning med tilbagesvaler i 23 timer. Efter afslutning af hydrolysen skylles tilbagesvaleren med 5 ml citratbuffer (3.24). Kolben aftages og afkøles i isbad.

Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.3.

5.3.2.4.    Lukket hydrolyse

Flasken med blandingen klargjort som beskrevet i punkt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2 anbringes i et tørreskab (4.3) ved 110 oC. For at forhindre trykopbygning (på grund af udvikling af gasser) og undgå eksplosion lægges skruelåget i den første time løst på flasken. Flasken må ikke lukkes med skruelåget. Efter en times forløb lukkes flasken med skruelåget og henstår i tørreskabet (4.3) i 23 timer. Efter afslutning af hydrolysen tages flasken ud af tørreskabet, skruelåget åbnes forsigtigt, og kolben anbringes i isbad, hvor den henstår til afkøling.

Alt efter metoden for justering af pH-værdien (5.3.3) overføres kolbens indhold kvantitativt med citratbuffer (3.24) til et 250 ml bægerglas eller til en 250 ml rundbundet kolbe.

Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.3.

5.3.3.    Justering af pH-værdien

Alt efter aminosyreanalysatorens (4.9) natriumtolerance foretages justeringen af pH-værdien som beskrevet i punkt 5.3.3.1 eller 5.3.3.2.

5.3.3.1.    For kromatografisystemer (4.9), der kræver en lav natrium-koncentration:

Det er tilrådeligt at bruge en intern standardstamopløsning (3.27.3), hvis der benyttes aminosyreanalysatorer, der kræver en lav natriumkoncentration (hvor syreindholdet skal reduceres).

I så fald tilsættes 2,00 ml af den interne standardstamopløsning (3.27.3) til hydrolysatet før inddampningen.

Der tilsættes 2 dråber 1-octanol (3.15) til det efter punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4 frembragte hydrolysat.

Volumen reduceres ved hjælp af rotationsfordamperen (4.7) til 5–10 ml under vakuum ved 40 oC. Hvis volumen ved et uheld reduceres til under 5 ml, kasseres hydrolysatet, og analysen gentages.

pH justeres til 2,20 med natriumhydroxidopløsning (3.18), og der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.4.

5.3.3.2.    For andre aminosyreanalysatorer (4.9) :

Det efter 5.3.2.3 eller 5.3.2.4 frembragte hydrolysat neutraliseres delvis ved under omrøring at tilsætte 17 ml natriumhydroxidopløsning (3.17), samtidig med at temperaturen holdes under 40 oC.

pH justeres til 2,20 med natriumhydroxidopløsning (3.17 og 3.18) ved rumtemperatur. Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.4.

5.3.4.    Prøveopløsning til kromatografi

Hydrolysatet (5.3.3.1 eller 5.3.3.2) justeret til en pH-værdi på 2,20 overføres med citratbuffer (3.24) kvantitativt til en 200 ml målekolbe, og der fyldes op til mærket med buffer (3.24).

Hvis en intern standard anvendes, og denne ikke allerede er tilsat, tilsættes der 2,00 ml intern standard (3.27.3) og fyldes op til mærket med citratbuffer (3.24). Der blandes omhyggeligt.

Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4.

Hvis prøveopløsningen ikke kromatograferes samme dag, skal den opbevares ved < 5 oC.

5.4.   Kromatografi

Inden kromatografi opvarmes ekstraktet (5.2) eller hydrolysatet (5.3.4) til rumtemperatur. Blandingen rystes, og en passende mængde filtreres gennem et 0,22 μm membranfilter (4.5). Der foretages ionbytningskromatografi af den fremstillede klarede opløsning ved brug af en aminosyreanalysator (4.9).

Indsprøjtningen kan foretages manuelt eller automatisk. Hovedsagen er, at der altid tilsættes samme mængde opløsning ± 0,5 % til kolonnen til analyse af standardopløsninger og prøveopløsninger, undtagen i tilfælde, hvor der bruges en intern standard. Forholdet mellem natrium og aminosyre i standard- og prøveopløsningerne skal være så ens som muligt.

Kalibreringshyppigheden afhænger normalt af stabiliteten af ninhydrinreagenset og det anvendte analysatorsystem. Standard- eller prøveopløsningen fortyndes med citratbuffer (3.24), således at der for standarden fremkommer et topareal på 30–200 % af arealet af toppene for aminosyrerne i prøveopløsningen.

Kromatografien af aminosyrerne vil variere lidt afhængigt af den anvendte type analysator og kolonnematerialet. Systemet skal kunne adskille aminosyrerne fuldstændigt fra hinanden og fra øvrige ninhydrinpositive stoffer. Kromatografisystemet skal i sit arbejdsområde give lineært respons på ændringer i mængderne af aminosyrer, der tilsættes kolonnen.

Hvis der analyseres en ækvimolær opløsning (af de aminosyrer, der skal bestemmes), skal der ved kromatografien opnås nedenstående forhold mellem dal og tophøjde. Den ækvimolære opløsning skal indeholde mindst 30 % af den største mængde af hver aminosyre, der kan måles præcist med aminosyreanalysatoren (4.9).

Ved adskillelsen af threonin og serin må forholdet mellem dal og tophøjde for den laveste af de to sammenhængende aminosyretoppe ikke være større end 2:10. (Hvis der kun bestemmes cyst(e)in, methionin, threonin og lysin, vil utilstrækkelig adskillelse fra nabotoppe indvirke uheldigt på bestemmelsen.) For alle øvrige aminosyrer skal adskillelsen være bedre end 1:10.

Systemet skal sikre, at lysin adskilles fra artefakter fra andre lysinlignende stoffer og ornithin.

6.   Beregning af resultater

Arealet af toppene i prøve- og standardopløsningerne måles for hver enkelt aminosyre, og mængden (X) beregnes i gram aminosyre pr. kg prøve:

Ved anvendelse af en intern standard multipliceres med:

Såvel cystin som cystein bestemmes som cysteinsyre i hydrolysater af den oxiderede prøve, men beregnes som cystin (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) ved anvendelse af M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Methionin bestemmes som methioninsulfon i hydrolysater af den oxiderede prøve, men beregnes som methionin ved anvendelse af M af methionin (149,21 g/mol).

Tilsat fri methionin bestemmes efter ekstraktion som methionin, hvorved der benyttes samme M til beregningen.

7.   Evaluering af metoden

Metoden er blevet afprøvet ved en international ringanalyse i 1990 med anvendelse af fire forskellige typer foder (svinefoderblanding, slagtefjerkræblanding, proteinkoncentrat og en forblanding). Resultaterne af middel- og standardafvigelse efter fjernelse af outliers er vist i tabellerne under dette punkt:

7.1.   Repeterbarhed

Repeterbarheden for de undersøgte aminosyrer udtrykt som »standardafvigelse inden for laboratorier« for de ovennævnte prøver er gengivet i nedenstående tabel.

7.2   Reproducerbarhed

Resultaterne af standardafvigelse mellem laboratorier for ovennævnte undersøgelser er vist i nedenstående skema.

8.   Anvendelse af referencematerialer

Det undersøges, om metoden er brugt korrekt, ved at foretage gentagne målinger af certificerede referencematerialer, når sådanne forefindes. Det anbefales at kalibrere med certificeret aminosyrekalibreringsopløsning.

9.   Bemærkninger

G.   BESTEMMELSE AF TRYPTOPHAN

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme det samlede indhold af tryptophan (totaltryptophan) og frit tryptophan i foder. Der differentieres ikke mellem D- og L-former.

2.   Princip

Til bestemmelse af totaltryptophan hydrolyseres prøven i basisk miljø i en mættet bariumhydroxidopløsning og holdes opvarmet til 110 oC i 20 timer. Efter hydrolysen tilsættes der intern standard.

Til bestemmelse af frit tryptophan ekstraheres prøven i svagt sur væske under tilstedeværelse af intern standard.

Tryptophanet og den interne standard i hydrolysatet eller i ekstraktet bestemmes ved HPLC med fluorescensdetektor.

3.   Reagenser

4.   Apparatur

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Klargøring af prøver

Prøven formales, så den kan passere gennem en 0,5 mm sigte. Meget fugtige prøver skal inden formalingen enten lufttørres ved højst 50 oC eller frysetørres. Prøver med et højt fedtindhold ekstraheres med petroleumsether (3.9) inden formaling.

5.2.   Bestemmelse af frit tryptophan (ekstrakt)

En passende mængde (1–5 g) af den klargjorte prøve (5.1) afvejes med en nøjagtighed på 1 mg i en konisk kolbe. Der tilsættes 100,0 ml saltsyre (3.13) og 5,00 ml koncentreret opløsning af intern standard (3.16). Der omrystes eller blandes i 60 minutter på mekanisk rysteapparat eller magnetomrører (4.7). Efter henstand og bundfældning afpipetteres 10,0 ml af supernatanten i et bægerglas. Der tilsættes 5 ml orthophosphorsyre (3.14). pH justeres til 3 med natriumhydroxid (3.10). Der tilsættes så meget methanol (3.8), at slutkoncentrationen af methanol bliver 10–30 %. Opløsningen overføres til en målekolbe af passende størrelse og fortyndes med vand til et volumen, der passer til kromatografien (ca. samme volumen som standardkalibreringsopløsningen (3.17)).

Nogle få ml af opløsningen filtreres gennem et 0,45 μm membranfilter (4.5), inden den indsprøjtes på HPLC-kolonnen. Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4.

Standardopløsninger og ekstrakter beskyttes mod direkte sollys. Hvis ekstrakterne ikke kan analyseres samme dag, kan de opbevares ved 5 oC i højst 3 dage.

5.3.   Bestemmelse af totaltryptophan (hydrolysat)

Med en nøjagtighed på 0,2 mg afvejes 0,1 –1 g af den klargjorte prøve (5.1) i polypropylenflasken (4.4). Den afvejede prøveportion skal have et kvælstofindhold på ca. 10 mg. Der tilsættes 8,4 g bariumhydroxidoctahydrat (3.4) og 10 ml vand. Der blandes på vortex-blander (4.8) eller magnetomrører (4.7). Den teflonbelagte magnetpind efterlades i blandingen. Flaskens vægge skylles med 4 ml vand. Skruelåget skrues løst på flasken, der sættes ind i autoklaven (4.6) med kogende vand i 30–60 minutter. Autoklaven lukkes, og der autoklaveres ved 110 (± 2) oC i 20 timer.

Temperaturen i autoklaven sænkes til lige under 100 oC, inden den åbnes. For at undgå udkrystallisering af Ba(OH)2 · 8H2O tilsættes der til den varme blanding 30 ml stuevarmt vand. Der omrystes eller omrøres forsigtigt og tilsættes 2,00 ml koncentreret intern standardopløsning (α-methyltryptophan) (3.16). Flasken afkøles i vand/isbad i 15 minutter.

Derefter tilsættes 5 ml orthophosphorsyre (3.14). Medens flasken stadig står i kølebadet, neutraliseres der med saltsyre (3.11) under omrøring, og pH justeres til 3,0 med saltsyre (3.12). Der tilsættes så meget methanol, at slutkoncentrationen af methanol bliver 10–30 %. Opløsningen overføres til en målekolbe af passende størrelse og fortyndes med vand til et volumen, der passer til kromatografien (f.eks. 100 ml). Der må ikke ske udfældning under methanoltilsætningen.

Nogle få ml af opløsningen filtreres gennem et 0,45 μm membranfilter (4.5), inden den indsprøjtes på HPLC-kolonnen. Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4.

Standardopløsninger og hydrolysater beskyttes mod direkte sollys. Hvis hydrolysaterne ikke kan analyseres samme dag, kan de opbevares ved 5 oC i højst 3 dage.

5.4.   HPLC-bestemmelse

Nedenstående betingelser for isokratisk eluering er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater (se også bemærkning 9.1 og 9.2).

6.   Beregning af resultater

Mængden af tryptophan (X) beregnes i gram pr. 100 g prøve:

7.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 10 % i relativ værdi (af det højeste resultat).

8.   Resultater af ringanalyse

Der er gennemført en EF-ringanalyse (4. ringanalyse), hvor 3 prøver blev analyseret i op til 12 laboratorier med henblik på certificering af hydrolysemetoden. Der blev foretaget 5-dobbelt bestemmelse på hver prøve. Resultaterne er vist i nedenstående tabel:

Der er også gennemført en EF-ringanalyse (3. ringanalyse), hvor 2 prøver blev analyseret i op til 13 laboratorier med henblik på certificering af metoden til ekstraktion af frit tryptophan. Der blev foretaget 5-dobbelt bestemmelse på hver prøve. Resultaterne er vist i nedenstående tabel:

Der er gennemført endnu en EF-ringanalyse, hvor 4 prøver blev analyseret i op til 7 laboratorier med henblik på certificering af tryptophan med hensyn til hydrolyse. Resultaterne er vist herunder. Der blev foretaget 5-dobbelt bestemmelse på hver prøve.

9.   Bemærkninger

H.   BESTEMMELSE AF RÅFEDT

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode anvendes til bestemmelse af råfedtindholdet i foder. Den er ikke beregnet til analyse af olieholdige frø og frugter.

Anvendelsen af de to fremgangsmåder, der er beskrevet nedenfor, afhænger af arten og sammensætningen af foderet og af grunden til, at analysen gennemføres.

1.1.   Metode A — Råfedt, som kan ekstraheres direkte

Denne metode anvendes til vegetabilske fodermidler med undtagelse af dem, der er medtaget under metode B.

1.2.   Metode B — Råfedt i alt

Denne metode anvendes til animalske fodermidler samt til alle foderblandinger. Den skal anvendes til alle materialer, hvorfra råfedt ikke kan ekstraheres fuldstændigt uden forudgående hydrolyse, såsom gluten, gær, kartoffelproteiner og produkter, der underkastes processer som ekstrudering, omdannelse til flager og opvarmning.

1.3.   Fortolkning af resultater

I samtlige tilfælde, hvor der opnås et højere resultat ved anvendelse af metode B end ved metode A, skal de resultater, der er opnået ved metode B, accepteres som den sande værdi.

2.   Princip

2.1.   Metode A

Prøven ekstraheres med petroleumsether. Opløsningsmidlet afdampes, og remanensen tørres og vejes.

2.2.   Metode B

Prøven behandles med saltsyre under opvarmning. Blandingen afkøles og filtreres. Den vaskede og tørrede remanens behandles herefter som beskrevet under metode A.

3.   Reagenser

4.   Apparatur

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Metode A (se punkt 8.1)

5 g af prøven afvejes med en nøjagtighed på 1 mg, overføres til en ekstraktionshætte (4.2) og tildækkes med en affedtet vatprop.

Hætten anbringes i et ekstraktionsapparat (4.1), og der ekstraheres i 6 timer med petroleumsether (3.1). Petroleumsetherekstraktet opsamles i en tør, tareret kolbe indeholdende stykker af pimpsten ( 28 ).

Opløsningsmidlet afdampes. Remanensen tørres derpå i kolben i 1 1/2 time i tørreskab (4.3). Efter afkøling i ekssikkator vejes remanensen. Der tørres i yderligere 30 minutter for at sikre, at fedtets vægt forbliver konstant (vægttabet mellem to på hinanden følgende vejninger må højst være på 1 mg).

5.2.   Metode B

2,5 g af prøven afvejes med en nøjagtighed på 1 mg (se punkt 8.2) og overføres til et 400 ml bægerglas eller en 300 ml konisk kolbe, hvorefter der tilsættes 100 ml saltsyre (3.3) og stykker af pimpsten. Bægerglasset tildækkes med et urglas, eller hvis der anvendes en konisk kolbe, forsynes denne med en tilbagesvaler. Blandingen bringes til let kogning over en svag flamme eller på varmeplade i ca. 1 time. Materialet skal forhindres i at sætte sig fast på beholderens sider.

Beholderen afkøles, og der tilsættes så meget filtreringsmiddel (3.4), at der ikke opstår noget fedttab ved filtreringen. Der filtreres gennem et fugtigt, fedtfrit dobbelt filtrerpapir. Remanensen vaskes med koldt vand, indtil filtratet er neutralt. Det kontrolleres, at filtratet ikke indeholder fedt. Tilstedeværelse af fedt viser, at der inden hydrolysen skal foretages en ekstraktion af prøven med petroleumsether ved anvendelse af metode A.

Det dobbelte filtrerpapir med remanensen lægges på et urglas og tørres i tørreskab (4.3) ved 100 oC ± 3 oC i 1 ½ time.

Det dobbelte filtrerpapir med den tørre remanens anbringes i ekstraktionshætte (4.2) og tildækkes med en affedtet vatprop. Hætten anbringes i et ekstraktionsapparat (4.1), hvorefter der fortsættes som beskrevet i punkt 5.1, andet og tredje afsnit.

6.   Angivelse af resultater

Remanensens vægt angives i procent af prøven.

7.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført af den samme person på den samme prøve må ikke overstige:

8.   Bemærkninger

I.   BESTEMMELSE AF TRÆSTOF

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af fedtfri organiske stoffer i foder, som er uopløselige i fortyndede syre- og baseopløsninger, og som normalt betegnes som træstof.

2.   Princip

Prøven, der om nødvendigt er affedtet, behandles i kogende opløsninger af først svovlsyre og derefter kaliumhydroxid i bestemte koncentrationer. Remanensen adskilles ved filtrering i en glasfilterdigel, hvorefter det vaskes, tørres, vejes og foraskes ved 475–500 oC. Vægttabet ved foraskningen svarer til træstofindholdet i prøven.

3.   Reagenser

4.   Apparatur

5.   Fremgangsmåde

I glasfilterdiglen (4.2) afvejes med 1 mg nøjagtighed 1 g af den klargjorte prøve (se bemærkning 8.1, 8.2 og 8.3), og der tilsættes 1 g filtreringshjælpemiddel (3.3).

Varmeenheden (4.1) og filterdiglen (4.2) samles. Kogecylinderen (4.3) forbindes til diglen. 150 ml svovlsyre (3.1), der er opvarmet til kogepunktet, overføres til kogecylinderen, og om nødvendigt tilsættes nogle få dråber skumdæmpende middel (3.2).

Væsken opvarmes til kogepunktet i løbet af 5 ± 2 minutter og koges livligt i nøjagtig 30 minutter.

Afgangshanen (4.1) åbnes, og svovlsyren filtreres under vakuum gennem filterdiglen. Remanensen på filterdiglen vaskes under vakuum tre gange med 30 ml kogende vand hver gang. Filtret med remanensen suges tørt efter hver vask.

Afgangshanen lukkes, og 150 ml kogende kaliumhydroxidopløsning (3.7) overføres til kogecylinderen. Der tilsættes nogle få dråber skumdæmpende middel (3.2). Væsken opvarmes til kogepunktet i løbet af 5 ± 2 minutter og koges livligt i nøjagtig 30 minutter. Remanensen filtreres og vaskes på samme måde som efter behandling med svovlsyre.

Efter den sidste vask suges bundfaldet tørt, og diglen med indhold forbindes til koldekstraktionsapparatet (4.6). Remanensen i diglen vaskes under vakuum tre gange med 25 ml acetone (3.4) hver gang og suges tørt efter hver vask.

Filterdiglen med indhold tørres i tørreskabet ved 130 oC indtil konstant vægt. Efter hver tørring afkøles diglen i en ekssikkator og vejes straks. Herefter anbringes den i muffelovnen, og indholdet foraskes ved 475–500 oC i mindst 30 minutter. Dette gentages indtil konstant vægt (vægttabet mellem to på hinanden følgende vejninger må højst være på 2 mg).

Efter hver foraskning afkøles diglen først i ovnen og derefter i ekssikkatoren, inden den vejes.

Der foretages en blindprøve uden prøve. Vægttabet ved foraskningen må ikke overstige 4 mg.

6.   Beregning af resultater

Træstofindholdet som procent af prøven beregnes efter følgende formel:

hvor:

7.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige:

8.   Bemærkninger

J.   BESTEMMELSE AF SUKKER

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af reducerende sukker og totalsukker efter invertering, udtrykt som glucose eller, ved omregning med faktoren 0,95 , som saccharose. Metoden finder anvendelse på foderblandinger. Der er fastsat særlige metoder for andre typer foder. Om nødvendigt bestemmes lactosen særskilt, idet der tages hensyn hertil ved beregningen af resultaterne.

2.   Princip

Sukkeret opløses i fortyndet ethanol; opløsningen klares ved hjælp af Carrez-reagens I og II. Efter afdampning af ethanol foretages bestemmelserne før og efter inverteringen efter Luff-Schoorl-metoden.

3.   Reagenser

4.   Apparatur

Mekanisk rysteapparat: ca. 35–40 omdrejninger i minuttet.

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Ekstraktion af prøven

2,5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og hældes i en 250 ml målekolbe. Der tilsættes 200 ml ethanol (3.1) og blandes i 1 time i rysteapparatet. Der tilsættes 5 ml Carrez-reagens I (3.2) og omrøres i ca. 30 sekunder. Derefter tilsættes 5 ml Carrez-reagens II (3.3) og omrøres på ny i 1 minut. Der fyldes op til mærket med ethanol (3.1), hvorefter der homogeniseres og filtreres. 200 ml af filtratet udtages og inddampes til ca. halvdelen af volumenet, hvorved størstedelen af ethanolen fordamper. Fordampningsresten overføres kvantitativt ved hjælp af varmt vand til en 200 ml målekolbe og afkøles, der fyldes op til mærket med vand og homogeniseres, og om nødvendigt filtreres. Denne opløsning benyttes til bestemmelse af reducerende sukker samt, efter invertering, af totalsukker.

5.2.   Bestemmelse af reducerende sukker

Med pipette udtages højst 25 ml af opløsningen indeholdende under 60 mg reducerende sukker, udtrykt som glucose. Om nødvendigt fyldes op med destilleret vand til 25 ml, og indholdet af reducerende sukker bestemmes efter Luff-Schoorl-metoden. Resultatet angives i procent glucose.

5.3.   Bestemmelse af totalsukker efter invertering

Med pipette udtages 50 ml opløsning, som overføres til en 100 ml målekolbe. Der tilsættes nogle få dråber methylorangeopløsning (3.4) og derefter, forsigtigt og under stadig omrøring, saltsyre (3.5), indtil der sker et tydeligt omslag til rødt. Der tilsættes 15 ml saltsyre (3.6), og kolben anbringes på vandbad i stærk kogning og efterlades der i 30 minutter. Der afkøles hurtigt til ca. 20 oC og tilsættes 15 ml natriumhydroxidopløsning (3.7). Der fyldes op med vand til 100 ml og homogeniseres. Der udtages en mængde, der ikke overstiger 25 ml, og som indeholder mindre end 60 mg reducerende sukker, udtrykt som glucose. Om nødvendigt fyldes op med destilleret vand til 25 ml, og indholdet af reducerende sukker bestemmes efter Luff-Schoorl-metoden. Resultatet angives i procent glucose eller, ved multiplikation med faktoren 0,95 , saccharose.

5.4.   Titrering efter Luff-Schoorl-metoden

Med pipette udtages 25 ml af Luff-Schoorl-reagenset (3.8), som overføres til en 300 ml erlenmeyerkolbe; der tilsættes nøjagtig 25 ml af den klarede sukkeropløsning. Der tilsættes 2 korn pimpsten (3.13) og opvarmes under omrystning med hånden over en fri flamme af middelhøjde, og væsken bringes i kog på ca. 2 minutter. Erlenmeyerkolben anbringes umiddelbart derefter på en metaltrådsdug, som er forsynet med et asbesttrådnet med et hul på ca. 6 cm i diameter, hvorunder man i forvejen har tændt en flamme. Denne skal være afpasset således, at alene erlenmeyerkolbens bund opvarmes. Kolben forbindes med en tilbagesvaler. Væsken koges i nøjagtig 10 minutter og afkøles straks derefter ved hjælp af koldt vand, hvorpå der efter ca. 5 minutters forløb titreres som følger:

Der tilsættes 10 ml kaliumiodidopløsning (3.12) og straks derefter (forsigtigt på grund af risikoen for dannelse af skum i stor mængde) 25 ml svovlsyre (3.11). Der titreres så med natriumthiosulfatopløsning (3.9), indtil der viser sig en matgul farve, hvorefter der tilsættes stivelse (3.10) som indikator, og titreringen færdiggøres.

Den samme titrering foretages med en nøjagtigt afmålt blanding af 25 ml Luff-Schoorl-reagens (3.8) og 25 ml vand, efter at der er tilsat 10 ml kaliumiodidopløsning (3.12) og 25 ml svovlsyre (3.11), dog uden at bringe den i kog.

6.   Beregning af resultater

Ved hjælp af tabellen beregnes den mængde glucose i mg, der svarer til forskellen mellem resultaterne af de to titreringer, udtrykt i mg natriumthiosulfat 0,1 mol/liter. Resultatet angives i procent af prøven.

7.   Specielle fremgangsmåder

8.   Bemærkninger

K.   BESTEMMELSE AF LACTOSE

1.   Formål og anvendelsesområde

Metoden gør det muligt at bestemme indholdet af lactose i foder, der indeholder mere end 0,5 % heraf.

2.   Princip

Sukkeret opløses i vand. Opløsningen underkastes en gæring med Saccharomyces cerevisiae, som ikke angriber lactosen. Efter klaring og filtrering bestemmes filtratets lactoseindhold efter Luff-Schoorl-metoden.

3.   Reagenser

4.   Apparatur

Vandbad forsynet med termostat, indstillet til 38–40 oC.

5.   Fremgangsmåde

1 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed, og denne portion anbringes i en 100 ml målekolbe. Der tilsættes 25–30 ml vand. Kolben opvarmes i 30 minutter i kogende vandbad, hvorefter der afkøles til ca. 35 oC. Der tilsættes 5 ml gærsuspension (3.1) og homogeniseres. Kolben henstår i 2 timer i vandbad ved en temperatur på 38–40 oC. Afkøles derpå til ca. 20 oC.

Der tilsættes 2,5 ml Carrez-reagens I (3.2), og blandingen rystes i 30 sekunder; dernæst tilsættes 2,5 ml Carrez-reagens II (3.3), og der rystes på ny i 30 sekunder. Der fyldes op med vand til 100 ml, blandes og filtreres. Med pipette udtages en mængde filtrat, der ikke overstiger 25 ml, og som så vidt muligt indeholder 40–80 mg lactose, og dette overføres til en 300 ml erlenmeyerkolbe. Om nødvendigt fyldes op med vand til 25 ml.

På samme måde udføres en blindprøve med 5 ml gærsuspension (3.1). Lactoseindholdet bestemmes efter Luff-Schoorl-metoden som følger: Der tilsættes nøjagtig 25 ml Luff-Schoorl-reagens (3.4) og 2 korn pimpsten (3.5). Der opvarmes under omrystning med hånden over en fri flamme af middelhøjde, og væsken bringes i kog på ca. 2 minutter. Erlenmeyerkolben anbringes umiddelbart derefter på en metaltrådsdug, som er forsynet med et asbesttrådnet med et hul på ca. 6 cm i diameter, hvorunder man i forvejen har tændt en flamme. Denne skal være afpasset således, at alene erlenmeyerkolbens bund opvarmes. Kolben forbindes med en tilbagesvaler. Væsken koges i nøjagtig 10 minutter. Derpå afkøles der straks ved hjælp af koldt vand, og efter ca. 5 minutters forløb titreres der som følger:

Der tilsættes 10 ml kaliumiodidopløsning (3.6) og straks derefter (forsigtigt på grund af risikoen for dannelse af skum i stor mængde) 25 ml svovlsyre (3.7). Der titreres så med natriumthiosulfatopløsning (3.8), indtil der viser sig en matgul farve, hvorefter der tilsættes stivelse (3.9) som indikator, og titreringen færdiggøres.

Den samme titrering foretages med en nøjagtigt afmålt blanding af 25 ml Luff-Schoorl-reagens (3.4) og 25 ml vand, efter at der er tilsat 10 ml kaliumiodidopløsning (3.6) og 25 ml svovlsyre (3.7), dog uden at bringe den i kog.

6.   Beregning af resultater

Ved hjælp af nedenstående tabel beregnes den mængde lactose i mg, der svarer til forskellen mellem resultaterne af de to titreringer, udtrykt i ml natriumthiosulfatopløsning 0,1 mol/liter.

Resultatet for vandfri lactose angives i procent af prøven.

7.   Bemærkning

Til produkter, der indeholder mere end 40 % gæringsdygtigt sukker, skal der benyttes mere end 5 ml gærsuspension (3.1).

L.   BESTEMMELSE AF STIVELSE

POLARIMETRISK METODE

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af stivelse og nedbrydningsprodukter heraf med høj molekylvægt i foder til kontrol af, om reglerne vedrørende angivelse af energiværdien (jf. bilag VII) og direktiv 96/25/EF ( 29 ) er overholdt.

2.   Princip

Metoden er baseret på dobbeltbestemmelse. Ved den første bestemmelse behandles prøven med fortyndet saltsyre. Efter klaring og filtrering måles opløsningens optiske drejning polarimetrisk.

Ved den anden bestemmelse ekstraheres prøven med 40 % ethanol. Efter behandling af filtratet med saltsyre klares og filtreres, og den optiske drejning måles under samme betingelser som ved den første bestemmelse.

Forskellen mellem de to målinger, multipliceret med en kendt faktor, giver prøvens stivelsesindhold.

3.   Reagenser

4.   Apparatur

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Klargøring af prøven

Prøven formales, så den kan passere fuldstændigt gennem en sigte med 0,5 mm runde masker.

5.2.   Bestemmelse af den totale optiske drejning (P eller S) (se bemærkning 7.1)

2,5 g af den formalede prøve afvejes med 1 mg nøjagtighed i en 100 ml målekolbe, og der tilsættes 25 ml saltsyre (3.2). Kolben rystes, indtil prøvematerialet er jævnt fordelt, og der tilsættes yderligere 25 ml saltsyre (3.2). Derefter nedsænkes kolben i et kogende vandbad. I de første 3 minutter rystes kolben kraftigt og med regelmæssige mellemrum for at forhindre klumpdannelse. Vandmængden i vandbadet skal være tilstrækkelig til fortsat at holde vandet i kog, når kolben nedsænkes. Under omrystningen må kolben ikke tages op af vandbadet. Efter nøjagtig 15 minutter tages kolben op af vandbadet, hvorefter der tilsættes 30 ml koldt vand og straks afkøles til 20 oC.

Der tilsættes 5 ml Carrez-reagens I (3.3) og omrystes i ca. 30 sekunder. Derpå tilsættes 5 ml Carrez-reagens II (3.4), og der omrystes atter i ca. 30 sekunder. Der fyldes op med vand til mærket, blandes og filtreres: Hvis filtratet ikke er fuldstændig klart, hvilket sjældent forekommer, skal bestemmelsen gentages med en større mængde Carrez-reagens I og II, f.eks. 10 ml.

Opløsningens optiske drejning måles i et 200 mm rør med et polarimeter eller et saccharimeter.

5.3.   Bestemmelse af den optiske drejning (P' eller S') for de i 40 % ethanol opløselige stoffer

5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i en 100 ml målekolbe, og der tilsættes ca. 80 ml ethanol (3.5) (se bemærkning 7.2). Kolben henstår i 1 time ved rumtemperatur. I dette tidsrum rystes kolben kraftigt seks gange, så prøvematerialet blandes omhyggeligt med ethanolen. Der fyldes op med ethanol (3.5) til mærket, blandes og filtreres.

50 ml af filtratet (svarende til 2,5 g af prøven) afpipetteres i en 250 ml erlenmeyerkolbe, og der tilsættes 2,1 ml saltsyre (3.1). Kolben rystes kraftigt, sluttes til en tilbagesvaler og nedsænkes i et bad med kogende vand. Efter nøjagtig 15 minutter tages erlenmeyerkolben op af vandbadet, og indholdet skylles over i en 100 ml målekolbe med en lille mængde koldt vand og afkøles til 20 oC.

Derpå klares med Carrez-reagens I (3.3) og II (3.4), fyldes op med vand til mærket, blandes og filtreres, og den optiske drejning måles som beskrevet i punkt 5.2, andet og tredje afsnit.

6.   Beregning af resultater

Indholdet af stivelse ( %) beregnes som følger:

6.1.   Polarimetriske målinger

6.2.   Saccharimetriske målinger

6.3.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ved indhold på under 40 % stivelse ikke overstige 0,4 % i absolut værdi og ved indhold på 40 % og derover ikke overstige 1 % i relativ værdi.

7.   Bemærkninger

M.   BESTEMMELSE AF RÅASKE

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af råaske i foder.

2.   Princip

Prøven foraskes ved 550 oC; remanensen vejes.

3.   Reagenser

Ammoniumnitrat, 20 % opløsning (w/v).

4.   Apparatur

5.   Fremgangsmåde

Ca. 5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed (2,5 g for produkter, der har tendens til at svulme op) i en foraskningsdigel, der i forvejen er opvarmet til 550 oC, afkølet og tareret. Diglen anbringes på varmepladen og opvarmes gradvist, indtil stoffet forkuller. Der foraskes som beskrevet i punkt 5.1 eller 5.2.

6.   Beregning af resultater

Vægten af remanensen beregnes, idet taraen trækkes fra.

Resultatet angives i procent af prøven.

7.   Bemærkninger

N.   BESTEMMELSE AF ASKE UOPLØSELIG I SALTSYRE

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet i foder af mineralske bestanddele, som er uopløselige i saltsyre. Der er fastsat to fremgangsmåder alt afhængigt af prøvens art.

2.   Princip

3.   Reagenser

4.   Apparatur

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Fremgangsmåde A

Prøven foraskes efter den fremgangsmåde, der er beskrevet for bestemmelse af råaske. Man kan også benytte den aske, der opnås ved denne bestemmelse.

Asken anbringes i et 250–400 ml bægerglas med 75 ml saltsyre (3.1). Væsken bringes forsigtigt til kogning og koges sagte i 15 minutter. Den varme opløsning filtreres gennem et askefrit filtrerpapir, og remanensen vaskes med varmt vand, indtil den sure reaktion forsvinder. Filtret med remanensen tørres, og der foraskes i en tareret digel ved en temperatur på mindst 550 oC og højst 700 oC. Afkøles i en ekssikkator og vejes.

5.2.   Fremgangsmåde B

5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i et 250–400 ml bægerglas. Der tilsættes 25 ml vand og derefter 25 ml saltsyre (3.1), blandes og ventes, indtil opbrusningen ophører. Der tilsættes yderligere 50 ml saltsyre (3.1). Det afventes, at en eventuel luftudvikling er overstået, hvorefter bægerglasset anbringes på kogende vandbad og efterlades dér i 30 minutter eller mere, om nødvendigt, så eventuelt forekommende stivelse hydrolyseres fuldstændigt. Der varmfiltreres gennem et askefrit filter, og filtret vaskes med 50 ml varmt vand (se punkt 7, »Bemærkning«). Filtret med remanensen anbringes i en foraskningsdigel, og der tørres og foraskes ved en temperatur på mindst 550 oC og højst 700 oC. Asken anbringes i et 250–400 ml bægerglas med 75 ml saltsyre (3.1). Derefter fortsættes som beskrevet i punkt 5, andet afsnit.

6.   Beregning af resultater

Vægten af remanensen beregnes, idet taraen trækkes fra. Resultatet angives i procent af prøven.

7.   Bemærkning

Hvis filtreringen viser sig vanskelig, gentages bestemmelsen, idet de 50 ml saltsyre (3.1) erstattes med 50 ml trichloreddikesyreopløsning på 20 % (3.2), og idet filtret vaskes med en varm trichloreddikesyreopløsning på 1 % (3.3).

O.   BESTEMMELSE AF CARBONATER

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af carbonater, der normalt udtrykkes som calciumcarbonat, i de fleste foderstoffer.

I visse tilfælde (f.eks. ferrocarbonat) må der dog anvendes en særlig metode.

2.   Princip

Carbonaterne spaltes med saltsyre; den frigjorte kuldioxid opsamles i et måleglas, og dens volumen sammenlignes med det volumen, der under de samme betingelser frigøres af en bekendt mængde calciumcarbonat.

3.   Reagenser

4.   Apparatur

Scheibler-Dietrich-apparat (se skitse) eller tilsvarende apparat.

5.   Fremgangsmåde

Alt efter prøvens carbonatindhold afvejes en prøve som angivet nedenfor:

Prøven anbringes i apparatets specialflaske (4), der er forsynet med et lille rør af brudsikkert materiale, som indeholder 10 ml saltsyre (3.1), og flasken forbindes med apparatet. Tregangshanen (5) drejes, således at røret (1) står i forbindelse med luften udenfor. Ved hjælp af det bevægelige rør (2), som er fyldt med farvet svovlsyre (3.3) og forbundet med det gradinddelte rør (1), bringes væskens niveau til nulpunktet på skalaen. Hanen (5) drejes, således at rørene (1) og (3) kommer i forbindelse med hinanden, og det kontrolleres, at væskeniveauet er på nulpunktet.

Saltsyren (3.1) lades langsomt flyde hen over prøven, idet flasken (4) hældes. Trykket udlignes ved at sænke røret (2). Flasken (4) rystes, indtil kuldioxidudviklingen er helt ophørt.

Trykket genoprettes ved at føre væsken tilbage til det samme niveau i rørene (1) og (2). Der aflæses efter få minutters forløb, når volumenet er blevet konstant.

Under de samme betingelser udføres et sammenlignende forsøg med 0,5 g calciumcarbonat (3.2).

6.   Beregning af resultater

Indholdet af carbonater, udtrykt som calciumcarbonat, beregnes efter følgende formel:

hvor:

7.   Bemærkninger

P.   BESTEMMELSE AF TOTALPHOSPHOR

FOTOMETRISK METODE

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af totalphosphor i foder. Metoden er specielt egnet til undersøgelse af foder med et ringe phosphorindhold. I bestemte tilfælde (phosphorrige produkter) kan der anvendes en gravimetrisk metode.

2.   Princip

Prøven destrueres enten ved forbrænding (når der er tale om organisk foder) eller ved syreoplukning (mineralske stoffer og flydende foder) og opløses i syre. Opløsningen behandles med vanadatmolybdatreagenset. Ekstinktionen af den gulfarvede opløsning måles ved 430 nm i spektrofotometret.

3.   Reagenser

4.   Apparatur

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Fremstilling af opløsningen

Alt efter prøvens art fremstilles opløsningen som beskrevet i punkt 5.1.1 eller 5.1.2.

5.1.1.    Normal metode

1 g eller mere af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og hældes i en Kjeldahlkolbe. Der tilsættes 20 ml svovlsyre (3.5), hvorefter der omrystes for at gennemvæde materialet med syren og for at forhindre, at materialet sætter sig fast på kolbens inderside. Derpå opvarmes blandingen og holdes i kog i 10 minutter. Efter en let afkøling tilsættes der 2 ml salpetersyre (3.4); der opvarmes svagt og afkøles atter noget. Herefter tilsættes på ny lidt salpetersyre (3.4) og opvarmes til kogetemperatur, og dette gentages, indtil opløsningen er farveløs. Derpå afkøles der; der tilsættes lidt vand, og væsken overføres kvantitativt til en 500 ml målekolbe ved skylning af Kjeldahlkolben med varmt vand. Efter afkøling fyldes der op med vand til mærket, homogeniseres og filtreres.

5.1.2.    Metode for prøver, der indeholder organiske stoffer, men er fri for calcium- og magnesium-dihydrogenphosphater

Ca. 2,5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i en foraskningsdigel og blandes omhyggeligt med 1 g calciumcarbonat (3.1). I muffelovnen foraskes der ved 550 oC, indtil asken er hvid eller grå (små mængder kul er ikke et problem). Asken overføres til et 250 ml bægerglas. Der tilsættes 20 ml vand og saltsyre (3.2), indtil opbrusningen ophører. Der tilsættes yderligere 10 ml saltsyre (3.2). Derpå anbringes bægerglasset på sandbad, og der inddampes til fuldstændig tørhed for at gøre kiselsyren uopløselig. Remanensen opløses i 10 ml salpetersyre (3.3) og opvarmes til kogetemperatur i 5 minutter på sandbad eller varmeplade, idet remanensen dog ikke skal tørre helt. Væsken overføres til en 500 ml målekolbe, idet bægerglasset gentagne gange skylles med varmt vand. Efter afkøling fyldes der op med vand til mærket, homogeniseres og filtreres.

5.2.   Udvikling af farvningen og måling af ekstinktionen

En alikvot del af det efter 5.1.1 eller 5.1.2 udvundne filtrat fortyndes for at få en koncentration af phosphor på højst 40 μg/ml. 10 ml af denne opløsning overføres til et reagensglas (4.6), og der tilsættes 10 ml vanadatmolybdatreagens (3.6). Blandingen homogeniseres og henstår i mindst 10 minutter ved 20 oC. Derpå måles ekstinktionen i spektrofotometret ved 430 nm i forhold til en opløsning af 10 ml vand og 10 ml vanadatmolybdatreagens (3.6).

5.3.   Kalibreringskurve

Af standardopløsningen (3.7) fremstilles opløsninger, der indeholder henholdsvis 5, 10, 20, 30 og 40 μg phosphor pr. ml. Til hver 10 ml af disse opløsninger tilsættes 10 ml vanadatmolybdatreagens (3.6). Der homogeniseres, og blandingen henstår i mindst 10 minutter ved 20 oC. Derpå måles ekstinktionen under de ovenfor i punkt 5.2 beskrevne betingelser. Kalibreringskurven tegnes, idet ekstinktionsværdierne indtegnes op ad ordinaten, og den tilsvarende phosphormængde ud ad abscissen. Kurven er lineær for phosphorkoncentrationer på 0–40 μg/ml.

6.   Beregning af resultater

Indholdet af phosphor i prøven bestemmes ved benyttelse af kalibreringskurven.

Resultatet angives i procent af prøven.

Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige:

Q.   BESTEMMELSE AF CHLOR AF CHLORIDER

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af chlor af vandopløselige chlorider, der normalt udtrykkes som natriumchlorid. Den kan anvendes på alt foder.

2.   Princip

Chloriderne opløses i vand. Dersom produktet indeholder organisk stof, foretages en klaring. Opløsningen gøres let sur ved tilsætning af salpetersyre, og chloriderne bundfældes i form af sølvchlorid ved hjælp af en sølvnitratopløsning. Overskuddet af sølvnitrat titreres med en ammoniumthiocyanatopløsning efter Volhards metode.

3.   Reagenser

4.   Apparatur

Mekanisk rysteapparat: ca. 35–40 omdrejninger i minuttet.

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Fremstilling af opløsningen

Alt efter prøvens art fremstilles en opløsning som beskrevet i punkt 5.1.1., 5.1.2 eller 5.1.3.

Der udføres til sammenligning en blindprøve uden analyseprøven.

5.1.1.    Prøver uden organisk stof

Der afvejes med 1 mg nøjagtighed en analyseprøve på ikke mere end 10 g, der ikke indeholder mere end 3 g chlor i form af chlorider, og denne anbringes i en 500 ml målekolbe med 400 ml vand på ca. 20 oC. Væsken blandes i 30 minutter i rysteapparatet, og der fyldes op til mærket, homogeniseres og filtreres.

5.1.2.    Prøver, der indeholder organisk stof, med undtagelse af de i punkt 5.1.3. anførte

Ca. 5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og anbringes med 1 g aktivt kul i en 500 ml målekolbe. Der tilsættes 400 ml vand på ca. 20 oC og 5 ml Carrez-reagens I (3.7), omrøres i 30 sekunder og tilsættes derefter 5 ml Carrez-reagens II (3.8). Væsken blandes i 30 minutter i rysteapparatet, og der fyldes op til mærket, homogeniseres og filtreres.

5.1.3.    Bagt foder, hørfrøkager og hørfrøskrå, produkter med et stort indhold af hørfrøskrå og andre produkter med et stort indhold af planteslim eller af kolloidale stoffer (f.eks. forklistret stivelse)

Opløsningen fremstilles som beskrevet i punkt 5.1.2, men filtreres ikke. Opløsningen dekanteres (om nødvendigt centrifugeres), med pipette udtages 100 ml af supernatanten, og dette overføres til en 200 ml målekolbe. Der blandes med acetone (3.6) og fyldes op til mærket med denne opløsningsvæske, hvorefter der homogeniseres og filtreres.

5.2.   Titrering

Med pipette overføres til en erlenmeyerkolbe 25–100 ml af filtratet (alt efter det formodede chlorindhold), der er opnået efter punkt 5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3. Den alikvote mængde må ikke indeholde mere end 150 mg klor (Cl). Om nødvendigt fortyndes med vand op til mindst 50 ml, hvorefter der tilsættes 5 ml salpetersyre (3.4), 20 ml mættet ammoniumferrisulfatopløsning (3.3) og 2 dråber ammoniumthiocyanatopløsning (3.1), som påfyldes ved hjælp af en burette, der er fyldt til nulpunktstregen. Dernæst påfyldes ved hjælp af en burette sølvnitratopløsningen (3.2), således at der opnås et overskud på 5 ml. Der tilsættes 5 ml diethylether (3.5) og omrystes kraftigt for at sikre fuldstændig udfældning. Overskuddet af sølvnitrat titreres med ammoniumthiocyanatopløsning (3.1), indtil omslaget til den brunrøde farve har holdt sig i 1 minut.

6.   Beregning af resultater

Mængden af chlor (X), udtrykt i % natriumchlorid, beregnes efter følgende formel:

hvor:

Hvis blindprøven viser et forbrug af sølvnitratopløsning 0,1 mol/liter, trækkes denne værdi fra volumenet (V1 - V2).

7.   Bemærkninger

BILAG IV

ANALYSEMETODER TIL KONTROL AF INDHOLDET AF GODKENDTE TILSÆTNINGSSTOFFER I FODER

A.   BESTEMMELSE AF VITAMIN A

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af vitamin A (retinol) i foder og forblandinger. Ved vitamin A forstås all-trans-retinylalkohol og dens cis-isomerer, som bestemmes ved denne metode. Indholdet af vitamin A udtrykkes i internationale enheder (IU) pr. kg. En IU svarer til aktiviteten af 0,300 μg all-trans-vitamin A-alkohol eller 0,344 μg all-trans-vitamin A-acetat eller 0,550 μg all-trans-vitamin A-palmitat.

Bestemmelsesgrænsen er 2 000 IU vitamin A pr. kg.

2.   Princip

Prøven hydrolyseres med kaliumhydroxid opløst i ethanol, og vitamin A ekstraheres med petroleumsether. Opløsningsmidlet fjernes ved inddampning, og remanensen opløses i methanol og fortyndes om nødvendigt til den ønskede koncentration. Vitamin A-indholdet bestemmes ved omvendt-fase-HPLC med anvendelse af UV- eller fluorescensdetektor. Kromatograferingsparametrene vælges således, at all-trans-vitamin A-alkohol og dens cis-isomerer ikke adskilles.

3.   Reagenser

4.   Apparatur

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Klargøring af prøven

Prøven formales, så den kan passere gennem en sigte med 1 mm maskevidde, men varmeudvikling skal undgås. Formalingen foretages umiddelbart før afvejning og forsæbning, da der ellers kan gå vitamin A tabt.

5.2.   Forsæbning

Afhængigt af vitamin A-indholdet afvejes der med en nøjagtighed på 1 mg 2–25 g af prøven i en 500 ml fladbundet eller konisk kolbe (4.2.1). Der tilsættes under forsigtig blanding i rækkefølge 130 ml ethanol (3.1), ca. 100 mg BHT (3.13), 2 ml natriumascorbatopløsning (3.5) og 2 ml natriumsulfidopløsning (3.6). Der sættes en svaler på kolben, som anbringes i vandbad med magnetomrører (4.7). Der opvarmes til kogning og koges med tilbagesvaling i 5 minutter. Dernæst tilsættes der 25 ml kaliumhydroxidopløsning (3.4) gennem svaleren (4.3), og der koges med tilbagesvaling i endnu 25 minutter under omrøring og under langsom nitrogengennemstrømning. Svaleren skylles med ca. 20 ml vand, og kolbens indhold afkøles til rumtemperatur.

5.3.   Ekstraktion

Forsæbningsopløsningen overføres kvantitativt til en 1 000 ml skilletragt (4.2.3) eller ekstraktionsapparatet (4.8) ved skylning med i alt 250 ml vand. Derefter skylles forsæbningskolben først med 25 ml ethanol (3.1) og dernæst med 100 ml petroleumsether (3.2), idet skyllevæskerne overføres til skilletragten eller ekstraktionsapparatet. Forholdet mellem vand og ethanol i den samlede væskemængde skal være ca. 2:1. Der omrystes kraftigt i 2 minutter, og blandingen henstår til adskillelse i 2 minutter.

5.3.1.    Ekstraktion med skilletragt (4.2.3)

Når væsken er skilt i to lag (se bemærkning 7.3), overføres petroleumsetherlaget til en anden skilletragt (4.2.3). Ekstraktionen gentages to gange med 100 ml petroleumsether (3.2) og derefter to gange med 50 ml petroleumsether (3.2).

De samlede ekstrakter i skilletragten vaskes to gange med 100 ml vand hver gang (ved forsigtig omdrejning, så der ikke dannes emulsion) og derefter flere gange ved rystning med 100 ml vand, indtil vandet ikke farves ved tilsætning af phenolphthaleinopløsning (3.7) (fire gange er normalt tilstrækkeligt). Det vaskede ekstrakt filtreres over i en 500 ml målekolbe (4.2.2) gennem et tørt foldefilter til faseseparation (4.4), således at eventuelt opslæmmet vand fjernes. Skilletragten og filtret skylles med 50 ml petroleumsether (3.2), og der fyldes op til mærket med petroleumsether (3.2) og blandes omhyggeligt.

5.3.2.    Ekstraktion med ekstraktionsapparat (4.8)

Når væsken er skilt i to lag (se bemærkning 7.3), udskiftes cylinderglassets (4.8.1) prop med slibindsatsen (4.8.2), og den nederste, U-formede del af det justerbare rør anbringes, så dets munding er lige over skillefladen. Ved at sætte nitrogentryk på sidearmen overføres det lette lag af petroleumsether til en 1 000 ml skilletragt (4.2.3). Der tilsættes 100 ml petroleumsether (3.2) til cylinderglasset, og det tilproppes og rystes omhyggeligt. Når væsken er skilt i to lag, overføres det lette lag til skilletragten som før. Ekstraktionen gentages med endnu 100 ml petroleumsether (3.2) og dernæst med 2 portioner 50 ml petroleumsether (3.2), og alle lagene af petroleumsether overføres til skilletragten.

De samlede petroleumsetherekstrakter i skilletragten vaskes som beskrevet i punkt 5.3.1, og der fortsættes som beskrevet der.

5.4.   Fremstilling af prøveopløsning til HPLC-analyse

En alikvot mængde af petroleumsetherekstraktet (fra 5.3.1 eller 5.3.2) afpipetteres i en 250 ml pærekolbe (4.2.4). Der inddampes til næsten tørhed på rotationsfordamper (4.1) under reduceret tryk med en vandbadstemperatur på højst 40 oC. Trykket udlignes til atmosfæretryk, ved at der ledes nitrogen (3.10) ind i kolben, og kolben fjernes fra rotationsfordamperen. Resterende opløsningsmiddel fjernes under en nitrogenstrøm (3.10), og remanensen opløses straks i en kendt mængde (10–100 ml) methanol (3.3) (vitamin A-koncentrationen skal ligge i intervallet 5–30 IU/ml).

5.5.   HPLC-bestemmelse

Separationen af vitamin A finder sted på en C18-kolonne med omvendt fase (4.5.1), og koncentrationen måles med en UV-detektor (325 nm) eller en fluorescensdetektor (excitation: 325 nm, emission: 475 nm) (4.5.2).

Der indsprøjtes en alikvot mængde (f.eks. 20 μl) af methanolopløsningen fra punkt 5.4, og der elueres med den mobile fase (3.9). Middeltophøjden (-arealet) for flere indsprøjtninger af samme prøveopløsning og middeltophøjderne (-arealerne) for flere indsprøjtninger af kalibreringsopløsningerne (5.6.2) beregnes.

HPLC-betingelser

Nedenstående betingelser er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater.

5.6.   Kalibrering

5.6.1.    Fremstilling af arbejdsstandardopløsninger

20 ml stamopløsning af vitamin A-acetat (3.11.1) eller vitamin A-palmitat (3.12.1) afpipetteres i en 500 ml fladbundet eller konisk kolbe (4.2.1), og der hydrolyseres som beskrevet i punkt 5.2, dog uden tilsætning af BHT. Derefter ekstraheres der med petroleumsether (3.2) som beskrevet i punkt 5.3 og fyldes op til 500 ml med petroleumsether (3.2). 100 ml af denne opløsning inddampes til næsten tørhed på rotationsfordamper (se punkt 5.4), resterende opløsningsmiddel fjernes under en nitrogenstrøm (3.10), og remanensen opløses i 10,0 ml methanol (3.3). Opløsningens nominelle vitamin A-koncentration er 560 IU pr. ml. Det nøjagtige indhold bestemmes efter punkt 5.6.3.3. Arbejdsstandardopløsningen skal fremstilles umiddelbart før brugen.

Der afpipetteres 2,0 ml af denne arbejdsstandardopløsning i en 20 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med methanol (3.3) og blandes. Denne fortyndede arbejdsstandardopløsning har en nominel vitamin A-koncentration på 56 IU pr. ml.

5.6.2.    Fremstilling af kalibreringsopløsninger og kalibreringskurve

Henholdsvis 1,0 , 2,0 , 5,0 og 10,0 ml af den fortyndede arbejdsstandardopløsning overføres til hver sin 20 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med methanol (3.3) og blandes. Opløsningernes nominelle vitamin A-koncentration er 2,8 , 5,6 , 14,0 og 28,0 IU pr. ml.

Der indsprøjtes 20 μl af hver kalibreringsopløsning flere gange, og middeltophøjderne (-arealerne) bestemmes. Kalibreringskurven tegnes ved hjælp af middeltophøjderne (-arealerne) under hensyntagen til resultaterne af UV-kontrollen (5.6.3.3).

5.6.3.    UV-indstilling af standardopløsningerne

5.6.3.1.    Stamopløsning af vitamin A-acetat

Der afpipetteres 2,0 ml stamopløsning af vitamin A-acetat (3.11.1) i en 50 ml målekolbe (4.2.2), hvorefter der fyldes op til mærket med 2-propanol (3.8). Opløsningens nominelle vitamin A-koncentration er 56 IU pr. ml. Der afpipetteres 3,0 ml af denne fortyndede opløsning af vitamin A-acetat i en 25 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med 2-propanol (3.8). Opløsningens nominelle vitamin A-koncentration er 6,72 IU pr. ml. Opløsningens UV-spektrum i området 300–400 nm måles mod 2-propanol (3.8) i spektrofotometret (4.6). Ekstinktionsmaksimum skal ligge mellem 325 nm og 327 nm.

Indholdet af vitamin A beregnes efter følgende formel:

IU vitamin A/ml = E326 × 19,0

(

for vitamin A-acetat = 1 530 ved 326 nm i 2-propanol)

5.6.3.2.    Stamopløsning af vitamin A-palmitat

Der afpipetteres 2,0 ml stamopløsning af vitamin A-palmitat (3.12.1) i en 50 ml målekolbe (4.2.2), hvorefter der fyldes op til mærket med 2-propanol (3.8). Opløsningens nominelle vitamin A-koncentration er 56 IU pr. ml. Der afpipetteres 3,0 ml af denne fortyndede opløsning af vitamin A-palmitat i en 25 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med 2-propanol (3.8). Opløsningens nominelle vitamin A-koncentration er 6,72 IU pr. ml. Opløsningens UV-spektrum i området 300–400 nm måles mod 2-propanol (3.8) i spektrofotometret (4.6). Ekstinktionsmaksimum skal ligge mellem 325 nm og 327 nm.

Indholdet af vitamin A beregnes efter følgende formel:

IU vitamin A/ml = E326 × 19,0

(

for vitamin A-palmitat = 957 ved 326 nm i 2-propanol)

5.6.3.3.    Arbejdsstandardopløsning af vitamin A

Der afpipetteres 3,0 ml af den ufortyndede arbejdsstandardopløsning af vitamin A som fremstillet under punkt 5.6.1 i en 50 ml målekolbe (4.2.2), hvorefter der fyldes op til mærket med 2-propanol (3.8). Der afpipetteres 5,0 ml af denne opløsning i en 25 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med 2-propanol (3.8). Opløsningens nominelle vitamin A-koncentration er 6,72 IU pr. ml. Opløsningens UV-spektrum i området 300–400 nm måles mod 2-propanol (3.8) i spektrofotometret (4.6). Ekstinktionsmaksimum skal ligge mellem 325 nm og 327 nm.

Indholdet af vitamin A beregnes efter følgende formel:

IU vitamin A/ml = E325 × 18,3

(

for vitamin A-alkohol = 1 821 ved 325 nm i 2-propanol)

6.   Beregning af resultater

Ud fra middelhøjden (-arealet) af prøveopløsningens vitamin A-toppe bestemmes koncentrationen i prøveopløsningen i IU/ml ved benyttelse af kalibreringskurven (5.6.2).

Indholdet w af vitamin A i IU pr. kg prøve beregnes efter følgende formel:

[UI/kg]

hvor:

7.   Bemærkninger

8.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 15 % i relativ værdi (af det højeste resultat).

9.   Resultater af ringanalyse ( 30 )

B.   BESTEMMELSE AF VITAMIN E

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af vitamin E i foder og forblandinger. Indholdet af vitamin E udtrykkes i mg DL-α -tocopherolacetat pr. kg. 1 mg DL-α-tocopherolacetat svarer til 0,91 mg DL-α-tocopherol (vitamin E).

Bestemmelsesgrænsen er 2 mg vitamin E pr. kg. Denne bestemmelsesgrænse er kun realistisk ved brug af fluorescensdetektor. Ved brug af UV-detektor er bestemmelsesgrænsen 10 mg/kg.

2.   Princip

Prøven hydrolyseres med kaliumhydroxid opløst i ethanol, og vitamin E ekstraheres med petroleumsether. Opløsningsmidlet fjernes ved inddampning, og remanensen opløses i methanol og fortyndes om nødvendigt til den ønskede koncentration. Vitamin E-indholdet bestemmes ved omvendt-fase-HPLC med anvendelse af UV- eller fluorescensdetektor.

3.   Reagenser

4.   Apparatur

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Klargøring af prøven

Prøven formales, så den kan passere gennem en sigte med 1 mm maskevidde, men varmeudvikling skal undgås. Formalingen foretages umiddelbart før afvejning og forsæbning, da der ellers kan gå vitamin E tabt.

5.2.   Forsæbning

Afhængigt af vitamin E-indholdet afvejes der med en nøjagtighed på 0,01 g 2–25 g af prøven i en 500 ml fladbundet eller konisk kolbe (4.2.1). Der tilsættes under forsigtig blanding i rækkefølge 130 ml ethanol (3.1), ca. 100 mg BHT (3.12), 2 ml natriumascorbatopløsning (3.5) og 2 ml natriumsulfidopløsning (3.6). Der sættes en svaler på kolben, som anbringes i vandbad med magnetomrører (4.7). Der opvarmes til kogning og koges med tilbagesvaling i 5 minutter. Dernæst tilsættes der 25 ml kaliumhydroxidopløsning (3.4) gennem svaleren (4.3), og der koges med tilbagesvaling i endnu 25 minutter under omrøring og under langsom nitrogengennemstrømning. Svaleren skylles med ca. 20 ml vand, og kolbens indhold afkøles til rumtemperatur.

5.3.   Ekstraktion

Forsæbningsopløsningen overføres kvantitativt til en 1 000 ml skilletragt (4.2.3) eller ekstraktionsapparatet (4.8) ved skylning med i alt 250 ml vand. Derefter skylles forsæbningskolben først med 25 ml ethanol (3.1) og dernæst med 100 ml petroleumsether (3.2), idet skyllevæskerne overføres til skilletragten eller ekstraktionsapparatet. Forholdet mellem vand og ethanol i den samlede væskemængde skal være ca. 2:1. Der omrystes kraftigt i 2 minutter, og blandingen henstår til adskillelse i 2 minutter.

5.3.1.    Ekstraktion med skilletragt (4.2.3)

Når væsken er skilt i to lag (se bemærkning 7.3), overføres petroleumsetherlaget til en anden skilletragt (4.2.3). Ekstraktionen gentages to gange med 100 ml petroleumsether (3.2) og derefter to gange med 50 ml petroleumsether (3.2).

De samlede ekstrakter i skilletragten vaskes to gange med 100 ml vand hver gang (ved forsigtig omdrejning, så der ikke dannes emulsion) og derefter flere gange ved rystning med 100 ml vand, indtil vandet ikke farves ved tilsætning af phenolphthaleinopløsning (3.7) (fire gange er normalt tilstrækkeligt). Det vaskede ekstrakt filtreres over i en 500 ml målekolbe (4.2.2) gennem et tørt foldefilter til faseseparation (4.4), således at eventuelt opslæmmet vand fjernes. Skilletragten og filtret skylles med 50 ml petroleumsether (3.2), og der fyldes op til mærket med petroleumsether (3.2) og blandes omhyggeligt.

5.3.2.    Ekstraktion med ekstraktionsapparat (4.8)

Når væsken er skilt i to lag (se bemærkning 7.3), udskiftes cylinderglassets (4.8.1) prop med slibindsatsen (4.8.2), og den nederste, U-formede del af det justerbare rør anbringes, så dets munding er lige over skillefladen. Ved at sætte nitrogentryk på sidearmen overføres det lette lag af petroleumsether til en 1 000 ml skilletragt (4.2.3). Der tilsættes 100 ml petroleumsether (3.2) til cylinderglasset, og det tilproppes og rystes omhyggeligt. Når væsken er skilt i to lag, overføres det lette lag til skilletragten som før. Ekstraktionen gentages med endnu 100 ml petroleumsether (3.2) og dernæst med 2 portioner 50 ml petroleumsether (3.2), og alle lagene af petroleumsether overføres til skilletragten.

De samlede petroleumsetherekstrakter i skilletragten vaskes som beskrevet i punkt 5.3.1, og der fortsættes som beskrevet der.

5.4.   Fremstilling af prøveopløsning til HPLC-analyse

En alikvot mængde af petroleumsetherekstraktet (fra 5.3.1 eller 5.3.2) afpipetteres i en 250 ml pærekolbe (4.2.4). Der inddampes til næsten tørhed på rotationsfordamper (4.1) under reduceret tryk med en vandbadstemperatur på højst 40 oC. Trykket udlignes til atmosfæretryk, ved at der ledes nitrogen (3.9) ind i kolben, og kolben fjernes fra rotationsfordamperen. Resterende opløsningsmiddel fjernes under en nitrogenstrøm (3.9), og remanensen opløses straks i en kendt mængde (10–100 ml) methanol (3.3) (koncentrationen af DL-α-tocopherol skal ligge i intervallet 5–30 μg/ml).

5.5.   HPLC-bestemmelse

Separationen af vitamin E finder sted på en C18-kolonne med omvendt fase (4.5.1), og koncentrationen måles med en UV-detektor (292 nm) eller en fluorescensdetektor (excitation: 295 nm, emission: 330 nm) (4.5.2).

Der indsprøjtes en alikvot mængde (f.eks. 20 μl) af methanolopløsningen fra punkt 5.4, og der elueres med den mobile fase (3.8). Middeltophøjderne (-arealerne) for flere indsprøjtninger af samme prøveopløsning og middeltophøjderne (-arealerne) for flere indsprøjtninger af kalibreringsopløsningerne (5.6.2) beregnes.

HPLC-betingelser

Nedenstående betingelser er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater.

5.6.   Kalibrering (DL-α-tocopherolacetat eller DL-α-tocopherol)

5.6.1.    DL-α-tocopherolacetatstandard

5.6.1.1.    Fremstilling af arbejdsstandardopløsning

25 ml stamopløsning af DL-α-tocopherolacetat (3.10.1) afpipetteres i en 500 ml fladbundet eller konisk kolbe (4.2.1), og der hydrolyseres som beskrevet i punkt 5.2. Derefter ekstraheres der med petroleumsether (3.2) som beskrevet i punkt 5.3 og fortyndes til 500 ml med petroleumsether. 25 ml af denne opløsning inddampes til næsten tørhed på rotationsfordamper (se punkt 5.4), resterende opløsningsmiddel fjernes under en nitrogenstrøm (3.9), og remanensen opløses i 25,0 ml methanol (3.3). Opløsningens nominelle koncentration er 45,5 μg DL-α-tocopherol pr. ml svarende til 50 μg DL-α-tocopherolacetat pr. ml. Arbejdsstandardopløsningen skal fremstilles umiddelbart før brugen.

5.6.1.2.    Fremstilling af kalibreringsopløsninger og kalibreringskurve

Henholdsvis 1,0 , 2,0 , 4,0 og 10,0 ml af arbejdsstandardopløsningen overføres til hver sin 20 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med methanol (3.3) og blandes. Opløsningernes nominelle koncentration er 2,5 , 5,0 , 10,0 og 25,0 μg DL-α-tocopherolacetat pr. ml, dvs. 2,28 , 4,55 , 9,10 og 22,8 μg DL-α-tocopherol pr. ml.

Der indsprøjtes 20 μl af hver kalibreringsopløsning flere gange, og middeltophøjderne (-arealerne) bestemmes. Kalibreringskurven tegnes ved hjælp af middeltophøjderne (-arealerne).

5.6.1.3.    UV-indstilling af stamopløsningen af DL-α-tocopherolacetat (3.10.1)

5,0 ml af stamopløsningen af DL-α-tocopherolacetat (3.10.1) fortyndes til 25,0 ml med ethanol, og opløsningens UV-spektrum i området 250–320 nm måles mod ethanol (3.1) i spektrofotometret (4.6).

Absorptionsmaksimum skal ligge ved 284 nm:

43,6 ved 284 nm i ethanol

Ved denne fortynding skal der opnås en ekstinktionsværdi på 0,84 –0,88 .

5.6.2.    DL-α-tocopherolstandard

5.6.2.1.    Fremstilling af arbejdsstandardopløsning

Der afpipetteres 2 ml stamopløsning af DL-α-tocopherol (3.11.1) i en 50 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med methanol (3.3). Opløsningens nominelle koncentration er 40 μg DL-α-tocopherol pr. ml svarende til 44,0 μg DL-α-tocopherolacetat pr. ml. Arbejdsstandardopløsningen skal fremstilles umiddelbart før brugen.

5.6.2.2.    Fremstilling af kalibreringsopløsninger og kalibreringskurve

Henholdsvis 1,0 , 2,0 , 4,0 og 10,0 ml af arbejdsstandardopløsningen overføres til hver sin 20 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med methanol (3.3) og blandes. Opløsningernes nominelle koncentration er 2,0 , 4,0 , 8,0 og 20,0 μg DL-α-tocopherol pr. ml, dvs. 2,20 , 4,40 , 8,79 og 22,0 μg DL-α-tocopherolacetat pr. ml.

Der indsprøjtes 20 μl af hver kalibreringsopløsning flere gange, og middeltophøjderne (-arealerne) bestemmes. Kalibreringskurven tegnes ved hjælp af middeltophøjderne (-arealerne).

5.6.2.3.    UV-indstilling af stamopløsningen af DL-α-tocopherol (3.11.1)

2,0 ml af stamopløsningen af DL-α-tocopherol (3.11.1) fortyndes til 25,0 ml med ethanol, og opløsningens UV-spektrum i området 250-320 nm måles mod ethanol (3.1) i spektrofotometret (4.6). Absorptionsmaksimum skal ligge ved 292 nm:

= 75,8 ved 292 nm i ethanol

Ved denne fortynding skal der opnås en ekstinktionsværdi på 0,6 .

6.   Beregning af resultater

Ud fra middelhøjden (-arealet) af prøveopløsningens vitamin E-toppe bestemmes koncentrationen i prøveopløsningen i μg/ml (beregnet som α-tocopherolacetat) ved benyttelse af kalibreringskurven (5.6.1.2 eller 5.6.2.2).

Indholdet w af vitamin E i mg/kg for prøven beregnes efter følgende formel:

[mg/kg]

hvor:

7.   Bemærkninger

8.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 15 % i relativ værdi (af det højeste resultat).

9.   Resultater af ringanalyse ( 31 )

C.   BESTEMMELSE AF MIKROMINERALERNE JERN, KOBBER, MANGAN OG ZINK

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme mikromineralerne jern, kobber, mangan og zink i foder. Bestemmelsesgrænserne er:

2.   Princip

Prøven opløses i saltsyre, efter at eventuelt organisk stof er destrueret. Jern, kobber, mangan og zink bestemmes efter en passende fortynding ved anvendelse af atomabsorptionsspektrofotometri.

3.   Reagenser

Indledning

Ved fremstillingen af reagenser og analyseopløsninger anvendes vand, som ikke indeholder de kationer, der skal bestemmes. Vandet renses enten ved en dobbelt destillation af vandet i et borsilikat- eller kvartsdestillationsapparat eller ved dobbelt behandling på ionbytter.

Reagenserne skal mindst være af analysekvalitet. Fravær af de mineraler, som skal bestemmes, kontrolleres ved blindbestemmelse. Om nødvendigt oprenses reagenserne yderligere.

I stedet for stamopløsninger, som beskrevet nedenfor, kan kommercielle stamopløsninger anvendes, på betingelse af at de kontrolleres før brug.

4.   Apparatur

5.   Fremgangsmåde ( 32 )

5.1.   Prøver indeholdende organisk stof

5.1.1.    Foraskning og fremstilling af prøveopløsningen til analyse ( 33 )

5.1.2.    Spektrofotometrisk bestemmelse

5.1.2.1.    Fremstilling af kalibreringsopløsninger

For hvert af de grundstoffer, som skal bestemmes, skal der ud fra arbejdsstandardopløsningerne 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 og 3.10.1 fremstilles en række kalibreringsopløsninger, hver med en HCl-koncentration på ca. 0,5 mol/liter og (for så vidt angår jern, mangan og zink) en lanthanchloridkoncentration svarende til 0,1 % La (w/v).

De valgte koncentrationer for mikromineraler skal ligge inden for det anvendte spektrofotometers følsomhedsområde. Som eksempler er i tabellerne nedenfor angivet sammensætningen af typiske rækker af kalibreringsopløsninger. Afhængigt af spektrofotometret og dets følsomhed kan det dog være nødvendigt at vælge andre koncentrationer

5.1.2.2.    Fremstilling af prøveopløsning til analyse

Til bestemmelse af kobber kan den opløsning, som er fremstillet efter punkt 5.1.1, normalt anvendes direkte. Hvis det er nødvendigt for at bringe dens koncentration ind i kalibreringsopløsningernes område, kan en alikvot mængde afpipetteres i en 100 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med 0,5 mol/liter saltsyre (3.3).

Til bestemmelse af jern, mangan og zink afpipetteres en alikvot mængde af den efter punkt 5.1.1 fremstillede opløsning i en 100 ml målekolbe, der tilsættes 10 ml lanthanchloridopløsning (3.11), og der fyldes op til mærket med 0,5 mol/liter saltsyre (3.3). (se også punkt 8, »Bemærkning«).

5.1.2.3.    Blindbestemmelse

Blindbestemmelsen skal indeholde alle trinene under fremgangsmåden, blot skal prøvematerialet udelades. Kalibreringsopløsning »0« må ikke anvendes som blind.

5.1.2.4.    Måling af atomabsorption

Atomabsorptionen for kalibreringsopløsningerne og den opløsning, der skal analyseres, måles ved anvendelse af en oxiderende luftacetylenflamme ved følgende bølgelængder:

Hver af målingerne gentages fire gange.

5.2.   Mineralfoder

Hvis prøven ikke indeholder organisk materiale, er forudgående foraskning unødvendig. Fremgangsmåden i punkt 5.1.1.1 følges, idet der startes fra andet afsnit. Fordampning i tilstedeværelse af flussyre kan udelades.

6.   Beregning af resultater

Ved anvendelse af en kalibreringskurve beregnes koncentrationen af mikromineralet i den opløsning, som skal analyseres, og resultatet angives i mg mikromineral pr. kg prøve (ppm).

7.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført af den samme person på den samme prøve må ikke overstige:

8.   Bemærkning

Tilstedeværelse af store mængder phosphater kan interferere på bestemmelsen af jern, mangan og zink. En sådan interferens skal korrigeres gennem tilsætning af lanthanchloridopløsning (3.11). Hvis imidlertid vægtforholdet Ca + Mg/P er > 2 i prøven, kan tilsætning af lanthanchlorid (3.11) til den opløsning, der skal analyseres, og til kalibreringsopløsningerne udelades.

D.   BESTEMMELSE AF HALOFUGINON

DL-trans-7-brom-6-chlor-3-[3-(3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]-quinazolin-4(3H)-on-hydrobromid

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af halofuginon i foder. Bestemmelsesgrænsen er 1 mg/kg.

2.   Princip

Efter behandling med varmt vand ekstraheres halofuginon som fri base med ethylacetat og separeres derefter som hydrochlorid over i en vandig syreopløsning. Ekstraktet oprenses ved ionbytningskromatografi. Indholdet af halofuginon bestemmes ved omvendt fase-HPLC med anvendelse af UV-detektor.

3.   Reagenser

4.   Apparatur

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Generelt

5.2.   Ekstraktion

10 g af den klargjorte prøve afvejes med en nøjagtighed på 0,1 g i et 200 ml centrifugeglas, hvorefter der tilsættes 0,5 g natriumascorbat (3.10), 0,5 g EDTA (3.13) og 20 ml vand og blandes. Centrifugeglasset anbringes i vandbad (80 oC) i 5 minutter. Efter afkøling til rumtemperatur tilsættes 20 ml natriumcarbonatopløsning (3.15) og blandes. Der tilsættes straks 100 ml ethylacetat (3.4), og glasset rystes kraftigt i hånden i 15 sekunder. Derefter anbringes glasset i 3 minutter i ultralydsbadet (4.1), og proppen løsnes. Der centrifugeres i 2 minutter, og ethylacetatfasen hældes gennem et glasfiberfilter (4.6) over i en 500 ml skilletragt. Ekstraktionen af prøven gentages med en ny portion på 100 ml ethylacetat. De samlede ekstrakter vaskes i 1 minut med 50 ml saltmættet natriumcarbonatopløsning (3.16), og den vandige fase kasseres.

Den organiske fase ekstraheres i 1 minut med 50 ml saltsyre (3.17). Den nederste syrefase aftappes i en 250 ml skilletragt. Den organiske fase ekstraheres igen i 1,5 minutter med yderligere 50 ml saltsyre og blandes med det første ekstrakt. De samlede syreekstrakter vaskes ved omrystning i ca. 10 sekunder med 10 ml ethylacetat (3.4).

Den vandige fase overføres kvantitativt til en 250 ml rundbundet kolbe, og den organiske fase kasseres. Al den resterende ethylacetat inddampes fra syreopløsningen ved brug af en rotationsfordamper (4.2). Vandbadets temperatur må ikke være over 40 oC. Under et vakuum på ca. 25 mbar vil al den resterende ethylacetat blive fjernet i løbet af 5 minutter ved 38 oC.

5.3.   Oprensning

5.3.1.    Klargøring af amberlitkolonnen

Der klargøres en XAD-2-kolonne for hvert prøveekstrakt. 10 g behandlet amberlit (3.19) overføres med methanol (3.8) til en glaskolonne (4.5). Der anbringes en lille tot glasuld på toppen af resinkolonnen. Methanolen aftappes fra kolonnen, og resinet vaskes med 100 ml vand, idet der standses, når væsken når toppen af resinkolonnen. Kolonnen henstår for at komme i ligevægt i 10 minutter inden brug. Man må aldrig lade kolonnen løbe tør.

5.3.2.    Oprensning af prøven

Ekstraktet (5.2) overføres kvantitativt til den klargjorte amberlitkolonne (5.3.1), og der elueres; eluatet kasseres. Elueringshastigheden må ikke være over 20 ml/minuttet. Den rundbundede kolbe skylles med 20 ml saltsyre (3.17), som derefter benyttes til at rense resinkolonnen. Eventuelt resterende syreopløsning fjernes med luft. Skyllevæskerne kasseres. 100 ml methanol (3.8) tilsættes til kolonnen, og 5–10 ml elueres; eluatet opsamles i en 250 ml rundbundet kolbe. Den resterende methanol henstår i 10 minutter for at komme i ligevægt med resinkolonnen, og elueringen fortsættes ved en hastighed på ikke over 20 ml/minuttet; eluatet opsamles i samme rundbundede kolbe. Methanolen inddampes på rotationsfordamperen (4.2); vandbadets temperatur må ikke være på over 40 oC. Remanensen overføres kvantitativt til en 10 ml målekolbe ved brug af den mobile fase (3.21). Der fyldes op til mærket med mobil fase og blandes. En alikvot mængde filtreres gennem et membranfilter (4.7). Denne opløsning gemmes til HPLC-bestemmelsen (5.4).

5.4.   HPLC-bestemmelse

5.4.1.    Parametre

Nedenstående betingelser er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater.

HPLC-kolonne (4.4.1)

Mobil fase til HPLC (3.21)

Flow: 1,5 –2 ml/minuttet

Detektionsbølgelængde: 243 nm

Injektionsvolumen: 40–100 μl.

Kromatografisystemets stabilitet kontrolleres, ved at der flere gange indsprøjtes kalibreringsopløsning (3.6.2) med 3,0 μg/ml, indtil der opnås konstante tophøjder (/-arealer) og retentionstider.

5.4.2.    Kalibreringskurve

Hver kalibreringsopløsning (3.6.2) indsprøjtes flere gange, og højden af toppene (arealerne) bestemmes for hver koncentration. Der tegnes en kalibreringskurve med kalibreringsopløsningernes middeltophøjder eller -arealer som ordinat og de tilsvarende koncentrationer i μg/ml som abscisse.

5.4.3.    Prøveopløsning

Prøveekstraktet (5.3.2) indsprøjtes flere gange, idet der benyttes samme mængde som til kalibreringsopløsningerne, og middeltophøjden (-arealet) af halofuginontoppene bestemmes.

6.   Beregning af resultater

Ud fra middelhøjden (-arealet) af prøveopløsningens halofuginontoppe bestemmes koncentrationen i prøveopløsningen i μg/ml ved benyttelse af kalibreringskurven (5.4.2).

Prøvens indhold af halofuginon w (mg/kg) beregnes efter følgende formel:

hvor:

7.   Validering af resultater

7.1.   Identitet

Analyttens identitet kan bekræftes ved ko-kromatografi eller ved at benytte en diodearraydetektor, hvormed spektrene for prøveekstraktet og kalibreringsopløsningen (3.6.2) indeholdende 6,0 μg/ml sammenlignes.

7.1.1.    Ko-kromatografi

Et prøveekstrakt spikes ved tilsætning af en passende mængde kalibreringsopløsning (3.6.2). Den tilsatte mængde halofuginon skal svare til den skønnede mængde halofuginon, der er fundet i prøveekstraktet.

Kun højden af halufuginontoppen må være blevet øget, efter at der er taget hensyn til både den tilsatte mængde og fortyndingen af ekstraktet. Toppens bredde skal i den halve højde ligge inden for ± 10 % af den oprindelige bredde.

7.1.2.    Diodearraydetektion

Resultaterne vurderes i overensstemmelse med følgende kriterier:

Hvis et af disse kriterier ikke er opfyldt, er analyttens tilstedeværelse ikke bekræftet.

7.2.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må højst være på 0,5 mg/kg for halofuginonindhold på op til 3 mg/kg.

7.3.   Genfinding

For den spikede blindprøve skal genfindingen være mindst 80 %.

8.   Resultater af ringanalyse

Der er gennemført en ringanalyse ( 34 ) hvor 3 prøver blev analyseret af 8 laboratorier.

E.   BESTEMMELSE AF ROBENIDIN

1,3-Bis[(4-chlorbenzyliden)amino]guanidinhydrochlorid

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af robenidin i foder. Bestemmelsesgrænsen er 5 mg/kg.

2.   Princip

Prøven ekstraheres med sur methanol. Ekstraktet tørres, og en alikvot mængde oprenses på en aluminiumoxidkolonne. Robenidinet elueres fra kolonnen med methanol og koncentreres, og rumfanget øges i passende grad ved tilsætning af mobil fase. Indholdet af robenidin bestemmes ved omvendt-fase-HPLC med anvendelse af UV-detektor.

3.   Reagenser

4.   Apparatur

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Generelt

5.2.   Ekstraktion

Ca. 15 g af den klargjorte prøve afvejes med en nøjagtighed på 0,01 g, overføres til en 250 ml konisk kolbe og tilsættes 100,0 ml sur methanol (3.2), hvorefter kolben tilproppes og rystes i 1 time på rysteapparatet (4.2). Opløsningen filtreres gennem et glasfiberfiltrerpapir (4.5), og hele filtratet opsamles i en 150 ml konisk kolbe. Der tilsættes 7,5 mg molekylsi (3.4), tilproppes og omrystes i 5 minutter. Derefter filtreres omgående gennem et glasfiberfiltrerpapir. Denne opløsning anvendes til oprensningsprocessen (5.3).

5.3.   Oprensning

5.3.1.    Klargøring af aluminiumoxidkolonnen

En lille prop af glasuld anbringes i den nedre ende af en glaskolonne (4.1) og skubbes helt ned med en glasstang. 11,0 g af den klargjorte aluminiumoxid (3.5) afvejes og overføres til kolonnen. Eksponeringen for luft begrænses mest muligt på dette stadium. Der bankes let på kolonnens nederste ende for at få aluminiumoxiden til at sætte sig.

5.3.2.    Prøveoprensning

Med pipette overføres 5,0 ml af det under (5.2) fremstillede prøveekstrakt til kolonnen. Man holder spidsen af pipetten nær kolonnevæggen og lader opløsningen absorbere af aluminiumoxiden. Robenidinet elueres fra kolonnen under anvendelse af 100 ml methanol (3.1) med en gennemstrømningshastighed på 2–3 ml/minuttet, og eluatet opsamles i en 250 ml rundbundet kolbe. Methanolopløsningen inddampes til tørhed under reduceret tryk ved 40 oC ved hjælp af en rotationsfordamper (4.3). Remanensen opløses i 3–4 ml mobil fase (3.8) og overføres kvantitativt til en 10 ml målekolbe. Kolben skylles med flere portioner på 1–2 ml mobil fase, som overføres til målekolben. Der fyldes op til mærket med samme opløsningsmiddel og blandes. En alikvot mængde filtreres gennem et 0,45 μm membranfilter (4.7). Denne opløsning gemmes til HPLC-bestemmelsen (5.4).

5.4.   HPLC-bestemmelse

5.4.1.    Parametre

Følgende betingelser er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater:

HPLC-kolonne (4.4.1)

Mobil fase til HPLC (3.8)

Flow: 1,5 –2 ml/minuttet

Detektorbølgelængde: 317 nm

Injektionsvolumen: 20–50 μl.