1)

I del A tilføjes følgende kapitel:

»A.25   DISSOCIATIONSKONSTANTER I VAND (TITRERINGSMETODE — SPEKTROFOTOMETRISK METODE — KONDUKTOMETRISK METODE)

INDLEDNING

Denne forsøgsmetode svarer til OECD-testvejledning (Test Guideline) 112 (1981).

Forudsætninger

Vejledning

Generelt om forsøgsmetoden

Standarddokumenter

Denne forsøgsmetode er baseret på metoder, der er anført i henvisningerne i afsnittet “Litteratur”, og i retningslinjerne af 18. august 1978, Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification EPA.

METODE — INDLEDNING, FORMÅL, ANVENDELSESOMRÅDE, RELEVANS, ANVENDELSE OG AFGRÆNSNING AF TESTEN

Dissociation af et stof i vand har betydning for at kunne vurdere dets indvirkning på miljøet. Det bestemmer stoffets form, som igen bestemmer dets adfærd og transport. Det kan påvirke kemikaliets adsorption på jord og sedimenter og absorption i biologiske celler.

Definitioner og enheder

Dissociation er reversibel opdeling i to eller flere kemiske bestanddele, som kan være ioniske. Processen kendes generelt ved

RX ⇌ R ++ X –

og koncentrationens ligevægtskonstant for reaktionen er

F.eks. i det særlige tilfælde, hvor R er hydrogen (stoffet er en syre), er konstanten

eller

Referencestoffer

Følgende referencestoffer er ikke påkrævet, hver gang et nyt stof skal undersøges. Formålet med dem er primært at sikre, at metoden til enhver tid kan kalibreres og give mulighed for at sammenligne resultaterne med andre anvendte metoder.

Det ville være nyttigt med et stof med flere pK'er som anført under Forsøgsmetodens princip nedenfor. Et sådant stof kunne være:

Forsøgsmetodens princip

Den beskrevne kemiske proces er generelt kun lidt temperaturafhængig i det miljømæssigt relevante temperaturområde. Bestemmelse af dissociationskonstanten kræver en måling af koncentrationerne af de dissocierede og udissocierede former af det kemiske stof. Ud fra viden om støkiometrien for dissociationsreaktionen, som er angivet under Definitioner og enheder ovenfor, kan den rigtige konstant beregnes. I det tilfælde, der er beskrevet lige netop i denne forsøgsmetode, opfører stoffet sig som en syre eller base, og bestemmelsen foretages nemmest ved at bestemme de relative koncentrationer af de ioniserede og ikke-ioniserede former af stoffet og opløsningens pH-værdi. Forholdet mellem disse betingelser er givet ved ligningen for pKa i Definitioner og enheder, se ovenfor. Nogle stoffer udviser mere end en dissociationskonstant, og tilsvarende ligninger kan udvikles. Nogle af de heri beskrevne metoder er også velegnede til ikke-syre/base-dissociation.

Kvalitetskriterier

Repeterbarhed

Dissociationskonstanten bør replikeres (mindst tre bestemmelser) med en nøjagtighed på ± 0,1 logenheder.

BESKRIVELSE AF TESTPROCEDURERNE

Der findes to grundlæggende metoder til bestemmelse af pKa. Den ene omfatter titrering af en kendt mængde af stoffet med standardsyre eller -base, alt efter hvad der er relevant. Den anden går ud på at finde frem til den relative koncentration af de ioniserede og ikke-ioniserede former og pH-afhængigheden.

Forberedelser

Metoder baseret på disse principper kan klassificeres som titrering, spektrofotometriske og konduktometriske procedurer.

Testopløsninger

Til titreringsmetoden og den konduktometriske metode bør det kemiske stof opløses i destilleret vand. Ved den spektrofotometriske metode og andre metoder anvendes bufferopløsninger. Koncentrationen af teststoffet bør ikke overstige den laveste værdi af 0,01 M eller halvdelen af mætningskoncentrationen, og ved fremstilling af opløsningerne bør der anvendes den reneste tilgængelige form af stoffet. Hvis stoffet kun er svagt opløseligt, kan det opløses i en lille mængde af et opløsningsmiddel, som er blandbart med vand, inden det tilsættes de ovenfor anførte koncentrationer.

Opløsninger bør kontrolleres for emulsioner ved hjælp af en Tyndall-stråle, især hvis der er anvendt et hjælpeopløsningsmiddel til at forbedre opløseligheden. Såfremt der anvendes bufferopløsninger, bør bufferkoncentrationen ikke overstige 0,05 M.

Testbetingelser

Temperatur

Temperaturen bør reguleres til mindst ± 1 °C. Bestemmelsen bør fortrinsvis udføres ved 20 °C.

Hvis der er mistanke om en betydelig temperaturafhængighed, bør bestemmelsen foretages ved mindst to andre temperaturer. Temperaturintervallerne bør i dette tilfælde være 10 °C og temperaturreguleringen ± 0,1 °C.

Analyser

Metoden vil afhænge af arten af det stof, der testes. Den skal være tilstrækkeligt følsom til, at de forskellige arter for hver koncentration af testopløsningen kan bestemmes.

Testens udførelse

Titreringsmetode

Testopløsningen bestemmes ved titrering med enten standardbase- eller standardsyreopløsningen, idet pH-værdien måles efter hver tilsætning af referenceopløsningen. Der bør foretages mindst 10 tilsætninger inden ækvivalenspunktet. Hvis der opnås ligevægt tilstrækkeligt hurtigt, kan der anvendes et registreringspotentiometer. Til denne metode skal både den samlede mængde af stoffet og dets koncentration kendes nøjagtigt. Der skal tages forholdsregler for at udelukke kuldioxid. Oplysninger om procedure, forholdsregler og beregning findes i standardtest, f.eks. henvisning (1), (2), (3) og (4).

Spektrofotometrisk metode

Bølgelængden er der, hvor de ioniserede og ikke-ioniserede former af stoffet har mærkbart forskellige ekstinktionskoefficienter. UV/VIS-absorptionsspektrummet er fremstillet af opløsninger af konstant koncentration i en pH-tilstand, hvor stoffet er i det væsentlige ioniseret og fuldt ud ioniseret med flere mellemliggende pH-værdier. Dette kan gøres ved enten at tilsætte flere portioner koncentreret syre (base) til en relativt stor mængde opløsning af stoffet i en flerkomponentbuffer, i første omgang ved høj (lav) pH (henvisning 5), eller ved at tilføje lige store mængder af en stamopløsning af stoffet i f.eks. vand, methanol, til konstante mængder af forskellige bufferopløsninger, der dækker det ønskede pH-interval. Ud fra pH- og absorbansværdier på den valgte bølgelængde beregnes et tilstrækkeligt antal værdier for pKa ved hjælp af data fra mindst fem pH-værdier, når stoffet er mindst 10 % og højst 90 % ioniseret. Yderligere forsøgsoplysninger og beregningsmetode findes i henvisning (1).

Konduktometrisk metode

Ved hjælp af en celle med en lille, kendt cellekonstant måles ledningsevnen for en opløsning af stoffet på ca. 0,1 M i vand til måling af ledningsevne. Ledningsevnen i en række nøjagtige fortyndinger af denne opløsning måles ligeledes. Koncentrationen halveres hver gang, og serien bør som minimum omfatte en størrelsesorden. Den begrænsende ledningsevne ved uendelig fortynding findes ved at gennemføre et lignende forsøg med Na-salt og ekstrapolere. Graden af dissociation kan derefter beregnes ud fra ledningsevnen for hver opløsning ved hjælp af Onsager-ligningen, og dermed kan dissociationskonstanten ved hjælp af Ostwalds fortyndingslov beregnes som K = α2C/(1 – α), hvor C er koncentrationen i mol pr. liter, og α er den dissocierede fraktion. Der skal tages forholdsregler for at udelukke kuldioxid. Yderligere forsøgsoplysninger og beregningsmetode findes i standardtekster og henvisning (1), (6) og (7).

DATA OG RAPPORTERING

Behandling af resultater

Titreringsmetode

PKa beregnes for 10 målte punkter på titreringskurven. Gennemsnit af og standardafvigelse for sådanne pKa-værdier beregnes. Der bør indgå et plot af pH-værdien over for mængden af standardbase eller -syre sammen med en tabelpræsentation.

Spektrofotometriske metoder

Absorbans og pH-værdi er opstillet for hvert spektrum. Mindst fem værdier for pKa beregnes ud fra de mellemliggende spektrale datapunkter, og gennemsnit af og standardafvigelse for resultaterne beregnes også.

Konduktometrisk metode

Den ækvivalente ledningsevne Λ beregnes for hver syrekoncentration og for hver koncentration af en blanding af en ækvivalent af syre plus 0,98 ækvivalent af carbonatfri natriumhydroxid. Der er et overskud af syre for at forhindre overskydende OH– på grund af hydrolyse. 1/Λ plottes i forhold til √C, og Λo af saltet kan findes ved ekstrapolering til nulkoncentration.

Λo af syren kan beregnes ved at anvende litteraturværdier for H+ og Na+. PKa kan beregnes ud fra α = Λi /Λo og Ka = α2C/(1 — α) for hver koncentration. Der kan opnås bedre værdier for Ka ved at korrigere for mobilitet og aktivitet. Gennemsnit af og standardafvigelse for pKa- værdierne bør beregnes.

Testrapport

Alle rådata og beregnede pKa-værdier bør indgives sammen med beregningsmetoden (helst i tabelformat som foreslået i henvisning 1) ligesom de ovenfor beskrevne statistiske parametre. For titreringsmetoder bør der gives oplysninger om standardisering af referenceopløsninger.

For den spektrofotometriske metode bør alle spektre fremlægges. For den konduktometriske metode bør der gives oplysninger om bestemmelsen af cellekonstant. Der bør gives oplysninger om anvendt teknik, analysemetoder og arten af eventuelle anvendte buffere.

Testtemperaturen eller testtemperaturerne bør rapporteres.

LITTERATUR

2)

Del B, kapitel B.5 affattes således:

»B.5   AKUT ØJENIRRITATION/-ÆTSNING

INDLEDNING

Denne forsøgsmetode svarer til OECD-testvejledning (Test Guideline (TG)) 405 (2012). OECD-testvejledningen om test af kemikalier (Test Guidelines for Testing of Chemicals) revideres regelmæssigt for at sikre, at de afspejler den bedste tilgængelige viden. I tidligere revisioner af denne testvejledning er der lagt særlig vægt på de forbedringer, som kan opnås ved at vurdere alle foreliggende oplysninger om testkemikaliet med henblik på at undgå unødvendige forsøg med laboratoriedyr og dermed komme betænkeligheder omkring dyrenes velfærd i møde. I TG 405 (som blev vedtaget i 1981 og ajourført i 1987, 2002 og 2012) indgår en anbefaling om, at man før iværksættelse af den beskrevne in vivo-test for akut øjenirritation/-ætsning bør gennemføre en weight-of-the-evidence-analyse (1) af foreliggende relevante data. Er de foreliggende data utilstrækkelige, anbefales det at udbygge dem ved sekventiel test (2) (3). Den anbefalede teststrategi, som omfatter validerede og anerkendte in vitro-test, er givet som supplement til denne forsøgsmetode. Med henblik på anvendelsen af forordning (EF) nr. 1907/2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for kemikalier (REACH) (2) omfatter den relevante ECHA-vejledning desuden en integreret teststrategi (21). Dyreforsøg bør kun foretages, hvis det vurderes nødvendigt efter gennemgang af tilgængelige alternative metoder og brug af de metoder, der anses for at være hensigtsmæssige. På tidspunktet for udarbejdelsen af denne ajourførte forsøgsmetode er der tilfælde, hvor det fortsat er nødvendigt eller påkrævet at anvende denne forsøgsmetode i henhold til visse lovrammer.

Den seneste ajourføring fokuserede primært på brug af analgetika og anæstetika uden at påvirke det grundlæggende koncept og strukturen i testvejledningen. ICCVAM (3) og et uafhængigt internationalt peer review-panel evaluerede anvendeligheden af og begrænsningerne for rutinemæssig brug af lokalanæstetika, systemiske analgetika og humane endepunkter ved in vivo-sikkerhedsundersøgelser af øjenirritation (12). Konklusionen på revisionen lød, at man ved at anvende lokalanæstetika og systemiske analgetika kan undgå de fleste eller alle smerter og lidelser uden at påvirke resultatet af testen, og det blev anbefalet, at disse stoffer altid anvendes. Denne forsøgsmetode tager hensyn til denne revision. Lokalanæstetika, systemiske analgetika og humane endepunkter bør anvendes rutinemæssigt ved akut øjenirritation og -ætsning i in vivo-test. Eventuelle undtagelser fra at bruge dem bør begrundes. Med forbedringerne i denne metode vil dyrenes smerter og lidelser i høj grad blive reduceret eller helt undgået i de fleste testsituationer, hvor der fortsat er behov for in vivo-øjensikkerhedstest.

Afbalanceret forebyggende smertebehandling bør omfatte i) rutinemæssig forbehandling med et lokalt anæstetikum (f.eks. proparacain eller tetracain) og et systemisk analgetikum (f.eks. buprenorphin), ii) rutinemæssig efterbehandling af systemiske analgetika (f.eks. buprenorphin og meloxicam), iii), planlagt observation, overvågning og registrering af dyrene for kliniske tegn på smerte og/eller lidelse og iv) planlagt observation, overvågning og registrering af arten og omfanget af samt udviklingen i alle øjenskader. Yderligere oplysninger kan findes i den ajourførte fremgangsmåde, som er beskrevet i det følgende. Efter indgivelse af testkemikaliet bør der ikke anvendes yderligere lokalanæstetika eller analgetika for at undgå forstyrrelser af forsøget. Analgetika med anti-inflammatorisk aktivitet (f.eks. meloxicam) bør ikke anvendes lokalt, og de systemisk anvendte doser bør ikke forstyrre virkningen på øjet.

Definitioner findes i tillægget til forsøgsmetoden.

INDLEDENDE OVERVEJELSER

Både den videnskabelige kvalitet og dyrenes velfærd fremmes ved, at in vivo-test ikke udføres, før alle relevante data om kemikaliets potentielle øjenætsende eller -irriterende egenskaber er vurderet ved en weight-of-the-evidence-analyse. Sådanne data består af dokumentation fra foreliggende undersøgelser hos mennesker og/eller laboratoriedyr, dokumentation for øjenætsende/-irriterende virkning af et eller flere strukturelt beslægtede stoffer eller af blandinger af sådanne stoffer, data, som viser, at kemikaliet er stærkt surt eller basisk (4) (5), og resultater af validerede og anerkendte in vitro- eller ex vivo-test for hudætsning og øjenætsning/-irritation (6) (13) (14) (15) (16) (17). Undersøgelserne kan være blevet foretaget forud for eller som følge af en weight-of-the-evidence-analyse.

For visse kemikalier kan en sådan analyse vise, at der er behov for in vivo-undersøgelser af, om kemikaliet eventuelt er øjenætsende/-irriterende. I alle sådanne tilfælde bør der først, inden man overvejer en in vivo-øjentest, helst foretages en undersøgelse af kemikaliets hudætsende virkning i in vitro- og/eller in vivo-test med efterfølgende vurdering i overensstemmelse med den sekventielle teststrategi i forsøgsmetode B.4 (7) eller den integrerede teststrategi i ECHA-vejledningen (21).

Denne forsøgsmetode omfatter en supplerende sekventiel teststrategi, som omfatter validerede in vitro- eller ex vivo-test af øjenætsning/-irritation i forbindelse med REACH, i ECHA-vejledningen (21). Det anbefales, at en sådan teststrategi følges, inden der foretages in vivo-test. For nye kemikalier anbefales en trinvis teststrategi til at indhente videnskabeligt forsvarlige oplysninger om kemikaliets ætsende/irriterende virkning. For eksisterende kemikalier, som ikke er tilstrækkelig undersøgt for hud- og øjenætsning/-irritation, kan strategien anvendes til at supplere de mangelfulde data. Anvendes en anden teststrategi eller -metode, eller beslutter man sig for ikke at følge den trinvise teststrategi, bør dette begrundes.

IN VIVO-TESTENS PRINCIP

Efter forbehandling med et systemisk analgetikum og induktion af et passende lokal anæstetikum, påføres det kemikalie, der skal testes, i en enkelt dosis til forsøgsdyrets ene øje; det ubehandlede øje tjener som kontrol. Graden af øjenirritation/-ætsning vurderes ved tildeling af scoreværdier til læsionerne af conjunctiva, cornea og iris med bestemte intervaller. Andre virkninger på øjet og systemiske negative virkninger beskrives ligeledes, således at man har en fuldstændig bedømmelse af virkningerne. Undersøgelsen bør strække sig over tilstrækkelig lang tid til, at virkningernes reversibilitet eller irreversibilitet kan vurderes.

Dyr, der på noget tidspunkt under testen viser tegn på stærk lidelse og/eller smerte eller læsioner, som svarer til de humane endepunkter, som er beskrevet i denne forsøgsmetode (jf. punkt 26), bør aflives humant, og kemikaliet bør vurderes tilsvarende. Kriterierne for at træffe beslutningen om human aflivning af døende og stærkt lidende dyr kan findes i en OECD-vejledning (8).

FORBEREDELSE TIL IN VIVO-TESTEN

Valg af art

Det foretrukne forsøgsdyr er albinokaninen, og der anvendes raske unge kønsmodne dyr. Anvendes andre arter, bør der fremlægges begrundelse herfor.

Forberedelse af dyr

På hvert af de foreløbigt udvalgte dyr bør begge øjne undersøges, højst 24 timer før testen begynder. Dyr, som udviser øjenirritation eller øjendefekter, eller som i forvejen har beskadiget cornea, bør ikke anvendes.

Miljø og fodringsbetingelser

Dyrene bør holdes i hvert sit bur. Temperaturen i forsøgslokalet bør være 20 °C (± 3 °C) for kaniner. Den relative luftfugtighed bør være mindst 30 % og helst ikke over 70 % bortset fra under rengøring af rummet, men 50-60 % bør tilstræbes. Belysningen bør være kunstig bestående af 12 timers lys og 12 timers mørke. Alt for høj lysintensitet bør undgås. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder og fri adgang til drikkevand.

TESTPROCEDURE

Brug af lokalanæstetika og systemiske analgetika

Det anbefales at følge nedenstående procedurer for at undgå eller minimere smerte og lidelse under testproceduren for øjensikkerhed. Alternative fremgangsmåder, som har vist sig at give lige så god eller bedre undgåelse eller lindring af smerte eller lidelse, kan anvendes.

Applikation af testkemikaliet

Testkemikaliet bør anbringes i conjunctivalsækken af det ene øje på hvert dyr, idet det nederste øjenlåg forsigtigt trækkes lidt ud fra øjeæblet. Derefter holdes øjenlågene sammen i ca. et sekund for at forhindre, at noget af materialet løber ud. Det ubehandlede øje fungerer som kontrol.

Skylning

I mindst 24 timer efter instillation af testkemikaliet bør der ikke foretages skylning af forsøgsdyrenes øjne, bortset fra faststof (jf. punkt 18) eller i tilfælde af øjeblikkeligt indsættende ætsende eller irriterende virkning. Efter 24 timer kan øjet skylles, hvis det anses for hensigtsmæssigt.

Anvendelse af en satellitgruppe af dyr til undersøgelse af virkningen af skylningen kan ikke anbefales, medmindre det er videnskabeligt begrundet. Er en satellitgruppe nødvendig, bør den bestå af to kaniner. Skylningsomstændighederne bør nøje dokumenteres, således skylningstidspunkt, skyllevæskens sammensætning og temperatur samt skylningens varighed, anvendt væskevolumen og -hastighed.

Dosisniveau

1)   Undersøgelse af væsker

Ved undersøgelse af væsker anvendes 0,1 ml. Der bør ikke anvendes pumpespray til direkte instillation af kemikaliet i øjet. I stedet bør væsken sprøjtes ud af sprayflasken og opsamles i et kar, før der instilleres 0,1 ml i øjet.

2)   Undersøgelse af faste stoffer

Ved undersøgelse af faste stoffer, pastaer og fintfordelte faste kemikalier bør der anvendes et volumen på 0,1 ml eller en vægtmængde på højst 100 mg. Testkemikaliet bør rives til finkornet støv. Partiklernes volumen bør måles efter let sammenpresning, f.eks. frembragt ved små slag på målekarret. Er det faste testkemikalie ikke forsvundet fra dyrets øje ad naturlig vej på det første observationstidspunkt en time efter behandlingen, kan øjet skylles med saltvand eller destilleret vand.

3)   Undersøgelse af aerosoler

Det anbefales, at alle pumpesprayprodukter og aerosoler opsamles før instillation i øjet. Den eneste undtagelse er kemikalier, som er under tryk i aerosolbeholdere og derfor ikke kan opsamles på grund af fordampning. I sådanne tilfælde bør øjet holdes åbent, og testkemikaliet indgives i øjet med et enkelt pust på ca. et sekund fra en afstand af 10 cm direkte foran øjet. Afstanden kan variere, afhængigt af trykket i aerosolbeholderen og dens indhold. Der bør drages omsorg for at undgå skade på øjet som følge af trykket i spraydåsen. I visse tilfælde kan der være brug for at vurdere potentialet for “mekanisk” skade på øjet forårsaget af forstøvningens styrke.

Den afgivne dosis fra aerosolbeholderen kan vurderes ved at simulere prøven på følgende måde: Kemikaliet sprøjtes på vejepapir gennem en åbning på størrelse med et kaninøje placeret umiddelbart foran papiret. Papirets vægtforøgelse anvendes som omtrentligt mål for den mængde, der tilføres øjet ved forstøvning. For flygtige kemikalier kan dosis vurderes ved vejning af den modtagende beholder før og efter udtagning af testkemikaliet.

Indledende test (in vivo-test af øjenirritation/-ætsning i et dyr)

Det anbefales stærkt, at in vivo-testen indledningsvist kun udføres i et dyr (se Supplement til denne forsøgsmetode: Sekventiel teststrategi for øjenirritation og ætsning). Observationerne bør give mulighed for at bestemme styrke og reversibilitet, inden der foretages en verifikationstest på et andet dyr.

Viser denne test, at kemikaliet virker ætsende eller stærkt irriterende på øjet ved brug af den beskrevne fremgangsmåde, bør der ikke udføres yderligere test for øjenirritation.

Verifikationstest (in vivo-øjenirritationstest i yderligere dyr)

Har den indledende test ikke vist ætsende eller stærkt irriterende virkning, bør den irriterende eller negative respons verificeres i indtil to yderligere dyr. Observeres der i den indledende test en stærkt irriterende virkning, anbefales det at udføre dette sekventielt i et dyr ad gangen frem for at eksponere yderligere to dyr samtidig. Udviser det andet dyr ætsning eller stærk irritation, standses testen. Hvis resultaterne fra det andet dyr er tilstrækkelige til, at der kan bestemmes en fareklassificering, bør der ikke udføres yderligere forsøg.

Observationsperiode

Observationsperioden bør være tilstrækkelig lang til, at de observerede virkningers omfang og reversibilitet kan vurderes fuldt ud. Testen bør imidlertid afsluttes, når som helst dyrene viser tegn på stærk smerte eller lidelser (8). For at bestemme reversibiliteten af virkningerne bør dyrene sædvanligvis observeres indtil 21 dage efter indgivelse af testkemikaliet. Observeres reversibilitet inden 21 dage, bør testen afsluttes på dette tidspunkt.

Kliniske observationer og klassificering af øjenrespons

Øjnene bør vurderes grundigt med henblik på tilstedeværelse eller fravær af øjenlæsioner, en time efter det kemiske stof er påført, efterfulgt af mindst en daglig evaluering. Dyrene bør evalueres flere gange dagligt i de første tre dage for at sikre, at beslutninger om at afslutte testen træffes i tide. Forsøgsdyrene bør under hele undersøgelsen vurderes regelmæssigt for kliniske tegn på smerte og/eller lidelse (f.eks. tager poterne op til øjet eller gnider i øjet, overdreven blinken, overdreven tåredannelse) (9) (10) (11) mindst to gange dagligt med mindst seks timer mellem observationerne eller om nødvendigt oftere. Dette er nødvendigt for at i) foretage en tilstrækkelig vurdering af, om dyrene viser tegn på smerte og lidelse, for at kunne træffe informerede beslutninger om behovet for at øge doseringen af analgetika og ii) vurdere, om dyrene viser tegn på etablerede humane endepunkter for at træffe informerede beslutninger om, hvorvidt det er hensigtsmæssigt at aflive dyrene humant, og sikre, at sådanne beslutninger træffes i tide. Fluoresceinfarvning bør anvendes rutinemæssigt, og der bør, hvor det findes hensigtsmæssigt (f.eks. til vurdering at skadens dybde ved ulceration af cornea), anvendes en spaltelampe som hjælp til at finde og måle skaden på øjet og vurdere, om de etablerede endepunktkriterier for human aflivning er opfyldt. Der kan indsamles digitale billeder af observerede læsioner til reference og som permanent registrering af omfanget af øjenskaden. Dyrene bør ikke forblive længere i forsøget, end indtil dette har givet definitive oplysninger. Dyr, som viser tegn på stærk lidelse og/eller smerte, bør omgående aflives humant, og testkemikaliet vurderes tilsvarende.

Når følgende øjenlæsioner optræder efter instillation af testkemikaliet, bør dyret aflives humant (se tabel 1 for at få en beskrivelse af læsionsgrader): perforation af cornea eller nævneværdig ulceration af cornea, herunder staphylom; blod i forreste øjenkammer; uklarhed af cornea af grad 4; manglende respons på lys (irisrespons grad 2), persisterende i 72 timer; ulceration af conjunctivaslimhinden; nekrose af conjunctivae eller blinkhinde; rynker i cornea. Begrundelsen herfor er, at sådanne læsioner sædvanligvis er irreversible. Endvidere anbefales det, at følgende øjenlæsioner anvendes som humane endepunkter for at afslutte undersøgelser inden udløbet af den planlagte obervationsperiode på 21 dage. Disse læsioner anses for at være tegn på svært irriterende eller ætsende skader og skader, som ikke forventes at reversere fuldt ud ved udgangen af den 21 dage lange observationsperiode: alvorlig dybde af skaden (f.eks. ulceration af cornea, der strækker sig ud over de overfladiske lag af stroma), limbusdestruktion > 50 % (påvist ved afblegning af conjunctivalvæv) og alvorlig øjeninfektion (purulent sekretion). En kombination af: vascularisation af overfladen af cornea (dvs. pannus); område med fluoresceinfarvning, der ikke mindskes over tid baseret på en daglig vurdering; og/eller manglende re-epithelialisering, fem dage efter testkemikaliet er påført, kan også betragtes som et potentielt nyttigt kriterium, der påvirker den kliniske beslutning om at afslutte undersøgelsen tidligt. Hver for sig er disse resultater imidlertid ikke tilstrækkelige til at afslutte undersøgelsen tidligt. Når der er identificeret en alvorlig øjenskade, bør en tilstedeværende eller kvalificeret laboratoriedyrlæge eller personale, som er uddannet til at identificere kliniske læsioner, konsulteres med henblik på en klinisk undersøgelse for at fastslå, om kombinationen af disse virkninger giver grund til at afslutte undersøgelsen tidligt. Graden af øjenrespons (conjunctivae, cornea og iris) bør indhentes og registreres 1, 24, 48 og 72 timer efter påføring af testkemikaliet (tabel 1). For dyr, som ikke udvikler øjenlæsioner, kan forsøget tidligst afsluttes tre dage efter instillation. Dyr med øjenlæsioner, der ikke er alvorlige, bør observeres, indtil læsionerne forsvinder, eller i 21 dage, på hvilket tidspunkt testen afsluttes. Observationerne bør foretages og registreres efter mindst 1 time, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 7 dage, 14 dage og 21 dage med henblik på at fastslå status for læsioner og deres reversibilitet eller irreversibilitet. Der bør foretages hyppigere observationer, hvis det er nødvendigt for at afgøre, hvorvidt forsøgsdyret bør aflives af humane grunde eller fjernes fra testen på grund af negative resultater.

Graden af øjenlæsioner (tabel 1) bør registreres ved hver undersøgelse. Alle andre læsioner i øjet (f.eks. pannus, farvning, ændringer i det forreste øjenkammer) og systemiske negative virkninger bør ligeledes rapporteres.

Undersøgelse af respons kan lettes ved brug af lup-briller, håndspaltelampe, binokulært mikroskop eller andre hensigtsmæssige hjælpemidler. Efter registrering af observationerne i 24 timer kan øjnene undersøges yderligere med fluorescein.

Klassificeringen af øjenrespons er nødvendigvis subjektiv. For at give en mere ensartet klassificering af øjenrespons og for at bistå prøvningslaboratorierne og dem, som foretager og fortolker observationerne, skal observationerne foretages af personer, som er tilstrækkeligt fortrolige med det anvendte score-system. Klassificeringen af øjenrespons foretages blindt.

DATA OG RAPPORTERING

Vurdering af resultater

Scoreværdierne for øjenirritation bør vurderes i tilknytning til læsionernes art, sværhedsgrad og reversibilitet eller manglende reversibilitet. De enkelte scoreværdier repræsenterer ikke en absolut standard for et kemikalies irritationsfremkaldende egenskaber, da andre virkninger af testkemikaliet ligeledes vurderes. I stedet bør de enkelte scoreværdier betragtes som vejledende værdier, som kun er meningsfulde, når de støttes af en fuldstændig beskrivelse og evaluering af alle observationer.

Testrapport

Testrapporten bør indeholde følgende oplysninger:

Fortolkning af resultaterne

Resultaterne af øjenirritationsundersøgelser i laboratoriedyr kan kun i begrænset omfang overføres til mennesker. I mange tilfælde er albinokaniner mere følsomme end mennesker for øjenirriterende eller -ætsende stoffer.

Fortolkning af data bør ske med forbehold, så man undgår at medtage irritation forårsaget af sekundær infektion.

LITTERATUR

Tabel 1

Klassificering af øjenskader

SUPPLEMENT TIL FORSØGSMETODE B.5  (4)

SEKVENTIEL TESTSTRATEGI FOR ØJENIRRITATION OG -ÆTSNING

Generelle betragtninger

Såvel hensynet til den videnskabelige kvalitet som til dyrenes velfærd taler for at undgå unødvendig brug af dyr og at minimere alle test, som kan forventes at fremkalde svære responser i dyr. Alle oplysninger om et kemikalies potentielle øjenætsende og -irriterende egenskaber bør vurderes, før in vivo-test overvejes. Der foreligger muligvis allerede tilstrækkelige vidnesbyrd til, at testkemikaliets potentiale for ætsning eller irritation af øjnene kan klassificeres, uden at der er behov laboratorieforsøg udført med dyr. Ved hjælp af weight-of-the-evidence-analyse og en sekventiel teststrategi kan behovet for in vivo-test således nedsættes til et minimum, navnlig når kemikaliet forventes at fremkalde svære responser.

Det anbefales, at de foreliggende oplysninger om kemikaliers øjenirriterende og -ætsende egenskaber vurderes ved weight-of-the-evidence-analyse for at afgøre, om der ud over in vivo-øjenundersøgelser bør udføres supplerende undersøgelser til nærmere karakterisering af et sådant potentiale. Når yderligere undersøgelser er nødvendige, anbefales det at benytte den sekventielle teststrategi til fastlæggelse af de relevante forsøgsdata. For ikke tidligere testede stoffer bør den sekventielle teststrategi anvendes til at fastlægge det sæt data, som er nødvendigt til vurdering af stoffets potentiale for øjenirritation/-ætsning. Den i dette bilag beskrevne indledende teststrategi er udviklet på en OECD-workshop (1). Den er senere blevet bekræftet og udvidet i form af Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, som vedtoges på det 28. fælles møde mellem OECD's kemikalieudvalg og arbejdsgruppe vedrørende kemikalier i november 1998 (2), og blev ajourført af en OECD-ekspertgruppe i 2011.

Skønt denne teststrategi ikke indgår som en del af forsøgsmetode B.5, er det den anbefalede strategi til bestemmelse af øjenirritation/-ætsning. Strategien repræsenterer både bedste praksis og en etisk standard for in vivo-test af øjenirritation/-ætsning. Forsøgsmetoden giver vejledning i udførelse af in vivo-test og sammenfatter de faktorer, som man bør tage i betragtning, før en sådant test overvejes. Strategien tilvejebringer en weight-of-the-evidence-metode til evaluering af foreliggende oplysninger om testkemikaliets øjenirriterende/-ætsende egenskaber og en trinvis fremgangsmåde til at generere relevante data om kemikalier, hvor der er behov for yderligere undersøgelse, eller som ikke er blevet undersøgt. Strategien indebærer, at der først udføres validerede og anerkendte in vivo- eller ex vivo-test, og derefter forsøgsmetode B.4, alt efter omstændighederne (3) (4).

Beskrivelse af den trinvise teststrategi

Før man iværksætter test som led i den sekventielle teststrategi (vist i figuren), bør alle foreliggende oplysninger vurderes for at afgøre nødvendigheden af in vivo-øjentest. Skønt vurdering af enkeltparametre (f.eks. ekstremt pH) i sig selv kan tænkes at give væsentlige oplysninger, bør alle de foreliggende oplysninger betragtes under ét. Som grundlag for en afgørelse baseret på weight-of-the-evidence bør alle relevante oplysninger om virkningerne af det pågældende kemikalie og dets strukturelle analoge stoffer evalueres, og en begrundelse for afgørelsen bør fremlægges. Primært bør foreliggende oplysninger om kemikaliets virkning på dyr og mennesker tillægges vægt, efterfulgt af resultaterne af in vivo- eller ex vivo-test. Når det på nogen måde er muligt, bør in vivo-undersøgelser af ætsende kemikalier undgås. I teststrategien bør følgende faktorer tages i betragtning;

EN STRATEGI FOR TEST OG VURDERING AF ØJENIRRITATION/-ÆTSNING

LITTERATUR

3)

Del B, kapitel B.10, affattes således:

»B.10    In vitro-test for kromosomaberrationer i celler fra pattedyr

INDLEDNING

Denne forsøgsmetode svarer til OECD-testvejledning (Test Guideline) 473 (2016). Den er en del af en række forsøgsmetoder vedrørende genetisk toksikologi. Der er udarbejdet et OECD-dokument med kortfattede oplysninger om test af genetisk toksikologi og en oversigt over de nylige ændringer af denne testvejledning (1).

Formålet med in vitro-testen for kromosomaberrationer er at påvise, om et kemikalie eller andet forårsager strukturelle kromosomafvigelser i dyrkede pattedyrceller (2) (3) (4). Der er to typer strukturændringer, kromosomtypen og kromatidtypen. Polyploidi (herunder endofordobling) kan opstå i kromosomaberrationsassays in vitro. Selv om aneugener kan fremkalde polyploidi, er polyploidi alene ikke tegn på aneugenpotentiale og kan ganske enkelt være tegn på forstyrrelse eller cytotoksicitet af cellecyklussen (5). Denne test er ikke beregnet til at måle aneuploidi. En in vitro-mikrokernetest (6) anbefales til påvisning af aneuploidi.

I in vitro-testen for kromosomaberrationer kan der benyttes kulturer af etablerede cellelinjer eller primære cellekulturer af human oprindelse eller gnaveroprindelse. Cellerne bør udvælges på grundlag af deres vækstegenskaber ved dyrkning, karotypens stabilitet (herunder kromosomtal) og hyppighed af spontane kromosomaberrationer (7). På nuværende tidspunkt gør de tilgængelige data det ikke muligt at fremlægge konkrete anbefalinger, men viser, at det i forbindelse med vurdering af kemiske farer er vigtigt at tage højde for status af p53, genetisk (karotypens) stabilitet, DNA-reparationskapacitet og oprindelse (gnavere eller mennesker) af de celler, der er udvalgt til test. Brugerne af denne forsøgsmetode opfordres således til at overveje, hvilken indflydelse disse og andre celleegenskaber har på, hvordan en cellelinje kan afsløre induktion af kromosomafvigelser, da der hele tiden fremkommer ny viden på dette område.

De anvendte definitioner er forklaret i tillæg 1.

INDLEDENDE OVERVEJELSER OG BEGRÆNSNINGER

Normalt kræver en in vitro-test, at der benyttes en eksogen metabolisk aktivering, medmindre cellerne er metabolisk kompetente i forhold til testkemikalierne Metabolismeaktiveringssystemet efterligner ikke fuldstændigt in vivo-forholdene. Man bør omhyggeligt undgå betingelser, der kunne føre til et artefakt positivt resultat, dvs. kromosomskade, der ikke skyldes direkte interaktion mellem testkemikaliet og kromosomer. Disse betingelser omfatter ændringer i pH eller osmolalitet (8) (9) (10), interaktion med mediets komponenter (11) (12) eller for højt cytotoksicitetsniveau (13) (14) (15) (16).

Denne test bruges til at registrere kromosomaberrationer, som kan hidrøre fra klastogene hændelser. Analysen af induktion af kromosomaberrationer bør foretages ved hjælp af celler i metafase. Det er derfor vigtigt, at celler bør opnå mitose i både behandlede og ubehandlede kulturer. For fremstillede nanomaterialer kan der være behov for særlige tilpasninger af denne forsøgsmetode, men disse er ikke beskrevet i denne forsøgsmetode.

Før forsøgsmetoden bruges på en blanding for at generere data til lovgivningsmæssige anvendelsesformål, bør det overvejes, om den vil give resultater, som er egnede til formålet, og i givet fald hvorfor. Sådanne overvejelser er ikke nødvendige, når der foreligger et myndighedskrav om test af blandingen.

PRINCIP FOR TESTEN

Cellekulturer fra mennesker eller andre pattedyr eksponeres for testkemikaliet både med og uden en eksogen metabolisk aktivering, medmindre der anvendes celler med en tilstrækkelig metaboliseringsevne (jf. punkt 13). Efter passende forud fastsatte tidsrum efter starten af eksponeringen for testkemikaliet behandles kulturerne med et metafasestandsende kemikalie (f.eks. colcemid eller colchicin), hvorefter de høstes og farves; dernæst undersøges metafasecellerne mikroskopisk for forekomst af aberration af kromatidtypen og kromosomtypen.

BESKRIVELSE AF METODEN

Forberedelser

Celler

Der kan benyttes en række forskellige cellelinjer (f.eks. ovarie fra kinesisk hamster (CHO), lunge fra kinesisk hamster V79, lunge fra kinesisk hamster (CHL)/IU, TK6) eller primære cellekulturer, herunder perifere blodlymfocytter fra mennesker eller andre pattedyr (7). Valget af anvendte cellelinjer bør begrundes videnskabeligt. Når der anvendes primære celler, bør det af hensyn til dyrevelfærden overvejes at anvende primære celler fra mennesker, hvis det er muligt, og disse bør indsamles i overensstemmelse med menneskelige etiske principper og regler. Perifere blodlymfocytter fra mennesker bør udtages fra unge (ca. 18-35 år), ikkerygende personer uden kendt sygdom eller nylige eksponeringer for genotoksiske stoffer (f.eks. kemikalier, ioniserende stråling) i et niveau, der vil øge baggrundsforekomsten af kromosomaberrationer. Det vil sikre en lav og konsekvent baggrundsforekomst af kromosomaberrationer. Den grundlæggende forekomst af kromosomaberrationer stiger med alderen, og denne tendens er mere markant hos kvinder end hos mænd (17) (18). Hvis celler fra mere end en donor pooles, bør antallet af donorer angives. Det er nødvendigt at påvise, at cellerne er delt fra begyndelsen af behandlingen med testkemikaliet til prøveudtagning. Cellekulturer fastholdes i en eksponentiel cellevækstfase (cellelinjer) eller stimuleres til at dele sig (primære kulturer af lymfocytter) for at eksponere cellerne på forskellige stadier i cellecyklussen, da cellefasernes følsomhed over for testkemikalierne muligvis ikke kendes. De primære celler, der skal stimuleres med mitogenstoffer for at dele sig, synkroniseres generelt ikke længere under eksponering for testkemikaliet (f.eks. humane lymfocytter efter en 48-timers stimulering med mitogen). Det anbefales ikke at bruge synkroniserede celler under behandlingen, men det kan accepteres, såfremt det er berettiget.

Medier og dyrkningsbetingelser

Til vedligeholdelse af kulturerne bør der benyttes egnede dyrkningsmedier og inkubationsbetingelser (dyrkningsflasker, fugtig atmosfære på 5 % CO2, hvor det er relevant, inkubationstemperatur på 37 °C). Cellelinjer bør kontrolleres regelmæssigt for et stabilt normalt kromosomtal og fravær af mykoplasmakontaminering (7) (19), og i tilfælde af kontaminering, eller hvis det normale kromosomtal har ændret sig, bør cellerne ikke anvendes. Den normale cyklustid for de cellelinjer eller primære kulturer, der benyttes i laboratoriet, bør være fastlagt og være i overensstemmelse med de offentliggjorte celleegenskaber (20).

Fremstilling af kulturer

Cellelinjer: Celler udtages fra stamkulturer og udsås i dyrkningsmedium med en sådan tæthed, at cellerne i suspension eller i encellede lag vil fortsætte med at vokse eksponentielt, indtil de høstes (f.eks. bør konfluens undgås for celler, der vokser i encellede lag).

Lymfocytter: Fuldblod, der er behandlet med antikoaguleringsmiddel (f.eks. heparin), eller fraseparerede lymfocytter dyrkes (f.eks. i 48 timer for humane lymfocytter) med tilstedeværelse af et mitogen [f.eks. phytohæmagglutinin (PHA) for humane lymfocytter] for at fremkalde celledeling inden eksponering for testkemikaliet.

Metabolisk aktivering

Eksogene metaboliserende systemer bør anvendes, når der gøres brug af celler med utilstrækkelige endogene metaboliske egenskaber. Det mest almindeligt anvendte system, der som standard anbefales, medmindre der er begrundelse for andet, er en cofaktorsuppleret postmitokondriefraktion (S9), der fremstilles af levere fra gnavere (normalt rotter), der har været behandlet med enzyminducerende stoffer såsom Aroclor 1254 (21) (22) (23) eller en blanding af phenobarbiton og β-naphthoflavon (24) (25) (26) (27) (28) (29). Sidstnævnte blanding er ikke i strid med Stockholmkonventionen om persistente organiske miljøgifte (30) og har vist sig at være lige så effektiv som Aroclor 25 til induktion af oxidaser med blandet funktion (24) (25) (26) (28). S9-fraktionen anvendes normalt i en koncentration på 1-2 % (v/v), men kan øges til 10 % (v/v) i det færdige testmedium. Brug af produkter, der nedsætter mitoseindekset, især calciumkompleksdannere (31), bør undgås under behandlingen. Valget af type og koncentration af exogent metabolismeaktiveringssystem eller anvendte metaboliske inducerende stoffer kan påvirkes af den testede kemikaliegruppe.

Præparering af testkemikaliet

Testkemikalier i fast form bør præpareres i passende opløsningsmidler og eventuelt fortyndes inden behandling af cellerne (jf. punkt 23). Testkemikalier i væskeform kan enten tilsættes direkte til testsystemet og/eller fortyndes inden behandlingen af testsystemet. Gasser og flygtige testkemikalier bør testes ved passende modifikation af standardprotokollerne, f.eks. i forseglede dyrkningsflasker (32) (33) (34). Der bør laves præparater af testkemikaliet lige inden behandlingen, medmindre stabilitetsdata påviser, at opbevaring er acceptabelt.

Testbetingelser

Opløsningsmidler

Opløsningsmidlet bør vælges for at optimere testkemikaliets opløselighed uden at påvirke assayets adfærd negativt, f.eks. ved at ændre cellevækst, påvirke integriteten af testkemikaliet, reagere med dyrkningsflasker eller forringe metabolismeaktiveringssystemet. Det anbefales så vidt muligt først at overveje at anvende et vandigt opløsningsmiddel (eller dyrkningsmedium). Veletablerede opløsningsmidler er f.eks. vand eller dimethylsulfoxid. Organiske opløsningsmidler bør generelt ikke overstige 1 % (v/v), og vandige opløsningsmidler (saltvand eller vand) bør ikke overstige 10 % (v/v) i det færdige behandlingsmedium. Hvis der anvendes ikke-veletablerede opløsningsmidler (f.eks. ethanol eller acetone), bør brugen af dem underbygges med data, der viser deres kompatibilitet med testkemikalier, testsystemet og fraværet af genetisk toksicitet ved den anvendte koncentration. Uden disse understøttende data er det vigtigt at medtage ubehandlede kontroller (jf. tillæg 1) for at påvise, at det valgte opløsningsmiddel ikke frembringer skadelige eller klastogene virkninger.

Måling af celleproliferation og cytotoksicitet og valg af behandlingskoncentrationer

Ved valg af højeste koncentration af testkemikaliet bør man undgå koncentrationer, der kan frembringe en artefakt positiv respons, f.eks. koncentrationer, der frembringer for høj cytotoksicitet (jf. punkt 22), udfældning i dyrkningsmediet (jf. punkt 23) eller væsentlige ændringer i pH eller osmolalitet (jf. punkt 5). Hvis testkemikaliet frembringer en væsentlig ændring i mediets pH på tilsætningstidspunktet, kan pH-værdien justeres ved bufring af det endelige behandlingsmedium for at undgå et artefakt positivt resultat og for at opretholde passende dyrkningsbetingelser.

Målinger af celleproliferation foretages for at sikre, at et passende antal af de behandlede celler har undergået mitose under testen, og at behandlingerne udføres med passende cytotoksicitet (jf. punkt 18 og 22). Cytotoksiciteten bør bestemmes med og uden metabolismeaktivering i hovedforsøget ved hjælp af en passende indikator for celledød og -vækst. Evaluering af cytotoksicitet i en indledende test kan være nyttig for at sikre en bedre definition af de koncentrationer, der skal anvendes i hovedforsøg, men en indledende test er ikke obligatorisk. Hvis en sådan test udføres, bør den ikke erstatte måling af cytotoksicitet i hovedforsøget.

Relativ populationsfordobling (RPD) eller relativ forøgelse af celletal (RICC) er passende metoder til vurdering af cytotoksicitet i cytogenetiske test (13) (15) (35) (36) (55) (jf. formlerne i tillæg 2). I tilfælde af langtidsbehandling og prøveudtagning efter et tidsrum, der svarer til 1,5 gange normal cellecykluslængde regnet fra behandlingens begyndelse (dvs. længere end 3 cellecykluslængder i alt), kan anvendelsen af RPD føre til, at cytotoksiciteten undervurderes (37). Under disse omstændigheder kan RICC være et bedre mål, eller evaluering af cytotoksicitet efter 1,5 gange normal cellecykluslængde kunne være et nyttigt estimat ved brug af RPD.

For lymfocytter i primærkulturer er mitoseindekset (MI) et mål for cytotoksisk/cytostatisk virkning, men påvirkes af, hvor længe efter behandlingen det måles, det anvendte mitogen og mulige forstyrrelser af cellecyklussen. MI er imidlertid acceptabelt, da andre cytotoksicitetsmålinger kan være både besværlige og upraktiske og ikke nødvendigvis gælder for målpopulationen af lymfocytter, der vokser som reaktion på PHA-stimulering.

Mens RICC og RPD for cellelinjer og MI for primærkulturer af lymfocytter er de anbefalede cytotoksicitetsparametre, kan andre indikatorer (f.eks. celleintegritet, apoptose, nekrose, cellecyklus) give nyttige supplerende oplysninger.

Mindst tre testkoncentrationer (herunder ikke opløsningsmiddel og positive kontroller), der opfylder acceptkriterierne (passende cytotoksicitet, antal celler mv.), bør vurderes. Uanset hvilke typer celler (cellelinjer eller primærkulturer af lymfocytter), det drejer sig om, kan der ved hver af de testede koncentrationer anvendes enten replikate eller enkelte behandlede kulturer. Selv om det anbefales at benytte duplikate kulturer, accepteres anvendelse af enkeltkulturer også, forudsat at det samme totale celleantal scores i enten enkeltkulturer eller dublikate kulturer. Brug af enkeltkulturer er især relevant ved vurdering af mere end tre koncentrationer (jf. punkt 31). De resultater, der er opnået i uafhængige replikate kulturer i en given koncentration, kan samles med henblik på dataanalyse (38). For testkemikalier, der udviser ringe eller ingen cytotoksicitet, vil koncentrationsintervaller på ca. 2 til 3 gange normalt være egnede. Hvis der forekommer cytotoksicitet, bør de valgte testkoncentrationer dække et interval fra det, der frembringer cytotoksicitet som beskrevet i punkt 22, til koncentrationer, hvor der er en beskeden og ringe eller ingen cytotoksicitet. Mange testkemikalier udviser kraftige koncentration/respons-kurver, og for at indhente data ved lav og moderat cytotoksicitet eller undersøge dosis/respons-forholdet nærmere vil det være nødvendigt at bruge mere samlede koncentrationer og/eller mere end tre koncentrationer (enkeltkulturer eller replikater), navnlig i situationer, hvor der er behov for at gentage forsøget (jf. punkt 47).

Hvis den højeste koncentration er baseret på cytotoksicitet, bør den højeste koncentration sigte mod at opnå 55 ± 5 % cytotoksicitet ved hjælp af de anbefalede cytotoksicitetsparametre (dvs. reduktion af RICC og RPD for cellelinjer og reduktion af MI for primærkulturer af lymfocytter til 45 ± 5 % af den sideløbende negative kontrol). Man bør være omhyggelig med at fortolke positive resultater, der kun findes i den høje ende af dette cytotoksicitetsområde på 55 ± 5 % (13).

For tungtopløselige testkemikalier, der ikke er cytotoksiske ved koncentrationer, der er lavere end den laveste uopløselige koncentration, bør den højeste analyserede koncentration producere uklarheder eller bundfald, som er synligt med det blotte øje eller ved hjælp af et inverteret mikroskop efter afslutningen af behandlingen med testkemikaliet. Selv om der forekommer cytotoksicitet over den laveste uopløselige koncentration, tilrådes det at gennemføre testen ved kun en koncentration, der frembringer uklarhed eller synligt bundfald, fordi artefakte virkninger kan skyldes bundfaldet. Ved den koncentration, der frembringer bundfald, bør det omhyggeligt sikres, at bundfaldet ikke griber forstyrrende ind i udførelsen af testen (f.eks. farvning eller scoring). Det kan være nyttigt at bestemme opløseligheden i dyrkningsmediet inden forsøget.

Hvis der ikke observeres bundfald eller begrænsende cytotoksicitet, bør testkoncentrationen højst være 10 mM, 2 mg/ml eller 2 μl/ml (den laveste af de tre) (39) (40) (41). Hvis testkemikaliets sammensætning ikke er defineret, f.eks. et stof af ukendt eller variabel sammensætning, komplekse reaktionsprodukter eller biologiske materialer (UVCB) (42), miljømæssige udtræk mv., kan der være behov for at øge den højeste koncentration (f.eks. 5 mg/ml) ved manglende tilstrækkelig cytotoksicitet for at øge koncentrationen af hver af komponenterne. Det bør dog bemærkes, at disse krav kan variere for humanlægemidler (43).

Kontroller

Der bør i hver høst indgå samtidige negative kontrolprøver (jf. punkt 15), hvor behandlingsmediet kun består af opløsningsmiddel, og som behandles på samme måde som de øvrige kulturer.

Der skal foretages samtidige positive kontroller for at påvise, at laboratoriet er i stand til at identificere klastogener i henhold til testprotokollen og effektiviteten af det exogene metabolismeaktiveringssystem, hvor det er relevant. Eksempler på positive kontroller er anført i tabel 1 nedenfor. Alternative positive kontrolkemikalier kan anvendes, hvis der er belæg for det. Fordi in vitro-test af pattedyrceller for genetisk toksicitet er tilstrækkeligt standardiserede, kan brug af positive kontroller begrænses til et klastogen, som kræver metabolisk aktivering. Forudsat at det sker samtidig med den ikke-aktiverede test med samme behandlingsvarighed, vil den positive kontrolrespons påvise både aktiviteten i metabolismeaktiveringssystemet og testsystemets reaktionsevne. Langtidsbehandling (uden S9) bør dog have sin egen positive kontrol, da behandlingens varighed er forskellig fra testen med metabolismeaktivering. Hver positiv kontrol bør anvendes ved en eller flere koncentrationer, der forventes at give reproducerbare og påviselige forøgelser i forhold til baggrundsværdierne for at påvise testsystemets følsomhed (dvs. virkningerne er tydelige, uden at de kodede objektglas' identitet umiddelbart afsløres for den, der aflæser dem), og responsen bør ikke bringes i fare på grund af cytotoksicitet, der overskrider de grænser, der er fastsat i forsøgsmetoden.

Tabel 1.

Anbefalede referencekemikalier til vurdering af laboratoriets kompetence og udvælgelse af positive kontroller.

FREMGANGSMÅDE

Behandling med testkemikalie

Celler under formering behandles med testkemikaliet med og uden tilstedeværelse af et metabolismeaktiveringssystem.

Høst af kulturer

For at opnå en grundig evaluering, hvilket er en forudsætning for at kunne konkludere, at resultatet er negativt, bør alle tre følgende forsøgsbetingelser udføres med en kortvarig behandling med og uden metabolisk aktivering og langtidsbehandling uden metabolisk aktivering (jf. punkt 43, 44 og 45):

I tilfælde af, at en af ovenstående forsøgsbetingelser fører til et positivt svar, er det muligvis ikke nødvendigt at undersøge nogen af de andre behandlinger.

Præparering af kromosomer

Cellekulturerne behandles med colcemid eller colchicin normalt 1-3 timer før høst. Høst og kromosompræparering skal foregå særskilt for hver enkelt kultur. Kromosompræpareringen består i hypotonisk behandling af cellerne, fiksering og farvning (1). I encellede lag kan der være mitotiske celler (runde celler, der er løsrevet fra overfladen) til stede efter eksponeringen på 3-6 timer. Da disse mitotiske celler let løsrives, kan de gå tabt, når mediet med testkemikaliet fjernes. Hvis der er grund til at tro, at der sker en betydelig stigning i antallet af mitotiske celler i forhold til kontrollerne, hvilket er tegn på sandsynlig mitosestandsning, bør cellerne indsamles ved centrifugering og gentilsættes kulturerne for ikke at miste celler, der er i mitose, og hvor der er risiko for kromosomaberration på høsttidspunktet.

Analyse

Alle objektglas, herunder fra positive og negative kontrolprøver, bør kodes uafhængigt inden mikroskopering for kromosomaberrationer. Da fikseringen ofte medfører, at en del af metafasecellerne går i stykker, og kromosomerne går tabt, bør scorede celler indeholde et antal centromerer svarende til kromosomtallet ± 2.

Mindst 300 velpræparerede metafaser bør scores pr. koncentration og kontrol, for at det kan konkluderes, at et testkemikalie er klart negativt (jf. punkt 45). De 300 celler bør fordeles ligeligt mellem replikaterne, når der benyttes replikate kulturer. Benyttes enkeltkulturer pr. koncentration (jf. punkt 21), bør mindst 300 velpræparerede metafaser scores i denne enkeltkultur. Scoring af 300 celler har den fordel, at testens statistiske power øges, og desuden ses nulværdier sjældent (forventes at være blot 5 %) (44). Antallet af bedømte metafaser kan reduceres, hvis der observeres store mængder celler med kromosomaberrationer, og testkemikaliet anses for at være tydeligt positivt.

Celler med strukturelle kromosomaberrationer med og uden gaps bør scores. Brud og gaps er defineret i tillæg 1 i henhold til (45) (46). Aberrationer af kromatid- og kromosomtypen bør registreres særskilt og klassificeres i undertyper (brud, udveksling). De procedurer, der anvendes i laboratoriet, bør sikre, at analyser af kromosomaberrationer udføres af veluddannede bedømmere og eventuelt underkastes peer review.

Selv om testens formål er at påvise ændringer i kromosomstrukturen, er det vigtigt også at notere frekvensen af polyploidi og endofordobling, hvis dette konstateres (jf. pkt. 2).

Laboratoriets kompetencer

For at få tilstrækkelig erfaring med testen, før den tages i brug til rutinetest, bør laboratoriet have udført en række forsøg med positive referencekemikalier, som virker via forskellige mekanismer, og forskellige negative kontroller (ved hjælp af forskellige opløsningsmidler/bærestoffer). Disse positive og negative kontrolresponser bør være i overensstemmelse med litteraturen. Dette gælder ikke for laboratorier, der har opsamlet erfaring, dvs. som har en historisk database til rådighed som defineret i punkt 37.

Et udvalg af positive kontrolkemikalier (jf. tabel 1 i punkt 26) bør undersøges med korte og lange behandlinger uden metabolismeaktivering samt med kort behandling med metabolismeaktivering med henblik på at kunne påvise evnen til at spore klastogene kemikalier og vurdere effektiviteten af metabolismeaktiveringssystemet. Der bør vælges en række koncentrationer af de udvalgte kemikalier, som giver en reproducerbar og koncentrationsafhængig stigning over baggrunden for at påvise testsystemets følsomhed og dynamiske rækkevidde.

Historiske kontroldata

Laboratoriet bør fastlægge:

Når der første gang indhentes data til en historisk negativ kontrolfordeling, bør de samtidige negative kontroller stemme overens med offentliggjorte kontroldata, hvis sådanne findes. Efterhånden som der tilføjes flere eksperimentelle data til kontrolfordelingen, bør de samtidige negative kontroller ideelt set ligge inden for kontrolgrænsen på 95 % af denne fordeling (44) (47). Laboratoriets database over historiske negative kontroller bør i første omgang opbygges med mindst 10 forsøg, men fortrinsvis bestå af mindst 20 forsøg udført under sammenlignelige forsøgsbetingelser. Laboratorierne bør anvende kvalitetskontrolmetoder som f.eks. kontrolkort (f.eks. C-diagrammer eller X-søjlediagrammer (48)) til at fastslå, hvor variable deres positive og negative kontroldata er, samt vise, at metodologien er “under kontrol” i deres laboratorium (44). Yderligere anbefalinger til, hvordan man opbygger og anvender de historiske data (dvs. kriterier for optagelse og udelukkelse af historiske data og acceptkriterier for et givent forsøg), kan findes i litteraturen (47).

Der bør tages hensyn til eventuelle ændringer af forsøgsprotokollen med hensyn til, om de stemmer overens med laboratoriets eksisterende historiske kontroldatabaser. Ved større uoverensstemmelser bør der etableres en ny historisk kontroldatabase.

Negative kontroldata bør bestå af forekomsten af celler med kromosomaberrationer fra en enkeltkultur eller summen af replikate kulturer som beskrevet i punkt 21. Sideløbende negative kontroller bør ideelt set ligge inden for kontrolgrænsen på 95 % af fordelingen af laboratoriets historiske negative kontroldatabase (44) (47). Såfremt data fra sideløbende negative kontroller falder uden for kontrolgrænsen på 95 %, kan de eventuelt optages i den historiske kontrolfordeling, så længe disse data ikke er ekstreme afvigende værdier, og der er dokumentation for, at testsystemet er “under kontrol” (jf. punkt 37) og for, at der ikke er begået tekniske eller menneskelige fejl.

DATA OG RAPPORTERING

Præsentation af resultaterne

Den procentdel af cellerne, som har en eller flere strukturelle kromosomaberrationer, bør vurderes. Aberrationer af kromatid- og kromosomtypen klassificeret ved undertyper (brud, udvekslinger) bør anføres særskilt med antal og hyppighed for forsøgs- og kontrolkulturer. Gaps registreres og oplyses særskilt, men medregnes ikke i den totale aberrationshyppighed. Procentdelen af polyploidi og/eller endofordoblede celler rapporteres, når den ses.

Sideløbende målinger af cytotoksicitet for alle behandlede, negative og positive kontrolkulturer i hovedforsøget bør ligeledes registreres.

Der anføres data for hver enkelt kultur. Desuden sammenfattes alle data i tabelform.

Acceptkriterier

Accept af en test er baseret på følgende kriterier:

Evaluering og fortolkning af resultater

Såfremt alle acceptkriterier er opfyldt, anses et testkemikalie for at være klart positivt, hvis følgende er opfyldt i en af de undersøgte forsøgsbetingelser (jf. punkt 28):

Når alle disse kriterier er opfyldt, anses testkemikaliet for at kunne fremkalde kromosomaberrationer i de dyrkede pattedyrceller i dette testsystem. Anbefalinger til de mest hensigtsmæssige statistiske metoder kan findes i litteraturen (49) (50) (51).

Såfremt alle acceptkriterier er opfyldt, anses et testkemikalie for at være klart negativt, hvis følgende er opfyldt i alle de undersøgte forsøgsbetingelser (jf. punkt 28):

Testkemikaliet anses derefter for ikke at kunne fremkalde kromosomaberrationer i de dyrkede pattedyrceller i dette testsystem.

Der er ikke krav om verifikation af en klart positiv eller negativ respons.

Hvis responsen hverken er klart negativ eller positiv som beskrevet ovenfor eller for at bidrage til at fastslå den biologiske relevans af et resultat, bør dataene evalueres af eksperter, og/eller der bør foretages yderligere undersøgelser. Scoring af yderligere celler (hvor det er relevant) eller et nyt forsøg, eventuelt med ændrede forsøgsbetingelser (f.eks. koncentrationsinterval, andre metabolismeaktiveringsbetingelser (dvs. S9-koncentration eller S9-oprindelse) kan være nyttigt.

I sjældne tilfælde, selv efter yderligere undersøgelser, giver dataene ikke mulighed for at konkludere, om resultaterne er positive eller negative; konklusionen er derfor, at testkemikalieresponsen er tvetydig.

En forøgelse i antallet af polyploide celler kan være tegn på, at testkemikaliet er i stand til at inhibere mitoseprocesser og fremkalde kromosomantalsaberrationer (52). En forøgelse af antallet af celler med endofordoblede kromosomer kan være tegn på, at testkemikaliet kan inhibere cellecyklussens forløb (53) (54) (jf. punkt 2). Forekomsten af polyploide celler og celler med endofordoblede kromosomer bør derfor registreres særskilt.

Testrapport

Testrapporten bør indeholde følgende oplysninger:

LITTERATUR

Tillæg 2

FORMLER FOR VURDERING AF CYTOTOKSICITET

Mitoseindeks (MI):

Relativ forøgelse af celletal (RICC) eller relativ populationsfordobling (RPD) anbefales, da der ved begge metoder tages højde for den andel af cellepopulationen, som har delt sig.

hvor:

Populationsfordobling = [log (celleantal efter behandling ÷ oprindeligt celleantal)] ÷ log 2

En RICC eller RPD på 53 % viser f.eks. 47 % cytotoksicitet/cytostase, og 55 % cytotoksicitet/cytostase målt ved MI betyder, at det faktiske MI er 45 % af kontrollen.

Under alle omstændigheder bør antallet af celler inden behandling måles, og det samme gør sig gældende for behandlede og negative kontrolkulturer.

Selv om RCC (dvs. antal celler i behandlede kulturer/antal celler i kontrolkulturer) tidligere er blevet brugt som cytotoksicitetsparameter, anbefales dette ikke længere, da cytotoksiciteten kan undervurderes.

I de negative kontrolkulturer bør populationsfordobling være kompatibel med kravet om at tage prøver af celler efter behandlingen på et tidspunkt svarende til ca. 1,5 gange længden af den normale cellecyklus, og mitoseindekset bør være højt nok til at få et tilstrækkeligt antal celler i mitose og til at kunne beregne en reduktion på 50 % pålideligt.

4)

Del B, kapitel B.11, affattes således:

»B.11   Test for kromosomaberrationer i knoglemarv hos pattedyr

INDLEDNING

Denne forsøgsmetode svarer til OECD-testvejledning (Test Guideline) 475 (2016). Den er en del af en række forsøgsmetoder vedrørende genetisk toksikologi. Der er udarbejdet et OECD-dokument med kortfattede oplysninger om test af genetisk toksikologi og en oversigt over de nylige ændringer af denne testvejledning (1).

In vivo-testen for kromosomaberrationer i knoglemarv hos pattedyr er navnlig relevant ved vurdering af genotoksicitet, da faktorer for in vivo-metabolisme, farmakokinetik og DNA-reparationsprocesser er aktive og bidrager til responserne, selv om de kan være forskellige fra art til art. En in vivo-test er ligeledes nyttig til yderligere undersøgelse af genotoksicitet, der er påvist ved en in vitro-test.

In vitro-testen for kromosomaberrationer hos pattedyr benyttes til at påvise, om et testkemikalie forårsager strukturelle kromosomafvigelser i knoglemarvceller hos dyr, normalt gnavere (2) (3) (4) (5). Der er to typer aberrationer af kromosomstrukturen, kromosomtypen og kromatidtypen. De fleste genotoksiske aberrationer er af kromatidtypen, men også aberrationer af kromosomtypen forekommer. Beskadigelse af kromosomer og lignende er årsag til mange genetiske sygdomme hos mennesker, og meget tyder på, at disse læsioner og lignende, som ændrer på onkogener og tumorsuppressorgener i somatiske celler, medvirker til induktion af kræft hos mennesker og i forsøgssystemet. Polyploidi (herunder endofordobling) kan opstå i kromosomaberrationsassays in vivo. En stigning i polyploidi alene er imidlertid ikke tegn på aneugenpotentiale og kan ganske enkelt være tegn på forstyrrelse eller cytotoksicitet af cellecyklussen. Denne test er ikke beregnet til at måle aneuploidi. En in vivo-test for mikrokerner i erythrocytter hos pattedyr (kapitel B.12 i dette bilag) eller en in vitro-test for mikrokerner i celler hos pattedyr (kapitel B.49 i dette bilag) vil være henholdsvis den in vivo- og in vitro-test, som anbefales til påvisning af aneuploidi.

Definitioner af den anvendte terminologi findes i tillæg 1.

INDLEDENDE OVERVEJELSER

Der anvendes rutinemæssigt gnavere i denne test, men andre arter kan i visse tilfælde være hensigtsmæssige, såfremt det er videnskabeligt begrundet. Knoglemarv er målvævet i denne test, da det er et væv med høj vaskularisation, der består af celler med kort cyklustid, som er lette at isolere og behandle. Den videnskabelige begrundelse for at bruge andre arter end rotter og mus bør anføres i rapporten. Hvis der anvendes andre arter end gnavere, anbefales det at integrere målingen af kromosomaberrationer i knoglemarv i en anden passende toksicitetstest.

Hvis der er grund til at tro, at testkemikaliet eller dets metabolit(ter) ikke vil nå frem til målvævet, er denne test ikke egnet.

Før brug af forsøgsmetoden til lovmæssig test af en blanding til generering af data bør det overvejes, om den vil give resultater, som er egnede til formålet, og i givet fald hvorfor. Sådanne overvejelser er ikke nødvendige, når der foreligger et myndighedskrav om test af blandingen.

PRINCIPPET FOR FORSØGSMETODEN

Dyrene eksponeres for testkemikaliet på passende vis og aflives humant et passende tidsrum efter eksponeringen. Inden aflivningen behandles dyrene med et metafasestandsende stof (f.eks. colchicin eller colcemid). Der fremstilles derefter præparater af knoglemarvceller, som farves, og metafasecellerne undersøges for kromosomaberrationer.

KONTROL AF LABORATORIETS KOMPETENCE

Kompetenceundersøgelser

For at få tilstrækkelig erfaring med udførelsen af assayet, inden det anvendes til rutinetest, bør laboratoriet have påvist, at det kan frembringe de forventede resultater ud fra de offentliggjorte data (f.eks. (6)) for hyppigheden af kromosomaberrationer med mindst to positive kontrolkemikalier (herunder svag respons fremkaldt af lave doser af positive kontroller) som dem, der er anført i tabel 1, og med kompatible bærestof-/opløsningsmiddelkontroller (jf. punkt 22). Til disse forsøg bør der anvendes doser, der giver reproducerbare og dosisrelaterede stigninger og påviser testsystemets følsomhed og dynamiske interval i det relevante væv (knoglemarv) ved hjælp af den scoringsmetode, som skal anvendes i laboratoriet. Dette krav gælder ikke for laboratorier, der har erfaring, dvs. som har en historisk database til rådighed som defineret i punkt 10-14.

Historiske kontroldata

I løbet af kompetenceundersøgelserne bør laboratoriet fastlægge:

Når der første gang indhentes data til en historisk negativ kontrolfordeling, bør de samtidige negative kontroller stemme overens med offentliggjorte kontroldata, hvis sådanne findes. Efterhånden som der tilføjes flere forsøgsdata til den historiske kontrolfordeling, bør de samtidige negative kontroller ideelt set ligge inden for kontrolgrænsen på 95 % af denne fordeling. Laboratoriets historiske negative kontroldatabase bør være så statistisk robust, at laboratoriet kan vurdere fordelingen af deres negative kontroldata. Ifølge litteraturen kan det være nødvendigt at foretage mindst 10 forsøg, men det foretrækkes at foretage mindst 20 forsøg udført under sammenlignelige forsøgsbetingelser. Laboratorierne bør anvende kvalitetskontrolmetoder som f.eks. kontrolkort (f.eks. C-diagrammer eller X-søjlediagrammer (7)) til at identificere, hvor variable deres kontroldata er, samt vise, at metodologien er “under kontrol” i deres laboratorium. Yderligere anbefalinger til, hvordan man opbygger og anvender de historiske data (dvs. kriterier for optagelse og udelukkelse af historiske data og acceptkriterier for et givent forsøg), kan findes i litteraturen (8).

Såfremt laboratoriet ikke gennemfører et tilstrækkeligt antal forsøg for at fastlægge en statistisk robust negativ kontrolfordeling (jf. punkt 11) under kompetenceundersøgelserne (beskrevet i punkt 9), kan det accepteres at opbygge fordelingen under de første rutinetest. Denne fremgangsmåde bør følge anbefalingerne i litteraturen (8), og de negative kontrolresultater, der opnås i disse forsøg, bør stemme overens med de offentliggjorte negative kontroldata.

Der bør tages hensyn til eventuelle ændringer af forsøgsprotokollen med hensyn til, om de påvirker resultaterne på en måde, der stemmer overens med laboratoriets eksisterende historiske kontroldatabaser. Kun store uoverensstemmelser bør føre til, at der etableres en ny historisk kontroldatabase, hvor eksperter vurderer, at den adskiller sig fra den tidligere fordeling (jf. punkt 11). Under genetableringen er der muligvis ikke behov for en fuldstændig negativ kontroldatabase for at give mulighed for at foretage en faktisk test, hvis laboratoriet kan påvise, at deres sideløbende negative kontrolværdier forbliver enten forenelige med deres tidligere database eller med de tilsvarende offentliggjorte data.

Negative kontroldata bør bestå af forekomsten af aberrationer i kromosomernes struktur (dog ikke gaps) hos hvert enkelt dyr. Sideløbende negative kontroller bør ideelt set ligge inden for kontrolgrænsen på 95 % af fordelingen af laboratoriets historiske negative kontroldatabase. Såfremt data fra sideløbende negative kontroller falder uden for kontrolgrænsen på 95 %, kan de eventuelt optages i den historiske kontrolfordeling, så længe disse data ikke er ekstreme afvigende værdier, og der er dokumentation for, at testsystemet er “under kontrol” (jf. punkt 11) og for, at der ikke er begået tekniske eller menneskelige fejl.

BESKRIVELSE AF METODEN

Forberedelser

Valg af dyreart

Der bør anvendes raske unge voksne dyr af sædvanligt benyttede laboratoriestammer. Der anvendes sædvanligvis rotter, men mus kan også anvendes. En hvilken som helst anden pattedyrsart kan anvendes, hvis dette begrundes videnskabeligt i rapporten.

Miljø og fodringsbetingelser

Temperaturen i dyrerummet bør for gnavere være 22 °C (± 3 °C). Den relative luftfugtighed bør ideelt set være 50-60 %, dog mindst 40 % og helst ikke over 70 % bortset fra under rengøring af rummet. Belysningen bør være kunstig bestående af 12 timers lys og 12 timers mørke. For så vidt angår fodring, kan der anvendes konventionelt laboratorieføde med ubegrænset adgang til vand. Valget af føde kan påvirkes af behovet for at sikre en passende iblanding af et testkemikalie, når dette indgives ad denne vej. Gnavere bør opbevares i små grupper (højst fem dyr pr. bur) af samme køn og behandlingsgruppe, såfremt der ikke forventes aggressiv adfærd, fortrinsvist i solide gulvbure med passende miljøberigelse. Dyr bør kun opbevares individuelt, hvis dette er sagligt begrundet.

Klargøring af dyrene

Der anvendes normalt sunde unge voksne dyr (for gnavere ideelt set 6-10 uger gamle ved behandlingens start, selv om lidt ældre dyr også accepteres), som fordeles tilfældigt i kontrol- og behandlingsgrupperne. De enkelte dyr identificeres unikt ved hjælp af en human og minimalt invasiv metode (f.eks. med ring, mærke, mikrochip eller biometrisk identifikation, men ikke øre- eller tåklipning) og akklimatiseres til laboratoriebetingelserne i mindst fem dage. Burene indrettes på en sådan måde, at de mulige følger af burets placering minimeres. Krydskontaminering af den positive kontrol og testkemikaliet bør undgås. Ved undersøgelsens start bør variationen i dyrenes vægt være minimal og ikke overstige ± 20 % af gennemsnitsvægten for hvert køn.

Fremstilling af doser

Faste testkemikalier opløses eller suspenderes i passende opløsningsmidler eller bærestoffer eller iblandes føde eller drikkevand før indgivelse i dyrene. Flydende testkemikalier kan indgives direkte eller opløses før indgivelse. Til inhalationseksponering kan testkemikalier indgives som gas, damp eller en fast/flydende aerosol, afhængigt af deres fysisk-kemiske egenskaber. Der bør anvendes friske præparater af testkemikaliet, medmindre stabilitetsdata påviser, at opbevaring er acceptabelt, og hensigtsmæssige opbevaringsbetingelser bør defineres.

Opløsningsmiddel/bærestof

Opløsningsmidlet/bærestoffet må ikke have toksiske virkninger ved de benyttede doser og må ikke mistænkes for at reagere kemisk med testkemikaliet. Hvis der anvendes andre opløsningsmidler/bærestoffer end de velkendte, bør deres anvendelse understøttes af referencedata om deres kompatibilitet. Det anbefales så vidt muligt først at overveje at anvende vandige opløsningsmidler/bærestoffer. Eksempler på almindeligt anvendte kompatible opløsningsmidler/bærestoffer omfatter vand, fysiologisk saltvand, methylcelluloseopløsning, saltopløsning af carboxymethylcellulosenatrium, olivenolie og majsolie. I fravær af historiske eller offentliggjorte kontroldata, der viser, at et valgt atypisk opløsningsmiddel/bærestof ikke frembringer strukturelle aberrationer eller andre skadelige virkninger, bør der foretages en indledende undersøgelse for at fastlægge, om opløsningsmiddel-/bærestofkontrollen kan accepteres.

Kontroller

Positive kontroller

Hver test bør normalt omfatte en gruppe dyr, der behandles med et positivt kontrolkemikalie. Dette krav kan fraviges, hvis testlaboratoriet har påvist, at det er kompetent til at udføre testen og har fastlagt et historisk positivt kontrolområde. Såfremt der ikke indgår en sideløbende positiv kontrolgruppe, bør hvert enkelt forsøg omfatte scoringskontroller (fikserede og ufarvede objektglas). Disse kan opnås ved i scoringen af undersøgelsen at inkludere passende referenceprøver, som er hentet og opbevaret fra et særskilt positivt og periodisk udført kontrolforsøg (f.eks. hver 6.-18. måned) i det laboratorium, hvor testen udføres, f.eks. under kompetencetest og derefter regelmæssigt, hvor det er nødvendigt.

Positive kontrolkemikalier bør frembringe en påviselig forøgelse af celler med strukturelle kromosomaberrationer over det spontane niveau. Der bør vælges sådanne doser i de positive kontrolprøver, at virkningerne er tydelige, uden dog at de kodede prøvers identitet umiddelbart afsløres for den, der bedømmer dem. Det kan accepteres, at den positive kontrol administreres på anden vis end testkemikaliet ved hjælp af et andet behandlingsprogram, eller at prøveudtagningen kun forekommer på et bestemt tidspunkt. Hvis det er hensigtsmæssigt, bør der anvendes kemisk beslægtede positive kontrolkemikalier. Eksempler på positive kontrolkemikalier findes i tabel 1.

Tabel 1

Nedenfor er opregnet eksempler på positive kontrolkemikalier

Negative kontroller

Dyr i den negative kontrolgruppe bør inkluderes på alle prøveudtagningstidspunkter og ellers håndteres på samme måde som behandlingsgrupperne, bortset fra at de ikke behandles med testkemikaliet. Hvis der anvendes et opløsningsmiddel/bærestof til administrering af testkemikaliet, bør kontrolgruppen modtage dette opløsningsmiddel/bærestof. Hvis der imidlertid konstant påvises forskelle mellem dyrene og hyppige forekomster af celler med strukturelle aberrationer i de historiske negative kontroldata på alle prøveudtagningstidspunkter for testlaboratoriet, er det muligvis kun nødvendigt med en enkelt prøveudtagning til den negative kontrol. Såfremt der bruges en enkelt prøveudtagning til negative kontroller, bør det være det første prøveudtagningstidspunkt, der anvendes i undersøgelsen.

FREMGANGSMÅDE

Dyrenes antal og køn

Generelt er mikrokerneresponsen ens mellem han- og hundyr (9), og dette ventes også at være tilfældet for strukturelle kromosomaberrationer. De fleste undersøgelser kan derfor udføres hos begge køn. Data, der påviser relevante forskelle mellem han- og hundyr (f.eks. forskelle i systemisk toksicitet, metabolisme, biotilgængelighed, knoglemarvstoksicitet mv., herunder en forprøve til bestemmelse af dosisinterval), vil tilskynde til, at begge køn anvendes. I så fald kan det være hensigtsmæssigt at foretage en undersøgelse hos begge køn, f.eks. som led i en toksicitetsundersøgelse med gentagen dosering. Det kan være hensigtsmæssigt at benytte faktormodellen, hvis begge køn anvendes. Oplysninger om, hvordan dataene analyseres med denne model, findes i tillæg 2.

Gruppernes størrelse ved undersøgelsens start bør fastlægges for at få mindst fem analyserbare dyr af samme køn eller af hvert køn, hvis begge anvendes, pr. gruppe. Hvis eksponeringen af mennesker for det kemiske stof er kønsspecifik, som det f.eks. er tilfældet med visse farmaceutiske stoffer, bør testen udføres med det pågældende køn. Vejledende vil en undersøgelse af knoglemarv med to prøveudtagningstidspunkter og tre dosisgrupper og en sideløbende negativ kontrolgruppe samt en positiv kontrolgruppe (hvor hver gruppe består af fem dyr af samme køn) typisk højst kræve 45 dyr.

Dosisniveauer

Hvis der gennemføres en forprøve til bestemmelse af dosisinterval, fordi der ikke foreligger egnede data, der kan bruges til at vælge dosis, bør den udføres i samme laboratorium med samme art, stamme, køn og behandlingsmåde, som agtes benyttet i hovedundersøgelsen (10). Formålet med undersøgelsen bør være at identificere den højst tolererede dosis (MTD) defineret som den højeste dosis, som tolereres uden dokumentation for undersøgelsesbegrænsende toksicitet i forhold til varigheden af undersøgelsesperioden (f.eks. ved at fremkalde et fald i kropsvægt eller cytotoksicitet i det hæmatopoietiske system), men ikke død eller tegn på smerte eller lidelse, der kræver human aflivning (11).

Højeste dosis kan også defineres som en dosis, der i nogen grad udviser tegn på toksicitet i knoglemarven.

Kemikalier, der udviser mætning af toksikokinetiske egenskaber eller fremkalder afgiftningsprocesser, der kan føre til et fald i eksponeringen efter en lang behandling, kan være undtagelser fra kriterierne om dosisfastsættelse og bør vurderes fra gang til gang.

For at opnå dosis/respons-oplysninger bør en fuldstændig undersøgelse omfatte en negativ kontrolgruppe og mindst tre dosisniveauer generelt adskilt af en faktor på 2, men ikke højere end 4. Hvis testkemikaliet ikke frembringer toksicitet i en forprøve eller baseret på eksisterende data, bør den højeste dosis for en enkelt indgivelse være 2 000 mg/kg kropsvægt. Hvis testkemikaliet imidlertid frembringer toksicitet, bør MTD være den højeste administrerede dosis, og de anvendte dosisniveauer bør fortrinsvist dække et interval fra maksimum til en dosis, der frembringer ringe eller ingen toksicitet. Når der observeres toksicitet i målvævet (knoglemarven) på alle de testede dosisniveauer, tilrådes det at foretage yderligere undersøgelser ved ikke-toksiske doser. Undersøgelser, der skal give en mere fuldstændig karakteristik af de kvantitative dosis/respons-oplysninger, kan kræve yderligere dosisgrupper. For visse typer testkemikalier (f.eks. humanlægemidler), som er omfattet af særlige krav, kan disse grænser variere.

Grænsetest

Hvis dosisforprøver eller eksisterende data fra beslægtede dyrestammer viser, at en behandling med som minimum grænsedosen (beskrevet nedenfor) ikke frembringer observerbare toksiske virkninger (herunder ingen formindskelse af knoglemarvsproliferation eller andre tegn på målvævets cytotoksicitet), og hvis der ikke forventes genotoksicitet baseret på in vitro-genotoksicitetsundersøgelser eller data fra strukturelt beslægtede kemikalier, er det ikke nødvendigt med en fuldstændig undersøgelse med tre dosisniveauer, forudsat at det er påvist, at testkemikaliet når målvævet (knoglemarven). I så fald kan det være tilstrækkeligt med et enkeltdosisniveau ved grænsedosis. For en indgivelsesperiode på > 14 dage er grænsedosis 1 000 mg/kg kropsvægt/dag. For indgivelsesperioder på 14 dage eller derunder er grænsedosis 2 000 mg/kg kropsvægt/dag.

Indgivelse af doser

Den forventede indgivelsesmåde for mennesker bør overvejes i forbindelse med udformningen af et assay. Andre indgivelsesmåder såsom føde, drikkevand, topisk, subkutant, intravenøst, oralt (med sonde), inhalation, intratrachealt eller implantation kan vælges, hvis de kan begrundes. Under alle omstændigheder bør der vælges en indgivelsesmåde, der sikrer tilstrækkelig eksponering af målvævet. Intraperitoneal injektion anbefales generelt ikke, eftersom det ikke er en tilsigtet metode til human eksponering og kun bør anvendes med en specifik saglig begrundelse. Hvis testkemikaliet iblandes føde eller drikkevand, navnlig med hensyn til enkeltdosering, bør det sikres, at tidsforskellen mellem indtagelse af føde og drikkevand og prøveudtagning er tilstrækkelig stor til, at virkningerne kan påvises (jf. punkt 33-34). Hvor stor en væskemængde der kan indgives ad gangen ved tvangsfodring eller injektion, afhænger af forsøgsdyrenes størrelse. Denne mængde må normalt højst være 1 ml/100 g kropsvægt, bortset fra vandige opløsninger, hvor der højst kan anvendes 2 ml/100 g kropsvægt. Anvendelse af større mængder bør begrundes. Bortset fra lokalirriterende eller ætsende testkemikalier, som normalt vil frembringe kraftigere virkninger ved højere koncentrationer, bør testmængden variere så lidt som muligt, idet koncentrationen justeres, så indgivelsen sker ved samme mængde i forhold til kropsvægt ved alle dosisniveauer.

Behandlingsplan

Testkemikalier indgives normalt som en enkelt behandling, men kan indgives som to deldoser (dvs. to eller flere behandlinger samme dag med kun 2-3 timers interval), hvorved det bliver lettere at indgive en større mængde. Under disse omstændigheder, eller når kemikaliet indgives ved inhalation, bør prøveudtagningstidspunktet planlægges på grundlag af tidspunktet for den seneste indgivelse eller ved slutningen af eksponeringen.

Der findes kun begrænsede data om, hvorvidt en protokol med gentagne doser er egnet til denne test. I de tilfælde, hvor det er ønskeligt at integrere denne test med en toksicitetstest med gentagne doser, bør det imidlertid sikres, at mitotiske celler med kromosomskader ikke går tabt, sådan som det kan forekomme med toksiske doser. En sådan integration kan accepteres, når den højeste dosis er større end eller svarer til grænsedosis (jf. punkt 29), og en dosisgruppe indgives grænsedosis under hele behandlingsperioden. Mikrokernetesten (forsøgsmetode B.12) bør ses som den valgte in vivo-test for kromosomaberrationer, når der ønskes integration med andre undersøgelser.

Der udtages knoglemarvsprøver på to tidspunkter efter enkeltbehandling. For gnavere bør det første prøveudtagningsinterval være den tid, som er nødvendig til at gennemføre 1,5 normal cellecykluslængde (idet sidstnævnte normalt følger 12-18 timer efter behandlingsperioden). Da det optimale tidspunkt for påvisning af kromosomaberrationer kan afhænge af, hvor lang tid der er påkrævet for optagelse og metabolisme af testkemikaliet, og af testkemikaliets indvirkning på cellecyklussens kinetik, anbefales det at udtage endnu en prøve 24 timer efter den første. Ved første prøveudtagning bør alle dosisgrupper behandles, og der bør udtages prøver med henblik på analyse. Ved de(n) senere prøveudtagning(er) er det imidlertid kun den højeste dosis, som skal indgives. Indgives stoffet over mere end en dag baseret på en saglig begrundelse, bør der generelt blot udtages en prøve, når der er gået 1,5 normal cellecykluslængde efter den sidste behandling.

Efter behandlingen og inden prøveudtagningen injiceres dyrene intraperitonealt med en passende dosis af et metafasestandsende stof (f.eks. colcemid eller colchicin), og efter et passende interval udtages der derefter prøver. For mus er dette interval ca. 3-5 timer inden prøveudtagningen, og for rotter er det 2-5 timer. Cellerne høstes fra knoglemarven, lades svulme op, fikseres og farves og analyseres for kromosomaberrationer (12).

Observationer

Der bør foretages generelle kliniske observationer af forsøgsdyrene, og de kliniske tegn bør registreres mindst en gang om dagen, fortrinsvis på samme tidspunkt(er) hver dag og under hensyntagen til det tidspunkt, hvor de forventede virkninger efter dosering topper. Alle dyr bør observeres mindst to gange dagligt i doseringsperioden for morbiditet og dødelighed. Alle dyr bør vejes ved undersøgelsens start mindst en gang om ugen i undersøgelser med gentagen dosering og ved aflivning. Ved undersøgelser af mindst en uges varighed bør foderindtag måles mindst en gang ugentligt. Hvis testkemikaliet indgives via drikkevandet, måles vandindtaget ved hvert vandskift og mindst en gang ugentligt. Dyr, der udviser ikkedødelig indikation for for høj toksicitet, bør aflives humant før testperiodens udløb (11).

Eksponering af målvæv

Der bør på passende tidspunkt(er) tages en blodprøve for at gøre det muligt at undersøge plasmaniveauet i testkemikaliet med henblik på at påvise, at der er sket eksponering af knoglemarven, hvor der er grundlag for dette, og hvor der ikke findes andre eksponeringsdata (jf. punkt 44).

Knoglemarvs- og kromosompræparater

Umiddelbart efter aflivningen udtages knoglemarvsceller fra dyrets lårben og skinneben, og disse eksponeres for hypotonisk væske og fikseres. Metafasecellerne udstryges derefter på objektglas og farves ved hjælp af etablerede metoder (jf. (3) (12)).

Analyse

Alle objektglas, herunder fra positive og negative kontroller, bør kodes selvstændigt inden analyse og randomiseres, så bedømmeren ikke er bekendt med eksponeringsbetingelserne.

Mitoseindekset bestemmes som udtryk for cytotoksiciteten i mindst 1 000 celler pr. dyr for alle behandlede dyr (inkl. positive kontroldyr), ubehandlede eller bærestof-/opløsningsmiddelnegative kontroldyr.

For hvert dyr bør der analyseres mindst 200 metafaser for strukturelle kromosomaberrationer med og uden gaps (6). Hvis den historiske negative kontroldatabase imidlertid viser, at den gennemsnitlige baggrundsfrekvens for strukturel kromosomaberration er < 1 % i testlaboratoriet, bør det overvejes at score flere celler. Aberrationer af kromatid- og kromosomtypen bør registreres særskilt og klassificeres i undertyper (brud, udveksling). De procedurer, der anvendes i laboratoriet, bør sikre, at analyser af kromosomaberrationer udføres af veluddannede bedømmere og eventuelt underkastes peer review. Da præpareringen af objektglas ofte medfører, at en del af metafasecellerne går i stykker og kromosomerne dermed går tabt, bør scorede celler indeholde et antal centromerer på mindst 2n ± 2, hvor n er habloidtallet for kromosomer af den pågældende art.

DATA OG RAPPORTERING

Behandling af resultater

Individuelle dyredata fremlægges i tabelform. For hvert dyr registreres mitoseindekset, antallet af scorede metafaseceller, antallet af aberrationer pr. metafasecelle og den procentdel af cellerne, der har kromosomaberrationer. Forskellige typer strukturelle kromosomaberrationer bør anføres med antal og hyppighed for behandlingsgrupper og kontrolgrupper. Forekomsten af gaps samt polyploide celler og celler med endofordoblede kromosomer registreres særskilt. Frekvensen for gaps anføres, men medtages generelt ikke i den samlede frekvens for strukturel aberration. Hvis der ikke er tegn på forskellig respons hos de to køn, kan dataene samles med henblik på statistisk analyse. Data om dyretoksicitet og kliniske tegn bør også anføres.

Acceptkriterier

Følgende kriterier bestemmer, om testen kan accepteres:

Evaluering og fortolkning af resultater

Såfremt alle acceptkriterier er opfyldt, anses et testkemikalie for at være klart positivt, hvis:

Hvis det kun er den højeste dosis, der undersøges på et bestemt prøveudtagningstidspunkt, anses et testkemikalie for at være klart positivt, hvis der er en statistisk signifikant stigning sammenlignet med den sideløbende negative kontrol, og resultaterne ligger uden for fordelingen af de historiske negative kontroldata (f.eks. Poisson-baserede kontrolgrænser på 95 %). Anbefalinger til hensigtsmæssige statistiske metoder kan findes i litteraturen (13). Ved en dosis/respons-analyse bør mindst tre behandlede dosisgrupper analyseres. I de statistiske test bør dyret anvendes som forsøgsenhed. Positive resultater i testen for kromosomaberrationer viser, at testkemikaliet fremkalder strukturelle kromosomaberrationer i den testede arts knoglemarv.

Såfremt alle acceptkriterier er opfyldt, anses et testkemikalie for at være klart negativt, hvis følgende er opfyldt i alle de undersøgte forsøgsbetingelser:

Anbefalinger til de mest hensigtsmæssige statistiske metoder kan findes i litteraturen (13). Dokumentation for knoglemarvens eksponering for et testkemikalie kan omfatte et fald i mitoseindekset eller måling af plasma eller blodniveauer for testkemikaliet eller testkemikalierne. I tilfælde af intravenøs indgivelse er der ikke behov for dokumentation for eksponering. Alternativt kan der anvendes ADME-data indsamlet i en uafhængig undersøgelse under anvendelse af den samme metode og de samme arter til påvise knoglemarvseksponering. Negative resultater viser, at testkemikaliet under testbetingelserne ikke fremkalder strukturelle kromosomaberrationer i den testede arts knoglemarv.

Der er ikke krav om verifikation af en klart positiv eller negativ respons.

Hvis responsen hverken er klart negativ eller positiv og for at bidrage til at fastslå den biologiske relevans af et resultat (f.eks. en svag eller usikker stigning), bør dataene evalueres af eksperter, og/eller der bør foretages yderligere undersøgelser af de afsluttede forsøg. I nogle tilfælde kan det være nyttigt at analysere flere celler eller foretage en ny undersøgelse under anvendelse af modificerede forsøgsbetingelser.

I sjældne tilfælde, selv efter yderligere undersøgelser, giver dataene ikke mulighed for at konkludere, om testkemikaliet fremkalder enten positive eller negative resultater, og konklusionen er derfor, at undersøgelsen er tvetydig.

Hyppigheden af polyploide og endofordoblede metafaser blandt de samlede metafaser bør registreres særskilt. En forøgelse af antallet af polyploide/endofordoblede celler kan være tegn på, at testkemikaliet kan inhibere mitotiske processer eller cellecyklussens forløb (jf. punkt 3).

Testrapport

Testrapporten bør indeholde følgende oplysninger:

Resumé

LITTERATUR

5)

Del B, kapitel B.12, affattes således:

»B.12   Test for mikrokerner i erythrocytter hos pattedyr

INDLEDNING

Denne forsøgsmetode svarer til OECD-testvejledning (Test Guideline) 474 (2016). Den er en del af en række forsøgsmetoder vedrørende genetisk toksikologi. Der er udarbejdet et OECD-dokument med kortfattede oplysninger om test af genetisk toksikologi og en oversigt over de nylige ændringer af denne testvejledning (1).

In vivo-testen for mikrokerner hos pattedyr er navnlig relevant ved vurdering af genotoksicitet, da faktorer for in vivo-metabolisme, farmakokinetik og DNA-reparationsprocesser er aktive og bidrager til responserne, selv om de kan være forskellige fra art til art. En in vivo-test er ligeledes nyttig til yderligere undersøgelse af genotoksicitet, der er påvist ved en in vitro-test.

En in vivo-test for mikrokerner hos pattedyr anvendes til at påvise beskadigelse af kromosomerne eller mitoseapparatet hos erythroblaster forårsaget af testkemikaliet. Testen vurderer dannelsen af mikrokerner i de udtagne erythrocytter, enten i knoglemarven eller det perifere blod hos dyr, sædvanligvis gnavere.

Formålet med mikrokernetesten er at påvise kemikalier, der forvolder cytogenetiske skader, som medfører dannelse af mikrokerner indeholdende enten tiloversblevne kromosomfragmenter eller hele kromosomer.

Når en erythroblast i knoglemarven udvikler sig til en umoden erythrocyt (kaldes til tider også polykromatisk erythrocyt eller reticulocyt), udstødes cellens hovedkerne, og en eventuel dannet mikrokerne kan blive tilbage i cytoplasma. I disse celler er mikrokerner let synlige eller påviselige, da de ikke har en hovedkerne. Forøget forekomst af umodne erythrocytter med mikrokerne hos behandlede dyr er tegn på inducerede strukturelle eller antalsmæssige kromosomaberrationer.

Nydannede erythrocytter med mikrokerne identificeres og kvantificeres ved farvning efterfulgt af enten visuel scoring ved hjælp af et mikroskop eller automatiseret analyse. Optælling af et tilstrækkeligt antal umodne erythrocytter i perifert blod eller knoglemarv fra voksne dyr lettes betydeligt ved hjælp af en automatisk scoringsplatform. Sådanne platforme er acceptable som alternativer til manuel bedømmelse (2). Sammenlignende undersøgelser har vist, at sådanne metoder, ved hjælp af passende kalibreringsstandarder, kan give bedre reproducerbarhed i og mellem laboratorier og bedre følsomhed end manuel mikroskopisk bedømmelse (3) (4). Automatiske systemer, som kan måle frekvensen af erythrocytter med mikrokerner, omfatter, men er ikke begrænset til, flowcytometre (5), billedanalyseplatforme (6) (7) og laserscanningcytometre (8).

Selv om det ikke normalt sker som en del af testen, kan kromosomfragmenter skelnes fra hele kromosomer ved en række kriterier, bl.a. om der er en kinetokor eller DNA-centromer til stede, hvilket er tegn på intakte kromosomer. Hvis der ikke er en kinetokor eller DNA-centromer til stede, indeholder mikrokernen kun fragmenter af kromosomer, mens tilstedeværende DNA-centromer indikerer kromosomtab.

Definitioner af den anvendte terminologi findes i tillæg 1.

INDLEDENDE OVERVEJELSER

Knoglemarven hos unge voksne gnavere er målvævet for genetiske skader i denne test, idet erythrocytter produceres i dette væv. Måling af mikrokerner hos umodne erythrocytter i perifert blod er acceptabel hos andre pattedyr, hvor der er påvist tilstrækkelig følsomhed for påvisning af kemikalier, der forårsager strukturelle eller antalsmæssige kromosomaberrationer i disse celler (ved induktion af mikrokerner i umodne erythrocytter), og hvor der foreligger en videnskabelig begrundelse. Det vigtigste endepunkt er hyppigheden af umodne erythrocytter med mikrokerner. Hyppigheden af modne erythrocytter med mikrokerner i det perifere blod kan også benyttes som et endepunkt hos arter uden stærk splenisk udvælgelse i forhold til celler med mikrokerner, og når dyrene behandles kontinuerligt i en periode på over levetiden for erythrocytter i de arter, der anvendes (f.eks. fire uger eller mere hos mus).

Hvis der er grund til at tro, at testkemikaliet eller dets metabolit(ter) ikke vil nå frem til målvævet, er denne test ikke egnet.

Før brug af forsøgsmetoden til lovmæssig test af en blanding til generering af data bør det overvejes, om den vil give resultater, som er egnede til formålet, og i givet fald hvorfor. Sådanne overvejelser er ikke nødvendige, når der foreligger et myndighedskrav om test af blandingen.

PRINCIPPET FOR FORSØGSMETODEN

Dyrene eksponeres for testkemikaliet på passende vis. Hvis der benyttes knoglemarv, aflives dyrene humant på et passende tidspunkt efter behandlingen, hvorefter knoglemarven udtages, og der fremstilles præparater, som farves (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Hvis der benyttes perifert blod, tages der blodprøver på et passende tidspunkt efter behandlingen, hvorefter der fremstilles præparater, som farves (12) (16) (17) (18). Når behandlingen administreres akut, er det vigtigt at vælge tidspunkter for høst af knoglemarv eller blod, hvor der kan påvises behandlingsrelateret induktion af umodne erythrocytter med mikrokerner. I tilfælde af udtagning af perifert blod, skal der være gået tilstrækkelig lang tid til, at dette kan påvises i cirkulerende blod. Præparaterne analyseres for tilstedeværelse af mikrokerner, enten ved visualisering ved hjælp af et mikroskop, billedanalyse, flowcytometri eller laserscanningcytometri.

KONTROL AF LABORATORIETS KOMPETENCE

Kompetenceundersøgelser

Med henblik på at fastslå, om der foreligger tilstrækkelige erfaringer med gennemførelse af assayet, før det tages i brug til rutinetest, bør laboratoriet have dokumenteret, at det er i stand til at reproducere forventede resultater ud fra offentliggjorte data (17) (19) (20) (21) (22) for frekvenser for mikrokerner med mindst to positive kontrolkemikalier (herunder svage responser induceret ved lave doser af positive kontroller), såsom dem, der er anført i tabel 1, og med kompatible bærestof-/opløsningsmiddelkontroller (jf. punkt 26). Til disse forsøg bør der anvendes doser, der giver reproducerbare og dosisrelaterede stigninger og påviser testsystemets følsomhed og dynamiske interval i det relevante væv (knoglemarv eller perifert blod) og ved hjælp af den scoringsmetode, som skal anvendes i laboratoriet. Dette krav gælder ikke for laboratorier, der har erfaring, dvs. som har en historisk database til rådighed som defineret i punkt 14-18.

Historiske kontroldata

I løbet af kompetenceundersøgelserne bør laboratoriet fastlægge:

Når der første gang indhentes data til en historisk negativ kontrolfordeling, bør de samtidige negative kontroller stemme overens med offentliggjorte kontroldata, hvis sådanne findes. Efterhånden som der tilføjes flere forsøgsdata til den historiske kontrolfordeling, bør de samtidige negative kontroller ideelt set ligge inden for kontrolgrænsen på 95 % af denne fordeling. Laboratoriets historiske negative kontroldatabase bør være så statistisk robust, at laboratoriet kan vurdere fordelingen af deres negative kontroldata. Ifølge litteraturen kan det være nødvendigt at foretage mindst 10 forsøg, men det foretrækkes at foretage mindst 20 forsøg udført under sammenlignelige forsøgsbetingelser. Laboratorierne bør anvende kvalitetskontrolmetoder som f.eks. kontrolkort (f.eks. C-diagrammer eller X-søjlediagrammer (23)) til at identificere, hvor variable deres kontroldata er, samt vise, at metodologien er “under kontrol” i deres laboratorium. Yderligere anbefalinger til, hvordan man opbygger og anvender de historiske data (dvs. kriterier for optagelse og udelukkelse af historiske data og acceptkriterier for et givent forsøg), kan findes i litteraturen (24).

Såfremt laboratoriet ikke gennemfører et tilstrækkeligt antal forsøg for at fastlægge en statistisk robust negativ kontrolfordeling (jf. punkt 15) under kompetenceundersøgelserne (beskrevet i punkt 13), kan det accepteres at opbygge fordelingen under de første rutinetest. Denne fremgangsmåde bør følge anbefalingerne i litteraturen (24), og de negative kontrolresultater, der opnås i disse forsøg, bør stemme overens med de offentliggjorte negative kontroldata.

Der bør tages hensyn til eventuelle ændringer af forsøgsprotokollen med hensyn til, om de påvirker resultaterne på en måde, der stemmer overens med laboratoriets eksisterende historiske kontroldatabaser. Kun store uoverensstemmelser bør føre til, at der etableres en ny historisk kontroldatabase, hvor eksperter vurderer, at den adskiller sig fra den tidligere fordeling (jf. punkt 15). Under genetableringen er der muligvis ikke behov for en fuldstændig negativ kontroldatabase for at give mulighed for at foretage en faktisk test, hvis laboratoriet kan påvise, at deres sideløbende negative kontrolværdier forbliver enten forenelige med deres tidligere database eller med de tilsvarende offentliggjorte data.

Negative kontroldata bør bestå af forekomst af mikrokerner i umodne erythrocytter hos hvert dyr. Sideløbende negative kontroller bør ideelt set ligge inden for kontrolgrænsen på 95 % af fordelingen af laboratoriets historiske negative kontroldatabase. Såfremt data fra sideløbende negative kontroller falder uden for kontrolgrænsen på 95 %, kan de eventuelt optages i den historiske kontrolfordeling, så længe disse data ikke er ekstreme afvigende værdier, og der er dokumentation for, at testsystemet er “under kontrol” (jf. punkt 15) og for, at der ikke er begået tekniske eller menneskelige fejl.

BESKRIVELSE AF METODEN

Forberedelser

Valg af dyreart

Der bør anvendes raske unge voksne dyr af sædvanligt benyttede laboratoriestammer. Mus, rotter eller andre egnede pattedyrarter kan benyttes. Hvis der benyttes perifert blod, skal det fastslås, at splenisk fjernelse af celler med mikrokerner fra kredsløbet ikke gør det sværere at påvise inducerede mikrokerner hos udvalgte arter. Dette er klart blevet påvist for perifert blod hos mus og rotter (2). Den videnskabelige begrundelse for at bruge andre arter end rotter og mus bør anføres i rapporten. Hvis der anvendes andre arter end gnavere, anbefales det at integrere målingen af inducerede mikrokerner i en anden passende toksicitetstest.

Miljø og fodringsbetingelser

Temperaturen i dyrerummet bør for gnavere være 22 °C (± 3 °C). Den relative luftfugtighed bør ideelt set være 50-60 %, dog mindst 40 % og helst ikke over 70 % bortset fra under rengøring af rummet. Belysningen bør være kunstig bestående af 12 timers lys og 12 timers mørke. For så vidt angår fodring, kan der anvendes konventionelt laboratorieføde med ubegrænset adgang til vand. Valget af føde kan påvirkes af behovet for at sikre en passende iblanding af et testkemikalie, når dette indgives ad denne vej. Gnavere bør opbevares i små grupper (højst fem dyr pr. bur) af samme køn og behandlingsgruppe, såfremt der ikke forventes aggressiv adfærd, fortrinsvist i solide gulvbure med passende miljøberigelse. Dyr bør kun opbevares individuelt, hvis dette er sagligt begrundet.

Klargøring af dyrene

Der anvendes normalt sunde unge voksne dyr (for gnavere ideelt set 6-10 uger gamle ved behandlingens start, selv om lidt ældre dyr også accepteres), som fordeles tilfældigt i kontrol- og behandlingsgrupperne. De enkelte dyr identificeres unikt ved hjælp af en human og minimalt invasiv metode (f.eks. med ring, mærke, mikrochip eller biometrisk identifikation, men ikke øre- eller tåklipning) og akklimatiseres til laboratoriebetingelserne i mindst fem dage. Burene indrettes på en sådan måde, at de mulige følger af burets placering minimeres. Krydskontaminering af den positive kontrol og testkemikaliet bør undgås. Ved undersøgelsens start bør variationen i dyrenes vægt være minimal og ikke overstige ± 20 % af gennemsnitsvægten for hvert køn.

Fremstilling af doser

Faste testkemikalier opløses eller suspenderes i passende opløsningsmidler eller bærestoffer eller iblandes føde eller drikkevand før indgivelse i dyrene. Flydende testkemikalier kan indgives direkte eller opløses før indgivelse. Til inhalationseksponering kan testkemikalier indgives som gas, damp eller en fast/flydende aerosol, afhængigt af deres fysisk-kemiske egenskaber. Der bør anvendes friske præparater af testkemikaliet, medmindre stabilitetsdata påviser, at opbevaring er acceptabelt, og hensigtsmæssige opbevaringsbetingelser bør defineres.

Testbetingelser

Opløsningsmiddel/bærestof

Opløsningsmidlet/bærestoffet må ikke have toksiske virkninger ved de benyttede doser og må ikke kunne reagere kemisk med testkemikaliet. Hvis der anvendes andre opløsningsmidler/bærestoffer end de velkendte, bør deres anvendelse understøttes af referencedata om deres kompatibilitet. Det anbefales så vidt muligt først at overveje at anvende vandige opløsningsmidler/bærestoffer. Eksempler på almindeligt anvendte kompatible opløsningsmidler/bærestoffer omfatter vand, fysiologisk saltvand, methylcelluloseopløsning, saltopløsning af carboxymethylcellulosenatrium, olivenolie og majsolie. I fravær af historiske eller offentliggjorte kontroldata, der viser, at et valgt atypisk opløsningsmiddel/bærestof ikke frembringer mikrokerner og andre skadelige virkninger, bør der foretages en indledende undersøgelse for at fastlægge, om opløsningsmiddel-/bærestofkontrollen kan accepteres.

Kontroller

Positive kontroller

Hver test bør normalt omfatte en gruppe dyr, der behandles med et positivt kontrolkemikalie. Dette krav kan fraviges, hvis testlaboratoriet har påvist, at det er kompetent til at udføre testen og har fastlagt et historisk positivt kontrolområde. Såfremt der ikke indgår en sideløbende positiv kontrolgruppe, bør hvert enkelt forsøg omfatte scoringskontroller (fikserede og ufarvede prøver på objektglas eller cellesuspensionsprøver, alt efter den anvendte scoringsmetode). Disse kan opnås ved i scoringen af undersøgelsen at inkludere passende referenceprøver, som er hentet og opbevaret fra et særskilt positivt og periodisk udført kontrolforsøg (f.eks. hver 6.-18. måned), f.eks. under kompetencetest og derefter regelmæssigt, hvor det er nødvendigt.

Positive kontrolkemikalier bør frembringe en påviselig forøgelse af frekvensen for mikrokerner over det spontane niveau. Ved anvendelse af manuel scoring ved mikroskopi bør der vælges sådanne doser i de positive kontrolprøver, at virkningerne er tydelige, uden dog at de kodede prøvers identitet umiddelbart afsløres for den, der bedømmer dem. Det kan accepteres, at den positive kontrol administreres på anden vis end testkemikaliet ved hjælp af et andet behandlingsprogram, eller at prøveudtagningen kun forekommer på et bestemt tidspunkt. Hvis det er hensigtsmæssigt, bør der anvendes kemisk beslægtede positive kontrolkemikalier. Eksempler på positive kontrolkemikalier findes i tabel 1.

Tabel 1

Nedenfor er opstillet eksempler på positive kontrolkemikalier:

Kemikalier og CAS-registreringsnummer

Ethylmethansulfonat [CASRN 62-50-0]

Methylmethansulfonat [CASRN 66-27-3]

Ethylnitrosourinstof [CASRN 759-73-9]

Mitomycin C [CASRN 50-07-7]

Cyclophosphamidmonohydrat [CASRN 50-18-0 (CASRN 6055-19-2)]

Triethylenmelamin [CASRN 51-18-3]

Colchicin [CASRN 64-86-8 ] eller vinblastin [CASRN 865-21-4 ] — som aneugener

Negative kontroller

Dyr i den negative kontrolgruppe bør inkluderes på alle prøveudtagningstidspunkter og ellers hånderes på samme måde som behandlingsgrupperne, bortset fra at de ikke behandles med testkemikaliet. Hvis der anvendes et opløsningsmiddel/bærestof til administrering af testkemikaliet, bør kontrolgruppen modtage dette opløsningsmiddel/bærestof. Hvis der imidlertid konstant påvises forskelle mellem dyrene og hyppige forekomster af celler med mikrokerner i de historiske negative kontroldata på alle prøveudtagningstidspunkter for testlaboratoriet, er det muligvis kun nødvendigt med en enkelt prøveudtagning til den negative kontrol. Såfremt der bruges en enkelt prøveudtagning til negative kontroller, bør det være det første prøveudtagningstidspunkt, der anvendes i undersøgelsen.

Hvis der benyttes perifert blod, kan en forbehandlingsprøve accepteres i stedet for en sideløbende negativ kontrol for korttidsundersøgelser, når de opnåede resultater er i overensstemmelse med den historiske kontroldatabase for testlaboratoriet. For rotter er det påvist, at forbehandlingsprøver af mindre volumen (f.eks. under 100 μl/dag) har minimal indflydelse på baggrundsforekomsten af mikrokerner (25).

FREMGANGSMÅDE

Dyrenes antal og køn

Generelt er mikrokernerespons ens mellem han- og hundyr, og de fleste undersøgelser kan derfor udføres hos begge køn (26). Data, der påviser relevante forskelle mellem han- og hundyr (f.eks. forskelle i systemisk toksicitet, metabolisme, biotilgængelighed, knoglemarvstoksicitet mv., herunder i en forprøve til bestemmelse af dosisinterval), vil tilskynde til, at begge køn anvendes. I så fald kan det være hensigtsmæssigt at foretage en undersøgelse hos begge køn, f.eks. som led i en toksicitetsundersøgelse med gentagen dosering. Det kan være hensigtsmæssigt at benytte faktormodellen, hvis begge køn anvendes. Oplysninger om, hvordan dataene analyseres med denne model, findes i tillæg 2.

Gruppernes størrelse ved undersøgelsens start bør fastlægges for at få mindst fem analyserbare dyr af samme køn eller af hvert køn, hvis begge anvendes, pr. gruppe. Hvis eksponeringen af mennesker for det kemiske stof er kønsspecifik, som det f.eks. er tilfældet med visse farmaceutiske stoffer, bør testen udføres med det pågældende køn. Vejledende vil en undersøgelse af knoglemarv, der udføres i henhold til de i punkt 37 fastlagte parametre med tre dosisgrupper og en sideløbende negativ og positiv kontrolgruppe (hvor hver gruppe består af fem dyr af samme køn) typisk højst kræve 25-35 dyr.

Dosisniveauer

Hvis der gennemføres en forprøve til bestemmelse af dosisinterval, fordi der ikke foreligger egnede data, der kan bruges til at vælge dosis, bør den udføres i samme laboratorium med samme art, stamme, køn og behandlingsmåde, som agtes benyttet i hovedundersøgelsen (27). Formålet med undersøgelsen bør være at identificere den højst tolererede dosis (MTD) defineret som den højeste dosis, som tolereres uden dokumentation for undersøgelsesbegrænsende toksicitet i forhold til varigheden af undersøgelsesperioden (f.eks. ved at fremkalde et fald i kropsvægt eller cytotoksicitet i det hæmatopoietiske system), men ikke død eller tegn på smerte eller lidelse, der kræver human aflivning (28).

Højeste dosis kan også defineres som en dosis, der udviser tegn på toksicitet i knoglemarven (f.eks. en nedsættelse af andelen af umodne erythrocytter i forhold til totale erythrocytter i knoglemarv eller perifert blod på mere end 50 %, men ikke mindre end 20 % af kontrolværdien). Ved analyser af CD71-positive celler i det perifere blodkredsløb (dvs. ved flowcytometri) reagerer denne meget unge fraktion af umodne erythrocytter imidlertid hurtigere på toksiske udfordringer end den større RNA-positive kohorte af umodne erythrocytter. Derfor kan der være tegn på en højere tilsyneladende toksicitet med akut eksponeringsdesign ved undersøgelse af den CD71-positive umodne erythrocytfraktion i forhold til dem, der indikerer umodne erythrocytter baseret på RNA-indhold. Af denne grund kan den højeste dosis for testkemikalier, der forårsager toksicitet, når forsøg skal behandles i fem dage eller mindre, defineres som den dosis, der forårsager en statistisk signifikant reduktion i andelen af CD71-positive umodne erythrocytter i forhold til det samlede antal erythrocytter, men ikke mindre end 5 % af kontrolværdien (29).

Kemikalier, der udviser mætning af toksikokinetiske egenskaber eller fremkalder afgiftningsprocesser, som kan føre til et fald i eksponeringen efter en lang indgivelsesperiode, kan være undtagelser fra kriterierne om dosisfastsættelse og bør vurderes fra gang til gang.

For at opnå dosis/respons-oplysninger bør en fuldstændig undersøgelse omfatte en negativ kontrolgruppe og mindst tre dosisniveauer generelt adskilt af en faktor på 2, men ikke højere end 4. Hvis testkemikaliet ikke fremkalder toksicitet i en forundersøgelse eller på grundlag af eksisterende data, bør den højeste dosis for en indgivelsesperiode på 14 dage eller derover være 1 000 mg/kg kropsvægt/dag eller for indgivelsesperioder på under 14 dage, 2 000 mg/kg kropsvægt/dag. Hvis testkemikaliet imidlertid frembringer toksicitet, bør MTD være den højeste administrerede dosis, og de anvendte dosisniveauer bør fortrinsvist dække et interval fra maksimum til en dosis, der frembringer ringe eller ingen toksicitet. Når der observeres toksicitet i målvævet (knoglemarven) på alle de testede dosisniveauer, tilrådes det at foretage yderligere undersøgelser ved ikke-toksiske doser. Undersøgelser, der skal give en mere fuldstændig karakteristik af de kvantitative dosis/respons-oplysninger, kan kræve yderligere dosisgrupper. For visse typer testkemikalier (f.eks. humanlægemidler), som er omfattet af særlige krav, kan disse grænser variere.

Grænsetest

Hvis dosisforprøver eller eksisterende data fra beslægtede dyrestammer viser, at en behandling med som minimum grænsedosen (beskrevet nedenfor) ikke frembringer observerbare toksiske virkninger (herunder ingen formindskelse af knoglemarvsproliferation eller andre beviser på målvævets cytotoksicitet), og hvis der ikke forventes genotoksicitet baseret på in vitro-genotoksicitetsundersøgelser eller data fra strukturelt beslægtede kemikalier, er det ikke nødvendigt med en fuldstændig undersøgelse med tre dosisniveauer, forudsat at det er påvist, at testkemikaliet når målvævet (knoglemarven). I så fald kan det være tilstrækkeligt med et enkeltdosisniveau ved grænsedosis. For indgivelsesperioder på 14 dage eller derover er grænsedosis 1000 mg/kg kropsvægt/dag. For indgivelsesperioder på mindre end 14 dage er grænsedosis 2000 mg/kg kropsvægt/dag.

Indgivelse af doser

Den forventede indgivelsesmåde for mennesker bør overvejes i forbindelse med udformningen af et assay. Andre indgivelsesmåder såsom føde, drikkevand, topisk, subkutant, intravenøst, oralt (med sonde), inhalation, intratrachealt eller implantation kan vælges, hvis de kan begrundes. Under alle omstændigheder bør der vælges en indgivelsesmåde, der sikrer tilstrækkelig eksponering af målvævet. Intraperitoneal injektion anbefales generelt ikke, eftersom det ikke er en tilsigtet metode til human eksponering og kun bør anvendes med en specifik saglig begrundelse. Hvis testkemikaliet iblandes føde eller drikkevand, navnlig med hensyn til enkeltdosering, bør det tilsikres, at tidsforskellen mellem indtagelse af føde og drikkevand og prøveudtagning er tilstrækkelig stor til, at virkningerne kan påvises (jf. punkt 37). Hvor stor en væskemængde der kan indgives ad gangen ved tvangsfodring eller injektion, afhænger af forsøgsdyrenes størrelse. Denne mængde må normalt højst være 1 ml/100 g kropsvægt, bortset fra vandige opløsninger, hvor der højst kan anvendes 2 ml/100 g kropsvægt. Anvendelse af større mængder bør begrundes. Bortset fra lokalirriterende eller ætsende testkemikalier, som normalt vil frembringe kraftigere virkninger ved højere koncentrationer, bør testmængden variere så lidt som muligt, idet koncentrationen justeres, så indgivelsen sker ved samme mængde i forhold til kropsvægt ved alle dosisniveauer.

Behandlingsplan

Der udføres fortrinsvist to eller flere behandlinger indgivet med 24 timers mellemrum, navnlig ved at integrere denne test i andre toksicitetsundersøgelser. Alternativt kan der indgives enkeltbehandlinger, hvis det er videnskabeligt begrundet (f.eks. kemikalier, der er kendt for at blokere cellecyklus). Testkemikalier kan også indgives som to deldoser, dvs. to eller flere behandlinger samme dag med kun 2-3 timers interval, hvorved det bliver lettere at indgive et større volumen. Under disse omstændigheder, eller når kemikaliet indgives ved inhalation, bør prøveudtagningstidspunktet planlægges på grundlag af tidspunktet for den seneste indgivelse eller ved slutningen af eksponeringen.

Testen kan udføres på mus eller rotter på en af tre måder:

Andre doserings- eller prøveudtagningsregimer kan anvendes, hvor det er relevant og videnskabeligt begrundet og for at fremme integrationen med andre toksicitetstest.

Observationer

Der bør foretages generelle kliniske observationer af forsøgsdyrene, og de kliniske tegn bør registreres mindst en gang om dagen, fortrinsvis på samme tidspunkt(er) hver dag og under hensyntagen til det tidspunkt, hvor de forventede virkninger efter dosering topper. Alle dyr bør observeres mindst to gange dagligt i doseringsperioden for morbiditet og dødelighed. Alle dyr bør vejes ved undersøgelsens start, mindst en gang om ugen i undersøgelser med gentagne doser og ved aflivning. Ved undersøgelser af mindst en uges varighed bør foderindtag måles mindst en gang ugentligt. Hvis testkemikaliet indgives via drikkevandet, måles vandindtaget ved hvert vandskift og mindst en gang ugentligt. Dyr, der udviser ikkedødelig indikation for for høj toksicitet, bør aflives humant før testperiodens udløb (28). Under visse omstændigheder kan dyrs kropstemperatur overvåges, da behandlingsinduceret hyper- og hypotermi har været medvirkende til at frembringe falske resultater (32) (33) (34).

Eksponering af målvæv

Der bør på passende tidspunkt(er) tages en blodprøve for at gøre det muligt at undersøge plasmaniveauet i testkemikaliet med henblik på at påvise, at der er sket eksponering af knoglemarven, hvor der er grundlag for dette, og hvor der ikke findes andre eksponeringsdata (jf. punkt 48).

Præparering af knoglemarv/blod

Knoglemarvceller udtages normalt fra dyrenes lårben eller skinneben umiddelbart efter human aflivning. Sædvanligvis udtages cellerne, hvorefter de præpareres og farves med velkendte metoder. Der kan udtages små mængder perifert blod i henhold til passende standarder for dyrevelfærd, enten ved hjælp af en metode, der lader forsøgsdyret overleve, som f.eks. ved blødning fra halevenen eller et andet egnet blodkar, eller ved hjertepunktur eller prøveudtagning fra et stort blodkar ved aflivning. For både knoglemarv eller erythrocytter fra perifert blod kan cellerne, afhængigt af analysemetoden, straks farves supravitalt (16) (17) (18), idet udstrygningspræparater fremstilles og derefter farves til mikroskopi eller fikseres og farves behørigt med henblik på flowcytometrianalyse. Ved at bruge en DNA-specifik farvning [f.eks. acridinorange (35) eller Hoechst 33258 plus pyronin-Y (36)] kan man undgå nogle af de artefakter, der optræder ved ikke-DNA-specifik farvning. Denne fordel udelukker ikke, at der benyttes konventionelle farvestoffer (f.eks. Giemsa ved mikroskopianalyse). Supplerende systemer [f.eks. cellulosekolonner til fjernelse af kerneindeholdende celler (37) (38)] kan også benyttes, forudsat at disse systemer påviseligt er kompatible med præpareringen af prøven i laboratoriet.

Hvis disse metoder kan anvendes, kan der anvendes anti-kinetokor-antistoffer (39), FISH med pancentromeriske DNA-prober (40) eller primet in situ-mærkning med pancentromerspecifikke primere og egnet DNA-kontrastfarvning (41) til at identificere arten af mikrokerner (kromosom/kromosomfragment) med henblik på at fastslå, om induktionen af mikrokerner skyldes klastogen og/eller aneugen aktivitet. Andre metoder til differentiering mellem klastogener og aneugener kan anvendes, hvis de har vist sig at være effektive.

Analyse (manuel og automatisk)

Alle objektglas eller prøver til analyse, herunder til positive og negative kontroller, bør kodes uafhængigt inden nogen form for analyse og bør randomiseres, så den manuelle bedømmer ikke har kendskab til behandlingsbetingelsen; denne bedømmelse er ikke nødvendig, når der anvendes automatiske scoringssystemer, som ikke bygger på visuel inspektion og ikke kan påvirkes af operatørbias. For hvert dyr bestemmes andelen af umodne erythrocytter i forhold til det samlede antal (umodne og modne) erythrocytter, idet der tælles mindst 500 erythrocytter i alt for knoglemarv og 2 000 erythrocytter for perifert blod (42). For hvert dyr scores mindst 4 000 umodne erythrocytter for forekomsten af umodne etythrocytter med mikrokerner (43). Hvis den historiske negative kontroldatabase viser, at den gennemsnitlige baggrundsfrekvens for umodne erythrocytter med mikrokerner er < 0,1 % i testlaboratoriet, bør det overvejes at score flere celler. Når prøverne analyseres, bør andelen af umodne erythrocytter i forhold til det samlede antal erythrocytter hos behandlede dyr ikke være mindre end 20 % af forholdet mellem bærestof-/opløsningsmiddelkontrol ved scoring ved mikroskopi og ikke mindre end ca. 5 % af forholdet mellem bærestof-/opløsningsmiddelkontrol ved scoring af CD71+ umodne erythrocytter CD71+ ved cytometrimetoder (jf. punkt 31) (29). For et knoglemarvsassay scoret ved mikroskopi gælder det f.eks., at hvis kontrolandelen af umodne erythrocytter i knoglemarven er 50 %, vil den øvre grænse for toksicitet være 10 % umodne erythrocytter.

Da rottemilten udskiller og destruerer erythrocytter med mikrokerner, foretrækkes det for at fastholde en høj følsomhed i assayet ved analyse af perifert blod at begrænse analysen af umodne erythrocytter med mikrokerner til den yngste fraktion. Ved hjælp af automatiserede analysemetoder kan disse mest umodne erythrocytter identificeres på basis af deres høje indhold af RNA eller det høje niveau af transferrinreceptorer (CD71+) udtrykt på deres overflade (31). En direkte sammenligning af forskellige farvningsmetoder har imidlertid vist, at der kan opnås et tilfredsstillende resultat med forskellige metoder, herunder traditionel acridinorangefarvning (3) (4).

DATA OG RAPPORTERING

Behandling af resultater

Individuelle dyredata fremlægges i tabelform. For hvert dyr registreres antallet af scorede umodne erythrocytter, antallet af umodne erythrocytter med mikrokerne og andelen af umodne erythrocytter i forhold til det samlede antal erythrocytter. Når mus behandles kontinuerligt i fire uger eller derover, bør der også anføres data om antallet og andelen af modne erythrocytter med mikrokerner, hvis de indsamles. Data om dyretoksicitet og kliniske tegn bør også anføres.

Acceptkriterier

Følgende kriterier bestemmer, om testen kan accepteres:

Evaluering og fortolkning af resultater

Såfremt alle acceptkriterier er opfyldt, anses et testkemikalie for at være klart positivt, hvis:

Hvis det kun er den højeste dosis, der undersøges på et bestemt prøveudtagningstidspunkt, anses et testkemikalie for at være klart positivt, hvis der er en statistisk signifikant stigning sammenlignet med den sideløbende negative kontrol, og resultaterne ligger uden for fordelingen af de historiske negative kontroldata (f.eks. Poisson-baserede kontrolgrænser på 95 %). Anbefalinger til de mest hensigtsmæssige statistiske metoder kan findes i litteraturen (44) (45) (46) (47). Ved en dosis/respons-analyse bør mindst tre behandlede dosisgrupper analyseres. I de statistiske test bør dyret anvendes som forsøgsenhed. Positive resultater af mikrokernetesten viser, at testkemikaliet fremkalder mikrokerner, som er en følge af kromosombeskadigelse eller beskadigelse af mitoseapparatet hos erythroblaster i testarten. I det tilfælde, hvor der blev foretaget en test med henblik på at påvise centromerer i mikrokerner, er et testkemikalie, der producerer mikrokerner indeholdende centromer (DNA-centromer eller kinetokor, tegn på hele kromosomtab) tegn på, at testkemikaliet er et aneugen.

Såfremt alle acceptkriterier er opfyldt, anses et testkemikalie for at være klart negativt, hvis følgende er opfyldt under alle de undersøgte forsøgsbetingelser:

Anbefalinger til de mest hensigtsmæssige statistiske metoder kan findes i litteraturen (44) (45) (46) (47). Dokumentation for knoglemarvens eksponering for et testkemikalie kan omfatte et fald i forholdet mellem umodne og modne erythrocytter eller måling af plasma eller blodniveauer for testkemikaliet. I tilfælde af intravenøs indgivelse er der ikke behov for dokumentation for eksponering. Alternativt kan der anvendes ADME-data indsamlet i en uafhængig undersøgelse under anvendelse af den samme metode og de samme arter til påvise knoglemarvseksponering. Negative resultater viser, at testkemikaliet under testbetingelserne ikke fremkalder mikrokerner hos umodne erythrocytter hos testarterne.

Der er ikke krav om verifikation af en klart positiv eller negativ respons.

Hvis responsen hverken er klart negativ eller positiv og for at bidrage til at fastslå den biologiske relevans af et resultat (f.eks. en svag eller usikker stigning), bør dataene evalueres af eksperter, og/eller der bør foretages yderligere undersøgelser af de afsluttede forsøg. I nogle tilfælde kan det være nyttigt at analysere flere celler eller foretage en ny undersøgelse under anvendelse af modificerede forsøgsbetingelser.

I sjældne tilfælde, selv efter yderligere undersøgelser, giver dataene ikke mulighed for at konkludere, om testkemikaliet fremkalder enten positive eller negative resultater, og konklusionen er derfor, at undersøgelsen er tvetydig.

Testrapport

Testrapporten bør indeholde følgende oplysninger:

LITTERATUR

6)

Del B, kapitel B.15 udgår.

7)

Del B, kapitel B.16 udgår.

8)

Del B, kapitel B.18 udgår.

9)

Del B, kapitel B.19 udgår.

10)

Del B, kapitel B.20 udgår.

11)

Del B, kapitel B.24 udgår.

12)

Del B, kapitel B.47, affattes således:

»B.47   Forsøgsmetode til påvisning af oksecornea-uklarhed og -permeabilitet til identifikation af i) kemikalier, der medfører alvorlig øjenskade, og ii) kemikalier, der ikke kræver klassificering for øjenirritation eller alvorlig øjenskade

INDLEDNING

Denne forsøgsmetode svarer til OECD-testvejledning (Test Guideline (TG)) 437 (2013). Forsøgsmetoden til påvisning af oksecornea-uklarhed og -permeabilitet (BCOP-forsøgsmetoden) blev evalueret af Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) sammen med Det Europæiske Center for Validering af Alternative Metoder (ECVAM) og Japanese Center for the Validation of Alternative Methods (JaCVAM) i 2006 og 2010 (1) (2). I den første evaluering blev BCOP-forsøgsmetoden evalueret med henblik på at identificere kemikalier (stoffer og blandinger), der medfører alvorlig øjenskade (1). I den anden evaluering blev BCOP-forsøgsmetoden evalueret med henblik på at identificere kemikalier (stoffer og blandinger), der ikke er klassificeret som forårsagende øjenirritation eller alvorlig øjenskade (2). BCOP-valideringsdatabasen indeholdt i alt 113 stoffer og 100 blandinger (2) (3). Ud fra disse evalueringer og deres peer reviews blev det konkluderet, at forsøgsmetoden på korrekt vis såvel kan anvendes til at identificere kemikalier (både stoffer og blandinger), der medfører alvorlig øjenskade (kategori 1), som dem, der ikke kræver klassificering for øjenirritation eller alvorlig øjenskade som defineret ved De Forenede Nationers (FN) globalt harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier (GHS) (4) og forordning (EF) nr. 1272/2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger (CLP) (7), og den blev derfor anerkendt som videnskabeligt gyldig til begge formål. Alvorlig øjenskade er frembringelse af vævsbeskadigelse i øjet eller alvorlig fysisk synsnedsættelse, som opstår efter påføring af et testkemikalie på øjets anteriore overflade, og som ikke er fuldt reversibel inden for 21 dage efter påføring. Testkemikalier, der medfører alvorlig øjenskade, er klassificeret som UN GHS-kategori 1. Kemikalier, der ikke klassificeres som forårsagende øjenirritation eller alvorlig øjenskade, defineres på samme måde som de kemikalier, der ikke opfylder kravene med hensyn til klassificering som UN GHS-kategori 1 eller 2 (2A eller 2B), dvs. de betegnes som UN GHS uden for kategori. Forsøgsmetoden omfatter den anbefalede anvendelse og begrænsninger af BCOP-forsøgsmetoden baseret på dens evalueringer. De vigtigste forskelle mellem den oprindelige udgave fra 2009 og den opdaterede udgave fra 2013 af OECD's vejledning (Test Guideline) omfatter, men er ikke begrænset til: anvendelse af BCOP-forsøgsmetoden til at identificere kemikalier, der ikke kræver UN GHS-klassificering (punkt 2 og 7), præcisering af anvendelsen af BCOP-forsøgsmetoden til test af alkoholer, ketoner og faste stoffer (punkt 6 og 7) og af stoffer og blandinger (punkt 8), præcisering af, hvordan overfladeaktive stoffer og blandinger, som indeholder overfladeaktive stoffer, testes (punkt 28), ajourføringer og præciseringer af de positive kontroller (punkt 39 og 40), en opdatering af beslutningskriterierne for BCOP-forsøgsmetoden (punkt 47), ajourføring af undersøgelsesacceptkriterier (punkt 48), ajourføring af testrapportens elementer (punkt 49), ajourføring af tillæg 1 om definitioner, tilføjelse af tillæg 2 om BCOP-forsøgsmetodens forudsigelsesevne efter forskellige klassifikationssystemer, ajourføring af tillæg 3 på listen over kompetencekemikalier og ajourføring af tillæg 4 om BCOP-corneaholderen (punkt 1) og opacitometeret (punkt 2 og 3).

I dag er det generelt accepteret, at der i den nærmeste fremtid ikke vil være en enkelt in vitro-øjenirritationstest, der vil kunne erstatte in vivo-Draize-øjentesten til forudsigelse af hele spektret af irritation for forskellige kemikaliegrupper. Imidlertid vil strategiske kombinationer af flere alternative forsøgsmetoder i en (trinvis) teststrategi muligvis kunne erstatte Draize-øjentesten (5). Top-down-tilgangen (5) er beregnet til at skulle anvendes, hvor et kemikalie på grund af eksisterende oplysninger ventes at have et højt irritationspotentiale, mens bottom-up-tilgangen (5) er beregnet til at skulle anvendes, hvor et kemikalie på grund af eksisterende oplysninger ikke ventes at forårsage tilstrækkelig øjenirritation til, at der kræves en klassificering. BCOP-forsøgsmetoden er en in vitro- forsøgsmetode, som kan anvendes under visse omstændigheder og med særlige begrænsninger for klassificering af risikoen for øjenskader og mærkning af kemikalier. Selv om den ikke betragtes som en gyldig enkeltstående erstatning for in vivo- kaninøjentesten, anbefales BCOP-forsøgsmetoden som første trin i en teststrategi, såsom top-down-tilgangen som anført af Scott et al. (5), til at identificere kemikalier, der medfører alvorlig øjenskade, dvs. kemikalier, der skal klassificeres som UN GHS-kategori 1 uden yderligere test (4). BCOP-forsøgsmetoden anbefales også til at identificere kemikalier, der ikke kræver klassificering for øjenirritation eller alvorlig øjenskade, som defineret i UN GHS (UN GHS uden for kategori) (4) i en teststrategi, såsom bottom-up-tilgangen (5). Et kemikalie, som ikke forudses at forårsage alvorlig øjenskade, eller som ikke er klassificeret som forårsagende irritation/alvorlig øjenskade med BCOP-forsøgsmetoden, vil kræve yderligere test (in vitro og/eller in vivo), for at den endelige klassificering kan fastslås.

Formålet med denne forsøgsmetode er at beskrive de procedurer, som anvendes til at vurdere et testkemikalies potentielle risiko for øjenskade som målt ved dets evne til at inducere uklarhed og øget permeabilitet i en isoleret oksecornea. Toksiske virkninger for cornea måles ved: i) nedsat lystransmission (uklarhed) og ii) øget passage af farvestoffet natriumfluorescein (permeabilitet). Uklarheds- og permeabilitetsvurderingerne af cornea efter eksponering for et testkemikalie kombineres til udledning af en in vitro-irritationsscore (IVIS, In Vitro Irritancy Score), som anvendes til at klassificere testkemikaliets irritationsniveau.

Definitioner findes i tillæg 1.

INDLEDENDE OVERVEJELSER OG BEGRÆNSNINGER

Denne forsøgsmetode er baseret på ICCVAM BCOP-forsøgsmetodeprotokollen (6) (7), som oprindeligt blev udviklet på baggrund af oplysninger fra protokollen fra Institute for in vitro Sciences (IIVS) og INVITTOX Protocol 124 (8). Sidstnævnte er den protokol, der blev anvendt til De Europæiske Fællesskabers sponsorerede prævalideringsundersøgelse, som blev gennemført i 1997-1998. Begge disse protokoller var baseret på BCOP-forsøgsmetoden, som først blev rapporteret af Gautheron et al. (9).

BCOP-forsøgsmetoden kan anvendes til at identificere kemikalier, der medfører alvorlig øjenskade som defineret af UN GHS, dvs. kemikalier, der skal klassificeres som UN GHS-kategori 1 (4). BCOP-forsøgsmetoden har til dette formål en generel nøjagtighed på 79 % (150/191), en falsk positiv-rate på 25 % (32/126) og en falsk negativ-rate på 14 % (9/65) sammenlignet med in vivo-kaninøjeforsøgsmetodedata klassificeret i henhold til UN GHS-klassificeringssystemet (3) (jf. tillæg 2, tabel 1). Når testkemikalier inden for visse kemiske (dvs. alkoholer, ketoner) eller fysiske (dvs. faste stoffer) klasser udelukkes fra databasen, har BCOP-forsøgsmetoden en nøjagtighed på 85 % (111/131), en falsk positiv-rate på 20 % (16/81) og en falsk negativ-rate på 8 % (4/50) for UN GHS-klassificeringssystemet (3). De mulige mangler ved BCOP-forsøgsmetoden, når den anvendes til at identificere kemikalier, der medfører alvorlig øjenskade (UN GHS-kategori 1) er baseret på de høje falsk positiv-rater for alkoholer og ketoner og den høje falsk negativ-rate for faste stoffer i valideringsdatabasen (1) (2) (3). Da ikke alle alkoholer og ketoner imidlertid overfortolkes af BCOP-forsøgsmetoden, og nogle fortolkes korrekt som UN GHS-kategori 1, anses disse to organiske funktionelle grupper ikke for at ligge uden for forsøgsmetodens anvendelsesområde. Det er op til brugeren af denne forsøgsmetode at beslutte, om en mulig overfortolkning af en alkohol eller keton kan accepteres, eller om der bør foretages yderligere “weight-of-evidence”-undersøgelser. Med hensyn til falsk negativ-raterne for faste stoffer skal det bemærkes, at faste stoffer kan føre til varierende og ekstrem eksponering i in vivo-Draize-øjenirritationstesten, hvilket kan medføre irrelevante forudsigelser af deres sande irritationspotentiale (10). Det skal også bemærkes, at ingen af de falsk negative resultater i ICCVAM-valideringsdatabasen (2) (3) ved identifikation af kemikalier, der medfører alvorlig øjenskade (UN GHS-kategori 1), resulterede i IVIS ≤ 3, som er det kriterium, der anvendes til at identificere et testkemikalie som UN GHS uden for kategori. Endvidere er falsk negative resultater af BCOP-forsøgsmetoden i denne forbindelse ikke afgørende, eftersom alle testkemikalier, der giver en 3 < INIS ≤ 55, efterfølgende vil blive testet med andre tilstrækkeligt validerede in vitro-test, alt efter de forskriftsmæssige krav, ved anvendelse af en sekventiel teststrategi med en “weight-of-the-evidence”-tilgang. Da visse faste kemikalier fortolkes korrekt af BCOP-forsøgsmetoden som UN GHS-kategori 1, anses denne fysiske tilstand heller ikke for at ligge uden for forsøgsmetodens anvendelsesområde. Undersøgeren kan overveje at anvende denne forsøgsmetode til alle typer kemikalier, hvorved en IVIS > 55 bør accepteres som indikation på alvorlig øjenskade, der bør klassificeres som UN GHS-kategori 1 uden yderligere test. Som allerede nævnt bør positive resultater for alkoholer eller ketoner dog fortolkes med forsigtighed som følge af risikoen for overfortolkning.

BCOP-forsøgsmetoden kan også anvendes til at identificere kemikalier, der ikke kræver klassificering for øjenirritation eller alvorlig øjenskade i henhold til UN GHS-klassificeringssystemet (4). BCOP-forsøgsmetoden har til dette formål en generel nøjagtighed på 69 % (135/196), en falsk positiv-rate på 69 % (61/89) og en falsk negativ-rate på 0 % (0/107) i sammenligning med in vivo-kaninøjeforsøgsmetodedata klassificeret i henhold til UN GHS-klassificeringssystemet (3) (jf. tillæg 2, tabel 2). Den falsk negativ-rate, der opnås (in vivo-kemikalier klassificeret som UN GHS uden for kategori, der frembringer en IVIS > 3, jf. punkt 47) anses for at være høj, men ikke afgørende, eftersom alle testkemikalier, der giver en 3 < INIS ≤ 47, efterfølgende vil blive testet med andre tilstrækkeligt validerede in vitro-test, alt efter de forskriftsmæssige krav, ved anvendelse af en sekventiel teststrategi med en “weight-of-the-evidence”-tilgang. BCOP-forsøgsmetoden viser ingen specifikke mangler vedrørende test af alkoholer, ketoner og faste stoffer, når formålet er at identificere kemikalier, der ikke kræver klassificering for øjenirritation eller alvorlig øjenskade (UN GHS uden for kategori) (3). Undersøgerne kunne overveje at anvende denne forsøgsmetode til alle typer kemikalier, hvorved et negativt resultat (IVIS < 3) bør accepteres som tegn på, at ingen klassifikation er påkrævet (UN GHS uden for kategori). Da BCOP-forsøgsmetoden kun kan identificere 31 % af de kemikalier, der ikke kræver klassificering for øjenirritation eller alvorlig øjenskade, korrekt, må metoden ikke være det første valg til at indlede en bottom-up-tilgang (5), hvis der findes andre validerede og anerkendte in vitro- metoder med tilsvarende høj følsomhed, men højere specificitet.

BCOP-valideringsdatabasen indeholdt i alt 113 stoffer og 100 blandinger (2) (3). BCOP-forsøgsmetoden anses derfor for at være gælde test af både stoffer og blandinger.

BCOP-forsøgsmetoden anbefales ikke til identifikation af testkemikalier, der bør klassificeres som øjenirriterende (UN GHS-kategori 2 eller -kategori 2A) eller testkemikalier, der bør klassificeres som let øjenirriterende (UN GHS-kategori 2B) som følge af det store antal kemikalier i UN GHS-kategori 1, der underklassificeres som UN GHS-kategori 2, 2A eller 2B, og kemikalier, der ifølge UN GHS er uden for kategori, og som overklassificeres som UN GHS-kategori 2, 2A eller 2B (2) (3). Til dette formål kan der være behov for at gennemføre yderligere test med en anden egnet metode.

Alle procedurer med okseøjne og oksecorneae bør følge testfacilitetens gældende forskrifter og procedurer for håndtering af animalske materialer, hvilket omfatter, men ikke er begrænset til, væv og vævsvæsker. Det anbefales at benytte universale laboratorieforsigtighedsregler (11).

Mens BCOP-forsøgsmetoden ikke tager højde for conjunctiva- og irisskader, behandler den corneavirkninger, som er de vigtigste faktorer for klassificering in vivo med hensyn til UN GHS-klassificering. Reversibiliteten af cornealæsioner kan ikke vurderes i sig selvmed BCOP-forsøgsmetoden. Det er på grundlag af kaninøjeundersøgelser foreslået, at en vurdering af den indledende cornealæsionsdybde kan anvendes til at identificere visse typer irreversible virkninger (12). Der er dog behov for yderligere videnskabelig viden for at forstå, hvordan irreversible virkninger, der ikke er forbundet med indledende stor skade, opstår. Endelig muliggør BCOP-forsøgsmetoden ikke vurdering af den potentielle systemiske toksicitet i forbindelse med øjeneksponering.

Denne forsøgsmetode vil blive opdateret regelmæssigt, i takt med at nye oplysninger og data behandles. Histopatologi kan f.eks. være potentielt nyttig ved behov for en mere fuldstændig beskrivelse af skader på cornea. Som beskrevet i OECD's vejledning nr. 160 (13) opfordres brugerne til at konservere corneae og udarbejde histopatologiprøver, der kan bruges til at udvikle en database og beslutningskriterier, der kan forbedre nøjagtigheden af denne forsøgsmetode yderligere.

Ethvert laboratorium bør, når det påbegynder brug af denne forsøgsmetode, benytte kompetencekemikalierne i tillæg 3. Et laboratorium kan benytte disse kemikalier til at godtgøre sin tekniske kompetence vedrørende brug af BCOP-forsøgsmetoden, inden det påbegynder fremsendelse af BCOP-forsøgsmetodedata med henblik på forskriftsmæssig fareklassificering.

PRINCIP FOR TESTEN

BCOP-forsøgsmetoden er en organotypisk model, som kortvarigt opretholder normal fysiologisk og biokemisk funktion af oksecornea in vitro. Ved denne forsøgsmetode vurderes testkemikaliets beskadigende virkning ved kvantitative målinger af ændringer i cornea-uklarhed og -permeabilitet med henholdsvis et opacitometer og et spektrofotometer til synligt lys. Begge målinger anvendes til at beregne en IVIS, som anvendes til at tildele en in vitro-irritationsfareklassificeringskategori med henblik på forudsigelse af et testkemikalies in vivo-øjenirritationspotentiale (jf. Beslutningskriterier i punkt 48).

I BCOP-forsøgsmetoden anvendes isolerede corneae fra øjnene fra friskslagtet kvæg. Cornea-uklarhed måles kvantitativt som mængden af lystransmission gennem cornea. Permeabilitet måles kvantitativt som mængden af farvestoffet natriumfluorescein, der passerer gennem den fulde tykkelse af cornea som påvist i mediet i det bageste kammer. Testkemikalierne tilføres til cornea-epiteloverfladen ved tilsætning til corneaholderens forreste kammer. I tillæg 4 findes en beskrivelse af og et diagram over en corneaholder, som anvendes i BCOP-forsøgsmetoden. Corneaholdere kan købes i handelen fra forskellige kilder eller konstrueres.

Kilde til okseøjne og deres alder samt udvælgelse af dyrearter

Kvæg, som sendes til slagterier, aflives typisk enten med henblik på anvendelse til konsum eller anden kommerciel udnyttelse. Kun raske dyr, som anses for egnede til at indgå i menneskets fødekæde, anvendes som kilde til corneae til brug i BCOP-forsøgsmetoden. Eftersom vægtintervallet for kvæg er bredt og afhænger af race, alder og køn, er der ingen anbefalet vægt for dyrene på slagtetidspunktet.

Der kan forekomme variationer i corneadimensioner ved anvendelse af øjne fra dyr med forskellig alder. Corneae med en vandret diameter > 30,5 mm og værdier for den centrale corneatykkelse (CCT) på ≥ 1 100 μm stammer i almindelighed fra kvæg, som er mere end otte år gamle, mens corneae med en vandret diameter < 28,5 mm og CCT < 900 μm i almindelighed stammer fra kvæg, som er mindre end fem år gamle (14). Derfor anvendes der typisk ikke øjne fra kvæg, som er mere end 60 måneder gamle. Øjne fra kvæg, som er mindre end 12 måneder gamle, har traditionelt ikke været anvendt, eftersom disse øjne stadig er i udviklingsfasen, og corneatykkelsen og -diameteren er betydeligt mindre end det rapporterede for øjne fra voksent kvæg. Anvendelse af corneae fra yngre (dvs. 6-12 måneder gamle) dyr er imidlertid tilladelig, eftersom det giver visse fordele, såsom øget tilgængelighed, et snævert aldersinterval og nedsat risiko for potentiel arbejdstagereksponering for bovin spongiform encefalopati (BSE) (15). Da yderligere vurdering af betydningen af corneastørrelse eller -tykkelse for responsen på ætsende og irriterende kemikalier ville være nyttig, opfordres brugerne til at rapportere den estimerede alder og/eller vægt for de dyr, hvorfra de corneae, der undersøges, stammer.

Indsamling og transport af øjne til laboratoriet

Øjnene indsamles af slagteriarbejdere. For at minimere mekanisk og anden beskadigelse af øjnene bør de enukleeres hurtigst muligt efter dyrenes aflivning og nedkøles straks efter enukleering og under transport. For at forhindre at øjnene eksponeres for potentielt irriterende kemikalier, må slagteriarbejderne ikke anvende rensemiddel, når de skyller dyrenes hoveder.

Øjnene bør nedsænkes helt i nedkølet Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) i en beholder af en passende størrelse og transporteres til laboratoriet på en sådan måde, at ødelæggelse og/eller bakteriekontaminering minimeres. Eftersom øjnene indsamles under slagteprocessen, vil de kunne blive eksponeret for blod og andre biologiske materialer, herunder bakterier og andre mikroorganismer. Det er derfor vigtigt at sikre, at risikoen for kontaminering minimeres (f.eks. ved at opbevare beholderen med øjnene på våd is under indsamling og transport, ved at tilsætte antibiotika til den HBSS, som øjnene opbevares i under transport [f.eks. penicillin i en koncentration på 100 IE/ml og streptomycin i en koncentration på 100 μg/ml)].

Tidsintervallet mellem indsamling af øjnene og anvendelsen af corneae i BCOP-forsøgsmetoden bør minimeres (typisk indsamling og anvendelse samme dag), og det bør påvises, at intervallets varighed ikke påvirker assayresultaterne negativt. Disse resultater er baseret på udvælgelseskriterierne for øjnene såvel som de positive og negative kontrolresponser. Alle de øjne, som anvendes i assayet, bør stamme fra samme gruppe øjne, som er indsamlet på en bestemt dag.

Udvælgelseskriterier for øjne, der anvendes i BCOP-forsøgsmetoden

Når øjnene er ankommet til laboratoriet, undersøges de omhyggeligt for defekter, herunder øget uklarhed, ridser og neovaskularisering. Der anvendes kun corneae fra øjne, som er fri for sådanne defekter.

Kvaliteten af hver enkelt cornea vurderes også på senere assaytrin. Corneae med en uklarhed på mere end syv uklarhedsenheder eller tilsvarende for det opacitometer og de corneaholdere, der anvendes efter en indledende ligevægtsindstillingsperiode på en time, skal kasseres (BEMÆRK: opacitometeret bør kalibreres med uklarhedsstandarder, som anvendes til at fastlægge uklarhedsenhederne, se tillæg 4).

Hver behandlingsgruppe (testkemikalie, samtidige negative og positive kontroller) består af minimum tre øjne. Der bør anvendes tre corneae som negative kontrolcorneae i BCOP-forsøgsmetoden. Eftersom alle corneae udskæres fra det hele øjeæble og anbringes i corneakamrene, er der risiko for håndteringsforårsagede artefakter i de individuelle værdier for cornea-uklarhed og -permeabilitet (inklusive negativ kontrol). Uklarheds- og permeabilitetsværdierne for de corneae, der fungerer som negativ kontrol, anvendes desuden til at korrigere uklarheds- og -permeabilitetsværdierne for testkemikaliebehandlede og positiv kontrol-behandlede corneae i IVIS-beregningerne.

FREMGANGSMÅDE

Præparering af øjnene

Corneae, som er fri for defekter, fridissekeres således, at der stadig er en 2-3 mm sclerakant tilbage til hjælp ved efterfølgende håndtering, idet det tilstræbes at undgå at beskadige cornea-epitelet og -endotelet. Isolerede corneae anbringes i specialdesignede corneaholdere, der består af et forreste og bageste kammer, som grænser op til henholdsvis epitel- og endotelsiden af cornea. Begge kamre fyldes rigeligt op med forvarmet Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) fri for phenolrødt (bageste kammer først), idet det sikres, at der ikke dannes bobler. Derpå bringes anordningen i ligevægt ved 32 ± 1 °C i mindst en time for at gøre det muligt for corneae at komme i ligevægt med mediet og opnå normal metabolisk aktivitet i det omfang, det er muligt (den tilnærmelsesvise temperatur af cornea-overfladen in vivo er 32 °C).

Efter ligevægtsindstillingsperioden tilsættes frisk forvarmet EMEM fri for phenolrødt til begge kamre, og der aflæses basislinje-uklarhed for hver cornea. Alle corneae, som viser makroskopisk vævsbeskadigelse (f.eks. ridser, pigmentering, neovaskularisering) eller en uklarhed på mere end syv uklarhedsenheder eller tilsvarende for det opacitometer og de corneaholdere, der anvendes, kasseres. Mindst tre corneae udvælges som negative kontrolcorneae (eller opløsningsmiddelkontrolcorneae). De resterende corneae fordeles derpå i en behandlingsgruppe og en positiv kontrolgruppe.

Eftersom varmekapaciteten for vand er højere end for luft, giver vand mere stabile temperaturbetingelser til inkubering. Derfor anbefales det at benytte et vandbad til at holde corneaholderen og dens indhold ved 32 ± 1 °C. Der kan dog også anvendes luftinkubatorer under forudsætning af omhyggelig opretholdelse af en stabil temperatur (f.eks. ved forvarmning af holdere og medier).

Påføring af testkemikaliet

Der anvendes to forskellige behandlingsprotokoller — en for væsker og overfladeaktive stoffer (faste stoffer eller væsker) og en for ikke-overfladeaktive stoffer.

Væsker testes ufortyndede. Halvfaste stoffer, cremer og vokser testes typisk som væsker. Rene overfladeaktive stoffer testes ved en koncentration på 10 % vægt/volumen i en 0,9 % natriumchloridopløsning, destilleret vand eller et andet opløsningsmiddel, som påviseligt ikke påvirker testsystemet negativt. Der bør gives passende begrundelse for alternative fortyndingskoncentrationer. Blandinger, der indeholder overfladeaktive stoffer, kan testes ufortyndet eller fortyndet til en passende koncentration, afhængigt af de relevante eksponeringsscenarier in vivo. Der bør gives passende begrundelse for den testede koncentration. Corneae eksponeres for væsker og overfladeaktive stoffer i 10 minutter. Anvendelse af andre eksponeringstider bør ledsages af en tilstrækkelig videnskabelig begrundelse. Der henvises til tillæg 1 for en definition af overfladeaktive stoffer og blandinger indeholdende overfladeaktivt stof.

Ikke-overfladeaktive faste stoffer testes typisk som opløsninger eller opslæmninger ved en koncentration på 20 % vægt/volumen i en 0,9 % natriumchloridopløsning, destilleret vand eller et andet opløsningsmiddel, som påviseligt ikke påvirker testsystemet negativt. Under visse omstændigheder og med behørig videnskabelig begrundelse kan faste stoffer også testes i ren form ved direkte påføring på corneaoverfladen ved anvendelse af metoden med åbent kammer (jf. punkt 32). Corneae eksponeres for faste stoffer i fire timer, men som for væsker og overfladeaktive stoffer kan der anvendes alternative eksponeringstider med en tilstrækkelig videnskabelig begrundelse.

Der kan anvendes forskellige behandlingsmetoder alt efter testkemikaliets fysiske natur og kemiske egenskaber (f.eks. faste stoffer, væsker, viskøse kontra ikke-viskøse væsker). I den forbindelse er det absolut påkrævet at sikre, at testkemikaliet dækker epiteloverfladen tilstrækkeligt, og at det fjernes tilstrækkeligt under skylletrinnene. Der anvendes typisk en metode med lukket kammer for ikke-viskøse til let viskøse flydende testkemikalier, mens der typisk anvendes en metode med åbent kammer for halvviskøse og viskøse flydende testkemikalier og for rene faste stoffer.

Ved metoden med lukket kammer indføres der tilstrækkeligt testkemikalie (750 μl) til at dække cornea-epitelsiden i det forreste kammer gennem doseringshullerne på kammerets overside, og hullerne lukkes efterfølgende med kammerpropperne under eksponeringen. Det er vigtigt at sikre, at hver cornea eksponeres for et testkemikalie i det rette tidsinterval.

Ved metoden med åbent kammer fjernes vindueslåseringen og glasvinduet fra det forreste kammer inden behandling. Kontrol- eller testkemikaliet (750 μl — nok testkemikalie til at dække cornea helt) påføres direkte på cornea-epiteloverfladen ved anvendelse af en mikropipette. Hvis et testkemikalie er vanskeligt at pipettere, kan testkemikaliet fyldes i en pipette med positiv fortrængning under tryk for at lette doseringen. Spidsen på pipetten med positiv fortrængning indsættes i sprøjtens doseringsspids, således at materialet kan fyldes over i fortrængningsspidsen under tryk. Samtidig trykkes sprøjtestemplet ned, efterhånden som pipettestemplet trækkes opad. Hvis der dukker luftbobler op i pipettespidsen, fjernes testkemikaliet (det presses ud), og processen gentages, indtil spidsen er fyldt uden luftbobler. Om nødvendigt kan der anvendes en normal sprøjte (uden kanyle), eftersom en sådan sprøjte dels muliggør afmåling af et nøjagtigt volumen testkemikalie og dels letter påføring på cornea-epiteloverfladen. Efter doseringen sættes glasvinduet på plads på det forreste kammer for at genskabe et lukket system.

Inkubering efter eksponering

Efter eksponeringsperioden fjernes testkemikaliet, den negative kontrol eller det positive kontrolkemikalie fra det forreste kammer, og epitelet vaskes mindst tre gange (eller indtil der ikke længere er synlige tegn på testkemikalie) med EMEM (som indeholder phenolrødt). Der anvendes phenolrødt-holdigt medium til skylning, eftersom et farveskift for phenolrødt kan anvendes som indikator for effektiviteten af bortskylning af sure eller basiske testkemikalier. Corneae vaskes mere end tre gange, hvis phenolrødt stadig er misfarvet (gul eller violet), eller hvis testkemikaliet stadig er synligt. Når testkemikaliet er fjernet fra mediet, foretages en afsluttende skylning af corneae med EMEM (uden phenolrødt). EMEM (uden phenolrødt) anvendes til afsluttende skylning for at sikre fjernelse af phenolrødt fra det forreste kammer inden uklarhedsmålingen. Derefter fyldes det forreste kammer igen med frisk EMEM uden phenolrødt.

For væsker eller overfladeaktive stoffer inkuberes corneae efter skylning i yderligere to timer ved 32 ± 1 °C. Længere tid efter eksponering kan være nyttig under visse omstændigheder og kan overvejes i hvert enkelt tilfælde. Corneae, som er behandlet med faste stoffer, skylles grundigt ved afslutningen af den fire timer lange eksponeringsperiode, men kræver ikke yderligere inkubering.

Ved afslutningen af inkubationsperioden efter eksponeringen for væsker og overfladeaktive stoffer og ved afslutningen af den fire timer lange eksponeringsperiode for ikke-overfladeaktive faste stoffer registreres uklarheden og permeabiliteten for hver cornea. Desuden observeres hver cornea visuelt, og væsentlige observationer registreres (f.eks. vævsafskalning, resterende testkemikalie, uensartede uklarhedsmønstre). Disse observationer kan være vigtige, da de kan give sig udslag i variationer i opacitometeraflæsningerne.

Kontrolkemikalier

Der indgår samtidige negative kontroller eller opløsningsmiddel/bærestof-kontroller og positive kontroller i hvert forsøg.

Ved test af et flydende stof i en koncentration på 100 % medtages der ved BCOP-forsøgsmetoden en samtidig negativ kontrol (f.eks. 0,9 % natriumchloridopløsning eller destilleret vand), således at der kan påvises ikke-specifikke ændringer i testsystemet og opnås en basislinje for assayets endepunkter. Det sikrer også, at assaybetingelserne ikke fejlagtigt resulterer i en irritationsrespons.

Ved test af fortyndet væske, overfladeaktivt stof eller fast stof medtages der i BCOP-forsøgsmetoden en samtidig opløsningsmiddel/bærestof-kontrolgruppe, således at der kan påvises ikke-specifikke ændringer i testsystemet og opnås en basislinje for assayets endepunkter. Kun et opløsningsmiddel/bærestof, som påviseligt ikke påvirker testsystemet negativt, kan anvendes.

Et kemikalie, som vides at fremkalde en positiv respons, indgår som en sideløbende positiv kontrol i hvert forsøg for at verificere integriteten af testsystemet og dets korrekte udførelse. For at sikre at det er muligt at vurdere variabiliteten i den positive kontrolrespons over tid, bør irritationsresponsen imidlertid ikke være overdrevent stor.

Eksempler på positive kontroller for flydende testkemikalier er 100 % ethanol eller 100 % dimethylformamid. Et eksempel på en positiv kontrol for faste testkemikalier er 20 % vægt/volumen imidazol i 0,9 % natriumchloridopløsning.

Referencekemikalier er nyttige i forbindelse med vurdering af øjenirritationspotentialet for ukendte kemikalier i en særlig kemikalie- eller produktgruppe eller vurdering af det relative irritationspotentiale for et øjenirriterende stof inden for et specifikt område af irritationsresponser.

Målte endepunkter

Uklarhed bestemmes ud fra mængden af lystransmission gennem cornea. Cornea-uklarhed måles kvantitativt ved hjælp af et opacitometer, hvorved der opnås uklarhedsværdier målt på en kontinuert skala.

Permeabilitet bestemmes ud fra mængden af farvestoffet natriumfluorescein, der trænger gennem alle corneacellelag (dvs. fra epitelet på den udvendige cornea-overflade til endotelet på den indvendige cornea-overflade). Der tilsættes 1 ml natriumfluoresceinopløsning (henholdsvis 4 mg/ml ved test af væsker og overfladeaktive stoffer og 5 mg/ml ved test af ikke-overfladeaktive faste stoffer) til det forreste kammer i corneaholderen, som grænser op til epitelsiden af cornea, mens det bageste kammer, som grænser op til endotelsiden af cornea, fyldes med frisk EMEM. Derpå inkuberes holderen i vandret position i 90 ± 5 min. ved 32 ± 1 °C. Mængden af natriumfluorescein, der kommer ind i det bageste kammer, måles kvantitativt ved hjælp af UV/VIS-spektrofotometri. Spektrofotometriske målinger vurderet ved 490 nm registreres som OD490 (OD = optisk tæthed) eller absorbansværdier, som måles på en kontinuert skala. Fluoresceinpermeabilitetsværdierne bestemmes ved anvendelse af OD490-værdier, som er opnået med et spektrofotometer til synligt lys ved brug af en standardvejlængde på 1 cm.

Der kan alternativt anvendes en aflæser til en mikrotiterplade med 96 brønde, forudsat at i) pladeaflæserens lineære interval for bestemmelse af fluorescein-OD490-værdier kan fastlægges; og at ii) volumenet af fluoresceinprøverne i pladen med 96 brønde er korrekt, således at der opnås OD490-værdier svarende til standardvejlængden på 1 cm (dette kan kræve en helt fuld brønd [sædvanligvis 360 μl l)].

DATA OG RAPPORTERING

Datavurdering

Efter at uklarhedsværdier og gennemsnitlige permeabilitetsværdier (OD490-værdier) er korrigeret for baggrundsuklarhed og permeabilitets-OD490-værdierne for den negative kontrol, bør den gennemsnitlige uklarhedsværdi og den gennemsnitlige permeabilitets-OD490-værdi for hver behandlingsgruppe kombineres i en empirisk udledt formel for at beregne en in vitro-irritationsscore (IVIS) for hver behandlingsgruppe som følger:

IVIS = gennemsnitlig uklarhedsværdi + (15 × gennemsnitlig permeabilitets-OD490-værdi)

Sina et al. (16) rapporterede, at denne formel blev udledt under interne og sammenlignende laboratorieundersøgelser. Data genereret for i alt 36 forbindelser i en undersøgelse med deltagelse af flere laboratorier blev underkastet flerdimensional analyse for at bestemme ligningen for bedste fit mellem in vivo- og in vitro-data. Denne analyse blev udført af forskere i to forskellige virksomheder, som udledte næsten identiske ligninger.

Uklarheds- og permeabilitetsværdierne bør også vurderes uafhængigt for at fastslå, om et testkemikalie kun inducerer ætsning eller stærk irritation ud fra et af de to endepunkter (jf. Beslutningskriterier).

Beslutningskriterier

IVIS-cut-off-værdier for identificering af testkemikalier, som medfører alvorlig øjenskade (UN GHS-kategori 1), og testkemikalier, der ikke kræver klassificering for øjenirritation eller alvorlig øjenskade (UN GHS uden for kategori) er angivet nedenfor:

Undersøgelsesacceptkriterier

En test betragtes som acceptabel, hvis den positive kontrol giver en IVIS, der ligger inden for to standardafvigelser fra det aktuelle historiske gennemsnit, som skal ajourføres mindst hver tredje måned eller hver gang, der gennemføres en acceptabel test på laboratorier, hvor der sjældent gennemføres test (dvs. sjældnere end en gang om måneden). Negative eller opløsningsmiddel/bærestof-kontrolresponser bør resultere i uklarheds- og permeabilitetsværdier, der er mindre end de fastsatte øvre grænser for baggrundsuklarheds- og -permeabilitetsværdier for oksecorneae behandlet med den respektive negative kontrol eller opløsningsmiddel/bærestof-kontrol. En analyseserie bestående af mindst tre corneae bør være tilstrækkelig for et testkemikalie, når klassificeringsresultatet er entydigt. I tilfælde af tvetydige resultater i den første test bør det imidlertid overvejes at gennemføre endnu en analyseserie (men dette er ikke nødvendigvis påkrævet), samt en tredje i tilfælde af diskordante gennemsnitlige IVIS-resultater af de første to test. I denne forbindelse betragtes et resultat i den første test som tvetydigt, hvis forudsigelserne fra de tre corneae var diskordante, således at:

Testrapport

Testrapporten bør omfatte følgende oplysninger, hvis de er relevante for undersøgelsens gennemførelse:

LITTERATUR

Tillæg 4

BCOP-CORNEAHOLDEREN

BCOP-corneaholderne er fremstillet af et inaktivt materiale (f.eks. polypropylen). Holderne består af to halvdele (et forreste og et bageste kammer) og har to ens cylindriske indre kamre. Hvert kammer kan rumme et volumen på ca. 5 ml og er afgrænset af et glasvindue, gennem hvilket der foretages uklarhedsmålinger. Hvert indre kammer har en diameter på 1,7 cm og en dybde på 2,2 cm (11). Der er anbragt en o-ring på det bageste kammer for at forhindre lækager. Corneae anbringes med endotelsiden nedad på de bageste kamres o-ring, og de forreste kamre anbringes på epitelsiden af corneae. Kamrene holdes på plads med tre skruer af rustfrit stål, som er placeret på de udvendige kammerkanter. Der er placeret et glasvindue for enden af hvert kammer, som kan fjernes, så der er let adgang til cornea. Der er også anbragt en o-ring mellem glasvinduet og kammeret for at forhindre lækager. To huller på hvert kammers overside muliggør tilførsel og fjernelse af medium og testkemikalier. De er lukket med gummihætter under behandling og inkubering. Lystransmissionen gennem corneaholdere kan ændres, da virkningerne af slitage eller ophobning af specifikke kemikalierester på det indre kammers huller eller på glasvinduerne kan påvirke lysspredning eller reflektans. Som følge heraf kan der forekomme stigninger eller fald i basislinjelystransmission (og omvendt i basislinjeuklarhedsaflæsninger) gennem corneaholderne, og dette kan vise sig som markante ændringer i de forventede indledende basislinjemålinger af cornea-uklarhed i de enkelte kamre (dvs. de indledende værdier for cornea-uklarhed i specifikke corneaholdere kan rutinemæssigt afvige mere end to eller tre uklarhedsenheder fra de forventede basislinjeværdier). Hvert laboratorium bør overveje at oprette et program til evaluering af ændringer i lystransmission gennem corneaholdere, afhængigt af arten af de testede kemikalier og hvor hyppigt kamrene anvendes. For at fastlægge basislinjeværdier kan corneaholdere kontrolleres før rutinemæssig brug ved at måle baselinjeværdier for uklarhed (eller lystransmission) i kamre fyldt med komplet medium uden corneae. Corneaholderne kontrolleres derefter med jævne mellemrum for ændringer i lystransmissionen i de anvendte perioder. Hvert laboratorium kan fastsætte hyppigheden for kontrol af corneaholdere baseret på de testede kemikalier, hyppigheden af brug og observationer af ændringer i basislinjeværdierne for cornea-uklarhed. Hvis der observeres markante ændringer i lystransmissionen gennem corneaholderne, må det overvejes at gennemføre egnede rengørings- og/eller poleringsprocedurer for den indvendige overflade af corneaholderne eller foretage udskiftning.

Corneaholder: eksploderet diagram

glass disc

PTFE-O-ring

refill

hanger

cap

glass disc

nut

O-ring

posterior compartment

anterior compartment

nut

fixing screws

13)

Del B, kapitel B.48, affattes således:

»B.48   Isoleret kyllingeøje-forsøgsmetode til identifikation af i) kemikalier, der fremkalder alvorlig øjenskade og ii) kemikalier, der ikke kræver klassificering for øjenirritation eller alvorlig øjenskade

INDLEDNING

Denne forsøgsmetode svarer til OECD-testvejledning (Test Guideline (TG)) 438 (2013). Isoleret kyllingeøje-forsøgsmetoden blev evalueret af Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) sammen med Det Europæiske Center for Validering af Alternative Metoder (ECVAM) og Japanese Center for the Validation of Alternative Methods (JaCVAM) i 2006 og 2010 (1) (2) (3). I den første evaluering blev ICE godkendt som en videnskabeligt gyldig forsøgsmetode til brug som screeningtest til identifikation af kemikalier (stoffer og blandinger), der medfører alvorlig øjenskade (kategori 1) som defineret i FN's globalt harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier (UN GHS) (1) (2) (4) og forordning (EF) nr. 1272/2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger (CLP-forordningen) (12). I den anden evaluering blev ICE-forsøgsmetoden evalueret med henblik på brug som screeningtest til identifikation af kemikalier, der ikke er klassificeret for øjenirritation eller alvorlig øjenskade som defineret i UN GHS (3) (4). Resultaterne af valideringsundersøgelserne og peer review-panelets anbefalinger opretholdt den oprindelige anbefaling om at bruge ICE til klassificering af kemikalier, der medfører alvorlig øjenskade (UN GHS-kategori 1), eftersom den tilgængelige database var uændret siden den oprindelige ICCVAM-validering. På det tidspunkt blev der ikke foreslået yderligere anbefalinger om at udvide ICE's anvendelsesområde (domæne) til også at omfatte andre kategorier. Der blev foretaget en revurdering af in vitro- og in vivo-datasættet, der blev anvendt i valideringsundersøgelsen, med fokus på at vurdere, om ICE kunne anvendes til at identificere kemikalier, der ikke kræver klassificering for øjenirritation eller alvorlig øjenskade (5). Konklusionen på revurderingen var, at ICE-forsøgsmetoden også kan anvendes til at identificere kemikalier, der ikke kræver klassificering for øjenirritation og alvorlig øjenskade som defineret af UN GHS (4) (5). Forsøgsmetoden omfatter den anbefalede anvendelse og begrænsninger af ICE-forsøgsmetoden baseret på disse evalueringer. De vigtigste forskelle mellem den oprindelige version fra 2009 og den ajourførte version fra 2013 af OECD's vejledning omfatter, men er ikke begrænset til, brug af ICE-forsøgsmetoden til at identificere kemikalier, der ikke kræver klassificering i henhold til UN GHS-klassificeringssystemet, en ajourføring af testrapportens elementer, en ajourføring af tillæg 1 om definitioner og en ajourføring af tillæg 2 om kompetencekemikalierne.

I dag er det generelt accepteret, at der i den nærmeste fremtid ikke vil være en enkelt in vitro-øjenirritationstest, der vil kunne erstatte in vivo-Draize-øjentesten til forudsigelse af hele spektret af irritation for forskellige kemikaliegrupper. Strategiske kombinationer af flere alternative forsøgsmetoder i en (trinvis) teststrategi kan dog muligvis erstatte Draize-øjentesten (6). Top-down-tilgangen (7) er beregnet til at skulle anvendes, hvor et kemikalie på grund af eksisterende oplysninger ventes at have et højt irritationspotentiale, mens bottom-up-tilgangen (7) er beregnet til at skulle anvendes, hvor et kemikalie på grund af eksisterende oplysninger ikke ventes at forårsage tilstrækkelig øjenirritation til at kræve en klassificering. ICE-forsøgsmetoden er en in vitro-forsøgsmetode, som kan anvendes under visse omstændigheder og med særlige begrænsninger som beskrevet i punkt 8 til 10 for klassificering af risikoen for øjenskader og mærkning af kemikalier. Selv om den ikke betragtes som gyldig som enkeltstående erstatning for in vivo-kaninøjentesten, anbefales ICE-forsøgsmetoden som første trin i en teststrategi såsom top-down-tilgangen som anført af Scott et al. (7) til at identificere kemikalier, der medfører alvorlig øjenskade, dvs. kemikalier, der skal klassificeres som UN GHS-kategori 1 uden yderligere test (4). ICE-forsøgsmetoden anbefales også til at identificere kemikalier, der ikke kræver klassificering for øjenirritation eller alvorlig øjenskade, som defineret i UN GHS (uden for kategori), og kan derfor anvendes som det indledende trin i en bottom-up-tilgang (7). Et kemikalie, der ikke forudses at forårsage alvorlig øjenskade eller som ikke er klassificeret for øjenirritation/alvorlig øjenskade med ICE-forsøgsmetoden, vil kræve yderligere test (in vitro og/eller in vivo), for at den endelige klassificering kan fastslås. Desuden bør de relevante kompetente myndigheder høres, før ICE anvendes i en bottom-up-tilgang i henhold til andre klassifikationsordninger end UN GHS.

Formålet med denne forsøgsmetode er at beskrive de procedurer, som anvendes til at vurdere et testkemikalies potentielle risiko for at forårsage øjenskade som målt ved dets evne til at inducere toksicitet i et enukleeret kyllingeøje. Toksiske virkninger på cornea måles ved i) en kvalitativ vurdering af uklarhed, ii) en kvalitativ vurdering af epitelbeskadigelse på grundlag af påføring af fluorescein på øjet (fluoresceinretention), iii) en kvantitativ måling af øget tykkelse (opsvulmning) og iv) en kvalitativ vurdering af makroskopisk morfologisk overfladebeskadigelse. Vurderingerne af cornea-uklarhed, -opsvulmning og -beskadigelse efter eksponering for et testkemikalie evalueres individuelt, hvorefter de kombineres til udledning af en Eye Irritancy Classification (øjenirritationsklassificering).

Definitioner findes i tillæg 1.

INDLEDENDE OVERVEJELSER OG BEGRÆNSNINGER

Denne forsøgsmetode er baseret på den foreslåede protokol i OECD's vejledning 160 (8), som blev udviklet efter den internationale ICCVAM-valideringsundersøgelse (1) (3) (9) med bidrag fra Det Europæiske Center for Validering af Alternative Metoder, Japanese Center for the Validation of Alternative Methods og TNO Quality of Life Department of Toxicology and Applied Pharmacology (Nederlandene). Protokollen er baseret på oplysninger fra offentliggjorte protokoller, såvel som TNO's aktuelt anvendte protokol (10) (11) (12) (13) (14).

Der er blevet testet en lang række forskellige kemikalier i forbindelse med valideringen af denne forsøgsmetode, og den empiriske database for valideringsundersøgelsen omfatter 152 kemikalier i alt, herunder 72 stoffer og 80 blandinger (5). Forsøgsmetoden anvendes på faste stoffer, væsker, emulsioner og geler. Væsker kan være vandige eller ikke-vandige, og faste stoffer kan være opløselige eller uopløselige i vand. Gasser og aerosoler er endnu ikke vurderet ved en valideringsundersøgelse.

ICE-forsøgsmetoden kan anvendes til at identificere kemikalier, der medfører alvorlig øjenskade, dvs. kemikalier, der skal klassificeres som UN GHS-kategori 1 (4). De identificerede begrænsninger, der anvendes til denne ICE-forsøgsmetode, er baseret på de høje falsk positiv-rater for alkoholer og de høje falsk negativ-rater for faste stoffer og overfladeaktive stoffer (1) (3) (9). Falske negativ-rater er imidlertid ikke afgørende i denne forbindelse (UN GHS-kategori 1 identificeret som ikke UN GHS-kategori 1), eftersom alle testkemikalier, der giver en 1 < INIS ≤ 1, efterfølgende vil blive testet med andre tilstrækkeligt validerede in vitro-test, alt efter de forskriftsmæssige krav, ved anvendelse af en sekventiel teststrategi med en “weight-of-the-evidence”-tilgang. Det bør bemærkes, at faste stoffer kan føre til varierende og ekstrem eksponering i in vivo-Draize-øjenirritationstesten, hvilket kan medføre irrelevante forudsigelser af deres sande irritationspotentiale (15). Undersøgeren kan overveje at anvende denne forsøgsmetode til alle typer af kemikalier, hvorved et positivt resultat bør accepteres som indikation på alvorlig øjenskade, dvs. UN GHS-kategori 1 uden yderligere test. Positive resultater for alkoholer bør dog fortolkes med forsigtighed som følge af risikoen for overfortolkning.

Ved identificering af kemikalier, der medfører alvorlig øjenskade (UN GHS-kategori 1), har ICE-forsøgsmetoden en generel nøjagtighed på 86 % (120/140), en falsk positiv-rate på 6 % (7/113) og en falsk negativ-rate på 48 % (13/27) i sammenligning med in vivo-kaninøjeforsøgsmetodedata klassificeret i henhold til UN GHS-klassificeringssystemet (4) (5).

ICE-forsøgsmetoden kan også anvendes til at identificere kemikalier, der ikke kræver klassificering for øjenirritation eller alvorlig øjenskade i henhold til UN GHS-klassificeringssystemet (4). De relevante kompetente myndigheder bør høres, før ICE anvendes i en bottom-up-tilgang i henhold til andre klassifikationsordninger. Denne forsøgsmetode kan anvendes til alle typer af kemikalier, hvor der kan accepteres et negativt resultat, som ikke klassificerer et kemikalie for øjenirritation og alvorlig øjenskade. På grundlag af et resultat af valideringsdatabasen kan der forekomme underfortolkning af antifoulingmaling, der indeholder organiske opløsningsmidler (5).

Ved identificering af kemikalier, der ikke kræver klassificering for øjenirritation og alvorlig øjenskade, har ICE-forsøgsmetoden en generel nøjagtighed på 82 % (125/152), en falsk positiv-rate på 33 % (26/79) og en falsk negativ-rate på 1 % (1/73) sammenlignet med in vivo-kaninøjeforsøgsmetodedata klassificeret i henhold til UN GHS-klassificeringssystemet (4) (5). Når testkemikalier i visse klasser (dvs. antifoulingmaling, der indeholder organiske opløsningsmidler) udelukkes fra databasen, er nøjagtigheden af ICE-forsøgsmetoden 83 % (123/149), falsk positiv-raten 33 % (26/78) og falsk negativ-raten 0 % (0/71) for UN GHS-klassificeringssystemet (4) (5).

ICE-forsøgsmetoden anbefales ikke til identifikation af testkemikalier, der bør klassificeres som øjenirriterende (dvs. UN GHS-kategori 2 eller 2A) eller testkemikalier, der bør klassificeres som let øjenirriterende (UN GHS-kategori 2B), som følge af det store antal kemikalier i UN GHS-kategori 1, som underklassificeres som UN GHS-kategori 2, 2A eller 2B, og kemikalier, der ifølge UN GHS er uden for kategori, og som overklassificeres som UN GHS-kategori 2, 2A eller 2B. Til dette formål kan der være behov for at gennemføre yderligere test med en anden egnet metode.

Alle procedurer med kyllingeøjne bør følge testfacilitetens gældende forskrifter og procedurer for håndtering af humane eller animalske materialer, hvilket omfatter, men ikke er begrænset til, væv og vævsvæsker. Det anbefales at benytte universale laboratorieforsigtighedsregler (16).

Mens ICE-forsøgsmetoden ikke tager højde for conjunctiva- og irisskader som evalueret i kaninøjeforsøgsmetoden for irritation, behandler den corneavirkninger, som er den vigtigste faktor for klassificering in vivo i betragtning af UN GHS-klassificeringen. Desuden kan reversibiliteten af cornealæsioner ikke vurderes i sig selv med ICE-forsøgsmetoden, men det er på grundlag af kaninøjeundersøgelser foreslået, at en vurdering af den indledende cornealæsionsdybde kan anvendes til at identificere visse typer irreversible virkninger (17). Der er navnlig behov for yderligere videnskabelig viden for at forstå, hvordan irreversible virkninger, der ikke er forbundet med indledende stor skade, opstår. Endelig muliggør ICE-forsøgsmetoden ikke vurdering af den potentielle systemiske toksicitet i forbindelse med øjeneksponering.

Denne forsøgsmetode vil blive opdateret regelmæssigt, i takt med at nye oplysninger og data behandles. Histopatologi kan f.eks. være potentielt nyttig ved behov for en mere fuldstændig beskrivelse af skader på cornea. Ved evaluering af denne mulighed opfordres brugerne til at konservere øjnene og udarbejde histopatologiprøver, der kan bruges til at udvikle en database og beslutningskriterier, der kan forbedre nøjagtigheden af denne forsøgsmetode yderligere. OECD har udarbejdet en vejledning i brug af in vitro- øjentoksicitetsforsøgsmetoder, som omfatter detaljerede procedurer for indsamling af histopatologiprøver og oplysninger om, hvor man kan indsende prøver og/eller histopatologiske data (8).

Ethvert laboratorium bør, når det påbegynder brug af dette assay, benytte kompetencekemikalierne i tillæg 2. Et laboratorium kan benytte disse kemikalier til at godtgøre sin tekniske kompetence vedrørende brug af ICE-forsøgsmetoden, inden det påbegynder fremsendelse af ICE-data med henblik på forskriftsmæssig fareklassificering.

PRINCIP FOR TESTEN

ICE-forsøgsmetoden er en organotypisk model, som kortvarigt opretholder kyllingeøjets funktion in vitro. Ved denne forsøgsmetode vurderes testkemikaliets beskadigende virkning ved bestemmelse af corneaopsvulmning, -uklarhed og -fluoresceinretention. Mens de to sidstnævnte parametre indebærer en kvalitativ vurdering, medfører analyse af corneaopsvulmning, at der skal foretages en kvantitativ vurdering. Hver måling konverteres enten til en kvantitativ score, som anvendes til beregning af et samlet irritationsindeks (Irritation Index), eller tildeles en kvalitativ kategorisering, som anvendes til at tildele en in vitro-fareklassificering enten som UN GHS-kategori 1 eller som UN GHS uden for kategori. Disse resultater kan derefter anvendes til at forudsige potentiel alvorlig øjenskade in vivo eller fraværet af kravet om klassificering af risikoen for øjenskade for et testkemikalie (jf. Beslutningskriterier). Der kan imidlertid ikke gives nogen klassificering for kemikalier, som ikke forudsiges at medføre alvorlig øjenskade, eller som ikke er klassificeret med ICE-forsøgsmetoden (jf. punkt 11).

Kilde til kyllingeøjne og deres alder

Historisk set er der til dette assay anvendt øjne indsamlet fra kyllinger på et slagteri, hvor de aflives med henblik på anvendelse til konsum, hvilket eliminerer behovet for forsøgsdyr. Kun øjnene fra raske dyr, som anses for egnede til at indgå i menneskets fødekæde, anvendes.

Selv om der ikke er gennemført en kontrolleret undersøgelse til vurdering af den optimale kyllingealder, har de ved denne forsøgsmetode anvendte kyllinger historisk set haft samme alder og vægt som de på et fjerkræslagteri traditionelt behandlede vårkyllinger (dvs. ca. syv uger gamle kyllinger med en vægt på 1,5-2 kg).

Indsamling og transport af øjne til laboratoriet

Hovederne bør fjernes umiddelbart efter sedering af kyllingerne, som sædvanligvis sker ved elektrisk stød, og incision i halsen med henblik på afblødning. Der bør findes en lokal kilde til kyllinger tæt på laboratoriet, således at deres hoveder kan overføres fra slagteriet til laboratoriet hurtigt nok til, at ødelæggelse og/eller bakteriekontaminering minimeres. Tidsintervallet mellem indsamling af kyllingehovederne og placering af øjnene i superfusionsapparatets kammer efter enukleering bør minimeres (typisk inden for to timer) for at sikre, at assayets acceptkriterier overholdes. Alle de øjne, som anvendes i assayet, bør stamme fra samme gruppe øjne, som er indsamlet på en bestemt dag.

Eftersom øjnene fridissekeres i laboratoriet, transporteres de intakte hoveder fra slagteriet ved omgivende temperatur (typisk mellem 18 °C og 25 °C) i plastkasser befugtet med klude, som er vædet med isotonisk saltvand.

Udvælgelseskriterier for og antal øjne, der anvendes i ICE-testen

Øjne med et højt niveau af basislinjefluoresceinfarvning (dvs. > 0,5) eller en høj cornea-uklarhedsscore (dvs. > 0,5) efter enukleering kasseres.

Hver behandlingsgruppe og en samtidig positiv kontrol består af mindst tre øjne. Den negative kontrolgruppe eller opløsningsmiddelkontrollen (hvis der anvendes et andet opløsningsmiddel end saltvand) består af mindst et øje.

I tilfælde af faste materialer, der resulterer i UN GHS uden for kategori, anbefales det at foretage endnu en test af tre øjne for at be- eller afkræfte det negative resultat.

FREMGANGSMÅDE

Præparering af øjnene

Øjenlågene bortskæres forsigtigt og uden at beskadige cornea. Der foretages en hurtig vurdering af cornea-integriteten ved at påføre en dråbe 2 % (vægt/volumen) natriumfluorescein på cornea-overfladen i nogle få sekunder, hvorefter der skylles med isotonisk saltvand. De fluoresceinbehandlede øjne undersøges derefter med et spaltelampemikroskop for at sikre, at cornea er ubeskadiget (dvs. har scorer for fluoresceinretention og cornea-uklarhed ≤ 0,5).

Er cornea ubeskadiget, fridissekeres øjet helt fra kraniet uden at beskadige cornea. Øjeæblet trækkes ud af øjenhulen ved et fast tag i blinkhinden med en kirurgisk tang, og øjenmusklerne skæres over med en bøjet, stumpendet saks. Det er vigtigt at undgå skader på cornea som følge af overdrevent tryk (dvs. komprimeringsartefakter).

Når øjet fjernes fra øjenhulen, skal der medfølge en synlig vedhængende del af synsnerven. Efter fjernelsen fra øjenhulen anbringes øjet på et absorberende underlag, hvorefter blinkhinden og andet bindevæv skæres væk.

Det enukleerede øje anbringes i en rustfri stålholder med cornea i lodret position. Derefter indsættes holderen i et kammer i superfusionsapparatet (18). Holderne bør anbringes sådan i superfusionsapparatet, at det isotoniske saltvand drypper ned over hele cornea (3-4 dråber pr. minut eller 0,1 til 0,15 ml/min). Temperaturen i superfusionsapparatets kamre bør være reguleret til 32 ± 1,5 °C. Tillæg 3 indeholder et diagram over et typisk superfusionsapparat og øjenholderne, som kan købes i handelen eller konstrueres. Apparatet kan modificeres, så det opfylder det enkelte laboratoriums behov (f.eks. så det kan rumme et andet antal øjne).

Efter anbringelsen i superfusionsapparatet undersøges øjnene igen med et spaltelampemikroskop for at sikre, at de ikke er blevet beskadiget under dissektionsproceduren. På dette tidspunkt måles også corneatykkelsen. Den måles ved corneas toppunkt ved anvendelse af dybdemålingsanordningen på spaltelampemikroskopet. Øjne med i) en fluoresceinretentionsscore på > 0,5, ii) en cornea-uklarhed på > 0,5 eller iii) eventuelle andre tegn på beskadigelse bør udskiftes. Af de øjne, der ikke kasseres ud fra nogen af ovennævnte kriterier, kasseres øjne med en corneatykkelse, som afviger mere end 10 % fra gennemsnitsværdien for alle øjne. Brugerne skal være opmærksomme på, at spaltelampemikroskoper kan give forskellige corneatykkelsesmålinger alt efter indstillingen af spaltebredden. Spaltebredden bør indstilles til 0,095 mm.

Når alle øjnene er undersøgt og godkendt, inkuberes de i ca. 45 til 60 minutter for at bringe dem i ligevægt med testsystemet inden dosering. Efter ligevægtsindstillingsperioden foretages en nulpunktsreferencemåling af corneatykkelse og -uklarhed, der skal fungere som basislinje (dvs. tid = 0). Den ved fridissekering bestemte fluoresceinscore anvendes som basislinjemåling for det endepunkt.

Påføring af testkemikaliet

Umiddelbart efter nulpunktsreferencemålingerne fjernes øjet (i sin holder) fra superfusionsapparatet og anbringes i vandret position, hvorefter testkemikaliet påføres på cornea.

Flydende testkemikalier testes typisk ufortyndede, men kan fortyndes, hvis det anses for nødvendigt (f.eks. som del af undersøgelsens design). Det foretrukne opløsningsmiddel til fortyndede testkemikalier er fysiologisk saltvand. Der kan imidlertid også anvendes alternative opløsningsmidler under kontrollerede betingelser, men egnetheden af andre opløsningsmidler end fysiologisk saltvand bør påvises.

Flydende testkemikalier påføres på cornea således, at hele overfladen af cornea dækkes jævnt med testkemikaliet. Standardvolumenet er 0,03 ml.

Om muligt bør faste testkemikalier formales så fint som muligt med morter og støder eller et tilsvarende formalingsværktøj. Pulveret påføres på cornea således, at overfladen dækkes jævnt med testkemikaliet. Standardmængden er 0,03 g.

Når testkemikaliet (flydende eller fast) har været påført i 10 sekunder, skylles det væk fra øjet med isotonisk saltvand (ca. 20 ml) ved omgivende temperatur. Øjet (i sin holder) sættes derefter tilbage i superfusionsapparatet i sin oprindelige opretstående position. Hvis der er behov for yderligere skylning, kan dette ske 10 sekunder efter påførelsen og på efterfølgende tidspunkter (f.eks. ved fund af rester af testkemikaliet på cornea). Generelt er det ikke afgørende, hvilken mængde saltvand der bruges til yderligere skylning, men det er vigtigt at observere, om kemikaliet klæber fast til cornea.

Kontrolkemikalier

Der bør indgå samtidige negative kontroller eller opløsningsmiddel/bærestof-kontroller og positive kontroller i hvert forsøg.

Ved test af væsker i en koncentration på 100 % eller faste stoffer anvendes fysiologisk saltvand som den samtidige negative kontrol ved ICE-forsøgsmetoden, således at ikke-specifikke ændringer i testsystemet kan påvises, og det kan sikres, at assaybetingelserne ikke fejlagtigt resulterer i en irritationsrespons.

Ved test af fortyndede væsker medtages en samtidig opløsningsmiddel/bærestof-kontrolgruppe ved forsøgsmetoden, således at ikke-specifikke ændringer i testsystemet kan påvises, og det kan sikres, at assaybetingelserne ikke fejlagtigt resulterer i en irritationsrespons. Som anført i punkt 31 kan der kun anvendes et opløsningsmiddel/bærestof, som påviseligt ikke påvirker testsystemet negativt.

Der medtages et kendt øjenirriterende stof som samtidig positiv kontrol i hvert forsøg for at verificere, at der induceres en passende respons. Eftersom ICE-assayet anvendes i denne forsøgsmetode til identifikation af ætsende eller stærkt irriterende stoffer, bør den positive kontrol være et referencekemikalie, som inducerer en svær respons ved denne forsøgsmetode. For at sikre at det er muligt at vurdere variabiliteten i den positive kontrolrespons over tid, bør den svære respons imidlertid ikke være overdrevent stor. Der bør genereres tilstrækkelige in vitro-data for den positive kontrol, således at der kan beregnes et statistisk defineret acceptabelt interval for den positive kontrol. Hvis der ikke er tilstrækkelige historiske ICE-forsøgsmetodedata tilgængelige for en bestemt positiv kontrol, kan det være nødvendigt at gennemføre undersøgelser for at tilvejebringe disse oplysninger.

Eksempler på positive kontroller for flydende testkemikalier er 10 % eddikesyre eller 5 % benzalkoniumchlorid, mens eksempler på positive kontroller for faste testkemikalier er natriumhydroxid eller imidazol.

Referencekemikalier er nyttige i forbindelse med vurdering af øjenirritationspotentialet for ukendte kemikalier i en særlig kemikalie- eller produktgruppe eller vurdering af det relative irritationspotentiale for et øjenirriterende stof inden for et specifikt område af irritationsresponser.

Målte endepunkter

Behandlede corneae vurderes inden behandlingen og ved 30, 75, 120, 180 og 240 minutter (± 5 minutter) efter skylningen efter behandlingen. Med disse tidspunkter opnås et passende antal målinger over behandlingsperioden på fire timer, samtidig med at der er tilstrækkelig tid mellem målingerne til at foretage de fornødne observationer for alle øjnene.

De vurderede endepunkter er cornea-uklarhed, -opsvulmning og -fluoresceinretention samt morfologiske virkninger på cornea (f.eks. erosion eller løsning af epitelet). Alle endepunkterne med undtagelse af fluoresceinretention (som kun bestemmes inden behandlingen og 30 minutter efter eksponering med testkemikaliet) bestemmes på hvert af de ovennævnte tidspunkter.

Det tilrådes at tage fotografier for at dokumentere cornea-uklarhed og -fluoresceinretention, morfologiske virkninger på cornea og, hvis det udføres, histopatologi.

Efter den afsluttende undersøgelse efter fire timer opfordres brugerne til at konservere øjnene i et egnet fikseringsmiddel (f.eks. neutralbufret formalin) med henblik på eventuel histopatologisk undersøgelse (jf. punkt 14 og henvisning (8) for nærmere oplysninger).

Cornea-opsvulmning bestemmes ud fra corneatykkelsesmålinger foretaget med et optisk pachymeter på et spaltelampemikroskop. Den udtrykkes i procent og beregnes ud fra corneatykkelsesmålinger ved hjælp af følgende formel:

Den gennemsnitlige procentvise cornea-opsvulmning for alle testøjnene beregnes for alle observationstidspunkter. Ud fra den højeste gennemsnitsscore for cornea-opsvulmning som observeret på et hvilket som helst af tidspunkterne opnås der derefter en samlet kategoriscore for hvert testkemikalie (jf. punkt 51).

Vurderingen af cornea-uklarhed baseres på scoring af det område af cornea, hvor uklarheden er mest udtalt som vist i tabel 1. Den gennemsnitlige værdi for cornea-uklarhed for alle testøjnene beregnes for alle observationstidspunkter. Ud fra den højeste gennemsnitsscore for cornea-uklarhed som observeret på et hvilket som helst af tidspunkterne opnås der derefter en samlet kategoriscore for hvert testkemikalie (jf. punkt 51).

Tabel 1

Score for cornea-uklarhed

Fluoresceinretention vurderes kun ved 30-minutters observationstidspunktet som vist i tabel 2. Den gennemsnitlige fluoresceinretentionsværdi for alle testøjnene beregnes herefter for 30-minutters observationstidspunktet og bruges til at opnå den samlede kategoriscore for hvert testkemikalie (jf. punkt 51).

Tabel 2

Score for fluoresceinretention

Morfologiske virkninger omfatter “erosion” af cornea-epitelceller, “løsning” af epitelet, “tiltagende ruhed” af cornea-overfladen og “fastklæben” af testkemikaliet til cornea. Disse resultater kan have varierende sværhedsgrad og kan forekomme samtidig. Klassificeringen af disse resultater er subjektiv og baseret på undersøgerens fortolkning.

DATA OG RAPPORTERING

Datavurdering

Resultaterne for cornea-uklarhed, -opsvulmning og -fluoresceinretention bør vurderes særskilt for at finde frem til en ICE-stofgruppe for hvert endepunkt. Derefter kombineres ICE-stofgrupperne for hvert endepunkt for at opnå en irritationsklassificering (Irritancy Classification) for hvert testkemikalie.

Beslutningskriterier

Når hvert af endepunkterne er vurderet, kan der fastlægges ICE-stofgrupper på grundlag af forudfastsatte intervaller. Fortolkning af cornea-opsvulmning (tabel 3), -uklarhed (tabel 4) og -fluoresceinretention (tabel 5) ved anvendelse af fire ICE-stofgrupper udføres ud fra nedenstående skalaer: Det er vigtigt at bemærke, at scorerne for cornea-opsvulmning, der vises i tabel 3, kun er relevante, hvis tykkelsen måles med et spaltelampemikroskop (f.eks. Haag-Streit BP900) med dybdemålingsanordning nr. 1 og med spaltebredden indstillet til 9

Tabel 3

ICE-klassificeringskriterier for cornea-opsvulmning

Tabel 4

ICE-klassificeringskriterier for uklarhed

Tabel 5

ICE-klassificeringskriterier for gennemsnitlig fluoresceinretention

In vitro-klassificeringen for et testkemikalie fastsættes ved at aflæse den GHS-klassificering, der svarer til kombinationen af kategorier opnået for cornea-opsvulmning, -uklarhed og -fluoresceinretention som beskrevet i tabel 6.

Tabel 6

Overordnede in vitro-klassificeringer

Undersøgelsesacceptkriterier

En test anses for acceptabel, hvis de samtidige negative kontroller eller opløsningsmiddel-/bærestofkontroller og de samtidige positive kontroller er identificeret som henholdsvis GHS uden for kategori og GHS-kategori 1.

Testrapport

Testrapporten bør omfatte følgende oplysninger, hvis de er relevante for undersøgelsens gennemførelse: