1.

Fordelingskoefficienten (P) defineres som forholdet mellem ligevægtskoncentrationerne af et stof, der er opløst i et tofasesystem bestående af to stort set ublandbare opløsningsmidler. I tilfælde af n-octanol og vand:

Fordelingskoefficienten, som er et forhold mellem to koncentrationer, er dimensionsløs og opgives ofte som titalslogaritmen.

2.

Pow er en nøgleparameter i undersøgelser af kemiske stoffers skæbne i miljøet. Der har vist sig at være et stærkt signifikant forhold mellem Pow for stoffers ikke-ioniserede form og bioakkumulering heraf i fisk. Det har desuden vist sig, at Pow er en nyttig parameter i forudsigelsen af adsorption i jord og sedimenter og til bestemmelse af kvantitative struktur/aktivitet-forhold for en lang række biologiske virkninger.

3.

Det oprindelige forslag til denne testmetode var baseret på en artikel af C. V. Eadsforth og P. Moser (1). Udviklingen af testmetoden og OECD's sammenlignende laboratorieundersøgelse blev koordineret af Forbundsrepublikken Tysklands Umweltbundesamt i 1986 (2).

4.

log Pow-værdier i området – 2 til 4 (undertiden op til 5 og derover) (1) kan bestemmes eksperimentelt med rystekolbemetoden (kapitel A.8 i dette bilag, OECD Test Guideline 107). HPLC-metoden omfatter log Pow i området 0 til 6 (1)(2)(3)(4)(5). Denne metode kan kræve en beregning af Pow med henblik på valg af egnede referencestoffer og som underbygning for konklusioner draget af de data, der er genereret ved hjælp af testen. Beregningsmetoderne beskrives kort i tillægget til denne testmetode. HPLC-operationsformen er isokratisk.

5.

Pow-værdierne afhænger af miljøforholdene, såsom temperatur, pH, ionstyrke osv., og disse bør defineres i eksperimentet med henblik på korrekt fortolkning af Pow-data. For så vidt angår ioniserbare stoffer, kan en alternativ metode blive tilgængelig (f.eks. udkastet til OECD's vejledning for den pH-metriske metode for ioniserede stoffer (6)). Udkastet til OECD's vejledning kan være egnet til at bestemme Pow for disse ioniserbare stoffer, men i visse tilfælde er det mere hensigtsmæssigt at bruge HPLC-metoden ved en miljørelevant pH-værdi (se punkt 9).

6.

Omvendt fase-HPLC udføres på analytiske kolonner pakket med en kommercielt tilgængelig fast fase indeholdende lange kulbrintekæder (f.eks. C8, C18), der er kemisk bundet til silica.

7.

Et kemikalie, der indsprøjtes på en sådan kolonne, fordeles mellem den mobile opløsningsmiddelfase og den stationære kulbrintefase, efterhånden som den mobile fase transporterer det gennem kolonnen. Stoffernes retentionstid afhænger af deres kulbrinte/vand-fordelingskoefficient; hydrofile stoffer elueres først, og lipofile stoffer sidst. Retentionstiden beskrives ved kapacitetsfaktoren k, der er givet ved udtrykket:

hvor tR er teststoffets retentionstid, og t0 er dødtiden, dvs. den tid det i gennemsnit tager et opløsningsmiddelmolekyle at komme gennem kolonnen. Der kræves ikke kvantitative analysemetoder, og det er kun nødvendigt at bestemme retentionstiderne.

8.

Et teststofs octanol/vand-fordelingskoefficient kan beregnes ved eksperimentelt at bestemme dets kapacitetsfaktor k og indsætte k i følgende ligning:

hvor

Ligningen ovenfor kan opnås ved lineær regression af logaritmen for referencestoffernes octanol/vand-fordelingskoefficienter mod logaritmen for referencestoffernes kapacitetsfaktorer.

9.

Med omvendt fase-HPLC-metoden kan der skønnes fordelingskoefficienter i log Pow-området fra 0 til 6, men metoden kan udvides til undtagelsesvis at omfatte log Pow-området fra 6 til 10. Det kan gøre det nødvendigt at ændre den mobile fase (3). Metoden kan ikke benyttes til stærke syrer og baser, metalkomplekser, overfladeaktive stoffer og stoffer, der reagerer med elueringsmidlet. Målinger på ioniserbare stoffer kan udføres på den ikke-ioniserede form (fri syre eller fri base) og kun ved anvendelse af en passende buffer med en pH-værdi på under pKa for en fri syre eller over pKa for en fri base. Hvis den pH-metriske metode til testning af ioniserbare stoffer (pH-Metric Method for Ionisable Substances (6)) bliver tilgængelig, vil den kunne benyttes som en alternativ metode. Hvis log Pow-værdien bestemmes med henblik på miljøfareklassificering eller miljørisikovurdering, bør testen udføres inden for det pH-område, der er relevant for det naturlige miljø, dvs. i pH-området 5,0-9.

10.

I visse tilfælde kan urenheder vanskeliggøre fortolkningen af resultaterne på grund af usikker tilforordning af toppene. For blandinger, der giver et uopløst bånd, anføres en øvre og nedre grænse for log Pow og område- % af hver log Pow-top. For blandinger, som er en gruppe af homologer, anføres også det vægtede gennemsnit af log Pow (7), som beregnes på grundlag af de enkelte Pow-værdier og de tilsvarende område- %-værdier (8). Alle toppe, der bidrager med et område på mindst 5 % til det samlede topareal, bør tages i betragtning i beregningen (9):

Det vægtede gennemsnit af log Pow gælder kun for stoffer eller blandinger (f.eks. tallolie), der består af homologer (f.eks. serier af alkaner). Blandinger kan måles med relevante resultater, forudsat at den anvendte analytiske detektor har samme følsomhed over for alle stoffer i blandingen og kan opløses i tilstrækkelig grad.

11.

Stoffets dissociationskonstant, strukturformel og opløselighed i den mobile fase skal være kendt forud for anvendelsen af metoden. Derudover er det nyttigt at have oplysninger om hydrolyseegenskaber.

12.

For at øge tilliden til målingen foretages der dobbeltbestemmelse.

13.

Den sammenlignende laboratorieundersøgelse har vist, at der med HPLC-metoden kan opnås log Pow-værdier på ± 0,5 enheder i forhold til de værdier, der er opnået med rystekolbemetoden (2). Andre sammenligninger kan findes i litteraturen (4)(5)(10)(11)(12). Korrelationskurver baseret på strukturmæssigt beslægtede stoffer giver de mest nøjagtige resultater (13).

14.

For at kunne korrelere den målte kapacitetsfaktor k for et stof med dets Pow skal der fastlægges en kalibreringskurve, som er baseret på mindst seks punkter (se punkt 24). Det er op til brugeren at vælge passende referencestoffer. Referencestoffet bør normalt have log Pow-værdier, der omfatter teststoffets log Pow, hvilket vil sige, at mindst et referencestof skal have en Pow-værdi på over teststoffets værdi og en anden Pow-værdi på under teststoffets værdi. Ekstrapolation bør kun anvendes i særlige tilfælde. Det foretrækkes, at referencestofferne er strukturmæssigt beslægtet med teststoffet. log Pow-værdierne for de referencestoffer, der bruges til kalibreringen, skal være baseret på pålidelige forsøgsdata. For stoffer med høj log Pow (normalt over 4) kan der anvendes beregnede værdier, medmindre der foreligger pålidelige forsøgsdata. Hvis der bruges ekstrapolerede værdier, skal der anføres en grænseværdi.

15.

Der foreligger omfattende lister med log Pow-værdier for mange grupper af kemikalier (14)(15). Hvis der ikke foreligger data om fordelingskoefficienter for strukturmæssigt beslægtede stoffer, kan der bruges en mere generel kalibrering foretaget med andre referencestoffer. Anbefalede referencestoffer og deres Pow-værdier er anført i tabel 1. For ioniserbare stoffer gælder de anførte værdier den ikke-ioniserede form. Værdierne blev kontrolleret med hensyn til sandsynlighed og kvalitet under den sammenlignende laboratorieundersøgelse.

Tabel 1

Anbefalede referencestoffer

16.

Om nødvendigt kan teststoffets fordelingskoefficient skønnes enten ved beregning (se tillæg) eller i givet fald ud fra teststoffets opløselighed i de rene opløsningsmidler.

17.

Der kræves en væskekromatograf med pumpe med lav pulsation og passende detektionssystem. En UV-detektor, der bruger en bølgelængde på 210 nm, eller en RI-detektor kan anvendes på en lang række kemiske grupper. Polære grupper i den stationære fase kan nedsætte HPLC-kolonnens ydeevne væsentligt. Derfor skal stationære faser have det lavest mulige procentindhold af polære grupper (16). Der kan anvendes kommercielt mikroniseret pakkemateriale med omvendt fase eller færdigpakkede kolonner. Der kan eventuelt anbringes en beskyttelseskolonne mellem injektionssystemet og analysekolonnen.

18.

Der anvendes methanol af HPLC-kvalitet og destilleret eller deioniseret vand til fremstilling af elueringsvæsken, som afgasses før brug. Elueringen skal være isokratisk (dvs. af ensartet styrke). Den anvendte methanol/vand-blanding skal indeholde mindst 25 % vand. Til eluering af stoffer med en log P på 6 på en time ved en flowhastighed på 1 ml/min. vil en blanding af methanol og vand i forholdet 3:1 (v/v) typisk være tilfredsstillende. For stoffer med en log P-værdi på over 6 kan det være nødvendigt at nedsætte elueringstiden (også for referencestofferne) ved at benytte en mindre polær mobil fase eller en kortere kolonne.

19.

Både teststof og referencestoffer skal være opløselige i den mobile fase i en så høj koncentration, at de kan påvises. Der må kun undtagelsesvis benyttes tilsætningsstoffer til methanol/vand-blandingen, da tilsætningsstoffer vil ændre kolonnens egenskaber. I disse tilfælde skal det kontrolleres, at retentionstiden for teststof og referencestoffer er upåvirket. Hvis en methanol/vand-blanding ikke er egnet, kan der anvendes andre blandinger af vand og organiske opløsningsmidler, f.eks. ethanol/vand, acetonitril/vand eller isopropylalkohol-(2-propanol)/vand.

20.

For ioniserbare stoffer er elueringsvæskens pH kritisk. Det skal ligge inden for kolonnens pH-driftsområde, normalt fra 2 til 8. Det anbefales at anvende buffer. Man må være omhyggelig med at undgå saltudfældning og ødelæggelse af kolonnen, hvilket kan forekomme med visse blandinger af organisk fase og buffer. Det frarådes normalt at foretage HPLC-målinger med silicabaserede stationære faser med en pH over 8, da brug af en alkalisk mobil fase kan føre til, at kolonnens ydeevne hurtigt falder.

21.

Teststof og referencestoffer skal være tilstrækkeligt rene til, at toppene i kromatogrammerne kan henføres til de respektive stoffer. Til test- og kalibreringsformål opløses stofferne om muligt i den mobile fase. Hvis der anvendes et andet opløsningsmiddel end den mobile fase til at opløse test- og referencestofferne, skal den mobile fase benyttes til slutfortyndingen forud for indsprøjtningen.

22.

Under målingen må temperaturen ikke variere med mere end ± 1 °C.

23.

Dødtiden t0 kan måles med organiske stoffer, der ikke holdes tilbage (f.eks. thiourinstof eller formamid). En mere præcis dødtid kan beregnes på grundlag af de målte retentionstider eller et sæt af ca. syv medlemmer af en homolog række (f.eks. n-alkylmethylketoner) (17). Retentionstiderne tR (nC + 1) afbildes mod tR (nC), hvor nC er antallet af kulstofatomer. Der frembringes en ret linje, tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, hvor A, der repræsenterer k(nC + 1)/k(nC), er konstant. Dødtiden t0 bestemmes af skæringspunktet (1 – A)t0 og hældningskoefficienten A.

24.

Næste trin består i at konstruere en korrelationskurve af log k mod log P for passende referencestoffer med log P-værdier i nærheden af den værdi, der forventes for teststoffet. I praksis indsprøjtes der 6-10 referencestoffer samtidigt. Retentionstiderne bestemmes, helst med en integrationsskriver, der er koblet til detektionssystemet. De tilsvarende logaritmer for kapacitetsfaktorerne, log k, afsættes som funktion af log P. Regressionsligningen foretages regelmæssigt, mindst en gang dagligt, så der kan tages højde for eventuelle ændringer i kolonnens ydeevne.

25.

Teststoffet indsprøjtes i den lavest påviselige mængde. Retentionstiden bestemmes dobbelt. Teststoffets fordelingskoefficient fås ved interpolation af den beregnede kapacitetsfaktor på kalibreringskurven. Ved meget lave og meget høje fordelingskoefficienter er det nødvendigt at ekstrapolere. Især i sådanne tilfælde må man være særlig opmærksom på regressionslinjens konfidensgrænser. Hvis prøvens retentionstid ligger uden for det interval af retentionstider, der er opnået for standarderne, skal der anføres en grænseværdi.

26.

Følgende skal anføres i rapporten:

(1)

C. V. Eadsforth og P. Moser (1983), Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients, Chemosphere, 12, 1459.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss og H. J. Poremski (1988), Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method, Chemosphere, 17, 361.

(3)

C. V. Eadsforth (1986), Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient, Pesticide Science, 17, 311.

(4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt og R. Fuerer (1981), Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients, Pesticide Science, 12, 219.

(5)

B. McDuffie (1981), Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography, Chemosphere, 10, 73.

(6)

OECD (2000), Guideline for Testing of Chemicals — Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances, Draft Guideline, november 2000.

(7)

OSPAR (1995), »Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995«, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Annex 10, Oviedo, 20.-24. februar 1995.

(8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez og C. C. Karman (1999), An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999, Version 1.0, 3, august.

(9)

E. A. Vik, S. Bakke og K. Bansal (1998), Partitioning of Chemicals, Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges, Environmental Modelling & Software Vol. 13, s. 529-537.

(10)

L. O. Renberg, S. G. Sundstroem og K. Sundh-Nygård (1980), Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes, Chemosphere, 9, 683.

(11)

W. E. Hammers, G. J. Meurs og C. L. De-Ligny (1982), Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system, J. Chromatography 247, 1.

(12)

J. E. Haky og A. M. Young (1984), Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds, J. Liq. Chromatography, 7, 675.

(13)

S. Fujisawa og E. Masuhara (1981), Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography, Journal of Biomedical Materials Research, 15, 787.

(14)

C. Hansch og A. J. Leo (1979), Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Willey, New York.

(15)

C. Hansch, chairman; A. J. Leo, dir. (1982), Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity — Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

R. F. Rekker og H. M. de Kort (1979), The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set, Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther, 14, 479.

(17)

G. E. Berendsen, P. J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony og J. Inczédy (1980), On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography, J. Liq. Chromato, 3, 1669.

1.

Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline (TG) 201 (2006, bilag berigtiget i 2011). Testmetoden bør revideres, idet der indsættes yderligere arter, og opdateres, således at den opfylder behovene for vurdering af kemikaliers farlighed og klassificering. Revisionen er foretaget på grundlag af de omfattende praktiske erfaringer med testen, den videnskabelige udvikling inden for algetoksicitetsundersøgelser samt de kontrollerende myndigheders udstrakte anvendelse af testen, siden denne oprindeligt blev indført.

2.

De anvendte definitioner er anført i tillæg 1.

3.

Testens formål er at bestemme kemikaliets påvirkning af væksten af ferskvandsmikroalger og/eller cyanobakterier. Testorganismer i eksponentiel vækst eksponeres for kemikaliet i batchkulturer i et tidsrum på normalt 72 timer. Til trods for testens forholdsvis korte varighed giver den mulighed for at vurdere virkningerne på flere generationer.

4.

Systemets respons er væksthæmningen i en række algekulturer (testenheder), der eksponeres for forskellige koncentrationer af et testkemikalie. Responsen udtrykkes som funktion af eksponeringskoncentrationen og sammenholdes med gennemsnitsvæksten i ikke-eksponerede replikatkontrolkulturer. For at systemets respons på toksiske virkninger kan komme fuldt til udtryk (optimal følsomhed), lader man kulturerne vokse uhæmmet eksponentielt med tilstrækkelige næringsstoffer og kontinuerlig belysning, tilstrækkelig længe til at hæmningen af den specifikke væksthastighed kan måles.

5.

Vækst og væksthæmning bestemmes kvantitativt ved måling af algebiomassen som funktion af tiden. Algebiomasse defineres som tørvægt pr. volumenenhed, f.eks. mg alger/liter testopløsning. Tørvægt er imidlertid vanskelig at måle, hvorfor der anvendes surrogatparametre. Af sådanne surrogater er celletal det mest anvendte. Andre surrogatparametre er cellevolumen, fluorescens, optisk tæthed mv. Omregningsfaktoren mellem den målte surrogatparameter og biomassen skal være kendt.

6.

Endepunktet for testen er væksthæmning, udtrykt som den logaritmiske stigning i biomasse (gennemsnitlig specifik væksthastighed) i eksponeringsperioden. Ud fra de gennemsnitlige specifikke væksthastigheder, der er registreret i en række testopløsninger, bestemmes den koncentration, der frembringer en bestemt hæmning på x % (f.eks. 50 %) af væksthastigheden, og denne betegnes ErCx (f.eks. ErC50).

7.

I denne metode anvendes udbytte som en supplerende responsvariabel, der kan være nødvendig for at efterkomme myndighedsbestemmelser i visse lande. Udbyttet defineres som biomassen ved eksponeringsperiodens slutning minus biomassen ved eksponeringsperiodens start. Ud fra det udbytte, der er registreret i en række testopløsninger, bestemmes den koncentration, der frembringer en bestemt hæmning på x % (f.eks. 50 %) i udbyttet, og denne betegnes EyCx (f.eks. EyC50).

8.

Derudover kan den laveste koncentration med observeret effekt (LOEC) og nuleffektkoncentrationen (NOEC) bestemmes statistisk.

9.

Med henblik på fastsættelse af testbetingelser vil det være nyttigt at kende testkemikaliets strukturformel, renhed, lysstabilitet, stabilitet under testbetingelserne, lysabsorptionsegenskaber, pKa og resultaterne af omdannelsesundersøgelser, herunder bionedbrydeligheden i vand.

10.

Kemikaliets vandopløselighed, octanol/vand-fordelingskoefficient (Pow) og damptryk skal være kendt, og til kvantitativ bestemmelse af kemikaliet i testopløsningerne skal der foreligge en pålidelig analysemetode, hvis restitutionsevne og detektionsgrænse rapporteres.

11.

Til afgørelse af, om en test er valid, anvendes følgende præstationskriterier:

12.

Til kontrol af testmetoden kan der testes et eller flere referencekemikalier, f.eks. 3,5-dichlorphenol, som er anvendt i den internationale ringtest (1). Kaliumdichromat kan ligeledes anvendes som referencekemikalie for grønalger. Det er ønskeligt, at der et referencekemikalie testes mindst to gange årligt.

13.

Metoden er bedst anvendelig på vandopløselige kemikalier, som under testbetingelserne forventes at forblive i vandet. Til testning af kemikalier, der er flygtige, stærkt adsorberende, farvede eller tungtopløselige i vand, eller som kan ændre tilgængeligheden af næringsstoffer eller mineraler i testsubstratet, kan visse ændringer af den beskrevne fremgangsmåde være nødvendige (f.eks. lukket system eller konditionering af testbeholderne). Anvisninger for sådanne ændringer er givet i (2), (3) og (4).

14.

Bægerglas og andet apparatur, der kommer i kontakt med testopløsningerne, skal være fremstillet af rent glas eller andet kemisk inert materiale. Det pågældende udstyr skal være omhyggeligt vasket, for at sikre at ingen organiske eller uorganiske kontaminanter kan forstyrre algevæksten eller testopløsningernes sammensætning.

15.

Som testbeholdere anvendes sædvanligvis glaskolber af en størrelse, der giver tilstrækkeligt kulturvolumen til målingerne under testen og tilstrækkelig masseoverførsel af CO2 fra atmosfæren (se punkt 30). Bemærk, at der skal være tilstrækkeligt væskevolumen til de analytiske bestemmelser (se punkt 37).

16.

Derudover kan der være brug for følgende udstyr eller en del deraf:

17.

Der kan anvendes forskellige arter af ikke-fastsiddende mikroalger og cyanobakterier. De i tillæg 2 opførte stammer har vist sig velegnede ved brug af fremgangsmåden i denne testmetode.

18.

Benyttes andre arter, skal stamme og/eller oprindelse angives. Det kontrolleres, at der kan opretholdes eksponentiel vækst af de valgte testalger i hele testperioden under de givne betingelser.

19.

To alternative næringssubstrater, OECD-substratet og AAP-substratet, anbefales. Substraternes sammensætning er angivet i tillæg 3. Bemærk, at de to substraters initiale pH-værdi og bufferkapacitet (som regulerer pH-stigningen) er forskellige. Testen kan derfor give forskelligt resultat afhængigt af substratet, specielt ved testning af ioniserende kemikalier.

20.

Til visse formål kan det være nødvendigt at modificere substratet, f.eks. ved testning af metaller og chelaterende midler, eller når testning finder sted ved afvigende pH-værdier. Modificerede substrater skal beskrives i detaljer og deres anvendelse begrundes (3)(4).

21.

Den initiale biomasse i testkulturerne skal være ens i alle testkulturer og tilstrækkelig lav til at muliggøre eksponentiel vækst i hele inkubationsperioden, uden risiko for at næringsstofferne opbruges. Den initiale biomasse må ikke udgøre mere end 0,5 mg/l som tørvægt. Følgende initiale cellekoncentrationer anbefales:

22.

Der kan udføres indledende test til at fastlægge det koncentrationsområde, hvor der kan forventes en effekt. Til den endelige test skal der vælges mindst fem koncentrationer, der er ordnet i en geometrisk serie med en faktor på højst 3,2. For testkemikalier med flad koncentrationsresponskurve kan en højere faktor være berettiget. Koncentrationsserien skal fortrinsvis dække det område, der medfører 5-75 % hæmning af algevæksthastigheden.

23.

Testens design skal indeholde tre replikater ved hver testkoncentration. Hvis der ikke kræves bestemmelse af NOEC, kan testens design ændres, så der anvendes flere forskellige koncentrationer og færre replikater for hver koncentration. Der skal være mindst tre replikater af kontrollerne, og ideelt dobbelt så mange som antallet af replikater for hver testkoncentration.

24.

Der kan fremstilles et separat sæt testopløsninger til analytisk bestemmelse af testkemikaliekoncentrationerne (se punkt 36 og 38).

25.

Anvendes der et opløsningsmiddel til at bringe testkemikaliet i opløsning, skal testen omfatte ekstra kontroller indeholdende opløsningsmidlet i samme koncentration som i testkulturerne.

26.

For at lade de testede alger tilpasse sig til testbetingelserne og sikre, at algerne er i den eksponentielle vækstfase, når de benyttes til podning af testopløsningerne, fremstilles en podekultur i testsubstratet, 2-4 dage før testen begynder. Mængden af algebiomasse skal tilpasses, så der bliver eksponentiel vækst i podekulturen, indtil testen begynder. Podekulturen skal inkuberes under samme betingelser som testkulturerne. Stigningen i biomasse i podekulturen skal måles, for at sikre at væksten er inden for normalområdet for den pågældende teststamme under dyrkningsbetingelserne. Et eksempel på fremgangsmåden ved dyrkning af alger er beskrevet i tillæg 4. For at undgå synkrone celledelinger under testen kan et ekstra trin til formering af podekulturen være nødvendigt.

27.

Alle testopløsninger skal indeholde samme koncentration af næringssubstrat og initial biomasse af testalger. Testopløsningerne af de valgte koncentrationer fremstilles sædvanligvis ved, at en stamopløsning af testkemikaliet opblandes med næringssubstrat og podekultur. Stamopløsningerne fremstilles normalt ved opløsning af testkemikaliet i testsubstrat.

28.

Opløsningsmidler, f.eks. acetone, t-butylalkohol og dimethylformamid, kan bruges som bæremedier, når kemikalier med ringe vandopløselighed skal tilsættes testsubstratet (2)(3). Koncentrationen af opløsningsmiddel må ikke være over 100 μl/l, og det skal tilsættes i samme koncentration til alle kulturer (også kontrollerne) i testserien.

29.

Testbeholderne lukkes med luftgennemtrængelige propper. Testbeholderne omrystes og anbringes i dyrkningsapparatet. Under testen skal algerne holdes opslæmmet og CO2-overførslen lettes. Kontinuerlig omrystning eller omrøring er derfor nødvendig. Kulturerne skal være reguleret til en temperatur i området 21 til 24 °C, og den fastsatte temperatur skal holdes inden for ± 2 °C. Til andre arter end de i tillæg 2 anførte, f.eks. tropiske arter, kan højere temperaturer være hensigtsmæssigt, forudsat at validitetskriterierne kan opfyldes. Det anbefales at placere kolberne i vilkårlig rækkefølge og dagligt bytte rundt på dem i inkubatoren.

30.

Kontrolmediets pH må højst stige med 1,5 enheder under testen. For metaller og kemikalier, der kun er delvist ioniseret ved pH-værdier omkring testens pH, kan det være nødvendigt at begrænse pH-afvigelsen for at få reproducerbare og veldefinerede resultater. Begrænsning af afvigelsen til < 0,5 pH-enhed er teknisk mulig og kan opnås ved at sikre tilstrækkelig CO2-masseoverførsel fra den omgivende luft til testopløsningen, f.eks. ved at øge omrystningshastigheden. En anden mulighed er at nedsætte CO2-behovet ved enten at reducere den initiale biomasse eller testens varighed.

31.

Den overflade, som kulturerne inkuberes på, skal have kontinuerlig, ensartet fluorescerende belysning, f.eks. af typen »cool-white« eller »daylight«. Forskellige stammer af alger og cyanobakterier har forskelligt lysbehov. Der skal vælges en passende lysintensitet i forhold til den anvendte organisme. Til de anbefalede arter af grønalger skal lysintensiteten i testopløsningernes niveau vælges i området 60-120 μE · m– 2 · s– 1, målt i det fotosyntetisk effektive bølgelængdeområde 400-700 nm med en egnet detektor. Visse arter, navnlig Anabaena flos-aquae, vokser godt ved lavere lysintensitet og kan tage skade af højere intensitet. Til sådanne arter bør vælges en gennemsnitlig lysintensitet i området 40-60 μE · m– 2 · s– 1. (For lysmåleinstrumenter kalibreret i lux vil den anbefalede lysintensitet på 60-120 μE · m– 2 · s– 1 med cool-white-lys tilnærmelsesvis svare til området 4 440-8 800 lux). Lysintensiteten må ikke afvige mere end ± 15 % fra den gennemsnitlige lysintensitet i hele inkubationsområdet.

32.

Testens varighed er normalt 72 timer. Kortere eller længere varighed kan dog anvendes, forudsat at alle validitetskriterierne i punkt 11 kan opfyldes.

33.

Algebiomassen i hver kolbe bestemmes mindst en gang dagligt i hele testperioden. Hvis målingerne foretages på små volumener, der er udtaget af testopløsningen med pipette, bør disse ikke erstattes.

34.

Måling af biomasse foretages enten ved manuel celletælling i mikroskop eller med en elektronisk partikeltæller (i celletal og/eller biovolumen). Andre teknikker kan anvendes, f.eks. flowcytometri, in vitro eller in vivo chlorophyl-fluorescens (5)(6) eller optisk densitet, hvis der kan påvises tilfredsstillende korrelation med biomasse i hele det biomasseområde, der forekommer under testen.

35.

Opløsningernes pH skal måles ved testens start og slutning.

36.

Hvis der foreligger en analysemetode til bestemmelse af testkemikaliet i det anvendte koncentrationsområde, skal testopløsningerne analyseres til efterprøvning af startkoncentrationerne og af, at eksponeringskoncentrationerne overholdes under testen.

37.

Hvis eksponeringskoncentrationerne under testen forventes at afvige mindre end 50 % fra de nominelle værdier, kan det være tilstrækkeligt at bestemme en høj og en lav testkemikaliekoncentration og en koncentration omkring den forventede EC50 ved testens begyndelse og slutning. Når koncentrationen ikke kan forventes at holde sig inden for 80-120 % af den nominelle koncentration, anbefales analytisk bestemmelse af alle testkoncentrationer ved testens begyndelse og slutning. Til flygtige, ustabile eller stærkt adsorberende testkemikalier anbefales det at udtage supplerende prøver til analyse med 24 timers mellemrum i hele eksponeringsperioden for bedre at bestemme tabet af testkemikaliet. For disse kemikalier kan der være brug for supplerende replikater. I alle tilfælde behøver testkemikaliekoncentrationen kun bestemmes på en testbeholderreplikat ved hver testkoncentration (eller indholdet af de poolede beholdere for hver replikat).

38.

Testsubstrater, der er fremstillet specielt til analyse af eksponeringskoncentrationerne under testen, skal behandles på samme måde som dem, der anvendes til testning, dvs. podes med alger og inkuberes ved identiske betingelser. Hvis koncentrationen af opløst testkemikalie kræves analyseret, kan det være nødvendigt at separere algerne fra substratet. Separationen skal fortrinsvis ske ved centrifugering med lav g-kraft, som er tilstrækkelig til at få algerne til at bundfælde.

39.

Hvis det kan konstateres, at testkemikaliekoncentrationen har været holdt tilfredsstillende inden for ± 20 % af den nominelle eller målte startkoncentration under hele testen, kan analysen af resultaterne baseres på nominelle eller målte startværdier. Er afvigelsen fra den nominelle eller målte startkoncentration større end ± 20 %, skal analysen af resultaterne baseres på den geometriske middelkoncentration under eksponeringen eller på modeller, der beskriver faldet i testkemikaliekoncentrationen (3)(7).

40.

Algevæksthæmning er et mere dynamisk testsystem end de fleste andre korttidstest for akvatisk toksicitet. De faktiske eksponeringskoncentrationer kan derfor være vanskelige at fastlægge, navnlig for adsorberende kemikalier, der testes ved lav koncentration. I sådanne tilfælde er testkemikaliets forsvinden fra opløsningen ved adsorption til den voksende algebiomasse ikke ensbetydende med, at det forsvinder fra testsystemet. Ved analyse af testresultatet skal det kontrolleres, om et fald i testkemikaliekoncentrationen under testen ledsages af et fald i væksthæmningen. Hvis det er tilfældet, kan det overvejes at benytte en egnet model, der beskriver faldet i testkemikaliekoncentrationen (7). Hvis ikke, kan det være hensigtsmæssigt at basere analysen af resultaterne på de initiale (nominelle eller målte) koncentrationer.

41.

Der skal foretages mikroskopisk undersøgelse for at verificere, at podekulturen fremtræder normal og sund, og konstatere, om algernes udseende er unormalt ved testens slutning (som en mulig følge af eksponeringen for testkemikaliet).

42.

Under visse omstændigheder, f.eks. når en indledende test viser, at testkemikaliet er uden toksiske virkninger i koncentrationer på op til 100 mg/l, dog ikke over stoffets opløselighed i testsubstratet, kan der udføres en grænsetest, hvor reaktionen i en kontrolgruppe sammenholdes med reaktionen i en behandlingsgruppe (100 mg/l eller en koncentration lig med opløselighedsgrænsen). Det anbefales kraftigt, at dette understøttes ved analyse af eksponeringskoncentrationen. Alle de beskrevne testbetingelser og validitetskriterier gælder for grænsetesten, bortset fra at antallet af behandlingsreplikater skal være mindst seks. Responsvariablene i kontrol- og behandlingsgruppen kan analyseres med en statistisk test til sammenligning af middelværdier, f.eks. Students t-test. Er variansen i de to grupper uens, skal der anvendes en t-test justeret for forskel i varians.

43.

Biomassen i testbeholderne kan angives i enheder svarende til den til målingen anvendte surrogatparameter (f.eks. celletal eller fluorescens).

44.

Der opstilles en tabel over den beregnede biomassekoncentration i testkulturer og kontroller sammen med teststofkoncentrationer og måletidspunkter, målt med en mindste opløsning på hele timer, og derudfra optegnes vækstkurverne. Både logaritmisk og lineær afbildning kan være nyttig på dette første trin, men logaritmisk afbildning er obligatorisk og giver sædvanligvis en bedre fremstilling af variationerne i vækstmønsteret i løbet af testperioden. Bemærk, at eksponentiel vækst frembringer en ret linje, når den afbildes på en logaritmisk skala, og at linjens hældning angiver den specifikke væksthastighed.

45.

Ud fra kurverne undersøges det, om kontrolkulturerne vokser eksponentielt med den forventede hastighed igennem hele testen. Alle datapunkter og kurvernes udseende kontrolleres kritisk, og rådata og de anvendte metoder gås efter for eventuelle fejl. Navnlig kontrolleres alle datapunkter, der synes at afvige med en systematisk fejl. Det er indlysende, at hvis metodefejl kan konstateres og/eller må anses for stærkt sandsynlige, må det pågældende punkt markeres som afvigende og udelades af den efterfølgende statistiske analyse. (En algekoncentration på nul i den ene af tre testbeholderreplikater kan tyde på, at beholderen enten ikke er blevet podet korrekt eller ikke har været tilstrækkelig rengjort.) Begrundelsen for at afvise et datapunkt som afvigende skal klart angives i testrapporten. Som begrundelse godtages kun (sjældne) metodefejl, ikke blot ringe præcision. Til identifikation af afvigende værdier har statistiske metoder kun begrænset værdi ved problemer af denne art og kan ikke erstatte en faglig vurdering. Afvigende værdier (mærket som sådanne) skal helst bibeholdes blandt de datapunkter, der vises ved efterfølgende fremstilling af data i grafer eller tabeller.

46.

Testens formål er at bestemme testkemikaliets virkninger på væksten af alger. I nærværende testmetode beskrives to responsvariable, da præferencer og myndighedskrav er forskellige fra land til land. For at testresultaterne skal kunne godtages i alle lande, skal virkningerne vurderes ved hjælp af begge de nedenfor beskrevne responsvariable a) og b).

a)    gennemsnitlig specifik væksthastighed : Denne responsvariabel beregnes på grundlag af den logaritmiske stigning i biomasse i løbet af testperioden, angivet pr. døgn

b)    udbytte : Denne responsvariabel er biomassen ved testens slutning minus biomassen ved testens start.

47.

Det skal bemærkes, at toksicitetsværdier beregnet ved hjælp af disse to responsvariable ikke er sammenlignelige, og at forskellen mellem dem må haves for øje ved anvendelse af testens resultater. ECx-værdier baseret på gennemsnitlig specifik væksthastighed (ErCx) vil sædvanligvis være højere end resultater baseret på udbytte (EyCx), når testbetingelserne i denne metode er overholdt, hvilket følger af det matematiske grundlag for de to beregningsmåder. Dette må ikke opfattes som en forskel i følsomhed mellem de to responsvariable, men kun, at der er tale om to matematisk forskellige størrelser. Begrebet gennemsnitlig specifik væksthastighed bygger på det generelle eksponentielle vækstmønster for alger i ikke-begrænsede kulturer, mens toksicitet vurderes på grundlag af virkningerne på væksthastigheden og ikke afhænger af kontrollens absolutte specifikke væksthastighed, koncentrationsresponskurvens hældning eller testens varighed. Resultater, der er baseret på responsvariablen for udbytte, afhænger derimod af alle disse øvrige variable. EyCx afhænger af den specifikke væksthastighed af de algearter, der anvendes i hver test, og af den maksimale specifikke væksthastighed, som kan variere mellem forskellige arter og endda algestammer. Denne responsvariabel bør ikke anvendes til at sammenligne følsomheden over for giftstoffer hos forskellige algearter eller -stammer. Skønt det videnskabeligt foretrukne grundlag til vurdering af toksicitet er den gennemsnitlige specifikke væksthastighed, indeholder nærværende testmetode toksicitetsvurderinger baseret på udbytte for at imødekomme de aktuelle myndighedskrav i visse lande.

48.

Den gennemsnitlige specifikke væksthastighed for en given periode beregnes som den logaritmiske stigning i biomassen ved hjælp af ligningen for hver enkelt testbeholder med kontrol- og behandlingsprøver [1]:

hvor:

For hver behandlings- og kontrolgruppe beregnes en gennemsnitlig væksthastighed samt estimater for variansen.

49.

Den gennemsnitlige specifikke væksthastighed i hele testperioden (sædvanligvis dag 0-3) beregnes ved at bruge den nominelt podede biomasse som startværdi i stedet for en målt startværdi, da der herved sædvanligvis opnås størst præcision. Hvis udstyret til biomassemåling tillader tilstrækkelig nøjagtig bestemmelse af den lille mængde podede biomasse (f.eks. med flowcytometer), kan den målte initiale biomassekoncentration anvendes. Desuden foretages trinvis beregning af den specifikke væksthastighed for hver dag af testen (dag 0-1, 1-2 og 2-3), og det undersøges, om væksthastigheden i kontrollen forbliver konstant (se validitetskriterierne i punkt 11). Er den specifikke væksthastighed væsentligt lavere på dag et end den totale gennemsnitlige specifikke væksthastighed, kan dette tyde på, at der er tale om en lag-fase. Mens en lag-fase i kontrolkulturerne kan minimeres og i praksis elimineres ved korrekt formering af forkulturen, kan en lag-fase i eksponerede kulturer tyde på, at der er tale om restitution efter indledende toksisk stress, eller at eksponeringen efter den initiale eksponering er mindsket på grund af tab af testkemikalie (herunder sorption på algebiomassen). Trinvis beregning af væksthastigheden kan derfor anvendes til at vurdere testkemikaliets virkninger i eksponeringsperioden. Væsentlige forskelle mellem den trinvist beregnede væksthastighed og den gennemsnitlige væksthastighed tyder på en afvigelse fra konstant eksponentiel vækst, og nøje granskning af vækstkurverne er da nødvendig.

50.

Den procentuelle hæmning af væksthastigheden beregnes for hver behandlingsreplikat af ligningen [2]:

hvor:

51.

Når der anvendes opløsningsmiddel til fremstilling af testopløsningerne, skal hæmningen i procent beregnes ved hjælp af opløsningsmiddelkontroller i stedet for kontroller uden opløsningsmiddel.

52.

Udbytte beregnes som biomassen ved testens slutning minus biomassen ved testens start for hver enkelt beholder med kontrol- eller behandlingsprøve. For hver testkoncentration og kontrol beregnes en gennemsnitsværdi af udbyttet samt estimater for variansen. Udbyttehæmningen i procent ( % Iy) kan beregnes for hver behandlingsreplikat som følger:

hvor:

53.

Hæmningen i procent afsættes som funktion af logaritmen til testkemikaliekoncentrationen, og grafen undersøges nøje, idet der ses bort fra alle datapunkter, der er udpeget som afvigende i første fase. Der lægges en jævn linje gennem datapunkterne, enten i fri hånd eller med computerinterpolation, for at få et første indtryk af sammenhængen mellem koncentration og respons, hvorefter der fortsættes med en mere dybtgående metode, fortrinsvis en computerbaseret statistisk metode. Afhængigt af den påtænkte anvendelse af data, dataenes kvalitet (præcision) og mængde samt adgangen til dataanalyseværktøjer kan det blive besluttet (undertiden med god grund) at standse dataanalysen på dette trin og blot aflæse nøgletallene EC50 og EC10 (og/eller EC20) på frihåndskurven (se også afsnittet nedenfor om stimulerende virkninger). Af gyldige grunde til ikke at benytte en statistisk metode kan nævnes:

54.

Målet er at formulere den kvantitative sammenhæng mellem koncentration og respons ved hjælp af regressionsanalyse. Der kan anvendes vægtet lineær regression efter forudgående lineariserende transformation af responsdataene — til f.eks. probit-, logit- eller Weibull-enheder (8), men det må foretrækkes at benytte ikke-lineære regressionsmetoder, da de håndterer de uundgåelige uregelmæssigheder i data og afvigelser fra jævne fordelinger bedre. I området tæt på enten ingen hæmning eller total hæmning kan sådanne uregelmæssigheder blive forstørret ved transformation og derved gribe forstyrrende ind i analysen (8). Det må bemærkes, at standardanalysemetoder, hvor der bruges probit-, logit- eller Weibull-transformerede variable, er bestemt til brug på kvantale data (f.eks. død eller overlevelse) og må modificeres for at kunne håndtere vækst- eller biomassedata. Særlige metoder til bestemmelse af ECx-værdier ud fra kontinuerlige data findes i henvisning (9), (10) og (11). Brugen af ikke-lineær regressionsanalyse er nærmere beskrevet i tillæg 5.

55.

For hver responsvariabel, der skal analyseres, anvendes sammenhængen mellem koncentration og respons til at beregne punktestimater for ECx-værdier. Når det er muligt, skal der bestemmes 95 % konfidensgrænser for hvert estimat. Responsdataenes tilpasningsgrad til regressionsmodellen vurderes enten grafisk eller statistisk. Regressionsanalysen skal foretages på responsværdierne for de enkelte replikater, ikke på behandlingsgruppegennemsnit. Hvis ikke-lineær kurvetilpasning er vanskelig eller umulig på grund af for stor spredning i dataene, kan problemet omgås ved udførelse af regressionen på gruppegennemsnittet som en praktisk måde at mindske indflydelsen fra formodet afvigende værdier på. Når denne mulighed udnyttes, skal det i testrapporten anføres, at der her er afveget fra den normale procedure, fordi kurvetilpasning med de enkelte replikater ikke har givet et godt resultat.

56.

Hvis de tilgængelige regressionsmodeller eller -metoder er uegnede til dataene, kan estimater og konfidensgrænser for EC50 desuden fås ved lineær interpolation med bootstrapping (13).

57.

For at beregne et estimat for LOEC og dermed NOEC og testkemikaliets virkninger på væksthastigheden må middelværdierne for behandlingerne sammenholdes ved hjælp af variansanalyse. Gennemsnittet for hver koncentration sammenholdes derefter med gennemsnittet for kontrollerne ved hjælp af en egnet multisammenlignings- eller trend test-metode. Dunnetts eller Williams' test kan eventuelt bruges (12) (14) (15) (16) (17). Det må vurderes, om variansanalysens forudsætning om varianshomogenitet er opfyldt. Denne vurdering kan foretages grafisk eller ved en formel test (17). Hertil kan Levenes eller Bartletts test anvendes. Manglende opfyldelse af forudsætningen om varianshomogenitet kan undertiden afhjælpes ved logaritmisk transformation af dataene. Hvis variansen er ekstremt heterogen og ikke kan korrigeres ved transformation, må analyse med step-down Jonkheere trend test overvejes. Supplerende vejledning for bestemmelse af NOEC er givet i (11).

58.

Den senere tids videnskabelige udvikling har ført til en anbefaling om, at NOEC-begrebet afskaffes og erstattes med regressionsbaserede punktestimater ECx. Der er ikke fastlagt en passende værdi for x til denne algetest. Et område på 10 til 20 % synes at være passende (afhængigt af den valgte responsvariabel), og det må foretrækkes at rapportere både EC10 og EC20.

59.

Ved lave koncentrationer ses undertiden vækststimulation (negativ hæmning). Dette kan enten skyldes hormese (»toksisk stimulation«), eller at der er tilsat stimulerende vækstfaktorer sammen med testmaterialet til det anvendte minimalsubstrat. Bemærk, at tilsætning af uorganiske næringsstoffer ikke skulle have nogen direkte virkning, da testmediet skal indeholde overskud af næringsstoffer under hele testen. Sædvanligvis kan der ses bort fra lavdosisstimulation i EC50-beregninger, medmindre den er ekstrem. Er den ekstrem, eller skal der beregnes en ECx-værdi for en lav x-værdi, kan særlige procedurer dog være nødvendige. Om muligt bør det undgås at lade stimulerende responsværdier udgå af dataanalysen, og kan den forhåndenværende kurvetilpasningssoftware ikke acceptere en lav grad af stimulation, kan der anvendes lineær interpolation med bootstrapping. Hvis stimulationen er ekstrem, kan det overvejes at anvende en hormese-model (18).

60.

Lysabsorberende teststoffer kan nedsætte væksthastigheden, fordi de ved at skygge mindsker den tilgængelige lysmængde. Sådanne fysiske virkninger må adskilles fra toksiske virkninger ved ændring af testbetingelserne og skal rapporteres særskilt. Vejledning findes i (2) og (3).

61.

Testrapporten skal indeholde følgende:

(1)

Den Internationale Standardiseringsorganisation (1993), ISO 8692 Water quality — Algal growth inhibition test.

(2)

Den Internationale Standardiseringsorganisation (1998), ISO/DIS 14442, Water quality — Guidance for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

(3)

OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Satety Publitations, Series on Testing and Assessment No. 23, Organisationen for Økonomisk Samarbejde og Udvikling, Paris.

(4)

Den Internationale Standardiseringsorganisation (1998), ISO 5667-16 Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

(5)

P. Mayer, R. Cuhel og N. Nyholm (1997), A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests, Water Research 31: 2525-2531.

(6)

R. E. Slovacey og P. J. Hanna (1997), In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925.

(7)

S. L. Simpson, M. G. E. Roland, J. L. Stauber og G. E. Batley (2003), Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints, Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073-2079.

(8)

E. R. Christensen og N. Nyholm (1984), Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves, Env. Sci. Technol, 19: 713-718.

(9)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992), Statistical treatment of data from microbial toxicity tests, Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.

(10)

R. D. Bruce og D. J. Versteeg (1992), A statistical procedure for modelling continuous toxicity data, Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485-1494.

(11)

OECD (2006), Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Organisationen for Økonomisk Samarbejde og Udvikling, Paris.

(12)

C. W. Dunnett (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, J. Amer. Statist. Assoc, 50: 1096-1121.

(13)

Norberg-King T.J. (1988), An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88, US EPA, Duluth, MN.

(14)

C. W. Dunnett (1964), New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20: 482-491.

(15)

D. A. Williams (1971), A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27: 103-117.

(16)

D. A. Williams (1972), The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28: 519-531.

(17)

N. R. Draper og H. Smith (1981), Applied Regression Analysis, second edition, Wiley, New York.

(18)

P. Brain og R. Cousens (1989), An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses, Weed Research, 29, 93-96.

1.

Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline (TG) 209 (2010). Den beskrevne testmetode er en metode til at bestemme virkningen af et kemikalie på mikroorganismer fra aktiveret slam (hovedsagelig bakterier) ved måling af respirationshastigheden (kulstof- og/eller ammoniumiltning) under fastsatte betingelser ved forskellige koncentrationer af testkemikaliet. Denne testmetode er baseret på ETAD-testen (Ecological and Toxicological Association of the Dyestuffs Manufacturing industry) (1)( 2), på det tidligere OECD TG 209 (3) og på den reviderede ISO-standard 8192 (4). Formålet med metoden er at give en hurtig screening-metode til vurdering af virkningen af kemikalier på mikroorganismerne i det aktiverede slam i spildevandsanlæggets biologiske (aerobe) fase. Resultatet af testen kan også indikere passende ikke-hæmmende koncentrationer af testkemikalier til anvendelse i bionedbrydelighedstest (f.eks. kapitel C.4 A-F, C.9, C.10, C12 og C.29 i dette bilag, OECD TG302C). I dette tilfælde kan testen udføres som en screeningstest, som ligner en test til bestemmelse af dosisinterval eller en grænsetest (se punkt 39), hvor kun den samlede respiration tages i betragtning. Der må dog udvises omhu med at bruge disse oplysninger til test for let bionedbrydelighed (kapitel C.4 A-F og C.29 i dette bilag), hvor inokulumkoncentrationen er betydeligt lavere end den, der bruges i denne testmetode. Fravær af hæmning i denne respirationshæmningstest indebærer ikke automatisk ikke-hæmmende betingelser i testen for let bionedbrydelighed i kapitel C.4 A-F eller C.29 i dette bilag.

2.

Generelt lader det til, at respirationshæmningstesten er blevet anvendt med succes, siden den blev offentliggjort, men der er i nogle tilfælde indberettet falske resultater, f.eks. (2)(4)(5). Der forekommer undertiden tofasede koncentrationsrelaterede respirationskurver, forvrængede dosis/respons-kurver og uventet lave EC50-værdier (5). Undersøgelser har vist, at sådanne resultater fås, når det aktiverede slam, der bruges i testen, nitrificerer i betydelig grad, og testkemikaliet har større virkning på iltningen af ammonium end på den generelle heterotrofe iltning. Disse falske resultater kan derfor afhjælpes ved yderligere testning med en specifik nitrifikationshæmmer. Ved at måle iltoptagelseshastigheden med og uden en sådan hæmmer, f.eks. N-allylthiourinstof (ATU), kan de enkelte samlede iltoptagelseshastigheder ved henholdsvis heterotrof iltning og nitrifikation beregnes (4)(7)(8). Et testkemikalies hæmmende virkninger på de to processer kan således bestemmes, og EC50-værdierne for både iltning af organisk kulstof (heterotrof) og ammoniumiltning (nitrifikation) kan beregnes på sædvanlig vis. Det skal bemærkes, at N-allylthiourinstofs hæmmende virkning i sjældne tilfælde kan ophæves helt eller delvist som følge af kompleksdannelse med testkemikalier eller tilsat substrat, f.eks. Cu++-ioner (6). Cu++-ioner er af afgørende betydning for Nitrosomonas, men er toksiske i højere koncentrationer.

3.

Der er opstået et presserende behov for nitrifikation i den aerobe behandling af spildevand i europæiske lande som et nødvendigt trin i fjernelsen af kvælstofforbindelser fra spildevand ved denitrifikation til gasformige produkter; EU har nu fastsat nedre grænser for koncentrationen af kvælstof i behandlet spildevand, der udledes til modtagende vand (5).

4.

Metoden til vurdering af virkningen på iltning af organisk kulstof er tilstrækkelig til de fleste formål. I visse tilfælde er det dog nødvendigt med en undersøgelse af virkningen på nitrifikation alene, eller på både nitrifikation og iltning af organisk kulstof hver for sig, for at kunne fortolke resultaterne og forstå virkningerne.

5.

Respirationshastigheden for prøver af aktiveret slam tilført syntetisk spildevand måles i en indkapslet celle, der indeholder en iltelektrode, efter en kontakttid på tre timer. Længere kontakttider kan være hensigtsmæssige for at opnå et realistisk eksponeringsscenarie. Hvis testkemikaliet er hurtigt nedbrydeligt, f.eks. abiotisk ved hydrolyse, eller er flygtigt, og koncentrationen ikke kan opretholdes i tilstrækkelig grad, kan der desuden anvendes en kortere eksponeringsperiode, f.eks. 30 minutter. Følsomheden af hvert parti aktiveret slam bør kontrolleres med et passende referencekemikalie på eksponeringsdagen. Testen bruges typisk til at bestemme testkemikaliets ECx (f.eks. EC50) og/eller koncentrationen uden observeret effekt (NOEC).

6.

Hæmningen af iltoptagelsen i mikroorganismer, der ilter organisk kulstof, kan udtrykkes særskilt fra iltoptagelsen i mikroorganismer, der ilter ammonium, ved måling af iltoptagelseshastigheden med og uden N-allylthiourinstof, som er en specifik inhibitor af de nitrificerende bakteriers iltning af ammonium til nitrit i første fase. I dette tilfælde beregnes hæmningen i procent af iltoptagelseshastigheden ved sammenligning af iltoptagelseshastigheden med et testkemikalie med den gennemsnitlige iltoptagelseshastighed for de tilsvarende kontroller, der ikke indeholder noget testkemikalie, både med og uden den specifikke inhibitor, N-allylthiourinstof.

7.

Iltoptagelse som følge af abiotiske processer kan påvises ved at bestemme hastigheden i blandinger af testkemikalie, syntetisk spildevandssubstrat og vand, idet aktiveret slam udelades.

8.

Testkemikaliets identifikation (fortrinsvis CAS-nummer), navn (IUPAC), renhed, vandopløselighed, damptryk, flygtighed og adsorptionsegenskaber skal være kendt, for at resultaterne kan fortolkes korrekt. Normalt kan flygtige kemikalier ikke testes korrekt, medmindre der træffes særlige forholdsregler (se punkt 21).

9.

Testmetoden kan anvendes på vandopløselige, tungt opløselige og flygtige kemikalier. Der er dog ikke altid muligt at opnå EC50-værdier med kemikalier med begrænset opløselighed, og der kan kun opnås gyldige resultater med flygtige kemikalier, hvis størstedelen (> 80 %) af testkemikaliet er til stede i reaktionsblandingen ved udløbet af eksponeringsperioden/-perioderne. Yderligere analytiske støttedata skal forelægges for at præcisere ECx-koncentrationen, når der er usikkerhed om testkemikaliets stabilitet eller flygtighed.

10.

Referencekemikalier skal testes periodisk, for at sikre at testmetoden og -betingelserne er pålidelige, og for at kontrollere følsomheden af hvert parti aktiveret slam, der er brugt som mikrobielt inokulum på eksponeringsdagen. Kemikaliet 3,5-dichlorphenol (3,5-DCP) anbefales som hæmmende referencekemikalie, da det vides at hæmme respiration og bruges i mange typer hæmnings-/toksicitetstest (4). Også kobber-(II)-sulfatpentahydrat kan bruges som referencekemikalie til hæmning af samlet respiration (9). N-methylanilin kan bruges som specifik nitrifikationshæmmer (4).

11.

Iltoptagelseshastigheden for blindkontrollerne (uden testkemikalie eller referencekemikalie) må ikke være under 20 mg ilt pr. gram aktiveret slam (tørvægt af opslæmmet faststof) pr. time. Hvis hastigheden er lavere, skal testen gentages med vasket aktiveret slam eller med slam fra en anden kilde. Variationskoefficienten for iltoptagelseshastigheden i kontrolreplikater må ikke overstige 30 % ved den endelige tests afslutning.

12.

I den internationale ringtest, der blev tilrettelagt af ISO (4) i 2004, og hvor der blev anvendt aktiveret slam fremstillet af husholdningsspildevand, viste EC50 for 3,5-DCP sig at ligge i intervallet 2 mg/l til 25 mg/l for samlet respiration, 5 mg/l til 40 mg/l for heterotrof respiration og 0,1 mg/l til 10 mg/l for respiration ved nitrifikation. Hvis EC50 for 3,5-DCP ikke ligger i det forventede område, skal testen gentages med aktiveret slam fra en anden kilde. EC50 for kobber-(II)-sulfatpentahydrat bør ligge i området 53-155 mg/l for den samlede respiration (9).

13.

Der skal anvendes sædvanligt laboratorieudstyr og følgende udstyr:

14.

Der bør anvendes reagenser af analysekvalitet i hele testen.

15.

Der bør kun bruges destilleret eller deioniseret vand, som indeholder under 1 mg/l opløst organisk kulstof, medmindre ledningsvand uden chlor er specificeret.

16.

Substratet skal fremstilles således, at det indeholder følgende bestanddele i de angivne mængder:

17.

Denne opløsnings pH skal være 7,5 ± 0,5. Hvis det fremstillede substrat ikke anvendes straks, skal det opbevares i mørke ved 0 til 4 °C, dog ikke længere end en uge og under forhold, som ikke ændrer sammensætningen. Det skal bemærkes, at dette syntetiske spildevand er 100 gange så koncentreret som det, der er beskrevet i OECD Technical Report »Proposed method for the determination of the biodegradability of surfactants used in synthetic detergents«, 11. juni 1976, med tilsætning af dikaliumhydrogenphosphat.

18.

Alternativt kan substratets komponenter steriliseres særskilt forud for opbevaringen, eller der kan tilsættes pepton og kødekstrakt, kort tid før testen udføres. Substratet skal blandes grundigt inden brug, og pH skal om nødvendigt justeres til pH 7,5 ± 0,5.

19.

Der skal fremstilles en stamopløsning til de let vandopløselige teststoffer, dog kun op til den maksimale vandopløselighed (udfældning accepteres ikke). Stoffer med ringe vandopløselighed, blandinger med komponenter med forskellig vandopløselighed og adsorptive stoffer skal afvejes direkte i testbeholderne. I disse tilfælde kan brug af stamopløsninger være et alternativ, hvis opløste koncentrationer af testkemikalierne bestemmes analytisk i testbeholderne (inden tilsætning af aktiveret slam). Hvis der fremstilles Water Accommodated Fractions (WAF — den andel af stoffet, der opløses i vandet), er det desuden afgørende at foretage en analytisk bestemmelse af de opløste koncentrationer af testkemikalierne i testbeholderne. Det bør undgås at bruge organiske opløsningsmidler og dispergeringsmidler/emulgatorer for at forbedre opløseligheden. Sonikering af stamopløsninger og suspensioner inden omrøring, f.eks. natten over, er mulig, når der foreligger tilstrækkelige oplysninger om testkemikaliets stabilitet under sådanne betingelser.

20.

Testkemikaliet kan have skadelig indvirkning på pH i testsystemet. De testkemikaliebehandlede blandingers pH skal bestemmes inden forsøgsopsætningen i et indledende forsøg, for at konstatere om det er nødvendigt at justere pH inden den endelige test og igen på dagen for den endelige test. Opløsninger/suspensioner af testkemikalie i vand bør om nødvendigt neutraliseres inden tilsætning af inokulum. Eftersom neutralisering kan ændre kemikaliets kemiske egenskaber, kan der dog, afhængigt af undersøgelsens formål, foretages yderligere test for at vurdere testkemikaliets virkning på slammet uden pH-justering.

21.

Flygtige kemikaliers toksiske virkning, navnlig i test, hvor systemet gennembobles, kan give forskellige effektniveauer, der forekommer som følge af tab af stof i eksponeringsperioden. Der bør udvises forsigtighed med sådanne stoffer ved at foretage stofspecifikke analyser af kontrolblandinger, som indeholder stoffet, og ændre beluftningssystemet.

22.

Hvis 3,5-dichlorphenol bruges som referencekemikalie, skal der fremstilles en opløsning af 1,00 g 3,5-dichlorphenol i 1 000 ml vand (15). Varmt vand og/eller sonikering bør bruges til at fremskynde opløsningen og bringe opløsningen op til volumen, når den er afkølet til stuetemperatur. Det skal dog sikres, at referencekemikaliet ikke har ændret sig strukturmæssigt. Opløsningens pH skal kontrolleres og om nødvendigt justeres med NaOH eller H2SO4 til pH 7-8.

23.

Hvis der bruges kobber-(II)-sulfatpentahydrat som referencekemikalie, bruges koncentrationer på 58 mg/l, 100 mg/l og 180 mg/l (en faktor på 1,8). Stoffet afvejes direkte i testbeholderne (29/50/90 mg med henblik på et samlet volumen på 500 ml). Det opløses derefter med 234 ml autoklaveret ledningsvand. Kobber-(II)-sulfatpentahydrat er let opløseligt. Når forsøget påbegyndes, tilsættes 16 ml syntetisk spildevand og 250 ml aktiveret slam.

24.

Der bør fremstilles en stamopløsning på 2,32 g/l af N-allylthiourinstof (ATU). Tilsætningen af 2,5 ml af denne stamopløsning til en inkubationsblanding med et slutvolumen på 500 ml giver en slutkoncentration på 11,6 mg ATU/l (10– 4mol/l), som vides at være tilstrækkelig (4) til at forårsage 100 % nitrifikationshæmning i nitrificerende aktiveret slam, som indeholder 1,5 g/l opslæmmet faststof.

25.

Under visse sjældne betingelser kan et testkemikalie med stærkt reducerende egenskaber forårsage et målbart abiotisk iltforbrug. I sådanne tilfælde er abiotiske kontroller nødvendige for at skelne mellem testkemikaliets abiotiske optagelse og mikrobiel respiration. Abiotiske kontroller kan fremstilles ved at udelade inokulum fra testblandingerne. Abiotiske kontroller uden inokulum kan også anvendes, når der udføres underbyggende analytiske målinger for at bestemme den opnåede koncentration i testens eksponeringsfase, f.eks. når der bruges stamopløsninger af kemikalier med ringe vandopløselighed med komponenter med forskellig vandopløselighed. I specifikke tilfælde kan det være nødvendigt at fremstille en abiotisk kontrol med steriliseret inokulum (f.eks. ved autoklavering eller tilsætning af steriliserende toksiske stoffer). Visse kemikalier producerer eller forbruger kun ilt, hvis overfladearealet er stort nok til reaktion, selv om de normalt kræver en langt højere temperatur eller et langt højere tryk hertil. I denne henseende skal der især fokuseres på peroxy-stoffer. Et steriliseret inokulum giver et stort overfladeareal.

26.

Til almindelig anvendelse bør aktiveret slam indsamles fra beluftningstankens udløb eller i nærheden af tankens udløb i et velfungerende spildevandsrensningsanlæg, der primært modtager husholdningsspildevand. Afhængigt af testens formål kan der også anvendes andre passende kilder til aktiveret slam, f.eks. slam fremstillet i laboratoriet, i passende opslæmmet faststof-koncentrationer på 2 g/l til 4 g/l. Slam fra forskellige rensningsanlæg vil dog sandsynligvis havde forskellige karakteristika og forskellig følsomhed.

27.

Slammet kan bruges, som det er, men grove partikler bør fjernes ved kortvarig bundfældning, f.eks. 5-15 minutter, og dekantering af det øverste lag af finere slampartikler eller sigtning (f.eks. maskestørrelse på 1 mm2). Alternativt kan slammet homogeniseres i en blender i ca. 15 sekunder eller derover, men der skal udvises forsigtighed i forhold til de forskydningskræfter og temperaturændringer, der kan forekomme ved lange blandingsperioder.

28.

Det er ofte nødvendigt at vaske slammet, f.eks. hvis den endogene respirationshastighed er lav. Slammet skal først centrifugeres i en periode for at producere en klar supernatant og en masse af faststof fra spildevandet, f.eks. i 10 minutter ved ca. 10 000 m/s2. Supernatantvæsken kasseres, og slammet genopslæmmes i ledningsvand uden chlor under omrystning, hvorefter vaskevandet fjernes ved gencentrifugering og kasseres. Vaske- og centrifugeringsprocessen gentages om nødvendigt. Tørmassen af et kendt volumen genopslæmmet slam bestemmes, og slammet koncentreres ved fjernelse af væske eller yderligere fortynding i ledningsvand uden chlor for at opnå den nødvendige koncentration af slamfaststoffer på 3 g/l. Det aktiverede slam bør beluftes kontinuerligt (f.eks. 2 l/minut) ved testtemperaturen og om muligt bruges på indsamlingsdagen. Hvis det ikke er muligt, bør slammet dagligt tilføres syntetisk spildevand (50 ml syntetisk spildevand/l aktiveret slam) i yderligere to dage. Slammet bruges herefter til testen, og resultaterne accepteres som gyldige, hvis der ikke er forekommet nogen betydelig ændring i dets aktivitet, vurderet ved dens endogene heterotrofe respirationshastighed og respirationshastighed ved nitrifikation.

29.

Der kan opstå problemer, hvis der forekommer skumdannelse under inkuberingen i en sådan grad, at skummet og slamfaststofferne, som bæres på skummet, fortrænges fra beluftningsbeholderne. Det forekommer, at skumdannelse blot skyldes tilstedeværelse af syntetisk spildevand, men skumdannelse bør forventes, hvis testkemikaliet er eller indeholder et overfladeaktivt stof. Tab af slamfaststoffer fra testblandingerne vil medføre kunstigt nedsat respirationshastighed, som fejlagtigt kan fortolkes som et resultat af hæmning. Derudover koncentrerer beluftningen af opløsningen med overfladeaktivt middel det overfladeaktive middel i skumlaget; tab af skum fra testsystemet vil sænke eksponeringskoncentrationerne. Skumdannelsen kan kontrolleres med enkle mekaniske metoder (f.eks. lejlighedsvis manuel omrøring med en glasstav) eller ved at tilføje et antiskummiddel uden overfladeaktivt middel baseret på silikoneemulsion og/eller bruge rystekolbemetoden. Hvis problemet hænger sammen med tilstedeværelsen af det syntetiske spildevand, bør spildevandets sammensætning ændres ved at tilsætte et reagens mod skumdannelse ved en hastighed på 50 μl/l. Hvis testkemikaliet forårsager skumdannelse, skal den mængde, der er nødvendig for afhjælpning heraf, bestemmes ved den maksimale testkoncentration, og derefter skal alle individuelle beluftningsbeholdere behandles på samme måde (herunder beluftningsbeholdere, f.eks. beholdere med blindkontroller og referencekemikalie, uden skumdannelse). Hvis der bruges antiskummidler, må der ikke være nogen interaktion med inokulum og/eller testkemikalie.

30.

Hæmningen for tre forskellige iltoptagelser kan bestemmes: samlet, kun heterotrof og som følge af nitrifikation. Normalt bør målingen af hæmningen af den samlede iltoptagelse være tilstrækkelig. Virkningerne på den heterotrofe iltoptagelse som følge af iltning af organisk kulstof og iltning af ammonium skal bestemmes, når der er et specifikt krav om sådanne to særskilte endepunkter for et bestemt kemikalie, eller (frivilligt) for at forklare atypiske dosis/respons-kurver i forbindelse med hæmning af den samlede iltoptagelse.

31.

Testen skal udføres ved en temperatur på 20 °C ± 2 °C.

32.

Testblandinger (FT som i tabel 1), der indeholder vand, syntetisk spildevand og testkemikaliet, fremstilles for at opnå forskellige nominelle koncentrationer af testkemikaliet (tabel 1 indeholder et eksempel på volumener af bestanddele). pH justeres om nødvendigt til 7,5 ± 0,5; blandingerne fortyndes med vand, og inokulummet tilsættes med henblik på at opnå lige store endelige volumener i beholderne og påbegynde beluftningen.

33.

Blandinger (FR) fremstilles med referencekemikaliet, f.eks. 3,5-dichlorphenol, i stedet for testkemikaliet på samme måde som testblandingerne.

34.

Blindkontroller (FB) fremstilles ved begyndelsen og slutningen af eksponeringsperioden i test, hvor testbægerglassene er opstillet sekventielt i intervaller. I test gennemført med udstyr, der giver mulighed for samtidig måling af iltforbruget, bør der indgå mindst to blindkontroller i hvert parti til samtidig analyse. Blindkontroller indeholder et tilsvarende volumen aktiveret slam og syntetisk substrat, men intet test- eller referencekemikalie. De fortyndes med vand til samme volumen som test- og referenceblandingerne.

35.

Der fremstilles om nødvendigt — f.eks. hvis et testkemikalie vides eller formodes at have stærkt reducerende egenskaber — en blanding FA med henblik på måling af det abiotiske iltforbrug. Blandingen skal indeholde samme mængder testkemikalie og syntetisk spildevand og have samme volumen som testblandingerne, men indeholder ikke aktiveret slam.

36.

Testblandingerne, referenceblandingerne, blindkontrollerne og de abiotiske kontroller inkuberes ved testtemperaturen under betingelser med tvungen beluftning (0,5 til 1 l/min.) for at holde koncentrationen af opløst ilt over 60-70 % af mætningen og holde slammet i suspension. Det er også nødvendigt at omrøre kulturerne for at holde slammet i suspension. Inkuberingen anses for at begynde med den første kontakt mellem inokulummet af aktiveret slam og de øvrige bestanddele af den færdige blanding. Efter endt inkubering, dvs. efter den angivne eksponeringstid på normalt tre timer, udtages der prøver for at måle hastigheden, hvormed koncentrationen af opløst ilt aftager i den celle, der er udformet til formålet (figur 2 i tillæg 3), eller i en helt fuld BOD-kolbe. Den måde, hvorpå inkuberingerne begynder, afhænger også af det anvendte udstyrs kapacitet til at måle iltforbrugshastigheden. Hvis udstyret f.eks. omfatter en enkelt iltsonde, foretages målingerne individuelt. I dette tilfælde fremstilles de forskellige blandinger, der skal bruges til testen i syntetisk spildevand, men uden inokulum, og de nødvendige portioner slam tilsættes til de enkelte beholdere i serien. Hver inkubering påbegyndes successivt med passende intervaller på f.eks. 10-15 minutter. Alternativt kan målingssystemet omfatte flere sonder, hvilket giver mulighed for flere samtidige målinger; i givet fald kan inokulum tilsættes samtidig til passende grupper af beholdere.

37.

Koncentrationen af aktiveret slam i alle blandinger — testblanding, referenceblanding og blindkontrolblanding (men ikke den abiotiske kontrol) — er nominelt 1,5 g/l opslæmmede faststoffer. Iltforbruget måles efter tre timers eksponering. Der udføres yderligere 30-minutters eksponeringsmålinger efter behov som beskrevet i punkt 5.

38.

Der fremstilles blandinger (FB) som blindkontrolblandingerne og de yderligere »kontrolblandinger« (FN), men som også indeholder 11,6 mg/l N-allylthiourinstof, for at afgøre om slammet nitrificerer og med hvilken hastighed. Blandingerne beluftes og inkuberes ved 20 °C ± 2 °C i tre timer. Herefter måles iltoptagelseshastigheden, og iltoptagelsen som følge af nitrifikation beregnes.

39.

Der anvendes om nødvendigt en indledende test til at bestemme det koncentrationsområde for testkemikaliet, der er nødvendigt i en endelig test til bestemmelse af hæmningen af iltforbrug. Alternativt kan fraværet af testkemikaliets hæmning af iltforbruget i en indledende test indikere, at en endelig test er unødvendig, men der skal gennemføres tre forsøg i den indledende test ved den højeste testede koncentration (typisk 1 000 mg/l, men afhængigt af datakrav).

Tabel 1

Eksempler på blandinger til den indledende test

40.

Testen udføres med mindst tre koncentrationer af testkemikaliet, f.eks. 10 mg/l, 100 mg/l og 1 000 mg/l med en blindkontrol og om nødvendigt mindst tre abiotiske kontroller med de højeste koncentrationer af testkemikaliet (se eksempel i tabel 1). Ideelt har den laveste koncentration ingen virkning på iltforbruget. Iltoptagelseshastigheden og, hvis det er relevant, nitrifikationshastigheden beregnes; herefter beregnes hæmningen i procent. Afhængigt af testens formål kan man dog også blot bestemme en grænsekoncentrations toksicitet, f.eks. 1 000 mg/l. Hvis der ikke forekommer nogen statistisk signifikant toksisk virkning ved denne koncentration, er det ikke nødvendigt at gennemføre yderligere test ved højere eller lavere koncentrationer. Det skal bemærkes, at stoffer med ringe vandopløselighed, blandinger med komponenter med forskellig vandopløselighed og adsorptive stoffer skal afvejes direkte i testbeholderne. I dette tilfælde erstattes det volumen, der er forbeholdt stamopløsningen af teststof, med fortyndingsvand.

41.

Testen udføres ved en række koncentrationer, der er udledt af den indledende test. I de fleste tilfælde anbefales seks kontroller og fem behandlingskoncentrationer i en geometrisk serie med fem replikater for at opnå både NOEC og ECx (f.eks. EC50). Det er ikke nødvendigt at gentage den abiotiske kontrol, hvis der ikke forekom iltoptagelse i den indledende test, men hvis der forekommer signifikant optagelse, foretages abiotisk kontrol for hver enkelt koncentration af testkemikalie. Slammets følsomhed kontrolleres med referencekemikaliet 3,5-dichlorphenol. Slammets følsomhed kontrolleres for hver testserie, da følsomheden vides at svinge. Der udtages i alle tilfælde prøver fra testbeholderne efter tre timer, og om nødvendigt efter yderligere 30 minutter, med henblik på måling af iltoptagelseshastigheden i iltelektrodecellen. Den specifikke respirationshastighed i kontrol- og testblandingerne beregnes på grundlag af de indsamlede data; hæmningen i procent beregnes derefter ud fra ligning 7 nedenfor.

42.

Brugen af den specifikke nitrifikationsinhibitor, ATU, giver mulighed for direkte vurdering af testkemikaliers inhibitoriske virkninger på den heterotrofe iltning og for beregning af virkningerne på nitrifikationshastigheden ved at trække iltoptagelseshastigheden med ATU fra den samlede optagelseshastighed (uden ATU). Der fremstilles to sæt reaktionsblandinger i henhold til de testdesign for ECx eller NOEC, der er beskrevet i punkt 41, men ATU tilsættes desuden til hver blanding i et sæt til en slutkoncentration på 11,6 mg/l, som har vist sig helt at hæmme nitrifikation i slam med koncentrationer af opslæmmede faststoffer på op til 3 000 mg/l (4). Iltoptagelseshastigheden måles efter eksponeringsperioden; disse direkte værdier repræsenterer kun den heterotrofe respiration, og forskellene mellem disse og den tilsvarende samlede respirationshastighed repræsenterer nitrifikation. Derefter beregnes de forskellige hæmningsgrader.

43.

Efter eksponeringsperioden/-perioderne overføres en prøve fra den første beluftningsbeholder til iltelektrodecellen (figur 1 i tillæg 2), og koncentrationen af opløst ilt måles straks. Hvis et system med flere elektroder er tilgængeligt, kan målingerne foretages samtidig. Det er afgørende, at omrøringen (ved hjælp af en overtrukket magnet) foregår ved samme hastighed, som når elektroden kalibreres, med henblik på at sikre, at sonden reagerer med minimal forsinkelse på ændringer i iltkoncentrationerne, og give mulighed for regelmæssige og reproducerbare iltmålinger i målebeholderen. Normalt er visse iltelektroders system med en selvomrørende sonde tilstrækkeligt. Cellen bør skylles med vand mellem målingerne. Alternativt kan prøven fyldes i en BOD-kolbe (figur 2 i tillæg 3) udstyret med en magnetomrører. En iltsonde med en muffeadapter indsættes derefter i kolbens hals, og magnetomrøreren startes. I begge tilfælde måles koncentrationen af opløst ilt regelmæssigt og registreres i en periode, normalt 5-10 minutter eller indtil iltkoncentrationen falder til under 2 mg/l. Elektroden fjernes, blandingen hældes tilbage i beluftningsbeholderen, og beluftningen og omrøringen fortsættes, hvis det er nødvendigt med måling efter længere eksponeringsperioder.

44.

Til nogle formål kan det være nødvendigt at måle testkemikaliekoncentrationen i testbeholderne. Det skal bemærkes, at hvis der bruges stamopløsninger af:

er den opløste andel ukendt, og den reelle koncentration af testkemikaliet, som overføres til testbeholderne, er ikke kendt. Der er brug for en analytisk vurdering af testkemikaliekoncetrationen i testbeholderne for at bestemme eksponeringen. For at forenkle proceduren foretages den analytiske vurdering inden tilsætning af inokulummet. Fordi kun opløste andele overføres til testbeholderne, kan de målte koncentrationer være meget lave.

45.

For at undgå tidskrævende og dyre analyser anbefales det blot at afveje testkemikaliet direkte i testbeholderne og bruge den oprindelige afvejede nominelle koncentration i efterfølgende beregninger. Det er ikke nødvendigt at sondre mellem opløste, uopløste og adsorberede andele af testkemikaliet, fordi alle disse andele forekommer under faktiske betingelser i et spildevandsrensningsanlæg, og andelene kan variere afhængigt af spildevandets sammensætning. Formålet med testmetoden er at give et realistisk skøn over en ikke-hæmmende koncentration, og metoden er ikke hensigtsmæssig til detaljeret undersøgelse af, hvilke andele der bidrager til hæmningen af organismerne i det aktiverede slam. Endelig bør adsorptive stoffer også afvejes direkte i testbeholderne, og der bør anvendes beholdere i silancoatet glas for at minimere tab ved adsorption.

46.

Iltoptagelseshastighederne beregnes på grundlag af gennemsnittet af de målte værdier, f.eks. den lineære del af kurverne over iltkoncentration som funktion af tid, hvilket begrænser beregningerne til iltkoncentrationer mellem 2,0 mg/l og 7,0 mg/l, eftersom højere og lavere koncentrationer i sig selv har indvirkning på forbrugshastighederne. Udsving ind i koncentrationsområder under eller over disse værdier er af og til uundgåelige og nødvendige, f.eks. når respirationen er voldsomt hæmmet og dermed meget langsom, eller hvis aktiveret slam respirerer meget hurtigt. Det kan accepteres, hvis optagelseskurvens forlængede dele er lige, og deres gradienter ikke ændrer sig, når de passerer 2,0 mg/l- eller 7,0 mg/l O2-grænserne. Eventuelle buede dele af kurven indikerer, at målingssystemet stabiliserer sig, eller at optagelseshastigheden ændrer sig, og må derfor ikke bruges til beregning af respirationshastigheden. Iltoptagelseshastigheden udtrykkes i milligram pr. liter pr. time (mg/l/t.) eller milligram pr. gram tørslam pr. time (mg/g/t.). Iltforbrugshastigheden, R, i mg/l/t. kan beregnes eller interpoleres fra den lineære del af den registrerede kurve over iltfald i henhold til ligning 1:

hvor:

47.

Den specifikke respirationshastighed (Rs) udtrykkes som den mængde ilt, der forbruges pr. gram slam (tørvægt) pr. time (mg/g/t.) i henhold til ligning 2:

hvor SS er koncentrationen af opslæmmede faststoffer i testblandingen (g/l).

48.

De forskellige indekser for R, der kan kombineres, er:

49.

Forholdet mellem samlet respiration (RT), respiration ved nitrifikation (RN) og heterotrof respiration (RH) er givet ved ligning 3:

hvor:

50.

Dette forhold gælder for blindværdier (RNB, RTB, RHB), abiotiske kontroller (RNA, RTA, RHA) og prøver med testkemikalier (RNS, RTS, RHS) (mg/g/t.). Den specifikke respirationshastighed beregnes på grundlag af:

51.

Hvis RN er uden betydning (f.eks. < 5 % af RT i blindkontroller) i en indledende test, må det antages, at den heterotrofe iltoptagelse er lig med den samlede optagelse, og at der ikke forekommer nitrifikation. En alternativ kilde til aktiveret slam ville være nødvendig, hvis testene skulle anvendes til at vurdere virkningerne på heterotrofe og nitrificerende mikroorganismer. Der udføres en endelig test, hvis der konstateres hæmmede iltoptagelseshastigheder med forskellige testkemikaliekoncentrationer.

52.

Hæmningen i procent, IT, af det samlede iltforbrug ved hver koncentration af testkemikaliet er givet ved ligning 7:

53.

Tilsvarende er hæmningen i procent af den heterotrofe iltoptagelse, IH, ved hver koncentration af testkemikaliet givet ved ligning 8:

54.

Endelig er hæmningen i procent af iltoptagelsen som følge af nitrifikation, IN, ved hver koncentration givet ved ligning 9:

55.

Hæmningen i procent af iltoptagelsen afbildes mod logaritmen for testkemikaliekoncentrationen (hæmningskurve, se figur 3 i tillæg 4). Hæmningskurver afbildes for hver beluftningsperiode på tre timer eller yderligere efter 30 min. Den testkemikaliekoncentration, der hæmmer iltoptagelsen med 50 % (EC50), skal beregnes eller interpoleres på grundlag af kurven. Hvis der foreligger passende data, kan man beregne eller interpolere 95 % konfidensgrænser for EC50, kurvens hældning og værdier, som er egnede til at markere begyndelsen af hæmningsintervallet (f.eks. EC10 eller EC20) og slutningen af hæmningsintervallet (f.eks. EC80 eller EC90).

56.

Det skal bemærkes, at det i lyset af den variabilitet, der ofte konstateres i resultaterne, i mange tilfælde kan være vanskeligt også at udtrykke resultaterne i størrelsesorden, f.eks.:

57.

ECx-værdier, herunder deres øvre og nedre 95 % konfidensgrænser for parameteren, beregnes med passende statistiske metoder (f.eks. probabilistisk analyse, logistisk funktion eller Weibull-funktion, Trimmed Spearman-Karber-metoden eller simpel interpolation (11)). En ECx-værdi opnås ved at indsætte en værdi, der svarer til x % af kontrolgennemsnittet, i den fundne ligning. For at beregne EC50 eller enhver anden ECx-værdi skal middelværdierne for hver behandling (x) underkastes regressionsanalyse.

58.

Hvis NOEC skal bestemmes ved statistisk analyse, er det nødvendigt med statistikker pr. beholder (individuelle beholdere anses for replikater). Passende statistiske metoder anvendes i overensstemmelse med OECD Document on the Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application (11). Generelt undersøges negative virkninger af testkemikaliet sammenlignet med kontrollerne ved hjælp af en ensidet (mindre) hypotesetest ved p ≤ 0,05.

59.

Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:

(1)

D. Brown, H. R. Hitz og L. Schäfer (1981), The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test, Chemosphere 10 (3): 245-261.

(2)

E. F. King og H. A. Painter (1986), Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results, Toxicity Assessment 1(1): 27-39.

(3)

OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

(4)

ISO (2007), ISO 8192 Water Quality — Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, Den Internationale Standardiseringsorganisation.

(5)

D. J. Bealing (2003), Document ISO/TC147/WGI/N.183, Den Internationale Standardiseringsorganisation.

(6)

H. A. Painter og K. Jones (1963), The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms, Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471-483.

(7)

H. A. Painter (1986), Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge, Toxicity Assessment 1:515-524.

(8)

B. Robra (1976), Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

S. Fiebig og U. Noack (2004), The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test — acc. to the OECD guideline 209, Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.

(10)

ISO (1995), ISO 10634 Water Quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, Den Internationale Standardiseringsorganisation.

(11)

OECD 2006, Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.

1.

Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline (TG) 221 (2006). Den anvendes til at vurdere kemikaliers toksicitet for akvatiske ferskvandsplanter af slægten Lemna (andemad). Den er baseret på eksisterende metoder (1)(2)(3)(4)(5)(6), men der er foretaget ændringer, som afspejler den senere tids forskning og drøftelser vedrørende en række vigtige punkter. Testmetoden er blevet valideret ved en international ringtest (7).

2.

I denne testmetode beskrives toksicitetstestning med Lemna gibba og Lemna minor, der begge har været genstand for omfattende undersøgelser og er omhandlet i ovennævnte standarder. Taksonomien for Lemna spp. er vanskelig, idet den kompliceres af, at der findes en bred vifte af fænotyper. Genetisk variation i Lemnas respons på giftstoffer kan forekomme, men de aktuelt foreliggende oplysninger om denne kilde til variation er utilstrækkelige som grundlag for at anbefale en bestemt klon til brug i nærværende testmetode. Det skal bemærkes, at testen ikke udføres axenisk, men nogle af testprocessens trin er foranstaltninger, der skal holde kontamineringen med andre organismer nede på et minimum.

3.

Der gives en nærmere beskrivelse af testning med udskiftning af testopløsningen (semistatisk test og gennemstrømningstest) og uden udskiftning (statisk). Afhængigt af målsætningen for testen og myndighedernes krav anbefales det at overveje brug af den semistatiske metode og gennemstrømningsmetoden f.eks. til kemikalier, der hurtigt forlader opløsningen ved fordampning, fotonedbrydning, udfældning eller bionedbrydning. Nærmere anvisninger er givet i (8).

4.

De anvendte definitioner er anført i tillæg 1.

5.

Eksponentielt voksende plantekulturer af slægten Lemna dyrkes som monokultur ved forskellige koncentrationer af testkemikaliet i syv dage. Testens formål er at kvantificere kemikalierelaterede virkninger på den vegetative vækst i dette tidsrum, baseret på vurdering af udvalgte målevariable. Bladantallet er den primære målevariabel. Der måles desuden mindst en anden målevariabel (totalt bladareal, tørvægt eller frisk vægt), da nogle kemikalier kan påvirke andre målevariable langt mere end bladantallet. De kemikalierelaterede virkninger kvantificeres ved, at væksten i testopløsningerne sammenholdes med væksten i kontrollerne, hvorudfra man bestemmer den koncentration, som frembringer en bestemt hæmning på x % (f.eks. 50 %) af væksthastigheden, og som betegnes ECx (f.eks. EC50).

6.

Testens endepunkt er hæmning af væksten, der er udtrykt som den logaritmiske stigning i målevariablen (den gennemsnitlige specifikke væksthastighed) i eksponeringsperioden. Ud fra de gennemsnitlige specifikke væksthastigheder, der er registreret i en række testopløsninger, bestemmes den koncentration, der frembringer en bestemt hæmning på x % (f.eks. 50 %) af væksthastigheden, og denne betegnes ErCx (f.eks. ErC50).

7.

I denne metode anvendes udbytte som en supplerende responsvariabel, der kan være nødvendig for at efterkomme myndighedsbestemmelser i visse lande. Udbyttet defineres som værdien af målevariablene ved eksponeringsperiodens slutning minus værdien af variablene ved eksponeringsperiodens start. Ud fra det udbytte, der er registreret i en række testopløsninger, bestemmes den koncentration, der frembringer en bestemt hæmning på x % (f.eks. 50 %) af udbyttet, og denne betegnes EyCx (f.eks. EyC50).

8.

Derudover kan den laveste koncentration med observeret effekt (LOEC) og nuleffektkoncentrationen (NOEC) bestemmes statistisk.

9.

Der skal foreligge en tilstrækkeligt følsom analysemetode til kvantitativ bestemmelse af kemikaliet i testsubstratet.

10.

Af oplysninger om testkemikaliet, der kan være nyttige ved fastsættelse af testbetingelserne, kan nævnes strukturformel, renhed, vandopløselighed, stabilitet i vand, lysstabilitet, pKa, Kow, damptryk og bionedbrydelighed. Vandopløseligheden og damptrykket kan bruges til at beregne Henrys konstant, som angiver, om der kan forventes væsentligt tab af testkemikalie i løbet af testperioden. Derved fås en indikation af, om der skal træffes særlige skridt til at kontrollere sådanne tab. Er oplysningerne om testkemikaliets opløselighed og stabilitet usikre, anbefales det at vurdere disse under testbetingelserne, dvs. med samme næringssubstrat, temperatur og belysning som i testen.

11.

Når regulering af testsubstratets pH er særlig vigtig, f.eks. ved testning af metaller eller hydrolytisk ustabile kemikalier, anbefales det at tilsætte en buffer til næringssubstratet (se punkt 21). I (8) findes der yderligere vejledning i testning af kemikalier, hvis fysisk-kemisk egenskaber vanskeliggør testning.

12.

For at testen er valid, skal fordoblingstiden for bladantallet i kontrollen være mindre end 2,5 dage (60 t.), tilnærmelsesvis svarende til en syvdobling på syv dage eller en gennemsnitlig specifik væksthastighed på 0,275 d– 1. Med de testsubstrater og testbetingelser, der er beskrevet i denne testmetode, kan dette kriterium opfyldes ved at gennemføre testen under statiske betingelser (5). Kriteriet forventes desuden at kunne opfyldes under semistatiske forhold og med gennemstrømning. Beregningen af fordoblingstiden er vist i punkt 49.

13.

Til kontrol af testmetoden kan der testes et eller flere referencekemikalier, f.eks. 3,5-dichlorphenol, som er anvendt i den internationale ringtest (7). Det tilrådes, at testning af et referencekemikalie finder sted mindst to gange årligt eller, hvis testningsfrekvensen er lavere, sideløbende med toksicitetsbestemmelsen af et testkemikalie.

14.

Alt udstyr, der kommer i berøring med testsubstraterne, skal være udført helt i glas eller et andet kemisk inaktivt materiale. Glasapparatur, der anvendes til dyrkning og testning, skal være renset for kemiske kontaminanter, der kan udvaskes i testsubstratet, og skal være sterilt. Testbeholderne skal være tilstrækkeligt vide til, at blade fra forskellige kolonier i kontrolbeholderne kan vokse uden at overlappe hinanden ved testens slutning. Rødderne må gerne røre bunden af testbeholderen, men en mindste dybde på 20 mm og et mindste rumfang på 100 ml i hver testbeholder tilrådes. Valget af testbeholder er ikke afgørende, når blot disse krav er opfyldt. Bægerglas, krystallisationsskåle eller petriskåle af glas med passende mål har alle vist sig velegnede. Testbeholderne skal have låg, der nedsætter fordampning og utilsigtet kontaminering til et minimum og samtidig tillader det nødvendige luftskifte. Testbeholderne, og især disses låg, må ikke skygge eller ændre lysets spektrale sammensætning.

15.

Kulturerne og testbeholderne må ikke opbevares sammen. Dette opnås bedst ved, at vækstkamre, inkubatorer eller lokaler er separate. Belysning og temperatur skal kunne reguleres og holdes på et konstant niveau (se punkt 35-36).

16.

Som testorganisme anvendes i denne test enten Lemna gibba eller Lemna minor. Tillæg 2 indeholder en kort beskrivelse af de arter af andemad, der er blevet anvendt til toksicitetstestning. Plantemateriale kan fås fra en kultursamling, fra et andet laboratorium eller i felten. Er planterne indsamlet i felten, skal de opbevares i mindst otte uger i kultur i samme substrat, som benyttes til testningen, før de anvendes. Indsamlingssteder for startkulturer i felten skal være fri for åbenlyse forureningskilder. Hvis de leveres fra et andet laboratorium eller en kultursamling, skal de opbevares på tilsvarende måde i mindst tre uger. Kilden til plantematerialet og den testede art og klon (hvis denne kendes) skal altid rapporteres.

17.

Der skal anvendes monokulturer, som er fri for synlig kontaminering med andre organismer såsom alger og protozoer. Sunde planter af L. minor består af kolonier på mellem to og fem blade, mens sunde kolonier af L. gibba kan bestå af op til syv blade.

18.

De testede planters kvalitet og ensartethed har stor indflydelse på testresultatet, hvorfor de bør udvælges nøje. Der skal anvendes unge, hurtigtvoksende planter uden synlige forandringer eller misfarvning (chlorose). Kulturer af god kvalitet er kendetegnet ved en høj andel af kolonier med mindst to blade. Et stort antal enkeltblade er tegn på miljøbelastning som f.eks. begrænset adgang til næringsstoffer, og plantemateriale fra sådanne kulturer bør ikke anvendes til testning.

19.

For at undgå at skulle vedligeholde kulturerne så ofte (f.eks. når Lemna-test ikke påtænkes anvendt i en periode), kan kulturerne opbevares ved reduceret belysning og temperatur (4-10 °C). En nærmere beskrivelse af dyrkningen er givet i tillæg 3. Hvis der er tydelige tegn på kontaminering med alger eller andre organismer, kan det være nødvendigt at udtage en delprøve af Lemna-blade, som overfladesteriliseres og derefter overføres til frisk substrat (se tillæg 3). I så fald kasseres resten af den kontaminerede kultur.

20.

Mindst syv dage før testning overføres et tilstrækkeligt antal kolonier aseptisk til frisk, sterilt substrat og dyrkes i 7-10 dage under testbetingelserne.

21.

Der anbefales forskellige substrater til Lemna minor og Lemna gibba som beskrevet nedenfor. Det må nøje overvejes, om der skal anvendes pH-buffer i testsubstratet (MOPS (4-morpholinpropansulfonsyre, CAS-Nr.: 1132-61-2) i L. minor-substrat og NaHCO3 i L. gibba-substrat), hvis det mistænkes for at kunne reagere med testkemikaliet og påvirke tegnene på dets toksicitet. Steinberg-substrat (9) er ligeledes acceptabelt, når blot validitetskriterierne er opfyldt.

22.

Til dyrkning af og testning med L. minor anbefales en modificeret version af Lemna-næringssubstratet efter svensk standard (SIS). Sammensætningen af dette substrat er givet i tillæg 4.

23.

Til dyrkning af og testning med L. gibba anbefales næringssubstratet 20X-AAP, som er beskrevet i tillæg 4.

24.

Steinberg-substratet, som beskrives i tillæg 4, er også velegnet til L. minor og kan desuden bruges til L. gibba, når blot validitetskriterierne er opfyldt.

25.

Testopløsninger fremstilles sædvanligvis ved fortynding af en stamopløsning. Stamopløsningerne af testkemikaliet fremstilles normalt ved opløsning af kemikaliet i næringssubstrat.

26.

Den højeste testede koncentration af testkemikaliet skal sædvanligvis ikke være større end kemikaliets vandopløselighed under testbetingelserne. Det skal dog bemærkes, at Lemna spp. flyder ovenpå og kan blive eksponeret for kemikalier, som samler sig i grænsefladen mellem vand og luft (f.eks. kemikalier, der er tungtopløselige i vand, hydrofobe eller overfladeaktive). Under sådanne omstændigheder vil eksponeringen skyldes andet materiale end det opløste materiale, og alt efter testkemikaliets egenskaber kan testkoncentrationerne være større end opløseligheden i vand. For testkemikalier med lav vandopløselighed kan det være nødvendigt at fremstille en koncentreret stamopløsning eller -dispersion af kemikaliet ved hjælp af et organisk opløsnings- eller dispergeringsmiddel for at lette tilsætning af nøjagtige mængder testkemikalie til testsubstratet og medvirke til, at det dispergeres eller opløses. Brug af sådanne midler bør på enhver måde søges undgået. Brug af sådanne hjælpeopløsnings- og dispergeringsmidler må ikke medføre fytotoksisk virkning. Som eksempler på almindeligt anvendte opløsningsmidler, der er uden fytotoksisk virkning i koncentrationer på op til 100 μl/l, kan nævnes acetone og dimethylformamid. Hvis der anvendes et opløsnings- eller dispergeringsmiddel, skal dets slutkoncentration rapporteres og holdes så lav som mulig (≤ 100 μl/l), og der skal være samme koncentration af opløsnings- eller dispergeringsmiddel i alle behandlings- og kontrolgrupper. Nærmere anvisninger kan findes i (8).

27.

Det vil lette valget af passende testkemikaliekoncentrationer, hvis man på forhånd kender til teststoffets toksicitet for Lemna, f.eks. fra en test til bestemmelse af dosisinterval. I den endelige toksicitetstest skal der normalt være mindst fem teststofkoncentrationer, der danner en geometrisk række. Kvotienten mellem testkoncentrationerne skal helst ikke være over 3,2, men kan dog være større, når koncentrationsresponskurven er flad. Anvendes færre end fem koncentrationer, skal dette begrundes. Der skal anvendes mindst tre replikater for hver testkoncentration.

28.

Ved fastsættelse af området for testkoncentrationerne (i det indledende forsøg og/eller i den endelige toksicitetstest) skal følgende tages i betragtning:

29.

Hver test skal omfatte kontroller med samme næringssubstrat, samme antal blade og kolonier og samme miljøbetingelser og procedurer som testbeholderne, men uden testkemikalie. Hvis der anvendes et opløsnings- eller dispergeringsmiddel, skal der indgå en ekstra kontrolbehandling med samme koncentration af opløsnings-/dispergeringsmiddel som i testbeholderne med testkemikalie. Antallet af kontrolreplikater (og, i givet fald, prøver med opløsningsmiddel) skal mindst være lig antallet af beholdere for hver testkoncentration, og ideelt dobbelt så stort.

30.

Hvis der ikke kræves bestemmelse af NOEC, kan testens design ændres, så der er flere forskellige koncentrationer og færre replikater for hver koncentration. Der skal dog være mindst tre replikater af kontrollerne.

31.

Kolonier bestående af 2 til 4 synlige blade overføres fra podekulturen i vilkårlig rækkefølge til testbeholderne under aseptiske betingelser. Hver testbeholder skal indeholde i alt 9 til 12 blade. Der skal være samme antal blade og kolonier i hver testbeholder. Erfaringerne med brugen af metoden og oplysninger fra ringtest har vist, at tre replikater pr. behandling med 9 til 12 blade som startværdi i hver replikat er tilstrækkeligt til at påvise vækstforskelle mellem behandlingerne svarende til en hæmning på 4 til 7 %, beregnet som væksthastighed (10 til 15 %, beregnet som udbytte) (7).

32.

Testbeholdernes placering i inkubatoren skal være randomiseret for at minimere indflydelsen af rumlige forskelle i lysintensitet eller temperatur. Desuden skal testen enten have blokdesign, eller også skal testbeholderne omplaceres vilkårligt ved hver observation (eller hyppigere).

33.

Hvis en indledende stabilitetstest viser, at testkemikaliekoncentrationen ikke kan opretholdes (dvs. den målte koncentration kommer ned under 80 % af den målte startkoncentration) gennem hele testperioden (syv dage), anbefales et semistatisk testregime. Dette gennemføres ved, at kolonierne eksponeres for friskfremstillede test- og kontrolopløsninger mindst to gange i løbet af testen (f.eks. på dag 3 og 5). Hyppigheden af eksponeringen for frisk substrat afhænger af testkemikaliets stabilitet. Meget ustabile eller flygtige kemikalier kan kræve hyppigere eksponering, for at koncentrationerne kan holdes tilnærmelsesvis konstante. I visse tilfælde kan det være nødvendigt at bruge en gennemstrømningsmetode (8)(10).

34.

Eksponeringsscenariet ved påføring på bladene (spray) er ikke omhandlet i denne metode. Der henvises i stedet til (11).

35.

Belysningen skal være konstant og komme fra lysstofrør med »warm« eller »cool white« lys med en styrke, der vælges i området 85-135 μE · m– 2 · s– 1, målt i det fotosyntetisk aktive spektrum (400-700 nm) i punkter med samme afstand fra lyskilden som bladene af Lemna (svarende til 6 500-10 000 lux). Lysstyrken over testområdet må ikke afvige mere end ± 15 % fra den valgte lysstyrke. Den anvendte metode til lysdetektion og -måling, specielt den anvendte type sensor, vil påvirke måleværdien. Sfæriske sensorer (som reagerer på lys fra alle vinkler over og under måleplanet) og cosinus-sensorer (som reagerer på lys fra alle vinkler over måleplanet) må foretrækkes frem for retningsbestemte sensorer og vil give højere aflæsninger fra en lyskilde bestående af mange punkter som den her beskrevne.

36.

Temperaturen i testbeholderne skal være 24 °C ± 2 °C. Kontrolsubstratets pH må højst stige med 1,5 enhed under testen. Dog vil en afvigelse på mere end 1,5 enhed ikke gøre testen ugyldig, hvis det kan dokumenteres, at validitetskriterierne er opfyldt. I særlige tilfælde, f.eks. testning af ustabile kemikalier eller metaller, må der udvises ekstra opmærksomhed over for pH-afvigelse. Nærmere vejledning er givet i (8).

37.

Testen afsluttes syv dage efter, at planterne er overført til testbeholderne.

38.

Ved testens begyndelse tælles og registreres antallet af blade i testbeholderne, idet der sørges for, at fremstående, klart synlige blade medtages. Antal blade med normalt og unormalt udseende bestemmes ved testens begyndelse, mindst hvert tredje døgn i løbet af eksponeringsperioden (dvs. mindst to gange i løbet af testperioden på syv dage) samt ved testens slutning. Ændringer i planternes udvikling, f.eks. i bladstørrelse, udseende, tegn på nekrose, chlorose eller opsvulmethed, opbrydning af kolonierne eller tab af disses flydeevne, samt i røddernes længde og udseende skal registreres. Særlige kendetegn ved testsubstratet (f.eks. uopløst materiale i testbeholderen eller algevækst på denne) skal ligeledes registreres.

39.

Foruden at bladantallet registreres under testen, vurderes testkemikaliets virkninger på en (eller flere) af følgende målevariable:

40.

Bestemmelse af det totale bladareal har den fordel, at det kan bestemmes for hver testbeholder og kontrolbeholder både ved testens start, under testen og ved dens slutning. Den tørre og friske vægt bestemmes ved testens start på en prøve af podekulturen, der er repræsentativ for den, der anvendes til at igangsætte testen, samt ved testens slutning med plantemateriale fra hver test- og kontrolbeholder. Hvis der ikke måles bladareal, er tørvægt at foretrække frem for frisk vægt.

41.

Bestemmelse af totalt bladareal, tørvægt og frisk vægt kan foretages således:

42.

Hvis testen udføres statisk, skal pH for hver behandling måles ved testens start og slutning. Udføres testen semistatisk, foretages pH-måling på hver portion »frisk« testopløsning før hver udskiftning foruden på de tilsvarende »brugte« opløsninger.

43.

Lysintensiteten skal måles i vækstkammeret, inkubatoren eller lokalet i punkter med samme afstand til lyskilden som Lemna-bladene. Målingerne foretages mindst en gang i løbet af testen. Mindst en gang dagligt måles temperaturen af substratet i en surrogatbeholder, der opbevares ved samme betingelser i vækstkammeret, inkubatoren eller lokalet.

44.

Under testen bestemmes testkemikaliekoncentrationerne med passende intervaller. Mindstekravet i statistiske test er bestemmelse af koncentrationerne ved testens start og slutning.

45.

I semistatiske test, hvor testkemikaliekoncentrationen ikke forventes at forblive inden for ± 20 % af den nominelle koncentration, er det nødvendigt at analysere alle friskfremstillede testopløsninger, og de samme opløsninger analyseres ved hver udskiftning (se punkt 33). For de test, hvor den målte startkoncentration af testkemikaliet ikke ligger inden for ± 20 % af den nominelle værdi, men hvor der kan fremlægges tilstrækkelig dokumentation for, at startkoncentrationerne er repeterbare og stabile (dvs. inden for området 80-120 % af startkoncentrationen), kan det godtages, at der kun foretages kemisk bestemmelse af den højeste og laveste testkoncentration. I alle tilfælde behøver testkemikaliekoncentrationen før udskiftning kun bestemmes på en testbeholderreplikat ved hver testkoncentration (eller på indholdet af de poolede beholdere for hver replikat).

46.

For gennemstrømningstest vil det være hensigtsmæssigt med en prøvetagningsplan svarende til den, der er beskrevet for semistatiske test, herunder analyse ved testens start, undervejs og ved testens slutning, men måling af »brugt« testopløsning er ikke hensigtsmæssig i dette tilfælde. I sådanne test skal flowhastigheden af fortyndingsmiddel og testkemikalie eller testkemikaliestamopløsning kontrolleres dagligt.

47.

Hvis det kan konstateres, at testkemikaliekoncentrationen har været holdt tilfredsstillende inden for ± 20 % af den nominelle eller målte startkoncentration under hele testen, kan analysen af resultaterne baseres på nominelle eller målte startværdier. Er afvigelsen fra den nominelle eller målte startkoncentration større end ± 20 %, skal analysen af resultaterne baseres på den geometriske middelkoncentration under eksponeringen eller på modeller, der beskriver faldet i testkemikaliekoncentrationen (8).

48.

Under visse omstændigheder, f.eks. når en indledende test viser, at testkemikaliet er uden toksiske virkninger i koncentrationer på op til 100 mg/l, dog ikke over stoffets opløselighed i testsubstratet, kan der udføres en grænsetest, hvor reaktionen i en kontrolgruppe sammenholdes med reaktionen i en behandlingsgruppe (100 mg/l eller en koncentration lig med opløselighedsgrænsen). Det anbefales kraftigt, at dette understøttes ved analyse af eksponeringskoncentrationen. Alle de beskrevne testbetingelser og validitetskriterier finder anvendelse på en grænsetest, bortset fra at antallet af behandlingsreplikater skal fordobles. Væksten i kontrol- og behandlingsgruppen kan analyseres med en statistisk test til sammenligning af middelværdier, f.eks. Students t-test.

49.

Til bestemmelse af fordoblingstiden (Td) for bladantallet og forsøgets overensstemmelse med dette validitetskriterium (punkt 12) anvendes følgende formel på de data, der er indsamlet for kontrolbeholderne:

Td = ln 2/μ

hvor μ er den gennemsnitlige specifikke væksthastighed, der bestemmes som beskrevet i punkt 54-55.

50.

Testens formål er at bestemme testkemikaliets virkninger på den vegetative vækst af Lemna. I nærværende testmetode beskrives to responsvariable, da præferencer og myndighedskrav er forskellige i forskellige lande. For at testresultaterne skal kunne godtages i alle lande, skal virkningerne vurderes ved hjælp af begge de nedenfor beskrevne responsvariable a) og b).

51.

Det skal bemærkes, at toksicitetsværdier beregnet ved hjælp af disse to responsvariable ikke er sammenlignelige, og at forskellen mellem dem må haves for øje ved anvendelse af testens resultater. ECx-værdier baseret på gennemsnitlig specifik væksthastighed (ErCx) vil sædvanligvis være højere end resultater baseret på udbytte (EyCx), når testbetingelserne i denne metode er overholdt, hvilket følger af det matematiske grundlag for de to beregningsmåder. Dette må ikke opfattes som en forskel i følsomhed mellem de to responsvariable, men kun, at der er tale om to matematisk forskellige størrelser. Begrebet gennemsnitlig specifik væksthastighed bygger på det generelle eksponentielle vækstmønster for andemad i ikke-begrænsede kulturer, idet toksiciteten vurderes på grundlag af virkningerne på væksthastigheden og ikke afhænger af den absolutte størrelse af den specifikke væksthastighed af kontrollen, koncentrationsresponskurvens hældning eller testens varighed. Resultater, der er baseret på responsvariablen for udbytte, afhænger derimod af alle disse øvrige variable. EyCx afhænger af den specifikke væksthastighed af de arter af andemad, der anvendes i hver test, og af den maksimale specifikke væksthastighed, som kan variere mellem de forskellige arter og endda kloner. Denne responsvariabel bør ikke anvendes til at sammenligne følsomheden over for giftstoffer mellem forskellige arter af andemad, endsige forskellige kloner. Skønt det videnskabeligt foretrukne grundlag til vurdering af toksicitet er den gennemsnitlige specifikke væksthastighed, indeholder nærværende testmetode toksicitetsvurderinger baseret på udbytte for at imødekomme de aktuelle myndighedskrav i visse lande.

52.

Beregningen af toksicitet skal baseres på bladantal og mindst en anden målevariabel (totalt bladareal, tørvægt eller frisk vægt), da visse kemikalier kan påvirke andre målevariable langt mere end bladantallet. Denne virkning ville ikke blive opdaget ved beregning af bladantallet alene.

53.

Bladantallet og eventuelle andre registrerede målevariable, dvs. totalt bladareal, tørvægt eller frisk vægt, samles i en tabel sammen med testkemikaliekoncentrationerne for hvert målepunkt. Den efterfølgende dataanalyse, f.eks. beregning af estimater for LOEC, NOEC eller ECx, skal baseres på værdierne for de enkelte replikater og ikke beregnede gennemsnit for hver behandlingsgruppe.

54.

Den gennemsnitlige specifikke væksthastighed for en given periode beregnes som den logaritmiske stigning i vækstvariablene — bladantal og en anden målevariabel (totalt bladareal, tørvægt eller frisk vægt) — ved hjælp af nedenstående udtryk for hver replikat af kontrol og behandlingsprøve:

hvor:

For hver behandlings- og kontrolgruppe beregnes en gennemsnitlig væksthastighed samt estimater for variansen.

55.

Den gennemsnitlige specifikke væksthastighed skal beregnes for hele testperioden (tiden »i« i ovenstående formel er testens starttid, og tiden »j« er testens sluttid). For hver testkoncentration og kontrol beregnes en gennemsnitsværdi af den specifikke væksthastighed samt estimater for variansen. Derudover foretages en trinvis beregning af væksthastigheden for at vurdere testkemikaliets virkninger i eksponeringsperioden (f.eks. ved betragtning af logaritmisk transformerede vækstkurver). Væsentlige forskelle mellem den trinvist beregnede væksthastighed og den gennemsnitlige væksthastighed tyder på en afvigelse fra konstant eksponentiel vækst, og nøje granskning af vækstkurverne er da nødvendig. I så fald kan et forsigtigt skøn opstilles ved at sammenholde de specifikke væksthastigheder fra behandlede kulturer i det tidsrum, hvor hæmningen er maksimal, med de tilsvarende værdier for kontroller i samme tidsrum.

56.

Hæmningen i procent af væksthastigheden (Ir) kan derefter beregnes for hver testkoncentration (behandlingsgruppe) ved hjælp af følgende formel:

hvor:

57.

Virkningerne på udbyttet bestemmes på grundlag af to målevariable, bladantallet og en anden målevariabel (totalt bladareal, tørvægt eller frisk vægt) i hver testbeholder ved testens start og slutning. For tørvægt og frisk vægt bestemmes startbiomassen på grundlag af en prøve af blade, der tages fra samme parti som det, der er anvendt til at pode testbeholderne (se punkt 20). For hver testkoncentration og kontrol beregnes en gennemsnitsværdi af udbyttet samt estimater for variansen. Udbyttehæmningen i procent ( % Iy) kan beregnes for hver behandlingsgruppe som følger:

hvor:

58.

Der afsættes koncentrationsresponskurver over sammenhængen mellem den gennemsnitlige hæmningsprocent for responsvariablene (Ir eller Iy, beregnet som vist i punkt 56 eller punkt 57) og logaritmen for testkemikaliekoncentrationen.

59.

Estimaterne for ECx (f.eks. EC50) baseres på gennemsnitsværdien dels af specifik væksthastighed (ErCx), dels af udbytte (EyCx), der hver især er baseret på bladantal og en anden målevariabel (totalt bladareal, tørvægt eller frisk vægt). Dette skyldes, at der findes testkemikalier med forskellig virkning på bladantallet og på de øvrige målevariable. Som parametre for toksicitet er der derfor fire ECx-værdier for hvert beregnet hæmningsniveau x: ErCx (bladantal), ErCx (totalt bladareal, tørvægt eller frisk vægt), EyCx (bladantal) og EyCx (totalt bladareal, tørvægt eller frisk vægt).

60.

Målet er at formulere den kvantitative koncentrationsresponssammenhæng ved hjælp af regressionsanalyse. Der kan anvendes vægtet lineær regression efter forudgående lineariserende transformation af responsdataene, til f.eks. probit-, logit- eller Weibull-enheder (13), men det må foretrækkes at benytte ikke-lineære regressionsmetoder, da de bedre håndterer de uundgåelige uregelmæssigheder i data og afvigelser fra jævne fordelinger. I området tæt på enten ingen hæmning eller total hæmning kan sådanne uregelmæssigheder blive forstørret ved transformation og derved gribe forstyrrende ind i analysen (13). Det må bemærkes, at standardanalysemetoder, hvor der bruges probit-, logit- eller Weibull-transformerede variable, er bestemt til brug på binære data (f.eks. død eller overlevelse) og må modificeres for at kunne benyttes til data for væksthastighed eller biomasse. Særlige metoder til bestemmelse af ECx-værdier ud fra kontinuerte data findes i henvisning (14),(15) og (16).