KOMMISSIONENS FORORDNING (EF) Nr. 1459/98 af 8. juli 1998 om referencemetoder til bestemmelse af vanillin i koncentreret smør, smør og fløde

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europæiske Fællesskab,

under henvisning til Rådets forordning (EØF) nr. 804/68 af 27. juni 1968 om den fælles markedsordning for mælk og mejeriprodukter (1), senest ændret ved forordning (EF) nr. 1587/96 (2), særlig artikel 6, stk. 6, og artikel 12, stk. 3, og

ud fra følgende betragtninger:

I Kommissionens forordning (EF) nr. 2571/97 af 15. december 1997 om salg af smør til nedsat pris og ydelse af støtte for fløde, smør og koncentreret smør til fremstilling af konditorvarer, konsumis og andre levnedsmidler (3), kræves under visse omstændigheder tilsætning af røbestof til fløde, smør og koncentreret smør for at sikre, at disse produkters endelige anvendelse er korrekt;

vigtigheden af røbestoffer af hensyn til ordningens korrekte anvendelse og for at sikre lige behandling af dem, der deltager i den, gør det ønskeligt at fastsætte fællesmetoder til bestemmelse af de røbestoffer, der omhandles i forordning (EF) nr. 2571/97;

det er vanskeligt at opstille sådanne referencemetoder for alle røbestoffer på samme tid; fastsættelsen af en referencemetode til bestemmelse af vanillin i koncentreret smør, smør og fløde er endnu et skridt i denne retning;

de i denne forordning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Forvaltningskomitéen for Mælk og Mejeriprodukter -

UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING:

Artikel 1

Den i bilaget beskrevne analysemetode anvendes som referencemetode til bestemmelse af vanillin i koncentreret smør, smør og fløde efter forordning (EF) nr. 2571/97.

Koncentreret smør, smør og fløde betragtes som tilsat røbestof i henhold til artikel 6 i forordning (EF) nr. 2571/97, hvis resultaterne svarer til specifikationerne i bilagets punkt 8.

Artikel 2

Denne forordning træder i kraft på tredjedagen efter offentliggørelsen i De Europæiske Fællesskabers Tidende.

Den anvendes fra 1. september 1998.

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat.

Udfærdiget i Bruxelles, den 8. juli 1998.

På Kommissionens vegne

Franz FISCHLER

Medlem af Kommissionen

(1) EFT L 148 af 28. 6. 1968, s. 13.

(2) EFT L 206 af 16. 8. 1996, s. 21.

(3) EFT L 350 af 20. 12. 1997, s. 3.

BILAG

Bestemmelse af indholdet af vanillin i koncentreret smør, smør og fløde ved højtryksvæskekromatografi (HPLC)

1. Formål og anvendelsesområde

Kvantitativ bestemmelse af vanillin i koncentreret smør, smør og fløde.

Metoden anvendes på prøver, der modtages efter forordning (EF) nr. 2571/97.

2. Princip

Ekstraktion af en kendt prøvemængde med en blanding af isopropanol/ethanol/acetonitril (1:1:2). Udskillelse af størsteparten af fedtstofferne ved afkøling til mellem -15 °C og -20 °C efterfulgt af centrifugering. Efter fortynding med vand bestemmes vanillinindholdet ved HPLC.

3. Apparatur

Sædvanligt laboratorieapparatur, herunder især følgende:

3.1. Fryser med en arbejdstemperatur mellem -15 °C og -20°C

3.2. Injektionssprøjter, engangs, 2 ml

3.3. Membranfiltre, porestørrelse 0,45 ìm, modstandsdygtige over for en 5 % opløsning af ekstraktionsmiddel (4.4)

3.4. Væskekromatografisk system bestående af pumpe (flow 1,0 ml/min), injektionsenhed (20 ìl injektion, automatisk eller manuel), UV-detektor (306 nm, fuldt udslag 0,01 absorptionsenhed), skriver eller integrator samt kolonnetermostat indstillet til 25 °C

3.5. Analysekolonne (250 mm × 4,6 mm indvendig diameter) pakket med LiChrospher RP 18 (Merck, 5 ìm) eller tilsvarende

3.6. Beskyttelseskolonne (ca. 20 mm × 3 mm indvendig diameter) pakket tørt med Perisorb RP 18 (30-40 ìm) eller tilsvarende.

4. Reagenser

Alle reagenser skal være af anerkendt analysekvalitet

4.1. Isopropanol

4.2. Ethanol, 96 % (v/v)

4.3. Acetonitril

4.4. Ekstraktionsmiddel

Isopropanol (4.1), ethanol (4.2) og acetonitril (4.3) blandes i forholdet 1:1:2 (v/v/v).

4.5. Vanillin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd)

4.5.1. Vanillin-stamopløsning (=500 ìg/ml)

Ca. 50 mg (»CM« mg) vanillin (4.5) afvejes med en nøjagtighed på 0,1 mg i en 100 ml målekolbe; der tilsættes 25 ml ekstraktionsmiddel (4.4) og fyldes op med vand.

4.5.2. Vanillinstandardopløsning (=10 ìg/ml)

Der afpipetteres 5,00 ml vanillinstamopløsning (4.5.1) i en 250 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op med vand.

4.6. Methanol, HPLC-kvalitet

4.7. Iseddike

4.8. Vand, HPLC-kvalitet

4.9. Mobil fase til HPLC

300 ml methanol (4.6), ca. 500 ml vand (4.8) og 20,0 ml iseddike (4.7) blandes i en 1 000 ml målekolbe, og der fyldes op med vand (4.8). Blandingen filtreres gennem et 0,45 ìm filter.

5. Fremgangsmåde

5.1. Prøveforberedelse

5.1.1. Smør

Prøven opvarmes, indtil den begynder at smelte. Lokal opvarmning over 40 °C skal undgås. Når prøven er blevet tilstrækkeligt blød, homogeniseres den ved rystning. Der omrøres i 15 s, inden der udtages en analyseprøve. Med en nøjagtighed på 1 mg afvejes der i en 100 ml målekolbe en analyseprøve på ca. 5 g (»SM« g).

5.1.2. Koncentreret smør

Umiddelbart inden prøveudtagningen anbringes beholderen med koncentreret smør i en ovn ved 40-50 °C, indtil smørret er fuldstændig smeltet. Prøven blandes ved forsigtig rystning eller omrøring; voldsom omrøring med dannelse af luftbobler bør undgås. Der afvejes med en nøjagtighed på 1 mg ca. 4 g (»SM« g) koncentreret smør i en 100 ml målekolbe.

5.1.3. Fløde

Prøven opvarmes på vandbad eller i inkubator ved en temperatur på 35-40 °C. Fedtstoffet fordeles homogent ved forsigtig rystning og om nødvendigt ved omrøring. Prøven afkøles hurtigt til 20 ± 2 °C. Prøven skal fremtræde ensartet, ellers gentages proceduren. Der afvejes med en nøjagtighed på 1 mg ca. 10 g (»SM« g) fløde i en 100 ml målekolbe.

5.2. Fremstilling af prøveopløsning

Der tilsættes ca. 75 ml ekstraktionsmiddel (4.4) til prøveportionen (5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3), omrøres eller omrystes kraftigt i ca. 15 min og fyldes op med ekstraktionsmiddel (4.4). Ca. 10 ml af dette ekstrakt overføres til et reagensglas med prop. Glasset stilles i fryseren (3.1) i ca. 30 min. Det afkølede ekstrakt centrifugeres i 5 min ved ca. 2 000 rpm, og der dekanteres straks. Den dekanterede opløsning henstår, til den har nået stuetemperatur. Der afpipetteres 5,00 ml heraf i en 100 ml målekolbe, og der fyldes op til mærket med vand. En delprøve heraf filtreres på membranfilter (3.3). Filtratet kan direkte anvendes til HPLC-analyse.

5.3. Kalibrering

Der afpipetteres 5,00 ml vanillinstandardopløsning (4.5.2) i en 100 ml målekolbe. Der tilsættes 5,0 ml ekstraktionsmiddel (4.4) og fyldes op til mærket med vand. Denne opløsning indeholder 0,5 ìg vanillin pr. ml.

5.4. Bestemmelse ved HPLC

Kromatografisystemet stabiliseres i ca. 30 min. Der indsprøjtes standardopløsning (5.3). Dette gentages, indtil forskellen i topareal eller tophøjde mellem to på hinanden følgende indsprøjtninger er mindre end 2 %. Under de beskrevne betingelser har vanillin en retentionstid på ca. 9 min. Der foretages en dobbeltbestemmelse på standardopløsningen (5.3) med indsprøjtning af 20 ìl. Der indsprøjtes 20 ìl prøveopløsning (5.2). Arealet eller højden af den fremkomne vanillintop bestemmes. Efter 10 indsprøjtninger af prøveopløsninger (5.2) gentages dobbeltbestemmelsen på standardopløsningen (5.3).

6. Beregning af resultater

Det gennemsnitlige topareal (eller tophøjde) (»AC«) for de vanillintoppe, der er fremkommet ved de to dobbeltbestemmelser før og efter hver batch af prøveopløsninger (arealer i alt), beregnes.

Responsfaktoren R beregnes ved udtrykket:

R = >NUM>AC/

>DEN>CM

hvor CM er massen af vanillin i mg (4.5.1).

Indholdet af vanillin (C) i analyseprøven (i mg/kg) beregnes ved udtrykket:

C = >NUM>AS × 20 × 0,96

>DEN>SM × R

hvor

AS er arealet af vanillintoppen fra prøveopløsningen

SM er massen af analyseprøven i g (5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3)

20 er en faktor, der tager hensyn til fortyndingen af standard- og analyseprøven

0,96 er korrektionsfaktoren for fedtindholdet ved første fortynding af prøven.

Anmærkning:

I stedet for toparealer kan der benyttes tophøjder (se punkt 8.3).

7. Metodens nøjagtighed

7.1. Repeterbarhed (r)

Forskellen mellem to bestemmelser, der er udført hurtigst muligt efter hinanden af samme person med samme apparatur på samme prøvemateriale, må ikke overstige 16 mg/kg.

7.2. Reproducerbarhed (R)

Forskellen mellem to bestemmelser, der er udført af forskellige personer i forskellige laboratorier med forskelligt apparatur på samme prøvemateriale, må ikke overstige 27 mg/kg.

8. Grænseværdier

8.1. Der skal tages tre prøver fra produktet med røbestof for at kontrollere homogeniteten.

8.2. Røbestof fra vanille eller syntetisk vanillin

8.2.1. Iblandingen af 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd er 250 g pr. ton.

8.2.2. Under hensyntagen til den kritiske differens (CrD), for en 95 %-sandsynlighedsgrænse (CrD95), må middelværdien af enkeltanalyser af hver af de tre prøver, der er udtaget til kontrol af homogenitet, ikke være under 236,0 mg/kg.

8.2.3. Foruden det i 8.2.2 givne kriterium benyttes det laveste analyseresultat til at kontrollere homogenitet af røbestoffordeling. Det sker ved at sammenligne med følgende grænseværdier:

- 221,5 mg/kg (95 % af den mindste iblanding med hensyntagen til CrD95 for enkeltprøven)

- 159,0 mg/kg (70 % af den mindste iblanding med hensyntagen til CrD95 for enkeltprøven).

Røbestofkoncentrationen i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 221,5 mg/kg og 159,0 mg/kg.

8.3. Røbestof kun fra vanilleplantens frugt eller komplette ekstrakter heraf

8.3.1. Iblandingen af 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd er 100 g pr. ton.

8.3.2. Under hensyntagen til den kritiske differens (CrD) for en 95 % sandsynlighedsgrænse (CrD95), må middelværdien af enkeltanalyser af hver af de tre prøver, der er udtaget til kontrol af homogenitet, ikke være under 86,0 mg/kg.

8.3.3. Foruden det i 8.3.2 givne kriterium benyttes det laveste analyseresultat til at kontrollere homogenitet af røbestoffordeling. Det sker ved at sammenligne med følgende grænseværdier:

- 79,0 mg/kg (95 % af den mindste iblanding med hensyntagen til CrD95 for enkeltprøven)

- 54,0 mg/kg (70 % af den mindste iblanding med hensyntagen til CrD95 for enkeltprøven).

Røbestofkoncentrationen i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 79,0 mg/kg og 54,0 mg/kg.

9. Anmærkninger

9.1. Repeterbarheden er den værdi, som den absolutte forskel mellem to enkeltbestemmelser udført med samme metode på samme prøvemateriale under samme forhold (samme apparatur, samme laboratorium og inden for et kort tidsinterval) kan ventes at ligge under med en bestemt sandsynlighed; når intet andet er anført, er denne sandsynlighed 95 %.

9.2. Reproducerbarheden er den værdi, som den absolutte forskel mellem to enkeltbestemmelser udført med samme metode på samme prøvemateriale men under forskellige forhold (forskellige personer, forskelligt apparatur, forskellige laboratorier og/eller på forskellige tidspunkter) kan ventes at ligge under med en bestemt sandsynlighed; når intet andet er anført, er denne sandsynlighed 95 %.

9.3. Genfindingen af vanillin, der er tilsat i en mængde på 250 mg pr. kg butteroil, varierer fra 97,0 % til 103,8 %. I gennemsnit er der fundet 99,9 % med en standardafvigelse på 2,7 %.

9.4. Standardopløsningen indeholder 5 % ekstraktionsmiddel for at kompensere for topforbredning som følge af, at prøveopløsningerne indeholder 5 % ekstraktionsmiddel. Derved kan der ved den kvantitative bestemmelse benyttes tophøjder.

9.5. Analysen bygger på en lineær kalibreringskurve, der går gennem nulpunktet. Med passende fortyndinger af standardopløsningen (4.5.2) bør lineariteten kontrolleres, første gang analysen udføres, og derefter regelmæssigt og efter udskiftninger eller reparationer på HPLC-udstyret.