KOMMISSIONENS ELVTE DIREKTIV 93/70/EOEF af 28. juli 1993 om fastsaettelse af faellesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets direktiv 70/373/EOEF af 20. juli 1970 om indfoerelse af faellesskabsproeveudtagningsmaader og -analysemetoder for saa vidt angaar den officielle kontrol med foderstoffer (1), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 3768/85 (2), saerlig artikel 2, og

ud fra foelgende betragtninger:

Ved dirketiv 70/373/EOEF er det fastsat, at den officielle kontrol med foderstoffer til konstatering af, om de betingelser, der er fastsat paa grundlag af administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser om foderstoffernes beskaffenhed og sammensaetning, er opfyldt, foretages efter faellesskabsproeveudtagningsmaader og -analysemetoder;

for at det kan kontrolleres, om betingelserne for at anvende halofuginon i foderstoffer overholdes, boer der fastsaettes en faellesskabsanalysemetode for dette tilsaetningsstof;

de i dette direktiv fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den Staaende Foderstofkomité -

UDSTEDT FOELGENDE DIREKTIV:

Artikel 1

Medlemsstaterne foreskriver, at analyserne i forbindelse med den officielle kontrol af foderstoffer, for saa vidt angaar deres indhold af halofuginon, skal foretages efter den metode, der er beskrevet i bilaget.

Artikel 2

Medlemsstaterne saetter senest den 30. juni 1994 de noedvendige administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser i kraft for at efterkomme bestemmelserne i dette direktiv. De underretter straks Kommissionen herom.

Naar medlemsstaterne vedtager disse bestemmelser, henvises der deri til dette direktiv, eller de ledsages ved offentliggoerelsen af en saadan henvisning. De naermere regler for denne henvisning fastsaettes af medlemsstaterne.

Artikel 3

Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne.

Udfaerdiget i Bruxelles, den 28. juli 1993.

Paa Kommissionens vegne

René STEICHEN

Medlem af Kommissionen

(1) EFT nr. L 170 af 3. 8. 1970, s. 2.

(2) EFT nr. L 362 af 31. 12. 1985, s. 8.

BILAG

BESTEMMELSE AF HALOFUGINON DL-trans-7-bromo-6-chloro-3-[3-(3-hydroxy-2-piperidyl) acetonyl]-quinazolin-4-(3H)-one hydrobromid

1. Formaal og anvendelsesomraade

Dette er en metode til bestemmelse af halofuginon i foderstoffer. Den nedre bestemmelsesgraense er 1 mg/kg.

2. Princip

Efter behandling med varmt vand ekstraheres halofuginon som fri base med etylacetat og separeres derefter som hydroklorid over i en vandig syreoploesning. Ekstraktet oprenses ved ionbytningskromatografi. Indholdet af halofuginon bestemmes ved omvendt-fase HPLC ved brug af en UV-detektor.

3. Reagenser

3.1. Acetonitril, HPLC-kvalitet

3.2. Amberlit XAD-2 resin

3.3. Ammoniumacetat

3.4. Etylacetat

3.5. Eddikesyre

3.6. Halofuginon standard (DL-trans-7-bromo-6-chloro-3-[3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]-quinazolin-4- (3H)-one hydrobromid, E 764)

3.6.1. Halofuginon standardoploesning, 100 mg/ml

50 mg halofuginon (3.6) afvejes til det naermeste 0,1 mg i en 500 ml maalekolbe, oploeses i ammoniumacetatbufferoploesning (3.18), fyldes op med bufferoploesning til maerket og blandes. Denne oploesning er stabil i tre uger ved 5 °C ved opbevaring i moerke.

3.6.2. Kalibreringsoploesninger

1,0, 2,0, 3,0, 4,0 og 6,0 ml af standardoploesningen (3.6.1) overfoeres til en raekke 100 ml maalekolber. Der fyldes op til maerket med mobil fase (3.21) og blandes. Disse oploesninger har koncentrationer paa henholdsvis 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 og 6,0 mg/ml halofuginon. Disse oploesninger skal fremstilles umiddelbart foer brug.

3.7. Saltsyre (r20 ca. 1,16 g/ml)

3.8. Metanol

3.9. Soelvnitrat

3.10. Natriumascorbat

3.11. Natriumkarbonat

3.12. Natriumklorid

3.13. EDTA (etylendiamintetraeddikesyre, dinatriumsalt)

3.14. Vand, HPLC-kvalitet

3.15. Natriumkarbonatoploesning, v = 10 g/100 ml

3.16. Saltmaettet natriumkarbonatoploesning, v = 5 g/100 ml

50 g natriumkarbonat (3.11) oploeses i vand og fortyndes til 1 l, hvorefter der tilsaettes salt (3.12), indtil oploesningen er maettet.

3.17. Saltsyre, ca. 0,1 mol/l

10 ml HCI (3.7) fortyndes med vand til 1 l.

3.18. Ammoniumacetatbufferoploesning, ca. 0.25 mol/l

19,3 g ammoniumacetat (3.3) og 30 ml eddikesyre (3.5) oploeses i vand (3.14) og fortyndes til 1 l.

3.19. Amberlit XAD-2 resinforberedelse

En passende maengde amberlit (3.2) vaskes med vand, til alle kloridioner er fjernet, saaledes som det viser sig ved kontrol med soelvnitrat (3.20) paa den kasserede, vandige fase. Resinen vaskes derefter med 50 ml metanol (3.8), methanolen kasseres, og resinen opbevares under metanol.

3.20. Soelvnitratoploesning, ca. 0,1 mol/l

0,17 g soelvnitrat (3.9) oploeses i 10 ml vand.

3.21. HPLC mobil fase

500 ml acetonitril (3.1) blandes med 300 ml ammoniumacetatbufferoploesning (3.18) og 1 200 ml vand (3.14). PH-vaerdien justeres til 4,3 ved tilsaetning af eddikesyre (3.5) Oploesningen filtreres gennem et 0,22 mm filter (4.8) og udluftes (f.eks. med ultralyd i ti minutter). Denne oploesning er stabil i en maaned, hvis den opbevares moerkt i en lukket beholder.

4. Apparatur

4.1. Ultralydbad

4.2. Rotationsinddamper

4.3. Centrifuge

4.4. HPLC-udstyr med UV-detektor med variabel boelgelaengde- eller diodearraydetektor

4.4.1. HPLC-kolonne, 300 mm × 4 mm, C 18, 10 mm pakning eller en tilsvarende kolonne

4.5. Glassoejle (300 mm × 10 mm) med filter af sintret glas og stophane

4.6. Glasfiberfiltre, diameter 150 mm

4.7. Membranfilter, 0,45 mm

4.8. Membranfilter 0,22 mm

5. Fremgangsmaade

NB: Halofuginon er som fri base ustabil i alkaliske oploesninger og etylacetatoploesninger. Boer ikke henstaa i etylacetat i over 30 minutter.

5.1. Generelt

5.1.1. En blindproeve analyseres for at kontrollere, at der hverken er halofuginon eller andre interfererende stoffer til stede.

5.1.2. Genfindelsen kontrolleres ved at analysere blindproeven, der tilsaettes halofuginon i en maengde svarende til analyseproevens indhold. For at tilsaette 3 mg/kg tilsaettes 300 ml af stamoploesningen (3.6.1) til 10 g blindproeve. Bland og vent ti minutter, foer der fortsaettes med ekstraktion (5.2).

Fodnote: Til denne metode anvendes en blindproeve af samme type som analyseproeven, og som ved analyse viser sig ikke at indeholde halofuginon.

5.2. Ekstraktion

10 g af den tilberedte proeve afvejes til naermeste 0,01 g i et 200 ml centrifugeglas, der tilsaettes 0,5 g natriumascorbat (3.10), 0,5 g EDTA (3.13) og 20 ml vand, hvorefter der blandes. Anbring centrifugeglasset i et vandbad (80° C) i 5 min. Efter afkoeling til stuetemperatur tilsaet 210 ml natriumcarbonatoploesning (3.15) og bland. Tilsaet straks 100 ml etylacetat (3.4) og ryst glasset kraftigt i haanden i 15 sekunder. Derefter anbringes glasset i tre minutter i ultralydbadet (4.1), og proppen loesnes. Der centrifugeres i to minutter, og etylacetatfasen haeldes gennem et glasfiberfilter (4.6) over i en 500 ml skilletragt. Ekstraktionen af proeven gentages med en ny portion paa 100 ml etylacetat. De kombinerede ekstrakter vaskes i et minut med 50 ml saltmaettet natriumkarbonatoploesning (3.16), og den vandige fase kasseres.

Den organiske fase ekstraheres et minut med 50 ml saltsyre (3.17) Den nederste syrefase aftappes i en 250 ml skilletragt. Den organiske fase ekstraheres igen i 1,5 minutter med yderligere 50 ml saltsyre og blandes med det foerste ekstrakt. De kombinerede syreekstrakter vaskes ved at omryste ca. ti sekunder med 10 ml etylacetat (3.4).

Den vandige fase overfoeres kvantitativt til en 250 ml rundbundet kolbe, og den organiske fase kasseres. Al den resterende etylacetat fordampes fra syreoploesningen ved brug af en rotationsfordamper (4.2). Vandbadets temperatur boer ikke vaere over 40° C. Under et vakuum paa ca. 25 mbar vil al den resterende etylacetat blive fjernet i loebet af fem minutter ved 38° C.

5.3. Oprensning

5.3.1. Tilberedning af amberlitsoejlen

Der tilberedes en XAD-2-soejle for hver proeveekstrakt. 10 g behandlet amberlit (3.19) overfoeres med metanol (3.8) til en glaskolonne (4.5). Der puttes en tot glasuld paa toppen af resinsoejlen. Metanolen aftappes fra soejlen, og resinen vaskes med 100 ml vand, idet der standses, naar vaesken naar toppen af resinsoejlen. Soejlen henstaar for at komme i ligevaegt i ti minutter inden brug. Man maa aldrig lade soejlen loebe toer.

5.3.2. Opresning af proeven

Ekstraktet (5.2) overfoeres kvantitativt til den tilberedte amberlitsoejle (5.3.1), og der elueres; eluatet kasseres. Elueringshastigheden boer ikke vaere over 20 ml/minut. Den rundbundede kolbe skylles med 20 ml saltsyre (3.17), som derefter benyttes til at rense resinsoejlen. Eventuelt resterende syreoploesning fjernes med luft. Rensevaeskerne kasseres. 100 ml metanol (3.8) tilsaettes soejlen og 5-10 ml elueres; eluatet opsamles i en 250 ml rundbundet kolbe. Den resterende metanol henstaar ti minutter for at komme i ligevaegt med resinsoejlen, og elueringen fortsaettes ved en hastighed paa ikke over 20 ml/minut; eluatet opsamles i samme rundbundede kolbe. Metanolen fordampes paa rotationsfordamperen (4.2); vandbadets temperatur boer ikke vaere over 40° C. Remanensen overfoeres kvantitativt til en 10 ml maalekolbe ved brug af den mobile fase (3.21). Der fyldes op til maerket med mobil fase og blandes. En alikvot maengde filtreres gennem et membranfilter (4.7). Denne oploesning gemmes til HPLC-bestemmelsen (5.4).

5.4. HPLC-bestemmelse

5.4.1. Parametre

Foelgende betingelser er vejledende. Andre betingelser kan bruges, saafremt de giver de samme resultater.

HPLC-kolonne (4.4.1)

HPLC mobil fase (3.21)

Flowhastighed: 1,5-2 ml/minut

Detektorboelgelaengde: 243 nm

Injektionsvolumen: 40-100 ml

Kromatografsystemets stabilitet kontrolleres ved, at der flere gange injiceres kaliberingsoploesning (3.6.2) med 3,0 mg/ml, indtil der er opnaaet konstante tophoejder (arealer) og retentionstider.

5.4.2. Kalibreringskurve

Hver kalibreringsoploesning (3.6.2) injiceres flere gange, og hoejden af toppene (arealerne) for hver koncentration maales. Der plottes en kalibreringskurve ved brug af kalibreringsoploesningernes middeltophoejder eller -arealer som ordinater og de tilsvarende koncentrationer i mg/ml som abscisser.

5.4.3. Proeveoploesning

Proeveekstraktet (5.3.2) injiceres flere gange, idet der benyttes samme maengde som til kalibreringsoploesningerne, og middeltophoejden (arealet) af halofuginontoppene bestemmes.

6. Beregning af resultaterne

Ud fra middeltophoejden (arealet) af proeveoploesningens halofuginontoppe bestemmes proeveoploesningens koncentration i mg/ml ved benyttelse af kalibreringskurven (5.4.2).

Proevens indhold af halofuginon w (mg/kg) beregnes efter foelgende formel:

w = c × 10 m

hvor:

- c: proeveoploesningens halofuginonkoncentration i mg/ml

- m: proeveportionens masse i g.

7. Evaluering af resultaterne

7.1. Identitet

Stoffets identitet kan bekraeftes ved co-kromatografi eller ved at benytte en diodearraydetektor, hvorved proeveekstraktets og kalibreringsoploesningens (3.6.2) spektre indeholdende 6,0 mg/ml sammenlignes.

7.1.1. Co-kromatografi

Et proeveekstrakt adderes ved tilsaetning af en passende maengde kalibreringsoploesning (3.6.2). Den tilsatte maengde halofuginon skal vaere af samme stoerrelse som den skoennede maengde halofuginon, der er fundet i proeveekstraktet.

Kun hoejden af halufuginontoppen maa oeges, efter at der er taget hensyn til baade den tilsatte maengde og fortyndingen af ekstraktet. Toppens bredde skal, ved den halve hoejde, ligge inden for ± 10 % af den oprindelige bredde.

7.1.2. Diodearraydetektion

Resultaterne evalueres efter nedenstaaende kriterier:

a) Den maksimale absorbtionsboelgelaengde af proevens og standardens spektre, maalt ved toppens spids paa kromatogrammet, skal vaere den samme inden for en margen, der afhaenger af detektorsystemets oploesningsevne. Ved dioderarraydetektion er den typisk ± 2 nm.

b) Mellem 225 og 300 nm maa proevens og standardtoppens spektre, maalt i toppens spids paa kromatogrammet, ikke vaere forskellige for de dele af spektret, der ligger inden for 10-100 % relativ absorption. Dette kriterium er opfyldt, hvis de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem to spektre paa intet observeret punkt overstiger 15 % af standardstoffet.

c) Mellem 225 og 300 nm maa spektrene intet sted paa proeveekstraktets top vaere forskellige fra hinanden i de dele af spektret, der ligger inden for 10-100 % relativ absorption. Dette kriterium er opfyldt, hvis de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem spektrene paa intet observeret punkt overstiger 15 % af spektrets absorption i spidsen.

Hvis et af disse kriterier ikke er opfyldt, er stoffets tilstedevaerelse ikke bekraeftet.

7.2. Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelbestemmelser foretaget paa samme proeve maa ikke vaere paa over 0,5 mg/kg for halofuginonindhold op til 3 mg/kg.

7.3. Genfindelse

Genfindelsen for den tilsatte blindproeve boer vaere mindst 80 %.

8. Resultaterne af en ringanalyse

Der blev arrangeret en ringanalyse (1), hvorved tre proever blev analyseret af otte laboratorier.

Resultater

/* Tabel: Se EFT */

(1) The Analyst 108, 1983, pp. 1252-1256.