KOMMISSIONENS DIREKTIV 92/69/EOEF af 31. juli 1992 om yttende tilpasning til den tekniske udvikling af Raadets direktiv 67/548/EOEF om tilnaermelse af lovgivning om klassificering, emballering og etikettering af farlige stoffer

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR

under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets direktiv 67/548/EOEF af 27. juni 1967 om tilnaermelse af lovgivning om klassificering, emballering og etikettering af farlige stoffer (1), senest aendret ved direktiv 92/32/EOEF (2), saerlig artikel 28 og 29,

(1) EFT nr. 196 af 16. 8. 1967, s. 1.

(2) EFT nr. L 154 af 5. 6. 1992, s. 1.

og ud fra foelgende betragtninger i artikel 3, stk. 1, i direktiv 67/548/EOEF og artikel 3 i Raadets direktiv 88/379/EOEF af 7. juni 1988 om indbyrdes tilnaermelse af medlemsstaternes love og administrative bestemmelser om klassificering, emballering og etikettering af farlige praeparater (3), senest aendret ved Kommissionens direktiv 90/492/EOEF (4), er det fastsat, at bestemmelsen af stoffernes og praeparaternes fysisk-kemiske egenskaber, deres toksicitet og deres oekotoksicitet foretages efter de metoder, der er fastlagt i bilag V til direktiv 67/548/EOEF;

(3) EFT nr. L 187 af 16. 7. 1988, s. 14.

(4) EFT nr. L 275 af 5. 10. 1990, s. 35.

teksten til bilag V til direktiv 67/548/EOEF er for oejeblikket offentliggjort i to dele, den ene som bilag til Kommissionens direktiv 84/449/EOEF (5) og den anden som bilag til Kommissionens direktiv 88/302/EOEF (6);

(5) EFT nr. L 251 af 19. 9. 1984, s. 1.

(6) nr. L 133 af 30. 5. 1988, s. 1 og EFT nr. L 136 af 2. 6. 1988, s. 20.

af hensyn til den tekniske udvikling er det noedvendigt at aendre de undersoegelsesmetoder, der er beskrevet i bilaget til direktiv 84/449/EOEF;

af hensyn til den tekniske udvikling er det ogsaa noedvendigt at aendre undersoegelsesmetoden for den algevaeksthaemningstest, der for oejeblikket findes i bilaget til direktiv 88/302/EOEF, og ved samme lejlighed overfoere denne undersoegelsesmetode til bilaget til direktiv 84/449/EOEF;

i overensstemmelse med Raadets direktiv 86/609/EOEF af 24. november 1986 om indbyrdes tilnaermelse af medlemsstaternes love og administrative bestemmelser om beskyttelse af dyr, der anvendes til forsoeg og andre videnskabelige formaal (7), boer der ikke anvendes flere dyr til forsoeg end hoejst noedvendigt;

(7) EFT nr. L 358 af 18. 12. 1986, s. 1

bestemmelserne i dette direktiv er i overensstemmelse med udtalelse fra Udvalget for Tilpasning til den Tekniske Udvikling af Direktiverne for Fjernelse af Tekniske Hindringer for Samhandelen med Farlige Stoffer og Praeparater

UDSTEDT FOELGENDE DIREKTIV:

Artikel 1

Bilaget til direktiv 84/449/EOEF erstattes af bilaget til dette direktiv.

Artikel 2

Den algevaeksthaemningstest, der er beskrevet i bilaget til direktiv 88/302/EOEF, udgaar.

Artikel 3

Medlemsstaterne gennemfoerer senest den 30. oktober 1993 de love og administrative bestemmelser, der er noedvendige for at efterkomme dette direktiv.

Medlemsstaterne underretter straks Kommissionen herom.Naar medlemsstaterne vedtager disse bestemmelser, henvises der deri til dette direktiv, eller de ledsages ved offentliggoerelsen af en saadan henvisning. De naermere regler for denne henvisning fastsaettes af medlemsstaterne.

Artikel 4

Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne.

Udfaerdiget i Bruxelles, den 31. juli 1992.

Paa Kommissionens vegne

Karel VAN MIERT

Medlem af Kommissionen

Bilag til Kommissionens direktiv 92/69/EOEF af 31. juli 1992 om syttende tilpasning til den tekniske udvikling af Raadets direktiv 67/548/EOEF om tilnaermelse af lovgivning om klassificering, emballering og etikettering af farlige stoffer

(1) INDHOLD

INDLEDNING

AFSNIT A: METODER TIL BESTEMMELSE AF FYSISK-KEMISKE EGENSKABER //5

A.1. Smelte-/frysepunkt5 //

A.2. Kogepunkt //15

A.3. Relativ massefylde //21

A.4. Damptryk //26

A.5. Overfladespaending //47

A.6. Vandoploeselighed //54

A.8. Fordelingskoefficient //63

A.9. Flammepunkt //74

A.10. Antaendelighed (faste stoffer) //76

A.11. Antaendelighed (gasser) //79

A.12. Antaendelighed (kontakt med vand) //81

A.13. Vaeskers og faste stoffers pyroforiske egenskaber //85

A.14. Eksplosive egenskaber //87

A.15. Selvantaendelsestemperatur (vaesker og gasser) //98

A.16. Relativ selvantaendelsestemperatur for faste stoffer //99

A.17. Oxiderende egenskaber (faste stoffer) //102

AFSNIT B: METODER TIL BESTEMMELSE AF TOKSICITET //107

Generel indledning //107

B.1. Akut toksicitet (oral) //110

B.1 bis. Akut toksicitet (oral indgift): Fastdosis-metode //113

B.2. Akut toksicitet (inhalation) //117

B.3. Akut toksicitet (dermal) //121

B.4. Akut toksicitet (hudirritation) //124

B.5. Akut toksicitet (oejenirritation) //127

B.6. Hudsensibilisering //131

B.7. Toksicitet ved gentagen dosering (28 dage, oral) //136

B.8. Toksicitet ved gentagen dosering (28 dage, inhalation) //140

B.9. Toksicitet ved gentagen dosering (28 dage, dermal) //144

B.10. Mutagenicitet (in vitro cytogenetisk test paa pattedyrceller) //148

B.11. Mutagenicitet (in vivo cytogenetisk test paa knoglemarv fra pattedyr - kromosomanalyse) //151

B.12. Mutagenicitet (mikronucleustest) //154

B.13. Mutagenicitet (Escherichia coli - tilbagemutationstest) //157

B.14. Mutagenicitet (Salmonella typhimurium - tilbagemutationstest) //160

AFSNIT C: METODER TIL BESTEMMELSE AF OEKOTOKSICITET //163

C.1. Akut toksicitet for fisk163 //

C.2. Akut toksicitet for dafnier //172

C.3. Vaeksthaemningstest for alger //179

C.4. Bionedbrydelighed: bestemmelse af »let« bionedbrydelighed //187

C.4-A DOC-eliminering //194

C.4-B Modificeret OECD-screeningstest //197

C.4-C CO2-udvikling //202

C.4-D Manometrisk respirometri //207

C.4-E Closed Bottle-test //211

C.4-F MITI-test //216

Bilag //221

C.5. Nedbrydning: biokemisk oxygenforbrug //226

C.6. Nedbrydning: kemisk oxygenforbrug //227

C.7. Nedbrydning: abiotisk nedbrydning: hydrolyse som funktion af pH //229

INDLEDNING

I bilaget anfoeres undersoegelsesmetoder til bestemmelse af de fysisk-kemiske, toksikologiske og oekotoksikologiske egenskaber, der er opregnet i bilag VII og VIII til direktiv 79/831/EOEF. Metoderne er baseret paa saadanne, der er anerkendt og anbefalet af kompetente internationale organisationer (navnlig OECD).

Hvor der ikke har foreligget saadanne metoder, er der valgt nationale standardmetoder eller videnskabeligt anerkendte metoder. I almindelighed skal undersoegelserne foretages med stoffet, som det markedsfoeres. Man boer vaere opmaerksom paa, at urenheder kan paavirke undersoegelsesresultaterne.

Hvis metoderne i bilaget til direktiv 79/831/EOEF ikke er anvendelige til undersoegelse af en given egenskab, skal anmelderen begrunde valget af alternativ metode.

Dyreforsoeg og -undersoegelser udfres i overensstemmelse med de nationale bestemmelser, og der skal tages hensyn til humane principper og den internationale udvikling inden for dyrebeskyttelse.

Hvor undersoegelsesmetoder er ligevaerdige, anvendes den metode, som kraever det mindste antal forsoegsdyr.

AFSNIT A: METODER TIL BESTEMMELSE AF FYSISK-KEMISKE EGENSKABER

A.1. SMELTE/FRYSEPUNKT

1. METODE

De fleste af de beskrevne metoder er baseret paa OECD-testvejledningen (1). Grundprincipperne er anfoert i reference (2) og (3).

1.1. INDLEDNING

De beskrevne metoder og apparater kan anvendes til bestemmelse af smeltepunktet for kemiske stoffer uanset renheden.

Valg af metode afhaenger af arten af det stof, der skal undersoeges. Det er saaledes afgoerende, om stoffet let, vanskeligt eller slet ikke kan pulveriseres.

For nogle stoffer er bestemmelse af fryse- eller stoerkningspunkt mere hensigtsmaessigt, og der er i denne metode medtaget standarder for saadanne bestemmelser.

Hvis det som foelge af stoffets saerlige egenskaber er umuligt at bestemme nogen af ovenstaaende parametre, kan det vaere hensigstmaessigt at bestemme et flydepunkt.

1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER

Smeltepunktet defineres som den temperatur, ved hvilken faseovergangen fra fast til flydende tilstand finder sted ved atmosfaeretryk, og denne temperatur svarer i det ideale tilfaelde til temperaturen ved frysepunktet.

Da faseovergangen for mange stoffer finder sted over et temperaturinterval, beskrives den ofte som smeltepunktsintervallet.

Enhedsomregning (K til C)

t = T 273,15, hvor

t er temperaturen i grader celsius ( C), og

T er temperaturen i Kelvin (K).

1.3. REFERENCESTOFFER

Anvendelse af referencestoffer er ikke paakraevet, hver gang et nyt stof skal undersoeges. Referencestoffer skal foerst og fremmest bruges til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater opnaaet med andre metoder.

Der er i referencerne (4) angivet nogle referencestoffer.

1.4. METODENS PRINCIP

Temperaturen (temperaturintervallet) for faseovergangen fra fast til flydende tilstand eller fra flydende til fast tilstand bestemmes. I praksis bestemmes temperaturen ved begyndende smeltning/frysning og ved endelig smeltning/frysning under opvarmning/afkoeling af en proeve af stoffet ved atmosfaeretryk. Der er beskrevet fem typer metoder: kapillarmetoder, varmebordsmetoder, frysepunktsbestemmelser, termoanalyse og flydepunktsbestemmelse (som udviklet til mineralolier).Det kan i nogle tilfaelde vaere mere hensigtsmaessigt at bestemme frysepunktet end smeltepunktet.

1.4.1. Kapillarmetoder

1.4.1.1. Smeltepunktsapparater med vaeskebad

En lille maengde af det findelte stof fyldes i et kapillarroer og pakkes taet. Roeret opvarmes sammen med et termometer, og temperaturstigningen indstilles til mindre end ca. 1 K/min under den egentlige smeltning. Temperaturen ved begyndende og endelig smeltning bestemmes.

1.4.1.2. Smeltepunktsapparater med metalblok

Som beskrevet under 1.4.1.1 bortset fra, at kapillarroeret og termometeret er anbragt i en opvarmet metalblok og kan iagttages gennem huller i blokken.

1.4.1.3. Bestemmelse med fotocelle

Proeven i kapillarroeret opvarmes automatisk i en metalcylinder. En lysstraale sendes via et hul i cylinderen gennem stoffet og ind paa en noejagtigt indstillet fotocelle. De fleste stoffers optiske egenskaber aendres under smeltning fra at vaere uigennemsigtige til gennemsigtige. Derved oeges den lysmaengde, som naar frem til fotocellen, og der sendes et stopsignal til en digitalindikator, som viser temperaturen af et platinmodstandstermometer anbragt i varmekammeret. Denne metode kan ikke anvendes for visse staerkt farvede stoffer.

1.4.2. Varmeborde

1.4.2.1. Koflers varmebaenk

Koflers varmebaenk bestaar af to elektrisk opvarmede metalstykker med forskellig varmeledningsevne og er udformet saadan, at dens temperaturgradient i laengderetningen er naesten lineaer. Varmebaenken kan spaende over temperaturomraadet fra 283 K til 573 K og er forsynet med en saerlig anordning til temperaturaflaesning, som bestaar af en skyder med en viser og en fane, og som er saerligt udformet til den enkelte baenk.

Smeltepunktet bestemmes ved, at det paagaeldende stof laegges i et tyndt lag direkte paa baenkens overflade, hvorefter der paa faa sekunder opstaar en skarp skillelinje mellem flydende og fast fase. Temperaturen paa skillelinjen aflaeses ved at indstille viseren paa denne.

1.4.2.2. Smeltemikroskop

Der anvendes en raekke varmeborde med mikroskop til smeltepunktsbestemmelser paa meget smaa stofmaengder. I de fleste varmeborde maales temperaturen med et foelsomt termoelement, men undertiden anvendes ogsaa kviksoelvtermometre. Et typisk smeltepunktsapparat, bestaaende af varmebord med mikroskop, er udstyret med et varmekammer indeholdende en metalplade, hvorpaa proeven anbringes i en slaede. I midten af metalpladen er der et hul, hvorigennem der kan sendes lys fra mikroskopets belysningsspejl. Naar apparatet er i brug, er kammeret lukket med en glasplade for at forhindre luftens adgang til proeven.

Opvarmningen af proeven reguleres med en rheostat. Kraeves meget noejagtige maalinger kan der for optisk anisotrope stoffer anvendes polariseret lys.

1.4.2.3. Meniskmetoden

Denne metode anvendes kun for polyamider.Den temperatur, ved hvilken forskydningen af en silikonoliemenisk, som er indesluttet mellem et varmebord og et daekglas hvilende paa polyamid-proeveemnet, iagttages visuelt.

1.4.3. Metode til bestemmelse af frysepunkt

Proeven anbringes i en saerlig type reagensglas og anbringes i et apparat til bestemmelse af frysepunkt. Proeven afkoeles under stadig langsom omroering, og temperaturen maales med passende mellemrum. Naar temperaturen er konstant ved flere aflaesninger, anfoeres denne temperatur (korrigeret for termometerfejl) som frysepunktet.

Underafkoeling skal undgaas ved, at der opretholdes ligevaegt mellem den faste fase og vaeskefasen.

1.4.4. Termoanalyse

1.4.4.1. Diffential termoanalyse (DTA)

Ved denne metode registreres temperaturforskellen mellem stoffet og et referencemateriale som funktion af temperaturen, imedens stoffet og referencematerialet foelger samme temperaturprogram. En faseovergang i stoffet ledsaget af en enthalpiaendring viser sig ved en endoterm (smeltning) eller exoterm (frysning) afvigelse fra den registrerede grundlinje.

1.4.4.2. Differential scanning kalorimetri (DSC)

Ved denne metode registreres forskellen i den energimaengde, der tilfoeres stoffet og et referencemateriale, som funktion af temperaturen, imedens stoffet og referencematerialet foelger samme temperaturprogram. Denne forskel svarer til den energimaengde, der er noedvendig for at opretholde en temperaturforskel paa nul mellem stoffet og referencematerialet. En faseovergang i stoffet ledsaget af en enthalpiaendring viser sig ved en endoterm (smeltning) eller exoterm (frysning) afvigelse fra den registrerede grundlinje.

1.4.5. Flydepunkt

Denne metode er udviklet til mineralolier og er egnet til olieagtige stoffer med lavt smeltepunkt.Efter foerst at vaere opvarmet afkoeles proeven med en bestemt hastighed, og dens flydeegenskaber undersoeges med 3 K's mellemrum. Den laveste temperatur, ved hvilken der kan iagttages bevaegelse i stoffet, registreres som flydepunktet.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Anvendelighed og noejagtighed for de forskellige metoder til bestemmelse af smeltepunkt/smeltepunktsinterval er angivet i foelgende tabel

TABEL: METODERNES ANVENDELIGHED

>TABELPOSITION>

>TABELPOSITION>

>TABELPOSITION>

>TABELPOSITION>

1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE

Fremgangsmaaden er for naesten alle undersoegelsesmetoderne beskrevet i internationale og nationale standarder (se tillaegget).

1.6.1. Kapillarroersmetoder

Fint pulveriserede stoffer udviser ved langsom opvarmning saedvanligvis et smeltningsforloeb som vist paa figur 1.

Figur 1

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Trin A (begyndende smeltning): Smaa draaber fordeler sig jaevnt over kapillarroerets indervaeg.

Trin B Der opstaar et mellemrum mellem proeven og indervaeggen som foelge af proevens skrumpning under smeltningen.

Trin C Den indskrumpne proeve begynder at synke ned paa bunden og blive flydende.

Trin D Der dannes en ubrudt vaeskeoverflade, men en vaesentlig del af proeven bestaar stadig af fast stof.

Trin E (endelig smeltning): Der er ingen faste partikler.

Under smeltepunktsbestemmelsen noteres temperaturerne ved begyndende og endelig smeltning.

1.6.1.1 Smeltepunktsapparater med vaeskebad

Figur 2 viser en type standardiseret smeltepunktsapparat (JIS K 0064). Apparatet er fremstillet af glas, og alle maal er angivet i mm .

Figur 2

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

A: Maalebeholder

B: Prop

C: Udluftningshul

D: Termometer

E: Hjaelpetermometer

F: Badvaeske

G: Kapillarroer af glas; laengde 80 - 100 mm ; indre diameter 1,0 ± 0,2 mm ; vaegtykkelse 0,2 - 0,3 mm

H: sideroer

Badvaeske

Der vaelges en passende vaeske. Valget afhaenger af, hvor hoejt et smeltepunkt der skal bestemmes, f.eks. paraffinolie for smeltepunkter op til 473 K og silikonolie for smeltepunkter op til 573 K.

For smeltepunkter over 523 K kan der anvendes en blanding af 3 dele svovlsyre og 2 dele kaliumsulfat (masseforhold). Anvendes denne blanding, skal der traeffes passende sikkerhedsforholdsregler.

Termometer

Man boer kun anvende termometre, som opfylder kravene i de foelgende eller tilsvarende standarder ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Fremgangsmaade

Det toerre stof pulveriseres fint i en morter og fyldes i kapillarroeret, som er lukket i den ene ende, saaledes at fyldningshoejden er ca. 3 mm efter taet pakning. For at opnaa en ensartet pakket proeve lader man kapillarroeret falde fra en hoejde af ca. 700 mm gennem et lodret glasroer ned paa et urglas.

Det fyldte kapillarroer anbringes i badet, saaledes at den midterste del af termometerets kviksoelvbeholder beroerer den del af kapillarroeret, som proeven befinder sig i. Saedvanligvis anbringes kapillarroeret i apparatet, naar badets temperatur er ca. 10 K under smeltepunktet.

Badvaesken opvarmes med en temperaturstigning paa ca. 3 K/min under omroering af vaesken. Naar

temperaturen er ca. 10 K under det forventede smeltepunkt, indstilles temperaturstigningen til hoejst 1 K/min.

Beregning

Smeltepunktet beregnes saaledes

T = TD + 0,00016 (TD TE)n

hvor

T = korrigeret smeltepunktstemperatur i K

TD = temperaturaflaesning af termometer D i K

TE = temperaturaflaesning af termometer E i K

n = antallet af gradinddelinger paa den udestaaende del af termometer D's kviksoelvsoejle.

1.6.1.2. Smeltepunktsapparater med metalblok

Apparat

Dette bestaar af

- en cylindrisk metalblok, hvis oeverste del er hul og danner et kammer (se figur 3)

- en metalprop med to eller flere huller som muliggr anbringelse af roer i metalklodsen

- et opvarmningssystem for metalklodsen, f.eks. i form af en elektrisk modstand indbygget i blokken

- en rheostat til regulering af energitilfoerslen, hvis der anvendes elektrisk opvarmning

- fire vinduer af varmeresistent glas i kammerets sidevaegge, anbragt diametralt og vinkelret paa hinanden. Foran et af disse vinduer er der anbragt en lup til iagttagelse af kapillarroeret. De tre andre vinduer tjener til belysning af indersiden af kammeret ved hjaelp af lamper

- et kapillarroer af varmeresistent glas lukket i den ene ende (se 1.6.1.1).

Termometer

Se standarderne i 1.6.1.1. Termoelektriske maaleinstrumenter med tilsvarende noejagtighed kan ogsaa anvendes.

Figur 3

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

1.6.1.3. Bestemmelse med fotocelle

Apparat og fremgangsmaade

Apparatet bestaar af et metalkammer med et automatisk opvarmningssystem. Tre kapillarroer fyldes som i 1.6.1.1 og anbringes i ovnen.

Der er mulighed for flere lineaere temperaturstigninger til kalibrering af apparatet, og temperaturstigningen indstilles elektrisk til en passende forudvalgt konstant og lineaer hastighed.

Skrivere viser den oejeblikkelige ovntemperatur og temperaturen af stoffet i kapillarroerene.

1.6.2. Varmeborde

1.6.2.1. Koflers varmebaenk

Se tillaeg.

1.6.2.2. Smeltemikroskop

Se tillaeg.

1.6.2.3. Meniskmetode (for polyamider)

Se tillaeg.

Opvarmingshastigheden ved smeltepunktet skal vaere mindre end 1 K/min.

1.6.3. Metoder til bestemmelse af frysepunkt

Se tillaeg.

1.6.4. Termoanalyse

1.6.4.1. Diffential termoanalyse

Se tillaeg

1.6.4.2. Differential scanning kalorimetri

Se tillaeg

1.6.5. Bestemmelse af flydepunkt

Se tillaeg

2. DATA

I visse tilfaelde er termometerkorrektion noedvendig.

3. RAPPORTERING

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- anvendt metode

- noejagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder) og eventuelt indledende oprensningstrin

- den skoennede noejagtighed.

Som smeltepunkt anfoeres gennemsnittet af mindst to maalinger, der ligger inden for den skoennede noejagtighed (jf. tabellerne).

Hvis forskellen mellem temperaturen ved begyndende og endelig smeltning ligger inden for metodens noejagtighed, angives temperaturen ved den endelige smeltning som smeltepunktet; i modsat fald angives begge temperaturer.

Hvis stoffet dekomponerer eller sublimerer, inden smeltepunktet er naaet, anfoeres den temperatur, hvor dette faenomen er iagttaget.

Alle oplysninger og bemaerkninger af betydning for vurdering af resultaterne isaer vedroerende urenheder og stoffets fysiske tilstand skal anfoeres.

4. LITTERATURHENVISNINGER

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803-834.

(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.

(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505-515.

Tillaeg

Der findes supplerende tekniske oplysninger i nedenstaaende standarder

1. Kapillarmetoder

1.1. Smeltepunktsapparater med vaeskebad

ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals

BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range

DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren

JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products.

1.2. Smeltepunktsapparater med metalblok

DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen

ISO 1218 (E) Plastics - polyamides - determination of »melting point«

2. Varmeborde

2.1. Koflers varmebaenk

ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings

2.2. Smeltemikroskop

DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen

2.3. Meniskmetode (polyamider)

ISO 1218 (E) Plastics - polyamides - determination of »melting point«

ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials

NF T 51-050 Résines du polyamides. Détermination du »point de fusion«. Méthode du ménisque

3. Metoder til bestemmelse af frysepunkt

BS 4633 Method for the determination of crystallizing point

BS 4695 Method for determination of melting point of petroleum wax (cooling curve)

DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen

ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la temperature de figeage

DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsaeuren

NF T 60-114 Point de fusion des paraffines

NF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation)

ISO 1392 Method for the determination of the freezing point

4. Termoanalyse

4.1. Differential termoanalyse

ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis

ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data

DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

4.2. Differential scanning kalorimetri

ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis

ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data

DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

5. Bestemmelse af flydepunkt

NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite - Monsterneming en ontleding van aardolieprodukten: Troebelingspunt en vloeipunt

ASTM D 97-66 Standard test methods for pour point of petroleum oils

ISO 3016 Petroleum oils - Determination of pour point

A.2. KOGEPUNKT

1. METODE

Flertallet af de beskrevne metoder er baseret paa OECD-testvejledningen (1). Grundprincipperne er anfoert i reference (2) og (3).

1.1. INDLEDNING

De her beskrevne metoder kan anvendes for alle vaesker og lavtsmeltende stoffer, forudsat at der ikke indtraeder nogen kemisk reaktion under kogepunktet (f.eks. autooxidation, omlejring eller nedbrydning). Metoderne kan anvendes for alle vaesker uanset renheden.

De metoder, hvor der benyttes bestemmelse med fotocelle, og de, der er baseret paa termoanalyse, fremhaeves specielt, da de kan benyttes til bestemmelse af baade smelte-og kogepunkt. Desuden kan disse maalinger udfoeres automatisk.

Den dynamiske metode har den fordel, at den ogsaa kan benyttes til bestemmelse af damptryk, og det er ikke noedvendigt at korrigere kogepunktstemperaturen til standardtryk (101,325 kPa), da standardtrykket kan indstilles med en pressostat under maalingen.

Bemaerkninger

Urenheders indflydelse paa kogepunktsbestemmelsen afhaenger staerkt af deres art. Hvis der i proeven er flygtige urenheder, som vil kunne faa indflydelse paa resultaterne, kan stoffet eventuelt renses.

1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER

Standardkogepunktet defineres som den temperatur, ved hvilken en vaeskes damptryk er 101,325 kPa.

Maales kogepunktet ikke ved standardatmosfaeretryk, kan damptrykkets afhaengighed af temperaturen beskrives ved Clausius-Clapeyron's ligning

log p = 2,3 RTD Hv + konstant

hvor

p = stoffets damptryk i pascal

AE Hv = stoffets fordampningsvarme i J 7mol 1

R = gaskonstanten = 8,314 J mol 1 K 1

T = den absolutte temperatur i K

Kogepunktet opgives i forhold til det aktuelle tryk under maalingen.

Omregninger

Tryk (enhed kPa)

100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa

(»bar« er stadig tilladt, men anbefales ikke)

133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr

(enhederne »mm Hg« og »Torr« er ikke tilladt)

1 atm = standardatmosfaere = 101 325 Pa

(»atm«-enheden er ikke tilladt).

Temperatur (enhed K)

t = T 273,15

t er temperaturen i grader celsius ( C)

T er termodynamisk temperaturen i kelvin (K)

1.3. REFERENCESTOFFER

Anvendelse af referencestoffer er ikke paakraevet, hver gang et nyt stof undersoeges. Referencestoffer skal foerst og fremmest tjene til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater opnaaet med andre metoder.

Der er i de metoder, der er anfoert i tillaegget, angivet nogle referencestoffer.

1.4. METODENS PRINCIP

Der er fem metoder til bestemmelse af kogepunkt (kogepunktsinterval), som er baseret paa maaling af den temperatur, ved hvilken proeven koger, og to metoder baseret paa termoanalyse.

1.4.1. Bestemmelse ved hjaelp af ebulliometer

Ebullitometre blev oprindeligt udviklet til molekylvaegtsbestemmelse via kogepunktsforhoejelse, men de er ogsaa velegnede til noejagtige kogepunktsbestemmelser. Et meget enkelt apparat er beskrevet i ASTM D 1120-72 (se tillaeg). I dette apparat opvarmes vaesken under ligevaegtsbetingelser ved atmosfaeretryk, indtil den koger.

1.4.2. Dynamisk metode

Ved denne metode maales dampens fortaetningstemperatur ved hjaelp af et egnet termometer anbragt i tilbagesvaleren under kogning. Trykket kan varieres ved denne metode.

1.4.3. Destillationsmetode til bestemmelse af kogepunkt

Ved denne metode destilleres vaesken, og dampens fortaetningstemperatur samt destillatmaengden maales.

1.4.4. Siwoloboff's metode

En proeve opvarmes i et proeveroer, som er nedsaenket i et varmebad. Et tilsmeltet kapillarroer med en luftboble i den nederste ende er nedsaenket i proeveroeret.

1.4.5. Bestemmelse med fotocelle

Der foretages automatisk fotoelektrisk maaling af opstigende bobler under anvendelse af Siwoloboff's princip.

1.4.6. Diffential termoanalyse

Ved denne metode registreres temperaturforskellen mellem stoffet og et referencemateriale som funktion af temperaturen, imedens stoffet og referencematerialet foelger samme temperaturprogram. En faseovergang i stoffet ledsaget af en enthalpiaendring viser sig ved en endoterm afvigelse (kogning) fra den registrerede grundlinje.

1.4.7. Differential scanning kalorimetri

Ved denne metode registreres forskellen i den energimaengde, der tilfoeres stoffet og et referencemateriale, som funktion af temperaturen, imedens stoffet og referencematerialet foelger samme temperaturprogram. Denne forskel svarer til den energimaengde, der er noedvendig for at opretholde en temperaturforskel paa nul mellem stoffet og referencematerialet. En faseovergang i stoffet ledsaget af en enthalpiaendring viser sig ved en endoterm afvigelse (kogning) fra den registrerede grundlinje.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Anvendelighed og noejagtighed for de forskellige metoder til bestemmelse af kogepunkt/kogepunktsinterval er angivet i tabel 1.

>TABELPOSITION>

1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE

Nogle af metodernes fremgangsmaader er beskrevet i internationale og nationale standarder (se tillaeg).

1.6.1. Ebulliometer

Se tillaeg.

1.6.2. Dynamisk metode

Se metode A.4 til bestemmelse af damptryk.

Den kogetemperatur, der iagttages ved et tryk paa 101,325 kPa, noteres.

1.6.3. Destillationsforloeb (kogepunktsinterval)

Se tillaeg.

1.6.4. Siwoloboff's metode

Proeven opvarmes i et smeltepunktsapparat i et proeveroer med en diameter paa ca. 5 mm (figur 1).

Figur 1 viser en model af et standardiseret smelte-og kogepunktsapparat (JIS K 0064) (fremstillet af glas, alle maal i millimeter).

Figur 1

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

A: Maalebeholder

B: Prop

C: Udluftning

D: Termometer

E: Hjaelpetermometer

F: Badvaeske

G: Proeveroer, ydre diameter maks. 5 mm, med ca. 100 mm langt kapillarroer med indre diameter maks. 1 mm og vaegtykkelse ca. 0,2-0,3 mm

H: sideroer

Et kapillarroer, som er tilsmeltet ca. 1 cm over den nederste ende, anbringes i proeveroeret. Der fyldes saa meget proeve i, at den tilsmeltede del af kapillarroeret befinder sig under vaeskeoverfladen. Proeveroeret med kapillarroeret fastgoeres til termometeret med en elastik eller fastholdes stoettet fra siden (se figur 2).

Figur 2

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Siwoloboff's princip

Figur 3

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Modificeret princip

Badvaesken vaelges under hensyntagen til kogepunktet. Ved en temperatur paa op til 573 K kan der benyttes silikonolie. Flydende paraffin maa kun anvendes op til 473 K. Badvaesken opvarmes foerst med en hastighed paa 3 K pr. minut under omroering. Ca. 10 K under det forventede kogepunkt saenkes varmetilfoerslen, saa temperaturstigningen bliver mindre end 1 K pr. minut. Naar temperaturen naermer sig kogepunktet, begynder der at stroemme bobler ud af kapillarroeret.

Kogepunktet er den temperatur, hvor boblestroemmen under et kortvarigt temperaturfald standser og vaesken begynder at stige op i kapillarroeret. Termometeraflaesningen viser stoffets kogepunkt.

I det modificerede princip (figur 3) bestemmes kogepunktet i et smeltepunktskapillarroer. Det traekkes ud til en ca. 2 cm lang tynd spids (a), og en smule af proeven suges op heri. Den aabne ende af det tynde kapillarroer tilsmeltes, saa der dannes en lille luftboble ved enden. Ved opvarmning i smeltepunktsapparatet (b) udvider luftboblen sig. Kogepunktet ligger ved den temperatur, hvor stofproppen naar op i hoejde med badvaeskens overflade (c).

1.6.5. Bestemmelse med fotocelle

Proeven opvarmes i et kapillarroer i en opvarmet metalblok.

Via passende huller i blokken sendes der en lysstraale gennem stoffet ind til en noejagtigt kalibreret fotocelle.

Medens temperaturen i proeven stiger, undviger der enkelte bobler fra kapillarroeret. Naar kogepunktet er naaet, vokser antallet af bobler voldsomt. Herved aendres intensiteten af det lys, som fotocellen modtager, saa der sendes et stopsignal til den indikator, der viser temperaturen af et platinmodstandstermometer, der er anbragt i blokken.

Denne metode er saerlig anvendelig, da den kan benyttes til bestemmelser under stuetemperatur ned til 253,15 K ( 20 C) uden aendringer ved apparaturet. Instrumentet skal blot anbringes i et kuldebad.

1.6.6. Termoanalyse

1.6.6.1. Differential termoanalyse

Se tillaeg.

1.6.6.2. Differential scanning kalorimetri

Se tillaeg.

2. DATA

Ved smaa afvigelser fra standardtryk (maks. ± 5 kPa) korrigeres kogepunktstemperaturerne ved hjaelp af Sidney-Youngs ligning

Tn = T + (fT × D p)

hvor

AE p = (101,325 p) [bemaerk fortegnet]

p = trykket maalt i kPa

fT = kogepunktets aendring med trykket i K/kPa

T = maalt kogepunkt i K

Tn = kogepunkt i K, korrigeret til standardtryk

I ovennaevnte nationale og internationale standarder findes der temperaturkorrektionsfaktorer fT for mange stoffer og udtryk til tilnaermelse af dem.

Eksempelvis anfoeres i DIN 53171 foelgende grove korrektioner for oploesningsmidler i maling

>TABELPOSITION>

3. RAPPORTERING

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- anvendt metode

- noejagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder) og eventuel indledende rensning

- den skoennede noejagtighed.

Som kogepunkt anfoeres gennemsnittet af mindst to maalinger, der ligger inden for den skoennede noejagtighed (jf. tabel 1).

De maalte kogetemperaturer og gennemsnittet heraf skal anfoeres, og det tryk, hvorved maalingerne er foretaget, opgives i kPa. Trykket skal helst ligge naer standardatmosfaeretryk.

Alle oplysninger og bemaerkninger af betydning for vurdering af resultaterne isaer vedroerende urenheder og stoffets fysiske tilstand skal anfoeres.

4. LITTERATURHENVISNINGER

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II.

(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.

Tillaeg

Der findes supplerende tekniske oplysninger i nedenstaaende standarder

1. Ebulliometer

ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

2. Destillationsforloeb (kogepunktsinterval)

ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)

BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products

BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics

DIN 53171 Loesungsmittel fuer Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes

NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation

3. Differential termoanalyse og differential scanning kalorimetri

ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis

ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data

DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

A.3. RELATIV MASSEFYLDE

1. METODE

De beskrevne metoder er baseret paa OECD-testvejledningen (1). Grundprincipperne er anfoert i reference (2).

1.1. INDLEDNING

De beskrevne metoder til bestemmelse af relativ massefylde kan anvendes for faste stoffer og vaesker uanset renheden. De forskellige metoder, som kan anvendes, er anfoert i tabel 1.

1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER

Den relative massefylde, D420, af faste stoffer og vaesker er forholdet mellem massen af et rumfang af det undersoegte stof bestemt ved 20 C og massen af det samme rumfang vand bestemt ved 4 C. Den relative massefylde er dimensionsloes.

Massefylden, ñ, af et stof er dets masse m divideret med dets rumfang v.

Massefylden, ñ, opgives i kg/m3 (SI-enheder).

1.3. REFERENCESTOFFER (1) (3)

Anvendelse af referencestoffer er ikke paakraevet, hver gang et nyt stof skal undersoeges. Referencestoffer skal foerst og fremmest tjene til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater opnaaet med andre metoder.

1.4. METODERNES PRINCIP

Der benyttes fire typer metoder.

1.4.1. Opdriftsmetoder

1.4.1.1. Araeometer (for vaesker)

Der kan opnaas tilstraekkelig noejagtige og hurtige massefyldebestemmelser med araeometre, hvor massefylden af en vaeske udledes af flydehoejden ved aflaesning paa en skala.

1.4.1.2. Hydrostatisk vaegt (for vaesker og faste stoffer)

Forskellen mellem massen af en proeve i henholdsvis atmosfaerisk luft og en passende vaeske (f.eks. vand) kan anvendes til at bestemme dens massefylde.

For faste stoffer er den fundne massefylde kun repraesentativ for den bestemte proeve, som er anvendt til bestemmelsen. Til bestemmelse af vaeskers massefylde vejes et legeme med kendt rumfang v foerst i atmosfaerisk luft og dernaest i vaesken.

1.4.1.3. Metode med nedsaenket legeme (for vaesker) (4)

Ved denne metode bestemmes en vaeskes massefylde ud fra forskellen mellem resultaterne af vejning af vaesken foer og efter nedsaenkning af et legeme med kendt rumfang heri.

1.4.2. Pyknometermetoder

Pyknometre af forskellig udformning og med kendt rumfang kan anvendes for faste stoffer og vaesker. Massefylden beregnes ud fra masseforskellen mellem det fulde og det tomme pyknometer og dets kendte rumfang.

1.4.3. Luftsammenligningspyknometer (for faste stoffer)

Massefylden af et fast stof i enhver form kan bestemmes ved stuetemperatur med et gassammenligningspyknometer. Rumfanget af en proeve af stoffet maales i atmosfaerisk luft eller i en inaktiv luftart i en beholder med korrigeret rumfangsinddeling. Til beregning af massefylden foretages efter rumfangsbestemmelsen en bestemmelse af proevens masse.

1.4.4. Oscillerende densitometer (5) (6) (7)

Massefylden af en vaeske kan bestemmes med et oscillerende densitometer. En mekanisk oscillator i form af et U-roer saettes i svingning ved sin resonansfrekvens, der afhaenger af dens masse. Naar der indfoeres en proeve heri, aendres oscillatorens resonansfrekvens. Apparatet kalibreres med to vaesker med kendt massefylde.

Disse stoffer vaelges fortrinsvis saaledes, at deres massefylde ligger i hver sin ende af det paagaeldende maaleomraade.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Anvendeligheden af de forskellige metoder, der anvendes til bestemmelse af den relative massefylde, er opstillet i tabellen.

1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE

Tillaegget indeholder en liste over nogle standarder, hvorfra yderligere tekniske detaljer kan hentes.

Maalingerne skal udfoeres ved 20 C, og der foretages mindst to bestemmelser.

2. DATA

Se standarderne.

3. RAPPORTERING

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- anvendt metode

- noejagtig beskrivelse af stoffet (art og urenheder) og eventuel indledende rensning.

Den under 1.2 definerede relative massefylde D420 rapporteres tillige med det undersoegte stofs fysiske tilstand.

Alle oplysninger og bemaerkninger af betydning for vurdering af resultaterne, isaer vedroerende urenheder og stoffets fysiske tilstand, skal anfoeres.

>TABELPOSITION>

4. LITTERATURHENVISNINGER

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.

(3) IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508.

(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Fluessigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol.11, 427-430.

(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Fluessigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297-302.

(6) Baumgarten, D., Fuellmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen - Verfahren zur Dichtebestimmung bei fluessigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717-726.

(7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255.

Tillaeg

Der findes supplerende tekniske oplysninger i nedenstaaende standarder

1. OPDRIFTSMETODER

1.1. Araeometer

DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions

DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use

Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation

Part III: Use and test

ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose

NF T 20-050 Chemical products for industrial use - Determination of density of liquids - Areometric method

DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers

1.2. Hydrostatisk vaegt

For faste stoffer

ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics

NF T 20-049 Chemical products for industrial use - Determination of the density of solids other than powders and cellular products - Hydrostatic balance method

ASTM D 792 Specific gravity and density of plastics by displacement

DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; determination of density

For vaesker

ISO 901 ISO 758

DIN 51757 Testing of mineral oils and related materials; determination of density

ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 og ASTM D 1481-62

ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

1.3. Metode med nedsaenket legeme

DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method

2. PYKNOMETERMETODER

2.1. For vaesker

ISO 3507 Pycnometers

ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 C

DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for ikke-flygtige vaesker, som ikke er for tyktflydende)

DIN 12798 Lipkin pycnometer (for vaesker med kinematisk viskositet under 100, 10 6 m2 s 1 ved 15 C)

DIN 12800 Sprengel pycnometer (for samme vaesker som DIN 12798)

DIN 12801 Reischauer pycnometer (for vaesker med kinematisk viskositet under 100, 10 6 m2 s 1 ved 20 C; desuden saerligt egnet til kulbrinter og vandige oploesninger samt vaesker med ret hoejt damptryk, ca. 1 bar ved 90 C)

DIN 12806 Hubbard pycnometer (for alle tyktflydende vaesker, som ikke har for hoejt damptryk, specielt ogsaa for malinger, lakker og asfalt)

DIN 12807 Bingham pycnometer (for samme vaesker som DIN 12801)

DIN 12808 Jaulmes pycnometer (hovedsagelig for ethanol/vand-blandinger)

DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for vaesker, som ikke er for tyktflydende)

DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer

DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density

ASTM D 297 Section 15: Rubber products - chemical analysis

ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compounds

BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method)

BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary-stoppered pycnometer method

NF T 20-053 Chemical products for industrial use - Determination of density of solids in powder and liquids - Pycnometric method

2.2. For faste stoffer

ISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics

NF T 20-053 Chemical products for industrial use - Determination of density of solids in powder and liquids - Pycnometric method

DIN 19683 Determination of the density of soils

3. LUFTSAMMENLIGNINGSPYKNOMETER

DIN 55990 Part 3: Pruefung von Anstrichstoffen und aehnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte

DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Pruefung

A.4. DAMPTRYK

1. METODE

Flertallet af de beskrevne metoder er baseret paa OECD-testvejledningen (1). Grundprincipperne er anfoert i reference (2) og (3).

1.1. INDLEDNING

Ved udfoerelse af denne test er det nyttigt at have forhaandsoplysninger om stoffets struktur, smeltepunkt og kogepunkt.

Der findes ikke en enkelt metode, som kan anvendes i hele damptryksomraadet.

Derfor anbefales der flere forskellige metoder til maaling af damptryk fra TABELPOSITION>

1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE

1.6.1. Dynamisk maaling

1.6.1.1. Apparatur

Maaleinstrumentet bestaar typisk af en kogebeholder med tilsluttet koeler fremstillet af glas eller metal (figur 1), udstyr til maaling af temperaturen og udstyr til regulering og maaling af trykket. Et typisk maaleudstyr som det paa skitsen viste er fremstillet af varmebestandigt glas og bestaar af fem deleEt stort delvis dobbeltvaegget roer bestaaende af en slibsamling, en koeler, en koelebeholder og et indloeb.

Der er monteret en glascylinder med en Cottrell-pumpe paa roerets kogesektion, og dens overflade er ru, saa stoedkogning undgaas.

Temperaturen maales med en egnet temperaturfoeler (f.eks. modstandstermometer eller termoelement med kappe), som er foert ind i instrumentet helt til maalepunktet (figur 1, nr. 5) gennem en passende aabning (f.eks. udvendigt slib).

Der foretages de fornoedne tilslutninger til det udstyr, hvormed trykket reguleres og maales.

Bulben, der fungerer som stoedpudevolumen, er forbundet med maaleinstrumentet med et kapillarroer.

Kogebeholderen opvarmes med et varmeelement (f.eks. varmepatron), der er indfoert i glasapparaturet nedefra. Den noedvendige stroemstyrke indstilles og reguleres via et termoelement.

Det paakraevede vakuum paa mellem 102 og ca. 105 Pa skabes med en vakuumpumpe.

Der benyttes en passende ventil til regulering af trykket med luft eller nitrogen (maaleomraade ca. 102 til 105 Pa) og til udluftning.

Trykket maales med et manometer.

1.6.1.2. Fremgangsmaade ved maalingen

Damptrykket maales ved, at proevens kogepunkt bestemmes ved forskellige specificerede tryk mellem ca. 103 og 105 Pa. En ikke-stigende temperatur ved konstant tryk viser, at kogetemperaturen er naaet. Skummende stoffers damptryk kan ikke maales ved denne metode.

Stoffet anbringes i testkammeret, der skal vaere rent og toert. Det kan vaere vanskeligt med ikke-pulverformige faste stoffer, men det kan undertiden hjaelpe at opvarme koelekappen. Naar kammeret er fyldt, samles apparatet, og stoffet afgasses. Derpaa indstilles der paa det laveste oenskede tryk, og der taendes for opvarmningen. Samtidig tilsluttes temperaturfoeleren til en skriver.

Der er naaet ligevaegt, naar der registreres konstant kogetemperatur ved konstant tryk. Det skal noeje paases, at der ikke forekommer stoedkogning. Desuden skal der ske fuldstaendig kondensation paa svaleren. Ved bestemmelse af damptryk af lavtsmeltende faste stoffer, skal man omhyggeligt soerge for, at svaleren ikke tilstoppes.

Naar ligevaegtspunktet er registreret, indstilles der til et hoejere tryk. Der fortsaettes paa samme maade, indtil 105 Pa er naaet (ca. 5 til 10 maalepunkter i alt). Som kontrol gentages ligevaegtspunkterne ved aftagende tryk.

1.6.2. Statisk maaling

1.6.2.1. Apparatur

Apparaturet bestaar af en beholder til proeven og et opvarmnings- og afkoelingssystem til regulering og maaling af proevens temperatur. Apparaturet omfatter desuden instrumenter til indstilling og maaling af trykket. Figur 2a og 2b viser grundprincipperne.

Testkammeret (figur 2a) er paa den ene side afgraenset af en passende hoejvakuumventil og paa den anden side forbundet med et U-roer, der indeholder en egnet manometervaeske. Den anden ende af U-roeret er tilsluttet til vakuumpumpen, nitrogenflasken eller udluftningsventilen og et manometer.

I stedet for U-roeret kan der anvendes en trykmaaler med separat viser (figur 2b).

Proevens temperatur styres ved, at testkammeret med ventil og U-roer eller trykmaaler anbringes i et bad, der holdes ved konstant temperatur ± 0,2 K. Temperaturmaalingerne udfoeres paa ydersiden af testkammerets vaeg eller i selve testkammeret.

Der benyttes en vakuumpumpe med frysefaelde til evakuering af apparatet.

I metode 2a maales stoffets damptryk indirekte ved hjaelp af en nulindikator. Der tages derved hensyn til, at massefylden af vaesken i U-roeret aendrer sig, hvis der sker store temperaturaendringer.

Foelgende vaesker er egnede som nulindikatorer i U-roeret og vaelges under hensyntagen til trykomraadet og teststoffets kemiske egenskaber: siliconevaesker og phthalater. Teststoffet maa ikke kunne oploeses vaesentligt i eller reageres med U-roervaesken.

I manometre kan der bruges kviksoelv i omraadet fra normalt lufttryk til 102 Pa, mens siliconevaesker og phthalater er egnede fra 102 ned til 10 Pa. Varmebestandige membrankondensatormanometre kan endda benyttes under 10 1 Pa. Der findes ogsaa andre trykmaalere, der kan bruges under 102 Pa.

1.6.2.2. Fremgangsmaade ved maalingen

Foer maalingen skal alle dele af det i figur 2 viste apparat rengoeres og toerres omhyggeligt.

Ved metode 2a fyldes U-roeret med den valgte vaeske, der afgasses ved hoej temperatur, inden der foretages aflaesninger.

Teststoffet anbringes i apparatet, som samles, hvorefter temperaturen saenkes tilstraekkeligt til afgasning. Temperaturen skal vaere saa lav, at luften suges ud, men der maa ikke for flerkomponentsystemers vedkommende ske nogen aendring af materialets sammensaetning. Om noedvendigt kan indstillingen af ligevaegt fremskyndes ved omroering.

Proeven kan underafkoeles med f.eks. flydende nitrogen (pas paa kondensation i luften og pumpevaesken) eller en blanding af ethanol og toeris. Til lavtemperaturmaalinger benyttes et temperaturreguleret bad forbundet med en ultrakryomat.

Idet ventilen over testbeholderen staar aaben, suges der i flere minutter, saa luften fjernes. Derefter lukkes ventilen, og proevens temperatur saenkes til den laveste oenskede. Om noedvendigt gentages afgasningen flere gange.

Naar proeven opvarmes, stiger damptrykket, hvorved vaesken i U-roeret aendrer ligevaegtsstilling. Som kompensation ledes der nitrogen eller luft ind i apparatet via ventilen, indtil trykindikatorvaesken atter er paa nul. Det tilsvarende tryk kan aflaeses paa et praecisionsmanometer ved stuetemperatur. Dette tryk svarer til stoffets damptryk ved den paagaeldende maaletemperatur.

Metode 2b er en lignende metode, men damptrykket aflaeses direkte.

Damptrykkets temperaturafhaengighed bestemmes med passende smaa intervaller (ca. 5 til 10 maalepunkter) op til det oenskede maksimum. Som kontrol gentages lavtemperaturmaalingerne.

En eventuel afvigelse mellem de nye maalinger og den kurve, der er fundet ved stigende temperatur, kan skyldes

1. at proeven stadig indeholder luft (f.eks. meget tyktflydende materialer) eller lavtkogende stoffer, som er frigjort under opvarmningen og kan fjernes ved sugning efterfulgt af endnu en underafkoeling

2. at afkoelingstemperaturen ikke er lav nok. I saa fald benyttes der flydende nitrogen som koelemiddel I tilfaelde 1 og 2 maa maalingerne gentages.

3. at der sker en kemisk reaktion i stoffet i det undersoegte temperaturinterval (f.eks. dekomponering eller polymerisering).

1.6.3. Isoteniskop

Reference 7 indeholder en fuldstaendig beskrivelse af denne metode. Maaleanordningens princip fremgaar af figur 3. Isoteniskopet er i lighed med den under 1.6.2 beskrevne metode egnet til undersoegelse af saavel faste stoffer som vaesker.

Ved maaling paa vaesker, tjener stoffet selv som hjaelpemanometervaeske. Der anbringes en saadan maengde af stoffet i isoteniskopet, at kuglen og den korte arm af manometersektionen er fyldt. Isoteniskopet forbindes med et vakuumsystem, evakueres og fyldes med nitrogen. Evakueringen og rensningen af systemet gentages to gange, saa alt resterende oxygen fjernes. Det fyldte isoteniskop anbringes vandret, saa proeven fordeler sig i et tyndt lag i kuglen og manometersektionen (U-delen). Trykket i systemet reduceres til 133 Pa, og proeven opvarmes forsigtigt, indtil den netop koger (fjernelse af oploeste fikserede gasser). Isoteniskopet anbringes nu saaledes, at proeven atter befinder sig i kuglen og manometerets korte arm og begge er helt fyldt med vaeske. Der opretholdes samme tryk som ved afgasning; kuglens udtrukne spids opvarmes med en lille flamme, indtil den dannede damp udvider sig tilstraekkeligt til, at en del af proeven presses ud af kuglens oevre del og manometerarm og ud i isoteniskopets manometersektion, hvorved der opstaar et dampfyldt nitrogenfrit rum.

Isoteniskopet anbringes dernaest i et bad med konstant temperatur, og nitrogentrykket indstilles til det er lig med proevens tryk. At der er trykligevaegt fremgaar af isoteniskopets manometersektion. Ved ligevaegt er nitrogenens damptryk lig med stoffets damptryk.

Ved maaling paa faste stoffer benyttes en af de i 1.6.2.1 naevnte manometervaesker, alt efter tryk- og temperaturomraade. Der fyldes afgasset manometervaeske ind i en udvidelse paa isoteniskopets lange arm. Derefter anbringes det faste teststof i kuglen og afgasses ved hoej temperatur. Dernaest haeldes isoteniskopet saaledes, at manometervaesken kan stroemme ind i U-roeret. Maaling af damptrykket som funktion af temperaturen foregaar som under 1.6.2.

1.6.4. Effusionsmetoden: damptryksvaegt

1.6.4.1. Apparatur

I litteraturen (1) er der beskrevet forskellige versioner af apparaturet. Det her beskrevne apparatur illustrerer det generelle princip (figur 4). Figur 4 viser apparaturets hovedkomponenter: en hoejvakuumbeholder af glas eller rustfrit staal, udstyr til generering og maaling af vakuum og indbyggede komponenter til maaling af damptryk paa en vaegt. Apparaturet indeholder foelgende indbyggede komponenter

- en fordampningsovn med flange og drejelig gennemfoering. Fordampningsovnen er en cylindrisk beholder fremstillet i f.eks. kobber eller en godt varmeledende kemisk bestandig legering. Der kan ogsaa benyttes en glasbeholder med kobbervaeg. Ovnen har en diameter paa ca. 3 til 5 cm og en hoejde paa 2 til 5 cm. Der er 1 til 3 aabninger af forskellig stoerrelse til dampstroemmen. Ovnen opvarmes enten med en varmeplade underneden eller med en varmespiral omkring ydersiden. For at undgaa bortledning af varme til grundpladen er varmeaggregatet fastgjort hertil med et metal med ringe varmeledningsevne (nikkel/soelv eller chromnikkelstaal), f.eks. et nikkel/soelv-roer fastgjort til en drejelig gennemfoering, hvis der benyttes en ovn med flere aabninger. En saadan opstilling har den fordel, at der kan indstikkes en kobberstang, saa der kan koeles udefra med et kuldebad

- hvis der i ovnens kobberlaag er tre aabninger anbragt med 90 i forhold til hinanden, kan forskellige damptryksintervaller inden for det totale maaleomraade daekkes (aabninger med diameter mellem ca. 0,30 og 4,50 mm). De store aabninger benyttes til lave damptryk og omvendt. Ved drejning af ovnen kan den oenskede aabning eller en mellemstilling i dampstroemmen (ovnaabning - skaerm - vaegtskaal) indstilles, saa molekylestroemmen frigoeres eller afboejes af ovnaabningen og rammer vaegtskaalen. Stoffets temperatur maales med et termoelement eller et modstandstermometer anbragt et passende sted

- over skaermen befinder sig vaegtskaalen paa en meget foelsom mikrovaegt (se nedenfor). Vaegtskaalen er ca. 30 mm i diameter. Forgyldt aluminium er et egnet materiale

- vaegtskaalen er omgivet af en cylindrisk koelekappe af messing eller kobber. Afhaengigt af vaegttypen er den forsynet med aabninger for vaegtbjaelken og en skaermaabning til molekylestroemmen, og den skal garantere fuldstaendig kondensering af dampen paa vaegtskaalen. Varmen bortledes til omgivelserne f.eks. med en kobberstang, der er forbundet med koelekappen. Denne stang er foert gennem grundpladen og isoleret herfra, f.eks. med et roer af chromnikkelstaal. Den nedsaenkes i et dewarkar med flydende nitrogen under grundpladen, eller der ledes flydende nitrogen gennem stangen. Herved holdes koelekappen paa en temperatur paa ca. 120 C. Vaegtskaalen koeles udelukkende ved straaling, hvilket er tilfredsstillende i det paagaeldende trykinterval (afkoeling ca. 1 time foer maalingerne paabegyndes)

- vaegten er anbragt over koelekappen. En hoejfoelsom toarmet elektronisk mikrovaegt (8) eller et meget foelsomt drejespoleinstrument (se OECD Test Guideline 104, udgave af 12.5.1981) er eksempler paa egnede vaegte

- paa grundpladen findes ligeledes de elektriske tilslutninger for termoelementer (eller modstandstermometre) og varmelegemer

- der frembringes et vakuum i beholderen med enten en partiel vakuumpumpe eller en hoejvakuumpumpe (der kraeves et vakuum paa ca. 1 til 2×10 3 Pa, hvilket opnaas efter 2 timers pumpning). Trykket reguleres med et egnet ioniseringsmanometer.

1.6.4.2. Fremgangsmaade ved maalingen

Teststoffet fyldes i beholderen, som lukkes med laaget. Skaermen og koelekappen skubbes paa plads over ovnen. Apparatet lukkes, og vakuumpumperne startes. Sluttrykket skal vaere ca. 10 4 Pa, foer maalingerne paabegyndes. Afkoeling af koelekappen saettes i gang ved 10 2 Pa.

Naar det kraevede vakuum er naaet, startes kalibreringsraekken ved den laveste temperatur. Der indstilles paa den paagaeldende aabning i laaget, og dampstroemmen passerer gennem skaermen direkte over aabningen og rammer den afkoelede vaegtskaal. Vaegtskaalen skal vaere saa stor, at hele den dampstroem, der ledes gennem skaermen, rammer den. Dampstroemmens impuls overfoerer en kraft til vaegtskaalen, og molekylerne kondenserer paa dens kolde overflade.

Impulsen og den samtidige kondensation frembringer et signal paa skriveren. Ved vurdering af signalerne kan der uddrages to oplysninger

1. Med det her beskrevne apparatur bestemmes damptrykket direkte ud fra den impuls, der overfoeres til vaegtskaalen (hertil er det ikke noedvendigt at kende molekylvaegten (6)). Ved vurdering af aflaesningerne maa der tages hensyn til geometriske faktorer, saasom ovnaabningen og molekylestroemmens vinkel.

2. Kondensatets masse kan maales samtidig, og herudfra kan fordampningshastigheden beregnes. Endvidere kan damptrykket beregnes ud fra fordampningshastigheden og molekylvaegten ved hjaelp af Hertz's ligning (2).

p = G2 p RT × 103M

hvor

G = fordampningshastigheden (kg s 1m 2)

M = molekylmassen (g mol 1)

T = temperaturen (K)

R = gaskonstanten (J mol 1 K 1)

p = damptrykket (Pa).

Naar det oenskede vakuum er naaet, paabegyndes maaleserien ved den laveste oenskede maaletemperatur.

Videre maalinger foretages ved, at temperaturen haeves i smaa spring, indtil den hoejeste oenskede temperatur er naaet. Dernaest afkoeles proeven igen, og der optegnes endnu en kurve over damptrykket. Bekraefter de sidste resultater ikke de foerste, kan det skyldes, at stoffet dekomponerer i det undersoegte temperaturomraade.

1.6.5. Effusionsmetode - vaegttab

1.6.5.1. Apparatur

Et effusionsapparat bestaar af foelgende basiskomponenter

- en beholder, der kan termostateres og evakueres, og hvori effusionscellerne placeres

- en hoejvakuumpumpe (f.eks. diffusionspumpe eller turbomolekylarpumpe) med vakuummeter

- en frysefaelde med flydende nitrogen eller toeris.

Som eksempel er der i figur 5 vist en elektrisk opvarmet vakuumbeholder af aluminium med fire effusionsceller af rustfrit staal. Den rustfrie staalfolie af ca. 0,3 mm's tykkelse har en effusionsaabning paa 0,2 til 1,0 mm i diameter og er fastgjort til effusionscellen med et laag med gevind.

1.6.5.2. Fremgangsmaade ved maalingen

Referencestoffet og teststoffet fyldes i hver effusionscelle, metalmembranen med aabningen fastgoeres ved hjaelp af laaget med gevind, og hver celle vejes med en noejagtighed paa 0,1 mg. Cellen anbringes i det termostaterede apparat, som derefter evakueres til et tryk, der er mindre end en tiendedel af det forventede. Med paa forhaand fastsatte tidsintervaller paa mellem 5 og 30 timer lukkes der luft ind i apparatet, og effusionscellernes massetab bestemmes ved vejning.

For at sikre at resultaterne ikke paavirkes af flygtige bestanddele, vejes cellen med faste mellemrum, saa det kan kontrolleres, at fordampningshastigheden er konstant over mindst to tidsintervaller.

Damptrykket p i effusionscellen er givet ved

p =mKAtE2pRTM

hvor

p = damptrykket (Pa)

m = massen af den stofmaengde, der forlader cellen i tidsrummet t (kg)

t = tiden (s)

A = hullets areal (m2)

K = korrektionsfaktor

R = gaskonstanten (J mol 1 K 1)

T = temperaturen (K)

M = molekylmassen (kg mol 1).

Korrektionsfaktoren K afhaenger af forholdet mellem den cylindriske aabnings laengde og radius

forhold:0,10,20,61,02,0

K:0,9520,9090,7710,6720,514

Ovenstaaende ligning kan omskrives til

p = EmtTM

hvor = E1KA2pR er effusionscellekonstanten.

Denne effusionscellekonstant kan bestemmes ved hjaelp af referencestoffer (2,9) ud fra foelgende ligning

E =p(r) tmM(r)T

hvor

p(r) = referencestoffets damptryk (Pa)

M(r) = referencestoffets molekylmasse (kg mol 1)

1.6.6. Gasmaetningsmetode

1.6.6.1. Apparatur

Et typisk apparat til udfoerelse af denne proevning bestaar af de komponenter, der er vist i figur 6a og beskrevet nedenfor (1).

Inert gas

Baeregassen maa ikke reagere kemisk med teststoffet. Det er normalt tilstraekkeligt at anvende nitrogen til dette formaal, men undertiden kan der kraeves andre gasser (10). Den anvendte gas skal vaere toer (se figur 6a, nr. 4 : foeler for relativ fugtighed).

Stroemningsregulering

Der kraeves et velegnet gasreguleringssystem for at sikre konstant og valgbar gennemstroemningshastighed gennem maetningskolonnen. Faelder til opsamling af damp Disse afhaenger af den aktuelle proeves egenskaber og af den valgte analysemetode. Dampen skal indfanges kvantitativt og i en form, som tillader efterfoelgende analyse. Til visse stoffer vil faelder, der indeholder vaesker saasom hexan eller ethylenglycol, vaere velegnede. Til andre vil der kunne anvendes faste absorptionsmidler.

Som alternativ til opsamling af damp og efterfoelgende analyse kan der benyttes in-line analyseteknikker, som f.eks. chromatografi, til kvantitativ bestemmelse af den maengde materiale, som en kendt maengde baeregas foerer med sig. Desuden kan proevens massetab maales.

Varmeveksler

Til maalinger ved forskellige temperaturer kan det vaere noedvendigt at indsaette en varmeveksler i opstillingen.

Maetningskolonne

Teststoffet overfoeres til en egnet inaktiv baerer fra en oploesning. Den coatede baerer pakkes i maetningskolonnen; dennes dimensioner og gennemstroemningshastigheden skal afpasses saaledes, at man er sikker paa, at baeregassen bliver maettet. Maetningskolonnen skal vaere termostateret. Ved maalinger over stuetemperatur skal stykket mellem maetningskolonnen og faelderne opvarmes, saa kondensation af teststoffet undgaas.

For at mindske massetransport ved diffusion kan der anbringes et kapillarroer efter maetningskolonnen (figur 6b).

1.6.6.2. Fremgangsmaade ved maalingen

Klargoering af maetningskolonnen

En oploesning af teststoffet i et meget letflygtigt oploesningsmiddel blandes med en passende maengde af baereren. Der skal vaere tilstraekkeligt med teststof til, at der finder maetning sted under hele testens varighed. Oploesningsmidlet afdampes fuldstaendigt i luft eller i en rotationsfordamper, og efter omhyggelig blanding fyldes materialet paa maetningskolonnen. Efter at proeven er termostateret, ledes der toer nitrogen gennem apparatet.

Maaling

Faelderne eller in-line detektoren forbindes med kolonnens afgangsroer, og tiden registreres. Gennemstroemningshastigheden kontrolleres i begyndelsen og med regelmaessige mellemrum under forsoeget ved anvendelse af en boblemaaler (eller kontinuerligt med en massestroemsmaaler).

Trykket ved maetningskolonnens afgangsaabning skal maales. Dette kan ske ved

a) enten at indsaette en trykmaaler mellem maetningskolonnen og faelderne (hvilket kan vaere utilfredsstillende paa grund af oeget doedvolumen og stoerre adsorptionsflade)

b) eller at bestemme trykfaldet over det bestemte faeldesystem, der benyttes, som funktion af gennemstroemningshastigheden i et saerskilt forsoeg (hvilket kan vaere lidet tilfredsstillende for vaeskefaelder).

Den tid, der kraeves til opsamling af den maengde teststof, der er noedvendig til de forskellige analysemetoder, bestemmes ved forforsoeg eller skoennes. Som alternativ til opsamling af stoffet til senere analyse kan der benyttes kvantitative in-line analyseteknikker (f.eks. chromatografi). Foer beregning af damptrykket ved en given temperatur udfoeres der forforsoeg til bestemmelse af den maksimale flowhastighed, hvor baeregassen maettes fuldstaendigt med stofdampe. Dette sikres ved at lede baeregassen saa langsomt gennem maetningskolonnen, at en lavere hastighed ikke giver stoerre beregnet damptryk.

Den specifikke analysemetode vil afhaenge af arten af teststof, der undersoeges (f.eks. gaschromatografi eller gravimetri).

Den maengde stof, som et kendt rumfang baeregas foerer med sig, bestemmes.

1.6.6.3. Beregning af damptryk

Damptrykket beregnes ud fra dampens massefylde W/V ved hjaelp af ligningen

p =WV×RTM

hvor

p = damptrykket (Pa)

W = massen af den stofmaengde, der er fordampet (g)

V = rumfang maettet gas (m3)

R = gaskonstanten (Jmol 1 K 1)

T = temperaturen (K)

M = teststoffets molekylmasse (g mol 1).

De maalte rumfang skal korrigeres for temperaturforskelle mellem flowmeteret og den termostaterede maetningskolonne. Hvis flowmeteret er placeret efter dampfaelden, kan det vaere noedvendigt at korrigere for eventuelt fordampede bestanddele fra faelden (1).

1.6.7. Roterende kugle (8, 11, 13)

1.6.7.1. Apparatur

Metoden kan udfoeres ved hjaelp af en viskositetsmaaler med roterende kugle som vist paa figur 8. Figur 7 viser forsoegsopstillingen skematisk.

Maaleopstillingen bestaar typisk af et maalehoved med roterende kugle anbragt i et termostateret hus (kontrolleret inden for 0,1 C). Testbeholderen er ligeledes anbragt i et termostateret hus (kontrolleret inden for 0,01 C), og alle opstillingens komponenter holdes ved en hoejere temperatur for at undgaa kondensation. Systemet er ved hjaelp af hoejvakuumventiler forbundet med en hoejvakuumpumpe.

Maalehovedet bestaar af en staalkugle (4 til 5 mm diameter) i et roer. Kuglen holdes stabilt svaevende af et magnetfelt, saedvanligvis ved en kombination af permanentmagneter og styrespoler.

Kuglen saettes i rotation ved hjaelp af roterende felter, der frembringes af spolerne. Rotationshastigheden maales med detektorspoler, der maaler den svage tvaermagnetisering af kuglen, der altid vil vaere til stede.

1.6.7.2. Fremgangsmaade ved maalingen

Naar kuglen har opnaaet en bestemt rotationshastighed v(o) (normalt omkring 400 omdrejninger pr. sekund), afbrydes energitilfoerslen, og gasfriktionen begynder at decelerere kuglens rotation.

Rotationshastighedstabet maales som funktion af tiden. Da friktionen i det magnetiske ophaeng er ubetydelig sammenlignet med gasfriktionen, er gastrykket givet ved udtrykket

p =pcrrs10t×lnv(t)v (o)

hvor

c = gasmolekylernes gennemsnitshastighed

r = kuglens radius

ñ = kuglens massefylde

ó = koefficient for tangential impulsoverfoersel (ó = 1 for en ideal kugleflade)

t = tiden

v(t) = rotationshastigheden efter tiden t

v(o) = begyndelsesrotationshastigheden.

Dette udtryk kan ogsaa omskrives til

p =pcrr10s×tn tn-1 tn × tn-1

hvor tn og tn 1 er den tid, der kraeves til et givet antal omdrejninger N. Disse tidsintervaller tn og tn 1 foelger lige efter hinanden, og tn > tn 1.

Gasmolekylernes gennemsnitshastighed Ec er givet ved

c =(8 RTp M)12

hvor

T = temperaturen

R = gaskonstanten

M = molekylmassen

2. DATA

Damptrykket bestemt ved en hvilken som helst af de ovenfor beskrevne metoder boer bestemmes ved mindst to temperaturer. Tre eller flere er oenskelige i omraadet 0 C til 50 C, saa damptrykkurvens linearitet kan kontrolleres.

3. RAPPORTERING

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- anvendt metode

- noejagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder) og eventuel indledende rensning

- mindst to vaerdier for damptryk og temperatur, helst i omraadet mellem 0 C og 50 C

- alle raadata

- en afbildning af log p mod 1/T

- et skoen over damptrykket ved 20 eller 25 C.

Hvis der er iagttaget omdannelse (aendring i tilstandsform eller dekomponering), skal foelgende oplysninger fremgaa

- aendringens art

- den temperatur, hvor aendringen sker ved atmosfaeretryk

- damptrykket ved 10 og 20 C under overgangstemperaturen og ved 10 og 20 C over denne temperatur (medmindre overgangen er fra fast stof til gas).

Alle oplysninger og bemaerkninger af betydning for vurdering af resultaterne, isaer vedroerende urenheder og stoffets fysiske tilstand, skal anfoeres.

4. LITTERATURHENVISNINGER

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol. II.

(3) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I.

(4) Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, 593.

(5) NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10 1 to 105 Pa - Static method.

(6) NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10 3 to 1 Pa - Vapour pressure balance method.

(7) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.

(8) G. Messer, P. Rohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987, vol. 5 (4), 2440.

(9) Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, 1173.

(10) B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435.

(11) G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), 642.

(12) G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), 1148.

(13) J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1985, vol. 3 (3), 1715.

Tillaeg 1

Estimeringsmetode

INDLEDNING

Man kan benytte beregnede vaerdier for damptrykket til

- at beslutte, hvilken af forsoegsmetoderne der er egnet

- at foretage et skoen eller at fastsaette en graensevaerdi, naar man af tekniske aarsager (herunder tilfaelde, hvor damptrykket er meget lavt) ikke kan benytte eksperimentelle metoder

- at konstatere, i hvilke tilfaelde det er berettiget at undlade eksperimentelle maalinger, fordi damptrykket sandsynligvis vil vaere START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Apparat til bestemmelse af damptrykskurven efter den dynamiske metode

1 = Termoelement

2 = Vakuumstoedpuderumfang

3 = Trykmaaler

4 = Vakuum

5 = Maalepunkt

6 = Varmeelement ca. 150 W

Figur 2a

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Apparat til bestemmelse af damptrykskurven efter den statiske metode (med U-roersmanometer)

1. Teststof

6. Temperaturbad

2. Dampfase

7. Temperaturmaaleanordning

3. Hoejvakuumventil

8. Til vakuumpumpe

4. U-roer (hjaelpemanometer)

9. Udluftning

5. Manometer

Figur 2b

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Apparat til bestemmelse af damptrykskurven efter den statiske metode (med trykindikator)

1. Teststof

5. Trykindikator

2. Dampfase

6. Temperaturbad

3. Hoejvakuumventil

7. Temperaturmaaleanordning

4. Trykmaaler

Figur 3

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Isoteniskop (se reference 7)

1. Til system for trykregulering og -maaling

2. Roer med ydre diameter 8 mm

3. Toer nitrogen i tryksystem

4. Dampe af proeven

5. Lille spids

6. Flydende proeve

Figur 4

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Apparat til bestemmelse af damptrykskurven efter metoden med damptryksvaegt

1. Teststof

7. Skaerm

2. Dampfase med dampstroem

8. Koelestang til koelekappe gennemfoering

3. Fordampningsovn med drejelig

9. Vaegtskaal

3a. Ovnlaag med aabning

10. Mikrovaegt

4. Opvarmning (afkoeling) af ovn

11. Til skriver

5. Maaling af proevens temperatur

12. Til hoejvakuumpumpe

6. Koelekappe

Figur 5

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Eksempel paa apparat til fordampning ved lavt tryk ved effusionsmetoden, med et effusionscellevolumen paa 8 cm3

1. Forbindelse til vakuum

2. Huller til platinmodstandstermometer eller temperaturmaaling og -regulering (2)

3. Laag til vakuumbeholder

4. O-ring

5. Vakuumbeholder af aluminium

6. Anordning til anbringelse og fjernelse af effusionsceller

7. Laag med gevind

8. Vingemoetrikker (6)

9. Bolte (6)

10. Effusionsceller af rustfrit staal

11. Opvarmningspatroner (6)

Figur 6a

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Eksempel paa et stroemningssystem til bestemmelse af damptryk efter gasmaetningsmetoden

1 = Flowregulator

2 = Varmeveksler

3 = Naaleventiler

4 = Foeler for relativ fugtighed

5 = Maetningskolonner

6 = PTFE-samlinger

7 = Flowmeter

8 = Faelde (absorber)

9 = Oliefaelde

10 = Bobleroer af glasfritte

Figur 6b

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Eksempel paa et system til bestemmelse af damptryk efter gasmaetningsmetoden med kapillarroer anbragt efter maetningskammeret

1. Termisk masseflowmeter

6. Gasmaetningskammer

2. Manometer

7. Kapillarroer

3. Kammer med temperaturstyring

8. Absorptionsbeholdere

4. Termostateringsspiral til baeregas

9. Gasmaaler

5. Termometer (Pt 100)

10. Kuldefaelde

Figur 7

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Eksempel paa forsoegsopstilling til metoden med roterende kugle Damptryksapparat

A. Maalehoved med roterende kugle

B. Proevecelle;

C. Termostat

D. Vakuumroer (turbopumpe)

E. Lufttermostat

Figur 8

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Eksempel paa maalehoved med roterende kugle

1. Kugle;

2. Evakueret roerformet forlaengelse af 6;

3. Permanentmagneter (2);

4. Spoler (2) for vertikal stabilisering;

5. Drivspoler (4);

6. Tilslutningsflange.

A. 5. OVERFLADESPAENDING

1. METODE

De beskrevne metoder er baseret paa OECD-testvejledningen (1). Grundprincipperne er anfoert i reference (2).

1.1. INDLEDNING

De beskrevne metoder anvendes til maaling af vandige oploesningers overfladespaending.

Ved udfoerelsen af denne test er det nyttigt at have forhaandsoplysninger om stoffets vandoploeselighed, struktur, hydrolyseegenskaber og kritiske koncentrationer for micelledannelse.

De foelgende metoder kan anvendes for de fleste kemiske stoffer uanset renheden.

Maaling af overfladespaending ved ringtensiometermetoden er begraenset til vandige oploesninger med en dynamisk viskositet paa mindre end ca. 200 mPa s.

1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER

Den frie overfladeenthalpi pr. overfladearealenhed betegnes som overfladespaendingen.

Overfladespaendingen angives i

N/m (SI-enhed)

eller mN/m (SI-underenhed) 1 N/m = 103 dyn/cm1 mN/m = 1 dyn/cm i det gamle cgs-system.

1.3. REFERENCESTOFFER

Anvendelse af referencestoffer er ikke paakraevet, hver gang et nyt stof skal undersoeges. Referencestoffer skal foerst og fremmest tjene til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater opnaaet med andre metoder.

Referencestoffer, som daekker et bredt udvalg af overfladespaendinger, er angivet i ref. 1 og 3.

1.4. METODERNES PRINCIP

Metoderne er baseret paa maaling af den stoerste kraft, der skal udoeves lodret paa en stigboejle eller ring i kontakt med vaeskeoverfladen af en proeve i et maalekar for, at denne kontakt brydes, eller den lodrette kraft, som skal udoeves paa en plade, hvis ene kant er i kontakt med proevens overflade, for at den dannede hinde brydes.

Stoffer, hvis oploeselighed i vand er mindst 1 mg/l, testes i vandig oploesning ved én koncentration.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Disse metoder kan give stoerre noejagtighed, end der maa forventes kraevet ved miljoevurderinger.

1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE

Der fremstilles en oploesning af stoffet i destilleret vand. Koncentrationen af denne oploesning skal vaere 90% af stoffets maetningskoncentration i vand; er denne koncentration stoerre end 1 g/l, benyttes der en koncentration paa 1 g/l til testen. Stoffer med en oploeselighed i vand paa mindre end 1 mg/l behoever ikke at testes.

1.6.1. Plademetoden

Se ISO 304 og NF T 73-060 (Surface Active Agents - Determination of Surface Tension by Drawing up Liquid Films).

1.6.2. Stigboejlemetoden

Se ISO 304 og NF T 73-060 (Surface Active Agents - Determination of Surface Tension by Drawing up Liquid Films).

1.6.3. Ringmetoden

Se ISO 304 og NF T 73-060 (Surface Active Agents - Determination of Surface Tension by Drawing up Liquid Films).

1.6.4. OECD-harmoniseret ringmetode

1.6.4.1. Apparatur

Kommercielt tilgaengelige tensiometre er tilstraekkelige til denne maaling. De bestaar af foelgende dele

- bevaegeligt proevebord

- kraftmaalingssystem

- maalelegeme (ring)

- maalekar.

1.6.4.1.1. Bevaegeligt proevebord

Det bevaegelige proevebord anvendes til understoettelse af det termostaterede maalekar, som rummer den vaeske, der skal undersoeges. Sammen med kraftmaalingssystemet er det monteret paa et stativ.

1.6.4.1.2. Kraftmaalingssystem

Kraftmaalingssystemet (se figuren) er placeret over proevebordet. Usikkerheden ved kraftmaalingen maa ikke overstige ± 10 6 N, svarende til en usikkerhed paa ± 0,1 mg ved en vejning. Oftest er maaleskalaen paa de kommercielt tilgaengelige tensiometre inddelt i mN/m, saaledes at overfladespaendingen direkte kan aflaeses i mN/m med en noejagtighed paa 0,1 mN/m.

1.6.4.1.3. Maalelegeme (ring)

Ringen er saedvanligvis fremstillet af en platin-iridium-traad med en tykkelse paa ca. 0,4 mm og en middelomkreds paa 60 mm. Traadringen er ophaengt vandret fra en metalstang og en traadbaerearm, som danner forbindelsen til kraftmaalingssystemet (se figuren).

Figur

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Maalelegeme (alle dimensioner er i mm)

1.6.4.1.4. Maalekar

Maalekarret, som rummer testoploesningen, skal vaere et termostateret glaskar. Det skal have en saadan form, at temperaturen af testoploesningen og gasfasen herover er konstant under maalingen, og at proeven ikke kan fordampe. Cylindriske glaskar med en indre diameter paa mindst 45 mm er acceptable.

1.6.4.2. Klargoering af apparatet

1.6.4.2.1. Rengoering

Glaskar rengoeres omhyggeligt. Om noedvendigt vaskes de foerst med varm chromsvovlsyre og dernaest med en tyktflydende phosphorsyreoploesning (83 til 98 w/w % H3PO4). Herefter skylles omhyggeligt i ledningsvand og endelig vaskes i redestilleret vand til neutral reaktion. Til sidst toerres karrene, eller de skylles i noget af den proevevaeske, som skal maales.

Ringen renses foerst grundigt i vand, saa alle vandoploeselige stoffer fjernes. Derefter nedsaenkes den et oejeblik i chromsvovlsyre, skylles i redestilleret vand til neutral reaktion og opvarmes til sidst et oejeblik over en methanolflamme.

Bemaerk

Forurening med stoffer, som ikke oploeses eller destrueres af chromsvovlsyre eller phosphorsyre, som f.eks. silikoner, fjernes ved hjaelp af et passende organisk oploesningsmiddel.

1.6.4.2.2. Kalibrering af apparatet

Apparatet klargoeres ved, at nulpunktet justeres, og apparatet indstilles til paalidelig aflaesning i mN/m.

Opstilling

Apparatet skal stilles i vater, f.eks. ved hjaelp af et vaterpas paa tensiometrets fod, idet man justerer stilleskruerne.

Nulpunktsindstilling

Efter montering af ringen i apparatet, men inden den nedsaenkes i vaesken, skal tensiometerviseren indstilles paa nul, og man kontrollerer, at ringen er parallel med vaeskeoverfladen. Til dette kan vaeskeoverfladen anvendes som et spejl.

Kalibreringer

Proevekalibrermngen kan udfoeres ved en af de foelgende to metoder

a) ved hjaelp af lodder: dette er en fremgangsmaade, hvor ryttere af kendt masse mellem 0,1 og 1,0 g anbringes paa ringen. Kalibreringsfaktoren OEa, som alle instrumentaflaesninger skal multipliceres med, bestemmes if oelge ligning (1)

fa = srsa(1)

hvor

sr = mg2b (mN/m)

m = rytterens masse (g)

g = tyngdeaccelerationen (981 cm 7s 2 ved havoverfladen)

b = ringens middelomkreds (cm)

óa = tensiometeraflaesningen efter anbringelse af rytteren paa ringen (mN/m)

b) ved hjaelp af vand: dette er en fremgangsmaade, hvor der anvendes rent vand, hvis overfladespaending ved f.eks. 23 C er 72,3 mN/m. Denne fremgangsmaade er hurtigere at udfoere end vaegtkalibreringen, men der er altid risiko for, at vandets overfladespaending er aendret ved forurening med spor af overfladeaktive stoffer.

Kalibreringsfaktoren OEb, som alle instrumentaflaesninger skal multipliceres med, bestemmes ifoelge ligning (2)

fb = sosg(2)

hvor

óo = litteraturvaerdi for vands overfladespaending (mN/m)

óg = maalt vaerdi for vands overfladespaending (mN/m) ved samme temperatur.

1.6.4.3. Testforberedelse

Der fremstilles vandige oploesninger med passende koncentrationer af de stoffer, som skal undersoeges. Oploesningerne maa ikke indeholde uoploest stof.

Oploesningerne holdes ved konstant temperatur (± 0,5 C). Idet en oploesnings overfladespaending aendres i maalekarret med tiden, maa der foretages adskillige maalinger paa forskellige tidspunkter, og der afsaettes en kurve, der viser overfladespaendingen som funktion af tiden. Naar overfladespaendingen ikke aendres yderligere, er ligevaegtstilstanden naaet.

Stoev og gasformig forurening med andre stoffer forstyrrer maalingen, hvorfor arbejdet boer udfoeres under et beskyttende daekke.

1.6.5. Testebetingelser

Maalingerne foretages ved ca. 20 C, og temperaturen skal holdes inden for ± 0,5 C.

1.6.6. Udfoerelse af testen

De oploesninger, som skal maales, fyldes i det omhyggeligt rengjorte maalekar, idet man undgaar skumning. Maalekarret anbringes paa apparatets proevebord. Bordet med maalekarret haeves, indtil ringen er nedsaenket fuldstaendigt i den oploesning, som skal maales. Derefter saenkes bordet jaevnt og gradvis (med en hastighed paa ca. 0,5 cm/min) for at loesrive ringen fra overfladen, indtil den stoerste kraft er naaet. Det vaeskelag, som haenger ved ringen, maa ikke fjernes fra denne. Naar maalingen er udfoert, nedsaenkes ringen atter i vaesken, og maalingen gentages, indtil der opnaas konstante vaerdier for overfladespaendingen. Den tid, der er gaaet fra overfoersel af oploesningen til maalekarret og til selve maalingen udfoeres, noteres ved hver bestemmelse. Aflaesningerne skal foretages ved den stoerste kraft, som kraeves til loesrivning af ringen fra vaeskeoverfladen.

2. DATA

For at beregne overfladespaendingen skal den vaerdi, som er aflaest i mN/m paa apparatet, foerst multipliceres med kalibreringsfaktoren OEa eller OEb (afhaengigt af den anvendte kalibreringsmetode). Dette giver en vaerdi, som kun gaelder tilnaermelsesvis, og som derfor kraever korrektion.

Harkins og Jordan (4) har empirisk bestemt korrektionsfaktorer for vaerdier af overfladespaendingen, som er bestemt med ringmetoden; disse faktorer afhaenger af ringens dimensioner, vaeskens massefylde og dens overfladespaending.

Da det er besvaerligt for hver enkelt maaling at bestemme korrektionsfaktoren ud fra Harkins og Jordans tabeller for at beregne overfladespaending, kan man for vandige oploesninger benytte en forenklet metode, hvor de korrigerede vaerdier for overfladespaendingen direkte aflaeses i den nedenstaaende tabel (der anvendes interpolation til aflaesninger, som ligger mellem tabelvaerdierne).

>TABELPOSITION>

Denne tabel er udarbejdet paa basis af Harkins-Jordan korrektioner, og ligner den, der er i DIN-standarden (DIN 53914) for vand og vandige oploesninger (massefylde ñ = 1 g/cm3) og for en kommerciel tilgaengelig ring med dimensionerne R = 9,55 mm (middelringradius) og r = 0,185 mm (ringtraadens radius). Tabellen angiver korrigerede vaerdier for overfladespaendingsmaalinger, der er foretaget efter kalibrering med lodder eller vand.

Alternativt kan overfladespaendingen uden forudgaaende kalibrering beregnes efter foelgende formel

s = 4 p Rf 7 F

hvor

F = kraften maalt paa dynamometeret, idet hinden brydes

R = ringens radius

f = korrektionsfaktoren (1).

3. RAPPORTERING

3.1. FORSOEGSRAPPORT

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- anvendt metode

- anvendt type vand eller oploesning

- noejagtig specifikation af stoffet (identitet og urenheder)

- maaleresultater: overfladespaending (aflaesning) med angivelse af baade de enkelte maalinger, deres middelvaerdi og den korrigerede middelvaerdi (med hensyn til apparatfaktoren og korrektionstabellen)

- oploesningens koncentration

- testtemperaturen

- den anvendte oploesnings alder, og specielt den tid, der er forloebet mellem fremstillingen af oploesningen og maalingen

- beskrivelse af overfladespaendingens tidsafhaengighed efter overfoersel til maalekarret

- alle oplysninger og bemaerkninger af betydning for vurdering af resultaterne, isaer vedroerende urenheder og stoffets fysiske tilstandsform.

3.2. FORTOLKNING AF RESULTATERNE

Paa baggrund af vands overfladespaending paa 72,75 mN/m ved 20 C anses stoffer med en overfladespaending paa mindre end 60 mN/m bestemt ved denne metode for at vaere overfladeaktive.

4. LITTERATURHENVISNINGER

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV.

(3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511.

(4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, 1751.

A.6 VANDOPLOESELIGHED

1. METODE

De beskrevne metoder er baseret paa OECD-testvejledningen (1).

1.1. INDLEDNING

Ved udfoerelse af denne test er det nyttigt at have forhaandsoplysninger om stoffets strukturformel, damptryk, dissociationskonstant og hydrolyse (som funktion af pH).

Der findes ikke én enkelt metode, der daekker hele omraadet af vandoploeselighed.

De to testmetoder, der er beskrevet nedenfor, daekker hele oploeselighedsomraadet, men egner sig ikke til flygtige stoffer

- en der kan anvendes til stoffer, som i det vaesentlige er rene, med lav oploeselighed ( 10 2 g/l), og som er stabile i vand, betegnet »kolbe-metoden«.

De undersoegte stoffers vandoploeselighed kan i betragtelig grad afhaenge af tilstedevaerelsen af urenheder.

1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER

Et stofs oploeselighed i vand angives ved maetningskoncentrationen af stoffet i vand ved en given temperatur. Oploeseligheden i vand angives i enheden masse pr. rumfang oploesning. SI-enheden er kg/m3 (g/l kan ogsaa anvendes).

1.3. REFERENCESTOFFER

Anvendelse af referencestoffer er ikke paakraevet, hver gang et nyt stof skal undersoeges. Referencestoffer skal foerst og fremmest tjene til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater opnaaet med andre metoder.

1.4. PROEVNINGSMETODENS PRINCIP

Ved en simpel foreloebig test undersoeges, omtrentligt hvor meget materiale og hvor lang tid der kraeves til at naa maetningskoncentrationen.

1.4.1. Kolonne-eluerings-metoden

Denne metode er baseret paa eluering af det undersoegte stof med vand fra en mikrokolonne, der indeholder et inert baeremateriale saasom glaskugler eller sand, belagt med overskud af teststof. Vandoploeseligheden bestemmes, naar koncentrationen i eluatet bliver konstant. Dette fremkommer som et koncentrationsplateau som en funktion af tiden.

1.4.2. Kolbe-metoden

Ved denne metode oploeses stoffet (faste stoffer pulveriseres) i vand ved en temperatur noget over testningstemperaturen. Naar maetning er opnaaet, afkoeles blandingen til testningstemperatur og holdes der under omroering saa laenge, som det er noedvendigt for at opnaa ligevaegt. Alternativt kan maalingen foretages direkte ved testningstemperaturen, hvis det ved passende proevetagning godtgoeres, at maetningsligevaegten er naaet. Derefter bestemmes massekoncentrationen af stoffet i den vandige oploesning, der ikke maa indeholde uoploeste partikler, ved en passende analysemetode.

1.5. KVALITETSKRITERIER

1.5.1. Repeterbarhed

For kolonne-eluerings-metoden er det muligt at opnaa 3% pr. C) udfoeres der ogsaa undersoegelser ved to andre temperaturer, der er mindst 10 C over og under den foerst valgte temperatur. I saa tilfaelde maa temperaturkontrollen vaere ± 0,1 C. Den valgte temperatur boer holdes konstant i alle relevante dele af udstyret.

1.6.2. Indledende test

Til ca. 0,1 g af proeven (faste stoffer maa vaere pulveriserede) i et 10 ml maaleglas med glasprop saettes stigende maengder destilleret vand ved stuetemperatur, efter de i tabellen nedenfor angivne trin.

>TABELPOSITION>

Efter hver tilsaetning af den angivne maengde vand til blandingen omrystes der kraftigt i 10 minutter, og det undersoeges visuelt, om der er noget uoploest af proeven tilbage. Hvis proeven eller dele af proeven forbliver uoploest, efter at der er tilsat 10 ml, gentages forsoeget i et 100 ml maaleglas med en stoerre vandmaengde. Ved lavere oploeseligheder kan den tid, der kraeves til oploesning af et givet stof, vaere betragteligt laengere (der boer ventes mindst 24 timer). Den anslaaede oploeselighed er angivet i tabellen under det rumfang af tilsat vand, der netop foraarsagede en fuldstaendig oploesning af proeven. Hvis stoffet stadig er tilsyneladende uoploest, oeges henstandstiden ud over de 24 timer (hoejst 96 timer), eller der foretages yderligere fortynding, saa det kan afgoeres, om det er kolonne-eluerings- eller kolbe-metoden, der skal anvendes.

1.6.3. Kolonne-eluerings-metoden

1.6.3.1. Baeremateriale, oploesningsmiddel og elueringsmiddel

Baerematerialet til kolonne-eluerings-metoden skal vaere inert. Mulige materialer, der kan anvendes, er glaskugler og sand. Der anvendes et passende flygtigt oploesningsmiddel af analysekvalitet til at overfoere teststoffet til baerematerialet. Som oploesningsmiddel anvendes der vand, der er dobbelt destilleret i glas- eller kvartsapparatur.

Bemaerk

Vand direkte fra en organisk ionbytter maa ikke anvendes.

1.6.3.2. Afsaetning paa baerematerialet

Ca. 600 mg baeremateriale afvejes og overfoeres til en 50 ml rundbundet kolbe.

En passende, afvejet maengde af proeven oploeses i det valgte oploesningsmiddel. En passende maengde af denne oploesning saettes til baerematerialet. Oploesningsmidlet skal afdampes fuldstaendigt, f.eks. i en rotationsinddamper; i modsat fald vil der ikke kunne opnaas maetning af baerematerialet med vand som foelge af fordelingseffekter paa overfladen af baerematerialet.

Afsaetningen paa baerematerialet kan give problemer (fejlagtige resultater), hvis det undersoegte stof afsaettes som en olie eller i en anden krystalstruktur. Dette problem maa undersoeges eksperimentelt, og resultaterne rapporteres.

Det behandlede baeremateriale henstilles til kvaeldning i ca. to timer i ca. 5 ml vand, hvorefter suspensionen overfoeres til mikrokolonnen. Alternativt kan det toerre behandlede baeremateriale haeldes i mikrokolonnen, der er fyldt med vand, og derefter henstaa i ca. to timer til opnaaelse af ligevaegt.

Testprocedure

Elueringen af stoffet fra baerematerialet kan udfoeres paa en af de to forskellige maader

- med recirkulationspumpe (se figur 1)

- med niveaubeholder (se figur 4).

1.6.3.3. Kolonne-eluerings-metoden med recirkulationspumpe

Apparatur

Et typisk system er vist skematisk i figur 1. En egnet mikrokolonne er vist i figur 2, omend en hvilken som helst stoerrelse kan anvendes, forudsat at den opfylder kriterierne for reproducerbarhed og foelsomhed. Kolonnen skal have et head-space paa mindst fem bed-volumen vand og kunne rumme mindst fem proever. Alternativt kan stoerrelsen reduceres, hvis der tilsaettes oploesningsmiddel som erstatning for de foerste fem bed-rumfang, der fjernes med urenheder.

Kolonnen skal forbindes til en recirkulationspumpe, der kan reguleres til en stroemningshastighed paa ca. 25 ml/h. Pumpen forbindes med tilslutning af polytetrafluoroethylen (PTFE) og/eller glas. Kolonnen og pumpen skal, naar de er forbundet, give mulighed for udtagning af proever af den eluerede vaeske og for indstilling af head-space-ligevaegt ved atmosfaeretryk. Kolonnematerialet holdes oppe med en lille (5 mm) prop af glasuld, der ogsaa fungerer som filter for partikler. Recirkulationspumpen kan f.eks. vaere en slangepumpe (man maa vaere omhyggelig med ikke at faa kontaminering af og/eller sorption paa slangematerialet) eller en membranpumpe.

Fremgangsmaade ved maalingen

Vaeskestroemmen gennem kolonnen startes. Det anbefales at bruge en stroemningshastighed paa ca. 25 ml/h (hvilket svarer til ca. ti bed-rumfang pr. time for den beskrevne kolonne). De foerste fem bed-rumfang (minimum) bortkastes, saa vandoploeselige urenheder fjernes. Derefter koerer recirkulationspumpen, til der er opnaaet ligevaegt, defineret ved at fem paa hinanden foelgende proever giver koncentrationer, der ikke afviger mere end ± 30 % paa tilfaeldig maade. Disse proever boer vaere adskilt fra hinanden ved tidsintervaller, der svarer til et gennemloeb af mindst ti bed-rumfang af oploesningsmiddel.

1.6.3.4. Kolonne-eluerings-metoden med niveaubeholder

Apparatur (se figur 4 og 3)

Niveaubeholder: Forbindelsen til niveaubeholderen etableres ved at anvende et glasslibovergangsstykke, der tilsluttes med en PTFE-slange. Det anbefales, at der anvendes en gennemstroemningshastighed paa ca. 25 ml/time. Successive fraktioner af eluatet opsamles og analyseres efter den valgte metode.

Fremgangsmaade ved maalingen

De fraktioner fra det midterste elueringsomraade, hvor koncentrationerne er konstante (± 30 %) i mindst fem paa hinanden foelgende proever, anvendes til at bestemme oploeseligheden i vand.

I begge tilfaelde (anvendelse af recirkulationspumpe eller niveaubeholder) udfoeres endnu et forsoeg med halvt saa hoej gennemstroemningshastighed som det foerste. Hvis resultaterne fra de to forsoeg stemmer overens, er testen tilfredsstillende; hvis der er en stoerre oploeselighed ved den lavere hastighed, maa halveringen af gennemstroemningshastigheden fortsaettes, indtil to paa hinanden foelgende forsoeg giver samme oploeselighed.

I begge tilfaelde (anvendelse af recirkulationspumpe eller niveaubeholder) kontrolleres fraktionerne for tilstedevaerelse af kolloidt materiale ved hjaelp af Tyndall-effekten (lysspredning). Tilstedevaerelse af saadanne partikler goer resultaterne ubrugelige, og testen maa gentages efter forbedring af kolonnens filtreringsformaaen.

pH i alle proever registreres. Der udfoeres endnu et forsoeg ved samme temperatur.

1.6.4. Kolbe-metoden

1.6.4.1. Apparatur

Til kolbe-metoden kraeves foelgende udstyr

- normalt laboratorieglasudstyr og -instrumentering

- udstyr til rystning/omroering af oploesninger ved kontrolleret konstant temperatur

- eventuelt en centrifuge (helst termostateret) til emulsioner og

- udstyr til analytisk bestemmelse.

1.6.4.2. Fremgangsmaade ved maalingen

Den maengde materiale, der er noedvendig for at maette det oenskede rumfang vand, anslaas ud fra den foreloebige test. Det fornoedne rumfang vand vil afhaenge af den analytiske metode og oploeselighedsomraadet. Ca. fem gange den maengde stof, der er bestemt ovenfor, afvejes i hver af tre beholdere med glasprop (f.eks. centrifugeglas eller kolber). Det valgte rumfang vand saettes til hver beholder, og beholderne lukkes helt taet. De lukkede beholdere rystes/omroeres derefter ved 30 C. (Der anvendes ryste- eller omroererudstyr, som kan operere ved konstant temperatur, f.eks. magnetomroering i et termostatbad). Efter en dag fjernes én af beholderne, og den henstilles til opnaaelse af ligevaegt i 24 timer ved den oenskede temperatur og lejlighedsvis omrystning. Indholdet i beholderen centrifugeres derefter ved testtemperaturen, og koncentrationen af stoffet i den klare vandige fase bestemmes med en passende analysemetode. De andre to kolber behandles paa samme maade efter forudgaaende opnaaelse af ligevaegt ved 30 C i henholdsvis to og tre dage. Hvis koncentrationsresultaterne fra mindst to af beholderne opfylder den kraevede reproducerbarhed, er testen tilfredsstillende. Hvis resultaterne fra beholder 1, 2 og 3 viser en stigende tendens, gentages hele forsoeget under anvendelse af laengere tider til opnaaelse af ligevaegt.

Maaleproceduren kan ogsaa udfoeres uden forudgaaende henstand ved 30 C. Der opnaas et skoen over, hvor hurtigt maetningsligevaegten indstiller sig, ved udtagning af proever, indtil omroeringstiden ikke laengere indvirker paa proeveoploesningens koncentration.

pH i alle proever registreres.

1.6.5. Analyse

Der foretraekkes en stofspecifik analysemetode til disse bestemmelser, eftersom smaa maengder af oploeselige urenheder kan foraarsage store fejl i den maalte oploeselighed. Eksempler paa saadanne metoder er gas- eller vaeskechromatografi, titreringsmetoder, fotometriske metoder og voltametriske metoder.

2. DATA

2.1. KOLONNE-ELUERINGS-METODEN

Middelvaerdien samt standardafvigelsen for mindst fem paa hinanden foelgende proever taget ved maetningsplateauet udregnes for hvert forsoeg. Resultaterne anfoeres i masseenhed pr. volumenenhed oploesning.

Gennemsnittene fra to forsoeg med forskellige stroemningshastigheder sammenlignes, og repeterbarheden skal vaere bedre end 30 %.

2.2. KOLBE-METODEN

De enkelte resultater skal angives for hver af de tre kolber, og for de resultater, der skoennes at vaere konstante (repeterbarhed bedre end 15 %), beregnes gennemsnittet, og det angives i masseenhed pr. volumenenhed oploesning. Dette kan kraeve omregning af masseenhed til volumenenhed ved hjaelp af massefylden, hvis oploeseligheden er meget hoej (>100 g/l).

3. RAPPORTERING

3.1. KOLONNE-ELUERINGS-METODEN

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- resultaterne af den foreloebige test

- noejagtig specifikation af stoffet (identitet og urenheder)

- koncentration, gennemstroemningshastighed og pH for hver enkelt proeve

- middelvaerdi og standardafvigelse for mindst fem proever fra maetningsplateauet fra hvert forsoeg

- gennemsnittet af to successive, acceptable forsoeg

- vandtemperaturen under maetningsprocessen

- den anvendte analysemetode

- arten af det anvendte baeremateriale

- afsaetning paa baerematerialet

- anvendt oploesningsmiddel

- tegn paa eventuel kemisk ustabilitet af stoffet under testen og den anvendte metode

- alle oplysninger af betydning for vurdering af resultaterne, isaer vedroerende urenheder og stoffets fysiske tilstandsform.

3.2. KOLBE-METODEN

Testrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- resultaterne af den foreloebige test

- noejagtig specifikation af stoffet (identitet og urenheder)

- de enkelte analyseresultater og gennemsnittet, naar der er bestemt mere end én vaerdi for hver kolbe

- pH i hver proeve

- gennemsnitsvaerdien for de forskellige kolber, der stemte overens

- analysetemperaturen

- den anvendte analysemetode

- tegn paa eventuel kemisk ustabilitet af stoffet under testen og den anvendte metode

- alle oplysninger af betydning for vurdering af resultaterne, isaer vedroerende urenheder og stoffets fysiske tilstandsform.

4. LITTERATURHENVISNINGER

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility - Column elution method.

(3) NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility - Flask method.

Tillaeg

Figur 1

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Kolonne-eluerings-metoden med recirkulationspumpe

Figur 2

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

En typisk mikrokolonne (alle dimensioner er i mm)

Figur 3

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

En typisk mikrokolonne (alle dimensioner er i mm)

Figur 4

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Kolonne-eluerings-metoden med niveaubeholder

1 = Niveaubeholder (f.eks. 2,5 l standflaske)

2 = Kolonne (se figur 3)

3 = Fraktionssamler

4 = Termostat

5 = Teflonslange

6 = Glasslibforbindelse

7 = Vandslange (mellem termostat og kolonne, indre diameter: ca. 8 mm).

A.8 FORDELINGSKOEFFICIENT

1. METODE

Den beskrevne »rystekolbemetode« er baseret paa OECD-testvejledningen (1).

1.1. INDLEDNING

Ved udfoerelse af denne test er det nyttigt at have forhaandsoplysninger om stoffets strukturformel, dissociationskonstant, vandoploeselighed, hydrolyse, oploeselighed i n-octanol og overfladespaending.

Maalinger paa ioniserbare stoffer udfoeres paa den ikke-ioniserede form (fri syre eller fri base) dvs. ved anvendelse af en passende buffer med en pH-vaerdi paa mindst 1 enhed under (fri syre) eller over (fri base) stoffets pK-vaerdi.

Testmetoden omfatter to saerskilte fremgangsmaader - rystekolbemetoden og hoejtydende vaeskekromatografi (HPLC). Foerstnaevnte er brugbar, naar vaerdien af log Pow (se definitionerne nedenfor) ligger mellem 2 og 4, og sidstnaevnte i omraadet mellem 0 og 6. Foerend nogen af fremgangsmaaderne paabegyndes, foretages der er foreloebigt skoen over fordelingskoefficienten.

Rystekolbemetoden kan kun benyttes for stoffer, der i alt vaesentligt er rene, og som er oploeselige i vand og n-octanol. Den kan ikke anvendes til overfladeaktive materialer (for hvilke der anfoeres en beregnet vaerdi eller et skoen baseret paa oploeseligheden i henholdsvis n-octanol og vand).

HPLC-metoden kan ikke benyttes til staerke syrer og baser, metalkomplekser, overfladeaktive stoffer og stoffer, der reagerer med elueringsmidlet. For saadanne materialer anfoeres der en beregnet vaerdi eller et skoen baseret paa oploeseligheden i henholdsvis n-octanol og vand.

HPLC-metoden er mindre foelsom end rystekolbemetoden over for urenheder i teststoffet. Ikke desto mindre kan urenheder i visse tilfaelde vanskeliggoere fortolkningen af resultaterne paa grund af usikker tilforordning af toppene. For blandinger med et uoploest baand anfoeres en oevre og nedre graense for log P.

1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER

Fordelingkoefficienten (P) defineres som forholdet mellem ligevaegtskoncentrationerne (ci) af et stof, der er oploest i et tofasesystem bestaaende af to stort set ublandbare oploesningsmidler. I tilfaeldet n-octanol og vand Pow = cn-octanolcvand Fordelingskoefficienten (P) er derfor et forhold mellem to koncentrationer og opgives ofte som titalslogaritmen (log P).

1.3. REFERENCESTOFFER

Rystekolbemetoden

Anvendelse af referencestoffer er ikke paakraevet, hver gang et nyt stof skal undersoeges. Referencestoffer skal foerst og fremmest tjene til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater opnaaet med andre metoder.

HPLC-metoden

For at kunne korrelere maalte HPLC-data for et stof med dets P-vaerdi maa der fastlaegges en kalibreringskurve for log P mod kromatografiske data, som er baseret paa mindst seks referencepunkter. Det er op til brugeren at vaelge de egnede referencestoffer. Saa vidt muligt skal der vaere mindst ét referencestof med en Pow-vaerdi, der ligger over teststoffets, og mindst ét med en Pow-vaerdi under teststoffets. For vaerdier af log P under 4 kan kalibreringen baseres paa data opnaaet med rystekolbemetoden. For vaerdier af log P over 4 kan kalibreringen baseres paa validerede litteraturvaerdier, hvis de stemmer overens med beregnede vaerdier. Af hensyn til noejagtigheden anbefales at vaelge referencestoffer, der strukturmaessigt ligner teststoffet.

Der foreligger omfattende lister med vaerdier for log Pow for mange grupper af kemikalier (2)(3). Hvis der ikke foreligger data om fordelingskoefficienter for strukturmaessigt beslaegtede stoffer, kan der bruges en mere generel kalibrering foretaget med andre referencestoffer.

Der er i tillaeg 2 en liste over anbefalede referencestoffer og deres Pow-vaerdier.

1.4. METODENS PRINCIP

1.4.1. Rystekolbemetoden

For at kunne bestemme fordelingskoefficienten maa der opnaas ligevaegt mellem alle komponenterne i systemet, og koncentrationerne af de i de to faser oploeste stoffer maa bestemmes. En gennemgang af litteraturen herom har vist, at der kan benyttes en raekke forskellige teknikker til at loese dette problem, dvs. omhyggelig blanding af de to faser og bestemmelse af ligevaegtskoncentrationen af det undersoegte stof efter adskillelse af faserne.

1.4.2. HPLC-metoden

HPLC udfoeres paa analytiske kolonner pakket med en kommercielt tilgaengelig fast fase indeholdende lange kulbrintekaeder (f.eks. C8, C18) kemisk bundet til silica. Indsproejtes der kemikalier paa en saadan kolonne, vil de vandre gennem den med forskellig hastighed, da deres fordeling mellem den mobile fase og den stationaere kulbrintefase ikke er den samme. Kemikalieblandinger elueres i raekkefoelge efter hydrofobicitet, idet de vandoploeselige kemikalier elueres foerst og de olieoploeselige sidst, alt efter deres kulbrinte/vand-fordelingskoefficient. Derved kan sammenhaengen mellem retentionstiden paa en saadan kolonne (med omvendt fase) og n-octanol/vand-fordelingskoefficienten fastslaas. Fordelingskoefficienten udledes af kapacitetsfaktoren k, der er givet ved udtrykket

k = tR t0t0

hvor

tR er teststoffets retentionstid og t0 er den tid, et oploesningsmiddelmolekyle i gennemsnit bruger paa at komme gennem kolonnen (kolonnens doedtid).

Der kraeves ikke kvantitative analysemetoder, og det er kun noedvendigt at bestemme retentionstiderne.

1.5. KVALITETSKRITERIER

1.5.1. Repeterbarhed

Rystekolbemetoden

For at opnaa en tilstraekkeligt noejagtig fordelingskoefficient foretages der dobbeltbestemmelse under tre forskellige testbetingelser, hvor baade stofmaengden og forholdet mellem oploesningsmidlerne kan varieres. De fundne vaerdier af fordelingskoefficienten skal, naar de udtrykkes som titalslogaritmer, ligge inden for et interval paa ± 0,3.

HPLC-metode

For at oege tilliden til maalingen foretages der dobbeltbestemmelse. Vaerdier af log P beregnet ud fra de enkelte maalinger skal ligge inden for et interval paa ± 0,1.

1.5.2. Foelsomhed

Rystekolbemetoden

Metodens maaleomraade afgraenses af analysemetodens paavisningsgraense. Den skal tillade bestemmelse af vaerdier for log Pow i omraadet fra 2 til 4 (under visse omstaendigheder op til 5), naar koncentrationen af oploest stof ikke er stoerre end 0,01 mol pr. liter i nogen af faserne.

HPLC-metoden

Med HPLC-metoden kan der skoennes fordelingskoefficienter i log Pow-omraadet fra 0 til 6.

Normalt kan en forbindelses fordelingskoefficient skoennes med en afvigelse paa mindre end ± 1 fra den vaerdi, der opnaas med rystekolbemetoden. Typiske korrelationer fremgaar af litteraturen (4)(5)(6)(7)(8). Der kan normalt opnaas stoerre noejagtighed, hvis der anvendes korrelationskurver bestemt med strukturmaessigt beslaegtede referencestoffer (9).

1.5.3. Specificitet

Rystekolbemetoden

Nernsts fordelingslov gaelder kun for fortyndede oploesninger ved konstant temperatur, tryk og pH. Den gaelder kun for et enkelt stof, der er fordelt mellem to rene oploesningsmidler. Hvis der forekommer flere oploeste stoffer i den ene eller i begge faser samtidig, kan dette paavirke resultaterne.

Dissociering eller associering af de oploeste molekyler resulterer i afvigelser fra Nernsts fordelingslov. At fordelingskoefficienten afhaenger af oploesningens koncentration er tegn paa en saadan afvigelse.

Paa grund af de mange involverede ligevaegte, maa metoden ikke anvendes paa ioniserbare stoffer uden korrektion. For saadanne stoffer kan det overvejes at benytte bufferoploesninger i stedet for vand; i saa fald skal bufferens pH ligge mindst 1 enhed fra stoffets pKa, og dette pH's relevans for miljoeet skal overvejes.

1.6. BESKRIVELSE AF METODEN

1.6.1. Indledende skoen over fordelingskoefficienten

Der kan dannes et skoen over fordelingskoefficienten enten ved beregning (se tillaeg 1), hvilket foretraekkes, eller i givet fald ud fra teststoffets oploeselighed i de rene oploesningsmidler (10).

1.6.2. Rystekolbemetoden

1.6.2.1. Forberedelser

n-octanol: bestemmelsen af fordelingskoefficienten udfoeres med reagenser af analysekvalitet.

vand: der anvendes vand, som er destilleret eller dobbeltdestilleret i glas- eller kvartsapparatur. Til ioniserbare forbindelser benyttes der bufferoploesninger i stedet for vand, hvis der er gode grunde hertil.

Bemaerk Der maa ikke bruges vand taget direkte fra en ionbytter.

1.6.2.1.1. Formaetning af oploesningsmidlerne

Foer en fordelingskoefficient bestemmes, maettes hver af de faser, der indgaar i oploesningsmiddelsystemet, med den anden fase ved rystning ved forsoegstemperaturen. Hertil er det praktisk at ryste to store standflasker med henholdsvis n-octanol af analysekvalitet og vand med tilstraekkelig meget af det andet oploesningsmiddel paa et mekanisk rysteapparat i 24 timer, og derefter lade dem henstaa saa laenge, at faserne skiller og der er opnaaet maetning.

1.6.2.1.2. Forberedelse af testen

Testbeholderen skal vaere naesten helt fyldt af tofasesystemet. Derved hindres materialetab ved fordampning. Stofmaengder og volumenforhold fastlaegges paa grundlag af

- det foreloebige skoen over fordelingskoefficienten (se ovenfor)

- den maengde teststof, der mindst kraeves til analysen

- en oevre koncentrationsgraense paa 0,01 mol/l for begge faser.

Der udfoeres tre tests. I den foerste bruges det beregnede volumenforhold mellem n-octanol og vand; i den anden divideres dette forhold med 2 og i det tredje multipliceres det med 2 (f.eks. 1:1, 1:2 og 2:1).

1.6.2.1.3. Teststof

Der fremstilles en stamoploesning i n-octanol, der paa forhaand er maettet med vand. Denne stamoploesnings koncentration bestemmes noejagtigt, inden den anvendes til bestemmelse af fordelingskoefficienten. Den opbevares under betingelser, hvor den er stabil.

1.6.2.2. Testbetingelser

Testtemperaturen skal holdes konstant (± 1 C) og ligge mellem 20 og 25 C.

1.6.2.3. Fremgangsmaade ved maalingen

1.6.2.3.1. Opnaaelse af fordelingsligevaegt

For hver af testbetingelserne benyttes der to testbeholdere, der hver indeholder den noedvendige noejagtigt afmaalte maengde af de to oploesningsmidler og den noedvendige maengde stamoploesning.n-octanolfaserne afmaales volumetrisk. Testbeholderne kan enten anbringes i et egnet rysteapparat eller rystes i haanden. Naar et centrifugeglas benyttes, anbefales en hurtig 180 drejning om tvaeraksen af glasset, hvorved den indespaerrede luft stiger op gennem de to faser. Erfaringen viser, at 50 saadanne drejninger normalt er tilstraekkeligt til, at fordelingsligevaegten indtraeder. For en sikkerheds skyld anbefales det at foretage 100 drejninger i loebet af 5 minutter.

1.6.2.3.2. Faseadskillelse

Blandingen kan om noedvendigt centrifugeres, saa faserne adskilles. Det goeres i en laboratoriecentrifuge ved stuetemperatur; hvis der benyttes en centrifuge uden temperaturregulering, henstaar centrifugeglassene i én time ved testtemperaturen til opnaaelse af ligevaegt foer analyse.

1.6.2.4. Analyse

Til bestemmelse af fordelingskoefficienten maa koncentrationen af teststoffet i begge faser bestemmes. Det kan goeres ved, at der for hver testbetingelse udtages en delproeve af hver fase fra hvert glas, som analyseres ved den valgte metode. Den samlede maengde stof i begge faser beregnes og sammenlignes med den oprindeligt tilsatte stofmaengde.

Proeven af vandfasen udtages paa en saadan maade, at risikoen for, at den indeholder spor af n-octanol, bliver minimal, nemlig med en glasinjektionssproejte. Fra starten skal sproejten vaere delvis fyldt med luft, som langsomt trykkes ud, medens kanylen foeres ned gennem n-octanollaget. En passende maengde af vandfasen suges op i sproejten, som hurtigt traekkes op af oploesningen, og kanylen fjernes. Sproejtens indhold kan nu benyttes som den vandige proeve. Koncentrationen i de to adskilte faser skal helst bestemmes ved en stofspecifik metode. Eksempelvis er foelgende analysemetoder egnede

- fotometriske metoder

- gaskromatografi

- hoejtydende vaeskekromatografi (HPLC).

1.6.3. HPLC-metode

1.6.3.1. Forberedelser

Apparatur

Der kraeves en vaeskekromatograf med pulsationsfri pumpe og passende detektionssystem. Det anbefales at bruge injektionsventil med injektionsspiral. Polaere grupper i den stationaere fase kan nedsaette HPLC-kolonnens ydeevne vaesentligt. Derfor maa stationaere faser have det lavest mulige procentindhold af polaere grupper (11). Der kan anvendes kommercielle mikroniserede pakkematerialer med omvendt fase eller faerdigpakkede kolonner. Der kan eventuelt anbringes en beskyttelseskolonne mellem injektionssystemet og analysekolonnen.

Mobil fase

Der anvendes methanol og vand af HPLC-kvalitet til fremstilling af elueringsvaesken, som afgasses foer brugen. Der benyttes isokratisk eluering. Den anvendte methanol/vand-blanding skal indeholde mindst 25 % vand. Til eluering af forbindelser med en log P paa 6 paa én time ved en flowhastighed paa 1 ml/min vil en blanding af methanol og vand i forholdet 3:1 (v/v) typisk vaere tilfredsstillende. For forbindelser med en hoej log P-vaerdi kan det vaere noedvendigt at nedsaette elueringstiden (ogsaa for referencestofferne) ved at benytte en mindre polaer mobil fase eller en kortere kolonne.

Stoffer med meget lav oploeselighed i n-octanol har tendens til at give unormalt lave vaerdier for log Pow med HPLC-metoden; undertiden foelger saadanne forbindelsers toppe oploesningsmiddelfronten. Dette skyldes sandsynligvis, at fordelingsprocessen er for langsom til, at der opnaas ligevaegt inden for den tid, en HPLC-adskillelse normalt tager. I saa fald kan nedsaettelse af flowhastigheden og/eller mindskelse af methanol/vand-forholdet vaere et virkningsfuldt middel til at opnaa en paalidelig vaerdi.

Baade teststof og referencestoffer skal vaere oploeselige i den mobile fase i en saa hoej koncentration, at de kan paavises. Der maa kun undtagelsesvis benyttes tilsaetningsstoffer til methanol/vand-blandingen, da tilsaetningsstoffer vil aendre kolonnens egenskaber. Til kromatogrammer med tilsaetningsstoffer skal der altid anvendes en separat kolonne af samme type. Hvis methanol/vand ikke er egnet, kan der anvendes andre blandinger af vand og organiske oploesningsmidler, f.eks. ethanol/vand eller acetonitril/vand.

For ioniserbare stoffer er elueringsvaeskens pH kritisk. Det skal ligge inden for kolonnens driftsomraade, som normalt er fra 2 til 8. Det anbefales at anvende buffer. Man maa vaere omhyggelig med at undgaa saltudfaeldning og oedelaeggelse af kolonnen, hvilket kan forekomme med visse blandinger af organisk fase og buffer. Det tilraades ikke at foretage HPLC-maalinger med silicabaserede stationaere faser med pH over 8, da alkalisk mobil fase kan foere til, at kolonnens ydeevne hurtigt falder.

Oploeste stoffer

Referencestoffer skal vaere af renest mulige kvalitet. Til testnings- og kalibreringsformaal oploeses stofferne om muligt i den mobile fase.

Testningsbetingelser

Under maalingen maa temperaturen ikke variere med mere end ± 2 K.

1.6.3.2. Maaling

Beregning af doedtiden t0

Doedtiden t0 kan bestemmes enten med en homolog raekke (f.eks. n-alkylmethylketoner) eller med organiske stoffer, der ikke holdes tilbage (f.eks. thiourinstof eller formamid). Til beregning af doedtiden t0 ud fra en homolog raekke, indsproejtes der mindst syv elementer af en homolog raekke, og retentionstiderne bestemmes. Bruttoretentionstiderne tr(nc + 1) afbildes mod tr(nc), og i regressionsligningen

tr(nc + 1) = a + b tr(nc)

bestemmes afskaeringen a og haeldningskoefficienten b (nc = antallet af kulstofatomer). Doedtiden er da givet ved

t0 = a / (1b)

Kalibreringskurve

Naeste trin bestaar i at konstruere en korrelationskurve af log k mod log P for passende referencestoffer. I praksis indsproejtes der samtidig mellem fem og ti standardreferencestoffer, hvis log P ligger i det forventede omraade, og retentionstiderne bestemmes, helst med en integrationsskriver, der er koblet til detektionssystemet. De tilsvarende logaritmer til kapacitetsfaktorerne, log k, beregnes og afsaettes mod den log P, der er bestemt ved rystekolbemetoden. Kalibreringen foretages regelmaessigt, mindst én gang dagligt, saa der kan tages hoejde for eventuelle aendringer i kolonnens ydeevne.

Bestemmelse af teststoffets kapacitetsfaktor

Teststoffet indsproejtes som en saa lille maengde mobil fase som mulig. Retentionstiden bestemmes (dobbeltbestemmelse), hvorved kapacitetsfaktoren k kan beregnes. Ud fra korrelationskurven over referencestofferne kan teststoffets fordelingskoefficient interpoleres. Ved meget lave og meget hoeje fordelingskoefficienter er det noedvendigt at ekstrapolere. I saadanne tilfaelde maa man vaere saerlig opmaerksom paa regressionslinjens konfidensgraenser.

2. DATA

Rystekolbemetoden

De maalte P-vaerdiers paalidelighed kan kontrolleres ved sammenligning af gennemsnittet af dobbeltbestemmelserne med det samlede gennemsnit.

3. RAPPORTERING

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- noejagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)

- en beregnet vaerdi eller et skoen baseret paa de enkelte oploeseligheder, hvis metoderne ikke kan anvendes (f.eks. overfladeaktivt materiale)

- alle oplysninger og bemaerkninger af betydning for vurdering af resultaterne isaer vedroerende urenheder og stoffets fysiske tilstand.

For rystekolbemetoden

- resultatet af et eventuelt indledende skoen

- den temperatur, som bestemmelsen er foretaget ved

- data om de analysemetoder, der er benyttet til koncentrationsbestemmelser

- eventuel centrifugeringstid og -hastighed

- maalte koncentrationer i begge faser for hver bestemmelse (der skal saaledes rapporteres i alt tolv koncentrationer)

- massen af teststof, det anvendte volumen af hver fase i hver testbeholder og den samlede beregnede maengde teststof i hver fase efter indstilling af ligevaegt

- den beregnede vaerdi for fordelingskoefficienten (P) og gennemsnittet for hvert saet testbetingelser samt gennemsnittet af samtlige bestemmelser. Eventuelle tegn paa, at fordelingskoefficienten er koncentrationsafhaengig anfoeres i rapporten

- de enkelte P-vaerdiers standardafvigelse fra gennemsnittet

- gennemsnitsvaerdien af P fra alle bestemmelser anfoeres tillige som titalslogaritmen

- den beregnede teoretiske vaerdi af Pow, naar denne vaerdi er bestemt eller naar den maalte vaerdi er >

104

- pH af det anvendte vand og af vandfasen under forsoeget

- begrundelse for anvendelse af buffere i stedet for vand, deres sammensaetning, koncentration og pH, samt vandfasens pH foer og efter forsoeget.

For HPLC-metoden

- resultatet af et eventuelt foreloebigt skoen

- test- og referencestoffer og deres renhedsgrad

- det temperaturinterval, som bestemmelserne er foretaget ved

- det pH, som bestemmelserne er foretaget ved

- detaljerede oplysninger om analyse- og beskyttelseskolonne, mobil fase og detektionssystem

- retentionsdata og litteraturvaerdier for log P for referencestoffer benyttet ved kalibrering

- detaljerede oplysninger om den fittede regressionslinje (log k mod log P)

- gennemsnitlige retentionsdata og interpoleret log P-vaerdi for teststoffet

- beskrivelse af udstyr og driftsbetingelser

- elueringsprofiler

- den maengde test- og referencestof, der er indfoert i kolonnen

- doedtiden og hvordan den er maalt.

4. LITTERATURHENVISNINGER

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979.

(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir.) - Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.

(4) L. Renberg, G. Sundstroem and K. Sundh-Nygaerd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683.

(5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219 (1981).

(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.

(7) W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.

(8) J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675.

(9) S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787.

(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339.

(11) R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479.

(12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

(13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977.

(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use - Determination of partition coefficient - Flask shaking method.

(15) C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.

(16) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

(17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207.

(18) W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1113.

(19) D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382.

(20) J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivitaet von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979.

(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam 1984.

(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel 1978.

(23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.

Tillaeg 1

Metoder til beregning/estimering

INDLEDNING

I Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a) er der en generel indfoering i beregningsmetoder samt data og eksempler.

Beregnede vaerdier for Pow kan benyttes

- til at afgoere, hvilken forsoegsmetode der er mest velegnet (rystekolbemetoden: log Pow 2 til 4; HPLC-metoden: log Pow 0 til 6)

- til at vaelge de bedste forsoegsbetingelser (f.eks. referencestoffer til HPLC-metoden og volumenforholdet mellem n-octanol og vand til rystekolbemetoden)

- som intern laboratoriekontrol for eventuelle forsoegsfejl

- til at give et skoen over Pow i de tilfaelde, hvor man af tekniske aarsager ikke kan anvende eksperimentelle metoder.

ESTIMERINGSMETODER

Foreloebigt skoen over fordelingskoefficienten

Der kan foretages et skoen over vaerdien af fordelingskoefficienten ved hjaelp af teststoffets oploeselighed i de rene oploesningsmidler

Hertil benyttes

Pestimeret = maetnings cn-octanol maetnings cvand

BEREGNINGSMETODER

Princippet bag beregningsmetoderne

Alle beregningsmetoder er baseret paa formel fragmentering af molekylet i passende delstrukturer, for hvilke man har paalideligt kendskab til log Pow-bidrag. Log Pow for hele molekylet beregnes dernaest som summen af fragmentvaerdierne plus summen af korrektionsudtryk for intramolekylaere vekselvirkninger.

Der foreligger lister over fragmentkonstanter og korrektionsudtryk (b)(c)(d)(e). Nogle af dem ajourfoeres regelmaessigt (b).

Kvalitetskriterier

Saedvanligvis aftager beregningsmetodens paalidelighed med, at det undersoegte stofs kompleksitet stiger. For simple molekyler med lav molekylvaegt og en eller to funktionelle grupper kan der forventes en afvigelse paa 0,1 til 0,3 mellem resultatet af forskellige fragmenteringsmetoder og den maalte vaerdi for log Pow. Fejlmargenen kan vaere stoerre for mere komplekse molekyler. Den afhaenger af, om der foreligger fragmentkonstanter og hvor paalidelige de er, samt af, om intramolekylaere vekselvirkninger (f.eks. hydrogenbindinger) erkendes, og om korrektionsudtrykkene anvendes korrekt (mindre problematisk med computerprogrammet CLOGP-3) (b). For ioniserbare forbindelsers vedkommende har det stor betydning, at ladningen eller ioniseringsgraden bedoemmes korrekt.

Fremgangsmaade ved beregningen

Hansch's ð-metode

Den oprindelige konstant for hydrofobe substituenter, ð, som indfoertes af Fujita m.fl. (f), defineres ved

px = log Pow (PhX) log Pow (PhH)

hvor Pow(PhX) er fordelingskoefficienten for et aromatisk derivat og Pow(PhH) er stamforbindelsens fordelingskoefficient

(f.eks. ðCl = log Pow (C6H5Cl) log Pow (C6H6)= 2,84 2,13 = 0,71).

Ifoelge sin definition gaelder ð-metoden navnlig for aromatisk substitution. Der findes tabeller med ð-vaerdier for en lang raekke substituenter (b)(c)(d). De benyttes til beregning af log Pow for aromatiske molekyler og delstrukturer.

Rekkers metode

Efter Rekker (g) beregnes vaerdien af log Pow saaledes

log Pow = Siai fi + Sj (vekselvirkningsudtryk)

hvor fi er de forskellige molekylfragmentkonstanter og ai er den hyppighed, hvormed de forekommer i det paagaeldende molekyle. Korrektionsudtrykkene kan udtrykkes som et heltalsmultiplum af én enkelt konstant Cm (den saakaldte »magiske konstant«). Fragmentkonstanterne fi og Cm er bestemt paa grundlag af en liste med 1 054 eksperimentelt bestemte vaerdier af Pow (825 forbindelser) ved hjaelp af flerdimensional regressionsanalyse (c)(h). Vekselvirkningsudtrykkene bestemmes efter faste regler, der er beskrevet i litteraturen (e)(h)(i).

Hansch-Leo's metode

Efter Hansch og Leo (c) beregnes vaerdien af log Pow saaledes

log Pow = Siai fi + Sj bj Fj

hvor fi er de forskellige molekylfragmentkonstanter, Fj er korrektionsudtrykkene, og ai og bj er de hertil hoerende hyppigheder. Ud fra eksperimentelt bestemte vaerdier af Pow har man ved at proeve sig frem kunnet opstille en liste over atom- og gruppefragmentvaerdier og en liste over korrektionsudtryk Fj (saakaldte »faktorer«). Korrektionsudtrykkene er ordnet i flere forskellige klasser (a)(c). Det er forholdsvis kompliceret og tidkraevende at tage hensyn til alle regler og korrektionsudtryk. Der er udviklet edb-programmer hertil (b).

Kombineret metode

Beregningen af log Pow for komplekse molekyler kan forbedres betydeligt, hvis molekylet deles op i stoerre delstrukturer, som man har paalidelige log Pow-vaerdier for, enten fra tabeller (b)(c) eller fra egne maalinger. Saadanne fragmenter (f.eks. heterocykliske forbindelser, anthraquinon, azobenzen) kan dernaest kombineres med Hansch's ð-vaerdier eller Rekkers eller Leo's fragmentkonstanter.

Bemaerkninger

i) Beregningsmetoderne kan kun anvendes paa helt eller delvis ioniserede forbindelser, hvis de noedvendige korrektionsfaktorer kan tages i betragtning.

ii) Hvis der maa antages at forekomme intramolekylaere hydrogenbindinger, maa det hertil svarende korrektionsudtryk (ca. + 0,6 til + 1,0 log Pow-enheder) laegges til (a). Rumlige modeller og spektroskopiske data kan afsloere, om der kan vaere tale om saadanne bindinger i molekylet.

iii) Hvis flere tautomere former er mulige, benyttes den mest sandsynlige form som grundlag for beregningen.

iv) Man skal noeje foelge med i revisioner af lister over fragmentkonstanter.

Rapport

Ved anvendelse af beregningsmetoder skal testrapporten om muligt indeholde foelgende oplysninger

- beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)

- angivelse af alle muligheder for intramolekylaere hydrogenbindinger, dissociation, ladning eller andre saerlige forhold (f.eks. tautomeri)

- beskrivelse af beregningsmetoden

- identifikation af de anvendte datas oprindelse

- saerlige valg af fragmenter

- udtoemmende dokumentation af beregningen.

LITTERATURHENVISNINGER

(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. - Chim. Ther. 1979, vol. 14, 479.

(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.

(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.

(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.

(i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.

Tillaeg 2

>TABELPOSITION>

A.9. FLAMMEPUNKT

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Ved udfoerelse af denne test er det nyttigt at have forhaandsoplysninger om stoffets braendbarhed. Metoden kan anvendes for vaesker, hvis dampe kan antaendes af en antaendelseskilde. De opregnede testmetoder er kun paalidelige i de flammepunktsintervaller, der er anfoert ved de enkelte metoder.

Ved valg af metode skal det tages med i overvejelserne, om der kan ske en kemisk reaktion mellem stoffet og testbeholderen.

1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER

Flammepunktet er den laveste temperatur, korrigeret til et tryk paa 101,325 kPa, ved hvilken en vaeske under de i metoden fastsatte betingelser udvikler dampe i en saadan maengde, at de danner en braendbar blanding med luft i testbeholderen.

Enheder: Ct = T 273,15(t er i C og T er i K)

1.3. REFERENCESTOFFER

Anvendelse af referencestoffer er ikke paakraevet, hver gang et nyt stof skal undersoeges. Referencestoffer skal foerst og fremmest tjene til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater opnaaet med andre metoder.

1.4. METODENS PRINCIP

Stoffet anbringes i en testbeholder og opvarmes eller afkoeles til testtemperaturen efter den fremgangsmaade, der er beskrevet i den enkelte testmetode. Der udfoeres antaendelsesforsoeg til konstatering af, om proeven antaendes ved testtemperaturen eller ikke.

1.5. KVALITETSKRITERIER

1.5.1. Repeterbarhed

Repeterbarheden varierer alt efter flammepunktsomraadet og den anvendte metode; hoejst 2 C.

1.5.2. Foelsomhed

Foelsomheden afhaenger af den anvendte testmetode.

1.5.3. Specificitet

Nogle af testmetoderne er begraenset til et bestemt flammepunktsinterval, og deres specificitet afhaenger af andre stofegenskaber (f.eks. hoej viskositet).

1.6. BESKRIVELSE AF METODEN

1

1.6.1. Forberedelser

Der anbringes en proeve af stoffet i testapparatet efter 1.6.3.1 og/eller 1.6.3.2.

Af sikkerhedshensyn anbefales det, at der kun anvendes en lille test, dvs. ca. 2 cm3, af energirige og giftige stoffer.

1.6.2. Testbetingelser

For saa vidt som det er foreneligt med sikkerhedskravene, skal apparatet anbringes et traekfrit sted.

1.6.3. Udfoerelse af testen

1.6.3.1. Ligevaegtsmetoden

Se ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523 og ISO 3679.

1.6.3.2. Ikke-ligevaegtsmetoden

Abel apparat

Se BS 2000 part 170, NF M07-011 og NF T66-009.

Abel-Pensky apparat

Se EN 57, DIN 51755 part 1 (for temperaturer fra 5 C til 65 C), DIN 51755 part 2 (for temperaturer under 5 C) og NF M07-036.

Tag apparat

Se ASTM D 56.

Pensky-Martens apparat

Se ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34 og NF M07-019.

Bemaerkninger

Hvis der ved en ikke-ligevaegtsmetode i 1.6.3.2 findes et flammepunkt paa 0 ± 2 C, 21 ± 2 C eller 55 ± 2 C, skal det bekraeftes ved en ligevaegtsmetode med samme apparat.

Til anmeldelsesformaal kan der kun bruges metoder, der giver flammepunktstemperaturen.

Til bestemmelse af flammepunktet af tyktflydende oploesningsmiddelholdige vaesker (maling, lim og lignende) maa der kun benyttes apparater og testmetoder, der er egnede til bestemmelse af tyktflydende vaeskers flammepunkt.

Se ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523 og DIN 53213 part 1.

2. DATA

3. RAPPORTERING

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- noejagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)

- angivelse af den anvendte metode samt eventuelle afvigelser herfra

- resultaterne og supplerende bemaerkninger af betydning for vurdering af dem.

4. LITTERATURHENVISNING

Ingen.

A.10. ANTAENDELIGHED (FASTE STOFFER)

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Ved udfoerelse af denne test er det nyttigt at have forhaandsoplysninger om stoffets eventuelle eksplosive egenskaber.

Testen udfoeres kun paa stoffer, der foreligger som pulver, granulat eller pasta.

For ikke at medtage alle stoffer, der kan antaendes, men kun dem, der braender hurtigt eller paa en maade, der er saerlig farlig, anses kun de stoffer, hvis forbraendingshastighed overstiger en vis vaerdi, for at vaere let antaendelige.

Det kan vaere saerlig farligt, hvis forgloedning kan fortsaette gennem metalpulver, da en brand er vanskelig at slukke. Metalpulver, hvori forgloedningen kan udbrede sig i et bestemt tidsrum, anses for let antaendelige.

1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER

Forbraendingstiden udtrykkes i sekunder.

1.3. REFERENCESTOFFER

Ikke specificeret.

1.4. METODENS PRINCIP

Stoffet anbringes i en ca. 250 mm lang ubrudt stribe, og der foretages en indledende screeningstest til bestemmelse af, om der efter antaending med en gasflamme sker en forbraending, der breder sig med aaben flamme eller ved gloedning. Hvis forbraendingen breder sig mere end 200 mm hen ad striben i loebet af et bestemt tidsrum, udfoeres der et komplet testprogram til bestemmelse af forbraendingshastigheden.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ingen anfoert.

1.6. BESKRIVELSE AF METODEN

1.6.1. Indledende screeningproeve

Stoffet anbringes paa en ikke-braendbar ikke-poroes daarligt varmeledende plade i en ca. 250 mm lang, 20 mm bred og 10 mm hoej ubrudt stribe. En gasflamme (mindste diameter 5 mm) holdes hen til den ene ende af striben, indtil pulveret bryder i brand, dog hoejst 2 minutter (5 minutter for pulver af metal og metallegeringer). Det noteres, om forbraendingen breder sig 200 mm hen ad striben i loebet af testperioden paa 4 minutter (40 minutter for metalpulver). Hvis stoffet ikke bryder i brand eller forbraendingen ikke med aaben flamme eller ved gloedning breder sig 200 mm hen ad striben i loebet af testperiodens 4 minutter (40 minutter), anses stoffet ikke for at vaere let antaendeligt, og yderligere testning er ikke paakraevet. Hvis forbraendingen i stoffet breder sig 200 mm hen ad striben paa mindre end 4 minutter eller mindre end 40 for metalpulver, gennemfoeres nedenstaaende test (1.6.2).

1.6.2. Test af forbraendingshastigheden

1.6.2.1. Forberedelse

Stoffer, der foreligger som pulver eller granulat, fyldes loest i en 250 mm lang form, der har trekantet tvaersnit med indvendig hoejde 10 mm og bredde 20 mm. Paa hver side af formen i laengderetningen er der anbragt en metalplade, der rager 2 mm op over det trekantede tvaersnits overkant (se figuren). Derefter lader man tre gange formen falde ned paa et fast underlag fra 2 cm's hoejde. Om noedvendigt fyldes formen op igen. Sidestykkerne fjernes, og overskydende materiale skrabes af. Der laegges en ikke-braendbar ikke-poroes daarligt varmeledende plade oven paa formen, det hele vendes om, og formen fjernes.

Pasta-agtige stoffer bredes ud paa en ikke-braendbar ikke-poroes daarligt varmeledende plade i en 250 mm lang poelse med et tvaersnit paa ca. 1 cm2.

1.6.2.2. Testbetingelser

Er stoffet foelsomt over for fugt, gennemfoeres testen saa hurtigt som muligt efter, at stoffet er taget ud af beholderen.

1.6.2.3. Udfoerelse af proevningen

Volden anbringes i et stinkskab paa tvaers af luftstroemmen.

Lufthastigheden skal vaere tilstraekkelig til at forhindre, at roegen slipper ud i laboratoriet, og maa ikke aendres under proevningen. Omkring apparatet opstilles der en skaerm til beskyttelse mod traek.

Volden antaendes i den ene ende med en gasflamme (diameter mindst 5 mm). Naar forbraendingen har forplantet sig 80 mm, maales udbredelseshastigheden over de naeste 100 mm. Testen udfoeres 6 gange, hver gang med en ren kold plade, medmindre der observeres et positivt resultat tidligere.

2. DATA

Forbraendingstiden fra den indledende screeningstest (1.6.1) og den korteste forbraendingstid i op til 6 tests (1.6.2.3) er relevante for vurderingen.

3. RAPPORTERING

3.1. FORSOEGSRAPPORT

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- noejagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)

- en noejagtig beskrivelse af det testede stof, dets fysiske tilstandsform og dets fugtindhold

- resultaterne af den indledende screeningstest og af testen af forbraendingshastigheden, hvis den er udfoert

- alle yderligere bemaerkninger af betydning for vurdering af resultaterne.

3.2. FORTOLKNING AF RESULTATERNE

Stoffer, der foreligger i form af pulver, granulat eller pasta, anses for at vaere let antaendelige, hvis forbraendingstiden i nogen af de tests, der er udfoert efter 1.6.2, er mindre end 45 sekunder. Pulver af metal eller en metallegering anses for at vaere let antaendeligt, hvis det kan antaendes og flammen eller reaktionszonen forplanter sig over hele testen paa 10 minutter eller derunder.

4. LITTERATURHENVISNING

(1) NF T 20-042 (sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

Tillaeg

Figur

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Form og tilbehoer til fremstilling af volden (alle maal i millimeter)

A.11. ANTAENDELIGHED (GASSER)

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Med denne metode kan det bestemmes, om en gas blandet med luft ved stuetemperatur (ca. 20 C) og atmosfaeretryk kan antaendes, og i saa fald i hvilket koncentrationsomraade. Blandinger med stigende koncentrationer af proevegasssen med luft paavirkes med en elektrisk gnist, og det iagttages, om der sker antaendelse.

1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER

Omraadet for antaendelighed er koncentrationsomraadet mellem den nedre og den oevre eksplosionsgraense. Nedre og oevre eksplosionsgraense er de koncentrationsgraenser for den antaendelige gas i blanding med luft, ved hvilke der ikke sker nogen flammeudbredelse.

1.3. REFERENCESTOFFER

Ikke specificeret.

1.4. METODENS PRINCIP

Koncentrationen af gassen i luft oeges trinvis, og blandingen paavirkes ved hvert trin med en elektrisk gnist.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ikke anfoert.

1.6. BESKRIVELSE AF METODEN

1.6.1. Apparatur

Testbeholderen er en opretstaaende glascylinder med en indre diameter paa mindst 50 mm og en hoejde paa mindst 300 mm. Antaendelseselektroderne er placeret 60 mm over cylinderens bund med en indbyrdes afstand paa 3 til 5 mm. Cylinderen er forsynet med en trykaflastningsaabning. Apparatet skal afskaermes, saa eventuelle eksplosionsskader begraenses.

Som antaendelseskilde anvendes en staaende induktionsgnist med en varighed paa 0,5 sek. Den dannes af en hoejspaendingstransformator med en sekundaerspaending paa 10 til 15 kV (stoerste tilfoerte effekt 300 W). I reference (2) er der vist et eksempel paa et egnet apparat.

1.6.2. Testbetingelser

Testen skal udfoeres ved stuetemperatur (ca. 20 C).

1.6.3. Udfoerelse af testen

Ved hjaelp af doseringspumper ledes en gas/luftblanding med kendt koncentration ind i glascylinderen. Blandingen paavirkes med en gnistudladning, og det iagttages, om der ved antaendelseskilden opstaar en flamme, som forplanter sig af sig selv. Gaskoncentrationen varieres i intervaller paa 1 vol. %, indtil der sker antaendelse som beskrevet ovenfor.

Hvis det ud fra kendskab til gassens kemiske struktur maa formodes, at gassen ikke kan antaendes, og sammensaetningen af den stoekiometriske blanding med luft kan beregnes, behoever man kun at afproeve blandinger fra 10 % under til 10 % over det stoekiometriske blandingsforhold.

2. DATA

Den eneste information, der er relevant for bestemmelse af denne egenskab er, om der forekommer flammeudbredelse.

3. RAPPORTERING

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- noejagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)

- beskrivelse af det anvendte apparat med angivelse af dimensioner

- den temperatur, som testen er udfoert ved

- de afproevede koncentrationer og de opnaaede resultater

- testens resultat: ikke-antaendelig eller let antaendelig gas

- konkluderes det, at gassen er ikke-antaendelig, anfoeres det koncentrationsomraade, hvor proevning med 1 % intervaller har fundet sted

- alle oplysninger og bemaerkninger, der er relevante for fortolkningen af resultaterne.

4. LITTERATURHENVISNINGER

(1) NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.

(2) W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. Redeker und H. Schacke. »Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen«. Chem.-Ing.-Tech., 1984, vol. 56, 2, 126-127.

A.12. ANTAENDELIGHED (KONTAKT MED VAND)

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Denne testmetode kan anvendes til bestemmelse af, om et stof ved reaktion med vand udvikler farlige maengder gas, der eventuelt er let antaendelig.

Testmetoden kan anvendes til baade vaesker og faste stoffer. Den kan ikke anvendes til stoffer, der spontant bryder i brand, naar de kommer i kontakt med luften.

1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER

Let antaendelig: stoffer, som ved kontakt med vand eller fugtig luft udvikler let antaendelige gasser i farlige maengder, dvs. mindst 1 liter/kg pr. time.

1.3. METODENS PRINCIP

Testen foregaar trinvis som beskrevet nedenfor; testen kan afbrydes, naar der sker antaending. Hvis det vides, at stoffet ikke reagerer voldsomt med vand, kan man begynde med trin 4 (1.3.4).

1.3.1. Trin 1

Teststoffet anbringes i et kar med destilleret vand ved 20 C, og det konstateres, om den udviklede gas bryder i brand.

1.3.2. Trin 2

Teststoffet anbringes paa et stykke filtrerpapir, der flyder paa overfladen i en skaal med destilleret vand ved 20 C, og det konstateres, om den udviklede gas bryder i brand. Filtrerpapiret tjener udelukkende til at holde stoffet samlet paa ét sted for at oege chancerne for antaendelse.

1.3.3. Trin 3

Teststoffet arrangeres i en ca. 2 cm hoej bunke med en diameter paa ca. 3 cm. Der tilsaettes et par draaber vand til bunken, og det konstateres, om den udviklede gas bryder i brand.

1.3.4. Trin 4

Teststoffet blandes med destilleret vand ved 20 C, og gasudviklingens hastighed maales hver time over en periode paa 7 timer. Hvis hastigheden efter 7 timer er uregelmaessig eller stigende, forlaenges maaleperioden, dog hoejst til 5 dage. Testen kan afbrydes, hvis hastigheden paa noget tidspunkt overstiger 1 liter/kg pr. time.

1.4. REFERENCESTOFFER

Ikke specificeret.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ikke anfoert.

1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE

1.6.1. Trin 1

1.6.1.1. Testbetingelser

Testen udfoeres ved stuetemperatur (ca. 20 C).

1.6.1.2. Udfoerelse af testen

En lille maengde af teststoffet (ca. 2 mm i diameter) anbringes i et kar med destilleret vand. Det noteres, (i) om der udvikles gas, og (ii) om gassen bryder i brand. Hvis gassen bryder i brand, behoeves der ikke yderligere testning, idet stoffet anses for farligt.

1.6.2. Trin 2

1.6.2.1. Apparatur

Et stykke filtrerpapir anbringes fladt flydende paa overfladen af destilleret vand i en egnet beholder, f.eks. en afdampningsskaal med en diameter paa 100 mm.

1.6.2.2. Testbetingelser

Testen udfoeres ved stuetemperatur (ca. 20 C).

1.6.2.3. Udfoerelse af testen

En lille maengde af teststoffet (ca. 2 mm diameter) anbringes midt paa filtrerpapiret. Det noteres, (i) om der udvikles gas, og (ii) om gassen bryder i brand. Hvis gassen bryder i brand, behoeves der ikke yderligere testning, idet stoffet anses for farligt.

1.6.3. Trin 3

1.6.3.1. Testbetingelser

Testen udfoeres ved stuetemperatur (ca. 20 C).

1.6.3.2. Udfoerelse af testen

Teststoffet anbringes i en ca. 2 cm hoej bunke paa ca. 3 cm i diameter med en fordybning i toppen. Der anbringes et par draaber vand i fordybningen, og det noteres, (i) om der udvikles gas, og (2) om gassen bryder i brand. Hvis gassen bryder i brand, behoeves der ikke yderligere testning, idet stoffet anses for farligt.

1.6.4. Trin 4

1.6.4.1. Apparatur

Der anvendes et apparat som vist paa figuren.

1.6.4.2. Testbetingelser

Det undersoeges visuelt, om beholderen med teststof indeholder pulver paa under 500 ìm (partikelstoerrelse). Hvis pulver udgoer mere end 1 % (w/w) af den samlede proeve eller proeven er smuldrende, formales hele testen til pulver inden testen, saa der tages hensyn til reduktion af partikelstoerrelsen under opbevaring og haandtering; i alle andre tilfaelde undersoeges testen i den stand, hvori den er modtaget. Testen udfoeres ved stuetemperatur (ca. 20 C) og atmosfaeretryk.

1.6.4.3. Udfoerelse af testen

Der anbringes 10 - 20 ml vand i apparatets tildrypningstragt og 10 g stof i den koniske kolbe. Den udviklede gasmaengde kan maales ved enhver egnet metode. Tildrypningstragtens hane aabnes, saa vandet loeber ned i kolben, og et stopur startes. Gasudviklingen maales hver time over en periode paa 7 timer. Hvis gasudviklingen er uregelmaessig i denne periode eller stiger hen mod periodens slutning, fortsaettes maalingerne i op til 5 doegn. Hvis gasudviklingen paa noget tidspunkt kommer over 1 liter/kg pr. time, kan testen afbrydes. Testen gentages yderligere to gange.

Hvis gassens kemiske sammensaetning ikke er kendt, foretages der en analyse af den. Hvis gassen indeholder let antaendelige bestanddele, og det ikke vides, om hele blandingen er let antaendelig, fremstilles der en blanding med samme sammensaetning, som tests efter metode A.11.

2. DATA

Stoffet anses for farligt, hvis

- det spontant bryder i brand paa noget trin af testen eller

- der udvikles braendbar gas i stoerre maengde end 1 liter/kg pr. time.

3. RAPPORTERING

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- noejagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)

- eventuel forbehandling af teststoffet

- resultatet af testen (trin 1, 2, 3 og 4)

- den udviklede gas' kemiske sammensaetning

- gasudviklingshastigheden, hvis trin 4 (1.6.4) udfoeres

- alle yderligere bemaerkninger, der er relevante for fortolkningen af resultaterne.

4. LITTERATURHENVISNINGER

(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York.

(2) NF T 20-040 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

Tillaeg

Figur

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Apparatur

A.13 VAESKERS OG FASTE STOFFERS PYROFORISKE EGENSKABER

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Testmetoden kan anvendes for vaesker og faste stoffer, der i smaa maengder spontant bryder i brand kort tid efter at vaere kommet i kontakt med luften ved stuetemperatur (ca. 20 C).

Stoffer, der skal udsaettes for luftens paavirkning i flere dage eller timer ved stuetemperatur, foerend der sker antaendelse, omfattes ikke af denne testmetode.

1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER

Stoffer anses for at vaere selvantaendelige, hvis de bryder i brand eller forkuller under betingelserne i 1.6.

Det kan ogsaa vaere paakraevet at undersoege vaeskers selvantaendelse med metode A.15 Selvantaendelsestemperatur (vaesker og gasser).

1.3. REFERENCESTOFFER

Ikke specificeret.

1.4. METODENS PRINCIP

Stoffet, fast eller flydende, blandes med en inaktiv baerer og bringes i kontakt med luften ved stuetemperatur i 5 minutter. Vaesker, der ikke bryder i brand, absorberes dernaest paa filtrerpapir og udsaettes for luftens paavirkning ved omgivende temperatur (ca. 20 C) i 5 minutter. Flydende og faste stoffer, der bryder i brand, og vaesker, der bryder i brand eller faar filtrerpapiret til at forkulle, anses for at vaere selvantaendelige.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Repeterbarhed: paa grund af den sikkerhedsmaessige betydning er et enkelt positivt resultat tilstraekkeligt til, at stoffet anses for selvantaendeligt.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN

1.6.1. Apparatur

Der fyldes et ca. 5 mm tykt lag diatoméjord i en porcelaensskaal med en diameter paa ca. 10 cm ved stuetemperatur (ca. 20 C).

Bemaerk

Diatoméjord eller et andet tilsvarende inaktivt stof, som er let at faa fat i, antages at repraesentere den jord, som teststoffet kunne blive spildt paa i tilfaelde af uheld.

Der behoeves toert filtrerpapir til test af vaesker, som ikke bryder i brand ved kontakt med luften, naar de er blandet med et inaktivt baeremateriale.

1.6.2. Udfoerelse af testen

a) Faste stoffer i pulverform

Fra en hoejde af ca. 1 m haeldes 1-2 cm af pulveret ned paa en ikke-braendbar flade, og det iagttages, om stoffet bryder i brand under faldet eller inden for 5 minutter derefter.

Testen udfoeres 6 gange, medmindre der sker antaendelse.

b) Vaesker

Ca. 5 cm3 af testvaesken haeldes ud i den klargjorte porcelaensskaal, og det iagttages, om stoffet bryder i brand, inden der er gaaet 5 minutter.

Hvis der ikke sker antaendelse i nogen af de seks forsoeg, udfoeres foelgende forsoeg

Med en injektionssproejte sproejtes 0,5 ml af proeven ud paa et boejet stykke filtrerpapir, og det iagttages, om der inden for 5 minutter sker antaendelse eller forkulning af filtrerpapiret. Forsoeget udfoeres 3 gange medmindre der sker antaendelse eller forkulning.

2. DATA

2.1. BEHANDLING AF RESULTATERNE

Testen kan afbrydes, saa snart et af forsoegene giver positivt resultat.

2.2 EVALUERING

Hvis stoffet bryder i brand inden 5 minutter efter, at det er tilsat til en inaktiv baerer og blevet udsat for luftens paavirkning, eller hvis en vaeske faar et stykke filtrerpapir til at forkulle eller bryde i brand, inden 5 minutter efter at stoffet er tilsat og blevet udsat for luftens paavirkning, anses stoffet (vaesken) for at vaere selvantaendeligt.

3. RAPPORTERING

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- noejagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)

- resultaterne af testen

- alle yderligere bemaerkninger, der er relevante for fortolkningen af resultaterne.

4. LITTERATURHENVISNINGER

(1) NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.

(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York

A.14. EKSPLOSIVE EGENSKABER

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Metoden indeholder et testsystem til bestemmelse af, om et fast eller pastaagtigt stof frembyder eksplosionsfare, naar det udsaettes for paavirkning med en flamme (varmefoelsomhed) eller ved slag eller friktion (foelsomhed over for mekanisk paavirkning), og om en vaeske frembyder eksplosionsfare, naar den udsaettes for paavirkning med en flamme eller ved slag.

Metoden bestaar af tre dele

a) en test for varmefoelsomhed (1)

b) en test for foelsomhed over for slagpaavirkning (1)

c) en test for foelsomhed over for friktionspaavirkning (1).

Metoden giver data til vurdering af sandsynligheden for, at der ved visse almindelige paavirkninger fremkaldes en eksplosion. Metoden tilsigter ikke at fastslaa, om stoffet overhovedet kan bringes til at eksplodere.

Metoden er egnet til bestemmelse af, om et stof frembyder en eksplosionfare (varmefoelsomhed og mekanisk foelsomhed) under de saerlige betingelser, der er specificeret i direktivet. Metoden er baseret paa en raekke apparattyper, som i vidt omfang anvendes internationalt (1), og som saedvanligvis giver brugbare resultater. Det erkendes, at metoden ikke er definitiv. Der kan benyttes andet apparatur end det specificerede, forudsat at det er internationalt anerkendt, og at de fundne resultater kan korreleres til resultater opnaaet med det specificerede apparatur.

Testen behoever ikke at udfoeres, hvis det paa grundlag af foreliggende termodynamiske oplysninger (f.eks. dannelsesvarme eller dekomponeringsvarme) og/eller en strukturformel, hvori visse reaktive grupper (2) ikke indgaar, maa anses for haevet over enhver rimelig tvivl, at stoffet er ude af stand til hurtig dekomponering ledsaget af gasudvikling eller varmefrigoerelse (dvs. at stoffet ikke frembyder nogen eksplosionsfare). For vaesker kraeves der ikke test for friktionsfoelsomhed.

1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER

Eksplosiv

Stoffer, som kan eksplodere ved flammepaavirkning, eller som er foelsomme over for slag eller friktion (eller mere foelsomme over for mekanisk paavirkning end 1,3-dinitrobenzen i et alternativt apparat).

1.3. REFERENCESTOFFER

1,3-dinitrobenzen, teknisk krystallinsk produkt, sigtet paa 0,5 mm sigte, til friktions- og slagpaavirkningsmetoden.

Perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX, hexogen, cyclonite - CAS121-82-4), omkrystalliseret i vandig cyclohexanon, vaadsigtet paa 250 ìm sigte og tilbageholdt paa en 150 ìm sigte, toerret ved 103 ± 2 C (i 4 timer) til anden raekke friktions- og slagproevninger.

1.4. METODENS PRINCIP

Der kraeves indledende testning til bestemmelse af, hvordan de tre foelsomhedstests kan udfoeres under betryggende forhold.

1.4.1. Test for sikker haandtering (3)

Af sikkerhedshensyn foretages der foer den egentlige test en indledende test bestaaende i, at en meget lille testmaengde (ca. 10 mg) opvarmes fritliggende i en gasflamme, og paavirkes med slag i et passende apparat og ved friktion ved hjaelp af en hammer mod en ambolt eller et andet friktionsapparat. Formaalet er at fastslaa, om stoffet er saa foelsomt og eksplosivt, at den foreskrevne foelsomhedstest, isaer for varmefoelsomhed, maa udfoeres under iagttagelse af saerlige forholdsregler, saa operatoeren ikke kan komme til skade.

1.4.2. Varmefoelsomhed (virkningen af en flamme)

Metoden bestaar i opvarmning af stoffet i et staalroer, der er lukket med en mundingsplade. Ved hjaelp af mundingsplader med forskellige huldiametre kan det bestemmes, om stoffet er tilboejeligt til at eksplodere under staerk varmepaavirkning og veldefineret indeslutningsgrad.

1.4.3. Mekanisk foelsomhed (slag)

Metoden bestaar i, at stoffet udsaettes for et slag med et specificeret lod, der falder fra en specificeret hoejde.

1.4.4. Mekanisk foelsomhed (friktion)

Metoden bestaar i, at et fast eller pastaagtigt stof udsaettes for friktion mellem standardoverflader med specificeret belastning og ved specificeret relativ bevaegelse.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ikke anfoert.

1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE

1.6.1. Varmefoelsomhed (virkningen af en flamme)

1.6.1.1. Apparatur

Apparaturet bestaar af et engangsstaalroer med lukkeanordning (figur 1) anbragt i en opvarmnings- og beskyttelsesanordning. Roeret er af dybtrukket staalplade (se tillaegget) og har en indvendig diameter paa 24 mm, en laengde paa 75 mm og en godstykkelse paa 0,5 mm. Roeret har i den aabne ende en flange, saa det kan lukkes med mundingspladen ved hjaelp af en todelt forskruning (moetrik og krave med gevind). Mundingspladen er trykmodstandsdygtig og har et hul i midten. Moetrikken og kraven med gevind er fremstillet i chrom-manganstaal (se tillaegget), som er gnistfrit op til 800 C. Der foreligger mundingsplader med en raekke forskellige huldiametre, som er fremstillet i 6 mm tykt varmebestandigt staal (se tillaegget).

1.6.1.2. Testbetingelser

Normalt testes stoffet i den tilstand, hvori det er modtaget, men i visse tilfaelde, f.eks. hvis det foreligger i presset, stoebt eller anden kompakt form, kan det vaere noedvendigt at knuse stoffet foer testen.

For faste stoffer bestemmes den maengde materiale, der skal anvendes til testen, ved en to-trins procedure. Foerst fyldes der i et tareret roer 9 cm af stoffer, som nedstampes med en kraft paa 80 N fordelt over hele roertvaersnittet. Af sikkerhedshensyn eller i tilfaelde, hvor stoffet kan aendre fysisk form ved kompression, kan der benyttes andre paafyldningsmetoder; eksempelvis er stampning ikke egnet, hvis stoffet er meget friktionsfoelsomt. Hvis materialet kan komprimeres, tilsaettes der mere og stampes, indtil roeret er fyldt til en hoejde af 55 mm fra overkanten. Den samlede maengde, der er brugt til fyldning af roeret til denne hoejde, bestemmes, og der tilsaettes endnu 2 portioner, som stampes med en kraft paa 80 N. Der tilsaettes materiale med stampning eller fjernes materiale, saa roeret er fyldt til 15 mm fra overkanten. Det andet trin foregaar ved, at der foerst tilsaettes og stampes en tredjedel af den samlede maengde, der blev brugt til det foerste trin. Der tilsaettes endnu 2 portioner med stampning med 80 N, og materialets hoejde i roeret justeres til 15 mm fra overkanten ved tilsaetning eller fjernelse af materiale. Til hvert forsoeg anvendes den maengde fast stof, der er fundet ved dette andet trin; paafyldningen sker i 3 lige store portioner, der hver komprimeres til 9 cm3 med den fornoedne kraft. (Dette goeres lettest ved anvendelse af afstandsringe.)

Vaesker og geler fyldes i roeret til en hoejde af 60 mm, idet det for gelernes vedkommende noeje paases, at der ikke dannes luftbobler. Kraven med gevind foeres op om roeret nedefra, den valgte mundingsplade indsaettes, og moetrikken strammes efter smoering med et molybdaensulfidbaseret smoeremiddel. Det er yderst vigtigt at kontrollere, at der hverken har sat sig stof mellem flangen og pladen eller i gevindet.

Opvarmningen sker med propan, der fra en industriel trykflaske med trykregulator (60-70 mbar) ledes gennem en maaler og fordeles ligeligt til fire braendere gennem en manifold (hvilket kontrolleres ved visuel inspektion af braendernes flammer). Braenderne er placeret omkring proevekammeret som vist paa figur 1. De fire braenderes samlede forbrug er paa ca. 3,2 liter propan pr. minut. Der kan anvendes andre braendstoffer og braendere, men opvarmningshastigheden skal vaere som specificeret i figur 3. Uanset det anvendte apparatur skal opvarmningshastigheden regelmaessigt kontrolleres med dibutylphthalatfyldte roer, som vist paa figur 3.

1.6.1.3. Udfoerelse af testene

Hver test varer, indtil roeret enten soenderdeles eller roeret har vaeret opvarmet i 5 minutter. En test, hvorved roeret soenderdeles i tre eller flere fragmenter, som eventuelt haenger sammen med smalle metalstrimler som vist paa figur 2, vurderes som en eksplosion. En test, der foerer til faerre fragmenter eller ingen fragmentering, betragtes ikke som en eksplosion.

Der udfoeres foerst tre tests med en mundingsplade med et 6 mm hul, og opnaas der ingen eksplosion, udfoeres endnu tre tests med en mundingsplade med et 2 mm hul. Finder der eksplosion sted under én af disse forsoegsraekker, er yderligere testning ikke paakraevet.

1.6.1.4. Evaluering

Testens resultat anses for positivt, hvis der sker eksplosion i én af ovennaevnte forsoegsraekker.

1.6.2. Mekanisk foelsomhed (slag)

1.6.2.1. Apparatur (figur 4)

Hoveddelene af et typisk faldhammerapparat er en stoebt staalblok med bundplade, ambolt, stander, styr, faldlodder, frigoerelsesmekanisme og proeveholder. Staalambolten paa 100 mm (diameter) × 70 mm (hoejde) er skruet fast oven paa en staalblok paa 230 mm (laengde) × 250 mm (bredde) × 200 mm (hoejde) med stoebt bundplade paa 450 mm (laengde) × 450 mm (bredde) × 60 mm (hoejde). En stander bestaaende af et soemloest trukket staalroer er fastgjort i en holder, der er fastskruet bag paa staalblokken. Apparatet er forankret til en massiv betonklods paa 60 × 60 × 60 cm med fire skruer, saa styrene er fuldstaendig lodrette og faldlodderne kan falde frit. Der findes lodder paa 5 og 10 kg fremstillet i massivt staal. Loddernes slaghoved er af haerdet staal, HRC 60 til 63, og har en diameter paa mindst 25 mm.

Testen er indeholdt i en slaganordning bestaaende af to massive staalcylindre anbragt koaksialt over hinanden i en hul cylindrisk styrering af staal. Staalcylindrene skal have en diameter paa 10 ( 0,003, 0,005) mm og en hoejde paa 10 mm og have polerede endeflader, afrundede kanter (krumningsradius 0,5 mm) og en haardhed paa HRC 58 til 65. Den hule cylinder skal have en udvendig diameter paa 16 mm, en poleret udboring paa 10 (+0,005, +0,010) mm og en hoejde paa 13 mm. Slaganordningen samles paa en mellemambolt (diameter 26 mm, hoejde 26 mm) af staal og centreres med en ring, hvori der er huller til bortledning af eksplosionsprodukterne.

1.6.2.2. Testbetingelser

Testvolumenet skal vaere paa 40 mm eller det volumen, der passer til et alternativt apparat. Faste stoffer testes i toer tilstand og forberedes saaledes

a) stoffer i pulverform sigtes (0,5 mm sigte); alt hvad der passerer gennem sigten bruges til testen

b) stoffer, der foreligger i presset, stoebt eller anden kompakt form, findeles og sigtes; sigtefraktionen fra 0,5 mm til 1 mm diameter bruges til testen og skal vaere repraesentativ for det oprindelige stof.

Stoffer, som normalt forekommer i pastaform skal om muligt testes i toer tilstand og under alle omstaendigheder efter fjernelse af stoerst mulig maengde oploesningsmiddel. Ved test af vaesker er der en afstand paa 1 mm mellem den oeverste og den nederste staalcylinder.

1.6.2.3. Udfoerelse af testen

Der udfoeres seks forsoeg, hvor 10 kg's loddet falder fra en hoejde af 0,40 m (40 J). Forekommer der eksplosion i et af de 6 forsoeg med 40 J, udfoeres der en ny raekke paa seks forsoeg, hvor et 5 kg's lod falder fra en hoejde af 0,15 m (7,5 J). I andre apparater sammenlignes proeven med det valgte referencestof ved hjaelp af en fastlagt procedure (f.eks. up-and-down teknik).

1.6.2.4. Evaluering

Testresultatet anses for positivt, hvis der sker eksplosion (opflamning og knald betragtes som eksplosion) i mindst ét af forsoegene med det specificerede slagapparat, eller hvis proeven er mere foelsom end 1,3-dinitrobenzen eller RDX i en alternativ slagtest.

1.6.3. Mekanisk foelsomhed (friktion)

1.6.3.1. Apparatur (figur 5)

Friktionsapparatet bestaar af en stoebt bundplade af staal, hvorpaa friktionsanordningen er monteret. Den bestaar af en fastsiddende porcelaensstift og en bevaegelig porcelaensplade. Porcelaenspladen fastholdes i en slaede, der glider paa to styr. Slaeden er via en forbindelsesstang, en krumtap og et passende gear forbundet med en elmotor, saaledes at porcelaenspladen bevaeges 10 mm frem og tilbage under porcelaensstiften én gang. Porcelaensstiften kan belastes f.eks. med 120 eller 360 newton.

Porcelaenspladerne er flade og er fremstillet af hvidt teknisk porcelaen (ruhed 9 til 32 ìm) og har dimensionerne 25 mm (laengde) × 25 mm (bredde) × 5 mm (hoejde). Den cylindriske porcelaensstift, der ligeledes er fremstillet af hvidt teknisk porcelaen, har en laengde paa 15 mm, en diameter paa 10 mm og ru kugleformede endeflader med en krumningsradius paa 10 mm.

1.6.3.2. Testbetingelser

Proevevolumenet skal vaere paa 10 mm3 eller det volumen, der passer til et alternativt apparat.

Faste stoffer testes i toer tilstand og forberedes saaledes

a) stoffer i pulverform sigtes (0,5 mm sigte); alt hvad der passerer gennem sigten bruges til testen

b) stoffer, der foreligger i presset, stoebt eller anden kompakt form, findeles og sigtes; sigtefraktionen START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Apparat til testing for varmefoelsomhed (alle dimensioner i mm)

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Figur 2

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Test for varmefoelsomhed

Eksempler paa fragmentering

Figur 3

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Kalibrering af opvarmningshastigheden ved test af varmefoelsomhed

Kurve over temperaturforloebet mod tiden ved opvarmning af dibutylphthalat (27 cm3) i et lukket roer (mundingsplade med 1,5 mm hul) med et propanflow paa 3,2 liter/minut. Temperaturen er maalt med chromel/alumel-termoelement med 1 mm indkapsling i rustfrit staal, anbragt centralt 43 mm under roerets overkant. Mellem 135 C og 285 C skal opvarmningshastigheden vaere 185-215 K/minut.

Figur 4

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Apparat til slagproevning (alle dimensioner i mm)

Figur 4a. Faldhammer, forfra og fra

Figur 4b. Faldhammer, nederste del siden, oversigtstegning

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Figur 4

Figur 4c. Slaganordning for stoffer,

Figur 4d. Slaganordning der foreligger i form af pulver eller pasta for vaesker

(1) staalcylindre

(2) styrering for staalcylindrene

(3) holdering med aabninger

(a) lodret snit

(b) plan

(4) gummiring

(5) vaeske (40 mm3)

(6) vaeskefrit rum

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Figur 4e. Hammer (faldlod paa 5 kg)

(1) ophaengningstap

(2) hoejdemaerke

(3) styrefals

(4) cylindrisk slaghoved

(5) bagslagshage

Figur 5

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Apparat til friktionsfoelsomhed

Figur 5a. Friktionsapparat vertikalprojektion

Figur 5b. Stiftens udgangsposition og grundridsn, paa proeven

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

A.15. SELVANTAENDELSESTEMPERATUR FOR VAESKER OG GASSER

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Eksplosive stoffer og stoffer, der spontant bryder i brand i kontakt med luften, underkastes ikke denne test. Testproceduren kan anvendes for gasser, vaesker og dampe, som kan antaendes af en hed overflade under tilstedevaerelse af luft.

Selvantaendelsestemperaturen kan paavirkes betydeligt i nedadgaaende retning af katalytiske urenheder, af overfladematerialet og af en stoerre testbeholder.

1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER

Tendensen til selvantaendelse udtrykkes ved selvantaendelsestemperaturen. Selvantaendelsestemperaturen er den laveste temperatur, ved hvilken teststoffet bryder i brand i blanding med luft under de i testmetoden definerede betingelser.

1.3. REFERENCESTOFFER

I standarderne (se 1.6.3) er der naevnt referencestoffer. De skal foerst og fremmest tjene til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater opnaaet med andre metoder.

1.4. METODENS PRINCIP

Ved metoden bestemmes den laveste temperatur af den indvendige overflade af et lukket rum, ved hvilken en gas, damp eller vaeske, der sproejtes ind i rummet, bryder i brand.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Repeterbarheden afhaenger af omraadet for selvantaendelsestemperaturen og af den anvendte testmetode.

Foelsomheden og specificiteten afhaenger af den anvendte testmetode.

1.6. BESKRIVELSE AF METODEN

1.6.1. Apparatur

Apparaturet er beskrevet i den metode, der henvises til i 1.6.3.

1.6.2. Testbetingelser

En proeve af stoffet testes i overensstemmelse med den metode, der henvises til i 1.6.3.

1.6.3. Udfoerelse af testen

Se IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056 og NF T 20-037.

2. DATA

Testtemperaturen, atmosfaeretrykket, den anvendte maengde proevemateriale og tidsrummet, indtil der sker antaendelse, registreres.

3. RAPPORTERING

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- noejagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)

- den anvendte testmaengde og atmosfaeretrykket

- det anvendte apparatur

- maaleresultaterne (testtemperatur, resultaterne af antaendelsen og det hertil svarende tidsrum)

- alle yderligere oplysninger, der er relevante for fortolkningen af resultaterne.

4. REFERENCER

Ingen.

A.16. RELATIV SELVANTAENDELSESTEMPERATUR FOR FASTE STOFFER

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Eksplosive stoffer og stoffer, der spontant bryder i brand i kontakt med luften, underkastes ikke denne test.

Formaalet med denne test er at fremskaffe foreloebige oplysninger om faste stoffers selvantaendelighed ved hoej temperatur.

Hvis den varme, der udvikles enten ved stoffets reaktion med luften eller ved eksoterm dekomponering, ikke bortledes hurtigt nok til omgivelserne, sker der en opvarmning, der foerer til selvantaendelse. Selvantaendelse kan derfor finde sted, naar varmeproduktionen sker hurtigere end varmeafgivelsen.

Testmetoden egner sig til foreloebig screening af faste stoffer. Da antaendelse og forbraending af faste stoffer er meget kompleks, boer den selvantaendelsestemperatur, der bestemmes ved denne metode, kun benyttes til sammenligningsformaal.

1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER

Den selvantaendelsestemperatur, der bestemmes ved denne metode, er den laveste omgivende temperatur udtrykt i C, hvorved en bestemt maengde af et stof bryder i brand under veldefinerede betingelser.

1.3. REFERENCESTOF

Ingen.

1.4. METODENS PRINCIP

En bestemt maengde af teststoffet anbringes i en ovn ved stuetemperatur; medens ovntemperaturen haeves med 0,5 C/min til smeltepunktet, dog hoejst til 400 C, registreres temperaturen midt i proeven som funktion af tiden. I forbindelse med denne test benaevnes den ovntemperatur, ved hvilken proevens temperatur naar op paa 400 C ved selvopvarmning, selvantaendelsestemperaturen.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ingen.

1.6. BESKRIVELSE AF METODEN

1.6.1. Apparatur

1.6.1.1. Ovn

En temperaturprogrammeret laboratorieovn (volumen ca. 2 liter) med fri konvektion og eksplosionsaflastning. For at imoedegaa enhver eksplosionsfare maa eventuelle dekomponeringsgasser ikke kunne komme i beroering med varmelegemet.

1.6.1.2. Terning af staaltraadsnet

Et stykke staaltraadsnet med maskevidden 0,045 mm skaeres ud efter tegningen i figur 1. Det foldes til terninger, hvor den ene side er aaben, og fastholdes med staaltraad.

1.6.1.3. Termoelementer

Egnede termoelementer.

1.6.1.4. Skriver

En to-kanals skriver, der er kalibreret op til 600 C eller en tilsvarende spaending.

1.6.2. Testbetingelser

Stoffer testes i den form, de modtages i.

1.6.3. Udfoerelse af testen

Terningen fyldes med teststoffet, og der bankes let paa den under tilsaetning af mere af stoffet, indtil den er helt fyldt. Dernaest ophaenges terningen midt i ovnen ved stuetemperatur. Det ene termoelement anbringes midt i terningen, det andet mellem terningen og ovnvaeggen til maaling af ovntemperaturen.

Ovntemperaturen og proevetemperaturen registreres loebende, mens ovntemperaturen haeves til 400 C, dog hoejst til stoffets smeltepunktet, med en hastighed paa 0,5 C/min.

Antaendelse af stoffet vil vise sig som en meget stejl temperaturstigning i proeven sammenlignet med ovntemperaturen.

2. DATA

Den ovntemperatur, ved hvilken proeven som foelge af selvopvarmning naar op paa en temperatur paa 400 C, er relevant for evaluering (se figur 2).

3. RAPPORTERING

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- en beskrivelse af teststoffet

- maaleresultaterne, herunder temperatur/tid-kurven

- alle yderligere bemaerkninger, der er relevante for fortolkningen af resultaterne.

4. REFERENCER

(1) NF T 20-036 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

Figur 1

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Tegning af 20 mm testterning

Figur 2

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Typisk temperatur/tid-kurve

A.17. OXIDERENDE EGENSKABER (FASTE STOFFER)

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Ved udfoerelse af denne test er det nyttigt at have forhaandsoplysninger om stoffets eventuelle eksplosive egenskaber.

Denne test kan ikke anvendes paa vaesker, gasser, eksplosive og yderst let antaendelige stoffer samt organiske peroxider.

Det er ikke noedvendigt at udfoere denne test, hvis det paa grundlag af strukturformelen kan godtgoeres, at stoffet med stor sandsynlighed ikke kan reagere eksotermt med et braendbart materiale.

Der udfoeres en indledende test til konstatering af, om den egentlige test skal udfoeres under iagttagelse af saerlige forsigtighedsregler.

1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER

Reaktionstid: den reaktionstid i sekunder, der kraeves for at reaktionszonen breder sig hen ad en vold, efter den fremgangsmaade, der er beskrevet i 1.6.

Reaktionshastighed: udtrykkes i millimeter pr. sekund.

Stoerste reaktionshastighed: den stoerste af de reaktionshastigheder, der bestemmes med blandinger indeholdende 10 til 90 vaegtprocent af det oxiderende stof.

1.3. REFERENCESTOF

Som referencestof til testen og screeningstesten benyttes bariumnitrat (analysekvalitet).

Referenceblandingen er den blanding af bariumnitrat og pulveriseret cellulose, fremstillet efter 1.6, som har den stoerste reaktionshastighed (normalt en blanding indeholdende 60 vaegtprocent bariumnitrat).

1.4. METODENS PRINCIP

Af sikkerhedshensyn udfoeres der en indledende screeningstest. Viser denne indledende test klart, at stoffet har oxiderende egenskaber, behoeves der ikke yderligere testing. Er dette ikke tilfaeldet, underkastes stoffet en fuldstaendig test.

Ved den fuldstaendige test blandes teststoffet og et veldefineret braendbart stof i forskellige forhold. Hver blanding arrangeres i en vold, der antaendes i den ene ende. Den stoerste maalte reaktionshastighed sammenlignes med referenceblandingens stoerste reaktionshastighed.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Alle paakraevede formalings- og blandemetoder kan anvendes under den forudsaetning, at den stoerste reaktionshastighed i hver af de seks enkeltforsoeg ikke afviger fra det aritmetiske gennemsnit med mere end 10 %.

1.6. BESKRIVELSE AF METODEN

1.6.1. Forberedelse

1.6.1.1. Teststof

Proeven reduceres til en partikelstoerrelse paa START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Form og tilbehoer til fremstilling af proevevold (alle dimensioner i mm)

AFSNIT B: METODER TIL BESTEMMELSE AF TOKSICITET GENEREL INDLEDNING: AFSNIT B

A. INDLEDNING

Se den generelle indledning.

B. DEFINITIONER

(i) Akut toksicitet omfatter de skadelige virkninger, der optraeder inden for et givet tidsrum (saedvanligvis 14 dage) efter udsaettelse for en enkelt dosis af et teststof

(ii) LD50 (middel letal dosis) er den statistisk bestemte enkeltdosis af et teststof, som kan forventes at foraarsage 50% af forsoegsdyrenes doed LD50-vaerdier udtrykkes som vaegt af teststof pr. vaegtenhed af forsoegsdyr (mg/kg)

(iii) LC50 (middel letal koncentration) er den statistisk bestemte koncentration af et stof, som kan forventes at foraarsage 50 % af forsoegsdyrenes doed enten under eksponeringen eller inden for et fastsat tidsrum efter eksponering i en bestemt periode. LC50-vaerdier udtrykkes som vaegt af teststof pr. luftvolumenenhed ved standardbetingelser (mg/liter)

(iv) Ikke-skadelig dosis er den stoerste dosis eller det hoejeste eksponeringsniveau i en test, som ikke har paaviselige toksiske virkninger

(v) Subakut/subkronisk toksicitet omfatter de skadelige virkninger, som iagttages paa forsoegsdyr som foelge af dagligt gentagen indgift af eller eksponering for et kemisk stof gennem en lille del af dyrenes forventede levetid

(vi) Maksimal tolerabel dosis (MTD) er den hoejeste dosis, som har toksiske virkninger uden dog i vaesentlig grad at paavirke overlevelsesgraden i det forsoeg, hvor den anvendes

(vii) Hudirritation er dannelse af reversible inflammatoriske forandringer i huden som foelge af applikation af et teststof

(viii) OEjenirritation er dannelse af reversible forandringer i oejet som foelge af applikation af et teststof paa oejeaeblet

(ix) Hudsensibilisering (allergisk kontakteksem) er en immunologisk udloest hudreaktion paa et teststof

Specifikke definitioner for toksicitet ved inhalation

- en aerosol defineres som en homogen dispersion af partikler (af faste og/eller vaeskeformige) i luft

- den aerodynamiske diameter er diameteren af en kugle med massefylden 1 g/cm 3, som har samme stationaere faldhastighed som den paagaeldende partikel

- massemedianen af den aerodynamiske diameter (MMAD) er den beregnede aerodynamiske diameter, som deler aerosolens partikelstoerrelsesfordeling i to lige store massedele

- den geometriske standardafvigelse (GSD) er forholdet mellem den estimerede 84%-fraktil og 50%-fraktilen, og den angiver den kumulative partikelstoerrelsesfordelings haeldning, forudsat at partikelstoerrelsen er logaritmisk normalfordelt.

Specifikke definitioner i forbindelse med fastdosis-metoden til bestemmelse af akut toksicitet ved oral indgift

- Tydelige tegn paa toksicitet henviser til de toksiske virkninger, som ses efter indgift af teststoffet, og som er saa alvorlige, at indgift af den naeste hoejere dosis vil medfoere doedsfald

- Den kritiske dosis er det hoejeste af de fire faststatte dosisniveauer, som kan indgives, uden at det medfoerer stofrelateret doedelighed (herunder human aflivning)

C. MUTAGENICITET (herunder prae-screening for carcinogenicitet)

En foreloebig vurdering af et stofs mutationsfremkaldende evne forudsaetter, at der foreligger oplysninger om to mutationstyper, nemlig genmutationer og kromosomforandringer.

Disse to typer vurderes ved hjaelp af foelgende to test

(i) Test for dannelse af gen(punkt)mutationer i prokaryotiske celler saasom Salmonella typhimurium. Test der anvender Escherichia coli kan ogsaa anvendes. Valget mellem disse to testorganismer kan afhaenge af, hvilket slags kemisk stof, der testes

(ii) Test for dannelse af kromosomforandringer i pattedyrceller, som er dyrket in vitro anbefales. Der kan dog i stedet for anvendes en in vivo metode (mikronucleustest eller metafaseanalyse af knoglemarvsceller).

I fravaer af enhver kontraindikation kan det staerkt anbefales at benytte in vitro metoder.

D. VURDERING OG FORTOLKNING

Der er graenser for, i hvilket omfang resultater af dyreforsoeg og in vitro test kan ekstrapoleres direkte til mennesker, hvilket skal tages i betragtning ved vurdering og fortolkning af de gennemfoerte forsoeg.

Naar der foreligger beviser paa kemiske stoffers skadelige virkninger paa mennesker, kan disse vaere relevante ved vurderingen af stoffernes potentielle virkninger paa mennesker.

E. LITTERATURHENVISNINGER

Toksikologi er en eksperimentel videnskab under udvikling, og der foreligger righoldig litteratur om de forskelllige emner, den omfatter. Relevante henvisninger findes i OECD's retningslinier for forsoegsvirksomhed (OECD Test Guidelines).

Supplerende bemaerkninger

Pasning af dyr

Ved toksicitetstest er det afgoerende, at der foeres noeje kontrol med testmiljoeet, og at dyrene passes korrekt.

(i) Miljoe

Miljoeet i forsoegsstalde og -bure skal afpasses efter dyrearten. For rotter, mus og marsvin er en rumtemperatur paa 22 ± 3 C og en relativ luftfugtighed paa 30-70 % passende; for kaniner boer temperaturen vaere paa 20 ± 3 C og den relative luftfugtighed paa 30-70 %.

Nogle forsoegsteknikker er saerlig foelsomme over for temperaturafvigelser, og i saadanne tilfaelde indeholder beskrivelsen af testmetoden naermere oplysninger om passende forsoegsbetingelser. Ved alle undersoegelser af toksiske virkninger skal temperaturen og luftfugtigheden kontrolleres, registreres og anfoeres i den afsluttende forsoegsrapport.

Naar der anvendes kunstig belysning, boer der almindeligvis foelges en rytme med 12 timers lys og 12 timers moerke. Oplysninger om belysningsrytmen registreres og anfoeres i den afsluttende forsoegsrapport.

I rapporter over dyreforsoeg er det vigtigt at anfoere, hvilken type bure der er anvendt, og hvor mange dyr der har vaeret i hvert bur, saavel under eksponering for det kemiske stof som i en efterfoelgende observationsperiode.

(ii) Fodring

Foderet skal opfylde alle de ernaeringskrav, som den paagaeldende art af forsoegsdyr stiller. Hvis teststofferne indgives med foderet, kan reaktioner mellem teststoffet og foderbestanddele medfoere, at naeringsvaerdien nedsaettes.

Muligheden af en saadan reaktion skal tages i betragtning, naar forsoegsresultaterne fortolkes.

Forureninger i foderet, som vides at influere paa toksiciteten, maa ikke forefindes i interfererende koncentrationer.

Hensyn ved anvendelse af forsoegsdyr

Ved udarbejdelse af testmetoderne er der taget skyldig hensyn til dyrenes velfaerd. I det foelgende er der givet nogle faa eksempler, men listen er ikke udtoemmende. Den noejagtige ordlyd og/eller de noejagtige betingelser fremgaar af de enkelte metoder

- Til vurdering af akut toksicitet ved oral indgift indfoeres en ny metode, nemlig »fastdosis-metoden«. Denne metode har ikke doedsfald som specifikt endepunkt. Der anvendes faerre forsoegsdyr, og metoden resulterer i mindre smerte og lidelse end den klassiske metode til bestemmelse af akut toksicitet ved oral indgift.

- Antallet af forsoegsdyr reduceres til et videnskabeligt acceptabelt minimum, idet kun 5 dyr af samme koen testes for hvert dosisniveau i forbindelse med metoderne B.1 og B.3; kun 10 dyr (og kun 5 til den negative kontrolgruppe) anvendes til bestemmelse af hudsensibilisering ved hjaelp af maksimeringstest paa marsvin (guinea pig maximization test) (metode B.6); antallet af forsoegsdyr til den positive kontrol i forbindelse med in vivo-testning af mutagenicitet reduceres ligeledes (metode B.11 og B.12).

- Dyrenes smerter og lidelser under forsoegene reduceres, idet dyr, der udviser alvorlige og vedvarende tegn paa lidelse og smerte aflives humant; dosering af teststoffer paa en maade, som man ved foraarsager smerte og lidelse paa grund af stoffernes aetsende eller lokalirriterende egenskaber, skal ikke udfoeres (metode B.1, B.2 og B.3).

- Forsoeg med alt for hoeje doser undgaas ved indfoerelse af testgraenser, ikke blot i forsoeg for akut toksicitet (metode B.1, B.2 og B.3), men ligeledes i in vivo-forsoeg for mutagenicitet (metode B.11 og B.12).

- En strategi for testning af irriterende egenskaber goer det nu muligt at undgaa forsoeg, eller forsoeget kan reduceres til undersoegelse af et enkelt dyr, naar der foreligger tilstraekkelige videnskabelige beviser.

En saadan videnskabelig begrundelse kan baseres paa stoffets fysisk-kemiske egenskaber, resultaterne af andre tidligere udfoerte test eller resultaterne af velvaliderede in vitro tests. Hvis der f.eks. er gennemfoert en undersoegelse af akut dermal toksicitet med graensetestdosis af stoffet (metode B.3), hvor der ikke er iagttaget nogen hudirritation, kan yderligere test for hudirritation (metode B.4) vaere unoedvendig; materialer, som har udvist klart aetsende eller alvorlige hudirriterende egenskaber i en undersoegelse af hudirritation (metode B.4), boer ikke undersoeges for oejenirritation (metode B.5).

B.1. AKUT TOKSICITET (ORAL)

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt A).

1.2. DEFINITIONER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt B).

1.3. REFERENCESTOFFER

Ingen.

1.4. TESTMETODENS PRINCIP

Teststoffet indgives med mavesonde i graduerede doser til grupper af forsoegsdyr, idet der gives en bestemt dosis til hver gruppe. De valgte doser kan baseres paa resultaterne fra »range finding test«. Der foretages derefter observationer af virkninger, herunder doed. Dyr, der doer under forsoeget, obduceres. Ved slutningen af forsoeget aflives og obduceres overlevende dyr. Denne testmetode er hovedsagelig beregnet til undersoegelser paa gnavere.

Det kan vaere noedvendigt, at dyr, der viser vedvarende symptomer paa staerk smerte eller lidelse, aflives paa human maade. Undersoegelse af stoffer paa en maade, som paa grund af deres aetsende eller lokalirriterende egenskaber vides at volde betydelig smerte og lidelse, er ikke paakraevet.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ingen.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN

1.6.1. Forberedelser

Dyrene holdes under forsoegsbetingelser med hensyn til miljoe og fodring i mindst fem dage, inden forsoeget paabegyndes. Unge, sunde, koensmodne dyr fordeles randomiseret i grupper, inden forsoeget saettes i gang. Teststoffet oploeses eller opslaemmes i et passende vehikel. Det anbefales, at der saa vidt muligt anvendes en vandig oploesning, og hvis dette ikke er muligt, dernaest en oploesning i vegetabilsk olie, en oploesning i andre vehikler eller eventuelt en opslaemning. Ikke-vandige vehiklers relevante toksiske egenskaber skal vaere kendt eller bestemmes forud for eller i forbindelse med forsoeget. Hos gnavere boer volumen normalt ikke overstige 10 ml/kg legemsvaegt, undtagen for vandige oploesningers vedkommende, hvor der kan anvendes op til 20 ml/kg.

Volumenvariationer skal goeres mindst mulige ved justering af koncentrationen, for at sikre konstant volumen ved alle dosisniveauer.

1.6.2. Forsoegsbetingelser

1.6.2.1. Forsoegsdyr

Rotter er de foretrukne forsoegsdyr, medmindre der foreligger kontraindikationer.

Der benyttes rotter af almindeligt anvendte stammer. For saavel han-som hunrotter gaelder det, at vaegten af de anvendte dyr ikke maa variere mere end ± 20% fra en rimelig gennemsnitsvaegt ved forsoegets begyndelse.

1.6.2.2. Antal og koen

Der anvendes mindst fem gnavere (af samme koen) til hvert dosisniveau. Hundyr maa ikke have foedt og maa ikke vaere draegtige. Foreligger der oplysninger om, at et bestemt koen er vaesentligt mere foelsomt, benyttes der dyr af dette koen.

Bemaerk: Ved anvendelse af hoejere dyr end gnavere til undersoegelse af akut toksicitet skal det overvejes, om antallet af dyr kan nedsaettes.

Doserne skal fastlaegges med omhu, og man skal bestraebe sig paa ikke at benytte hoejere doser end moderat toksiske doser. I saadanne undersoegelser boer indgift af doedelige doser af teststoffet undgaas.

1.6.2.3. Dosisniveauer

Der anvendes et tilstraekkeligt antal dosisniveauer, mindst tre, og disse skal vaere valgt saaledes, at der opnaas en graduering af de toksiske virkninger og doedeligheden i testgrupperne. Der skal vaere tilstraekkelige data til, at der kan optegnes en dosis-virkningskurve og om muligt foretages en rimelig bestemmelse af LD50.

1.6.2.4. Graensetest

Naar der anvendes gnavere, kan der udfoeres en graensetest med en dosis paa mindst 2 000 mg/kg legemsvaegt med en gruppe paa fem dyr af hvert koen efter de ovenfor beskrevne procedurer. Optraeder der teststofrelaterede doedsfald, kan gennemfoerelse af en fuldstaendig undersoegelse komme i betragtning.

1.6.2.5. Observationsperiode

Observationsperioden skal vaere mindst 14 dage. Observationsperiodens varighed boer dog ikke fastsaettes rigoristisk, men bestemmes ud fra de toksiske reaktioner, hvornaar disse indtraeder, og restitutionsperiodens laengde; den kan saaledes forlaenges, saafremt det anses for noedvendigt. Tidspunktet for, hvornaar symptomer paa toksicitet erkendes og forsvinder, samt doedstidspunktet er vigtigt, navnlig hvis der er tendens til, at der indtraeffer sene doedsfald.

1.6.3. Fremgangsmaade

Dyrene fastes, inden teststoffet indgives. Rotter fastes natten over. En kortere fasteperiode er hensigtsmaessig for dyr med et hurtigere stofskifte. Der skal vaere fri adgang til drikkevand. Den foelgende dag vejes dyrene, og teststoffet indgives i en enkelt dosis med mavesonde. Hvis det ikke er muligt at give hele dosis paa én gang, kan den gives fraktioneret over en periode, der ikke maa overstige 24 timer. Naar teststoffet er indgivet, kan man undlade at give dyrene foder i yderligere tre til fire timer. Hvis en dosis indgives fraktioneret over en periode, kan det vaere noedvendigt at give dyrene foder og vand afhaengigt af, hvor lang en periode der er tale om.

Efter indgivelse af teststoffet foretages der systematiske observationer, som registreres for hvert enkelt dyr. Observationerne skal foretages hyppigt i loebet af den foerste dag.

Der skal foretages en grundig klinisk undersoegelse mindst én gang hver arbejdsdag. Herudover boer dyrene dagligt observeres, saa det mindst mulige antal dyr gaar tabt for undersoegelsen, d.v.s. at dyr, der findes doede, obduceres eller nedkoeles, og at svage eller doeende dyr isoleres eller aflives. Inspektion af dyrene skal omfatte forandringer i hud og pels, oejne og slimhinder, derudover aandedraet og kredsloeb, det autonome og centrale nervesystem, den motoriske aktivitet og adfaerdsmoensteret. Der boer navnlig foretages en omhyggelig observation for forekomst af rystelser, kramper, spytflaad, diarré, apati, soevn og bevidstloeshed. Doedstidspunktet noteres med stoerst mulig noejagtighed.

De dyr, der doer under forsoeget, og de dyr, der overlever til forsoegets afslutning, obduceres. Alle makroskopisk patologiske forandringer registreres. Paa indikation udtages der vaevsproever til histopatologisk undersoegelse.

Vurdering af toksiciteten hos det modsatte koen

Efter afslutning af undersoegelsen med det ene koen testes en gruppe paa fem dyr af det modsatte koen, saa det konstateres, om dyr af dette koen er vaesentligt mere foelsomme over for teststoffet. I enkelte tilfaelde kan anvendelse af faerre dyr vaere velbegrundet. Foreligger der tilstraekkelige oplysninger om, at dyr af det koen, der er testet, er vaesentligt mere foelsomme, er test med dyr af det modsatte koen ikke paakraevet.

2. DATA

Data opstilles i tabelform, som for hver gruppe viser antal dyr ved begyndelsen af forsoeget, doedstidspunkt for de enkelte dyr, hvor mange dyr der udviser andre symptomer paa toksicitet, beskrivelse af toksiske virkninger og obduktionsresultater. Forsoegsdyrenes individuelle vaegt bestemmes og registreres kort foer teststoffet indgives, derefter ugentligt og endelig paa doedstidspunktet. Vaegtaendringer beregnes og registreres for alle dyr, der lever mere end én dag efter indgivelsen af teststoffet. Aflivning af dyr paa human maade paa grund af lidelse og smerte fremkaldt af teststoffet registreres som teststofrelaterede doedsfald. LD50 bestemmes efter en anerkendt metode. Evaluering af data boer omfatte sammenhaeng, hvis en saadan findes, mellem dyrenes eksponering for teststoffet og hyppighed og grad af alle forandringer, herunder adfaerdsmaessige og kliniske symptomer, makroskopisk patologiske forandringer, aendringer i legemsvaegt, doedelighed og eventuelle andre toksiske virkninger.

3. RAPPORTERING

3.1. FORSOEOGSRAPPORT

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- dyreart/stamme, herkomst, miljoebetingelser, foder o.s.v.

- forsoegsbetingelser

- dosisniveauer (med angivelse af typen af vehikel, hvor et saadant er anvendt, samt koncentration)

- forsoegsdyrenes koen

- tabelopstilling over reaktioner efter koen og dosis (d.v.s. antal dyr, der er doede eller aflivet under forsoeget; antal dyr, der har vist symptomer paa toksicitet; antal eksponerede dyr)

- doedstidspunktet efter indgift, begrundelse og kriterier for human aflivning af dyr

- alle observationer

- LD50 for det koen, der har vaeret genstand for en fuldstaendig undersoegelse, bestemt efter 14. dag (med angivelse af beregningsmetode)

- 95 % konfidensinterval for LD50 (hvor det er muligt)

- dosis/doedelighedskurve og haeldning (hvor beregningsmetoden muliggoer det)

- obduktionsfund

- eventuelle histopatologiske fund

- resultater af forsoeg med det modsatte koen

- diskussion af resultaterne (med saerlig opmaerksomhed paa, hvordan human aflivning af dyr under forsoeget kan have indvirket paa den beregnede LD50

- fortolkning af resultaterne.

3.2. VURDERING OG FORTOLKNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt D).

4. LITTERATURHENVISNINGER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt E).

B.1 bis. AKUT TOKSICITET (ORAL INDGIFT) - FASTDOSIS-METODE

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Se den generelle indledning afsnit B (punkt A).

1.2. DEFINITIONER

Se den generelle indledning afsnit B (punkt B).

1.3. REFERENCESTOFFER

Ingen.

1.4. PRINCIPPET I TESTMETODEN

Testen for akut toksicitet ved oral indgift giver oplysninger om de skadelige virkninger, der kan vise sig kort tid efter indtagelse af en enkelt dosis af teststoffet.

Den faste dosismetode gennemfoeres i to faser.

I en indledende observationsundersoegelse foretages en sekventiel undersoegelse af virkningerne af forskellige doser indgivet oralt ved hjaelp af sonde til enkelte dyr af et koen. Observationsundersoegelsen giver oplysninger om forholdet mellem dosis og toksicitet, herunder et skoen over mindste doedelige dosis. Normalt bruges hoejst fem dyr i denne foerste fase.

I hovedundersoegelsen indgives stoffet oralt ved hjaelp af sonde til grupper af fem handyr og fem hundyr ved et af de forud fastsatte dosisniveauer (5, 50, 500 eller 2 000 mg/kg). Den anvendte dosis beregnes paa grundlag af observationsundersoegelsen, og er den dosis, der sandsynligvis vil medfoere »tydelige tegn paa toksicitet« (se punkt 1.2 Definitioner), men ingen doedsfald.

Efter indgift observeres virkningerne paa forsoegsdyrene.

Naar det foerst valgte dosisniveau fremkalder tydelige tegn paa toksicitet, men ikke nogen stofrelateret doedelighed, er yderligere testning unoedvendig.

Naar der ikke konstateres tydelige tegn paa toksicitet ved det valgte dosisniveau, boer stoffet testes igen med den dosis, som ligger lige over det foerst valgte dosisniveau. Naar dyr doer, eller udviser en kraftig toksisk reaktion, som kraever human aflivning af dyrene, skal stoffet testes igen med den dosis, som ligger lige under det foerst valgte dosisniveau.

Denne fremgangsmaade goer det muligt at identificere den »kritiske dosis« (se punkt 1.2 Definitioner), dvs. den hoejeste af de forud fastsatte doser, som dyrene kan udsaettes for, uden at det medfoerer doedsfald (herunder human aflivning).

Dyr, som udviser alvorlige og vedvarende tegn paa lidelse og smerte, maa evt. aflives humant. Dosering af teststoffer paa en maade, som man ved giver udtalt smerte eller lidelse paa grund af aetsning eller lokalirriterende egenskaber, er overfloedig.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ingen.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN

1.6.1. Forberedelser

1.6.1.1. Forsoegsdyr

Rotter er de foretrukne forsoegsdyr, medmindre der foreligger kontraindikationer.

Der benyttes rotter af almindeligt anvendte stammer. For saavel han- som hunrotter gaelder det, at begyndelsesvaegten af de dyr, som anvendes ved et forsoeg, ikke maa variere mere end ± 20 % fra en rimelig gennemsnitsvaegt.

Dyrene holdes under forsoegsbetingelser med hensyn til miljoe og fodring i mindst 5 dage, inden forsoeget begyndes. Unge, sunde, koensmodne dyr skal fordeles randomiseret i grupper til observationsundersoegelsen og hovedundersoegelsen. I praksis kan en gruppe af hvert koen vaere nok til hovedundersoegelsen.

1.6.1.2. Dosisforberedelse og indgivelse

Naar det er noedvendigt, oploeses eller opslemmes teststoffet i et passende vehikel. Det anbefales, at der saa vidt muligt anvendes en vandig oploesning, og hvis dette ikke er muligt, en oploesning i vegetabilsk olie, en oploesning i andre vehikler eller evt. en suspension. Ved ikke-vandige vehikler boer vehiklets relevante karakteristika vaere kendt eller, hvis de ikke kendes, bestemmes forud for eller i forbindelse med forsoeget. Hos gnavere boer volumen normalt ikke overstige 10 ml/kg legemsvaegt, undtagen ved anvendelse af vandige oploesninger, hvor op til 20 ml/kg kan anvendes.

Forskelle i volumen skal goeres mindst mulig ved at justere koncentrationen og saaledes sikre, at volumen er konstant ved alle doser.

Dyrene skal faste, inden teststoffet indgives. Rotter maa ikke fodres natten foer teststoffet indgives; der skal vaere fri adgang til drikkevand. Den foelgende dag vejes dyrene, og teststoffet indgives i en enkelt dosis med mave-sonde. Hvis det ikke er muligt at give hele dosis paa én gang, kan den gives i mindre portioner over et tidsrum, der ikke maa overstige 24 timer. Naar teststoffet er indgivet, kan man undlade at give dyrene foder i yderligere tre til fire timer. Hvis en dosis indgives i mindre portioner over et tidsrum, kan det vaere noedvendigt at give dyrene foder og vand afhaengig af, hvor lang en periode der er tale om.

1.6.2. Fremgangsmaade

1.6.2.1. Observationsundersoegelse

Virkningerne af forskellige doser undersoeges hos enkelte dyr. Normalt anvendes hundyr, medmindre der foreligger oplysninger om, at handyr er de mest foelsomme. Doseringen er sekventiel, idet der skal gaa mindst 24 timer, foer en dosis gives til det naeste dyr. Alle dyr observeres omhyggeligt for tegn paa toksicitet i mindst syv dage. Hvis der efter syv dage stadig er tegn paa moderat toksicitet, skal dyrene observeres i endnu syv dage. Foelgende faste dosisniveauer er fastlagt : 5, 50, 500 og 2 000 mg/kg. Hvis det faste dosisniveau, som er valgt, ikke fremkalder alvorlig toksicitet, og det naestfoelgende hoejere niveau medfoerer doedelighed, er det noedvendigt at undersoege et eller flere mellemliggende dosisniveauer. Paa denne maade skulle det vaere muligt at faa oplysninger om det dosisniveau, som fremkalder tegn paa toksicitet, og det mindste dosisniveau, der fremkalder doedelighed.

Man boer forsoege at vaelge det faste dosisniveau paa grundlag af resultater i forbindelse med lignende kemikalier. Saafremt saadanne oplysninger ikke foreligger, foreslaas det, at der i foerste omgang anvendes en dosis paa 500 mg/kg. Hvis der ikke fremkommer nogen tegn paa toksicitet ved det faste dosisniveau, undersoeges det naeste hoejere dosisniveau. Hvis der ikke forekommer nogen doedelighed ved 2 000 mg/kg, er observationsundersoegelsen fuldfoert, og hovedundersoegelsen boer gennemfoeres ved dette dosisniveau. Hvis alvorlige virkninger, der noedvendiggoer human aflivning viser sig ved det faste dosisniveau (f.eks. 500 mg/kg), gives den umiddelbart lavere dosis (f.eks 50 mg/kg) til et andet dyr. Hvis dette dyr overlever, kan andre dyr gives passende doser mellem de faste dosisniveauer. Normalt boer der ikke anvendes mere end fem dyr i denne undersoegelse.

1.6.2.2. Hovedundersoegelse

Der anvendes mindst 10 dyr (5 hundyr og 5 handyr) til hvert dosisniveau. Hundyrene maa ikke have foedt og maa ikke vaere draegtige.

Det er et princip i fastdosis-metoden, at der kun anvendes moderat toksiske doser. Indgift af doedelige doser af teststoffet skal undgaas.

Det dosisniveau, som anvendes ved forsoeget, skal vaelges fra et af de fire faste dosisniveauer, nemlig 5, 50, 500 eller 2 000 mg/kg legemsvaegt. Det niveau, som vaelges foerst, skal vaere det niveau, som med stoerst sandsynlighed fremkalder tydelige tegn paa toksicitet, men ingen stofrelateret doedelighed (herunder human aflivning; doedsfald ved ulykke er ikke inkluderet, men skal registreres). Naar et dosisniveau fremkalder tydelige tegn paa toksicitet, men ingen stofrelateret doedelighed, er yderligere testning unoedvendig.

Naar der ikke fremkommer tydelige tegn paa toksicitet efter indgift af den valgte dosis, skal stoffet testes igen ved det naeste hoejere dosisniveau. Dyrene skal imidlertid holdes under observation indtil afslutningen af observationsperioden. Naar en kraftig toksisk reaktion goer det paakraevet, at dyrene aflives humant, eller naar der foreligger stofrelateret doedelighed, skal stoffet testes igen ved det naeste lavere dosisniveau. Ogsaa her skal de dyr, som det ikke har vaeret noedvendigt at aflive, holdes under observation i hele observationsperioden.

Efter indgift af teststoffet fortages der systematiske observationer, som registreres for hvert enkelt dyr.

Observationsperioden skal vaere mindst 14 dage. Dens varighed boer dog ikke fastsaettes rigoristisk. Den boer bestemmes ud fra toksiske reaktioner, tidspunktet for disses indtraeden og restitutionsperiodens laengde; den boer saaledes forlaenges, saafremt det anses for noedvendigt. Tidspunktet for, hvornaar symptomer paa toksicitet erkendes og forsvinder, samt doedstidspunktet er vigtigt, navnlig hvis der er tendens til, at symptomerne paa toksicitet indtraeder med nogen forsinkelse.

Der skal foretages en grundig klinisk undersoegelse mindst to gange den dag, hvor teststoffet indgives, og mindst én gang hver dag derefter. Dyr, som tydeligvis har smerter, eller som udviser alvorlige tegn paa lidelse, skal aflives humant. Supplerende observationer er noedvendige i de foerste dage efter indgift af teststoffet, hvis dyrene fortsaetter med at udvise tegn paa toksicitet. Forsoeget kan afsluttes, hvis det viser sig, at det foerst valgte dosisniveau var for hoejt.

Observationerne af dyrene skal omfatte forandringer i hud og pels, oejne og slimhinder, derudover aandedraet og kredsloeb, det autonome og centrale nervesystem, den motoriske aktivitet og adfaerdsmoenster. Der boer navnlig foretages en omhyggelig observation for forekomst af rystelser, kramper, spytflaad, diarré, apati, soevn og bevidstloeshed.

Dyrene vejes kort tid inden teststoffet indgives, dernaest én gang om dagen i de naeste tre dage og én gang om ugen derefter. De dyr, som doer under forsoeget, og de dyr, som overlever forsoeget, vejes og obduceres. Alle makroskopisk patologiske forandringer registreres. Paa indikation udtages der vaevsproever til histopatologisk undersoegelse.

Undersoegelse af et andet eller i sjaeldne tilfaelde et tredje dosisniveau kan vaere noedvendig, afhaengig af resultaterne af forsoeget med det foerst valgte dosisniveau.

Saafremt et stof fremkalder doedsfald ved 5 mg/kg (eller naar en range finding study viser, at der sandsynligvis vil forekomme doedsfald ved dette dosisniveau), kan det vaere noedvendigt at foretage en yderligere undersoegelse af stoffets akutte toksicitet.

2. DATA

Data fra baade observationsundersoegelsen og hovedundersoegelsen opstilles i tabelform, som for hvert testet dosisniveau viser: antal dyr ved begyndelsen af forsoeget; antal dyr, der udviser tegn paa toksicitet; antal dyr, som findes doede under forsoeget, eller som aflives af humane aarsager; en beskrivelse af de toksiske virkninger og for hovedundersoegelsens vedkommende af, hvorvidt der er konstateret tydelige stofrelaterede tegn paa toksicitet; tidsforloebet for de toksiske virkninger og obduktionsfund. AEndringer i vaegt skal beregnes og registreres, naar et dyr lever mere end én dag efter indgift af teststoffet.

Dyr, som er aflivet af humane aarsager paa grund af stofrelateret lidelse og smerte, registreres som stofrelaterede doedsfald.

3. RAPPORTERING

3.1. FORSOEGSRAPPORT

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger for baade observationsundersoegelsen og hovedundersoegelsen

- dyreart, stamme, herkomst, miljoebetingelser, foder osv.

- forsoegsbetingelser

- dosisniveauer (med angivelse af typen af vehikel, hvor et saadant er anvendt, samt koncentration)

- samtlige resultater af alle de undersoegte dosisniveauer

- tabelopstilling over reaktioner efter koen og dosis (dvs. antal doserede dyr; aendringer i vaegt; antal doede dyr eller antal dyr, som er aflivet under forsoeget, hvor noget saadant har fundet sted; antal dyr, som har vist tegn paa toksicitet; art, svaerhedsgrad og varighed af virkningerne)

- tidspunkt for fremkomst af symptomer paa toksicitet og angivelse af, hvorvidt disse symptomer forsvinder igen

- doedstidspunktet efter doseringen, naar dyr er doede eller er blevet aflivet, samt aarsager til og kriterier for human aflivning af dyrene

- obduktionsfund

- evt. histopatologiske fund

- diskussion af resultaterne

- fortolkning af resultaterne, herunder tydelige tegn paa toksicitet og det kritiske dosisniveau, som er blevet paavist under forsoeget.

3.2. VURDERING OG FORTOLKNING

>TABELPOSITION>

Se ligeledes den generelle indledning til del B (D).

4. LITTERATURHENVISNINGER

Se den generelle indledning til del B (E).

B.2. AKUT TOKSICITET (INHALATION)

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Det er nyttigt at have forhaandsoplysninger om stoffets partikelstoerrelsesfordeling, damptryk, smeltepunkt, kogepunkt, flammepunkt og eventuelle eksplosive egenskaber.

Se ogsaa den generelle indledning til afsnit B (punkt A).

1.2. DEFINITIONER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt B).

1.3. REFERENCESTOFFER

Ingen.

1.4. TESTMETODENS PRINCIP

Flere grupper forsoegsdyr udsaettes i en angivet periode for teststoffet i graduerede koncentrationer, idet der anvendes en bestemt koncentration til hver enkelt gruppe. Der foretages observationer af virkningerne, herunder doed. Dyr, der doer under forsoeget, obduceres. Ved slutningen af forsoeget aflives og obduceres overlevende dyr.

Det kan vaere noedvendigt, at dyr, der viser vedvarende symptomer paa staerk smerte eller lidelse, aflives paa human maade. Undersoegelse af stoffer paa en maade, som paa grund af deres aetsende eller lokalirriterende egenskaber vides at volde betydelig smerte og lidelse, er ikke paakraevet.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ingen.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN

1.6.1. Forberedelser

Dyrene holdes under forsoegsbetingelser med hensyn til miljoe og fodring i mindst fem dage, inden forsoeget paabegyndes. Unge, sunde, koensmodne rotter fordeles randomiseret i det noedvendige antal grupper, inden forsoeget saettes i gang. De behoever ikke udsaettes for simuleret eksponering, medmindre dette indiceres af den type eksponeringsudstyr, der anvendes.

Det kan vaere noedvendigt at mikronisere faste teststoffer for at opnaa en passende partikelstoerrelse.

Om noedvendigt kan der tilsaettes et egnet vehikel til teststoffet, saaledes at der opnaas en passende koncentration af teststoffet i luften. I saa tilfaelde skal der i forsoeget indgaa en kontrolgruppe, der udsaettes for vehiklet. Hvis der anvendes et vehikel eller andre tilsaetningsstoffer for at lette doseringen, skal det vaere paavist, at de ikke har nogen toksisk virkning. Her kan tidligere data benyttes.

1.6.2. Forsoegsbetingelser

1.6.2.1. Forsoegsdyr

Rotter er de foretrukne forsoegsdyr, medmindre der foreligger kontraindikationer. Der benyttes rotter af almindeligt anvendte stammer. For saavel han- som hunrotter gaelder det, at vaegten af de anvendte dyr ikke maa variere mere end ± 20 % fra en rimelig gennemsnitsvaegt ved forsoegets begyndelse.

1.6.2.2. Antal og koen

Der anvendes mindst 10 gnavere (fem hunner og fem hanner) til hvert koncentrationsniveau af stoffet. Hunnerne maa ikke have foedt og maa ikke vaere draegtige.

Bemaerk: Ved anvendelse af hoejere dyr end gnavere til undersoegelse af akut toksicitet skal det overvejes, om antallet af dyr kan nedsaettes. Doserne skal fastlaegges med omhu, og man skal bestraebe sig paa ikke at benytte hoejere doser end moderat toksiske doser. I saadanne undersoegelser boer indgift af doedelige doser af teststoffet undgaas.

1.6.2.3. Eksponeringskoncentrationer

Der anvendes et tilstraekkeligt antal dosisniveauer, mindst tre, og disse skal vaere valgt saaledes, at der opnaas en graduering af de toksiske virkninger og doedeligheden i testgrupperne. Der skal vaere tilstraekkelige data til, at der kan optegnes en dosis-virkningskurve og om muligt foretages en rimelig bestemmelse af LC50.

1.6.2.4. Graensetest

Hvis eksponering af fem han- og fem hundyr for 5 mg/l af en gas eller af en aerosol af en vaeske eller et fast stof (eller den hoejeste opnaaelige koncentration, dersom stoffets fysiske eller kemiske, herunder eksplosive, egenskaber umuliggoer opnaaelse af den naevnte koncentration) i fire timer ikke har teststofrelateret doedelig virkning inden for 14 dage, kan yderligere forsoeg betragtes som overfloedige.

1.6.2.5. Eksponeringstid

Eksponeringsperioden er fire timer.

1.6.2.6. Udstyr

Dyrene testes med inhalationsudstyr, der er udformet saaledes, at der kan opretholdes en dynamisk luftcirkulation med et luftskifte paa mindst 12 gange pr. time samtidig med et tilstraekkeligt iltindhold og jaevn fordeling af eksponeringsluften. Benyttes der eksponeringskammer, skal det vaere saaledes indrettet, at forsoegsdyrene sammenklumpes mindst muligt og eksponeres mest muligt for teststoffet ved inhalation. Den generelle regel for sikkerhed for stabil atmosfaere er, at dyrenes totale »volumen« ikke maa overstige 5 % af eksponeringskammerets volumen. Eksponeringen kan foregaa gennem mund-naese, hovedet alene eller ved kamre til hele kroppen; ved anvendelse af de to foerste muligheder opnaar man, at optagelsen af teststoffet ad andre veje minimeres.

1.6.2.7. Observationsperiode

Observationsperioden skal vaere mindst 14 dage. Observationsperiodens varighed boer dog ikke fastsaettes rigoristisk, men bestemmes ud fra de toksiske reaktioner, hvornaar disse indtraeder, og restitutionsperiodens laengde; den kan saaledes forlaenges, saafremt det anses for noedvendigt. Tidspunktet for, hvornaar symptomer paa toksicitet erkendes og forsvinder, samt doedstidspunktet er vigtige, navnlig hvis der er tendens til, at der indtraeffer sene doedsfald.

1.6.3. Fremgangsmaade

Kort foer eksponeringen vejes dyrene, hvorefter de udsaettes for testkoncentrationen i det paagaeldende eksponeringsudstyr i fire timer, efter at der er opnaaet ligevaegtskoncentration i kammeret. Ligevaegten skal opnaas hurtigt. Temperaturen holdes under forsoeget paa 22 C ± 3 C. Under ideelle forhold skal den relative luftfugtighed holdes paa mellem 30 % og 70 %, men i visse tilfaelde (f.eks. ved test af visse aerosoler) kan det vaere praktisk uigennemfoerligt. Udsivning af teststof til omgivelserne kan forhindres ved, at der i kammeret holdes et svagt undertryk (≤ 5 mm vandsoejle). Der gives hverken foder eller vand under eksponeringen. Der anvendes passende systemer til generering og kontrol af testatmosfaeren. Systemet skal sikre stabile eksponeringsforhold saa hurtigt som muligt. Kammeret skal vaere konstrueret og kunne betjenes paa en saadan maade, at testatmosfaeren hele tiden er ensartet fordelt i kammeret.

Der foretages maalinger eller kontrol af

(a) lufthastighed (kontinuerligt)

(b) den faktiske koncentration af teststoffet maalt i opholdsarealet mindst tre gange under eksponeringen (for nogle atmosfaerers vedkommende, f.eks. aerosoler med hoeje koncentrationer, kan hyppigere kontrol vaere paakraevet). Koncentrationen maa under eksponeringsperioden ikke variere mere end ± 15 % fra den gennemsnitlige koncentration. Det kan dog vaere umuligt at opnaa en saadan grad af kontrol med visse aerosoler, og i saa tilfaelde kan stoerre udsving accepteres. For aerosoler skal partikelstoerrelsen analyseres saa ofte, som det er noedvendigt (mindst én gang pr. forsoegsgruppe)

(c) temperatur og luftfugtighed, om muligt kontinuerligt.

Under og efter eksponering foretages der systematiske observationer, som registreres for hvert enkelt dyr. Observationerne skal foretages hyppigt i loebet af den foerste dag. Der skal foretages en grundig klinisk undersoegelse mindst én gang hver arbejdsdag. Herudover boer dyrene dagligt observeres, saa det mindst mulige antal dyr gaar tabt for undersoegelsen, d.v.s. at dyr, der findes doede, obduceres eller nedkoeles, og at svage eller doeende dyr isoleres eller aflives.

Inspektion af dyrene skal omfatte forandringer i hud og pels, oejne og slimhinde, derudover aandedraet og kredsloeb, det autonome og centrale nervesystem, den motoriske aktivitet og adfaerdsmoensteret. Der boer navnlig foretages en omhyggelig observation af respiration, rystelser, kramper, spytflaad, diarré, apati, soevn og bevidstloeshed. Doedstidspunktet noteres med stoerst mulig noejagtighed. Forsoegsdyrenes individuelle vaegt bestemmes ugentligt og paa doedstidspunktet.

De dyr, der doer under forsoeget, og de, der overlever til forsoegets afslutning, obduceres med saerlig opmaerksomhed rettet mod eventuelle aendringer i de oevre og nedre luftveje. Alle makroskopisk patologiske forandringer registreres. Paa indikation udtages der vaevsproever til histopatologisk undersoegelse.

2. DATA

Data opstilles i tabelform, som for hver gruppe viser antal dyr ved begyndelsen af forsoeget, doedstidspunkt for de enkelte dyr, antal dyr, der udviser andre symptomer paa toksicitet, beskrivelse af toksiske virkninger og obduktionsfund. Vaegtaendringer beregnes og registreres for alle dyr, der lever mere end en dag efter eksponeringen. Aflivning af dyr paa human maade paa grund af lidelse og smerte fremkaldt af teststoffet registreres som teststofrelaterede doedsfald. LC50 bestemmes efter en anerkendt metode. Evaluering af data boer omfatte sammenhaeng, hvis en saadan findes, mellem dyrenes eksponering for teststoffet og hyppighed og grad af alle forandringer, herunder adfaerdsmaessige og kliniske symptomer, makroskopisk patologiske forandringer, aendringer i legemsvaegt, doedelighed og eventuelle andre toksiske virkninger.

3. RAPPORTERING

3.1. FORSOEGSRAPPORT

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- dyreart/stamme, herkomst, miljoebetingelser, foder o.s.v.

- forsoegsbetingelser

beskrivelse af eksponeringsudstyret, herunder udformning, type, dimensionering, luftkilde, system til frembringelse af aerosoler, metode til konditionering af luften og den maade, hvorpaa dyrene holdes i et eksponeringskammer, naar et saadant benyttes. Apparatur til maaling af temperatur, fugtighed og aerosolers koncentration og partikelstoerrelsesfordeling skal beskrives

Eksponeringsdata

disse skal opstilles i tabelform med angivelse af middelvaerdier og et maal for variationen (standardafvigelser) og i videst muligt omfang omfatte

(a) lufthastigheden gennem inhalationsudstyret

(b) luftens temperatur og fugtighed

(c) nominelle koncentrationer (total maengde teststof tilfoert inhalationsudstyret, divideret med luftvolumen)

(d) type vehikel, hvor et saadant er anvendt

(e) faktiske koncentrationer i opholdsarealet under forsoeget

(f) massemedianen af den aerodynamiske diameter (MMAD) og den geometriske standardafvigelse (GSD)

(g) periode til ligevaegtsindstilling

(h) eksponeringsperiode

- tabelopstilling over reaktioner efter koen og eksponeringsniveau (d.v.s. antal dyr eksponeret; antal dyr, der er doede eller aflivet under forsoeget; antal dyr, der har vist symptomer paa toksicitet)

- doedstidspunktet under eller efter eksponering; begrundelse og kriterier for human aflivning af dyr

- alle observationer

- LC50 for hvert koen bestemt ved afslutningen af observationsperioden (med angivelse af beregningsmetode)

- 95 % konfidensinterval for LC50 (hvor det er muligt)

- dosis/doedelighedskurve og haeldning (hvor beregningsmetoden muliggoer det)

- obduktionsfund

- eventuelle histopatologiske fund

- diskussion af resultaterne (med saerlig opmaerksomhed paa, hvordan human aflivning af dyr under forsoeget kan have indvirket paa den beregnede LC50)

- fortolkning af resultaterne.

3.2. VURDERING OG FORTOLKNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt D).

4. LITTERATURHENVISNINGER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt E).

B.3. AKUT TOKSICITET (DERMAL)

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt A).

1.2. DEFINITIONER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt B).

1.3. REFERENCESTOFFER

Ingen.

1.4. TESTMETODENS PRINCIP

Teststoffet paafoeres huden paa flere grupper af forsoegsdyr i graduerede doser, idet der anvendes en bestemt dosis til hver enkelt gruppe. Der foretages observationer af virkningerne, herunder doed. Dyr, der doer under forsoeget, obduceres. Ved slutningen af forsoeget aflives og obduceres overlevende dyr.

Det kan vaere noedvendigt, at dyr, der viser vedvarende symptomer paa staerk smerte eller lidelse, aflives paa human maade. Undersoegelse af stoffer paa en maade, som paa grund af deres aetsende eller lokalirriterende egenskaber vides at volde betydelig smerte og lidelse, er ikke paakraevet.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ingen.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN

1.6.1. Forberedelser

Dyrene holdes under forsoegsbetingelser med hensyn til miljoe og fodring i mindst fem dage, inden forsoeget paabegyndes. Unge, sunde, koensmodne dyr fordeles randomiseret i forsoegsgrupper, inden forsoeget saettes i gang. Ca. 24 timer foer forsoeget paabegyndes, klippes eller barberes dyrene paa ryggen. Under denne procedure maa man passe paa ikke at beskadige huden, da det kan aendre dens permeabilitet. Mindst 10 % af legemets overflade skal goeres klar til paafoering af teststoffet. Ved testning af faste stoffer, som i givet fald kan pulveriseres, skal teststoffet fugtes tilstraekkeligt med vand eller om noedvendigt med et passende vehikel, saa der sikres god kontakt med huden. Hvis der anvendes et vehikel, boer man tage hensyn til, om vehiklet har indflydelse paa hudens permeabilitet for teststoffet. Flydende teststoffer paafoeres normalt ufortyndet.

1.6.2. Forsoegsbetingelser

1.6.2.1. Forsoegsdyr

Der kan anvendes voksne rotter eller kaniner. Der kan anvendes andre dyrearter, men i saa fald skal dette vaere begrundet. Der benyttes dyr af almindeligt anvendte stammer. For begge koen af forsoegsdyr gaelder det, at vaegten af de anvendte dyr ikke maa variere mere end ± 20 % fra en rimelig gennemsnitsvaegt ved forsoegets begyndelse.

1.6.2.2. Antal og koen

Der anvendes mindst 5 dyr (af samme koen) til hvert dosisniveau. Hunnerne maa ikke have foedt og maa ikke vaere draegtige. Foreligger der oplysninger om, at et bestemt koen er vaesentligt mere foelsomt, benyttes der dyr af dette koen.

Bemaerk: Ved anvendelse af hoejere dyr end gnavere til undersoegelse af akut toksicitet skal det overvejes, om antallet af dyr kan nedsaettes. Doserne skal fastlaegges med omhu, og man skal bestraebe sig paa ikke at benytte hoejere doser end moderat toksiske doser. I saadanne undersoegelser boer indgift af doedelige doser af teststoffet undgaas.

1.6.2.3. Dosisniveauer

Der anvendes et tilstraekkeligt antal dosisniveauer, mindst tre, og disse skal vaere valgt saaledes, at der opnaas en graduering af de toksiske virkninger og doedeligheden i testgrupperne. Der boer ved valg af dosis tages hensyn til eventuelle hudirriterende eller aetsende virkninger. Der skal vaere tilstraekkelige data til, at der kan optegnes en dosis-virkningskurve og om muligt foretages en rimelig bestemmelse af LD50.

1.6.2.4. Graensetest

Der kan med en gruppe paa 5 dyr af hvert koen udfoeres en graensetest med en dosis paa mindst 2 000 mg/kg legemsvaegt efter den ovenfor beskrevne procedure. Optraeder der teststofrelaterede doedsfald, kan gennemfoerelse af en fuldstaendig undersoegelse komme i betragtning.

1.6.2.5. Observationsperiode

Observationsperioden skal vaere mindst 14 dage. Observationsperiodens varighed boer dog ikke fastsaettes rigoristisk, men bestemmes ud fra de toksiske reaktioner, hvornaar disse indtraeder, og af restitutionsperiodens laengde; den kan saaledes forlaenges, saafremt det anses for noedvendigt. Tidspunktet for, hvornaar symptomer paa toksicitet erkendes og forsvinder, samt doedstidspunktet er vigtige, navnlig hvis der er tendens til, at der indtraeffer sene doedsfald.

1.6.3. Fremgangsmaade

Dyrene holdes i hver sit bur. Teststoffet paafoeres jaevnt over et omraade, som svarer til ca. 10 % af den samlede legemsoverflade. Med staerkt toksiske stoffer kan der anvendes et mindre omraade, men stoffet boer paafoeres saa tyndt og ensartet og over saa stor en del af omraadet som muligt.

Teststoffet skal holdes i kontakt med huden ved hjaelp af en poroes gazeforbinding og en ikke-hudirriterende klaebestrimmel i en eksponeringsperiode paa 24 timer. Teststedet skal desuden tildaekkes paa en saadan maade, at gazeforbindingen og teststoffet holdes sikkert paa plads, saa at dyrene ikke kan indtage teststoffet. Der kan anvendes andre foranstaltninger, som forhindrer dyrene i at indtage teststoffet; dog kan fuldstaendig immobilisering ikke anbefales.

Ved eksponeringsperiodens afslutning fjernes tilbagesiddende teststof, idet der f.eks. anvendes vand eller et andet egnet middel til at rense huden.

Der foretages systematiske observationer, som registreres for hvert enkelt dyr. Observationerne skal foretages hyppigt i loebet af den foerste dag. Der skal foretages en grundig klinisk undersoegelse mindst én gang hver arbejdsdag. Herudover boer dyrene dagligt observeres, saa det mindst mulige antal dyr gaar tabt for undersoegelsen, d.v.s. at dyr, der findes doede, obduceres eller nedkoeles, og at svage eller doeende dyr isoleres eller aflives.

Inspektionen af dyrene skal omfatte forandringer i pels, behandlet hud, oejne og slimhinder, derudover aandedraet og kredsloeb, det autonome og centrale nervesystem, den motoriske aktivitet samt adfaerdsmoensteret. Der boer foretages omhyggelig observation af rystelser, kramper, spytflaad, diarré, apati, soevn og bevidstloeshed. Doedstidspunktet skal noteres saa praecist som muligt. De dyr, der doer under forsoeget, og de, der overlever til forsoegets afslutning, obduceres. Alle makroskopisk patologiske forandringer registreres. Paa indikation udtages der vaevsproever til histopatologisk undersoegelse.

Vurdering af toksiciteten hos det modsatte koen

Efter afslutning af undersoegelsen med det ene koen testes en gruppe paa 5 dyr af det modsatte koen, saa det konstateres, om dyr af dette koen er vaesentligt mere foelsomme over for teststoffet. I enkelte tilfaelde kan anvendelse af faerre dyr vaere velbegrundet. Foreligger der tilstraekkelige oplysninger om, at dyr af det koen, der er testet, er vaesentligt mere foelsomme, er test med dyr af det modsatte koen ikke paakraevet.

2. DATA

Data opstilles i tabelform, som for hver gruppe viser antal dyr ved begyndelsen af forsoeget, doedstidspunkt for de enkelte dyr, antal dyr, der udviser andre symptomer paa toksicitet, beskrivelse af toksiske virkninger og obduktionsresultater. Dyrenes individuelle vaegt bestemmes og registreres, kort foer teststoffet paafoeres, derefter ugentligt og endelig paa doedstidspunktet. Vaegtaendringer beregnes og registreres for alle dyr, der lever mere end én dag efter paafoeringen af teststoffet. Aflivning af dyr paa human maade paa grund af lidelse og smerte fremkaldt af teststoffet registreres som teststofrelaterede doedsfald. LD50 bestemmes efter en anerkendt metode.

Evaluering af data boer omfatte sammenhaeng, hvis en saadan findes, mellem dyrenes eksponering for teststof og hyppighed og grad af alle forandringer, herunder adfaerdsmaessige og kliniske symptomer, makroskopisk patologiske forandringer, aendringer i legemsvaegt, doedelighed og eventuelle andre toksiske virkninger.

3. RAPPORTERING

3.1. FORSOEGSRAPPORT

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- dyreart/stamme, herkomst, miljoebetingelser, foder o.s.v.

- forsoegsbetingelser (herunder, hvordan huden er renset, og forbindingstypen: med eller uden okklusion)

- dosisniveauer (med angivelse af typen af vehikel, hvor et saadant er anvendt, samt koncentration)

- forsoegsdyrenes koen

- tabelopstilling over reaktioner efter koen og dosis (d.v.s. antal dyr, der er doede eller aflivet under forsoeget; antal dyr, der har vist symptomer paa toksicitet; antal eksponerede dyr)

- doedstidspunktet efter eksponeringen, begrundelse og kriterier for human aflivning af dyr

- alle observationer

- LD50 for det koen, der har vaeret genstand for en fuldstaendig undersoegelse, bestemt efter 14. dag med angivelse af beregningsmetode

- 95 % konfidensinterval for LD50 (hvor det er muligt)

- dosis/doedelighedskurve og haeldning, hvor beregningsmetoden muliggoer det

- obduktionsfund

- eventuelle histopatologiske fund

- resultater af forsoeg med det modsatte koen

- diskussion af resultaterne (med saerlig opmaerksomhed paa, hvordan human aflivning af dyr under forsoeget kan have indvirket paa den beregnede LD50)

- fortolkning af resultaterne.

3.2. VURDERING OG FORTOLKNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt D).

4. LITTERATURHENVISNINGER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt E).

B.4. AKUT TOKSICITET (HUDIRRITATION)

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt A).

1.2. DEFINITIONER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt B).

1.3. REFERENCESTOFFER

Ingen.

1.4. TESTMETODENS PRINCIP

Indledende betragtninger

Alle foreliggende oplysninger om teststoffet skal tages under omhyggelig overvejelse, saa der foretages faerrest mulige forsoeg med stoffer under betingelser, der maa formodes at give voldsom reaktion. Foelgende oplysninger kan vaere til nytte, naar det skal afgoeres, om der skal udfoeres en fuldstaendig undersoegelse, en enkeltdyrsundersoegelse eller slet ingen undersoegelse.

i) Fysisk-kemiske egenskaber og kemisk reaktivitet. Staerkt sure og staerkt basiske stoffer (f.eks. pH under eller lig med 2 eller over eller lig med 11,5) behoever muligvis ikke at blive testet for primaer hudirritation, hvis der maa forventes aetsende egenskaber. Der skal desuden tages hensyn til stoffets syre-/base-kapacitet.

ii) Foreligger der resultater af godt validerede in vitro-test, der tydeligt peger paa alvorlige virkninger, er en fuldstaendig undersoegelse ikke altid paakraevet.

iii) Resultater af undersoegelser af akut toksicitet. Er der foretaget undersoegelse af akut toksicitet ved optagelse gennem huden med en dosis af stoffet paa graensetestniveau (2 000 mg/kg legemsvaegt) og ikke iagttaget nogen hudirritation, kan yderligere test for hudirritation vaere overfloedig. Test af stoffer, der er vist at have et hoejt niveau af giftighed ved optagelse gennem huden, er ligeledes unoedvendig.

Teststoffet paafoeres huden i en enkelt dosis paa en raekke forsoegsdyr, der hver isaer fungerer som sin egen kontrol. Efter et fastlagt tidsrum vurderes og klassificeres graden af irritation, som desuden beskrives detaljeret med henblik paa en fuldstaendig vurdering af virkningerne. Observationerne boer straekke sig over et saa langt tidsrum, at der bliver mulighed for en fuldstaendig vurdering af, om de iagttagne virkninger er reversible.

Det kan vaere noedvendigt, at dyr, der viser vedvarende symptomer paa staerk smerte eller lidelse, aflives paa human maade.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ingen.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN

1.6.1. Forberedelser

Ca. 24 timer foer forsoeget paabegyndes, klippes eller barberes dyrene paa ryggen.

Under denne procedure maa man passe paa ikke at beskadige huden. Der benyttes kun dyr med sund og intakt hud.

Nogle kaninstammer har pletter med taet pels, som er mere fremtraedende paa visse tidspunkter af aaret. Der paafoeres ikke teststof paa disse omraader med taet haarvaekst.

Ved test af faste stoffer, som i givet fald kan pulveriseres, skal teststoffet fugtes tilstraekkeligt med vand eller om noedvendigt med et passende vehikel, saa der sikres god kontakt med huden. Hvis der anvendes et vehikel, boer man tage hensyn til, om vehiklet har indflydelse paa teststoffets hudirriterende virkning. Flydende teststoffer paafoeres normalt ufortyndet.

1.6.2. Forsoegsbetingelser

1.6.2.1. Forsoegsdyr

Albinokaniner er det foretrukne forsoegsdyr, selv om mange andre pattedyrarter ogsaa kan anvendes.

1.6.2.2. Antal dyr

Hvis stoffet paa grundlag af in vitro-screeningsforsoeg eller af andre aarsager mistaenkes for at fremkalde nekrose (d.v.s. at vaere aetsende), kan en enkeltdyrsundersoegelse komme paa tale. Hvis en saadan undersoegelse ikke tyder paa aetsning, suppleres den med en undersoegelse med yderligere mindst to dyr.

Til en fuldstaendig undersoegelse anvendes der mindst tre sunde koensmodne dyr. Det er ikke noedvendigt at anvende en saerskilt kontrolgruppe af ubehandlede dyr. Det kan vaere noedvendigt at anvende flere dyr for at afklare tvetydige reaktioner.

1.6.2.3. Dosisniveau

Medmindre der foreligger kontraindikationer, paafoeres testarealet 0,5 ml flydende eller 0,5 g fast eller halvflydende teststof. Naerliggende, ubehandlede hudomraader paa hvert enkelt dyr fungerer som kontrol.

1.6.2.4. Observationsperiode

Observationsperiodens varighed boer ikke fastsaettes rigoristisk. Den skal vaere tilstraekkelig lang til at vurdere den observerede virkning og en eventuel tilbagevenden til normaltilstanden, men behoever ikke i almindelighed overskride 14 dage efter paafoeringen.

1.6.3. Fremgangsmaade

Dyrene holdes i hver sit bur. Teststoffet paafoeres et lille hudomraade (ca. 6 cm2) og daekkes med et stykke gaze, som holdes paa plads med en ikke-hudirriterende klaebestrimmel. Hvis der anvendes flydende eller pastaagtige teststoffer, kan det vaere noedvendigt at paafoere gazestoffet teststoffet og saa placere gazestykket paa huden. Gazestykket skal holdes i loes kontakt med huden v.h.a. en passende occlusiv eller semi-occlusiv forbinding i hele eksponeringsperioden. Man skal sikre sig, at dyrene ikke kan komme til at loesne gazestykket og herved indtage eller indaande teststoffet.

Ved eksponeringsperiodens afslutning skal rester af teststoffet fjernes hvor dette er muligt, idet der bruges vand eller et passende oploesningsmiddel, idet men skal undgaa at paavirke en eventuel hudreaktion.

Eksponeringstiden er normalt fire timer.

Hvis det mistaenkes at stoffet kan medfoere nekroser (dvs. virke aetsende), skal eksponeringstiden nedsaettes (fx til 3 min. til 1 time). Ved en saadan undersoegelse kan man starte med at benytte et enkelt dyr. Hvis den dermale toksicitet af teststoffet ikke udelukker det, kan man samtidig bruge tre forbindinger paa dette forsoegsdyr. Den foerste forbinding fjernes efter tre minutter. Hvis der ikke observeres alvorlige hudreaktioner, fjernes den anden forbinding efter en time. Hvis observationerne paa dette trin antyder at en fire timers eksponering er noedvendig og kan udfoeres humant, fjernes den tredje forbinding efter fire timer og reaktionerne aflaeses. I dette tilfaelde (dvs naar fire timers eksponering er mulig), kompletteres testen idet der bruges mindst to dyr yderligere, bortset fra de tilfaelde hvor dette ikke skoennes humant (fx hvis der observeres nekroser efter fire timers eksponering).

Hvis en alvorlig hudreaktion observeres enten efter tre minutter eller en time, afsluttes testen oejeblikkeligt.

Laengere eksponering kan vaere indikeret under saerlige forhold, fx under hensyntagen til brugen af stoffet og menneskets eksponering.

1.6.3.1. Observering og gradering

Dyrene skal observeres for tegn paa erythem og oedem, og reaktionen skal aflaeses efter 60 minutter, 24 timer, 48 timer og 72 timer efter at forbindingen er fjernet. Hudreaktionen aflaeses og resultatet noteres i overensstemmelse med systemet i tabel 1. Yderligere observationer kan vaere noedvendige hvis tilbagevenden til normal tilstanden ikke helt har fundet sted inden for 72 timer. Udover observation af irritation, skal enhver alvorlig effekt saasom aetsning (irreversibel oedelaeggelse af hudvaev) og andre gift-effekter beskrives fuldstaendigt.

Teknikker saa som histopatologisk undersoegelse eller maaling af hudfold-tykkelse kan evt. bruges til at opklare tvivlsomme reaktioner som skjules af hudfarvning foraarsaget af teststoffet.

2. DATA

Data skal opgoeres i tabelform, idet irritationsgraderingen for erythem og oedem vises for hvert enkelt dyr i gennem hele observationsperioden. Ved enhver observeret alvorlig skade angives graden og naturen af irritation, reversibiliteten eller aetsvirkningen samt enhver anden toksisk effekt.

3. RAPPORTERING

3.1. FORSOEGSRAPPORT

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- dyreart/stamme, herkomst, miljoebetingelser, foder o.s.v.

- forsoegsbetingelser (herunder det kemiske stofs relevante fysisk-kemiske egenskaber, den anvendte teknik ved forberedelse og rensning af huden samt forbindingstypen: okklusiv eller semi-okklusiv)

- tabelopstilling over hvert enkelt dyrs irritationsreaktion i hver enkelt observationsperiode (f.eks. 1, 24, 48, 72 o.s.v. timer efter fjernelse af forbindingen)

- beskrivelse af alle alvorlige laesioner, inklusive aetsning

- beskrivelse af arten og graden af den observerede irritation og eventuelle histopatologiske fund- beskrivelse af eventuelle toksiske virkninger udover hudirritation

- diskussion af resultaterne

- fortolkning af resultaterne.

3.2. VURDERING OG FORTOLKNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt D).

4. LITTERATURHENVISNINGER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt E).

Bilag

>TABELPOSITION>

B.5. AKUT TOKSICITET (OEJENIRRITATION)

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt A).

1.2. DEFINITIONER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt B).

1.3. REFERENCESTOFFER

Ingen.

1.4. TESTMETODENS PRINCIP

Indledende betragtninger

Alle foreliggende oplysninger om teststoffet skal tages under omhyggelig overvejelse, saa der foretages faerrest mulige forsoeg med stoffer under betingelser, der maa formodes at give voldsom reaktion. Foelgende oplysninger kan vaere til nytte i denne henseende.

i) Fysisk-kemiske egenskaber og kemisk reaktivitet. Staerkt sure og staerkt basiske stoffer, som f.eks. forventes at foere til et pH i oejet paa under eller lig med 2 eller over eller lig med 11,5, behoever muligvis ikke at blive testet, hvis der maa forventes svaere laesioner. Der skal desuden tages hensyn til stoffets syre-/base-kapacitet.

ii) Resultater af godt validerede alternative undersoegelser; materialer, der er vist at have potentielle aetsende eller staerkt lokalirriterende egenskaber, undersoeges ikke yderligere for oejenirritation, da det maa antages, at saadanne stoffer vil paavirke oejet voldsomt ved den foreliggende forsoegsmetode.

iii) Resultater af undersoegelser af hudirritation. Materialer, der i en undersoegelse for hudirritation er vist at have tydelige aetsende eller staerkt lokalirriterende egenskaber, undersoeges ikke yderligere for oejenirritation, da det maa antages, at saadanne stoffer vil paavirke oejet voldsomt.

Hele teststofdosis paafoeres i det ene oeje af et antal forsoegsdyr. Det ubehandlede oeje benyttes som kontrol. Graden af irritation vurderes og klassificeres med bestemte intervaller og beskrives udfoerligt med henblik paa en fuldstaendig vurdering af virkningerne. Observationerne boer straekke sig over saa langt et tidsrum, at der bliver mulighed for en fuldstaendig vurdering af, om de iagttagne virkninger er reversible eller irreversible.

Det kan vaere noedvendigt, at dyr, der viser vedvarende symptomer paa staerk smerte eller lidelse, aflives paa human maade.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ingen.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN

1.6.1. Forberedelser

Inden for de sidste 24 timer foer forsoeget begyndes, undersoeges oejnene paa de dyr, der foreloebig er udtaget til forsoeget. Dyr, som lider af oejenirritation, oejendefekter, eller som tidligere har haft hornhindebeskadigelser, anvendes ikke.

1.6.2. Forsoegsbetingelser

1.6.2.1. Forsoegsdyr

Det anbefales at anvende sunde, koensmodne albinokaniner, selv om mange andre forsoegsdyr har vaeret anvendt.

1.6.2.2. Antal dyr

Forventes der tydelige virkninger, kan et enkeltdyrsforsoeg komme i betragtning. Hvis resultaterne af dette forsoeg med én kanin viser, at stoffet er staerkt oejenirriterende (reversibel virkning) eller aetsende (irreversibel virkning) ved den beskrevne fremgangsmaade, er det ikke altid noedvendigt at fortsaette undersoegelsen af oejenirritation med flere dyr. I enkelte tilfaelde kan det vaere hensigtsmaessigt at undersoege specifikke aspekter ved forsoeg med flere dyr.

I alle andre tilfaelde end enkeltdyrsforsoeget anvendes der mindst 3 dyr. Det kan vaere noedvendigt at anvende flere dyr for at afklare tvetydige reaktioner.

1.6.2.3. Dosisniveauer

Ved undersoegelse af vaesker anvendes der 0,1 ml. Ved undersoegelse af faste stoffer, pastaer og fintfordelte faste stoffer anvendes et volumen paa 0,1 ml eller en maengde paa ca. 0,1 g (vaegten registreres under alle omstaendigheder). Faste og granulerede teststoffer knuses til fint stoev. Partiklernes volumen maales efter let sammenrystning f.eks. frembragt ved smaa slag paa maalebeholderen.

Foreligger stoffet i flaske med forstoever eller i spraydaase, opsamles der 0,1 ml af den udsproejtede vaeske, som inddryppes i oejet paa samme maade som beskrevet for vaesker.

1.6.2.4. Observationsperiode

Observationsperiodens varighed boer ikke fastsaettes rigoristisk. Den boer vaere tilstraekkelig lang til at give mulighed for en vurdering af, om observerede virkninger er reversible eller irreversible, men behoever normalt ikke overskride 21 dage regnet fra inddrypningen.

1.6.3. Fremgangsmaade

Dyrene skal holdes i hver sit bur. Teststoffet inddryppes hos hvert enkelt dyr i det ene oejes nederste oejenlaag ved, at dette forsigtigt traekkes lidt ud fra oejeaeblet. Derefter holdes oejenlaagene forsigtigt sammen i ca. et sekund, saa at ikke noget af stoffet loeber ud. Det ubehandlede oeje fungerer som kontrol.

Hvis det menes, at teststoffet kan foraarsage urimelige smerter, kan der anvendes lokalbedoevelse foer inddrypning af teststoffet. Bedoevelsesmidlets type, koncentration og anvendelsestidspunkt vaelges med omhu, saa anvendelsen ikke medfoerer signifikant forskellig reaktion paa teststoffet. Kontroloejet bedoeves paa samme maade.

I 24 timer efter inddrypning af teststoffet maa der ikke foretages skylning af forsoegsdyrenes oejne. Efter 24 timers forloeb kan der, hvis det skoennes rimeligt, foretages skylning.

For nogle af de stoffer, der i denne test har vist sig at foraarsage oejenirritation, kan der vaere indikationer for yderligere forsoeg, hvor kaninernes oejne skylles ud kort efter inddrypning af stoffet. I saa tilfaelde anbefales det at anvende tre kaniner. Et halvt minut efter instillationen skylles kaninernes oejne i et halvt minut med en vaeskemaengde og et vaesketryk, som ikke beskadiger oejet.

1.6.3.1. Observation og klassificering

OEjnene undersoeges efter 1, 24, 48 og 72 timers forloeb. Hvis der ikke er tegn paa oejenlaesion efter 72 timer, kan undersoegelsen afsluttes.

Saafremt der forekommer vedvarende beskadigelse af hornhinden eller anden oejenirritation, kan det vaere noedvendigt at forlaenge observationsperioden, saa det kan bestemmes, hvordan laesionerne udvikler sig, og om de er reversible eller irreversible. Samtidig med observation af hornhinde, iris og bindehinder registreres og rapporteres eventuelle andre laesioner. OEjets reaktionsgrad (tabellen) skal registreres ved hver enkelt undersoegelse. (Inddeling af oejets reaktioner i grader kan goeres til genstand for forskellige fortolkninger. Til hjaelp for forsoegslaboratorier og personale, der foretager og fortolker observationer, kan der anvendes en illustreret vejledning om oejenirritationer.)

Undersoegelse af oejenreaktionerne kan lettes ved anvendelse af binokulaer lup, haandspaltelampe, ophthalmoskop eller andre egnede instrumenter. Efter de foerste 24 timers observationer kan en eller flere kaniners oejne undersoeges yderligere ved hjaelp af fluorescein.

2. DATA

Data opstilles i tabelform, som for hvert enkelt dyr angiver klassificering af oejenirritation paa de enkelte observationstidspunkter. En beskrivelse af arten og graden af irritation og tilstedevaerelse af alvorlige laesioner og enhver observeret virkning ud over virkningen paa selve oejet skal indgaa i rapporten.

3. RAPPORTERING

3.1. FORSOEGSRAPPORT

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- dyredata (art/stamme, herkomst, miljoebetingelser, foder o.s.v.)

- forsoegsbetingelser (herunder teststoffets relevante fysisk-kemiske egenskaber)

- tabelopstilling over hvert enkelt dyrs irritations/aetsningsreaktion paa hvert enkelt observationstidspunkt (f.eks. efter 1, 24, 48 og 72 timer)

- beskrivelse af alle alvorlige laesioner

- beskrivelse af arten og graden af observeret irritation og aetsning, herunder det beroerte omraade af hornhinden, og tilbagevenden til normal tilstand

- beskrivelse af den metode, der er anvendt til klassificering af irritation efter 1, 24, 48 og 72 timers forloeb (f.eks. haandspaltelampe, ophthalmoskop, fluorescein)

- beskrivelse af eventuelle registrerede lokale virkninger uden for selve oejet

- diskussion af resultaterne

- fortolkning af resultaterne.

3.2. VURDERING OG FORTOLKNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt D).

4. LITTERATURHENVISNINGER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt E).

Bilag

>TABELPOSITION>

B.6. HUDSENSIBILISERING

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Bemaerkninger

I et system for klassifikation af den toksicitet, der er relevant for folkesundheden, er det af stor betydning at have foelsomme test, som kan afsloere stoffer, der kan virke hudsensibiliserende paa mennesker.

Der findes ikke én enkelt testmetode, hvorved man med sikkerhed kan identificere alle stoffer, som kan virke hudsensibiliserende paa mennesker, og som kan anvendes til alle stoffer.

Der skal ved valg af test tages hensyn til en raekke faktorer saasom stoffets fysiske egenskaber, herunder dets evne til at traenge gennem huden.

Test med marsvin kan underopdeles i adjuvanstypen, hvor en allergisk tilstand forstaerkes, naar forsoegsstoffet oploeses eller opslaemmes i Freund's komplette adjuvans (FCA), og typen uden adjuvans.

Test af adjuvanstypen vil normalt forudsige et stofs sandsynlige hudsensibiliserende virkning hos mennesker mere praecist end de metoder, hvor der ikke benyttes Freund's komplette adjuvans, og bliver derfor foretrukket.

Maksimeringstest paa marsvin (Guinea Pig Maximization Test - GPMT) er en meget anvendt test af adjuvanstypen. Skoent der kan benyttes en raekke andre metoder til at undersoege et stofs potentielle sensibiliserende virkning, er GPMT den foretrukne metode af adjuvanstypen.

Test uden adjuvans (hvor Buehler-testen er den foretrukne) bliver for mange kemiske stofgrupper anset for at vaere mindre foelsom.

Der kan i visse tilfaelde vaere gode grunde til at vaelge Buehler-testen med lokal paafoering i stedet for den intradermale injektion, der benyttes i maksimeringstesten paa marsvin. Der skal gives en videnskabelig begrundelse for anvendelse af Buehler-testen.

I denne metode beskrives maksimeringstesten paa marsvin (GPMT) og Buehler-testen. Der kan anvendes andre metoder, forudsat at de er tilstraekkeligt validerede, og at valget er videnskabeligt begrundet.

Uanset hvilke metoder der benyttes, skal sensibiliteten hos den marsvinestamme, der anvendes til hudsensibiliseringstest, kontrolleres med jaevne mellemrum (hvert halve aar) med et kendt mildt til moderat sensibiliserende stof, som der skal opnaas et tilfredsstillende antal positive reaktioner med.

Se ogsaa den generelle indledning til afsnit B (punkt A).

1.2. DEFINITION

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt B).

1.3. REFERENCESTOFFER

Foelgende stoffer, om noedvendigt fortyndet, og alle andre sensibiliserende stoffer, enten kendt fra litteraturen eller af samme gruppe som det stof, der undersoeges, anbefales

- p-phenylendiaminCAS nr. 106-50-3

- 2,4-dinitrochlorbenzenCAS nr. 97-00-7

- kaliumdichromatCAS nr. 7778-50-9

- neomycinsulfatCAS nr. 1405-10-3

- nikkelsulfatCAS nr. 7786-81-4

1.4. TESTMETODERNES PRINCIP

Efter den foerste eksponering for teststoffet (»induktionsperioden«) udsaettes dyrene omtrent to uger efter den sidste eksponering for en provokationsmaengde af teststoffet til konstatering af, om der er opstaaet hypersensibilitet. Sensibilisering konstateres ved at undersoege hudens reaktion paa provokationen med teststoffet.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ingen.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODERNE

1.6.1. Maksimeringstest paa marsvin (Guinea Pig Maximization Test - GPMT)

1.6.1.1. Forberedelser

Unge sunde albinomarsvin fordeles randomiseret i forsoegs- og kontrolgrupper. Foer forsoeget begyndes, klippes eller barberes dyrene paa skulderregionen. Man maa passe paa ikke at beskadige huden.

1.6.1.2. Forsoegsbetingelser

1.6.1.2.1. Forsoegsdyr

Der benyttes albinomarsvin af almindeligt anvendte stammer med en vaegt paa under 500 g.

1.6.1.2.2. Antal og koen

Der anvendes handyr og/eller hundyr. Hvis der benyttes hundyr, maa de ikke have foedt, og de maa ikke vaere draegtige. Forsoegsgruppen skal bestaa af mindst 10 dyr og kontrolgruppen af mindst 5 dyr. Anvendes der faerre dyr, skal det begrundes. Er resultaterne ikke entydige, kan en histopatologisk undersoegelse vaere til hjaelp ved en eventuel beslutning om gentagelse af forsoeget med en ny gruppe forsoegsdyr. Naar det ikke er muligt klart at konkludere, at teststoffet er eller ikke er sensibiliserende, anbefales undersoegelse i yderligere dyr, saaledes at det totale antal bliver 20 test- og 10 kontroldyr.

1.6.1.2.3. Dosisniveauer

Koncentrationen af teststoffet i hver enkelt induktionsfase vaelges saaledes, at der sker en vis irritation af huden, dog uden at der er nogen toksisk effekt.

Provokationskoncentrationen skal vaere den stoerst mulige, der ikke fremkalder symptomer paa hudirritation hos ikke-sensibiliserede dyr.

Disse koncentrationer kan bestemmes ved en forundersoegelse i lille skala (2-3 dyr).

1.6.1.2.4. Observationsperiode

Under induktionsperioden observeres der for eventuel hudirritation. Efter provokationen registreres hudens reaktion, 24 og 48 timer efter at lappen er fjernet.

1.6.1.3. Fremgangsmaade

Dyrene vejes foer induktionsperioden og ved forsoegets afslutning. Dyrene klippes i skulderregionen. Fremgangsmaaden bestaar af to faser

1.6.1.3.1. Induktion

Dag 0 - forsoegsgruppe

Foelgende intradermale injektioner - hver paa 0,1 ml - gives parvis i skulderpartiet saaledes, at hvert injektionspar bestaar af en injektion paa hver side af midterlinjen

Injektion 1: 0,1 ml af Freund's komplette adjuvans (FCA) blandet med vand eller fysiologisk saltoploesning i forholdet 1:1

Injektion 2: 0,1 ml teststof, eventuelt i et egnet vehikel

Injektion 3:0,1 ml teststof i FCA.

Til injektion 3 oploeses vandoploeselige stoffer i 0,05 ml vand og 0,05 ml ufortyndet FCA. Fedtoploeselige og uoploeselige stoffer blandes med ufortyndet FCA.

Teststoffets slutkoncentration i injektion 3 skal vaere den samme som i injektion 2.

Injektion 1 og 2 placeres taet paa hinanden og naermest ved hovedet. Injektion 3 placeres i den bageste del af testomraadet.

Dag 0 - kontrolgruppe

Foelgende intradermale injektioner gives parvis paa samme maade som ovenfor.

Injektion 1:0,1 ml af Freund's komplette adjuvans (FCA) blandet med vand eller fysiologisk saltoploesning i forholdet 1:1

Injektion 2:0,1 ml vehikel alene

Injektion 3:0,1 ml vehikel i FCA.

Dag 6 - kontrol- og forsoegsgruppe

Hvis stoffet ikke er hudirriterende, fremkaldes der en lokal irritation ved pensling af testomraadet med 0,5 ml 10 % natriumlaurylsulfat i vaseline, efter klipning og/eller barbering.

Dag 7 - forsoegsgruppe

Testomraadet klippes. Paa et stykke filtrerpapir (2 × 4 cm) fordeles teststoffet, der er blandet med et egnet vehikel (valget af vehikel skal begrundes; faste stoffer pulveriseres og inkorporeres i et passende vehikel; vaesker kan eventuelt anvendes direkte). Filtrerpapiret anbringes paa testomraadet og fastholdes med en okklusiv forbinding i 48 timer.

Dag 7 - kontrolgruppe

Testomraadet klippes. Vehikel alene anbringes paa tilsvarende maade paa testomraadet og fastholdes med en okklusiv forbinding i 48 timer.

1.6.1.3.2. Provokation

Dag 21

Baade i forsoegsgruppen og i kontrolgruppen klippes og/eller barberes dyrenes flanke. Paa forsoegsdyrenes ene side anbringes en lap eller en kapsel med teststoffet, og paa den anden side en lap eller en kapsel med rent vehikel.

Lapperne holdes i kontakt med huden i 24 timer med en okklusiv forbinding.

Kontrolgruppen behandles paa samme maade.

Dag 23 og 24

- 21 timer efter at lappen er fjernet, renses provokationsomraadet og klippes om noedvendigt

- 3 timer senere (dvs. 48 timer efter paafoering af provokationsdosis) observeres hudens reaktion, og den registreres

- 24 timer efter denne observation foretages endnu en observation (72 timer), som registreres.

Resultaterne fra den foerste provokationseksponering kan om noedvendigt uddybes ved endnu en provokationseksponering, eventuelt med en ny vehikelkontrolgruppe, ca. 1 uge efter den foerste eksponering.

1.6.1.3.3. Observation og klassificering

Alle hudreaktioner og alle usaedvanlige virkninger af baade induktions- og provokationseksponeringen skal registreres og rapporteres.

Histopatologisk undersoegelse, maaling af hudfoldtykkelse og lignende teknikker kan benyttes til afklaring af tvetydige reaktioner og af reaktioner, der delvis skjules af teststoffets farvning af huden.

1.6.2. Buehler-test

1.6.2.1. Forberedelser

Unge sunde albinomarsvin fordeles randomiseret i forsoegs- og kontrolgrupper. Foer forsoeget begyndes, klippes og/eller barberes forsoegsdyrenes ene flanke. Man maa passe paa ikke at beskadige huden.

1.6.2.2. Forsoegsbetingelser

1.6.2.2.1. Forsoegsdyr

Der benyttes albinomarsvin af almindeligt anvendte stammer med en vaegt paa under 500 g.

1.6.2.2.2. Antal og koen

Der anvendes handyr og/eller hundyr. Hvis der benyttes hundyr, maa de ikke have foedt, og de maa ikke vaere draegtige. Forsoegsgruppen skal bestaa af mindst 20 dyr og kontrolgruppen af mindst 10 dyr. Anvendes der faerre dyr, skal det begrundes. Er resultaterne ikke entydige, kan en histopatologisk undersoegelse vaere til hjaelp ved en eventuel beslutning om gentagelse af forsoeget med en ny gruppe forsoegsdyr.

1.6.2.2.3. Dosisniveauer

Der vaelges en saa hoej koncentration af teststoffet i hver enkelt induktionsfase, at der for irriterende stoffer fremkaldes let til moderat irritation af huden hos stoersteparten af forsoegsdyrene, dog saaledes at der ikke er nogen systemisk toksisk virkning. Provokationskoncentrationen skal vaere den stoerst mulige, der ikke fremkalder symptomer paa hudirritation hos ikke-sensibiliserede dyr. Disse koncentrationer kan bestemmes ved en forundersoegelse i lille skala (2-3 dyr).

1.6.2.2.4. Observationsperiode

Under induktionsperioden observeres der for eventuel hudirritation. Efter provokationen registreres hudens reaktion, 24 og 48 timer efter at lappen er fjernet, dvs. 30 og 54 timer efter paafoeringen.

1.6.2.3. Fremgangsmaade

Dyrene vejes foer induktionsperioden og ved forsoegets afslutning.

Fremgangsmaaden bestaar af to faser

1.6.2.3.1. Induktion

Dag 0 - forsoegsgruppe

Dyrene klippes og/eller barberes paa den ene flanke. 0,5 ml af teststoffet i et egnet vehikel (valget af vehikel skal begrundes; vaesker kan eventuelt anvendes direkte) fordeles paa et stykke gaze. Det anbringes paa testomraadet og fastholdes i kontakt med huden med en okklusiv lap eller kapsel og en passende forbinding i 6 timer.

Dag 0 - kontrolgruppe

Dyrene klippes og/eller barberes paa den ene flanke. Der anbringes rent vehikel paa testomraadet paa tilsvarende maade, og det fastholdes i kontakt med huden med en okklusiv lap eller kapsel og en passende forbinding i 6 timer.

Dag 7 og 14

Paa dag 7 og dag 14 foretages samme paafoering som dag 0 paa samme testomraade (om noedvendigt efter klipning/barbering).

1.6.2.3.2. Provokation

Dag 28

Baade i forsoegsgruppen og i kontrolgruppen klippes og/eller barberes dyrene paa den anden flanke. Bagest paa flanken anbringes der en okklusiv lap eller en kapsel med 0,5 ml af teststoffet i den hoejest mulige koncentration, der ikke fremkalder irritation. Desuden anbringes der en okklusiv lap eller kapsel med rent vehikel forrest paa flanken.

De okklusive lapper holdes i kontakt med huden i 6 timer med en passende forbinding.

Kontrolgruppen behandles paa samme maade.

Dag 29 og 30

- 21 timer efter, at lappen er fjernet, renses provokationsomraadet og dyrene klippes/barberes om noedvendigt

- 3 timer senere (dvs. 30 timer efter paafoering af provokationsdosis) observeres hudens reaktion, og den registreres

- 24 timer efter denne observation foretages endnu en observation (54 timer), som registreres.

1.6.2.3.3. Observation og klassificering

Alle hudreaktioner og alle usaedvanlige virkninger af baade induktions- og provokationseksponeringen skal registreres og rapporteres.

Histopatologisk undersoegelse, maaling af hudfoldtykkelse og lignende teknikker kan benyttes til afklaring af tvetydige reaktioner og af reaktioner, der delvis skjules af teststoffets farvning af huden.

2. DATA (GPMT og Buehler-test)

Data opstilles i tabelform, som angiver hudens reaktion ved hver enkelt observation af hvert enkelt dyr.

3. RAPPORTERING (GPMT og Buehler-test)

3.1. FORSOEGSRAPPORT (GPMT og Buehler-test)

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- anvendt marsvinstamme

- forsoegsbetingelser samt vehikel og teststofkoncentrationer til induktion og provokation

- dyrenes antal, alder og koen

- hvert enkelt dyrs vaegt ved forsoegets begyndelse og slutning

- hver enkelt observation af hvert enkelt dyr, herunder et eventuelt anvendt klassificeringssystem

- diskussion af resultaterne

- fortolkning af resultaterne.

3.2. VURDERING OG FORTOLKNING (GPMT og Buehler-test)

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt D).

4. LITTERATURHENVISNINGER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt E).

B.7. TOKSICITET VED GENTAGEN DOSERING (28 DAGE, ORAL)

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt A).

1.2. DEFINITIONER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt B).

1.3. REFERENCESTOFFER

Ingen.

1.4. TESTMETODENS PRINCIP

Teststoffet indgives oralt dagligt i graduerede doser til grupper af forsoegsdyr, idet der gives en bestemt dosis til hver gruppe gennem en periode paa 28 dage. I eksponeringsperioden observeres dyrene dagligt for symptomer paa toksisk virkning. Dyr, der doer under forsoerget, obduceres, og ved forsoegets afslutning aflives og obduceres de overlevende dyr.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ingen.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN

1.6.1. Forberedelser

Dyrene holdes under forsoegsbetingelser med hensyn til miljoe og fodring i mindst fem dage, inden forsoeget paabegyndes. Unge sunde dyr fordeles randomiseret i grupper, inden forsoeget saettes i gang. Teststoffet kan indgives med foderet, med mavesonde, i kapsler eller i drikkevandet. Der anvendes samme indgiftsmaade til alle dyr i hele forsoegsperioden. Hvis der anvendes et vehikel eller andre tilsaetningsstoffer for at lette doseringen, skal det vaere paavist, at de ikke har nogen toksisk virkning. Her kan tidligere data eventuelt benyttes.

1.6.2. Forsoegsbetingelser

1.6.2.1. Forsoegsdyr

Rotten er det foretrukne forsoegsdyr, medmindre der foreligger kontraindikationer. Der benyttes unge sunde rotter af almindeligt anvendte stammer. Doseringen skal helst paabegyndes, inden rotterne er seks uger, og under alle omstaendigheder inden de er otte uger gamle.

Ved forsoegets begyndelse maa vaegten af de anvendte dyr ikke variere mere end ± 20 % fra en rimelig gennemsnitsvaegt.

1.6.2.2. Antal og koen

Der anvendes mindst 10 dyr (fem hunner og fem hanner) til hvert dosisniveau. Hundyrene maa ikke have foedt og maa ikke vaere draegtige. Hvis der paaregnes aflivning af dyr under forsoeget, skal det oprindelige antal dyr foroeges med det antal dyr, man paaregner at aflive i loebet af forsoeget. Man kan samtidig udsaette en satellitgruppe paa 10 dyr (fem af hvert koen) for den hoejeste dosis i 28 dage og gennem en periode paa 14 dage efter forsoeget observere, om der er reversible, varige eller forsinkede toksiske virkninger. Der anvendes tillige en satellitgruppe paa 10 kontroldyr (fem af hvert koen).

1.6.2.3. Dosisniveauer

Der skal anvendes mindst tre dosisniveauer samt en kontrolgruppe. Dyrene i kontrolgruppen behandles noejagtigt som dyrene i forsoegsgrupperne, bortset fra indgiften af teststoffet. Hvis der anvendes et vehikel for at lette doseringen, skal kontrolgruppen indgives vehiklet paa samme maade som forsoegsgrupperne, og der indgives samme maengde vehikel som til den forsoegsgruppe, der modtager den hoejeste dosis. Den hoejeste dosis boer have toksisk virkning, men kun medfoere faa eller ingen doedsfald. Det laveste dosisniveau boer ikke have nogen toksisk virkning overhovedet. Hvis der foreligger en anvendelig vurdering af menneskers eksponering for stoffet, skal det laveste dosisniveau ligge over denne eksponering. Middeldosis skal helst frembringe saa svage observerbare toksiske virkninger som muligt. Hvis der anvendes mere end tre dosisniveauer, boer de vaelges saaledes, at der opnaas graduering af de toksiske virkninger. I grupperne med lav og middel dosering og i kontrolgruppen skal doedeligheden holdes paa et lavt niveau, saa der bliver mulighed for en meningsfuld vurdering af resultaterne.

Hvis teststoffet indgives med foderet, kan man enten anvende en konstant koncentration (ppm eller mg/kg foder) eller en konstant dosering i forhold til dyrenes vaegt; det benyttede alternativ specificeres. Hvis teststoffet indgives med mavesonde, skal dette finde sted paa samme tidspunkt hver dag. Doserne justeres med jaevne mellemrum (én gang eller to gange om uge), saa de er konstante i forhold til dyrenes legemsvaegt.

1.6.2.4. Graensetest

Hvis der ikke i et 28 dages forsoeg udfoert efter nedenstaaende retningslinjer kan konstateres toksisk virkning af en dosis paa 1 000 mg/kg legemsvaegt, eller en stoerre dosis fastsat ud fra kendskab til den eksponering, mennesker kan blive udsat for, kan yderligere testning betragtes som unoedvendig. Det er vigtigt at sikre sig, at stoffer med lav toksicitet, som indgives med foderet, ikke paavirker de normale ernaeringsmaessige behov i kraft af deres maengde eller andre egenskaber.

1.6.2.5. Observationsperiode

Alle dyr observeres dagligt, og det registreres, om der optraeder symptomer paa toksisk virkning, hvornaar disse symptomer optraeder foerste gang, hvor laenge de varer, og hvor kraftige de er. Doedstidspunkt og tidspunkter for toksicitetssymptomers fremkomst og forsvinden registreres.

1.6.3. Fremgangsmaade

Den ideelle dosering bestaar i daglig indgift af teststoffet syv dage om ugen i en periode paa 28 dage. En eventuel satellitgruppe beregnet til opfoelgningsobservationer holdes i yderligere 14 dage uden indgift af teststof, saaledes at det kan registreres, om toksiske virkninger er reversible, eller om de er vedvarende.

Inspektion af dyrene skal omfatte forandringer i hud og pels, oejne og slimhinder, aandedraet og kredsloeb, det autonome og centrale nervesystem, den motoriske aktivitet og adfaerdsmoensteret. Det ugentlige foderforbrug beregnes (tillige med vandforbruget, hvis teststoffet indgives via drikkevandet), og dyrene vejes én gang om ugen.

Dyrene observeres med jaevne mellemrum, saaledes at det mindst mulige antal dyr gaar tabt for undersoegelsen paa grund af f.eks. kannibalisme, autolyse af vaev eller forveksling. Ved forsoegets slutning aflives og obduceres alle overlevende dyr med undtagelse af dem i satellitgruppen. Doeende dyr og dyr, der viser symptomer paa staerk smerte eller lidelse, fjernes, saa snart de iagttages, hvorefter de aflives paa human maade og obduceres.

Ved forsoegets afslutning skal alle dyr inklusive kontrolgruppen underkastes foelgende undersoegelse

1. haematologisk undersoegelse omfattende mindst haematokrit, haemoglobinkoncentration, erythrocyttaelling, total og differential leucocyttaelling og et maal for koaguleringsevnen.

2. klinisk biokemisk blodanalyse omfattende mindst én lever- og nyrefunktionsparameter: serum alanin aminotransferase (ALAT), serum aspartat aminotransferase (ASAT), urinstof, albumin, kreatinin, total bilirubin og total serumprotein.

Andre bestemmelser, der kan vaere paakraevet for en fyldestgoerende toksikologisk vurdering, er calcium, phosphor, chlorid, natrium, kalium, glucose efter faste, lipidanalyser, hormoner, syre/basebalance, methaemoglobin og cholinesteraseaktivitet.

Der kan udfoeres yderligere klinisk biokemiske analyser, hvor det skoennes noedvendigt for en videre undersoegelse af de observerede virkninger.

1.6.3.1. Makroskopisk undersoegelse

Alle forsoegsdyrene underkastes en fuldstaendig makroskopisk undersoegelse. Lever, nyrer, binyrer og testes vejes saa hurtigt som muligt efter udtagningen, saa udtoerring undgaas. Vaev og organer (lever, nyrer, milt, testes, binyrer, hjerte og organer, der udviser makroskopiske laesioner eller stoerrelsesforandringer opbevares i et passende medium med henblik paa eventuel senere histopatologisk undersoegelse.

1.6.3.2. Histopatologisk undersoegelse

Der foretages en histologisk undersoegelse af praepareret vaev og organer fra dyrene i kontrolgruppen samt i den gruppe, der har faaet indgivet den hoejeste dosis. Observeres der i gruppen med hoejeste dosis vaevs- eller organdefekter, som kan tilskrives teststoffet, undersoeges de samme vaev og organer i grupperne med lavere dosis. Dyrene i en eventuel satellitgruppe underkastes en histologisk undersoegelse, isaer de vaev og organer, der udviser toksisk virkning i de oevrige grupper.

2. DATA

Data opstilles i tabelform, som for hver gruppe viser antallet af dyr ved begyndelsen af forsoeget, og for hver type laesion det antal dyr, der udviser den paagaeldende laesion.

Evaluering af samtlige observationer skal baseres paa en passende statistisk metode. Alle anerkendte statistiske metoder kan anvendes.

3. RAPPORTERING

3.1. FORSOEGSRAPPORT

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- dyreart/stamme, herkomst, miljoebetingelser, foder o.s.v.

- forsoegsbetingelser

- dosisniveauer (med angivelse af vehikel, hvor et saadant er anvendt) samt koncentrationer

- oplysninger om toksisk reaktion opdelt efter koen og dosis

- nuleffektniveau, hvor det er muligt

- angivelse af dyrenes doedstidspunkt under forsoeget eller overlevelse til forsoegets slutning

- toksiske og andre virkninger

- for hvert enkelt abnormitetstegn det tidspunkt, hvor det er observeret, og dets senere udvikling

- foder- og legemsvaegt

- haematologiske analyser og samtlige resultater

- klinisk biokemiske analyser og samtlige resultater

- obduktionsfund

- detaljeret beskrivelse af alle histopatologiske fund

- eventuel statistisk behandling af resultaterne

- diskussion af resultaterne

- fortolkning af resultaterne.

3.2. VURDERING OG FORTOLKNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt D).

4. LITTERATURHENVISNINGER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt E).

B.8. TOKSICITET VED GENTAGEN DOSERING (28 DAGE, INHALATION)

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Det er nyttigt at have forhaandsoplysninger om stoffets partikelstoerrelsesfordeling, damptryk, smeltepunkt, kogepunkt, flammepunkt og eventuelle eksplosive egenskaber.Se ogsaa den generelle indledning til afsnit B (punkt A).

1.2. DEFINITIONER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt B).

1.3. REFERENCESTOFFER

Ingen.

1.4. TESTMETODENS PRINCIP

Flere grupper af forsoegsdyr udsaettes i 28 dage dagligt i en angivet periode for teststoffet i graduerede koncentrationer, idet hver gruppe eksponeres for en bestemt koncentration.Anvendes der et vehikel til at frembringe en passende koncentration af teststoffet i luften, boer der i forsoeget indgaa en kontrolgruppe, der udsaettes for vehiklet alene. I eksponeringsperioden observeres dyrene dagligt for symptomer paa toksisk virkning. Dyr, der doer under forsoeget, obduceres, og ved forsoegets afslutning aflives og obduceres de overlevende dyr.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ingen.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN

1.6.1. Forberedelser

Dyrene holdes under forsoegsbetingelser med hensyn til miljoe og fodring i mindst fem dage, inden forsoeget begyndes. Unge sunde dyr fordeles randomiseret i det fornoedne antal grupper. Om noedvendigt kan der tilsaettes et egnet vehikel til teststoffet, saaledes at der opnaas en passende koncentration af teststoffet i luften. Hvis der anvendes et vehikel eller andre tilsaetningsstoffer for at lette doseringen, skal det vaere paavist, at de ikke har nogen toksisk virkning. Her kan tidligere data benyttes.

1.6.2. Forsoegsbetingelser

1.6.2.1. Forsoegsdyr

Rotter er de foretrukne forsoegsdyr, medmindre der foreligger kontraindikationer. Der benyttes unge sunde rotter af almindeligt anvendte stammer.

Ved forsoegets begyndelse maa vaegten af de anvendte dyr ikke variere mere end ± 20 % fra en rimelig gennemsnitsvaegt.

1.6.2.2. Antal og koen

Der anvendes mindst 10 dyr (fem hunner og fem hanner) i hver forsoegsgruppe. Hundyrene maa ikke have foedt og maa ikke vaere draegtige. Hvis der paaregnes aflivning af dyr under forsoeget, skal det oprindelige antal dyr foroeges med det antal dyr, man paaregner at aflive i loebet af forsoeget. Man kan samtidig udsaette en satellitgruppe paa 10 dyr (fem af hvert koen) for den hoejeste koncentration i 28 dage og gennem en periode paa 14 dage efter forsoeget observere, om der er reversible, varige eller sent opstaaede toksiske virkninger. Der anvendes tillige en satellitgruppe paa 10 kontroldyr (fem af hvert koen).

1.6.2.3. Eksponeringskoncentrationer

Der skal anvendes mindst tre koncentrationsniveauer og en kontrolgruppe eller en vehikelkontrolgruppe (svarende til koncentrationen af vehiklet i hoejeste dosisniveau), saafremt der benyttes vehikel. Dyrene i kontrolgruppen behandles noejagtigt som dyrene i forsoegsgrupperne, bortset fra inhalation af teststoffet. Den hoejeste koncentration boer have toksisk virkning, men kun medfoere faa eller ingen doedsfald. Der maa ikke vaere tegn paa toksisk virkning ved den laveste koncentration. Hvis der foreligger en anvendelig vurdering af menneskers eksponering for stoffet, skal den laveste koncentration overskride denne eksponering. Middelkoncentrationen skal helst frembringe saa svage observerbare toksiske virkninger som muligt. Hvis der anvendes mere end tre koncentrationer, boer de vaelges saaledes, at der opnaas graduering af de toksiske virkninger. I grupperne med lav og middel koncentration og i kontrolgrupperne skal doedeligheden holdes paa et lavt niveau, saa der bliver mulighed for en meningsfuld vurdering af resultaterne.

1.6.2.4. Eksponeringstid

Den daglige eksponeringsperiode er seks timer, men det kan vaere noedvendigt at benytte kortere eller laengere perioder for at imoedekomme specielle krav.

1.6.2.5. Udstyr

Dyrene testes med inhalationsapparatur, der er udformet saaledes, at der kan opretholdes en dynamisk luftcirkulation med et luftskifte paa mindst 12 gange pr. time samtidig med et tilstraekkeligt iltindhold og jaevn fordeling af eksponeringsluften. Benyttes der eksponeringskammer, skal det vaere saaledes indrettet, at forsoegsdyrene sammenklumpes mindst muligt og eksponeres mest muligt for teststoffet ved inhalation. Den generelle regel for sikkerhed for stabil atmosfaere er, at dyrenes totale »volumen« ikke maa overstige 5 % af eksponeringskammerets volumen. Eksponeringen kan foregaa gennem mund-naese, hovedet alene eller ved kamre til hele kroppen; ved anvendelse af de to foerste muligheder opnaar man, at optagelsen af teststoffet ad andre veje minimeres.

1.6.2.6. Observationsperiode

Dyrene observeres dagligt for symptomer paa toksiske virkninger i hele forsoegsperioden og restitutionsperioden. Doedstidspunkt og tidspunkter for toksicitetssymptomers fremkomst og forsvinden registreres.

1.6.3. Fremgangsmaade

Dyrene eksponeres for teststoffet dagligt 5-7 dage om ugen i en periode paa 28 dage. En eventuel satellitgruppe beregnet til opfoelgningsobservationer holdes i yderligere 14 dage, efter at eksponering for teststoffet er ophoert, saaledes at det kan registreres, om toksiske virkninger er reversible, eller om de vedvarer. Temperaturen under forsoeget holdes paa 22 C ± 3 C.

Under ideelle forhold skal den relative luftfugtighed holdes paa mellem 30 % og 70 %, men i visse tilfaelde (f.eks. ved testning af visse aerosoler) kan det vaere praktisk uigennemfoerligt. Udsivning af teststof til omgivelserne kan forhindres ved, at der i kammeret holdes et svagt undertryk (≤ 5 mm vandsoejle). Der gives hverken foder eller vand under eksponeringen.

Der anvendes et dynamisk inhalationssystem med et passende analytisk kontrolsystem til sikring af eksponeringskoncentrationen. Det anbefales at foretage en proevetest for at finde frem til passende eksponeringskoncentrationer. Lufthastigheden tilpasses, saaledes at der er ensartede forhold i hele eksponeringskammeret. Systemet skal vaere af en saadan beskaffenhed, at der saa hurtigt som muligt opnaas stabile eksponeringsbetingelser.

Der foretages maaling og kontrol af

(a) lufthastighed (kontinuerlig)

(b) den faktiske koncentration af teststoffet maalt i opholdsarealet. Koncentrationen maa under den daglige eksponeringsperiode ikke variere mere end ± 15 % fra gennemsnitskoncentrationen. Det kan vaere umuligt at opnaa en saadan grad af kontrol med visse aerosoler, og i saa tilfaelde kan stoerre udsving accepteres. Koncentrationerne boer fra dag til dag holdes saa konstante som muligt under hele forsoegets forloeb. For aerosoler analyseres partikelstoerrelsen mindst én gang ugentligt pr. forsoegsgruppe.

(c) temperatur og luftfugtighed, om muligt kontinuerligt.

Under og efter eksponering foretages der systematiske observationer, som registreres for hvert enkelt dyr. Alle dyr observeres dagligt, og toksicitetssymptomer registreres, herunder hvornaar disse symptomer optraeder foerste gang, hvor laenge de varer, og hvor kraftige de er. Inspektionen af dyrene skal omfatte forandringer i hud og pels, oejne og slimhinder, aandedraet og kredsloeb, det autonome og det centrale nervesystem, den motoriske aktivitet og adfaerdsmoensteret. Dyrene vejes én gang om ugen. Det anbefales, at der ogsaa holdes regnskab med den ugentlige foedeindtagelse. Dyrene observeres med jaevne mellemrum, saa dyr ikke gaar tabt for undersoegelsen paa grund af f.eks. kannibalisme, autolyse af vaev eller forveksling. Ved forsoegets slutning aflives og obduceres alle overlevende dyr med undtagelse af dem i satellitgruppen. Doeende dyr og dyr, der viser symptomer paa staerk smerte eller lidelse, fjernes, saa snart de iagttages, hvorefter de aflives paa human maade og obduceres.

Ved forsoegets afslutning skal alle dyr inklusive kontrolgruppen underkastes foelgende undersoegelser

(i) haematologisk analyse omfattende mindst haematokrit, haemoglobinkoncentration, erythrocyttaelling, total og differential leucocyttaelling og et maal for koaguleringsevnen.

(ii) klinisk biokemisk blodanalyse omfattende mindst én lever- og nyrefunktionsparameter: serum alanin aminotransferase (ALAT), serum aspartat aminotransferase (ASAT), urinstof, albumin, kreatinin, total bilirubin og total serumprotein.

Andre bestemmelser, der kan vaere paakraevet for en fyldestgoerende toksikologisk vurdering, er calcium, phosphor, chlorid, natrium, kalium, glucose efter faste, lipidanalyser, hormoner, syre/basebalance, methaemoglobin og cholinesteraseaktivitet.

Der kan udfoeres yderligere klinisk biokemiske analyser, hvor det skoennes noedvendigt for en videre undersoegelse af de observerede virkninger.

1.6.3.1. Makroskopisk undersoegelse

Alle forsoegsdyrene underkastes en fuldstaendig makroskopisk undersoegelse. Lever, nyrer, binyrer, lunger og testes vejes saa hurtigt som muligt efter udtagning, saa udtoerring undgaas. Vaev og organer (luftveje, lever, nyrer, milt, testes, binyrer, hjerte og organer, der udviser makrokopiske laesioner eller stoerrelsesforandringer) opbevares i et passende medium med henblik paa eventuel senere histopatologisk undersoegelse. Lunger udtages hele og intakte, vejes og behandles med et passende fixativ for at sikre, at lungestrukturen bevares.

1.6.3.2. Histopatologisk undersoegelse

Der foretages en histologisk undersoegelse af praepareret vaev og organer fra dyrene i kontrolgruppen samt i den gruppe, der har vaeret udsat for den hoejeste koncentration. Observeres der i gruppen med den hoejeste koncentration vaevs- eller organdefekter, som kan tilskrives teststoffet, undersoeges de samme vaev og organer i grupperne med lavere koncentration. Dyrene i en eventuel satellitgruppe underkastes en histologisk undersoegelse, isaer de vaev og organer, der udviser toksisk virkning i de oevrige grupper.

2. DATA

Data opstilles i tabelform, som for hver gruppe viser antal dyr ved begyndelsen af forsoeget, og for hver type af laesion det antal dyr, der udviser den paagaeldende laesion.

Evaluering af samtlige observationer skal baseres paa en passende statistisk metode. Alle anerkendte statistiske metoder kan anvendes.

3. RAPPORTERING

3.1. FORSOEGSRAPPORT

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- dyreart/stamme, herkomst, miljoebetingelser, foder o.s.v.

- forsoegsbetingelser

Beskrivelse af eksponeringsudstyret, herunder udformning, type, dimensionering, luftkilde, system til frembringelse af aerosoler, metode til konditionering af luften, behandling af udpumpet luft og den maade, hvorpaa dyrene holdes i et eksponeringskammer, naar et saadant benyttes. Apparatur til maaling af temperatur, fugtighed og i givet fald aerosolkoncentrationens stabilitet eller partikelstoerrelse skal beskrives.

Eksponeringsdata

Disse skal opstilles i tabelform med angivelse af middelvaerdier og et maal for variationen (f.eks. standardafvigelser) og i videst muligt omfang omfatte

a) lufthastighed gennem inhalationsudstyret

b) luftens temperatur og fugtighed

c) nominelle koncentrationer (total maengde teststof tilfoert inhalationsapparaturet, divideret med luftvolumen)

d) type vehikel, hvor et saadant er anvendt

e) faktiske koncentrationer i opholdsarealet under forsoeget

f) massemedianen af den aerodynamiske diameter (MMAD) og den geometriske standardafvigelse (GSD)

- oplysninger om toksisk reaktion opdelt efter koen og koncentration

- angivelse af dyrenes doedstidspunkt under forsoeget eller overlevelse til forsoegets slutning

- beskrivelse af toksiske og andre virkninger; nuleffektniveau

- for hvert enkelt abnormitetstegn det tidspunkt, hvor det er observeret, og dets senere udvikling

- foder- og legemsvaegt

- haematologiske analyser og samtlige resultater

- klinisk biokemiske analyser og samtlige resultater

- obduktionsfund

- detaljeret beskrivelse af alle histopatologiske fund

- eventuel statistisk behandling af resultaterne

- diskussion af resultaterne

- fortolkning af resultaterne.

3.2. VURDERING OG FORTOLKNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt D).

4. LITTERATURHENVISNINGER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt E).

B.9. TOKSICITET VED GENTAGEN DOSERING (28 DAGE, DERMAL)

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt A).

1.2. DEFINITIONER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt B).

1.3. REFERENCESTOFFER

Ingen.

1.4. TESTMETODENS PRINCIP

Teststoffet paafoeres dagligt huden i graduerede doser paa grupper af forsoegsdyr, idet der anvendes en bestemt dosis til hver gruppe gennem en periode paa 28 dage. I eksponeringsperioden observeres dyrene dagligt for symptomer paa toksisk virkning. Dyr, der doer under forsoeget, obduceres, og ved forsoegets afslutning aflives og obduceres de overlevende dyr.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ingen.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN

1.6.1. Forberedelser

Dyrene holdes under forsoegsbetingelser med hensyn til miljoe og fodring i mindst fem dage, inden forsoeget paabegyndes. Unge sunde dyr fordeles randomiseret i forsoegs- og kontrolgrupper, inden forsoeget saettes i gang. Kort foer forsoeget indledes, klippes dyrene paa ryggen. Saafremt dyrene barberes, boer det ske ca. 24 timer, inden forsoeget indledes. Klipningen eller barberingen maa som regel gentages med en uges mellemrum. Man maa ved klipning og barbering passe paa ikke at beskadige huden. Mindst 10 % af kroppens overflade klargoeres til paafoering af teststoffet. Ved afgoerelse af, hvilket og hvor stort et omraade der skal klippes, boer der tages hensyn til dyrets vaegt. Ved testning af faste stoffer, som i givet fald kan pulveriseres, skal teststoffet fugtes tilstraekkeligt med vand eller om noedvendigt med et passende vehikel, saa der sikres god kontakt med huden. Flydende teststoffer paafoeres normalt ufortyndet. Teststoffet paafoeres dagligt 5-7 dage om ugen.

1.6.2. Forsoegsbetingelser

1.6.2.1. Forsoegsdyr

Der kan anvendes voksne rotter, kaniner eller marsvin. Der kan ogsaa anvendes andre dyrearter, men i saa fald skal det begrundes.

Ved forsoegets begyndelse maa vaegten af de anvendte dyr ikke variere mere end ± 20 % fra en rimelig gennemsnitsvaegt.

1.6.2.2. Antal og koen

Der anvendes mindst 10 dyr (fem hunner og fem hanner) med sund hud til hvert dosisniveau. Hunnerne maa ikke have foedt og maa ikke vaere draegtige. Hvis der paaregnes aflivning af dyr under forsoeget, skal det oprindelige antal dyr foroeges med det antal dyr, man paaregner at aflive i loebet af forsoeget. Man kan samtidig udsaette en satellitgruppe paa 10 dyr (fem af hvert koen) for den hoejeste dosis i 28 dage og gennem en periode paa 14 dage efter forsoeget observere, om der er reversible, varige eller forsinkede toksiske virkninger. Der anvendes tillige en satellitgruppe paa 10 kontroldyr (fem af hvert koen).

1.6.2.3. Dosisniveauer

Der skal anvendes mindst tre dosisniveauer samt en kontrolgruppe eller en vehikelkontrolgruppe, saafremt der benyttes vehikel. Eksponeringsperioden er paa mindst seks timer dagligt. Teststoffet paafoeres paa omtrent samme tidspunkt hver dag, og doserne justeres med jaevne mellemrum (én gang eller to gange om uge), saa de er konstante i forhold til dyrenes legemsvaegt. Dyrene i kontrolgruppen behandles noejagtigt som dyrene i forsoegsgrupperne, bortset fra paafoering af teststoffet. Hvis der anvendes et vehikel til at lette doseringen, skal vehikelkontrolgruppen eksponeres paa samme maade som forsoegsgrupperne og paafoeres samme maengde vehikel som den gruppe, der modtager den hoejeste dosis. Den hoejeste dosis boer have toksisk virkning, men kun medfoere faa eller ingen doedsfald. Det laveste dosisniveau boer ikke have nogen toksisk virkning overhovedet. Hvis der foreligger en anvendelig vurdering af menneskers eksponering for stoffet, skal det laveste dosisniveau overskride denne eksponering. Middeldosis skal helst frembringe saa svage observerbare toksiske virkninger som muligt. Hvis der anvendes mere end tre dosisniveauer, boer de vaelges saaledes, at der opnaas graduering af de toksiske virkninger. I grupperne med lav og middel dosis og i kontrolgrupperne skal doedeligheden holdes paa et lavt niveau, saa der bliver mulighed for en meningsfuld vurdering af resultaterne.

Hvis paafoering af teststoffet foraarsager alvorlig hudirritation, saenkes koncentrationen, hvilket kan medfoere, at andre toksiske virkninger paa det hoejeste dosisniveau svaekkes eller forsvinder. Hvis huden er blevet alvorligt beskadiget, kan det vaere noedvendigt at afslutte forsoeget og foretage et nyt forsoeg med lavere koncentrationer.

1.6.2.4. Graensetest

Hvis der i en indledende undersoegelse med en dosis paa 1 000 mg/kg legemsvaegt eller en stoerre dosis fastsat ud fra kendskab til den eksponering, mennesker kan blive udsat for, ikke konstateres nogen toksisk virkning, kan yderligere test betragtes som unoedvendige.

1.6.2.5. Observationsperiode

Dyrene observeres dagligt for symptomer paa toksicitet. Doedstidspunkt og tidspunkter for toksicitetssymptomers fremkomst og forsvinden registreres.

1.6.3. Fremgangsmaade

Dyrene holdes i hver sit bur. Den ideelle dosering bestaar i paafoering af teststoffet syv dage om ugen i en periode paa 28 dage. En eventuel satellitgruppe beregnet til opfoelgningsobservationer holdes i yderligere 14 dage uden paafoering af teststof, saaledes at det kan registreres, om toksiske virkninger er reversible, eller om de vedvarer. Den daglige eksponeringsperiode er paa mindst seks timer.

Teststoffet paafoeres jaevnt over et omraade, som svarer til ca. 10 % af den samlede legemsoverflade. Med staerkt toksiske stoffer kan der anvendes et mindre omraade, men stoffet skal paafoeres saa tyndt og ensartet over en saa stor del af omraadet som muligt.

Teststoffet skal holdes i kontakt med huden ved hjaelp af en poroes gazeforbinding og en ikke-hudirriterende klaebestrimmel. Teststedet skal desuden tildaekkes paa en saadan maade, at gazeforbindingen og teststoffet holdes sikkert fast, saa at dyrene ikke kan indtage teststoffet. Der kan anvendes andre foranstaltninger, som forhindrer dyrene i at indtage teststoffet; dog kan fuldstaendig immobilisering ikke anbefales. Alternativt kan der benyttes en beskyttelseskrave.

Ved eksponeringsperiodens afslutning fjernes tilbagesiddende teststof, idet der f.eks. anvendes vand eller et andet egnet middel til at rense huden.

Alle ddy observvres daagigt, oggtoosicitetssymptomer reeiitreres, heruudee hvornaar disse symptomer optraeder foerste gang, hvor laenge de varer, og hvor kraftige de er. Inspektion af dyrene skal omfatte forandringer i hud og pels, oejne og slimhinder, aandedraet og kredsloeb, det autonome og centrale nervesystem, den motoriske aktivitet og adfaerdsmoensteret. Dyrene vejes én gang om ugen. Det anbefales, at der ogsaa holdes regnskab med den ugentlige foedeindtagelse. Dyrene observeres med jaevne mellemrum, saa dyr ikke gaar tabt for undersoegelsen paa grund af f.eks. kannibalisme, autolyse af vaev eller forveksling. Ved forsoegets slutning aflives og obduceres alle overlevende dyr med undtagelse af dem i satellitgrupperne. Doeende dyr og dyr, der viser symptomer paa staerk smerte eller lidelse, fjernes, saa snart de iagttages, hvorefter de aflives paa human maade og obduceres.

Ved forsoegets afslutning skal alle dyr inklusive kontrolgruppen underkastes foelgende undersoegelser

1) haematologisk analyse omfattende mindst haematokrit, haemoglobinkoncentration, erythrocyttaelling, total og differential leucocyttaelling og et maal for koaguleringsevnen.

2) klinisk biokemisk blodanalyse omfattende mindst én lever- og nyrefunktionsparameter: serum alanin aminotransferase (ALAT), serum aspartat aminotransferase (ASAT), urinstof, albumin, kreatinin, total bilirubin og total serumprotein.

Andre bestemmelser, der kan vaere paakraevet for en fyldestgoerende toksikologisk vurdering, er calcium, phosphor, chlorid, natrium, kalium, glucose efter faste, lipidanalyser, hormoner, syre/basebalance, methaemoglobin og cholinesteraseaktivitet.

Der kan udfoeres yderligere klinisk biokemiske analyser, hvor det skoennes noedvendigt for videre undersoegelse af observerede virkninger.

1.6.4. Makroskopisk undersoegelse

Alle forsoegsdyrene underkastes en fuldstaendig makroskopisk undersoegelse. Lever, nyrer, binyrer testes og vejes saa hurtigt som muligt efter udtagningen, saa udtoerring undgaas. Vaev og organer, d.v.s. normal og eksponeret hud, lever, nyrer, milt testes, binyrer, hjerte og maalorganer (d.v.s. organer, der udviser makroskopiske laesioner eller forandringer i stoerrelse) opbevares i et passende medium med henblik paa eventuel senere histopatologisk undersoegelse.

1.6.5. Histopatologisk undersoegelse

Der foretages en histologisk undersoegelse af praepareret vaev og organer fra dyrene i kontrolgruppen samt i den gruppe, der har vaeret udsat for den stoerste dosis. Observeres der i gruppen med den hoejeste dosis vaevs- eller organdefekter, som kan tilskrives teststoffet, undersoeges de samme vaev og organer i grupperne med lavere dosis. Dyrene i satellitgruppen underkastes en histologisk undersoegelse, isaer de vaev og organer, der udviser virkning i de oevrige grupper.

2. DATA

Data opstilles i tabelform, som for hver gruppe viser antallet af dyr ved begyndelsen af forsoeget, og for hver type laesion det antal dyr, der udviser den paagaeldende laesion.

Evaluering af samtlige observationer skal baseres paa en passende statistisk metode. Alle anerkendte statistiske metoder kan anvendes.

3. RAPPORTERING

3.1. FORSOEGSRAPPORT

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- dyreart/stamme, herkomst, miljoebetingelser, foder o.s.v.

- forsoegsbetingelser (herunder forbindingstypen: med eller uden okklusion)

- dosisniveauer (med angivelse af vehikel, hvor et saadant er anvendt) samt koncentration

- nuleffektniveau, hvor det er muligt

- oplysninger om toksiske reaktioner opdelt efter koen og dosis

- angivelse af dyrenes doedstidspunkt under forsoeget eller overlevelse til forsoegets slutning

- toksiske og andre virkninger

- for hvert enkelt abnormitetstegn det tidspunkt, hvor det er observeret, og dets senere udvikling

- foder- og legemsvaegt

- haematologiske analyser og samtlige resultater

- klinisk biokemiske analyser og samtlige resultater

- obduktionsfund

- detaljeret beskrivelse af alle histopatologiske fund

- eventuel statistisk behandling af resultaterne

- diskussion af resultaterne

- fortolkning af resultaterne.

3.2. VURDERING OG FORTOLKNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt D).

4. LITTERATURHENVISNINGER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt E).

B.10. MUTAGENICITET (»IN VITRO« CYTOGENETISK TEST PAA PATTEDYRCELLER)

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt A).

1.2. DEFINITIONER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt C).

1.3. REFERENCESTOFFER

Ingen.

1.4. TESTMETODENS PRINCIP

Denne in vitro cytogenetiske test er en korttids mutagenicitetstest til paavisning af strukturelle kromosomforandringer i dyrkede pattedyrceller. Der kan anvendes baade primaerkulturer og kulturer af etablerede cellelinjer. Efter at cellekulturerne har vaeret eksponeret for teststoffet baade med og uden et egnet metabolisk aktiveringssystem, behandles kulturerne med en tentraadsinhibitor som for eksempel colchicin, saa der akkumuleres celler i et metafasestadium i mitosen (c-metafase). Cellerne hoestes paa passende tidspunkter og praepareres med henblik paa kromosomanalyse. Praeparaterne farves, og celler i metafase undersoeges for eventuelle kromosomforandringer.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ingen.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN

1.6.1. Forberedelser

1.6.1.1. Celler

Der anvendes primaerkulturer eller kulturer af etablerede cellelinjer, f.eks. celler fra kinesiske hamstere eller humane lymfocytter. Teststoffet tilsaettes direkte til naeringssubstratet eller oploeses i et passende vehikel, inden cellerne eksponeres.

1.6.1.2. Metabolisk aktivering

Celler udsaettes for teststoffet baade med og uden tilsaetning af et egnet metabolisk aktiveringssystem. Det hyppigst anvendte system bestaar af den mikrosomholdige supernatant fra leverhomogenat fremstillet af levere fra gnavere, der har vaeret behandlet med enzyminducerende stoffer, tilsat cofaktor.

1.6.2. Forsoegsbetingelser

Antal kulturer

Der anvendes mindst to kulturer for hvert dosisniveau og kontrol.

Negative og positive kontrolkulturer

Som negativ kontrol anvendes oploesningsmiddel (saafremt dette ikke er substratet eller vand), leverenzymaktiveringsblanding, leverenzymaktiveringsblanding plus oploesningsmiddel samt helt ubehandlede kulturer.

Der anvendes en positiv kontrol i hvert enkelt forsoeg. Anvendes der en leverenzymaktiveringsblanding til at aktivere teststoffet, skal der som positiv kontrol benyttes et stof, der vides at kraeve metabolisk aktivering.

Dosisniveau

Der anvendes mindst tre dosisniveauer af teststoffet over mindst ét logaritmisk dosisinterval, og saaledes at den hoejeste dosis nedsaetter den mitotiske aktivitet med ca. 50 % eller paa anden maade udviser cytotoksicitet. Hvis stoffet ikke er toksisk, testes det ved den hoejeste koncentration, som oploeseligheden tillader, dog hoejst 5 mg/ml.

Dyrkningsbetingelser

Der anvendes et passende substrat og passende inkubationsbetingelser (temperatur, dyrkningsflasker, CO2-koncentration, fugtighed, o.s.v.).

1.6.3. Fremgangsmaade

1.6.3.1. Fremstilling af kulturer

Etablerede cellelinjer: Cellerne tages fra stamkulturer (f.eks. ved hjaelp af trypsinbehandling eller afrystning), hvorefter de udsaas med passende taethed paa dyrkningsplader og inkuberes ved 37 C.

Humane lymfocytter: hepariniseret fuldblod tilsaettes substrat indeholdende phyto-haemagglutinin, foetalt kalveserum og antibiotika. Blandingen inkuberes ved 37 C.

1.6.3.2. Behandling af kulturerne med teststof

(i) Behandling uden leverenzymaktiveringsblanding

Behandling skal saa vidt muligt mindst have samme varighed som en hel cellecyklus, og der skal fastlaegges fikseringstidspunkter for at sikre, at celler, der er blevet underkastet behandling paa forskellige trin i deres cyklus, analyseres under den foerste mitose efter behandlingen.

Hvis behandlingen har kortere varighed end en hel cellecyklus, skal der fastlaegges saadanne fikseringstidspunkter, at der udtages celler, som er paa forskellige trin af cellecyklus (G1, S og G2) under behandlingen.

Teststoffet tilsaettes til kulturer af etablerede cellelinjer, mens de er i den eksponentielle vaekstfase. Humane lymfocytkulturer behandles, mens de stadig befinder sig i en semisynkron tilstand.

(ii) Behandling med leverenzymaktiveringsblanding

Kulturerne behandles med teststoffet plus aktiveringssystemet saa laenge som muligt, uden at der optraeder toksiske virkninger i cellerne. Hvis behandlingen som foelge af toksisk virkning maa begraenses til mindre varighed end en hel cellecyklus, skal der fastlaegges saadanne fikseringstidspunkter, at der udtages celler, som er paa forskellige trin af cellecyklus (G1, S og G2) under behandlingen.

Hoest af celler

Cellekulturerne behandles med tentraadsinhibitoren i et passende tidsrum, foer de hoestes. Hoest og kromosompraeparering skal foregaa saerskilt for hver enkelt kultur.

1.6.3.3. Kromosompraeparering

Kromosompraeparering omfatter hypotonisk behandling af cellerne, fiksering, udstrygning paa objektglas og farvning.Der skal mindst hoestes paa to tidspunkter. Det anbefales at hoeste foerste gang efter ca. én cellecyklus og anden gang paa et senere tidspunkt. Derved sikres daekning af alle trin i cellecyklus, og der tages hoejde for forlaengelse af cellecyklus.

Analyse

Der undersoeges mindst 100 velpraeparerede metafaser pr. kultur for eventuelle kromosomforandringer. Objektglas kodes foer analyse. Ved humane lymfocytter undersoeges kun metafaser, der indeholder 46 centromerer.

Ved etablerede cellelinjer undersoeges kun metafaser, som indeholder ± 2 centromerer i forhold til normaltallet for stammen (modaltallet). Endvidere vurderes i givet fald det mitotisk indeks eller en anden indikator for cytotoksicitet paa hvert dosisniveau.

2. DATA

Data opstilles i tabelform. Forandringer af kromatider (gaps, brud, translokationer) og af kromosomer (gaps, brud, bruddele, ringe, dicentromerer, polycentromerer) samt antallet af afvigende metafaser (inklusive og eksklusive gaps) anfoeres separat for alle behandlede kulturer og kontrolkulturer.

Evaluering af data baseres paa passende statistiske metoder.

Testresultaterne skal sammenholdes med de tilsvarende negative kontrolkulturer.

Der foretages mindst to uafhaengige forsoeg. Dog kan ét enkelt forsoeg vaere tilstraekkeligt, hvis det er videnskabeligt begrundet. Det andet forsoeg behoever ikke noedvendigvis at udfoeres paa noejagtig samme maade som det foerste. Man kan faktisk med fordel aendre paa visse testbetingelser og derved faa mere nyttige data.

3. RAPPORTERING

3.1. FORSÃGSRAPPORT

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- anvendt celletype

- forsoegsbetingelser: sammensaetning af mediet, CO2-koncentration, inkubationstemperatur, inkubationstid, dosisniveauer, behandlingstid, varigheden af behandling med og koncentrationen af den anvendte tentraadsinhibitor, den anvendte leverenzymaktiveringsblanding, positive og negative kontrolkulturer

- antal cellekulturer

- antal undersoegte metafaser (der angives data for hver enkelt kultur)

- mitotisk indeks eller anden indikator for cytotoksicitet

- type og antal af kromosomforandringer oplyst saerskilt for hver enkelt behandlet kultur og kontrolkultur, og de etablerede cellelinjers modaltal

- statistisk evaluering

- diskussion af resultaterne

- fortolkning af resultaterne.

3.2. VURDERING OG FORTOLKNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt D).

4. LITTERATURHENVISNINGER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt E).

B.11. KNOGLEMARV FRA PATTEDYR - KROMOSOMANALYSE

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt A).

1.2. DEFINITIONER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt C).

1.3. REFERENCESTOFFER

Ingen.

1.4. TESTMETODENS PRINCIP

Denne in vivo cytogenetiske test er en korttids mutagenicitetstest til paavisning af strukturelle kromosomforandringer. Vurdering af kromosomforandringer foregaar oftest i forbindelse med den foerste mitose efter eksponering. Stoerstedelen af de forandringer, der induceres af kemiske mutagener, er kromatidforandringer.

Der anvendes knoglemarvsceller fra pattedyr, som eksponeres for teststofferne paa hensigtsmaessig maade, hvorefter de aflives med regelmaessige intervaller. Foer aflivningen behandles dyrene med en tentraadsinhibitor som for eksempel colchicin, saa der akkumuleres celler i et metafasestadium i mitosen (c-metafase). Der fremstilles lufttoerrede kromosompraeparater af cellerne, og praeparaterne farves og undersoeges mikroskopisk for kromosomforandringer.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ingen.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN

1.6.1. Forberedelser

Teststoffet oploeses i isotonisk saltvand. Hvis dette ikke lader sig goere, oploeses eller opslaemmes det i et passende vehikel.

Oploesning af teststoffet foretages umiddelbart inden anvendelse. Hvis der anvendes et vehikel for at lette doseringen, maa det ikke indvirke paa teststoffet og ikke foraarsage toksiske virkninger.

1.6.2. Forsoegsbetingelser

1.6.2.1. Forsoegsdyr

Der anvendes gnavere som f.eks. rotter, mus eller kinesiske hamstere. Unge, sunde, koensmodne dyr fordeles randomiseret i forsoegs- og kontrolgrupper.

1.6.2.2. Antal og koen

Der anvendes mindst fem hunner og fem hanner til hver forsoegsgruppe og hver kontrolgruppe. Saaledes bliver der aflivet 10 dyr pr. tidsinterval pr. gruppe, hvis forsoegsplanen foreskriver flere testtidspunkter efter eksponeringen. Et enkelt testtidspunkt er tilstraekkeligt for den positive kontrolgruppe.

1.6.2.3. Indgiftsmaade

Teststoffet skal i almindelighed gives i én dosis. Saafremt der foreligger en toksikologisk begrundelse, kan indgift ske efter opdeling i mindre doser. Denne fremgangsmaade kan imidlertid kun anvendes, saafremt teststoffet ikke har cytotoksisk virkning paa knoglemarv. Saedvanligvis indgives teststoffet oralt eller ved intraperitoneal injektion. Andre indgiftsmaader kan dog ogsaa anvendes.

1.6.2.4. Negative og positive kontrolgrupper

Som positiv kontrol anvendes et kemisk stof, der vides at foraarsage kromosomforandringer in vivo, og der inkluderes ogsaa en negativ kontrolgruppe (oploesningsmiddel) i hvert forsoeg.

1.6.2.5. Dosisniveau

I den basale forsoegsbeskrivelse anvendes én (1) dosis, som skal vaere den maksimale ikke-toksiske dosis eller den dosis, der viser en vis cytotoksisk virkning, (dvs. delvis mitosehaemning).

For »ikke-toksiske« stoffer er den hoejeste dosis, der behoever at undersoeges ved indgift af én enkelt dosis, 2 000 mg/kg legemsvaegt.

Hvis stoffet indgives i flere doser, er den oevre graense paa 1 000 mg/kg legemsvaegt pr. dag.

Der kan anvendes flere dosisniveauer, saafremt der er videnskabeligt grundlag herfor.

I tilfaelde, hvor testen anvendes som verifikation, boer der yderligere anvendes mindst to andre dosisniveauer.

1.6.3. Fremgangsmaade

Testen kan gennemfoeres paa to maader

(i) Forsoegsdyrene eksponeres for teststoffet i én dosis paa det maksimale ikke-toksiske niveau. I foerste omgang udtages der proever efter 24 timer. Er resultaterne paa dette trin klart positive, kan yderligere proeveudtagning udelades. Er resultaterne derimod negative eller tvetydige, udtages der herudover proever efter ét kortere og ét laengere tidsinterval, der er af en passende laengde mellem 6 og 48 timer, da teststoffet kan have indflydelse paa cellecyklus kinetik.

Hvis der benyttes mere end ét dosisniveau, udtages der proever i den periode, hvor virkningen er stoerst, eller, saafremt denne ikke kendes, efter 24 timer.

(ii) Eksponeringen kan med farmakokinetisk og metabolisk begrundelse opdeles i flere doser, og proeveudtagningen finder i saa fald sted 6 og 24 timer efter sidste indgift.

Knoglemarvspraeparation

Inden aflivning faar forsoegsdyrene en intraperitoneal injektion af en tentraadsinhibitor, saa der akkumuleres et tilstraekkeligt antal celler i c-metafase. Knoglemarven vaskes ud af begge femora paa nyligt aflivede dyr ved hjaelp af en isotonisk oploesning. Efter hypotonisk behandling fikseres cellerne og udstryges paa objektglas, lufttoerres og farves.

Analyse

Inden mikroskopering kodes objektglassene. For hvert dyr undersoeges mindst 50 velpraeparerede metafaser med komplet antal centromerer for strukturelle kromosomforandringer. Samtidig kan det mitotiske indeks for hvert dyr beregnes.

2. DATA

Data opstilles i tabelform. Kromatidforandringer og isokromatidforandringer (gaps, brud, translokationer), samt det eventuelt registrerede mitotiske indeks anfoeres separat for alle forsoegs- og kontroldyr. Der anfoeres ogsaa middeltal og standardafvigelser for de enkelte forsoegs- og kontrolgrupper. Evaluering af data baseres paa passende statistiske metoder.

3. RAPPORTERING

3.1. FORSOEGSRAPPORT

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- dyreart/stamme samt dyrenes alder

- antal dyr af hvert koen i forsoegs- og kontrolgrupperne

- forsoegsbetingelser: detaljeret beskrivelse af indgiftsmaade, proeveudtagning, dosisniveauer, varighed af behandling med tentraadsinhibitor samt dens koncentration

- antal undersoegte metafaser pr. dyr

- mitotisk indeks, hvis det er registreret

- antal og type af forandringer opgivet separat for hvert enkelt forsoegs- og kontroldyr

- toksicitetssymptomer iagttaget under forsoeget

- statistisk evaluering

- diskussion af resultaterne

- fortolkning af resultaterne.

3.2. VURDERING OG FORTOLKNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt D).

4. LITTERATURHENVISNINGER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt E).

B.12. MUTAGENICITET (MIKRONUCLEUSTEST)

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt A).

1.2. DEFINITIONER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt C).

1.3. REFERENCESTOFFER

Ingen.

1.4. TESTMETODENS PRINCIP

Mikronucleustesten er en in vivo korttidstest i pattedyrceller, som anvendes til paavisning af kromosomskader eller beskadigelser af det mitotiske apparat foraarsaget af kemiske stoffer. Grundlaget for denne test er en foroegelse af antallet af mikronuclei i forsoegsdyrenes polykromatiske erytrocytter i forhold til kontroldyrenes.

Mikronuclei dannes af kromosomdele eller hele kromosomer, som forsinkes i mitosen. Naar erytroblaster udvikler sig til erytrocytter, udstoedes cellekernen, mens mikronuclei kan forblive i cytoplasmaet. I denne test anvendes unge polykromatiske erytrocytter fra knoglemarven hos forsoegsdyr, der har vaeret eksponeret for teststoffer paa en passende maade. Knoglemarven ekstraheres og anvendes til udstrygningspraeparater, som farves. Polykromatiske erytrocytter undersoeges i mikroskop, mikronuclei taelles, og forholdet mellem polykromatiske og normokromatiske erytrocytter bestemmes.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ingen.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN

1.6.1. Forberedelser

Teststoffet oploeses i isotonisk saltvand. Hvis dette ikke lader sig goere, oploeses eller opslaemmes det i et passende vehikel. Hvis der anvendes et vehikel, maa det ikke indvirke paa teststoffet og ikke foraarsage toksiske virkninger. Oploesning af teststoffet foretages normalt umiddelbart inden anvendelsen.

1.6.2. Forsoegsbetingelser

1.6.2.1. Forsoegsdyr

Det anbefales at anvende mus, men andre pattedyr kan ogsaa anvendes. Unge, sunde, koensmodne dyr fordeles randomiseret i forsoegs- og kontrolgrupper.

1.6.2.2. Antal og koen

Der anvendes mindst fem hunner og fem hanner i hver forsoegsgruppe og hver kontrolgruppe. Saaledes bliver der aflivet 10 dyr pr. tidsinterval pr. gruppe, hvis forsoegsplanen foreskriver flere testtidspunkter efter eksponeringen. Et enkelt testtidspunkt er tilstraekkeligt for den positive kontrolgruppe.

1.6.2.3. Indgiftsmaade

Teststoffet skal i almindelighed gives i én dosis. Saafremt der foreligger en toksikologisk begrundelse, kan indgift ske efter opdeling i flere doser. Denne fremgangsmaade kan imidlertid kun anvendes, saafremt teststoffet ikke har cytotoksisk virkning paa knoglemarv. Saedvanligvis indgives teststoffet oralt eller ved intraperitoneal injektion. Andre indgiftsmaader kan dog ogsaa anvendes.

1.6.2.4. Negative og positive kontrolgrupper

Der anvendes baade positiv og negativ (oploesningsmiddel) kontrol i hvert enkelt forsoeg.

1.6.2.5. Dosisniveau

I den basale forsoegsbeskrivelse anvendes én (1) dosis, som skal vaere den maksimale ikke-toksiske dosis eller den dosis, der har en vis cytotoksisk virkning, dvs. aendring af forholdet mellem polykromatiske og normokromatiske erytrocytter.

For »ikke-toksiske« stoffer er den hoejeste dosis, der behoever at undersoeges ved indgift af én enkelt dosis, 2 000 mg/kg legemsvaegt.

Hvis stoffet indgives i flere doser, er den oevre graense paa 1 000 mg/kg legemsvaegt pr. dag.

Der kan anvendes flere dosisniveauer, saafremt der er videnskabeligt grundlag herfor.

I de tilfaelde, hvor testen anvendes som verifikation, boer der yderligere anvendes mindst to andre dosisniveauer.

1.6.3. Fremgangsmaade

Testen kan gennemfoeres paa to maader

(i) Forsoegsdyrene eksponeres for teststoffet i én dosis. Proeveudtagning boer foretages paa de tidspunkter, hvor der kan forventes maksimal respons, hvilket varierer med teststoffet. Der udtages derfor proever af knoglemarven mindst to gange, foerste gang ikke tidligere end 12 timer efter indgift og herefter ikke senere end 48 timer efter indgift.

Hvis der benyttes mere end ét dosisniveau, udtages der proever i den periode, hvor virkningen er stoerst, eller, saafremt denne ikke kendes, efter 24 timer.

(ii) Eksponeringen kan med farmakokinetisk og metabolisk begrundelse opdeles i flere doser, og proeveudtagningen finder i saa fald sted én gang, ikke tidligere end 12 timer efter sidste indgift.

Knoglemarvspraeparation

Knoglemarven vaskes ud af begge femora paa nyligt aflivede dyr med foetalt kalveserum. Cellerne sedimenteres ved centrifugering, og supernatanten fjernes. Den homogene cellesuspension dryppes paa objektglas, og der fremstilles udstrygningspraeparater. Efter lufttoerring farves praeparaterne.

Analyse

Inden mikroskopering kodes objektglassene. For hvert dyr undersoeges mindst 1 000 polykromatiske erytrocytter for forekomst af mikronuclei.

Forholdet mellem normokromatiske og polykromatiske erytrocytter bestemmes for hvert dyr ved taelling af sammenlagt 1 000 erytrocytter.

2. DATA

Data opstilles i tabelform. Antallet af polykromatiske erytrocytter samt antallet af polykromatiske erytrocytter med mikronuclei og procentdelen af celler med mikronuclei anfoeres for hvert enkelt forsoegs- og kontroldyr tillige med forholdet mellem normokromatiske og polykromatiske erytrocytter. Der anfoeres ogsaa middeltal og standardafvigelser for de enkelte forsoegs- og kontrolgrupper. Evaluering af de anfoerte data baseres paa passende statistiske metoder.

3. RAPPORTERING

3.1. FORSOEGSRAPPORT

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- dyreart/stamme samt dyrenes alder

- antal dyr af hvert koen i forsoegs- og kontrolgrupperne

- forsoegsbetingelser: detaljeret beskrivelse af indgiftsmaade, proeveudtagning, dosisniveauer, toksiske reaktioner, negative og positive kontrolgrupper

- kriterier for registrering af mikronuclei

- dosis-virkningskurve, hvor det er muligt

- toksicitetssymptomer iagttaget under forsoeget

- statistisk evaluering

- diskussion af resultaterne

- fortolkning af resultaterne.

3.2. VURDERING OG FORTOLKNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt D).

4. LITTERATURHENVISNINGER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt E).

B.13. MUTAGENICITET (ESCHERICHIA COLI - TILBAGEMUTATIONSTEST)

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt A).

1.2. DEFINITIONER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt C).

1.3. REFERENCESTOFFER

Ingen.

1.4. TESTMETODENS PRINCIP

En tilbagemutation hos Escherichia coli i tryptophan (trp) operonet trp . trp+ er grundlaget for, at kemiske stoffer kan foraarsage baseparsubstitutioner i genomet hos denne mikroorganisme.

Bakterier eksponeres for teststoffet baade med og uden metabolisk aktivering. Efter en passende inkubationstid paa minimalsubstrat taelles de tilbagemuterede kolonier (revertanter), og der sammenlignes med antallet af spontane revertanter i en ubehandlet kontrolkultur og/eller en kontrolkultur tilsat oploesningsmiddel.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ingen.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN

Der kan benyttes foelgende metoder ved denne bestemmelse: (1) forinkubationsmetoden, eller (2) direkte inkorporering, hvor bakterier og teststof blandes i topagar og haeldes ud over en selektiv agarplade.

1.6.1. Forberedelser

1.6.1.1. Bakterier

Bakterierne dyrkes ved 37 C, til de naar slutningen af den eksponentielle vaekstfase eller begyndelsen af den stationaere vaekstfase. Celletaetheden skal ligge omkring 108-109 celler pr. ml.

1.6.1.2. Metabolisk aktivering

Bakterierne udsaettes for teststoffet baade med og uden tilsaetning af et egnet metabolisk aktiveringssystem. Det hyppigst anvendte system bestaar af den mikrosomholdige supernatant fra leverhomogenat fremstillet af levere fra gnavere, der har vaeret behandlet med enzyminducerende stoffer tilsat cofaktor.

1.6.2. Forsoegsbetingelser

1.6.2.1. Teststammer

Der skal anvendes tre stammer, WP2, WP2 uvr A og WP2 uvr A pKM 101. Der benyttes anerkendte metoder ved dyrkning og opbevaring af stamkulturer. Stammernes vaekstkrav og genetiske identitet samt deres foelsomhed over for ultraviolet lys eller mitomycin C skal undersoeges. WP2 uvr A pKM 101's modstandsdygtighed over for ampicillin skal undersoeges. Stammerne skal ogsaa producere spontane revertanter med den forventede hyppighed.

1.6.2.2. Substrater

Der anvendes et passende selektivt substrat, som fremmer mutanternes udvikling, og en egnet topagar.

1.6.2.3. Negative og positive kontrolkulturer

Der skal anvendes baade ubehandlet kontrol og kontrol med oploesningsmiddel. Der anvendes desuden positiv kontrol med det formaal

(i) at bekraefte bakteriestammernes foelsomhed.

Ved test uden metabolismeaktivering kan der anvendes methylmethansulfonat, 4-nitroquinolinoxid eller ethylnitrosourinstof som positiv kontrol.

(ii) at sikre, at det anvendte metaboliske system er aktivt.

Som positiv kontrol for alle stammers metaboliske system kan der benyttes 2-aminoanthracen. Hvis det er muligt, boer der som positiv kontrol anvendes en kemisk forbindelse af samme type som teststoffet.

1.6.2.4. Teststofmaengde pr. plade

Mindst fem forskellige maengder af teststoffet proeves over halve logaritmiske dosisintervaller. Stoffet proeves i maengder op til graensen for oploeselighed eller toksicitet. Toksicitet erkendes ved en reduktion i antallet af spontane revertanter, ved pladens dybdegennemskinnelighed, eller ved de eksponerede kulturers overlevelsesgrad. Ikke-toksiske stoffer skal testes op til 5 mg pr. plade, foer de betragtes som negative.

1.6.2.5. Inkubationsbetingelser

Pladerne inkuberes ved 37 C i 48-72 timer.

1.6.3. Fremgangsmaade

Ved den direkte inkorporering (uden enzymaktivering) tilsaettes teststoffet og 0,1 ml frisk bakteriekultur til 2,0 ml topagar. Hvis testen udfoeres med metabolisk aktivering, tilsaettes der 0,5 ml leverenzymaktiveringsblanding indeholdende en passende maengde mikrosomer til topagaren, efter at teststoffet og bakterierne er tilsat. Proeveglassets indhold blandes og haeldes ud over en plade med selektiv agar. Topagaren faar lov til at stoerkne, og pladerne inkuberes ved 37 C i 48-72 timer. Ved inkubationsperiodens slutning taelles antallet af tilbagemuterede kolonier pr. plade.

Ved forinkubationsmetoden forinkuberes en blanding af teststoffet, 0,1 ml frisk bakteriekultur og en passende maengde leverenzymaktiveringsblanding eller en tilsvarende maengde buffer, foer de 2,0 ml topagar tilsaettes. De oevrige dele af denne metode er identiske med den direkte inkorporering.

Ved begge metoder foretages al udsaaning parallelt paa mindst tre plader.

2. DATA

Antallet af tilbagemuterede kolonier pr. plade anfoeres baade for de eksponerede kulturers og for kontrolkulturernes vedkommende. Alle optaellinger paa enkeltplader, det gennemsnitlige antal tilbagemuterede kolonier pr. plade samt standardafvigelser angives baade for de plader, der har vaeret eksponeret for teststoffet, og for kontrolpladerne.

Evaluering af data baseres paa passende statistiske metoder.

Der foretages mindst to uafhaengige forsoeg. Det andet forsoeg behoever ikke noedvendigvis at udfoeres paa noejagtig samme maade som det foerste. Man kan faktisk med fordel aendre paa visse testbetingelser og derved faa mere nyttige data.

3. RAPPORTERING

3.1. FORSOEGSRAPPORT

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- anvendte bakteriestammer

- forsoegsbetingelser: doser, toksicitet, substratsammensaetning, fremgangsmaader (forinkubation og inkubation), metabolisk aktivering, referencestoffer, negative kontrolkulturer

- optaelling paa de enkelte plader, det gennemsnitlige antal tilbagemuterede kolonier pr. plade, standardafvigelse, om muligt en dosis-virkningskurve

- diskussion af resultaterne

- fortolkning af resultaterne.

3.2. VURDERING OG FORTOLKNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt D).

4. LITTERATURHENVISNINGER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt E).

B.14. MUTAGENCITET (SALMONELLA TYPHIMURIUM - TILBAGEMUTATIONSTEST)

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt A).

1.2. DEFINITIONER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt C).

1.3. REFERENCESTOFFER

Ingen.

1.4. TESTMETODENS PRINCIP

En tilbagemutation hos Salmonella typhimurium i histidin (his) operonet his . his+ er grundlaget for, at kemiske stoffer kan foraarsage baseparsubstitutioner eller frameshiftmutationer i genomet hos denne mikroorganisme.

Bakterier eksponeres for teststoffet baade med og uden metabolisk aktivering og udsaas paa plader med minimalsubstrat. Efter en passende inkubationstid taelles de tilbagemuterede kolonier (revertanter), og der sammenlignes med antallet af spontane revertanter paa en ubehandlet kontrolkultur og/eller en kontrolkultur tilsat oploesningsmiddel.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Ingen.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN

1.6.1. Forberedelser

1.6.1.1. Bakterier

Nyfremstillede bakteriekulturer dyrkes ved 37 C, til de naar slutningen af den eksponentielle vaekstfase eller begyndelsen af den stationaere vaekstfase. Celletaetheden skal ligge omkring 108-109 celler pr. ml.

1.6.1.2. Metabolisk aktivering

Bakterierne udsaettes for teststoffet med og uden tilsaetning af et egnet metabolismeaktiveringssystem. Det hyppigst anvendte system bestaar af den mikrosomholdige supernatant fra leverhomogenat fremstillet af levere fra gnavere, der har vaeret behandlet med enzyminducerende stoffer tilsat cofaktor.

1.6.2. Forsoegsbetingelser

1.6.2.1. Teststammer

Der anvendes mindst fire stammer, TA 1535, TA 1537 eller TA 97, TA 98 og TA 100. Andre stammer saasom TA 1538 og TA 102 kan anvendes derudover. Der benyttes anerkendte metoder ved dyrkning og opbevaring af stamkulturer. Stammernes vaekstkrav og genetiske identitet samt deres foelsomhed over for ultraviolet lys og krystalviolet og deres modstandsdygtighed over for ampicillin skal undersoeges. Stammerne skal ogsaa producere spontane revertanter med den forventede hyppighed.

1.6.2.2. Substrater

Der anvendes et passende selektivt substrat og en egnet topagar.

1.6.2.3. Negative og positive kontrolkulturer

Der anvendes baade ubehandlet kontrol og kontrol med oploesningsmiddel. Der anvendes desuden positiv kontrol med det formaal

(i) at bekraefte bakteriestammernes foelsomhed.

Foelgende stoffer kan anvendes i test uden metabolismeaktivering

StammeReverteres med

TA 1535, TA 100 natriumazid

TA 1538, TA 98, TA 97 2-nitrofluoren

TA 1537 9-aminoacridin

TA 102 cumenhydroperoxid

(ii) at sikre, at det anvendte metaboliske system er aktivt.

Som positiv kontrol for alle stammers metaboliske system kan der benyttes 2-aminoanthracen. Hvis det er muligt, boer der som positiv kontrol anvendes en kemisk forbindelse af samme type som teststoffet.

1.6.2.4. Teststofmaengde pr. plade

Mindst fem forskellige maengder af teststoffet proeves over halve logaritmiske dosisintervaller. Stoffet proeves i maengder op til graensen for oploeselighed eller toksicitet. Toksicitet erkendes ved en reduktion i antallet af spontane revertanter, ved pladens dybdegennemskinnelighed, eller ved de eksponerede kulturers overlevelsesgrad. Ikke-toksiske stoffer skal testes op til 5 mg pr. plade, foer de betragtes som negative.

1.6.2.5. Inkubationsbetingelser

Pladerne inkuberes ved 37 C i 48-72 timer.

1.6.3. Fremgangsmaade

Ved den direkte inkorporering (uden enzymaktivering) tilsaettes teststoffet og 0,1 ml frisk bakteriekultur til 2,0 ml topagar. Hvis testen udfoeres med metabolisk aktivering, tilsaettes der 0,5 ml leverenzymaktiveringsblanding indeholdende en passende maengde mikrosomer til topagaren, efter at teststoffet og bakterierne er tilsat. Proeveglassets indhold blandes og haeldes ud over en plade med selektiv agar. Topagaren faar lov til at stoerkne, og pladerne inkuberes ved 37 C i 48-72 timer. Ved inkubationsperiodens slutning taelles antallet af tilbagemuterede kolonier pr. plade. Ved forinkubationsmetoden forinkuberes en blanding af teststoffet, 0,1 ml frisk bakteriekultur og en passende maengde leverenzymaktiveringsblanding eller en tilsvarende maengde buffer, foer de 2,0 ml topagar tilsaettes. De oevrige dele af denne metode er identiske med den direkte inkorporering.

Ved begge metoder foretages al udsaaning parallelt paa mindst tre plader.

2. DATA

Antallet af tilbagemuterede kolonier pr. plade anfoeres baade for de eksponerede kulturers og for kontrolkulturernes vedkommende.

Alle optaellinger paa enkeltplader, det gennemsnitlige antal tilbagemuterede kolonier pr. plade samt standardafvigelser angives baade for de plader, der har vaeret eksponeret for teststoffet, og for kontrolpladerne.

Evaluering af data baseres paa passende statistiske metoder.

Der foretages mindst to uafhaengige forsoeg. Det andet forsoeg behoever ikke noedvendigvis at udfoeres paa noejagtig samme maade som det foerste. Man kan faktisk med fordel aendre paa visse testbetingelser og derved faa mere nyttige data.

3. RAPPORTERING

3.1. FORSOEGSRAPPORT

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- anvendte bakteriestammer

- forsoegsbetingelser: doser, toksicitet, substratsammensaetning, fremgangsmaader (forinkubation og inkubation), metabolisk aktivering, referencestoffer, negative kontrolkulturer

- optaelling paa de enkelte plader, det gennemsnitlige antal tilbagemuterede kolonier pr. plade, standardafvigelse, om muligt en dosis-virkningskurve

- diskussion af resultaterne

- fortolkning af resultaterne.

3.2. VURDERING OG FORTOLKNING

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt D).

4. LITTERATURHENVISNINGER

Se den generelle indledning til afsnit B (punkt E).

AFSNIT C: METODER TIL BESTEMMELSE AF OEKOTOKSICITET C.1. AKUT TOKSICITET FOR FISK

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Formaalet med denne test er at bestemme et stofs akutte doedelige toksicitet for ferskvandsfisk. Det er oenskeligt at have flest mulige oplysninger om stoffets vandoploeselighed, damptryk, kemiske stabilitet, dissociationskonstanter og bionedbrydelighed, naar man skal vaelge, med hvilken testmetode (statisk, semistatisk eller gennemloeb) der mest hensigtsmaessigt kan opnaas tilfredsstillende konstante koncentrationer af teststoffet under testens forloeb.

OEvrige oplysninger (f.eks. strukturformel, renhedsgrad, art og procentdel af betydende urenheder, tilstedevaerelse og maengde af tilsaetningsstoffer, samt n-octanol/vand-fordelingskoefficienten) boer tages i betragtning baade ved planlaegningen af testen og ved fortolkningen af testresultaterne.

1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER

Akut toksicitet er erkendbar skadelig virkning, der fremkaldes hos en organisme inden for kort tid (dage) ved eksponering for et stof. I denne test udtrykkes akut toksicitet som middel doedelig koncentration (LC50), dvs. den koncentration i vand, som draeber 50 % af fiskene i en forsoegsgruppe under kontinuerlig eksponering i en vis periode, som skal angives.

Alle koncentrationer af teststoffet er angivet i vaegt pr. volumenenhed (mg/l). De kan ogsaa udtrykkes i vaegtforhold (mg/kg).

1.3. REFERENCESTOFFER

Der kan anvendes et referencestof til at godtgoere, at forsoegsdyrenes foelsomhed ikke har aendret sig vaesentligt under forsoegsbetingelserne i laboratoriet.

Der er ikke specificeret nogen referencestoffer til denne test.

1.4. TESTMETODENS PRINCIP

Der kan udfoeres en graensetest med 100 mg/l til konstatering af, om LC50 er stoerre end denne koncentration.

Fiskene udsaettes for teststoffet i vand i en raekke koncentrationer i 96 timer. Doedeligheden registreres med hoejst 24 timers mellemrum, og man beregner om muligt de koncentrationer, der paa hvert observationstidspunkt draeber 50 % af fiskene (LC50).

1.5. KVALITETSKRITERIER

Kvalitetskriterierne gaelder for saavel graensetesten som den komplette testmetode.

Doedeligheden i kontrolgruppen maa ikke overstige 10 % (eller 1 fisk hvis der benyttes mindre end 10 fisk) ved testens afslutning.

Koncentrationen af oploest oxygen skal vaere hoejere end 60 % af maetning gennem hele testen.

Koncentrationen af teststoffet skal ligge over 80 % af startkoncentrationen gennem hele testen.

For stoffer, der let oploeses i testmediet og giver stabile oploesninger, dvs. stoffer, der ikke i vaesentlig grad fordamper, nedbrydes, hydrolyseres eller adsorberes, kan startkoncentrationen antages at vaere lig med den nominelle koncentration. Det skal godtgoeres, at koncentrationen har vaeret opretholdt gennem hele testen, og at kvalitetskriterierne er opfyldt.

For stoffer, som

(i) er tungt oploeselige i testmediet eller

(ii) kan danne stabile emulsioner eller dispersioner eller

(iii) er ustabile i vandig oploesning, skal der som vaerdi for startkoncentrationen anvendes den koncentration, som er maalt i oploesningen (eller hvis dette ikke er teknisk muligt, maalt i vandsoejlen) ved testens begyndelse. Koncentrationen bestemmes efter, at der opnaaet ligevaegt, men foerend testfisk kommes i.

I alle disse tilfaelde skal yderligere maalinger foretages i loebet af testen for at sikre at koncentrationen har vaeret opretholdt eller kvalitetskriterierne har vaeret opfyldt.

pH maa ikke variere med mere end 1 enhed.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN

Der kan anvendes tre typer procedurer

Statisk test

Toksicitetstest hvor der ikke foregaar gennemloeb af testoploesning. (Oploesningerne udskiftes ikke under testens forloeb.)

Semi-statisk test

Test uden gennemloeb af testoploesning, men hvor hele testoploesningen udskiftes med regelmaessige lange mellemrum (f.eks. hver 24. time).

Gennemstroemningstest

Toksicitetstest, hvor vandet i testkamrene loebende udskiftes, og hvor teststoffet transporteres med udskiftningsvandet.

1.6.1. Reagenser

1.6.1.1. Teststofoploesninger

Der fremstilles stamoploesninger af den paakraevede styrke ved oploesning af stoffet i deioniseret vand eller vand som beskrevet i 1.6.1.2.

De valgte testkoncentrationer fremstilles ved fortynding af stamoploesningen. Hvis der testes hoeje koncentrationer, kan stoffet oploeses direkte i det vand, der ellers anvendes til fortynding.

Stoffer testes normalt kun op til oploeselighedsgraensen. For visse stoffer (f.eks. stoffer, som er tungt oploeselige i vand, som har en hoej Pow-vaerdi, eller som danner en stabil dispersion og ikke en aegte oploesning i vand) kan det accepteres, at der anvendes en testkoncentration, der er stoerre end oploeseligheden, saa det sikres, at den hoejeste oploeste/stabile koncentration er naaet. Det er dog vigtigt, at denne koncentration ikke paa anden maade forstyrrer testsystemet (f.eks. dannelse af en hinde af stoffet paa vandoverfladen, saa vandet ikke iltes, osv.).

Der kan tages ultralyd, organiske oploesningsmidler, emulgatorer eller dispergeringsmidler til hjaelp til fremstilling af stamoploesninger af stoffer, der er tungt oploeselige i vand, og til dispergering af saadanne stoffer i testmediet. Hvis der anvendes hjaelpestoffer, skal alle testkoncentrationer indeholde samme maengde hjaelpestof, og der anvendes en ekstra kontrolgruppe, der udsaettes for samme koncentration af hjaelpestoffet, som er anvendt i testserien. Saadanne hjaelpestoffer anvendes i den lavest mulige koncentration, der i hvert tilfaelde ikke maa vaere stoerre end 100 mg/l i testmediet.

Testen gennemfoeres uden justering af pH. Hvis der konstateres en vaesentlig pH-aendring, anbefales det at gentage testen med justeret pH, og disse resultater rapporteres. I saa fald justeres stamoploesningens pH til samme vaerdi som i det vand, der anvendes til fortynding, medmindre der er saerlige grunde til at undlade dette. Til justering af pH foretraekkes HCl og NaOH. Justering af pH skal foregaa paa en saadan maade, at koncentrationen af teststof i stamoploesningen ikke aendres vaesentligt. Hvis teststoffet reagerer kemisk eller udfaeldes ved justeringen, rapporteres dette.

1.6.1.2. Vand til opbevaring og fortynding

Der kan benyttes drikkevand (ikke forurenet med potentielt skadelige koncentrationer af chlor, tungmetaller eller andre stoffer), raavand af egnet kvalitet eller kunstigt fremstillet ferskvand (se tillaeg 1). Der foretraekkes vand med en total haardhed mellem 10 og 250 mg/l (som CaCO3) og med et pH mellem 6,0 og 8,5.

1.6.2. Apparatur

Alt apparatur skal vaere af kemisk inert materiale.

- automatisk fortyndingssystem (for gennemstroemningstest)

- oxygenmaaleudstyr

- udstyr til bestemmelse af vandets haardhed

- passende apparatur til temperaturkontrol

- pH-meter.

1.6.3. Testfisk

Fiskene skal vaere i god helbredstilstand og uden synlige misdannelser.

Arterne udvaelges paa grundlag af praktiske kriterier saasom, om de er til raadighed hele aaret, hvor lette de er at holde, om de er egnede til testning, og hvor foelsomme de er, samt andre oekonomiske, biologiske og oekologiske faktorer af betydning. Hensynet til dataenes sammenlignelighed og den allerede gennemfoerte internationale harmonisering (reference 1) boer ligeledes tages i betragtning ved valg af fiskearterne.

Tillaeg 2 indeholder en liste over de fiskearter, der anbefales til gennemfoerelse af denne test; zebrafisk og regnbueoerred foretraekkes.

1.6.3.1. Opbevaring

Testfisk skal fortrinsvis komme fra en enkelt bestand og vaere af samme laengde og alder. Fiskene skal holdes i mindst 12 dage under foelgende betingelser

Belastning

Passende for systemet (recirkulation eller gennemstroemning) og fiskearten.

Vand

Se 1.6.1.2.

Lys

12 til 16 timers lys dagligt.

Koncentration af oploest oxygen

Mindst 80 % maetning.

Fodring

Dagligt eller tre gange ugentligt, sidste gang 24 timer foer testen paabegyndes.

1.6.3.2. Doedelighed

Efter en 48 timers tilpasningsperiode registreres doedeligheden, og foelgende kriterier anvendes

- stoerre end 10 % af populationen paa 7 dage

hele partiet kasseres.

- mellem 5 og 10 % af populationen

observationsperioden forlaenges med yderligere syv dage. Hvis der ikke sker flere doedsfald, accepteres partiet; i modsat fald maa det kasseres.

- mindre end 5 % af populationen

partiet accepteres.

1.6.4. Tilvaenning

Alle fisk skal udsaettes for vand af den kvalitet og med den temperatur, som vil blive anvendt i testen, i mindst syv dage, foer de tages i anvendelse.

1.6.5. Testens udfoerelse

Forud for den endelige test kan der udfoeres en indledende test med det formaal at skaffe oplysninger om, hvilke koncentrationer der skal anvendes i den endelige test.

Udover testserien medtages en kontrolgruppe uden teststof og i givet fald en kontrolgruppe med hjaelpestof.

Der vaelges en statisk test, en semi-statisk test eller en gennemstroemningstest alt efter teststoffets fysiske og kemiske egenskaber, idet den bedst egnede til opfyldelse af kvalitetskriterierne vaelges.

Fiskene udsaettes for stoffet, som beskrevet nedenfor

- varighed: 96 timer

- antal dyr: mindst 7 pr. koncentration

- kar: af passende stoerrelse i forhold til den anbefalede belastning

- belastning: for statiske og semi-statiske test anbefales 1,0 g/l som den maksimale belastning; for gennemstroemningstest kan stoerre belastning accepteres

- testkoncentration: mindst 5 koncentrationer med et konstant indbyrdes forhold paa ikke over 2,2, som saa vidt muligt daekker hele doedelighedsintervallet fra 0 til 100 %

- vand: se 1.6.1.2

- lys: 12 til 16 timers lys dagligt

- temperatur: passende for arten (tillaeg 2) men inden for ± 1 C i den enkelte test

- koncentration af oploest oxygen: ikke mindre end 60 % af maetning ved den valgte temperatur

- fodring: ingen.

Fiskene inspiceres efter de foerste 2 til 4 timer og derefter med hoejst 24 timers mellemrum. Fisk betragtes som doede, hvis beroering af haleroden ikke giver nogen reaktion og der ikke er synlige respirationsbevaegelser. Doede fisk fjernes, naar de observeres, og doedeligheden registreres.

Synlige abnormaliteter (f.eks. tab af ligevaegt, aendringer i svoemmeadfaerd, respirationsbevaegelser og pigmentering) registreres.oest oxygen og temperatur maales dagligt.

Graensetest

En graensetest med 100 mg/l til konstatering af, om LC50 er stoerre end denne koncentration kan anvendes, hvis den fremgangsmaade, som er anfoert i denne testmetode, benyttes.

Hvis stoffet er af en saadan art, at der ikke kan opnaas en koncentration paa 100 mg/l i testvandet, udfoeres graensetesten ved stoffets maetningskoncentration (eller den hoejeste koncentration, ved hvilken der dannes en stabil dispersion) i det anvendte medium (se ogsaa 1.6.1.1).

Graensetesten udfoeres med 7-10 fisk og en eller to kontrolgrupper af samme stoerrelse. (Ifoelge binomialteorien er der ved anvendelse af 10 fisk 99,9 % sikkerhed for, at LC50 er stoerre end den anvendte koncentration, hvis doedeligheden er nul. Med 7, 8 eller 9 fisk giver en doedelighed paa nul 99 % sikkerhed for, at LC50 er stoerre end den anvendte koncentration).

Hvis der sker doedsfald, maa der gennemfoeres en komplet undersoegelse. Eventuelle subletale virkninger registreres.

2. DATA OG EVALUERING

For hvert af de tidspunkter, hvor der er foretaget observationer (efter 24, 48, 72 og 96 timer), afsaettes den procentvise doedelighed mod koncentrationen paa logaritmisk sandsynlighedspapir.

For hvert observationstidspunkt skoennes om muligt LC50 og konfidensgraenserne (p = 0,05) ved hjaelp af standardprocedurer; disse vaerdier afrundes til ét, eller hoejst to betydende cifre (eksempler paa afrunding til 2 cifre: 173,5 til 170; 0,127 til 0,13; 1,21 til 1,2).

I de tilfaelde, hvor haeldningen af koncentration/responsprocentkurven er for stejl til, at LC50 kan beregnes, er et skoen ud fra kurven tilstraekkeligt.

Hvis to paa hinanden foelgende koncentrationer med et indbyrdes forhold paa 2,2 giver en doedelighed paa 0 og 100 %, er disse to vaerdier tilstraekkelige til angivelse af, i hvilket interval LC50 ligger.

Hvis det bemaerkes, at teststoffet ikke kan holdes stabilt eller homogent, skal dette anfoeres, og resultaterne maa fortolkes med forsigtighed.

3. RAPPORTERING

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- oplysninger om testfisk (videnskabeligt navn, stamme, leverandoer, eventuel forbehandling, stoerrelse samt, hvor mange der er anvendt ved hver testkoncentration)

- hvor det vand, der er anvendt til fortynding, kommer fra og dets vigtigste kemiske egenskaber (pH, haardhed og temperatur)

- for stoffer, der er tungtoploeselige i vand, hvilken metode der er anvendt til fremstilling af stam- og testoploesning

- koncentrationen af eventuelle hjaelpestoffer

- en liste over de anvendte koncentrationer og alle foreliggende oplysninger om testkemikaliets stabilitet i testoploesningen ved disse koncentrationer

- metoder og resultater, hvis der er udfoert kemiske analyser

- resultaterne af en eventuel graensetest

- begrundelse for og detaljer vedroerende den valgte testprocedure (f.eks. statisk, semi-statisk, doseringshastighed, gennemstroemningshastighed, beluftning, antal fisk, osv.)

- beskrivelse af testudstyret

- lysforhold

- koncentrationen af oploest oxygen, pH og temperatur i testoploesningerne hver 24. time

- godtgoerelse af, at kvalitetskriterierne er opfyldt

- en tabel med den kumulative doedelighed for hver koncentration og for kontrolgruppen (samt i givet fald for kontrolgruppen med hjaelpestof) paa alle de anbefalede observationstidspunkter

- afbildning af koncentration/responsprocent-kurven ved testens afslutning

- om muligt LC50-vaerdier paa alle de anbefalede observationstidspunkter (med 95 % konfidensgraenser)

- hvilke statistiske metoder der er anvendt til bestemmelse af LC50

- hvis der er benyttet et referencestof, de fundne resultater

- hoejeste testkoncentration, der ikke foraarsager nogen doedsfald inden for testperioden

- laveste testkoncentration, der foraarsager 100 % doedelighed inden for testperioden.

4. LITTERATURHENVISNINGER

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.

(2) AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio - Static and Flow Through methods - NFT 90-303 June 1985.

(3) AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri - Static and Flow Through methods - NFT 90-305 June 1985.

(4) ISO 7346/1, /2 and /3 - Water Quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan - Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.

(5) Eidgenoessisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien fuer Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden - Part II 1974.

(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (15).

(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.

(8) NEN 6506 - Water - Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia recticulata, 1980.

(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.

(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978.

(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979.

(12) Standard methods for the examination of water and wastewater, 14th edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.

(13) Commission of the European Communities, Inter-Laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979.

(14) Verfahrenvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. OEkotoxikologie, Grundlagen fuer die oekotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., A simplified method for evaluating dose effects experiments, J. Pharm, Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99.

(16) Finney, D.J., Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.

(17) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.

(18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, vol. 4, 3-32.

(19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelinck). American Society for Testing and Materials. ASTM STP 634, 1977, 65-84.

(20) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R. Burke, J. and Andrews, R.W. A computer program for calculating an C50. US EPA.

Tillaeg 1

Kunstigt fremstillet ferskvand

Eksempel paa vand egnet til fortynding

Alle kemikalier skal vaere af analysekvalitet.

Vandet skal vaere destilleret vand af god kvalitet eller deioniseret vand med en ledningsevne paa mindre end 5 ìScm 1.

Vanddestillationsapparatet maa ikke indeholde dele af kobber.

Stamoploesninger

CaCl2 7 2H2O (calciumchlorid dihydrat): 11,76 g oploeses i vand og fortyndes til 1 liter

MgSO4 7 7H2O (magnesiumsulfat heptahydrat): 4,93 g oploeses i vand og fortyndes til 1 liter

NaHCO3 (natriumhydrogencarbonat): 2,59 g oploeses i vand og fortyndes til 1 liter

KCl (kaliumchlorid): 0,23 g oploeses i vand og fortyndes til 1 liter

Kunstigt fremstillet ferskvand til fortynding 25 ml af hver af de fire stamoploesninger blandes, og der fortyndes til 1 liter med vand.Oploesningen beluftes, indtil koncentrationen af oploest oxygen svarer til vaerdien ved maetning.pH skal vaere 7,8 ± 0,2.

Om noedvendigt justeres pHmed NaOH (natriumhydroxid) eller HCl (saltsyre).Det saaledes fremstillede vand til fortynding henstaar i ca. 12 timer og beluftes ikke yderligere.

Summen af Ca- og Mg-ioner i denne oploesning er 2,5 mmol/l. Forholdet mellem Ca- og Mg-ioner er 4:1 og mellem Na- og K-ioner 10:1. Oploesningens totale alkalinitet er 0,8 mmol/l.

Afvigelser ved fremstillingen af fortyndingsvandet maa ikke medfoere aendringer i vandets sammensaetning og egenskaber.

Tillaeg 2

>TABELPOSITION>

Opdraetsbetingelser

De ovenfor naevnte fisk er lette at opdraette og/eller let tilgaengelige hele aaret rundt. De kan opdraettes enten i dambrug eller i laboratoriet under sygdoms- og parasitfrie forhold, saadan at forsoegsdyrene er sunde og af kendt afstamning. Disse fisk er tilgaengelige i store dele af verden.

Tillaeg 3

Eksempel paa kurve over koncentration mod doedelighed

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Eksempel paa bestemmelse af LC50 paa log/sandsynlighedspapir

C.2. AKUT TOKSICITET FOR DAFNIER

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Formaalet med denne test er at bestemme et stofs effektive middelkoncentration (EC50) for immobilisering af dafnier i ferskvand. Det er oenskeligt at have flest mulige oplysninger om teststoffets vandoploeselighed, damptryk, kemiske stabilitet, dissociationskonstanter og bionedbrydelighed, foerend testen paabegyndes.

OEvrige oplysninger (f.eks. strukturformel, renhedsgrad, art og procentdel af betydende urenheder, tilstedevaerelse og maengde af tilsaetningsstoffer, samt n-octanol/vand-fordelingskoefficienten) boer tages i betragtning baade ved planlaegningen af testen og ved fortolkningen af dens resultater.

1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER

Direktivets krav med hensyn til LC50 for dafnier anses for opfyldt, hvis EC50 bestemmes som beskrevet i denne testmetode.

Akut toksicitet udtrykkes i denne test som den effektive middelkoncentration (EC50) for immobilisering. Det er den koncentration udtrykt som initialvaerdi ved hvilken 50 % af dafnierne i en forsoegsgruppe immobiliseres under kontinuerlig eksponering i en vis periode, som skal angives.

Immobilisering

De dyr, der ikke er i stand til at svoemme inden for 15 sekunder efter forsigtig omroering i proeveglasset, anses for at vaere immobile.

Alle koncentrationer af teststoffet er angivet i vaegt pr. volumenenhed (mg/l). De kan ogsaa udtrykkes i vaegtforhold (mg/kg 1).

1.3. REFERENCESTOFFER

Der kan anvendes et referencestof til at godtgoere, at forsoegsdyrenes foelsomhed ikke har aendret sig vaesentligt under forsoegsbetingelserne i laboratoriet.

Resultaterne af en EF-ringtest med 4 forskellige stoffer er sammenfattet i tillaeg 2.

1.4. TESTMETODENS PRINCIP

Der kan udfoeres en graensetest med 100 mg/l til konstatering af, om EC50 er stoerre end denne koncentration.

Dafnierne udsaettes for teststoffet i vand i en raekke koncentrationer i 48 timer. Anvendes der en kortere test, skal dette begrundes i forsoegsrapporten.

Under i oevrigt identiske forsoegsbetingelser og i et passende koncentrationsomraade vil de forskellige koncentrationer af et teststof give forskellige gennemsnitlige grader af paavirkning af dafniernes svoemmedygtighed. Forskellige koncentrationer resulterer i, at forskellige procentdele af dafnierne ikke er i stand til at svoemme ved afslutningen af forsoeget. Koncentrationerne, der foraarsager 0 og 100 % immobilisering, udledes direkte af de ved forsoeget gjorte observationer, hvorimod 48-timers EC50 om muligt bestemmes ved beregning.

I denne metode anvendes der et statisk system, og de anvendte oploesninger udskiftes derfor ikke i testperioden.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Kvalitetskriterierne gaelder for saavel graensetesten som den komplette testmetode.

Immobiliseringen i kontrolgruppen maa ikke overstige 10 % ved testens afslutning.

Kontrolgruppernes dafnier maa ikke vaere fanget i vandets overflade. Koncentrationen af oploest oxygen i testbeholderne skal helst vaere over 3 mg/l 1 gennem hele testen. Den maa dog under ingen omstaendigheder komme under 2 mg/l 1.

Koncentrationen af teststoffet skal ligge over 80 % af startkoncentrationen gennem hele testen.

For stoffer, der let oploeses i testmediet og giver stabile oploesninger, dvs. stoffer, der ikke i vaesentlig grad fordamper, nedbrydes, hydrolyseres eller adsorberes, kan startkoncentrationen antages at vaere lig med den nominelle koncentration. Det skal godtgoeres, at koncentrationen har vaeret opretholdt hoej gennem hele testen, og at kvalitetskriterierne er opfyldt.

For stoffer, som

(i) er tungt oploeselige i testmediet eller

(ii) kan danne stabile emulsioner eller dispersioner eller

(iii) er ustabile i vandig oploesning,skal der som vaerdi for startkoncentrationen anvendes den koncentration, som er maalt i oploesningen (eller hvis dette ikke er teknisk muligt, maalt i vandsoejlen) ved testens begyndelse. Koncentrationen bestemmes efter, at der er opnaaet ligevaegt, men foerend testorganismerne kommes i.

I alle disse tilfaelde skal yderligere maalinger foretages i loebet af testen for at sikre at koncentrationen har vaeret opretholdt eller kvalitetskriterierne har vaeret opfyldt.

pH maa ikke variere med mere end 1 enhed.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN

1.6.1. Reagenser

1.6.1.1. Teststofoploesninger

Der fremstilles stamoploesninger af den paakraevede styrke ved oploesning af stoffet i deioniseret vand eller vand som beskrevet i 1.6.1.2.

De valgte testkoncentrationer fremstilles ved fortynding af stamoploesningen. Hvis der testes hoeje koncentrationer, kan stoffet oploeses direkte i det vand, der ellers anvendes til fortynding.

Stoffer testes normalt kun op til oploeselighedsgraensen. For visse stoffer (f.eks. stoffer, som er tungt oploeselige i vand, som har en hoej Pow-vaerdi, eller som danner en stabil dispersion og ikke en aegte oploesning) kan det accepteres, at der anvendes en testkoncentration, der er stoerre end oploeseligheden, saa det sikres, at den hoejeste oploeste/stabile koncentration er naaet. Det er dog vigtigt, at denne koncentration ikke paa anden maade forstyrrer testsystemet (f.eks. dannelse af en hinde af stoffet paa vandoverfladen, saa vandet ikke iltes, osv.).

Der kan tages ultralyd, organiske oploesningsmidler, emulgatorer eller dispergeringsmidler til hjaelp til fremstilling af stamoploesninger af stoffer, der er tungt oploeselige i vand, og til dispergering af saadanne stoffer i testmediet. Hvis der anvendes hjaelpestoffer, skal alle testkoncentrationer indeholde samme maengde hjaelpestof, og der anvendes en ekstra kontrolgruppe, der udsaettes for samme koncentration af hjaelpestoffet, som der er anvendt i testserien. Saadanne hjaelpestoffer anvendes i den lavest mulige koncentration, der i hvert tilfaelde ikke maa vaere stoerre end 100 mg/l i testmediet.

Testen gennemfoeres uden justering af pH. Hvis der konstateres en vaesentlig pH-aendring, anbefales det at gentage testen med justeret pH, og disse resultater rapporteres. I saa fald justeres stamoploesningens pH til samme vaerdi som i det vand, der anvendes til fortynding, medmindre der er saerlige grunde til at undlade dette. Til justering af pH foretraekkes HCl og NaOH. Justering af pH skal foregaa paa en saadan maade, at koncentrationen af teststof i stamoploesningen ikke aendres vaesentligt. Hvis teststoffet reagerer kemisk eller udfaeldes ved justeringen, rapporteres dette.

1.6.1.2. Testvand

Til denne test anvendes der kunstigt fremstillet ferskvand (se tillaeg 1 og reference (2): ISO 6341). For at overfloediggoere akklimatisering inden testen anbefales det, at det vand, der benyttes til opbevaring, er af samme kvalitet (med hensyn til pH og haardhed) som det vand, der anvendes til testen.

1.6.2. Apparatur

Der anvendes saedvanligt laboratorieapparatur og -udstyr. Udstyr, der kommer i beroering med testoploesningerne, skal helst bestaa udelukkende af glas

- oxygenmaaleudstyr (med mikroelektrode eller andet udstyr, der er egnet til maaling af oploest oxygen i smaa proever)

- passende apparatur til temperaturkontrol

- pH-meter

- udstyr til bestemmelse af vandets haardhed.

1.6.3. Testorganisme

Den foretrukne art er Daphnia magna, men Daphnia pulex kan ogsaa anvendes. Forsoegsdyrene skal vaere mindre end 24 timer gamle ved forsoegets begyndelse, opdraettet i laboratoriet og fri for aabenbare sygdomme, og deres forhistorie (f.eks. opdraetning og eventuel forbehandling) skal vaere kendt.

1.6.4. Testens udfoerelse

Forud for den endelige test kan der udfoeres en indledende test med det formaal at skaffe oplysninger om, hvilke koncentrationer der skal anvendes i den endelige test.

Udover testserien medtages en kontrolgruppe uden teststof og i givet fald en kontrolgruppe med hjaelpestof.

Dafnierne udsaettes for stoffet som beskrevet nedenfor

- varighed: helst 48 timer

- antal dyr: mindst 20 ved hver testkoncentration, helst opdelt i fire grupper med hver 5 dyr eller 2 grupper med hver 10 dyr

- belastning: mindst 2 ml testoploesning pr. dyr

- testkoncentration: testoploesningen fremstilles umiddelbart foer dafnierne kommes i, helst uden anvendelse af andre oploesningsmidler end vand. Koncentrationerne udgoer en kvotientraekke med en kvotient paa hoejst 2,2. Parallelt kontroller anvendes et passende antal koncentrationer, saaledes at der opnaas 0 og 100 % immobilisering efter 48 timer og forskellige grader af immobilisering, saaledes at en 48 timers EC50 kan beregnes

- vand: se 1.6.1.2

- lys: anvendelse af en cyklus med skiftende lys og moerke er valgfri

- temperatur: testtemperaturen skal ligge mellem 18 og 22 C, men inden for ± 1 C i den enkelte test

- beluftning: testoploesningerne maa ikke beluftes ved luftgennembobling

- fodring: ingen.

Ved forsoegets afslutning maales pH og oxygenkoncentrationen i kontrolgrupperne og ved alle testkoncentrationerne; testoploesningernes pH maa ikke aendres.

Flygtige forbindelser testes i lukkede beholdere, der er helt fyldt op, og som er tilstraekkeligt store til, at der ikke opstaar oxygenmangel.

Dafnierne inspiceres efter hoejst 24 timers eksponering og igen efter 48 timer.

Graensetest

En graensetest med 100 mg/l til konstatering af, om EC50 er stoerre end denne koncentration kan anvendes, hvis den fremgangsmaade, som er anfoert i denne testmetode, benyttes.

Hvis stoffet er af en saadan art, at der ikke kan opnaas en koncentration paa 100 mg/l i testvandet, udfoeres graensetesten ved stoffets maetningskoncentration (eller den hoejeste koncentration, ved hvilken der dannes en stabil dispersion) i det anvendte medium (se ogsaa 1.6.1.1).

Graensetesten udfoeres med 20 dafnier, opdelt i to eller fire grupper, samt kontrolgrupper af samme stoerrelse. Hvis der sker immobilisering, maa der gennemfoeres en komplet undersoegelse.

2. DATA OG EVALUERING

For hver af de perioder, hvor der er foretaget observationer (24 og 48 timer), afsaettes den procentvise doedelighed mod koncentrationen paa logaritmisk sandsynlighedspapir.

For hvert observationstidspunkt skoennes om muligt EC50 og konfidensgraenserne (p = 0,05) ved hjaelp af standardprocedurer; disse vaerdier afrundes til ét, eller hoejst to betydende cifre (eksempler paa afrunding til 2 cifre: 173,5 til 170; 0,127 til 0,13; 1,21 til 1,2).

I de tilfaelde, hvor haeldningen af koncentration/responsprocentkurven er for stejl til, at EC50 kan beregnes, er et skoen ud fra kurven tilstraekkeligt.

Hvis to paa hinanden foelgende koncentrationer med et indbyrdes forhold paa 2,2 giver en immobilisering paa 0 og 100 %, er disse to vaerdier tilstraekkelige til angivelse af, i hvilket interval EC50 ligger.

Hvis det bemaerkes, at teststoffet ikke kan holdes stabilt eller homogent, skal dette anfoeres, og resultaterne maa fortolkes med forsigtighed.

3. RAPPORTERING

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- oplysninger om testorganismen (videnskabeligt navn, stamme, leverandoer eller kilde, eventuel forbehandling, opdraetningsmetode - herunder kilde, fodertype og -maengde samt fodringshyppighed)

- hvor det vand, der er anvendt til fortynding, kommer fra og dets vigtigste kemiske egenskaber (pH, haardhed og temperatur)

- for stoffer, der er tungtoploeselige i vand, hvilken metode der er anvendt til fremstilling af stam- og testoploesning

- koncentrationen af eventuelle hjaelpestoffer

- en liste over de anvendte koncentrationer og alle foreliggende oplysninger om testkemikaliets stabilitet i testoploesningen ved disse koncentrationer

- metoder og resultater, hvis der er udfoert kemiske analyser

- resultaterne af en eventuel graensetest

- beskrivelse af testudstyret

- lysforhold

- koncentrationen af oploest oxygen, pH og temperatur i testoploesningerne

- godtgoerelse af, at kvalitetskriterierne er opfyldt

- en tabel med den kumulative immobilisering for hver koncentration og for kontrolgruppen (samt i givet fald for kontrolgruppen med hjaelpestof) paa alle de anbefalede observationstidspunkter (24 og 48 timer)

- afbildning af koncentration/responsprocent-kurven ved testens afslutning

- om muligt EC50-vaerdier paa alle de anbefalede observationstidspunkter (med 95 % konfidensgraenser)

- hvilke statistiske metoder der er anvendt til bestemmelse af EC50

- hvis der er benyttet et referencestof, de fundne resultater

- hoejeste testkoncentration, der ikke foraarsager nogen immobilisering inden for testperioden

- laveste testkoncentration, der foraarsager 100 % immobilisering inden for testperioden.

4. LITTERATURHENVISNINGER

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 202, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.

(2) International Standard ISO, Water Quality - Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341-1989.

(3) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera - crustacea) NFT 90 301 (January 1983).

(4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudolph, P. und Boje, R. OEkotoxikologie, Grundlagen fuer die oekotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (L11).

(6) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.

(7) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. and Exper. Ther., 1949, vol. 96, 99-113.

(8) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.

(9) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, vol. 4, 3-32.

(10) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer AND J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials. ASTM STP 634, 1977, 65-84.

(11) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R.W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.

Tillaeg 1

Kunstigt fremstillet ferskvand

Eksempel paa vand egnet til fortynding (ifoelge ISO 6341)

Alle kemikalier skal vaere af analysekvalitet.

Vandet skal vaere destilleret vand af god kvalitet eller deioniseret vand med en ledningsevne paa mindre end 5 ìScm 1.

Vanddestillationsapparater maa ikke indeholde dele af kobber.

Stamoploesninger

CaCl2 7H2O (calciumchlorid dihydrat): 11,76 g oploeses i vand og fortyndes til 1 liter

MgSO4 77 H2O (magnesiumsulfat heptahydrat): 4,93 g oploeses i vand og fortyndes til 1 liter

NaHCO3 (natriumhydrogencarbonat): 2,59 g oploeses i vand og fortyndes til 1 liter

KCl (kaliumchlorid): 0,23 g oploeses i vand og fortyndes til 1 liter

Kunstigt fremstillet ferskvand til fortynding 25 ml af hver af de fire stamoploesninger blandes, og der fortyndes til 1 liter med vand.

Oploesningen beluftes, indtil koncentrationen af oploest oxygen svarer til vaerdien ved maetning.

pH skal vaere 7,8 ± 0,2.

Om noedvendigt justeres pH med NaOH (natriumhydroxid) eller HCl (saltsyre).

Det saaledes fremstillede vand til fortynding henstaar i ca. 12 timer og beluftes ikke yderligere.

Summen af Ca- og Mg-ioner i denne oploesning er 2,5 mmol/l. Forholdet mellem Ca- og Mg-ioner er 4:1 og mellem Na- og K-ioner 10:1. Oploesningens totale basestyrke er 0,8 mmol/l.

Afvigelser ved fremstillingen af fortyndingsvandet maa ikke medfoere aendringer i andets sammensaetning og egenskaber.

Tillaeg 2

Sammenfatning af resultaterne af en EF-ringtest gennemfoert i 1978 (ogsaa citeret i reference 2)

Anmaerkning: denne ringtest havde til formaal at bestemme 24 timers EC50.

Anvendte stoffer

1) kaliumdichromat

2) tetrapropylbenzensulfonsyre

3) natriumtetrapropylbenzensulfonat

4) kaliumtrichlor-2,4,5-phenoxyacetat

>TABELPOSITION>

Tillaeg 3

Eksempel paa kurve over koncentration mod immobiliseringsprocent

>START GRAFIK>

>SLUT GRAFIK>

Eksempel paa bestemmelse af EC50 paa log/sandsynlighedspapir

Immobilisering i %

C.3. VAEKSTHAEMNINGSTEST FOR ALGER

1. METODE

1.1. INDLEDNING

Formaalet med denne test er at bestemme et stofs virkning paa vaeksten af en encellet groenalgeart. Med relativt korte tests (72 timer) kan virkningerne vurderes over flere generationer. Da metoden kan tilpasses til brug med adskillige encellede algearter, maa forsoegsrapporten indeholde en beskrivelse af den metode, der er anvendt.

Metoden er lettest at anvende for vandoploeselige stoffer, som under forsoesbetingelserne kan forventes at forblive i vandet.

Metoden kan benyttes til stoffer, der ikke direkte interfererer med maaling af algevaekst.

Det er oenskeligt at have flest mulige oplysninger om teststoffets vandoploeselighed, damptryk, kemiske stabilitet, dissociationskonstanter og bionedbrydelighed, foerend testen paabegyndes.

OEvrige oplysninger (f.eks. strukturformel, renhedsgrad, art og procentdel af betydende urenheder, tilstedevaerelse og maengde af tilsaetningsstoffer, samt n-octanol/vand-fordelingskoefficienten) boer tages i betragtning baade ved planlaegningen af testen og ved fortolkningen af dens resultater.

1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER

Celletaethed: antal celler pr. milliliter.

Vaekst: foroegelsen i celletaetheden i testperioden.

Vaeksthastighed: foroegelsen i celletaetheden pr. tidsenhed.

EC50: i denne metode den koncentration af teststoffet, der medfoerer, at enten vaeksten (EbC50) eller vaeksthastigheden (ErC50) nedsaettes med 50 % i forhold til kontrolkulturen.

NOEC (no observed effect concentration): i denne metode den hoejeste koncentration, hvor der ikke iagttages nogen signifikant vaeksthaemning i forhold til kontrolkulturen.

Alle koncentrationer af teststoffet er angivet i vaegt pr. volumenenhed (mg/l). De kan ogsaa udtrykkes i vaegtforhold (mg/kg).

1.3. REFERENCESTOFFER

Der kan anvendes et referencestof til at godtgoere, at forsoegsorganismernes foelsomhed ikke har aendret sig vaesentligt under forsoegsbetingelserne i laboratoriet.

Hvis der benyttes et referencestof, skal resultaterne anfoeres i forsoegsrapporten. Kaliumdichromat kan anvendes som referencestof, men dets farve kan indvirke dels paa kvaliteten og styrken af det lys, som cellerne har til raadighed, dels paa en eventuel spektrofotometrisk bestemmelse. Der blev benyttet kaliumdichromat i en international ringtest (se ref. (3) og tillaeg 2).

1.4. TESTMETODENS PRINCIP

Der kan udfoeres en graensetest med 100 mg/l til konstatering af, om EC50 er stoerre end denne koncentration.

Kulturer af en udvalgt groenalge i den eksponentielle vaekstfase udsaettes for forskellige koncentrationer af teststoffet gennem flere generationer under veldefinerede forhold.

Testoploesningerne inkuberes i 72 timer, og i denne periode maales celletaetheden mindst hver 24. time. Vaeksthaemningen i forhold til en kontrolkultur bestemmes.

1.5. KVALITETSKRITERIER

Kvalitetskriterierne gaelder for saavel graensetesten som den komplette testmetode.

Celletaetheden i kontrolkulturerne skal vaere vokset med en faktor paa mindst 16 i loebet af 3 dage.

Koncentrationen af teststoffet skal ligge over 80 % af startkoncentrationen i et tidsrum, der svarer til testens varighed.

For stoffer, der let oploeses i testmediet og giver stabile oploesninger, dvs. stoffer, der ikke i vaesentlig grad fordamper, nedbrydes, hydrolyseres eller adsorberes, kan startkoncentrationen antages at vaere lig med den nominelle koncentration. Det skal godtgoeres, at koncentrationen har vaeret opretholdt gennem hele testen, og at kvalitetskriterierne er opfyldt.

For stoffer, som

(i) er tungt oploeselige i testmediet eller

(ii) kan danne stabile emulsioner eller dispersioner eller

(iii) er ustabile i vandig oploesning, skal der som vaerdi for startkoncentrationen anvendes den koncentration, som er maalt ved testens begyndelse. Koncentrationen bestemmes efter, at der opnaaet ligevaegt.

I alle disse tilfaelde skal yderligere maalinger foretages i loebet af testen for at sikre at koncentrationen har vaeret opretholdt eller kvalitetskriterierne har vaeret opfyldt.

Det er velkendt, at en vaesentlig maengde teststof vil vaere indeholdt i algebiomassen ved testens afslutning. Derfor burde baade den del af teststoffet, der er indeholdt i biomassen, og den del, der er i oploesning (eller hvis det ikke er teknisk muligt, maalt i vandsoejlen), tages i betragtning ved godtgoerelse af, at ovennaevnte kvalitetskriterier er opfyldt. Da det kan volde betydelige tekniske problemer at bestemme teststofkoncentrationen i algebiomassen, kan opfyldelse af kvalitetskriterierne godtgoeres ved, at der anvendes en testbeholder med den hoejeste stofkoncentration men uden alger, hvori koncentrationen i oploesningen (eller hvis det ikke er teknisk muligt, i vandsoejlen) maales ved testperiodens begyndelse og slutning.

1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN

1.6.1. Reagenser

1.6.1.1. Teststofoploesninger

Der fremstilles stamoploesninger af den paakraevede styrke ved oploesning af stoffet i deioniseret vand eller vand som beskrevet i 1.6.1.2.

De valgte testkoncentrationer fremstilles ved tilsaetning af passende teststofmaengder til algeforkulturer (se tillaeg 1). Stoffer testes normalt kun op til oploeselighedsgraensen. For visse stoffer (f.eks. stoffer, som er tungt oploeselige i vand, som har en hoej Pow-vaerdi, eller som danner en stabil dispersion og ikke en aegte oploesning) kan det accepteres, at der anvendes en testkoncentration, der er stoerre end oploeseligheden, saa det sikres, at den hoejeste oploeste/stabile koncentration er naaet. Det er dog vigtigt, at denne koncentration ikke paa anden maade forstyrrer testsystemet (f.eks. dannelse af en hinde af stoffet paa vandoverfladen, saa vandet ikke iltes, osv.).

Der kan tages ultralyd, organiske oploesningsmidler, emulgatorer eller dispergeringsmidler til hjaelp til fremstilling af stamoploesninger af stoffer, der er tungt oploeselige i vand, og til dispergering af saadanne stoffer i testmediet. Hvis der anvendes hjaelpestoffer, skal alle testkoncentrationer indeholde samme maengde hjaelpestof, og der anvendes en ekstra kontrolkultur, der udsaettes for samme koncentration af hjaelpestoffet, som der er anvendt i testserien. Saadanne hjaelpestoffer anvendes i den lavest mulige koncentration, der i hvert tilfaelde ikke maa vaere stoerre end 100 mg/l i testmediet.

Testen gennemfoeres uden justering af pH. Hvis der konstateres en vaesentlig pH-aendring, anbefales det at gentage testen med justeret pH, og disse resultater rapporteres. I saa fald justeres stamoploesningens pH til samme vaerdi som i det vand, der anvendes til fortynding, medmindre der er saerlige grunde til at undlade dette. Til justering af pH foretraekkes HCl og NaOH. Justering af pH skal foregaa paa en saadan maade, at koncentrationen af teststof i stamoploesningen ikke aendres vaesentligt. Hvis teststoffet reagerer kemisk eller udfaeldes ved justeringen, rapporteres dette.

1.6.1.2. Testmedium

Vandet skal vaere destilleret vand af god kvalitet eller deioniseret vand med en ledningsevne paa mindre end 5 ìScm 1. Vanddestillationsapparater maa ikke indeholde dele af kobber.

Foelgende medium anbefales.

Der fremstilles fire stamoploesninger ifoelge nedenstaaende tabel. Stamoploesningerne steriliseres ved autoklavering eller membranfiltrering, hvorefter de opbevares ved 4 C beskyttet mod lys. Stamoploesning nr. 4 maa kun steriliseres ved membranfiltrering. Testoploesningernes endelige naeringsstofkoncentration opnaas ved fortynding af stamoploesningerne.

>TABELPOSITION>

Naar mediet er kommet i ligevaegt med luft, er dets pH ca. 8.

1.6.2. Apparatur

- Saedvanligt laboratorieudstyr.

- Testkolber af passende volumen (f.eks. er 250 ml konisk kolbe passende til et testoploesningsvolumen paa 100 ml). Alle testkolber skal vaere identiske, baade med hensyn til materiale og dimensioner.

- Dyrkningsapparatur: kammer, hvori en temperatur mellem 21 og 25 C kan holdes inden for ± 2 C, og som har kontinuerlig ensartet belysning i omraadet 400-700 nm. Vaekstbetingelserne, herunder lysstyrken, anses for at have vaeret tilfredsstillende, hvis kontrolkulturerne naar op paa den anbefalede vaeksthastighed.

Det anbefales at anvende en lysintensitet, som er paa 60-120 ìE 7m 2 7s 1 (35-70 71018 fotoner m 2 7s 1), naar den maales i omraadet 400-700 nm med en egnet modtager. For lysmaaleudstyr, der er kalibreret i lux, er det tilsvarende passende niveau paa 6 000-10 000 lux.

Denne lysintensitet kan opnaas ved hjaelp af 4-7 lysstofroer à 30 W af hvid standardtype (farvetemperatur ca. 4 000 K) anbragt i en afstand af 35 cm fra algekulturen.

- Maalinger af celletaetheden foretages ved direkte taelling af levende celler, f.eks. ved hjaelp af et mikroskop med taellekammer. Andre metoder (fotometri, turbidimetri m.fl.) kan dog benyttes, hvis de er tilstraekkelig foelsomme og det paavises, at de korrelerer tilstraekkelig godt med celletaetheden.

1.6.3. Testorganismer

Det foreslaas, at der anvendes en hurtigtvoksende groenalgeart, der er egnet til dyrkning og test. Foelgende arter foretraekkes

- Selenastrum capricornutum, f.eks. ATCC 22662 eller CCAP 278/4

- Scenedesmus subspicatus, f.eks. 86.81 SAG.

Bemaerk

ATCC = American Type Culture Collection (USA)

CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (UK)

SAG = Collection of algal culture (Goettingen, Tyskland)

Ved anvendelse af andre arter skal den benyttede stamme anfoeres i rapporten.

1.6.4. Testens udfoerelse

Ved hjaelp af indledende tests bestemmes det koncentrationsomraade, hvor der kan forventes at indtraede virkninger.

De to maal for vaeksten (biomasse og vaeksthastighed) kan foere til vidt forskellige resultater for vaeksthaemning; de skal begge anvendes i de indledende tests, saa det sikres, at baade EbC50 og ErC50 kan skoennes ud fra den kvotientraekke, der vaelges for koncentrationerne.

Celletaetheden ved forsoegets begyndelse

Den anbefalede celletaethed i proevekulturerne ved forsoegets begyndelse er ca. 104 celler/ml for Selenastrum capricornutum og Scenedesmus subspicatus. Ved anvendelse af andre arter skal biomassen vaere af samme stoerrelsesorden.

Koncentrationer af teststoffet

Til forsoeget anvendes der mindst 5 koncentrationer, der danner en kvotientraekke med en kvotient paa hoejst 2,2. Den laveste koncentration maa ikke have nogen synlig virkning paa algernes vaekst. Den hoejeste koncentration skal haemme vaeksten med mindst 50 % i forhold til kontrolkulturen og helst standse vaeksten helt.

Gentagelser og kontrolkulturer

Forsoegsplanen skal omfatte tredobbelt bestemmelse ved hver koncentration. Der medtages desuden 3 kontrolkulturer uden teststof og i givet fald 3 kontrolkulturer med hjaelpestof. Hvis det er begrundet, kan forsoegsplanen aendres ved, at antallet af koncentrationer oeges og antallet af bestemmelser pr. koncentration nedsaettes.

Udfoerelse af testen

Der fremstilles testkulturer med den oenskede teststofkoncentration og den oenskede maengde algeinoculum ved tilsaetning af stamoploesning af teststoffet til en passende maengde algeforkultur (se tillaeg 1).

Testkolberne rystes og anbringes i dyrkningsapparaturet. Algecellerne holdes i suspension ved rystning, omroering eller gennembobling med luft, saaledes at der bliver bedre luftudveksling og mindre pH-variationer i testoploesningerne. Kulturerne holdes ved en temperatur mellem 21 og 25 C, der holdes konstant inden for ± 2 C.

Celletaetheden i hver kolbe bestemmes mindst 3 gange, nemlig 24, 48 og 72 timer efter forsoegets begyndelse. Naar celletaetheden maales paa anden maade end ved direkte taelling, anvendes der filtreret algemedium med den paagaeldende teststofkoncentration til bestemmelse af baggrundsvaerdien.

pH maales ved forsoegets begyndelse og efter 72 timer.

Kontrolkulturernes pH maa normalt ikke afvige med mere end 1,5 i loebet af forsoeget.

Test af flygtige stoffer

Der findes i dag ingen generelt accepteret metode til test af flygtige stoffer. Hvis et stof vides at have tendens til at fordampe, kan der benyttes lukkede testkolber med ekstra luftrum over vaesken. Muligheden for CO2-mangel skal tages i betragtning, naar dette ekstra luftrum beregnes. Der er foreslaaet varianter af denne metode (se reference 4).

Den maengde stof, der forbliver i oploesning, skal forsoeges bestemt, og det tilraades, at der udvises den stoerste forsigtighed ved fortolkning af resultater af tests, der er udfoert med flygtige kemikalier i lukkede kolber.

Graensetest

Der kan under anvendelse af den i denne test anfoerte fremgangsmaade udfoeres en graensetest med 100 mg/l til konstatering af, om EC50 er stoerre end denne koncentration.

Hvis stoffet er af en saadan art, at der ikke kan opnaas en koncentration paa 100 mg/l i testvandet, udfoeres graensetesten ved stoffets maetningskoncentration (eller den hoejeste koncentration, ved hvilken der dannes en stabil dispersion) i det anvendte medium (se ogsaa 1.6.1.1).

Graensetesten udfoeres mindst som en tredobbeltbestemmelse og med kontrolkulturer af samme stoerrelse. Begge maal for vaeksten (biomasse og vaeksthastighed) benyttes i graensetesten.

Hvis biomassen eller vaeksthastigheden er mindst 25 % lavere i graensetesten end i kontrolkulturen, maa der gennemfoeres en komplet undersoegelse.

2. DATA OG EVALUERING

De celletaetheder, der er maalt i test- og kontrolkulturerne, opstilles i en tabel sammen med teststoffets koncentrationer og maaletidspunkterne. Der optegnes vaekstkurver for hver teststofkoncentration og for kontrolkulturerne ved afsaetning af den gennemsnitlige celletaethed mod tiden (0-72 timer).

De to nedenstaaende metoder kan benyttes til bestemmelse af sammenhaengen mellem koncentration og virkning. Nogle stoffer kan virke vaekstfremmende ved lave koncentrationer. Kun datapunkter, hvor haemningen er mellem 0 og 100 %, tages i betragtning.

2.1. SAMMENLIGNING AF AREALER UNDER VAEKSTKURVERNE

Arealet mellem vaekstkurverne og den vandrette linje N = N0 kan beregnes ved foelgende formel

A =N1N02 × t1 + N1 + N22N02 × (t2t1) + .+Nn 1 + Nn 2N02× (tn tn 1)

hvor

A = arealet

N0 = antallet af celler pr. ml paa tidspunktet t0 (testens begyndelse)

N1 = antallet af celler pr. ml paa tidspunktet t1

Nn = antallet af celler pr. ml paa tidspunktet tn

t1 = tidspunktet for foerste maaling efter testens begyndelse

tn = tidspunktet for n'te maaling efter testens begyndelse

n = det antal maalinger, der er foretaget efter testens begyndelse.

Den procentvise haemning af cellevaeksten beregnes ved hver teststofkoncentration (IA) efter foelgende formel

IA = Ac AtAc × 100

hvor

Ac = arealet mellem den vandrette linje N = N0 og vaekstkurven for kontrolkulturen

At = arealet mellem den vandrette linje N = N0 og vaekstkurven ved koncentrationen t.

IA-vaerdierne afsaettes paa semilogaritmisk papir eller semilogaritmisk sandsynlighedspapir mod de tilsvarende koncentrationer. Benyttes der sandsynlighedspapir, indtegnes den bedste rette linje, enten paa oejemaal eller ved regressionsberegning.

Ud fra regressionslinjen skoennes EC50 ved aflaesning af den koncentration, der svarer til 50 % inhibering (IA = 50 %). Som utvetydig betegnelse for den vaerdi, der er fundet ved denne beregningsmetode, foreslaas det at benytte EbC50. Det er vigtigt, at den paagaeldende eksponeringstid anfoeres sammen med EbC50, f.eks. EbC50(0-72 h).

2.2. SAMMENLIGNING AF VAEKSTRATER (SPECIFIKKE VAEKSTHASTIGHEDER)

Den gennemsnitlige specifikke vaeksthastighed (Iìt, den gennemsnitlige vaekstrate) for kulturer i den eksponentielle vaekstfase kan beregnes ved

m = ln Nn ln N0tn t0

hvor t0 er tidspunktet for forsoegets begyndelse.

Alternativt kan den gennemsnitlige specifikke vaeksthastighed afledes af haeldningen af regressionslinjen i en afbildning af ln N mod tiden.

Den procentvise haemning af den gennemsnittige specifikke vaeksthastighed beregnes for hver teststofkoncentration (Iìt) ved hjaelp af foelgende formel

Imt = mc mtmc × 100

hvor

ìc = kontrolkulturens gennemsnitlige specifikke vaeksthastighed (= gennemsnitlige vaekstrate)

ìt = den gennemsnitlige specifikke vaeksthastighed ved testkoncentrationen t.

Den procentvise nedsaettelse i den gennemsnitlige specifikke vaeksthastighed ved hver teststofkoncentration i forhold til kontrolvaerdien afbildes mod logaritmen til koncentrationen. EC50 kan aflaeses af den fremkomne kurve. Som utvetydig betegnelse for den EC50-vaerdi, der er fundet ved denne beregningsmetode, foreslaas det at benytte ErC50. Maaletidspunkterne skal anfoeres, dvs. at betegnelsen bliver f.eks. ErC50(0-72 h), hvis vaerdierne vedroerer tidspunkterne 0 og 72 timer.

Bemaerk: Specifik vaeksthastighed er et logaritmisk udtryk, og smaa aendringer i vaekstraten (= den specifikke vaeksthastighed) kan medfoere store aendringer i biomassen. Man kan derfor ikke sammenligne talvaerdierne for EbC og ErC direkte.

2.3. BEREGNING AF NOEC-VAERDIEN

Den koncentration, hvor der ikke kan iagttages nogen virkning, (NOEC-vaerdien) bestemmes ved hjaelp af en egnet statistisk metode til sammenligning af flere proever (f.eks. variansanalyse eller Dunnett's test), som anvendes paa de enkelte vaerdier af arealerne under vaekstkurverne A (se 2.1) eller af de specifikke vaeksthastigheder ì (se 2.2).

3. RAPPORTERING

Forsoegsrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- teststof: kemisk betegnelse

- testorganismer: oprindelse, laboratoriekultur, stammenummer og dyrkningsmetode

- testbetingelser

- testens begyndelses- og sluttidspunkt og dens varighed

- temperatur

- mediets sammensaetning

- dyrkningsapparatur

- oploesningernes pH ved testens begyndelse og afslutning (der redegoeres for eventuelt iagttagne afvigelser paa mere end 1,5)

- hvilket vehikel og hvilken metode der er anvendt til oploesning af teststoffet, samt vehiklens koncentration i testoploesningerne

- lysintensitet og -kvalitet

- testkoncentrationer (maalte eller nominelle)

- resultater

- celletaethed i hver kolbe ved hvert maalepunkt, samt hvilken metode der er anvendt til maaling af celletaetheden

- gennemsnitlige celletaetheder

- vaekstkurver

- grafisk fremstilling af sammenhaengen mellem koncentration og effekt

- EC-vaerdier og beregningsmetode

- NOEC

- andre iagttagne effekter.

4. LITTERATURHENVISNINGER

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag »Hemmung der Zellvermehrung bei der Gruenalge Scenedesmus subspicatus«, in: Rudolph/Boje: OEkotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.

(3) ISO 8692 - Water Quality - Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.

(4) S.Galassi and M.Vighi - Chemosphere, 1981, vol. 10, 1 123-1 126.

Tillaeg 1

Eksempel paa fremgangsmaade ved dyrkning af alger

Almindelige bemaerkninger

Formaalet med dyrkning efter foelgende fremgangsmaade er at fremskaffe algekulturer til toksicitetstest.

Der traeffes foranstaltninger til at sikre, at algekulturerne ikke inficeres med bakterier (ISO 4833). Det er oenskeligt at have axeniske kulturer, men det er absolut noedvendigt at kulturerne kun bestaar af én algeart.

Alle operationer foretages under sterile forhold, saa kontaminering med bakterier og andre alger undgaas. Kontaminerede kulturer kasseres.

Fremgangsmaade til fremskaffelse af algekulturer

Fremstilling af naeringsoploesninger (substrater)

Substratet kan fremstilles ved fortynding af koncentrerede naeringsstofoploesninger. Til faste substrater tilsaettes 0,8 % agar. Der anvendes kun sterile substrater. Ved autoklavering kan der ske tab af NH3.

Stamkultur

Stamkulturerne er smaa algekulturer, som regelmaessigt overfoeres til frisk substrat, og som benyttes som udgangsmateriale til testen. Hvis disse kulturer ikke anvendes regelmaessigt, spredes de ud paa skraa agarroer. Saadanne kulturer overfoeres til frisk substrat mindst hver anden maaned.

Stamkulturerne dyrkes i koniske kolber med et egnet substrat (volumen ca. 100 ml). Dyrkes algerne ved 20 C med kontinuerlig belysning, er overfoersel én gang ugentligt paakraevet.

Ved overfoerslen overfoeres en maengde af den »gamle« kultur med en steril pipette til en kolbe med frisk substrat, saa der med de hurtigtvoksende arter er en startkoncentration paa ca. 1/100 af koncentrationen i den gamle kultur.

En arts vaeksthastighed kan bestemmes ud fra vaekstkurven. Hvis denne kendes, kan man skoenne, ved hvilken taethed kulturen maa overfoeres til et nyt substrat. Dette skal goeres foer kulturen naar doedsfasen.

Forkultur

Forkulturen har til formaal at give en passende algemaengde til podning af testkulturerne. Forkulturer inkuberes under forsoegsbetingelserne og tages i anvendelse, medens vaeksten stadig er eksponentiel, normalt efter ca. 3 dage. Algekulturer, der indeholder deforme eller abnorme celler, kasseres.

Tillaeg 2

I ISO 8692 - Water Quality - Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum er nedenstaaende resultater af en sammenlignende laboratorietest med kaliumdichromat udfoert paa 16 laboratorier anfoert

>TABELPOSITION>

C.4. BESTEMMELSE AF »LET« BIONEDBRYDELIGHED DEL

I. GENERELLE BETRAGTNINGER

I.1. INDLEDNING

Der er beskrevet 6 metoder til screening af kemikalier for let bionedbrydelighed i aerobt vandigt miljoe

ve eL4,(a) Eliminering af oploest organisk kulstof (DOC) (metode C.4-A)

(b) Modificeret OECD-screeningtest - eliminering af DOC (metode C.4-B)

(c) Kuldioxidudvikling (modificeret Sturm-test) (metode C.4-C)

(d) Manometrisk respirometri (metode C.4-D)

(e) Closed Bottle Test (metode C.4-E)

(f) MITI-test (Ministry of International Trade and Industry - Japan) (metode C.4-F)

Del I indeholder generelle betragtninger og betragtninger, der gaelder for alle seks test. I del II-VII findes de punkter, der er specifikke for de enkelte test. Tillaeggene indeholder definitioner, formler og vejledende oplysninger.

I 1988 gennemfoerte OECD en ringtest, som viste, at metoderne giver indbyrdes overensstemmende resultater. Imidlertid kan en bestemt metode foretraekkes, alt efter det undersoegte stofs fysiske egenskaber.

I.2. VALG AF METODE

For at kunne vaelge den bedst egnede metode er det afgoerende at have kendskab til kemikaliets oploeselighed, damptryk og adsorptionsegenskaber. Den kemiske struktur eller formel boer kendes for at kunne beregne den teoretiske vaerdi og/eller kontrollere maalte vaerdier af parametre som f.eks. ThOD, ThCO2, DOC, TOC og COD (se bilag I og II).

Testkemikalier, der er oploeselige i vand med mindst 100 mg/l og ikke-flygtige og ikke-adsorberende, kan vurderes ved alle metoderne. Af tabel 1 fremgaar, hvilke metoder der er egnede for kemikalier, der er tungtoploeselige i vand, flygtige eller adsorberende. I bilag III er det beskrevet, hvordan man kan baere sig ad med tungt vandoploeselige og flygtige kemikalier. Kemiske stoffer med moderat flygtighed kan testes i DOC-henfaldsmetoden, hvis der er tilstraekkelig luftrum i testbeholderen (som skal tillukkes passende). I dette tilfaelde, skal der benyttes en abiotisk kontrolkolbe, som tillader ethvert fysisk tab.

>TABELPOSITION>

Oplysninger om testmaterialets renhed eller forholdet mellem dets hovedbestanddele er noedvendige for fortolkning af de fundne resultater, isaer hvis de er smaa eller usikre.

Oplysninger om testkemikaliets toksicitet over for bakterier (bilag IV) kan vaere til nytte ved valg af passende testkoncentrationer og kan vaere afgoerende for korrekt fortolkning af lave vaerdier for bionedbrydning.

I.3. REFERENCESTOFFER

Til kontrol af fremgangsmaaden benyttes der referencestoffer, som opfylder kriterierne for let bionedbrydelighed, og som testes i en separat kolbe parallelt med de oevrige proever.

Anilin (frisk destilleret), natriumacetat og natriumbenzoat er egnede kemikalier. Alle disse referencekemikalier nedbrydes ved disse metoder, selv naar der ikke tilsaettes inoculum.

Det har vaeret fremfoert, at man burde finde frem til et referencekemikalie, der er let nedbrydeligt men kraever tilsaetning af inoculum, selv i Closed Bottle-metoden. Kaliumhydrogenphthalat har vaeret foreslaaet, men der mangler endnu konkret bevis med dette stof, foer det kan accepteres som et referencestof.

I metoder, der er baseret paa respirometri, kan nitrogenholdige forbindelser paavirke oxygenoptagelsen paa grund af nitrifikation (se bilag II og V).

I.4. TESTMETODERNES PRINCIP

Teststoffet oploeses eller opslaemmes i et uorganisk medium, inoculeres og inkuberes under aerobe forhold i moerke eller daempet lys. Den del af DOC i oploesningen, der stammer fra inoculum, skal vaere saa lavt som muligt lille i forhold til den del, der stammer fra teststoffet. Der tages hensyn til inoculums endogene aktivitet ved at koere parallelle blindproever med inoculum men uden teststof i oploesningen, selvom cellernes endogene aktivitet under tilstedevaerelse af stoffet ikke praecis svarer til denne i den endogene kontrol. Et referencestof benyttes parallelt for at kontrollere hvorledes procedurerne fungerer.

I regelen foelges nedbrydningen ved bestemmelse af parametre saasom DOC, CO2-dannelse og oxygenoptagelse, og der foretages maalinger med tilstraekkeligt hyppige intervaller saaledes at begyndelsen og afslutningen af bionedbrydningen kan identificeres. Med automatiske respirometre sker maalingen kontinuerligt. Undertiden maales baade DOC og en anden parameter, men det er normalt kun tilfaeldet ved testens begyndelse og slutning. Der kan ogsaa anvendes specifik kemisk analyse til bedoemmelse af den primaere nedbrydning af teststoffet og til bestemmelse af koncentrationen af eventuelle mellemprodukter (obligatorisk i MITI-testen).

Normalt loeber testen over 28 dage. Naar bionedbrydningskurven har naaet et plateau ved mindst 3 maalinger, kan testen dog afbrydes. Hvis kurven viser, at bionedbrydningen er begyndt men ikke har naaet et plateau inden de 28 dage, kan testen forlaenges ud over denne periode.

I.5. KVALITETSKRITERIER

I.5.1. Reproducerbarhed

Som foelge af bionedbrydningens natur og den blandede bakteriepopulation i inoculum, foretages der mindst dobbeltbestemmelse.

Den almindelige erfaring er, at variationen mellem gentagelser bliver mindre, desto stoerre startkoncentrationen af mikroorganismer i testmediet er. Ringtest har desuden vist, at der kan vaere betydelige forskelle mellem de resultater, forskellige laboratorier naar frem til, men der opnaas generelt god overensstemmelse med let bionedbrydelige forbindelser.

I.5.2. Testens gyldighed

En test anses for gyldig, hvis forskellene mellem de to yderste vaerdier for teststoffets forsvinden ved en multibestemmelse i plateau-fasen, ved afslutningen af testen eller ved afslutningen af 10 doegns-vinduet er mindre end 20 %, og hvis den procentvise nedbrydning af referencestoffet har naaet niveauet for let bionedbrydelighed inden for 14 dage. Hvis ikke begge betingelser er opfyldt, gentages testen. Da metoderne er ret strikse, betyder lave vaerdier ikke noedvendigvis, at stoffet ikke er bionedbrydeligt under miljoeforhold, men at der kraeves yderligere arbejde til bestemmelse af bionedbrydeligheden.

Er nedbrydningen i en toksicitetstest med baade teststof og referencekemikalie mindre end 35 % (baseret paa DOC) eller 25 % (baseret paa ThOD eller ThCO2) paa 14 dage, maa testkemikaliet antages at vaere haemmende (se ogsaa bilag IV). Testraekken gentages, om muligt med lavere teststofkoncentration og/eller hoejere inoculumkoncentration, dog hoejst 30 mg toerstof pr. liter.

I.6. GENERELLE PROCEDURER

De generelle betingelser for testene er sammenfattet i tabel 2. Apparatur og forsoegsomstaendigheder, der er specifikke for en bestemt test, er beskrevet senere under den paagaeldende test.

>TABELPOSITION>

I.6.1. Vand

Det deioniserede eller destillerede vand, der benyttes, maa hverken indeholde toksiske stoffer (f.eks. Cu++-ioner) i haemmende maengder eller organisk kulstof svarende til mere end 10 % af testmaterialets organiske kulstof. Denne hoeje renhed er noedvendig for at undgaa hoeje blindvaerdier. Forureninger kan stamme fra naturlige urenheder og fra ionbytterharpikser og lyseret materiale fra bakterier og alger. Til hver testserie anvendes kun én bestemt batch af vand, som i forvejen er kontrolleret ved DOC-analyse. En saadan kontrol er ikke noedvendig for Closed Bottle-testen, men oxygenforbruget fra vandet skal vaere lavt.

I.6.2. Stamoploesninger af uorganiske medium

Der fremstilles stamoploesninger af uorganiske medier med passende koncentrationer af salte til brug ved fremstilling af testoploesningerne. Foelgende stamoploesninger kan (med forskellige fortyndingsforhold) anvendes til DOC-eliminering, modificeret OECD-screening, CO2-udvikling, manometrisk respirometri og Closed Bottle-test.

Fortyndingsforholdene og for MITI-testens vedkommende fremstilling af det specifikke uorganiske medium, er anfoert under de enkelte metoder.

Stamoploesninger

Foelgende stamoploesninger fremstilles ud fra reagenser af analysekvalitet

(a) monokaliumdihydrogenorthophosphat, KH2PO48,50 g

dikaliummonohydrogenorthophosphat, K2HPO421,75 g

dinatriummonohydrogenorthophosphat dihydrat, Na2HPO4 72H2O33,40 g

ammoniumchlorid, NH4Cl0,50 g

Oploeses i vand og fortyndes til 1 liter. Oploesningens pH skal vaere 7,4.

(b) calciumchlorid, vandfrit, CaCl227,50 g eller calciumchlorid dihydrat, CaCl2 72H2O36,40 g Oploeses i vand og fortyndes til 1 liter.

(c) magnesiumsulfat heptahydrat, MgSO4 77H2O22,50 g

Oploeses i vand og fortyndes til 1 liter.

(d) jern(III)chlorid hexahydrat, FeCl3 76H2O0,25 g

Oploeses i vand og fortyndes til 1 liter.

Anmaerkning: For at undgaa at skulle fremstille denne oploesning umiddelbart foer brugen tilsaettes der 1 draabe koncentreret HCl eller 0,40 g ethylendiamintetraeddikesyre dinatriumsalt (EDTA) pr. liter.

I.6.3. Stamoploesninger af kemikalier

Hvis oploeseligheden er stoerre end 1 g/l oploeses f.eks. 1-10 g af test- eller referencekemikalie i deioniseret vand, og der fortyndes til 1 liter. I modsat fald fremstilles stamoploesningen i det uorganiske medium, eller kemikaliet tilsaettes direkte til det uorganiske medium. Jf. tillaeg III for haandtering af mindre oploeselige kemikalier; dog maa der i MITI-testen (metode C.4-F) hverken anvendes oploesningsmidler eller emulgatorer.

I.6.4. Inoculum

Inoculum kan stamme fra en raekke forskellige kilder, f.eks. aktivt slam, spildevandsafloeb (ikke chloreret), overfladevand og -jord eller en blanding af disse. Aktivt slam til DOC-eliminering, CO2-udvikling og manometrisk respirometri skal udtages fra et rensningsanlaeg eller et laboratorieanlaeg, der foerst og fremmest behandler husholdningsspildevand. Inoculum fra andre kilder har vist sig at foere til stoerre spredning af resultaterne. Til den modificerede OECD-screening og Closed Bottle-testen kraeves der et mere fortyndet inoculum uden slampartikler, og som kilde foretraekkes sekundaert afloebsvand fra et rensningsanlaeg for husholdningsspildevand eller et anlaeg i laboratorieskala. Til MITI-testen fremstilles inoculum fra en blanding af kilder, hvilket er beskrevet under denne specifikke test.

I.6.4.1. Inoculum fra aktivt slam

Der udtages en frisk proeve af aktivt slam fra beluftningstanken ved et rensningsanlaeg eller et laboratorieanlaeg, der fortrinsvis behandler husholdningsspildevand. Om noedvendigt fjern grove partikler fra ved filtrering gennem en finmasket sigte og hold herefter slammet aerobt.

Alternativt kan slammet henstaa til bundfaeldning eller centrifugeres (f.eks. ved 1 100 g i 10 min), efter at grove partikler er fjernet. Supernatanten fjernes. Slammet kan vaskes i uorganisk medium. Det koncentrerede slam opslaemmes til en koncentration paa 3-5 g opslaemmet toerstof pr. liter, hvorefter det beluftes indtil anvendelse.

Slammet skal tages fra et ordentligt fungerende normalt anlaeg. Slammet vaskes, hvis det er noedvendigt at tage det fra et staerkt belastet rensningsanlaeg, eller et renseanlaeg som menes at indeholde haemmende stoffer. Det genopslaemmede slam henstaar til bundfaeldning eller centrifugeres efter grundig blanding, supernatanten fjernes, og det vaskede slam genopslaemmes i uorganisk medium. Denne fremgangsmaade gentages, indtil slammet menes at vaere fri for overskud af substrat eller haemmende stoffer.

Lige foer brugen udtages der en proeve af det fuldstaendigt genopslaemmede slam eller af det ubehandlede slam, til bestemmelse af maengden af opslaemmet toerstof.

Et andet alternativ er at homogenisere aktivt slam (3-5 g opslaemmet toerstof pr. liter). Slammet behandles i en mekanisk blender i 2 minutter ved middel hastighed. Det homogeniserede slam henstaar til bundfaeldning i 30 min. eller om noedvendigt laengere, og vaesken dekanteres fra til brug som inoculum i en maengde paa 10 ml pr. liter uorganisk medium.

I.6.4.2. Andre inoculumkilder

Det kan fremstilles af sekundaert afloebsvand fra et rensningsanlaeg eller et laboratorieanlaeg, der overvejende behandler husholdningsspildevand. Der udtages en frisk proeve, der opbevares under aerobe forhold under transporten. Den henstaar til bundfaeldning i 1 time eller filtreres gennem et groft papirfilter, og denne vaeske opbevares under aerobe forhold indtil brugen. Op til 100 ml af denne inoculumtype kan bruges pr. liter medium.

Overfladevand er en yderligere inoculumkilde. I dette tilfaelde udtages en proeve af egnet overfladevand, f.eks. flod- eller soevand, som opbevares under aerobe forhold indtil anvendelsen. Om noedvendigt kan inoculum koncentreres ved filtrering eller centrifugering.

I.6.5. Forkonditionering af inoculum

De fremstillede inoculum kan forkonditioneres til forsoegsbetingelserne, men maa ikke tilvaennes til testkemikaliet. Forkonditioneringen bestaar i beluftning af aktivt slam i uorganisk medium eller af sekundaert afloebsvand i 5-7 dage ved stuetemperatur. Undertiden goer forkonditionering metoderne mere praecise, idet blindvaerdierne reduceres. Det anses for unoedvendigt at forkonditionere MITI- inoculum.

I.6.6. Abiotiske kontrolproever

Om noedvendigt foretages der kontrol af eventuel abiotisk nedbrydning af teststoffet ved bestemmelse af DOC-tab, oxygenoptagelse og kuldioxidudvikling i sterile kontrolproever, der ikke indeholder inoculum. Der steriliseres ved membranfiltrering (0,2-0,45 ìm) eller ved tilsaetning af et passende toksisk stof i passende koncentration. Hvis der benyttes membranfiltrering skal proeverne tages aseptisk for at opretholde steriliteten. Med mindre adsorption af teststoffet i forvejen er blevet udelukket, skal tests som maaler bionedbrydning som DOC-fjernelse, inkludere en abiotisk kontrol som inoculeres og forgiftes. Dette gaelder saerligt for inocula med aktiveret slam.

I.6.7. Antal kolber

For hver test er antallet af kolber i en typisk forsoegsraekke beskrevet under den enkelte metode.

Foelgende typer af kolber kan bruges testopslaemning: indeholder teststof og inoculum

inoculumblind: indeholder kun inoculum procedurekontrol: indeholder referencestof og inoculum abiotisk steril kontrol: sterile, indehlder teststof (I.6.6.)adsorptionskontrol: indeholder teststof, inoculum og steriliserende stof toksicitetskontrol: indeholder teststof, referencestof og inoculum Bestemmelser i testopslaemning og inoculumblind skal obligatorisk foretages sideloebende. Det anbefales ligeledes at foretage sideloebende bestemmelser i den anden flaske.

Det er dog ikke altid muligt. Man maa soerge for, at der udtages tilstraekkeligt med proever eller foretages tilstraekkeligt mange aflaesninger til, at den procentvise eliminering i 10-dages vinduet kan vurderes.

I.7. DATA OG EVALUERING

Ved beregning af den procentvise nedbrydning Dt anvendes gennemsnitsvaerdierne af dobbeltbestemmelserne af parameteren i testopslaemningen og inoculumblindproeven. Formlerne er givet i afsnittene om de enkelte testmetoder. Nedbrydningens forloeb vises grafisk med angivelse af 10-dages vinduet. Den procentvise eliminering ved afslutningen af 10-dages vinduet og ved plateauet eller testens afslutning beregnes og rapporteres.

I de respirometriske test kan nitrogenholdige forbindelser indvirke paa oxygenoptagelsen som foelge af nitrifikation (se bilag II og V).

I.7.1. Nedbrydning maalt ved bestemmelse af DOC

Den procentuelle nedbrydning (Dt) paa ethvert proevetagningstidspunkt skal beregnes saerskildt for kolberne, som indeholder teststof, idet gennemsnitsvaerdierne af dobbeltbestemmelserne af DOC benyttes for at kunne bedoemme paalideligheden af testen (se I.5.2.). Den beregnes ved at bruge foelgende udtryk

Dt = (1 Ct Cbt Co Cbo) × 100

hvor

Dt = % nedbrydning til tidspunktet t

Co = gennemsnitlig startkoncentration af DOC i kulturmediet med teststof og inoculum (mg DOC/l)

Ct = gennemsnitskoncentration af DOC i kulturmediet med teststof og inoculum til tidspunktet t (mg DOC/l)

Cbo = gennemsnitlig startkoncentration af DOC i blindproeve med uorganisk medium og inoculum (mg DOC/l)

Cbt = gennemsnitskoncentration af DOC i blindproeve med uorganisk medium og inoculum til tidspunktet t (mg DOC/l).

Alle koncentrationer bestemmes eksperimentelt.

I.7.2. Nedbrydning maalt ved specifik analyse

Naar der foreligger specifikke analysedata, beregnes den primaere bionedbrydning ved udtrykket

Dt = Sb SaSb × 100

hvor

Dt = % nedbrydning til tidspunktet t, normalt 28 dage

Sa = restmaengde teststof i medium med inoculum ved testens afslutning (mg)

Sb = restmaengde teststof i blindproeve kun med vand/medium og teststof (mg)

I.7.3. Abiotisk nedbrydning

Naar en abiotisk kontrol bruges, beregnes den procentuelle abiotiske nedbrydning ved at bruge

% abiotisk nedbrydning = Cs(o) Cs(t)Cs(o) × 100

hvor

Cs(o) = DOC-koncentrationen, sterilkontrollen paa dag 0

Cs(t) = DOC-koncentrationen, sterilkontrollen paa dag t

I.8. RAPPORTERING

Testrapporten skal om muligt indeholde foelgende oplysninger

- test- og referencekemikalie og deres renhed

- testbetingelser

- inoculum: art og udtagningssted(er), koncentration og eventuel forkonditionering

- art og andel af industrispildevand i afloebsvandet, hvis kendt

- testens varighed og temperatur

- for tungt oploeselige testkemikalier, den foretagene behandling

- anvendt testmetode; aendringer i fremgangsmaaden skal begrundes videnskabeligt

- forsoegsresultater i skema

- eventuelt iagttagne haemningsfaenomener

- eventuelt iagttagen abiotisk nedbrydning

- eventuelle data fra specifikke kemiske analyser

- om muligt analytiske data vedroerende nedbrydningsprodukter

- afbildning af den procentvise nedbrydning mod tiden for baade test- og referencestof med tydelig angivelse af lag-periode, nedbrydningstid, 10-dages vindue og haeldning (se bilag I). Hvis der i testen benyttes paalidelighedskriterier kan gennemsnittet af nedbrydningsprocenterne i kolberne indeholdende teststoffet benyttes til fremstilling af grafen.

- procentvis eliminering efter 10-dages vinduet og ved enten plateau eller testens afslutning.

DEL II. DOC-ELIMINERING (Metode C.4-A)

II.1. METODENS PRINCIP

En afmaalt maengde uorganisk medium indeholdende inoculum og, som den nominelle eneste organiske kulstofkilde, teststof i kendt koncentration (10-40 mg/l) beluftes i moerke eller daempet lys ved 22 ± 2 C.

Nedbrydningen foelges ved hyppig DOC-analyse i en periode paa 28 dage. Bionedbrydningsgraden beregnes ved at udtrykke koncentrationen af fjernet DOC (korrigeret for koncentrationen i inoculumblindproeven) i procent af startkoncentrationen af DOC. Den primaere bionedbrydning kan ogsaa beregnes ud fra supplerende kemisk analyse ved inkubationsperiodens begyndelse og afslutning.

II.2. BESKRIVELSE AF METODEN

II.2.1. Apparatur

(a) Koniske kolber, f.eks. 250 ml op til 2 l, afhaengigt af det volumen, der kraeves til DOC-analyse

(b) Rysteapparat til de koniske kolber, enten med automatisk temperaturkontrol eller anbragt i et lokale med konstant temperatur, og tilstraekkelig kraftigt til, at forholdene holdes aerobe i alle kolberne

(c) Filtreringsapparatur med passende membraner

(d) DOC-analysator

(e) Apparatur til bestemmelse af oploest oxygen

(f) Centrifuge.

II.2.2. Fremstilling af uorganisk medium

Se I.6.2 om fremstilling af stamoploesning.

10 ml af oploesning (a) blandes med 800 ml fortyndingsvand, og af oploesning (b), (c) og (d) tilsaettes der 1 ml af hver, hvorefter der fyldes op til 1 l med fortyndingsvand.

II.2.3. Fremstilling og forkonditionering af inoculum

Inoculum kan stamme fra en raekke forskellige kilder: aktivt slam, spildevandsafloeb, overfladevand og -jord eller en blanding af disse.

Se I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. og I.6.5.

II.2.4. Klargoering af kolberne

Eksempelvis kan der overfoeres 800 ml portioner af uorganisk medium til koniske 2-liters kolber, hvorefter der tilsaettes saa meget af stamoploesningerne af test- og referencestof til de forskellige kolber, at kemikaliekoncentrationen bliver paa 10-40 mg DOC pr. liter. Kontroller pH-vaerdier og juster om noedvendigt til 7,4. Der tilsaettes inoculum fra aktivt slam eller en anden kilde (se I.6.4) til en slutkoncentration paa hoejst 30 mg opslaemmet toerstof pr. liter. Der klargoeres ogsaa inoculumkontrolproever i uorganisk medium uden test- og referencekemikalier.

Om noedvendigt kan der medtages en kolbe til kontrol af, om testkemikaliet har en haemmende virkning, ved tilsaetning af omtrent lige store maengder test- og referencekemikalie til uorganisk medium indeholdende inoculum.

Der kan ogsaa om noedvendigt inkluderes en steril kolbe, dvs. en kolbe uden inoculum, til undersoegelse af, om testkemikaliet nedbrydes abiotisk (se I.6,6.).

Hvis testkemikaliet mistaenkes for i vaesentlig grad at kunne adsorberes til glas, slampartikler el. lign., foretages desuden en indledende vurdering af denne adsorption og dermed af testens egnethed for det paagaeldende testkemikalie (se tabel 1). Benyt en flaske indeholdende teststoffet, inoculum og det steriliserende stof.

Alle kolber fyldes op til 1 liter med uorganisk medium, og efter blanding udtages der en proeve af hver kolbe til bestemmelse af startkoncentrationen af DOC (se bilag II, punkt 4). Kolbernes aabning tildaekkes, f.eks. med aluminiumfolie, paa en saadan maade, at luften frit kan passere ind og ud af kolberne. Dernaest startes testen ved, at kolberne anbringes i rysteapparatet.

II.2.5. Antal kolber i en typisk testraekke

Flaske 1 og 2: testopslaemning

Flaske 3 og 4: inoculumblind

Flaske 5: procedurekontrol

Anbefalet og om noedvendigt

Flaske 6: abiotisk steril kontrol

Flaske 7: adsorptionskontrol

Flaske 8: toksicitetskontrol

Se I.6.7.

II.2.6. Gennemfoerelse af testen

Under testens forloeb foretages der dobbeltbestemmelse af DOC-koncentrationen i alle kolberne med bestemte tidsintervaller og saa ofte, at baade 10-dages vinduets start og den procentvise fjernelse ved 10-dages vinduets afslutning kan konstateres. Der udtages kun netop saa meget af testopslaemningen, som er noedvendigt til analysen.

Inden proeveudtagningen kompenseres der for eventuelt fordampningstab fra kolberne ved tilsaetning af vand (I.6.1). Inden proeven udtages, blandes kulturmediet omhyggeligt, idet det paases, at materiale paa kolbens sider foerst bringes i oploesning eller opslaemning. Der centrifugeres eller filtreres paa membranfilter (se tillaeg II.4) straks efter proeveudtagningen. Den filtrerede eller centrifugerede proeve analyseres samme dag; ellers kan den opbevares i hoejst 48 timer ved 2-4 C eller i laengere tid ved hoejst 18 C.

II.3. DATA OG RAPPORTERING

II.3.1. Behandling af resultaterne

Den procentvise nedbrydning til tidspunktet t beregnes som anfoert under I.7.1. (DOC-bestemmelse) og eventuelt som under I.7.2. (specifik analyse).

Alle resultater noteres paa de tilhoerende skemaer.

II.3.2. Resultaternes gyldighed

Se I.5.2.

II.3.3. Rapportering

Se I.8.

II.4. RESULTATSKEMA

Nedenfor er vist et eksempel paa et resultatskema.

DOC-ELIMINERING

1. LABORATORIUM

2. DATO VED TESTENS BEGYNDELSE

3. TESTSTOF

Navn

Stamoploesningens koncentration: ... mg/l stof

Begyndelseskoncentration i mediet, to: ... mg/l stof

4. INOCULUM

Kilde

Behandling

Eventuel forkonditionering

Koncentrationen af opslaemmet toerstof i reaktionsblandingen: ... mg/l

5. KULSTOFBESTEMMELSER

Kulstofanalysator

>TABELPOSITION>

6. VURDERING AF RAADATA

>TABELPOSITION>

7. ABIOTISK KONTROL (frivillig)

>TABELPOSITION>

% abiotisk nedbrydning = Cs(o) Cs(t)Cs(o) × 100

8. SPECIFIK KEMISK ANALYSE (frivillig)

>TABELPOSITION>

DEL III. MODIFICERET OECD-SCREENINGTEST (Metode C.4-B)

III.1. METODENS PRINCIP

Til en afmaalt maengde uorganisk medium indeholdende teststof i kendt koncentration (10-40 mg/l) som den nominelle eneste organisk kulstofkilde, tilsaettes der 0,5 ml spildevandsinoculum pr. liter. Blandingen beluftes i moerke eller daempet lys ved 22 ± 2 C.

Nedbrydningen foelges ved hyppig DOC-analyse i en periode paa 28 dage. Bionedbrydningsgraden beregnes ved at udtrykke koncentrationen af fjernet DOC (korrigeret for koncentrationen i inoculumblindproeven) i procent af startkoncentrationen af DOC. Den primaere bionedbrydning kan ogsaa beregnes ud fra supplerende kemisk analyse ved inkubationsperiodens begyndelse og afslutning.

III.2. BESKRIVELSE AF METODEN

III.2.1. Apparatur

(a) Koniske kolber, f.eks. 250 ml op til 2 l, afhaengigt af det volumen, der kraeves til DOC-analyse

(b) Rysteapparat til de koniske kolber, enten med automatisk temperaturkontrol eller anbragt i et lokale med konstant temperatur, og tilstraekkelig kraftigt til, at forholdene holdes aerobe i alle kolberne

(c) Filtreringsapparatur med passende membraner

(d) DOC-analysator

(e) Apparatur til bestemmelse af oploest oxygen

(f) Centrifuge.

III.2.2. Fremstilling af uorganisk medium

Se I.6.2 om fremstilling af stamoploesning.

10 ml af oploesning (a) blandes med 800 ml fortyndingsvand, og af oploesning (b), (c) og (d) tilsaettes der 1 ml af hver, hvorefter der fyldes op til 1 l med fortyndingsvand.

I denne metode anvendes der kun 0,5 ml spildevand pr. liter som inoculum, og derfor kan det vaere noedvendigt at tilsaette yderligere sporstoffer og vaekstfaktorer til mediet. Dette goeres ved tilsaetning af 1 ml af hver af foelgende oploesninger pr. liter medium (slutvolumen).

Oploesning af sporstoffer

Mangansulfat tetrahydrat, MnSO4 7 4H2O 39,9 mg

Borsyre, H3BO4 57,2 mg

Zinksulfat heptahydrat, ZnSO4 7 7H2O 42,8 mg

Ammoniumheptamolybdat (NH4)6Mo7O24 34,7 mg

Jernchelat (FeCl3 ethylendiamintetraeddikesyre) 100,0 mg

oploeses i vand og fortyndes til 1 000 ml.

Vitaminoploesning

Gaerekstrakt 15,0 mg

oploeses i 100 ml vand. Der steriliseres ved filtrering igennem 0,2 ìm membranfilter, hvis oploesningen friskfremstilles hver gang.

III.2.3. Fremstilling og forkonditionering af inoculum

Inokulum tages fra det sekundaere afloeb fra et spildevandsanlaeg eller et laboratorieanlaeg, som fortrinsvis modtager husholdningsspildevand. Se I.6.4.2 og I.6.5.

0,5 ml pr. liter uorganisk naeringsstofoploesning benyttes.

III.2.4. Klargoering af kolberne

Eksempelvis kan der overfoeres 800 ml portioner af uorganisk medium til koniske 2-liters kolber, hvorefter der tilsaettes saa meget af stamoploesningerne af test- og referencestof til de forskellige kolber, at kemikaliekoncentrationen bliver paa 10-40 mg DOC pr. liter. Kontroller pH-vaerdier og juster om noedvendigt til 7,4. Der tilsaettes 0,5 ml spildevand pr. liter (se I.6.4.2.) til kolberne som inoculum. Der klargoeres ogsaa inoculumkontrolproever i uorganisk medium uden test- og referencekemikalier.

Om noedvendigt kan der medtages en kolbe til kontrol af, om testkemikaliet virker haemmende; der tilsaettes omtrent lige store maengder test- og referencekemikalie til uorganisk medium indeholdende inoculum.

Der kan ogsaa om noedvendigt inkluderes en steril kolbe, dvs. en kolbe uden inoculum, til kontrol af, om testkemikaliet nedbrydes abiotisk (se I.6.6.).

Hvis testkemikaliet mistaenkes for i vaesentlig grad at kunne adsorberes til glas, slampartikler el. lign., foretages desuden en indledende vurdering af denne adsorption og dermed af testens egnethed for det paagaeldende testkemikalie (se tabel 1). Benyt en kolbe indeholdende teststoffet, inoculum og det steriliserende stof.

Alle kolber fyldes op til 1 liter med uorganisk medium, og efter blanding udtages der en proeve af hver kolbe til bestemmelse af startkoncentrationen af DOC (se tillaeg II, punkt 4). Kolbernes aabning tildaekkes, f.eks. med aluminiumfolie, paa en saadan maade, at luften frit kan passere ind og ud af kolberne. Dernaest startes testen ved, at kolberne anbringes i rysteapparatet.

III.2.5. Antal kolber i en typisk testraekke

Flaske 1 og 2: testopslaemning

Flaske 3 og 4: inoculumblind

Flaske 5: procedurekontrol anbefalet og om noedvendigt

Flaske 6: abiotisk steril kontrol

Flaske 7: adsorptionskontrol

Flaske 8: toksicitetskontrol

Se I.6.7.

III.2.6. Gennemfoerelse af testen

Under testens forloeb foretages der dobbeltbestemmelse af DOC-koncentrationen i alle kolberne med bestemte tidsintervaller og saa ofte, at baade 10-dages vinduets start og den procentvise fjernelse ved 10-dages vinduets afslutning kan konstateres. Der udtages kun netop saa meget af testopslaemningen, som er noedvendig til analysen.

Inden proeveudtagningen kompenseres der for eventuelt fordampningstab fra kolberne ved tilsaetning af fortyndingsvand (I.6.1.). Inden proeven udtages, blandes kulturmediet omhyggeligt, idet materiale paa kolbens sider foerst bringes i oploesning eller opslaemning. Der centrifugeres eller filtreres paa membranfilter (se bilag II.4.) straks efter proeveudtagningen. Den filtrerede eller centrifugerede proeve analyseres samme dag; ellers kan den opbevares i hoejst 48 timer ved 2-4 C eller i laengere tid ved hoejst 18 C.

III.3. DATA OG RAPPORTERING

III.3.1. Behandling af resultaterne

Den procentvise nedbrydning til tidspunktet t beregnes som anfoert under I.7.1. (DOC-bestemmelse) og eventuelt som under I.7.2. (specifik analyse).

Alle resultater noteres paa de tilhoerende skemaer.

III.3.2. Resultaternes gyldighed

Se I.5.2.

III.3.3. Rapportering

Se I.8.

III.4. RESULTATSKEMA

Nedenfor er vist et eksempel paa et resultatskema.

MODIFICERET OECD-SCREENINGTEST

1. LABORATORIUM

2. DATO VED TESTENS BEGYNDELSE

3. TESTSTOF

Navn

Stamoploesningens koncentration: ... mg/l stof

Begyndelseskoncentration i mediet, to: ... mg/l stof

4. INOCULUM

Kilde

Behandling

Eventuel forkonditionering

Koncentrationen af opslaemmet toerstof i reaktionsblandingen: ... mg/l

5. KULSTOFBESTEMMELSER

Kulstofanalysator

>TABELPOSITION>

6. VURDERING AF RAADATA

>TABELPOSITION>

7. ABIOTISK KONTROL (frivillig)

>TABELPOSITION>

% abiotisker nedbrydning = Cs(o) Cs(t)Cs(o) × 100

8. SPECIFIK KEMISK ANALYSE (frivillig)

>TABELPOSITION>

DEL IV. CO2-UDVIKLING (Metode C.4-C)

IV.1. METODENS PRINCIP

En afmaalt maengde uorganisk medium indeholdende inoculum og, som den nominelle eneste organiske kulstofkilde, teststof i kendt koncentration (10-20 mg DOC eller TOC/l) beluftes ved gennemledning af kuldioxidfri luft med kontrolleret hastighed i moerke eller i diffust lys. Nedbrydningen foelges gennem 28 dage ved bestemmelse af den dannede maengde kuldioxid, idet den opsamles i barium- eller natriumhydroxid og maales enten ved titrering af det resterende hydroxid eller som uorganisk kulstof. Den maengde kuldioxid, som er udviklet af testkemikaliet (korrigeret for inoculumblindvaerdien), udtrykkes i procent af ThCO2. Graden af bionedbrydning kan ogsaa beregnes ud fra supplerende DOC-analyser ved inkubationsperiodens begyndelse og afslutning.

IV.2. BESKRIVELSE AF METODEN

IV.2.1. Apparatur

(a) Kolber, 2-5 l, alle forsynet med beluftningsroer, der naesten naar ned til bunden af beholderen, og afgangsaabning

(b) Magnetomroerere, naar der testes tungtoploeselige kemikalier

(c) Gasabsorptionsflasker

(d) Udstyr til styring og maaling af luftgennemstroemning

(e) Apparatur til udvaskning af kuldioxid, til fremstilling af kuldioxidfri luft; alternativt kan der benyttes CO2-fri oxygen og CO2-fri nitrogen paa staalflaske i det rette blandingsforhold (20 % O2 og 80 % N2)

(f) Udstyr til bestemmelse af kuldioxid, enten titrimetrisk eller ved en eller anden form for analysator for uorganisk kulstof

(g) Membranfiltreringsapparatur (valgfrit)

(h) DOC-analysator (valgfri)

IV.2.2. Fremstilling af uorganisk medium

Se I.6.2 om fremstilling af stamoploesning.

10 ml af oploesning (a) blandes med 800 ml fortyndingsvand, og af oploesning (b), (c) og (d) tilsaettes der 1 ml af hver, hvorefter der fyldes op til 1 l med fortyndingsvand.

IV.2.3. Fremstilling og forkonditionering af inoculum

Inoculum kan stamme fra en raekke forskellige kilder: aktivt slam, spildevandsafloeb, overfladevand og -jord eller en blanding af disse.

Se I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. og I.6.5.

IV.2.4. Klargoering af kolberne

Foelgende volumen- og vaegtangivelser gaelder som eksempel for 5-liters kolber med 3 l opslaemning. Anvendes der mindre rumfang, tilpasses vaerdierne, dog skal den dannede maengde kuldioxid kunne bestemmes noejagtigt.

Der overfoeres 2 400 ml uorganisk medium til hver 5-liters kolbe. Der tilsaettes saa meget klargjort aktivt slam (se I.6.4.1 og I.6.5), at koncentrationen af opslaemmet toerstof bliver hoejst 30 mg/l i de 3 liter slutblanding. Alternativt kan det klargjorte slam foerst fortyndes med uorganisk medium til en opslaemning indeholdende 500-1 000 mg/l, hvorefter en del heraf tilsaettes til 5-liters kolbens indhold til en koncentration paa 30 mg/l; dette giver stoerre noejagtighed. Der kan benyttes andre inoculumkilder (se I.6.4.2).

Disse blandinger beluftes natten over med CO2-fri luft, saa al kuldioxiden drives ud af systemet.

Test- og referencestof tilsaettes hver for sig som v.h.a. kendte maengder af stamoploesninger til replika-kolberne, saa der opnaas en koncentration paa 10-20 mg DOC eller TOC pr. liter; til nogle af kolberne tilsaettes der ingen kemikalier, og de fungerer som inoculumkontrolproever. Tungtoploeselige teststoffer tilsaettes direkte til kolberne paa vaegt- eller volumenbasis, eller haandteres som beskrevet i bilag III.

Om noedvendigt kan der medtages en kolbe til kontrol af, om testkemikaliet virker haemmende; der tilsaettes baade test- og referencekemikalie til samme koncentration som i de andre kolber.

Der kan ogsaa om noedvendigt inkluderes en steril kolbe, dvs. en kolbe uden inoculum, til kontrol af, om testkemikaliet nedbrydes abiotisk (se I.6.6). Steriliser ved tilsaetning af et giftigt stof i en passende koncentration.

I alle kolberne fyldes der op til et opslaemningsvolumen paa 3 l ved tilsaetning af uorganisk medium, der i forvejen er gennemluftet med CO2-fri luft. Der kan eventuelt udtages proever til DOC-analyse (se bilag II.4) og/eller specifik analyse. Absorptionsflaskerne forbindes til kolbernes afgangsaabning.

Hvis der anvendes bariumhydroxid, serieforbindes der 3 absorptionsflasker med hver 100 ml 0,0125 M bariumhydroxidoploesning til hver 5-liters kolbe. Oploesningen skal vaere fri for bundfald af sulfat og carbonat, og dens styrke skal bestemmes umiddelbart foer brugen. Anvendes der natriumhydroxid forbindes der 2 faelder, hvor den sidste fungerer som kontrol af, at al kuldioxiden er absorberet i den foerste. Absorptionsflasker med serumflaskelukker er egnede. Der anbringes 200 ml 0,05 M natriumhydroxid i hver flaske, hvilket er tilstraekkeligt til at absorbere hele den maengde kuldioxid, der udvikles, naar testkemikaliet nedbrydes fuldstaendigt. Selv en friskfremstillet natriumhydroxidoploesning vil altid indeholde spor af carbonat; dette korrigeres der for ved subtraktion af blindproevens carbonatindhold.

IV.2.5. Antal kolber i en typisk testraekke

Flaske 1 og 2: testopslaemning

Flaske 3 og 4: inoculumblind

Flaske 5: procedurekontrol anbefalet og om noedvendigt

Flaske 6: abiotisk steril kontrol

Flaske 7: toksicitetskontrol

Se I.6.7.

IV.2.6. Gennemfoerelse af testen

Testen indledes ved gennembobling af opslaemningerne med 30-100 ml CO2-fri luft pr. minut. Der udtages regelmaessigt proever af kuldioxidabsorbenten til analyse for CO2-indhold. Det anbefales, at der i de foerste 10 dage foretages analyser hver anden eller tredje dag og derefter hver femte dag indtil den 28. dag, saaledes at 10-dages vinduet kan identificeres.

Paa den 28. dag udtages der (eventuelt) proever til DOC-analyse og/eller specifik analyse, opslaemningernes pH maales, og der tilsaettes 1 ml koncentreret saltsyre til hver kolbe; kolberne beluftes natten over, saa al kuldioxid drives ud af testopslaemningerne. Paa den 29. dag foretages den sidste analyse af udviklet kuldioxid.

Paa de dage, hvor CO2 bestemmes, fjernes den bariumhydroxidabsorptionsflaske, der er naermest kolben, og indholdet titreres med 0,05 M HCl med phenolphthalein som indikator. De oevrige absorptionsflasker rykkes én plads naermere kolben, og der anbringes en ny flaske indeholdende 100 ml friskfremstillet 0,0125 M bariumhydroxyd bagest i serien. Titreringerne foretages efter behov, f.eks. naar der er betragteligt bundfald i den foerste flaske og intet synligt i den anden, dog mindst én gang ugentligt. Anvendes der NaOH som absorptionsmiddel udtages der med en injektionssproejte en lille proeve (afhaengigt af den anvendte kulstofanalysator) af natriumhydroxidoploesningen i den flaske, der er naermest ved kolben. Proeven sproejtes ind i IC-delen af kulstofanalysatoren til direkte analyse af den udviklede kuldioxid.

Indholdet af den anden absorptionsflaske analyseres foerst ved testens afslutning, saa der kan korrigeres for eventuel overfoersel af kuldioxid.

IV.3. DATA OG RAPPORTERING

IV.3.1. Behandling af resultaterne

Den absorberede CO2-maengde er efter titrering givet ved

mg CO2 = [(100 × CB 0,5 × V × CA)] × 44

hvor

V = den maengde HCl, der forbruges til titrering af de 100 ml absorptionsmiddel (ml)

CB = bariumhydroxidoploesningens koncentration (M)

CA = saltsyreoploesningens koncentration (M).

Hvis CB = 0,0125 M og CA = 0,05 M, skal der anvendes 50 ml til titrering af 100 ml bariumhydroxid, og CO2-maengden er givet ved

0,052 × 44 × ml HCl til titrering = 1,1 × ml HCl

I dette tilfaelde skal der altsaa anvendes en faktor paa 1,1 ved omregning fra det rumfang HCl, der medgaar til titrering, til det antal mg CO2, der er udviklet.

Den vaegtmaengde CO2, der dannes af inoculum alene og af inoculum plus testkemikalie, beregnes ud fra de paagaeldende titreringsvaerdier, og forskellen er den vaegtmaengde CO2, som testkemikaliet alene udvikler.

Hvis f.eks. inoculum alene kraever 48 ml til titreringen og inoculum plus testkemikalie kraever 45 ml, faas

CO2 fra inoculum = 1,1 × (50-48) = 2,2 mg

CO2 fra inoculum plus testkemikalie = 1,1 × (50-45) = 5,5 mg,

og den vaegtmaengde CO2, som testkemikaliet har udviklet, bliver altsaa 3,3 mg.

Den procentvise bionedbrydning beregnes ved

% nedbrydning = ThCO2 × mg tilsat testkemikaliemg udviklet CO2 × 100

eller

% nedbrydning = mg tilsat TOC i testen × 3,67mg udviklet CO2 × 100

idet 3,67 er omregningsfaktoren (44/12) fra kulstof til kuldioxid.

Den procentvise nedbrydning efter et givet tidsrum beregnes ved summering af de enkelte procentdele af ThCO2, der er maalt indtil det paagaeldende tidspunkt.

Anvendes der natriumhydroxid som absorptionsmiddel, beregnes den udviklede CO2- maengde, udtrykt som IC (mg), ved multiplikation af absorptionsmidlets IC- koncentration med dets volumen.

Den procentvise nedbrydning beregnes ved

% ThCO2 = mg IC i testkolbe mg IC i blindproevemg TOC tilsat som testkemikalie × 100

Det fjernede DOC beregnes (eventuelt) som beskrevet under 1.7. Dette og alle oevrige resultater noteres paa de tilhoerende skemaer.

IV.3.2. Resultaternes gyldighed

IC-indholdet i testkemikalieopslaemningen i uorganisk medium ved testens begyndelse skal vaere mindre end 5 % af TC, og den udviklede CO2-maengde i inoculumblindproeven maa ved testens afslutning normalt ikke overstige 40 mg pr. liter medium. Hvis der findes vaerdier paa over 70 mg CO2 pr. liter, gennemgaas data og forsoegsteknikker kritisk.

Se ogsaa I.5.2.

IV.3.3. Rapportering

Se I.8.

IV.4. RESULTATSKEMA

Nedenfor er vist et eksempel paa et resultatskema.

KULDIOXIDUDVIKLING

1. LABORATORIUM

2. DATO VED TESTENS BEGYNDELSE

3. TESTSTOF

Navn

Stamoploesningens koncentration: ... mg/l stof

Begyndelseskoncentration i mediet: ... mg/l stof

Total C tilsat til kolben: ... mg C

ThCO2: ... mg CO2

4. INOCULUM

Kilde: ...

Behandling: ...

Eventuel forkonditionering: ...

Koncentrationen af opslaemmet toerstof i reaktionsblandingen: ... mg/l

5. KULDIOXIDUDVIKLING OG NEDBRYDELIGHED

Metode: Ba(OH)2/NaOH/andet

>TABELPOSITION>

6. KULSTOFANALYSE (valgfri)

Kulstofanalysator

>TABELPOSITION>

% DOC fjernet = 1 Ct Cb(t) Co Cb(o) × 100

7. ABIOTISK NEDBRYDNING (valgfri)

% abiotisk nedbrydning = CO2-udvikling i steril kolbe efter 28 dage (mg)ThCO2 (mg) × 100

DEL V. MANOMETRISK RESPIROMETRI (Metode C.4-D)

V.1. METODENS PRINCIP

En afmaalt maengde uorganisk medium indeholdende inoculum og, som den nominelle eneste organiske kulstofkilde, teststof i kendt koncentration (100 mg teststof pr. liter svarende til mindst 50-100 mg ThOD pr. l) omroeres i en lukket kolbe ved konstant temperatur (± 1 C eller mindre) i op til 28 dage. Oxygenforbruget bestemmes enten ved maaling af den maengde oxygen (fremstillet elektrolytisk), der kraeves til opretholdelse af konstant gasvolumen i respirometerkolben, eller ud fra volumen- eller trykaendringen (eller en kombination af dem) i apparatet. Udviklet kuldioxid absorberes i en kaliumhydroxidoploesning eller andet egnet absorptionsmiddel. Den oxygenmaengde, testkemikaliet har optaget, (korrigeret for den parallelle inoculumblindproeves optagelse) udtrykkes som procent af ThOD eller COD. Frivilligt kan primaer bionedbrydning ogsaa beregnes ved supplerende specifik analyse ved begyndelsen og slutningen af inkuberingen, og fuldstaendig bionedbrydning ved analyse af DOC.

V.2. BESKRIVELSE AF METODEN

V.2.1. Apparatur

(a) Egnet respirometer

(b) Temperaturregulering inden for ± 1 C eller mindre

(c) Membranfiltreringsapparatur (valgfrit)

(d) Kulstofanalysator (valgfri).

V.2.2. Fremstilling af uorganisk medium

Se I.6.2. om fremstilling af stamoploesning.

10 ml af oploesning (a) blandes med 800 ml fortyndingsvand, og af oploesning (b), (c) og (d) tilsaettes der 1 ml af hver, hvorefter der fyldes op til 1 l med fortyndingsvand.

V.2.3. Fremstilling og forkonditionering af inoculum

Inoculum kan stamme fra en raekke forskellige kilder: aktivt slam, spildevandsafloeb, overfladevand og -jord eller en blanding af disse.

Se I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. og I.6.5.

V.2.4. Klargoering af kolberne

Ud fra stamoploesningerne fremstilles der saerskilte oploesninger af test- og referencestof i uorganisk medium med en kemikaliekoncentration paa normalt 100 mg/l (svarende til mindst 50-100 mg ThOD pr. l).

ThOD beregnes ud fra dannelsen af ammoniumsalte, medmindre der forventes nitrifikation; i saa fald baseres beregningen paa nitratdannelsen (se bilag II.2).

pH maales og justeres om noedvendigt til 7,4 ± 0,2.

Tungtoploeselige stoffer tilsaettes paa et senere tidspunkt (se nedenfor).

Hvis teststoffets toksicitet skal bestemmes, fremstilles endnu en oploesning i uorganisk medium, som indeholder baade test- og referencestof i samme koncentration som i de enkelte oploesninger.

Hvis bestemmelse af den fysisk-kemiske oxygenoptagelse er paakraevet, fremstilles der en oploesning af teststof i en koncentration paa normalt 100 mg ThOD pr. l som er blevet steriliseret ved tilsaetningen af et passende giftigt stof (se I.6,6.).

Den noedvendige maengde af henholdsvis test- og referencestofoploesningerne overfoeres til mindst to kolber (dobbeltbestemmelse). Der klargoeres yderligere kolber med uorganisk medium alene (inoculumblindproever) og hvis noedvendigt med den blandede test- og referencestofoploesning og med den sterile oploesning.

Hvis teststoffet er tungtoploeseligt, tilsaettes det direkte paa dette tidspunkt, enten paa vaegtbasis eller volumenbasis, eller ved haandtering som beskrevet i bilag III. Der tilsaettes kaliumhydroxid, natriumhydroxidperler eller et andet absorptionsmiddel til CO2-absorbtionskamrene.

V.2.5. Antal kolber i en typisk testraekke

Flaske 1 og 2: testopslaemning

Flaske 3 og 4: inoculumblind

Flaske 5: procedurekontrol anbefalet og om noedvendigt

Flaske 6: abiotisk steril kontrol

Flaske 7: toksicitetskontrol

Se I.6.7.

V.2.6. Gennemfoerelse af testen

Beholderne henstaar, indtil de har naaet den oenskede temperatur, og der tilsaettes klargjort aktivt slam eller et andet inoculum til de paagaeldende beholdere, saa der opnaas en koncentration af opslaemmet toerstof paa hoejst 30 mg/l. Apparaturet samles, omroeringen saettes i gang, der kontrolleres for lufttaethed, og oxygenoptagelsesmaalingen paabegyndes. Normalt kraeves der ikke anden pasning end de noedvendige aflaesninger og daglig kontrol af, at temperaturen er korrekt og omroeringen tilstraekkelig.

Oxygenoptagelsen beregnes paa grundlag af hyppige regelmaessige aflaesninger, foretaget efter apparaturfabrikantens anvisninger. Ved inkubationsperiodens afslutning, normalt 28 dage, maales pH i kolberne, navnlig hvis oxygenoptagelsen er meget lav eller stoerre end ThODNH4 (for nitrogenholdige forbindelser).

Om noedvendigt udtages der foer og efter inkuberingen proever fra respirometerkolberne til DOC-analyse eller specifik kemisk analyse (se bilag II.4). Man skal soerge for, at rumfanget af den testopslaemning, der er tilbage i kolben efter den foerste proeveudtagning, er kendt. Hvis teststoffet er N- holdigt, bestemmes koncentrationsforoegelsen af nitrit og nitrat over 28 dage, og korrektionen for oxygenforbruget ved nitrifikation beregnes (bilag V).

V.3. DATA OG RAPPORTERING

V.3.1. Behandling af resultaterne

Testkemikaliets oxygenoptagelse (mg) efter et givet tidsrum (korrigeret for inoculumblindproevens oxygenoptagelse i samme tidsrum) divideres med vaegten af den anvendte teststofmaengde. Herved fremkommer BOD udtrykt i mg oxygen pr. mg teststof, dvs.

BOD = mg O2 optaget af teststof mg O2 optaget af blindproevenmg teststof i kolben= mg O2 pr. mg teststof.

Den procentvise bionedbrydning beregnes enten ved % bionedbrydning = % ThOD = ThOD (mg O2/mg kemikalie)BOD (mg O2/mg kemikalie) × 100,c eller % COD = BOD (mg O2/mg kemikalie) COD (mg O2/mg kemikalie) × 100

Det bemaerkes, at de to metoder ikke noedvendigvis giver samme resultat; foerstnaevnte metode boer foretraekkes.

Der benyttes den ThOD (NH4 eller NO3), der svarer til det foreliggende kendskab til nitrifikation (bilag II.2). Sker der ufuldstaendig nitrifikation beregnes korrektionen for oxygenforbruget til nitrifikationen ud fra aendringerne i nitrit- og nitratkoncentrationen (bilag V).

Hvis det vaelges at foretage bestemmelser af organisk kulstof og/eller af et specifikt kemikalie, beregnes den procentvise nedbrydning som beskrevet under punkt I.7.

Alle resultater noteres paa de tilhoerende skemaer.

V.3.2. Resultaternes gyldighed

Inoculumblindproevens oxygenoptagelse er normalt 20-30 mg O2/l paa 28 dage og boer ikke vaere stoerre end 60 mg/l. Findes der vaerdier over 60 mg/l, maa data og forsoegsteknikker gennemgaas kritisk. Hvis pH ligger uden for intervallet 6-8,5 og teststoffets oxygenoptagelse er mindre end 60 %, gentages testen med lavere teststofkoncentration.

Se ogsaa I.5.2.

V.3.3. Rapportering

Se I.8.

V.4. RESULTATSKEMA

Nedenfor er vist et eksempel paa et resultatskema.

MANOMETRISK RESPIROMETRI

1. LABORATORIUM

2. DATO VED TESTENS BEGYNDELSE

3. TESTSTOF

Navn

Stamoploesningens koncentration: ... mg/l

Begyndelseskoncentration i mediet, Co: ... mg/l

Volumen i test kolbe (V): ... ml

ThOD eller COD: ... mg O2/mg test-stof (NH4, NO3)

4. INOCULUM

Kilde: ...

Behandling: ...

Eventuel forkonditionering: ...

Koncentrationen af opslaemmet toerstof i reaktionsblandingen: ... mg/l

5. OXYGENOPTAGELSE: BIONEDBRYDELIGHED

>TABELPOSITION>

6. KORREKTION FOR NITRIFIKATION (se bilag V)

>TABELPOSITION>

7. KULSTOFANALYSE (valgfri)

Kulstofanalysator

>TABELPOSITION>

% DOC fjernet = 1 Ct Cblt Co Cblo × 100

8. SPECIFIK KEMIKALIEBESTEMMELSE (valgfri)

Sb = koncentrationen af testkemikalie i steril kontrolkolbe efter 28 dage

Sa = koncentrationen af testkemikalie i kolbe med inoculum efter 28 dage

% bionedbrydning = Sb SaSb × 100

9. ABIOTISK NEDBRYDNING (valgfri)

a = oxygenforbruget i sterile kolber efter 28 dage (mg)

Oxygenforbrug pr. mg teststof = CoVa

(se afsnit 1 og 3)

% abiotisk nedbrydning = CoV × ThODa × 100

DEL VI. CLOSED BOTTLE TEST (metode C.4-E)

VI.1. TESTMETODENS PRINCIP

Til en saedvanligvis 2-5 mg/l oploesning af teststoffet i uorganisk medium tilsaettes der inoculum bestaaende af et forholdvis lille antal mikroorganismer fra en blandet population, og oploesningen opbevares i moerke ved konstant temperatur i helt fyldte lukkede kolber. Nedbrydningen foelges gennem 28 dage ved analyse af oploest oxygen. Den oxygenmaengde, som teststoffet har forbrugt, korrigeres for den oxygenmaengde, der er forbrugt i den parallelle inoculumblindproeve, og udtrykkes i procent af ThOD eller COD.

VI.2. BESKRIVELSE AF METODEN

VI.2.1. Apparatur

(a) BOD-kolber med glasprop, f.eks. 250-300 ml

(b) vandbad eller inkuberingsapparat, som kan holde kolberne ved konstant temperatur (± 1 C eller mindre) i moerke

(c) store glasflasker (2-5 l) til fremstilling af medium og opfyldning af BOD-kolberne

(d) oxygenelektrode og -maaler eller udstyr og reagenser til Winkler-titrering.

VI.2.2. Fremstilling af uorganisk medium

Se I.6.2 om fremstilling af stamoploesning.

1 ml af oploesning (a), (b), (c) og (d) fortyndes til 1 liter med vand.

VI.2.3. Fremstilling af inoculum

Inoculum tages normalt fra det sekundaere afloeb fra et spildevandsanlaeg eller et laboratorieanlaeg, som fortrinsvis modtager husholdningspildevand. En alternativ inoculumkilde er overfladevand. Brug normalt fra en draabe (0,05 ml) til 5 ml filtrat pr. liter medium. Afproevninger kan vaere noedvendige for at klarlaegge det optimale volumen for et givet afloeb (se I.6.4.2. og I.6.5.).

VI.2.4. Klargoering af kolberne

Det uorganiske medium beluftes kraftigt i mindst 20 minutter. En given forsoegsraekke udfoeres med uorganisk medium fra samme batch. Normalt er mediet klar til brug efter henstand i 20 timer ved testtemperaturen. Som kontrol bestemmes koncentrationen af oploest oxygen; vaerdien skal ligge omkring 9 mg/l ved 20 C. Al overfoering og opfyldning med det luftmaettede medium udfoeres, uden at der dannes bobler, f.eks. med en haevert.

Der klargoeres parallelle grupper af BOD-kolber til samtidige forsoeg med test- og referencestof. Der samles saa mange BOD-kolber, inklusive inoculumblindproever, at der mindst kan foretages dobbeltbestemmelse af oxygenforbruget med den oenskede hyppighed, f.eks. efter 0, 7, 14, 21 og 28 dage. Det kan vaere noedvendigt at anvende flere kolber, hvis man vil vaere sikker paa at kunne identificere 10-dages vinduet.

De store kolber fyldes en tredjedel op med fuldt beluftet uorganisk medium. Dernaest tilsaettes der saa meget stamoploesning af tes- og referencestof til forskellige kolber, at deres slutkoncentration normalt ikke bliver stoerre end 10 mg/l. Til en saerskilt kolbe med kontrolmedium tilsaettes der ingen kemikalier.

For at vaere sikker paa, at inoculumaktiviteten ikke begraenses, maa koncentrationen af oploest oxygen ikke falde til under 0,5 mg/l i BOD-kolberne, hvilket begraenser testkemikaliets koncentration til ca. 2 mg/l. Af tungt nedbrydelige stoffer og stoffer med lavt ThOD kan der dog anvendes 5-10 mg/l. I visse tilfaelde tilraades det at koere parallelle serier med teststof i to forskellige koncentrationer, f.eks. 2 og 5 mg/l. Normalt beregnes ThOD paa basis af dannelsen af ammoniumsalte, men hvis der forventes eller vides at ske nitrifikation, beregnes vaerdien paa grundlag af nitratdannelsen (ThODNO3: se bilag II.2). Sker der ufuldstaendig nitrifikation korrigeres der for de aendringer i nitrit- og nitratkoncentrationen, der er bestemt ved analyse (se bilag V).

Endnu en serie kolber er paakraevet, hvis teststoffets toksicitet skal undersoeges (f.eks. hvis der tidligere er fundet en lav bionedbrydelighedsvaerdi).

Hertil klargoeres der endnu en stor kolbe med beluftet uorganisk medium (ca. en tredjedel fuld) plus teststof og referencestof normalt i samme slutkoncentrationer som i de andre kolber.

Der tilsaettes inoculum til kolberne i form af sekundaert afloebsvand (fra 1 draabe (ca. 0,05 ml) til 5 ml pr. liter) eller f.eks. flodvand (se I.6.4.2). Endelig fyldes der op med beluftet uorganisk medium ved hjaelp af en slange, der naar helt ned til bunden, saa der bliver tilstraekkelig omroering.

VI.2.5. Antal kolber i en typisk testraekke

I en typisk testraekke anvendes foelgende antal kolber

mindst 10 med teststof og inoculum (testopslaemning)

mindst 10 kun med inoculum (inoculumblindproeve)

mindst 10 med referencestof og inoculum (procedurekontrol)

og i givet fald 6 kolber med teststof, referencestof og inoculum (toksicitetskontrol). Til sikker identifikation af 10-dages vinduet kraeves der dog det dobbelte antal kolber.

VI.2.6. Gennemfoerelse af testen

De fremstillede oploesninger fordeles straks i de paagaeldende grupper af BOD-kolber, idet de suges op fra den nederste fjerdedel af den passende store kolbe (ikke bunden) med en slange, og saaledes at alle BOD-kolberne fyldes helt. Eventuelle luftbobler fjernes ved en let banken paa kolbens side. Starttidskolberne analyseres straks for oploest oxygen enten ved Winklers metode eller med elektrode. Indholdet i kolberne kan opbevares til senere analyse efter Winklers metode, hvis der straks tilsaettes mangan(II)sulfat og natriumhydroxid (det foerste Winkler- reagens). De omhyggeligt tilproppede kolber, hvor oxygenet er fikseret som brunt hydratiseret mangan(III)oxid, opbevares i moerke ved 10-20 C i hoejst 24 timer, inden Winkler-testen goeres faerdig. De resterende kolber tilproppes, idet man soerger for, at der ikke indesluttes nogen luftbobler, og de inkuberes ved 20 C i moerke. Parallelt med hver serie skal der vaere en fuldstaendig serie til bestemmelse af inoculumblindvaerdien. Under de 28 dages inkubering udtages der med bestemte mellemrum (mindst en gang om ugen) mindst 2 kolber af hver serie til analyse for oploest oxygen.

Med ugentlig proeveudtagning skulle den procentvise fjernelse kunne bedoemmes i et 14-dages vindue, mens der ved proeveudtagning hver 3. til 4. dag, hvilket kraever omtrent det dobbelte antal kolber, bliver mulighed for identificering af 10-dages vinduet.

For N-holdige stoffers vedkommende maa der korrigeres for oxygenforbrug ved eventuel nitrifikation. Hertil anvendes der en O2-elektrode til bestemmelse af koncentrationen af oploest oxygen, hvorefter der udtages en proeve fra BOD-kolben til analyse for nitrit og nitrat. Den forbrugte oxygenmaengde beregnes paa grundlag af foroegelsen i nitrit- og nitratkoncentrationen (se bilag V).

VI.3. DATA OG RAPPORTERING

VI.3.1. Behandling af resultaterne

Foerst beregnes BOD efter hvert tidsinterval ved at traekke oxygentabet (mg O2 pr. l) i inoculumblindproeven fra oxygentabet i kolben med teststof. Dette korrigerede oxygentab divideres med teststoffets koncentration (mg/l), hvorved den specifikke BOD fremkommer i mg oxygen pr. mg teststof. Den procentvise bionedbrydelighed beregnes ved at dividere den specifikke BOD med den specifikke ThOD (beregnet som anfoert i bilag II.2) eller COD (bestemt ved analyse, se bilag II.3), dvs.

BOD = mg O2 optaget af teststof mg O2 optaget af blindproevenmg teststof i kolben = mg O2 pr. mg teststof.

% nedbrydning = BOD (mg O2 pr. mg teststof) ThOD (mg O2 pr. mg teststof) × 100

eller

% nedbrydning = BOD (mg O2 pr. mg teststof) COD (mg O2 pr. mg teststof) × 100

Det bemaerkes, at de to metoder ikke noedvendigvis giver samme resultat; foerstnaevnte metode foretraekkes.

Der benyttes den ThOD (NH4 eller NO3), der svarer til det foreliggende kendskab til nitrifikation (bilag II.2). Sker der ufuldstaendig nitrifikation beregnes korrektionen for oxygenforbruget til nitrifikationen ud fra aendringerne i nitrit- og nitratkoncentrationen (bilag V).

VI.3.2. Resultaternes gyldighed

Inoculumblindproevens oxygentab boer ikke vaere stoerre end 1,5 mg oploest oxygen pr. liter efter 28 dage. Findes der hoejere vaerdier, maa forsoegsteknikkerne gennemgaas kritisk. Restkoncentrationen af oxygen i testkolberne maa ikke falde til under 0,5 mg/l paa noget tidspunkt. Maalinger af saa lavt oxygenindhold er kun gyldige, hvis den anvendte maalemetode for oploest oxygen tillader noejagtig maaling af saa lave indhold.

Se ogsaa I.5.2.

VI.3.3. Rapportering

Se I.8.

VI.4. RESULTATSKEMA

Nedenfor er vist et eksempel paa et resultatskema.

CLOSED BOTTLE TEST

1. LABORATORIUM

2. DATO VED TESTENS BEGYNDELSE

3. TESTSTOF

Navn

Stamoploesningens koncentration: ... mg/l

Begyndelseskoncentration i kolbe: ... mg/l

ThOD eller COD: ... mg O2/mg teststof

4. INOCULUM

Kilde: ...

Behandling: ...

Eventuel forkonditionering: ...

Koncentrationen i reaktionsblandingen: ... ml/l

5. DO-BESTEMMELSE

Metode: Winkler/elektrode

>TABELPOSITION>

6. KORREKTION FOR NITRIFIKATION (se bilag V)

>TABELPOSITION>

7. TAB AF DO: % NEDBRYDNING

>TABELPOSITION>

mto = vaerdi i testkolbe til tid 0

mtx = vaerdi i testkolbe til tid x

mbo = gennemsnitsblindvaerdi til tid 0

mbx = gennemsnitsblindvaerdi til tid x

Der foretages desuden korrektion for nitrifikation som beregnet i punkt 6.

8. BLINDPROEVER FOR TAB AF DO

Oxygenforbrug i blindproeve: (mb0 mb28) mg/l. Dette forbrug har betydning for testens gyldighed og maa hoejst vaere 1,5 mg/l.

DEL VII. MITI-TEST (Metode C.4-F)

VII.1. METODENS PRINCIP

Oxygenoptagelsen i en omroert oploesning eller opslaemning af teststoffet i uorganisk medium, som er tilsat inoculum i form af saerligt dyrkede ikke-tilvaennede mikroorganismer, maales automatisk gennem en periode paa 28 dage i et moerklagt lukket respirometer ved 25 ± 1 C. Den udviklede kuldioxid absorberes i natriumhydroxid. Bionedbrydeligheden udtrykkes som den optagne oxygenmaengde (korrigeret for blindproevens optagelse) i procent af den teoretiske oxygenoptagelse (ThOD). Ogsaa den procentvise primaere bionedbrydelighed beregnes, nemlig paa grundlag af supplerende specifikke kemiske analyser ved inkuberingens begyndelse og slutning og eventuelt ved DOC-analyse.

VII.2. BESKRIVELSE AF METODEN

VII.2.1. Apparatur

a) Automatisk elektrolytisk BOD-meter eller respirometer, normalt med 6 kolber paa hver 300 ml og med skaale til CO2-absorptionsmiddel

b) Lokale med konstant temperatur og/eller vandbad paa 25 ± 1 C eller mindre

c) Membranfiltreringsudstyr (valgfrit)

d) Kulstofanalysator (valgfri).

VII.2.2. Fremstilling af uorganisk medium

Foelgende stamoploesninger fremstilles ud fra reagenser af analysekvalitet og vand (I.6.1.)

(a) monokaliumdihydrogenorthophosphat, KH2PO4 8,50 g

dikaliummonohydrogenorthophosphat, K2HPO4 21,75 g

dinatriummonohydrogenorthophosphat dodecahydrat, Na2HPO4 7 12 H2O 44,60 g

ammoniumchlorid, NH4Cl 1,70 g

Oploeses i vand og fortyndes til 1 liter.

Oploesningens pH skal vaere 7,2.

(b) magnesiumsulfat heptahydrat, MgSO4 7 7 H2O 22,50 g

Oploeses i vand og fortyndes til 1 liter.

(c) calciumchlorid, vandfrit, CaCl2 27,50 g

Oploeses i vand og fortyndes til 1 liter.

(d) jern(III)chlorid hexahydrat, FeCl3 7 6 H2O 0,25 g

Oploeses i vand og fortyndes til 1 liter.

Der udtages 3 ml af oploesning (a), (b), (c) og (d), som fortyndes til 1 liter.

VII.2.3. Fremstilling af inoculum

Der indsamles friske proever fra mindst 10 lokaliteter, hovedsagelig omraader, hvor der anvendes og udledes forskellige kemikalier. Fra saadanne lokaliteter som spildevandsanlaeg, vandloeb, soeer og havomraader indsamles 1-liters proever af slam, overfladejord, vand, m.v., og det hele blandes grundigt. Materiale, der flyder ovenpaa, fjernes, og efter henstand indstilles supernatantens pH til 7 ± 1 med natriumhydroxid og phosphorsyre.

Der benyttes en passende maengde filtrat til at fylde en »fill-and-draw« aktiv slambeholder, og vaesken beluftes i ca. 231/2 time. 30 minutter efter at beluftningen er standset, borthaeldes ca. 1/3 af det samlede supernatantvolumen, og der tilsaettes en lige saa stor maengde af en oploesning (med pH 7), der indeholder 0,1 % glucose, 0,1 % pepton og 0,1 % monokaliumorthophosphat, og beluftningen genoptages. Dette gentages hver dag. Slamenheden drives efter god praksis: afloebsvandet skal vaere klart, temperaturen skal holdes paa 25 ± 2 C, pH skal vaere 7 ± 1, slam skal bundfaeldes godt, tilstraekkelig beluftning skal opretholdes for at holde blandingen aerob hele tiden, protozoer skal vaere til stede og slamaktiviteten skal testes mod referencestoffet mindst hver tredje maaned. Slammet maa tidligst anvendes som inoculum efter en maaneds drift og ikke senere end efter fire maaneders drift. Derefter udtages der regelmaessigt proever fra mindst 10 lokaliteter hver tredje maaned.

For at holde det friske og det gamle slam paa samme aktivitet, blandes den filtrerede supernatant fra aktivt slam i brug med en lige saa stor maengde filtreret supernatant fra en frisk indsamlet blanding fra 10 kilder, og denne vaeske opdyrkes som ovenfor naevnt. 18-24 timer efter at enheden er fyldt op, kan der udtages slam til brug som inoculum.

VII.2.4. Klargoering af kolber

Der klargoeres 6 kolber som foelger

nr. 1: teststof i fortyndingsvand, 100 mg/l

nr. 2, 3 og 4: teststof fortyndet med uorganisk medium til 100 mg/l

nr. 5: referencestof (f.eks. anilin) fortyndet med uorganisk medium til 100 mg/l

nr. 6: rent uorganisk medium

Tungtoploeselige teststoffer tilsaettes direkte paa vaegt- eller volumenbasis eller haandteres som beskrevet i bilag III, bortset fra, at der hverken maa benyttes oploesningsmidler eller emulgatorer. Der anbringes CO2-absorptionsmiddel i alle kolber i den saerlige skaal. pH i kolbe nr. 2, 3 og 4 justeres til 7,0.

VII.2.5. Gennemfoerelse af testen

Der tilsaettes en lille maengde inoculum til kolbe nr. 2, 3 og 4 (testopslaemninger), nr. 5 (aktivitetskontrol) og nr. 6 (inoculumblindproeve), saaledes at koncentrationen af opslaemmet toerstof bliver paa 30 mg/l. Der tilsaettes ikke inoculum til kolbe nr. 1, der tjener som abiotisk kontrol. Udstyret samles, der kontrolleres for lufttaethed, omroererne startes, og oxygenoptagelsesmaalingen startes i moerke. Temperaturen, omroeringen og den coulometriske oxygenoptagelsesskriver kontrolleres dagligt, og eventuelle farveaendringer i kolberne noteres. Oxygenoptagelsen i de 6 kolber aflaeses direkte v.h.a. en passende metode, f.eks. paa sekskanalsskriveren, som giver en BOD-kurve. Ved inkuberingens afslutning, normalt efter 28 dage, maales pH i kolberne, og koncentrationen af resterende teststof og af eventuelle mellemprodukter og, naar der er tale om vandoploeselige stoffer, eventuelt DOC-koncentrationen bestemmes (bilag II.4). Der maa udvises saerlig omhu, naar der er tale om flygtige kemikalier. Forventes der nitrifikation, bestemmes om muligt nitrat- og nitritkoncentrationen.

VII.3. DATA OG RAPPORTERING

VII.3.1. Behandling af resultaterne

Teststoffets oxygenforbrug (mg) efter et givet tidsrum, korrigeret for oxygenoptagelsen i inoculumblindproeven efter samme tidsrum, divideres med den anvendte vaegtmaengde teststof. Herved fremkommer BOD udtrykt som mg oxygen pr. mg teststof, dvs.

BOD = mg O2 optaget af teststoffet mg O2 optaget af blindproevenmg teststof i kolben = mg O2 pr. mg teststof.

Den procentvise bionedbrydning fremkommer af

% bionedbrydning = % ThOD = BOD (mg O2 pr.mg kemikalie) ThOD (mg O2 pr. mg kemikalie) × 100

For blandinger beregnes ThOD paa samme maade som for enkeltstoffer, nemlig paa grundlag af grundstofanalysen. Den ThOD, der benyttes, (ThODNH4 eller ThODNO3) afhaenger af, om der slet ikke sker nitrifikation eller der sker fuldstaendig nitrifikation (bilag II.2). Sker der ufuldstaendig nitrifikation beregnes korrektionen for oxygenforbruget til nitrifikationen ud fra aendringerne i nitrit- og nitratkoncentrationen (bilag V).

Den procentvise primaere bionedbrydning beregnes ud fra den maengde af det specifikke (oprindelige) kemikalie, der forsvinder (se I.7,2).

Dt = Sb SaSb × 100 %

Er der forsvundet teststof i kolbe nr. 1, som maaler fysisk og kemisk nedbrydning, anfoeres dette, og teststoffets koncentration (Sb) i denne kolbe efter 28 dage benyttes til beregning af den procentvise bionedbrydning.

Foretages der (valgfrie) bestemmelser af DOC, beregnes den procentvise fuldstaendige bionedbrydning ved

Dt = 1 Ct Cbt C0 Cb0 × 100

som anfoert under punkt I.7.1. Er der forsvundet teststof (DOC) i kolbe nr. 1, som maaler fysisk og kemisk nedbrydning, benyttes DOC-koncentrationen i denne kolbe til beregning af den procentvise bionedbrydning.

Alle resultater noteres paa de tilhoerende skemaer.

VII.3.2. Resultaternes gyldighed

Inoculumblindproevens oxygenforbrug er normalt 20-30 mg O2/l paa 28 dage og boer ikke vaere stoerre end 60 mg/l. Findes der vaerdier over 60 mg/l, maa data og forsoegsteknikker gennemgaas kritisk. Hvis pH ligger uden for intervallet 6-8,5 og teststoffets oxygenforbrug er mindre end 60 %, gentages testen med lavere teststofkoncentration.

Se ogsaa I.5.2.

Hvis den procentvise nedbrydning af anilin beregnet ud fra oxygenforbrug ikke er stoerre end 40 % efter 7 dage og 65 % efter 14 dage, anses testen for ugyldig.

VII.3.3. Rapportering

Se I.8.

VII.4. RESULTATSKEMA

Nedenfor er vist et eksempel paa et resultatskema.

MITI (I) TEST

1. LABORATORIUM

2. DATO VED TESTENS BEGYNDELSE

3. TESTSTOF

Navn

Stamoploesningens koncentration: ... mg/l stof

Begyndelseskoncentration i kolbe, Co: ... mg/l stof

Reaktions blandingens volumen, V: ... ml

ThOD eller COD: ... mg O2/l

4. INOCULUM

Lokaliteter for proeveudtagning

1) ...

2) ...

3) ...

4) ...

5) ...

6) ...

7) ...

8) ...

9) ...

10) ...

Koncentration af opslaemmet toerstof i det aktive slam efter akklimatisering med syntetisk spildevand: ... mg/l

Rumfang af aktivt slam pr. liter slutmedium: ... ml

Slamkoncentration i slutmedium: mg/l

5. OXYGENOPTAGELSE: BIONEDBRYDELIGHED

Respirometertype

>TABELPOSITION>

6. KULSTOFANALYSE (valgfri)

Kulstofanalysator

>TABELPOSITION>

% DOC forsvundet: a (b c)a × 100

7. DATA FRA SPECIFIK KEMISK ANALYSE

>TABELPOSITION>

% nedbrydning = Sb SaSb × 100

% nedbrydning beregnes for kolbe a1, a2 og a3.

8. BEMAERKNINGER

En kurve over BOD mod tiden skal vedlaegges, hvis den foreligger.

BILAG I

FORKORTELSER OG DEFINITIONER

DO: Oploest oxygen (mg/l) er koncentrationen af oploest oxygen i en vandig proeve.

BOD: Biokemisk oxygenforbrug (g) er den maengde oxygen, som mikroorganismer forbruger under metabolisme af teststoffet; udtrykkes ogsaa i g optaget oxygen pr. g teststof (se metode C.5).

COD: Kemisk oxygenforbrug (g) er den maengde oxygen, der forbruges ved oxidation af teststoffet med varm dichromat i sur vaeske; det er et maal for den tilstedevaerende maengde oxiderbart stof; udtrykkes ogsaa i g forbrugt oxygen pr. g teststof (se metode C.6).

DOC: Oploest organisk kulstof er den maengde organisk kulstof, der er til stede i oploesning, passerer gennem et 0,45 ìm filter, eller forbliver i centrifugatet efter centrifugering ved 40 000 ms 2 (± 4 000 g) i 15 minutter.

ThOD: Teoretisk oxygenforbrug (mg) er den samlede maengde oxygen, der kraeves til fuldstaendig oxidation af et kemisk stof; det beregnes paa grundlag af bruttoformlen (se bilag II, punkt 2) og udtrykkes ogsaa i mg oxygen pr. mg teststof.

ThCO2: Teoretisk kuldioxid (mg) er den maengde kuldioxid, der ifoelge beregninger paa grundlag af teststoffets kendte eller maalte kulstofindhold skulle dannes ved fuldstaendig nedbrydning af teststoffet; den udtrykkes ogsaa i mg udviklet kuldioxid pr. mg teststof.

TOC: En proeves totale indhold af organisk kulstof er summen af organisk kulstof i oploesning og i opslaemning.

IC: Uorganisk kulstof

TC: En proeves totale kulstofindhold er summen af organisk og uorganisk kulstof.

Primaer bionedbrydning

er en saadan aendring af et stofs kemiske struktur, fremkaldt ad biologisk vej, at stoffet mister sine specifikke egenskaber.

Fuldstaendig bionedbrydning (aerob)

er den nedbrydningsgrad, der er naaet, naar mikroorganismer har opbrugt et teststof fuldstaendigt under samtidig dannelse af kuldioxid, vand, uorganiske salte og nye cellebestanddele (biomasse).

Let bionedbrydelig

kendetegner en arbitraer klasse af kemikalier, der har klaret visse specifikke screeningstests for fuldstaendig bionedbrydning; disse tests er saa kraevende, at saadanne stoffer i vandigt miljoe under aerobe forhold hurtigt vil blive fuldstaendigt nedbrudt.

Inherent (potentielt) bionedbrydelig

karakteriserer en klasse af kemikalier, som ved enhver anerkendt bionedbrydelighedstest klart har vist sig at kunne omdannes ved bionedbrydning (primaer eller fuldstaendig).

Behandlingsmulighed

er muligheden for at fjerne et stof ved biologisk spildevandsrensning uden at spildevandsrensningsprocessernes normale forloeb forstyrres. Generelt er alle let bionedbrydelige, men ikke alle inherent bionedbrydelige, stoffer mulige at behandle. Abiotiske processer kan ogsaa spille ind.

Lag-periode

er det tidsrum, der i en elimineringstest forloeber fra inokuleringen, indtil nedbrydningsprocenten er mindst 10 %. Lag-perioden er ofte staerkt varierende og vanskeligt reproducerbar.

Nedbrydningstid

er tidsrummet mellem lagperiodens afslutning og det tidspunkt, hvor nedbrydningen har naaet 90 % af sin maksimale vaerdi.

10-dages vindue

er den periode paa 10 dage, der begynder, naar nedbrydningen er naaet op paa 10 %.

BILAG II

BEREGNING OG BESTEMMELSE AF PASSENDE HOVEDPARAMETRE

Der vil afhaengigt af den valgte metode vaere behov for forskellige hovedparametre. I dette afsnit beskrives, hvordan disse vaerdier udledes. Parametrenes anvendelse er beskrevet i de enkelte metoder.

1. Kulstofindhold

Kulstofindholdet kan enten beregnes ud fra teststoffets grundstofsammensaetning eller bestemmes ved elementaranalyse.

2. Teoretisk oxygenforbrug (ThOD)

Det teoretiske oxygenforbrug (ThOD) kan beregnes, hvis grundstofsammensaetningen er kendt, og ellers bestemmes ved elementaranalyse. For forbindelsen

CcHhClclNnNanaOoPpSs

er det uden nitrifikation

ThODNH4 = 16 (2 c + 1/2 (h cl 3 n) + 3 s + 5/2 p + 1/2 na o)MW mg/mg

og med nitrifikation

ThODNO3 = 16 (2 c + 1/2 (h cl) + 5/2 n + 3 s + 5/2 p + 1/2 na o)MW mg/mg

3. Kemisk oxygenforbrug (COD)

Det kemiske oxygenforbrug (COD) bestemmes efter metode C.6.

4. Oploest organisk kulstof (DOC)

Oploest organisk kulstof (DOC) defineres som den organiske kulstofmaengde i et kemikalie eller en kemikalieblanding, som i vandig oploesning kan passere gennem et 0,45 ìm filter.

Der udtages proever fra testbeholderne, som straks filtreres gennem filtreringsudstyret, der er forsynet med et passende membranfilter. De foerste 20 ml af filtratet bortkastes (ved smaa filtre kan denne maengde reduceres). Der opsamles en maengde paa 10 20 ml til kulstofanalyse (ved indsproejtning mindre, afhaengigt af den anvendte kulstofanalysator). DOC-koncentrationen bestemmes ved hjaelp af en organisk kulstofanalysator, som tillader noejagtig bestemmelse af en kulstofkoncentration paa mindre end 10 % af startkoncentrationen af DOC i testen.

Kan filtrerede proever ikke analyseres samme arbejdsdag, kan de opbevares i hoejst 48 timer i koeleskab ved 2-4 C eller i laengere tid ved 18 C.

Anmaerkninger

Membranfiltre er ofte behandlet med overfladeaktive stoffer, saa de bliver mere hydrofile. De kan derfor indeholde op til flere mg oploeseligt organisk kulstof, som vil gribe forstyrrende ind i bionedbrydelighedsbestemmelsen. De overfladeaktive stoffer og andre oploeselige organiske stoffer fjernes fra filtrene ved kogning i demineraliseret vand i 3 gange 1 time. Derefter kan filtrene opbevares i vand i op til 1 uge. Benyttes der engangsfiltre, maa hvert parti kontrolleres for afgivelse af oploeseligt organisk kulstof.

Paa visse typer membranfiltre kan der ske adsorption af teststoffet. Det tilraades derfor at kontrollere, at teststoffet ikke tilbageholdes paa filteret.

Centrifugering ved 40 000 ms 2 (4 000 g) i 15 minutter kan traede i stedet for filtrering, naar der skal skelnes mellem TOC og DOC. Metoden er ikke paalidelig ved en startkoncentration paa TABELPOSITION>

0,05 M borax + 0,1 N NaOH

>TABELPOSITION>