KOMMISSIONENS BESLUTNING af 19. november 1992 om fastlaeggelse af proeveudtagningsplaner og diagnosticeringsmetoder til paavisning og bekraeftelse af bestemte fiskesygdomme (92/532/EOEF)

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets direktiv 91/67/EOEF af 28. januar 1991 om dyresundhedsmaessige betingelser for afsaetning af akvakulturdyr og -produkter (1), saerlig artikel 15, og

ud fra foelgende betragtninger:

Ifoelge artikel 15 i det omtalte direktiv skal der fastlaegges proeveudtagningsplaner og diagnosticeringsmetoder, der skal anvendes til paavisning og bekraeftelse af sygdomme hos akvakulturdyr;

Den Videnskabelige Veterinaerkomité, der blev oprettet ved Kommissionens beslutning 81/651/EOEF (2), er blevet hoert;

de i denne beslutning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den Staaende Veterinaerkomité -

VEDTAGET FOELGENDE BESLUTNING:

Artikel 1

Proeveudtagningsplanerne og diagnosticeringsmetoderne til paavisning og bekraeftelse af infektioes haematopoietisk nekrose (IHN) og egtvedsyge (VHS) er fastlagt i bilaget.

Artikel 2

Denne beslutning er rettet til medlemsstaterne. Udfaerdiget i Bruxelles, den 19. november 1992. Paa Kommissionens vegne

Ray MAC SHARRY

Medlem af Kommissionen

(1) EFT nr. L 46 af 19. 2. 1991, s. 1. (2) EFT nr. L 233 af 19. 8. 1981, s. 32.

BILAG

DEL I

METODER TIL UDTAGNING OG ANALYSE AF PROEVER FOR VHS OG IHN-OVERVAAGNING I. Analyseproever 1. Proevetagningstidspunkt

Brugene kontrolleres klinisk mindst to gange om aaret i perioden fra oktober til juni, eller naar vandtemperaturen er under 14 °C. Der skal gaa mindst fire maaneder mellem kontrolbesoegene. Alle produktionsenheder (damme, tanke, akvarier, netbure m.v.) kontrolleres for tilstedevaerelse af doede og svage fisk eller fisk med unormal adfaerd. Opmaerksomheden skal i saerdeleshed vaere henledt paa vandudledningsomraadet (hvis det kan lade sig goere), hvor de svage fisk har tendens til at samles paa grund af vandstroemmen.

2. Udvaelgelse og indsamling af proever

Der indsamles 30-150 fisk og/eller ovarievaeskeproever til undersoegelse i forbindelse med kontrolbesoeg, jf. tabel 1. Hvis der er regnbueoerred til stede, skal fisk af den art udgoere hele proeven. Hvis der ikke er regnbueoerred til stede, skal proeven indeholde fisk af alle andre tilstedevaerende arter, som er modtagelige for VHS og/eller IHN som anfoert i bilag A til Raadets direktiv 91/67/EOEF om dyresundhedsmaessige betingelser for afsaetning af akvakulturdyr og -produkter. Arterne skal vaere ligeligt repraesenteret i proeven. I den indledende fireaars kontrolperiode, der gaar forud for opnaaelsen af status som godkendt, er proevestoerrelsen 150 for at sikre, at virusbaerere med en forekomst paa 2 % paavises paa et konfidensniveau paa 95 %. I de foelgende aar (bevarelse af godkendelsen) kan proevestoerrelsen reduceres til 30 for at sikre, at virus med en forekomst paa 10 % paavises paa et konfidensniveau paa 95 % (tabel 1B).

Paa akvakulturbrug, der har en dokumenteret fortid med frihed for VHS og IHN (baseret paa et regulaert officielt sundhedskontrolprogram), kan den lille proevestoerrelse ogsaa anvendes i den indledende fireaarige kontrolperiode.

Ved anvendelse af mere end én vandkilde til fiskeproduktion kan der medtages fisk fra alle vandkilder i proeven paa 150 eller 30 fisk. Hvis der forekommer svage fisk, fisk med unormal adfaerd eller nyligt doede fisk (som ikke er gaaet i oploesning), skal disse foerst og fremmest medtages i proeven. Hvis der ikke forekommer saadanne fisk, skal proeven sammensaettes af normalt udseende, sunde fisk, der indsamles paa en saadan maade, at alle dele af akvakulturbruget og alle aargange er repraesenteret i proeven.

3. Forberedelse og forsendelse af fiskeproever

Inden proeverne sendes eller overfoeres til laboratoriet, fjernes stykker af de organer, som skal undersoeges, fra fisken med steril saks og pincet og overfoeres til plastroer indeholdende transportvaeske, dvs. cellekulturvaeske med 10 % kalveserum og antibiotika. En kombination af 200 i.e. penicillin, 200 mg streptomycin og 200 mg kanamycin pr. ml kan anbefales, men andre effektive antibiotika kan ogsaa anvendes. Det vaevsmateriale, som skal undersoeges, er milt, forreste nyre, hjernevaev og i nogle tilfaelde ovarievaeske (tabel 1A og 1B).

Stykker af organerne fra 5-10 fisk (tabel 1A og 1B) kan indsamles i et roer og udgoer en samlet proeve. Vaevet i hver proeve boer veje mindst 1 g, saa slutoploesningen bliver 1: 10.

Roerene anbringes i isolerede beholdere (f.eks. tykvaeggede polystyrenaesker) sammen med tilstraekkeligt med is eller »frostblokke« for at sikre, at proeverne holdes nedkoelet paa mellem 0 og 5 °C under transport til laboratoriet. Frysning maa undgaas.

Den virologiske undersoegelse skal paabegyndes snarest muligt og inden 48 timer efter indsamlingen af proeverne. Hvis den fisk, der skal undersoeges, er under 6 cm lang, kan hele fisken indsendes til laboratoriet i plastpose, der nedkoeles som beskrevet ovenfor.

4. Indsamling af supplerende materiale til diagnosticering

Efter aftale med det paagaeldende diagnostiske laboratorium kan ogsaa andet fiskevaev indsamles og forberedes til supplerende undersoegelser.

II. Forberedelse af proever til virologisk undersoegelse

1. Homogenisering af organer

Paa laboratoriet skal vaevet i roerene homogeniseres fuldstaendigt (enten med stomacher, blender eller morter og pistil) og derefter opslemmes i den oprindelige transportvaeske. Hvis proeven bestaar af hele fisk, dvs. fisk paa under 6 cm, klippes de i stykker med steril saks efter fjernelse af kroppen bag gataabningen, homogeniseres som beskrevet ovenfor og opslemmes i transportvaeske i forholdet 1: 10.

2. Centrifugering af homogenatet

Homogenatet centrifugeres i en koelecentrifuge ved 2-5 °C og 2 000-4 000 × g i 15 minutter, hvorefter den oeverste vaeskefase indsamles til undersoegelse.

Saafremt forsendelsen af proeven er foregaaet i transportvaeske (dvs. tilsat antibiotika), behoever den oeverste vaeskefase ingen yderligere behandling med antibiotika.

Saafremt proeven er indsendt som hele fisk, skal homogenatet efter centrifugeringen genopslemmes i transportvaeske tilsat antibiotika og henstaa enten i 4 timer ved rumtemperatur eller natten over ved 4 °C.

Formaalet med behandlingen med antibiotika er at undgaa bakterieforurening af proeverne og overfloediggoer filtrering gennem membranfiltre.

Umiddelbart efter centrifugeringen blandes noget af supernatanten med en tilsvarende maengde divalent antiserum mod IPN-virus passende fortyndet (referencestammerne Sp og Ab) og inkuberes i mindst 1 time ved 15 °C eller hoejst 18 timer ved 4 °C. Antiserumtiteren skal vaere mindst 1/2 000 i en 50 % pladeneutraliseringsproeve.

Formaalet med at behandle alle podestoffer med antiserum mod IPN-virus (et virus, som i visse dele af Europa forekommer i op til 50 % af alle fiskeproever) er at hindre, at der udvikles CPE som foelge af IPN-virus i podede cellekulturer. Dette vil mindske varigheden af de virologiske undersoegelser og antallet af tilfaelde, hvor forekomst af CPE ellers maatte opfattes som en potentiel indikation for VHS eller IHN.

Naar proeverne kommer fra produktionsenheder, som anses for fri for IPN, kan behandling af podestoffer med antiserum mod IPN-virus undlades.

III. Virologisk undersoegelse

1. Cellekulturer og -vaesker

BF-2 og enten EPC eller FHM celler dyrkes ved 20-25 °C i Eagle's MEM (eller modifikationer heraf) tilsat 10 % foetalt bovint serum og antibiotika i standardkoncentrationer.

Naar cellerne dyrkes i lukkede glas, anvendes bicarbonat som buffer. I vaesker til dyrkning af celler i aabne enheder anvendes som buffer Tris-HCl (23 mM) og Na-bicarbonat (6 mM) med en pH-vaerdi saa naer ved 7,6 som muligt, en pH-vaerdi, som er optimal for virusmultiplikation.

Cellekulturer, som skal anvendes til podning med vaevsmateriale, boer vaere unge (4-48 timer) og vaere i aktiv vaekst (ikke sammenflydende) paa podningstidspunktet.

2. Podning af cellekulturer

En organopslemning behandlet med antibiotika podes paa cellekulturer i to fortyndinger, dvs. primaerfortyndingen og derudover en fortynding heraf paa 1: 10 (for at forhindre homolog interferens). Der foretages podning af mindst to cellelinjer (se III.1). Forholdet mellem podestoffets og cellekulturvaeskens rumfang boer vaere ca. 1: 10.

For hver fortynding og hver cellelinje anvendes et celleomraade paa mindst ca. 2 cm2 svarende til 1 hul paa en cellekulturplade med 24 huller. Det anbefales at anvende cellekulturplader, men andre enheder med tilsvarende eller stoerre vaekstareal kan ogsaa accepteres.

3. Inkubation af cellekulturer

Podede cellekulturer inkuberes ved 15 °C i syv dage. Saafremt cellekulturvaesken aendrer farve fra roed til gul, hvilket er tegn paa forsuring af vaesken, maa pH-vaerdien justeres med steril bicarbonatoploesning eller tilsvarende stoffer for at sikre, at cellematerialet lader sig inficere med virus.

Der gennemfoeres hver sjette maaned en titrering af frosne lagre af VHSV og IHNV for at sikre, at cellekulturerne lader sig inficere.

4. Mikroskopi

Podede cellekulturer undersoeges dagligt for forekomst af CPE ved ca. 40 × forstoerrelse. Konstateres der tydelig CPE, maa der omgaaende ivaerksaettes virusidentifikationsprocedurer som beskrevet i afsnit IV.

Samtidig maa der tages skridt til at suspendere godkendelsen af den produktionsenhed, hvorfra den viruspositive proeve stammer, saavel som af alle produktionsenheder laengere nede ad samme vandloeb.

Suspensionen af godkendelsesstatus maa opretholdes, indtil laboratorieproever har vist, at det paagaeldende virus ikke er VHSV eller IHNV. Der tillades maksimalt fire uger til identifikation af viruset, heri medregnet den noedvendige tid til undersoegelse paa referencelaboratorier.

5. Dyrkning af subkulturer

Er der ingen udvikling af CPE efter inkubation i syv dage, gennemfoeres der en dyrkning af subkulturer med friske cellekulturer under anvendelse af et celleomraade af samme stoerrelse som primaerkulturens.

Maengder af vaeske fra alle kulturer/huller, som udgoer primaerkulturen, samles pr. cellelinje efter én frysning/optoening af kulturerne, og 0,5 ml af vaesken blandes med en tilsvarende maengde antiserum mod IPN-virus som beskrevet i afsnit II.2, og blandingen inkuberes ved 15 °C i 60 minutter. Blandingen podes derefter paa homologe cellekulturer i fortyndinger paa 1: 1 og 1: 100 som beskrevet i afsnit III.2. Forud for podningen kan der foretages en inkubation af fortyndingerne med divalent antiserum mod IPN-virus i en passende fortynding.

De podede kulturer inkuberes derefter i syv doegn ved 15 °C og observeres som beskrevet i afsnit III.4.

IV. Virusidentifikation

1. Neutralisation

Er der konstateret tegn paa CPE i en cellekultur, indsamles vaesken, cellerne fjernes ved langsom centrifugering eller membranfiltrering (0,45 mm), og vaesken fortyndes 1: 100 og 1: 10 000 i cellekulturvaeske.

Maengder af fortyndingerne blandes og inkuberes i 60 minutter ved 15 °C med lige dele af foelgende reagenser hver for sig:

- Gruppespecifikt antistof mod VHSV (Egtved-virus) 1: 50 * - gruppespecifikt antistof mod infektioes haematopoietisk nekrose-virus (IHNV) 1: 50 * - specifikt divalent antiserum mod infektioes pankreasnekrose-virus (IPNV) (referencestammer Sp og Ab) 1: 50 * - vaeske 1: 1

* eller som angivet af referencelaboratoriet med sigte til antiseraenes eventuelle cytotoksicitet.

Reagenserne skal vaere af referencekvalitet med hensyn til titer og specificitet.

Fra hver virus-serum-blanding podes mindst to cellekulturer med 50 ml hver og inkuberes derefter ved 15 °C. Der checkes for CPE-udvikling som beskrevet i afsnit III.4.

Giver proeven ikke mulighed for sikker identifikation af viruset inden for en uge, maa man tage et af foelgende skridt:

a) overfoere viruset til et nationalt referencelaboratorium for fiskevirus med henblik paa omgaaende identifikation;

b) anvende IFAT (afsnit IV.2), ELISA (afsnit IV.3) eller andre virusidentifikationsmetoder med reagenser af referencekvalitet.

2. Immunofluorescens (IFAT)

Til identifikation af hvert enkelt virusisolat udstryges der EPC-celler paa mindst otte daekglas eller lignende i en taethed, som foerer til ca. 60-90 % sammenflydning efter 24 timers dyrkning. Der vaelges EPC-celler til dette formaal, fordi de klaeber staerkt til glasoverflader.

Naar cellerne har sat sig paa glasoverfladen (ca. 1 time efter udstrygningen), eller naar kulturerne er blevet inkuberet i op til 24 timer, podes det virus, der skal identificeres. Fire kulturer podes i forholdet 1: 10 (v/v), og fire kulturer i forholdet 1: 100.

Mellem 20 og 30 timer efter podningen skylles kulturerne to gange i Eagle's MEM uden serum, fikseres i acetone og farves derefter ved hjaelp af et tolags-IFAT. Det foerste reagenslag bestaar af godkendt antiserum (som i afsnit IV.1). Det andet reagenslag er et FITC-konjugeret antiserum mod immunoglobulinet i det foerste lag. For hver af de testede antisera skal der farves mindst én hoejdosis- og én lavdosispodet kultur. Proeven skal omfatte en passende negativ og positiv kontrol.

De farvede kulturer praepareres med glycerolsaltoploesning. De undersoeges under indfaldende UV-lys. Der anvendes okularer, der forstoerrer 10 × eller 12 ×, og × 25- eller ×40-objektiver, med en blaende paa henholdsvis > 0,7 og > 1,3. Fortyndingerne af primaert antiserum og FITC-konjugeret antiserum mod immunoglobulinet afhaenger af den valgte eller disponible mikroskopopstilling.

Nogle stammer af Egtved-virus reagerer kraftigt med antiserum mod referencestammer F1 i IFAT, selv om de ikke reagerer i neutralisationsproever.

3. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)

Hullerne i mikrotiterplader (f.eks. Nunc-immunoplader, Maxisorp, Nunc, Danmark) daekkes natten over med anbefalede fortyndinger af protein-A-rensede immunoglobulinfraktioner af de i afsnit IV.1 naevnte antisera.

Efter skylning af hullerne med PBS-Tween-20 buffer tilsaettes det virus, som skal identificeres, til hullerne i to- eller firefoldsfortyndingstrin, og man lader det reagere med antistofbelaegningen i 60 minutter ved 37 °C. Efter skylning med PBS-Tween-20 buffer tilsaettes biotinylerede antistoffer af en specifitet svarende til specifiteten af antistofbelaegningen, og man lader dem reagere i 60 minutter ved 20 °C. Efter endnu en skylning som ovenfor tilsaettes HRP-konjugeret streptavidin, som man lader reagere i 1 time ved 20 °C. Efter en sidste skylning goeres bundet enzym synligt ved anvendelse af passende ELISA-substrater (OPD, TBM eller andre).

Ovennaevnte biotin-/avidin-baserede ELISA-version gives som et eksempel. Der kan anvendes andre effektive ELISA-versioner i stedet.

Tabel 1 A

Opnaaelse af status

Antal kliniske undersoegelser om aaret Undersoegelse af organer - antal fisk Undersoegelse af ovarievaeske - antal fisk Kontinentalzoner: a) Brug med avlsbestand 2 120 (1.)

150 (2.) 30 (1.)

0 b) Brug udelukkende med avlsbestand 2 0 150 (1. og 2.) c) Brug uden avlsbestand 2 150 (1. og 2.) 0 Kystzoner: a) Brug uden avlsbestand 2 30 (1. og 2.) 0 b) Brug med avlsbestand 2 120 (1.)

150 (2.) 30 (1.)

0

Maksimalt antal fisk pr. samleproeve: 5

Tabel 1 B

Bevarelse af status

Antal kliniske undersoegelser om aaret Undersoegelse af organer - antal fisk Undersoegelse af ovarievaeske - antal fisk Kontinentalzoner: a) Brug med avlsbestand 2 15 (1. el. 2.) 15 (1. el 2.) b) Brug udelukkende med avlsbestand 2 0 30 (1. el 2.) c) Brug uden avlsbestand 2 30 (1. el 2.) 0 Kystzoner: a) Brug uden avlsbestand 1 30 (1) (1. el 2.) 0 b) Brug med avlsbestand 2 0 30 (1. el. 2.)

Maksimalt antal fisk pr. samleproeve: 10

(1) Proeverne skal indsamles fra maaned 2 til 6 efter overfoersel af fisk fra ferskvand til saltvand.

DEL II

DIAGNOSTICERINGSMETODER TIL BEKRAEFTELSE AF IHN OG VHS VED MISTANKE OM UDBRUD

IHN og VHS kan diagnosticeres ved hjaelp af en af foelgende metoder:

- A. Konventionel virusisolering med efterfoelgende serologisk virusidentifikation

- B. Virusisolering med samtidig serologisk virusidentifikation

- C. Hurtige diagnosticeringsmetoder (IFAT, ELISA).

Den foerste diagnosticering af IHN og VHS paa brug i godkendte zoner maa ikke baseres paa metode C alene. Metode A eller B skal ogsaa benyttes.

Det vaevsmateriale, der skal underkastes virologisk undersoegelse, skal i nogle tilfaelde ledsages af supplerende materiale til bakteriologisk, parasitologisk, histologisk eller anden undersoegelse, for at der kan stilles en differentialdiagnose. Materialet boer indsamles efter de af IOE fastsatte metoder. A. Konventionel virusisolering med efterfoelgende serologisk virusidentifikation

A.I.1. Udvaelgelse af proever Der udvaelges mindst 10 fisk med typiske tegn paa IHN eller VHS til undersoegelse. A.I.2. Forberedelse og forsendelse af fiskeproever Inden proeverne sendes eller overfoeres til laboratoriet, fjernes stykker af de organer, som skal undersoeges, fra fisken med steril saks og pincet og overfoeres til plastroer indeholdende transportvaeske, dvs. cellekulturvaeske med 10 % kalveserum og antibiotika. En kombination af 200 i.e. penicillin, 200 mg streptomycin og 200 mg kanamycin pr. ml kan anbefales, men andre effektive antibiotika kan ogsaa anvendes. De organer, som skal undersoeges, er milt, forreste nyre og hjernevaev. Stykker af organerne fra 5-10 fisk kan indsamles i et roer og udgoer en samlet proeve. Vaevet i hver proeve boer veje mindst 1 g, saa slutfortyndingen bliver ca. 1: 10. Roererne anbringes i isolerede beholdere (f.eks. tykvaeggede polystyrenaesker) sammen med tilstraekkeligt med is eller »frostblokke« for at sikre, at proeverne holdes nedkoelet paa mellem 0 og 5 °C under transport til laboratoriet. Frysningen maa undgaas. Den virologiske undersoegelse skal paabegyndes snarest muligt og inden 48 timer efter indsamlingen af proeverne. Hvis den fisk, der skal undersoeges, er under 6 cm lang, kan hele fisken indsendes til laboratoriet i plastpose, der nedkoeles som beskrevet ovenfor. A.I.3. Indsamling af supplerende materiale til diagnosticering Efter aftale med det paagaeldende diagnostiske laboratorium kan ogsaa andet fiskevaev indsamles og forberedes til supplerende undersoegelser. A.II.1. Homogenisering af organer Paa laboratoriet skal vaevet i roererne homogeniseres fuldstaendigt (enten med stomacher, blender eller morter og pistil) og derefter opslemmes i den oprindelige transportvaeske. Hvis proeven bestaar af hele fisk, dvs. fisk paa under seks cm, klippes de i stykker med steril saks efter fjernelse af kroppen bag gataabningen, homogeniseres som beskrevet ovenfor og opslemmes i transportvaeske i forholdet 1: 10. A.II.2. Centrifugering af homogenatet Homogenatet centrifugeres i en koelecentrifuge ved 2-5 °C og 2 000-4 000 × g i 15 minutter, hvorefter den oeverste vaeskefase indsamles til undersoegelse. Saafremt forsendelsen af proeven er foregaaet i transportvaeske (dvs. tilsat antibiotika), behoever den oeverste vaeskefase ingen yderligere behandling med antibiotika. Saafremt proeven er indsendt som hele fisk, skal homogenatet efter centrifugeringen genopslemmes i transportvaeske tilsat antibiotika og henstaa enten i fire timer ved rumtemperatur eller natten over ved 4 °C. Behandlingen med antibiotika tager sigte paa at undgaa bakterieforureningen af proeverne og overfloediggoer filtrering gennem membranfiltre. Umiddelbart efter centrifugeringen blandes en maengde af den oeverste vaeskefase med en tilsvarende maengde divalent antiserum mod IPN-virus fortyndet passende (referencestammerne Sp og Ab) og inkuberes i mindst 1 time ved 15 °C eller hoejst 18 timer ved 4 °C. Antiserumtiteren skal vaere mindst 1/2000 i en 50 % pladeneutraliseringsproeve. Formaalet med at behandle alle podestoffer med antiserum mod IPN-virus (et virus, som i visse dele af Europa forekommer i op til 50 % af alle fiskeproever) er at hindre, at der udvikles CPE som foelge af IPN-virus i podede cellekulturer. Dette vil mindske varigheden af de virologiske undersoegelser og antallet af tilfaelde, hvor forekomst af CPE ellers maatte opfattes som en potentiel indikation for VHS eller IHN. Naar proeverne kommer fra produktionsenheder, som anses for fri for IPN, kan behandling af podestoffer med antiserum mod IPN-virus undlades. A.III.1. Cellekulturer og -vaesker BF-2 og enten EPC eller FHM celler dyrkes ved 20-25 °C i Eagle's MEM (eller modifikationer heraf) tilsat 10 % foetalt bovint serum og antibiotika i standardkoncentrationer. Naar cellerne dyrkes i lukkede glas, anvendes bicarbonat som buffer. I vaesker til dyrkning af celler i aabne enheder anvendes som buffer Tris-HCl (23 mM) og bicarbonat (6 mM) med en pH-vaerdi saa naer ved 7,6 som muligt, en pH-vaerdi, som er optimal for virusmultiplikation. Cellekulturer, som skal anvendes til podning med vaevsmateriale, boer vaere unge (4-48 timer) og vaere i aktiv vaekst (ikke sammenflydende) paa podningstidspunktet. A.III.2. Podning af cellekulturer En organopslemning behandlet med antibiotika podes paa cellekulturer i to fortyndinger, dvs. primaerfortyndingen og derudover en fortydning heraf paa 1: 100 (for at forhindre homolog interferens). Der foretages podning af mindst to cellelinjer (se A.III.1). Forholdet mellem podestoffets og cellekulturvaeskens rumfang boer vaere ca. 1: 10. For hver fortynding og hver cellelinje anvendes et celleomraade paa mindst ca. 2 cm2 svarende til 1 hul paa en cellekulturplade med 24 huller. Det anbefales at anvende cellekulturplader, men andre enheder med tilsvarende eller stoerre vaekstareal kan ogsaa accepteres.

A.III.3. Inkubation af cellekulturer Podede cellekulturer inkuberes ved 15 °C i syv dage. Saafremt cellekulturvaesken aendrer farve fra roed til gul, hvilket er tegn paa en forsuring af vaesken, maa pH-vaerdien justeres med en steril bicarbonatoploesning eller tilsvarende stoffer for at sikre, at cellematerialet lader sig inficere med virus. Der gennemfoeres hver sjette maaned en titrering af frosne lagre af VHSV og IHNV for at sikre, at cellekulturerne lader sig inficere. A.III.4. Mikroskopi Podede cellekulturer undersoeges dagligt for forekomst af CPE ved ca. 40 × forstoerrelse. Konstateres der tydelig CPE, maa der omgaaende ivaerksaettes virusidentifikationsprocedurer som beskrevet i afsnit A.IV. Samtidig maa der tages skridt til at suspendere godkendelsen af den produktionsenhed, hvorfra den viruspositive proeve stammer, saavel som af alle produktionsenheder laengere nede ad samme vandloeb. Suspensionen af godkendelsesstatus maa opretholdes, indtil laboratorieproever har vist, at det paagaeldende virus ikke er VHSV eller IHNV. Der tillades maksimalt 4 uger til identifikation af viruset, heri medregnet den noedvendige tid til undersoegelse paa referencelaboratorier. A.III.5. Dyrkning af subkulturer Er der ingen udvikling af CPE efter inkubation i syv dage, gennemfoeres der en dyrkning af subkulturer med friske cellekulturer under anvendelse af et celleomraade af samme stoerrelse som primaerkulturens. Maengder af vaeske fra alle kulturer/huller, som udgoer primaerkulturen, samles alt efter cellelinje efter én frysning/optoening af kulturerne, og 0,5 ml af vaesken blandes med en tilsvarende maengde antiserum mod IPN-virus som beskrevet i afsnit A.II.2, og blandingen inkuberes ved 15 °C i 60 minutter. Blandingen podes derefter paa cellekulturer i fortyndinger paa 1: 1 og 1: 100 som beskrevet i afsnit A.III.2. Forud for podningen kan der foretages en inkubation af fortyndingerne med divalent antiserum mod IPN-virus i en passende fortynding. De podede kulturer inkuberes derefter i syv doegn ved 15 °C og observeres som beskrevet i afsnit A.III.4. A.IV.1. Neutralisation Er der konstateret tegn paa CPE i en cellekultur, indsamles vaesken, cellerne fjernes ved langsom centrifugering eller membranfiltrering (0,45 mm) og vaesken fortyndes 1: 100 og 1: 10 000 i cellekulturvaeske. Maengder af fortyndingerne blandes og inkuberes i 60 minutter ved 15 °C med lige dele af foelgende reagenser hver for sig: - gruppespecifikt antistof mod VHSV (Egtved-virus) 1: 50 * - gruppespecifikt antistof mod infektioes haematopoietisk nekrose-virus (IHNV) 1: 50 * - specifikt divalent antiserum mod infektioes pankreasnekrose-virus (IPNV) (referencestammer Sp og Ab) 1: 50 * - vaeske 1: 1 * eller som angivet af referencelaboratoriet med sigte til antiseraenes eventuelle cytotoksicitet. Reagenserne skal vaere af referencekvalitet med hensyn til titer og specificitet. Fra hver virus-/serumblanding podes mindst to cellekulturer med 50 ml hver og inkuberes derefter ved 15 °C. Der checkes for CPE-udvikling som beskrevet i afsnit A.III.4. Giver proeven ikke mulighed for sikker identifikation af viruset inden for en uge, maa man tage et af foelgende skridt: a) overfoere viruset til et nationalt referencelaboratorium for fiskevirus med henblik paa omgaaende identifikation b) anvende IFAT (afsnit A.IV.2), ELISA (afsnit A.IV.3) eller andre virusidentifikationsmetoder med reagenser af referencekvalitet. A.IV.2. Immunofluorescens (IFAT) Til identifikation af hvert enkelt virusisolat udstryges der EPC-celler paa mindst otte daekglas eller lignende i en taethed, som foerer til ca. 60-90 % sammenflydning efter 24 timers dyrkning. Der vaelges EPC-celler til dette formaal, fordi de klaeber staerkt til glasoverflader. Naar cellerne har sat sig paa glasoverfladen (ca. 1 time efter udstrygningen), eller naar kulturerne er blevet inkuberet i op til 24 timer, podes det virus, der skal identificeres. Fire kulturer podes i forholdet 1: 10 (v/v), og fire kulturer i forholdet 1: 100. Mellem 20 og 30 timer efter podningen skylles kulturerne to gange i Eagle's MEM uden serum, fikseres i acetone og farves derefter ved hjaelp af et tolags-IFAT. Det foerste reagenslag bestaar af godkendt antiserum (som i afsnit IV.1). Det andet reagenslag er et FITC-konjugeret antiserum mod immunoglobulinet i det foerste lag. For hver af de testede antisera skal der farves mindst én hoejdosis- og én lavdosis-podet kultur. Proeven skal omfatte en passende negativ og positiv kontrol. De farvede kulturer praepareres med glycerolsaltoploesning. De undersoeges under indfaldende UV-lys. Der anvendes okularer, der forstoerrer 10 × eller 12 ×, og × 25- eller × 40-objektiver med en blaende paa henholdsvis > 0,7 og > 1,3. Fortyndingerne af primaert antiserum og FITC-konjugeret antiserum mod immunoglobulinet afhaenger af den valgte eller disponible mikroskopopstilling. Nogle stammer af Egtved-virus reagerer kraftigt med antiserum mod referencestamme F1 i IFAT, selv om de ikke reagerer i neutralisationsproever. A.IV.3. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) Hullerne i mikrotiterplader (f.eks. Nunc-immunoplader, Maxisorp, Nunc, Danmark) daekkes natten over med anbefalede fortyndinger af protein-A-rensede immunoglobulinfraktioner af de i afsnit A.IV.1 naevnte antisera. Efter skylning af hullerne med PBS-Tween-20 buffer tilsaettes det virus, som skal identificeres, til hullerne i to- eller firefoldsfortyndingstrin, og man lader det reagere med antistofbelaegningen i 60 minutter ved 37 °C. Efter skylning med PBS-Tween-20 buffer tilsaettes biotinylerede antistoffer af en specificitet svarende til specifiteten af antistofbelaegningen, og man lader dem reagere i 60 minutter ved 20 °C. Efter endnu en skylning som ovenfor tilsaettes HRP-konjugeret streptavidin, som man lader reagere i 1 time ved 20 °C. Efter en sidste skylning goeres bundet enzym synligt ved anvendelse af passende ELISA-substrater (OPD, TBM eller andre). Ovennaevnte biotin-avidin-baserede ELISA-version gives som et eksempel. Der kan anvendes andre effektive ELISA-versioner i stedet.

B. Virusisolering med samtidig serologisk virusidentifikation

B.I.1. Udvaelgelse af proever Som A.I.1. B.I.2. Forberedelse og forsendelse af fiskeproever Som A.I.2. B.II.1. Homogenisering af organer Som A.II.1. B.II.2. Centrifugering af homogenatet Som A.II.2. B.II.3. Behandling af oeverste vaeskefase med diagnostiske antisera Organopslemningen, der er behandlet med antibiotika og anti-IPN, fortyndes 1: 10 og 1: 10 000 i cellekulturvaeske, og maengder blandes og inkuberes i 60 minutter ved 15 °C med lige dele af de i afsnit 1.IV.1 naevnte reagenser. B.III.1. Cellekulturer og -vaesker Som A.III.1. B.III.2. Podning af cellekulturer Fra hver virus-/serumblanding (tilberedt efter B.II.3) podes mindst 2 cellekulturer pr. cellelinje med 50 ml hver. B.III.3. Inkubation af cellekulturer Som A.III.3. B.III.4. Mikroskopi Podede cellekulturer undersoeges dagligt for forekomst af CPE ved ca. 40 × forstoerrelse. Hvis et af de benyttede antisera forhindrer udvikling af CPE, kan viruset hermed identificeres. Hvis ingen af antiseraene forhindrer udvikling af CPE, maa en af de i A.IV naevnte fremgangsmaader anvendes. B.III.5. Dyrkning af subkulturer Er der ingen udvikling af CPE efter 7 dage, gennemfoeres der en dyrkning af subkulturer ud fra kulturer podet med oeverste vaeskefase plus vaeske (B.II.3).

C. Hurtige diagnosticeringsmetoder (IFAT, ELISA) Supernatant fremstillet som beskrevet i A.II.2 analyseres ved hjaelp af IFAT eller ELISA efter henholdsvis A.IV.2 og A.IV.3. Disse hurtige metoder maa suppleres med en virologisk undersoegelse efter A eller B inden 48 timer efter proeveudtagningen, hvis

a) der opnaas en negativ reaktion

eller

b) der opnaas en positiv reaktion med materiale fra foerste tilfaelde af IHN eller VHS i godkendte zoner.