*****

KOMMISSIONENS FORORDNING (EOEF) Nr. 2435/86

af 29. juli 1986

om aendring af forordning (EOEF) nr. 1470/68 om udtagelse og reduktion af proever samt om bestemmelse af indholdet af olie, urenheder og fugtighed i olieholdige froe

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE

FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets forordning (EOEF) nr. 136/66/EOEF af 22. september 1966 om oprettelse af en faelles markedsordning for fedtstoffer (1), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 1454/86 (2), saerlig artikel 24a, og

ud fra foelgende betragtninger:

Som foelge af de successive aendringer af Kommissionens forordning (EOEF) nr. 1470/68 (3), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 3519/84 (4), daekker den naevnte forordnings titel kun delvis indholdet; titlen boer derfor tilpasses;

udtrykket »dobbeltlav« anvendt om raps- og rybsfroe afhaenger af froeets indhold af glucosinolater; der boer fastsaettes en passende metode til bestemmelse af dette indhold;

i henhold til Kommissionens forordning nr. 282/67/EOEF af 11. juli 1967 om de naermere regler for intervention ved olieholdige froe (5), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 2436/86 (6), og Kommissionens forordning (EOEF) nr. 2681/83 af 21. september 1983 om gennemfoerelsesbestemmelser til stoetteordningen for olieholdige froe (7), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 2434/86 (8), boer der fastsaettes en faelles EF-metode til bestemmelse af glucosinolatindholdet;

de i denne forordning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Forvaltningskomiteen for Fedstoffer -

UDSTEDT FOELGENDE FORORDNING:

Artikel 1

I forordning (EOEF) nr. 1470/68 foretages foelgende aendringer:

1. Titlen affattes saaledes:

»om udtagelse og reduktion af proever samt om analysemetoder for saa vidt angaar olieholdige froe«.

2. Som artikel 2c indsaettes:

»Artikel 2c

Den i artikel 4 i forordning nr. 282/67/EOEF og artikel 32 i forordning (EOEF) nr. 2681/83 omhandlede bestemmelse af glucosinolatindholdet foretages efter metoden i bilag VIII til naervaerende forordning, uden at dette indskraenker anvendelsen af de i naevnte artikler omhandlede overgangsbestemmelser.«

3. Bilaget indsaettes som bilag VIII.

Artikel 2

Denne forordning traeder i kraft paa dagen for offentliggoerelsen i De Europaeiske Faellesskabers Tidende.

Den anvendes fra den 1. juli 1986.

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gaelder umiddelbart i hver medlemsstat.

Udfaerdiget i Bruxelles, den 29. juli 1986.

Paa Kommissionens vegne

Frans ANDRIESSEN

Naestformand

(1) EFT nr. 172 af 30. 9. 1966, s. 3025/66.

(2) EFT nr. L 133 af 21. 5. 1986, s. 8.

(3) EFT nr. L 239 af 28. 9. 1968, s. 2.

(4) EFT nr. L 328 af 15. 12. 1984, s. 12.

(5) EFT nr. L 151 af 13. 7. 1967, s. 1.

(6) Se side 61 i denne Tidende.

(7) EFT nr. L 266 af 28. 9. 1983, s. 1.

(8) Se side 51 i denne Tidende.

BILAG

»BILAG VIII

RAPS- OG RYBSFROE

Bestemmelse af indholdet af glucosinolater

1. EMNE

Denne metode er udarbejdet til bestemmelse af indholdet af de vigtigste glucosinolater i raps- og rybsfroe.

2. PRINCIP

2.1. Maaling af trimethylsilylderivater af enzymatisk desulfonerede glucosinolater ved temperaturprogrammet gaschromatografi med anvendelse af sinigrin som intern standard.

2.2. Metoden giver maengden, i mikromol pr. gram lufttoerret froe, af seks vigtige glucosinolater i raps- og rybsfroe og to glucosinolater i sennepsfroe, der kan vaere en urenhed.

3. DE VIGTIGSTE REAGENSER

3.1. DEAE Sephadex A-25.

3.2. SP Sephadex C-25.

3.3. Sulfatase type H-1.

3.4. Allylglucosinolat (sinigrin).

3.5. Bariumacetat.

3.6. Blyacetat.

3.7. Pyridin (siluleringskvalitet).

3.8. N-methyl-n-trimethylsilylheptafluorbutyramid (MSHFBA).

3.9. Trimethylchlorsilan (TMCS).

3.10. 1-methylimidazol.

4. DET VIGTIGSTE UDSTYR

4.1. Svenske ekstrationsroer, 70 ml, af rustfrit staal og med aabning 18 mm ID, 17 mm kuglelejer, propper af fluorsiliconegummi nr. 3 og horisontalt rysteapparat (Troeng 1955) eller et tilsvarende rysteapparat med staalkugler.

4.2. Hurtigtgaaende kaffemoelle.

4.3. Ovn med luftcirkulation.

4.4. Gaschromatograf med temperaturprogrammering og flammeionisationsdetektor.

4.5. Gaschromatografisk kolonne af glas med en laengde paa ca. 2 m og en indre diameter 2 mm fyldt med 2 % OV-07 paa diatomit CLQ 80-100 maskevidde.

5. KLARGOERING

5.1. Klargoering af DEAE Sephadex A-25 paa acetatform og »pyridinacetat«-form

10 g DEAE Sephadex A-25 afvejes i et 250 ml baegerglas, der tilsaettes 150 ml vand, og Sephadexen henstaar til kvaeldning natten over. Sephadex-opslaemningen haeldes i en kolonne paa 20 × 400 mm.

500 ml 0,5 N natriumhydroxid (10 g oploest i vand og fortyndet til 500 ml) ledes gennem kolonnen. Kolonnen skylles med 250 ml vand for at fjerne overskuddet af natriumhydroxid, idet det kontrolleres, at pH er faldet til neutral.

1 / 10 af Sephadexen udtages til omdannelse til acetatform. Den opslaemmes i vand og haeldes i en kolonne paa 15 × 200 mm. 100 ml 0,5 M eddikesyre (2,9 ml isedikke fortyndet til 100 ml) ledes gennem kolonnen. Der skylles med 250 ml vand. Opbevares opslaemmet i vand i en 250 ml kolbe.

De resterende 9 / 10 Sephadex sedimenteres i en kolonne med vand. Der ledes 400 ml 0,5 M pyridinacetat (19,8 ml pyridin plus 15 ml isedikke fortyndet til 500 ml med vand) gennem kolonnen. Der skylles med 250 ml vand. Opbevares som opslaemning i vand i en 250 ml kolbe. 5.2. Klargoering af SP Spehadex C-25 paa natriumform

1 g SP Sephadex C-25 afvejes i et 100 ml baegerglas, der tilsaettes 75 ml vand, og Sephadexen henstaar til kvaeldning natten over. Sephadex-opslaemningen haeldes i en kolonne paa 15 × 200 mm, og der skylles med 250 ml vand. Opbevares som opslaemning i vand i en 250 ml kolbe.

5.3. Rensning af sulfatase

70 mg sulfatase type H-1 afvejes i et 16 × 150 mm reagensglas. Sulfatasen oploeses i 3 ml vand og fortyndes med et lige saa stort volumen ethanol. Der centrifugeres i 10 minutter ved 2 000 g. Centrifugatet dekanteres over i et andet glas, og bundfaldet bortkastes. Der saettes 9 ml ethanol til centrifugatet, og der centrifugeres atter i 10 minutter ved 2 000 g. Centrifugatet bortkastes, og bundfaldet oploeses i 2 ml vand.

I to pipetter anbringes 100 ml af det vandige lag over DEAE Sephadex A-25 paa acetatform. Dernaest anbringes der saa meget DEAE Sephadex A-25 paa acetatform, at der dannes en 15 mm hoej kolonne, hvilket svarer til 20 mg toer Sephadex.

I den anden anbringes 100 ml af det vandige lag over SP Sephadex C-25 paa natriumform. Dernaest anbringes der saa meget klargjort SP Sephadex C-25 paa natriumform, at der dannes en tilsvarende kolonne. Den vandige enzymoploesning ledes foerst gennem kolonnen med DEAE Sephadex A-25 paa acetatform og dernaest gennem kolonnen med SP Sephadex C-25 paa natriumform.

Sulfataseoploesningen anvendes ufortyndet paa kolonnerne i pipettespidserne. Eluatet opbevares ved 20° C og optoes foerst umiddelbart foer brug.

5.4. Fremstilling af intern standard

Allylglucosinolat (monohydrat, kaliumsalt)

SC6H 1 1 O5

CH2 = CHCH2 C

NOSO3 K +H2O

Molekylvaegt:

1.2.3 // C // 10 × 12,011 = // 120,110 // H // 18 × 1,008 = // 18,144 // N // 1 × 14,008 = // 14,008 // S // 2 × 32,006 = // 64,132 // O // 10 × 16,000 = // 160,000 // K // 1 × 39,100 = // 39,100 415,494

Til fremstilling af en oploesning med 1 mmol/ml afvejes 41,5 mg, der fortyndes til 100 ml.

5.5. Fremstilling af gaschromatografikkolonne med OV-7

Foerst skylles indersiden af en 4 × 0,25 glaskolonne med ID 2 mm ved at forbinde dens ene ende til en vandluftpumpe med en gummislange for at frembringe svagt vakuum. 100 ml chloroform, dernaest 100 ml acetone og til sidst 100 ml petroleumether (kp 30-60° C) suges gennem kolonnen. Der suges luft igennem kolonnen for at toerre den, hvorefter den toerres i ovn med luftcirkulation.

Den ene ende tilproppes med glasuld. Denne ende af kolonnen forbindes med vakuum. Der tilsaettes kolonnepakning, 2 % OV-7 paa diatomit CLQ 80-100 maskevidde, gennem en lille tragt, der med et lille stykke Tygonslange er forbunder med kolonnens anden ende. For at pakningen lettere skal kunne loebe gennem boejningerne, bankes der let paa kolonnen, indtil den er fuld og regelmaessigt pakket. Tragt og Tygonslange fjernes. Ved hjaelp af en Pasteur-pipette med gummibold blaeses saa meget pakning ud ad enden af kolonnen, at den kan tilproppes med glasuld.

Kolonnen monteres paa gaschromatografens injektionsblok ved hjaelp af en moetrik af rustfrit staal, en omvendt monteret bagferrul og en grafitferrul. Der ledes heliumbaeregas gennem kolonnen; temperaturprogrammeringen startes ved 100° C og indstilles til 1° C pr. minut indtil 290° C, som fastholdes natten over. Ovnen afkoeles, og kolonnen skrues fast paa detektoren med en moetrik af rustfrit staal, bagferrul og forferrul af grafit.

Injektionsblokkens temperatur indstilles til 250° C, detektortemperaturen til 300° C, kolonnetemperaturen til 200° C, heliumbaeregassens hastighed til 40 ml pr. minut, hydrogen- og luftstroemmen til henholdsvis 50 og 500 ml pr. minut, saa detektoren faar stoerst mulig foelsomhed, maaleomraadet (range) til 1 og daempningen (attenuation) til 64. 6. FREMGANGSMAADE

6.1. Proeveforberedelse

Udtagning af froeproever og reduktion af laboratorieproever til analyseproever foretages i overensstemmelse med de fremgangsmaader, der er beskrevet i henholdsvis bilag I og II til forordning (EOEF) nr. 1470/68.

For hver batch af proever boer der mindst én gang analyseres en standardfroeproeve. Data fra analyser af standardproever er nyttige til kontrol af metodens praecision og noejagtighed.

Hvis froeproeven er fugtig, toerres 20 g heraf ved 45° C natten over i en ovn med luftcirkulation for at opnaa en fugtighed paa 7 %. 20 g toerrede froe males i en kaffemoelle.

I et svensk roer med tre staalkugler lukket med en prop af fluorsiliconegummi ekstraheres olien fra 3 g formalede froe med 40 ml petrolumether (kp 40-60° C) eller n-hexan. Der rystes vandret i et rysteapparat i 45 minutter. Der filtreres under vakuum paa papirfilter (Whatman nr. 1) i en konisk tragt og skylles to gange med frisk oploesningsmiddel. Melet lufttoerres natten over i stinkskab. Efter toerringen fjernes eventuelle klumper, om noedvendigt med en 280 mm sigte. Mere end 90 % af proeven skal passere gennem sigten.

6.2. Deaktivering af myrosinase og ekstraktion af glucosinolater

En maengde mel (100 mg) afvejes i et reagensglas, som opvarmes paa kogende vandbad (95° C). Efter to minutter tilsaettes kogende vand (1 ml), og efter yderligere to minutter tilsaettes intern standard (1 ml) (allylglucosinolat). Koncentrationen af den interne standard er som anfoert i tabellen afhaengig af proevens skoennede glucosinolatindhold. Glasset holdes opvarmet til 95° C i 15 minutter.

For at bestemme den originale proeves indhold af allyglucosinolat, benyttes en anden proeve, til hvilken der ikke tilsaettes intern standard.

Blandingen afkoeles, hvorefter der tilsaettes 100 ml af en oploesning indeholdende 0,5 mol bariumacetat og 0,5 mol blyacetat pr. liter vand og blandes. Der centrifugeres ved 2 000 g, og centrifugatet gemmes.

1.2.3 // // // // Glucosinolatindhold (mmol/g froe) // Koncentration af intern standard oploesning (mmol/ml) // Ekstraktmaengde, der skal behandles med Sephadex (ml) // // // // < 15 // 1 // 1,0 // 15-40 // 2 // 0,5 // > 40 // 3 // 0,2 // // //

6.3. Fremstilling af minikolonner med DEAE - Sephadex A-25

Passende kolonner kan fremstilles ved anvendelse af 1 ml plasticpipettespidser eller ved hjaelp af afkortede Pasteur-pipetter. En lille glasuldsprop anbringes i bunden af »minikolonnen«, og der vaskes med vand (1 ml). Der tilsaettes en maengde opslaemning af DEAE Sephadex A-25 (pyridinacetatform) svarende til 20 mg toer Sephadex. Dette goeres enklest ved at tilsaette et i forvejen bestemt volumen af en (omhyggeligt blandet) opslaemning. Naar gelen har sat sig, skylles der med vand.

Centrifugatet fra barium/bly-behandlingen saettes paa kolonnen. Naar det er loebet igennem, skylles kolonnen foerst med 1 ml vand og dernaest med 1 ml pyridinacetat (0,02 M). Naar kolonnen er loebet toer, saettes der 50 ml renset sulfataseoploesning paa, og den henstaar natten over ved stuetemperatur. Desulfoglucosinolaterne elueres med vand (3 × 0,5 ml).

6.4. Derivatisering af desulfoglucosinolaterne

Silyleringsreagenset fremstilles ved at blande MSHFBA (100 m l) og fortyndet 1-methylimidazol (50 ml) og acetone (950 ml).

En proeve af desulfoglucosinolateluatet toerres i et lille glas, der kan lukkes taet til. Smaa maengder (5-10 ml) kan toerres ved opvarmning til 120° C i ti minutter.

Eller der toerres over p2O5 i en vakuum ekssikkator. Til den toerrede proeve tilsaettes et lige saa stort volumen silyleringsreagens, og glasset lukkes taet til. Derivatiseringen finder sted ved opvarmning af glasset til 120° C (fem minutter).

6.5. Adskillelse af desulfoglucosinolatderivaterne ved gaschromatografi

Der indsproejtes 2 ml i OV-7-kolonnen, som holdes ved 200° C i fem minutter, hvorefter temperaturprogrammeringen indstilles paa 5° C pr. minut op til 280° C. Denne temperatur fastholdes i 15 minutter.

Toppene optegnes for:

3-butenyglucosinolat, 4-pentenylglucosinolat, 2-hydroxy-3-butenylglucosinolat, 2-hydroxy-4-pentenylglucosinolat, indolyl-3-methylglucosinolat, 4-OH-indolyl-3-methylglucosinolat samt allylglucosinolat, og 4-hydroxy benzylglucosinolat. Ved analysering af proever med staerkt varierende glucosinolatindhold eller ved gentagelse af chromatograferingen efter nogle timers pause er det noedvendigt at indsproejte samme proeve flere gange, indtil resultaterne er konstante.

Adskillelse af desulfoglucosinolatderivater ved temperaturprogrammeret gaschromatografi

(1) allyl-,

(2) 3-butenyl-,

(3) 4-penthenyl-,

(4) 2-hydroxy-3-butenyl-,

(5) 2-hydroxy-4-pentenyl-,

(6) saccharose,

(7) benzyl-,

(8) 4-hydroxy-benzyl,

(9) 4-hydroxyindolyl-3-methyl-.

6.6. Beregning af resultater

Foerst bestemmes arealet af allylglucosinolat, som skyldes eventuel forurening.

Det allyglucosinolat-areal, der frekommer ved analysen uden tilsaetning af intern standard, korrigeres ved hjaelp af arealerne for 2-hydroxy-3-butenylglucosinolat fra begge analyser, med og uden tilsaetning af intern standard:

1.2.3.4.5 // areal for allyl-glucosinolat TMS (uden tilsaetning af intern standard) // × // areal for 2-HO-3-butenylglucosinolat TMS (med tilsaetning af intern standard) areal for 2-HO-3-butenylglucosinolat TMS (uden tilsaetning af intern standard) // = // allyllucosinolat TMS fra forurening

Dernaest bestemmes arealet af allylglucosinolat, som svarer til den tilsatte interne standard. Det foerste areal traekkes fra det samlede allylglucosinolat-areal fremkommet ved analysen med tilsaetning af intern standard:

1.2.3.4.5 // areal for allylglucosinolat TMS (med intern standard) // - // areal for allylglucosinolat TMS fra forurening // = // areal for allylglucosinolat TMS fra tilsat intern standard

Glucosinolatindholdet i mikromol pr. gram oliefrit lufttoerret mel fremkommer ved for hvert glucosinolat-TMS-derivat at dividere arealet fra analysen med tilsaetning af intern standard med det areal, der svarer til den maengde allylglucosinolat, der er tilsat som intern standard, og dernaest at gange med den maengde allylglucosinolat, der er tilsat pr. gram oliefrit lufttoerret mel, udtrykt i mikromol:

1.2.3.4.5 // areal for glucosinolat-TMS areal for allylglucosinolat TMS fra tilsat intern standard // × // m mol allylglucosinolat g oliefrit lufttoerret mel // = // m mol glucosinolat g oliefrit lufttoerret mel

Resultaterne udtrykkes i forhold til froemaengde:

1.2.3.4.5 // mmol glucosinolat g oliefrit lufttoerret mel // × // 100 - olieindholdet (%) 100 // = // mmol glucosinolat g lufttoerret froe

7. RAPPORTERING AF RESULTATER

Maengderne af 3-butenyl-, 4-pentenyl-, 2-hydroxy-3-butenyl-, 2-hydroxy-4-pentenyl-, indolyl-3-methyl- og 4-OH-indolyl-3-methylglucosinolat adderes og anfoeres samlet. Et eventuelt indhold af allyl- og 4-hydroxybenzylglucosinolat angives saerskilt som tegn paa forurening med sennep eller andet froe af korsblomstret ukrudt.

Resultaterne anfoeres i mikromol pr. gram lufttoerret froe som gennemsnitsvaerdi af to bestemmelser og med angivelse af forskellen R (R = hoejeste vaerdi - laveste vaerdi af de to bestemmelser).«