++++

RAADETS DIREKTIV

af 29 . marts 1977

om biologisk overvaagning af befolkningen med hensyn til risikoen for blyforgiftning

( 77/312/EOEF )

RAADET FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab , saerlig artikel 235 ,

under henvisning til forslag fra Kommissionen ,

under henvisning til udtalelse fra Europa-Parlamentet ( 1 ) ,

under henvisning til udtalelse fra Det oekonomiske og sociale Udvalg ( 2 ) , og

ud fra foelgende betragtninger :

En af de vaesentlige opgaver for Det europaeiske oekonomiske Faellesskab er at fremme en harmonisk udvikling af den oekonomiske virksomhed i Faellesskabet som helhed og en varig og afbalanceret ekspansion , hvilket ikke vil kunne ske uden saavel en bekaempelse af forureningen og de deraf foelgende gener , som en forbedring af livskvaliteten og beskyttelse af miljoeet ;

de forskellige former for anvendelse af bly medfoerer for tiden , at der finder blyforurening sted i talrige dele af miljoeet ;

det store antal blyforureningskilder i miljoeet goer det vanskeligt at afgoere , i hvor hoej grad det enkelte individ samlet er udsat for denne forureningsfaktor , og beskyttelsen af menneskets sundhed kraever derfor , at der foretages en saa noeje overvaagning af det enkelte menneskes samlede blyoptagelse som muligt ;

der boer gennemfoeres en biologisk overvaagning af befolkningen med hensyn til risikoen for blyforgiftning , og resultaterne af denne overvaagning boer vurderes med henblik paa eventuel udarbejdelse af nye forslag ;

der boer fastlaegges tekniske retningslinjer og biologiske referenceniveauer for denne overvaagning ;

bestemmelse af blodets blyindhold er den bedste metode for oejeblikket til vurdering af stoerrelsen af den blymaengde , et individ nyligt har optaget efter at have vaeret udsat for bly i miljoeet , og delta-aminolaevulinsyredehydrataseaktiviteten ( ALA-D-aktiviteten ) i blodet kan tjene som vejledende eller supplerende maalemetode ved bestemmelse af blypaavirkningen ;

De europaeiske Faellesskabers handlingsprogram paa miljoeomraadet ( 3 ) fastsaetter , at de nationale programmer skal koordineres med henblik paa en forbedring af livskvaliteten , samt at en indsats mod blyforureningen skal prioriteres hoejt -

UDSTEDT FOELGENDE DIREKTIV :

Artikel 1

Medlemsstaterne traeffer de noedvendige foranstaltninger til anvendelse af en faelles fremgangsmaade for biologisk overvaagning med henblik paa at vurdere , i hvor hoej grad befolkningen er udsat for risiko for blyforgiftning uden for arbejdspladsen .

Artikel 2

Denne faelles fremgangsmaade , der skal finde anvendelse i fire , aar , bygger paa maaling af blodets blyindhold .

Som vejledende eller supplerende undersoegelse kan der ligeledes foretages maaling af ALA-D efter de i bilag I og II fastlagte fremgangsmaader .

Artikel 3

1 . Med henblik paa denne biologiske overvaagning fastlaegges :

- de naermere bestemmelser for proeveudtagning og analyse ,

- proeveudtagningens hyppighed .

2 . De anvendte blodproever udtages paa personer , der frivilligt deltager i undersoegelsen .

Artikel 4

Proeveudtagningen foretages paa :

- grupper paa mindst 100 personer i bymaessige omraader med over 0,5 millioner indbyggere ;

- grupper paa mindst 100 personer , for saa vidt dette tal kan naas , udvalgt blandt de befolkningsgrupper , der er udsat for paavirkning fra betydelige blyforureningskilder ;

- risikogrupper , udvalgt efter de kompetente nationale myndigheders anvisning .

I hver medlemsstat og i hver undersoegelsesraekke skal der foretages mindst 50 analyser/1 million indbyggere .

Artikel 5

Proeveudtagningen blandt de i artikel 4 omhandlede grupper skal foretages over mindst to undersoegelsesraekker i hvert af de paagaeldende omraader inden for programmets loebetid med et interval paa mindst 24 maaneder . Anden undersoegelsesraekke skal ikke noedvendigvis foretages paa samme personer som dem , der var omfattet af foerste undersoegelsesraekke .

Artikel 6

Til vurdering af resultaterne af den biologiske overvaagning med henblik paa de i artikel 8 omhandlede aktioner , skal foelgende tal for blodets blyindhold , som tager hensyn til det i bilag I anfoerte forhold mellem dosis og virkning , i forening anvendes som referenceniveauer :

- hoejst 20 mg Pb/100 ml blod for 50 % af den undersoegte befolkningsgruppe ;

- hoejst 30 mg Pb/100 ml blod for 90 % af den undersoegte befolkningsgruppe ;

- hoejst 35 mg Pb/100 ml blod for 98 % af den undersoegte befolkningsgruppe .

Artikel 7

Med henblik paa bestemmelse af blodets blyindhold :

- giver medlemsstaterne Kommissionen oplysning om navnene paa de laboratorier , der deltager i det biologiske overvaagningsprogram , og om de anvendte analysemetoder ;

- tilrettelaegger Kommissionen i samarbejde med medlemsstaterne de interkalibreringsprogrammer , som de ovennaevnte laboratorier deltager i ;

- gennemgaar Kommissionen i samarbejde med medlemsstaterne resultaterne af disse programmer med henblik paa at forbedre analysemetodernes sammenlignelighed .

Artikel 8

Hvis resultatet af analyserne viser , at de i artikel 6 anfoerte referenceniveauer i et eller flere tilfaelde er overskredet , skal medlemsstaterne :

- efterproeve resultaternes paalidelighed ;

- soege a * finde frem til de forureningskilder , som kan vaere aarsagen til disse overskridelser ; dette gaelder ligeledes for alle individer med et blyindhold i blodet paa mere end 35 mg/100 ml ;

- traeffe passende foranstaltninger efter deres kompetente nationale myndigheders skoen .

Artikel 9

1 . Inden seks maaneder efter meddelelsen af dette direktiv udpeger medlemsstaterne den kompetente nationale myndighed , som meddeler Kommissionen :

- resultaterne af den biologiske overvaagning af de i artikel 4 naevnte befolkningsgrupper med oplysninger om analysemetoderne , de undersoegte befolkningsgrupper og om de omraader , hvor proeverne er blevet udtaget ; disse resultater skal udformes saaledes , at de undersoegte personers anonymitet sikres paa enhver maade ; de naermere bestemmelser vedroerende fremsendelsen af disse resultater og den form , hvorunder fremsendelsen skal finde sted , fastlaegges efter faelles aftale mellem Kommissionen og medlemsstaterne ;

- oplysningerne om de formodede aarsager til overskridelsen af de i artikel 6 naevnte referenceniveauer .

2 . Den kompetente nationale myndighed underretter desuden Kommissionen om de i medfoer af artikel 8 , tredje led , trufne foranstaltninger .

Artikel 10

Kommissionen sammenkalder mindst to gange aarligt repraesentanterne for medlemsstaternes regeringer , navnlig med henblik paa :

- at sikre harmoniseret gennemfoerelse af den biologiske overvaagning , og isaer af bestemmelserne i artikel 4 og 5 ;

- at drage omsorg for , at de foretagne analyser er sammenlignelige ;

- at gennemgaa oplysningerne og lette udvekslingen af oplysninger mellem medlemsstaterne om resultaterne af den biologiske overvaagning , samt om de i medfoer af artikel 8 trufne foranstaltninger .

Artikel 11

Paa grundlag af de i medfoer af artikel 9 indhentede oplysninger udarbejder Kommissionen i samarbejde med de kompetente nationale myndigheder :

- en aarlig sammenfattende rapport om programmets gennemfoerelse , som fremsendes til medlemsstaterne , Raadet og Europa-Parlamentet ;

- ved programmets afslutning en generel rapport som skal danne grundlag for eventuel forberedelse af nye forslag , hvori der tillige tages hensyn til de fremskridt , der er gjort inden for videnskabelig og teknisk viden .

Artikel 12

Medlemsstaterne traeffer de noedvendige foranstaltninger , for at efterkomme dette direktiv inden 12 maaneder efter dets meddelelse og underretter straks Kommissionen herom .

Artikel 13

Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne .

Udfaerdiget i Bruxelles , den 29 . marts 1977 .

Paa Raadets vegne

T . BENN

Formand

( 1 ) EFT nr . C 28 af 9 . 2 . 1976 , s . 31 .

( 2 ) EFT nr . C 50 af 4 . 3 . 1976 , s . 9 .

( 3 ) Jf . EFT nr . C 112 af 20 . 12 . 1973 , s . 3 .

BILAG I

FORHOLDET DOSIS - VIRKNING

De niveauer for blyindhold i blodet , der vaelges med henblik paa bedoemmelse af resultaterne af den biologiske overvaagning , hidroerer fra en vurdering af de videnskabelige data vedroerende de forskellige giftvirkninger af bly . Denne vurdering , der tager hensyn til de normale variationer i de biologiske vaerdier hos befolkningen , goer det muligt at opst * le et kvasi-kvantitativt forhold mellem dosis og virkning . Foelgende forhold mellem dosis og virkning anvendes som referencegrundlag ved ivaerksaettelsen af dette direktiv :

Der kan hos befolkningen accepteres en vis nedgang i ALA-D-aktiviteten i de roede blodlegemer efter udsaettelse for blypaavirkning , for saa vidt den ikke bevirker en forstyrrelse i dannelsen af roede blodlegemer . Ved et blyindhold i blodet paa under 15 - 20 mg/100 ml mener man paa naervaerende tidspunkt ikke , at nedsaettelsen af ALA-D-aktiviteten bringer forstyrrelse i dannelsen af roede blodlegemer .

En foroegelse af protoporfhyrinerne i de roede blodlegemer ( PPE ) tyder paa interferens med udnyttelsen af jern , hvorved haemoglobinsyntesen haemmes . En foroegelse af PPE indtraeder ved blyindhold i blodet paa over 20 - 30 mg/100 ml . En foroegelse af PPE kan imidlertid skyldes andre aarsager .

Interferencen med glutathion-syntesen kan kun accepteres hos en lille broekdel af befolkningen og kun , saafremt den er lidet udtalt og ikke fremkalder andre subkliniske symptomer . En saadan uacceptabel interferens med glutathion-syntesen opstaar ikke , dersom blodets blyindhold er lavere end 30 mg/100 ml .

Den betydeligt foroegede udskillelse af delta-aminolaevulinsyre ( ALA-U ) i urinen er et tegn paa en alvorlig forstyrrelse af porfhyrinstofskiftet og er saaledes tegn paa svigtende helbred . Den statistisk betydelige foroegelse af ALA-U optraeder foerst ved blyindhold i blodet paa over 35 mg/100 ml .

BILAG II

FORHOLDET MELLEM BLYINDHOLDET I BLODET OG ENZYMAKTIVITETEN

I henhold til artikel 2 i dette direktiv er forholdet mellem blyindholdet i blodet og ALA-D-aktiviteten , maalt efter europaeisk standardmetode ( bilag 3 ) , som foelger :

Blyindhold i blodet ( mg/100 ml blod ) * ALA-D ( enheder/liter ) *

35 * 20 *

30 * 25 *

20 * 35 *

Saa laenge de maalte ALA-D-vaerdier klart ligger over ovennaevnte graensevaerdier for de forskellige dele af befolkningen , er bekraeftende maalinger af blodets blyindhold overfloedige .

BILAG III

TEKNISKE FORSKRIFTER FOR BESTEMMELSE AF ALA-D AKTIVITETEN

Europaeisk standardmetode til bestemmelse af delta-aminolaevulinsyredehydrataseaktiviteten

Princippet i den metode , som er valgt til bestemmelse af delta-aminolaevulinsyredehydrataseaktiviteten , er velkendt . Det er baseret paa enzyminkubation med et overskud af delta-aminolaevulinsyresubstrat . Det i loebet af en bestemt tid dannede porphobilinogen blandes med modificeret Ehrlich-reagens , og den opnaaede farve maales ved hjaelp af et fotometer mod blindproeve . Maengden af det dannede porphobilinogen et er maal for ALA-D-aktiviteten .

METODE

Lysets indvirkning

Nyligt foretagne forsoeg har vist , at navnlig PBG er meget foelsomt over for lys . Hele analysen boer foretages under udelukkelse af alt direkte sollys i laboratoriet ( og ikke blot paa det sted , hvor analysen foretages ) .

Foerste fase - Udtagning og opbevaring af blodproever inden analysen .

- Der udtages en proeve paa 2 ml venoest blod ved hjaelp af en engangssproejte af plastmateriale ( uden blytilsaetning ) under tilstedevaerelse af toerret heparin ( < 5 mg ) .

- Heraf udtages straks 4 portioner à 0,2 ml fordelt i plastikroer ( uden blytilsaetning ) , og der nedkoeles til 4 * C . Opsugningen foretages med maalepipetter af Marbourg-typen .

- Hvis analysen foretages inden for 3 timer , er nedkoeling af proeverne ikke noedvendig .

- Proeverne maa hoejest opbevares 24 timer ved 4 * C .

- Lige foer analysen skal alle proeverne anbringes i et isafkoelet vandbad i 10 minutter .

Anmaerkning : Af plastmaterialer kan eksempelvis vaelges polyethylen , polystyren og polypropylen . Opbevaringstiden paa 24 timer ved 4 * C er fastsat efter et forsigtigt skoen . Dette tidsrum er tilstraekkeligt til at transportere blodproeven fra proeveudtagningsstedet til et centrallaboratorium for analyse . Af de 4 udtagne portioner blod skal 3 benyttes til bestemmelse af ALA-D og 1 til kontrolproeven .

Anden fase - Bestemmelse af haematokrit

Denne bestemmelse skal foretages :

- samtidig med udtagningen af blodproeven ,

- efter en kapillarmetode med anvendelse af to proever .

Centrifugering efter lukning af den ene ende ved en hastighed paa mindst 30 000 omdr./min . ( i mindst 5 minutter ) .

Anmaerkning : Denne bestemmelse skal helst foretages paa stedet , men ikke over 24 timer efter udtagningen af blodproeven . Om muligt anvendes en mikrohaematokritcentrifuge .

Tredje fase - Haemolyse

- Tre forud " optoede " blodproever haemolyseres med 1,3 ml destilleret vand ( som i forvejen er opvarmet til 37 * C ) i 10 minutter ved 37 * C mere eller mindre 0,2 * C .

- Der tilsaettes vand , helst ved hjaelp af en 2 ml maalepipette , hvorefter der blandes grundigt .

- Proeverne maa derefter ikke rystes mere paa dette stadium .

Anmaerkning : Det er besluttet at anvende vand og ikke Triton X 100 til haemolysen . Ved haemolyseforsoeg med Triton X 100 sker der en betydelig nedsaettelse af ALA-D aktiviteten , som man endnu ikke har fundet nogen forklaring paa , men som kunne tyde paa en artefakt .

Fjerde fase - Tilsaetning af ALA-oploesningen til haemolysatet .

- ALA-oploesningen tilberedes .

- Den maa ikke vaere tilberedt mere end 5 timer i forvejen .

- Oploesningen bringes op paa 37 * i mindst 10 minutter inden tilsaetningen .

- 1 ml af denne oploesning tilsaettes haemolysatet , helst ved hjaelp af en 1 ml fuldpipette , hvorefter der blandes .

Anmaerkning : der er valgt en pH paa 6,4 , idet erfaringen har vist , at denne pH-vaerdi giver stoerst overensstemmelse mellem vaerdierne for ALA-D-aktiviteten og blyindholdet i blodet hos befolkningen under normale forhold . Det drejer sig ikke om at opnaa maksimal virkning ( hvilket er muligt ved at haeve pH ) , da den virkning , der skal bestemmes , er tilstraekkelig stor .

Femte fase - Tilberedning af kontrolproeven

- 0,2 ml blod , behandlet som ved bestemmelsen af ALA-D indtil det punkt , hvor ALA-oploesningen tilsaettes ; i stedet for denne tilfoejes 1 ml HgCl2 - TCA-oploesning , og derefter tilsaettes 1 ml ALA-oploesning , hvorefter fremgangsmaaden er som ved bestemmelsen af ALA-D ( se nedenfor ) .

- Ved ovennaevnte tilsaetning benyttes pipette .

Anmaerkning : kun én kontrolproeve sammenlignes med en serie paa 3 forsoeg for hver blodproeve . Hvis den for kontrolproeven opnaaede O.D . er meget hoej , gentages proeven .

Sjette fase - Inkubation

- 60 minutters vandbad ved 37 * C mere eller mindre 0,2 * C .

- Inkubationstiden beregnes fra tilsaetningen af ALA-oploesningen .

Anmaerkning : Inkubationstiden paa 60 minutter er valgt for paa naturlig maade at foroege ALA-D-aktiviteten , da ingen anden fase bevirker kunstig foroegelse af aktiviteten . Erfaringen har vist , at forholdet inkubationstid/aktivitet er lineaert ved tidsrum laengere end to timer .

Inkubationstemperaturen holdes paa 37 * af praktiske grunde .

Syvende fase - Standsning af PBG-reaktionen .

- Der tilsaettes 1 ml HgCl2 - TCA-oploesning til inkubationsblandingen , helst med 1 ml fuldpipette .

Ottende fase - Centrifugering og filtrering .

- 30 000 omdr . minutter .

- Filtrering med Whatman-papir nr . 54 eller tilsvarende ( syrebestandigt ) .

Anmaerkning : Centrifugeringen skal vare ca . 10 minutter .

Filtreringsfasen er indfoert for at undgaa , at smaa partikler ved pipetteopsugning overfoeres paa vaeskeoverfladen . Disse partikler synes at fremkalde en farvereaktion med Ehrlich-reagensen . Flere forsoeg har vist , at indfoerelsen af filtreringsfasen forbedrer reproducerbarheden . Filtreringsfasen kan om fornoedent erstattes af en yderligere centrifugering .

Niende fase - Reaktion med Ehrlich-reagensen .

- 1 ml af det oeverste vaeskelag blandes med 1 ml modificeret Ehrlich-reagens ved hjaelp af en fuldpipette .

- Der blandes ved hjaelp af en blandingspipette af Vortex-typen for at opnaa homogenitet .

- Proeven henstilles til reaktion i 5 minutter , foer extinktionen maales .

Anmaerkning : Det er meget vigtigt , at det oeverste , filtrerede vaeskelag blandes godt med Ehrlichreagensen for at sikre homogenitet .

Tiende fase - Maaling af extinktionen .

- Spektrofotometret indstilles ved hjaelp af en phenolphtaleinoploesning i en basisk puffer .

- Maaling af proevens extinktion i forhold til kontrolproeven ved 555 nm i en kuvette paa 1 cm ( eller 2 cm , hvis der er meget ringe absorption ) .

Ellevte fase - Beregning af enzymaktiviteten .

- Denne aktivitet beregnes efter foelgende ligning :

OD korr . gange 35 gange 2 gange 100 gange K / ( Hct . % gange 60 gange 62 ) = nmoles ALA/nm/ml RBC = U/ml

OD = maalt extinktion .

60 = inkubationstid .

35 = fortyndingsfaktor .

62 = molaer extinktionskoefficient i cm2/nmol .

K = spektrofotometrisk korrektionskoefficient .

Anmaerkning : De foreslaaede enheder er i overensstemmelse med Den internationale union for Biokemi's rekommandationer vedroerende enzymnomenklatur .

REAGENSER

1 . Tilberedning af en ALA-oploesning

Oploesning A :

1,78 g Na2HPO4 * 2 H2O oploest i 100 ml destilleret vand ( helst foretaget ved ionbytning ) .

Oploesning B :

1,38 g NaH2PO4 * 1 H2O oploest i 100 ml destilleret vand .

29 ml oploesning A + 71 ml oploesning B giver en puffer paa 0,1-molaer Na-phosphat med pH 6,4 .

Det er noedvendigt , at pufferen har denne ionkoncentration for at forhindre enhver pH-aendring i reagens-oploesningen .

167,6 mg ALA-HCl oploeses i oploesning B ( denne skal stadig vaere sur ) ; pH reguleres til 6,4 ved hjaelp af oploesning A . Rumfanget bringes derefter op paa 100 ml med pufferoploesningen 0,1-molaer Na-phosphat med pH 6,4 . Dette praeparat giver en 0,01-molaer ALA-oploesning .

2 . HgCl2 - TCA-oploesning

1,35 g HgCl2 oploeses i 100 ml 10 % trichloreddikesyre .

3 . Ehrlich-reagens-oploesningen

Reagenser :

2,5 g dimethylaminobenzaldehyd ( pDMAE )

0,25 g HgCl2 oploest i 10 ml iseddikesyre

perchlorsyre S.G . 1,7

iseddikesyre

Tilberedning :

pDMAB oploeses i 50 ml eddikesyre ; der tilsaettes 24,5 ml perchlorsyre og 4 ml HgCl2-oploesning . Dette blandes og afkoeles , og rumfanget foroeges til 100 ml ved tilsaetning af iseddikesyre i en maalekolbe ( 1 ) . Opbevares i en moerkfarvet flaske .

Kalibrering

Der skal paa faellesskabsplan finde en aarlig kalibrering sted hos et laboratorium , som udpeges af medlemsstaterne i forening .

( 1 ) Skulle der paa dette stadium vise sig en brunfarvning , skal reagensen kasseres .