1991R2568 — DA — 01.04.2011 — 023.001
Dette dokument er et dokumentationsredskab, og institutionerne påtager sig intet ansvar herfor
|
KOMMISSIONENS FORORDNING (EØF) Nr. 2568/91 af 11. juli 1991 (EFT L 248, 5.9.1991, p.1) |
Ændret ved:
Berigtiget ved:
KOMMISSIONENS FORORDNING (EØF) Nr. 2568/91
af 11. juli 1991
om kendetegnene for olivenolie og olie af olivenpresserester og de i den forbindelse anvendte metoder
KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR —
under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det Europæiske Økonomiske Fællesskab,
under henvisning til Rådets forordning nr. 136/66/EØF af 22. september 1966 om oprettelse af en fælles markedsordning for fedtstoffer ( 1 ), senest ændret ved forordning (EØF) nr. 3577/90 ( 2 ), særlig artikel 35a, og
ud fra følgende betragtninger:I bilaget til forordning nr. 136/66/EØF er der fastsat betegnelser for og definitioner på olivenolie og olie af olivenpresserester, der afsættes i de enkelte medlemsstater, i samhandelen mellem medlemsstaterne og i samhandelen mellem medlemsstaterne og tredjelande;
for at kunne skelne mellem de forskellige typer olie er det nødvendigt at definere de fysisk-kemiske kendetegn for hver type samt de organoleptiske kendetegn for jomfruolie, således at produkternes renhed og kvalitet sikres uden at dette berører andre eksisterende bestemmelser på området;
kendetegnene for de forskellige typer olie bør fastlægges ensartet for hele Fællesskabet; med henblik herpå bør der fastlægges EF-metoder for kemisk analyse og orgenoleptisk vurdering; i en overgangsperiode bør medlemsstaterne dog kunne anvende andre metoder, idet det dog skal fastsættes, at det er resultatet af den fælles metode, der gælder i tilfælde af uoverensstemmelse;
definitionen af de fysisk-kemiske kendetegn for olivenolie og analysemetoder indebærer, at de supplerende bestemmelser til kapitel 15 i Den Kombinerede Nomenklatur skal tilpasses;
som led i metoden til bedømmelse af jomfruolies organoleptiske kendetegn skal der oprettes paneler af udvalgte og øvede smagsdommere; der bør afsættes den fornødne tid til etablering af en sådan struktur; i betragtning af de vanskeligheder, som visse medlemsstater vil få med at oprette panelerne, bør det tillades disse medlemsstater at benytte de i andre medlemsstater eksisterende paneler;
for at ordningen med importafgift på olivenpresserester kan fungere efter hensigten bør der fastlægges en fælles metode til bestemmelse af olieindholdet i disse produkter;
for ikke at påføre handelen skade, bør det fastsættes, at det i en begrænset periode er tilladt at afsætte olie aftappet før denne forordnings ikrafttræden;
Kommissionens forordning (EØF) nr. 1058/77 ( 3 ), senest ændret ved forordning (EØF) nr. 1858/88 ( 4 ), bør ophæves;
Forvaltningskomitéen for Fedtstoffer har ikke afgivet udtalelse inden for den af formanden fastsatte frist —
UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING:
Artikel 1
1. Som jomfruolie efter punkt 1, litra a) og b), i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis respektive kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 1 og 2 i bilag I til nærværende forordning.
2. Som bomolie efter punkt 1, litra c), i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 3 i bilag I til nærværende forordning.
3. Som raffineret olivenolie efter punkt 2 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 4 i bilag I til nærværende forordning.
4. Som olivenolie bestående af raffineret olivenolie og jomfruolier efter punkt 3 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 5 i bilag I til nærværende forordning.
5. Som rå olie af olivenpresserester efter punkt 4 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 6 i bilag I til nærværende forordning.
6. Som raffineret olie af olivenpresserester efter punkt 5 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 7 i bilag I til nærværende forordning.
7. Som olie af olivenpresserester efter punkt 6 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 8 i bilag I til nærværende forordning.
Artikel 2
1. Bestemmelsen af kendetegnene for de i bilag I fastsatte olier sker ved hjælp af følgende analysemetoder:
— til bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer, beregnet som oliesyre, metoden i bilag II
— til bestemmelse af peroxidtallet, metoden i bilag III
— til bestemmelse af indholdet af voks: metoden i bilag IV
— til bestemmelse af indholdet af steroler, metoden i bilag V
— til bestemmelse af indholdet af erytrodiol og uvaol, metoden i bilag VI
— til bestemmelse af det procentvise indhold af 2-glycerylmonopalmitat, metoden i bilag VII
▼M20 —————
— til den spektrofotometriske undersøgelse, metoden i bilag IX
— til bestemmelse af fedtsyrernes sammensætning, metoden i bilag X A og X B
— til bestemmelse af indholdet af flygtige halogenerede opløsningsmidler, metoden i bilag XI
— til bestemmelse af jomfruolies organoleptiske kendetegn, metoden i bilag XII, anvendt som omhandlet i stk. 2
▼M20 —————
— til bestemmelse af indholdet af stigmastadiener, metoden i bilag XVII.
— til bestemmelse af indholdet af ECN42-holdige triglycerider, metoden i bilag XVIII.
— til bestemmelse af indholdet af alifatiske alkoholer: metoden i bilag XIX
— til bestemmelse af indholdet af voks, fedtsyremethylestere og fedtsyreethylestere ved gaskromatografi på kapillarkolonne, metoden i bilag XX.
2. Den kontrol, som de nationale myndigheder eller deres repræsentanter foretager af de organoleptiske kendetegn for jomfruolie, gennemføres af paneler af smagere, som medlemsstaterne har godkendt.
De organoleptiske kendetegn for en i første afsnit omhandlet olivenolie anses for at stemme overens med den anmeldte type olivenolie, hvis et af den pågældende medlemsstat godkendt panel bekræfter klassifikationen i den henseende.
Hvis det godkendte panel ikke bekræfter anmeldelsen med hensyn til de organoleptiske kendetegn for den anmeldte type olivenolie, lader de nationale myndigheder eller deres repræsentanter på den berørte parts anmodning foretage to kontrolanalyser, som udføres af andre godkendte paneler, og hvoraf mindst den ene udføres af et panel, der er godkendt af den pågældende producentmedlemsstat. De pågældende kendetegn anses for at stemme overens med dem, der er anmeldt, hvis de to kontrolanalyser bekræfter den anmeldte klassifikation. I modsat fald pålægges kontrolanalyseudgifterne den berørte part, uden at dette foregriber anvendelsen af sanktioner.
3. Hvad angår de nationale myndigheders eller deres repræsentanters kontrol af oliens kendetegn som omhandlet i stk. 1 udtages der prøver efter de internationale standarder EN ISO 661 og EN ISO 5555 for forberedelse af prøver til forsøg og prøveudtagning. Uanset punkt 6.8 i standard EN ISO 5555 udtages prøverne i henhold til bilag Ia til denne forordning for partier af den nævnte olie i umiddelbare emballager på 100 liter eller derunder.
Med forbehold af bestemmelserne i standard EN ISO 5555 og kapitel 6 i standard ISO 661 beskyttes prøverne hurtigst muligt mod lys og stærk varme og sendes til laboratoriet til analyse senest:
— den tiende arbejdsdag efter udtagningsdagen i månederne oktober-maj, og
— den femte arbejdsdag efter udtagningsdagen i månederne juni-september.
4. ►M20 Med hensyn til kontrollen i stk. 3 foretages analyserne i bilag II, III, IX, X og XII samt eventuelle kontrolanalyser, der er fastsat ved national lov, inden datoen for mindste holdbarhed. Udtages prøverne mere end fire måneder før sidste holdbarhedsdato, foretages analyserne senest fire måneder efter prøveudtagningen. Der gælder ingen frister for de øvrige analyser, som er fastsat ved forordningen. ◄
Svarer analyseresultaterne ikke til kendetegnene for den anmeldte kategori olivenolie eller olie af olivenpresserester, underrettes den pågældende herom senest en måned inden udløbet af fristen i første afsnit, undtagen hvis prøveudtagningen fandt sted mindre end en måned inden datoen for mindste holdbarhed.
5. Til bestemmelse af olivenoliernes kendetegn efter metoderne omhandlet i stk. 1 sammenlignes analyseresultaterne direkte med de i denne forordning fastsatte grænseværdier.
Artikel 2a
De nationale myndigheders eller deres repræsentanters kontrol af, om en prøve af olivenolie og olie af olivenpresserester svarer til den anmeldte kategori, kan enten foregå ved:
a) at analyserne i bilag I udføres i vilkårlig rækkefølge, eller
b) at analyserne udføres i den rækkefølge, der er angivet i beslutningsskemaet i bilag Ib, indtil en af beslutningerne i samme skema træffes.
▼M19 —————
Artikel ►M19 3 ◄
Konstateres det, at en olies organoleptiske kendetegn er forskellige fra dem, der følger af dens benævnelse, anvender medlemsstaten administrative bøder, hvis størrelse afhænger af den konstaterede uregelmæssigheds omfang, uden at dette i øvrigt udelukker eventuelle andre sanktioner.
Ved vurderingen af uregelmæssigheden tages der hensyn til den naturlige udvikling i kendetegnene for en olie, der er opbevaret under normale vilkår.
I begyndelsen af hvert halvår underretter medlemsstaterne om antallet og arten af konstaterede uregelmæssigheder og de sanktioner, der er anvendt i det foregående halvår.
Artikel 4
1. Med henblik på de nationale myndigheders eller deres repræsentants vurdering og kontrol af de organoleptiske kendetegn kan medlemsstaterne godkende paneler af smagere.
Godkendelsesbetingelserne fastlægges af medlemsstaterne, således at bl.a.
— betingelserne i bilag XII, punkt 4, opfyldes
— det sikres, at panelets leder optrænes af en virksomhed og på betingelser, som er anerkendt af medlemsstaten i den henseende
— godkendelsens gyldighed gøres afhængig af de resultater, der opnås ved en årlig kontrolordning, som medlemsstaten har oprettet.
Hver medlemsstat meddeler Kommissionen listen over godkendte paneler og de foranstaltninger, der er truffet i henhold til dette stykke.
2. Hvis en medlemsstat har vanskeligheder med at oprette et panel på sit område, kan den gøre brug af et godkendt panel i en anden medlemsstat.
3. Hver medlemsstat opstiller en liste over de paneler af smagsdommere, der er oprettet af erhvervs- eller brancheorganisationer på de i stk. 1 fastsatte betingelser, og de kontrollerer, at disse betingelser overholdes.
▼M19 —————
Artikel 6
1. Olieindholdet i presserester og andre restprodukter fra udvinding af olivenolie (KN-kode 2306 90 11 og 2306 90 19) bestemmes efter metoden i bilag XV.
2. Det i stk. 1 omhandlede olieindhold udtrykkes i vægtprocent af tørstoffet.
Artikel 7
EF-bestemmelserne om forekomst af forurenende stoffer finder anvendelse.
Hvad indholdet af halogenerede opløsningsmidler angår, gælder følgende grænseværdier for alle kategorier af olivenolie:
— Maksimalt indhold af hvert påvist halogeneret opløsningsmiddel: 0,1 mg/kg
— Maksimalt samlet indhold af påviste halogenerede opløsningsmidler: 0,2 mg/kg.
Artikel 8
1. Medlemsstaterne meddeler Kommissionen, hvilke foranstaltninger de træffer til anvendelse af denne forordning.
2. Medlemsstaterne meddeler Kommissionen i begyndelsen af hvert halvår en oversigt over analyseresultaterne i forbindelse med de bestemmelser, der er foretaget i løbet af det foregående halvår.
Resultaterne gennemgås af Forvaltningskomitéen for Fedtstoffer efter proceduren i artikel 39 i forordning nr. 136/66/EØF.
Artikel 9
Forordning (EØF) nr. 1058/77 ophæves.
Artikel 10
1. Denne forordning træder i kraft på tredjedagen efter offentliggørelsen i De Europæiske Fællesskabers Tidende.
Metoden i bilag XII anvendes dog fra den ►M1 1. november 1992 ◄ , undtagen i forbindelse med interventionsforanstaltninger.
Metoden anvendes ikke for jomfruolie, der er aftappet før den 1. november 1992.
2. Denne forordning anvendes ikke for olivenolie og olie af olivenpresserester, der aftappes inden datoen for denne forordnings ikrafttræden, og som bringes i handelen inden den 31. oktober 1992.
Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat.
BILAG
Resumé
|
Bilag I: |
Kendetegn for olivenolie |
|
Bilag Ia: |
Prøveudtagning for partier af olivenolie eller olie af olivenpresserester i umiddelbare emballager på højst 100 liter |
|
Bilag Ib: |
Beslutningsskema |
|
Bilag II: |
►M21 Bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer, kold metode ◄ |
|
Bilag III: |
Bestemmelse af peroxidtallet |
|
Bilag IV: |
►M6 Bestemmelse af voksindhold ved gaskramatografering med kapillarkolonne ◄ |
|
Bilag V: |
Bestemmelse af sammensætningen og indholdet af steroler ved gaskromatografi på kapillarsøjle |
|
Bilag VI: |
Bestemmelse af erythrodiol og uvaol |
|
Bilag VII: |
►M21 Bestemmelse af indholdet af 2-glycerylmonopalmitat i procent ◄ |
|
▼M20 ————— |
|
|
▼M20 ————— |
|
|
Bilag XX: |
Metode til bestemmelse af indholdet af voks, fedtsyremethylestere og fedtsyreethylestere ved gaskromatografi på kapillarkolonne |
BILAG I
KENDETEGN FOR OLIVENOLIE
|
Kategori |
Fedtsyremethylestere (FAME) og fedtsyreethylestere (FAEE) |
Surhedsgrad (%) (*) |
Peroxidtal mEq O2/kg (*) |
Voks mg/kg (**) |
2-glycerylmonopalmitat (%) |
Stigmastadien mg/kg (1) |
Forskel mellem HPLC og ECN42, teoretisk beregnet |
K232 (*) |
K270 (*) |
Delta-K (*) |
Organoleptisk vurdering Median for mangler (Md) (*) |
Organoleptisk vurdering Median for lugt og smag (Mf) (*) |
|
1 Ekstra jomfruolie |
Σ FAME + FAEE ≤ 75 mg/kg eller 75 mg/kg < Σ FAME + FAEE ≤ 150 mg/kg og (FAEE/FAME) ≤ 1,5 |
≤ 0,8 |
≤ 20 |
≤ 250 |
≤ 0,9, hvis palmitinsyre i alt ≤ 14 % |
≤ 0,10 |
≤ 0,2 |
≤ 2,50 |
≤ 0,22 |
≤ 0,01 |
Md = 0 |
Mf > 0 |
|
≤ 1,0, hvis palmitinsyre i alt > 14 % |
||||||||||||
|
2 Jomfruolie |
— |
≤ 2,0 |
≤ 20 |
≤ 250 |
≤ 0,9, hvis palmitinsyre i alt ≤ 14 % |
≤ 0,10 |
≤ 0,2 |
≤ 2,60 |
≤ 0,25 |
≤ 0,01 |
Md ≤ 2,5 |
Mf > 0 |
|
≤ 1,0, hvis palmitinsyre i alt > 14 % |
||||||||||||
|
3 Bomolie |
— |
> 2,0 |
— |
≤ 300 (3) |
≤ 0,9, hvis palmitinsyre i alt ≤ 14 % |
≤ 0,50 |
≤ 0,3 |
— |
— |
— |
Md > 2,5 (2) |
— |
|
≤ 1,0, hvis palmitinsyre i alt > 14 % |
||||||||||||
|
4 Raffineret olivenolie |
— |
≤ 0,3 |
≤ 5 |
≤ 350 |
≤ 0,9, hvis palmitinsyre i alt ≤ 14 % |
— |
≤ 0,3 |
— |
≤ 1,10 |
≤ 0,16 |
— |
— |
|
≤ 1,0, hvis palmitinsyre i alt > 14% |
||||||||||||
|
5 Olivenolie bestående af raffinerede olivenolier |
— |
≤ 1,0 |
≤ 15 |
≤ 350 |
≤ 0,9, hvis palmitinsyre i alt ≤ 14 % |
— |
≤ 0,3 |
— |
≤ 0,90 |
≤ 0,15 |
— |
— |
|
≤ 1,0, hvis palmitinsyre i alt > 14 % |
||||||||||||
|
6 Rå olie af olivenpresserester |
— |
— |
— |
> 350 (4) |
≤ 1,4 |
— |
≤ 0,6 |
— |
— |
— |
— |
— |
|
7 Raffineret olie af olivenpresserester |
— |
≤ 0,3 |
≤ 5 |
> 350 |
≤ 1,4 |
— |
≤ 0,5 |
— |
≤ 2,00 |
≤ 0,20 |
— |
— |
|
8 Olie af olivenpresserester |
— |
≤ 1,0 |
≤ 15 |
> 350 |
≤ 1,2 |
— |
≤ 0,5 |
— |
≤ 1,70 |
≤ 0,18 |
— |
— |
|
Kategori |
Fedtsyreindhold (1) |
Summen af isomerer af trans- oliesyrer (%) |
Summen af isomerer af trans- linolsyre og trans- linolensyre (%) |
Sterolsammensætning |
Steroler i alt (mg/kg) |
Erythrodiol og uvaol (%) (**) |
||||||||||
|
Myristin (%) |
Linolen (%) |
Arachin (%) |
Eicosan (%) |
Behen (%) |
Lignocerin (%) |
Kolesterol (%) |
Brassicasterol (%) |
Campesterol (%) |
Stigmasterol (%) |
Betasitosterol (%) (2) |
Delta-7- stigmastenol (%) |
|||||
|
1 Ekstra jomfruolie |
≤ 0,05 |
≤ 1,0 |
≤ 0,6 |
≤ 0,4 |
≤ 0,2 |
≤ 0,2 |
≤ 0,05 |
≤ 0,05 |
≤ 0,5 |
≤ 0,1 |
≤ 4,0 |
< Camp. |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 000 |
≤ 4,5 |
|
2 Jomfruolie |
≤ 0,05 |
≤ 1,0 |
≤ 0,6 |
≤ 0,4 |
≤ 0,2 |
≤ 0,2 |
≤ 0,05 |
≤ 0,05 |
0,5 |
≤ 0,1 |
≤ 4,0 |
< Camp. |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 000 |
≤ 4,5 |
|
3 Bomolie |
≤ 0,05 |
≤ 1,0 |
≤ 0,6 |
≤ 0,4 |
≤ 0,2 |
≤ 0,2 |
≤ 0,10 |
≤ 0,10 |
≤ 0,5 |
≤ 0,1 |
≤ 4,0 |
— |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 000 |
≤ 4,5 (3) |
|
4 Raffineret olivenolie |
≤ 0,05 |
≤ 1,0 |
≤ 0,6 |
≤ 0,4 |
≤ 0,2 |
≤ 0,2 |
≤ 0,20 |
≤ 0,30 |
≤ 0,5 |
≤ 0,1 |
≤ 4,0 |
< Camp. |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 000 |
≤ 4,5 |
|
5 Olivenolie, blandet |
≤ 0,05 |
≤ 1,0 |
≤ 0,6 |
≤ 0,4 |
≤ 0,2 |
≤ 0,2 |
≤ 0,20 |
≤ 0,30 |
≤ 0,5 |
≤ 0,1 |
≤ 4,0 |
< Camp. |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 000 |
≤ 4,5 |
|
6 Rå olie af olivenpresserester |
≤ 0,05 |
≤ 1,0 |
≤ 0,6 |
≤ 0,4 |
≤ 0,3 |
≤ 0,2 |
≤ 0,20 |
≤ 0,10 |
≤ 0,5 |
≤ 0,2 |
≤ 4,0 |
— |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 2 500 |
> 4,5 (4) |
|
7 Raffineret olie af olivenpresserester |
≤ 0,05 |
≤ 1,0 |
≤ 0,6 |
≤ 0,4 |
≤ 0,3 |
≤ 0,2 |
≤ 0,40 |
≤ 0,35 |
≤ 0,5 |
≤ 0,2 |
≤ 4,0 |
< Camp. |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 800 |
> 4,5 |
|
8 Olie af olivenpresserester |
≤ 0,05 |
≤ 1,0 |
≤ 0,6 |
≤ 0,4 |
≤ 0,3 |
≤ 0,2 |
≤ 0,40 |
≤ 0,35 |
≤ 0,5 |
≤ 0,2 |
≤ 4,0 |
< Camp. |
≥ 93,0 |
≤ 0,5 |
≥ 1 600 |
> 4,5 |
BILAG Ia
Udtagning af prøver af partier af olivenolie eller olie af olivenpresserester leveret i umiddelbare emballager på højst 100 liter
Denne prøveudtagningsmetode anvendes for partier af olivenolie eller olie af olivenpresserester på højst 125 000 liter, aftappet i umiddelbare emballager på højst 100 liter.
Hvis leverancen er på over 125 000 liter, opdeles den i partier på 125 000 liter eller derunder. Hvis leverancen er på under 125 000 liter, udgør den ét parti. Metoden anvendes da for hvert parti.
Ud fra partiets størrelse fastsættes det mindste antal basisprøver, der skal udtages, jf. tabellen i punkt 1.
Basisprøvens størrelse bestemmes ud fra de umiddelbare emballagers indhold, jf. tabellen i punkt 2.1.
Leverancer, basisprøver og laboratorieprøver svarer til definitionerne i EN ISO 5555.
Ved »parti« forstås de salgsenheder, der produceres, fremstilles og aftappes under sådanne forhold, at olien i alle disse salgsenheder anses for homogen med hensyn til alle analysekendetegn.
1. ANTAL BASISPRØVER
Det mindste antal basisprøver, der skal udtages, fastsættes på grundlag af partiets størrelse som vist i nedenstående tabel:
|
Parti (liter) på under |
Mindste antal basisprøver |
|
7 500 |
2 |
|
25 000 |
3 |
|
75 000 |
4 |
|
125 000 |
5 |
Til basisprøven udvælges umiddelbare emballager, som står ved siden af hinanden i partiet.
I tvivlstilfælde kan medlemsstaterne forøge det antal basisprøver, der skal udtages.
2. BASISPRØVENS INDHOLD
2.1 En basisprøve omfatter følgende:
|
Hvis de umiddelbare emballager indeholder: |
tages basisprøven af olien i: |
|
a) 5 liter eller derover |
a) 3 umiddelbare emballager |
|
b) 3 liter eller derover, men under 5 liter |
b) 3 umiddelbare emballager |
|
c) 2 liter eller derover, men under 3 liter |
c) 3 umiddelbare emballager |
|
d) 1 liter eller derover, men under 2 liter |
d) 6 umiddelbare emballager |
|
e) 0,75 liter eller derover, men under 1 liter |
e) 6 umiddelbare emballager |
|
f) under 0,75 liter |
f) 3 gange olien i det mindste antal emballager, hvis samlede indhold overstiger 1,5 liter |
2.2 Basisprøverne skal opbevares i de umiddelbare emballager indtil det tidspunkt, hvor analyserne foretages. Olien i basisprøverne opdeles derpå i givet fald i tre laboratorieprøver med henblik på at foretage:
a) analyserne i bilag II, III, IX og X
b) analysen i bilag XII
c) de øvrige analyser.
2.3 Emballager, der udgør en basisprøve, opdeles efter de kontrolprocedurer, der er fastsat i de nationale lovgivninger.
3. ANALYSER OG RESULTATER
a) Hver basisprøve som omhandlet i punkt 1 opdeles i laboratorieprøver, jf. punkt 2.5 i standard EN ISO 5555, med henblik på at blive underkastet følgende analyser:
— bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer, jf. artikel 2, stk. 1, første led
— bestemmelse af peroxidtallet, jf. artikel 2, stk. 1, andet led
— spektrofotometrisk undersøgelse, jf. artikel 2, stk. 1, ottende led
— fedtsyrernes sammensætning, jf. artikel 2, stk. 1, niende led.
b) Hvis alle analyseresultaterne, jf. litra a), for mindst en af basisprøverne fra samme parti ikke svarer til kendetegnene for den anmeldte oliekategori, anses hele det pågældende parti for ikke at opfylde kravene.
Hvis analyseresultaterne, jf. litra a), for hver af basisprøverne fra samme parti ikke alle er homogene under hensyntagen til repeterbarheden af de pågældende metoder, anses hele partiet for at være uhomogent, og hver basisprøve skal underkastes de øvrige foreskrevne analyser. I modsat fald skal kun en af basisprøverne fra dette parti underkastes de foreskrevne analyser.
c) Hvis et af analyseresultaterne, jf. litra b), andet afsnit, ikke svarer til kendetegnene for den anmeldte oliekategori, anses hele det pågældende parti for ikke at opfylde kravene.
Hvis alle analyseresultaterne, jf. litra b), andet afsnit, svarer til kendetegnene for den anmeldte oliekategori, anses hele det pågældende parti for at opfylde kravene.
BILAG Ib
BESLUTNINGSSKEMA TIL KONTROL AF, OM EN OLIVENOLIEPRØVE SVARER TIL DEN ANMELDTE KATEGORI
Analyse af, om en olivenolie eller olie af olivenpresserester svarer til den anmeldte kategori, kan foretages:
a) enten ved i vilkårlig rækkefølge at udføre de analyser, der er fastsat til kontrol af, at de i bilag I fastsatte kendetegn er overholdt
b) eller ved i den i beslutningsskemaet fastsatte rækkefølge at udføre de deri fastsatte analyser, indtil man når frem til en af de i skemaet nævnte beslutninger.
De analyser vedrørende forurenende stoffer, der er nødvendige for at fastslå, om et produkt overholder EF's normer, udføres særskilt.
Beslutningsskemaet skal anvendes for alle kategorier af olivenolie og olie af olivenpresserester. Det består af tabeller med numrene 1 til 11, der skal anvendes som foreskrevet og i den i oversigtstabellen angivne rækkefølge afhængigt af, hvilken kategori olie der er anmeldt.
Oversigtstabellen og tabel 1 til 11 læses som følger:
— En dobbelt linje (=) angiver den vej, der skal følges i tilfælde af overensstemmelse (positivt svar) med betingelserne i den foregående rubrik; en stiplet linje (…) angiver omvendt, hvilken vej der skal følges i tilfælde af manglende overensstemmelse.
— Overskrifterne i rubrikkerne i tabel 1 til 11 vedrører de i denne forordning fastsatte analyser på grundlag af de sammenligninger, der er nævnt i tillæg 1 til dette bilag.
— Referencebogstaverne i cirklerne for negativ beslutning i tabel 1 til 11 svarer til de vejledende oplysninger, der er nævnt i tillæg 2 til dette bilag. De indebærer ikke i sig selv nogen forpligtelse til at fortsætte analyserne eller sikkerhed for de nævnte formodninger.
Oversigtstabel
Tabel 1
Tabel 2
Tabel 3
Tabel 4
Tabel 5
Tabel 6
Tabel 7
Tabel 8
Tabel 9
Tabel 10
Tabel 11
Tillæg 1
Overensstemmelse mellem bilagene til denne forordning og de i beslutningsskemaet nævnte analyser
|
— Syreindhold |
Bilag II |
Bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer, kold metode |
|
— Peroxidtal |
Bilag III |
Bestemmelse af peroxidtal |
|
— Spektrofotometri ved ultraviolet lys |
Bilag IX |
Spektrofotometrisk analyse |
|
— Organoleptisk vurdering |
Bilag XII |
Organoleptisk vurdering af jomfruolie |
|
— Stigmasta-3,5-dien |
Bilag XVII |
Metode til bestemmelse af indhold af stigmastadiener i vegetabilske olier |
|
— Transisomerer i fedtsyrer |
Bilag X a og |
Gaskromatografianalyse af fedtsyremethylestere |
|
Bilag X b |
Forberedelse af fedtsyremethylestere |
|
|
— Sammensætning af fedtsyrer |
Bilag X a og |
Gaskromatografianalyse af fedtsyremethylestere |
|
Bilag X b |
Forberedelse af fedtsyremethylestere |
|
|
— ΔECN42 |
Bilag XVIII |
Bestemmelse af sammensætning af triglycerider i ECN42 (forskel mellem faktisk og teoretisk sammensætning) |
|
— Sammensætning af steroler og steroler i alt |
Bilag V |
Bestemmelse af sammensætning og indhold af steroler ved gaskromatografi på kapillarsøjle |
|
— Erytrodiol og uvaol |
Bilag VI |
Bestemmelse af indhold af erytrodiol og uvaol |
|
— Voks |
Bilag IV |
Bestemmelse af voksindhold ved gaskromatografi på kapillarsøjle |
|
— Alifatiske alkoholer |
Bilag XIX |
Bestemmelse af indhold af alifatiske alkoholer ved gaskromatografi på kapillarsøjle |
|
— Mættede fedtsyrer i 2-stillingen |
Bilag VII |
Bestemmelse af indholdet af 2-glycerylmonopalmitat i procent |
Tillæg 2
Tabel 1
a) Se jomfruolie eller bomolie (tabel 2: kvalitetskriterier eller tabel 4: kvalitets- og renhedskriterier)
b) Se bomolie (tabel 4: kvalitets- og renhedskriterier)
Tabel 2
a) Se bomolie (tabel 4: kvalitets- og renhedskriterier)
b) Se jomfruolie ekstra (tabel 1: kvalitetskriterier)
Tabel 3
a) Tilstedeværelse af raffineret olie (oliven- eller anden olie)
b) Tilstedeværelse af olivenolie af presserester
Tabel 4
a) Se jomfruolie ekstra og jomfruolie (tabel 1 og 2: kvalitetskriterier)
b) Tilstedeværelse af raffineret olie (oliven- eller anden olie)
c) Tilstedeværelse af olivenolie af presserester
d) Tilstedeværelse af forestrede olier
Tabel 7
a) Tilstedeværelse af olivenolie af presserester
b) Tilstedeværelse af forestrede olier
Tabel 8
a) Tilstedeværelse af raffineret olie (oliven- eller anden olie)
b) Se bomolie (tabel 4: kvalitets- og renhedskriterier)
c) Tilstedeværelse af forestrede olier
Tabel 11
a) Tilstedeværelse af forestrede olier
BILAG II
BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF FRIE FEDTSYRER, KOLD METODE
1. FORMÅL
Bestemmelse af frie fedtsyrer i olivenolie. Indholdet af frie fedtsyrer udtrykkes ved det vedtægtsmæssigt beregnede syreindhold.
1.1. Princip
En analyseprøve opløses i en blanding af opløsningsmidler, hvorefter de tilstedeværende frie fedtsyrer bestemmes ved hjælp af en opløsning af kaliumhydroxid i ethanol.
1.2. Reagenser
Samtlige reagenser skal være af anerkendt analysekvalitet, og der anvendes destilleret vand eller vand af tilsvarende renhed.
|
1.2.1. |
Dietyhlether/ethanol, 95 % (v/v), blandet i forholdet 1:1 efter rumfang. Note: Dietylether er meget let antændelig og kan danne eksplosive peroxider. Under anvendelsen skal der træffes særlige forholdsregler. Nøjagtigt på anvendelsestidspunktet neutraliseres med en opløsning af kaliumhydroxid (1.2.2) ved tilstedeværelse af 0,3 ml phenolphtalein-opløsning (1.2.3) pr. 100 ml blanding. Note: Hvis det ikke er muligt at anvende diethylether, kan en blanding af opløsningsmidler bestående af ethanol og toluen anvendes. Om nødvendigt kan ethanolen erstattes af 2-propanol. |
|
1.2.2. |
Indstillet opløsning af kaliumhydroxid i ethanol, c(KOH) ca. 0,1 mol/l eller om nødvendigt c(KOH) ca. 0,5 mol/l. Den nøjagtige koncentration af kaliumhydroxid-opløsningen i ethanol skal være kendt og verificeres umiddelbart før brug. Der anvendes en opløsning, der er fremstillet mindst fem dage før brugen, og dekanteret over i en flaske af brunt glas, lukket med en gummiprop. Opløsningen skal være farveløs eller strågul. Note: En ufarvet stabil opløsning af kaliumhydroxid kan fremstilles på følgende måde: 1 000 ml ethanol med 8 g kaliumhydroxid og 0,5 g aluminiumspåner bringes i kog og holdes kogende i 1 time med tilbageløb. Derefter destilleres omgående, og den krævede mængde kaliumhydroxid opløses i destillatet. Man lader opløsningen henstå i flere dage og dekanterer derefter den øverste klare væske fra bundfaldet af kaliumcarbonat. Opløsingen kan også fremstilles uden destillation på følgende måde: til 1 000 ml ethanol tilsættes 4 ml aluminiumbutylat, hvorefter man lader blandingen henstå i nogle dage. Derefter dekanteres den klare væske fra, og heri opløses den krævede mængde kaliumhydroxid. Denne opløsning er klar til brug. |
|
1.2.3. |
Phenolphtalein, opløsning med 10 g/l i 95—96 % (v/v) ethanol, eller alkaliblåt (i tilfælde af stærkt farvede fedtstoffer), opløsning med 20 g/l i 95—96 % (v/v) ethanol. |
1.3. Apparatur
Sædvanligt laboratorieudstyr, herunder:
|
1.3.1. |
Analysevægt. |
|
1.3.2. |
250 ml Erlenmeyer-kolbe. |
|
1.3.3. |
10 ml burette med 0,05 ml inddelinger. |
1.4. Fremgangsmåde
|
1.4.1. |
Forberedelse af analyseprøve Analyseprøven forberedes i overensstemmelse med NF T 60—200. (På prøven som den er, hvis det samlede indhold af vand og urenheder ikke overstiger 1 %, ellers på en filtreret prøve). Bestemmelsen foretages på den filtrerede prøve. Hvis det samlede indhold af vand og urenheder er under 1 %, foretages bestemmelsen på den ubehandlede prøve. |
|
1.4.2. |
Prøveudtagning Ud fra det antagne syreindhold udtages en prøve efter angivelserne i følgende tabel:
Prøven afvejes i Erlenmeyer-kolben (1.3.2). |
|
1.4.3. |
Bestemmelse Prøven (1.4.2) opløses i 50 — 150 ml af den på forhånd neutraliserede blanding af diethylether/ethanol (1.2.1). Under omrøring titreres med kaliumhydroxidopløsning, 0,1 mol/l (1.2.2) (se note 2), indtil indikatoren slår om (den rosa farve af phenolphtalein skal holde sig i mindst 10 sek.). Note 1: Den indstillede opløsning af kaliumhydroxid i ethanol (1.2.2) kan erstattes af en vandig opløsning af kaliumhydroxid eller natriumhydroxid, når den tilførte vandmængde ikke medfører faseadskillelse. Note 2: Hvis den nødvendige mængde 0,1 mol/l kaliumhydroxidopløsning overstiger 10 ml, anvendes i stedet en opløsning på 0,5 mol/l. Note 3: Bliver opløsningen uklar under titreringen, tilsættes så meget opløsningsmiddelblanding (1.2.1), at opløsningen bliver klar. |
1.5. Angivelse af syreindholdet i % oliesyre
Syreindholdet, udtrykt som vægtprocent =
hvor:
V = rumfanget i ml af den forbrugte kaliumhydroxidopløsning
c = den nøjagtige koncentration i mol/l af den anvendte kaliumhydroxidopløsning
M = den molvægt i g/mol af syren, der er valgt til angivelse af resultatet (Moliesyre = 282 g/mol)
m = analyseprøvens vægt i gram.
Som resultat anvendes det aritmetiske gennemsnit ►M6 af to bestemmelser ◄ .
BILAG III
BESTEMMELSE AF PEROXIDTALLET
1. OMRÅDE
Denne standard beskriver en metode til bestemmelse af peroxidtallet for olier og fedtstoffer.
2. ANVENDELSESOMRÅDE
Denne standard finder anvendelse for animalske og vegetabilske olier og fedtstoffer.
3. DEFINITION
Peroxidtallet angiver den mængde stoffer i prøven, udtrykt som milliækvivalenter aktivt oxygen pr. kg, som oxiderer kaliumiodid under de beskrevne forsøgsbetingelser.
4. PRINCIP
Analyseprøven, opløst i en blanding af eddikesyre og chloroform, behandles med en opløsning af kaliumiodid. Det frigjorte iod titreres med en indstillet natriumthiosulfatopløsning.
5. APPARATUR
Alt udstyr skal være fri for reducerende og oxiderende stoffer.
Note:
Sliboverflader må ikke indfedtes.
|
5.1. |
3 ml glasske. |
|
5.2. |
Kolber med slib og prop, på ca. 250 ml, som på forhånd tørres og fyldes med ren, tør inert gas (nitrogen eller — helst — carbondioxid). |
|
5.3. |
25 eller 50 ml burette med 0,1 ml inddeling. |
6. REAGENSER
|
6.1. |
Analyseren chloroform, befriet for oxygen ved gennembobling med ren, tør inert gas. |
|
6.2. |
Analyseren iseddike, befriet for oxygen ved gennembobling med ren, tør inert gas. |
|
6.3. |
Mættet vandig opløsning af kaliumiodid, fremstillet umiddelbart før brug og fri for iod og iodater. |
|
6.4. |
Natriumthiosulfat, 0,01 eller 0,002 N nøjagtigt indstillet vandig opløsning, indstillet umiddelbart før brug. |
|
6.5. |
Stivelsesopløsning, 10 g/l vandig opslæmning, fremstillet umiddelbart før brug ud fra naturlig opløselig stivelse. |
7. PRØVE
Prøven udtages og opbevares beskyttet mod lys, holdes nedkølet og opbevares i fuldstændigt fyldte glasbeholdere, der er hermetisk tillukket med slibpropper af glas eller korkpropper.
8. FREMGANGSMÅDE
Analysen udføres i diffust dagslys eller i kunstigt lys. I en glasske (5.1) eller i mangel heraf en kolbe (5.2) afvejes med en nøjagtighed på 0,001 g en prøvemængde i overensstemmelse med følgende tabel, svarende til det forventede peroxidtal:
|
Forventet perioxidtal (meq O2/kg) |
Analyseprøvens vægt (i g) |
|
0 — 12 |
5,0 — 2,0 |
|
12 — 20 |
2,0 — 1,2 |
|
20 — 30 |
1,2 — 0,8 |
|
30 — 50 |
0,8 — 0,5 |
|
50 — 90 |
0,5 — 0,3 |
Proppen tages af en kolbe (5.2), og analyseprøven i glasskeen overføres til kolben. Der tilsættes 10 ml chloroform (6.1), og analyseprøven opløses hurtigt ved omrystning. Derefter tilsættes 15 ml eddikesyre (6.2), efterfulgt af 1 ml kaliumiodidopløsning (6.3). Så sættes proppen hurtigt i, og der omrystes i 1 min., hvorefter man lader kolben henstå i nøjagtigt 5 min. i mørke ved en temperatur på 15 — 25° C.
Der tilsættes ca. 75 ml destilleret vand, og det frigjorte iod titreres med natriumthiosulfatopløsning (6.4) (0,002 N opløsning for forventede værdier under 12, og 0,01 N opløsning for forventede værdier over 12) under kraftig omrystning og med anvendelse af stivelsesopløsning (6.4) som indikator.
Der udføres to bestemmelser på samme analyseprøve.
Samtidig udføres en blindprøve. Hvis resultatet af blindprøven overstiger 0,05 ml 0,01 N natriumthiosulfatopløsning (6.4), udskiftes de urene reagenser.
9. ANGIVELSE AF RESULTATERNE
Perioxidtallet (P.V.), udtrykt i milliækvivalenter aktivt oxygen pr. kg, er givet ved formlen:
hvor:
V = antal ml forbrugt indstillet natriumthiosulfatopløsning (6.4) ved analysen, korrigeret for resultatet af blindprøven
T = den nøjagtige normalitet af den anvendte natriumthiosulfatopløsning (6.4),
m = analyseprøvens vægt i g.
Som resultat angives det aritmetiske gennemsnit af de to udførte bestemmelser.
BILAG IV
BESTEMMELSE AF VOKSINDHOLD VED GASKROMATOGRAFERING MED KAPILLARKOLONNE
1. GENSTAND
Metoden er en procedure til bestemmelse af voksindholdet i olivenolie. Vokserne adskilles efter antallet af kulstofatomer. Metoden er navnlig velegnet, når der skal skelnes mellem olivenolie, der er udvundet ved presning, og olivenolie, der er udvundet ved ekstraktion (af presserester).
2. PRINCIP
Der tilsættes en egnet intern standard til olien, hvorefter adskillelsen finder sted ved kromatografering på en kolonne med hydratiseret silicagel. Den fraktion, der først elueres under prøvebetingelserne (og som har lavere polaritet end triglyceriderne), opsamles og analyseres direkte ved gaskromatografi med kapillarkolonne.
3. APPARATUR
|
3.1. |
25 ml erlenmeyerkolbe |
|
3.2. |
kromatografikolonne af glas, indvendig diameter 15,0 mm, længde 30-40 cm, med hane |
|
3.3. |
gaskromatograf til brug med kapillarkolonne og med et system til direkte indsprøjtning i kolonnen, bestående af følgende:
|
|
3.4. |
mikroinjektionssprøjte på 10 μl med hærdet kanyle til direkte indsprøjtning i kolonnen |
|
3.5. |
elektrisk vibrator |
|
3.6. |
rotationsfordamper |
|
3.7. |
muffelovn |
|
3.8. |
analysevægt med en nøjagtighed på ± 0,1 mg |
|
3.9. |
sædvanligt glasudstyr. |
4. REAGENSER
|
4.1. |
silicagel med kornstørrelse 60-200 μm Silicagelen anbringes i ovnen ved 500 °C i mindst fire timer. Efter afkøling tilsættes der 2 % vand beregnet på silicagelmængden. Pulveret rystes omhyggeligt, til det er ensartet. Opbevares i mørke i mindst tolv timer inden brug. |
|
4.2. |
n-hexan til kromatografi |
|
4.3. |
ethylether til kromatografering |
|
4.4. |
n-heptan til kromatografi |
|
4.5. |
kalibreringsopløsning af 0,1 % (m/v) laurylarachidat i hexan (intern standard) (Der kan også bruges palmitylpalmitat eller myristylstearat.)
|
|
4.6. |
bæregas: hydrogen eller helium, ren, til gaskromatografi |
|
4.7. |
hjælpegasser: — hydrogen, ren, til gaskromatografi — luft, ren, til gaskromatografi. |
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. Fremstilling af kromatografikolonnen
15 g silicagel (4.1) opslæmmes i n-hexan (4.2) og hældes i kolonnen (3.2). Når kolonnematerialet har sat sig ved henstand, pakkes det yderligere ved hjælp af en el-vibrator (3.5) for at opnå større homogenitet. Der elueres med 30 ml n-hexan for at fjerne eventuelle urenheder. På vægten (3.8) afvejes der nøjagtig 500 mg af prøven i en 25 ml erlenmeyerkolbe (3.1), og der tilsættes en mængde intern standard (4.5) svarende til det formodede voksindhold. F.eks. tilsættes der 0,1 mg laurylarachidat til presset olivenolie og 0,25-0,5 mg til olie af presserester. Den tilberedte prøve overføres til kromatografikolonnen ved hjælp af to portioner n-hexan (4.2) a 2 ml.
Der aftappes opløsningsmiddel, indtil væskeoverfladen står 1 mm over kolonnematerialet, og ved eluering med yderligere 70 ml n-hexan fjernes det naturlige indhold af n-alkaner. Kromatograferingen startes dernæst ved, at 180 ml af n-hexan/ethylether-blandingen i forholdet 99:1 opsamles med en hastighed på ca. 15 dråber pr. 10 sekunder. Prøveelueringen foretages ved en rumtemperatur på 22 ± 4 °C.
Bemærkninger:
— n-hexan/ethylether-blandingen (99:1) skal friskfremstilles hver dag.
— Korrekt eluering af vokserne kan kontrolleres visuelt ved, at der til prøveopløsningen tilsættes 100 μl 1 % Sudan 1 i elueringsvæsken. Farvestoffet har en retentionstid mellem vokser og triglycerider, så når farven har nået bunden af kolonnen, bør elueringen standses, eftersom al voks da er elueret.
Den derved fremkomne fraktion inddampes i en rotationsfordamper (3.6), indtil opløsningsmidlet næsten helt er forsvundet. De sidste 2 ml opløsningsmiddel fjernes ved hjælp af en svag nitrogenstrøm, og derefter tilsættes der 2-4 ml n-heptan.
5.2. Gaskromatografisk analyse
5.2.1. Indledende procedure
Kolonnen påmonteres gaskromatografen (3.3), idet den ene ende forbindes med injektionssystemet og den anden ende med detektoren. Gaskromatografen kontrolleres (gasledningerne, detektors og skrivers ydeevne, m.v.).
Hvis kolonnen ikke har været benyttet før, kan det anbefales at konditionere den. En svag gasstrøm ledes gennem kolonnen, hvorefter gaskromatografen sættes i gang. Der opvarmes gradvis til 350 °C over en periode på ca. fire timer. Denne temperatur holdes i mindst to timer, hvorefter apparaturet indstilles til arbejdsbetingelserne (gasstrømmen indstilles, der tændes for flammen, den elektroniske skriver (3.3.4) tilsluttes, kolonneovnens og detektorens temperatur indstilles, osv.). Signalet registreres med en følsomhed på mindst det dobbelte af den, der kræves for at foretage analysen. Basislinjen bør være lineær uden nogen form for toppe og uden nogen forstyrrelser.
Negativ drift tyder på utætheder i kolonneforbindelserne, mens positiv drift er tegn på utilstrækkelig konditionering af kolonnen.
5.2.2. Valg af arbejdsbetingelser
Arbejdsbetingelserne er normalt som følger:
— kolonnetemperatur:
—
|
20 °C/minut |
5 °C/minut |
20 °C/minut |
||||
|
fra 80 °C (1′) |
→ |
240 °C |
→ |
325 °C (6′) |
→ |
340 °C (10′) |
— detektortemperatur: 350 °C
— indsprøjtet mængde: 1 μl af opløsningen i (2-4 ml) n-heptan
— bæregas: helium eller hydrogen med den for den valgte gas optimale lineære hastighed (se tillægget)
— instrumentfølsomhed: skal opfylde nedenstående krav:
Disse betingelser kan ændres alt efter kolonnens og gaskromatografens karakteristika, så man opnår adskillelse af alle vokser, en tilfredsstillende opløsning af toppene (se figuren) og en retentionstid for den interne C32-standard på 18 ± 3 minutter. Voksernes mest repræsentative top skal måle mindst 60 % af fuldt udslag.
Parametrene for toppenes integration fastlægges på en sådan måde, at de relevante toppes arealer vurderes korrekt.
Bemærkning: På grund af den høje sluttemperatur, tillades der en positiv drift på op til 10 % af fuldt udslag.
5.3. Udførelse af analysen
Der suges 1 μl af opløsningen op i 10 μl-mikrosprøjten, og stemplet trækkes tilbage, så kanylen er tom. Kanylen stikkes ind i injektionssystemet, og der indsprøjtes hurtigt efter 1-2 sekunder. Efter ca. 5 sekunder trækkes kanylen forsigtigt ud.
Registreringen fortsættes, indtil alle vokserne er helt elueret.
Basislinjen skal hele tiden opfylde de fastsatte betingelser.
5.4. Identifikation af toppene
Toppene identificeres ud fra retentionstiderne, idet de sammenlignes med blandinger af vokser med kendte retentionstider analyseret under samme betingelser.
Figuren viser et kromatogram af vokser fra jomfruolie.
5.5. Kvantitativ vurdering
Arealerne af toppene for den interne standard og de alifatiske C40-C46-estere bestemmes ved hjælp af integratoren.
Indholdet af hver af voksesterne bestemmes i mg pr. kg fedtstof efter formlen:
hvor:
|
Ax |
= |
arealet af toppen for den enkelte ester i kvadratmillimeter |
|
As |
= |
arealet af toppen for den interne standard i kvadratmillimeter |
|
ms |
= |
massen af tilsat intern standard i milligram |
|
m |
= |
massen af den prøve, der er udtaget til analyse, i gram. |
6. ANGIVELSE AF RESULTATER
Summen af de forskellige C40-C46-vokser angives i mg pr. kg fedtstof (ppm).
Bemærkning: De bestanddele, der skal bestemmes kvantitativt, er dem med toppe, der kan identificeres som C40-C46-estere med et lige antal kulstofatomer, jf. kromatogrammet af vokser fra jomfruolie i nedenstående figur. Hvis C46-esteren giver en dobbelt top, tilrådes den identificeret ved analyse af voksfraktionen fra olie af olivenpresserester, hvor C46-toppen let kan identificeres på grund af sin størrelse.
Resultaterne angives med en decimal.
Figur
Kromatogram af vokser fra jomfruolie ( 5 )
Signaturer:
|
I.S. |
= |
laurylarachidat |
|
1. |
= |
diterpenestere |
|
2 + 2′ |
= |
C40-estere |
|
3 + 3′ |
= |
C42-estere |
|
4 + 4′ |
= |
C44-estere |
|
5 |
= |
C46-estere |
|
6 |
= |
sterolestere og triterpenalkoholer. |
APPENDIKS
Bestemmelse af gassens lineære hastighed
Der indsprøjtes 1-3 μl methan (eller propan) i gaskromatografen, efter at den er indstillet til normale arbejdsbetingelser. Den tid, som det tager gassen at strømme gennem kolonnen, fra det øjeblik, den indsprøjtes, til toppen viser sig, måles (tM).
Den lineære hastighed i cm/s beregnes ved formlen L/tM, hvor L er kolonnens længde i cm og tM tiden målt i sekunder.
BILAG V
BESTEMMELSE AF SAMMENSÆTNINGEN OG INDHOLDET AF STEROLER VED GASKROMATOGRAFI PÅ KAPILLARSØJLE
1. OMRÅDE
Metoden beskriver en fremgangsmåde til bestemmelse af indholdet af de enkelte steroler og det samlede sterolindhold i fedtstoffer.
2. METODENS PRINCIP
Fedtstoffer, med α-cholestanol tilsat som en intern standard, forsæbes med kaliumhydroxid i ethanolopløsning, og de bestanddele, der ikke kan forsæbes, ekstraheres derefter med diethylether.
Sterolfraktionen adskilles fra ekstrakten af stoffer, som ikke kan forsæbes, ved kromatografi på en basisk kiselgelplade. De steroler, som genvindes fra kiselgelen, omdannes til trimethylsilylethere og analyseres ved hjælp af gaskromatografi på kapillarsøjle.
3. APPARATUR
|
3.1. |
250 ml kolbe monteret med en refluxsvaler med samlinger med glasslib. |
|
3.2. |
500 ml skilletragte. |
|
3.3. |
250 ml kolber. |
|
3.4. |
Komplet apparatur til analyse ved tyndtlagskromatografi med 20 × 20 cm glasplader. |
|
3.5. |
Ultraviolet lampe med en bølgelængde på 366 eller 254 nm. |
|
3.6. |
100 μl og 500 μl mikrosprøjter. |
|
3.7. |
En cylindrisk filtertragt med et G3 porøst septum (porøsitet 15—40 μm), med en diameter på ca. 2 cm og en dybde på ca. 5 cm, med en befæstelsesdel, der er egnet til filtrering under vakuum, og en samlingsdel med et 12/21 udvendig konisk glasslib. |
|
3.8. |
En 50 ml konisk vakuumkolbe med et 12/21 indvendig konisk glasslib, som filtertragten (3.7) kan monteres på. |
|
3.9. |
Et 10 ml prøverør med konisk bund og tætsluttende prop. |
|
3.10. |
En gaskromatograf, der er egnet til brug med kapillarsøjle, forsynet med et spaltningssystem, der består af:
|
|
3.11. |
En kapillarsøjle af glas eller kvartsglas, med en længde på 20—30 m, en indre diameter på 0,25—0,32 mm, helt overtrukket med SE-52 eller SE-54 væske eller tilsvarende i en ensartet tykkelse på mellem 0,10 og 0,30 μm. |
|
3.12. |
En 10 μl gaskromatografi-mikrosprøjte med hærdet kanyle. |
4. REAGENSER
|
4.1. |
Kaliumhydroxid, ca. 2 N, i ethanolopløsning. 130 g kaliumhydroxid (minimum titer 85 %) opløses i 200 ml destilleret vand under afkøling, og der fyldes op med ethanol til 1 liter. Opløsningen opbevares i veltilproppede, mørke glasflasker. |
|
4.2. |
Diethylether, analyseren. |
|
4.3. |
Vandfrit natriumsulfat, analyserent. |
|
4.4. |
Glasplader overtrukket med kiselgel, uden fluorescensindikator, tykkelse 0,25 mm (kan fås brugsfærdige i handelen). |
|
4.5. |
Kaliumhydroxid, 0,2 N, i ethanolopløsning. 13 g kaliumhydroxid opløses i 20 ml destilleret vand, og der fyldes op med ethanol til 1 liter. |
|
4.6. |
Benzen, til kromatografi (5.2.2). |
|
4.7. |
Acetone, til kromatografi (5.2.2). |
|
4.8. |
Hexan, til kromatografi (5.2.2). |
|
4.9. |
Diethylether, til kromatografi (5.2.2). |
|
4.10. |
Chloroform, analyseren. |
|
4.11. |
Referenceopløsning til tyndtlagskromatografi: cholesterol eller phytosteroler, ►M6 2 % ◄ opløsning i chloroform. |
|
4.12. |
2,7-dichlorfluorescein, 0,2 % opløsning i ethanol. Gøres svagt basisk ved tilsætning af nogle få dråber 2 N alkoholisk kaliumhydroxidopløsning. |
|
4.13. |
Vandfri pyridin til kromatografi. |
|
4.14. |
Hexamethyldisilazan. |
|
4.15. |
Trimethylchlorsilan. |
|
4.16. |
Referenceopløsninger af sterol-trimethylsilylethere (TMSE). Friskfremstillet ud fra rene steroler eller blandinger af steroler udvundet af sterolholdige olier. |
|
4.17. |
α-cholestanol, 0,2 % opløsning (m/v) i chloroform (intern standard). |
|
4.18. |
Bæregas: Hydrogen eller helium, gaskromatografiren. |
|
4.19. |
Hjælpegasser: — Hydrogen, gaskromatografiren — Luft, gaskromatografiren. |
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. Forberedelse af de ikke-forsæbelige stoffer
|
5.1.1. |
Et rumfang 0,2 % α-cholestanolopløsning i chloroform (4.17), der indeholder en mængde α-cholestanol svarende til ca. 10 % af sterolindholdet i den del af prøven, der er taget ud til bestemmelsen, indføres i 250 ml kolben ved hjælp af 500 μl mikrosprøjten. F.eks. sættes til 5 g af prøven 500 μl 0,2 % α-cholestanolopløsning, hvis undersøgelsen gælder olivenolie, og 1 500 μl, hvis det gælder ►M6 ————— ◄ olie fra olivenpresserester. Prøven inddampes til tørhed i en nitrogenstrøm, hvorefter 5 g af den tørrede, filtrerede prøve afvejes nøjagtigt og overføres til den samme kolbe. ►M6 ————— ◄ Olier ►M6 ————— ◄ , der indeholder betydelige mængder cholesterol, kan vise en top, der har den samme retentionstid som α-cholestanol. Hvis det forekommer, må sterolfraktionen analyseres to gange med og uden intern standard ►M6 eller der anvendes betulinol i stedet for cholestanol ◄ . |
|
5.1.2. |
50 ml 2 N kaliumhydroxid i ethanolopløsning tilsættes, refluxsvaleren påsættes, og væsken opvarmes til svag kogning på vandbad under vedvarende, kraftig omrøring, indtil forsæbningen sker (opløsningen bliver klar). Opvarmningen fortsættes i endnu 20 minutter, derefter tilsættes 50 ml destilleret vand fra den øverste del af svaleren, svaleren tages af, og kolben afkøles til ca. 30° C. |
|
5.1.3. |
Kolbens indhold overføres kvantitativt til en 500 ml skilletragt, idet der skylles flere gange med destilleret vand, ialt ca. 50 ml. Ca. 80 ml diethylether tilsættes, tragten rystes kraftigt i ca. 30 sekunder og får lov til at henstå (note 1). Den nederste, vandige fase tappes af og opsamles i en anden skilletragt. Yderligere to ekstraktioner foretages på den vandige fase på samme måde, idet der bruges 60—70 ml diethylether hver gang. Note 1: Eventuel emulsion kan ødelægges ved tilsætning af små mængder ethyl- eller methylalkohol ved hjælp af en spray. |
|
5.1.4. |
Etherekstrakterne samles i en enkelt skilletragt og vaskes med destilleret vand (50 ml ad gangen), indtil vaskevandet giver en neutral reaktion. Når vaskevandet er fjernet, tørres ekstrakterne med vandfrit natriumsulfat og filtreres på vandfrit natriumsulfat ned i en på forhånd vejet 250 ml kolbe, idet tragt og filter vaskes med små mængder diethylether. |
|
5.1.5. |
Etheren destilleres ned til nogle få ml og bringes derefter til tørhed under et let undertryk eller i en nitrogenstrøm, tørres fuldstændigt i en ovn ved 100° C i ca. 15 minutter, og vejes så efter afkøling i en ekssikkator. |
5.2. Separation af sterolfraktionen
|
5.2.1. |
Forberedelse af de basiske plader. Kiselgelpladerne (4.4) nedsænkes fuldstændig i 0,2 N opløsningen af kaliumhydroxid i ethanol (4.5) i 10 sekunder. Derefter får de lov at tørre i et stinkskab i 2 timer og sættes til sidst i en ovn ved 100° C i 1 time. Pladerne tages ud af ovnen og opbevares i en calciumchlorid-ekssikkator, til de skal bruges (plader, der er behandlet på denne måde, skal anvendes inden 15 dage). Note 2: Når basiske kiselgelplader benyttes til at separere sterolfraktionen, er det ikke, nødvendigt at behandle de ikke-forsæbelige stoffer med aluminiumoxid. På denne måde holdes alle sure forbindelser (fede syrer og andre) tilbage på basislinien, og sterolbåndet er klar adskilt fra de alifatiske og triterpene alkoholers bånd. |
|
5.2.2. |
En 95:5 (v/v) benzen/acetoneblanding anbringes i kromatografikammeret til en højde på ca. 1 cm. Som et alternativ kan en 65:35 (v/v) hexan/diethyletherblanding bruges. Kammeret lukkes med det dertil passende dæksel og efterlades således i ca. en halv time, så at der opnås ligevægt mellem væske og damp. Strimler af filtrerpapir, der dypper ned i eluenten, kan anbringes på kammerets indre overflader. Dette reducerer elueringstiden med ca. 1/3 og giver en mere ensartet og regelmæssig eluering af komponenterne. Note 3: Kromatografiblandingen bør udskiftes for hver test for at opnå fuldstændig reproducerbare elueringsbetingelser. |
|
5.2.3. |
Man tilbereder en ca. 5 % opløsning af de ikke-forsæbelige stoffer (5.1.5) i chloroform. Med 100 μl mikrosprøjten afsætter man på en kromatografiplade (5.2.1) med 0,3 ml, ca. 2 cm fra den ene ende, en streg, som er så tynd og ensartet som muligt. På linie med stregen placeres 2—3 μl af sterol-referenceopløsningen (4.11) i den ene ende af pladen, så sterolbåndet kan identificeres efter eluering. |
|
5.2.4. |
Pladen anbringes i kromatografikammeret, som er forberedt som angivet i 5.2.2. Den omgivende temperatur bør holdes mellem 15 og 20° C. Kammeret lukkes straks med dækslet, og det får lov til at eluere, indtil opløsningsmidlets forkant når ca. 1 cm fra pladens øverste kant. Derpå fjernes pladen fra kromatografikammeret, og man lader opløsningsmidlet fordampe i en strøm af varm luft eller ved at lade pladen stå en kort tid i et stinkskab. |
|
5.2.5. |
Pladen sprøjtes let og ensartet med 2,7-dichlorfluorosceinopløsningen. Når pladen observeres under ultraviolet lys, kan sterolbåndet identificeres ved, at det bringes på linie med den plet, der er opnået fra referenceopløsningen. Båndets grænser langs fluoroscenses kanter markeres med en sort blyant. |
|
5.2.6. |
Med en metalspatel skraber man kiselgelen af i det markerede område. Det fint pulveriserede materiale, der er fjernet, placeres i filtertragten (3.7). 10 ml varm chloroform tilsættes, man blander omhyggeligt med metalspatelen og filtrerer under vakuum; filtratet opsamles i den koniske kolbe (3.8), der er forbundet med filtertragten. Det tilbageholdte materiale i tragten vaskes tre gange med diethylether (ca. 10 ml hver gang), idet filtratet samles i den samme kolbe, der er forbundet med filtertragten. Filtratet inddampes til et rumfang af 4—5 ml, den tilbageværende opløsning overføres til det på forhånd vejede 10 ml prøverør (3.9), det inddampes til tørhed med let opvarmning i en blød strøm af nitrogen, der fyldes atter op med nogle få dråber acetone, der inddampes igen til tørhed, røret placeres i en ovn ved 105° C i ca. 10 minutter, derefter lader man det svale af i en ekssikkator og vejer det. Den rest, der findes i prøverøret, består af sterolfraktionen. |
5.3. Forberedelse af trimethylsilyletherne
|
5.3.1. |
Til prøverøret, der indeholder sterolfraktionen, sættes silyleringsreagenset, der består af en 9:3:1 (v/v/v) blanding af pyridin/hexamethyl-disilazan/trimethyl-chlorsilan (note 4), i forholdet 50 μl for hvert milligram sterol, idet enhver optagelse af fugt undgås (note 5). Note 4: Brugsfærdige opløsninger kan fås i handelen. Man kan også få andre silyleringsreagenser som f.eks. bis-trimethylsilyltrifluor-acetamid + 1 % trimethyl-chlorsilan, som skal fortyndes med et lige så stort rumfang vandfrit pyridin. |
|
5.3.2. |
Prøverøret tilproppes, rystes omhyggeligt (uden at vende bunden i vejret på det), indtil sterolerne er fuldstændig opløst. Man lader det stå i mindst 15 minutter ved stuetemperatur og centrifugerer det så i nogle få minutter. Den klare opløsning er parat til gaskromatografisk analyse. Note 5: Den lette opalisering, som kan fremkomme, er normal og giver ikke anledning til interferens. Hvis der dannes hvide fnug eller fremkommer en lyserød farve, er det et tegn på tilstedeværelsen af fugt eller svækkelse af reagensen. Hvis det forekommer, må prøven gentages. |
5.4. Gaskromatografisk analyse
|
5.4.1. |
Forberedende operationer, pakning af søjlen
|
|
5.4.2. |
Valg af driftsbetingelser
|
|
5.4.3. |
Analytisk fremgangsmåde
|
|
5.4.4. |
Identifikation af toppene De enkelte toppe identificeres på basis af retentionstiderne og ved sammenligning med blandinger af sterol-TMSE, der er analyseret under de samme betingelser. Sterolerne elueres i følgende rækkefølge: cholesterol, brassicasterol, 24-methylencholesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol, Δ-7-campesterol, Δ-5,23-stigmastadienol, clerosterol, β-sitosterol, sitostanol, Δ-5-avenasterol, Δ-5,24-stigmastadienol, Δ-7-stigmastenol, Δ-7-avenasterol. Retentionstiderne for β-sitosterol for SE 52 og SE 54 søjler er vist i tabel 1. Figur 1 og 2 illustrerer typiske kromatogrammer for nogle olier. |
|
5.4.5. |
Kvantitativ vurdering
|
6. RAPPORTERING AF RESULTATERNE
|
6.1. |
De individuelle sterolkoncentrationer angives som mg/100 g fedtstof og deres sum som »total sterolmængde«. |
|
6.2. |
Den procentvise andel af de individuelle steroler beregnes på grundlag af forholdet mellem arealet af den tilsvarende top og summen af arealerne af sterolernes toppe.
hvor: Ax = arealet af top x A = summen af arealerne af alle toppe. |
APPENDIX
Bestemmelse af gassens lineære hastighed
Med gaskromatografen indstillet på normale driftsbetingelser injiceres 1—3 μl methan (eller propan), og man måler den tid, det tager for gassen at passere gennem søjlen fra tidspunktet for injektionen til det tidspunkt, hvor toppen fremkommer (tM).
Den lineære hastighed i cm/s er givet ved L/tM, hvor L er søjlens længde i cm, og tM er den målte tid i sekunder.
Tabel 1
Relative retentionstider for steroler
|
Top |
Identifikation |
Relativ retentionstid |
||
|
SE 54 søjle |
SE 52 søjle |
|||
|
1 |
cholesterol |
Δ-5-cholesten-3-β-ol |
0,67 |
0,63 |
|
2 |
cholestanol |
5-α-cholestan-3-β-ol |
0,68 |
0,64 |
|
3 |
brassicasterol |
[24S]-24-methyl-Δ-5,22-cholestadien-3-β-ol |
0,73 |
0,71 |
|
4 |
24-methylen-cholesterol |
24-methylen-Δ-5,24-cholestadien-3-β-ol |
0,82 |
0,80 |
|
5 |
campesterol |
[24R]-24-methyl-Δ-5-cholesten-3-β-ol |
0,83 |
0,81 |
|
6 |
campestanol |
[24R]-24-methyl-cholestan-3-β-ol |
0,85 |
0,82 |
|
7 |
stigmasterol |
[24S]-24-ethyl-Δ-5,22-cholestadien-3-β-ol |
0,88 |
0,87 |
|
8 |
Δ-7-campesterol |
[24R]-24-methyl-Δ-7-cholesten-3-β-ol |
0,93 |
0,92 |
|
9 |
Δ-5,23-stigmastadienol |
[24R,S]-24-ethyl-Δ-5,23-cholestadien-3-β-ol |
0,95 |
0,95 |
|
10 |
chlerosterol |
[24S]-24-ethyl-Δ-5,25-cholastadien-3-β-ol |
0,96 |
0,96 |
|
11 |
β-sitosterol |
[24R]-24-ethyl-Δ-5-cholestan-3-β-ol |
1,00 |
1,00 |
|
12 |
sitostanol |
24-ethyl-cholestan-3-β-ol |
1,02 |
1,02 |
|
13 |
Δ-5-avenasterol |
[24Z]-24-ethyliden-Δ-5-cholesten-3-β-ol |
1,03 |
1,03 |
|
14 |
Δ-5,24-stigmastadienol |
[24R,S]-24-ethyl-Δ-5,24-cholestadien-3-β-ol |
1,08 |
1,08 |
|
15 |
Δ-7-stigmastenol |
[24R,S]-24-ethyl-Δ-7,24-cholestadien-3-β-ol |
1,12 |
1,12 |
|
16 |
Δ-7-avenasterol |
[24Z]-24-ethyliden-Δ-7-cholesten-3-β-ol |
1,16 |
1,16 |
Figur 1
Gaskromatogram af sterolfraktionen af en uraffineret olivenolie
Figur 2
Gaskromatogram af sterolfraktionen af en raffineret olivenolie
BILAG VI
BESTEMMELSE AF ERYTHRODIOL OG UVAOL
INDLEDNING
Erythrodiol (almindeligvis forstået som totalindholdet af diolerne erythrodiol og uvaol) er en uforsæbelig bestanddel, som er karakteristisk for visse arter af fedtstoffer. Den findes i betydeligt højere koncentration i ekstraheret olivenolie end i de andre olier, som den findes i (presset olivenolie, vindruekerneolie), hvorfor bestemmelsen heraf kan anvendes til at konstatere tilstedeværelsen af ekstraheret olivenolie.
1. FORMÅL
At beskrive fremgangsmåden til bestemmelse af erythrodiol i fedtstoffer.
2. PRINCIP
Fedtstoffer forsæbes med kaliumhydroxid i ethanolopløsning, og de uforsæbelige bestanddele ekstraheres derefter med diethylether og renses på en kolonne af aluminiumoxid.
De uforsæbelige bestanddele fraktioneres ved tyndtlagskromatografi på kiselgel, hvorved båndet med sterolfraktionen adskilles fra båndet med erythrodiolfraktionen.
Sterolfraktionen og erythrodiolfraktionen fra pladen omdannes til trimethylsilylethere, hvorefter blandingen analyseres ved gaskromatografi.
Resultatet angives i procent erythrodiol i forhold til det samlede indhold af erythrodiol plus steroler.
3. APPARATUR
|
3.1. |
Det apparatur, som er foreskrevet i bilag V (bestemmelse af sterolindholdet). |
4. REAGENSER
|
4.1. |
De reagenser, som er foreskrevet i bilag V (bestemmelse af sterolindholdet). |
|
4.2. |
Referenceopløsning af erythrodiol, 0,5 % opløsning i chloroform. |
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. Femstilling af de uforsæbelige stoffer
Der gås frem som beskrevet i afsnit 5.1.2 i bilag V.
5.2. Separation af erythrodiol og steroler
|
5.2.1. |
Se afsnit 5.2.1 i bilag V. |
|
5.2.2. |
Se afsnit 5.2.2 i bilag V. |
|
5.2.3. |
Der fremstilles en 5 % opløsning i chloroform af de uforsæbelige stoffer. Med en mikrosprøjte på 100 μl anbringes på en kromatografiplade ca. 1,5 cm fra den nederste kant 0,3 ml af denne opløsning i en streg, der er så tynd og ensartet som muligt. På den ene ende af pladen anbringes som reference nogle mikroliter af opløsningen af cholesterol og erythrodiol. |
|
5.2.4. |
Pladen anbringes i kromatografikarret, der er klargjort som angivet i 5.2.2 i bilag V. Den omgivende temperatur holdes på ca. 20° C. Karret lukkes straks, og der elueres, indtil opløsningsmiddelfronten er ca. 1 cm fra pladens øverste kant. Derpå fjernes pladen fra kromatografikarret, og man lader opløsningsmidlet fordampe i en strøm af varm luft. |
|
5.2.5. |
Pladen sprøjtes ensartet med en alkoholopløsning af 2,7-dichlorfluorescein. Når pladen observeres under ultraviolet lys, fremstår sterol- og erythrodiolbåndene ud for pletterne fra referenceopløsningen, og de afmærkes med et punkt lidt uden for det fluorescerende bånds kanter. |
|
5.2.6. |
Med en metalspatel skrabes kiselgelen i det markerede område af. Det afskrabede materiale fra pladen overføres til en kolbe på 50 ml. Der tilsættes 15 ml varm chloroform, omrystes omhyggeligt og filtreres på glasfilter, idet siliagelen overføres til selve filteret. Der vaskes tre gange med 10 ml portioner varm chloroform, idet filtratet opsamles i en rundbundet kolbe på 100 ml. Filtratet inddampes til et rumfang på 4—5 ml og overføres til et tareret spidsbundet centrifugeglas på 10 ml, og der inddampes til tørhed under let opvarmning i en svag strøm af nitrogen, hvorefter der vejes. |
5.3. Forberedelse af trimethylsilyletherne (TMSE)
Der gås frem som beskrevet i afsnit 5.3 i bilag V.
5.4. Gaskromatografi
Der gås frem som beskrevet i afsnit 5.4 i bilag V.
Arbejdsbetingelserne for gaskromatograferingen skal vælges således, at de udover at opfylde kravene for analyse af sterolerne også fører til separation af TMSE af erythrodiol og uvaol.
Efter injektion af prøven lader man skriveren køre indtil alle tilstedeværende steroler, erythrodiol og uvaol er elueret. Derefter identificeres toppene (erythrodiol og uvaol har i forhold til β-sitosterol en relativ retentionstid på henholdsvis ca. 1,45 og 1,55), og arealerne beregnes som angivet for sterolerne.
6. ANGIVELSE AF RESULTATERNE
hvor:
A1 = toparealet for erythrodiol ►M6 ————— ◄
A2 = toparealet for uvaol ►M6 ————— ◄
Asteroler = summen af arealerne for de tilstedeværende steroler ►M6 ————— ◄
Resultatet angives med én decimal.
BILAG VII
BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF 2-GLYCERYLMONOPALMITAT I PROCENT
1. GENSTAND OG ANVENDELSESOMRÅDE
Metoden er en analyseprocedure for bestemmelse af det procentvise indhold af palmitinsyre i 2-stillingen i triglycerider ved måling af 2-glycerylmonopalmitat.
Metoden kan anvendes på vegetabilske olier, der er flydende ved stuetemperatur (20 °C).
2. PRINCIP
Olieprøven behandles efter forberedelsen med pankreaslipase, som specifikt hydrolyserer triglyceridets 1- og 3-stilling og efterlader 2-monoglycerider. Det procentvise indhold af 2-glycerylmonopalmitat i monoglyceridfraktionen bestemmes efter silylering ved gaskromatografi med kapillarkolonne.
3. APPARATUR OG SÆDVANLIGT UDSTYR
|
3.1. |
25 ml erlenmeyerkolbe |
|
3.2. |
100, 250 og 300 ml bægerglas |
|
3.3. |
kromatografikolonne af glas, indvendig diameter 21-23 mm og længde 400 mm, med sintret glasfilter og hane |
|
3.4. |
10, 50, 100 og 200 ml måleglas |
|
3.5. |
100 og 250 ml rundbundede kolber |
|
3.6. |
rotationsfordamper |
|
3.7. |
10 ml centrifugeglas med konisk bund og slibprop |
|
3.8. |
centrifuge til 10 og 100 ml glas |
|
3.9. |
termostat, der kan holde en temperatur på 40 ± 0,5 °C |
|
3.10. |
1 og 2 ml målepipetter |
|
3.11. |
1 ml injektionssprøjte |
|
3.12. |
100 μl mikroinjektionssprøjte |
|
3.13. |
1 000 ml skilletragt |
|
3.14. |
gaskromatograf til kapillarkolonner med kold »on column«-injektor til direkte indsprøjtning af prøven i kolonnen og med en ovn, der kan fastholde den ønskede temperatur inden for ca. 1 °C. |
|
3.15. |
kold »on column«-injektor til direkte indsprøjtning af prøven i kolonnen |
|
3.16. |
flammeioniseringsdetektor og elektrometer |
|
3.17. |
skriver-integrator, der passer til elektrometeret, med responstid højst 1 sekund og variabel papirhastighed |
|
3.18. |
kapillarkolonne af glas eller sintret kvarts, længde 8-12 m og indvendig diameter 0,25-0,32 mm, coatet med 5 % methylpolysiloxan eller phenylmethylpolysiloxan i en lagtykkelse på 0,10-0,30 μm, og brugbar op til 370 °C |
|
3.19. |
10 μl mikroinjektionssprøjte med hærdet kanyle, længde mindst 7,5 cm, til indsprøjtning direkte i kolonnen. |
4. REAGENSER
|
4.1. |
silicagel med kornstørrelse 63-200 μm (70/280 mesh), tilberedt således: Silicagelen anbringes i en porcelænsskål, tørres i ovn ved 160 °C i fire timer og afkøles til stuetemperatur i ekssikkator. Der tilsættes 5 % vand til silicagelen på følgende måde: I en erlenmeyerkolbe afvejes 152 g silicagel, og der tilsættes 8 g destilleret vand; kolben tilproppes og rystes forsigtigt, indtil vandet er jævnt fordelt. Henstår i mindst 12 timer inden brugen. |
|
4.2. |
n-hexan (til kromatografi) |
|
4.3. |
isopropanol |
|
4.4. |
isopropanol, vandig opløsning 1:1 (v/v) |
|
4.5. |
pankreaslipase. Den anvendte lipase skal have en aktivitet på 2,0-10 lipaseenheder pr. mg. (Der er pankreaslipaser i handelen med en aktivitet på 2-10 enheder pr. mg enzym.) |
|
4.6. |
bufferopløsning af trishydroxymethylaminomethan: 1 M vandig opløsning indstillet til pH 8 (potentiometrisk måling) med koncentreret HCl (1:1, v/v) |
|
4.7. |
natriumcholat, enzymkvalitet, 0,1 % vandig opløsning (opløsningen skal bruges inden for to uger) |
|
4.8. |
calciumchlorid, 22 % vandig opløsning |
|
4.9. |
diethylether til kromatografi |
|
4.10. |
elueringsvæske: blanding af n-hexan og diethylether, 87:13 (v/v) |
|
4.11. |
natriumhydroxid, 12 % opløsning (w/w) |
|
4.12. |
phenolphthalein, 1 % opløsning i ethanol |
|
4.13. |
bæregas: hydrogen eller helium, til gaskromatografi |
|
4.14. |
hjælpegasser: hydrogen, mindst 99 % ren, fri for vand og organisk materiale, og luft af samme renhed, til kromatografi |
|
4.15. |
silyleringsreagens: blanding af pyridin, hexamethyldisilazan og trimethylchlorsilan 9:3:1 (v/v/v). (Der fås brugsklare opløsninger i handelen. Der kan også benyttes andre silyleringsreagenser, f.eks. bis-(trimethylsilyl)trifluoracetamid + 1 % trimethylchlorsilan, fortyndet med samme volumen vandfri pyridin.) |
|
4.16. |
Referenceopløsninger: rene monoglycerider eller blandinger af monoglycerider med kendt procentvis sammensætning af omtrent samme størrelse som prøven. |
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. Prøveforberedelse
|
5.1.1. |
Olier med under 3 % frie syrer behøver ikke at neutraliseres inden kromatograferingen på silicagelkolonne. Olier med mere end 3 % frie syrer neutraliseres som beskrevet i punkt 5.1.1.1.
|
|
5.1.2. |
I en 25 ml erlenmeyerkolbe (3.1) anbringes 1,0 g olie, som er behandlet som beskrevet ovenfor, og den opløses i 10 ml elueringsvæske (4.10). Opløsningen henstår mindst 15 minutter inden kromatografering på silicagelkolonne. Hvis opløsningen er uklar, centrifugeres den, så kromatografibetingelserne bliver optimale. (Der kan anvendes brugsklare patroner med 500 mg SPE-silicagel.) |
|
5.1.3. |
Fremstilling af kromatografikolonnen Der hældes ca. 30 ml elueringsvæske (4.10) i kolonnen (3.3), og i bunden af kolonnen placeres der ved hjælp af en glasstav et stykke vat, som luften trykkes ud af. I et bægerglas fremstilles en opslæmning af 25 g silicagel (4.1) i ca. 80 ml elueringsvæske, og opslæmningen hældes på kolonnen gennem en tragt. Når det er kontrolleret, at al silicagelen er kommet ned i kolonnen, skylles der med elueringsvæske (4.10), hanen åbnes, og der tappes væske af, indtil overfladen er ca. 2 mm over silicagelens overkant. |
|
5.1.4. |
Kolonnekromatografi I en 25 ml erlenmeyerkolbe (3.1) anbringes 1,0 g prøve, som er behandlet som beskrevet i punkt 5.1. Prøven opløses i 10 ml elueringsvæske (4.10). Opløsningen overføres til kromatografikolonnen, der er fremstillet som beskrevet i punkt 5.1.3. Kolonnepakningens overflade må ikke forstyrres. Der åbnes for hanen og aftappes elueringsmiddel, indtil prøveopløsningens overflade er på niveau med silicagelen. Der elueres med 150 ml elueringsvæske. Hastigheden sættes til 2 ml/min (dvs. at de 150 ml løber gennem kolonnen på ca. 60-70 minutter). Eluatet opsamles i en tareret 250 ml rundbundet kolbe. Opløsningsmidlet afdampes under vakuum, og de sidste rester fjernes med en nitrogenstrøm. Kolben vejes, og ekstraktmængden udregnes. (Hvis der benyttes brugsklare SPE-silicagelpatroner, følges denne fremgangsmåde: 1 ml af opløsningen (5.1.2) sættes på patroner, der er forberedt med 3 ml n-hexan. Når opløsningen er løbet igennem, elueres der med 4 ml n-hexan/diethylether 9:1 (v/v). Eluatet opsamles i et 10 ml glas og inddampes med en nitrogenstrøm til fuldstændig tørhed. Remanensen behandles med pankreaslipase (5.2). Det er meget vigtigt, at fedtsyresammensætningen før og efter behandlingen på SPE-patronen kontrolleres.) |
5.2. Hydrolyse med pankreaslipase
|
5.2.1. |
I centrifugeglasset afvejes 0,1 g olie, som er behandlet som beskrevet i punkt 5.1. Der tilsættes 2 ml bufferopløsning (4.6), 0,5 ml natriumcholatopløsning (4.7) og 0,2 ml calciumchloridopløsning, idet der omrøres omhyggeligt mellem hver tilsætning. Glasset lukkes med slibproppen og anbringes i termostaten ved 40 ± 0,5 °C. |
|
5.2.2. |
Der tilsættes 20 mg lipase og omrystes omhyggeligt (uden at proppen fugtes), og glasset anbringes i termostaten i nøjagtig 2 minutter, hvorefter det tages op, rystes energisk i nøjagtig 1 minut og hensættes til afkøling. |
|
5.2.3. |
Der tilsættes 1 ml diethylether, tilproppes og rystes energisk, og centrifugeres, hvorefter etheropløsningen overføres til et rent og tørt glas med en mikroinjektionssprøjte. |
5.3. Fremstilling af silanderivater og gaskromatografi
|
5.3.1. |
Med en mikroinjektionssprøjte overføres 100 μl af opløsningen (5.2.3) til et 10 ml glas med konisk bund. |
|
5.3.2. |
Opløsningsmidlet afdampes med en svag nitrogenstrøm, der tilsættes 200 μl silyleringsreagens (4.15), glasset tilproppes, og man lader det stå i 20 minutter. |
|
5.3.3. |
Efter 20 minutter tilsættes der 1-5 ml n-hexan (alt efter kromatograferingsbetingelserne): Den fremkomne opløsning er klar til gaskromatografering. |
5.4. Gaskromatografi
Der anvendes følgende arbejdsbetingelser:
— injektortemperatur (»on column«-injektor) under opløsningsmidlets kogepunkt (68 °C)
— detektortemperatur: 350 °C
— kolonnetemperatur: temperaturprogrammering af ovnen: 60 °C i 1 minut, derefter stigning først med 15 °C pr. minut indtil 180 °C og dernæst med 5 °C pr. minut indtil 340 °C, og endelig 340 °C i 13 minutter
— bæregas: hydrogen eller helium indstillet til en sådan lineær hastighed, at der opnås den i figur 1 viste opløsning. C54-triglyceridet skal have en retentionstid på 40 ± 5 minutter (se figur 2). (Ovenstående arbejdsbetingelser er vejledende. Den enkelte analyseansvarlige må optimere dem for at opnå det ønskede resultat. Højden af toppen for 2-glycerylmonopalmitat skal være mindst 10 % af fuldt udslag på skriveren.)
— indsprøjtet mængde: 0,5-1 μl af opløsningen i (5 ml) n-hexan (5.3.3).
5.4.1. Identifikation af toppene
De enkelte monoglycerider identificeres efter deres retentionstider i prøveanalysen sammenlignet med tiderne fra analyse af standardmonoglyceridblandinger under samme betingelser.
5.4.2. Kvantitativ vurdering
Arealerne af toppene beregnes ved hjælp af integratoren.
6. ANGIVELSE AF RESULTATER
Det procentvise indhold af glycerylmonopalmitat beregnes ud fra forholdet mellem arealet af den pågældende top og summen af arealerne af samtlige monoglyceridtoppe (se figur 2) efter følgende formel:
glycerylmonopalmitat (%):
hvor:
|
Ax |
= |
arealet af den top, der svarer til glycerylmonopalmitat |
|
ΣA |
= |
summen af arealerne af samtlige monoglyceridtoppe |
Resultatet angives med én decimal.
7. ANALYSERAPPORT
Analyserapporten skal indeholde følgende:
— henvisning til denne metode
— alle oplysninger til fuldstændig identifikation af prøven
— resultatet af analysen
— alle afvigelser fra metoden, uanset om det er besluttet af de berørte parter eller har andre årsager
— nøje identifikation af laboratoriet, dato for udførelse af analysen og de ansvarliges underskrift.
Figur 1
Kromatogram af reaktionsprodukter fra silylering efter lipasebehandling af en raffineret olivenolie med tilsætning af 20 % forestret olie (100 %)
Signaturer: »acides gras libres« = frie fedtsyrer,»huile d'olive raffinée + 20 % huile estérifiée« = raffineret olivenolie + 20 % forestret olie, »1-2 monopalmitoléine« = 1-2 monopalmitolein, »1-2 mono C18 insat.« = umættet 1-2 mono-C18.
Figur 2
Kromatogram af:
|
A) |
ægte olivenolie, efter lipasebehandling og silylering; under de pågældende betingelser (kapillarkolonne 8-12 m) elueres voksfraktionen samtidig med eller kort tid efter diglyceridfraktionen. Efter lipasebehandlingen bør triglyceridindholdet ikke være højere end 15 % 
Signaturer:
|
Kromatogram af:
|
B) |
forestret olie efter lipasebehandling og silylering; under de pågældende betingelser (kapillarkolonne 8-12 m) elueres voksfraktionen samtidig med eller kort tid efter diglyceridfraktionen. Efter lipasebehandlingen bør triglyceridindholdet ikke være højere end 15 % 
Signaturer:
|
8. NOTER
FREMSTILLING AF LIPASELipaser med tilfredsstillende aktivitet kan fås i handelen. De kan også fremstilles i laboratoriet på følgende måde:
5 kg frisk svinepankreas afkøles til 0 °C. Alt omgivende fedt og bindevæv fjernes, og vævet findeles i blender til en flydende pasta. Den omrøres i 4-6 timer med 2,5 l vandfri acetone, hvorefter den centrifugeres. Bundfaldet ekstraheres endnu tre gange med samme mængde vandfri acetone og derefter to gange med en blanding af acetone og diethylether (1:1) (v/v) og to gange med diethylether.
Bundfaldet tørres i 48 timer under vakuum til et stabilt pulver, som har lang holdbarhed ved opbevaring tørt i køleskab.
TEST FOR LIPASEAKTIVITETDer fremstilles en olivenolieemulsion på følgende måde:
I en mixer omrøres i 10 minutter en blanding af 165 ml af en gummi arabicum-opløsning med 100 g/l, 15 g knust is og 20 ml neutraliseret olivenolie.
I et 50 ml bægerglas hældes først 10 ml af denne emulsion og derefter 0,3 ml natriumcholatopløsning (0,2 g/ml) og 20 ml destilleret vand.
Bægerglasset anbringes i termostat ved 37 °C, og der nedsænkes en pH-meterelektrode og en propelomrører i bægerglasset.
Fra en burette tilsættes der dråbevis en 0,1 N natriumhydroxidopløsning, indtil pH er 8,3.
Der tilsættes en portion af opslæmningen af lipasepulver i vand (0,1 g lipase pr. ml). Når pH-meteret viser et pH på 8,3, startes stopuret, og der tilsættes dråbevis så meget natriumhydroxidopløsning, at pH holdes på 8,3. Hvert minut noteres den forbrugte mængde natriumhydroxidopløsning.
Målingerne afsættes i et koordinatsystem med tiden som abscisse og det forbrugte antal ml 0,1 N natriumhydroxidopløsning som ordinat. Der skal fremkomme en ret linje.
Lipaseaktiviteten, målt i lipaseenheder pr. mg, beregnes efter følgende formel:
hvor:
|
A |
er aktiviteten i lipaseenheder pr. mg |
|
V |
er antallet af ml 0,1 N natriumhydroxidopløsning pr. minut (beregnet ud fra grafen) |
|
N |
er natriumhydroxidopløsningens normalitet |
|
m |
er mængden af tilsat lipase i mg. |
Lipaseenheden er defineret som den mængde enzym, der frigør 10 mikroækvivalenter syre pr. minut.
▼M20 —————
BILAG IX
SPEKTROFOTOMETRISK UNDERSØGELSE VED ULTRAVIOLET LYS
INDLEDNING
Spektrofotometrisk undersøgelse ved ultraviolet lys kan give oplysninger om et fedtstofs kvalitet, dets konserveringstilstand og om forandringer i det, frembragt ved teknologiske processer.
Absorptionen ved de bølgelængder, der er specificeret i metoden, skyldes tilstedeværelsen af konjugerede dien- og triensystemer. Disse absorptioner er udtrykt som specifikke ekstinktioner E 1 % 1 cm (ekstinktionen for en 1 % opløsning af fedtstoffet i det angivne opløsningsmiddel i et 1 cm tykt væskelag), sædvanligvis betegnet ved K, (også kaldet ekstinktionskoefficienten).
1. OMRÅDE
Metoden beskriver fremgangsmåden til udførelse af en spektrofotometrisk undersøgelse af fedtstoffer ved ultraviolet lys.
2. METODENS PRINCIP
Fedtstoffet opløses i det specificerede opløsningsmiddel, og opløsningens ekstinktion bestemmes så ved de fastsatte bølgelængder i forhold til rent opløsningsmiddel. De specifikke ekstinktioner beregnes ud fra aflæsningerne på spektrofotometeret.
3. APPARATUR
|
3.1. |
Et spektrofotometer til måling af ekstinktion i ultraviolet lys mellem 220 og 360 nm, med mulighed for aflæsning ved hver hele nanometer. |
|
3.2. |
Firkantede kvartskuvetter med låg, med en optisk vejlængde på 1 cm. Når kuvetterne er fyldt med vand eller et andet passende opløsningsmiddel, bør der ikke være forskelle på mere end 0,01 ekstinktionsenheder mellem dem. |
|
3.3. |
25 ml målekolber. |
|
3.4. |
En kromatografisøjle, hvis øverste del er 270 mm lang med en diameter på 35 mm, og hvis nederste del er 270 ml lang med en diameter på 10 mm. |
4. REAGENSER
|
4.1. |
Isooctan (2,2,4-trimethylpentan) af spektrofotometrikvalitet med en transmittans på ikke mindre end 60 % ved 220 nm og ikke mindre end 95 % ved 250 nm i forhold til destilleret vand, eller — cyclohexan af spektrofotometrikvalitet med en transmittans på ikke mindre end 40 % ved 220 nm og ikke mindre end 95 % ved 250 nm i forhold til destilleret vand. ▼M6 ————— |
|
4.2. |
Basisk aluminiumoxid til søjlekromatografi, tilberedt og kontrolleret som beskrevet i appendix 1. |
|
4.3. |
n-hexan til kromatografi. |
5. FREMGANGSMÅDE
|
5.1. |
Prøven skal være fuldstændig homogen og fri for urenheder i suspension. Olier, som er flydende ved stuetemperatur, filtreres på papir ved en temperatur på ca. 30° C; faste fedtstoffer homogeniseres og filtreres ved en temperatur på højst 10° C over smeltepunktet. |
|
5.2. |
Ca. 0,25 g af den således forberedte prøve afvejes nøjagtigt i en 25 ml målekolbe, der fyldes op til mærket med det angivne opløsningsmiddel, og opløsningen homogeniseres. Den fremkomne opløsning skal være fuldstændig klar. I modsat fald filtreres hurtigt på papir. |
|
5.3. |
En kuvette fyldes med opløsningen, og ekstinktionerne måles ved en passende bølgelængde mellem 232 og 276 nm med opløsningsmiddel som reference. De aflæste ekstinktionsværdier skal ligge inden for området 0,1—0,8. Gør de ikke det, gentages målingerne, idet der benyttes mere koncentrerede eller mere fortyndede opløsninger. |
|
5.4. |
Når bestemmelse af en specifik ekstinktion skal ske efter passage over aluminiumoxid, går man frem på følgende måde: 30 g basisk aluminiumoxid opslæmmet i hexan hældes på kromatografisøjlen. Efter at adsorbenten har bundfældet sig, tappes den overskydende hexan af, indtil overfladen er ca. 1 cm over aluminiumoxidet. 10 g af fedtstoffet, homogeniseret og filtreret som beskrevet (5.1), opløses i 100 ml hexan, og opløsningen hældes på søjlen. Eluatet opsamles, og alt opløsningsmiddel dampes af under vakuum ved en temperatur under 25° C. Man går straks videre som beskrevet i (5.2) med dette fedtstof. |
6. ANGIVELSE AF RESULTATERNE
|
6.1. |
Man opgiver den specifikke ekstinktion (ekstinktionskoefficient) ved de forskellige bølgelængder, som beregnes efter:
hvor: Kλ = den specifikke ekstinktion ved bølgelængden λ Eλ = den ekstinktion, der er målt ved bølgelængden λ c = opløsningens koncentration i g/100 ml s = kuvettens tykkelse i cm. Resultaterne angives med to decimaler. |
|
6.2. |
Spektrofotometrisk analyse af olivenolie i henhold til den officielle metode, der er angivet i EF-forordningerne, kræver bestemmelse af den specifikke ekstinktion i isooctanopløsning ved bølgelængderne 232 og 270 nm samt bestemmelse af ΔK, som er givet ved:
hvor Km er den specifikke ekstinktion ved bølgelængden m, den bølgelængde på ca. 270 nm der giver maksimal absorption. |
APPENDIX I
Tilberedning af aluminiumoxidet og kontrol af dets aktivitet
A 1.1. Tilberedning af aluminiumoxidet
Aluminiumoxid, som på forhånd er tørret i en ovn ved 380—400° C i 3 timer, anbringes i en beholder, der kan lukkes hermetisk, hvorefter der tilsættes 5 ml destilleret vand pr. 100 g aluminiumoxid, og beholderen lukkes øjeblikkeligt. Den rystes flere gange og får så lov til at stå i mindst 12 timer før brugen.
A 1.2. Kontrol af aluminiumoxidets aktivitet
En kromatografisøjle med 30 g aluminiumoxid klargøres. Efter fremgangsmåden i afsnit (5.4) lader man en blanding, der består af:
— 95 % jomfruolie med en specifik ekstinktion på under 0,18 ved 268 nm
— 5 % jordnødolie, der er behandlet med blegejord ved raffineringen, og som har en specifik ekstinktion på ikke under 4 ved 268 nm,
passere gennem søjlen.
Hvis blandingen efter passage gennem søjlen har en specifik ekstinktion på over 0,11 ved 268 nm, er aluminiumoxidet acceptabelt; hvis ikke må hydratiseringsgraden øges.
APPENDIX II
Kalibrering af spektrofotometeret
|
A 2. |
Udstyret skal kontrolleres med regelmæssige mellemrum (mindst hver sjette måned), både for korrekt bølgelængde og for udslagets nøjagtighed.
|
BILAG X A
GASKROMATOGRAFERING AF FEDTSYREMETHYLESTERE
1. FORMÅL
Denne standard giver generelle retninglinjer for gaskromatografisk bestemmelse med pakket kolonne eller kapillarkolonne af den kvalitative og kvantitative sammensætning af en blanding af fedtsyremethylestere fremstillet i henhold til bilag X B.
Metoden gælder ikke for polymeriserede fedtsyrer.
2. REAGENSER
2.1. Bæregas
Inaktiv gas (nitrogen, helium, argon, hydrogen etc.) vel tørret og indeholdende mindre end 10 mg oxygen/kg.
Note 1:
Hydrogen, der kun benyttes som bæregas, når det gælder kapillarkolonner, gør det muligt at foretage analysen dobbelt så hurtigt, men indebærer en risiko. Der forefindes sikkerhedsanordninger.
2.2. Hjælpegasser
|
2.2.1. |
Hydrogen (renhedsgrad ≥ 99,9 %), fri for organiske urenheder. |
|
2.2.2. |
Luft eller oxygen, fri for organiske urenheder. |
2.3. Referencestandard
En methylesterblanding af rene fedtsyrer eller methylesterne af et fedtstof, der så vidt muligt har samme sammensætning som det fedtstof, der skal analyseres.
Iltning af polyumættende fedtsyrer må undgås.
3. APPARATUR
Instruktionerne angår det sædvanlige udstyr til gaskromatografering med pakket kolonne og/eller kapillarkolonne og flammeionisationsdetektor. Alt udstyr, som kan give den i 4.1.2. definerede ydeevne og opløsning, kan anvendes.
3.1. Gaskromatograf
Gaskromatografen skal omfatte følgende elementer:
3.1.1. Injektionssystem
Der benyttes enten et injektionssystem
a) med pakkede kolonner med det mindst mulige dødvolumen (i dette tilfælde skal injektionssystemet kunne opvarmes til en temperatur, som er 20—50° C højere end kolonnens) eller
b) med kapillarkolonner, hvor injektionssystemet skal være specielt udformet til anvendelse med sådanne kolonner. Injektoren kan være med eller uden split.
Note 2:
Er der ikke tale om fedtsyrer med mindre end 16 kulstofatomer, kan der benyttes injektor med faldende nål (moving needle injector).
3.1.2. Ovn
Ovnen skal være i stand til at opvarme kolonnen til en temperatur på mindst 260° C og holde den valgte temperatur inden for 1° C, når der er tale om en kapillarkolonne. Det sidste krav er særlig vigtigt, da der benyttes et rør af sintret kvarts.
Det anbefales i alle tilfælde at anvende temperaturprogrammeret opvarmning, navnlig til fedtsyrer med mindre end 16 kulstofatomer.
3.1.3. Pakket kolonne
|
3.1.3.1. |
Kolonnen skal være kontrueret af et materiale, som er inaktivt i forhold til de stoffer, der skal analyseres (dsv. glas eller rustfrit stål), af følgende dimensioner: a) Længde: 1—3 m. En relativt kort kolonne anvendes ved tilstedeværelse af langkædede fedtsyrer (over C20). Ved analyse af syrer med 4 eller 6 kulstofatomer anbefales det at anvende en kolonne på 2 m. b) Indre diameter: 2—4 mm. Note 3: Ved tilstedeværelse af polyumætterde forbindelser med mere end tre dobbeltbindinger er der risiko for, at de nedbrydes i en kolonne af rustfrit stål. Note 4: Der kan anvendes et system med to pakkede kolonner. |
|
3.1.3.2. |
Fyldmateriale bestående af følgende elementer: a) Bærer: kiselgur, syrevasket og silanbehandlet, eller andet egnet inaktivt bæremateriale med et snævert kornstørrelsesinterval (25 μm i området 125 μm—200 μm), idet middelværdien vælges efter kolonnens indre diameter og længde. b) Stationær fase: polær væske af polyestertype (f.eks. diethylenglycolpolysuccinat, butandiolpolysuccinat, ethylenglycolpolyadipat mv.), cyanosiliconer eller enhver anden væske, der giver den krævede kromatografiske adskillelse (4). Den stationær fase bør udgøre 5 % (m/m)—20 % (m/m) af fyldmaterialet. En ikke-polær fase kan anvendes til visse adskillelser. |
|
3.1.3.3. |
Konditionering af kolonnen Efter at kolonnen om muligt er adskilt fra detektoren, opvarmes ovnen gradvis til 185° C, og en strøm af inaktiv gas ledes gennem den netop fremstillede kolonne med en hastighed på 20—60 ml/min. i mindst 16 timer ved denne temperatur og derpå i 2 timer ved 195° C. |
3.1.4. Kapillarkolonne
|
3.1.4.1. |
Røret skal være af et materiale, som er inaktivt i forhold til de stoffer, der skal analyseres (normalt glas eller sintret kvarts). Den indre diameter skal være på mellem 0,2 mm og 0,8 mm. Den indvendige overflade skal undergå en passende behandling (f.eks. forbehandling, deaktivering), inden den stationære fasebelægning påføres. En længde på 25 m er tilstrækkelig i de fleste tilfælde. |
|
3.1.4.2. |
Stationær fase: normalt af typen polyglycol [poly(ethylenglycol) 20 000], polyester (butandiolpolysuccinat) eller polær polysiloxan (cyanosiliconer). Bundne (tværbundne) kolonner er velegnede. Note 5: Der er risiko for, at polære polysiloxaner gør det vanskeligt at identificere og adskille linolensyre og C20 syrer. Belægningerne skal være tynde, dvs. 0,1 μm—0,2 μm. |
|
3.1.4.3. |
Samling og konditionering af kolonnen Der træffes de normale forholdsregler ved samlingen af kapillarkolonner, dvs. placering af kolonnen i ovnen (bærer), valg og montering af samlinger (tæthed), anbringelse af kolonnens ender i injektoren og detektoren (reduktion af dødvolumener). Kolonnen anbringes under en strøm af bæregas (f.eks. 0,3 bar (30 kPa) for en kolonne med en længde på 25 m og en indre diameter på 0,3 mm). Kolonnen konditioneres ved temperaturprogrammering af ovnen ved 3° C/min. fra den omgivende temperatur til en temperatur på 10° C under den stationære fases dekomponeringsgrænse. Ovnen holdes på denne temperatur i 1 time, indtil basislinjen har stabiliseret sig. Den genindstilles på 180° C, så der opnås isotermiske betingelser. Note 6: Korrekt prækonditionerede kolonner fås i handelen. |
|
3.1.5. |
Detektoren skal helst kunne opvarmes til en temperatur, som er højere end ovnens. |
3.2. Injektionssprøjte
Injektionssprøjten skal have en maksimumskapacitet på 10 μl med 0,1 μl inddelinger.
3.3. Skriver
Hvis den optegnede kurve skal anvendes til at beregne sammensætningen af den analyserede blanding, skal skriveren være et meget præcist elektronisk instrument, som er foreneligt med det anvendte apparatur. Skriveren skal have følgende specifikationer:
a) responstid mindre end 1,5 sek. og helst 1 sek. (responstiden er den tid, der forløber, fra skriveren modtager et pludseligt signal på 100 %, og indtil den giver et udslag på 90 %)
b) papirbredde: minimum 20 cm
c) papirhastighed: regulerbar fra 0,4—2,5 cm/min.
3.4. Integrator
Anvendelse af elektronisk integrator giver en hurtig og præcis beregning. Den skal give et lineært udslag med tilstrækkelig følsomhed, og korrektionen for forstyrrelser på basislinjen skal være tilfredsstillende.
4. FREMGANGSMÅDE
4.1 til 4.3 angår anvendelse af en flammeionisationsdetektor.
Alternativt kan anvendes en gaskromatograf med katarometerdetektor (registrerer ændringer af varmeledningsevne). I så fald ændres arbejdsbetingelserne som angivet i 6.
4.1. Prøvebetingelser
4.1.1. Bestemmelse af de optimale arbejdsbetingelser
|
4.1.1.1. |
Pakket kolonne Følgende variabler indgår i valget af arbejdsbetingelser: a) kolonnes længde og diameter b) den stationære fases art og mængde c) kolonnens temperatur d) bæregassens hastighed e) den ønskede opløsning f) prøvens størrelse valgt på en sådan måde, at detektoren og elektrometret i forening giver et lineært udslag g) analysetiden. Almindeligvis vil værdierne i tabel 1 og tabel 2 give de ønskede resultater, dvs. for methylstearat mindst 2 000 teoretiske bunde pr. m kolonnelængde og en elueringstid på ca. 15 min. Hvis apparaturet gør det muligt, skal injektoren have en temperatur på omkring 200° C og detektoren en temperatur, som er lig med eller højere end kolonnes. Forholdet mellem hydrogenstrømmen til flammeionisationsdetektoren og bæregassens hastighed ligger normalt på 1:2 til 1:1 alt efter kolonnens diameter. Oxygenstrømmen er ca. 5—10 gange større end hydrogenstrømmen.
Tabel 1
Tabel 2
|
|
4.1.1.2. |
Kapillarkolone Kapillarkolonnens ydeevne og permabilitet er ensbetydende med, at adskillelsen mellem bestanddelene og analysetiden stort set afhænger af bæregassens hastighed i kolonnen. Det vil derfor være nødvendigt at skabe de bedst mulige driftsbetingelser ved ad følge dette parameter (eller blot rette sig efter kolonnens tryktab) alt efter, om man ønsker at opnå bedre adskillelser eller foretage en hurtig analyse. |
4.1.2. Bestemmelse af antallet af teoretiske bunde (ydeevne) og opløsning
(Se figur 1).
Analysen gennemføres med en blanding af methylstearat og methyloleat i nogenlunde lige store mængder (f.eks. methylestere af kakaosmør).
Kolonnens temperatur og bæregassens hastighed vælges således, at methylstearattoppens maksimum resistreres ca. 15 min. efter opløsningsmiddeltoppen. Der anvendes en tilstrækkelig mængde af methylesterblandingen til, at methylstearattoppen svarer til ca. ¾ af fuldt udslag.
Antallet af teoretiske bunde, n (ydeevne), beregnes ud fra formelen:
og opløsningen, R, ud fra formelen:
hvor
dω = retentionsafstanden i mm målt fra kromatogrammets start til det relative maksimum for methylstearattoppen
ω1 og ω2 = methylstearat- og methylolealtoppenes bredde i mm målt mellem basislinjens skæringspunkter med kurvens vendetangenter
Δ = afstanden i mm mellem methylstearat- og methyloleattoppenes maksima.
og opløsningsindekset Ir ud fra formlen
hvor
a = højden af den mindste top målt i forhold til basislinjen
b = højden af det laveste punkt i området mellem to toppe ved siden af hinanden målt i forhold til basislinjen.
Figur 1
Kromatogram til bestemmelse af antallet af teoretiske bunde (ydeevne) og opløsning
Betingelserne vælges således, at de for methylstearat giver mindst 2 000 teoretiske bunde pr. m kolonnelængde og en opløsning på mindst 1,25.
4.2. Prøve
Med injektionssprøjten (3.2) udtages 0,1—2 μl af methylesteropløsningen, der er fremstillet i henhold til bilag X B, og indsprøjtes i kolonnen.
Når det gælder ikke opløste estere, fremstilles i heptan til kromatografi en opløsning på 100 mg/ml, og 0,1—1 μl af denne opløsning indsprøjtes.
Ved analyse af bestanddele, der kun er til stede som spor, kan prøveudtagningen forøges (op til ti gange).
4.3. Analyse
Normalt vil driftsbetingelserne være de samme som dem, der er fastlagt i (4.1.1).
Det er dog muligt at arbejde med en lavere kolonnetemperatur, når fedtsyrer med mindre end 12 kulstofatomer skal bestemmes, eller en højere temperatur, når fedtsyrer med mere end 20 kulstofatomer skal bestemmes. Det et muligt at anvende temperaturprogrammering i begge tilfælde. Hvis prøven f.eks. indeholder fedtsyremethylestere med mindre end 12 kulstofatomer, indsprøjtes prøven ved 100° C (eller 50—60° C, hvis der er smørsyre til stede), hvorefter temperaturen straks øges med 4—8° C/min, indtil den optimale temperatur nås. I visse tilfælde kan de to fremgangsmåder kombineres.
Efter den programmerede opvarmning fortsættes elueringen ved konstant temperatur, indtil alle bestanddelene er elueret. Hvis apparatet ikke arbejder med programmeret opvarmning, arbejdes der med to faste temperaturer mellem 100° C og 195° C.
Om nødvendigt anbefales det at foretage en analyse på to stationære faser med forskellig polaritet for at sikre sig, at der ikke forekommer maskerede toppe, hvilket kan være tilfældet ved samtidig tilstedeværelse af C18:3 og C20:0 eller af C18:3 og C18:2 konjugeret.
4.4. Udarbejdelse af referencekromatogrammet og referencediagrammer
Referencestandardblandingen (2.3) analyseres under de samme driftsbetingelser som for prøvens vedkommende, og retentionstiderne eller retentionsafstandene for de tilstedeværende fedtsyrer måles. På semilogaritmisk papir afbildes logaritmen til retentionstiden eller -afstanden mod antallet af kulstofatomer for alle grader af umættethed; under isotermiske betingelser skal de punkter, der repræsenterer ligekædede syrer med samme umættethedsgrad, ligge på rette linjer, der er nogenlunde parallelle.
Det er nødvendigt at undgå betingelser, hvor der fremkommer »maskerede toppe«, dvs. hvor opløsningen er utilstrækkelig til at adskille to bestanddele.
5. ANGIVELSE AF RESULTATER
5.1. Kvalitativ analyse
Prøvens methylestertoppe identificeres ud fra diagrammerne, der er udarbejdet i 4.4, om nødvendigt ved interpolation.
5.2. Kvantitativ analyse
5.2.1. Bestemmelse af sammensætningen
Bortset fra undtagelsestilfælde anvendes den interne normaliseringsmetode, dvs. det forudsættes, at samtlige bestanddele i prøven er repræsenteret på kromatogrammet, således at toppenes samlede areal udgør 100 % af bestanddelene (total eluering).
Hvis apparaturet omfatter en integrator, anvendes resultaterne fra denne. Hvis ikke, bestemmer man arealet af hver enkelt top ved at multiplicere toppens høje med dens bredde i halv højde og tager i givet fald hensyn til de forsekllige dæmpningsindstillinger under registreringen.
5.2.2. Beregningsmetode
|
5.2.2.1. |
Generelt Indholdet af en given bestanddel i, udtrykt i vægtprocent methylestere, beregnes ved, at man bestemmer den procentdel, som den tilsvarende top udgør i forhold til summen af arealerne af samtlige toppe, ud fra følgende formel:
hvor Ai = arealet af den top, der svarer til bestanddel i
Resultatet anføres med en decimal. Note 7: I dette generelle tilfælde betragtes resultatet af beregningen, som er baseret på relative arealer, som en vægtprocent. I de tilfælde, hvor man ikke kan arbejde med denne antagelse, henvises til 5.2.2.2. |
|
5.2.2.2. |
Anvendelse af korrektionsfaktorer I visse tilfælde, f.eks. ved tilstedeværelse af fedtsyrer med mindre end otte kulstofatomer eller syrer med andre funktionelle grupper, bør der, når man anvender varmeledningsevnedetektorer, eller når den størst mulige præcision er specielt påkrævet, anvendes korrektionsfaktorer for at omsætte bestanddelenes procentvise toparealer til vægtprocent. Korrektionsfaktorerne bestemmes ved hjælp af et kromatogram af en referenceblanding af methylestere med kendt sammensætning under samme betingelser som for prøvens vedkommende. For denne referenceblanding udtrykkes vægtprocent bestanddel i ud fra formlen
hvor mi = massen af bestanddel i i referenceblandingen
Ud fra referenceblandingens (4.4) kromatogram beregnes procentdelen (areal/areal) af bestanddel i som følger:
hvor Ai = arealet af den top, der svarer til bestanddel i
Korrektionsfaktoren beregnes derpå som:
Almindeligvis sættes korrektionsfaktorerne i relation til KC16, så de relative faktorer bliver:
For prøven er mængden af hver bestanddel i, udtrykt i vægtprocent methylestere,
Resultatet anføres med en decimal. |
|
5.2.2.3. |
Anvendelse af en intern standard I forbindelse med visse analyser (f.eks. når det ikke er alle fedtsyrerne der er elueret, som det er tilfældet, når syrer med 4 og 6 kulstofatomer er til stede sammen med syrer med 16 og 18 kulstofatomer, eller når det er nødvendigt at bestemme den absolutte mængde af en fedtsyre i en prøve), er det nødvendigt at anvende en intern standard. Der benyttes ofte fedtsyrer med 5, 15 eller 17 kulstofatomer. Den eventuelle korrektionsfaktor for den interne standard bestemmes. Vægtprocent bestanddele i, udtrykt som methylestere, betemmes ud fra formlen
hvor Ai = arealet af den top, der svarer til bestanddel i As = arealet af den top, der svarer til den interne standard K′i = korrektionsfaktoren for bestanddel i (i forhold til KC16) K′s = korrektionsfaktoren for den interne standard (i forhold til KC16) m = massen i mg af prøven ms = massen i mg af den interne standard. Resultaterne anføres med en decimal. |
6. BESTEMMELSE AF TRANSISOMERER
Det er muligt at bestemme indholdet af transisomerer i fedtsyrer med et antal kulstofatomer på mellem 10 og 24 ved adskillelse af methylestere under anvendelse af en kromatograf med kapillarkolonne og særlig polaritet.
|
6.1. |
Kapillarkolonne af kvartsglas med en intern diameter på 0,25 mm - 0,32 mm og en længde på 50 m, dækket af cyanopropylsilicone i en lagtykkelse på 0,1 - 0,3 μm (type SP 2340, type SP 2380 C.P. Sil 88, Silor 10 og lignende). |
|
6.2. |
Methylestrene fremstilles i overensstemmelse med metode B i bilag X B. Fedtstoffer og olier med et indhold af frie syrer på over 3 % skal på forhånd neutraliseres i overensstemmelse med punkt 5.1.1 i bilag VII. |
|
6.3. |
De vilkår, hvorunder gaskromatograferingen skal finde sted, er: — kolonnetemperatur programmeret til 150-230 °C (f.eks. 165 °C i 15 minutter, derefter en stigning på 5 °C i minuttet indtil 200 °C) — injektorens temperatur: 250 °C, hvis der anvendes splitting, eller samme begyndelsestemperatur som kolonnen, hvis der anvendes »on column« — detektorens temperatur: 260 °C — strømningshastighed for bæregassen (helium eller hydrogen): 1,2 ml/minut. Den injicerede mængde skal være sådan, at højden af den top, der svarer til methylesteren fra arachinsyre ved den anvendte følsomhed skal være mindst 20 % af fuldt udslag. |
|
6.4. |
Identifikationen af de enkelte methylestere sker på grundlag af retentionstiderne, der sammenlignes med retentionstiderne for referenceblandinger (som angivet i punkt 2.3). Esterne fra transfedtsyrerne elueres før de tilsvarende cis-isomerer. Et eksempel på kromatogram er anført i figur 2. 
Figur 2 Gaskromatogram vedrørende bestemmelse af transisomerer i fedtsyrer med kapillarkolonne |
|
6.5. |
Kolonnens effektivitet som bestemt i overensstemmelse med punkt 4.1.2 skal muliggøre separation af visse kritiske par, f.eks. det par, der består af transoliesyre og oliesyre, trans C18: 1/cis C18: 1, med et opløsningsindeks på over 2. |
|
6.6. |
Den procentvise andel af hver enkelt transfedtsyre beregnet på grundlag af forholdet mellem arealet af den tilhørende top og summen af arealerne af alle tilstedeværende toppe. De procentvise andele af følgende syrer tages i betragtning: — trans-octadecensyre (T 18: 1), i bilag I til nærværende forordning anført som isomerer af transoliesyrer — cis-trans- og trans-cis-octadecadiensyre [(CT/TC) 8: 2], i bilag I til nærværende forordning anført som isomerer af translinolsyre — trans-cis-trans-, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis-octadecatriensyre [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18: 3], i bilag I til nærværende forordning anført som isomerer af translinolensyre. Note 8: På grund af denne metodes ganske særlige karakteristik, skal resultatet angives med to decimaler. |
7. SÆRLIGE TILFÆLDE — ANVENDELSE AF KATAROMETERDETEKTORER (REGISTRERER ÆNDRINGER AF VARMELEDNINGSEVNE)
En gaskromatograf med detektor, der registrerer ændringer af varmeledningsevne (et katarometer) kan også anvendes til bestemmelse af den kvalitative og kvantitative sammensætning af en blanding af fedtsyremethylestere. I så fald ændres betingelserne i (3) og (4) som vist i tabel 3.
Til kvantitativ analyse anvendes korrektionsfaktorerne i (5.2.2.2).
Tabel 3
|
Variabel |
Værdi/betingelse |
|
Kolonne |
Længde: 2—4 m Indre diameter: 4 mm |
|
Bærer |
Kornstørrelse mellem 160 og 200 μm |
|
Mængde stationær fase |
15 % (m/m) — 25 % (m/m) |
|
Bæregas |
Helium eller i mangel heraf hydrogen med lavest mulige indhold af oxygen |
|
Hjælpegasser |
Ingen |
|
Indsprøjtningstemperatur |
40—60 °C højere end kolonnens temperatur |
|
Kolonnens temperatur |
180—200 °C |
|
Bæregassens hastighed |
Normalt mellem 60 og 80 ml/min. |
|
Indsprøjtet prøvemængde |
Normalt mellem 0,5 og 2 μl |
8. PRØVERAPPORT
Prøverapporten skal indeholde en beskrivelse af de metoder, der er anvendt til fremstilling af methylesterne og til gaskromatograferingen, samt de opnåede resultater. Den skal også indholde alle de enkeltheder, der ikke er nævnt i denne standard, eller som betragtes om valgfri, samt en redegørelse for eventuelle forhold, der kan have haft indflydelse på resultaterne.
Rapporten skal indeholde alle oplysninger, der er nødvendige for en nøjagtig identifikation af prøven.
BILAG X B
FREMSTILLING AF METHYLESTERE AF FEDTSYRER FRA OLIVENOLIE OG OLIE AF OLIVENPRESSERESTER
De to nedenfor anførte metoder anbefales til fremstilling af methylestere af fedtsyrer fra olivenolie og olie af olivenpresserester:
metode A : kold omestring med kaliumhydroxid i methanol
metode B : varm methylering med natriummethylat i methanol efterfulgt af forestring i sur væske.
Valget mellem de to metoder afhænger af, hvilken parameter der skal analyseres, og hvilken olietype der er tale om, på følgende måde:
a) bestemmelse af forskellen mellem det faktiske og det teoretiske indhold af ECN42-triglycerider (ΔECN42):
— Metode A anvendes til olieprøver af alle typer efter rensning af olien på silicagelkolonne
b) bestemmelse af fedtsyresammensætningen:
— Metode A anvendes direkte på prøver af følgende olietyper:
—— jomfruolier med et indhold af frie fedtsyrer på under 3,3 %
— raffineret olivenolie
— olivenolie (blanding af jomfruolier og raffineret olivenolie)
— raffineret olie af olivenpresserester
— olie af olivenpresserester (blanding af jomfruolier og raffineret olie af olivenpresserester).
— Metode B anvendes direkte på prøver af følgende olietyper:
—— jomfruolie med et indhold af frie fedtsyrer på over 3,3 %
— rå olie af olivenpresserester
c) bestemmelse af transfedtsyrer:
— Metode A anvendes direkte på prøver af følgende olietyper:
—— jomfruolier med et indhold af frie fedtsyrer på under 3,3 %
— raffineret olivenolie
— olivenolie (blanding af jomfruolier og raffineret olivenolie)
— raffineret olie af olivenpresserester
— olie af olivenpresserester (blanding af jomfruolier og raffineret olie af olivenpresserester).
— Metode A anvendes til olieprøver af nedenstående typer efter rensning af olien på silicagelkolonne:
—— jomfruolie med et indhold af frie fedtsyrer på over 3,3 %
— rå olie af olivenpresserester.
RENSNING AF OLIEPRØVER
Om nødvendigt renses prøverne på silicagelkolonne med en blanding af hexan og diethylether (87:13, v/v) som elueringsmiddel som beskrevet i IUPAC-metode 2.507.
En alternativ metode er fastfaseekstraktion ved hjælp af silicagelpatroner. En silicagelpatron (1 g, 6 ml) anbringes i et tomt elueringsapparat og skylles med 6 ml hexan. Sugningen standses, så udtørring af kolonnen undgås. Derefter sættes der en opløsning af olien (ca. 0,12 g) i 0,5 ml hexan på kolonnen, og der åbnes for sugningen, så opløsningen trænger ned i silicagelen; derefter elueres der med 10 ml hexan/diethylether (87:13, v/v) med vakuum. Eluaterne samles og blandes og deles i to lige store portioner. Den ene portion inddampes til tørhed på rotationsfordamper under reduceret tryk og ved stuetemperatur. Remanensen opløses i 1 ml heptan. Opløsningen er parat til gaskromatografisk analyse. Den anden portion inddampes, og remanensen opløses i 1 ml acetone til HPLC-triglyceridanalyse, hvis det er påkrævet.
METODER TIL FREMSTILLING AF FEDTSYREMETHYLESTERE
1. Metode A: Kold omestring med kaliumhydroxid i methanol
1.1. Anvendelse
Denne hurtigmetode kan anvendes på olivenolie og olie af olivenpresserester med et indhold af frie fedtsyrer på under 3,3 %. De frie fedtsyrer forestres ikke med kaliumhydroxid. Ethylestere af fedtsyrer omestrer langsommere end glycerolestere, og muligvis methyleres de kun delvis.
1.2. Princip
Methylestrene dannes ved omestring i en opløsning af kaliumhydroxid i methanol, hvilket er mellemstadiet inden forsæbning (punkt 5 i metoden i ISO 5509:2000, punkt 5 i IUPAC-metode 2.301).
1.3. Reagenser
methanol med højst 0,5 % (m/m) vand
heptan til kromatografi.
kaliumhydroxid, ca. 2 N opløsning i methanol: 11,2 g kaliumhydroxid opløses i 100 ml methanol.
1.4. Apparatur
reagensglas (rumindhold: 5 ml) med skrueprop med teflonpakning
målepipetter eller automatpipetter på 2 ml og 0,2 ml.
1.5. Fremgangsmåde
I et 5 ml reagensglas med skrueprop afvejes ca. 0,1 g af olieprøven. Der tilsættes 2 ml heptan og rystes. Efter tilsætning af 0,2 ml 2 N kaliumhydroxidopløsning i methanol lukkes glasset med proppen med teflonpakning, og det rystes kraftigt i 30 sekunder. Glasset henstilles, indtil det øvre lag af opløsningen er blevet klart. Det øvre lag, som indeholder methylestrene, dekanteres fra. Heptanopløsningen er parat til injektion i kromatografen. Det tilrådes, at opløsningen opbevares i køleskab indtil kromatograferingen. Det frarådes at opbevare opløsningen i mere end 12 timer.
2. Metode B: Varm methylering med natriummethylat i methanol efterfulgt af forestring i sur væske
2.1. Anvendelse
Denne metode kan anvendes på olivenolie og olie af olivenpresserester med et indhold af frie fedtsyrer på over 3,3 %.
2.2. Princip
Neutralisering af frie fedtsyrer og alkalisk methanolyse af glycerider efterfulgt af forestring af fedtsyrerne i sur væske (punkt 4.2 i IUPAC-metode 2.301).
2.3. Reagenser
— heptan til kromatografi
— methanol med højst 0,05 % (m/m) vand
— natriummethanolat, 0,2 N opløsning i methanol: 5 g natrium opløses i 1 000 ml methanol (kan fremstilles ud fra indkøbte opløsninger).
— phenolphtalein, 0,2 % opløsning i methanol
— svovlsyre, 1 N opløsning i methanol: Der tilsættes 3 ml 96 % svovlsyre til 100 ml methanol
— mættet opløsning af natriumchlorid i vand.
2.4. Apparatur
— 50 ml målekolbe med flad bund og høj snæver hals med slib
— tilbagesvaler: luftkøler (1 m lang) med slib
— kogesten
— glastragt.
2.5. Fremgangsmåde
0,25 g af olieprøven anbringes i en 50 ml målekolbe med slib. Gennem tragten tilsættes der 10 ml 0,2 N-natriummethanolatopløsning i methanol og kogesten. Tilbagesvaleren påsættes, og efter omrystning bringes opløsningen i kog. Opløsningen skal være klar efter ca. 10 minutter. Reaktionen er praktisk taget afsluttet efter 15 minutter. Kolben tages af varmen, tilbagesvalingen standses, svaleren fjernes, og der tilsættes to dråber phenolphthaleinopløsning. Der tilsættes nogle ml 1 N svovlsyre i methanol, indtil opløsningen bliver farveløs, og der tilsættes endnu 1 ml i overskud. Svaleren påsættes, og der koges i endnu ca. 20 minutter. Kolben tages af varmen og afkøles under rindende vand. Svaleren fjernes, der tilsættes 20 ml mættet natriumchlorid, og der omrystes. Der tilsættes 5 ml heptan, kolben tilproppes, og der rystes kraftigt i 15 sekunder.
Blandingen henstilles, indtil faserne er helt adskilt. Der tilsættes mættet natriumchloridopløsning, indtil vandfasen når op til kolbehalsens underkant. Det øvre lag, der befinder sig i kolbehalsen, indeholder methylestrene. Opløsningen er parat til injektion i gaskromatografen.
Forsigtig: Methylering ifølge metode B skal udføres i stinkskab.
2.6. Alternativ til methylering ifølge metode B
2.6.1. Metode C
2.6.1.1. Princip
Fedtstoffet, der skal analyseres, behandles med en opløsning af chlorbrinte i methanol i et forseglet glas ved 100 °C.
2.6.1.2. Apparatur
— tykvægget glas med et rumindhold på ca. 5 ml (højde 40-45 mm, diameter 14-16 mm)
— målepipetter, 1 og 2 ml.
2.6.1.3. Reagenser
2 % opløsning af chlorbrinte i methanol, fremstillet ud fra chlorbrintegas og vandfri methanol (note 1).
Hexan til kromatografi.
Der kan benyttes indkøbte opløsninger af chlorbrinte i methanol. Det er nemt at fremstille små mængder chlorbrinte i laboratoriet ved simpel uddrivning fra den i handelen værende saltsyre (d = 1,18) ved tildrypning af koncentreret svovlsyre. Da methanol let optager chlorbrintegas, bør der træffes de sædvanlige forholdsregler ved opløsningen (f.eks. tilføres gassen ved hjælp af en lille omvendt tragt, der netop rører metanoloverfladen). Større mængder methanolopløsning af chlorbrinte kan fremstilles i forvejen; de er holdbare ved opbevaring i mørke i kolber med glasprop. Reagenset kan også fremstilles vedopløsning af acetylchlorid i vandfri metanol.
2.6.1.4. Fremgangsmåde
— I glasset anbringes 0,2 g af fedtstoffet, som forinden er tørret over natriumsulfat og filtreret, og der tilsættes 2 ml af methanolopløsningen af chlorbrinte. Glasset lukkes.
— Glasset neddyppes ved 100 °C i 40 minutter.
— Glasset afkøles under rindende vand og åbnes, og der tilsættes 2 ml destilleret vand og 1 ml hexan.
— Blandingen centrifugeres, og hexanfasen, som er klar til brug, kan udtages.
2.6.2. Metode D
2.6.2.1. Princip
Fedtstoffet, der skal analyseres, opvarmes med tilbagesvaling med methanol, hexan og svovlsyre. Methylestrene ekstraheres med petroleumsether.
2.6.2.2. Apparatur
— reagensglas på ca. 20 ml med glasslib og med en ca. 1 m lang luftsvaler.
— 5 ml målepipette
— 50 ml skilletragt
— 10 og 25 ml reagensglas
— 15 ml spidsbundet reagensglas.
2.6.2.3. Reagenser
— methyleringsreagens: vandfri methanol, hexan og koncentreret svovlsyre (d = 1,84) i forholdet 75:25:1 (v/v/v)
— 40-60 °C petroleumsether
— vandfrit natriumsulfat.
2.6.2.4. Fremgangsmåde
I glasset på 20 ml anbringes 0,1 g olie, og der tilsættes 5 ml methyleringsreagens.
Svaleren påsættes, og der opvarmes i 30 minutter på kogende vandbad (note 2).
Blandingen overføres kvantitativt til en 50 ml skilletragt ved hjælp af 10 ml destilleret vand og 10 ml petroleumsether. Der omrystes kraftigt, og blandingen henstår, indtil faserne er adskilt. Vandfasen fjernes, og etherlaget vaskes to gange med 20 ml destilleret vand. Skilletragten tilsættes en lille mængde vandfrit natriumsulfat, der omrystes, blandingen henstår i nogle få minutter, og der filtreres, idet filtratet opsamles i et 15 ml spidsbundet reagensglas.
Opløsningsmidlet afdampes på vandbad med en strøm af nitrogen.
For at holde kogningen under kontrol kan man indsætte en glasstav i reagensglasset og begrænse vandbadets temperatur til 90 C
3. Nøjagtighed
Det Internationale Olivenolieråd har i forbindelse med sin metode COI/T.20/dok. nr. 24 offentliggjort en statistisk vurdering af nøjagtigheden ved metode A og B.
ANVISNINGER FOR GASKROMATOGRAFI AF ESTERE AF FEDTSYRER FRA OLIVENOLIE OG OLIE AF OLIVENPRESSERESTER
1. Fremgangsmåde
Gaskromatografi af opløsninger af fedtsyreestere i hexan udføres ifølge ISO 5508 på kapillarkolonne (50 m lang, indre diameter 0,25 eller 0,32 mm) belagt med cyanopropylsilicone som angivet ved bestemmelse af trans-fedtsyrer (COI/T.20/dok. nr. 17).
Figur 1 viser et typisk kromatogram af olie af olivenpresserester, som indeholder methyl- og ethylestere af fedtsyrer og transisomerer af methylestere.
2. Beregninger
|
2.1. |
Ved beregning af sammensætningen af fedtsyrer og ΔECN42 skal følgende fedtsyrer medregnes: myristinsyre (C14:0) palmitinsyre (C16:0) — summen af arealerne af methyl- og ethylestertoppene palmitolsyre (C16:1) — summen af arealerne af toppene for ω9- et ω7-isomererne af methylesteren heptadecansyre (C17:0) heptadecensyre (C17:1) stearinsyre (C18:0) oliesyre (C18:1) summen af arealerne af toppene for ω9- et ω7-isomererne af methylesteren, ethylesteren og transisomeren af methylesteren linolsyre (C18:2) — summen af arealerne af toppene for methyl- og ethylesteren og transisomererne af methylesteren arachinsyre (C20:0) linolensyre (C18:3) — summen af toppene for methylesteren og transisomererne af methylesteren eicosensyre (C20:1) behensyre (C22:0) lignocerinsyre (C24:0). Squalen medregnes ikke ved beregningen af det samlede areal. |
|
2.2. |
Til beregning af det procentvise indhold af trans-C18:1 benyttes toppen for methylesteren af denne fedtsyre. For at få summen (trans-C18:2 + trans-C18:3) adderes alle toppene for transisomererne af disse to fedtsyrer. Ved beregning af det samlede areal medregnes alle de toppe, der er nævnt i punkt 2.1 (jf. COI/T.20/dok. nr. 17). Procentindholdet af de enkelte fedtsyrer beregnes efter følgende formel:
Figur 1: Typisk kromatogram af olie af olivenpresserester, fremkommet ved metoden med kold methylering. Toppene er for methylestrene, hvor intet andet er anført. |
BILAG XI
BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF FLYGTIGE HALOGENE OPLØSNINGSMIDLER I OLIVENOLIE
1. PRINCIP
Analyse ved gaskromatografi ifølge teknikken med luftrummet over væsken (head space).
2. APPARATUR
|
2.1. |
Gaskromatografiapparat udstyret med en elektronindfangningsdetektor (ECD). |
|
2.2. |
Apparatur for luftrummet over væsken (head space). |
|
2.3. |
Gaskromatografisøjle af glas med længde på 2 m og med 2 mm diameter, stationær fase 10 % OV101 på chromosorb WLA DMOS granulometri 80—100 Mesh. |
|
2.4. |
Transportluftart og hjælpeluftart: nitrogen. |
|
2.5. |
10 til 15 ml glaskolber med en foring af teflon og en aluminiumsprop med en åbning til udtagning med sprøjte. |
|
2.6. |
Tang til hermetisk lukning. |
|
2.7. |
Sprøjte til luftarter på 0,5 til 2 ml. |
3. REAGENSER
Flygtige halogene opløsningsmidler med en renhedsgrad, der egner sig til gaskromatografi.
Pentan med en renhedsgrad, der egner sig til gaskromatografi.
4. ANALYSEMETODE
|
4.1. |
Der afvejes med nøjagtighed ca. 3 g olie i en glaskolbe (der ikke må genbruges), og kolben tilproppes indtil den hermetiske lukning. Kolben anbringes i en termostat ved 70° C i en time. Der udtages med akkuratesse ved hjælp af sprøjten en mængde på 0,2 til 0,5 ml af luftrummet over væsken. Det indsprøjtes i gaskromatografisøjleapparatet, der er indstillet således: — injektortemperatur: 150° C — søjletemperatur: 70 til 80° C — detektortemperatur: 200 til 250° C. Andre temperaturer kan også anvendes, såfremt resultaterne er ækivalente. |
|
4.2. |
Referenceopløsninger. Der tilberedes standardopløsninger ved brug af raffineret olivenolie uden spor af opløsningsmidler til variable koncentrationer af flygtige halogene opløsningsmidler mellem 0,05 og 1 ppm og i forhold til det formodede indhold af prøven. En eventuel fortynding af flygtige halogene opløsningsmidler skal ske ved hjælp af pentan. |
|
4.3. |
Mængdemæssig vurdering. Forholdet fastlægges mellem overfladerne eller toppene på prøverne og den standardopløsning, der har den nærmeste formodede koncentration. Hvis den forholdsvise forskel er over 10 %, er det nødvendigt at gentage analysen ved sammenligning med en ny standardopløsning, indtil dens koncentration overholder ovennævnte forholdsvise forskel. Indholdet af flygtige halogene opløsningsmidler bestemmes på grundlag af et gennemsnit af elementære indsprøjtninger. |
|
4.4. |
Udtryk for resultaterne. Resultaterne udtrykkes i ppm (mg/kg). Metodens påvisningsgrænse er 0,01 mg/kg. |
BILAG XII
DET INTERNATIONALE OLIVENOLIERÅDS METODE TIL ORGANOLEPTISK VURDERING AF JOMFRUOLIER
1. FORMÅL OG ANVENDELSESOMRÅDE
Metoden er baseret på Det Internationale Olivenolieråds afgørelse nr. DEC-21/95-V/2007 af 16. november 2007 om den reviderede metode for organoleptisk vurdering af jomfruolier. Formålet med metoden er at fastlægge proceduren for vurdering af jomfruoliers organoleptiske kendetegn, jf. punkt 1 i bilag XVI til forordning (EF) nr. 1234/2007, og at fastlægge metoden til klassifikation af jomfruolie på grundlag af sådanne kendetegn. Metoden omfatter også angivelser til frivillig mærkning.
Den beskrevne metode er kun anvendelig til klassifikation og mærkning af jomfruolier i forhold til de opfattede manglers intensitet, den frugtagtige karakter og andre positive egenskaber, der bestemmes af en gruppe udvalgte og optrænede smagere, der er nedsat som et panel.
2. GENERELT
Hvad den almindelige grundordliste, prøvelokale, glas til oliesmagning og alle andre spørgsmål i forbindelse med denne metode angår, henvises der til de forskrifter, som er fastsat af Det Internationale Olivenolieråd, herunder navnlig afgørelse nr. DEC-21/95-V/2007 af 16. november 2007 om den reviderede metode for organoleptisk vurdering af jomfruolie.
3. SÆRLIG ORDLISTE
3.1. Positive egenskaber
Frugtagtig :en række duftfornemmelser, der afhænger af olivensort og kendetegn for en olie, som er udvundet af sunde og friske, grønne eller modne frugter, og som fornemmes direkte og/eller retronasalt.
Egenskaben Frugtagtig suppleres med grøn, hvis duftfornemmelserne minder om duftfornemmelserne af grønne frugter, der er karakteristiske for olie af grønne frugter.
Egenskaben Frugtagtig suppleres med moden, hvis duftfornemmelserne minder om duftfornemmelserne af modne frugter, der er karakteristiske for olie af grønne og modne frugter.
Bitter : karakteristisk smag af olie, der er udvundet af grønne oliven eller oliven, der er lige ved at skifte farve, som opfattes af de bægerformede papiller, der danner tunge-V'et.
Skarp : en prikkende fornemmelse, der er karakteristisk for olier, som er udvundet i produktionsårets begyndelse især af endnu grønne oliven, og som kan opfattes i hele mundhulen og navnlig i svælget.
3.2. Negative egenskaber
Muggen/bundfald : karakteristisk flavour ved olie, som er udvundet af oliven, der har været opbevaret i bunker eller oplagret på vilkår, som har medført et fremskredet stadium af anaerob forgæring, eller olien har været i kontakt med dekanteret bundfald, som også har gennemgået en anaerob forgæring i bunker eller tanke.
Mug-fugt : karakteristisk flavour ved olie udvundet af oliven, hvori svampe og gær har udviklet sig, fordi de har været opbevaret i flere dage i fugtige omgivelser.
Vinagtig-eddikeagtig/sur-syrlig : karakteristisk flavour ved visse olier, som minder om vin eller eddike. Den skyldes hovedsagelig en aerob forgæring af oliven eller rester af olivenpasta i måtter, der ikke er blevet korrekt afvasket, så der dannes eddikesyre, ethylacetat og ethanol.
Metallisk : flavour, der minder om metal. Karakteristisk for olie, der har været i langvarig kontakt med metaloverflader under knusning, blanding, presning eller opbevaring.
Harsk : flavour ved olie, der har undergået en oxideringsproces.
Ophedet eller brændt : karakteristisk flavour ved olie, forårsaget af overdreven og/eller langvarig opvarmning under bearbejdningen, især når pastaen blandes termisk, hvis det gøres under uegnede betingelser.
Hø-træ : karakteristisk flavour ved visse olier, der er udvundet af tørre oliven.
Grov : tyk, pastaagtig fornemmelse, som visse gamle olier giver i munden.
Fedtet : flavour ved olie, der minder om jordolie, fedt eller mineralsk olie.
Frugtvand : flavour, som olien får som følge af langvarig kontakt med forgæret grønsagsvand.
Saltlage : flavour ved olie, der er udvundet af oliven, som har været konserveret i saltlage.
Esparto : karakteristisk flavour ved olie, der er udvundet af oliven, som er presset i nye måtter af espartogræs. Lugten/smagen kan være forskellig, alt efter om måtterne er lavet af grønt eller tørret espartogræs.
Jordet : flavour ved olie, der er udvundet af oliven, som er opsamlet med jord eller mudder på overfladen, og som ikke er blevet vasket.
Larvebefængt : flavour ved olie, der er udvundet af oliven, som har været hårdt angrebet af larver af olivenfluen (Bactrocera oleae).
Agurk : karakteristisk flavour, der fremkommer, når en olie har været pakket hermetisk i for lang tid, især i blikbeholdere, og som tilskrives dannelsen af 2,6-nonadienal.
Vådt træ : karakteristisk flavour ved olier, der er udvundet af oliven, som har været udsat for frost på træet.
3.3. Frivillig anvendelse ord og udtryk på etiketter
Panellederen kan på anmodning herom attestere, at de bedømte olier opfylder de definitioner og intervaller, der svarer til følgende udtryk og tillægsord i forhold til intensiteten og opfattelsen af egenskaberne:
a) for hver af de positive egenskaber, der er nævnt i punkt 3.1 (frugtagtig, i givet fald suppleret med grøn eller moden, skarp og bitter):
i) udtrykket »intens« kan benyttes, hvis medianen for den pågældende egenskab er på over 6
ii) udtrykket »middel« kan benyttes, hvis medianen for den pågældende egenskab er på mellem 3 og 6
iii) udtrykket »let« kan benyttes, hvis medianen for den pågældende egenskab er på under 3
iv) de pågældende egenskaber kan benyttes uden henvisning til de i nr. i), ii) et iii) nævnte tillægsord, hvis medianen for den pågældende egenskab er på 3 og derover
b) udtrykket »afbalanceret« kan benyttes om en olie, der ikke er uafbalanceret. Ved ubalance forstås den lugt-, smag- og berøringsfornemmelse, hvor medianen for egenskaben bitter og/eller medianen for egenskaben skarp er to points større end medianen for egenskaben frugtagtig
c) udtrykket »mild olie« kan benyttes for en olie, hvor medianen for egenskaben bitter og medianen af egenskaben skarp er lig med eller mindre end 2.
4. PANEL
Panelet består af en panelleder og 8-12 smagere.
Panellederen skal have gennemgået en grundig optræning, være kender og være kyndig ekspert i de forskellige olietyper. Han er ansvarlig for panelet og dets tilrettelæggelse og funktion, for prøvernes forberedelse, kodning og præsentation af prøver for smagerne samt for indsamling af data og deres statistiske behandling.
Panellederen udvælger smagerne og sørger for at optræne dem og kontrollere deres indsats for at sikre sig, at de opretholder et passende egnethedsniveau.
Smagere, der foretager organoleptisk kontrol af olivenolie, skal udvælges og optrænes i forhold til deres evne til at skelne mellem prøver, der ligner hinanden, i overensstemmelse med Det Internationale Olivenolieråds vejledning om udvælgelse, optræning og kontrol af kvalificerede jomfruoliesmagere.
Panelerne skal forpligte sig til at deltage i organoleptiske vurderinger på nationalt plan, EF-plan og internationalt plan med henblik på periodisk kontrol og harmonisering af fornemmelseskriterier. De paneler, der er godkendt i henhold til forordningens artikel 4, stk. 1, skal endvidere hvert år meddele den pågældende medlemsstat alle data om deres sammensætning og antallet af vurderinger, de har udført som godkendt panel.
5. PROCEDURE FOR ORGANOLEPTISK VURDERING OG KLASSIFIKATION
5.1. Smagerens anvendelse af profilskemaet
Det profilskema, som smageren skal benytte, er anført i tillæg A til denne metode.
Hver smager i panelet skal lugte til og derpå smage på den olie, der skal bedømmes. På profilskemaet noterer han derpå den intensitet, hvormed han opfatter hver enkelt negative og positive egenskab ( 6 ). Hvis smageren opfatter den grønne eller modne karakter af egenskaben frugtagtig, afkrydser han den pågældende rubrik på profilskemaet.
Hvis smageren opfatter negative egenskaber, som ikke er anført på profilskemaet, skal han anføre dem i rubrikken »Andet«, idet han benytter det eller de udtryk, som beskriver dem med den størst mulige præcision af de udtryk, som er blevet defineret.
5.2. Panellederens anvendelse af data
Panellederen indsamler de profilskemaer, som smagerne har udfyldt; han kontrollerer de intensiteter, der er tildelt de forskellige egenskaber. Konstaterer han en anormalitet, anmoder han smageren om at ændre sit profilskema og om nødvendigt gentage forsøget.
Panellederen kan indlæse data fra hver smager i et edb-program efter den metode til statistisk beregning af medianen, der er anført i tillæg B. Data for en prøve registreres på en matrix bestående af ni kolonner, der svarer til de ni sanseegenskaber, og antal linjer svarende til antal smagere i panelet.
Hvis mindst 50 % af panelet anfører en negativ egenskab i rubrikken »andet«, skal panellederen beregne medianen for denne egenskab og den tilsvarende klassifikation.
Panellederen må kun attestere, at den bedømte olie opfylder betingelserne i punkt 3.3.a., for så vidt angår ordene »grøn« og »moden«, hvis mindst 50 % af panelet angiver at have opfattet den grønne eller modne karakter af egenskaben frugtagtig.
Hvis der foretages analyser i forbindelse med kontrol af overensstemmelse, gennemføres der et forsøg. Hvis der foretages modanalyser, skal panellederen gennemføre en dobbelt analyse. I tilfælde af annullerende analyser skal der gennemføres en tredobbelt vurdering. I så fald skal medianen beregnes ud fra gennemsnittet af medianerne. Alle gentagelser af disse analyser skal gennemføres på særskilte forsøg.
5.3. Klassifikation af olier
Olien klassificeres under nedennævnte betegnelser i forhold til medianen for mangler og medianen for egenskaben frugtagtig. Ved medianen af manglerne forstås medianen af den mangel, der opfattes med den største intensitet. Medianen af manglerne og medianen for egenskaben frugtagtig udtrykkes med én decimal, og værdien af den robuste variationskoefficient for disse mangler skal være mindre end eller lig med 20 %.
Olien klassificeres ved at sammenligne værdien af medianen af manglerne og medianen af egenskaben frugtagtig med de referenceintervaller, der er nævnt nedenfor. Da grænseværdien for disse intervaller er fastlagt under hensyn til metodens fejlmargen, anses de for at være absolutte. Med edb-programmer er det muligt at vise klassifikationen i en tabel med statistiske data eller som grafik.
|
a) |
Jomfruolie, ekstra : Medianen af manglerne er lig med 0, og medianen af den frugtagtige karakter er større end 0. |
|
b) |
Jomfruolie : Medianen af manglerne er større end 0 og lig med eller mindre end 3,5, og medianen af den frugtagtige karakter er større end 0. |
|
c) |
Bomolie : Medianen af manglerne er større end 3,5; eller medianen af manglerne er lig med eller mindre end 3,5, og medianen af den frugtagtige karakter er lig med 0. |
5.4. Særlige tilfælde
Hvis medianen for en anden positiv egenskab end frugtagtig er større end 5,0, anfører panellederen dette på oliens analyseattest.
Tillæg A
Profilskema for jomfruolie
Tillæg B
METODE TIL BEREGNING AF MEDIAN OG KONFIDENSINTERVALLER
Median
Medianen er det reelle tal, Xm, der er kendetegnet ved, at sandsynligheden (P) for, at værdierne af fordelingen (X) er mindre end dette tal (Xm), er mindre end eller lig med 0,5, og at sandsynligheden (P) for, at værdierne af fordelingen (X) er mindre end eller lig med Xm, samtidig er større end eller lig med 0,5. Ifølge en anden definition er medianen den 50. percentil af en fordeling, hvis elementer er ordnet i stigende rækkefølge. Med andre ord er medianen den midterste værdi i en ordnet række af et ulige antal elementer eller gennemsnittet af de to midterste værdier i en ordnet række af et lige antal elementer.
Robust standardafvigelse
Som et pålideligt estimat af variabiliteten omkring medianen benyttes Stuart og Kendalls estimat over den robuste standardafvigelse. I følgende formel er N antallet af observationer, og IQR er den interkvartile afstand, dvs. det robuste estimat af variabiliteten af de pågældende data (den interkvartile afstand dækker nøjagtig 50 % af elementerne i en given sandsynlighedsfordeling).
Den interkvartile afstand beregnes som afstanden mellem den 75. og 25. percentil.
IQR = 75. percentil – 25. percentil
Percentilen er værdien Xpc, der er kendetegnet ved, at sandsynligheden (P) for, at værdierne af fordelingen er mindre end Xpc, er mindre end eller lig med en given procentdel, og at sandsynligheden (P) for, at værdierne af fordelingen er mindre end eller lig med Xpc, samtidig er større end eller lig med den pågældende procentdel. Procentdelen angiver den pågældende fordelingsfraktion. For medianens vedkommende er den 50 %.
Percentilen er med andre ord den værdi af fordelingen, der svarer til et bestemt areal, som tegnes ud fra fordelings- eller tæthedskurven. Den 25. percentil er fx den værdi af fordelingen, som svarer til et areal på 0,25 eller 25/100.
Robust variationskoefficient i %
Variationskoefficienten er et rent (dvs. dimensionsløst) tal, der angiver forholdet mellem den procentvise variabilitet i den analyserede talrække og medianens værdi Me. Af denne grund er variationskoefficienten til stor nytte som kontrol af panelmedlemmernes pålidelighed.
95 %-konfidensintervaller
95 %-konfidensintervallerne (IC) (fejl af første orden lig med 0,05 eller 5 %) repræsenterer det interval, inden for hvilket værdien af medianen ville variere, hvis det var muligt at gentage forsøget et uendeligt antal gange. I praksis angiver dette interval variabilitetsintervallet for forsøget ved de herskende betingelser, hvis forsøget kunne gentages flere gange. Intervallet er ligesom variationskoefficienten en hjælp til evaluering af forsøgets pålidelighed.
ICsup. = Me + (c.S*)
ICinf. = Me – (c.S*)
Hvor c, hvis konfidensintervallet er på 0,95, er lig med 1,96.
▼M20 —————
▼M19 —————
BILAG XV
1. OLIEINDHOLD I PRESSERESTER AF OLIVEN
1.1. Apparatur
— Egnet ekstraktionsapparat, forsynet med en 200—250 ml kolbe.
— Elektrisk opvarmet bad (sandbad, vandbad, osv.) eller varmeplade.
— Analysevægt.
— Ovn, der er indstillet til højst 80° C.
— Elektrisk ovn med temperaturregulering, der kan indstilles til 103° C ± 2° C, og som muliggør luftindblæsning eller vakuum.
— Mekanisk mølle, der er let at rengøre, egnet til olivenoliekager, og som er i stand til at male uden opvarmning eller mærkbar reduktion af indholdet af vand, af flygtige stoffer og af stoffer, der kan uddrages ved hjælp af hexan.
— Ekstraktionshylster og vat eller filterpapir, fri for substanser, der kan uddrages ved hjælp af hexan.
— Ekssikkator.
— Sigte med huller på 1 mm i diameter.
— Pimpsten i små korn, tørret.
1.2. Reagens
Teknisk n-hexan, hvis fordampningsrest ved fuldstændig fordampning er mindre end 0,002 g/100 ml.
2. FREMGANGSMÅDE
2.1. Tilberedning af prøven
Om nødvendigt males analyseprøven i den mekaniske mølle, der skal være omhyggeligt rengjort på forhånd, således at prøven kan reduceres til små partikler, der kan passere sien fuldstændigt.
Ca. en tyvendedel af prøven anvendes til en fuldstændig rengøring af møllen; denne formalede del bortkastes, og resten males, opsamles og blandes med omhu, hvorefter analysen straks foretages.
2.2. Prøvemængde
Der afvejes med 0,01 g nøjagtighed ca. 10 g af analyseprøven til prøvemængde, når formalingen er afsluttet.
2.3. Tilberedning af ekstraktionshylstret
Prøvemængden anbringes i hylstret, og dette lukkes med vandsugende vat. Såfremt der anvendes filterpapir, indpakkes prøven i dette papir.
2.4. Fortørring
Hvis presseresterne er meget fugtige (indhold af vand og flygtige stoffer på over 10 %), foretages der en fortørring, idet det fyldte hylster (eller filterpapir) anbringes en passende tid i ovnen, der højst kan opvarmes til 80° C, således at indholdet af vand og flygtige stoffer bringes ned under 10 %.
2.5. Tilberedning af kolben
Kolben, der indeholder 1 à 2 pimpstenskorn, og som på forhånd er tørret i ovnen ved en temperatur på 103° C ± 2° C og derefter afkølet mindst 1 time i ekssikkatoren, vejes med 1 mg nøjagtighed.
2.6. Første ekstraktion
Hylstret (eller filterpapiret), der indeholder prøvemængden, anbringes i ekstraktionsapparatet. Den nødvendige mængde hexan hældes i kolben. Kolben tilsluttes ekstraktionsapparatet, og det hele anbringes i det elektrisk opvarmede bad. Opvarmningen reguleres således, at tilbageløbsmængden udgør mindst tre dråber i sekundet (moderat, ikke stærk kogning).
Efter fire timers ekstraktion foretages afkøling. Hylstret udtages af ekstraktionsapparatet og anbringes i en luftstrøm for at fjerne størstedelen af det indeholdte opløsningsmiddel.
2.7. Anden ekstraktion
Hylstret tømmes i mikromøllen, og der males så fint som muligt.
Anbring mængdemæssigt blandingen påny i hylstret og dette i ekstraktionsapparatet.
Ekstraktionen begyndes påny, og den fortsættes endnu to timer, idet kolben med forrige ekstraktion anvendes.
Den opløsning, der opnås i ekstraktionskolben, skal være gennemsigtig. Såfremt dette ikke er tilfældet, filtreres der på et stykke filterpapir, idet den første kolbe og filterpapiret gentagne gange vaskes med hexan. Filtratet og afvaskningsopløsningen opsamles i en særskilt kolbe, der på forhånd er tørret og vejet med 1 mg nøjagtighed.
2.8. Eliminering af opløsning og vejning af ekstraktet
Størstedelen af opløsningsmidlet fjernes ved destillation i elektrisk opvarmet vandbad. De sidste rester af opløsningsmidlet fjernes ved at opvarme kolben i ovnen ved 103° C ± 2° C i 20 minutter. Fordampningen fremskyndes enten ved indblæsning af luft eller, bedre, inaktiv gas fra tid til anden eller ved anvendelse af vakuum.
Kolben afkøles i ekssikkatoren i mindst 1 time, og den vejes med 1 mg nøjagtighed.
Der opvarmes på ny i 10 min. under samme forhold, hvorefter kolben afkøles i ekssikkator og vejes.
Forskellen mellem to vejninger må ikke overstige 10 mg. I modsat fald opvarmes der på ny i perioder på ti minutter med efterfølgende afkøling og vejning, indtil forskellen i masse er højst 10 mg. Den sidste vejning af kolben noteres.
Der foretages to bestemmelser.
3. UDFORMNING AF RESULTATER
3.1. Beregning og formler
a) Ekstraktet udtrykt i masseprocent af produktet som leveret er lig med:
hvor:
S = masseprocent af produktet som leveret
m0 = massen i gram af den udtagne prøvemængde
m1 = massen i gram af ekstraktet efter tørring
Som resultat tages det aritmetiske gennemsnit af de to bestemmelser, såfremt ingen gentagelse af bestemmelsen er nødvendig.
Resultatet udtrykkes med en decimal
b) Ekstraktet kan udtrykkes i relation til tørstoffet ved anvendelse af følgende formel:
hvor:
S = masseprocent for ekstraktet af produktet som leveret (jf. a))
U = indhold af vand og flygtige stoffer.
3.2. Reproducerbarhed
Forskellen mellem resultaterne af de to samtidigt eller umiddelbart efter hinanden af samme analytiker foretagne bestemmelser, må ikke overstige 0,2 g ekstrakt ved hexan for 100 g prøve.
I modsat fald gentages analysen på to andre prøvemængder. Hvis forskellen også denne gang overstiger 0,2 g, tages som resultat det aritmetiske gennemsnit af de fire bestemmelser.
BILAG XVI
BESTEMMELSE AF IODTAL
1. ANVENDELSESOMRÅDE
Denne internationale standard specificerer en metode til bestemmelse af iodtallet i animalske og vegetabilske fedtstoffer og olier, i det følgende benævnt fedtstoffer.
2. DEFINITION
Ved anvendelsen af denne internationale standard gælder følgende definition.
|
2.1. |
Iodtal: den mængde iod, der absorberes af prøven under de arbejdsbetingelser, der er specificeret i denne internationale standard. Iodtallet udtrykkes som g iod pr. 100 g prøve. |
3. PRINCIP
En prøve opløses i opløsningsmiddel, og der tilsættes Wijs reagens. Efter en nærmere fastsat tid tilsættes kaliumiodidopløsning og vand, og det frigjorte iod titreres med natriumthiosulfatopløsning.
4. REAGENSER
Alle reagenser skal være anerkendt analysekvalitet.
|
4.1. |
Vand, skal opfylde kravene i ISO 3696, grad 3. |
|
4.2. |
Kaliumiodid — 100 g/l opløsning, der ikke indeholder iodat eller frit iod. |
|
4.3. |
Stivelseopløsning. 5 g opløselig stivelse blandes i 30 ml vand, denne blanding tilsættes 1 000 ml kogende vand efterfulgt af kogning i 3 min. og afkøling. |
|
4.4. |
Natriumthiosulfat — standardopløsning. c(Na2S2O3 × 5H2O) = 0,1 mol/l, som er standardiseret højst syv dage inden brug. |
|
4.5. |
Opløsningsmiddel — tilberedes ved blanding af lige dele cyclohexan og eddikesyre. |
|
4.6. |
Wijs reagens — indeholder iodmonochlorid i eddikesyre. Der benyttes kommercielt Wijs reagens. |
5. APPARATUR
Normalt laboratorieudstyr og navnlig følgende:
|
5.1. |
Vejeskeer af glas, der passer til prøven og kan anbringes i kolberne (5.2). |
|
5.2. |
Erlenmeyer-kolber, 500 ml, der er forsynet med slebne glaspropper og er helt tørre. |
6. FORBEREDELSE AF ANALYSEPRØVEN
Den homogeniserede prøve tørres på natriumsulfat og filtreres.
7. FREMGANGSMÅDE
7.1. Prøven
Prøvens størrelse varierer alt efter dens forventede iodtal, jf. tabel 1.
Tabel 1
|
Forventet iodtal |
Prøvens størrelse |
|
under 5 |
3,00 g |
|
5— 20 |
1,00 g |
|
21— 50 |
0,40 g |
|
51—100 |
0,20 g |
|
101—150 |
0,13 g |
|
151—200 |
0,10 g |
Prøven afvejes til nærmeste 0,1 mg i en glasske (5.1).
7.2. Bestemmelse
Prøven kommes i en 500 ml kolbe (5.2). Der tilsættes 20 ml opløsningsmiddel (4.5) for at opløse fedtstoffet. Der tilsættes nøjagtig 25 ml Wijs reagens (4.6), proppen sættes i, indholdet omrystes med en roterende bevægelse, og kolben anbringes i mørke. Der må ikke benyttes mundpipette til Wijs reagenset.
På tilsvarende måde forberedes der en blindprøve med opløsningsmidlet og reagenset, men prøven udelades.
Når det gælder prøver med et iodtal på under 150, skal kolberne henstå i mørke i 1 time. Når det gælder prøver med et iodtal på over 150, polymeriserede produkter eller kraftigt iltede produkter, skal kolberne henstå i 2 timer.
Derefter tilsættes hver af kolberne 20 ml kaliumiodidopløsning (4.2) og 150 ml vand (4.1).
Der titreres med natriumthiosulfat i standardopløsning (4.4), indtil den gule farve, der skyldes iodet, næsten er forsvundet. Der tilsættes nogle få dråber stivelsesopløsning (4.3), og titreringen fortsætter, indtil den blå farve lige akkurat forsvinder efter meget kraftig omrystning.
Note:
Potentiometrisk bestemmelse af slutpunktet kan tillades.
7.3. Antal bestemmelser
Der foretages to bestemmelser af samme prøve.
8. ANGIVELSE AF RESULTATER
Iodtallet angives som
hvor
c = den numeriske værdi af den eksakte koncentration (mol/l) af den benyttede natriumthiosulfat-standardopløsning (4.4)
V1 = den numeriske værdi af den til blindprøven benyttede mængde (ml) natriumthiosulfat-standardopløsning (4.4)
V2 = den numeriske værdi af den til bestemmelsen benyttede mæmgde (ml) natriumthiosulfat-standardopløsning (4.4)
m = den numeriske værdi af prøvens størrelse (g) (7.1).
Resultatet betragtes som det artimetiske gennemsnit af de to bestemmelser under forudsætning af, at repeterbarhedskravet er opfyldt.
BILAG XVII
METODE TIL BESTEMMELSE AF STIGMASTADIENER I VEGETABILSKE OLIER
1. FORMÅL
Bestemmelse af stigmastadiener i vegetabilske olier indeholdende lave koncentrationer af disse kulbrinter, navnlig i jomfruolie og råolie af olivenpresserester.
2. OMRÅDE
Metoden kan anvendes på alle vegetabilske olier, selv om målinger kun er pålidelige, hvis indholdet af de pågældende kulbrinter er på mellem 0,01 og 4,0 mg/kg. Metoden er særligt velegnet til at påvise tilstedeværelsen af raffinerede vegetabilske olier (oliven, olivenrester, solsikke, palme osv.) i jomfruolie, da raffinerede olier indeholder stimastadiener, og jomfruolie ikke gør det.
3. PRINCIP
Isolation af uforsæbelige stoffer. Separation af den steroide kulbrintefraktion ved søjlekromatografi på silicagel og analyse ved kapillargaskromatografi.
4. APPARATUR
|
4.1. |
250 ml kolber, der er egnet til brug med tilbagesvaler |
|
4.2. |
Skilletragte, kapacitet 500 ml |
|
4.3. |
100 ml rundbundede kolber |
|
4.4. |
Rotationsfordamper |
|
4.5. |
Kromatografisøjle af glas (1,5-2,0 cm indvendig diameter × 50 cm længde) med teflonprop og en tot glasuldsfibre eller sintret glasskive i bunden. Til tilberedning af en silicagelsøjle hældes hexan på kromatografisøjlen til en dybde på ca. 5 cm, hvorefter der fyldes op med en opslæmning af silicagel i hexan (15 g i 40 ml) ved hjælp af små mængder hexan. Henstilles til bundfældning, som afsluttes med let sammenrystning. Der tilsættes vandfrit natriumsulfat til en højde på ca. 0,5 cm, og til slut elueres den overskydende hexan. |
|
4.6. |
Gaskromatograf med flammeioniseringsdetektor, splitinjektor eller kold »on column«-injektor og en ovn, der kan programmeres til en nøjagtighed på ± 1 °C. |
|
4.7. |
Kapillarsøjle med sintret silica til gaskromatografi (0,25 eller 0,32 mm indvendig diameter × 25 m længde) belagt med en 5 % phenylmethylsiliconefase, 0,25 μm filmtykkelse. Note 1. Der kan bruges andre søjler med lignende eller lavere polaritet. |
|
4.8. |
Skriver/integrator med mulighed for integration over hver enkelt top. |
|
4.9. |
5-10 μl mikroinjektionssprøjte til gaskromatografi med cementeret nål. |
|
4.10. |
Elektrisk varmekappe eller varmeplade. |
5. REAGENSER
Alle reagenser bør være af analytisk renhed, medmindre andet er angivet. Det benyttede vand bør være destilleret vand eller vand af mindst tilsvarende renhed.
|
5.1. |
Hexan eller blanding af alkaner med kogepunktsinterval på 65-70 °C destilleret med rektificeringssøjle. Note 2. Opløsningsmidlet skal være destilleret for at fjerne urenheder. |
|
5.2. |
96 v/v ethanol. |
|
5.3. |
Vandfrit natriumsulfat. |
|
5.4. |
10 % alkoholisk kaliumhydroxidopløsning. Der tilsættes 10 ml vand til 50 g natriumoxid og omrøres. Derpå opløses blandingen i ethanol til 500 ml. Note 3. Alkoholisk kaliumhydroxid bliver brun ved henstand. Den bør tilberedes frisk hver dag og opbevares i godt tilproppede, brune glasflasker. |
|
5.5. |
Silicagel 60 til søjlekromatografi, 70-230 mesh (Merck ref. 7734 el.lign.). Note 4. Normalt kan silicagel bruges direkte fra beholderen uden behandling. Imidlertid kan nogle batcher silica vise lav aktivitet, som giver ringe kromatografiske separationer. Derfor bør silicagelen behandles således: Silicagelen deaktiveres ved opvarmning i mindst fire timer ved 550 °C. Efter opvarmning anbringes silicagelen i en ekssikator, hvor gelen afkøler, og derefter overføres silicagelen til en kolbe med prop. Der tilsættes 2 % vand og omrystes, til der ikke længere kan ses klumper, og pulveret flyder frit. Hvis batcher af silicagel giver kromatogrammer med interfererende toppe, bør silicagelen behandles som beskrevet ovenfor. Som alternativ kan der benyttes ekstraren silicagel 60 (Merck ref. 7754). |
|
5.6. |
Stamopløsning (200 ppm) af cholesta-3,5-dien (Sigma, 99 % renhed) i hexan (10 mg i 50 ml). |
|
5.7. |
Standardopløsning af cholesta-3,5-dien i hexan ved en koncentration på 20 ppm fremkommet ved fortynding af ovennævnte opløsning. Note 5. Hvis opløsninger som nævnt i 5.6 og 5.7 holdes ved under 4 °C, forringes de ikke i løbet af i hvert fald de første fire måneder. |
|
5.8. |
Opløsning af n-nonacosan i hexan i en koncentration på ca. 100 ppm. |
|
5.9. |
Bæregas til kromatografi: helium eller hydrogen af 99,9990 % renhed. |
|
5.10. |
Hjælpegasser til flammeioniseringsdetektor: hydrogen af 99,9990 % renhed og renset luft. |
6. FREMGANGSMÅDE
6.1. Fremstilling af uforsæbeligt stof:
|
6.1.1. |
20 ± 0,1 g olie afvejes i en 250 ml kolbe (4.1), der tilsættes 1 ml af standardopløsningen af cholesta-3,5-dien (20 μg) og 75 ml 10 % alkoholisk kaliumhydroxid, 10 %. Tilbagesvaleren påsættes, og der opvarmes til svag kogning i 30 minutter. Kolben med prøven fjernes fra varmekilden, og man lader opløsningen køle lidt (den må ikke afkøles helt, da prøven så vil stivne). Der tilsættes 100 ml vand, og opløsningen overføres til en skilletragt (4.2) ved hjælp af 100 ml hexan. Blandingen rystes kraftigt i 30 sekunder, hvorefter man lader den henstå, så lagene kan skilles. Note 6. Hvis der dannes en emulsion, som ikke hurtigt forsvinder, tilsættes der små mængder ethanol. |
|
6.1.2. |
Den nedre vandige fase overføres til en anden skilletragt, og der ekstraheres igen med 100 ml hexan. Man lader igen den nedre fase løbe af, og hexanekstrakterne vaskes (samlet i en anden skilletragt) tre gange med hver gang 100 ml blanding af ethanol-vand (1: 1), indtil der opnås neutral pH-værdi. |
|
6.1.3. |
Hexanopløsningen passeres gennem vandfrit natriumsulfat (50 g), vaskes med 20 ml hexan og inddampes i en rotationsfordamper ved 30 °C og lavt tryk, indtil den er tør. |
6.2. Separation af den steroide kulbrintefraktion:
|
6.2.1. |
Det tilbageværende overføres til fraktioneringssøjlen ved hjælp af to 1 ml-portioner hexan. Man lader væskeniveauet falde til toppen af natriumsulfatet, og den kromatografiske eluering startes med hexan ved en hastighed på ca. 1 ml/min. De første 25-30 ml af elueringen kasseres, og den følgende 40 ml fraktion opsamles. Efter opsamlingen overføres denne fraktion til en 100 ml rundbundet kolbe (4.3). Note 7. Den første fraktion indeholder mættede kulbrinter (jf. figur 1a) og den anden fraktion de steroide kulbrinter. Yderligere eluering giver squalen og relaterede forbindelser. For at opnå god separation mellem mættede og steroide kulbrinter kræves der optimering af fraktioneringsmængderne. Med henblik herpå justeres mængden af den første fraktion således, at når den anden fraktion analyseres, er de toppe, som repræsenterer de mættede kulbrinter, lave (jf. figur 1c). Hvis sådanne ikke fremkommer, men standardtoppens intensitet er lav, reduceres mængden. I hvert fald er en komplet separation mellem komponenterne i den første og den anden fraktion unødvendig, da der ikke er nogen overlappende toppe under gaskromatografianalyse, hvis betingelserne justeres som beskrevet i 6.3.1. Optimering af mængden af den anden fraktion er normalt unødvendig, da der er god separation fra de øvrige komponenter. Tilstedeværelsen af en høj top ved en retentionstid på ca. 1,5 min. mindre end standard skyldes squalen og angiver dårlig separation. |
|
6.2.2. |
Den anden fraktion inddampes i en fordamper ved 30 °C og lavt tryk indtil tørhed, og restmængden opløses straks i 0,2 ml hexan. Opløsningen opbevares i køleskab indtil analyse. Note 8. Restmængder under 6.1.3 og 6.2.2 bør ikke opbevares tørt ved rumtemperatur. Så snart de er fremkommet, bør opløsningsmidlet tilsættes, og opløsningerne bør opbevares i køleskab. |
6.3. Gaskromatografi
|
6.3.1. |
Arbejdsbetingelser for splitinjektion: — injektortemperatur: 300 °C — detektortemperatur: 320 °C — skriver/integrator: parametrene for integration bør sættes, så de giver en korrekt bedømmelse af arealerne. Integration over de enkelte toppe anbefales — følsomhed: ca. 16 gange mindste dæmpning — injiceret mængde opløsning: 1μl — ovnprogrammeringstemperaturer: initialtemperatur 235 °C i 6 min. og derefter stigende med 2 °C/min. indtil 285 °C — injektor med splitforhold 1: 15 — bæregas: helium eller hydrogen ved ca. 120 kPa tryk. Disse betingelser kan justeres alt efter kromatografens og søjlens evne til at give kromatogrammer, der imødekommer følgende krav: intern standardtop inden for ca. 5 min. af den tid, der er angivet i 6.3.2. Den interne standardtop bør være på mindst 80 % fuldt udslag. Gaskromatografisystemet skal kontrolleres ved injektion af en blanding af stamopløsningen af cholestadien (5.6) og n-nonacosanopløsning (5.8). Cholesta-3,5-dientoppen skal vise sig før n-nonacosanen (jf. figur 1c). Hvis den ikke fremkommer, kan man vælge mellem to metoder: at bringe ovntemperaturen ned og/eller benytte mindre polære søjler. |
|
6.3.2. |
Identifikation af toppe Den interne standardtop viser sig efter ca. 19 min. og stigmasta-3,5-dien ved en relativ retentionstid på ca. 1,29 (jf. figur 1b). Sammen med med stigmasta-3,5-dien forekommer der små mængder af en isomer, som normalt kun giver en enkelt kromatografisk top. Hvis søjlen er for polær eller har stor opløsningsevne, kan isomeren imidlertid vise sig som en lille top før og nær på toppen for stigmasta-3,5-dien (jf. figur 2). For at sikre, at stigmastadienerne elueres som en top, er det tilrådeligt at erstatte søjlen med en mindre polære søjle eller med en søjle med større indvendig diameter. Note 9. Der kan fås en stigmastadienreference ved analyse af en raffineret vegetabilsk olie ved at benytte metoden til bestemmelser af steroide kulbrinter. Stigmastadiener fremkalder en signifikant og let identificerbar top. |
|
6.3.3. |
Kvantitativ analyse Indholdet af stimastadiener bestemmes efter formlen: mg/kg stigmastadiener =
Påvisningsgrænse: Ca. 0,01 mg/kg. |
Figur 1
Gaskromatogrammer fra olivenolieprøver analyseret på en kapillarsøjle med sintret silica (0,25 mm indvendig diameter × 25 m), belagt med 5 % phenylmethylsilicone, 0,25 μm filmtykkelse.
a) Første fraktion (30 ml) fra jomfruolie tilsat standardopløsning.
b) Anden fraktion (40 ml) fra olivenolie indeholdende 0,10 mg/kg stigmastadiener.
c) Anden fraktion (40 ml) indeholdende en lille smule af den første fraktion.
Figur 2
Gaskromatogrammer fra en prøve af raffineret olivenolie analyseret på en D-5-søjle, der viser stigmasta-3,5-diens isomer.
BILAG XVIII
BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF ECN 42-HOLDIGE TRIGLYCERIDER (FORSKEL MELLEM HPLC-DATA OG DET TEORETISKE INDHOLD)
1. Formål
Bestemmelse af sammensætningen af triglycerider (TAG) i olivenolier udtrykt på basis af deres ækvivalente kulstofantal, ved hjælp af forskellene mellem de analytiske resultater opnået ved HPLC og det teoretiske indhold beregnet ud fra fedtsyresammensætningen.
2. Anvendelsesområde
Standarden gælder for olivenolier. Metoden er anvendelig til at påvise tilstedeværelsen af små mængder frøolie (der har et stort indhold af linolsyre) i alle kategorier af olivenolie.
3. Princip
Indholdet af ECN 42-holdige triglycerider bestemt ved HPLC-analyse og det teoretiske indhold af ECN 42-holdige triglycerider (beregnet på grundlag af GLC-bestemmelse af fedtsyresammensætningen) er inden for visse grænser i overensstemmelse med hinanden for rene olier. En større forskel end de værdier, der er fastsat i forordningen for hver type olie, viser, at olien indeholder frøolier.
4. Metode
Metoden til beregning af det teoretiske indhold af ECN 42-holdige triglycerider og af forskellen mellem denne værdi og data fra HPLC-analysen består hovedsagelig i samordning af analytiske data, der er fremkommet ved andre metoder; disse kan opdeles i tre trin: bestemmelse af fedtsyresammensætningen ved hjælp af gaschromatografi ved anvendelse af kapillarkolonne, beregning af den teoretiske sammensætning af ECN 42-holdige triglycerider og HPLC-bestemmelse af ECN 42-holdige triglycerider.
4.1. Apparatur
|
4.1.1. |
Rundkolber, 250 og 500 ml. |
|
4.1.2. |
Bægerglas 100 ml. |
|
4.1.3. |
Glaschromatografikolonne, indvendig diameter på 21 mm, længde på 450 mm, med hane og normal (indvendig) slib foroven. |
|
4.1.4. |
Skilletragte, 250 ml, med normal (udvendig) slib forneden, som passer øverst på kolonnen. |
|
4.1.5. |
Glasstang, længde på 600 mm. |
|
4.1.6. |
Glastragt, diameter på 80 mm. |
|
4.1.7. |
Målekolber, 50 ml. |
|
4.1.8. |
Målekolber, 20 ml. |
|
4.1.9. |
Rotationsinddamper. |
|
4.1.10. |
HPLC med mulighed for termostatstyring af kolonnetemperaturen. |
|
4.1.11. |
Injektionsenhed à 10 μl. |
|
4.1.12. |
Detektor: differentialrefraktometer. Følsomheden ved fuldt udslag bør være mindst 10-4 enheder. |
|
4.1.13. |
Kolonne: rustfrit stålrør, længde på 250 mm og indvendig diameter på 4,5 mm, fyldt med 5 μm diameter silicapartikler med 22-23 % kulstof i form af octadecylsilan (note 2). |
|
4.1.14. |
Skriver og/eller integrator. |
4.2. Reagenser
Reagenserne skal være af analysegrad. Elueringsvæskerne bør degasses og kan recirkuleres adskillige gange uden indflydelse på separationerne.
|
4.2.1. |
Petroleumether, 40-60 °C, chromatografigrad. |
|
4.2.2. |
Ethylether, peroxidfri, frisk destilleret. |
|
4.2.3. |
Glaschromatografisk elueringsvæske: blanding af petroleumether/ethylether 87/13 (v/v). |
|
4.2.4. |
Silicagel, 70-230 mesh, type Merck 7734, med standardiseret vandindhold på 5 % (w/w). |
|
4.2.5. |
Glasuld. |
|
4.2.6. |
Acetone. |
|
4.2.7. |
Acetonitril. |
|
4.2.8. |
HPLC-elueringsvæske: acetonitril + acetone (i et indbyrdes forhold, der giver den ønskede separation; der begyndes med en blanding i forholdet 50:50). |
|
4.2.9. |
Opløsningsmiddel: acetone. |
|
4.2.10. |
Referencetriglycerider: enten anvendes triglycerider, som fås i handelen (tripalmitin, triolein osv.), hvis retentionstider plottes mod det ækvivalente kulstofantal, eller der anvendes referencechromatogrammer af sojaolie, en blanding af sojaolie og olivenolie i forholdet 30:70 og ren olivenolie (se note 3 og 4 og figur 1, 2, 3 og 4). |
4.3. Prøveforberedelse
Da interfererende stoffer kan give falsk positive resultater, skal prøven altid oprenses ifølge IUPAC-metode 2.507, der anvendes til bestemmelse af polære stoffer i oxyderet olie.
4.3.1. Forberedelse af chromatografikolonne
Kolonnen (4.1.3) fyldes med ca. 30 ml elueringsvæske (4.2.3), derefter indsættes glasuld (4.2.5) i kolonnen, og ved hjælp af glasstangen (4.1.5) skubbes glasulden ned i bunden af kolonnen.
I et 100 ml bægerglas opslæmmes 25 g silicagel (4.2.4) i 80 ml elueringsblanding (4.2.3), som derefter overføres til kolonnen ved hjælp af en glastragt (4.1.6).
For at sikre sig, at al silicagelen er overført til kolonnen, skylles bægerglasset med elueringsblandingen, og skyllevæsken hældes ligeledes ned i kolonnen.
Der åbnes for hanen, så væsken kan løbe ud af kolonnen, indtil den står ca. 1 cm over silicagelen.
4.3.2. Kolonnechromatografi
2,5 ± 0,1 g olie, der om nødvendigt er filtreret, homogeniseret og tørret i forvejen, afvejes med 0,001 g nøjagtighed i en 50 ml målekolbe (4.1.7). Olien opløses i ca. 20 ml elueringsvæske (4.2.3), som om nødvendigt opvarmes lidt for at få den i opløsning. Olien afkøles ved stuetemperatur og volumen justeres med elueringsvæske.
Ved hjælp af en fuldpipette overføres 20 ml opløsning til kolonnen, der er forberedt i overensstemmelse med 4.3.1, der åbnes for hanen og væsken eluerer, indtil den er på højde med silicagelen.
Der elueres dernæst med 150 ml elueringsvæske (4.2.3), med en hastighed på ca. 2 ml/min (det vil tage ca. 60-70 minutter at lade 150 ml løbe gennem kolonnen).
Eluatet opsamles i en 250 ml rundkolbe (4.1.1), der i forvejen er tareret og nøjagtigt afvejet. Efter at væsken er inddampet (Rotavapor), afvejes remanensen, som vil blive anvendt ved fremstilling af opløsningen til HPLC-analyse og ved fremstilling af methylester.
Udbyttet af prøven fra kolonnen skal være mindst 90 % for kategorierne ekstra jomfru, jomfru og almindelig raffineret olivenolie, og mindst 80 % for bomolie og olivenolie af presserester.
4.4. HPLC-analyse
4.4.1. Prøveforberedelse til chromatografianalyse
Der fremstilles en 5 % opløsning af den prøve, der skal analyseres, ved at der afvejes 0,5 ± 0,001 g af prøven i en 10 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til 10 ml med opløsningsmiddel (4.2.9).
4.4.2. Fremgangsmåde
Chromatografisystemet gøres klar, og der pumpes elueringsvæske (4.2.8) igennem med en hastighed af 1,5 ml/min. til rensning af hele systemet. Der ventes, indtil basislinjen er blevet stabil. Derefter indsprøjtes 10 μl af prøven forberedt som under 4.3.
4.4.3. Beregning og angivelse af resultaterne
Der anvendes intern standard, dvs. at summen af toparealerne svarende til de forskellige triglycerider sættes lig med 100 %. Den procentvise andel af hvert triglycerid beregnes efter formlen:
% triglycerid = topareal × 100/summen af alle toparealer
idet resultatet angives med to decimaler.
Note 1:
Elueringsrækkefølgen kan bestemmes ved beregning af det ækvivalente kulstofantal, ofte defineret ved udtrykket ECN = CN - 2n, hvor CN er kulstofantallet, og n er antallet af dobbeltbindinger. Det kan beregnes mere nøjagtigt, hvis dobbeltbindingens placering tages i betragtning. Hvis no, nl og nln er antallet af dobbeltbindinger i henholdsvis olie-, linol- og linolensyre, kan det ækvivalente kulstofantal beregnes efter formlen:
EN = CN - dono - dlnl - dlnnln
hvor koefficienterne do, dl og dln kan beregnes ved hjælp af referencetriglyceriderne. Under de betingelser, der er specificeret ved denne metode, vil resultatet ligge tæt ved:
ECN = CN - (2,60 no) - (2,35 nl) - (2,17 nln)
Note 2:
|
Eksempler: |
Lichrosorb (Merck) RP 18 Art 50333 |
|
Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377 |
Note 3:
Med flere referencetriglycerider er det også muligt at beregne opløsningsevnen med hensyn til triolein:
α = RT1 / RT triolein
ved hjælp af den reducerede retentionstid RT1 = RT - RT opløsningsmiddel.
Ud fra en afbildning af log α mod f (antal dobbeltbindinger) kan retentionstiderne for alle de triglycerider af fedtsyrer, som findes i referencetriglyceriderne, bestemmes (se figur 2).
Note 4:
Kolonnen skal være så effektiv, at toppene af LLL (trilinolein) adskilles tydeligt fra toppene af triglyceriderne med næsten samme retentionstid. Elueringen fortsættes, indtil ECN 52-toppen.
Note 5:
Der sikres en præcis måling af alle relevante toparealer for denne bestemmelse, hvis den anden top svarende til ECN 50 giver 50 % af fuldt udslag på skriveren.
4.5. Beregning af triglyceridernes sammensætning
4.5.1. Bestemmelse af fedtsyresammensætningen
Fedtsyresammensætningen bestemmes ved hjælp af den gaschromatografiske EF-metode, der er omhandlet i bilag X A til forordning (EØF) nr. 2568/91, ved anvendelse af en kapillarkolonne. Methylesterne fremstilles efter metoden i bilag X B i ovennævnte forordning (natriummethylat i en alkoholopløsning).
4.5.2. Fedtsyrer, der indgår i beregningen
Glyceriderne grupperes på grundlag af deres ækvivalente kulstofantal (Equivalent Carbon Number - ECN) som anført i tabellen nedenfor. Der er kun medtaget fedtsyrer med 16 eller 18 kulstofatomer, fordi kun disse er af betydning for olivenolie.
|
Fedtsyre (AG) |
Forkortelse |
Molekylvægt (MW) |
ECN |
|
Palmitinsyre |
P |
256,4 |
16 |
|
Palmitolsyre |
Po |
254,4 |
14 |
|
Stearinsyre |
S |
284,5 |
18 |
|
Oliesyre |
O |
282,5 |
16 |
|
Linolsyre |
L |
280,4 |
14 |
|
Linolensyre |
Ln |
278,4 |
12 |
4.5.3. Omregning af areal % til mol for alle fedtsyrer
|
mol P = areal % PMW Pmol S = areal % SMW Smol Po = areal % PoMW Po |
|
||
|
mol O = areal % OMW Omol L = areal % LMW Lmol Ln = areal % LnMW Ln |
4.5.4. Normalisering af fedtsyrerne til 100 %
|
mol % P 1,2,3 = mol P * 100molP + S + Po + O + L + Ln |
|
||
|
mol % S 1,2,3 = mol S * 100molP + S + Po + O + L + Ln |
|||
|
mol % Po 1,2,3 = mol Po * 100molP + S + Po + O + L + Ln |
|||
|
mol % O 1,2,3 = mol O * 100molP + S + Po + O + L + Ln |
|||
|
mol % L 1,2,3 = mol L * 100molP + S + Po + O + L + Ln |
|||
|
mol % Ln 1,2,3 = mol Ln * 100molP + S + Po + O + L + Ln |
Resultaterne giver den procentvise andel af hver fedtsyre i mol % i den samlede position (1, 2 og 3) for TAG.
Derefter beregnes summen af de mættede fedtsyrer P og S (SFA) og de umættede fedtsyrer Po, O, L og Ln (UFA):
|
mol % SFA = mol % P + mol % S |
|
||
|
mol % UFA = 100 - mol % SFA |
4.5.5. Beregning af fedtsyresammensætningen i 2- og 1-3-positionerne i TAG
Fedtsyrerne fordeles i tre grupper som følger: to identiske for 1- og 3-positionerne og én for 2-positionen med forskellige koefficienter for de mættede (P og S) og umættede syrer (Po, O, L og Ln).
|
4.5.5.1. |
Mættede fedtsyrer i 2-positionen [P(2) og S(2)]
|
|
4.5.5.2. |
Umættede fedtsyrer i 2-positionen [Po(2), O(2), L(2) og Ln(2)]:
|
|
4.5.5.3. |
Fedtsyrer i 1- og 3-positionerne [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) og Ln(1,3)]:
|
4.5.6. Beregning af triglycerider
|
4.5.6.1. |
TAG med én fedtsyre (AAA, her LLL, PoPoPo)
|
|
4.5.6.2. |
TAG med to fedtsyrer (AAB, her PoPoL, PoLL)
|
|
4.5.6.3. |
TAG med tre forskellige fedtsyrer (ABC, her OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn)
|
|
4.5.6.4. |
ECN 42-holdige triglycerider De følgende ECN 42-holdige triglycerider beregnes i overensstemmelse med ligning 7, 8 og 9 i den rækkefølge, der er bestemt af den forventede eluering i HPLC (normalt kun tre toppe). LLL PoLL og den positionelle isomer LPoL OLLn og de positionelle isomerer OLnL og LnOL PoPoL og den positionekke isomer PoLPo PoOLn og de positionelle isomerer OPoLn og OLnPo PLLn og de positionelle isomerer LLnP og LnPL PoPoPo SLnLn og den positionelle isomer LnSLn PPoLn og de positionelle isomerer PLnPo og PoPLn De ECN 42-holdige triglycerider er givet ved summen af de ni triglycerider, inklusive deres positionelle isomerer. Resultaterne angives med mindst to decimaler. |
5. Evaluering af resultaterne
Den beregnede teoretiske sammensætning og den sammensætning, der er bestemt ved HPLC-analysen, sammenlignes. Hvis differencen mellem HPLC-data minus teoretiske data overstiger de værdier, der er anført i forordningen for den pågældende oliekategori, indeholder prøven frøolie.
Bemærk:
Resultaterne angives med én decimal.
6. Eksempel (Tallene henviser til afsnittene i beskrivelsen af metoden)
4.5.1. Beregning af mol % fedtsyrer på grundlag af GLC-data (areal %)
Der fremkommer følgende data for fedtsyresammensætningen ved GLC:
|
FA MW |
P 256,4 |
S 284,5 |
Po 254,4 |
O 282,5 |
L 280,4 |
Ln 278,4 |
|
Areal % |
10,0 |
3,0 |
1,0 |
75,0 |
10,0 |
1,0 |
4.5.3. Omregning af areal % til mol for alle fedtsyrer
|
mol P = 10256,4 = 0,03900 mol P |
Se formel (1) |
||
|
mol S = 3284,5 = 0,01054 mol S |
Se formel (1) |
||
|
mol Po = 1254,4 = 0,00393 mol Po |
Se formel (1) |
||
|
mol O = 75282,5 = 0,26549 mol O |
Se formel (1) |
||
|
mol L = 10280,4= 0,03566 mol L |
Se formel (1) |
||
|
mol Ln = 1278,4 = 0,003594 mol Ln |
Se formel (1) |
||
|
|
4.5.4. Normalisering af fedtsyrerne til 100 %
|
mol % P1,2,3 = 0,03900 mol P * 1000,35822 mol = 10,888 % |
Se formel (2) |
||
|
mol % S1,2,3 = 0,01054 mol S * 1000,35822 mol = 2,944 % |
Se formel (2) |
||
|
mol % Po1,2,3 = 0,00393 mol Po * 1000,35822 mol = 1,097 % |
Se formel (2) |
||
|
mol % O1,2,3 = 0,26549 mol O * 1000,35822 mol = 74,113 % |
Se formel (2) |
||
|
mol % L1,2,3 = 0,03566 mol L * 1000,35822 mol = 9,956 % |
Se formel (2) |
||
|
mol % Ln1,2,3 = 0,00359 mol Ln * 1000,35822 mol = 1,003 % |
Se formel (2) |
||
|
|
Sum af mættede og umættede fedtsyrer i 1-, 2-, 3-position i TAG:
|
mol % SFA = 10,888 % + 2,944 % = 13,831 % |
Se formel (3) |
|
mol % UFA = 100,000 % - 13,831 % = 86,169 % |
Se formel (3) |
4.5.5. Beregning af fedtsyresammensætningen i 2- og 1-3-positionerne i TAG
|
4.5.5.1. |
Mættede fedtsyrer i 2-positionen [P(2) og S(2)]
|
|
4.5.5.2. |
Umættede fedtsyrer i 1,3-positionen [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) og Ln(1,3)]
|
|
4.5.5.3. |
Fedtstyrer i 1,3-positionerne [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) og Ln(1,3)]
|
4.5.6. Beregning af triglycerider
På grundlag af den beregnede fedtsyresammensætning i sn-2- og sn-1,3-positionerne (se ovenfor):
|
FA i |
1,3-pos. |
2-pos. |
|
P |
16,005 % |
0,653 % |
|
S |
4,327 % |
0,177 % |
|
Po |
1,015 % |
1,263 % |
|
O |
68,522 % |
85,295 % |
|
L |
9,205 % |
11,458 % |
|
Ln |
0,927 % |
1,154 % |
|
I alt |
100,0 % |
100,0 % |
beregnes følgede triglycerider:
LLL
PoPoPo
PoLL med 1 positionel isomer
SLnLn med 1 positionel isomer
PoPoL med 1 positionel isomer
PPoLn med 2 positionelle isomerer
OLLn med 2 positionelle isomerer
PLLn med 2 positionelle isomerer
PoOLn med 2 positionelle isomerer
|
4.5.6.1. |
TAG med én fedtsyre (LLL, PoPoPo) Se formel (7)
|
|
4.5.6.2. |
TAG med to fedtyrer (PoLL, SLnLn, PoPoL) Se formel (8)
|
|
4.5.6.3. |
TAG med tre forskellige fedtsyrer (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) Se formel (9)
|
Figur 1: Afbildning af log α mod f (antal dobbeltbindinger)
La: laurinsyre; My: myristinsyre; P: palmitinsyre; St: stearinsyre; O: oliesyre; L: linolsyre; Ln: linolensyre.
Figur 2: Sojaolie
Figur 3: Sojaolie/olivenolie 30/70
Figur 4: Olivenolie
BILAG XIX
BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF ALIFATISKE ALKOHOLER VED GASKROMATOGRAFI PÅ KAPILLARSØJLE
1. ANVENDELSESOMRÅDE
Metoden beskriver en fremgangsmåde til at bestemme indholdet af de enkelte alifatiske alkoholer og det samlede indhold af alifatiske alkoholer i fedtstoffer.
2. METODENS PRINCIP
Fedtstoffer, tilsat 1-eicosanol som intern standard, forsæbes med kaliumhydroxid i ethanolopløsning, hvorefter de ikke-forsæbelige stoffer ekstraheres med diethylether. Alkoholfraktionen separeres fra ekstrakten af ikke-forsæbelige stoffer ved kromatografi på basiske kiselgelplader. De alkoholer, der er indvundet fra kiselgelen, omdannes til trimethylsilylethere og analyseres ved gaskromatografi på kapillarsøjle.
3. APPARATUR
3.1. 250 ml kolbe monteret med en refluxsvaler med samlinger med glasslib
3.2. 500 ml skilletragt
3.3. 250 ml kolber
3.4. komplet apparatur til analyse ved tyndtlagskromatografi med 20 × 20 cm glasplader.
3.5. ultraviolet lampe med en bølgelængde på 366 eller 254 nm
3.6. 100 og 500 μl mikrosprøjter
3.7. en cylindrisk filtertragt med G3-glasfritte (porøsitet 15-40 μm), med en diameter på ca. 2 cm og en højde på ca. 5 cm, egnet til vakuumfiltrering og med et 12/21 udvendigt konisk glasslib
3.8. en 50 ml konisk vakuumkolbe med et 12/21 indvendigt konisk glasslib, som filtertragten (punkt 3.7) kan monteres på
3.9. et 10 ml prøverør med konisk bund og tætsluttende prop
3.10. en gaskromatograf, der er egnet til brug med kapillarsøjle, har et splittersystem og består af:
3.10.1. et termostatkammer til søjler, som kan opretholde den ønskede temperatur med en nøjagtighed på 1 °C
3.10.2. en injektionsenhed med temperaturindstilling, med et fordampningselement af silanglas
3.10.3. en flammeioniseringsdetektor og en omformer-forstærker
3.10.4. en integrerende skriver, der er egnet til brug med omformer-forstærkeren (punkt 3.10.3), og som har en svartid på ikke over ét sekund og variabel papirhastighed
3.11. en kapillarsøjle af glas eller kvartsglas, med en længde på 20-30 m, en indre diameter på 0,25-0,32 mm, indvendig belagt med SE-52– eller SE-54–væskefase eller tilsvarende i en ensartet tykkelse på mellem 0,10 og 0,30 μm
3.12. en 10 μl gaskromatografi-mikrosprøjte med hærdet kanyle.
3.13. præcisionsvægt med en følsomhed på 1 mg (angivelse af 0,1 mg).
4. REAGENSER
4.1. kaliumhydroxid, ca. 2 N, i ethanolopløsning: 130 g kaliumhydroxid (titer: min. 85 %) opløses i 200 ml destilleret vand under afkøling, og der fyldes op med ethanol til 1 liter. Opløsningen opbevares i veltilproppede, mørke glasflasker
4.2. diethylether, analyseren
4.3. vandfrit natriumsulfat, analyserent
4.4. glasplader belagt med kiselgel uden fluorescensindikator, tykkelse 0,25 mm (kan fås brugsfærdige i handelen)
4.5. kaliumhydroxid, ca. 0,2 N, i ethanolopløsning: 13 g kaliumhydroxid opløses i 20 ml destilleret vand, og der fyldes op med ethanol til 1 liter
4.6. benzen, til kromatografi (punkt 5.2.2)
4.7. acetone, til kromatografi (punkt 5.2.2)
4.8. hexan, til kromatografi (punkt 5.2.2)
4.9. diethylether, til kromatografi (punkt 5.2.2)
4.10. chloroform, analyseren
4.11. referenceopløsning til tyndtlagskromatografi: cholesterol eller phytosteroler, 5 %-opløsning i chloroform
4.12. 2,7-dichlorfluorescein, 0,2 %-opløsning i ethanol. Gøres svagt basisk ved tilsætning af nogle få dråber 2 N alkoholisk kaliumhydroxidopløsning
4.13. vandfri pyridin til kromatografi
4.14. hexamethyldisilazan
4.15. trimethylchlorsilan
4.16. standardopløsninger af trimethylsilylethere (TMSE) af de alifatiske alkoholer fra C20 til C28, friskfremstillede ud fra blandinger af rene alkoholer
4.17. 1-eicosanol, 0,1 % (m/v)–opløsning i chloroform (intern standard)
4.18. bæregas: hydrogen eller helium, ren, til gaskromatografi
4.19. hjælpegas: nitrogen, ren, til gaskromatografi.
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. Fremstilling af de uforsæbelige stoffer
|
5.1.1. |
Et rumfang 0,1 %-1-eicosanolopløsning i chloroform (punkt 4.17), der indeholder en mængde 1-eicosanol (man kan ligeledes anvende 1-eneicosanol) svarende til ca. 10 % af indholdet af alifatiske alkoholer i den del af prøven, der er taget ud til bestemmelsen, overføres til 250 ml-kolben ved hjælp af 500 μl-mikrosprøjten. F.eks. sættes til 5 g af prøven 250 μl 0,1 %–1-eicosanolopløsning, hvis undersøgelsen gælder olivenolier eller frøolier, og 1 500 μl, hvis det gælder olie fra olivenpresserester. Prøven inddampes til tørhed i en nitrogenstrøm, hvorefter 5 g af den tørrede, filtrerede prøve afvejes nøjagtigt og overføres til den samme kolbe. |
|
5.1.2. |
50 ml 2 N–opløsning af kaliumhydroxid i ethanol tilsættes, refluxsvaleren påsættes, og væsken opvarmes til svag kogning på vandbad under vedvarende, kraftig omrøring, indtil forsæbningen er sket (opløsningen bliver klar). Opvarmningen fortsættes i endnu 20 minutter, derefter tilsættes 50 ml destilleret vand ovenfra gennem svaleren, svaleren tages af, og kolben afkøles til ca. 30 °C. |
|
5.1.3. |
Kolbens indhold overføres kvantitativt til en 500 ml–skilletragt, idet der skylles flere gange med destilleret vand, i alt ca. 50 ml. Ca. 80 ml diethylether tilsættes, tragten rystes kraftigt i ca. 30 sekunder og får lov til at henstå (note 1). Den nedre vandige fase tappes af og opsamles i en anden skilletragt. Yderligere to ekstraktioner foretages på den vandige fase på samme måde, idet der bruges 60-70 ml diethylether hver gang. Note 1: En eventuel emulsion kan brydes ved tilsætning af en lille mængde ethyl- eller methylalkohol ved hjælp af en spray. |
|
5.1.4. |
Etherekstrakterne samles i én skilletragt og vaskes med destilleret vand (50 ml ad gangen), indtil vaskevandet giver neutral reaktion. Når vaskevandet er fjernet, tørres ekstrakterne med vandfrit natriumsulfat og filtreres over vandfrit natriumsulfat ned i en på forhånd vejet 250 ml-kolbe, idet tragt og filter vaskes med små mængder diethylether. |
|
5.1.5. |
Etheren destilleres ned til nogle få ml og bringes derefter til tørhed under et let undertryk eller i en nitrogenstrøm, tørres fuldstændigt i en ovn ved 100 °C i ca. 15 minutter og vejes efter afkøling i en ekssikkator. |
5.2. Separation af alkoholfraktionen
|
5.2.1. |
Forberedelse af de basiske plader: Kiselgelpladerne (punkt 4.4) nedsænkes fuldstændig i 0,2 N-opløsningen af kaliumhydroxid i ethanol (punkt 4.5) i 10 sekunder, tørrer under emhætte i 2 timer og sættes til sidst i en ovn ved 100 °C i 1 time. Pladeren tages ud af ovnen og opbevares i en ekssikkator med calciumchlorid, til de skal bruges (plader, der er behandlet på denne måde, skal anvendes inden 15 dage). Note 2: Når basiske kiselgelplader benyttes til at separere alkoholfraktionen, er det ikke nødvendigt at behandle de ikke-forsæbelige stoffer med aluminiuoxid. På denne måde holdes alle sure forbindelser (fedtsyrer og andre syrer) tilbage på basislinjen, og båndet med alifatiske alkoholer og terpenalkoholer bliver klart adskilt fra sterolbåndet. |
|
5.2.2. |
Der hældes 65:35 (v/v)-hexan/ethyletherblanding i kromatografikammeret til en højde på ca. 1 cm ( 7 ). Kammeret lukkes med det dertil passende låg og henstår i ca. en halv time, så at der opnås ligevægt mellem væske og damp. Strimler af filtrerpapir, der dypper ned i eluenten, kan anbringes på kammerets indre overflader. Dette reducerer elueringstiden med ca. en tredjedel og giver en mere ensartet og regelmæssig eluering af komponenterne. Note 3: Kromatografiblandingen bør udskiftes for hver test for at opnå fuldstændig reproducerbare elueringsbetingelser. |
|
5.2.3. |
Der fremstilles en ca. 5 %-opløsning af de ikke-forsæbelige stoffer (punkt 5.1.5) i chloroform. Med 100 μl-mikrosprøjten afsættes med 0,3 ml af denne opløsning på en kromatografiplade (punkt 5.2.1), ca. 2 cm fra den ene ende, en streg, som er så tynd og ensartet som muligt. På linje med stregen placeres 2-3 μl af alkoholreferenceopløsningen (punkt 4.11) i den ene ende af pladen, så båndet med de alifatiske alkoholer kan identificeres efter eluering. |
|
5.2.4. |
Pladen anbringes i kromatografikammeret, der er forberedt som angivet i punkt 5.2.2. Temperaturen bør holdes mellem 15 og 20 °C. Kammeret lukkes straks med låget, og der elueres, indtil opløsningsmiddelfronten er ca. 1 cm fra pladens øverste kant. Derpå fjernes pladen fra kromatografikammeret, og man lader opløsningsmidlet fordampe i en strøm af varm luft eller ved at lade pladen stå en kort tid under emhætte. |
|
5.2.5. |
Pladen sprøjtes let og ensartet med 2,7-dichlorfluroresceinopløsningen. Båndet med alifatiske alkoholer identificeres ved, at det ligger på linje med pletten fra referenceopløsningen, hvorefter båndet med alifatiske alkoholer og båndet umiddelbart derover, som indeholder triterpenalkoholer, markeres med en sort blyant. Note 4: Anvisningen om at udtage både båndet med alifatiske alkoholer og båndet med triterpenalkoholer skyldes, at under denne metodes betingelser er der en betydelig mængde alifatiske alkoholer i båndet med triterpenalkoholer. |
|
5.2.6. |
Med en metalspatel skrabes kiselgelen i det markerede område af. Det fjernede materiale pulveriseres fint og placeres i filtertragten (punkt 3.7). Der tilsættes 10 ml varm chloroform, blandes omhygeligt med metalspatelen og filtreres under vakuum; filtratet opsamles i den koniske kolbe (punkt 3.8), der er forbundet med filtertagten. Materialet i tragten vaskes tre gange med diethylether (ca. 10 ml ad gangen), idet filtratet samles i den samme kolbe, der er forbundet med filtertragten. Filtratet inddampes til et rumfang af 4-5 ml, som overføres til det på forhånd vejede 10 ml–prøverør (punkt 3.9), og der inddampes til tørhed med let opvarmning i en svag strøm af nitrogen. Remanensen genopløses i nogle få dråber acetone, der inddampes igen til tørhed, røret placeres i en ovn ved 105 °C i ca. 10 minutter, og det afsvales i en ekssikkator og vejes. Remanensen i prøverøret udgør alkoholfraktionen. |
5.3. Fremstilling af trimethylsilylethere (TMSE)
|
5.3.1. |
Til prøverøret med alkoholfraktionen sættes silyleringsreagenset, der består af en 9:3:1 (v/v/v)-blanding af pyridin/hexamethyl-disilazan/trimethylchlorsilan (note 5), i en mængde af 50 μl pr. milligram alkohol, idet enhver optagelse af fugt undgås (note 6). Note 5: Brugsfærdige opløsninger kan fås i handelen. Man kan også få andre silyleringsreagenser som f.eks. bis-trimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % trimethylchlorsilan, som skal fortyndes med et lige så stort rumfang vandfri pyridin. Note 6: Den lette opalisering, som kan fremkomme, er normal og giver ikke anledning til interferens. Hvis der dannes hvide fnug eller fremkommer en lyserød farve, er det tegn på, at der er fugt til stede, eller at reagenset ikke er i orden. Hvis det forekommer, må prøven gentages. |
|
5.3.2. |
Prøverøret tilproppes, rystes omhyggeligt (uden at vende bunden i vejret på det), indtil alkoholerne er fuldstændig opløst. Efter mindst 15 minutters henstand ved stuetemperatur centrifugeres der i nogle få minutter. Den klare opløsning er parat til gaskromatografisk analyse. |
5.4. Gaskromatografisk analyse
5.4.1. Forberedende operationer, konditionering af søjlen
|
5.4.1.1. |
Søjlen monteres i gaskromatografen, idet indløbsenden forbindes med injektoren, der står i forbindelse med splittersystemet, og udløbsenden forbindes med detektoren. Der foretages en generel kontrol af gaskromatografienheden (lækager fra gaskredsløbene, detektorens effektivitet, splittersystemets og skriversystemets effektivitet osv.). |
|
5.4.1.2. |
Hvis søljen skal bruges for første gang, anbefales det, at den underkastes en konditionering. Man lader en svag gasstrøm passere gennem søjlen og tænder så for gaskromatografienheden, derefter begynder man gradvis at varme op til en temperatur mindst 20 °C over driftstemperaturen (note 7). Denne temperatur opretholdes i mindst 2 timer, derefter sættes hele systemet i driftstilstand (justering af gasstrømme og splitter, antændelse a flammen, forbindelse til den elektroniske skriver, justering af søjlekammeret, detektorens og injektorens temperatur osv.), og derefter optegnes signalet med en følsomhed, der er mindst to gange større end den, man agter at anvende til analysen. Basislinjens forløb skal være lige, uden toppe af nogen art, og den må ikke drive. Drivning nedad af en lige linje tyder på lækage fra søjlens forbindelser, drivning opad tyder på utilstrækkelig konditionering af søjlen. Note 7: Konditioneringstemperaturen skal altid være mindst 20 °C lavere end den maksimumtemperatur, der er angivet for den anvendte stationære fase. |
5.4.2. Valg af driftsbetingelser
5.4.2.1. Der anbefales følgende vejledende driftsbetingelser:
— søjletemperatur: først konstant temperatur 180 °C i 8 minutter, derefter programmeret stigning med 5 °C/minut op til 260 °C og endelig 15 minutter ved 260 °C
— fordampertemperatur: 280 °C
— detektortemperatur: 290 °C
— bæregassens lineære hastighed: helium 20-35 cm/s, hydrogen 30-50 cm/s
— splitterforhold: fra 1:50 til 1:100
— instrumentets følsomhed: fra 4 til 16 gange den minimale dæmpning
— registreringsfølsomhed: 1-2 mV fuld skala
— papirhastighed: 30-60 cm/time
— mængde stof injiceret: 0,5-1 μl TMSE-opløsning.
Disse betingelser kan varieres alt efter søjlens og gaskromatografens egenskaber, så man opnår kromatogrammer, der opfylder følgende krav:
— Retentionstiden for C26-alkohol skal være 18 ± 5 minutter.
— Toppen for C22-alkohol skal være 80 ± 20 % af fuld skala for olivenolie og 40 ± 20 % af fuld skala for frøolier.
5.4.2.2. For at kontrollere ovenstående krav foretages gentagne injektioner af prøveblandinger af alkohol-TMSE, og driftsbetingelserne justeres, så de bedste resultater opnås.
5.4.2.3. Integrationsparametrene for toppene må fastsættes sådan, at de giver korrekte værdier for de relevante toppe.
5.4.3. Udførelse af analysen
5.4.3.1. Med 10 μl-mikrosprøjten opsuges 1 μl hexan, 0,5 μl luft og derefter 0,5-1 μl af prøveopløsningen. Stemplet trækkes længere ud, så kanylen tømmes. Kanylen trykkes gennem injektionsenhedens membran, og efter 1-2 sekunder injiceres hurtigt; derefter fjernes kanylen langsomt efter ca. 5 sekunder.
5.4.3.2. Skriveren skal køre, indtil alle alkohol-TMSE er fuldstændig elueret. Basislinjen skal til stadighed opfylde kravene (punkt 5.4.1.2).
5.4.4. Identifikation af toppene
De enkelte toppe identificeres på basis af retentionstiderne og ved sammenligning med blandinger af alkohol-TMSE, der er analyseret under de samme betingelser.
Figur 1 viser et kromatogram for alkoholfraktionen af en jomfruolie.
5.4.5. Kvantitativ vurdering
5.4.5.1. Toparealerne for 1-eicosanol og de alifatiske alkoholer C22, C24, C26 og C28 beregnes ved hjælp af integratoren.
5.4.5.2. Koncentrationen af de enkelte simple alifatiske alkoholer beregnes i mg pr.
1 000
g fedtstof som følger:
hvor:
Ax = toparealet for alkohol x
As = arealet af 1-eicosanoltoppen
ms = massen af tilsat 1-eicosanol i milligram
m = massen af den prøve, der bruges til bestemmelsen, i gram.
6. ANGIVELSE AF RESULTATER
Koncentrationerne af simple alifatiske alkoholer angives i mg pr. 1 000 g fedtstof og deres sum som »total mængde alifatiske alkoholer«.
TILLÆG
Bestemmelse af gassens lineære hastighed
Med gaskromatografen indstillet på normale driftsbetingelser injiceres 1-3 μl methan (eller propan), og man måler den tid, det tager for gassen at passere gennem søjlen fra tidspunktet for injektionen til det tidspunkt, hvor toppen fremkommer (tM).
Den lineære hastighed i cm/s er givet ved L/tM, hvor L er søjlens længde i cm, og tM er den målte tid i sekunder.
Figur 1: Kromatogram af alkoholfraktionen af en jomfruolie
1 = eicosanol
2 = docosanol
3 = tricosanol
4 = tetracosanol
5 = pentacosanol
6 = hexacosanol
7 = heptacosanol
8 = octacosanol
BILAG XX
Metode til bestemmelse af indholdet af voks, fedtsyremethylestere og fedtsyreethylestere ved gaskromatografi på kapillarkolonne
1. FORMÅL
Metodens formål er bestemmelse af indholdet af voks, fedtsyremethylestere og fedtsyreethylestere i olivenolie. De enkelte vokser og alkylestere adskilles efter antallet af kulstofatomer. Metoden anbefales som værktøj til at skelne mellem olivenolie og olie af olivenpresserester og som kvalitetsparameter for ekstra jomfruolie og dermed påvisning af ulovlig blanding af ekstra jomfruolie med olie af ringere kvalitet, uanset om det er jomfruolie, bomolie eller desodoriseret olie.
2. PRINCIP
Tilsætning af egnede interne standarder til olien og adskillelse ved kromatografi på silicagelkolonne. Opsamling af den fraktion, der elueres under prøvebetingelserne (og som har lavere polaritet end triacylglycerolerne), og direkte analyse ved gaskromatografi på kapillarkolonne.
3. APPARATUR
|
3.1. |
Erlenmeyerkolbe, 25 ml |
|
3.2. |
Glaskolonne til væskekromatografi, indvendig diameter 15 mm, længde 30-40 cm, med hane |
|
3.3. |
Gaskromatograf til brug med kapillarkolonne og med et system til direkte indsprøjtning i kolonnen, bestående af følgende:
|
|
3.4. |
Mikroinjektionssprøjte på 10 μl, med hærdet kanyle, til direkte indsprøjtning i kolonnen |
|
3.5. |
Elektrisk vibrator |
|
3.6. |
Rotationsfordamper |
|
3.7. |
Muffelovn |
|
3.8. |
Analysevægt med en nøjagtighed på ± 0,1 mg |
|
3.9. |
Sædvanligt laboratorieglasudstyr |
4. REAGENSER
|
4.1. |
Silicagel med kornstørrelse 60-200 μm. Silicagelen anbringes i ovnen ved 500 °C i mindst fire timer. Efter afkøling tilsættes der 2 % vand beregnet på silicagelmængden. Pulveret rystes omhyggeligt, til det er ensartet, og opbevares i ekssikkator i mindst tolv timer inden brug. |
|
4.2. |
n-hexan af kvalitet til kromatografering eller bestemmelse af restkoncentrationer (renheden kontrolleres) ADVARSEL – Dampe kan antændes. Holdes væk fra varme, gnister og åben ild. Sørg for, at flasker altid er rigtigt lukket. Sørg for god udluftning under brugen. Undgå akkumulering af dampe, og fjern alle antændelseskilder såsom elvarmeapparater og elektrisk udstyr, der ikke er lavet af ikke brændbare materialer. Farligt ved indånding, da det kan forårsage skader på nerveceller. Undgå indånding af dampe. Brug om nødvendigt egnet åndedrætsværn. Undgå kontakt med øjne og hud. |
|
4.3. |
Ethylether, til kromatografering
ADVARSEL – Meget brandfarligt og moderat giftigt. Hudirriterende. Farligt ved indånding. Kan forårsage øjenskader. Virkningerne kan indtræde med forsinkelse. Kan danne eksplosive peroxider. Dampe kan antændes. Holdes væk fra varme, gnister og åben ild. Sørg for, at flasker altid er rigtigt lukket. Sørg for god udluftning under brugen. Undgå akkumulering af dampe, og fjern alle antændelseskilder såsom elvarmeapparater og elektrisk udstyr, der ikke er lavet af ikkebrændbare materialer. Bør ikke inddampes til tørhed eller næsten tørhed. Dannelse af peroxider kan mindskes ved tilsætning af vand eller et passende reduktionsmiddel. Må ikke drikkes. Undgå indånding af dampe. Undgå længerevarende eller gentagen hudkontakt. |
|
4.4. |
n-heptan, til kromatografering, eller isooctan ADVARSEL – Brandfarligt. Farligt ved indånding. Holdes væk fra varme, gnister og åben ild. Sørg for, at flasker altid er rigtigt lukket. Sørg for god udluftning under brugen. Undgå indånding af dampe. Undgå længerevarende eller gentagen hudkontakt. |
|
4.5. |
Standardopløsning af laurylarachidat (anm. 3), 0,05 % (m/v) i heptan (intern standard for voks). Anmærkning 3: Der kan også bruges palmitylpalmitat, myristylstearat eller arachidyllaurat. |
|
4.6. |
Standardopløsning af methylheptadecanoat, 0,02 % (m/v) i heptan (intern standard for methyl- og ethylestere) |
|
4.7. |
Sudan 1 (1-phenylazo-2-naphthol) |
|
4.8. |
Bæregas: hydrogen eller helium, ren, til gaskromatografi ADVARSEL Hydrogen. Meget brandfarligt, under tryk. Holdes væk fra varme, gnister, åben ild og elektrisk udstyr, der ikke er lavet af ikkebrændbare materialer. Sørg for, at flaskens ventil er lukket, når den ikke er i brug. Benyt altid reduktionsventil. Reduktionsventilens fjeder skal udløses helt, inden ventilen på flasken åbnes. Stå ikke foran flaskens åbning, når ventilen åbnes. Sørg for god udluftning under brugen. Overfør ikke hydrogen fra en flaske til en anden. Bland ikke gasser i flasken. Sørg for, at flaskerne ikke kan vælte. Hold flasker afskærmet mod sollys og varme. Opbevares i ikkekorrosionsfremmende omgivelser. Brug ikke flasker, der er beskadiget eller mangler etiket. Helium. Komprimeret gas under højt tryk. Gassen mindsker den mængde oxygen, der er til rådighed til vejrtrækning. Hold flasken lukket. Sørg for god udluftning under brugen. Gå ikke ind i lagerrum, hvis de ikke har tilstrækkelig udluftning. Benyt altid reduktionsventil. Reduktionsventilens fjeder skal udløses helt, inden ventilen på flasken åbnes. Overfør ikke gas fra en flaske til en anden. Sørg for, at flaskerne ikke kan vælte. Stå ikke foran flaskens åbning, når ventilen åbnes. Hold flasker afskærmet mod sollys og varme. Opbevares i ikkekorrosionsfremmende omgivelser. Brug ikke flasker, der er beskadiget eller mangler etiket. Må ikke indåndes. Kun til teknisk brug. |
|
4.9. |
Hjælpegasser: — hydrogen, ren, til gaskromatografi — luft, ren, til gaskromatografi. ADVARSEL Luft. Komprimeret gas under højt tryk. Bruges med forsigtighed, når der er brændbare stoffer til stede, da de fleste organiske forbindelser har en betydeligt lavere selvantændelsestemperatur i luft under højt tryk. Sørg for, at flaskens ventil er lukket, når den ikke er i brug. Benyt altid reduktionsventil. Reduktionsventilens fjeder skal udløses helt, inden ventilen på flasken åbnes. Stå ikke foran flaskens åbning, når ventilen åbnes. Overfør ikke gas fra en flaske til en anden. Bland ikke gasser i flasken. Sørg for, at flaskerne ikke kan vælte. Hold flasker afskærmet mod sollys og varme. Opbevares i ikkekorrosionsfremmende omgivelser. Brug ikke flasker, der er beskadiget eller mangler etiket. Luft til teknisk brug må ikke anvendes til inhalations- og respirationsapparater. |
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. Fremstilling af kromatografikolonnen
15 g silicagel (4.1) opslæmmes i n-hexan (4.2) og hældes i kolonnen (3.2). Når kolonnematerialet har sat sig ved henstand, pakkes det yderligere ved hjælp af en el-vibrator (3.5) for at opnå større homogenitet. Der elueres med 30 ml n-hexan for at fjerne eventuelle urenheder. På analysevægten (3.8) afvejes ca. 500 mg af prøven nøjagtigt i en 25 ml kolbe (3.1), og der tilsættes en mængde intern standard (4.5) svarende til det formodede voksindhold, eksempelvis 0,1 mg laurylarachidat til olivenolie og 0,25-0,50 mg til olie af olivenpresserester og 0,05 mg methylheptadecanoat til olivenolier (4.6).
Den tilberedte prøve overføres til kromatografikolonnen ved hjælp af to portioner n-hexan (4.2) a 2 ml.
Der aftappes opløsningsmiddel, indtil væskeoverfladen står 1 mm over kolonnematerialet. Der elueres yderligere med n-hexan/ethylether (99:1) og opsamles 220 ml eluat med en hastighed på ca. 15 dråber pr. 10 sekunder. (Denne fraktion indeholder methyl- og ethylestrene og vokserne). (Anm. 4) (Anm. 5).
Anmærkning 4: n-hexan/ethylether-blandingen (99:1) skal friskfremstilles hver dag.
Anmærkning 5: Korrekt eluering af vokserne kan kontrolleres visuelt ved, at der til prøveopløsningen tilsættes 100 μl 1 % Sudan 1 i elueringsvæske.
Farvestoffet har en retentionstid mellem vokser og triglycerider, så når farven har nået bunden af kolonnen, skal elueringen standses, eftersom al voks da er elueret.
Den derved fremkomne fraktion inddampes i en rotationsfordamper, indtil opløsningsmidlet næsten helt er forsvundet. De sidste 2 ml fjernes ved hjælp af en svag nitrogenstrøm. Den opsamlede fraktion, der indeholder methyl- og ethylestrene, fortyndes med 2-4 ml n-heptan eller isooctan.
5.2. Gaskromatografisk analyse
5.2.1. Indledende procedure
Kolonnen påmonteres gaskromatografen (3.3), idet den ene ende forbindes med injektionssystemet og den anden ende med detektoren. Gaskromatografen kontrolleres (gasledningerne, detektors og skrivers ydeevne, m.v.).
Hvis kolonnen ikke har været benyttet før, kan det anbefales at konditionere den. En svag gasstrøm ledes gennem kolonnen, hvorefter gaskromatografen sættes i gang. Der opvarmes gradvis til 350 °C over en periode på ca. fire timer.
Denne temperatur holdes i mindst to timer, hvorefter apparaturet indstilles til arbejdsbetingelserne (gasstrømmen indstilles, der tændes for flammen, den elektroniske skriver (3.3.4) tilsluttes, kolonneovnens temperatur indstilles, detektoren indstilles osv.). Signalet registreres med en følsomhed på mindst det dobbelte af den, der kræves ved analysen. Basislinjen bør være lineær uden nogen form for toppe og må ikke drive.
Negativ lineær drift tyder på utætheder i kolonneforbindelserne, mens positiv drift er tegn på utilstrækkelig konditionering af kolonnen.
5.2.2. Valg af arbejdsbetingelser for vokser og methyl- og ethylestere (Anm. 6)
Arbejdsbetingelserne er normalt som følger:
|
— |
Kolonnetemperatur : 20 °C/min 5 °C/min fra 80 °C (1’) |
|
— |
Detektortemperatur : 350 °C |
|
— |
Indsprøjtet mængde : 1 μl af opløsningen i (2-4 ml) n-heptan |
|
— |
Bæregas : helium eller hydrogen med den for den valgte gas optimale lineære hastighed (se tillæg A) |
|
— |
Instrumentfølsomhed : passende til opfyldelse af ovenstående krav. |
Anmærkning 6: På grund af den høje sluttemperatur, tillades der en positiv drift på op til 10 % af fuldt udslag.
Disse betingelser kan ændres alt efter kolonnens og gaskromatografens karakteristika, så man opnår adskillelse af alle vokser og methyl- og ethylestere af fedtsyrer, en tilfredsstillende opløsning af toppene (se figur 2, 3 og 4) og en retentionstid for den interne standard laurylarachidat på 18 ± 3 minutter. Voksernes mest repræsentative top skal måle mindst 60 % af fuldt udslag, mens den interne standard for methyl- og ethylestrene, methylheptadecanoat, skal give fuldt udslag.
Parametrene for toppenes integration fastlægges på en sådan måde, at de relevante toppes arealer vurderes korrekt.
5.3. Udførelse af analysen
Der suges 10 μl af opløsningen op i 10 μl-mikrosprøjten, og stemplet trækkes tilbage, indtil kanylen er tom. Kanylen stikkes ind i injektionssystemet, og der indsprøjtes hurtigt efter 1-2 sekunder. Efter ca. 5 sekunder trækkes kanylen forsigtigt ud.
Registreringen fortsættes, indtil alle vokser eller stigmastadiener er helt elueret, afhængigt af, hvilken fraktion der analyseres.
Basislinjen skal hele tiden opfylde de fastsatte betingelser.
5.4. Identifikation af toppene
Toppene identificeres ud fra retentionstiderne, idet de sammenlignes med blandinger af vokser med kendte retentionstider, der er analyseret under samme betingelser. Alkylestrene identificeres ud fra blandinger af methyl- og ethylestre af de vigtigste fedtsyrer i olivenolie (palmitinsyre og oliesyre).
Figur 1 viser et kromatogram af vokser fra jomfruolie. Figur 2 og 3 viser kromatogrammer af to ekstra jomfruolier fra detailhandelen, den ene indeholdende methyl- og ethylestre, den anden ikke. Figur 4 viser kromatogrammerne af en ekstra jomfruolie af bedste kvalitet og af samme olie, hvortil der er tilsat 20 % desodoriseret olie.
5.5. Kvantitativ analyse af vokserne
Arealerne af toppene for den interne standard laurylarachidat og for de alifatiske C40- til C46- estere bestemmes ved hjælp af integratoren.
Det samlede voksindhold bestemmes som summen af de enkelte vokser i mg/kg fedtstof efter formlen:
hvor:
|
Ax |
= |
arealet af toppen for den enkelte ester i computerenheder |
|
As |
= |
arealet af toppen for den interne standard laurylarachidat i computerenheder |
|
ms |
= |
massen af tilsat intern standard laurylarachidat i milligram |
|
m |
= |
massen af den prøve, der bruges til bestemmelsen, i gram. |
5.5.1. Kvantitativ analyse af methyl- og ethylestere
Arealerne af toppene for den interne standard methylheptadecanoat, methylestrene af C16- og C18-fedtsyrerne og ethylestrene af C16- og C18-fedtsyrerne bestemmes ved hjælp af integratoren.
Indholdet af den enkelte alkylester bestemmes i mg/kg fedtstof efter formlen:
hvor:
|
Ax |
= |
arealet af toppen for den enkelte C16- og C18-ester i computerenheder |
|
As |
= |
arealet af toppen for den interne standard methylheptadecanoat i computerenheder |
|
ms |
= |
massen af tilsat intern standard methylheptadecanoat i milligram |
|
m |
= |
massen af den prøve, der bruges til bestemmelsen, i gram. |
6. ANGIVELSE AF RESULTATER
Summen af indholdet af de forskellige C40- til C46-vokser (Anm. 7) angives i mg pr. kg fedtstof (ppm).
Summen af indholdet af henholdsvis C16- til C18-methylestere og -ethylestere angives samt de to summer tilsammen.
Resultaterne angives i nærmeste hele mg/kg.
Anmærkning 7: De bestanddele, der skal bestemmes kvantitativt, er dem med et lige antal kulstofatomer blandt C40- til C46-estrene, jf. eksemplet på et kromatogram af vokser i olivenolie i nedenstående figur. Hvis C46-esteren giver en dobbelt top, tilrådes det med henblik på identifikation at analysere voksfraktionen fra en olie af olivenpresserester, hvor C46-toppen tydeligt kan skelnes, da den er langt den største.
Forholdet mellem ethylestere og methylestere angives.
Figur 1
Eksempel på et gaskromatogram af voksfraktionen fra en olivenolie ( 8 )
Signaturer:
Toppe med en retentionstid mellem 5 og 8 minutter større end fedtsyremethylestere og -ethylestere.
|
I.S. |
= |
laurylarachidat |
|
1 |
= |
diterpenestere |
|
2+2′ |
= |
C40-estere |
|
3+3′ |
= |
C42-estere |
|
4+4′ |
= |
C44-estere |
|
5 |
= |
C46-estere |
|
6 |
= |
sterolestere og triterpenalkoholer. |
Figur 2
Methylestere, ethylestere og vokser i en jomfruolie
Signaturer:
|
1 |
– |
methyl-C16 |
|
2 |
– |
ethyl-C16 |
|
3 |
– |
methylheptadecanoat, I.S. |
|
4 |
– |
methyl-C18 |
|
5 |
– |
ethyl-C18 |
|
6 |
– |
Squalene |
|
7 |
– |
laurylarachidat, I.S. |
|
A |
– |
diterpenestere |
|
B |
– |
vokser |
|
C |
– |
sterolestere og triterpenalkoholer |
Figur 3
Methylestere, ethylestere og vokser i en ekstra jomfruolie
Signaturer:
|
1 |
– |
methylheptadecanoat, I.S. |
|
2 |
– |
methyl-C18 |
|
3 |
– |
ethyl-C18 |
|
4 |
– |
squalen |
|
5 |
– |
laurylarachidat, I.S. |
|
A |
– |
diterpenestere |
|
B |
– |
vokser |
|
C |
– |
sterolestere og triterpenalkoholer |
Figur 4
Udsnit af kromatogrammer af en ekstra jomfruolie og af samme olie, hvortil der er tilsat desodoriseret olie
Signaturer:
|
1 |
– |
methylmyristat, I.S. |
|
2 |
– |
methylpalmitat |
|
3 |
– |
ethylpalmitat |
|
4 |
– |
methylheptadecanoat, I.S. |
|
5 |
– |
methyllinoleat |
|
6 |
– |
methyloleat |
|
7 |
– |
methylstearat |
|
8 |
– |
ethyllinoleat |
|
9 |
– |
ethyloleat |
|
10 |
– |
ethylsteara |
Tillæg A
Bestemmelse af gassens lineære hastighed
Der indsprøjtes 1-3 μl methan (eller propan) i gaskromatografen, efter at den er indstillet til normale arbejdsbetingelser. Den tid, som det tager gassen at strømme gennem kolonnen fra det øjeblik, den indsprøjtes, til toppen viser sig, måles (tM).
Den lineære hastighed i cm/s er givet ved L/tM, hvor L er søjlens længde i cm, og tM er den målte tid i sekunder.
( 1 ) EFT nr. 172 af 30.9.1966, s. 3025/66.
( 2 ) EFT nr. L 353 af 17.12.1990, s. 23.
( 3 ) EFT nr. L 128 af 24.5.1977, s. 6.
( 4 ) EFT nr. L 166 af 1.7.1988, s. 10.
( 5 ) Efter eluering af sterolestrene må kromatogrammet ikke have nogen betydende toppe (triglycerider).
( 6 ) Smageren kan undlade at smage på olien, hvis han konstaterer særligt intense negative egenskaber, og han noterer denne ekstraordinære omstændighed på profilskemaet.
( 7 ) I disse tilfælde i særdeleshed benyttes 95:5 (v/v)–benzen/acetoneblandingen for at opnå god adskillelse af båndene.
( 8 ) Efter eluering af sterolestrene må kromatogrammet ikke have nogen betydende toppe (triacylglyceroler).
140 °C 
335 °C (20)