---

BILAG

BESKRIVELSE AF REFERENCEANALYSEMETODER FOR FØLGENDE PARAMETRE
	I.
	II.
	III.
	III.1
	III.2
	III.3
	IV.
	V.
	VI.
	VII.
	VIII.
	IX.
▼M2
	X.
▼M3
	XI.
▼B

I.   REFERENCEMETODE TIL BESTEMMELSE AF VOLUMENKONCENTRATIONEN AF ALKOHOL I SPIRITUS

Indledning

Referencemetoden indeholder to bilag:

Bilag I : Fremstilling af destillat

Bilag II : Måling af destillatets densitet

1.   Anvendelsesområde

Metoden er egnet til bestemmelse af den faktiske volumenkoncentration af alkohol i spiritus.

2.   Normative referencer

ISO 3696:1987: Vand til analytisk laboratoriebrug. Specifikation og prøvningsmetoder.

3.   Udtryk og definitioner

3.1.

Referencetemperatur: Referencetemperaturen for bestemmelse af volumenkoncentrationen af alkohol i spiritus og densitet og relativ densitet af spiritus er 20 °C. Anm. 1: Udtrykket »ved t °C« er forbeholdt målinger (af densitet og volumenkoncentration af alkohol) ved en anden temperatur end referencetemperaturen 20 °C.

3.2.	Densitet: Densiteten er massen pr. volumenenhed i vakuum af spiritus ved 20 °C. Den angives i kilogram pr. kubikmeter og har symbolet ρ20 °C eller ρ20.

3.3.

Relativ densitet: Den relative densitet er forholdet mellem densiteten af spiritussen ved 20 °C og vand ved samme temperatur, udtrykt som decimalbrøk. Hertil benyttes symbolet d20 °C/20 °C eller d20/20, eller blot d, når der ikke er mulighed for forveksling. Den målte parameter skal angives på prøvningsattesten ved hjælp af ovennævnte symboler og ingen andre. Anm. 2: Det er muligt at finde den relative densitet ud fra densiteten ρ20 ved 20 °C: eller hvor 998,203 er densiteten af vand ved 20 °C.

3.4.

Faktisk volumenkoncentration af alkohol: Den faktiske volumenkoncentration af alkohol i spiritus er lig med det antal liter ethylalkohol, der er indeholdt i 100 l af en vand/alkohol-blanding med samme densitet som alkoholen eller spiritussen efter destillation. Som referenceværdier for volumenkoncentration af alkohol ( % vol.) ved 20 °C mod densiteten ved 20 °C for forskellige vand/alkohol-blandinger skal benyttes de værdier, der er opgivet i den internationale tabel, som Den Internationale Organisation for Retslig Metrologi har vedtaget i sin rekommandation nr. 22. Den generelle ligning for sammenhængen mellem volumenkoncentrationen af alkohol og densiteten (massefylden) af en vand/alkohol-blanding ved en given temperatur findes på side 40 i bilaget til Kommissionens forordning (EØF) nr. 2676/90, kapitel 3, »Alkoholindhold udtrykt i volumen« (EFT L 272 af 3.10.1990, s. 1), eller i OIV's manual for analysemetoder (1994), s. 17. Anm. 3: For likører, hvis volumen er meget vanskeligt at måle nøjagtigt, vejes prøven, og alkoholindholdet beregnes først i massekoncentration. Omregningsformel: hvor ASM = massekoncentrationen af alkohol ρ20 (alkohol) = 789,24 kg/m3.

4.   Princip

Efter destillation bestemmes destillatets volumenkoncentration af alkohol ved pyknometri, elektronisk densimetri eller densimetri med hydrostatisk vægt.

BILAG I: FREMSTILLING AF DESTILLAT

1.   Anvendelsesområde

Metoden er egnet til fremstilling af destillater til bestemmelse af den faktiske volumenkoncentration af alkohol i spiritus.

2.   Princip

Spiritussen destilleres, så ethylalkohol og andre flygtige forbindelser adskilles fra ekstraktivstofferne (stoffer, der ikke destilleres).

3.   Reagenser og materialer

4.   Apparatur og udstyr

Sædvanligt laboratorieudstyr, herunder følgende:

Anm.:

Det ovenfor beskrevne apparatur anvendes til prøver på mindst 200 ml. Mindre prøver kan dog også destilleres, hvis der benyttes en mindre destillationskolbe, forudsat at der benyttes en dråbefanger eller anden anordning til at forhindre medrivning.

5.   Opbevaring af prøver

Prøver opbevares ved rumtemperatur inden analysen.

6.   Fremgangsmåde

Indledende bemærkning:

6.1.	Kontrol af destillationsapparatet Med apparatet skal det være muligt at foretage følgende: Ved destillation af 200 ml af en vand/alkohol-blanding med kendt koncentration på ca. 50 % vol. må tabet af alkohol højst være 0,1 % vol.

6.2.

Spiritus med alkoholindhold under 50 % vol. Der afmåles 200 ml spiritus i en målekolbe. Væskens temperatur noteres, eller den henstilles ved standardtemperatur (20 °C). Prøven hældes over i destillationsapparatets rundbundede kolbe, og målekolben skylles med tre gange 20 ml destilleret vand. Skyllevæsken hældes over i destillationskolben. Anm.: Denne fortynding med 60 ml er tilstrækkelig for spiritus med op til 250 g tørstof pr. liter. For at undgå pyrolyse ved højere tørstofindhold øges mængden af skyllevand til mindst 70 ml ved et tørstofindhold på 300 g/l, 85 ml ved et tørstofindhold på 400 g/l og 100 ml ved et tørstofindhold på 500 g/l (visse frugtlikører). Disse mængder tilpasses proportionalt i tilfælde af andre prøvestørrelser. Der tilsættes nogle få korn mod stødkogning (3.1) (og skumdæmper i tilfælde af likør). Der hældes 20 ml destilleret vand i den oprindelige 200 ml målekolbe, som benyttes til opsamling af destillatet. Kolben anbringes i koldt vandbad (4.1) (10-15 °C for spiritus med anissmag). Idet medrivning og svidning undgås og under lejlighedsvis omrøring af kolbens indhold, destilleres der, indtil destillatet er nogle få mm fra målekolbens streg. Når destillatets temperatur ligger inden for ± 0,5 °C af væskens begyndelsestemperatur, fyldes der op til mærket med destilleret vand og blandes omhyggeligt. Destillatet benyttes til bestemmelse af volumenkoncentrationen af alkohol (bilag II).

6.3.

Spiritus med alkoholindhold over 50 % vol. I en 100 ml målekolbe afmåles der 100 ml spiritus, som hældes over i destillationsapparatets rundbundede kolbe. Målekolben skylles flere gange med destilleret vand, og skyllevæsken hældes over i destillationskolben. Der benyttes så meget vand, at kolbens indhold kommer op på ca. 230 ml. Der hældes 20 ml destilleret vand i en 200 ml målekolbe, som benyttes til opsamling af destillatet. Kolben anbringes i koldt vandbad (4.1) (10-15 °C for spiritus med anissmag). Under lejlighedsvis omrøring af kolbens indhold destilleres der, indtil destillatet er nogle få mm fra målekolbens streg (200 ml). Når destillatets temperatur ligger inden for ± 0,5 °C af væskens begyndelsestemperatur, fyldes der op til mærket med destilleret vand og blandes omhyggeligt. Destillatet benyttes til bestemmelse af volumenkoncentrationen af alkohol (bilag II). Anm.: Spiritussens volumenkoncentration af alkohol er dobbelt så høj som destillatets.

BILAG II: MÅLING AF DESTILLATETS DENSITET

METODE A:   BESTEMMELSE AF DEN FAKTISKE VOLUMENKONCENTRATION AF ALKOHOL I SPIRITUS — PYKNOMETRI

A.1.   Princip

Volumenkoncentrationen af alkohol bestemmes ved måling af destillatets densitet ved pyknometri.

A.2.   Reagenser og materialer

Under analysen må der kun benyttes reagenser af anerkendt analysekvalitet og vand af mindst klasse 3 if. ISO 3696:1987, medmindre andet er anført.

A.2.1.

Natriumchloridopløsning (2 % w/v) Der afvejes 20 g natriumchlorid, som opløses i vand og fortyndes til 1 liter.

A.3.   Apparatur og udstyr

Sædvanligt laboratorieudstyr, herunder følgende:

Anm. 1:

Metoden til bestemmelse af densiteten af spiritus in vacuo kræver brug af en vægt med to skåle, et pyknometer og en tareringsflaske med samme ydre volumen til udligning af luftens opdrift til ethvert tidspunkt. Denne simple teknik kan også benyttes med en vægt med én skål, så længe en eventuel ændring i luftens opdrift konstateres ved en ny vejning af tareringsflasken.

A.4.   Fremgangsmåde

Indledende bemærkninger:

A.4.1.   Kalibrering af pyknometret

Pyknometret kalibreres ved bestemmelse af følgende parametre:

A.4.1.1.

Kalibrering med en enskålsvægt: massen af det tørre, rene pyknometer (P) —  massen af det vandfyldte pyknometer ved t °C (P1) —  massen af tareringsflasken (T0) —  bestemmes. A.4.1.1.1. Det tørre, rene pyknometer vejes (P). A.4.1.1.2. Pyknometret fyldes omhyggeligt med destilleret vand ved stuetemperatur, hvorefter termometret sættes på. Pyknometret aftørres omhyggeligt og anbringes i den varmeisolerende kappe. Indholdet blandes ved at vende pyknometret på hovedet flere gange, indtil termometret viser konstant temperatur. Væskeoverfladen bringes i nøjagtigt niveau med siderørets overkant. Temperaturen t °C aflæses omhyggeligt, og om nødvendigt korrigeres der for unøjagtigheder i temperaturskalaen. Det vandfyldte pyknometer vejes (P1). A.4.1.1.3. Tareringsflasken vejes (T0). A.4.1.1.4. Beregning: —  Tara af tomt pyknometer = P – m hvor m er massen af luft i pyknometret m = 0,0012 × (P1 – P) Anm 2: 0,0012 er densiteten af tør luft ved 20 °C og et tryk på 760 mmHg. —  Volumen af pyknometret ved 20 °C: hvor Ft er faktoren F ved temperaturen t °C i bilaget til forordning (EØF) nr. 2676/90, kapitel 1, »Massefylde og relativ densitet«, tabel I (s. 10). V20 °C skal være kendt med en nøjagtighed på 0,001 ml. —  Massen af vandet i pyknometret ved 20 °C: hvor 0,998203 er vands densitet ved 20 °C. Anm. 3: Om ønsket kan værdien 0,99715 for densiteten i luft benyttes, og alkoholindholdet beregnes med henvisning til den tilsvarende densitet i HM Customs and Excise tables i luft; i så fald korrigeres der ikke for massen af den luft, der er fortrængt i pyknometret.

A.4.1.2.

Kalibrering med en toskålsvægt: A.4.1.2.1.  Tareringsflasken anbringes på den venstre vægtskål, og det rene og tørre pyknometer med opsamlingsprop på den højre. Vægten bringes i ligevægt ved anbringelse af lodder ved siden af pyknometret: p gram (p). A.4.1.2.2.  Pyknometret fyldes omhyggeligt med destilleret vand ved stuetemperatur, hvorefter termometret sættes på; pyknometret aftørres omhyggeligt og anbringes i den varmeisolerende kappe; indholdet blandes ved at vende pyknometret på hovedet flere gange, indtil termometret viser konstant temperatur. Væskeoverfladen bringes i nøjagtigt niveau med siderørets overkant. Siderøret aftørres, og opsamlingsproppen sættes på; temperaturen t °C aflæses omhyggeligt, og om nødvendigt korrigeres der for unøjagtigheder i temperaturskalaen. Det vandfyldte pyknometer vejes, idet p' er den masse i gram, der skal til for at opnå ligevægt (p'). A.4.1.2.3.  Beregning: —  Tara af tomt pyknometer = p + m hvor m er massen af luft i pyknometret m = 0,0012 × (p – p') —  Volumen af pyknometret ved 20 ° C: hvor Ft er faktoren F ved temperaturen t °C i bilaget til forordning (EØF) nr. 2676/90, kapitel 1, »Massefylde og relativ densitet«, tabel I (s. 10). V20 °C skal være kendt med en nøjagtighed på 0,001 ml. —  Massen af vandet i pyknometret ved 20 °C: hvor 0,998203 er vands densitet ved 20 °C.

A.4.2.   Bestemmelse af alkoholkoncentrationen i prøven

A.5.   Metodens kvalitetsparametre (præcision)

A.5.1.   Statistiske resultater af interkalibrering

Følgende data kommer fra en international metodekvalitetsundersøgelse, der er foretaget efter internationalt anerkendte procedurer [1] [2].

METODE B:   BESTEMMELSE AF DEN FAKTISKE VOLUMENKONCENTRATION AF ALKOHOL I SPIRITUS — MÅLING VED ELEKTRONISK DENSIMETRI (BASERET PÅ EN PRØVES RESONANSFREKVENS I EN OSCILLATIONSCELLE)

B.1.   Princip

Væskens densitet bestemmes ved elektronisk måling af oscillationerne i et vibrerende U-rør. Ved målingen adderes prøven til et oscillerende system, hvis oscillationsfrekvens ændres af den således tilføjede masse.

B.2.   Reagenser og materialer

Under analysen må der kun benyttes reagenser af anerkendt analysekvalitet og vand af mindst klasse 3 if. ISO 3696:1987, medmindre andet er anført.

B.3.   Apparatur og udstyr

Sædvanligt laboratorieudstyr, herunder følgende:

B.4.   Fremgangsmåde

B.5.   Metodens kvalitetsparametre (præcision)

B.5.1.   Statistiske resultater af interkalibrering

Følgende data kommer fra en international metodekvalitetsundersøgelse, der er foretaget efter internationalt anerkendte procedurer [1] [2].

METODE C:   BESTEMMELSE AF DEN FAKTISKE VOLUMENKONCENTRATION AF ALKOHOL I SPIRITUS — MÅLING AF DENSITET VED HJÆLP AF EN HYDROSTATISK VÆGT

C.1.   Princip

Alkoholindholdet i spiritus kan måles ved densitetsmåling ved hjælp af en hydrostatisk vægt, som bygger på Archimedes's princip om, at et legeme, der nedsænkes i en væske, påvirkes af en lodret opadgående kraft svarende til massen af den fortrængte væskemængde.

C.2.   Reagenser og materialer

Under analysen må der kun benyttes reagenser af anerkendt analysekvalitet og vand af mindst klasse 3 if. ISO 3696:1987, medmindre andet er anført.

C.2.1.   Opløsning til rengøring af flyder (natriumhydroxid, 30 % w/v)

Til fremstilling af 100 ml opløsning afvejes der 30 g natriumhydroxid, som fortyndes med 96 % (v/v) ethanol.

C.3.   Apparatur og udstyr

Sædvanligt laboratorieudstyr, herunder følgende:

Anm. 1:

Der kan også benyttes en vægt med to vægtskåle; princippet er beskrevet i bilaget til forordning (EØF) nr. 2676/90, kapitel 1, »Massefylde og relativ densitet« (s. 7).

C.4.   Fremgangsmåde

Flyder og måleglas rengøres mellem hver måling med destilleret vand, aftørres med fnugfrit papir og skylles med den opløsning, hvis densitet skal bestemmes. Målingerne foretages, så snart apparatet er stabilt, således at fordampningstab af alkohol begrænses mest muligt.

C.5.   Metodens kvalitetsparametre (præcision)

C.5.1.   Statistiske resultater af interkalibrering

Følgende data kommer fra en international metodekvalitetsundersøgelse, der er foretaget efter internationalt anerkendte procedurer [1] [2].

Figur 1: Destillationsapparat til bestemmelse af faktisk volumenkoncentration af alkohol af spiritus
1.1 liter rundbundet kolbe med standardslib
2.20 cm lang destillationskolonne (f.eks. Vigreux-kolonne)
3.10 cm lang glat svaler (f.eks. West-svaler)
4.kølespiral, 40 cm lang.

II.   METODE TIL BESTEMMELSE AF TOTALT TØRSTOFINDHOLD — GRAVIMETRISK METODE

1.   Anvendelsesområde

Ifølge forordning (EØF) nr. 1576/89 anvendes denne metode kun til akvavit med et tørstofindhold på højst 15 g/l.

2.   Normative referencer

ISO 3696:1987: Vand til analytisk laboratoriebrug. Specifikation og prøvningsmetoder.

3.   Definition

Det totale tørstofindhold er mængden af de stoffer, som ved givne fysiske betingelser ikke forflygtiges.

4.   Princip

Vejning af spiritussens inddampningsrest efter inddampning på kogende vandbad og tørring i tørreovn.

5.   Apparatur og udstyr

6.   Prøveudtagning og prøver

Prøver opbevares ved rumtemperatur inden analysen.

7.   Fremgangsmåde

8.   Beregning

Remanensens masse multipliceret med 40 er spiritussens tørstofindhold i g/l. Det opgives med en decimal.

9.   Metodens kvalitetsparametre (præcision)

9.1.   Statistiske resultater af interkalibrering

Følgende data kommer fra en international metodekvalitetsundersøgelse, der er foretaget efter internationalt anerkendte procedurer [1] [2].

III.   BESTEMMELSE AF FLYGTIGE STOFFER I SPIRITUS

III.1.   GENERELLE BEMÆRKNINGER

1.   Definitioner

I forordning (EØF) nr. 1576/89 er der fastsat minimumsgrænser for indholdet af andre flygtige stoffer end ethanol og methanol i en række spiritusser (rom, vinbrændevin, frugtbrændevin mv.). For sådanne drikkevarer anses dette indhold pr. konvention at svare til summen af koncentrationerne af følgende:

Til bestemmelse af flygtige forbindelser benyttes følgende metoder pr. konvention:

2.   Gaskromatografisk analyse af flygtige forbindelser

Gaskromatografisk analyse af andre flygtige forbindelser end de ovenfor nævnte kan vise sig særlig interessant til at bestemme både oprindelsen af de råvarer, der er benyttet til destillationen, og de herskende destillationsbetingelser.

Nogle spirituosa indeholder andre flygtige komponenter, f.eks. aromatiske forbindelser, som er karakteristiske for de råvarer, der er benyttet til fremstilling af alkoholen, for spiritussens aroma og for den særlige måde, spiritussen er fremstillet på. Sådanne forbindelser er af stor betydning for evaluering af, om kravene i forordning (EØF) nr. 1576/89 er opfyldt.

III.2.   GASKROMATOGRAFISK BESTEMMELSE AF FLYGTIGE BESLÆGTEDE STOFFER I SPIRITUS

1.   Anvendelsesområde

Metoden er egnet til bestemmelse af 1,1-diethoxyethan (acetal), 2-methylbutan-1-ol (optisk aktiv amylalkohol), 3-methylbutan-1-ol (isoamylalkohol), methanol (methylalkohol), ethylethanoat (ethylacetat), butan-1-ol (n-butanol), butan-2-ol (sec-butanol), 2-methylpropan-1-ol (isobutylalkohol), propan-1-ol (n-propanol) og ethanal (acetaldehyd) i spiritus ved gaskromatografi. Metoden benytter intern standard, f.eks. pentan-3-ol. Analysandkoncentrationerne udtrykkes i gram pr. 100 liter absolut alkohol; produktets alkoholkoncentration må bestemmes inden analysen. Blandt de spirituosa, der kan analyseres ved denne metode, er whisky, brandy, rom, vinbrændevin, frugtbrændevin og brændevin af presserester af druer.

2.   Normative referencer

ISO 3696:1987: Vand til analytisk laboratoriebrug. Specifikation og prøvningsmetoder.

3.   Definition

Beslægtede stoffer er flygtige stoffer, der dannes sammen med ethanol under fermentering, destillation og ældning af spiritus.

4.   Princip

Beslægtede stoffer i spiritus bestemmes ved direkte indsprøjtning af spiritussen eller en passende fortyndet spiritus i et gaskromatografsystem. Inden indsprøjtningen tilsættes der en passende intern standard til spiritussen. De forskellige beslægtede stoffer adskilles ved temperaturprogrammering med en passende kolonne, og de påvises med flammeioniseringsdetektor (FID). Koncentrationen af det enkelte beslægtede stof bestemmes ud fra den interne standard på grundlag af responsfaktorer, som bestemmes under kalibrering ved samme kromatograferingsbetingelser som ved analyse af spiritussen.

5.   Reagenser og materialer

Medmindre andet er anført, må der kun benyttes reagenser med en renhed på mindst 97 %, som er indkøbt hos en ISO-akkrediteret leverandør med renhedscertifikat, og som ikke indeholder andre beslægtede stoffer ved testfortyndingen (dette kan bekræftes ved indsprøjtning af standarder for de enkelte beslægtede stoffer ved testfortyndingen under kromatograferingsbetingelser som i punkt 6.4), og kun vand af mindst klasse 3 if. ISO 3696:1987. Acetal og acetaldehyd skal opbevares mørkt ved < 5 °C, mens alle andre reagenser kan opbevares ved rumtemperatur.

▼M3

▼B

6.   Apparatur og udstyr

7.   Prøveudtagning og prøver

8.   Fremgangsmåde (ved den validerede metode)

9.   Beregning

Der kan benyttes et automatisk databehandlingssystem, forudsat at dataene kan kontrolleres efter de nedenfor beskrevne principper.

Topareal eller -højde måles for de beslægtede stoffer og den interne standard.

10.   Kvalitetssikring og kontrol (ved den validerede metode)

Ved hjælp af ligning 2 beregnes koncentrationen af hvert beslægtet stof i kvalitetskontrolstandardopløsningerne efter fremgangsmåden i 8.1.1-8.1.4. Ved hjælp af ligning 3 beregnes den procentvise genfinding. Er analyseresultaterne inden for ± 10 % af de teoretiske værdier for hvert beslægtet stof, kan analysen fortsættes. I modsat fald undersøges det, hvad årsagen kan være til den manglende nøjagtighed, så der kan træffes de fornødne forholdsregler.

11.   Metodens kvalitetsparametre (præcision)

Statistiske resultater af interkalibrering: Nedenstående tabel indeholder værdier for følgende stoffer: ethanal, ethylacetat, acetal, totalethanal, methanol, butan-2-ol, propan-1-ol, butan-1-ol, 2-methylpropan-1-ol, 2-methylbutan-1-ol, 3-methylbutan-1-ol.

Følgende data kommer fra en international metodekvalitetsundersøgelse, der er foretaget efter internationalt anerkendte procedurer.

▼M2

III.3.   BESTEMMELSE AF FLYGTIGE SYRER I SPIRITUS

1.    Anvendelsesområde

Metoden er blevet valideret i interkalibrering for rom, brandy, druemarc og frugtbrændevin i intervaller fra 30 mg/l til 641 mg/l.

2.    Normative referencer

ISO 3696: 1987 Vand til analytisk laboratoriebrug. Specifikation og prøvningsmetoder.

3.    Definitioner

3.1.	Indholdet af flygtige syrer beregnes ved at fratrække indholdet af ikke-flygtige syrer fra det totale syreindhold.

3.2.	Totalt syreindhold er det totale titreringssyreindhold.

3.3.	Indholdet af ikke-flygtige syrer er syreindholdet i inddampningsresten efter tørring af spiritussen.

4.    Princip

Det totale syreindhold og indholdet af ikke-flygtige syrer bestemmes ved titrering eller potentiometri.

5.    Reagenser og materialer

Under analysen må der kun benyttes reagenser af anerkendt analysekvalitet og vand af mindst klasse 3 if. ISO 3696:1987, medmindre andet er anført.

5.1.	0,01 M natriumhydroxidopløsning (NaOH)

5.2.	Indikatorblanding: 0,1 g indigocarmin og 0,1 g phenolrød afvejes. Opløses i 40 ml vand, og der fyldes op med ethanol til 100 ml.

6.    Apparatur og udstyr

Indirekte laboratorieudstyr, A-glasudstyr og følgende:

7.    Prøveudtagning og prøver

Prøver opbevares ved rumtemperatur inden analysen.

8.    Fremgangsmåde

8.1.   Totalt syreindhold

8.1.1.   Fremstilling af prøve

Spiritussen bestråles med ultralyd (sonikering) eller omrøres i to minutter under vakuum for at fjerne kuldioxid, hvis det er nødvendigt.

8.1.2.   Titrering

Der afpipetteres 25 ml spiritus i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe.

Der tilsættes ca. 200 ml afkølet kogt destilleret vand (fra samme dag) og 2-6 dråber af indikatorblandingen (5.2).

Der titreres med 0,01 M natriumhydroxidopløsning (5.1), indtil den gulgrønne farve ændres til violet i forbindelse med farveløs spiritus, og den gulbrune farve ændres til rødbrun i forbindelse med brunfarvet spiritus.

Titreringen kan også foretages ved potentiometri til pH 7,5.

Antallet af ml tilsat 0,01 M natriumhydroxidopløsning betegnes n1.

8.1.3.   Beregning

Det totale syreindhold (TA) i milliækvivalenter pr. l spiritus er lig med 0,4 × n1.

Det totale syreindhold (TA′) i mg eddikesyre pr. l spiritus er lig med 24 × n1.

8.2.   Ikke-flygtige syrer

8.2.1.   Fremstilling af prøve

Der inddampes 25 ml spiritus til tørhed:

8.2.2.   Titrering

Inddampningsresten efter inddampningen med afkølet kogt destilleret vand (fra samme dag) opløses, og der fyldes op til ca. 100 ml og tilsættes 2-6 dråber af indikatorblandingen (5.2).

Der titreres med 0,01 M natriumhydroxidopløsning (5.1).

Titreringen kan også foretages ved potentiometri til pH 7,5.

Antallet af ml tilsat 0,01 M natriumhydroxidopløsning betegnes n2.

8.2.3.   Beregning

Indholdet af ikke-flygtige syrer (FA) i milliækvivalenter pr. l spiritus er lig med 0,4 × n2.

Indholdet af ikke-flygtige syrer (FA) i mg eddikesyre pr. l spiritus er lig med 24 × n2.

9.    Beregning af indholdet af flygtige syrer

9.1.	Udtrykt i milliækvivalenter pr. l: Idet: TA = totalt syreindhold i milliækvivalenter pr. l FA = indholdet af ikke-flygtige syrer i milliækvivalenter pr. l Indholdet af flygtige syrer (VA) i milliækvivalenter pr. l er lig med: TA – FA

9.2.	Udtrykt i mg eddikesyre pr. l: Idet: TA′ = totalt syreindhold i mg eddikesyre pr. l FA′ = indholdet af ikke-flygtige syrer i mg eddikesyre pr. l Indholdet af flygtige syrer (VA) i mg eddikesyre pr. l er lig med: TA′ – FA′

9.3.	Udtrykt i g eddikesyre pr. hl ren alkohol (100 % vol.) er lig med: hvor A er volumenkoncentration af alkohol i spiritus.

10.    Metodens kvalitetsparametre (præcision)

10.1.   Statistiske resultater af interkalibrering

Følgende data kommer fra en international metodekvalitetsundersøgelse, der er foretaget efter internationalt anerkendte procedurer [1], [2].

Prøvetyper:

A	blommebrændevin; to niveauer (*)

B	rom I; blind dobbeltbestemmelse

C	rom II; to niveauer*

D	slivovitz; blind dobbeltbestemmelse

E	brandy; blind dobbeltbestemmelse

F	brændevin af druepresserester; blind dobbeltbestemmelse

▼M1

V.   ANETHOL. GASKROMATOGRAFISK BESTEMMELSE AF TRANS-ANETHOL I SPIRITUS

1.   Anvendelsesområde

Metoden er egnet til bestemmelse af trans-anethol i spiritus med anissmag ved kapillargaskromatografi.

2.   Normative referencer

ISO 3696:1987 Water for analytical laboratory use — Specifications and test methods.

3.   Princip

Spiritussens koncentration af trans-anethol bestemmes ved gaskromatografi (GC). Der tilsættes ens mængde intern standard, f.eks. 4-allylanisol (estragol), når estragol ikke er naturligt til stede i prøven, til prøven og til en trans-anethol-referenceopløsning med kendt koncentration, hvorefter begge opløsninger fortyndes med en 45 % ethanolopløsning og injiceres direkte i gaskromatografisystemet. Ekstrahering er nødvendig, før prøver af likører, der indeholder store mængder sukker, fremstilles og analyseres.

4.   Reagenser og materialer

Under analysen må der kun anvendes reagenser med en renhed på mindst 98 %. Vand af mindst klasse 3 if. ISO 3696 anvendes.

Referencekemikalier skal opbevares koldt (ca. 4 °C), beskyttet mod lys i aluminiumbeholdere eller i reagensflasker af farvet (ravgult) glas. Propperne skal helst være forsynet med aluminiumpakning. Trans-anethol skal før brug »optøs« fra sin krystallinske tilstand, men herunder må dets temperatur ikke komme over 35 °C.

4.1.	Ethanol 96 % v/v (CAS 64-17-5).

4.2.	1-methoxy-4-(1-propenyl)benzen (trans-anethol) (CAS 4180-23-8).

4.3.	4-allylanisol (estragol) (CAS 140-67-0), foreslået intern standard (IS).

4.4.	Ethanol 45 % v/v. Til 560 g destilleret vand tilsættes 378 g ethanol 96 % v/v.

4.5.

Fremstilling af standardopløsninger Alle standardopløsninger skal opbevares ved rumtemperatur (15-35 °C), beskyttet mod lys i aluminiumbeholdere eller i reagensflasker af farvet (ravgult) glas. Propperne skal helst have aluminiumtætning. Trans-anethol og 4-allylanisol er praktisk talt uopløselige i vand og må derfor opløses i noget 96 % ethanol (4.1), før der tilsættes 45 % ethanol (4.4). Nye stamopløsninger skal fremstilles hver uge. 4.5.1.   Standardopløsning A Stamopløsning af trans-anethol (koncentration: 2 g/l). 40 mg trans-anethol (4.2) afvejes i en 20 ml målekolbe (eller 400 mg i 200 ml osv.). Der tilsættes noget 96 % ethanol (4.1) og fyldes op til stregen med 45 % v/v ethanol (4.4), hvorefter der blandes grundigt. 4.5.2.   Intern standardopløsning B Stamopløsning af intern standard, f.eks. estragol (koncentration: 2 g/l). 40 mg estragol (4.3) afvejes i en 20 ml målekolbe (eller 400 mg i 200 ml osv.). Der tilsættes noget 96 % ethanol (4.1) og fyldes op til stregen med 45 % v/v ethanol (4.4), hvorefter der blandes grundigt. 4.5.3.   Opløsninger til kontrol af lineariteten af flammeiondetektorens respons Lineariteten af flammeiondetektorens respons skal kontrolleres med henblik på analyse under hensyntagen til en række koncentrationer af trans-anethol i spiritus fra 0 til 2,5 g/l. Under analysen fortyndes de ukendte spiritusprøver, der skal analyseres, ti gange (8.3). Med henblik på de i metoden beskrevne analysebetingelser fremstilles der stamopløsninger svarende til koncentrationer på 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2 og 0,25 g/l trans-anethol i den prøve, der skal analyseres, som følger: 0,5, 1, 1,5, 2 og 2,5 ml stamopløsning A (4.5.1) afpipetteres i hver sin 20 ml målekolbe. I hver målekolbe afpipetteres 2 ml intern standardopløsning B (4.5.2), hvorefter der fyldes op til stregen med 45 % v/v ethanol (4.4) og blandes grundigt. Blankopløsninger (8.4) anvendes som 0 g/l-opløsning. 4.5.4.   Standardopløsning C I en 20 ml målekolbe afpipetteres 2 ml stamopløsning A (4.5.1); der tilsættes 2 ml intern standardopløsning B (4.5.2) og fyldes op til stregen med 45 % v/v ethanol (4.4), hvorefter der blandes grundigt.

5.   Apparatur og udstyr

6.   Betingelser for kromatografi

Kolonnens type og dimensioner samt betingelserne for gaskromatografi skal vælges således, at anethol og intern standard er adskilt fra hinanden og fra alle forstyrrende stoffer. Typiske betingelser for den i punkt 5.3 som eksempel angivne kolonne er:

7.   Prøver

Prøver skal opbevares ved rumtemperatur, beskyttet mod lys- og kuldepåvirkning.

8.   Fremgangsmåde

8.1.   Screening af prøverne for estragol

For at sikre, at prøven ikke i forvejen indeholder estragol, analyseres en blankprøve uden tilsætning af intern standard. Hvis estragol forekommer naturligt, må der vælges en anden intern standard (f.eks. menthol).

2 ml stamopløsning A afpipetteres i en 20 ml målekolbe, der fyldes op til stregen med 45 % v/v ethanol (4.4) og blandes grundigt.

8.2.   Tilberedning af ukendte prøver

I en 20 ml målekolbe afpipetteres 2 ml prøve; der tilsættes 2 ml intern standardopløsning B (4.5.2) og fyldes op til stregen med 45 % v/v ethanol (4.4), hvorefter der blandes grundigt.

8.3.   Blankprøve

I en 20 ml målekolbe afpipetteres 2 ml intern standardopløsning B (4.5.2), og der fyldes op til stregen med 45 % v/v ethanol (4.4), hvorefter der blandes grundigt.

8.4.   Linearitetsprøve

Før analysen påbegyndes, kontrolleres lineariteten af flammeiondetektorens respons ved tre på hinanden følgende bestemmelser af hver linearitetsstandardopløsning (4.5.3).

Af integratorens topareal eller tophøjde afsættes for hver injektion koncentrationen af den tilsvarende stamopløsning i g/l mod forholdet R.

R = trans-anethol tophøjde eller -areal, divideret med estragol tophøjde eller -areal.

Derved skal fremkomme en retlinjet kurve.

8.5.   Bestemmelse

Injicer blankopløsningen (8.3) efterfulgt af standardopløsning C (4.5.4), efterfulgt af en af linearitetsstandarderne (4.5.3), der fungerer som kvalitetskontrolprøve (denne kan vælges på grundlag af den formodede koncentration af trans-anethol i den ukendte prøve), efterfulgt af fem ukendte (8.2). Efter hver fem ukendte prøver indskydes en linearitetsprøve (kvalitetskontrolprøve) for at sikre den analytiske stabilitet.

9.   Beregning af responsfaktor

Der måles enten topareal (med integrator eller andet datasystem) eller tophøjde (ved manuel integration) for trans-anethol og intern standard.

9.1.   Beregning af responsfaktor (RFi)

Responsfaktoren beregnes således:

hvor:

Ci	er koncentrationen af trans-anethol i standardopløsning A (4.5.1)

Cis	er koncentrationen af intern standard i standardopløsning B (4.5.2)

areali

er areal (eller højde) af trans-anethol-toppen

arealis

er areal (eller højde) af intern standard-toppen.

RFi beregnes af de fem prøver af opløsning C (4.5.4).

9.2.   Analyse af opløsningerne til linearitetskontrol

Injicer opløsningerne til linearitetskontrol (4.5.3).

9.3.   Analyse af prøver

Injicer opløsningen af den ukendte prøve (8.2).

10.   Beregning af resultaterne

Koncentrationen af trans-anethol beregnes ved følgende formel:

hvor:

ci	er den ukendte koncentration af trans-anethol

Cis	er koncentrationen af intern standard i den ukendte prøve (4.5.2)

topareal eller -højdei

er trans-anethol toppens areal (eller højde)

topareal eller -højdeis

er areal (eller højde) af toppen for intern standard

RFi	er responskoefficienten (beregnet som angivet i punkt 9.1).

Koncentrationen af trans-anethol angives i gram pr. liter med én decimal.

11.   Kvalitetssikring og -kontrol

Kromatogrammerne skal være sådan, at anethol og intern standard er adskilt fra hinanden og fra ethvert forstyrrende stof. RFi-værdien beregnes af resultaterne af de fem injektioner af opløsning C (4.5.4). Hvis variationskoefficienten (CV % = (standardafvigelse/gennemsnit) * 100)) er inden for plus eller minus 1 %, er RFi-gennemsnitsværdien acceptabel.

Ovenstående beregning skal anvendes til beregning af koncentrationen af trans-anethol i den prøve, der er udvalgt til kvalitetskontrol fra linearitetskontrolopløsningerne (4.5.3).

Hvis de beregnede gennemsnitsresultater af analysen af den linearitetsopløsning, der er valgt som intern kvalitetskontrolprøve (IQC), er inden for plus eller minus 2,5 % fra den teoretiske værdi, kan resultaterne for de ukendte prøver godtages.

12.   Behandling af prøve af spiritus med stort indhold af sukker og likør før GC-analyse

Ekstraktion af alkohol i spiritus med stort sukkerindhold med henblik på bestemmelse af koncentrationen af trans-anethol med kapillargaskromatografi.

12.1.   PRINCIP

Af prøven af likør udtages en alikvot del, hvortil der tilsættes intern standard i en koncentration svarende til analysandens (trans-anethol) i likøren. Dette tilsættes natriumphosphat (dodecahydrat) og vandfrit ammoniumsulphat. Den resulterende blanding rystes godt og afkøles, hvorved den deler sig i to lag. Den øverste, alkoholiske fase dekanteres. En alikvot del af denne alkoholfase udtages og fortyndes med 45 % ethanolopløsning (4.4). (Bemærkning: Der tilsættes ikke intern standard på dette trin, da den er tilsat i forvejen). Den resulterende opløsning analyseres ved gaskromatografi.

12.2.   REAGENSER OG MATERIALER

Til ekstraktionen må kun anvendes reagenser med renhed på over 99 %.

12.3.   APPARATUR OG UDSTYR

Koniske kolber, skilletragte, køleskab.

12.4.   FREMGANGSMÅDE

12.4.1.   Screening af prøverne for estragol

For at sikre, at der ikke i forvejen findes estragol i prøven, undersøges en blank ekstraktion (12.6.2), og analysen finder sted uden tilsætning af intern standard. Hvis estragol forekommer naturligt, må der vælges en anden intern standard.

12.4.2.   Ekstraktion

I en konisk kolbe afpipetteres 5 ml 96 % ethanol (4.1), og i samme kolbe afvejes 50 mg intern standard (4.3), og der tilsættes 50 ml af prøven. Der tilsættes 12 g ammonium sulfat, vandfrit (12.2.1), samt 8,6 g dibasisk natriumphosphat, dodecahydrat (12.2.2). Den koniske kolbe tilproppes.

Kolben omrystes i mindst 30 minutter. Der skal anvendes mekanisk rystebord, ikke en teflonbelagt omrører, da teflon vil absorbere noget af analysanden. Bemærk, at de tilsatte salte ikke vil blive fuldstændig opløst.

Den tilproppede kolbe stilles i køleskab (T < 5 oC) i mindst to timer.

Når denne tid er gået, skal der have dannet sig to tydeligt adskilte væskelag og et bundfald. Det alkoholiske lag skal være klart. Hvis ikke, sættes kolben tilbage i køleskabet, indtil der er opnået et klart adskilt lag.

Når det alkoholiske lag er klart, udtager man uden at forstyrre den vandige fase forsigtigt en alikvot mængde (f.eks. 10 ml), som overføres til et ravgult hætteglas, der lukkes forsvarligt.

12.4.3.   Fremstilling af den ekstraherede prøve til analyse

Lad ekstrakten (12.4.2) nå rumtemperatur.

I en 20 ml målekolbe afpipetteres 2 ml af alkoholfasen af den afkølede ekstraherede prøve, og der fyldes op til stregen med 45 % v/v ethanol (4.4), hvorefter der blandes grundigt.

12.5.   Bestemmelse

Følg proceduren i punkt 8.5.

12.6.   Beregning af resultaterne

Til beregning af resultaterne anvendes følgende formel:

hvor:

mis	er massen af den udtagne (12.4.2) interne standard (4.3) (mg)

V	er rumfanget af ukendt prøve (50 ml)

RFi	er responsfaktoren (9.1)

areali

er arealet af trans-anethol-toppen

arealis

er toparealet af den interne standard.

Resultaterne angives i gram pr. liter med én decimal.

12.7.   KVALITETSKONTROL OG KVALITETSSIKRING

Følg proceduren i punkt 11.

13.   Metodens funktionsdata (præcision)

Statistiske resultater af interkalibrering:

VI.   GLYCYRRHIZINSYRE. BESTEMMELSE AF GLYCYRRHIZINSYRE MED HØJPERFORMANS-VÆSKEKROMATOGRAFI

1.   Anvendelsesområde

Metoden er egnet til bestemmelse af glycyrrhizinsyre i spiritus med anissmag, ved hjælp af højperformans-æskekromatografi (HPLC). I forordning (EØF) nr. 1576/89 er det fastsat, at enhver spiritus, som har anissmag og benævnes »pastis«, skal indeholde mellem 0,05 og 0,5 g glycyrrhizinsyre pr. liter.

2.   Normative referencer

ISO 3696:1987 Water for analytical laboratory use — Specifications and test methods.

3.   Princip

Koncentrationen af glycyrrhizinsyre bestemmes ved højperformans væskekromatografi (HPLC) med UV-detektion. En standardopløsning og prøven filtreres og injiceres hver for sig direkte i HPLC-systemet.

4.   Reagenser og materialer

Til analysen må kun benyttes reagenser af HPLC-kvalitet, absolut ethanol og vand af klasse 3 som defineret i ISO 3696.

4.1.	Ethanol 96 % v/v (CAS 64-17-5).

4.2.	Ammoniumglycyrrhizinat, C42H62O16.NH3 (ammoniumsalt af glycyrrhizinsyre) (molekylvægt 839,98)(CAS 53956-04-0): renhed mindst 90 % (molekylvægt af glycyrrhizinsyre 822,94).

4.3.	Iseddikesyre, CH3COOH (CAS 64-19-7).

4.4.	Methanol, CH3OH (CAS 67-56-1).

4.5.	Ethanol 50 % v/v. Til 1 000  ml ved 20 °C: —  96 % v/v ethanol (4.1): 521 ml —  vand (2.0): 511 ml.

4.6.

Fremstilling af HPLC-elueringsvæsker 4.6.1.   Elueringsvæske A (eksempel) 80 dele (v/v) vand (2.0) 20 dele (v/v) eddikesyre (4.3). Elueringsvæsken afgasses i fem minutter. Bemærkning: Er det anvendte vand ikke mikrofiltreret, tilrådes det at filtrere den fremstillede elueringsvæske gennem et filter til organiske opløsningsmidler med porestørrelse på ikke over 0,45 μm. 4.6.2.   Elueringsvæske B Methanol (4.4).

4.7.

Fremstilling af standardopløsninger Alle standardopløsninger skal friskfremstilles efter to måneder. 4.7.1.   Referenceopløsning C 25 mg ammoniumglycyrrhizinat (4.2) afvejes til nærmeste 0,1 mg i en 100 ml målekolbe. Der tilsættes noget 50 % v/v ethanol (4.5), og ammoniumglycyrrhizinatet bringes i opløsning. Når det er bragt i opløsning, fyldes op til stregen med 50 % v/v ethanol (4.5). Opløsningen filtreres gennem et filter til organiske opløsningsmidler. 4.7.2.   Standardopløsninger (til kontrol af lineariteten af instrumenternes respons) Der tilberedes en 1,0 g/l stamopløsning ved afvejning af 100 mg ammoniumglycyrrhizinat til nærmeste 0,1 mg i en 100 ml målekolbe. Der tilsættes noget 50 % v/v ethanol (4.5), og ammoniumglycyrrhizinatet bringes i opløsning. Når det er bragt i opløsning, fyldes op til stregen med 50 % v/v ethanol (4.5). Der tilberedes mindst fire andre opløsninger med 0,05, 0,1, 0,25 og 0,5 g ammoniumglycyrrhizinat pr. liter ved at afpipettere henholdsvis 5, 10, 25 og 50 ml af 1,0 g/l-og stamopløsningen i hver sin 100 ml målekolbe. Der fyldes så op til stregen med 50 % v/v ethanol (4.5), og indholdet blandes grundigt. Alle opløsninger filtreres gennem et filter til organiske opløsningsmidler.

5.   Apparatur og udstyr

5.1.   Adskillelsessystem

5.2.	Dataintegrator eller -registrator med en ydeevne, som er forenelig med det øvrige system.

5.3.	Kolonne (eksempel) Materiale: rustfrit stål eller glas. Indre diameter: 4-5 mm. Længde: 100-250 mm. Stationær fase: tværbundet silica med en (fortrinsvis sfærisk) octadecyl (C18) funktionel gruppe, partikelstørrelse maks. 5 μm.

5.4.	Laboratorieudstyr 5.4.1. Analysevægt med en nøjagtighed på 0,1 mg. 5.4.2. Glasmåleudstyr af klasse A. 5.4.3. Mikromembran-filtreringsopstilling til små mængder.

6.   Betingelser for kromatografi

7.   Fremgangsmåde

7.1.   Fremstilling af spiritusprøven

Om nødvendigt filtreres gennem et filter til organiske opløsningsmidler (porediameter: 0,45 μm).

7.2.   Bestemmelse

Når de kromatografiske betingelser har stabiliseret sig:

8.   Metodens funktionsdata (præcision)

Statistiske resultater af interkalibrering:

VII.   CHALCONER. METODE TIL PÅVISNING AF CHALCONER I PASTIS VED HØJPERFORMANS VÆSKEKROMATOGRAFI

1.   Anvendelsesområde

Metoden er velegnet til bestemmelse af, hvorvidt der er chalconer til stede i drikkevarer med anissmag eller ikke. Chalconer hører til flavonoiderne og er naturlige farvestoffer, som findes i lakridstræ (Glycyrrhiza glabra).

For at spiritus med anissmag kan kaldes »pastis«, skal den indeholde chalconer (forordning (EØF) nr. 1576/89).

2.   Normative referencer

ISO 3696 1987 Water for analytical laboratory use — Specifications and test methods.

3.   Princip

Der fremstilles en referenceopløsning af lakridsekstrakt. Tilstedeværelse eller fravær af chalconer bestemmes ved højperformans væskekromatografi (HPLC) med UV-detektion.

4.   Reagenser og materialer

Til analysen må kun benyttes reagenser af HPLC-kvalitet. Den anvendte ethanol skal være 96 % v/v. Der må kun anvendes vand af kvalitet 3 som fastlagt i ISO 3696.

4.1.	Ethanol 96 % v/v (CAS 64-17-5).

4.2.	Acetonitril, CH3CN (CAS 75-05-8).

4.3.	Referencestof: Glycyrrhiza glabra (lakridstræ). Groftrevet lakridstræ (Glycyrrhiza glabra). Gennemsnitsstrørrelse af stavformede partikler: længde: 10-15 mm, tykkelse: 1-3 mm.

4.4.	Natriumacetat, CH3COONa (CAS 127-09-3).

4.5.	Iseddikesyre, CH3COOH (CAS 64-19-7).

4.6.

Fremstilling af opløsninger 4.6.1.   Ethanol 50 % v/v. Til 1 000  ml ved 20 °C: —  96 % v/v ethanol (4.1): 521 ml —  vand (2.0): 511 ml. 4.6.2.   Opløsningsmiddel A: acetonitril. Acetonitril (4.2) af en kvalitet svarende til HPLC-analyse. Der afgasses. 4.6.3.   Opløsningsmiddel B: 0,1 M natriumacetatbuffer, pH 4,66. 8,203 g natriumacetat (4.4) afvejes og tilsættes 6,005 g iseddikesyre (4.5), hvorefter der i en 1 000  ml målekolbe fyldes op til stregen med vand (2).

5.   Fremstilling af referenceekstrakt af Glycyrrhiza glabra (4.3)

5.1.	10 g revet lakridstræ (Glycyrrhiza glabra) (4.3) afvejes og anbringes i en rundbundet destillationskolbe. —  Der tilsættes 100 ml 50 % v/v ethanol (4.6.1). —  Der koges med tilbagesvaling i en time. —  Opløsningen filtreres. —  Filtratet stilles til side til senere brug.

5.2.	Lakridstræsekstrakten uddrages fra filteret. —  Den anbringes i en rundbundet destillationskolbe. —  Der tilsættes 100 ml 50 % v/v ethanol (4.6.1). —  Der koges med tilbagesvaling i en time. —  Opløsningen filtreres. Filtratet stilles til side til senere brug.

5.3.	Ekstraheringen af lakridstræet skal udføres tre på hinanden følgende gange.

5.4.	De tre filtrater sammenhældes.

5.5.	Opløsningsmiddelfasen (fra 5.4) inddampes i en rotationsinddamper.

5.6.	Resten af ekstrakten (fra 5.5) opsamles med 100 ml 50 % v/v ethanol (4.6.1).

6.   Apparatur og udstyr

6.1.   Adskillelsessystem

6.2.	En dataintegrator eller -registrator med en ydeevne, som er forenelig med resten af adskillelsessystemet.

6.3.	Kolonne Materiale: rustfrit stål eller glas. Indre diameter: 4-5 mm. Stationær fase: tværbundet silica med en octadecyl (C18) funktionel gruppe, partikelstørrelse maks. 5 μm (tværbundet fase).

6.4.

Sædvanligt laboratorieudstyr, herunder: 6.4.1.  Analysevægt (nøjagtighed: ± 0,1 mg). 6.4.2.  Destillationsapparat med tilbagesvaler, bestående af f.eks.: —  250 ml rundkolbe med standardslib —  en 30 cm lang tilbagesvaler, og —  en varmekilde (eventuelle pyrogene reaktioner, som inddrager det ekstraherede stof, skal undgås ved passende foranstaltninger). 6.4.3.  Rotationsfordamper. 6.4.4.  Filtreringsopstilling (dvs. Büchner-tragt).

6.5.

Betingelser for kromatografi (eksempel) 6.5.1. Elueringskarakteristika for opløsningsmiddel A (4.6.2) og B (4.6.3): —  gradientændring fra 20/80 (v/v) til 50/50 (v/v) på 15 minutter —  gradientændring fra 50/50 (v/v) til 75/25 (v/v) på 5 minutter —  ensartet styrke på 75/25 (v/v) i 5 minutter —  stabilisering af kolonnen mellem injektionerne —  ensartet styrke 20/80 (v/v) i 5 minutter. 6.5.2. Gennemstrømningshastighed: 1 ml/minut. 6.5.3. Indstilling af UV-detektor Detektoren indstilles på 370 nm for at påvise chalconer og derefter på 254 nm for at påvise glycyrrhizinsyre. Bemærkning: Ændringen i bølgelængde (fra 370 til 254 nm) skal finde sted 30 sekunder før starten af elueringstoppen for glycyrrhizinsyre.

7.   Fremgangsmåde

7.1.   Fremstilling af spiritusprøven

Der filtreres gennem et filter til organiske opløsningsmidler (porediameter: 0,45 μm).

7.2.   Fremstilling af restekstrakt (5.6) af lakridstræ

Før analyse fremstilles en fortynding i forholdet 1:10 med 50 % v/v ethanol (4.6.1).

7.3.   Bestemmelse

8.   Karakteristisk kromatogram for en pastis

Figur 1

Kromatogram, som er optegnet ved ovenstående metode og viser tilstedeværelse af chalconer i en »pastis«. Top 1-8 er chalconer, top 9 er glycyrrhizinsyre

9.   Metodens funktionsdata (præcision)

Resultater af interkalibrering:

▼M2

VIII.   TOTALT SUKKERINDHOLD

1.    Anvendelsesområde

HPLC-RI finder anvendelse på bestemmelsen af totalt sukkerindhold (udtrykt i invertsukker) i spiritus, bortset fra likører med æg- og mælkeprodukter.

Metoden er blevet valideret i interkalibrering for pastis, destilleret anis, kirsebærlikør, crème de (efterfulgt af navnet på frugten eller den anvendte råvare) og crème de cassis, i intervaller fra 10,86 til 509,7 g/l. Lineariteten af instrumenternes respons blev imidlertid påvist for koncentrationsintervallet fra 2,5 til 20 g/l.

Denne metode er ikke egnet til bestemmelse af lavt sukkerindhold.

2.    Normative referencer

ISO 3696: 1987 Vand til analytisk laboratoriebrug. Specifikation og prøvningsmetoder.

3.    Princip

Højtryksvæskekromatografisk analyse af sukkeropløsninger til bestemmelse af deres koncentrationer af glucose, fructose, saccharose, maltose og lactose.

Denne metode omfatter en stationær fase af alkylaminer og detektering ved differentialrefraktometri og er givet som eksempel. Det er ligeledes muligt at anvende ionbytterharpikser som stationær fase.

4.    Reagenser og materialer

4.1.	Glucose (CAS 50-99-7) med en renhedsgrad på mindst 99 %.

4.2.	Fructose (CAS 57-48-7) med en renhedsgrad på mindst 99 %.

4.3.	Saccharose (CAS 57-50-1) med en renhedsgrad på mindst 99 %.

4.4.	Lactose (CAS 5965-66-2) med en renhedsgrad på mindst 99 %.

4.5.	Maltose monohydrat (CAS 6363-53-7) med en renhedsgrad på mindst 99 %.

4.6.	Ren acetonitril (CAS 75-05-8) for HPLC-analyse.

4.7.	Destilleret eller demineraliseret vand, helst mikrofiltreret.

4.8.

Opløsningsmidler (eksempel) Elueringsvæsken består af: 75 dele (v/v) acetonitril (4.6) 25 dele (v/v) destilleret vand (4.7). Helium passeres langsomt gennem i 5-10 minutter inden anvendelse med henblik på afgasning. Er det anvendte vand ikke mikrofiltreret, tilrådes det at filtrere væsken gennem et filter til organiske opløsningsmidler med porestørrelse på ikke over 0,45 μm.

4.9.	Ethanol, absolut (CAS 64-17-5).

4.10.

Ethanolopløsning (5 %, v/v).

4.11.

Fremstilling af standardstamopløsning (20 g/l) 2 g af de enkelte sukkerarter, der skal analyseres (4.1-4.5), afvejes og hældes uden spild i en 100 ml målekolbe. (Bemærk: 2,11 g maltose monohydrat svarer til 2 g maltose). Der fyldes op til 100 ml med en alkoholopløsning på 5 % vol. (4.10), der omrøres og opbevares ved ca. + 4 °C. Der fremstilles en ny stamopløsning en gang om ugen.

4.12.

Fremstilling af arbejdsstandardopløsninger (2,5, 5,0, 7,5, 10 og 20 g/l) Stamopløsningen på 20 g/l fortyndes (4.11) behørigt med en alkoholopløsning på 5 % vol. (4.10) til fremstilling af fem arbejdsstandardopløsninger på 2,5, 5,0, 7,5, 10 og 20 g/l. Opløsningen filtreres gennem et filter med porestørrelse på ikke over 0,45 μm (5.3).

5.    Apparatur og udstyr

5.1.   HPLC-system til fremstilling af en grundopløsning af alle sukkerarterne.

5.1.1.

Højtryksvæskekromatograf med en seksvejsinjektor med 10 μL loop eller anden automatisk eller manuel anordning til pålidelig injektion af mikromængder.

5.1.2.

Pumpesystem, som giver mulighed for at opnå og opretholde en konstant eller programmeret gennemstrømningshastighed med stor nøjagtighed.

5.1.3.

Differentialrefraktometer.

5.1.4.

Dataintegrator eller -registrator med en ydeevne, som er forenelig med det øvrige system.

5.1.5.

Forkolonne: Det anbefales at knytte en passende forkolonne til den analytiske kolonne.

5.1.6.

Kolonne (eksempel): Materiale: rustfrit stål eller glas. Indre diameter: 2-5 mm. Længde: 100-250 mm (afhængigt af pakkepartikelstørrelsen), f.eks. 250 mm, hvis partiklerne har en diameter på 5 μm. Stationær fase: funktionelle grupper af alkylaminbundet silica, partikelstørrelse maks. 5 μm.

5.1.7.

Betingelser for kromatografi (eksempel): Elueringsvæske (4.8), gennemstrømningshastighed: 1 ml/minut. Detektering: differentialrefraktometri. For at sikre, at detektoren er helt stabil, bør den tændes et par timer inden brug. Blindprøven skal opfyldes med elueringsvæsken.

5.2.	Analysevægt med nøjagtighed 0,1 mg.

5.3.	Filtreringsopstilling til små mængder ved brug af mikromembran på 0,45 μm.

6.    Opbevaring af prøver

Prøver opbevares ved modtagelsen ved rumtemperatur inden analysen.

7.    Fremgangsmåde

7.1.   DEL A: Forberedelse af prøve

7.1.1.

Prøven rystes.

7.1.2.

Prøven filtreres gennem et filter med porestørrelse på ikke over 0,45 μm (5.3).

7.2.   DEL B: HPLC

7.2.1.   Bestemmelse

10 μL af standardopløsningerne (4.12) og prøverne (7.1.2). Analysen foretages under passende betingelser for kromatografi, f.eks. de oven for beskrevne betingelser.

7.2.2.

Hvis arealet (eller højden) af en top i en prøve er større end den tilsvarende top i den mest koncentrerede standard, bør prøven fortyndes med destilleret vand og analyseres på ny.

8.    Beregning

De to opnåede kromatogrammer for standardopløsningen og spiritussen sammenlignes. Toppene identificeres ud fra retentionstiden. Højden (eller arealet) af hver top måles for at beregne koncentrationerne ved anvendelse af ekstern standard. Der tages højde for eventuelle fortyndinger af prøven.

Det endelige resultat er summen af saccharose, maltose, lactose, glucose og fructose i g/l invertsukker.

Indholdet af invertsukker beregnes som summen af alle monosaccharider og ved at reducere indholdet af disaccharider plus den støkiometriske mængde af glucose og fructose beregnet på grundlag af indholdet af saccharose.

Invertsukker (g/l)

=

glucose (g/l) + fructose (g/l) + maltose (g/l) + lactose (g/l) + (saccharose (g/l) × 1,05)

1,05

=

(molekylvægt, fructose + molekylvægt, glucose)/molekylvægt, saccharose

9.    Metodens kvalitetsparametre (præcision)

9.1.   Statistiske resultater af interkalibrering

Følgende data kommer fra en international metodekvalitetsundersøgelse, der er foretaget efter internationalt anerkendte procedurer [1], [2].

▼M1

IX.   ÆGGEBLOMME. BESTEMMELSE AF ÆGGEBLOMMEKONCENTRATIONEN I SPIRITUS — FOTOMETRISK METODE

1.   Anvendelsesområde

Metoden er egnet til bestemmelse af koncentrationen af æggeblomme i området 40-250 g/l i æggelikør og likør med æg.

2.   Normative referencer

ISO 3696:1987 Water for analytical laboratory use — Specifications and test methods.

3.   Princip

Æggeblommens alkoholopløselige fosforforbindelser ekstraheres og bestemmes fotometrisk som fosformolybdatkompleks.

4.   Reagenser og materialer

5.   Apparatur og udstyr

6.   Prøver

Prøver opbevares ved rumtemperatur inden analysen.

7.   Fremgangsmåde

7.1.   Tilberedning af prøver

7.2.   Fotometrisk phosphatbestemmelse

7.2.1.   Sammenligningsopløsning

7.2.2.   Prøveopløsning

7.2.3.   Kalibreringskurve

8.   Angivelse af resultater

Koncentrationen af æggeblomme i g/l beregnes af følgende formel:

hvor:

110	er omregningsfaktor for total mængde P2O5 i g i 100 g æggeblomme

mg P2O5

er værdi fastlagt ud fra kalibreringskurven

massefylde

er masse pr. rumfangsenhed (g/ml) af den æggebaserede likør ved 20 °C

E	er vægtmængde æggebaseret likør i g

40	er fortyndingsfaktor for en 5 ml alikvot af askeopløsningen.

9.   Metodens funktionsdata (præcision)

Statistiske resultater af interkalibrering:

▼M2

X.   BESTEMMELSE AF FØLGENDE FORBINDELSER FRA TRÆ I SPIRITUS VED HØJTRYKSVÆSKEKROMATOGRAFI (HPLC): FURFURAL, 5-HYDROXYMETHYLFURFURAL, 5-METHYLFURFURAL, VANILLIN, SYRINGALDEHYD, CONIFERALDEHYD, SINAPALDEHYD, GALLUSSYRE, ELLAGINSYRE, VANILLINSYRE, SYRINGASYRE OG SCOPOLETIN

1.    Anvendelsesområde

Metoden vedrører bestemmelse af furfural, 5-hydroxymethylfurfural, 5-methylfurfural, vanillin, syringaldehyd, coniferaldehyd, sinapaldehyd, gallussyre, ellaginsyre, vanillinsyre, syringasyre og scopoletin ved højtryksvæskekromatografi.

2.    Normativ reference

Analysemetode, der er godkendt af Den Internationale Vinorganisations (OIV) generalforsamling og offentliggjort af OIV under reference OIV-MA-BS-16: R2009.

3.    Princip

Bestemmelse ved højtryksvæskekromatografi (HPLC) med detektering ved ultraviolet spektrofotometri ved flere bølgelængder og ved spektrofluorimetri.

4.    Reagenser

Reagenserne skal være af analysekvalitet. Der anvendes destilleret vand eller vand af mindst tilsvarende renhed. Det er bedst at anvende mikrofiltreret vand med en resistivitet på 18,2 M Ω.cm.

4.1.	Alkoholindhold på 96 %.

4.2.	Methanol af HPLC-kvalitet (væske B).

4.3.	0,5 % eddikesyre (væske A).

4.4.	Mobile faser: (er kun givet som eksempel). Væske A (0,5 % eddikesyre) og væske B (ren methanol). Filtreres gennem et membranfilter (porestørrelse 0,45 μm). Der afgasses om nødvendigt i ultralydsbad.

4.5.	Referencestandarder for en renhed på mindst 99 %: furfural, 5-hydroxymethylfurfural, 5-methylfurfural, vanillin, syringaldehyd, coniferaldehyd, sinapaldehyd, gallussyre, ellaginsyre, vanillinsyre, syringasyre og scopoletin.

4.6.

Referenceopløsning: Standardstofferne opløses i en vandig-alkoholholdig opløsning på 50 % vol. De endelige koncentrationer i referenceopløsningen bør være i størrelsesordenen: furfural: 5 mg/l; 5-hydroxymethyl furfural: 10 mg/l; 5-methylfurfural 2 mg/l; vanillin: 5 mg/l; syringaldehyd: 10 mg/l; coniferaldehyd: 5 mg/l; sinapaldehyd: 5 mg/l; gallussyre: 10 mg/l; ellaginsyre: 10 mg/l; vanillinsyre: 5 mg/l; syringasyre: 5 mg/l; scopoletin: 0,5 mg/l.

5.    Apparatur

Sædvanligt laboratorieudstyr

5.1.

Højtryksvæskekromatograf, der kan fungere i binær gradient mode, udstyret med: 5.1.1.  Spektrofotometrisk detektor til måling af bølgelængder i intervallet 260-340 nm. Det er imidlertid bedst at arbejde med en detektor med variabel bølgelængde med en diode eller lignende med henblik på at bekræfte toppenes renhed. 5.1.2.  Spektrofotometrisk detektor — excitationsbølgelængde: 354 nm, emissionsbølgelængde: 446 nm (til detektering af scopoletin, der ligeledes kan detekteres ved 313 nm ved spektrofotometri). 5.1.3.  Injektionsanordning til injektion af 10 eller 20 μl (f.eks.) af prøven. 5.1.4.  Kolonne til højtryksvæskekromatografi af typen RP C18, partikelstørrelse maks. 5 μm.

5.2.	Sprøjter til HPLC.

5.3.	Anordning til membranfiltrering af små mængder.

5.4.	Computer/integrator eller optager/integrator, der er kompatibel med hele apparaturet. Den skal navnlig have flere indsamlingskanaler.

6.    Fremgangsmåde

6.1.   Fremstilling af injektionsopløsningen.

Referenceopløsningen og spiritussen filtreres om nødvendigt gennem et membranfilter med porestørrelse på ikke over 0,45 μm.

6.2.

Kromatografiske driftsbetingelser: Analysen foretages ved stuetemperatur ved hjælp af det udstyr, der er beskrevet i punkt 5.1, og ved brug af de mobile faser (punkt 4.4) og en gennemstrømningshastighed på ca. 0,6 ml pr. minut i overensstemmelse med nedenstående gradient (er kun givet som et eksempel) Tidspunkt: 0 min, 50 min, 70 min, 90 min Væske A (vand-syre): 100 %, 60 %, 100 %, 100 % Væske B (methanol): 0 %, 40 %, 0 %, 0 % Bemærk, at denne gradient bør ændres i nogle tilfælde for at undgå co-eluering.

6.3.

Bestemmelse 6.3.1. Referencestandarderne sprøjtes ind særskilt og blandes. Tilpas driftsbetingelserne, således at opløsningsfaktorerne for alle forbindelsernes toppe mindst svarer til 1. 6.3.2. Prøven fremstillet i overensstemmelse med punkt 6.1 indsprøjtes. 6.3.3. Arealet af toppene i referenceopløsningen og spiritussen måles, og koncentrationerne beregnes.

7.    Angivelse af resultater

Koncentrationen af hver bestanddel udtrykkes i mg/l.

8.    Metodens kvalitetsparametre (præcision)

Følgende data kommer fra en international metodekvalitetsundersøgelse af forskellige spirituskategorier foretaget i 2009 efter internationalt anerkendte procedurer [1], [2].

8.1.   Furfural

8.2.   5-hydroxymethylfurfural

8.3.   5-methylfurfural

8.4.   Vanillin

8.5.   Syringaldehyd

8.6.   Coniferaldehyd

8.7.   Sinapaldehyd

8.8.   Gallussyre

8.9.   Ellaginsyre

8.10.   Vanillinsyre

8.11.   Syringasyre

8.12.   Scopoletin

▼M3

XI.    BESTEMMELSE AF 14C-INDHOLDET I ETHANOL

1.    Indledning

Bestemmelsen af 14C-indholdet i ethanol gør det muligt at skelne mellem alkohol af fossile råstoffer (såkaldt syntetisk alkohol) og alkohol af fornyelige råstoffer (såkaldt gæringsalkohol).

2.    Definition

Ved 14C-indholdet i ethanol forstås det 14C-indhold, der bestemmes ved den metode, der beskrives her, eller metode C, der beskrives i standarden EN 16640.

Det naturlige 14C-indhold i atmosfæren (referenceværdi), som optages af levende planter ved assimilation, er ikke nogen konstant værdi. Derfor bestemmes referenceværdien altid af ethanol af råstoffer fra den seneste vækstperiode. Denne årlige referenceværdi bestemmes i henhold til standard EN 16640. En anden referenceværdi kan dog accepteres, hvis den er certificeret af et akkrediteret organ.

3.    Princip

I alkoholholdige prøver med mindst 85 masseprocent alkohol bestemmes 14C-indholdet direkte ved hjælp af en væskescintillationstælling.

4.    Reagenser

4.1.   Toluenscintillator.

5,0 g 2,5-diphenyloxazol (PPO).

0,5 g p-bis-[4-methyl-5-phenyloxazolyl(2)]-benzol (dimethyl-POPOP) i 1 l toluen p.a.

Der kan også anvendes brugsklare toluenscintillatorer med denne sammensætning, der fås i handelen.

4.2.    14C-standard

n-hexadecan 14C med en aktivitet på ca. 1 × 106 dpm/g (ca. 1,67 × 106 cBq/g) og en garanteret nøjagtighed af den bestemte aktivitet på ± 2 % rel.

4.3.    14C-fri ethanol

Syntetisk alkohol af fossile råstoffer med mindst 85 masseprocent ethanol til bestemmelse af baggrundsværdien.

5.    Apparatur

6.    Fremgangsmåde

6.1.   Indstilling af apparatur

Apparaturet indstilles efter fabrikantens anvisninger. Målebetingelserne er optimale, når værdien E2/B, kvalitetsindekset, er maksimal.

E = Efficiency (tælling).

B = Background (baggrundsværdi).

Der optimeres kun to målekanaler. Den tredje målekanal lades helt åben til kontrolformål.

6.2.   Udvælgelse af måleflaskerne

Et større antal måleflasker, end der senere er brug for, fyldes med 10 ml 14C-fri syntetisk ethanol og 10 ml toluenscintillator og måles i mindst 4 cyklusser × 100 minutter. Flasker med baggrundsværdier, som afviger mere end ± 1 % rel. fra middelværdien, frasorteres. Ved udvælgelsen anvendes kun fabriksnye måleflasker fra samme produktionsserie.

6.3.   Bestemmelse af ekstern-standard-kanalforholdet (ESKF)

Ved kanalindstillingen efter punkt 6.1 bestemmes ekstern-standard-kanalforholdet (ESKF) ved hjælp af det relevante edb-program samtidig med konstateringen af efficiency. Som ekstern standard benyttes 137cæsium, der allerede er fast indbygget af fabrikanten.

6.4.   Tilberedning af prøven

Prøver, der har et ethanolindhold på mindst 85 masseprocent og er fri for urenheder, som absorberer ved bølgelængder under 450 nm, kan måles. Det lave restindhold af estere og aldehyder har ingen forstyrrende virkning. Prøvens alkoholindhold bestemmes på forhånd med en tilnærmelsesværdi på 0,1 %.

7.    Måling af prøverne med ekstern standard

7.2.   Måling

10 ml af de efter punkt 6.4 tilberedte prøver afpipetteres i en måleflaske, der er kontrolleret for baggrundsværdien (udvalgt), og der tilsættes 10 ml toluenscintillator ved hjælp af en automatisk doseringsanordning. Med egnede rotationsbevægelser homogeniseres prøverne i måleflasken, idet væsken ikke må befugte polyethylenindlægget i skruelåget. På samme måde tilberedes en måleflaske med 14C-frit fossilt ethanol til bestemmelse af baggrundsværdien. Til kontrol af 14C-årsværdien fremstilles en dobbeltprøve af ethanol af fornyelige råstoffer fra den seneste vækstperiode, idet en måleflaske blandes med intern standard i overensstemmelse med punkt 8.

Kontrol- og baggrundsprøverne anbringes forrest i målerækken, som ikke må omfatte mere end ti analyseprøver. Den samlede måletid pr. prøve er på mindst 2 × 100 minutter, idet målingen af den enkelte prøve foretages i faser på hver 100 minutter, for at man kan fastslå eventuelt forekommende drift eller anden forstyrrelse. (En cyklus omfatter således et måleinterval på 100 minutter pr. prøve).

Baggrundsværdi- og kontrolprøver skal fornyes efter fire uger.

Når det gælder prøver med ringe absorbans (ESKF-værdi ca. 1,8), er påvirkningen af efficiency ved ændring af denne værdi kun ubetydelig. Ligger denne ændring inden for ± 5 % rel., kan der regnes med samme efficiency. Hvad angår prøver med større absorbans, som f.eks. gæringsalkohol, kan efficiency fastsættes ved hjælp af den såkaldte absorbanskorrekturkurve. Findes der ikke noget relevant edb-program, foretages målingen med intern standard, der giver en utvetydig bestemmelse af efficiency.

8.    Måling af prøverne med intern standard hexadecan 14C

8.1.   Fremgangsmåde

Kontrol- og baggrundsprøve (fossilt ethanol og ethanol af fornyelige råstoffer) og det ukendte materiale måles som dobbeltprøve. Den ene af dobbeltprøverne forberedes i en ikke udvalgt flaske, som tilsættes en nøjagtigt doseret mængde (30 μl) hexadecan 14C som intern standard (tilsat aktivitet ca. 26 269 dpm/g C ca. 43 782 cBq/gC). Hvad angår den øvrige prøvetilberedning og måletid går man frem som beskrevet i punkt 7.2, idet måletiden for prøverne med intern standard begrænses til ca. fem minutter ved forvalget på 105 impulser. En dobbeltprøve af kontrol- og baggrundsværdiprøver tilberedes for hver målerække, som anbringes forrest i målerækken.

8.2.   Håndtering af den interne standard og målekolberne

Ved målinger med intern standard skal opbevaring og håndtering for at undgå kontamineringer foregå i lokaler, der er strengt adskilt fra de lokaler, hvor tilberedning og måling af analyseprøverne finder sted. Efter målingen kan de baggrundsværdikontrollerede kolber genanvendes. Skruelågene og flaskerne med intern standard bortkastes.

9.    Angivelse af resultater

9.1.   Et radioaktivt stofs aktivitet udtrykkes i Becquerel, 1 Bq = 1 henfald/sec.

Den specifikke radioaktivitet angives i Becquerel for 1 g kulstof = Bq/gC.

For at opnå mere realistiske værdier udtrykkes resultatet i centi-Becquerel = cBq/gC.

De betegnelser og beregningsformler, der hidtil er blevet benyttet i litteraturen, og som bygger på dpm-angivelser, kan også anvendes. For at opnå den tilsvarende værdi i centi-Becquerel skal man blot multiplicere det opnåede dmp-resultat med faktoren 100/60.

9.2.   Beregning af resultat med ekstern standard

9.3.   Beregning af resultat med intern standard

9.4.   Forkortelser

cpmpr

=

det for prøven konstaterede gennemsnitlige impulstal i hele måletiden

cpmNE

=

det ligeledes konstaterede impulstal for baggrundsværdien

cpmIS

=

det konstaterede impulstal for prøven med intern standard

dpmIS

=

mængden af tilsat intern standard (kalibreret radioaktivitet dpm)

V

=

prøvevolumen i ml

F

=

indholdet af g ren alkohol pr. ml svarende til koncentrationen

Z

=

efficiency svarende til ESKF-værdien

1,918

=

g alkohol/1 g kulstof.

10.    Metodens pålidelighed

10.1.   Repeterbarhed (r)

r = 0,632 cBq/g C; S(r) = ± 0,223 cBq/g C

10.2.   Reproducerbarhed (R)

R = 0,821 cBq/g C; S(R) = ± 0,290 cBq/g C.