1.

Rozdělovací koeficient (P) je definován jako poměr rovnovážných koncentrací rozpuštěné látky v dvoufázovém systému tvořeném dvěma prakticky nemísitelnými rozpouštědly. V případě n-oktanolu a vody platí:

Rozdělovací koeficient jako podíl dvou koncentrací je bezrozměrná veličina a obvykle se uvádí jeho dekadický logaritmus.

2.

Pow je klíčový parametr při studiu chování chemických látek v životním prostředí. Byl zjištěn vysoce významný vztah mezi Pow neionizované formy látek a jejich bioakumulací u ryb. Bylo rovněž ukázáno, že Pow je účinný parametr v odhadech adsorpce na půdě a sedimentech a při stanovení kvantitativních vztahů mezi strukturou a aktivitou v širokém rozsahu biologických účinků.

3.

Původní návrh této zkušební metody vycházel z článku autorů C. V. Eadsfortha a P. Mosera (1). Vývoj zkušební metody a srovnávací zkoušky OECD mezi laboratořemi byly koordinovány centrálním úřadem pro životní prostředí (Umweltbundesamt) Spolkové republiky Německo během roku 1986 (2).

4.

Hodnoty log Pow v rozsahu – 2 až 4 (někdy až 5 a více) (1) mohou být experimentálně stanoveny metodou třepací lahve (Shake-Flask) (kapitola A.8 této přílohy, Pokyn OECD pro zkoušení 107). Metoda HPLC pokrývá log Pow v rozsahu 0 až 6 (1, 2, 3, 4, 5). Tato metoda může vyžadovat odhad Pow pro přiřazení vhodných referenčních látek a podporu jakýchkoli závěrů vyvozených z dat získaných zkouškou. Výpočtové metody jsou stručně probrány v dodatku této zkušební metody. HPLC provozní režim je izokratický.

5.

Hodnoty Pow závisejí na podmínkách prostředí, jakými jsou teplota, pH, iontová síla atd., a ty je třeba v experimentu definovat, aby byla zajištěna správná interpretace údajů Pow. U ionizovatelných látek může být k dispozici jiná metoda (např. návrh pokynu OECD k metodě měření pH ionizovaných látek (6)) a lze ji použít jako alternativní metodu. Ačkoli tento návrh pokynu OECD může být vhodný pro stanovení Pow těchto ionizovatelných látek, v některých případech je vhodnější použít metodu HPLC při pH odpovídajícím přírodnímu prostředí (viz odstavec 9).

6.

HPLC na reverzní fázi se provádí v analytických kolonách plněných komerčně dostupnou pevnou fází obsahující dlouhé uhlovodíkové řetězce (např. C8, C18) chemicky vázané na oxid křemičitý.

7.

Chemická látka nastříknutá do takové kolony se rozděluje mezi mobilní rozpouštědlovou fázi a uhlovodíkovou stacionární fázi, jak se působením mobilní fáze pohybuje kolonou. Látky jsou zadržovány úměrně jejich rozdělovacímu koeficientu uhlovodík-voda, přičemž hydrofilní látky se vymývají jako první a lipofilní látky jako poslední. Retenční čas je popsán kapacitním faktorem k daným výrazem:

kde tR je retenční čas zkoušené látky a t0 je mrtvý čas, tj. průměrná doba, kterou potřebuje molekula rozpouštědla, aby prošla kolonou. Kvantitativní analytické metody nejsou zapotřebí, nezbytné je pouze stanovení retenčních časů.

8.

Rozdělovací koeficient oktanol/voda zkoušené látky se dá vypočítat tak, že experimentálně stanovíme její kapacitní faktor k a ten pak dosadíme do následující rovnice:

kde

Tato rovnice se získá lineární regresí logaritmu rozdělovacích koeficientů oktanol/voda referenčních látek proti logaritmu kapacitních faktorů referenčních látek.

9.

Metoda HPLC na reverzní fázi umožňuje odhad rozdělovacích koeficientů v rozsahu log Pow od 0 do 6, ale ve výjimečných případech lze rozsah rozšířit tak, že pokrývá i log Pow od 6 do 10. To může vyžadovat modifikaci mobilní fáze (3). Metoda se nedá aplikovat na silné kyseliny a zásady, komplexní sloučeniny kovů, látky reagující s eluentem nebo povrchově aktivní činidla. Měření lze provádět na ionizovatelných látkách pouze v jejich neionizované formě (volné kyseliny nebo volné zásady) použitím vhodného pufru s pH nižším než pKa volné kyseliny nebo vyšším než pKa volné zásady. Popřípadě může být k dispozici metoda měření pH pro zkoušení ionizovatelných látek (6), kterou lze použít jako alternativní metodu (6). Jestliže je hodnota log Pow stanovena pro použití ke klasifikaci nebezpečí pro životní prostředí nebo hodnocení environmentálních rizik, je třeba zkoušku provádět v rozsahu pH příslušném pro přírodní prostředí, tj. v rozsahu pH 5,0–9.

10.

V některých případech mohou nečistoty znesnadnit interpretaci výsledků vzhledem k nejistému přiřazení píků. U směsí, výsledkem jejichž analýzy je nerozlišený pás, je třeba uvést horní a dolní mez log Pow, a procentuální podíl ploch píků pro každý log Pow. U směsí, které jsou skupinou homologů, je třeba rovněž uvést vážený průměr log Pow (7) vypočítaný na základě jednotlivých hodnot Pow a odpovídajících procentuálních podílů ploch (8). Ve výpočtu je třeba brát v úvahu všechny píky, které přispívají k celkové ploše píků 5 nebo více procenty (9):

Vážený průměr log Pow je platný pouze pro látky nebo směsi (např. tálové oleje) skládající se z homologů (např. série alkanů). Při měření směsí lze užitečné výsledy získat za předpokladu, že použitý analytický detektor má stejnou citlivost vůči všem látkám ve směsi a lze je dostatečně rozlišit.

11.

Před použitím metody musí být známa disociační konstanta, strukturní vzorec a rozpustnost v mobilní fázi. Užitečné budou rovněž informace o hydrolýze.

12.

Aby se zvýšila spolehlivost měření, musí být provedena opakovaná stanovení.

13.

Zkouška mezilaboratorního srovnání ukázala, že pomocí metody HPLC lze hodnoty log Pow získat s přesností + 0,5 jednotek pro rozdělovací koeficienty získané metodou třepací lahve (2). V literatuře lze nalézt další srovnání (4, 5, 10, 11, 12). Nejpřesnější výsledky poskytují korelační grafy založené na referenčních látkách, které mají podobnou strukturu (13).

14.

Pro korelaci měřeného kapacitního faktoru k látky s jejím Pow je třeba stanovit kalibrační graf s použitím alespoň 6 bodů (viz odstavec 24). Vhodné referenční látky zvolí uživatel. Referenční látky by v zásadě měly mít hodnoty log Pow v rozsahu, který zahrnuje log Pow zkoušené chemické látky, tzn. alespoň jedna referenční látka by měla mít Pow nad hodnotou zkoušené látky a jiná Pow pod touto hodnotou. Extrapolaci je možné použít pouze ve výjimečných případech. Je vhodnější, aby tyto referenční látky byly svou strukturou podobné zkoušené látce. Hodnoty log Pow referenčních látek použitých pro kalibraci by měly vycházet ze spolehlivých experimentálních údajů. Avšak u látek s vysokým log Pow (obvykle více než 4) je možné použít vypočítané hodnoty, pokud nejsou k dispozici spolehlivé experimentální údaje. Jestliže se použijí extrapolované hodnoty, je třeba uvést mezní hodnotu.

15.

V literatuře jsou dostupné rozsáhlé seznamy hodnot Pow pro mnoho skupin chemických látek (14, 15). Jestliže nejsou k dispozici data o rozdělovacích koeficientech látek s podobnou strukturou, je možné použít obecnější kalibraci stanovenou s jinými referenčními látkami. Tabulka 1 uvádí doporučené referenční látky a jejich hodnoty Pow. V případě ionizovatelných látek platí uvedené hodnoty pro neionizovanou formu. Věrohodnost a kvalita hodnot byly prověřeny mezilaboratorní srovnávací zkouškou.

Tabulka 1

Doporučené referenční látky

16.

V případě potřeby lze rozdělovací koeficient zkoušené látky nejlépe odhadnout na základě výpočtu (viz dodatek) nebo popřípadě z poměru rozpustností zkoušené látky v čistých rozpouštědlech.

17.

Nezbytným vybavením je kapalinový chromatograf vybavený nízkopulzním čerpadlem a vhodným detekčním systémem. UV detektor pracující na vlnové délce 210 nm nebo RI detektor jsou použitelné pro širokou škálu chemických skupin. Přítomnost polárních skupin ve stacionární fázi může významně zhoršit účinnost kolony HPLC. Stacionární fáze by proto měly mít minimální podíl polárních skupin (16). Lze použít komerční mikročásticové náplně s reverzními fázemi nebo hotové kolony s náplní. Mezi nástřikem a analytickou kolonou může být umístěna ochranná předkolona.

18.

K přípravě elučního rozpouštědla, které je třeba před použitím odplynit, se užije metanol čistoty pro HPLC a destilovaná nebo deionizovaná voda. Měla by být provedena izokratická eluce. Doporučuje se použít směs metanol-voda s minimálním obsahem vody 25 %. Směs 3:1 (obj.) metanol-voda je obvykle vyhovující pro vymývání látek s log P = 6 během hodiny při průtokové rychlosti 1 ml/min. U látek s log P vyšším než 6 může být nezbytné zkrátit eluční dobu (rovněž u referenčních látek) snížením polarity mobilní fáze nebo délky kolony.

19.

Zkoušené i referenční látky musí být rozpustné v mobilní fázi v dostatečné koncentraci, aby byla umožněna jejich detekce. Aditiva se mohou použít se směsí metanol-voda pouze ve výjimečných případech, neboť mění vlastnosti kolony. V těchto případech je třeba ověřit, zda retenční časy zkoušené a referenční látky nejsou ovlivněny. Jestliže směs metanol-voda není vhodná, je možné použít jiné směsi organických rozpouštědel a vody, např. etanol-voda, acetonitril-voda nebo izopropylalkohol (2-propanol)-voda.

20.

Pro ionizovatelné látky je kritické pH eluentu. Mělo by se nacházet v pracovní oblasti pH kolony, obvykle mezi 2 and 8. Doporučuje se použitít pufračních roztoků. Je třeba dbát na to, aby se nedošlo ke srážení solí a narušení kolony, k čemuž dochází u některých směsí organické fáze s pufračním roztokem. Měření pomocí HPLC se stacionárními fázemi na bázi oxidu křemičitého se obvykle nedoporučuje při pH vyšším než 8, neboť použití alkalické mobilní fáze může způsobit rychlé narušení činnosti kolony.

21.

Zkoušené a referenční látky musí být dostatečně čisté, aby bylo možno přiřadit píky v chromatogramech příslušným látkám. Látky, které se mají používat ke zkoušení nebo kalibraci, se pokud možno rozpustí v mobilní fázi. Jestliže se k rozpuštění zkoušené a referenční látky použije jiné rozpouštědlo než mobilní fáze, je třeba použít mobilní fázi ke konečnému zředění před nástřikem.

22.

Teplota by během měření neměla kolísat o více než ± 1 °C.

23.

Mrtvý čas t0 je možné měřit použitím nezadržovaných organických látek (např. thiomočovina nebo formamid). Přesnější mrtvý čas lze získat ze změřených retenčních časů nebo užitím souboru přibližně sedmi členů homologické řady (např. n-alkylmethylketonů) (17). Retenční časy tR (nC + 1) se vynesou jako funkce tR (nC), kde nC je počet atomů uhlíku. Tak se získá přímka tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, kde A = k(nC + 1)/k(nC) je konstantní. Mrtvý čas t0 se získá z úseku (1 – A)t0 a směrnice A.

24.

Dalším krokem je sestrojení korelační závislosti hodnot log k na log P pro vhodné referenční látky s hodnotami log P blízkými hodnotám očekávaným pro zkoušenou chemickou látku. V praxi se současně nastříkne 6 až 10 referenčních látek. Retenční časy se stanoví nejlépe pomocí zapisovacího integrátoru napojeného na detekční systém. Odpovídající logaritmy kapacitních faktorů log k se vynesou jako funkce log P. Regresní rovnice se stanoví v pravidelných intervalech, alespoň jednou denně, aby bylo možno zohlednit případné změny činnosti kolony.

25.

Zkoušená chemická látka se nastříkne v nejmenších detekovatelných množstvích. Retenční čas se stanovuje zdvojeným měřením. Rozdělovací koeficient zkoušené látky se získá interpolací vypočítaného kapacitního faktoru na kalibračním grafu. U velmi nízkých a velmi vysokých rozdělovacích koeficientů je nutná extrapolace. Zejména v těchto případech je třeba věnovat pozornost intervalům spolehlivosti regresní přímky. Jestliže je retenční čas vzorku mimo rozsah retenčních časů stanovených pro standardy, je třeba uvést mezní hodnotu.

26.

V závěrečné zprávě musí být obsaženy následující údaje:

1)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss and H.J. Poremski. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

3)

C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.

5)

B. McDuffie (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

6)

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Draft Guideline, November 2000.

7)

OSPAR (1995). ‚Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995‘, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Annex 10, Oviedo, 20–24 February 1995.

8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez and C. C. Karman. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3. August.

9)

E. A. Vik, S. Bakke and K. Bansal. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, pp. 529-537.

10)

L.O. Renberg, S.G. Sundstroem and K. Sundh-Nygård. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

11)

W.E. Hammers, G.J.Meurs and C.L. De-Ligny. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

12)

J.E. Haky and A.M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

13)

S. Fujisawa and E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

14)

C. Hansch and A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, New York.

15)

C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity – Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

16)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

17)

G.E. Berendsen, P.J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony, and J. Inczédy. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

1.

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení 201 (2006, příloha opravena v roce 2011). Bylo potřebné rozšířit zkušební methodu tak, aby zahrnovala další druhy, a aktualizovat ji, aby splňovala požadavky na posouzení nebezpečnosti a klasifikaci chemických látek. Tato přepracovaná verze byla dokončena na základě rozsáhlých praktických zkušeností, vědeckého pokroku na poli studia toxicity řas a širokého uplatňování příslušných právních předpisů, k němuž došlo od přijetí původního znění.

2.

Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.

3.

Účelem této zkoušky je stanovit účinek látky na růst sladkovodních mikrořas a/nebo sinic (Cyanophyta). Exponenciálně rostoucí zkušební organismy jsou vystaveny zkoušené chemické látce v sérii kultur obvykle po dobu 72 hodin. Navzdory relativně krátké době trvání zkoušky lze posoudit účinky na několik generací.

4.

Systémovou odezvou je snížení růstu v řadě kultur řas (zkušebních jednotek) vystavených různým koncentracím zkoušené látky. Odezva se vyhodnocuje jako funkce expoziční koncentrace v porovnání s průměrným růstem neexponovaných kontrolních kultur použitých k opakování. Pro úplné vyjádření odezvy systému na toxické účinky (optimální citlivost) se kultury ponechají exponenciálně růst bez omezení za podmínek dostatečné výživy a nepřetržitého osvětlení po dostatečnou dobu, aby bylo možné změřit snížení specifické růstové rychlosti.

5.

Růst a inhibice (zpomalení) růstu se kvantifikují měřeními biomasy řas jako funkce času. Biomasa řas se definuje jako hmotnost sušiny na objem, např. mg řas/litr zkušebního roztoku. Ovšem hmotnost sušiny se měří obtížně, proto se používají náhradní parametry. Z těchto náhrad se nejčastěji používají počty buněk. Mezi další náhradní parametry patří buněčný objem, fluorescence, optická hustota atd. Je třeba znát přepočítávací faktor mezi naměřeným náhradním parametrem a biomasou.

6.

Cílovým ukazatelem zkoušky je inhibice růstu vyjádřená jako logaritmické zvýšení biomasy (průměrná specifická růstová rychlost) během expoziční doby. Z průměrných specifických růstových rychlostí zaznamenaných v řadě zkušebních roztoků se stanoví koncentrace způsobující stanovenou x % inhibici růstové rychlosti (např. 50 %) a vyjádří se jako ErCx (např. ErC50).

7.

Další proměnnou odezvy použitou v této zkušební metodě je výtěžek, který může být nezbytný ke splnění specifických právních požadavků v některých zemích. Je definován jako biomasa na konci expoziční doby minus biomasa na počátku expoziční doby. Z výtěžku zaznamenaného v řadě zkušebních roztoků se vypočítá koncentrace způsobující stanovenou x % inhibici výtěžku (např. 50 %) a vyjádří se jako EyCx (např. EyC50).

8.

Kromě toho se může statisticky určit nejnižší koncentrace s pozorovaným účinkem (LOEC) a koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC).

9.

Informace o zkoušené chemické látce, které mohou být užitečné pro účely stanovení podmínek zkoušky, jsou strukturní vzorec, čistota, stálost na světle, stálost za podmínek zkoušky, vlastnosti světelné absorpce, pKa a výsledky studií transformace, včetně biologické rozložitelnosti ve vodě.

10.

Měly by být známy rozpustnost zkoušené chemické látky ve vodě, její rozdělovací koeficient oktanol/voda (Pow) a tlak jejích par; měla by být k dispozici validovaná metoda kvantitativního stanovení látky ve zkušebních roztocích, a to s doloženou výtěžností a mezí detekce.

11.

Má-li být zkouška platná, musí být splněna tato kritéria platnosti:

12.

Jako prostředek kontroly zkušebního postupu lze zkoušet referenční látku (látky), například 3,5-dichlorfenol použitý v mezinárodní kroužkové zkoušce (1). Dvojchroman draselný lze rovněž použít jako referenční látku pro zelené řasy. Je žádoucí zkoušet referenční látku nejméně dvakrát ročně.

13.

Tato metoda se nejsnáze používá pro látky rozpustné ve vodě, které za podmínek zkoušky pravděpodobně ve vodě zůstanou. Pro zkoušení látek, které jsou těkavé, silně adsorbují, jsou zbarvené, mají nízkou rozpustnost ve vodě nebo látek, které mohou nepříznivě ovlivňovat dostupnost živin či minerálů ve zkušebním médiu, mohou být potřebné určité úpravy popsaného postupu (např. uzavřený systém, klimatizace zkušebních nádob). Pokyny k některým vhodným úpravám jsou uvedeny v literatuře (2, 3 a 4).

14.

Zkušební nádoby a jiné přístroje, které přijdou do styku se zkušebními roztoky, by měly být celoskleněné nebo vyrobeny z jiného chemicky inertního materiálu. Jednotlivé komponenty musí být pečlivě umyty, aby se zajistilo, že žádné organické nebo anorganické kontaminující látky nebudou rušit růst řas nebo ovlivňovat složení zkušebních roztoků.

15.

Zkušební nádoby jsou běžně skleněné baňky takové velikosti, že pojmou dostatečný objem kultury během zkoušky a umožní dostatečný přenos CO2 z atmosféry (viz odstavec 30). Objem kapaliny musí být dostatečný pro analytická stanovení (viz odstavec 37).

16.

Kromě toho bude nezbytné veškeré následující vybavení nebo jeho část:

17.

Lze použít několik druhů nevázaných mikrořas a sinic. Kmeny uvedené v dodatku 2 se ukázaly jako vhodné při použití zkušebního postupu uvedeného v této zkušební metodě.

18.

Jestliže se použijí jiné druhy, je třeba uvést v závěrečné zprávě kmen a/nebo původ. Musí se potvrdit, že lze udržovat exponenciální růst vybraných zkušebních řas po dobu zkoušky za převažujících podmínek.

19.

Doporučují se dvě alternativní růstová média, média OECD a AAP. Složení těchto médií je uvedeno v dodatku 3. Uvědomte si, že počáteční hodnota pH a pufrovací kapacita (regulující zvýšení pH) těchto dvou médií jsou rozdílné. Proto se mohou výsledky zkoušek lišit v závislosti na použitém médiu, zejména při zkoušení ionizujících látek.

20.

Pro určité účely může být nezbytná úprava růstových médií, např. když se zkoušejí kovy a chelatační činidla nebo když se provádějí zkoušky při různých hodnotách pH. Použití upraveného média musí být podrobně popsáno a zdůvodněno (3, 4).

21.

Počáteční biomasa musí být stejná ve všech zkušebních kulturách a dostatečně nízká, aby umožňovala exponenciální růst po celou inkubační dobu bez rizika vyčerpání živin. Počáteční biomasa by neměla překročit 0,5 mg/l pro hmotnost sušiny. Doporučují se následující počáteční koncentrace buněk:

22.

Koncentrační rozmezí, ve kterém lze očekávat účinky, lze určit na základě výsledků orientačních zkoušek. Pro závěrečnou hlavní zkoušku je zapotřebí vybrat alespoň pět koncentrací tvořících geometrickou posloupnost s faktorem nepřekračujícím 3,2. U zkoušených látek vykazujících plochou křivku závislosti odezvy na koncentraci může být opodstatněný vyšší faktor. Posloupnosti koncentrací by nejlépe měly pokrývat rozmezí způsobující 5–75 % inhibici růstové rychlosti řas.

23.

Uspořádání zkoušky by mělo zahrnovat tři opakování s každou zkoušenou koncentrací. Jestliže se nepožaduje stanovení NOEC (koncentrace bez pozorovaných účinků), uspořádání zkoušky lze pozměnit tak, že se zvýší počet koncentrací a sníží počet opakování pro příslušnou koncentraci. Počet kontrolních opakování musí být nejméně tři a v ideálním případě by měl být dvojnásobkem počtu opakování používaných pro každou zkoušenou koncentraci.

24.

Pro analytická stanovení koncentrací zkoušených chemických látek se může připravit samostatná sada zkušebních roztoků (viz odstavce 36 a 38).

25.

Pokud se k rozpouštění zkoušené látky používá rozpouštědlo, musí být do uspořádání zkoušky zahrnuty dodatečné kontroly obsahující rozpouštědlo o stejné koncentraci, jaká se používá v zkušebních kulturách.

26.

Pro přizpůsobení zkušebních řas podmínkám zkoušky a zajištění toho, aby řasy byly v exponenciální růstové fázi, když se použijí pro naočkování zkušebních roztoků, se očkovací kultura v zkušebním médiu připravuje 2 až 4 dny před zahájením zkoušky. Biomasu řas je třeba upravit, aby mohl do zahájení zkoušky v očkovací kultuře převážit exponenciální růst. Očkovací kultura se musí inkubovat za stejných podmínek jako zkušební kultury. Měří se nárůst biomasy v očkovací kultuře, aby bylo zajištěno, že je růst v rámci normálního rozmezí pro zkušební kmen za podmínek kultivace. Příklad postupu pro kultivaci řas je popsán v dodatku 4. Aby se předešlo synchronnímu dělení buněk během zkoušky, může být potřebné provést druhý krok propagace očkovací kultury.

27.

Všechny zkušební roztoky musí obsahovat stejné koncentrace růstového média a počáteční biomasy zkušebních řas. Zkušební roztoky zvolených koncentrací se obvykle připravují smísením zásobního roztoku zkoušené chemické látky s růstovým médiem a očkovací kulturou. Zásobní roztoky se obyčejně připravují rozpuštěním chemické látky ve zkušebním médiu.

28.

Jako nosiče pro přidávání látek o nízké rozpustnosti ve vodě do zkušebního média mohou být použita rozpouštědla, např. aceton, terc-butylalkohol a dimethylformamid (2, 3). Koncentrace rozpouštědla by neměla překročit 100 μl/l a do všech kultur (včetně kontrolních) ve zkušební řadě by měla být přidána stejná koncentrace rozpouštědla.

29.

Zkušební nádoby se uzavřou zátkami, které propouštějí vzduch. Nádoby se protřepou a umístí do kultivačního zařízení. Během zkoušky je nezbytné udržovat řasy v suspensi a umožnit přenos CO2. Za tímto účelem je třeba provádět nepřetržité třepání nebo míchání. Kultury je třeba udržovat při teplotě v rozsahu 21 až 24 °C, která je regulována s přesností na ± 2 °C. Pro druhy jiné než uvedené v seznamu v dodatku 2, např. tropické druhy, mohou být vhodné vyšší teploty, pokud je možné splnit kritéria platnosti. Doporučuje se umístit baňky náhodně a denně je v inkubátoru přemísťovat.

30.

Hodnota pH kontrolního média by neměla během zkoušky vzrůst o více než 1,5. U kovů a chemických látek, které částečně ionizují při pH blížící se pH zkoušky, může být nezbytné omezit posun pH pro získání opakovatelných a dobře definovaných výsledků. Posun hodnoty pH o < 0,5 je technicky proveditelný a lze jej dosáhnout zajištěním adekvátní rychlosti přesunu hmoty CO2 z okolního vzduchu do zkušebního roztoku, např. zvýšením rychlosti třepání. Další možností je snížit potřebu CO2 snížením počáteční biomasy nebo doby trvání zkoušky.

31.

Povrch, kde jsou kultury inkubovány, by měl být trvale osvětlen jednotným fluorescenčním světlem, např. ‚chladným bílým‘ nebo ‚denním‘ světlem. Jednotlivé kmeny řas a sinic mají různé požadavky na osvětlení. Intenzita světla by měla být zvolena tak, aby vyhovovala použitému zkušebnímu organismu. Pro doporučené druhy zelených řas se intenzita světla na hladině zkušebních roztoků zvolí v rozmezí 60–120 μE · m– 2 · s– 1, přičemž se měří ve fotosynteticky efektivním rozsahu vlnových délek od 400 do 700 nm pomocí vhodného snímače. Některé druhy, zejména Anabaena flos-aquae, dobře rostou při nízkých intenzitách světla a mohou být při vysokých intenzitách poškozeny. U takových druhů by měla být zvolena průměrná intenzita světla 40–60 μE·m– 2·s– 1. (Měří-li se intenzita osvětlení luxmetry, ekvivalentní rozpětí 4 440 až 8 880 luxů pro chladné bílé světlo odpovídá přibližně doporučené světelné intenzitě 60–120 μE·m– 2 · s– 1). Nad inkubační plochou musí být udržována intenzita světla v rozmezí ± 15 % od průměrné intenzity světla.

32.

Zkouška obvykle trvá 72 hodin. Lze však použít kratší nebo delší doby trvání zkoušky, pokud lze splnit všechna kritéria platnosti uvedená v odstavci 11.

33.

Biomasa řas se v každé baňce určí během doby zkoušky nejméně jednou denně. Jestliže se měření provádí na malých objemech odebraných ze zkušebního roztoku pipetou, tyto se nenahrazují.

34.

Měření biomasy se provádí ručním počítáním buněk pod mikroskopem nebo pomocí elektronického počítače částic (počty buněk a/nebo biologický objem). Alternativní techniky, jako jsou např. průtoková cytometrie, fluorescence chlorofylu in vitro nebo in vivo (5, 6) nebo optická hustota, lze použít za předpokladu, že je možné prokázat uspokojivou korelaci s biomasou v rozmezí, v němž se biomasa během zkoušky vyskytuje.

35.

pH roztoků se měří na počátku a na konci zkoušky.

36.

Pokud je dostupný analytický postup k určení zkoušené chemické látky v rozmezí použitých koncentrací, zkušební roztoky je třeba analyzovat, aby se ověřily počáteční koncentrace a udržení expozičních koncentrací během zkoušky.

37.

Analýza koncentrace zkoušené chemické látky na počátku a konci zkoušky při nízké a vysoké zkušební koncentraci a koncentrace okolo očekávané EC50 mohou být dostatečné, jestliže je pravděpodobné, že se expoziční koncentrace budou během zkoušky lišit o méně než 20 % od nominálních hodnot. Analýza všech zkušebních koncentrací na počátku a konci zkoušky se doporučuje v případě, kdy je nepravděpodobné, že koncentrace zůstanou v rozmezí 80 až 120 % nominální hodnoty. U těkavých, nestabilních nebo silně adsorbujících zkoušených chemických látek se doporučuje provést dodatečný odběr vzorků k analýze v 24hodinových intervalech během expoziční doby s cílem lépe definovat ztrátu zkoušené chemické látky. U těchto chemických látek mohou být zapotřebí dodatečná opakování. Ve všech případech se určení koncentrací zkoušené chemické látky provádí pouze u jedné z opakovaných kultur při každé zkušební koncentraci (nebo u sdruženého obsahu nádob ze všech opakovaných kultur).

38.

Zkušební média specificky připravená k analýze expozičních koncentrací během zkoušky by měla být exponována stejným způsobem jako zkušební média použitá ke zkoušení, tj. měla by být naočkována řasami a inkubována za identických podmínek. Jestliže se požaduje analýza koncentrace rozpuštěné zkoušené látky, může být nezbytné oddělit řasy od média. Oddělení by se mělo nejlépe provádět odstřeďováním při nízké gravitační síle dostatečné pro usazení řas.

39.

Lze-li prokázat, že byla po celou dobu zkoušky koncentrace zkoušené chemické látky uspokojivě udržována v rozmezí ± 20 % nominální nebo naměřené počáteční koncentrace, může být analýza výsledků založena na nominálních nebo naměřených počátečních hodnotách. Je-li odchylka od nominální nebo naměřené počáteční koncentrace větší než ± 20 %, analýza výsledků by měla být založena na geometrické střední koncentraci během expozice nebo na modelech popisujících pokles koncentrace zkoušené chemické látky (3, 7).

40.

Zkouška inhibice růstu řas je dynamičtější zkušební systém než většina jiných krátkodobých zkoušek vodní toxicity. V důsledku toho může být obtížné definovat skutečné expoziční koncentrace, zvláště u adsorbujících látek zkoušených při nízkých koncentracích. V takových případech vymizení zkoušené látky z roztoku adsorpcí do zvyšující se biomasy řas neznamená, že se ztratila ze zkušebního systému. Při analýze výsledku zkoušky je třeba zkontrolovat, jestli je pokles koncentrace zkoušené chemické látky v průběhu zkoušky doprovázen poklesem inhibice růstu. Pokud tomu tak je, lze zvážit použití vhodného modelu popisujícího pokles koncentrace zkoušené chemické látky (7). Pokud tomu tak není, může být vhodné založit analýzu výsledků na počátečních (nominálních či naměřených) koncentracích.

41.

Pro ověření normálního a zdravého vzhledu očkovací kultury a sledování jakéhokoliv abnormálního vzhledu řas (které může být způsobeno expozicí zkoušené chemické látce) na konci zkoušky by mělo být provedeno mikroskopické pozorování.

42.

Za určitých okolností, např. pokud předběžná zkouška naznačuje, že zkoušená chemická látka nemá žádné toxické účinky při koncentracích až do 100 mg/l nebo až do meze své rozpustnosti v zkušebním médiu (podle toho, co je nižší), může být provedena limitní zkouška zahrnující porovnání odezvy v kontrolní skupině a odezvy v jedné exponované skupině (100 mg/l nebo koncentrace rovná mezi rozpustnosti). Důrazně se doporučuje podpořit tuto zkoušku analýzou expozičních koncentrací. Všechny dříve popsané zkušební podmínky a kritéria platnosti se vztahují i na limitní zkoušku s výjimkou toho, že by mělo být provedeno alespoň šest opakování s exponovanými vzorky. Proměnné odezvy v kontrolní a exponované skupině mohou být analyzovány pomocí statistického testu pro porovnání středních hodnot, např. Studentova t-testu. Jestliže rozptyly obou skupin nejsou shodné, je třeba provést t-test upravený pro nerovnost rozptylů.

43.

Biomasa ve zkušebních nádobách může být vyjádřena v jednotkách náhradního parametru použitého pro měření (např. počet buněk, fluorescence).

44.

Pro vynesení růstových křivek do grafu sestavte tabulku odhadovaných koncentrací biomasy ve zkušebních kulturách a kontrolních kulturách společně s koncentracemi zkušebního materiálu a časy měření zaznamenanými v rozlišení nejméně na celé hodiny. V tomto prvním stadiu mohou být užitečné jak logaritmické, tak lineární stupnice, ale logaritmické stupnice jsou povinné a obecně poskytují lepší zobrazení odchylek ve vzorci růstu během zkušebního období. Nezapomeňte, že exponenciální růst má při vynesení na logaritmické stupnici podobu přímky a že sklon (směrnice) přímky ukazuje specifickou růstovou rychlost.

45.

Po vynesení do grafu prověřte, jestli kontrolní kultury rostou exponenciálně očekávanou rychlostí po celou dobu zkoušky. Kriticky zhodnoťte všechny datové body a vzhled grafů a zkontrolujte, zda v hrubých datech a postupech nejsou chyby. Zejména zkontrolujte všechny body grafu, u nichž se zdá, že se odchylují na základě systematické chyby. Pokud je zřejmé, že lze rozpoznat procesní chyby a/nebo je lze považovat za vysoce pravděpodobné, konkrétní datový bod se označí jako odlehlá hodnota a nebude zahrnut do následné statistické analýzy. (Nulová koncentrace řas v jedné ze dvou nebo tří nádob-replik může ukazovat na to, že nádoba nebyla správně naočkována nebo byla nesprávně vyčištěna.) Důvody pro vyřazení bodu jako odlehlé hodnoty jasně uveďte v závěrečné zprávě. Přijatelnými důvody jsou pouze (vzácné) procesní chyby, a nikoli jen malá preciznost. Statistické postupy pro rozpoznání odlehlé hodnoty mají u tohoto typu problému pouze omezené použití a nemohou nahradit odborné posouzení. Odlehlé hodnoty (takto označené) by nejlépe měly zůstat mezi údaji zobrazenými v jakékoliv následné grafické či tabelární prezentaci dat.

46.

Účelem této zkoušky je stanovit účinky zkoušené chemické látky na růst řas. Tato zkušební metoda popisuje dvě proměnné odezvy, protože jurisdikce v členských zemích mají odlišné preference a právní požadavky. Mají-li být výsledky zkoušky přijatelné ve všech členských zemích, účinky je třeba vyhodnotit pomocí obou proměnných odezvy a) a b) popsaných dále.

a)    Průměrná specifická růstová rychlost : tato proměnná odezvy se vypočítá na základě logaritmického zvýšení biomasy během zkušebního období a vyjádří se v jednotkách za den.

b)    Výtěžek : tato proměnná odezvy je biomasa na konci zkoušky minus počáteční biomasa.

47.

Je třeba uvést, že hodnoty toxicity vypočítané pomocí těchto dvou proměnných odezvy nejsou srovnatelné a při používání výsledků zkoušky se musí vzít tento rozdíl na vědomí. Hodnoty ECx založené na průměrné specifické růstové rychlosti (ErCx) budou všeobecně vyšší než výsledky založené na výtěžku (EyCx), pokud se dodrží zkušební podmínky této zkušební metody, a to vzhledem k matematickému základu příslušných přístupů. Tuto skutečnost nelze vykládat jako rozdíl v citlivosti mezi těmito dvěma proměnnými odezvy; hodnoty jsou jednoduše matematicky odlišné. Koncepce průměrné specifické růstové rychlosti je založena na obecném průběhu exponenciálního růstu řas v nelimitovaných kulturách, u nichž se toxicita odhaduje na základě účinků na růstovou rychlost, aniž by závisela na absolutní úrovni specifické růstové rychlosti kontrolní kultury, na sklonu křivky závislosti koncentrace-odezva nebo na době trvání zkoušky. Naproti tomu výsledky založené na proměnné odezvy ‚výtěžek‘ jsou závislé na všech těchto ostatních proměnných. EyCx závisí na specifické růstové rychlosti druhů řas použitých v každé zkoušce a na maximální specifické růstové rychlosti, která se může lišit u jednotlivých druhů, a dokonce i u různých kmenů řas. Tato proměnná odezvy by se neměla používat pro srovnávání citlivosti na toxické látky mezi druhy řas, nebo dokonce mezi různými kmeny. Přestože se z vědeckého hlediska dává přednost použití průměrné specifické růstové rychlosti pro odhad toxicity, odhady toxicity založené na výtěžku jsou rovněž do této zkušební metody zahrnuty, aby uspokojily současné právní požadavky v některých zemích.

48.

Průměrná specifická růstová rychlost pro konkrétní období se vypočítá jako logaritmické zvýšení biomasy z rovnice pro každou jednotlivou nádobu s kontrolními a exponovanými vzorky:

kde:

Pro každou exponovanou skupinu a kontrolní skupinu vypočítejte střední hodnotu růstové rychlosti a odhady rozptylu.

49.

Vypočítejte průměrnou specifickou růstovou rychlost po celou dobu trvání zkoušky (obvykle 0 až 3 dny), přičemž namísto naměřené počáteční hodnoty použijte jako počáteční hodnotu spíše nominálně naočkovanou biomasu, protože se tímto způsobem obvykle dosáhne větší přesnosti. Jestliže zařízení použité pro měření biomasy umožňuje dostatečně přesné určení nízké biomasy inokula (např. průtokovým cytometrem), pak lze použít naměřenou počáteční koncentraci biomasy. Rovněž vyhodnoťte růstovou rychlost po jednotlivých časových úsecích vypočtenou jako specifické růstové rychlosti pro každý den v průběhu zkoušky (dny 0–1, 1–2 a 2–3) a zkontrolujte, zda růstová rychlost v kontrolním vzorku zůstává konstantní (viz kritéria platnosti, odstavec 11). Významně nižší specifická růstová rychlost v den jedna v porovnání s celkovou průměrnou specifickou růstovou rychlostí může poukazovat na fázi iniciace. Zatímco v kontrolních kulturách lze fázi iniciace minimalizovat a prakticky vyloučit správnou kultivací předkultury, fáze iniciace v exponovaných kulturách může být známkou obnovy po počátečním toxickém stresu nebo známkou snížené expozice vyvolané ztrátou zkoušené chemické látky (včetně sorpce na biomasu řas) po počáteční expozici. Odpovídajícím způsobem lze růstovou rychlost vyhodnocovat v jednotlivých časových úsecích s cílem zhodnotit účinky zkoušené látky, které se vyskytly během expoziční doby. Významné rozdíly mezi růstovou rychlostí v jednotlivých časových úsecích a průměrnou růstovou rychlostí jsou známkou odchylky od konstantního exponenciálního růstu a vyžadují důkladné prozkoumání růstových křivek.

50.

Vypočítejte procentuální inhibici růstové rychlosti u jednotlivých opakování s exponovanými vzorky se vypočítá z rovnice [2]:

kde:

51.

Jestliže se k přípravě zkušebních roztoků používají rozpouštědla, pro výpočet procentuální inhibice by se měly namísto kontrol bez rozpouštědel používat kontroly s rozpouštědly.

52.

Výtěžek se vypočítá jako biomasa na konci zkoušky minus počáteční biomasa pro každou jednotlivou nádobu s kontrolními a exponovanými vzorky. Pro každou zkušební koncentraci a kontrolu vypočítejte střední hodnotu výtěžku a odhady rozptylu. Procentuální inhibici výtěžku ( % Iy) lze vypočítat pro každé opakování s exponovanými vzorky následovně:

kde:

53.

Vyneste procentuální hodnotu inhibice proti logaritmu koncentrace zkušební látky a vynesené body pečlivě prozkoumejte, přičemž neberte v úvahu žádný datový bod, který byl v první fázi vyloučen jako odlehlá hodnota. Od oka nebo pomocí počítačové interpolace proložte datovými body hladkou křivku, abyste získali první dojem o vztahu koncentrace a odezvy; poté přistupte k podrobnější metodě, nejlépe počítačové statistické metodě. V závislosti na zamýšleném použití dat, jakosti (přesnosti) a množství dat, jakož i na dostupnosti nástrojů pro analýzu dat je možné rozhodnout (a někdy je to dostatečně odůvodněno) o ukončení analýzy dat v tomto stadiu a klíčové hodnoty EC50 a EC10 (a/nebo EC20) se jednoduše odečtou z křivky vytvořené od oka (rovněž viz následující bod o stimulačních účincích). Platnými důvody pro nepoužití statistické metody mohou být:

54.

Cílem je získat kvantitativní vztah mezi koncentrací a účinkem pomocí regresní analýzy. Je možné použít váženou lineární regresi po provedení linearizující transformace dat odezvy – například do probitových nebo logitových či Weibullových jednotek (8), ale dává se přednost nelineárním regresním postupům, s jejichž pomocí se lépe zpracovávají nevyhnutelné nepravidelnosti dat a odchylky od hladkých distribucí. Při přiblížení se k nule či úplné inhibici mohou být takové nepravidelnosti zesíleny transformací a rušit při analýze (8). Je třeba uvést, že standardní metody analýzy používající probitové, logitové nebo Weibullovy transformace jsou určeny k použití s kvantálními daty (např. mortalita nebo přežití) a musí se upravit, aby se mohly použít na data růstu či biomasy. Speciální postupy pro stanovení hodnoty ECx ze spojitých dat lze nalézt v literatuře (9, 10 a 11). Použití nelineární regresní analýzy je dále podrobně popsáno v dodatku 5.

55.

Pro každou proměnnou odezvy, která se má analyzovat, se použije vztah koncentrace-odezva pro výpočet bodových odhadů hodnot ECx. Je-li to možné, je zapotřebí určit 95 % intervaly spolehlivosti pro každý odhad. Dobrou shodu dat odezvy s regresním modelem je zapotřebí vyhodnotit buď graficky, nebo statisticky. Regresní analýza by se měla provádět pomocí odezev jednotlivých opakování, nikoliv pomocí středních hodnot exponovaných skupin. Pokud však je proložení nelineární křivky obtížné či neúspěšné kvůli příliš velkému rozptylu dat, lze problém obejít provedením regrese na skupinových středních hodnotách, což je praktický způsob, jak snížit vliv podezřelých odlehlých hodnot. Použití této možnosti je zapotřebí zaznamenat v závěrečné zprávě jako odchylku od normálního postupu v důsledku skutečnosti, že křivka vyhovující jednotlivým opakováním nevedla k uspokojivému výsledku.

56.

Odhady EC50 a intervaly spolehlivosti lze rovněž získat lineární interpolací s bootstrapem (metoda postupného výpočtu) (13), pokud se dostupné regresní modely/metody pro příslušná data nehodí.

57.

Pro odhad LOEC, a tedy i NOEC, a pro účinky zkoušené chemické látky na růstovou rychlost je nezbytné porovnat střední hodnoty exponovaných vzorků pomocí metod analýzy rozptylu (ANOVA). Střední hodnota pro každou koncentraci musí být poté porovnána se střední hodnotou pro kontrolní skupinu, a to vhodnou metodou vícenásobného porovnání nebo metodou zkoušky trendu. Užitečný může být Dunnettův nebo Williamsův test (12, 14, 15, 16, 17). Je nezbytné vyhodnotit, zda je splněn předpoklad homogenity rozptylu nezbytný pro ANOVA. Toto hodnocení lze provádět graficky nebo formálním testem (17). Vhodné jsou testy podle Levenea nebo Bartletta. Nesplnění předpokladu homogenity rozptylů může být někdy korigováno logaritmickou transformací dat. Jestliže je heterogenita rozptylů extrémní a nelze ji napravit transformací, pak je třeba zvážit analýzu takovými metodami, jako je sestupný Jonckheerův trend test. Další pokyny pro stanovení NOEC lze nalézt v (11).

58.

Vědecký vývoj poslední doby vedl k doporučení opustit koncepci NOEC a nahradit ji odhady bodů ECx na základě regresní analýzy. Vhodná hodnota pro x nebyla pro tuto zkoušku pomocí řas stanovena. Zdá se, že vhodné je rozmezí od 10 do 20 % (v závislosti na zvolené proměnné odezvy) a nejlépe by se měly v závěrečné zprávě uvádět jak EC10, tak EC20.

59.

Při nízkých koncentracích bývá někdy pozorována stimulace růstu (negativní inhibice). To může být důsledkem buď hormese (‚toxická stimulace‘), nebo přidání stimulujících růstových faktorů se zkušebním materiálem k minimálnímu použitému médiu. Nezapomeňte, že přidání anorganických živin by nemělo mít žádný přímý účinek, protože zkušební médium by mělo po celou dobu zkoušky udržovat přebytek živin. Stimulaci nízkými dávkami lze ve výpočtech EC50 obvykle ignorovat, pokud není extrémní. Je-li však extrémní nebo má-li být vypočtena hodnota ECx pro nízké x, mohou být zapotřebí speciální postupy. K vymazání stimulačních odezev z analýzy dat by nemělo pokud možno dojít, a pokud dostupný software pro stanovení křivky nemůže drobnou stimulaci přijmout, lze použít lineární interpolaci s bootstrapem. Jestliže je stimulace extrémní, lze zvážit použití modelu předpokládajícího hormesi (18).

60.

Zkušební materiály absorbující světlo mohou způsobit snížení růstové rychlosti, protože stínění snižuje množství dostupného světla. Takové účinky fyzikální povahy je zapotřebí oddělit od toxických účinků, a to úpravou zkušebních podmínek, přičemž takové fyzikální účinky je nutno uvádět v závěrečné zprávě samostatně. Pokyny lze nalézt v literatuře (2 a 3).

61.

V závěrečné zprávě musí být uvedeny tyto údaje:

1)

International Organisation for Standardisation (1993). ISO 8692 Water quality – Algal growth inhibition test.

2)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO/DIS 14442. Water quality – Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waste water.

3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

4)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO 5667-16 Water quality – Sampling – Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

5)

Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.

6)

Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925.

7)

Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073-2079.

8)

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713-718.

9)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.

10)

Bruce, R.D.,and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485-1494.

11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

12)

Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121.

13)

Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

14)

Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.

15)

Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.

16)

Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.

17)

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

18)

Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

1.

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení 209 (2010). Tato zkušební metoda popisuje postup stanovení účinků chemické látky na mikroorganismy z aktivovaného kalu (většinou bakterie) měřením rychlosti jejich dýchání (oxidace uhlíku a/nebo amonia) za definovaných podmínek v přítomnosti různých koncentrací zkoušené chemické látky. Zkušební metoda vychází ze zkoušky ETAD (Ekologická a toxikologická asociace průmyslových výrobců barviv) (1, 2), z předchozího pokynu OECD pro zkoušení 209 (3) a z přepracované normy ISO 8192 (4). Účelem zkoušky je poskytnout rychlou screeningovou metodu posouzení účinků chemických látek na mikroorganismy aktivovaného kalu v biologickém (aerobním) stupni čistíren odpadních vod. Výsledky zkoušky mohou rovněž sloužit jako indikátor vhodných neinhibujících koncentrací zkoušených chemických látek pro použití ve zkouškách biologické rozložitelnosti (například kapitoly C.4 A-F, C.9, C.10, C12 a C.29 této přílohy, Pokyn OECD pro zkoušení 302C). V tomto případě se zkouška může provádět jako screeningový test, podobně jako orientační nebo limitní zkoušky (viz odstavec 39), přičemž se bere v úvahu pouze celková respirace. Avšak tuto informaci je třeba pečlivě zvážit u zkoušek snadné biologické rozložitelnosti (kapitoly C.4 A-F a C.29 této přílohy), u nichž je koncentrace inokula významně nižší než koncentrace používaná v této zkušební metodě. Absence inhibice v této respirační zkoušce samozřejmě nemá automaticky za následek podmínky nulové inhibice u zkoušek snadné biologické rozložitelnosti – kapitoly C.4 A-F nebo C.29 této přílohy.

2.

Obecně se dá říci, že zkouška inhibice dýchání byla od té doby, co byla poprvé publikována, úspěšně aplikována, ovšem za určitých okolností byly uváděny nevěrohodné výsledky, např. (2, 4, 5). Respirační křivky v závislosti na koncentraci jsou někdy dvoufázové, grafy dávka-odezva byly zkreslené a hodnoty EC50 byly neočekávaně nízké (5). Zkoumání ukázala, že takové výsledky se získají, když se aktivovaný kal použitý ve zkoušce významně nitrifikuje a zkoušená chemická látka má větší účinek na oxidaci amonia než na obecnou heterotrofní oxidaci. Proto mohou být tyto nevěrohodné výsledky upřesněny provedením dodatečných zkoušek za použití specifického inhibitoru nitrifikace. Měřením rychlostí příjmu kyslíku za přítomnosti takového inhibitoru a ze jeho nepřítomnosti, např. N-allylthiomočoviny (ATU), je možné vypočítat odděleně celkovou, heterotrofní a nitrifikační rychlost příjmu kyslíku (4, 7, 8). Takto lze stanovit inhibiční účinky zkoušené chemické látky ve dvou procesech a je možné obvyklým způsobem vypočítat hodnoty EC50 jak pro oxidaci organického uhlíku (heterotrofní), tak pro oxidaci amonia (nitrifikační). Je třeba poznamenat, že v některých vzácných případech může být účinek inhibice N-allylthiomočoviny částečně nebo úplně neutralizován v důsledku komplexace se zkoušenými chemickými látkami nebo s látkami obohacujícími médium, např. ionty Cu++ (6). Ionty Cu++ jsou nepostradatelné pro bakterie rodu Nitrosomonas, ale ve vyšších koncentracích jsou toxické.

3.

Potřeba nitrifikace v aerobním čištění odpadních vod jako nezbytného kroku v procesu odstranění dusíkatých sloučenin z odpadních vod cestou denitrifikace na plynné produkty se stala naléhavou zejména v evropských zemích; EU nyní stanovila nižší limity pro koncentrace dusíku ve vyčištěných odpadech vypouštěných do vodních toků (5).

4.

Ve většině případů je metoda hodnocení účinku pouze na procesy oxidace organicky vázaného uhlíku postačující. Avšak v některých případech jsou zkoumání účinku na samotnou nitrifikaci nebo jak na nitrifikaci, tak na oxidaci organického uhlíku odděleně potřebná pro interpretaci výsledů a pochopení účinků.

5.

Respirační rychlosti vzorků aktivovaného kalu vyživovaného syntetickými odpadními vodami se měří v uzavřené nádobě s kyslíkovou elektrodou po kontaktní době 3 hodin. Při uvážení realistického expozičního scénáře mohou být vhodné delší kontaktní časy. Jestliže se zkoušená chemická látka rychle rozkládá, např. abiotickou hydrolýzou, nebo je těkavá a její koncentraci nelze dostatečně udržovat, je možné dodatečně použít kratší expoziční dobu, např. 30 minut. Citlivost každé dávky aktivovaného kalu je třeba prověřit s vhodnou referenční chemickou látkou v den expozice. Zkouška se obvykle používá pro stanovení ECx (např. EC50) zkoušené chemické látky a/nebo koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC).

6.

Inhibice příjmu kyslíku mikroorganismy oxidujícími organický uhlík může být vyjádřena odděleně od inhibice mikroorganismy oxidujícími amonium prostřednictím měření rychlostí příjmu kyslíku za nepřítomnosti a přítomnosti N-allylthiomočoviny, což je specifický inhibitor oxidace amonia na dusitan nitrifikačními bakteriemi v prvním stupni. V tomto případě se procentuální inhibice rychlosti příjmu kyslíku vypočítá porovnáním rychlosti příjmu kyslíku za přítomnosti zkoušené chemické látky se střední hodnotou rychlosti příjmu kyslíku odpovídajících kontrolních vzorků neobsahujících žádnou zkoušenou chemickou látku jak v přítomnosti, tak i v nepřítomnosti specifického inhibitoru N-allylthiomočoviny.

7.

Jakýkoli příjem kyslíku pocházející z abiotických procesů se dá detekovat stanovením rychlosti ve směsích zkoušené chemické látky, média syntetických odpadních vod a vody, s vynecháním aktivovaného kalu.

8.

Pro správnou interpretaci výsledků, která má být provedena, by měla být známa identifikace (nejlépe číslo CAS), název (IUPAC), čistota zkoušené chemické látky, její rozpustnost ve vodě, tlak par a adsorpční vlastnosti. Těkavé chemické látky se obvykle nemohou přiměřeně zkoušet, pokud se nepřijmou speciální opatření (viz odstavec 21).

9.

Zkušební metodu je možné použít na chemické látky rozpustné ve vodě, obtížně rozpustné a těkavé chemické látky. Avšak ne vždy je možné získat hodnoty EC50 pro chemické látky s omezenou rozpustností a platné výsledky s těkavými chemickými látkami je možné získat pouze za předpokladu, že větší část (řekněme > 80 %) zkoušené chemické látky zůstane v reakční směsi na konci doby expozice. V případě, že existuje jakákoli nejistota ohledně stability zkoušené chemické látky nebo její těkavosti, měly by být předloženy další podpůrné analytické údaje, aby se upřesnila ECx koncentrace.

10.

Referenční chemické látky se musí pravidelně zkoušet, aby se zajistilo, že zkušební metoda a podmínky jsou spolehlivé, a prověřila citlivost každé dávky aktivovaného kalu použité jako mikrobiální inokulum v den expozice. Chemická látka 3,5-dichlorfenol (3,5-DCP) je doporučena jako referenční inhibiční chemická látka, jelikož se jedná o známý inhibitor dýchání a používá se v různích druzích zkoušek inhibice/toxicity (4). Rovněž síran měďnatý pentahydrát se dá použít jako referenční chemická látka pro inhibici celkové respirace (9). N-methylanilin lze použít jako specifický referenční inhibitor nitrifikace (4).

11.

Rychlost příjmu kyslíku u slepých zkoušek (bez zkoušené chemické látky nebo referenční chemické látky) by neměla být nižší než 20 mg kyslíku na 1 g aktivovaného kalu (hmotnost sušiny suspendovaných pevných látek) za hodinu. Je-li rychlost nižší, je třeba zkoušku opakovat s vypraným aktivovaným kalem nebo s kalem z jiného zdroje. Variační koeficient rychlosti příjmu kyslíku v kontrolních opakovaných zkouškách by neměl být vyšší než 30 % na konci hlavní zkoušky.

12.

Při mezinárodním okružním testu organizovaném ISO v roce 2004 (4) za použití aktivovaného kalu získaného z domácích odpadních vod bylo zjištěno, že EC50 3,5-DCP leží v rozsahu 2 mg/l až 25 mg/l pro celkovou respiraci, 5 mg/l až 40 mg/l pro heterotrofní respiraci a 0,1 mg/l až 10 mg/l pro nitrifikační respiraci. V případě, že EC50 3,5-DCP neleží v očekávaném rozsahu, je třeba zkoušku opakovat s aktivovaným kalem z jiného zdroje. EC50 pentahydrátu síranu měďnatého by měl spadat do rozsahu 53–155 mg/l pro celkovou respiraci (9).

13.

Použije se běžné laboratorní vybavení a následující pomůcky:

14.

Při zkouškách se musí zásadně používat činidla analytické čistoty.

15.

Musí se použít destilovaná nebo deionizovaná voda obsahující méně než 1 mg/l DOC (rozpuštěný organický uhlík) s výjimkou případů, kdy je předepsána voda z vodovodu bez chlóru.

16.

Médium se musí připravit tak, aby obsahovalo následující složky v uvedených množstvích:

17.

pH tohoto roztoku by mělo být 7,5 ± 0,5. Jestliže se připravené médium nepoužije ihned, musí se skladovat v temnu při 0–4 °C po dobu maximálně 1 týdne nebo za podmínek, kdy se nemění jeho složení. Je třeba poznamenat, že tato syntetická odpadní voda má 100násobnou koncentraci oproti vodě popsané v technické zprávě OECD ‚Návrh metody stanovení biologické rozložitelnosti povrchově aktivních látek používaných v syntetických detergentech‘ (11. června 1976), s přídavkem hydrogenfosforečnanu draselného.

18.

Alternativně se mohou složky média sterilizovat jednotlivě před skladováním nebo se krátce před provedením zkoušky může přidat pepton a masový extrakt. Před použitím se musí médium důkladně promíchat a je-li třeba, pH upravit na 7,5 ± 0,5.

19.

Zásobní roztok se musí připravit pro zkoušené látky snadno rozpustné ve vodě až do maximální rozpustnosti ve vodě (nesmí dojít k vysrážení). Látky špatně rozpustné ve vodě, směsi se složkami o rozdílné rozpustnosti ve vodě a adsorbující se látky se musí navážit přímo do zkušebních nádob. V těchto případech je možné použít zásobní roztoky, jestliže koncentrace rozpuštěných zkoušených chemických látek jsou analyticky stanoveny ve zkušebních nádobách (před přidáním aktivovaného kalu). Jestliže se připravují upravené frakce WAF, je rovněž důležité provést analytické stanovení koncentrací rozpuštěných zkoušených chemických látek ve zkušebních nádobách. Použití organických rozpouštědel, dispergátorů/emulgátorů ke zlepšení rozpustnosti je nepřípustné. Zpracování zásobních roztoků ultrazvukem a předmícháním suspenzí, např. přes noc, je možné, jestliže jsou k dispozici adekvátní informace ohledně stability zkoušené chemické látky za takovýchto podmínek.

20.

Zkoušená chemická látka může negativně ovlivnit pH zkušebního systému. Hodnota pH zkoušených chemicky zpracovaných směsí se musí stanovit před sestavením zkoušky v předběžném pokusu, aby se zjistilo, zda bude třeba úprava pH před hlavní zkouškou a znovu v den hlavní zkoušky. Před přidáním inokula je třeba roztoky/suspenze zkoušené chemické látky ve vodě podle potřeby neutralizovat. Protože ale neutralizace může pozměnit chemické vlastnosti chemické látky, mohou být v závislosti na účelu studie provedeny další zkoušky, aby se vyhodnotil účinek zkoušené chemické látky na kal bez úpravy pH.

21.

Toxické účinky těkavých chemických látek, zejména u zkoušek, při kterých vzduch probublává skrz systém, mohou vyústit do různých úrovní působení v důsledku ztrát látky během expozice. Při práci s takovými látkami je třeba postupovat obezřetně a provádět látkově specifickou analýzu kontrolních směsí obsahujících danou látku a měnit režim provzdušňování.

22.

Je-li 3,5-dichlorfenol použit jako referenční chemická látka, je třeba připravit roztok 1,00 g 3,5-dichlorfenolu v 1 000 ml vody (15). Pro urychlení rozpouštění je třeba použít teplou vodu a/nebo tzv. ultrazvukovou lázeň. Po ochlazení na laboratorní teplotu se roztok doplní na daný objem. Je však třeba zajistit, aby referenční chemická látka nedoznala strukturních změn. pH roztoku se musí kontrolovat a podle potřeby upravit použitím NaOH nebo H2SO4 na pH 7–8.

23.

Jestliže se jako referenční chemická látka použije síran měďnatý pentahydrát, použijí se koncentrace 58 mg/l, 100 mg/l a 180 mg/l (faktor 1,8). Látka se naváží přímo do zkušebních nádob (29 – 50 – 90 mg na celkový objem 500 ml). Pak se rozpustí v 234 ml vody z vodovodu upravené v autoklávu. Síran měďnatý pentahydrát je snadno rozpustný. Na začátku zkoušky se přidá 16 ml syntetické odpadní vody a 250 ml aktivovaného kalu.

24.

Připraví se zásobní roztok 2,32 g/l N-allylthiomočoviny (ATU). 2,5 ml tohoto zásobního roztoku se přidá do inkubační směsi o konečném objemu 500 ml, čímž se dosáhne konečné koncentrace 11,6 mg ATU/l (10– 4 mol/l), která je, jak známo (4), dostatečná, aby způsobila 100 % inhibici nitrifikace v nitrifikujícím aktivovaném kalu, který obsahuje 1,5 g/l suspendovaných pevných látek.

25.

Za určitých vzácných podmínek může zkoušená chemická látka se silnými redukčními vlastnostmi způsobit měřitelnou spotřebu kyslíku při abiotickém rozkladu. V takových případech jsou nezbytné abiotické kontroly, aby se dalo rozlišit mezi příjmem kyslíku zkoušenou chemickou látkou způsobeným abiotickým rozkladem a mikrobiálním dýcháním. Abiotický kontrolní vzorek je možné připravit vynecháním inokula ze zkušebních směsí. Podobně je možné zařadit abiotické kontroly bez inokula, když se provedou podpůrná analytická měření pro stanovení dosažené koncentrace během expoziční fáze zkoušky, např. když se použijí zásobní roztoky chemických látek špatně rozpustných ve vodě se složkami o rozdílné rozpustnosti ve vodě. Ve speciálních případech může být zapotřebí připravit abiotickou kontrolu se sterilizovaným inokulem (např. v autoklávu nebo přidáním sterilizačních toxických látek). Některé chemické látky mohou produkovat nebo spotřebovávat kyslík, pouze je-li povrch dostatečně velký pro reakci, i když obvykle k tomu potřebují daleko vyšší teplotu nebo tlak. V tomto ohledu je třeba věnovat speciální pozornost látkám s peroxy skupinou. Sterilizované inokulum poskytuje veliký povrch.

26.

Pro obecné použití je třeba shromáždit aktivovaný kal na výstupu z provzdušňovací nádrže nebo v blízkosti výstupu z nádrže dobře provozované čistírny odpadních vod, do které přicházejí především odpadní vody z domácností. V závislosti na účelu zkoušky lze rovněž použít jiné postačující druhy nebo zdroje aktivovaného kalu, např. kal vypěstovaný v laboratoři, a to s vhodnými koncentracemi suspendovaných pevných látek ve výši 2 g/l až 4 g/l. Avšak kaly z rozdílných čistíren odpadních vod často vykazují rozdílné charakteristiky a citlivosti.

27.

Kal se dá použít tak, jak je sebrán, ale hrubé částice se musí odstranit usazením po krátkou dobu, např. 5 až 15 minut, a dekantací horní vrstvy jemnějších pevných částic nebo prosetím (např. přes síto s otvory o ploše 1 mm2). Alternativně je možné kal homogenizovat mísením po dobu cca 15 s nebo delší, ale pozornost je třeba věnovat třecím silám a teplotním změnám, které se mohou vyskytnout při dlouhodobém mísení.

28.

Často je nezbytné kal promýt, např. je-li rychlost endogenní respirace nízká. Kal je nejdříve třeba odstřeďovat po určitou dobu, aby se získal čirý supernatant a granule pevných částic odpadních vod, např. 10 minut při odstředivém zrychlení cca 10 000 m/s2. Kapalný supernatant se slije a kal se resuspenduje v nechlórované vodě z vodovodu, protřepe a promývací voda se pak odstraní opětovným odstředěním a slitím. Proces promývání a odstřeďování se musí podle potřeby opakovat. Stanoví se hmotnost sušiny o známém objemu resuspendovaného kalu a kal se zkoncentruje odstraněním kapaliny nebo dále zředí v bezchlórové vodě z vodovodu, aby se získal kal s požadovanou koncentrací pevných částic 3 g/l. Aktivovaný kal se musí nepřetržitě provzdušňovat (např. 2 l/min) při zkušební teplotě, a je-li to možné, použít v den odebrání. Není-li to možné, musí se do kalu denně přidávat syntetická odpadní voda (přívod 50 ml syntetické odpadní vody na litr aktivovaného kalu) po dva další dny. Kal se pak použije ve zkoušce a výsledky jsou přijaty jako platné za předpokladu, že se nevyskytnou žádné významné změny v jeho aktivitě, zjištěné stanovením jeho rychlosti endogenní heterotrofní respirace a nitrifikační respirace.

29.

Potíže mohou nastat, jestliže se během inkubace vyskytne pěnění takového rozsahu, že jsou pěna a na ní zachycené pevné částice kalu vypuzovány z provzdušňovacích nádob. Občas může být pěnění jednoduše následkem přítomnosti syntetické odpadní vody, ale pěnění se dá očekávat, je-li zkoušená chemická látka surfaktant nebo ho obsahuje. Ztráta pevných částic kalu ze zkušebních směsí bude mít za následek uměle sníženou respirační rychlost, která může být chybně interpretována jako důsledek inhibice. Kromě toho se provzdušňováním roztoku surfaktantu surfaktant zkoncentruje ve vrstvě pěny; ztrátou pěny ze zkušebního systému se sníží expoziční koncentrace. Pěnění se dá regulovat jednoduchými mechanickými metodami (např. občasným ručním zamícháním za použití skleněné tyčinky) nebo přidáním silikonového emulgačního odpěňovacího činidla neobsahujícího surfaktant a/nebo použitím metody provzdušňování v třepací lahvi. Je-li problém spojen s přítomností syntetické odpadní vody, je třeba složení odpadní vody upravit přidáním odpěňovacího činidla rychlostí např. 50 μl/l. Je-li pěnění způsobeno zkoušenou chemickou látkou, musí se množství potřebné k potlačení stanovit při maximální zkoušené koncentraci a pak je třeba stejným způsobem ošetřit všechny jednotlivé provzdušňovací nádoby (včetně např. nádob se slepými a referenčními vzorky, ve kterých se pěna nevyskytuje). Jestliže se používají odpěňovací činidla, nesmí dojít k žádné interakci s inokulem a/nebo zkoušenou chemickou látkou.

30.

Je možné stanovit inhibici tří rozdílných příjmů kyslíku, celkového, pouze heterotrofního a pocházejícího z nitrifikace. Obvykle by mělo stačit měření celkové inhibice příjmu kyslíku. Stanovení účinků na heterotrofní příjem kyslíku spojený s oxidací organického uhlíku a v důsledku oxidace amonia je nutné tehdy, jsou-li požadovány konkrétně tyto dva oddělené koncové ukazatele pro příslušnou chemickou látku nebo (volitelně) za účelm vysvětlení atypických křivek dávka-odezva z inhibice celkového příjmu kyslíku.

31.

Zkoušku je třeba provádět při teplotě v rozsahu 20 ± 2 °C.

32.

Zkoušené směsi (FT jako v tabulce 1) obsahující vodu, syntetickou odpadní vodu a zkoušenou chemickou látku se připraví tak, aby se získaly rozdílné nominální koncentrace zkoušené chemické látky (viz tabulka 1 – příklad objemů složek). pH se podle potřeby nastaví na 7,5 ± 0,5; směsi se zředí vodou a přidá se inokulum, čímž se dosáhne stejných konečných objemů v nádobách a začne provzdušňování.

33.

Referenční směsi (FR) se připraví stejným způsobem jako zkoušené směsi, přičemž se referenční chemická látka, např. 3,5-dichlorfenol, použije namísto zkoušené chemické látky.

34.

Slepé směsi (FB) se připraví na začátku a na konci doby expozice při zkouškách, ve kterých jsou zkušební kádinky uspořádány postupně v intervalech. Ve zkouškách prováděných s vybavením, které umožňuje simultánní měření spotřeby kyslíku, je třeba zahrnout do každé dávky pro simultánní analýzu alespoň dva slepé vzorky. Slepé vzorky obsahují stejné objemy aktivovaného kalu a syntetického média, ale žádnou zkušební chemickou látku nebo referenční chemickou látku. Tyto vzorky se zředí vodou na stejný objem jako zkoušené a referenční směsi.

35.

Je-li to nezbytné, například je-li o zkoušené chemické látce známo nebo u ní existuje podezření, že má silné redukční vlastnosti, je třeba připravit směs FA pro měření abiotické spotřeby kyslíku. Směs musí obsahovat stejné množství zkoušené chemické látky i syntetické odpadní vody a musí mít stejný objem jako zkoušené směsi, ale neobsahuje aktivovaný kal.

36.

Zkoušené směsi, referenční směsi a slepé vzorky a abiotické kontrolní vzorky se inkubují při zkušební teplotě za podmínek nuceného provzdušňování (0,5 až 1 l/min), aby se koncentrace rozpuštěného kyslíku udržovala nad hranicí 60–70 % saturace a aby se vločky kalu udržely v suspenzi. Rovněž je nezbytné kultury míchat, aby se vločky kalu udržely v suspenzi. Za začátek inkubace se považuje počáteční kontakt inokula aktivovaného kalu s ostatními složkami konečné směsi. Na konci inkubace, po dané expoziční době obvykle 3 hodin, se vzorky vyjmou pro změření rychlosti poklesu koncentrace rozpuštěného kyslíku v kyvetě konstruované pro tento účel (obr. 2 v dodatku 3) nebo ve zcela naplněné BSK láhvi. Způsob zahájení inkubací rovněž závisí na možnostech zařízení použitého k měření rychlostí spotřeby kyslíku. Například jestliže zařízení obsahuje jedinou kyslíkovou sondu, provádějí se měření jednotlivě. V tomto případě se musí připravit různé směsi potřebné pro zkoušku se syntetickou odpadní vodou, ale inokulum se nepoužije a předepsané dávky kalu se přidají do každé nádoby série. Jednotlivé inkubace je třeba zahájit postupně, ve vhodných časových intervalech, např. 10 až 15 minut. Alternativně může měřicí systém zahrnovat řadu sond, které umožňují mnohočetná simultánní měření; v tomto případě se může inokulum přidat současně do příslušných skupin nádob.

37.

Koncentrace aktivovaného kalu ve všech zkoušených, referenčních a slepých (ale ne abiotických kontrolních) směsích je nominálně 1,5 g/l suspendovaných pevných látek. Spotřeba kyslíku se měří po 3 hodinách expozice. Další měření expozice po 30 minutách se provádí podle potřeby postupem dříve popsaným v odstavci 5.

38.

Aby se rozhodlo, zda kal nitrifikuje, a jestliže ano, tak jakou rychlostí, připraví se směsi (FB) jako ve slepých a dalších ‚kontrolních‘ směsích (FN), které však rovněž obsahují N-allylthiomočovinu v koncentraci 11,6 mg/l. Směsi je třeba provzdušňovat a inkubovat při 20° ± 2 °C po dobu 3 hodin. Pak se změří rychlosti příjmu kyslíku a vypočítá se rychlost příjmu kyslíku v důsledku nitrifikace.

39.

Podle potřeby se používá předběžná zkouška pro odhad rozsahu koncentrací zkoušené chemické látky potřebného v hlavní zkoušce stanovení inhibice spotřeby kyslíku. Alternativně může absence inhibice spotřeby kyslíku zkoušenou chemickou látkou v předběžné zkoušce ukazovat, že hlavní zkouška není nezbytná, ale je třeba zařadit trojmo opakovanou zkoušku při nejvyšší zkoušené koncentraci v předběžné zkoušce (obvykle 1 000 mg/l, ale v závislosti na požadavcích na data).

Tabulka 1

Příklady směsí pro předběžnou zkoušku

40.

Zkouška se provádí použitím alespoň tří koncentrací zkoušené chemické látky, například 10 mg/l, 100 mg/l a 1 000 mg/l, se slepým vzorkem a podle potřeby alespoň se třemi abiotickými kontrolními vzorky s nejvyššími koncentracemi zkoušené chemické látky (viz jako příklad tabulku 1). V ideálním případě by nejnižší koncentrace neměla mít žádný vliv na spotřebu kyslíku. Je-li to náležité, vypočítá se rychlost příjmu kyslíku a rychlost nitrifikace; pak se vypočítá procentuální inhibice. V závislosti na účelu zkoušky je rovněž možné jednoduše stanovit toxicitu koncentračního limitu, např. 1 000 mg/l. Jestliže se při této koncentraci neprojeví žádný statisticky významný toxický účinek, není další zkoušení při vyšších nebo nižších koncentracích nezbytné. Nutno poznamenat, že látky obtížně rozpustné ve vodě, směsi se složkami o rozdílné rozpustnosti ve vodě a adsorbenty je třeba navážit přímo do zkušebních nádob. V tomto případě se objem rezervovaný pro zásobní roztok zkoušené látky nahradí zřeďovací vodou.

41.

Zkouška se provádí použitím rozsahu koncentrací zjištěných předběžnou zkouškou. Aby se získaly hodnoty jak NOEC tak ECx (např. EC50), doporučuje se ve většině případů šest kontrolních a pět exponovaných koncentrací v geometrické posloupnosti s pěti opakovanými vzorky. Zkouška s abiotickým kontrolním vzorkem se nemusí opakovat, jestliže v předběžné zkoušce nebyl zjištěn žádný příjem kyslíku. Jestliže se však významný příjem vyskytne, je třeba abiotické kontroly provést pro každou koncentraci zkoušené chemické látky. Citlivost kalu se musí prověřovat použitím referenční chemické látky, 3,5-dichlorfenolu. Citlivost kalu se musí prověřovat pro každou sérii zkoušek, neboť o citlivosti je známo, že kolísá. Ve všech případech se pro měření rychlosti příjmu kyslíku v kyvetě s kyslíkovou elektrodou vzorky odeberou ze zkušebních nádob po 3 hodinách a podle potřeby po dalších 30 minutách. Ze shromážděných údajů se vypočítají specifické respirační rychlosti kontrolních a zkoušených směsí; procentuální inhibice se pak vypočítá z rovnice 7 níže.

42.

Použití specifického inhibitoru nitrifikace ATU umožňuje přímé hodnocení inhibičních účinků zkoušené chemické látky na heterotrofní oxidaci; odečtením rychlosti příjmu kyslíku v přítomnosti ATU od celkové rychlosti příjmu (bez ATU) se dá vypočítat vliv na rychlost nitrifikace. Připraví se dva soubory reakčních směsí podle upořádání zkoušky pro ECx nebo NOEC podle popisu v odstavci 41, ale navíc se ATU přidá do každé směsi jednoho souboru v konečné koncentraci 11,6 mg/l, která jak známo úplně inhibuje nitrifikaci v kalu s koncentracemi suspendovaných pevných látek do 3 000 mg/l (4). Rychlosti příjmu kyslíku se měří po expoziční době; tyto přímé hodnoty představují pouze heterotrofní respiraci a rozdíly mezi nimi a odpovídajícími rychlostmi celkové respirace představují nitrifikaci. Pak se vypočítají různé stupně inhibice.

43.

Po dané době expozice se vzorek z první provzdušňovací nádoby přemístí do kyvety s kyslíkovou elektrodou (obr. 1 v dodatku 2) a ihned se změří koncentrace rozpuštěného kyslíku. Jestliže je k dispozici systém s více elektrodami, pak se měření může provádět simultánně. Míchání (použitím magnetu s krytem) je zásadní při stejné rychlosti, jaká se použila při kalibraci elektrody, aby se zajistilo, že sonda bude reagovat s minimálním zpožděním na měnící se koncentrace kyslíku a že bude umožněno pravidelné a reprodukovatelné měření kyslíku v měřicí nádobě. Obvykle postačí systém se samomíchací sondou užívaný s některými kyslíkovými elektrodami. Mezi měřeními se kyveta vypláchne vodou. Alternativně se může vzorek použít pro naplnění BSK lahve (obr. 2 v dodatku 3) vybavené magnetickou míchačkou. Do hrdla lahve se pak vloží kyslíková sonda s redukční objímkou a spustí se magnetická míchačka. V obou případech se koncentrace rozpuštěného kyslíku kontinuálně měří a zaznamenává v určitých intervalech, obvykle 5 až 10 minut, nebo dokud koncentrace kyslíku neklesne pod 2 mg/l. Elektroda se vyjme, směs se vrátí do provzdušňovací nádoby a provzdušňování a míchání pokračuje, jestliže je měření po delší expozici nezbytné.

44.

Pro některé účely se může ukázat nezbytné měřit koncentraci zkoušené chemické látky ve zkušebních nádobách. Je třeba vzít na vědomí, že používají-li se zásobní roztoky:

není rozpuštěná frakce známá, a tudíž není známá skutečná koncentrace zkoušené chemické látky převáděné do zkušebních nádob. Pro charakterizaci expozice je nezbytné analyticky odhadnout koncentrace zkoušené chemické látky ve zkušebních nádobách. Situace se zjednoduší, když se analytický odhad provede před přidáním inokula. Vzhledem ke skutečnosti, že do zkušebních nádob budou převedeny pouze rozpuštěné frakce, mohou být měřené koncentrace velmi nízké.

45.

Aby se předešlo časově a finančně náročným analýzám, doporučuje se jednoduše navážit zkoušenou chemickou látku přímo do zkušebních nádob a následné výpočty vztahovat k počáteční navážené nominální koncentraci. Rozlišení mezi rozpuštěnou, nerozpuštěnou nebo adsorbovanou frakcí zkoušené chemické látky není nutné, protože všechny tyto frakce se stejně v reálných podmínkách vyskytují v čistírnách odpadních vod a tyto frakce se mohou měnit v závislosti na složení odpadních vod. Cílem zkušební metody je odhadnout neinhibiční koncentraci reálně a není účelné zkoumat detailně, které frakce přispívají k inhibici organismů aktivovaného kalu. Také adsorptivní látky by se měly navážit přímo do zkušebních nádob a nádoby by se měly silanizovat, aby se minimalizovaly ztráty v důsledku adsorpce.

46.

Rychlosti příjmu kyslíku se vypočítají ze středních hodnot naměřených hodnot, např. z lineární části grafů závislosti koncentrace kyslíku na čase, které omezují výpočty na koncentrace kyslíku mezi 2,0 mg/l a 7,0 mg/l, jelikož vyšší a nižší koncentrace mohou samy o sobě ovlivnit rychlosti spotřeby. Práce s koncentracemi v pásmu pod nebo nad těmito hodnotami jsou občas nevyhnutelné a nezbytné, například jestliže je respirace silně potlačena a v důsledku toho velmi pomalá nebo jestliže respirace příslušného aktivovaného kalu velmi rychlá. To je akceptovatelné za předpokladu, že i tato rozšíření příjmového grafu jsou lineární a jejich směrnice se nemění při přechodu přes hranici 2,0 mg/l nebo 7,0 mg/l O2. Jakékoli zakřivené sekce grafu naznačují, že se měřicí systém stabilizuje nebo že se rychlost příjmu mění, a neměly by se používat pro výpočet respiračních rychlostí. Rychlost příjmu kyslíku se vyjádří v miligramech na litr a hodinu (mg/l.h) nebo v miligramech na gram suchého kalu a hodinu (mg/g.h). Rychlost spotřeby kyslíku R v mg/l.h lze vypočítat nebo interpolovat z přímkové části zaznamenaného grafu poklesu kyslíku podle rovnice 1:

kde:

47.

Specifická respirační rychlost (Rs) se vyjadřuje jako množství spotřebovaného kyslíku na gram sušiny kalu za hodinu (mg/g.h) podle rovnice 2:

kde SS je koncentrace suspendovaných pevných látek ve zkoušené směsi (g/l).

48.

Rozdílné indexy R, které se mohou kombinovat, jsou:

49.

Vztah mezi celkovou respirací (RT), nitrifikační respirací (RN) a heterotrofní respirací (RH) je dán rovnicí 3:

kde:

50.

Tento vztah je platný pro hodnoty slepých zkoušek (RNB, RTB, RHB), abiotické kontrolní vzorky (RNA, RTA, RHA) a zkoušky se zkoušenou chemickou látkou (RNS, RTS, RHS) (mg/g.h). Specifické respirační rychlosti se vypočítají z:

51.

Jestliže RN je nevýznamné (např. < 5 % RT ve slepých zkouškách) v předběžné zkoušce, dá se předpokládat, že heterotrofní příjem kyslíku bude roven celkovému příjmu a že nedochází k žádné nitrifikaci. Alternativní zdroj aktivovaného kalu by byl potřebný, jestliže by se při zkouškách braly v úvahu účinky na heterotrofní a nitrifikační mikroorganismy. Hlavní zkouška se provádí, jestliže existuje důkaz o potlačených rychlostech příjmu kyslíku s rozdílnými koncentracemi zkoušené chemické látky.

52.

Procentuální inhibice IT celkové spotřeby kyslíku při každé koncentraci zkoušené chemické látky je dána rovnicí 7:

53.

Podobně je procentuální inhibice heterotrofního příjmu kyslíku IH při každé koncentraci zkoušené chemické látky dána rovnicí 8:

54.

A konečně inhibice příjmu kyslíku způsobená nitrifikací IN při každé koncentraci je dána rovnicí 9:

55.

Procentuální inhibice příjmu kyslíku se vynese proti logaritmu koncentrace zkoušené chemické látky (inhibiční křivka, viz obr. 3 v dodatku 4). Inhibiční křivky se vynesou pro každý tříhodinový interval provzdušňování nebo navíc po 30 min. Koncentrace zkoušené chemické látky, která inhibuje příjem kyslíku z 50 % (EC50), se vypočítá nebo interpoluje z grafu. Jestliže jsou k dispozici vhodná data, mohou se vypočítat nebo interpolovat 95 % meze spolehlivosti EC50, směrnice křivky, vhodné hodnoty označující začátek inhibice (například EC10 nebo EC20) a konec rozsahu inhibice (například EC80 nebo EC90).

56.

Je třeba poznamenat, že s ohledem na variabilitu často pozorovanou ve výsledcích může být v mnoha případech postačující vyjádřit výsledky dodatečně v řádech, například:

57.

Hodnoty ECx, včetně s nimi spojené dolní a horní 95 % meze spolehlivosti pro parametr, se vypočítají použitím vhodných statistických metod (např. probit analýzou, logistickou nebo Weibullovou funkcí, upravenou Spearman-Karberovou metodou nebo jednoduchou interpolací (11)). ECx se získá zadáním hodnoty odpovídající x % střední hodnoty kontroly do zjištěné rovnice. Při výpočtu EC50 nebo jakékoli další ECx se střední hodnoty pro danou expozici (x) podrobí regresní analýze.

58.

Jestliže se ke stanovení NOEC má použít statistická analýza, je třeba mít statistické hodnoty pro každou nádobu (jednotlivé nádoby se považují za opakované pokusy). Poté se použijí vhodné statistické metody podle dokumentu OECD ‚Současné přístupy ke statistické analýze dat týkajících se ekotoxicity: pokyny pro aplikaci‘ (11). Obecně se nepříznivé účinky zkoušené chemické látky ve srovnání s kontrolou zkoumají použitím jednostranného (menšího) testu statistické hypotézy na p ≤ 0,05.

59.

Závěrečná zpráva musí obsahovat následující informace:

1)

Brown, D., Hitz, H.R. and Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245-261.

2)

King, E. F. and Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27-39.

3)

OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

4)

ISO (2007). ISO 8192 Water Quality- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, International Organization for Standardization.

5)

Bealing, D. J. (2003). Document ISO/TC147/WGI/N.183, International Organization for Standardization.

6)

Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471-483.

7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.

8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

9)

Fiebig S. and Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test – acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.

10)

ISO (1995). ISO 10634 Water Quality – Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, International Organization for Standardization.

11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.

1.

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení 221 (2006). Tato zkušební metoda je určena k hodnocení toxicity chemických látek pro sladkovodní rostliny rodu Lemna (okřehek). Je založena na existujících metodách (1, 2, 3, 4, 5, 6), ale zahrnuje úpravy těchto metod, aby odrážela nejnovější výsledky výzkumu a konzultace v řadě klíčových otázek. Navrhovaná metoda byla validována mezinárodní okružní zkouškou (7).

2.

Tato zkušební metoda popisuje zkoušení toxicity pomocí druhů Lemna gibba a Lemna minor, které byly oba rozsáhle studovány a jsou předmětem shora uvedených norem. Taxonomie druhů Lemna spp. je obtížná, přičemž ji komplikuje existence široké škály fenotypů. Ačkoliv se u druhů Lemna může vyskytnout genetická variabilita v odezvě na toxické látky, není v současnosti dostatek údajů o zdroji této variability, aby mohl být pro použití v rámci této metody doporučen specifický klon. Je třeba uvést, že zkouška se neprovádí axenicky (jednodruhově), ale v jednotlivých stupních během zkušebního procesu se provádí opatření pro udržení kontaminace jinými organismy na minimální úrovni.

3.

Podrobně se popisuje zkoušení s obnovením (semistatické a průtokové) a bez obnovení (statické) zkušebního roztoku. V závislosti na cílech zkoušky a právních požadavcích se doporučuje zvážit použití semistatických a průtokových metod, například pro chemické látky, které se z roztoku rychle ztrácejí v důsledku odpaření, fotodegradace, srážení nebo biologické rozložitelnosti. Další pokyny jsou uvedeny v (8).

4.

Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.

5.

Exponenciálně rostoucí kultury rostlin rodu Lemna se po dobu sedmi dnů nechají růst jako monokultury v různých koncentracích zkoušené látky. Cílem zkoušky je kvantifikovat účinky související s chemickou látkou na vegetativní růst během tohoto období, a to na základě hodnocení zvolených proměnných měření. Primární proměnnou měření je počet lístků. Rovněž se měří nejméně jedna další proměnná měření (celková plocha lístků, hmotnost sušiny nebo čerstvá hmotnost), protože některé chemické látky mohou ovlivňovat jiné proměnné měření mnohem více než počet lístků. Pro kvantifikaci účinků souvisejících s chemickou látkou se růst ve zkušebních roztocích porovnává s růstem v kontrolních vzorcích a stanoví se koncentrace způsobující stanovenou x % inhibici růstu (např. 50 %) a vyjádří se jako ECx (např. EC50).

6.

Cílovým ukazatelem zkoušky je inhibice růstu vyjádřená jako logaritmické zvýšení proměnné měření (průměrná specifická růstová rychlost) během expoziční doby. Z průměrných specifických růstových rychlostí zaznamenaných v řadě zkušebních roztoků se stanoví koncentrace způsobující stanovenou x % inhibici růstové rychlosti (např. 50 %) a vyjádří se jako ErCx (např. ErC50).

7.

Další proměnnou odezvy použitou v této zkušební metodě je výtěžek, který může být nutný ke splnění specifických právních požadavků v některých zemích. Je definován jako proměnná měření na konci expoziční doby minus proměnná měření na počátku expoziční doby. Z výtěžku zaznamenaného v řadě zkušebních roztoků se vypočítá koncentrace způsobující stanovenou x % inhibici výtěžku (např. 50 %) a vyjádří se jako EyCx (např. EyC50).

8.

Kromě toho se může statisticky určit nejnižší koncentrace s pozorovaným účinkem (LOEC) a koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC).

9.

Měla by být k dispozici analytická metoda s odpovídající citlivostí pro kvantifikaci chemické látky ve zkušebním médiu.

10.

Užitečnými informacemi o zkoušené chemické látce pro účely stanovení zkušebních podmínek mohou být strukturní vzorec, čistota, rozpustnost ve vodě, stálost ve vodě a na světle, pKa, Kow, tlak par a biologická rozložitelnost. Rozpustnost ve vodě a tlak par lze použít pro výpočet Henryho konstanty z Henryho zákona, která bude ukazovat, zda jsou pravděpodobné významné ztráty zkoušené chemické látky během doby zkoušky. Toto pomáhá zjistit, zda by se měla podniknout konkrétní opatření ke kontrole takových ztrát. Jestliže nejsou informace o rozpustnosti a stálosti zkoušené látky jisté, doporučuje se, aby byly hodnoceny za podmínek zkoušky, tj. v růstovém médiu, při teplotě a režimu osvětlení, které mají být při zkoušce použity.

11.

Pokud je zvláště důležitá kontrola pH zkušebního média, např. zkoušejí-li se kovy nebo chemické látky, které jsou hydrolyticky nestálé, doporučuje se přídavek pufru do růstového média (viz odstavec 21). Další pokyny pro zkoušení chemických látek s fyzikálně-chemickými vlastnostmi, které činí jejich zkoušení obtížné, jsou uvedeny v (8).

12.

Aby byla zkouška platná, musí být doba, za kterou se zdvojnásobí počet lístků v kontrolním vzorku, kratší než 2,5 dne (60 h), což odpovídá přibližně sedmi-násobnému zvýšení v sedmi dnech a průměrné specifické růstové rychlosti 0,275 d– 1. Při použití média a zkušebních podmínek popsaných v této zkušební metodě lze tohoto kritéria dosáhnout použitím režimu statické zkoušky (5). Rovněž se předpokládá, že toto kritérium bude splnitelné za podmínek semistatické a průtokové zkoušky. Výpočet doby zdvojnásobení je uveden v odstavci 49.

13.

Jako prostředek kontroly zkušebního postupu lze zkoušet referenční látku (látky), například 3,5-dichlorfenol použitý v mezinárodní okružní zkoušce (7). Doporučuje se zkoušet referenční chemickou látku nejméně dvakrát ročně nebo – pokud se zkoušení provádí s menší četností – souběžně se stanovováním toxicity zkoušené chemické látky.

14.

Veškeré vybavení přicházející do styku se zkušebními médii by mělo být vyrobeno ze skla nebo jiného chemicky inertního materiálu. Skleněné pomůcky použité pro kultivační a zkušební účely je zapotřebí vyčistit od chemických kontaminantů, které by mohly unikat do zkušebního média, a musí být sterilní. Zkušební nádoby by měly být dostatečně široké, aby mohly lístky jednotlivých kolonií v kontrolních nádobách růst, aniž by se na konci zkoušky překrývaly. Není důležité, zda se kořeny dotýkají dna zkušebních nádob, ale doporučuje se, aby v každé zkušební nádobě byla minimální hloubka 20 mm a minimální objem 100 ml. Volba zkušebních nádob není zásadně důležitá, pokud budou splněny tyto požadavky. Jako vhodné se ukázaly skleněné kádinky, krystalizační misky nebo skleněné Petriho misky vhodných rozměrů. Zkušební nádoby musí být zakryty, aby se minimalizovalo odpařování a náhodná kontaminace, přičemž však musí být umožněna nezbytná výměna vzduchu. Vhodné zkušební nádoby, a zejména kryty, musí zabránit stínění nebo změnám spektrálních charakteristik světla.

15.

Kultury a zkušební nádoby by se měly přechovávat odděleně. Toho se nejlépe dosáhne pomocí samostatných komor, inkubátorů či místností pro růst za podmínek prostředí. Osvětlení a teplota musí být regulovatelné a musí se udržovat na stálé úrovni (viz odstavce 35, 36).

16.

Organismem použitým pro tuto zkoušku je Lemna gibba nebo Lemna minor. Stručný popis druhů okřehku, které byly použity pro zkoušení toxicity, je uveden v dodatku 2. Rostlinný materiál lze získat ze sbírky kultur, z jiné laboratoře nebo v terénu. Jestliže se sběr provádí z terénu, rostliny by se měly kultivovat ve stejném médiu, jaké se používá ke zkoušení, minimálně po dobu osmi týdnů před použitím. Terénní místa použitá pro sběr výchozích kultur musí být prostá zřejmých zdrojů kontaminace. Pokud se získávají z jiné laboratoře nebo ze sbírky kultur, měly by se podobně uchovávat po minimální dobu tří týdnů. V závěrečné zprávě je vždy třeba uvést zdroj rostlinného materiálu a druhu a klonu (je-li znám) použitého ke zkoušení.

17.

Měly by se používat monokultury, které jsou očividně prosté kontaminace jinými organismy, například řasami a prvoky. Zdravé rostliny L. minor obsahují kolonie skládající se ze dvou až pěti lístků, zatímco zdravé kolonie L. gibba mohou obsahovat až sedm lístků.

18.

Kvalita a jednotnost rostlin použitých ve zkoušce bude mít významný vliv na její výsledek a proto by se jejich výběru měla věnovat velká pozornost. Měly by se používat mladé, rychle rostoucí rostliny bez viditelných lézí či odbarvení (chlorózy). Kultury dobré kvality se vyznačují vysokým výskytem kolonií obsahujících nejméně dva lístky. Velký počet jednotlivých lístků je ukazatelem environmentálního stresu, např. nedostatku živin, a rostlinný materiál z takovýchto kultur by se ke zkoušení neměl používat.

19.

Pro snížení četnosti udržování kultury (např. pokud se na určité období neplánují žádné zkoušky s Lemna) lze kultury udržovat za sníženého osvětlení a teploty (4–10 °C). Podrobnosti o kultivaci jsou uvedeny v dodatku 3. Očividné známky kontaminace řasami nebo jinými organismy vyžadují povrchovou sterilizaci dílčího vzorku lístků Lemna a následný přenos do čerstvého média (viz dodatek 3). V tomto případě je třeba zbývající kontaminovanou kulturu zlikvidovat.

20.

Nejméně sedm dnů před zkoušením se dostatečný počet kolonií asepticky převede do čerstvého sterilního média a kultivuje se 7 až 10 dnů za podmínek zkoušky.

21.

Pro Lemna minor a Lemna gibba se doporučují odlišná média, jak je dále uvedeno. Je třeba pečlivě zvážit zahrnutí pH pufru do zkušebního média (MOPS (kyselina 4-morfolinpropansulfonová, č. CAS: 1132-61-2) do média pro L. minor a NaHCO3 do média pro L. gibba), když existuje podezření, že by mohl reagovat se zkoušenou chemickou látkou a ovlivňovat vyjádření její toxicity. Steinbergovo médium (9) je rovněž přijatelné, pokud jsou splněna kritéria platnosti.

22.

Pro kultivaci a zkoušení s L. minor se doporučuje úprava švédského standardního (SIS) růstového média pro Lemna. Složení tohoto média je uvedeno v dodatku 4.

23.

Ke kultivaci a zkoušení s L. gibba se doporučuje růstové médium 20X AAP popsané v dodatku 4.

24.

Steinbergovo médium, popsané v dodatku 4, je rovněž vhodné pro L. minor, ale může se používat i pro L. gibba, pokud jsou splněna kritéria platnosti.

25.

Zkušební roztoky se obvykle připravují ředěním zásobního roztoku. Zásobní roztoky zkoušené chemické látky se obyčejně připravují rozpuštěním látky v růstovém médiu.

26.

Nejvyšší zkušební koncentrace zkoušené chemické látky by obvykle neměla překročit rozpustnost látky ve vodě za zkušebních podmínek. Je však třeba poznamenat, že Lemna spp. plují na povrchu a mohou být vystaveny působení chemických látek, které se hromadí na rozhraní voda-vzduch (např. látky špatně rozpustné ve vodě nebo hydrofobní či povrchově aktivní látky). Za takových podmínek dochází k expozici jiným látkám, než které se nacházejí v roztoku, a zkušební koncentrace mohou v závislosti na vlastnostech zkoušené chemické látky překračovat rozpustnost ve vodě. Pro zkoušené chemické látky s nízkou rozpustností ve vodě může být nezbytné připravit koncentrovaný zásobní roztok nebo disperzi látky pomocí organického rozpouštědla nebo dispergátoru, aby se usnadnilo přidávání přesných množství zkoušené chemické látky do zkušebního média, a napomohlo se tak její dispergaci a rozpuštění. Měla by být vynaložena maximální snaha takové látky nepoužívat. Používání pomocných rozpouštědel nebo dispergátorů by nemělo způsobovat žádnou fytotoxicitu. Příkladem běžně používaných rozpouštědel, která nezpůsobují fytotoxicitu při koncentracích až do 100 μl/l, jsou aceton a dimetylformamid. Jestliže se použije rozpouštědlo nebo dispergátor, jeho konečná koncentrace by se měla zapsat v závěrečné zprávě a udržovat na minimální hodnotě (≤ 100 μl · l– 1) a všechny exponované vzorky a kontroly by měly obsahovat stejnou koncentraci rozpouštědla nebo dispergátoru. Další pokyny k používání dispergátorů jsou uvedeny v (8).

27.

Předběžná znalost toxicity zkoušené chemické látky pro Lemna, např. z orientační zkoušky, pomůže při volbě vhodných zkušebních koncentrací. Při hlavní zkoušce toxicity se zpravidla použije alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou posloupnost. Faktor mezi zkušebními koncentracemi by nejlépe neměl překročit 3,2, ale lze použít i vyšší hodnotu, jestliže je křivka závislosti koncentrace a odezvy plochá. Použití méně než pěti koncentrací by mělo být zdůvodněno. Pro každou zkušební koncentraci se použijí nejméně tři opakování.

28.

Při volbě rozsahu zkušebních koncentrací (pro orientační a/nebo hlavní zkoušku toxicity) je zapotřebí vzít v úvahu následující:

29.

Každá zkouška by měla zahrnovat kontrolní vzorky obsahující stejné živné médium, stejný počet lístků a kolonií, stejné podmínky okolního prostředí a postupy, jaké byly zvoleny pro zkušební nádoby, avšak neobsahují zkoušenou chemickou látku. Jestliže se použije pomocné rozpouštědlo nebo dispergátor, měla by být zahrnuta i další kontrolní expozice s rozpouštědlem/dispergátorem přítomným ve stejné koncentraci jako v nádobách se zkoušenou chemickou látkou. Počet kontrolních nádob použitých k opakování (a případných nádob s rozpouštědly) by měl být nejméně roven počtu nádob použitých pro každou zkušební koncentraci; v ideálním případě by měl být dvojnásobný.

30.

Jestliže se stanovení NOEC nepožaduje, upořádání zkoušky lze pozměnit tak, že se zvýší počet koncentrací a sníží počet replik pro příslušnou koncentraci. Počet kontrolních replik však musí být nejméně tři.

31.

Kolonie tvořené 2 až 4 viditelnými lístky se převedou z očkovací kultury a za aseptických podmínek se náhodně přidají do zkušebních nádob. Každá nádoba by měla celkem obsahovat 9 až 12 lístků. Počet lístků a kolonií by měl být v každé zkušební nádobě stejný. Zkušenosti získané s touto metodou a údaje z okružní zkoušky ukazují, že použití tří replik na expozici, kdy pro každé opakování se zpočátku použije od 9 do 12 lístků, je dostatečné ke zjištění rozdílů v inhibici růstu přibližně o 4 až 7 % vypočítaných pomocí růstové rychlosti (10 až 15 % vypočítaných pomocí výtěžku) mezi jednotlivými expozicemi (7).

32.

K minimalizaci vlivu prostorových rozdílů v intenzitě světla nebo v teplotě je zapotřebí náhodně uspořádat zkušební nádoby v inkubátoru. Při prováděném pozorování se rovněž vyžaduje uspořádání do bloků nebo náhodné přemísťování nádob (nebo častější přemísťování).

33.

Jestliže předběžná zkouška stálosti ukazuje, že během doby trvání zkoušky (7 dnů) nelze udržet koncentraci zkoušené chemické látky (tj. měřená koncentrace poklesne pod 80 % naměřené počáteční koncentrace), doporučuje se režim semistatické zkoušky. V tomto případě by měly být kolonie nejméně dvakrát během zkoušky (např. v den 3 a 5) vystaveny čerstvě připraveným zkušebním a kontrolním roztokům. Četnost expozice čerstvému médiu závisí na stálosti zkoušené chemické látky; pro udržení téměř konstantních koncentrací vysoce nestálých či těkavých látek může být zapotřebí vyšší četnost. Za určitých okolností může být nutný průtokový postup (8, 10).

34.

Scénář expozice prostřednictvím aplikace na lístek (rozprašování) není do této zkušební metody zahrnut; tomuto tématu se věnuje literatura (11).

35.

Pomocí kontinuálního teplého nebo chladného bílého fluorescenčního osvětlení je třeba zajistit světelnou intenzitu zvolenou z rozmezí 85–135 μE·m– 2 · s– 1, přičemž se tato intenzita měří v pásmu fotosynteticky aktivního záření (400 až 700 nm) v bodech nacházejících se ve stejné vzdálenosti od zdroje světla jako lístky Lemna (ekvivalent 6 500 až 10 000 luxů). Jakékoliv odchylky od zvolené intenzity světla nad zkušební plochou by neměly překročit ± 15 %. Naměřenou hodnotu bude ovlivňovat metoda detekce světla a měření, zejména typ čidla. Kulová čidla (která reagují na světlo přicházející ze všech úhlů nad i pod rovinou měření) a ‚kosinová‘ čidla (která reagují na světlo přicházející ze všech úhlů nad rovinou měření) jsou vhodnější než jednosměrná čidla, neboť poskytují vyšší naměřené hodnoty pro vícebodový světelný zdroj zde popsaného typu.

36.

Teplota v zkušebních nádobách by měla být 24 ± 2 °C. pH kontrolního média by se během zkoušky nemělo zvýšit o více než 1,5. Ovšem odchylka o více než 1,5 nebude znamenat neplatnost zkoušky, pokud je možné prokázat, že byla splněna kritéria platnosti. Zvláštní pozornost je zapotřebí věnovat posunu pH ve speciálních případech, jako jsou zkoušky nestálých chemických látek nebo kovů. Další pokyny naleznete v (8).

37.

Zkouška je ukončena za 7 dnů poté, co byly rostliny přeneseny do zkušebních nádob.

38.

Na počátku zkoušky se zjistí a zaznamená počet lístků ve zkušebních nádobách, přičemž se pečlivě dbá na to, aby byly započítány vystupující, jasně viditelné lístky. Na počátku zkoušky, dále nejméně jednou během každých 3 dnů během expoziční doby (tj. nejméně dvakrát během celkové doby 7 dnů) a při ukončení zkoušky se musí určit počty lístků, které mají normální či abnormální vzhled. V závěrečné zprávě se musí zaznamenat změny ve vývoji rostlin, např. velikost lístku, vzhled, známky nekrózy, chlorózy nebo hrbatosti, rozpadávání kolonií nebo ztráta vzplývavosti, a v délce a vzhledu kořenu. Je rovněž nutné zaznamenat významné znaky zkušebního média (např. přítomnost nerozpuštěného materiálu, růst řas ve zkušební nádobě).

39.

Kromě určení počtu lístků během zkoušky se také hodnotí účinky zkoušené chemické látky na jednu (nebo více) následujících proměnných měření:

40.

Celková plocha lístků má tu výhodu, že ji lze u každé zkušební a kontrolní nádoby určit na počátku zkoušky, v jejím průběhu i na jejím konci. Hmotnost sušiny nebo čerstvá hmotnost by se měly určit na počátku zkoušky ze vzorku očkovací kultury, která se obvykle používá k zahájení zkoušky, a na konci zkoušky pak na základě rostlinného materiálu z každé zkušební a kontrolní nádoby. Jestliže se plocha lístků neměří, dává se přednost hmotnosti sušiny před čerstvou hmotností.

41.

Celková plocha lístků, hmotnost sušiny a čerstvá hmotnost se mohou určit následovně:

42.

Jestliže se používá statické uspořádání zkoušky, pH každé expozice by se mělo změřit na počátku a na konci zkoušky. Jestliže se používá semistatické uspořádání zkoušky, pH by se mělo měřit v každé vsázce ‚čerstvého‘ zkušebního roztoku před každým obnovením a rovněž i v odpovídajících ‚spotřebovaných‘ roztocích.

43.

Intenzita osvětlení by se měla měřit v růstové komoře, inkubátoru nebo místnosti v bodech nacházejících se ve stejné vzdálenosti od zdroje světla jako lístky Lemna. Měření je třeba provádět nejméně jednou během zkoušky. Teplota média v náhradní nádobě držené za stejných podmínek v růstové komoře, inkubátoru nebo místnosti by se měla zaznamenávat nejméně jednou denně.

44.

Během zkoušky se koncentrace zkoušené látky určují ve vhodných intervalech. Při statických zkouškách je minimálním požadavkem určení koncentrací na počátku a na konci zkoušky.

45.

Při semistatických zkouškách, u nichž se neočekává, že koncentrace zkoušené látky zůstane v rozmezí ± 20 % nominální koncentrace, je nezbytné analyzovat všechny čerstvě připravené zkušební roztoky a tytéž roztoky při každém obnovení (viz odstavec 33). Ovšem u zkoušek, u nichž není naměřená počáteční koncentrace zkoušené chemické látky v rozmezí ± 20 % nominální hodnoty, avšak u nichž lze dostatečně prokázat, že počáteční koncentrace jsou reprodukovatelné a stálé (tj. od 80 do 120 % počáteční koncentrace), mohou být chemická stanovení provedena pouze na nejvyšších a nejnižších zkušebních koncentracích. Ve všech případech je třeba určit koncentrace zkoušené chemické látky před obnovením při každé zkušební koncentraci vždy pouze u jedné nádoby z počtu použitých replik (nebo u sdruženého obsahu nádob všech replik).

46.

U průtokových zkoušek je vhodný podobný vzorkovací režim, jaký je popsán u semistatických zkoušek včetně analýzy na počátku, uprostřed a na konci zkoušky, ale měření ‚spotřebovaného‘ roztoku není v tomto případě vhodné. U tohoto typu zkoušky je zapotřebí kontrolovat denně průtok ředicí vody a zkoušené chemické látky nebo zásobního roztoku zkoušené látky.

47.

Jestliže lze prokázat, že koncentrace zkoušené chemické látky byla po celou dobu zkoušky uspokojivě udržována v rozmezí ± 20 % nominální nebo naměřené počáteční koncentrace, může být analýza výsledků založena na nominálních nebo naměřených počátečních hodnotách. Je-li odchylka od nominální nebo naměřené počáteční koncentrace větší než ± 20 %, analýza výsledků by měla být založena na geometrické střední koncentraci během expozice nebo na modelech popisujících pokles koncentrace zkoušené chemické látky (8).

48.

Za určitých okolností, např. pokud předběžná zkouška naznačuje, že zkoušená chemická látka nemá žádné toxické účinky při koncentracích až do 100 mg/l nebo až do meze své rozpustnosti ve zkušebním médiu (podle toho, co je nižší), může se provést limitní zkouška zahrnující porovnání odezvy v kontrolní skupině a odezvy v jedné exponované skupině (100 mg/l nebo koncentrace rovná mezi rozpustnosti). Důrazně se doporučuje podpořit tuto zkoušku analýzou expozičních koncentrací. Všechny dříve popsané zkušební podmínky a kritéria platnosti se vztahují i na limitní zkoušku s výjimkou toho, že počet opakování s exponovanými vzorky by se měl zdvojnásobit. Růst v kontrolní a exponované skupině může být analyzován pomocí statistické zkoušky pro porovnání středních hodnot, např. Studentova t-testu.

49.

Pro stanovení doby zdvojnásobení (Td ) počtu lístků a dodržování tohoto kritéria platnosti ve studii (odstavec 12) se používá následující vzorec s údaji získanými z kontrolních nádob:

Td = ln 2/μ

kde μ je průměrná specifická růstová rychlost stanovena tak, jak je popsáno v odstavcích 54–55.

50.

Účelem této zkoušky je stanovit účinky zkoušené chemické látky na vegetativní růst Lemna. Tato zkušební metoda popisuje dvě proměnné odezvy, protože členské země mají odlišné preference a právní požadavky. Mají-li být výsledky zkoušky přijatelné ve všech členských zemích, účinky je třeba vyhodnotit pomocí obou proměnných odezvy a) a b) popsaných dále.

51.

Je třeba uvést, že hodnoty toxicity vypočítané pomocí těchto dvou proměnných odezvy nejsou srovnatelné a při používání výsledků zkoušky se musí vzít tento rozdíl na vědomí. Hodnoty ECx založené na průměrné specifické růstové rychlosti (ErCx) budou obecně vyšší než výsledky založené na výtěžku (EyCx), pokud se dodrží zkušební podmínky této zkušební metody, a to kvůli matematickému základu příslušných přístupů. Tuto skutečnost nelze vykládat jako rozdíl v citlivosti mezi těmito dvěma proměnnými odezvy; hodnoty jsou jednoduše matematicky odlišné. Koncepce průměrné specifické růstové rychlosti je založena na obecném průběhu exponenciálního růstu okřehku v nelimitovaných kulturách, u nichž se toxicita odhaduje na základě účinků na růstovou rychlost, aniž by závisela na absolutní úrovni specifické růstové rychlosti kontroly, na sklonu křivky závislosti koncentrace-odezva nebo na době trvání zkoušky. Naproti tomu výsledky založené na proměnné odezvy výtěžku jsou závislé na všech těchto ostatních proměnných. EyCx závisí na specifické růstové rychlosti druhů okřehku použitých v každé zkoušce a na maximální specifické růstové rychlosti, která se může u jednotlivých druhů, a dokonce i u různých klonů, lišit. Tato proměnná odezvy by se neměla používat pro srovnávání citlivosti na toxické látky mezi druhy okřehku nebo dokonce různými klony. Přestože se z vědeckého hlediska dává při odhadu toxicity přednost použití průměrné specifické růstové rychlosti, odhady toxicity založené na výtěžku jsou rovněž do této zkušební metody zahrnuty, aby uspokojily současné právní požadavky v některých zemích.

52.

Odhady toxicity by měly být založeny na počtu lístků a na jedné další proměnné měření (celková plocha lístků, hmotnost sušiny nebo čerstvá hmotnost), protože některé chemické látky mohou ovlivňovat jiné proměnné měření mnohem více než počet lístků. Pouhým určováním počtu lístků by se tento účinek nezjistil.

53.

Počet lístků a jakákoliv další zaznamenaná proměnná měření, tj. celková plocha lístků, hmotnost sušiny nebo čerstvá hmotnost, se pro každé měření uvedou v tabulce společně s koncentracemi zkoušené látky. Následná analýza dat, např. odhad LOEC, NOEC nebo ECx, by měla být založena na hodnotách pro jednotlivá opakování, a nikoliv na vypočítaných středních hodnotách pro každou exponovanou skupinu.

54.

Průměrná specifická růstová rychlost pro konkrétní období se vypočítá jako logaritmické zvýšení proměnných růstu – počtu lístků a jedné další proměnné měření (celková plocha lístků, hmotnost sušiny nebo čerstvá hmotnost) – pomocí následujícího vzorce pro každé opakování kontrolních a exponovaných vzorků:

kde:

Pro každou exponovanou skupinu a kontrolní skupinu se vypočítá střední hodnota růstové rychlosti a odhady rozptylu.