ISSN 1977-0626

Úřední věstník

Evropské unie

L 54

European flag  

České vydání

Právní předpisy

Svazek 59
1. března 2016


Obsah

 

II   Nelegislativní akty

Strana

 

 

NAŘÍZENÍ

 

*

Nařízení Komise (EU) 2016/266 ze dne 7. prosince 2015, kterým se přizpůsobuje technickému pokroku nařízení (ES) č. 440/2008, kterým se stanoví zkušební metody podle nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek ( 1 )

1

 


 

(1)   Text s významem pro EHP

CS

Akty, jejichž název není vyti_těn tučně, se vztahují ke každodennímu řízení záležitostí v zemědělství a obecně platí po omezenou dobu.

Názvy všech ostatních aktů jsou vytištěny tučně a předchází jim hvězdička.


II Nelegislativní akty

NAŘÍZENÍ

1.3.2016   

CS

Úřední věstník Evropské unie

L 54/1


NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) 2016/266

ze dne 7. prosince 2015,

kterým se přizpůsobuje technickému pokroku nařízení (ES) č. 440/2008, kterým se stanoví zkušební metody podle nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek

(Text s významem pro EHP)

EVROPSKÁ KOMISE,

s ohledem na Smlouvu o fungování Evropské unie,

s ohledem na nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 ze dne 18. prosince 2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek, o zřízení Evropské agentury pro chemické látky, o změně směrnice 1999/45/ES a o zrušení nařízení Rady (EHS) č. 793/93, nařízení Komise (ES) č. 1488/94, směrnice Rady 76/769/EHS a směrnic Komise 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES (1), a zejména na čl. 13 odst. 2 uvedeného nařízení,

vzhledem k těmto důvodům:

(1)

Nařízení Komise (ES) č. 440/2008 (2) obsahuje zkušební metody pro určování fyzikálně-chemických vlastností, toxicity a ekotoxicity chemických látek, které se mají používat pro účely nařízení (ES) č. 1907/2006.

(2)

Nařízení (ES) č. 440/2008 je třeba aktualizovat a zahrnout do něj nové a aktualizované zkušební metody, jež nedávno schválila OECD, aby byl zohledněn technický pokrok a v souladu se směrnicí Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU (3) došlo ke snížení počtu zvířat používaných pro pokusné účely. Se zúčastněnými stranami byla tato předloha konzultována.

(3)

Přizpůsobení spočívá v začlenění 20 zkušebních metod: jedné nové metody pro stanovení fyzikálně-chemické vlastnosti, jedenácti nových zkušebních metod, tří aktualizovaných zkušebních metod pro posouzení ekotoxicity a pěti nových zkušebních metod pro posouzení rozpadu a chování v životním prostředí.

(4)

Nařízení (ES) č. 440/2008 by proto mělo být odpovídajícím způsobem změněno.

(5)

Opatření tohoto nařízení jsou v souladu se stanoviskem výboru zřízeného podle článku 133 nařízení (ES) č. 1907/2006,

PŘIJALA TOTO NAŘÍZENÍ:

Článek 1

Příloha nařízení (ES) č. 440/2008 se mění v souladu s přílohou tohoto nařízení.

Článek 2

Toto nařízení vstupuje v platnost třetím dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropské unie.

Toto nařízení je závazné v celém rozsahu a přímo použitelné ve všech členských státech.

V Bruselu dne 7. prosince 2015.

Za Komisi

předseda

Jean-Claude JUNCKER


(1)  Úř. věst. L 396, 30.12.2006, s. 1.

(2)  Nařízení Komise (ES) č. 440/2008 ze dne 30. května 2008, kterým se stanoví zkušební metody podle nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek (Úř. věst. L 142, 31.5.2008, s. 1).

(3)  Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU ze dne 22. září 2010 o ochraně zvířat používaných pro vědecké účely (Úř. věst. L 276, 20.10.2010, s. 33).


PŘÍLOHA

Příloha nařízení (EC) č. 440/2008 se mění takto:

1)

Na začátek přílohy se před část A vkládá poznámka:

„Poznámka:

Před použitím jakékoli z následujících zkušebních metod ke zkoušení vícesložkové látky, látky s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexního reakčního produktu nebo biologického materiálu (UVCB) nebo směsi a v případě, že její použitelnost ke zkoušení vícesložkové látky, UVCB nebo směsí není v příslušné zkušební metodě uvedena, je třeba zvážit, zda je metoda přiměřená pro zamýšlené použití v právních předpisech.

Jestliže se zkušební metoda použije ke zkoušení vícesložkové látky, UVCB nebo směsi, měly by být pokud možno k dispozici dostatečné informace o jejím složení, jako např. chemická identita jejích složek, jejich kvantitativní výskyt a vlastnosti složek.“

2)

Doplňuje se kapitola A.24:

A.24.   ROZDĚLOVACÍ KOEFICIENT (N-OKTANOL/VODA), METODA VYSOKOÚČINNÉ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE (HPLC)

ÚVOD

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) 117 (2004).

1.

Rozdělovací koeficient (P) je definován jako poměr rovnovážných koncentrací rozpuštěné látky v dvoufázovém systému tvořeném dvěma prakticky nemísitelnými rozpouštědly. V případě n-oktanolu a vody platí:

Formula

Rozdělovací koeficient jako podíl dvou koncentrací je bezrozměrná veličina a obvykle se uvádí jeho dekadický logaritmus.

2.

Pow je klíčový parametr při studiu chování chemických látek v životním prostředí. Byl zjištěn vysoce významný vztah mezi Pow neionizované formy látek a jejich bioakumulací u ryb. Bylo rovněž ukázáno, že Pow je účinný parametr v odhadech adsorpce na půdě a sedimentech a při stanovení kvantitativních vztahů mezi strukturou a aktivitou v širokém rozsahu biologických účinků.

3.

Původní návrh této zkušební metody vycházel z článku autorů C. V. Eadsfortha a P. Mosera (1). Vývoj zkušební metody a srovnávací zkoušky OECD mezi laboratořemi byly koordinovány centrálním úřadem pro životní prostředí (Umweltbundesamt) Spolkové republiky Německo během roku 1986 (2).

VÝCHOZÍ ÚVAHY

4.

Hodnoty log Pow v rozsahu – 2 až 4 (někdy až 5 a více) (1) mohou být experimentálně stanoveny metodou třepací lahve (Shake-Flask) (kapitola A.8 této přílohy, Pokyn OECD pro zkoušení 107). Metoda HPLC pokrývá log Pow v rozsahu 0 až 6 (1, 2, 3, 4, 5). Tato metoda může vyžadovat odhad Pow pro přiřazení vhodných referenčních látek a podporu jakýchkoli závěrů vyvozených z dat získaných zkouškou. Výpočtové metody jsou stručně probrány v dodatku této zkušební metody. HPLC provozní režim je izokratický.

5.

Hodnoty Pow závisejí na podmínkách prostředí, jakými jsou teplota, pH, iontová síla atd., a ty je třeba v experimentu definovat, aby byla zajištěna správná interpretace údajů Pow. U ionizovatelných látek může být k dispozici jiná metoda (např. návrh pokynu OECD k metodě měření pH ionizovaných látek (6)) a lze ji použít jako alternativní metodu. Ačkoli tento návrh pokynu OECD může být vhodný pro stanovení Pow těchto ionizovatelných látek, v některých případech je vhodnější použít metodu HPLC při pH odpovídajícím přírodnímu prostředí (viz odstavec 9).

PODSTATA METODY

6.

HPLC na reverzní fázi se provádí v analytických kolonách plněných komerčně dostupnou pevnou fází obsahující dlouhé uhlovodíkové řetězce (např. C8, C18) chemicky vázané na oxid křemičitý.

7.

Chemická látka nastříknutá do takové kolony se rozděluje mezi mobilní rozpouštědlovou fázi a uhlovodíkovou stacionární fázi, jak se působením mobilní fáze pohybuje kolonou. Látky jsou zadržovány úměrně jejich rozdělovacímu koeficientu uhlovodík-voda, přičemž hydrofilní látky se vymývají jako první a lipofilní látky jako poslední. Retenční čas je popsán kapacitním faktorem k daným výrazem:

Formula

kde tR je retenční čas zkoušené látky a t0 je mrtvý čas, tj. průměrná doba, kterou potřebuje molekula rozpouštědla, aby prošla kolonou. Kvantitativní analytické metody nejsou zapotřebí, nezbytné je pouze stanovení retenčních časů.

8.

Rozdělovací koeficient oktanol/voda zkoušené látky se dá vypočítat tak, že experimentálně stanovíme její kapacitní faktor k a ten pak dosadíme do následující rovnice:

Formula

kde

a, b

=

lineární regresní koeficienty.

Tato rovnice se získá lineární regresí logaritmu rozdělovacích koeficientů oktanol/voda referenčních látek proti logaritmu kapacitních faktorů referenčních látek.

9.

Metoda HPLC na reverzní fázi umožňuje odhad rozdělovacích koeficientů v rozsahu log Pow od 0 do 6, ale ve výjimečných případech lze rozsah rozšířit tak, že pokrývá i log Pow od 6 do 10. To může vyžadovat modifikaci mobilní fáze (3). Metoda se nedá aplikovat na silné kyseliny a zásady, komplexní sloučeniny kovů, látky reagující s eluentem nebo povrchově aktivní činidla. Měření lze provádět na ionizovatelných látkách pouze v jejich neionizované formě (volné kyseliny nebo volné zásady) použitím vhodného pufru s pH nižším než pKa volné kyseliny nebo vyšším než pKa volné zásady. Popřípadě může být k dispozici metoda měření pH pro zkoušení ionizovatelných látek (6), kterou lze použít jako alternativní metodu (6). Jestliže je hodnota log Pow stanovena pro použití ke klasifikaci nebezpečí pro životní prostředí nebo hodnocení environmentálních rizik, je třeba zkoušku provádět v rozsahu pH příslušném pro přírodní prostředí, tj. v rozsahu pH 5,0–9.

10.

V některých případech mohou nečistoty znesnadnit interpretaci výsledků vzhledem k nejistému přiřazení píků. U směsí, výsledkem jejichž analýzy je nerozlišený pás, je třeba uvést horní a dolní mez log Pow, a procentuální podíl ploch píků pro každý log Pow. U směsí, které jsou skupinou homologů, je třeba rovněž uvést vážený průměr log Pow (7) vypočítaný na základě jednotlivých hodnot Pow a odpovídajících procentuálních podílů ploch (8). Ve výpočtu je třeba brát v úvahu všechny píky, které přispívají k celkové ploše píků 5 nebo více procenty (9):

Formula

Vážený průměr log Pow je platný pouze pro látky nebo směsi (např. tálové oleje) skládající se z homologů (např. série alkanů). Při měření směsí lze užitečné výsledy získat za předpokladu, že použitý analytický detektor má stejnou citlivost vůči všem látkám ve směsi a lze je dostatečně rozlišit.

INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE

11.

Před použitím metody musí být známa disociační konstanta, strukturní vzorec a rozpustnost v mobilní fázi. Užitečné budou rovněž informace o hydrolýze.

KRITÉRIA KVALITY

12.

Aby se zvýšila spolehlivost měření, musí být provedena opakovaná stanovení.

Opakovatelnost: Hodnoty log Pow získané z opakovaných měření za identických podmínek a za použití stejného souboru referenčních látek by měly spadat do rozmezí + 0,1 log.

Reprodukovatelnost: Jsou-li měření opakována s odlišným souborem referenčních látek, výsledky se mohou lišit. Korelační koeficient R vztahu mezi log k a log Pow pro soubor zkoušených látek je obvykle okolo 0,9, což odpovídá rozdělovacímu koeficientu oktanol/voda log Pow + 0,5 log.

13.

Zkouška mezilaboratorního srovnání ukázala, že pomocí metody HPLC lze hodnoty log Pow získat s přesností + 0,5 jednotek pro rozdělovací koeficienty získané metodou třepací lahve (2). V literatuře lze nalézt další srovnání (4, 5, 10, 11, 12). Nejpřesnější výsledky poskytují korelační grafy založené na referenčních látkách, které mají podobnou strukturu (13).

REFERENČNÍ LÁTKY

14.

Pro korelaci měřeného kapacitního faktoru k látky s jejím Pow je třeba stanovit kalibrační graf s použitím alespoň 6 bodů (viz odstavec 24). Vhodné referenční látky zvolí uživatel. Referenční látky by v zásadě měly mít hodnoty log Pow v rozsahu, který zahrnuje log Pow zkoušené chemické látky, tzn. alespoň jedna referenční látka by měla mít Pow nad hodnotou zkoušené látky a jiná Pow pod touto hodnotou. Extrapolaci je možné použít pouze ve výjimečných případech. Je vhodnější, aby tyto referenční látky byly svou strukturou podobné zkoušené látce. Hodnoty log Pow referenčních látek použitých pro kalibraci by měly vycházet ze spolehlivých experimentálních údajů. Avšak u látek s vysokým log Pow (obvykle více než 4) je možné použít vypočítané hodnoty, pokud nejsou k dispozici spolehlivé experimentální údaje. Jestliže se použijí extrapolované hodnoty, je třeba uvést mezní hodnotu.

15.

V literatuře jsou dostupné rozsáhlé seznamy hodnot Pow pro mnoho skupin chemických látek (14, 15). Jestliže nejsou k dispozici data o rozdělovacích koeficientech látek s podobnou strukturou, je možné použít obecnější kalibraci stanovenou s jinými referenčními látkami. Tabulka 1 uvádí doporučené referenční látky a jejich hodnoty Pow. V případě ionizovatelných látek platí uvedené hodnoty pro neionizovanou formu. Věrohodnost a kvalita hodnot byly prověřeny mezilaboratorní srovnávací zkouškou.

Tabulka 1

Doporučené referenční látky

 

Číslo CAS

Referenční látka

log Pow

pKa

1

78-93-3

2-butanon

(methylethylketon)

0,3

 

2

1122-54-9

4-acetylpyridin

0,5

 

3

62-53-3

anilin

0,9

 

4

103-84-4

acetanilid

1,0

 

5

100-51-6

benzylalkohol

1,1

 

6

150-76-5

4-methoxyfenol

1,3

pKa = 10,26

7

122-59-8

kyselina fenoxyoctová

1,4

pKa = 3,12

8

108-95-2

fenol

1,5

pKa = 9,92

9

51-28-5

2,4-dinitrofenol

1,5

pKa = 3,96

10

100-47-0

benzonitril

1,6

 

11

140-29-4

fenylacetonitril

1,6

 

12

589-18-4

4-methylbenzylalkohol

1,6

 

13

98-86-2

acetofenon

1,7

 

14

88-75-5

2-nitrofenol

1,8

pKa = 7,17

15

121-92-6

kyselina 3-nitrobenzoová

1,8

pKa = 3,47

16

106-47-8

4-chloranilin

1,8

pKa = 4,15

17

98-95-3

nitrobenzen

1,9

 

18

104-54-1

skořicový alkohol

1,9

 

19

65-85-0

kyselina benzoová

1,9

pKa = 4,19

20

106-44-5

p-kresol

1,9

pKa = 10,17

21

140-10-3

(trans)

kyselina skořicová

2,1

pKa = 3,89 (cis)

4,44 (trans)

22

100-66-3

anisol

2,1

 

23

93-58-3

methylbenzoát

2,1

 

24

71-43-2

benzen

2,1

 

25

99-04-7

kyselina 3-methylbenzoová

2,4

pKa = 4,27

26

106-48-9

4-chlorfenol

2,4

pKa = 9,1

27

79-01-6

trichlorethylen

2,4

 

28

1912-24-9

atrazin

2,6

 

29

93-89-0

ethylbenzoát

2,6

 

30

1194-65-6

2,6-dichlorbenzonitril

2,6

 

31

535-80-8

kyselina 3-chlorbenzoová

2,7

pKa = 3,82

32

108-88-3

toluen

2,7

 

33

90-15-3

1-naftol

2,7

pKa = 9,34

34

608-27-5

2,3-dichloranilin

2,8

 

35

108-90-7

chlorbenzen

2,8

 

36

1746-13-0

allyl-fenyl-ether

2,9

 

37

108-86-1

brombenzen

3,0

 

38

100-41-4

ethylbenzen

3,2

 

39

119-61-9

benzofenon

3,2

 

40

92-69-3

4-fenylfenol

3,2

pKa = 9,54

41

89-83-8

thymol

3,3

 

42

106-46-7

1,4-dichlorbenzen

3,4

 

43

122-39-4

difenylamin

3,4

pKa = 0,79

44

91-20-3

naftalen

3,6

 

45

93-99-2

fenylbenzoát

3,6

 

46

98-82-8

izopropylbenzen

3,7

 

47

88-06-2

2,4,6-trichlorfenol

3,7

pKa = 6

48

92-52-4

bifenyl

4,0

 

49

120-51-4

benzylbenzoát

4,0

 

50

88-85-7

2,4-dinitro-6-sek-butylfenol

4,1

 

51

120-82-1

l,2,4-trichlorbenzen

4,2

 

52

143-07-7

kyselina dodekanová

4,2

pKa = 5,3

53

101-84-8

difenylether

4,2

 

54

85-01-8

fenantren

4,5

 

55

104-51-8

n-butylbenzen

4,6

 

56

103-29-7

dibenzyl

4,8

 

57

3558-69-8

2,6-difenylpyridin

4,9

 

58

206-44-0

fluoranten

5,1

 

59

603-34-9

trifenylamin

5,7

 

60

50-29-3

DDT

6,5

 

POPIS METODY

Předběžný odhad rozdělovacího koeficientu

16.

V případě potřeby lze rozdělovací koeficient zkoušené látky nejlépe odhadnout na základě výpočtu (viz dodatek) nebo popřípadě z poměru rozpustností zkoušené látky v čistých rozpouštědlech.

Přístroje a pomůcky

17.

Nezbytným vybavením je kapalinový chromatograf vybavený nízkopulzním čerpadlem a vhodným detekčním systémem. UV detektor pracující na vlnové délce 210 nm nebo RI detektor jsou použitelné pro širokou škálu chemických skupin. Přítomnost polárních skupin ve stacionární fázi může významně zhoršit účinnost kolony HPLC. Stacionární fáze by proto měly mít minimální podíl polárních skupin (16). Lze použít komerční mikročásticové náplně s reverzními fázemi nebo hotové kolony s náplní. Mezi nástřikem a analytickou kolonou může být umístěna ochranná předkolona.

Mobilní fáze

18.

K přípravě elučního rozpouštědla, které je třeba před použitím odplynit, se užije metanol čistoty pro HPLC a destilovaná nebo deionizovaná voda. Měla by být provedena izokratická eluce. Doporučuje se použít směs metanol-voda s minimálním obsahem vody 25 %. Směs 3:1 (obj.) metanol-voda je obvykle vyhovující pro vymývání látek s log P = 6 během hodiny při průtokové rychlosti 1 ml/min. U látek s log P vyšším než 6 může být nezbytné zkrátit eluční dobu (rovněž u referenčních látek) snížením polarity mobilní fáze nebo délky kolony.

19.

Zkoušené i referenční látky musí být rozpustné v mobilní fázi v dostatečné koncentraci, aby byla umožněna jejich detekce. Aditiva se mohou použít se směsí metanol-voda pouze ve výjimečných případech, neboť mění vlastnosti kolony. V těchto případech je třeba ověřit, zda retenční časy zkoušené a referenční látky nejsou ovlivněny. Jestliže směs metanol-voda není vhodná, je možné použít jiné směsi organických rozpouštědel a vody, např. etanol-voda, acetonitril-voda nebo izopropylalkohol (2-propanol)-voda.

20.

Pro ionizovatelné látky je kritické pH eluentu. Mělo by se nacházet v pracovní oblasti pH kolony, obvykle mezi 2 and 8. Doporučuje se použitít pufračních roztoků. Je třeba dbát na to, aby se nedošlo ke srážení solí a narušení kolony, k čemuž dochází u některých směsí organické fáze s pufračním roztokem. Měření pomocí HPLC se stacionárními fázemi na bázi oxidu křemičitého se obvykle nedoporučuje při pH vyšším než 8, neboť použití alkalické mobilní fáze může způsobit rychlé narušení činnosti kolony.

Rozpouštěné látky

21.

Zkoušené a referenční látky musí být dostatečně čisté, aby bylo možno přiřadit píky v chromatogramech příslušným látkám. Látky, které se mají používat ke zkoušení nebo kalibraci, se pokud možno rozpustí v mobilní fázi. Jestliže se k rozpuštění zkoušené a referenční látky použije jiné rozpouštědlo než mobilní fáze, je třeba použít mobilní fázi ke konečnému zředění před nástřikem.

Zkušební podmínky

22.

Teplota by během měření neměla kolísat o více než ± 1 °C.

Stanovení mrtvého času t0

23.

Mrtvý čas t0 je možné měřit použitím nezadržovaných organických látek (např. thiomočovina nebo formamid). Přesnější mrtvý čas lze získat ze změřených retenčních časů nebo užitím souboru přibližně sedmi členů homologické řady (např. n-alkylmethylketonů) (17). Retenční časy tR (nC + 1) se vynesou jako funkce tR (nC), kde nC je počet atomů uhlíku. Tak se získá přímka tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, kde A = k(nC + 1)/k(nC) je konstantní. Mrtvý čas t0 se získá z úseku (1 – A)t0 a směrnice A.

Regresní rovnice

24.

Dalším krokem je sestrojení korelační závislosti hodnot log k na log P pro vhodné referenční látky s hodnotami log P blízkými hodnotám očekávaným pro zkoušenou chemickou látku. V praxi se současně nastříkne 6 až 10 referenčních látek. Retenční časy se stanoví nejlépe pomocí zapisovacího integrátoru napojeného na detekční systém. Odpovídající logaritmy kapacitních faktorů log k se vynesou jako funkce log P. Regresní rovnice se stanoví v pravidelných intervalech, alespoň jednou denně, aby bylo možno zohlednit případné změny činnosti kolony.

STANOVENÍ POW ZKOUŠENÉ LÁTKY

25.

Zkoušená chemická látka se nastříkne v nejmenších detekovatelných množstvích. Retenční čas se stanovuje zdvojeným měřením. Rozdělovací koeficient zkoušené látky se získá interpolací vypočítaného kapacitního faktoru na kalibračním grafu. U velmi nízkých a velmi vysokých rozdělovacích koeficientů je nutná extrapolace. Zejména v těchto případech je třeba věnovat pozornost intervalům spolehlivosti regresní přímky. Jestliže je retenční čas vzorku mimo rozsah retenčních časů stanovených pro standardy, je třeba uvést mezní hodnotu.

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

Závěrečná zpráva

26.

V závěrečné zprávě musí být obsaženy následující údaje:

předběžný odhad rozdělovacího koeficientu, odhadnuté hodnoty a použitá metoda, jsou-li stanoveny; byla-li použita výpočtová metoda, její úplný popis, včetně identifikace databáze a podrobné informace o výběru fragmentů,

zkoušené a referenční látky: čistota, strukturní vzorec a číslo CAS,

popis zařízení a pracovních podmínek: analytická kolona, ochranná předkolona,

mobilní fáze, detekční systém, teplotní rozsah, pH,

eluční profily (chromatogramy),

mrtvý čas a metoda jeho měření,

retenční data a hodnoty log Pow z literatury pro referenční látky použité ke kalibraci,

charakteristiky proložené regresní přímky (log k versus log Pow) a korelační koeficient přímky, včetně intervalů spolehlivosti,

průměrné retenční údaje a interpolovaná hodnota log Pow pro zkoušenou látku,

v případě směsi: chromatogram elučního profilu s uvedenými hraničními hodnotami,

poměr hodnot log Pow k procentuálnímu podílu plochy píku log Pow,

výpočet použitím regresní přímky,

popřípadě vypočítané vážené průměrné hodnoty log Pow.

LITERATURA

1)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss and H.J. Poremski. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

3)

C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.

5)

B. McDuffie (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

6)

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Draft Guideline, November 2000.

7)

OSPAR (1995). ‚Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995‘, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Annex 10, Oviedo, 20–24 February 1995.

8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez and C. C. Karman. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3. August.

9)

E. A. Vik, S. Bakke and K. Bansal. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, pp. 529-537.

10)

L.O. Renberg, S.G. Sundstroem and K. Sundh-Nygård. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

11)

W.E. Hammers, G.J.Meurs and C.L. De-Ligny. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

12)

J.E. Haky and A.M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

13)

S. Fujisawa and E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

14)

C. Hansch and A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, New York.

15)

C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity – Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

16)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

17)

G.E. Berendsen, P.J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony, and J. Inczédy. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

Dodatek

Metody výpočtu Pow

ÚVOD

1.

Tento dodatek obsahuje krátký úvod k výpočtu Pow. Další informace jsou uvedeny v učebnicích (1, 2).

2.

Vypočítané hodnoty Pow se použijí pro:

rozhodnutí, která experimentální metoda se použije: metoda Shake Flask (třepací lahev) pro log Pow mezi – 2 a 4; HPLC metoda pro log Pow mezi 0 a 6;

volbu podmínek použitých v HPLC (referenční látky, poměr metanol/voda);

prověření věrohodnosti hodnot získaných experimentálními metodami;

zjištění odhadu v případě, kdy experimentální metody nelze použít.

Podstata výpočtových metod

3.

Výpočtové metody navržené zde jsou založeny na teoretické fragmentaci molekuly na vhodné podstruktury, pro které jsou známy spolehlivé hodnoty přírůstků log Pow. Hodnota log Pow se vypočte jako součet hodnot pro příslušné fragmenty a korekčních členů pro intramolekulární interakce. Seznamy fragmentových konstant a korekčních členů lze nalézt v literatuře (1, 2, 3, 4, 5, 6). Některé se pravidelně aktualizují (3).

Spolehlivost vypočítaných hodnot

4.

Spolehlivost výpočtových metod obecně klesá s rostoucí složitostí studované chemické látky. V případě jednoduchých molekul s nízkou molekulovou hmotností a jednou nebo dvěma funkčními skupinami lze očekávat, že odchylky hodnot log Pow získaných různými fragmentačními metodami od naměřených hodnot budou v rozmezí od 0,1 do 0,3. Rozpětí chyby bude záviset na spolehlivosti použitých fragmentových konstant, schopnosti zjistit intramolekulární interakce (např. vodíkové vazby) a správném použití korekčních členů. V případě ionizujících látek se musí brát v úvahu náboj a ionizační stupeň (10).

π-metoda Fujity-Hansche

5.

Konstanta hydrofobnosti substituentu π původně zavedená Fujitou a kol. (7) je definována jako:

πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH)

kde PhX je aromatický derivát a PhH výchozí látka.

např.

πCl

= log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6)

= 2,84 – 2,13

= 0,71

π-metoda je primárně důležitá u aromatických látek. π-hodnoty pro velký počet substituentů lze nalézt v literatuře (4, 5).

Rekkerova metoda

6.

Při použití Rekkerovy metody (8) se hodnota log Pow vypočítá podle vzorce:

Formula

kde ai je číslo vyjadřující, kolikrát se daný fragment vyskytuje v molekule, a fi je přírůstek log Pow fragmentu. Interakční členy je možné vyjádřit jako souhrnný násobek jediné konstanty Cm (tzv. ‚magické konstanty‘). Fragmentové konstanty fi a Cm byly stanoveny ze seznamu 1 054 experimentálních hodnot Pow pro 825 látek pomocí vícenásobné regresní analýzy (6, 8). Stanovení interakčních členů se provede podle stanovených pravidel (6, 8, 9).

Hansch-Leova metoda

7.

Při použití Hansch-Leovy metody (4) se hodnota log Pow vypočítá podle vzorce:

Formula

kde fi je fragmentová konstanta, Fj korekční člen (faktor), ai a bj odpovídající četnosti výskytu. Seznamy atomových a skupinových fragmentových hodnot a korekčních členů Fj byly získány metodou pokusu a omylu z experimentálních hodnot Pow. Korekční členy byly rozděleny do několika různých tříd (1, 4). Byla vyvinuta sada programů, které berou v úvahu všechna pravidla a korekční členy (3).

KOMBINOVANÁ METODA

8.

Výpočet log Pow složitých molekul lze značně zdokonalit, jestliže se molekula rozdělí do větších podstruktur, pro něž existují spolehlivé hodnoty log Pow pocházející buď z tabulek (3, 4), nebo z existujících měření. Tyto fragmenty (např. heterocykly, antrachinon, azobenzen) lze poté kombinovat s Hanschovými π-hodnotami nebo s Rekkerovými či Leovými fragmentovými konstantami.

Poznámky

i)

Výpočetní metody lze použít pro částečně nebo úplně ionizované látky pouze tehdy, jsou-li zohledněny nezbytné korekční faktory.

ii)

Jestliže je možné předpokládat existenci intramolekulárních vodíkových vazeb, musí být přičteny odpovídající korekční členy (přibližně + 0,6 až + 1,0 log Pow) (1). Přítomnost takových vazeb mohou naznačit stereo modely nebo spektroskopické údaje.

iii)

Může-li existovat několik tautomerních forem, měla by být jako základ pro výpočet použita nejpravděpodobnější forma.

iv)

Pečlivě by měly být sledovány přepracované seznamy fragmentových konstant.

LITERATURA O VÝPOČTOVÝCH METODÁCH

1)

W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York (1982).

2)

W.J. Dunn, J.H. Block and R.S. Pearlman (ed.). Partition Coefficient, Determination and Estimation, Pergamon Press, Elmsford (New York) and Oxford (1986).

3)

Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

4)

C. Hansch and A.J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York (1979).

5)

Leo, C. Hansch and D. Elkins. (1971) Partition coefficients and their uses. Chemical. Reviews. 71, 525.

6)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

7)

Toshio Fujita, Junkichi Iwasa & Corwin Hansch (1964). A New Substituent Constant, π, Derived from Partition Coefficients. J. Amer. Chem. Soc. 86, 5175.

8)

R.F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Vol. 1, Elsevier, New York (1977).

9)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

10)

R.A. Scherrer. ACS – Symposium Series 255, p. 225, American Chemical Society, Washington, D.C. (1984).

3)

Kapitola C.3 se nahrazuje tímto:

C.3.   ZKOUŠKA INHIBICE RŮSTU SLADKOVODNÍCH ŘAS A SINIC

ÚVOD

1.

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení 201 (2006, příloha opravena v roce 2011). Bylo potřebné rozšířit zkušební methodu tak, aby zahrnovala další druhy, a aktualizovat ji, aby splňovala požadavky na posouzení nebezpečnosti a klasifikaci chemických látek. Tato přepracovaná verze byla dokončena na základě rozsáhlých praktických zkušeností, vědeckého pokroku na poli studia toxicity řas a širokého uplatňování příslušných právních předpisů, k němuž došlo od přijetí původního znění.

2.

Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.

PODSTATA ZKOUŠKY

3.

Účelem této zkoušky je stanovit účinek látky na růst sladkovodních mikrořas a/nebo sinic (Cyanophyta). Exponenciálně rostoucí zkušební organismy jsou vystaveny zkoušené chemické látce v sérii kultur obvykle po dobu 72 hodin. Navzdory relativně krátké době trvání zkoušky lze posoudit účinky na několik generací.

4.

Systémovou odezvou je snížení růstu v řadě kultur řas (zkušebních jednotek) vystavených různým koncentracím zkoušené látky. Odezva se vyhodnocuje jako funkce expoziční koncentrace v porovnání s průměrným růstem neexponovaných kontrolních kultur použitých k opakování. Pro úplné vyjádření odezvy systému na toxické účinky (optimální citlivost) se kultury ponechají exponenciálně růst bez omezení za podmínek dostatečné výživy a nepřetržitého osvětlení po dostatečnou dobu, aby bylo možné změřit snížení specifické růstové rychlosti.

5.

Růst a inhibice (zpomalení) růstu se kvantifikují měřeními biomasy řas jako funkce času. Biomasa řas se definuje jako hmotnost sušiny na objem, např. mg řas/litr zkušebního roztoku. Ovšem hmotnost sušiny se měří obtížně, proto se používají náhradní parametry. Z těchto náhrad se nejčastěji používají počty buněk. Mezi další náhradní parametry patří buněčný objem, fluorescence, optická hustota atd. Je třeba znát přepočítávací faktor mezi naměřeným náhradním parametrem a biomasou.

6.

Cílovým ukazatelem zkoušky je inhibice růstu vyjádřená jako logaritmické zvýšení biomasy (průměrná specifická růstová rychlost) během expoziční doby. Z průměrných specifických růstových rychlostí zaznamenaných v řadě zkušebních roztoků se stanoví koncentrace způsobující stanovenou x % inhibici růstové rychlosti (např. 50 %) a vyjádří se jako ErCx (např. ErC50).

7.

Další proměnnou odezvy použitou v této zkušební metodě je výtěžek, který může být nezbytný ke splnění specifických právních požadavků v některých zemích. Je definován jako biomasa na konci expoziční doby minus biomasa na počátku expoziční doby. Z výtěžku zaznamenaného v řadě zkušebních roztoků se vypočítá koncentrace způsobující stanovenou x % inhibici výtěžku (např. 50 %) a vyjádří se jako EyCx (např. EyC50).

8.

Kromě toho se může statisticky určit nejnižší koncentrace s pozorovaným účinkem (LOEC) a koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC).

INFORMACE O ZKOUŠENÉ CHEMICKÉ LÁTCE

9.

Informace o zkoušené chemické látce, které mohou být užitečné pro účely stanovení podmínek zkoušky, jsou strukturní vzorec, čistota, stálost na světle, stálost za podmínek zkoušky, vlastnosti světelné absorpce, pKa a výsledky studií transformace, včetně biologické rozložitelnosti ve vodě.

10.

Měly by být známy rozpustnost zkoušené chemické látky ve vodě, její rozdělovací koeficient oktanol/voda (Pow) a tlak jejích par; měla by být k dispozici validovaná metoda kvantitativního stanovení látky ve zkušebních roztocích, a to s doloženou výtěžností a mezí detekce.

PLATNOST ZKOUŠKY

11.

Má-li být zkouška platná, musí být splněna tato kritéria platnosti:

Biomasa by se měla v kontrolních kulturách během 72 hodin trvání zkoušky zvýšit exponenciálně, a to nejméně na šestnáctinásobek. To odpovídá specifické růstové rychlosti 0,92.den– 1. U nejčastěji používaných druhů je růstová rychlost obvykle podstatně vyšší (viz dodatek 2). Může se stát, že se toto kritérium nesplní, pokud se používají druhy, které rostou pomaleji než druhy uvedené v seznamu v dodatku 2. V takovém případě je třeba prodloužit dobu zkoušky, aby bylo dosaženo nejméně 16násobného nárůstu kontrolních kultur, přičemž růst musí být v průběhu zkoušky exponenciální. Trvání zkoušky lze zkrátit až na minimální dobu 48 hodin, aby se během zkoušky udržel neomezený exponenciální růst, pokud bude dosaženo minimálního násobícího faktoru 16.

Střední variační koeficient pro specifické růstové rychlosti v jednotlivých obdobích (dny 0–1, 1–2 a 2–3 při 72hodinových zkouškách) v kontrolních kulturách (viz dodatek 1 odstavec ‚variační koeficient‘) nesmí překročit 35 %. Výpočet specifické růstové rychlosti v jednotlivých obdobích je uveden v odstavci 49. Toto kritérium platí pro střední hodnotu variačních koeficientů vypočítaných pro opakované kontrolní kultury.

Variační koeficient průměrných specifických růstových rychlostí během celého zkušebního období u kontrolních kultur replik nesmí překročit 7 % u zkoušek s Pseudokirchneriella subcapitataDesmodesmus subspicatus. U jiných, méně často zkoušených druhů by hodnota neměla překročit 10 %.

REFERENČNÍ CHEMICKÉ LÁTKY

12.

Jako prostředek kontroly zkušebního postupu lze zkoušet referenční látku (látky), například 3,5-dichlorfenol použitý v mezinárodní kroužkové zkoušce (1). Dvojchroman draselný lze rovněž použít jako referenční látku pro zelené řasy. Je žádoucí zkoušet referenční látku nejméně dvakrát ročně.

POUŽITELNOST ZKOUŠKY

13.

Tato metoda se nejsnáze používá pro látky rozpustné ve vodě, které za podmínek zkoušky pravděpodobně ve vodě zůstanou. Pro zkoušení látek, které jsou těkavé, silně adsorbují, jsou zbarvené, mají nízkou rozpustnost ve vodě nebo látek, které mohou nepříznivě ovlivňovat dostupnost živin či minerálů ve zkušebním médiu, mohou být potřebné určité úpravy popsaného postupu (např. uzavřený systém, klimatizace zkušebních nádob). Pokyny k některým vhodným úpravám jsou uvedeny v literatuře (2, 3 a 4).

POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

Přístroje

14.

Zkušební nádoby a jiné přístroje, které přijdou do styku se zkušebními roztoky, by měly být celoskleněné nebo vyrobeny z jiného chemicky inertního materiálu. Jednotlivé komponenty musí být pečlivě umyty, aby se zajistilo, že žádné organické nebo anorganické kontaminující látky nebudou rušit růst řas nebo ovlivňovat složení zkušebních roztoků.

15.

Zkušební nádoby jsou běžně skleněné baňky takové velikosti, že pojmou dostatečný objem kultury během zkoušky a umožní dostatečný přenos CO2 z atmosféry (viz odstavec 30). Objem kapaliny musí být dostatečný pro analytická stanovení (viz odstavec 37).

16.

Kromě toho bude nezbytné veškeré následující vybavení nebo jeho část:

Kultivační zařízení: doporučuje se skříň nebo komora, ve které může být udržována zvolená inkubační teplota ± 2 °C.

Přístroje na měření světla: je důležité mít na paměti, že metoda měření intenzity osvětlení, a zejména typ snímače (kolektoru), může ovlivnit naměřenou hodnotu. Měření by se mělo provádět nejlépe pomocí kulového (4 π) snímače (reaguje na přímé a odražené světlo ze všech úhlů nad a pod rovinou měření), nebo 2 π snímače (reaguje na světlo ze všech úhlů nad rovinou měření).

Zařízení pro stanovení biomasy řas. Počet buněk, který je nejčastěji používaným náhradním parametrem pro biomasu řas, lze určit pomocí elektronického počítače částic, mikroskopu s počítací komůrkou nebo průtokovým cytometrem. Další náhrady biomasy lze měřit průtokovým cytometrem, fluorimetrem, spektrofotometrem nebo kolorimetrem. Je užitečné vypočítat faktor pro přepočet počtu buněk na hmotnost sušiny. Aby bylo možné zajistit užitečná měření při nízkých koncentracích biomasy za použití spektrofotometru, může být nutné používat kyvety s dráhou světla nejméně 4 cm.

Zkušební organismy

17.

Lze použít několik druhů nevázaných mikrořas a sinic. Kmeny uvedené v dodatku 2 se ukázaly jako vhodné při použití zkušebního postupu uvedeného v této zkušební metodě.

18.

Jestliže se použijí jiné druhy, je třeba uvést v závěrečné zprávě kmen a/nebo původ. Musí se potvrdit, že lze udržovat exponenciální růst vybraných zkušebních řas po dobu zkoušky za převažujících podmínek.

Růstové médium

19.

Doporučují se dvě alternativní růstová média, média OECD a AAP. Složení těchto médií je uvedeno v dodatku 3. Uvědomte si, že počáteční hodnota pH a pufrovací kapacita (regulující zvýšení pH) těchto dvou médií jsou rozdílné. Proto se mohou výsledky zkoušek lišit v závislosti na použitém médiu, zejména při zkoušení ionizujících látek.

20.

Pro určité účely může být nezbytná úprava růstových médií, např. když se zkoušejí kovy a chelatační činidla nebo když se provádějí zkoušky při různých hodnotách pH. Použití upraveného média musí být podrobně popsáno a zdůvodněno (3, 4).

Počáteční koncentrace biomasy

21.

Počáteční biomasa musí být stejná ve všech zkušebních kulturách a dostatečně nízká, aby umožňovala exponenciální růst po celou inkubační dobu bez rizika vyčerpání živin. Počáteční biomasa by neměla překročit 0,5 mg/l pro hmotnost sušiny. Doporučují se následující počáteční koncentrace buněk:

Pseudokirchneriella subcapitata

5 × 103 – 104 buněk/ml

Desmodesmus subspicatus

2 – 5 × 103 buněk/ml

Navicula pelliculosa

104 buněk/ml

Anabaena flos-aquae

104 buněk/ml

Synechococcus leopoliensis

5 × 104 – 105 buněk/ml

Koncentrace zkoušené chemické látky

22.

Koncentrační rozmezí, ve kterém lze očekávat účinky, lze určit na základě výsledků orientačních zkoušek. Pro závěrečnou hlavní zkoušku je zapotřebí vybrat alespoň pět koncentrací tvořících geometrickou posloupnost s faktorem nepřekračujícím 3,2. U zkoušených látek vykazujících plochou křivku závislosti odezvy na koncentraci může být opodstatněný vyšší faktor. Posloupnosti koncentrací by nejlépe měly pokrývat rozmezí způsobující 5–75 % inhibici růstové rychlosti řas.

Opakování a kontroly

23.

Uspořádání zkoušky by mělo zahrnovat tři opakování s každou zkoušenou koncentrací. Jestliže se nepožaduje stanovení NOEC (koncentrace bez pozorovaných účinků), uspořádání zkoušky lze pozměnit tak, že se zvýší počet koncentrací a sníží počet opakování pro příslušnou koncentraci. Počet kontrolních opakování musí být nejméně tři a v ideálním případě by měl být dvojnásobkem počtu opakování používaných pro každou zkoušenou koncentraci.

24.

Pro analytická stanovení koncentrací zkoušených chemických látek se může připravit samostatná sada zkušebních roztoků (viz odstavce 36 a 38).

25.

Pokud se k rozpouštění zkoušené látky používá rozpouštědlo, musí být do uspořádání zkoušky zahrnuty dodatečné kontroly obsahující rozpouštědlo o stejné koncentraci, jaká se používá v zkušebních kulturách.

Příprava očkovací kultury

26.

Pro přizpůsobení zkušebních řas podmínkám zkoušky a zajištění toho, aby řasy byly v exponenciální růstové fázi, když se použijí pro naočkování zkušebních roztoků, se očkovací kultura v zkušebním médiu připravuje 2 až 4 dny před zahájením zkoušky. Biomasu řas je třeba upravit, aby mohl do zahájení zkoušky v očkovací kultuře převážit exponenciální růst. Očkovací kultura se musí inkubovat za stejných podmínek jako zkušební kultury. Měří se nárůst biomasy v očkovací kultuře, aby bylo zajištěno, že je růst v rámci normálního rozmezí pro zkušební kmen za podmínek kultivace. Příklad postupu pro kultivaci řas je popsán v dodatku 4. Aby se předešlo synchronnímu dělení buněk během zkoušky, může být potřebné provést druhý krok propagace očkovací kultury.

Příprava zkušebních roztoků

27.

Všechny zkušební roztoky musí obsahovat stejné koncentrace růstového média a počáteční biomasy zkušebních řas. Zkušební roztoky zvolených koncentrací se obvykle připravují smísením zásobního roztoku zkoušené chemické látky s růstovým médiem a očkovací kulturou. Zásobní roztoky se obyčejně připravují rozpuštěním chemické látky ve zkušebním médiu.

28.

Jako nosiče pro přidávání látek o nízké rozpustnosti ve vodě do zkušebního média mohou být použita rozpouštědla, např. aceton, terc-butylalkohol a dimethylformamid (2, 3). Koncentrace rozpouštědla by neměla překročit 100 μl/l a do všech kultur (včetně kontrolních) ve zkušební řadě by měla být přidána stejná koncentrace rozpouštědla.

Inkubace

29.

Zkušební nádoby se uzavřou zátkami, které propouštějí vzduch. Nádoby se protřepou a umístí do kultivačního zařízení. Během zkoušky je nezbytné udržovat řasy v suspensi a umožnit přenos CO2. Za tímto účelem je třeba provádět nepřetržité třepání nebo míchání. Kultury je třeba udržovat při teplotě v rozsahu 21 až 24 °C, která je regulována s přesností na ± 2 °C. Pro druhy jiné než uvedené v seznamu v dodatku 2, např. tropické druhy, mohou být vhodné vyšší teploty, pokud je možné splnit kritéria platnosti. Doporučuje se umístit baňky náhodně a denně je v inkubátoru přemísťovat.

30.

Hodnota pH kontrolního média by neměla během zkoušky vzrůst o více než 1,5. U kovů a chemických látek, které částečně ionizují při pH blížící se pH zkoušky, může být nezbytné omezit posun pH pro získání opakovatelných a dobře definovaných výsledků. Posun hodnoty pH o < 0,5 je technicky proveditelný a lze jej dosáhnout zajištěním adekvátní rychlosti přesunu hmoty CO2 z okolního vzduchu do zkušebního roztoku, např. zvýšením rychlosti třepání. Další možností je snížit potřebu CO2 snížením počáteční biomasy nebo doby trvání zkoušky.

31.

Povrch, kde jsou kultury inkubovány, by měl být trvale osvětlen jednotným fluorescenčním světlem, např. ‚chladným bílým‘ nebo ‚denním‘ světlem. Jednotlivé kmeny řas a sinic mají různé požadavky na osvětlení. Intenzita světla by měla být zvolena tak, aby vyhovovala použitému zkušebnímu organismu. Pro doporučené druhy zelených řas se intenzita světla na hladině zkušebních roztoků zvolí v rozmezí 60–120 μE · m– 2 · s– 1, přičemž se měří ve fotosynteticky efektivním rozsahu vlnových délek od 400 do 700 nm pomocí vhodného snímače. Některé druhy, zejména Anabaena flos-aquae, dobře rostou při nízkých intenzitách světla a mohou být při vysokých intenzitách poškozeny. U takových druhů by měla být zvolena průměrná intenzita světla 40–60 μE·m– 2·s– 1. (Měří-li se intenzita osvětlení luxmetry, ekvivalentní rozpětí 4 440 až 8 880 luxů pro chladné bílé světlo odpovídá přibližně doporučené světelné intenzitě 60–120 μE·m– 2 · s– 1). Nad inkubační plochou musí být udržována intenzita světla v rozmezí ± 15 % od průměrné intenzity světla.

Doba trvání zkoušky

32.

Zkouška obvykle trvá 72 hodin. Lze však použít kratší nebo delší doby trvání zkoušky, pokud lze splnit všechna kritéria platnosti uvedená v odstavci 11.

Měření a analytická stanovení

33.

Biomasa řas se v každé baňce určí během doby zkoušky nejméně jednou denně. Jestliže se měření provádí na malých objemech odebraných ze zkušebního roztoku pipetou, tyto se nenahrazují.

34.

Měření biomasy se provádí ručním počítáním buněk pod mikroskopem nebo pomocí elektronického počítače částic (počty buněk a/nebo biologický objem). Alternativní techniky, jako jsou např. průtoková cytometrie, fluorescence chlorofylu in vitro nebo in vivo (5, 6) nebo optická hustota, lze použít za předpokladu, že je možné prokázat uspokojivou korelaci s biomasou v rozmezí, v němž se biomasa během zkoušky vyskytuje.

35.

pH roztoků se měří na počátku a na konci zkoušky.

36.

Pokud je dostupný analytický postup k určení zkoušené chemické látky v rozmezí použitých koncentrací, zkušební roztoky je třeba analyzovat, aby se ověřily počáteční koncentrace a udržení expozičních koncentrací během zkoušky.

37.

Analýza koncentrace zkoušené chemické látky na počátku a konci zkoušky při nízké a vysoké zkušební koncentraci a koncentrace okolo očekávané EC50 mohou být dostatečné, jestliže je pravděpodobné, že se expoziční koncentrace budou během zkoušky lišit o méně než 20 % od nominálních hodnot. Analýza všech zkušebních koncentrací na počátku a konci zkoušky se doporučuje v případě, kdy je nepravděpodobné, že koncentrace zůstanou v rozmezí 80 až 120 % nominální hodnoty. U těkavých, nestabilních nebo silně adsorbujících zkoušených chemických látek se doporučuje provést dodatečný odběr vzorků k analýze v 24hodinových intervalech během expoziční doby s cílem lépe definovat ztrátu zkoušené chemické látky. U těchto chemických látek mohou být zapotřebí dodatečná opakování. Ve všech případech se určení koncentrací zkoušené chemické látky provádí pouze u jedné z opakovaných kultur při každé zkušební koncentraci (nebo u sdruženého obsahu nádob ze všech opakovaných kultur).

38.

Zkušební média specificky připravená k analýze expozičních koncentrací během zkoušky by měla být exponována stejným způsobem jako zkušební média použitá ke zkoušení, tj. měla by být naočkována řasami a inkubována za identických podmínek. Jestliže se požaduje analýza koncentrace rozpuštěné zkoušené látky, může být nezbytné oddělit řasy od média. Oddělení by se mělo nejlépe provádět odstřeďováním při nízké gravitační síle dostatečné pro usazení řas.

39.

Lze-li prokázat, že byla po celou dobu zkoušky koncentrace zkoušené chemické látky uspokojivě udržována v rozmezí ± 20 % nominální nebo naměřené počáteční koncentrace, může být analýza výsledků založena na nominálních nebo naměřených počátečních hodnotách. Je-li odchylka od nominální nebo naměřené počáteční koncentrace větší než ± 20 %, analýza výsledků by měla být založena na geometrické střední koncentraci během expozice nebo na modelech popisujících pokles koncentrace zkoušené chemické látky (3, 7).

40.

Zkouška inhibice růstu řas je dynamičtější zkušební systém než většina jiných krátkodobých zkoušek vodní toxicity. V důsledku toho může být obtížné definovat skutečné expoziční koncentrace, zvláště u adsorbujících látek zkoušených při nízkých koncentracích. V takových případech vymizení zkoušené látky z roztoku adsorpcí do zvyšující se biomasy řas neznamená, že se ztratila ze zkušebního systému. Při analýze výsledku zkoušky je třeba zkontrolovat, jestli je pokles koncentrace zkoušené chemické látky v průběhu zkoušky doprovázen poklesem inhibice růstu. Pokud tomu tak je, lze zvážit použití vhodného modelu popisujícího pokles koncentrace zkoušené chemické látky (7). Pokud tomu tak není, může být vhodné založit analýzu výsledků na počátečních (nominálních či naměřených) koncentracích.

Další pozorování

41.

Pro ověření normálního a zdravého vzhledu očkovací kultury a sledování jakéhokoliv abnormálního vzhledu řas (které může být způsobeno expozicí zkoušené chemické látce) na konci zkoušky by mělo být provedeno mikroskopické pozorování.

Limitní zkouška

42.

Za určitých okolností, např. pokud předběžná zkouška naznačuje, že zkoušená chemická látka nemá žádné toxické účinky při koncentracích až do 100 mg/l nebo až do meze své rozpustnosti v zkušebním médiu (podle toho, co je nižší), může být provedena limitní zkouška zahrnující porovnání odezvy v kontrolní skupině a odezvy v jedné exponované skupině (100 mg/l nebo koncentrace rovná mezi rozpustnosti). Důrazně se doporučuje podpořit tuto zkoušku analýzou expozičních koncentrací. Všechny dříve popsané zkušební podmínky a kritéria platnosti se vztahují i na limitní zkoušku s výjimkou toho, že by mělo být provedeno alespoň šest opakování s exponovanými vzorky. Proměnné odezvy v kontrolní a exponované skupině mohou být analyzovány pomocí statistického testu pro porovnání středních hodnot, např. Studentova t-testu. Jestliže rozptyly obou skupin nejsou shodné, je třeba provést t-test upravený pro nerovnost rozptylů.

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

Vynášení růstových křivek

43.

Biomasa ve zkušebních nádobách může být vyjádřena v jednotkách náhradního parametru použitého pro měření (např. počet buněk, fluorescence).

44.

Pro vynesení růstových křivek do grafu sestavte tabulku odhadovaných koncentrací biomasy ve zkušebních kulturách a kontrolních kulturách společně s koncentracemi zkušebního materiálu a časy měření zaznamenanými v rozlišení nejméně na celé hodiny. V tomto prvním stadiu mohou být užitečné jak logaritmické, tak lineární stupnice, ale logaritmické stupnice jsou povinné a obecně poskytují lepší zobrazení odchylek ve vzorci růstu během zkušebního období. Nezapomeňte, že exponenciální růst má při vynesení na logaritmické stupnici podobu přímky a že sklon (směrnice) přímky ukazuje specifickou růstovou rychlost.

45.

Po vynesení do grafu prověřte, jestli kontrolní kultury rostou exponenciálně očekávanou rychlostí po celou dobu zkoušky. Kriticky zhodnoťte všechny datové body a vzhled grafů a zkontrolujte, zda v hrubých datech a postupech nejsou chyby. Zejména zkontrolujte všechny body grafu, u nichž se zdá, že se odchylují na základě systematické chyby. Pokud je zřejmé, že lze rozpoznat procesní chyby a/nebo je lze považovat za vysoce pravděpodobné, konkrétní datový bod se označí jako odlehlá hodnota a nebude zahrnut do následné statistické analýzy. (Nulová koncentrace řas v jedné ze dvou nebo tří nádob-replik může ukazovat na to, že nádoba nebyla správně naočkována nebo byla nesprávně vyčištěna.) Důvody pro vyřazení bodu jako odlehlé hodnoty jasně uveďte v závěrečné zprávě. Přijatelnými důvody jsou pouze (vzácné) procesní chyby, a nikoli jen malá preciznost. Statistické postupy pro rozpoznání odlehlé hodnoty mají u tohoto typu problému pouze omezené použití a nemohou nahradit odborné posouzení. Odlehlé hodnoty (takto označené) by nejlépe měly zůstat mezi údaji zobrazenými v jakékoliv následné grafické či tabelární prezentaci dat.

Proměnné odezvy

46.

Účelem této zkoušky je stanovit účinky zkoušené chemické látky na růst řas. Tato zkušební metoda popisuje dvě proměnné odezvy, protože jurisdikce v členských zemích mají odlišné preference a právní požadavky. Mají-li být výsledky zkoušky přijatelné ve všech členských zemích, účinky je třeba vyhodnotit pomocí obou proměnných odezvy a) a b) popsaných dále.

a)    Průměrná specifická růstová rychlost : tato proměnná odezvy se vypočítá na základě logaritmického zvýšení biomasy během zkušebního období a vyjádří se v jednotkách za den.

b)    Výtěžek : tato proměnná odezvy je biomasa na konci zkoušky minus počáteční biomasa.

47.

Je třeba uvést, že hodnoty toxicity vypočítané pomocí těchto dvou proměnných odezvy nejsou srovnatelné a při používání výsledků zkoušky se musí vzít tento rozdíl na vědomí. Hodnoty ECx založené na průměrné specifické růstové rychlosti (ErCx) budou všeobecně vyšší než výsledky založené na výtěžku (EyCx), pokud se dodrží zkušební podmínky této zkušební metody, a to vzhledem k matematickému základu příslušných přístupů. Tuto skutečnost nelze vykládat jako rozdíl v citlivosti mezi těmito dvěma proměnnými odezvy; hodnoty jsou jednoduše matematicky odlišné. Koncepce průměrné specifické růstové rychlosti je založena na obecném průběhu exponenciálního růstu řas v nelimitovaných kulturách, u nichž se toxicita odhaduje na základě účinků na růstovou rychlost, aniž by závisela na absolutní úrovni specifické růstové rychlosti kontrolní kultury, na sklonu křivky závislosti koncentrace-odezva nebo na době trvání zkoušky. Naproti tomu výsledky založené na proměnné odezvy ‚výtěžek‘ jsou závislé na všech těchto ostatních proměnných. EyCx závisí na specifické růstové rychlosti druhů řas použitých v každé zkoušce a na maximální specifické růstové rychlosti, která se může lišit u jednotlivých druhů, a dokonce i u různých kmenů řas. Tato proměnná odezvy by se neměla používat pro srovnávání citlivosti na toxické látky mezi druhy řas, nebo dokonce mezi různými kmeny. Přestože se z vědeckého hlediska dává přednost použití průměrné specifické růstové rychlosti pro odhad toxicity, odhady toxicity založené na výtěžku jsou rovněž do této zkušební metody zahrnuty, aby uspokojily současné právní požadavky v některých zemích.

Průměrná růstová rychlost

48.

Průměrná specifická růstová rychlost pro konkrétní období se vypočítá jako logaritmické zvýšení biomasy z rovnice pro každou jednotlivou nádobu s kontrolními a exponovanými vzorky:

Formula

[1],

kde:

μi-j

je průměrná specifická růstová rychlost od doby i do doby j,

Xi

je biomasa v čase i,

Xj

je biomasa v čase j.

Pro každou exponovanou skupinu a kontrolní skupinu vypočítejte střední hodnotu růstové rychlosti a odhady rozptylu.

49.

Vypočítejte průměrnou specifickou růstovou rychlost po celou dobu trvání zkoušky (obvykle 0 až 3 dny), přičemž namísto naměřené počáteční hodnoty použijte jako počáteční hodnotu spíše nominálně naočkovanou biomasu, protože se tímto způsobem obvykle dosáhne větší přesnosti. Jestliže zařízení použité pro měření biomasy umožňuje dostatečně přesné určení nízké biomasy inokula (např. průtokovým cytometrem), pak lze použít naměřenou počáteční koncentraci biomasy. Rovněž vyhodnoťte růstovou rychlost po jednotlivých časových úsecích vypočtenou jako specifické růstové rychlosti pro každý den v průběhu zkoušky (dny 0–1, 1–2 a 2–3) a zkontrolujte, zda růstová rychlost v kontrolním vzorku zůstává konstantní (viz kritéria platnosti, odstavec 11). Významně nižší specifická růstová rychlost v den jedna v porovnání s celkovou průměrnou specifickou růstovou rychlostí může poukazovat na fázi iniciace. Zatímco v kontrolních kulturách lze fázi iniciace minimalizovat a prakticky vyloučit správnou kultivací předkultury, fáze iniciace v exponovaných kulturách může být známkou obnovy po počátečním toxickém stresu nebo známkou snížené expozice vyvolané ztrátou zkoušené chemické látky (včetně sorpce na biomasu řas) po počáteční expozici. Odpovídajícím způsobem lze růstovou rychlost vyhodnocovat v jednotlivých časových úsecích s cílem zhodnotit účinky zkoušené látky, které se vyskytly během expoziční doby. Významné rozdíly mezi růstovou rychlostí v jednotlivých časových úsecích a průměrnou růstovou rychlostí jsou známkou odchylky od konstantního exponenciálního růstu a vyžadují důkladné prozkoumání růstových křivek.

50.

Vypočítejte procentuální inhibici růstové rychlosti u jednotlivých opakování s exponovanými vzorky se vypočítá z rovnice [2]:

Formula

[2],

kde:

% Ir

=

procentuální inhibice průměrné specifické růstové rychlosti,

μC

=

střední hodnota průměrné specifické růstové rychlosti (μ) v kontrolní skupině,

μT

=

průměrná specifická růstová rychlost při opakování s exponovaným vzorkem.

51.

Jestliže se k přípravě zkušebních roztoků používají rozpouštědla, pro výpočet procentuální inhibice by se měly namísto kontrol bez rozpouštědel používat kontroly s rozpouštědly.

Výtěžek

52.

Výtěžek se vypočítá jako biomasa na konci zkoušky minus počáteční biomasa pro každou jednotlivou nádobu s kontrolními a exponovanými vzorky. Pro každou zkušební koncentraci a kontrolu vypočítejte střední hodnotu výtěžku a odhady rozptylu. Procentuální inhibici výtěžku ( % Iy) lze vypočítat pro každé opakování s exponovanými vzorky následovně:

Formula

[3]

kde:

% Iy

=

procentuální inhibice výtěžku,

YC

=

střední hodnota výtěžku v kontrolní skupině,

YT

=

hodnota výtěžku u jedné repliky s exponovaným vzorkem.

Vynášení křivky závislosti koncentrace-odezva

53.

Vyneste procentuální hodnotu inhibice proti logaritmu koncentrace zkušební látky a vynesené body pečlivě prozkoumejte, přičemž neberte v úvahu žádný datový bod, který byl v první fázi vyloučen jako odlehlá hodnota. Od oka nebo pomocí počítačové interpolace proložte datovými body hladkou křivku, abyste získali první dojem o vztahu koncentrace a odezvy; poté přistupte k podrobnější metodě, nejlépe počítačové statistické metodě. V závislosti na zamýšleném použití dat, jakosti (přesnosti) a množství dat, jakož i na dostupnosti nástrojů pro analýzu dat je možné rozhodnout (a někdy je to dostatečně odůvodněno) o ukončení analýzy dat v tomto stadiu a klíčové hodnoty EC50 a EC10 (a/nebo EC20) se jednoduše odečtou z křivky vytvořené od oka (rovněž viz následující bod o stimulačních účincích). Platnými důvody pro nepoužití statistické metody mohou být:

Údaje nejsou vhodné pro počítačové metody, které neposkytnou spolehlivější výsledky než ty, které lze získat odborným posouzením – v takových situacích mohou dokonce některé počítačové programy selhat při získání spolehlivého řešení (iterace nemusí konvergovat atd.).

Stimulační růstové odezvy nelze odpovídajícím způsobem zpracovat pomocí dostupných počítačových programů (viz níže).

Statistické postupy

54.

Cílem je získat kvantitativní vztah mezi koncentrací a účinkem pomocí regresní analýzy. Je možné použít váženou lineární regresi po provedení linearizující transformace dat odezvy – například do probitových nebo logitových či Weibullových jednotek (8), ale dává se přednost nelineárním regresním postupům, s jejichž pomocí se lépe zpracovávají nevyhnutelné nepravidelnosti dat a odchylky od hladkých distribucí. Při přiblížení se k nule či úplné inhibici mohou být takové nepravidelnosti zesíleny transformací a rušit při analýze (8). Je třeba uvést, že standardní metody analýzy používající probitové, logitové nebo Weibullovy transformace jsou určeny k použití s kvantálními daty (např. mortalita nebo přežití) a musí se upravit, aby se mohly použít na data růstu či biomasy. Speciální postupy pro stanovení hodnoty ECx ze spojitých dat lze nalézt v literatuře (9, 10 a 11). Použití nelineární regresní analýzy je dále podrobně popsáno v dodatku 5.

55.

Pro každou proměnnou odezvy, která se má analyzovat, se použije vztah koncentrace-odezva pro výpočet bodových odhadů hodnot ECx. Je-li to možné, je zapotřebí určit 95 % intervaly spolehlivosti pro každý odhad. Dobrou shodu dat odezvy s regresním modelem je zapotřebí vyhodnotit buď graficky, nebo statisticky. Regresní analýza by se měla provádět pomocí odezev jednotlivých opakování, nikoliv pomocí středních hodnot exponovaných skupin. Pokud však je proložení nelineární křivky obtížné či neúspěšné kvůli příliš velkému rozptylu dat, lze problém obejít provedením regrese na skupinových středních hodnotách, což je praktický způsob, jak snížit vliv podezřelých odlehlých hodnot. Použití této možnosti je zapotřebí zaznamenat v závěrečné zprávě jako odchylku od normálního postupu v důsledku skutečnosti, že křivka vyhovující jednotlivým opakováním nevedla k uspokojivému výsledku.

56.

Odhady EC50 a intervaly spolehlivosti lze rovněž získat lineární interpolací s bootstrapem (metoda postupného výpočtu) (13), pokud se dostupné regresní modely/metody pro příslušná data nehodí.

57.

Pro odhad LOEC, a tedy i NOEC, a pro účinky zkoušené chemické látky na růstovou rychlost je nezbytné porovnat střední hodnoty exponovaných vzorků pomocí metod analýzy rozptylu (ANOVA). Střední hodnota pro každou koncentraci musí být poté porovnána se střední hodnotou pro kontrolní skupinu, a to vhodnou metodou vícenásobného porovnání nebo metodou zkoušky trendu. Užitečný může být Dunnettův nebo Williamsův test (12, 14, 15, 16, 17). Je nezbytné vyhodnotit, zda je splněn předpoklad homogenity rozptylu nezbytný pro ANOVA. Toto hodnocení lze provádět graficky nebo formálním testem (17). Vhodné jsou testy podle Levenea nebo Bartletta. Nesplnění předpokladu homogenity rozptylů může být někdy korigováno logaritmickou transformací dat. Jestliže je heterogenita rozptylů extrémní a nelze ji napravit transformací, pak je třeba zvážit analýzu takovými metodami, jako je sestupný Jonckheerův trend test. Další pokyny pro stanovení NOEC lze nalézt v (11).

58.

Vědecký vývoj poslední doby vedl k doporučení opustit koncepci NOEC a nahradit ji odhady bodů ECx na základě regresní analýzy. Vhodná hodnota pro x nebyla pro tuto zkoušku pomocí řas stanovena. Zdá se, že vhodné je rozmezí od 10 do 20 % (v závislosti na zvolené proměnné odezvy) a nejlépe by se měly v závěrečné zprávě uvádět jak EC10, tak EC20.

Stimulace růstu

59.

Při nízkých koncentracích bývá někdy pozorována stimulace růstu (negativní inhibice). To může být důsledkem buď hormese (‚toxická stimulace‘), nebo přidání stimulujících růstových faktorů se zkušebním materiálem k minimálnímu použitému médiu. Nezapomeňte, že přidání anorganických živin by nemělo mít žádný přímý účinek, protože zkušební médium by mělo po celou dobu zkoušky udržovat přebytek živin. Stimulaci nízkými dávkami lze ve výpočtech EC50 obvykle ignorovat, pokud není extrémní. Je-li však extrémní nebo má-li být vypočtena hodnota ECx pro nízké x, mohou být zapotřebí speciální postupy. K vymazání stimulačních odezev z analýzy dat by nemělo pokud možno dojít, a pokud dostupný software pro stanovení křivky nemůže drobnou stimulaci přijmout, lze použít lineární interpolaci s bootstrapem. Jestliže je stimulace extrémní, lze zvážit použití modelu předpokládajícího hormesi (18).

Netoxická inhibice růstu

60.

Zkušební materiály absorbující světlo mohou způsobit snížení růstové rychlosti, protože stínění snižuje množství dostupného světla. Takové účinky fyzikální povahy je zapotřebí oddělit od toxických účinků, a to úpravou zkušebních podmínek, přičemž takové fyzikální účinky je nutno uvádět v závěrečné zprávě samostatně. Pokyny lze nalézt v literatuře (2 a 3).

ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

61.

V závěrečné zprávě musí být uvedeny tyto údaje:

 

Zkoušená látka:

fyzikální povaha a relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti, včetně meze rozpustnosti ve vodě,

údaje o chemické identifikaci (např. číslo CAS), včetně čistoty (nečistot).

 

Zkušební systém/druh:

kmen, dodavatel nebo zdroj a použité podmínky kultivace.

 

Zkušební podmínky:

datum zahájení zkoušky a délka jejího trvání,

popis uspořádání zkoušky: zkušební nádoby, objemy kultur, hustota biomasy na počátku zkoušky,

složení média,

zkušební koncentrace a opakování (například počet opakování, počet zkušebních koncentrací a použitá geometrická progrese),

popis přípravy zkušebních roztoků včetně použití rozpouštědel atd.,

kultivační zařízení,

intenzita a kvalita světla (zdroj, homogenita),

teplota,

zkušební koncentrace: nominální zkušební koncentrace a jakékoliv výsledky analýz pro stanovení koncentrace zkoušené chemické látky v zkušebních nádobách. V závěrečné zprávě je třeba uvést výtěžnost metody a mez kvantifikace ve zkušební matrici,

všechny odchylky od této zkušební metody,

metoda stanovení biomasy a důkaz o korelaci mezi naměřeným parametrem a hmotností sušiny.

 

Výsledky:

hodnoty pH na počátku a konci zkoušky u všech expozic,

biomasa pro každou baňku v každém měřicím bodě a metoda měření biomasy,

růstové křivky (vynášení biomasy vůči času),

vypočítané proměnné odezvy pro jednotlivé repliky s exponovanými vzorky, spolu se středními hodnotami a variačním koeficientem ze všech opakování,

grafické znázornění vztahu koncentrace/odezva,

odhady toxicity pro proměnné odezvy, např. EC50, EC10, EC20, a související intervaly spolehlivosti. Jestliže se počítají LOEC a NOEC, uvedou se jejich hodnoty a statistické metody použité k jejich stanovení,

jestliže byla použita ANOVA, uvede se velikost účinku, který lze detekovat (např. nejmenší významný rozdíl),

jakákoliv stimulace růstu zjištěná v jakémkoli exponovaném vzorku,

jakékoliv jiné pozorované účinky, např. morfologické změny řas,

diskuse výsledků včetně případného vlivu na výsledek zkoušky v důsledku odchylek od této zkušební metody.

LITERATURA

1)

International Organisation for Standardisation (1993). ISO 8692 Water quality – Algal growth inhibition test.

2)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO/DIS 14442. Water quality – Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waste water.

3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

4)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO 5667-16 Water quality – Sampling – Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

5)

Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.

6)

Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925.

7)

Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073-2079.

8)

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713-718.

9)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.

10)

Bruce, R.D.,and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485-1494.

11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

12)

Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121.

13)

Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

14)

Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.

15)

Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.

16)

Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.

17)

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

18)

Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

Dodatek 1

Definice

Pro účely této zkušební metody se používají následující definice a zkratky:

 

Biomasa je hmotnost sušiny živé hmoty přítomné v populaci vyjádřená ve vztahu k danému objemu; např. mg řas/litr zkušebního roztoku. ‚Biomasa‘ je obvykle definována jako hmota, ale v rámci této zkoušky se toto slovo používá pro hmotu vztaženou na objem. V této zkoušce se obvykle měří náhrady biomasy, například počet buněk, fluorescence atd., a používání termínu ‚biomasa‘ tedy rovněž odkazuje na tyto náhradní míry.

 

Chemická látka je látka nebo směs.

 

Variační koeficient je bezrozměrná veličina proměnlivosti parametru definovaná jako poměr směrodatné odchylky a střední hodnoty. Lze jej rovněž vyjádřit jako procentuální údaj. Střední variační koeficient průměrné specifické růstové rychlosti v kontrolních kulturách použitých k opakování se počítá následovně:

1.

vypočítejte % variační koeficient průměrné specifické růstové rychlosti z denních růstových rychlostí nebo růstových rychlostí po jednotlivých časových úsecích pro příslušnou repliku;

2.

vypočítejte střední hodnotu ze všech hodnot vypočítaných v bodě 1 pro získání středního variačního koeficientu denní specifické růstové rychlosti nebo specifické růstové rychlosti po jednotlivých časových úsecích v opakovaných kontrolních kulturách.

 

ECx je koncentrace zkoušené chemické látky rozpuštěné ve zkušebním médiu, která pro danou expoziční dobu vede k x % (např. 50 %) snížení růstu zkušebního organismu (musí se výslovně uvést, pokud se odchyluje od plné či normální doby trvání zkoušky). Pro jednoznačné označení hodnoty EC odvozené z růstové rychlosti nebo výtěžku se symbol ‚ErC‘ používá pro růstovou rychlost a ‚EyC‘ pro výtěžek.

 

Růstové médium je úplné syntetické kultivační médium, v němž rostou zkušební řasy při expozici zkoušené chemické látce. Zkoušená chemická látka bude za normálních podmínek ve zkušebním médiu rozpuštěna.

 

Růstová rychlost (průměrná specifická růstová rychlost) je logaritmické zvýšení biomasy během doby expozice.

 

Nejnižší koncentrace s pozorovaným účinkem (LOEC) je nejnižší zkušební koncentrace, při níž je pro danou expoziční dobu pozorován statisticky významný účinek chemické látky na snížení růstu (na hladině spolehlivosti p < 0,05) ve srovnání s kontrolou. Všechny zkušební koncentrace vyšší než LOEC musí však mít stejné nebo vážnější škodlivé účinky, než jsou účinky pozorované při koncentraci LOEC. Nelze-li tyto dvě podmínky splnit, musí být podrobně vysvětleno, jak byla LOEC (a tedy i NOEC) zvolena.

 

Koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC) je zkušební koncentrace bezprostředně nižší než LOEC.

 

Proměnná odezvy je proměnná pro odhad toxicity odvozená z jakýchkoliv naměřených parametrů, jež popisují biomasu, různými metodami výpočtu. U této metody jsou proměnnými odezvy růstová rychlost a výtěžek, které se odvozují přímo z měření biomasy nebo jakékoliv z uvedených náhrad.

 

Specifická růstová rychlost je proměnná odezvy definovaná jako podíl rozdílu přirozených logaritmů sledovaného parametru (v této zkušební metodě je jím biomasa) a příslušného časového období.

 

Zkoušená chemická látka je jakákoli látka nebo směs zkoušená pomocí této zkušební metody.

 

Výtěžek je hodnota proměnné měření na konci expoziční doby minus hodnota proměnné měření na počátku expoziční doby, která vyjadřuje nárůst biomasy během zkoušky.

Dodatek 2

Kmeny, u nichž byla prokázána vhodnost pro zkoušku

Zelené řasy

 

Pseudokirchneriella subcapitata (dříve známá jako Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG

 

Desmodesmus subspicatus (dříve známá jako Scenedesmus subspicatus), 86.81 SAG

Rozsivky

Navicula pelliculosa, UTEX 664

Sinice

 

Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A

 

Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1

Zdroje kmenů

Doporučené kmeny jsou dispozici v jednodruhových kulturách z následujících sbírek (v abecedním pořadí):

 

ATCC: American Type Culture Collection (Americká sbírka kultur druhů)

10801 University Boulevard

Manassas, Virginia 20110-2209

USA

 

CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa (Sbírka kultur řas a prvoků)

Institute of Freshwater Ecology,

Windermere Laboratory

Far Sawrey, Amblerside

Cumbria LA22 0LP

Spojené království

 

SAG: Collection of Algal Cultures (Sbírka kultur řas)

Inst. Plant Physiology

University Göttingen

Nicholausberger Weg 18

37073 Göttingen

Německo

 

UTEX Culture Collection of Algae (Sbírka kultur řas)

Section of Molecular, Cellular a Developmental Biology

School of Biological Sciences

the University of Texas at Austin

Austin, Texas 78712

USA.

Vzhled a charakteristiky doporučených druhů

 

P. subcapitata

D. subspicatus

N. pelliculosa

A. flos-aquae

S. leopoliensis

Vzhled

zakřivené, zkroucené jednotlivé buňky

oválné, většinou jednotlivé buňky

tyčinky

řetězce oválných buněk

tyčinky

Velikost (d × š) μm

8–14 × 2–3

7–15 × 3–12

7,1 × 3,7

4,5 × 3

6 × 1

Buněčný objem (μm3/buňka)

40–60 (2)

60–80 (2)

40–50 (2)

30–40 (2)

2,5 (3)

Hmotnost buněčné sušiny (mg/buňku)

2–3 × 10– 8

3–4 × 10– 8

3–4 × 10– 8

1–2 × 10– 8

2–3 × 10– 9

Růstová rychlost (4) (den– 1)

1,5–1,7

1,2–1,5

1,4

1,1–1,4

2,0–2,4

Specifická doporučení pro kultivaci doporučených zkušebních druhů a nakládání s nimi

Pseudokirchneriella subcapitata a Desmodesmus subspicatus

Tyto zelené řasy se obecně snadno udržují v různých kultivačních médiích. Informace o vhodných médiích lze získat ze sbírek kultur. Buňky jsou normálně osamocené a měření hustoty buněk lze snadno provádět použitím elektronického počítače částic nebo mikroskopu.

Anabaena flos-aquae

Pro uchovávání zásobní kultury lze použít různá růstová média. Zejména je důležité zabránit tomu, aby vsázková kultura překročila při obnově fázi logaritmického růstu; zpětné získání je v tomto bodě obtížné.

Anabaena flos-aquae vytváří shluky vnořených řetězců buněk. Velikost těchto shluků se může měnit s podmínkami kultivace. Může vzniknout potřeba tyto shluky rozrušit, pokud se ke stanovení biomasy použije počítání pod mikroskopem nebo elektronický počítač částic.

Pro snížení variability počtu mohou být v dílčích vzorcích použity k rozrušení řetězců ultrazvukové vlny (tzv. sonikace). Delší aplikace ultrazvuku, než je zapotřebí pro rozrušení řetězců na kratší úseky, může buňky zničit. Intenzita a délka aplikace musí být stejná pro každé zpracování.

Spočítejte dostatečný počet políček na hemocytometru (alespoň 400 buněk), což pomůže kompenzovat variabilitu. Tím se zvýší spolehlivost mikroskopického stanovení hustoty.

Pro stanovení celkového buněčného objemu sinic rodu Anabaena po rozrušení řetězců buněk opatrnou sonikací lze použít elektronický počítač částic. Energii ultrazvuku je třeba nastavit tak, aby se předešlo narušení buněk.

Použijte vířivou míchačku nebo podobnou odpovídající metodu, abyste zajistili, že suspenze řas použitá pro inokulaci zkušebních nádob bude dobře promíchaná a homogenní.

Zkušební nádoby je nutno umístit na desku orbitální nebo reciproké třepačky při přibližně 150 otáčkách za minutu. Případně je možné použít občasné promíchávání pro snížení sklonu sinic rodu Anabaena vytvářet shluky. Jestliže ke shlukování dojde, je třeba věnotvat péči tomu, abyste získali reprezentativní vzorky pro měření biomasy. Před odběrem vzorků může být nezbytné intenzívní třepání pro rozrušení shluků sinic.

Synechococcus leopoliensis

Pro uchovávání zásobní kultury lze použít různá růstová média. Informace o vhodných médiích lze získat ze sbírek kultur.

Synechococcus leopoliensis vyrůstají jako jednotlivé buňky tyčinkovitého tvaru. Buňky jsou velmi malé, což komplikuje použití počítání pod mikroskopem pro měření biomasy. Užitečné jsou elektronické počítače částic vybavené pro počítání částic až do velikosti přibližně 1 μm. Rovněž jsou využitelná fluorimetrická měření in vitro.

Navicula pelliculosa

Pro uchování zásobní kultury lze použít různá růstová média. Informace o vhodných médiích lze získat ze sbírek kultur. Je třeba mít na paměti, že v médiu musí být přítomen křemičitan.

Za určitých růstových podmínek může Navicula pelliculosa vytvářet shluky. Kvůli produkci lipidů mají buňky řas někdy tendenci se shlukovat v povrchovém filmu. Za těchto okolností se musí přijmout zvláštní opatření při odběru dílčích vzorků pro stanovení biomasy, aby se získaly reprezentativní vzorky. Patrně bude třeba intenzívní protřepávání, např. použitím vířivé míchačky.

Dodatek 3

Růstová média

Lze použít jedno z následujících dvou růstových médií:

Médium OECD: původní médium podle Pokynu OECD pro zkoušení 201, rovněž podle normy ISO 8692.

Médium US. EPA AAP rovněž podle ASTM.

Při přípravě těchto médií je třeba použít chemické látky analytické čistoty nebo na úrovni činidel a deionizovanou vodu.

Složení média AAP (US. EPA) a média podle Pokynu OECD pro zkoušení 201.

Složka

AAP

OECD

 

mg/l

mM

mg/l

mM

NaHCO3

15,0

0,179

50,0

0,595

NaNO3

25,5

0,300

 

 

NH4Cl

 

 

15,0

0,280

MgCl2 · 6(H2O)

12,16

0,0598

12,0

0,0590

CaCl2 · 2(H2O)

4,41

0,0300

18,0

0,122

MgSO4 · 7(H2O)

14,6

0,0592

15,0

0,0609

K2HPO4

1,044

0,00599

 

 

KH2PO4

 

 

1,60

0,00919

FeCl3 · 6(H2O)

0,160

0,000591

0,0640

0,000237

Na2EDTA · 2(H2O)

0,300

0,000806

0,100

0,000269*

H3BO3

0,186

0,00300

0,185

0,00299

MnCl2 · 4(H2O)

0,415

0,00201

0,415

0,00210

ZnCl2

0,00327

0,000024

0,00300

0,0000220

CoCl2 · 6(H2O)

0,00143

0,000006

0,00150

0,00000630

Na2MoO4 · 2(H2O)

0,00726

0,000030

0,00700

0,0000289

CuCl2 · 2(H2O)

0,000012

0,00000007

0,00001

0,00000006

pH

7,5

8,1

Molární poměr EDTA k železu je mírně větší než jedna. Tím se zabrání srážení železa a současně se minimalizuje chelatace iontů těžkých kovů.

Při zkoušce s rozsivkou Navicula pelliculosa musí být obě média doplněna Na2SiO3 · 9H20 pro dosažení koncentrace 1,4 mg Si/l.

pH média se získá při rovnováze mezi uhličitanovým systémem média a parciálním tlakem CO2 v atmosférickém vzduchu. Přibližný vztah mezi pH při 25 °C a molární koncentrací hydrogenuhličitanu je:

pHrovn = 11,30 + log[HCO3]

S 15 mg NaHCO3/l, pHrovn = 7,5 (médium U.S. EPA) a s 50 mg NaHCO3/l, pHrovn = 8,1 (médium OECD).

Prvkové složení zkušebních médií

Prvek

AAP

OECD

 

mg/l

mg/l

C

2,144

7,148

N

4,202

3,927

P

0,186

0,285

K

0,469

0,459

Na

11,044

13,704

Ca

1,202

4,905

Mg

2,909

2,913

Fe

0,033

0,017

Mn

0,115

0,115

Příprava média OECD

Živina

Koncentrace v zásobním roztoku

Zásobní roztok č. 1:

makroživiny

NH4Cl

1,5 g/l

MgCl2 · 6H2O

1,2 g/l

CaCl2 · 2H2O

1,8 g/l

MgSO4 · 7H2O

1,5 g/l

KH2PO4

0,16 g/l

Zásobní roztok č. 2:

železo

FeCl3 · 6H2O

64 mg/l

Na2EDTA · 2H2O

100 mg/l

Zásobní roztok č. 3:

stopové prvky

H3BO3

185 mg/l

MnCl2 · 4H2O

415 mg/l

ZnCl2

3 mg/l

CoCl2 · 6H2O

1,5 mg/l

CuCl2 · 2H2O

0,01 mg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7 mg/l

Zásobní roztok č. 4:

hydrogenuhličitan

NaHCO3

50 g/l

Na2SiO3 · 9H20

 

Zásobní roztoky vysterilizujte membránovou filtrací (střední průměr pórů 0,2 μm) nebo v autoklávu (120 °C, 15 min). Roztoky skladujte v temnu při 4 °C.

Zásobní roztoky 2 a 4 neošetřujte v autoklávu, ale sterilizujte membránovou filtrací.

Připravte růstové médium přidáním odpovídajícího objemu zásobních roztoků 1 až 4 do vody:

 

Do 500 ml sterilizované vody přidejte:

 

10 ml zásobního roztoku č. 1

 

1 ml zásobního roztoku č. 2

 

1 ml zásobního roztoku č. 3

 

1 ml zásobního roztoku č. 4

 

Doplňte do 1 000 ml sterilizovanou vodou.

Nechte stát dostatečně dlouhou dobu na to, aby se vytvořila rovnováha média s atmosférickým CO2, v případě potřeby pomocí probublávání sterilním filtrovaným vzduchem po dobu několika hodin.

Příprava U.S. EPA média

1.

Přidejte 1 ml každého zásobního roztoku v 2.1–2.7 do přibližně 900 ml deionizované nebo destilované vody a poté zřeďte do 1 litru.

2.

Zásobní roztoky makroživin se připraví rozpuštěním následujících látek v 500 ml deionizované nebo destilované vody. Činidla 2.1, 2.2, 2.3 a 2.4 se mohou spojit do jednoho zásobního roztoku.

2.1

NaNO3

12,750 g.

2.2

MgCl2 · 6H2O

6,082 g.

2.3

CaCl2 · 2H2O

2,205 g.

2.4

Zásobní roztok mikroživin (viz 3).

2.5

MgSO4 · 7H2O

7,350 g.

2.6

K2HPO4

0,522 g.

2.7

NaHCO3

7,500 g.

2.8

Na2SiO3 · 9H2O

viz poznámka 1.

Poznámka 1: Používejte pouze pro zkušební druhy rozsivek. Může se přidat přímo (202,4 mg) nebo prostřednictvím zásobního roztoku, aby bylo dosaženo konečné koncentrace 20 mg/l Si v médiu.

3.

Zásobní roztok mikroživin se připraví rozpuštěním následujících látek v 500 ml deionizované nebo destilované vody:

3.1

H3BO3

92,760 mg

3.2

MnCl2 · 4H2O

207,690 mg

3.3

ZnCl2

1,635 mg

3.4

FeCl3 · 6H2O

79,880 mg

3.5

CoCl2 · 6H2O

0,714 mg

3.6

Na2MoO4 · 2H2O

3,630 mg

3.7

CuCl2 · 2H2O

0,006 mg

3.8

Na2EDTA · 2H2O

150,000 mg [dinatrium-ethylendiamintetraacetát dihydrát].

3.9

Na2SeO4 · 5 H2O

0,005 mg viz poznámka 2.

Poznámka 2: Použije se pouze v médiu pro zásobní kultury druhů rozsivek.

4.

pH upravte na 7,5 ± 0,1 přidáním 0,1 N nebo 1,0 N NaOH nebo HCl.

5.

Odfiltrujte média do sterilní nádoby buď přes 0,22 μm membránový filtr, jestliže se má použít počítač částic; pokud se počítač částic použít nemá, přes filtr 0,45 μm.

6.

Médium skladujte až do použití v temnu při teplotě přibližně 4 °C.

Dodatek 4

Příklad postupu kultivace řas

Všeobecné poznámky

Účelem kultivace následujícím postupem je získání kultur řas pro zkoušky toxicity.

Použijte vhodné metody, které zajistí, že kultury řas nebudou infikovány bakteriemi. Axenické (zbavené cizích organismů) kultury mohou být vhodné, avšak musí se vytvořit a používat jednodruhové kultury.

Všechny operace se musí provádět za sterilních podmínek, aby nedošlo ke kontaminaci bakteriemi a jinými řasami.

Zařízení a materiály

Viz zkušební metoda: Přístroje a pomůcky

Postupy při získávání kultur řas

Příprava živných roztoků (média):

Všechny soli živin média se připraví jako koncentrované zásobní roztoky a skladují se v temnu a chladu. Tyto roztoky se sterilizují filtrací nebo autoklávem.

Médium se připraví přidáním správného množství zásobního roztoku do sterilní destilované vody, přičemž se dbá na to, aby nedošlo k žádné infekci. K získání pevného média se doplní 0,8 % agaru.

Kmenová kultura:

Kmenové kultury jsou malé kultury řas, které se pravidelně přenášejí do čerstvého média, kde slouží jako výchozí zkušební materiál. Nejsou-li kultury pravidelně používány, naočkovávají se na šikmý agar. Poté se nejméně jednou za dva měsíce přenášejí do čerstvého média.

Kmenové kultury se pěstují v Erlenmeyerových baňkách obsahujících vhodné médium (objem přibližně 100 ml). Jsou-li řasy kultivovány při teplotě 20 °C a za stálého osvětlení, musí se přenášet každý týden.

Při přeočkování se přenese sterilní pipetou do baňky s čerstvým médiem takové množství ‚staré‘ kultury, aby byla počáteční koncentrace u rychle rostoucího druhu řas asi stokrát menší než koncentrace kultury staré.

Růstovou rychlost druhu řas lze odečíst z růstové křivky. Je-li známa, lze z ní odhadnout hustotu, při níž musí být kultura přenesena do čerstvého média. K tomu musí dojít před fází odumírání kultury.

Předkultura:

Účelem předkultur je poskytnout dostatečné množství řas potřebných pro naočkování zkušebních kultur. Předkultura se kultivuje za zkušebních podmínek a použije se ještě během exponenciálního růstu, to znamená obvykle po inkubační době o délce 2 až 4 dní. Obsahují-li kultury řas deformované nebo abnormální buňky, musí se odstranit.

Dodatek 5

Analýza dat pomocí nelineární regrese

Obecné poznámky

Odezva ve zkouškách růstu řas a jiných zkouškách mikrobiálního růstu – růstu biomasy – je svojí povahou spojitá nebo metrická proměnná – rychlost procesu, jestliže se použije růstová rychlost, a její integrál během doby, pokud se zvolí biomasa. Obě jsou popsány příslušnou střední odezvou neexponovaných kontrolních replik, jež vykazují maximální odezvu při daných podmínkách – přičemž světlo a teplota jsou primární určující faktory ve zkoušce růstu řas. Systém je distribuovaný nebo homogenní a na biomasu je možné nahlížet jako na kontinuum, aniž by se braly v úvahu jednotlivé buňky. Distribuce rozptylu typu odezvy pro takový systém závisí výhradně na experimentálních faktorech (obvykle popsaných lognormálními nebo normálními distribucemi chyb). To je v kontrastu s typickými odezvami biozkoušek s kvantálními daty, u nichž se často předpokládá, že tolerance (obvykle s binomickou distribucí) jednotlivých organismů je dominantní složkou rozptylu. Kontrolní odezvy jsou zde nulové nebo na základní úrovni.

V nekomplikované situaci normalizovaná nebo relativní odezva, r, klesá monotónně z 1 (nulová inhibice) na 0 (100 % inhibice). Je třeba mít na paměti, že všechny odezvy mají přidruženou chybu a že očividně negativní inhibice se dají vypočítat pouze jako výsledek náhodných chyb.

Regresní analýza

Modely

Cílem regresní analýzy je kvantitativně popsat křivku závislosti koncentrace a odezvy ve formě matematické regresní funkce Y = f (C) nebo častěji F(Z), kde Z = log C. Použití inverzní funkce C = f– 1 (Y) dovoluje vypočítat hodnoty ECx, včetně EC50, EC10 a EC20, a jejich 95 % intervaly spolehlivosti. Prokázalo se, že vztah koncentrace a odezvy získané ve zkouškách inhibice růstu řas úspěšně popisuje několik jednoduchých matematických funkcí. Funkce například obsahují logistickou rovnici, nesymetrickou Weibulovu rovnici a lognormální distribuční funkci, které jsou všechny esovitými křivkami asymptoticky se blížícími nule pro C → 0 a jedné pro C → nekonečno.

Použití modelů spojité prahové funkce (např. Kooijmanův model ‚pro inhibici populačního růstu‘, Kooijman a kol. 1996) bylo nedávno navrženo jako alternativa k asymptotickým modelům. Tento model nepředpokládá žádné účinky při koncentracích pod určitou prahovou hodnotou EC0+, která se odhaduje extrapolací vztahu odezva-koncentrace, aby došlo k protnutí osy koncentrace pomocí jednoduché spojité funkce, která není v počátečním bodě diferencovatelná.

Je třeba mít na paměti, že analýza může být prostou minimalizací reziduálních součtů čtverců (za předpokladu konstantního rozptylu) nebo vážených čtverců, jestliže je kompenzuje heterogenita rozptylu.

Postup

Postup lze nastínit následovně: zvolte vhodnou funkční rovnici Y = f(C) a uzpůsobte ji podle údajů pomocí nelineární regrese. Je lepší použít měření z každé jednotlivé baňky než střední hodnoty opakování, aby se z dat získalo co nejvíce informací. Je-li rozptyl vysoký, praktická zkušenost naopak naznačuje, že střední hodnoty opakování mohou poskytovat spolehlivější matematický odhad, který bude méně ovlivněn systematickými chybami v datech, než je tomu u každého zachovaného jednotlivého datového bodu.

Vyneste vytvořenou křivku a naměřená data a prozkoumejte, zda byla křivka vynesena správně. Analýza reziduálních hodnot může být pro tento účel zvláště užitečným nástrojem. V případě, že zvolený funkční vztah pro vyjádření odezvy koncentrace nepopisuje dobře celou křivku nebo některou její zásadně důležitou část, jako je např. odezva při nízkých koncentracích, zvolte jinou variantu vložení křivky – např. nesymetrickou křivku, jako je Weibulova funkce – místo křivky symetrické. Negativní inhibice mohou představovat problém, například u lognormální distribuční funkce, která podobně vyžaduje alternativní regresní funkci. Takovým negativním hodnotám se nedoporučuje přiřazovat nulu nebo malou kladnou hodnotu, protože se tím zkresluje distribuce chyb. Vhodným postupem může být na části křivky nasadit samostatnou křivku, například v části s nízkou inhibicí, pro odhad hodnot ECnízké x. Vypočítejte ze vsazené rovnice (metodou ‚inverzního odhadu‘, C = f– 1(Y)) odhady charakteristického bodu ECx a uveďte přinejmenším EC50 a jeden nebo dva odhady ECnízké x. Zkušenost z praktických zkoušek ukázala, že přesnost zkoušky růstu řas obvykle umožňuje přiměřeně přesný odhad na úrovni 10 % inhibice, jsou-li datové body dostačující – ledaže by se vyskytla stimulace při nízkých koncentracích jakožto zkreslující faktor. Přesnost odhadu EC20 je často podstatně lepší než přesnost odhadu EC10, protože EC20 se obvykle nachází na přibližně lineární části centrální křivky odezvy koncentrace. Někdy se EC10 interpretuje obtížně kvůli růstové stimulaci. Tudíž zatímco EC10 se dá obvykle zjistit s dostatečnou přesností, doporučuje se vždy v závěrečné zprávě uvádět také EC20.

Váhové faktory

Experimentální rozptyl není obecně konstantní a obvykle zahrnuje proporcionální složku, proto je výhodné běžně provádět váženou regresi. Obvykle se předpokládá, že váhové faktory pro takovou analýzu jsou nepřímo úměrné rozptylu:

Wi = 1/Var(ri)

Řada regresních programů umožňuje váženou regresní analýzu s váhovými faktory uvedenými v tabulce. Váhové faktory by se měly pohodlně normalizovat vynásobením n/Σ wi (n je počet datových bodů) tak, aby se jejich součet rovnal jedné.

Normalizace odezev

Normalizování střední kontrolní odezvou přináší určité principiální problémy a vede ke vzniku poněkud komplikované struktury rozptylu. Dělením odezev střední kontrolní odezvou pro získání procentuální hodnoty inhibice se zavádí dodatečná chyba způsobená chybou kontrolní střední hodnoty. Pokud tato chyba není zanedbatelně malá, musí se opravit váhové faktory v regresní analýze a intervaly spolehlivosti na kovarianci (Draper a Smith, 1981). Je nutné mít na paměti, že je důležitá vysoká přesnost u odhadované střední kontrolní odezvy pro minimalizaci celkového rozptylu u relativní odezvy. Tento rozptyl je následující:

(Dolní index i znamená úroveň koncentrace i a dolní index 0 odkazuje na kontroly)

Yi = Relativní odezva = ri/r0 = 1 – I = f(Ci)

s rozptylem Var(Y i) = Var (ri/r0) ≅ (∂Yi/∂ri)2 · Var(ri) + ((∂Yi/∂r0)2 · Var(r0)

a jelikož (∂Yi/∂ ri) = 1/r0 a (∂Yi/∂r0) = ri/r0 2

pro data s normální distribucí a opakováními mi a m0: Var(ri) = σ2/mi

se pak celkový rozptyl relativní odezvy Yi vypočítá:

Var(Yi) = σ2/(r0 2 · mi) + ri 2 · σ2/r0 4 · m0

Chyba kontrolní střední hodnoty je nepřímo úměrná druhé odmocnině počtu zprůměrovaných kontrolních replik, přičemž někdy může být opodstatněné zanést historická data, čímž se chyba značně sníží. Alternativním postupem je data nenormalizovat a nevynášet absolutní odezvy včetně dat kontrolní odezvy, ale zavést hodnoty kontrolní odezvy jako dodatečný parametr, který bude upraven nelineární regresí. Zatímco obvyklá regresní rovnice je dvouparametrická, tato metoda vyžaduje vnesení tří parametrů a proto potřebuje více datových bodů než nelineární regrese prováděná s daty, která jsou normalizována pomocí předem stanovené kontrolní odezvy.

Inverzní intervaly spolehlivosti

Výpočet nelineárních regresních intervalů spolehlivosti inverzním odhadem je poněkud komplikovaný a není to dostupná standardní možnost v běžných balících statistických počítačových programů. Přibližné intervaly spolehlivosti lze získat pomocí standardních programů nelineární regrese s opakovanou parametrizací (Bruce a Versteeg, 1992), což zahrnuje přepisování matematické rovnice za použití požadovaných odhadů bodů, např. EC10 a EC50 jakožto parametrů, které se mají odhadnout. (Nechť je funkce I = f (α, β, koncentrace); využijte definiční vztahy f (α, β, EC10) = 0,1 a f (α, β, EC50) = 0,5 k nahrazení f (α, β, koncentrace) ekvivalentní funkcí g (EC10, EC50, koncentrace).

Přímější výpočet (Andersen a kol. 1998) se provádí zachováním původní rovnice a použitím Taylorova rozvoje okolo středních hodnot ri a r0.

V poslední době začaly být oblíbené metody ‚bootstrap‘ (metody postupného výpočtu). Tyto metody používají naměřené údaje a častý opakovaný odběr vzorků určovaný generátorem náhodných čísel pro odhad empirické distribuce rozptylů.

LITERATURA

Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632.

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

Bruce, R..D. and Versteeg,, D.J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Ecotoxicity Data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494.

Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. (1998). Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.

4)

Kapitola C.11 se nahrazuje tímto:

C.11.   ZKOUŠKA INHIBICE DÝCHÁNÍ AKTIVOVANÉHO KALU (OXIDACE UHLÍKU A AMONIA)

ÚVOD

1.

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení 209 (2010). Tato zkušební metoda popisuje postup stanovení účinků chemické látky na mikroorganismy z aktivovaného kalu (většinou bakterie) měřením rychlosti jejich dýchání (oxidace uhlíku a/nebo amonia) za definovaných podmínek v přítomnosti různých koncentrací zkoušené chemické látky. Zkušební metoda vychází ze zkoušky ETAD (Ekologická a toxikologická asociace průmyslových výrobců barviv) (1, 2), z předchozího pokynu OECD pro zkoušení 209 (3) a z přepracované normy ISO 8192 (4). Účelem zkoušky je poskytnout rychlou screeningovou metodu posouzení účinků chemických látek na mikroorganismy aktivovaného kalu v biologickém (aerobním) stupni čistíren odpadních vod. Výsledky zkoušky mohou rovněž sloužit jako indikátor vhodných neinhibujících koncentrací zkoušených chemických látek pro použití ve zkouškách biologické rozložitelnosti (například kapitoly C.4 A-F, C.9, C.10, C12 a C.29 této přílohy, Pokyn OECD pro zkoušení 302C). V tomto případě se zkouška může provádět jako screeningový test, podobně jako orientační nebo limitní zkoušky (viz odstavec 39), přičemž se bere v úvahu pouze celková respirace. Avšak tuto informaci je třeba pečlivě zvážit u zkoušek snadné biologické rozložitelnosti (kapitoly C.4 A-F a C.29 této přílohy), u nichž je koncentrace inokula významně nižší než koncentrace používaná v této zkušební metodě. Absence inhibice v této respirační zkoušce samozřejmě nemá automaticky za následek podmínky nulové inhibice u zkoušek snadné biologické rozložitelnosti – kapitoly C.4 A-F nebo C.29 této přílohy.

2.

Obecně se dá říci, že zkouška inhibice dýchání byla od té doby, co byla poprvé publikována, úspěšně aplikována, ovšem za určitých okolností byly uváděny nevěrohodné výsledky, např. (2, 4, 5). Respirační křivky v závislosti na koncentraci jsou někdy dvoufázové, grafy dávka-odezva byly zkreslené a hodnoty EC50 byly neočekávaně nízké (5). Zkoumání ukázala, že takové výsledky se získají, když se aktivovaný kal použitý ve zkoušce významně nitrifikuje a zkoušená chemická látka má větší účinek na oxidaci amonia než na obecnou heterotrofní oxidaci. Proto mohou být tyto nevěrohodné výsledky upřesněny provedením dodatečných zkoušek za použití specifického inhibitoru nitrifikace. Měřením rychlostí příjmu kyslíku za přítomnosti takového inhibitoru a ze jeho nepřítomnosti, např. N-allylthiomočoviny (ATU), je možné vypočítat odděleně celkovou, heterotrofní a nitrifikační rychlost příjmu kyslíku (4, 7, 8). Takto lze stanovit inhibiční účinky zkoušené chemické látky ve dvou procesech a je možné obvyklým způsobem vypočítat hodnoty EC50 jak pro oxidaci organického uhlíku (heterotrofní), tak pro oxidaci amonia (nitrifikační). Je třeba poznamenat, že v některých vzácných případech může být účinek inhibice N-allylthiomočoviny částečně nebo úplně neutralizován v důsledku komplexace se zkoušenými chemickými látkami nebo s látkami obohacujícími médium, např. ionty Cu++ (6). Ionty Cu++ jsou nepostradatelné pro bakterie rodu Nitrosomonas, ale ve vyšších koncentracích jsou toxické.

3.

Potřeba nitrifikace v aerobním čištění odpadních vod jako nezbytného kroku v procesu odstranění dusíkatých sloučenin z odpadních vod cestou denitrifikace na plynné produkty se stala naléhavou zejména v evropských zemích; EU nyní stanovila nižší limity pro koncentrace dusíku ve vyčištěných odpadech vypouštěných do vodních toků (5).

4.

Ve většině případů je metoda hodnocení účinku pouze na procesy oxidace organicky vázaného uhlíku postačující. Avšak v některých případech jsou zkoumání účinku na samotnou nitrifikaci nebo jak na nitrifikaci, tak na oxidaci organického uhlíku odděleně potřebná pro interpretaci výsledů a pochopení účinků.

PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

5.

Respirační rychlosti vzorků aktivovaného kalu vyživovaného syntetickými odpadními vodami se měří v uzavřené nádobě s kyslíkovou elektrodou po kontaktní době 3 hodin. Při uvážení realistického expozičního scénáře mohou být vhodné delší kontaktní časy. Jestliže se zkoušená chemická látka rychle rozkládá, např. abiotickou hydrolýzou, nebo je těkavá a její koncentraci nelze dostatečně udržovat, je možné dodatečně použít kratší expoziční dobu, např. 30 minut. Citlivost každé dávky aktivovaného kalu je třeba prověřit s vhodnou referenční chemickou látkou v den expozice. Zkouška se obvykle používá pro stanovení ECx (např. EC50) zkoušené chemické látky a/nebo koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC).

6.

Inhibice příjmu kyslíku mikroorganismy oxidujícími organický uhlík může být vyjádřena odděleně od inhibice mikroorganismy oxidujícími amonium prostřednictím měření rychlostí příjmu kyslíku za nepřítomnosti a přítomnosti N-allylthiomočoviny, což je specifický inhibitor oxidace amonia na dusitan nitrifikačními bakteriemi v prvním stupni. V tomto případě se procentuální inhibice rychlosti příjmu kyslíku vypočítá porovnáním rychlosti příjmu kyslíku za přítomnosti zkoušené chemické látky se střední hodnotou rychlosti příjmu kyslíku odpovídajících kontrolních vzorků neobsahujících žádnou zkoušenou chemickou látku jak v přítomnosti, tak i v nepřítomnosti specifického inhibitoru N-allylthiomočoviny.

7.

Jakýkoli příjem kyslíku pocházející z abiotických procesů se dá detekovat stanovením rychlosti ve směsích zkoušené chemické látky, média syntetických odpadních vod a vody, s vynecháním aktivovaného kalu.

INFORMACE O ZKOUŠENÉ CHEMICKÉ LÁTCE

8.

Pro správnou interpretaci výsledků, která má být provedena, by měla být známa identifikace (nejlépe číslo CAS), název (IUPAC), čistota zkoušené chemické látky, její rozpustnost ve vodě, tlak par a adsorpční vlastnosti. Těkavé chemické látky se obvykle nemohou přiměřeně zkoušet, pokud se nepřijmou speciální opatření (viz odstavec 21).

POUŽITELNOST ZKUŠEBNÍ METODY

9.

Zkušební metodu je možné použít na chemické látky rozpustné ve vodě, obtížně rozpustné a těkavé chemické látky. Avšak ne vždy je možné získat hodnoty EC50 pro chemické látky s omezenou rozpustností a platné výsledky s těkavými chemickými látkami je možné získat pouze za předpokladu, že větší část (řekněme > 80 %) zkoušené chemické látky zůstane v reakční směsi na konci doby expozice. V případě, že existuje jakákoli nejistota ohledně stability zkoušené chemické látky nebo její těkavosti, měly by být předloženy další podpůrné analytické údaje, aby se upřesnila ECx koncentrace.

REFERENČNÍ CHEMICKÉ LÁTKY

10.

Referenční chemické látky se musí pravidelně zkoušet, aby se zajistilo, že zkušební metoda a podmínky jsou spolehlivé, a prověřila citlivost každé dávky aktivovaného kalu použité jako mikrobiální inokulum v den expozice. Chemická látka 3,5-dichlorfenol (3,5-DCP) je doporučena jako referenční inhibiční chemická látka, jelikož se jedná o známý inhibitor dýchání a používá se v různích druzích zkoušek inhibice/toxicity (4). Rovněž síran měďnatý pentahydrát se dá použít jako referenční chemická látka pro inhibici celkové respirace (9). N-methylanilin lze použít jako specifický referenční inhibitor nitrifikace (4).

KRITÉRIA PLATNOSTI A REPRODUKOVATELNOST

11.

Rychlost příjmu kyslíku u slepých zkoušek (bez zkoušené chemické látky nebo referenční chemické látky) by neměla být nižší než 20 mg kyslíku na 1 g aktivovaného kalu (hmotnost sušiny suspendovaných pevných látek) za hodinu. Je-li rychlost nižší, je třeba zkoušku opakovat s vypraným aktivovaným kalem nebo s kalem z jiného zdroje. Variační koeficient rychlosti příjmu kyslíku v kontrolních opakovaných zkouškách by neměl být vyšší než 30 % na konci hlavní zkoušky.

12.

Při mezinárodním okružním testu organizovaném ISO v roce 2004 (4) za použití aktivovaného kalu získaného z domácích odpadních vod bylo zjištěno, že EC50 3,5-DCP leží v rozsahu 2 mg/l až 25 mg/l pro celkovou respiraci, 5 mg/l až 40 mg/l pro heterotrofní respiraci a 0,1 mg/l až 10 mg/l pro nitrifikační respiraci. V případě, že EC50 3,5-DCP neleží v očekávaném rozsahu, je třeba zkoušku opakovat s aktivovaným kalem z jiného zdroje. EC50 pentahydrátu síranu měďnatého by měl spadat do rozsahu 53–155 mg/l pro celkovou respiraci (9).

POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

Zkušební nádoby a přístroje

13.

Použije se běžné laboratorní vybavení a následující pomůcky:

a)

zkušební nádoby – například 1 000ml kádinky, které pojmou 500 ml reakční směsi (viz 5 na Obr.1);

b)

kyveta a úchyty pro měření koncentrace rozpuštěného kyslíku; vhodná kyslíková elektroda; uzavřená kyveta obsahující vzorek bez volného prostoru pod víčkem a zapisovač (např. 7, 8, 9 na obr. 1 v dodatku 2); další možností je použít BSK láhev s vhodnou redukční objímkou pro utěsnění kyslíkové elektrody v hrdle lahve (viz obr. 2 v dodatku 3). Aby se předešlo ztrátám vytlačené kapaliny po vložení kyslíkové elektrody, doporučuje se nejdříve skrz objímku vložit nálevku nebo skleněnou trubičku nebo použít nádoby s rozšířenými okraji. V obou případech se použije magnetická míchačka nebo jiný způsob míchání, např. samomíchací sonda;

c)

magnetické míchačky s míchacími tyčinkami pokrytými inertním materiálem pro použití v měřicí komoře a/nebo ve zkušební nádobě;

d)

provzdušňovací zařízení: v případě potřeby je nutné, aby stlačený vzduch procházel skrz vhodný filtr pro odstranění prachu a oleje a skrz promývací lahve obsahující vodu pro zvlhčení vzduchu. Obsah nádob se musí provzdušňovat pomocí Pasteurových pipet nebo jiných provzdušňovacích zařízení, která neadsorbují chemické látky. Rotační třepačka pracující při rychlostech rotace od 150 do 250 ot/min s baňkami o objemu např. 2 000 ml se může použít pro pokrytí spotřeby kyslíku kalem a překonání obtíží s chemickými látkami, které jsou mimořádně pěnivé, těkavé, a proto se ztrácejí, nebo se při provzdušňování proudem vzduchu dají obtížně dispergovat. Zkušební systém se obvykle skládá z řady kádinek nepřetržitě provzdušňovaných a uspořádaných do posloupnosti (např. v cca 10–15minutových intervalech) a poté postupně analyzovaných. Rovněž je možné použít validované přístrojové vybavení, které umožňuje souběžné provzdušňování a měření rychlosti spotřeby kyslíku ve směsích;

e)

pH-metr;

f)

odstředivka, běžná stolní odstředivka pro kal, která je schopna dosáhnout odstředivého zrychlení 10 000 m/s2.

Činidla

14.

Při zkouškách se musí zásadně používat činidla analytické čistoty.

Voda

15.

Musí se použít destilovaná nebo deionizovaná voda obsahující méně než 1 mg/l DOC (rozpuštěný organický uhlík) s výjimkou případů, kdy je předepsána voda z vodovodu bez chlóru.

Syntetická odpadní voda

16.

Médium se musí připravit tak, aby obsahovalo následující složky v uvedených množstvích:

pepton

16 g

masový extrakt (nebo srovnatelný rostlinný extrakt)

11 g

močovina

3 g

chlorid sodný (NaCl)

0,7 g

chlorid vápenatý dihydrát (CaC12 · 2H2O)

0,4 g

síran hořečnatý heptahydrát (MgSO4 · 7H2O)

0,2 g

bezvodý hydrogenfosforečnan draselný (K2HPO4)

2,8g

destilovaná nebo deionizovaná voda do 1 litru

 

17.

pH tohoto roztoku by mělo být 7,5 ± 0,5. Jestliže se připravené médium nepoužije ihned, musí se skladovat v temnu při 0–4 °C po dobu maximálně 1 týdne nebo za podmínek, kdy se nemění jeho složení. Je třeba poznamenat, že tato syntetická odpadní voda má 100násobnou koncentraci oproti vodě popsané v technické zprávě OECD ‚Návrh metody stanovení biologické rozložitelnosti povrchově aktivních látek používaných v syntetických detergentech‘ (11. června 1976), s přídavkem hydrogenfosforečnanu draselného.

18.

Alternativně se mohou složky média sterilizovat jednotlivě před skladováním nebo se krátce před provedením zkoušky může přidat pepton a masový extrakt. Před použitím se musí médium důkladně promíchat a je-li třeba, pH upravit na 7,5 ± 0,5.

Zkoušená chemická látka

19.

Zásobní roztok se musí připravit pro zkoušené látky snadno rozpustné ve vodě až do maximální rozpustnosti ve vodě (nesmí dojít k vysrážení). Látky špatně rozpustné ve vodě, směsi se složkami o rozdílné rozpustnosti ve vodě a adsorbující se látky se musí navážit přímo do zkušebních nádob. V těchto případech je možné použít zásobní roztoky, jestliže koncentrace rozpuštěných zkoušených chemických látek jsou analyticky stanoveny ve zkušebních nádobách (před přidáním aktivovaného kalu). Jestliže se připravují upravené frakce WAF, je rovněž důležité provést analytické stanovení koncentrací rozpuštěných zkoušených chemických látek ve zkušebních nádobách. Použití organických rozpouštědel, dispergátorů/emulgátorů ke zlepšení rozpustnosti je nepřípustné. Zpracování zásobních roztoků ultrazvukem a předmícháním suspenzí, např. přes noc, je možné, jestliže jsou k dispozici adekvátní informace ohledně stability zkoušené chemické látky za takovýchto podmínek.

20.

Zkoušená chemická látka může negativně ovlivnit pH zkušebního systému. Hodnota pH zkoušených chemicky zpracovaných směsí se musí stanovit před sestavením zkoušky v předběžném pokusu, aby se zjistilo, zda bude třeba úprava pH před hlavní zkouškou a znovu v den hlavní zkoušky. Před přidáním inokula je třeba roztoky/suspenze zkoušené chemické látky ve vodě podle potřeby neutralizovat. Protože ale neutralizace může pozměnit chemické vlastnosti chemické látky, mohou být v závislosti na účelu studie provedeny další zkoušky, aby se vyhodnotil účinek zkoušené chemické látky na kal bez úpravy pH.

21.

Toxické účinky těkavých chemických látek, zejména u zkoušek, při kterých vzduch probublává skrz systém, mohou vyústit do různých úrovní působení v důsledku ztrát látky během expozice. Při práci s takovými látkami je třeba postupovat obezřetně a provádět látkově specifickou analýzu kontrolních směsí obsahujících danou látku a měnit režim provzdušňování.

Referenční chemické látky

22.

Je-li 3,5-dichlorfenol použit jako referenční chemická látka, je třeba připravit roztok 1,00 g 3,5-dichlorfenolu v 1 000 ml vody (15). Pro urychlení rozpouštění je třeba použít teplou vodu a/nebo tzv. ultrazvukovou lázeň. Po ochlazení na laboratorní teplotu se roztok doplní na daný objem. Je však třeba zajistit, aby referenční chemická látka nedoznala strukturních změn. pH roztoku se musí kontrolovat a podle potřeby upravit použitím NaOH nebo H2SO4 na pH 7–8.

23.

Jestliže se jako referenční chemická látka použije síran měďnatý pentahydrát, použijí se koncentrace 58 mg/l, 100 mg/l a 180 mg/l (faktor 1,8). Látka se naváží přímo do zkušebních nádob (29 – 50 – 90 mg na celkový objem 500 ml). Pak se rozpustí v 234 ml vody z vodovodu upravené v autoklávu. Síran měďnatý pentahydrát je snadno rozpustný. Na začátku zkoušky se přidá 16 ml syntetické odpadní vody a 250 ml aktivovaného kalu.

Specifický inhibitor nitrifikace

24.

Připraví se zásobní roztok 2,32 g/l N-allylthiomočoviny (ATU). 2,5 ml tohoto zásobního roztoku se přidá do inkubační směsi o konečném objemu 500 ml, čímž se dosáhne konečné koncentrace 11,6 mg ATU/l (10– 4 mol/l), která je, jak známo (4), dostatečná, aby způsobila 100 % inhibici nitrifikace v nitrifikujícím aktivovaném kalu, který obsahuje 1,5 g/l suspendovaných pevných látek.

Abiotický kontrolní vzorek

25.

Za určitých vzácných podmínek může zkoušená chemická látka se silnými redukčními vlastnostmi způsobit měřitelnou spotřebu kyslíku při abiotickém rozkladu. V takových případech jsou nezbytné abiotické kontroly, aby se dalo rozlišit mezi příjmem kyslíku zkoušenou chemickou látkou způsobeným abiotickým rozkladem a mikrobiálním dýcháním. Abiotický kontrolní vzorek je možné připravit vynecháním inokula ze zkušebních směsí. Podobně je možné zařadit abiotické kontroly bez inokula, když se provedou podpůrná analytická měření pro stanovení dosažené koncentrace během expoziční fáze zkoušky, např. když se použijí zásobní roztoky chemických látek špatně rozpustných ve vodě se složkami o rozdílné rozpustnosti ve vodě. Ve speciálních případech může být zapotřebí připravit abiotickou kontrolu se sterilizovaným inokulem (např. v autoklávu nebo přidáním sterilizačních toxických látek). Některé chemické látky mohou produkovat nebo spotřebovávat kyslík, pouze je-li povrch dostatečně velký pro reakci, i když obvykle k tomu potřebují daleko vyšší teplotu nebo tlak. V tomto ohledu je třeba věnovat speciální pozornost látkám s peroxy skupinou. Sterilizované inokulum poskytuje veliký povrch.

Inokulum

26.

Pro obecné použití je třeba shromáždit aktivovaný kal na výstupu z provzdušňovací nádrže nebo v blízkosti výstupu z nádrže dobře provozované čistírny odpadních vod, do které přicházejí především odpadní vody z domácností. V závislosti na účelu zkoušky lze rovněž použít jiné postačující druhy nebo zdroje aktivovaného kalu, např. kal vypěstovaný v laboratoři, a to s vhodnými koncentracemi suspendovaných pevných látek ve výši 2 g/l až 4 g/l. Avšak kaly z rozdílných čistíren odpadních vod často vykazují rozdílné charakteristiky a citlivosti.

27.

Kal se dá použít tak, jak je sebrán, ale hrubé částice se musí odstranit usazením po krátkou dobu, např. 5 až 15 minut, a dekantací horní vrstvy jemnějších pevných částic nebo prosetím (např. přes síto s otvory o ploše 1 mm2). Alternativně je možné kal homogenizovat mísením po dobu cca 15 s nebo delší, ale pozornost je třeba věnovat třecím silám a teplotním změnám, které se mohou vyskytnout při dlouhodobém mísení.

28.

Často je nezbytné kal promýt, např. je-li rychlost endogenní respirace nízká. Kal je nejdříve třeba odstřeďovat po určitou dobu, aby se získal čirý supernatant a granule pevných částic odpadních vod, např. 10 minut při odstředivém zrychlení cca 10 000 m/s2. Kapalný supernatant se slije a kal se resuspenduje v nechlórované vodě z vodovodu, protřepe a promývací voda se pak odstraní opětovným odstředěním a slitím. Proces promývání a odstřeďování se musí podle potřeby opakovat. Stanoví se hmotnost sušiny o známém objemu resuspendovaného kalu a kal se zkoncentruje odstraněním kapaliny nebo dále zředí v bezchlórové vodě z vodovodu, aby se získal kal s požadovanou koncentrací pevných částic 3 g/l. Aktivovaný kal se musí nepřetržitě provzdušňovat (např. 2 l/min) při zkušební teplotě, a je-li to možné, použít v den odebrání. Není-li to možné, musí se do kalu denně přidávat syntetická odpadní voda (přívod 50 ml syntetické odpadní vody na litr aktivovaného kalu) po dva další dny. Kal se pak použije ve zkoušce a výsledky jsou přijaty jako platné za předpokladu, že se nevyskytnou žádné významné změny v jeho aktivitě, zjištěné stanovením jeho rychlosti endogenní heterotrofní respirace a nitrifikační respirace.

29.

Potíže mohou nastat, jestliže se během inkubace vyskytne pěnění takového rozsahu, že jsou pěna a na ní zachycené pevné částice kalu vypuzovány z provzdušňovacích nádob. Občas může být pěnění jednoduše následkem přítomnosti syntetické odpadní vody, ale pěnění se dá očekávat, je-li zkoušená chemická látka surfaktant nebo ho obsahuje. Ztráta pevných částic kalu ze zkušebních směsí bude mít za následek uměle sníženou respirační rychlost, která může být chybně interpretována jako důsledek inhibice. Kromě toho se provzdušňováním roztoku surfaktantu surfaktant zkoncentruje ve vrstvě pěny; ztrátou pěny ze zkušebního systému se sníží expoziční koncentrace. Pěnění se dá regulovat jednoduchými mechanickými metodami (např. občasným ručním zamícháním za použití skleněné tyčinky) nebo přidáním silikonového emulgačního odpěňovacího činidla neobsahujícího surfaktant a/nebo použitím metody provzdušňování v třepací lahvi. Je-li problém spojen s přítomností syntetické odpadní vody, je třeba složení odpadní vody upravit přidáním odpěňovacího činidla rychlostí např. 50 μl/l. Je-li pěnění způsobeno zkoušenou chemickou látkou, musí se množství potřebné k potlačení stanovit při maximální zkoušené koncentraci a pak je třeba stejným způsobem ošetřit všechny jednotlivé provzdušňovací nádoby (včetně např. nádob se slepými a referenčními vzorky, ve kterých se pěna nevyskytuje). Jestliže se používají odpěňovací činidla, nesmí dojít k žádné interakci s inokulem a/nebo zkoušenou chemickou látkou.

POSTUP ZKOUŠKY

30.

Je možné stanovit inhibici tří rozdílných příjmů kyslíku, celkového, pouze heterotrofního a pocházejícího z nitrifikace. Obvykle by mělo stačit měření celkové inhibice příjmu kyslíku. Stanovení účinků na heterotrofní příjem kyslíku spojený s oxidací organického uhlíku a v důsledku oxidace amonia je nutné tehdy, jsou-li požadovány konkrétně tyto dva oddělené koncové ukazatele pro příslušnou chemickou látku nebo (volitelně) za účelm vysvětlení atypických křivek dávka-odezva z inhibice celkového příjmu kyslíku.

Zkušební podmínky

31.

Zkoušku je třeba provádět při teplotě v rozsahu 20 ± 2 °C.

Zkoušené směsi

32.

Zkoušené směsi (FT jako v tabulce 1) obsahující vodu, syntetickou odpadní vodu a zkoušenou chemickou látku se připraví tak, aby se získaly rozdílné nominální koncentrace zkoušené chemické látky (viz tabulka 1 – příklad objemů složek). pH se podle potřeby nastaví na 7,5 ± 0,5; směsi se zředí vodou a přidá se inokulum, čímž se dosáhne stejných konečných objemů v nádobách a začne provzdušňování.

Referenční směsi

33.

Referenční směsi (FR) se připraví stejným způsobem jako zkoušené směsi, přičemž se referenční chemická látka, např. 3,5-dichlorfenol, použije namísto zkoušené chemické látky.

Slepé vzorky

34.

Slepé směsi (FB) se připraví na začátku a na konci doby expozice při zkouškách, ve kterých jsou zkušební kádinky uspořádány postupně v intervalech. Ve zkouškách prováděných s vybavením, které umožňuje simultánní měření spotřeby kyslíku, je třeba zahrnout do každé dávky pro simultánní analýzu alespoň dva slepé vzorky. Slepé vzorky obsahují stejné objemy aktivovaného kalu a syntetického média, ale žádnou zkušební chemickou látku nebo referenční chemickou látku. Tyto vzorky se zředí vodou na stejný objem jako zkoušené a referenční směsi.

Abiotický kontrolní vzorek

35.

Je-li to nezbytné, například je-li o zkoušené chemické látce známo nebo u ní existuje podezření, že má silné redukční vlastnosti, je třeba připravit směs FA pro měření abiotické spotřeby kyslíku. Směs musí obsahovat stejné množství zkoušené chemické látky i syntetické odpadní vody a musí mít stejný objem jako zkoušené směsi, ale neobsahuje aktivovaný kal.

Obecný postup a měření

36.

Zkoušené směsi, referenční směsi a slepé vzorky a abiotické kontrolní vzorky se inkubují při zkušební teplotě za podmínek nuceného provzdušňování (0,5 až 1 l/min), aby se koncentrace rozpuštěného kyslíku udržovala nad hranicí 60–70 % saturace a aby se vločky kalu udržely v suspenzi. Rovněž je nezbytné kultury míchat, aby se vločky kalu udržely v suspenzi. Za začátek inkubace se považuje počáteční kontakt inokula aktivovaného kalu s ostatními složkami konečné směsi. Na konci inkubace, po dané expoziční době obvykle 3 hodin, se vzorky vyjmou pro změření rychlosti poklesu koncentrace rozpuštěného kyslíku v kyvetě konstruované pro tento účel (obr. 2 v dodatku 3) nebo ve zcela naplněné BSK láhvi. Způsob zahájení inkubací rovněž závisí na možnostech zařízení použitého k měření rychlostí spotřeby kyslíku. Například jestliže zařízení obsahuje jedinou kyslíkovou sondu, provádějí se měření jednotlivě. V tomto případě se musí připravit různé směsi potřebné pro zkoušku se syntetickou odpadní vodou, ale inokulum se nepoužije a předepsané dávky kalu se přidají do každé nádoby série. Jednotlivé inkubace je třeba zahájit postupně, ve vhodných časových intervalech, např. 10 až 15 minut. Alternativně může měřicí systém zahrnovat řadu sond, které umožňují mnohočetná simultánní měření; v tomto případě se může inokulum přidat současně do příslušných skupin nádob.

37.

Koncentrace aktivovaného kalu ve všech zkoušených, referenčních a slepých (ale ne abiotických kontrolních) směsích je nominálně 1,5 g/l suspendovaných pevných látek. Spotřeba kyslíku se měří po 3 hodinách expozice. Další měření expozice po 30 minutách se provádí podle potřeby postupem dříve popsaným v odstavci 5.

Nitrifikační potenciál kalu

38.

Aby se rozhodlo, zda kal nitrifikuje, a jestliže ano, tak jakou rychlostí, připraví se směsi (FB) jako ve slepých a dalších ‚kontrolních‘ směsích (FN), které však rovněž obsahují N-allylthiomočovinu v koncentraci 11,6 mg/l. Směsi je třeba provzdušňovat a inkubovat při 20° ± 2 °C po dobu 3 hodin. Pak se změří rychlosti příjmu kyslíku a vypočítá se rychlost příjmu kyslíku v důsledku nitrifikace.

Uspořádání zkoušky

Orientační zkouška

39.

Podle potřeby se používá předběžná zkouška pro odhad rozsahu koncentrací zkoušené chemické látky potřebného v hlavní zkoušce stanovení inhibice spotřeby kyslíku. Alternativně může absence inhibice spotřeby kyslíku zkoušenou chemickou látkou v předběžné zkoušce ukazovat, že hlavní zkouška není nezbytná, ale je třeba zařadit trojmo opakovanou zkoušku při nejvyšší zkoušené koncentraci v předběžné zkoušce (obvykle 1 000 mg/l, ale v závislosti na požadavcích na data).

Tabulka 1

Příklady směsí pro předběžnou zkoušku

Činidlo

Původní koncentrace

Zásobní roztok zkoušené chemické látky

10 g/l

Zásobní roztok syntetického média

viz odstavec 16

Zásobní suspenze aktivovaného kalu

3 g/l suspendovaných pevných látek

Složky směsí

Dávkování do zkušebních nádob (6)

FT1

FT2

FT3-5

FB1-2

FA

Zásobní roztok zkoušené chemické látky (ml)

(odstavce 19 až 21)

0,5

5

50

0

50

Zásobní roztok syntetické odpadní vody (ml)

(odstavec 16)

16

16

16

16

16

Suspenze aktivovaného kalu (ml)

(odstavce 26 až 29)

250

250

250

250

0

Voda

(odstavec 15)

233,5

229

184

234

434

Celkový objem směsí (ml)

500

500

500

500

500

Koncentrace ve směsi

 

 

 

 

 

Zkušební suspenze (mg/l)

Aktivovaný kal

10

10

1 000

0

1 000

(suspendované pevné látky) (mg/l)

1 500

1 500

1 500

1 500

0

40.

Zkouška se provádí použitím alespoň tří koncentrací zkoušené chemické látky, například 10 mg/l, 100 mg/l a 1 000 mg/l, se slepým vzorkem a podle potřeby alespoň se třemi abiotickými kontrolními vzorky s nejvyššími koncentracemi zkoušené chemické látky (viz jako příklad tabulku 1). V ideálním případě by nejnižší koncentrace neměla mít žádný vliv na spotřebu kyslíku. Je-li to náležité, vypočítá se rychlost příjmu kyslíku a rychlost nitrifikace; pak se vypočítá procentuální inhibice. V závislosti na účelu zkoušky je rovněž možné jednoduše stanovit toxicitu koncentračního limitu, např. 1 000 mg/l. Jestliže se při této koncentraci neprojeví žádný statisticky významný toxický účinek, není další zkoušení při vyšších nebo nižších koncentracích nezbytné. Nutno poznamenat, že látky obtížně rozpustné ve vodě, směsi se složkami o rozdílné rozpustnosti ve vodě a adsorbenty je třeba navážit přímo do zkušebních nádob. V tomto případě se objem rezervovaný pro zásobní roztok zkoušené látky nahradí zřeďovací vodou.

Hlavní zkouška

Inhibice celkového příjmu kyslíku

41.

Zkouška se provádí použitím rozsahu koncentrací zjištěných předběžnou zkouškou. Aby se získaly hodnoty jak NOEC tak ECx (např. EC50), doporučuje se ve většině případů šest kontrolních a pět exponovaných koncentrací v geometrické posloupnosti s pěti opakovanými vzorky. Zkouška s abiotickým kontrolním vzorkem se nemusí opakovat, jestliže v předběžné zkoušce nebyl zjištěn žádný příjem kyslíku. Jestliže se však významný příjem vyskytne, je třeba abiotické kontroly provést pro každou koncentraci zkoušené chemické látky. Citlivost kalu se musí prověřovat použitím referenční chemické látky, 3,5-dichlorfenolu. Citlivost kalu se musí prověřovat pro každou sérii zkoušek, neboť o citlivosti je známo, že kolísá. Ve všech případech se pro měření rychlosti příjmu kyslíku v kyvetě s kyslíkovou elektrodou vzorky odeberou ze zkušebních nádob po 3 hodinách a podle potřeby po dalších 30 minutách. Ze shromážděných údajů se vypočítají specifické respirační rychlosti kontrolních a zkoušených směsí; procentuální inhibice se pak vypočítá z rovnice 7 níže.

Rozlišení mezi inhibicí heterotrofní respirace a nitrifikace

42.

Použití specifického inhibitoru nitrifikace ATU umožňuje přímé hodnocení inhibičních účinků zkoušené chemické látky na heterotrofní oxidaci; odečtením rychlosti příjmu kyslíku v přítomnosti ATU od celkové rychlosti příjmu (bez ATU) se dá vypočítat vliv na rychlost nitrifikace. Připraví se dva soubory reakčních směsí podle upořádání zkoušky pro ECx nebo NOEC podle popisu v odstavci 41, ale navíc se ATU přidá do každé směsi jednoho souboru v konečné koncentraci 11,6 mg/l, která jak známo úplně inhibuje nitrifikaci v kalu s koncentracemi suspendovaných pevných látek do 3 000 mg/l (4). Rychlosti příjmu kyslíku se měří po expoziční době; tyto přímé hodnoty představují pouze heterotrofní respiraci a rozdíly mezi nimi a odpovídajícími rychlostmi celkové respirace představují nitrifikaci. Pak se vypočítají různé stupně inhibice.

Měření

43.

Po dané době expozice se vzorek z první provzdušňovací nádoby přemístí do kyvety s kyslíkovou elektrodou (obr. 1 v dodatku 2) a ihned se změří koncentrace rozpuštěného kyslíku. Jestliže je k dispozici systém s více elektrodami, pak se měření může provádět simultánně. Míchání (použitím magnetu s krytem) je zásadní při stejné rychlosti, jaká se použila při kalibraci elektrody, aby se zajistilo, že sonda bude reagovat s minimálním zpožděním na měnící se koncentrace kyslíku a že bude umožněno pravidelné a reprodukovatelné měření kyslíku v měřicí nádobě. Obvykle postačí systém se samomíchací sondou užívaný s některými kyslíkovými elektrodami. Mezi měřeními se kyveta vypláchne vodou. Alternativně se může vzorek použít pro naplnění BSK lahve (obr. 2 v dodatku 3) vybavené magnetickou míchačkou. Do hrdla lahve se pak vloží kyslíková sonda s redukční objímkou a spustí se magnetická míchačka. V obou případech se koncentrace rozpuštěného kyslíku kontinuálně měří a zaznamenává v určitých intervalech, obvykle 5 až 10 minut, nebo dokud koncentrace kyslíku neklesne pod 2 mg/l. Elektroda se vyjme, směs se vrátí do provzdušňovací nádoby a provzdušňování a míchání pokračuje, jestliže je měření po delší expozici nezbytné.

Ověření koncentrace zkoušené chemické látky

44.

Pro některé účely se může ukázat nezbytné měřit koncentraci zkoušené chemické látky ve zkušebních nádobách. Je třeba vzít na vědomí, že používají-li se zásobní roztoky:

látek obtížně rozpustných ve vodě,

směsí se složkami s rozdílnou rozpustností ve vodě, nebo

látek s dobrou rozpustností ve vodě, ale o koncentraci zásobního roztoku blízké maximální rozpustnosti ve vodě,

není rozpuštěná frakce známá, a tudíž není známá skutečná koncentrace zkoušené chemické látky převáděné do zkušebních nádob. Pro charakterizaci expozice je nezbytné analyticky odhadnout koncentrace zkoušené chemické látky ve zkušebních nádobách. Situace se zjednoduší, když se analytický odhad provede před přidáním inokula. Vzhledem ke skutečnosti, že do zkušebních nádob budou převedeny pouze rozpuštěné frakce, mohou být měřené koncentrace velmi nízké.

45.

Aby se předešlo časově a finančně náročným analýzám, doporučuje se jednoduše navážit zkoušenou chemickou látku přímo do zkušebních nádob a následné výpočty vztahovat k počáteční navážené nominální koncentraci. Rozlišení mezi rozpuštěnou, nerozpuštěnou nebo adsorbovanou frakcí zkoušené chemické látky není nutné, protože všechny tyto frakce se stejně v reálných podmínkách vyskytují v čistírnách odpadních vod a tyto frakce se mohou měnit v závislosti na složení odpadních vod. Cílem zkušební metody je odhadnout neinhibiční koncentraci reálně a není účelné zkoumat detailně, které frakce přispívají k inhibici organismů aktivovaného kalu. Také adsorptivní látky by se měly navážit přímo do zkušebních nádob a nádoby by se měly silanizovat, aby se minimalizovaly ztráty v důsledku adsorpce.

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

Výpočet rychlostí příjmu kyslíku

46.

Rychlosti příjmu kyslíku se vypočítají ze středních hodnot naměřených hodnot, např. z lineární části grafů závislosti koncentrace kyslíku na čase, které omezují výpočty na koncentrace kyslíku mezi 2,0 mg/l a 7,0 mg/l, jelikož vyšší a nižší koncentrace mohou samy o sobě ovlivnit rychlosti spotřeby. Práce s koncentracemi v pásmu pod nebo nad těmito hodnotami jsou občas nevyhnutelné a nezbytné, například jestliže je respirace silně potlačena a v důsledku toho velmi pomalá nebo jestliže respirace příslušného aktivovaného kalu velmi rychlá. To je akceptovatelné za předpokladu, že i tato rozšíření příjmového grafu jsou lineární a jejich směrnice se nemění při přechodu přes hranici 2,0 mg/l nebo 7,0 mg/l O2. Jakékoli zakřivené sekce grafu naznačují, že se měřicí systém stabilizuje nebo že se rychlost příjmu mění, a neměly by se používat pro výpočet respiračních rychlostí. Rychlost příjmu kyslíku se vyjádří v miligramech na litr a hodinu (mg/l.h) nebo v miligramech na gram suchého kalu a hodinu (mg/g.h). Rychlost spotřeby kyslíku R v mg/l.h lze vypočítat nebo interpolovat z přímkové části zaznamenaného grafu poklesu kyslíku podle rovnice 1:

R = (Q1 – Q2)/Δt × 60

(1)

kde:

Q1

je koncentrace kyslíku na začátku zvoleného intervalu lineární fáze (mg/l);

Q2

je koncentrace kyslíku na konci zvoleného intervalu lineární fáze (mg/l);

Δt

je časový interval mezi těmito dvěma měřeními (min.).

47.

Specifická respirační rychlost (Rs) se vyjadřuje jako množství spotřebovaného kyslíku na gram sušiny kalu za hodinu (mg/g.h) podle rovnice 2:

Rs = R/SS

(2)

kde SS je koncentrace suspendovaných pevných látek ve zkoušené směsi (g/l).

48.

Rozdílné indexy R, které se mohou kombinovat, jsou:

S

specifická rychlost

T

celková respirační rychlost

N

rychlost v důsledku nitrifikační respirace

H

rychlost v důsledku heterotrofní respirace

A

rychlost v důsledku abiotických procesů

B

rychlost na základě analýzy slepých zkoušek (střední hodnota)

Výpočet rychlosti příjmu kyslíku v důsledku nitrifikace

49.

Vztah mezi celkovou respirací (RT), nitrifikační respirací (RN) a heterotrofní respirací (RH) je dán rovnicí 3:

RN = RT – RH

(3)

kde:

RN

je rychlost příjmu kyslíku v důsledku nitrifikace (mg/l.h);

RT

je měřená rychlost příjmu kyslíku při slepé zkoušce (bez ATU; FB) (mg/l.h).

RH

je měřená rychlost příjmu kyslíku při slepé zkoušce s přídavkem ATU (FN) (mg/l.h).

50.

Tento vztah je platný pro hodnoty slepých zkoušek (RNB, RTB, RHB), abiotické kontrolní vzorky (RNA, RTA, RHA) a zkoušky se zkoušenou chemickou látkou (RNS, RTS, RHS) (mg/g.h). Specifické respirační rychlosti se vypočítají z:

RNS = RN/SS

(4)

RTS = RT/SS

(5)

RHS = RH/SS

(6)

51.

Jestliže RN je nevýznamné (např. < 5 % RT ve slepých zkouškách) v předběžné zkoušce, dá se předpokládat, že heterotrofní příjem kyslíku bude roven celkovému příjmu a že nedochází k žádné nitrifikaci. Alternativní zdroj aktivovaného kalu by byl potřebný, jestliže by se při zkouškách braly v úvahu účinky na heterotrofní a nitrifikační mikroorganismy. Hlavní zkouška se provádí, jestliže existuje důkaz o potlačených rychlostech příjmu kyslíku s rozdílnými koncentracemi zkoušené chemické látky.

Výpočet procentuální inhibice

52.

Procentuální inhibice IT celkové spotřeby kyslíku při každé koncentraci zkoušené chemické látky je dána rovnicí 7:

IT = [1 – (RT – RTA)/RTB] × 100 %

(7)

53.

Podobně je procentuální inhibice heterotrofního příjmu kyslíku IH při každé koncentraci zkoušené chemické látky dána rovnicí 8:

IH = [1 – (RH – RHA)/RHB] × 100 %

(8)

54.

A konečně inhibice příjmu kyslíku způsobená nitrifikací IN při každé koncentraci je dána rovnicí 9:

IN = [1 – (RT – RH)/(RTB – RHB)] × 100 %

(9)

55.

Procentuální inhibice příjmu kyslíku se vynese proti logaritmu koncentrace zkoušené chemické látky (inhibiční křivka, viz obr. 3 v dodatku 4). Inhibiční křivky se vynesou pro každý tříhodinový interval provzdušňování nebo navíc po 30 min. Koncentrace zkoušené chemické látky, která inhibuje příjem kyslíku z 50 % (EC50), se vypočítá nebo interpoluje z grafu. Jestliže jsou k dispozici vhodná data, mohou se vypočítat nebo interpolovat 95 % meze spolehlivosti EC50, směrnice křivky, vhodné hodnoty označující začátek inhibice (například EC10 nebo EC20) a konec rozsahu inhibice (například EC80 nebo EC90).

56.

Je třeba poznamenat, že s ohledem na variabilitu často pozorovanou ve výsledcích může být v mnoha případech postačující vyjádřit výsledky dodatečně v řádech, například:

EC50

< 1 mg/l

EC50

1 mg/l až 10 mg/l

EC50

10 mg/l až 100 mg/l

EC50

> 100mg/l

Interpretace výsledků

ECx

57.

Hodnoty ECx, včetně s nimi spojené dolní a horní 95 % meze spolehlivosti pro parametr, se vypočítají použitím vhodných statistických metod (např. probit analýzou, logistickou nebo Weibullovou funkcí, upravenou Spearman-Karberovou metodou nebo jednoduchou interpolací (11)). ECx se získá zadáním hodnoty odpovídající x % střední hodnoty kontroly do zjištěné rovnice. Při výpočtu EC50 nebo jakékoli další ECx se střední hodnoty pro danou expozici (x) podrobí regresní analýze.

Odhad NOEC

58.

Jestliže se ke stanovení NOEC má použít statistická analýza, je třeba mít statistické hodnoty pro každou nádobu (jednotlivé nádoby se považují za opakované pokusy). Poté se použijí vhodné statistické metody podle dokumentu OECD ‚Současné přístupy ke statistické analýze dat týkajících se ekotoxicity: pokyny pro aplikaci‘ (11). Obecně se nepříznivé účinky zkoušené chemické látky ve srovnání s kontrolou zkoumají použitím jednostranného (menšího) testu statistické hypotézy na p ≤ 0,05.

Závěrečná zpráva

59.

Závěrečná zpráva musí obsahovat následující informace:

 

Zkoušená chemická látka

obecný název, chemický název, číslo CAS, čistota,

fyzikálně-chemické vlastnosti zkoušené chemické látky (např. log Kow, rozpustnost ve vodě, tlak par, Henryho konstanta (H) a případné informace o osudu zkoušené chemické látky, např. adsorpce na aktivovaném kalu).

 

Zkušební systém

zdroj, podmínky provozu čistírny odpadních vod a vstupujících přítoky, koncentrace, předběžné zpracování a uchovávání aktivovaného kalu.

 

Zkušební podmínky

zkušební teplota, pH během zkoušky a trvání fáze(í) expozice.

 

Výsledky

specifická spotřeba kyslíku v kontrolách (mg O2/(g kalu × h),

všechna naměřená data, inhibiční křivka(y) a metoda výpočtu, EC50,

EC50 a pokud možno 95 % meze spolehlivosti, případně EC20, EC80, případně NOEC a použité statistické metody, jestliže EC50 nemůže být stanoveno,

výsledky pro celkovou a v případě potřeby i heterotrofní a nitrifikační inhibici,

abiotický příjem kyslíku ve fyzikálně-chemické kontrole (je-li použita),

název referenční chemické látky a výsledky s touto látkou,

veškerá pozorování a odchylky od standardního postupu, které mohly ovlivnit výsledek.

LITERATURA

1)

Brown, D., Hitz, H.R. and Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245-261.

2)

King, E. F. and Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27-39.

3)

OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

4)

ISO (2007). ISO 8192 Water Quality- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, International Organization for Standardization.

5)

Bealing, D. J. (2003). Document ISO/TC147/WGI/N.183, International Organization for Standardization.

6)

Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471-483.

7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.

8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

9)

Fiebig S. and Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test – acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.

10)

ISO (1995). ISO 10634 Water Quality – Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, International Organization for Standardization.

11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.

Dodatek 1

Definice

V této zkušební metodě se používají následující definice.

 

Chemická látka je sloučenina nebo směs.

 

ECx (účinná koncentrace vyvolávající x % účinek) je koncentrace, která vyvolá účinek u x % zkušebních organismů během dané expoziční doby ve srovnání s kontrolou. Například EC50 je koncentrace, která podle odhadu má účinky na zkoušený ukazatel u 50 % exponované populace během definované expoziční doby.

 

Koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC) je koncentrace zkoušené chemické látky, při níž není pozorován žádný účinek. V této zkoušce koncentrace odpovídající NOEC nemá žádný statisticky významný účinek (p < 0,05) během dané expoziční doby ve srovnání s kontrolou.

 

Zkoušená chemická látka je jakákoli látka nebo směs zkoušená použitím této zkušební metody.

Dodatek 2

Obr. 1:   Příklady měřicí jednotky

Image

Legenda

1

aktivovaný kal

2

syntetické médium

3

zkoušená chemická látka

4

vzduch

5

mísící nádoba

6

magnetická míchačka

7

kyveta na měření kyslíku

8

kyslíková elektroda

9

přístroj na měření kyslíku

10

zapisovač

Dodatek 3

Obr. 2:   Příklad měřicí jednotky s použitím BSK lahve

Image

Legenda

1

zkušební nádoba

2

kyslíková elektroda

3

přístroj na měření kyslíku

Dodatek 4

Obr. 3:   Příklad inhibičních křivek

Image

Legenda

X

koncentrace 3,5-dichlorfenolu (mg/l)

Y

inhibice ( %)

Image

inhibice heterotrofní respirace za použití nitrifikačního kalu

Image

inhibice nitrifikace za použití nitrifikačního kalu

5)

Kapitola C.26 se nahrazuje tímto:

C.26   ZKOUŠKA INHIBICE RŮSTU DRUHŮ LEMNA

ÚVOD

1.

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení 221 (2006). Tato zkušební metoda je určena k hodnocení toxicity chemických látek pro sladkovodní rostliny rodu Lemna (okřehek). Je založena na existujících metodách (1, 2, 3, 4, 5, 6), ale zahrnuje úpravy těchto metod, aby odrážela nejnovější výsledky výzkumu a konzultace v řadě klíčových otázek. Navrhovaná metoda byla validována mezinárodní okružní zkouškou (7).

2.

Tato zkušební metoda popisuje zkoušení toxicity pomocí druhů Lemna gibbaLemna minor, které byly oba rozsáhle studovány a jsou předmětem shora uvedených norem. Taxonomie druhů Lemna spp. je obtížná, přičemž ji komplikuje existence široké škály fenotypů. Ačkoliv se u druhů Lemna může vyskytnout genetická variabilita v odezvě na toxické látky, není v současnosti dostatek údajů o zdroji této variability, aby mohl být pro použití v rámci této metody doporučen specifický klon. Je třeba uvést, že zkouška se neprovádí axenicky (jednodruhově), ale v jednotlivých stupních během zkušebního procesu se provádí opatření pro udržení kontaminace jinými organismy na minimální úrovni.

3.

Podrobně se popisuje zkoušení s obnovením (semistatické a průtokové) a bez obnovení (statické) zkušebního roztoku. V závislosti na cílech zkoušky a právních požadavcích se doporučuje zvážit použití semistatických a průtokových metod, například pro chemické látky, které se z roztoku rychle ztrácejí v důsledku odpaření, fotodegradace, srážení nebo biologické rozložitelnosti. Další pokyny jsou uvedeny v (8).

4.

Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.

PODSTATA ZKOUŠKY

5.

Exponenciálně rostoucí kultury rostlin rodu Lemna se po dobu sedmi dnů nechají růst jako monokultury v různých koncentracích zkoušené látky. Cílem zkoušky je kvantifikovat účinky související s chemickou látkou na vegetativní růst během tohoto období, a to na základě hodnocení zvolených proměnných měření. Primární proměnnou měření je počet lístků. Rovněž se měří nejméně jedna další proměnná měření (celková plocha lístků, hmotnost sušiny nebo čerstvá hmotnost), protože některé chemické látky mohou ovlivňovat jiné proměnné měření mnohem více než počet lístků. Pro kvantifikaci účinků souvisejících s chemickou látkou se růst ve zkušebních roztocích porovnává s růstem v kontrolních vzorcích a stanoví se koncentrace způsobující stanovenou x % inhibici růstu (např. 50 %) a vyjádří se jako ECx (např. EC50).

6.

Cílovým ukazatelem zkoušky je inhibice růstu vyjádřená jako logaritmické zvýšení proměnné měření (průměrná specifická růstová rychlost) během expoziční doby. Z průměrných specifických růstových rychlostí zaznamenaných v řadě zkušebních roztoků se stanoví koncentrace způsobující stanovenou x % inhibici růstové rychlosti (např. 50 %) a vyjádří se jako ErCx (např. ErC50).

7.

Další proměnnou odezvy použitou v této zkušební metodě je výtěžek, který může být nutný ke splnění specifických právních požadavků v některých zemích. Je definován jako proměnná měření na konci expoziční doby minus proměnná měření na počátku expoziční doby. Z výtěžku zaznamenaného v řadě zkušebních roztoků se vypočítá koncentrace způsobující stanovenou x % inhibici výtěžku (např. 50 %) a vyjádří se jako EyCx (např. EyC50).

8.

Kromě toho se může statisticky určit nejnižší koncentrace s pozorovaným účinkem (LOEC) a koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC).

INFORMACE O ZKOUŠENÉ CHEMICKÉ LÁTCE

9.

Měla by být k dispozici analytická metoda s odpovídající citlivostí pro kvantifikaci chemické látky ve zkušebním médiu.

10.

Užitečnými informacemi o zkoušené chemické látce pro účely stanovení zkušebních podmínek mohou být strukturní vzorec, čistota, rozpustnost ve vodě, stálost ve vodě a na světle, pKa, Kow, tlak par a biologická rozložitelnost. Rozpustnost ve vodě a tlak par lze použít pro výpočet Henryho konstanty z Henryho zákona, která bude ukazovat, zda jsou pravděpodobné významné ztráty zkoušené chemické látky během doby zkoušky. Toto pomáhá zjistit, zda by se měla podniknout konkrétní opatření ke kontrole takových ztrát. Jestliže nejsou informace o rozpustnosti a stálosti zkoušené látky jisté, doporučuje se, aby byly hodnoceny za podmínek zkoušky, tj. v růstovém médiu, při teplotě a režimu osvětlení, které mají být při zkoušce použity.

11.

Pokud je zvláště důležitá kontrola pH zkušebního média, např. zkoušejí-li se kovy nebo chemické látky, které jsou hydrolyticky nestálé, doporučuje se přídavek pufru do růstového média (viz odstavec 21). Další pokyny pro zkoušení chemických látek s fyzikálně-chemickými vlastnostmi, které činí jejich zkoušení obtížné, jsou uvedeny v (8).

PLATNOST ZKOUŠKY

12.

Aby byla zkouška platná, musí být doba, za kterou se zdvojnásobí počet lístků v kontrolním vzorku, kratší než 2,5 dne (60 h), což odpovídá přibližně sedmi-násobnému zvýšení v sedmi dnech a průměrné specifické růstové rychlosti 0,275 d– 1. Při použití média a zkušebních podmínek popsaných v této zkušební metodě lze tohoto kritéria dosáhnout použitím režimu statické zkoušky (5). Rovněž se předpokládá, že toto kritérium bude splnitelné za podmínek semistatické a průtokové zkoušky. Výpočet doby zdvojnásobení je uveden v odstavci 49.

REFERENČNÍ CHEMICKÁ LÁTKA

13.

Jako prostředek kontroly zkušebního postupu lze zkoušet referenční látku (látky), například 3,5-dichlorfenol použitý v mezinárodní okružní zkoušce (7). Doporučuje se zkoušet referenční chemickou látku nejméně dvakrát ročně nebo – pokud se zkoušení provádí s menší četností – souběžně se stanovováním toxicity zkoušené chemické látky.

POPIS METODY

Přístroje a pomůcky

14.

Veškeré vybavení přicházející do styku se zkušebními médii by mělo být vyrobeno ze skla nebo jiného chemicky inertního materiálu. Skleněné pomůcky použité pro kultivační a zkušební účely je zapotřebí vyčistit od chemických kontaminantů, které by mohly unikat do zkušebního média, a musí být sterilní. Zkušební nádoby by měly být dostatečně široké, aby mohly lístky jednotlivých kolonií v kontrolních nádobách růst, aniž by se na konci zkoušky překrývaly. Není důležité, zda se kořeny dotýkají dna zkušebních nádob, ale doporučuje se, aby v každé zkušební nádobě byla minimální hloubka 20 mm a minimální objem 100 ml. Volba zkušebních nádob není zásadně důležitá, pokud budou splněny tyto požadavky. Jako vhodné se ukázaly skleněné kádinky, krystalizační misky nebo skleněné Petriho misky vhodných rozměrů. Zkušební nádoby musí být zakryty, aby se minimalizovalo odpařování a náhodná kontaminace, přičemž však musí být umožněna nezbytná výměna vzduchu. Vhodné zkušební nádoby, a zejména kryty, musí zabránit stínění nebo změnám spektrálních charakteristik světla.

15.

Kultury a zkušební nádoby by se měly přechovávat odděleně. Toho se nejlépe dosáhne pomocí samostatných komor, inkubátorů či místností pro růst za podmínek prostředí. Osvětlení a teplota musí být regulovatelné a musí se udržovat na stálé úrovni (viz odstavce 35, 36).

Zkušební organismus

16.

Organismem použitým pro tuto zkoušku je Lemna gibba nebo Lemna minor. Stručný popis druhů okřehku, které byly použity pro zkoušení toxicity, je uveden v dodatku 2. Rostlinný materiál lze získat ze sbírky kultur, z jiné laboratoře nebo v terénu. Jestliže se sběr provádí z terénu, rostliny by se měly kultivovat ve stejném médiu, jaké se používá ke zkoušení, minimálně po dobu osmi týdnů před použitím. Terénní místa použitá pro sběr výchozích kultur musí být prostá zřejmých zdrojů kontaminace. Pokud se získávají z jiné laboratoře nebo ze sbírky kultur, měly by se podobně uchovávat po minimální dobu tří týdnů. V závěrečné zprávě je vždy třeba uvést zdroj rostlinného materiálu a druhu a klonu (je-li znám) použitého ke zkoušení.

17.

Měly by se používat monokultury, které jsou očividně prosté kontaminace jinými organismy, například řasami a prvoky. Zdravé rostliny L. minor obsahují kolonie skládající se ze dvou až pěti lístků, zatímco zdravé kolonie L. gibba mohou obsahovat až sedm lístků.

18.

Kvalita a jednotnost rostlin použitých ve zkoušce bude mít významný vliv na její výsledek a proto by se jejich výběru měla věnovat velká pozornost. Měly by se používat mladé, rychle rostoucí rostliny bez viditelných lézí či odbarvení (chlorózy). Kultury dobré kvality se vyznačují vysokým výskytem kolonií obsahujících nejméně dva lístky. Velký počet jednotlivých lístků je ukazatelem environmentálního stresu, např. nedostatku živin, a rostlinný materiál z takovýchto kultur by se ke zkoušení neměl používat.

Kultivace

19.

Pro snížení četnosti udržování kultury (např. pokud se na určité období neplánují žádné zkoušky s Lemna) lze kultury udržovat za sníženého osvětlení a teploty (4–10 °C). Podrobnosti o kultivaci jsou uvedeny v dodatku 3. Očividné známky kontaminace řasami nebo jinými organismy vyžadují povrchovou sterilizaci dílčího vzorku lístků Lemna a následný přenos do čerstvého média (viz dodatek 3). V tomto případě je třeba zbývající kontaminovanou kulturu zlikvidovat.

20.

Nejméně sedm dnů před zkoušením se dostatečný počet kolonií asepticky převede do čerstvého sterilního média a kultivuje se 7 až 10 dnů za podmínek zkoušky.

Zkušební médium

21.

Pro Lemna minorLemna gibba se doporučují odlišná média, jak je dále uvedeno. Je třeba pečlivě zvážit zahrnutí pH pufru do zkušebního média (MOPS (kyselina 4-morfolinpropansulfonová, č. CAS: 1132-61-2) do média pro L. minor a NaHCO3 do média pro L. gibba), když existuje podezření, že by mohl reagovat se zkoušenou chemickou látkou a ovlivňovat vyjádření její toxicity. Steinbergovo médium (9) je rovněž přijatelné, pokud jsou splněna kritéria platnosti.

22.

Pro kultivaci a zkoušení s L. minor se doporučuje úprava švédského standardního (SIS) růstového média pro Lemna. Složení tohoto média je uvedeno v dodatku 4.

23.

Ke kultivaci a zkoušení s L. gibba se doporučuje růstové médium 20X AAP popsané v dodatku 4.

24.

Steinbergovo médium, popsané v dodatku 4, je rovněž vhodné pro L. minor, ale může se používat i pro L. gibba, pokud jsou splněna kritéria platnosti.

Zkušební roztoky

25.

Zkušební roztoky se obvykle připravují ředěním zásobního roztoku. Zásobní roztoky zkoušené chemické látky se obyčejně připravují rozpuštěním látky v růstovém médiu.

26.

Nejvyšší zkušební koncentrace zkoušené chemické látky by obvykle neměla překročit rozpustnost látky ve vodě za zkušebních podmínek. Je však třeba poznamenat, že Lemna spp. plují na povrchu a mohou být vystaveny působení chemických látek, které se hromadí na rozhraní voda-vzduch (např. látky špatně rozpustné ve vodě nebo hydrofobní či povrchově aktivní látky). Za takových podmínek dochází k expozici jiným látkám, než které se nacházejí v roztoku, a zkušební koncentrace mohou v závislosti na vlastnostech zkoušené chemické látky překračovat rozpustnost ve vodě. Pro zkoušené chemické látky s nízkou rozpustností ve vodě může být nezbytné připravit koncentrovaný zásobní roztok nebo disperzi látky pomocí organického rozpouštědla nebo dispergátoru, aby se usnadnilo přidávání přesných množství zkoušené chemické látky do zkušebního média, a napomohlo se tak její dispergaci a rozpuštění. Měla by být vynaložena maximální snaha takové látky nepoužívat. Používání pomocných rozpouštědel nebo dispergátorů by nemělo způsobovat žádnou fytotoxicitu. Příkladem běžně používaných rozpouštědel, která nezpůsobují fytotoxicitu při koncentracích až do 100 μl/l, jsou aceton a dimetylformamid. Jestliže se použije rozpouštědlo nebo dispergátor, jeho konečná koncentrace by se měla zapsat v závěrečné zprávě a udržovat na minimální hodnotě (≤ 100 μl · l– 1) a všechny exponované vzorky a kontroly by měly obsahovat stejnou koncentraci rozpouštědla nebo dispergátoru. Další pokyny k používání dispergátorů jsou uvedeny v (8).

Zkoušené a kontrolní skupiny

27.

Předběžná znalost toxicity zkoušené chemické látky pro Lemna, např. z orientační zkoušky, pomůže při volbě vhodných zkušebních koncentrací. Při hlavní zkoušce toxicity se zpravidla použije alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou posloupnost. Faktor mezi zkušebními koncentracemi by nejlépe neměl překročit 3,2, ale lze použít i vyšší hodnotu, jestliže je křivka závislosti koncentrace a odezvy plochá. Použití méně než pěti koncentrací by mělo být zdůvodněno. Pro každou zkušební koncentraci se použijí nejméně tři opakování.

28.

Při volbě rozsahu zkušebních koncentrací (pro orientační a/nebo hlavní zkoušku toxicity) je zapotřebí vzít v úvahu následující:

Pro stanovení ECx by se zkušební koncentrace měly pohybovat pod a nad hodnotu ECx, aby se zajistila patřičná úroveň spolehlivosti. Například pokud se odhaduje EC50, nejvyšší zkušební koncentrace by měla být vyšší než hodnota EC50. Jestliže hodnota EC50 leží mimo rozmezí zkušebních koncentrací, související intervaly spolehlivosti budou velké, a proto správné hodnocení statistické vhodnosti modelu nemusí být možné.

Jestliže je cílem odhadnout LOEC/NOEC, nejnižší zkušební koncentrace by měla být dostatečně nízká, aby růst nebyl výrazně nižší než růst v kontrolním vzorku. Dále by nejvyšší zkušební koncentrace měla být dostatečně vysoká, aby byl růst výrazně nižší než růst v kontrolním vzorku. Pokud tomu tak není, zkouška se bude muset opakovat v odlišném rozmezí koncentrací (s výjimkou případů, kdy je nejvyšší koncentrace na mezi rozpustnosti nebo představuje maximální požadovaný koncentrační limit, např. 100 mg/l).

29.

Každá zkouška by měla zahrnovat kontrolní vzorky obsahující stejné živné médium, stejný počet lístků a kolonií, stejné podmínky okolního prostředí a postupy, jaké byly zvoleny pro zkušební nádoby, avšak neobsahují zkoušenou chemickou látku. Jestliže se použije pomocné rozpouštědlo nebo dispergátor, měla by být zahrnuta i další kontrolní expozice s rozpouštědlem/dispergátorem přítomným ve stejné koncentraci jako v nádobách se zkoušenou chemickou látkou. Počet kontrolních nádob použitých k opakování (a případných nádob s rozpouštědly) by měl být nejméně roven počtu nádob použitých pro každou zkušební koncentraci; v ideálním případě by měl být dvojnásobný.

30.

Jestliže se stanovení NOEC nepožaduje, upořádání zkoušky lze pozměnit tak, že se zvýší počet koncentrací a sníží počet replik pro příslušnou koncentraci. Počet kontrolních replik však musí být nejméně tři.

Expozice

31.

Kolonie tvořené 2 až 4 viditelnými lístky se převedou z očkovací kultury a za aseptických podmínek se náhodně přidají do zkušebních nádob. Každá nádoba by měla celkem obsahovat 9 až 12 lístků. Počet lístků a kolonií by měl být v každé zkušební nádobě stejný. Zkušenosti získané s touto metodou a údaje z okružní zkoušky ukazují, že použití tří replik na expozici, kdy pro každé opakování se zpočátku použije od 9 do 12 lístků, je dostatečné ke zjištění rozdílů v inhibici růstu přibližně o 4 až 7 % vypočítaných pomocí růstové rychlosti (10 až 15 % vypočítaných pomocí výtěžku) mezi jednotlivými expozicemi (7).

32.

K minimalizaci vlivu prostorových rozdílů v intenzitě světla nebo v teplotě je zapotřebí náhodně uspořádat zkušební nádoby v inkubátoru. Při prováděném pozorování se rovněž vyžaduje uspořádání do bloků nebo náhodné přemísťování nádob (nebo častější přemísťování).

33.

Jestliže předběžná zkouška stálosti ukazuje, že během doby trvání zkoušky (7 dnů) nelze udržet koncentraci zkoušené chemické látky (tj. měřená koncentrace poklesne pod 80 % naměřené počáteční koncentrace), doporučuje se režim semistatické zkoušky. V tomto případě by měly být kolonie nejméně dvakrát během zkoušky (např. v den 3 a 5) vystaveny čerstvě připraveným zkušebním a kontrolním roztokům. Četnost expozice čerstvému médiu závisí na stálosti zkoušené chemické látky; pro udržení téměř konstantních koncentrací vysoce nestálých či těkavých látek může být zapotřebí vyšší četnost. Za určitých okolností může být nutný průtokový postup (8, 10).

34.

Scénář expozice prostřednictvím aplikace na lístek (rozprašování) není do této zkušební metody zahrnut; tomuto tématu se věnuje literatura (11).

Podmínky inkubace

35.

Pomocí kontinuálního teplého nebo chladného bílého fluorescenčního osvětlení je třeba zajistit světelnou intenzitu zvolenou z rozmezí 85–135 μE·m– 2 · s– 1, přičemž se tato intenzita měří v pásmu fotosynteticky aktivního záření (400 až 700 nm) v bodech nacházejících se ve stejné vzdálenosti od zdroje světla jako lístky Lemna (ekvivalent 6 500 až 10 000 luxů). Jakékoliv odchylky od zvolené intenzity světla nad zkušební plochou by neměly překročit ± 15 %. Naměřenou hodnotu bude ovlivňovat metoda detekce světla a měření, zejména typ čidla. Kulová čidla (která reagují na světlo přicházející ze všech úhlů nad i pod rovinou měření) a ‚kosinová‘ čidla (která reagují na světlo přicházející ze všech úhlů nad rovinou měření) jsou vhodnější než jednosměrná čidla, neboť poskytují vyšší naměřené hodnoty pro vícebodový světelný zdroj zde popsaného typu.

36.

Teplota v zkušebních nádobách by měla být 24 ± 2 °C. pH kontrolního média by se během zkoušky nemělo zvýšit o více než 1,5. Ovšem odchylka o více než 1,5 nebude znamenat neplatnost zkoušky, pokud je možné prokázat, že byla splněna kritéria platnosti. Zvláštní pozornost je zapotřebí věnovat posunu pH ve speciálních případech, jako jsou zkoušky nestálých chemických látek nebo kovů. Další pokyny naleznete v (8).

Doba trvání zkoušky

37.

Zkouška je ukončena za 7 dnů poté, co byly rostliny přeneseny do zkušebních nádob.

Měření a analytická stanovení

38.

Na počátku zkoušky se zjistí a zaznamená počet lístků ve zkušebních nádobách, přičemž se pečlivě dbá na to, aby byly započítány vystupující, jasně viditelné lístky. Na počátku zkoušky, dále nejméně jednou během každých 3 dnů během expoziční doby (tj. nejméně dvakrát během celkové doby 7 dnů) a při ukončení zkoušky se musí určit počty lístků, které mají normální či abnormální vzhled. V závěrečné zprávě se musí zaznamenat změny ve vývoji rostlin, např. velikost lístku, vzhled, známky nekrózy, chlorózy nebo hrbatosti, rozpadávání kolonií nebo ztráta vzplývavosti, a v délce a vzhledu kořenu. Je rovněž nutné zaznamenat významné znaky zkušebního média (např. přítomnost nerozpuštěného materiálu, růst řas ve zkušební nádobě).

39.

Kromě určení počtu lístků během zkoušky se také hodnotí účinky zkoušené chemické látky na jednu (nebo více) následujících proměnných měření:

i)

celková plocha lístků,

ii)

hmotnost sušiny,

iii)

čerstvá hmotnost.

40.

Celková plocha lístků má tu výhodu, že ji lze u každé zkušební a kontrolní nádoby určit na počátku zkoušky, v jejím průběhu i na jejím konci. Hmotnost sušiny nebo čerstvá hmotnost by se měly určit na počátku zkoušky ze vzorku očkovací kultury, která se obvykle používá k zahájení zkoušky, a na konci zkoušky pak na základě rostlinného materiálu z každé zkušební a kontrolní nádoby. Jestliže se plocha lístků neměří, dává se přednost hmotnosti sušiny před čerstvou hmotností.

41.

Celková plocha lístků, hmotnost sušiny a čerstvá hmotnost se mohou určit následovně:

i)

Celková plocha lístků: Celková plocha lístků všech kolonií se může stanovit analýzou obrazu. Pomocí videokamery lze zachytit siluetu zkušební nádoby a rostlin (tj. umístíte nádobu na negatoskop) a výsledný obraz se digitalizuje. Plochu lístků v zkušební nádobě lze poté stanovit kalibrací pomocí plochých tvarů o známé ploše. Je třeba vyloučit rušení způsobené hranou zkušební nádoby. Alternativní, ale pracnější způsob spočívá v pořízení fotografie zkušebních nádob a rostlin, vyříznutí výsledné siluety kolonií a určení jejich plochy pomocí analyzátoru plochy lístku nebo milimetrového papíru. Mohou být vhodné i další postupy (například poměr hmotnosti papírů s plochou siluety kolonií a s jednotkovou plochou).

ii)

Hmotnost sušiny: Z každé ze zkušebních nádob se shromáždí všechny kolonie a propláchnou se destilovanou nebo deionizovanou vodou. Nadbytečná voda se odstraní savým papírem a pak se vzorky suší při 60 °C do konstantní hmotnosti. Měly by být zahrnuty jakékoliv úlomky kořenů. Hmotnost sušiny by se měla vyjádřit s přesností alespoň na 0,1 mg.

iii)

Čerstvá hmotnost: Všechny kolonie se převedou do předem zvážených zkumavek vyrobených z polystyrenu nebo z jiného interního materiálu, s malými (1 mm) otvory v zaoblených dnech. Zkumavky se poté odstřeďují při rychlosti 3 000 ot/min po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Zkumavky obsahující nyní osušené kolonie se opětovně zváží a čerstvá hmotnost se vypočítá odečtením hmotnosti prázdné zkumavky.

Četnost měření a analytická stanovení

42.

Jestliže se používá statické uspořádání zkoušky, pH každé expozice by se mělo změřit na počátku a na konci zkoušky. Jestliže se používá semistatické uspořádání zkoušky, pH by se mělo měřit v každé vsázce ‚čerstvého‘ zkušebního roztoku před každým obnovením a rovněž i v odpovídajících ‚spotřebovaných‘ roztocích.

43.

Intenzita osvětlení by se měla měřit v růstové komoře, inkubátoru nebo místnosti v bodech nacházejících se ve stejné vzdálenosti od zdroje světla jako lístky Lemna. Měření je třeba provádět nejméně jednou během zkoušky. Teplota média v náhradní nádobě držené za stejných podmínek v růstové komoře, inkubátoru nebo místnosti by se měla zaznamenávat nejméně jednou denně.

44.

Během zkoušky se koncentrace zkoušené látky určují ve vhodných intervalech. Při statických zkouškách je minimálním požadavkem určení koncentrací na počátku a na konci zkoušky.

45.

Při semistatických zkouškách, u nichž se neočekává, že koncentrace zkoušené látky zůstane v rozmezí ± 20 % nominální koncentrace, je nezbytné analyzovat všechny čerstvě připravené zkušební roztoky a tytéž roztoky při každém obnovení (viz odstavec 33). Ovšem u zkoušek, u nichž není naměřená počáteční koncentrace zkoušené chemické látky v rozmezí ± 20 % nominální hodnoty, avšak u nichž lze dostatečně prokázat, že počáteční koncentrace jsou reprodukovatelné a stálé (tj. od 80 do 120 % počáteční koncentrace), mohou být chemická stanovení provedena pouze na nejvyšších a nejnižších zkušebních koncentracích. Ve všech případech je třeba určit koncentrace zkoušené chemické látky před obnovením při každé zkušební koncentraci vždy pouze u jedné nádoby z počtu použitých replik (nebo u sdruženého obsahu nádob všech replik).

46.

U průtokových zkoušek je vhodný podobný vzorkovací režim, jaký je popsán u semistatických zkoušek včetně analýzy na počátku, uprostřed a na konci zkoušky, ale měření ‚spotřebovaného‘ roztoku není v tomto případě vhodné. U tohoto typu zkoušky je zapotřebí kontrolovat denně průtok ředicí vody a zkoušené chemické látky nebo zásobního roztoku zkoušené látky.

47.

Jestliže lze prokázat, že koncentrace zkoušené chemické látky byla po celou dobu zkoušky uspokojivě udržována v rozmezí ± 20 % nominální nebo naměřené počáteční koncentrace, může být analýza výsledků založena na nominálních nebo naměřených počátečních hodnotách. Je-li odchylka od nominální nebo naměřené počáteční koncentrace větší než ± 20 %, analýza výsledků by měla být založena na geometrické střední koncentraci během expozice nebo na modelech popisujících pokles koncentrace zkoušené chemické látky (8).

Limitní zkouška

48.

Za určitých okolností, např. pokud předběžná zkouška naznačuje, že zkoušená chemická látka nemá žádné toxické účinky při koncentracích až do 100 mg/l nebo až do meze své rozpustnosti ve zkušebním médiu (podle toho, co je nižší), může se provést limitní zkouška zahrnující porovnání odezvy v kontrolní skupině a odezvy v jedné exponované skupině (100 mg/l nebo koncentrace rovná mezi rozpustnosti). Důrazně se doporučuje podpořit tuto zkoušku analýzou expozičních koncentrací. Všechny dříve popsané zkušební podmínky a kritéria platnosti se vztahují i na limitní zkoušku s výjimkou toho, že počet opakování s exponovanými vzorky by se měl zdvojnásobit. Růst v kontrolní a exponované skupině může být analyzován pomocí statistické zkoušky pro porovnání středních hodnot, např. Studentova t-testu.

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

Doba zdvojnásobení

49.

Pro stanovení doby zdvojnásobení (Td ) počtu lístků a dodržování tohoto kritéria platnosti ve studii (odstavec 12) se používá následující vzorec s údaji získanými z kontrolních nádob:

Td = ln 2/μ

kde μ je průměrná specifická růstová rychlost stanovena tak, jak je popsáno v odstavcích 54–55.

Proměnné odezvy

50.

Účelem této zkoušky je stanovit účinky zkoušené chemické látky na vegetativní růst Lemna. Tato zkušební metoda popisuje dvě proměnné odezvy, protože členské země mají odlišné preference a právní požadavky. Mají-li být výsledky zkoušky přijatelné ve všech členských zemích, účinky je třeba vyhodnotit pomocí obou proměnných odezvy a) a b) popsaných dále.

a)

Průměrná specifická růstová rychlost: Tato proměnná odezvy se počítá na základě změn logaritmů počtů lístků a dále na základě změn logaritmů jiného parametru měření (celková plocha lístků, hmotnost sušiny nebo čerstvá hmotnost) v čase (vyjádřeno na den) v kontrolních vzorcích a každé exponované skupině. Někdy se označuje jako relativní růstová rychlost (12).

b)

Výtěžek: Tato proměnná odezvy se počítá na základě změn počtu lístků a dále na základě změn jiného parametru měření (celková plocha lístků, hmotnost sušiny nebo čerstvá hmotnost) v kontrolních vzorcích a každé exponované skupině až do konce zkoušky.

51.

Je třeba uvést, že hodnoty toxicity vypočítané pomocí těchto dvou proměnných odezvy nejsou srovnatelné a při používání výsledků zkoušky se musí vzít tento rozdíl na vědomí. Hodnoty ECx založené na průměrné specifické růstové rychlosti (ErCx) budou obecně vyšší než výsledky založené na výtěžku (EyCx), pokud se dodrží zkušební podmínky této zkušební metody, a to kvůli matematickému základu příslušných přístupů. Tuto skutečnost nelze vykládat jako rozdíl v citlivosti mezi těmito dvěma proměnnými odezvy; hodnoty jsou jednoduše matematicky odlišné. Koncepce průměrné specifické růstové rychlosti je založena na obecném průběhu exponenciálního růstu okřehku v nelimitovaných kulturách, u nichž se toxicita odhaduje na základě účinků na růstovou rychlost, aniž by závisela na absolutní úrovni specifické růstové rychlosti kontroly, na sklonu křivky závislosti koncentrace-odezva nebo na době trvání zkoušky. Naproti tomu výsledky založené na proměnné odezvy výtěžku jsou závislé na všech těchto ostatních proměnných. EyCx závisí na specifické růstové rychlosti druhů okřehku použitých v každé zkoušce a na maximální specifické růstové rychlosti, která se může u jednotlivých druhů, a dokonce i u různých klonů, lišit. Tato proměnná odezvy by se neměla používat pro srovnávání citlivosti na toxické látky mezi druhy okřehku nebo dokonce různými klony. Přestože se z vědeckého hlediska dává při odhadu toxicity přednost použití průměrné specifické růstové rychlosti, odhady toxicity založené na výtěžku jsou rovněž do této zkušební metody zahrnuty, aby uspokojily současné právní požadavky v některých zemích.

52.

Odhady toxicity by měly být založeny na počtu lístků a na jedné další proměnné měření (celková plocha lístků, hmotnost sušiny nebo čerstvá hmotnost), protože některé chemické látky mohou ovlivňovat jiné proměnné měření mnohem více než počet lístků. Pouhým určováním počtu lístků by se tento účinek nezjistil.

53.

Počet lístků a jakákoliv další zaznamenaná proměnná měření, tj. celková plocha lístků, hmotnost sušiny nebo čerstvá hmotnost, se pro každé měření uvedou v tabulce společně s koncentracemi zkoušené látky. Následná analýza dat, např. odhad LOEC, NOEC nebo ECx, by měla být založena na hodnotách pro jednotlivá opakování, a nikoliv na vypočítaných středních hodnotách pro každou exponovanou skupinu.

Průměrná specifická růstová rychlost

54.

Průměrná specifická růstová rychlost pro konkrétní období se vypočítá jako logaritmické zvýšení proměnných růstu – počtu lístků a jedné další proměnné měření (celková plocha lístků, hmotnost sušiny nebo čerstvá hmotnost) – pomocí následujícího vzorce pro každé opakování kontrolních a exponovaných vzorků:

Formula

kde:

:

μi-j

:

průměrná specifická růstová rychlost od doby i do doby j,

:

Ni

:

proměnná měření ve zkušební nebo kontrolní nádobě v době i,

:

Nj

:

proměnná měření ve zkušební nebo kontrolní nádobě v době j,

:

t

:

čas od i do j.

Pro každou exponovanou skupinu a kontrolní skupinu se vypočítá střední hodnota růstové rychlosti a odhady rozptylu.

55.

Průměrná specifická růstová rychlost by se měla vypočítat pro celou dobu trvání zkoušky (doba ‚i‘ ve shora uvedeném vzorci je počátek zkoušky a doba ‚j‘ je ukončení zkoušky). Pro každou zkušební koncentraci a kontrolu se vypočítá střední hodnota průměrné specifické růstové rychlosti a odhady rozptylu. Dále je zapotřebí vyhodnotit růstovou rychlost v jednotlivých časových úsecích s cílem zhodnotit účinky zkoušené chemické látky, které se vyskytly během expoziční doby (např. kontrolou logaritmicky transformovaných růstových křivek). Významné rozdíly mezi růstovou rychlostí v jednotlivých časových úsecích a průměrnou růstovou rychlostí jsou známkou odchylky od konstantního exponenciálního růstu a vyžadují důkladné prozkoumání růstových křivek. V tomto případě by konzervativní přístup spočíval v porovnání specifických růstových rychlostí exponovaných kultur během doby maximální inhibice se specifickými růstovými rychlostmi kontrolních vzorků pro totéž období.

56.

Procentuální inhibici růstové rychlosti (Ir) lze potom vypočítat pro každou zkušební koncentraci (exponovanou skupinu) podle následujícího vzorce:

Formula

kde:

:

% Ir

:

procentuální inhibice průměrné specifické růstové rychlosti,

:

μC

:

střední hodnota μ v kontrolní skupině,

:

μT

:

střední hodnota μ v exponované skupině.

Výtěžek

57.

Účinky na výtěžek se určují na základě dvou proměnných měření, tj. počtu lístků a jedné další proměnné měření (celková plocha lístků, hmotnost sušiny nebo čerstvá hmotnost), přítomných v každé zkušební nádobě na počátku a konci zkoušky. Pro hmotnost sušiny nebo čerstvou hmotnost se počáteční biomasa určuje na základě vzorku lístků odebraných ze stejné vsázky použité k naočkování zkušebních nádob (viz odstavec 20). Pro každou zkušební koncentraci a kontrolu se vypočítá střední hodnota výtěžku a odhad rozptylu. Střední hodnotu procentuální inhibice výtěžku ( % Iy) lze vypočítat pro každou exponovanou skupinu následovně:

Formula

kde:

:

% Iy

:

procentuální snížení výtěžku,

:

bC

:

konečná biomasa minus počáteční biomasa pro kontrolní skupinu,

:

bT

:

konečná biomasa minus počáteční biomasa pro exponovanou skupinu.

Vynášení křivek závislosti koncentrace-odezva

58.

Je třeba vynést křivky závislosti koncentrace-odezva, které vyjadřují vztah střední procentuální inhibice proměnné odezvy (Ir, or Iy vypočítané postupem z odstavce 56 nebo 57) a logaritmu koncentrace zkoušené chemické látky.

Odhad ECx

59.

Odhady ECx (např. EC50) by měly být založeny jak na průměrné specifické růstové rychlosti (ErCx), tak na výtěžku (EyCx), přičemž obě tyto hodnoty by zase měly vycházet z počtu lístků a jedné další proměnné měření (celková plocha lístků, hmotnost sušiny nebo čerstvá hmotnost). Důvodem je skutečnost, že existují zkoušené chemické látky, které mají odlišný dopad na počet lístků a na další proměnné měření. Požadovanými parametry toxicity jsou proto čtyři hodnoty ECx pro každou vypočítanou úroveň inhibice x: ErCx (počet lístků); ErCx (celková plocha lístků, hmotnost sušiny nebo čerstvá hmotnost); EyCx (počet lístků) a EyCx (celková plocha lístků, hmotnost sušiny nebo čerstvá hmotnost).

Statistické postupy

60.

Cílem je získat kvantitativní vztah mezi koncentrací a odezvou pomocí regresní analýzy. Je možné použít váženou lineární regresi po provedení linearizující transformace dat odezvy – například do probitových nebo logitových či Weibullových jednotek (13), ale dává se přednost nelineárním regresním postupům, s jejichž pomocí se lépe zpracovávají nevyhnutelné nepravidelnosti dat a odchylky od hladkých distribucí. Při přiblížení se k nule či úplné inhibici mohou být takové nepravidelnosti zesíleny transformací a rušit při analýze (13). Je zapotřebí uvést, že standardní metody analýzy používající probitové, logitové nebo Weibullovy transformace jsou určeny k použití s binárními daty (např. mortalita nebo přežití) a musí se upravit, aby mohly být použity s daty růstové rychlosti nebo výtěžku. Speciální postupy pro stanovení hodnot ECx ze spojitých dat lze nalézt v literatuře (14, 15 a 16).

61.

Pro každou proměnnou odezvy, která se má analyzovat, se použije vztah koncentrace a odezvy pro výpočet bodových odhadů hodnot ECx. Je-li to možné, je zapotřebí určit 95 % intervaly spolehlivosti pro každý odhad. Dobrá shoda dat odezvy s regresním modelem se vyhodnotí buď graficky, nebo statisticky. Regresní analýza by se měla provádět pomocí odezev jednotlivých opakování, nikoliv pomocí středních hodnot exponovaných skupin.

62.

Odhady EC50 a meze spolehlivosti lze rovněž získat lineární interpolací s bootstrapem (17), pokud se dostupné regresní modely/metody pro příslušná data nehodí.

63.

Pro odhad LOEC, a tedy i NOEC je nezbytné porovnat střední hodnoty exponovaných vzorků pomocí metod analýzy rozptylu (ANOVA). Střední hodnota pro každou koncentraci se poté musí porovnat se střední hodnotou pro kontrolní skupinu, a to vhodnou metodou vícenásobného porovnání nebo metodou zkoušky trendu. Užitečné mohou být Dunnettův test nebo Williamsův test (18, 19, 20, 21). Je nezbytné vyhodnotit, zda je splněn předpoklad homogenity rozptylu nezbytný pro ANOVA. Toto hodnocení lze provádět graficky nebo formální zkouškou (22). Vhodnými testy jsou Leveneův nebo Bartlettův. Nesplnění předpokladu homogenity rozptylů se dá někdy napravit logaritmickou transformací dat. Jestliže je heterogenita rozptylů extrémní a nelze ji napravit transformací, pak je třeba zvážit analýzu takovými metodami, jako je sestupný Jonckheerův trend test. Další pokyny pro stanovení NOEC lze nalézt v (16).

64.

Vědecký vývoj poslední doby vedl k doporučení opustit koncepci NOEC a nahradit ji odhady bodů ECx na základě regrese. Vhodná hodnota x nebyla pro tuto zkoušku s Lemna stanovena. Nicméně se zdá, že vhodné je rozmezí od 10 do 20 % (v závislosti na zvolené proměnné odezvy) a nejlépe by se měly uvádět jak EC10, tak EC20.

Závěrečná zpráva

65.

V závěrečné zprávě musí být uvedeny tyto údaje:

 

Zkoušená chemická látka:

fyzikální povaha a fyzikálně-chemické vlastnosti, včetně meze rozpustnosti ve vodě,

údaje o chemické identifikaci (např. číslo CAS), včetně čistoty.

 

Zkušební druh:

vědecký název, klon (je-li znám) a zdroj.

 

Zkušební podmínky:

použitý zkušební postup (statický, semistatický nebo průtokový),

datum zahájení zkoušky a délka jejího trvání,

zkušební médium,

popis experimentálního uspořádání: zkušební nádoby a kryty, objemy roztoků, počty kolonií a lístků na zkušební nádobu na počátku zkoušky,

zkušební koncentrace (nominální, popř. naměřené) a počet opakování pro každou koncentraci,

metody přípravy zásobních a zkušebních roztoků, včetně použití jakýchkoliv rozpouštědel nebo dispergátorů,

teplota během zkoušky,

zdroj světla, intenzita světla a homogenita,

hodnoty pH zkušebních a kontrolních médií,

koncentrace zkoušené chemické látky a metoda analýzy s příslušnými údaji pro hodnocení jakosti (validační studie, směrodatné odchylky nebo intervaly spolehlivosti analýz),

metody pro určení počtu lístků a dalších proměnných měření, např. hmotnost sušiny, čerstvá hmotnost nebo plocha lístků,

všechny odchylky od této zkušební metody.

 

Výsledky:

hrubá data: počet lístků a další proměnné měření v každé zkušební a kontrolní nádobě při každém pozorování a každé analýze,

střední hodnoty a směrodatné odchylky pro každou proměnnou měření,

růstové křivky pro každou koncentraci (doporučeno s logaritmicky transformovanou proměnnou měření, viz odstavec 55),

doba zdvojnásobení/růstová rychlost v kontrole na základě počtu lístků,

vypočítané proměnné odezvy pro všechna opakování s exponovanými vzorky, spolu se středními hodnotami a variačními koeficienty pro opakování,

grafické znázornění vztahu koncentrace a odezvy,

odhady toxických cílových ukazatelů pro proměnné odezvy, např. EC50, EC10, EC20, a související intervaly spolehlivosti. Jestliže se počítají LOEC a/nebo NOEC, uvedou se jejich hodnoty a statistické metody použité k jejich stanovení,

jestliže byla použita ANOVA, uvede se velikost účinku, který lze detekovat (např. nejmenší významný rozdíl),

jakákoliv stimulace růstu zjištěná v jakémkoli exponovaném vzorku,

jakékoliv vizuální známky fytotoxicity, jakož i pozorování zkušebních roztoků,

diskuse výsledků, včetně případného vlivu na výsledek zkoušky v důsledku odchylek od této zkušební metody.

LITERATURA

1)

ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742. In, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.

2)

US EPA – United States Environmental Protection Agency. (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ‚Public draft‘. EPA 712-C-96-156. 8pp.

3)

AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

4)

SSI – Swedish Standards Institute. (1995). Water quality – Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (in Swedish).

5)

Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37 – 120 pp.

6)

Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.

7)

Sims I., Whitehouse P. and Lacey R. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency.

8)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

9)

International Organisation for Standardisation. ISO DIS 20079. Water Quality – Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) – Duckweed Growth Inhibition Test.

10)

Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3-77 108. September 1977.

11)

Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353 – 359.

12)

Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481-483.

13)

Christensen, E.R.,, Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713-718.

14)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.

15)

Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494.

16)

OECD. (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

17)

Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

18)

Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.

19)

Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491.

20)

Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.

21)

Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 519-531.

22)

Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

Dodatek 1

Definice

Pro účely této zkušební metody se používají následující definice a zkratky:

 

Biomasa je hmotnost sušiny živé hmoty přítomné v populaci. V této zkoušce se obvykle měří náhrady biomasy, například počet lístků nebo plocha lístků, a používání termínu ‚biomasa‘ rovněž odkazuje na tyto náhradní míry.

 

Chemická látka je látka nebo směs.

 

Chloróza je žloutnutí tkáně lístků.

 

Klon je organismus nebo buňka vzniklá z jediného jedince asexuální reprodukcí. Jedinci ze stejného klonu jsou proto geneticky identičtí.

 

Kolonie znamená soubor mateřských a dceřiných lístků (obvykle 2 až 4) navzájem spolu spojených. Někdy se označuje jako rostlina.

 

ECx je koncentrace zkoušené látky rozpuštěné ve zkušebním médiu, která po dané expoziční době (musí se výslovně uvést, pokud se odchyluje od úplné či normální doby trvání zkoušky) vede k x % (např. 50 %) snížení růstu Lemna. Pro jednoznačný popis hodnoty EC odvozené z růstové rychlosti nebo z výtěžku se pro růstovou rychlost používá symbol ‚ErC‘ a pro výtěžek ‚EyC‘ následovaný proměnnou měření, např. ErC (počet lístků).

 

Průtoková zkouška je zkouška, při níž jsou zkušební roztoky průběžně vyměňovány.

 

Lístek je individuální/samostatná listovitá struktura rostliny okřehku. Je to nejmenší jednotka, tj. jedinec, schopná reprodukce.

 

Hrbatost znamená lístky mající hrbolatý či napuchlý vzhled.

 

Růst je zvýšení proměnné měření, např. počtu lístků, hmotnosti sušiny, hmotnosti za mokra nebo plochy lístků, během doby zkoušky.

 

Růstová rychlost (průměrná specifická růstová rychlost) je logaritmický nárůst biomasy během období expozice.

 

Nejnižší koncentrace s pozorovaným účinkem (LOEC) je nejnižší zkušební koncentrace, při níž je pro danou expoziční dobu pozorován statisticky významný účinek chemické látky na snížení růstu (na hladině spolehlivosti p < 0,05) ve srovnání s kontrolou. Všechny zkušební koncentrace vyšší než LOEC musí však mít stejné nebo závažnější škodlivé účinky, než jsou účinky pozorované při koncentraci LOEC. Nelze-li tyto dvě podmínky splnit, musí být podrobně vysvětleno, jak byla LOEC (a tedy i NOEC) zvolena.

 

Proměnné měření jsou jakýmkoliv druhem proměnných, které se měří pro vyjádření cílového ukazatele pomocí jedné či více různých proměnných odezvy. V této metodě jsou proměnnými měření počet lístků, plocha lístků, čerstvá hmotnost a hmotnost sušiny.

 

Monokultura je kultura s jedním druhem rostliny.

 

Nekróza je mrtvá (tj. bílá či vodou nasáklá) tkáň lístku.

 

Koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC) je zkušební koncentrace bezprostředně nižší než LOEC.

 

Fenotyp je pozorovatelná charakteristika organismu určená interakcí jeho genů s jeho prostředím.

 

Proměnné odezvy jsou proměnné pro odhad toxicity odvozené z jakýchkoliv naměřených proměnných, jež popisují biomasu, různými metodami výpočtu. U této metody jsou proměnnými odezvy růstová rychlost a výtěžek, které se odvozují z proměnných měření jako např. počtu lístků, plochy lístků, čerstvé hmotnosti nebo hmotnosti sušiny.

 

Semistatická (obnovovací) zkouška je zkouška, při níž je zkušební roztok během zkoušky ve stanovených intervalech pravidelně nahrazován.

 

Statická zkouška je zkušební metoda bez obnovování zkušebního roztoku během zkoušky.

 

Zkoušená chemická látka je jakákoli látka nebo směs zkoušená pomocí této zkušební metody.

 

Cílový ukazatel popisuje obecný faktor, který bude jakožto cíl zkoušky změněn zkoušenou chemickou látkou vzhledem ke kontrole. Při této metodě je cílovým ukazatelem inhibice růstu, kterou lze vyjádřit různými proměnnými odezvy, jež jsou založeny na jedné či více proměnných měření.

 

Zkušební médium je úplné syntetické růstové médium, v němž rostou zkušební rostliny při expozici zkoušené chemické látce. Zkoušená chemická látka bude za normálních podmínek v zkušebním médiu rozpuštěna.

 

Výtěžek je hodnota proměnné měření pro vyjádření biomasy na konci expoziční doby minus proměnná měření na počátku expoziční doby.

Dodatek 2

Popis Lemna spp.

Vodní rostlina běžně označovaná jako okřehek, Lemna spp., patří do čeledi Lemnaceae (okřehkovité), která má řadu celosvětově rozšířených druhů ve čtyřech rodech. Jejich rozdílný vzhled a taxonomie byly vyčerpávajícím způsobem popsány v (1, 2). Lemna gibba a L. minor jsou představiteli druhů oblastí mírného pásu a běžně se používají pro zkoušky toxicity. Oba druhy mají plovoucí nebo ponořenou lodyžku diskovitého tvaru (lístek) a velmi tenký kořínek, který vychází ze středu spodní části každého lístku. Lemna spp. zřídkakdy kvetou a rostliny se množí vegetativně vytvářením nových lístků (3). Ve srovnání se staršími rostlinami jsou mladší rostliny spíše světlejší, mají kratší kořínky a skládají se ze dvou až tří lístků různých velikostí. Díky malé velikosti, jednoduché struktuře, asexuální reprodukci a krátké generační době jsou rostliny rodu Lemna velmi vhodné pro laboratorní zkoušení (4, 5).

Kvůli pravděpodobným rozdílům v citlivost mezi jednotlivými druhy jsou platná pouze srovnání citlivosti v rámci daného druhu.

Příklady druhů Lemna, které byly použity pro zkoušení: odkazy na druh.

 

Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.

 

Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.

 

Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ‚Public draft‘. EPA 712-C-96-156. 8pp.

Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality – Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (in Swedish).

 

Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742.

United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ‚Public draft‘. EPA 712-C-96-156. 8pp.

 

Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.

 

Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.

 

Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481- 483.

 

Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.

Zdroje druhu Lemna

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria

Department of Botany, University of Toronto

Toronto, Ontario, Kanada, M5S 3 B2

Tel: +1-416-978-3641

Fax:+1-416-978-5878

e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca

North Carolina State University

Forestry Dept

Duckweed Culture Collection

Campus Box 8002

Raleigh, NC 27695-8002

USA

phone 001 (919) 515-7572

astomp@unity.ncsu.edu

Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University

SE-106 91

STOCKHOLM

ŠVÉDSKO

Tel: +46 8 674 7240

Fax +46 8 674 7636

Federal Environmental Agency (UBA)

FG III 3.4

Schichauweg 58

12307 Berlin

Německo

e-mail: lemna@uba.de

LITERATURA

1)

Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.

2)

Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Switzerland.

3)

Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.

4)

Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.

5)

Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52:7-22

Dodatek 3

Uchovávání zásobních kultur

Zásobní kultury je možné uchovávat při nižších teplotách (4–10 °C) po delší dobu bez potřeby je znovu zakládat. Růstové médium pro Lemna může být stejné jako médium použité pro zkoušení, ale pro zásobní kultury je možné použít jiná média bohatá na živiny.

Pravidelně se několik mladých, světle-zelených rostlin vyjme a za aseptických podmínek umístí do nových kultivačních nádob obsahujících čerstvé médium. Za zde navržených podmínek nižší teploty lze provádět dílčí kultivace v intervalech až tří měsíců.

Je třeba používat chemicky čisté (umyté kyselinou) a sterilní skleněné kultivační nádoby a dodržovat aseptické podmínky manipulace. V případě kontaminace zásobní kultury, např. řasami nebo houbami, je nezbytné podniknout opatření k odstranění kontaminujících organismů. V případě řas a většiny dalších kontaminujících organismů toho lze dosáhnout povrchovou sterilizací. Odebere se vzorek kontaminovaného rostlinného materiálu a uříznou se kořeny. Materiál se pak intenzívně třepe v čisté vodě a následně ponoří do 0,5 % (obj.) roztoku chlornanu sodného na dobu mezi 30 s a 5 min. Pak se rostlinný materiál opláchne sterilní vodou a převede, po várkách, do kultivačních nádob obsahujících čerstvé růstové médium. Při tomto zpracování mnoho lístků odumře, zejména jestliže se použijí delší expoziční doby, ale některé z lístků, které přežijí, budou obvykle prosté kontaminace. Ty je pak možné použít k opětovné inokulaci nových kultur.

Dodatek 4

Média

Pro L. minor a L. gibba se doporučují rozdílná růstová média. Pro L. minor je doporučeno upravené médium Švédského standardu (SIS), zatímco pro L. gibba je doporučeno médium 20X AAP. Složení obou médií je uvedeno níže. Při přípravě těchto médií je třeba používat chemicky čisté nebo analyticky čisté látky a deionizovanou vodu.

Švédský standard (SIS) pro růstové médium Lemna:

Zásobní roztoky I–V se sterilizují v autoklávu (120 °C, 15 minut) nebo membránovou filtrací (přibližná velikost pórů 0,2 μm).

Zásobní roztoky VI (a volitelně VII) se sterilizuje pouze membránovou filtrací; tyto roztoky by se neměly autoklávovat.

Sterilní zásobní roztoky se skladují v chladu a temnu. Zásobní roztoky I–V se musí vylít po šesti měsících, zatímco zásobní roztok VI (a volitelně VII) se mohou skladovat jen jeden měsíc.

Zásobní roztok č.

Látka

Koncentrace v zásobním roztoku

(g/l)

Koncentrace v připraveném médiu

(mg/l)

Připravené médium

 

 

 

 

Prvek

Koncentrace

(mg/l)

I

NaNO3

8,50

85

Na; N

32; 14

KH2PO4

1,34

13,4

K; P

6,0; 2,4

II

MgSO4 · 7H2O

15

75

Mg; S

7,4; 9,8

III

CaCl2 · 2H2O

7,2

36

Ca; Cl

9,8; 17,5

IV

Na2CO3

4,0

20

C

2,3

V

H3BO3

1,0

1,00

B

0,17

MnCl2 · 4H2O

0,20

0,20

Mn

0,056

Na2MoO4 · 2H2O

0,010

0,010

Mo

0,0040

ZnSO4 · 7H2O

0,050

0,050

Zn

0,011

CuSO4 · 5H2O

0,0050

0,0050

Cu

0,0013

Co(NO3)2 · 6H2O

0,010

0,010

Co

0,0020

VI

FeCl3 · 6H2O

0,17

0,84

Fe

0,17

Na2-EDTA 2H2O

0,28

1,4

VII

MOPS (pufr)

490

490

Pro přípravu 1 litru média SIS se do 900 ml deionizované vody přidají následující roztoky:

10 ml zásobního roztoku I,

5 ml zásobního roztoku II,

5 ml zásobního roztoku III,

5 ml zásobního roztoku IV,

1 ml zásobního roztoku V,

5 ml zásobního roztoku VI,

1 ml zásobního roztoku VII (volitelně).

Poznámka: Pro určité zkoušené chemické látky může být potřebný další zásobní roztok VII- (pufr MOPS (viz odstavec 11).

pH se nastaví na 6,5 ± 0,2 buď 0,1 mol nebo 1 mol HCl nebo NaOH a objem se doplní do 1 litru deionizovanou vodou.

Růstové médium 20X AAP

Zásobní roztoky se připraví v sterilní destilované nebo deionizované vodě.

Sterilní zásobní roztoky se skladují v chladu a temnu. Za těchto podmínek mají zásobní roztoky skladovatelnost min. 6–8 týdnů.

Pro médium 20X – AAP se připraví pět živných zásobních roztoků (A1, A2, A3, B a C) za použití chemicky čistých látek. 20 ml každého živného zásobního roztoku se přidá do přibližně 850 ml deionizované vody, čímž vznikne růstové médium. pH se nastaví na 7,5 ± 0,1 buď 0,1 nebo 1 mol HCl nebo NaOH a objem se doplní do 1 litru deionizovanou vodou. Médium se pak zfiltruje přes (přibližně) 0,2μm membránový filtr do sterilního kontejneru.

Růstové médium určené pro zkoušení by se mělo připravit 1–2 dny před použitím, aby se pH mohlo stabilizovat. pH růstového média by se mělo před použitím zkontrolovat a podle potřeby znovu upravit přídavkem 0,1 nebo 1 mol NaOH nebo HCl, jak je popsáno výše.

Zásobní roztok č.

Látka

Koncentrace v zásobním roztoku

(g/l) (7)

Koncentrace v připraveném médiu

(mg/l) (7)

Připravené médium

 

 

 

 

Prvek

Koncentrace

(mg/l) (7)

A1

NaNO3

26

510

Na; N

190; 84

MgCl2 · 6H2O

12

240

Mg

58,08

CaCl2 · 2H2O

4,4

90

Ca

24,04

A2

MgSO4 · 7H2O

15

290

S

38,22

A3

K2HPO4 · 3H2 · O

1,4

30

K;P

9,4; 3,7

B

H3BO3

0,19

3,7

B

0,65

MnCl2 · 4H2O

0,42

8,3

Mn

2,3

FeCl3 · 6H2O

0,16

3,2

Fe

0,66

Na2EDTA.2H2O

0,30

6,0

ZnCl2

3,3 mg/l

66 μg/l

Zn

31 μg/l

CoCl2 · 6H2O

1,4 mg/l

29 μg/l

Co

7,1 μg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7,3 mg/l

145 μg/l

Mo

58 μg/l

CuCl2 · 2H2O

0,012 mg/l

0,24 μg/l

Cu

0,080 μg/l

C

NaHCO3

15

300

Na;C

220; 43

STEINBERGovo médium (podle ISO 20079)

Koncentrace a zásobní roztoky

Upravené médium podle Steinberga se používá v normě ISO 20079 pro Lemna minor samotné (jelikož norma povoluje pouze Lemna minor), ale zkoušky ukázaly, že dobré výsledky je možné získat rovněž s Lemna gibba.

Při přípravě média je třeba použít chemicky nebo analyticky čisté látky a deionizovaná voda.

Připraví se živné médium ze zásobních roztoků nebo 10násobně koncentrovaného média, které umožňuje maximální koncentraci média bez vysrážení.

Tabulka 1

STEINBERGovo médium se stabilizovaným pH (upraveno podle Altenburgera)

Složka

Živné médium

Makroprvky

molekulová hmotnost

mg/l

mmol/l

KNO3

101,12

350,00

3,46

Ca(NO3)2 · 4H2O

236,15

295,00

1,25

KH2PO4

136,09

90,00

0,66

K2HPO4

174,18

12,60

0,072

MgSO4 · 7H2O

246,37

100,00

0,41

Mikroprvky

molekulová hmotnost

μg/l

μmol/l

H3BO3

61,83

120,00

1,94

ZnSO4 · 7H2O

287,43

180,00

0,63

Na2MoO4 · 2H2O

241,92

44,00

0,18

MnCl2 · 4H2O

197,84

180,00

0,91

FeCl3 · 6H2O

270,21

760,00

2,81

EDTA dvojsodný-dihydrát

372,24

1 500,00

4,03


Tabulka 2

Zásobní roztoky (makroprvky)

1.

Makroprvky (50násobně koncentrované)

g/l

Zásobní roztok 1:

KNO3

17,50

KH2PO4

4,5

K2HPO4

0,63

Zásobní roztok 2:

MgSO4 · 7H2O

5,00

Zásobní roztok 3:

Ca(NO3)2 · 4H2O

14,75


Tabulka 3

Zásobní roztoky (mikroprvky)

2.

Mikroprvky (1 000násobně koncentrované)

mg/l

Zásobní roztok 4:

H3BO3

120,0

Zásobní roztok 5:

ZnSO4 · 7H2O

180,0

Zásobní roztok 6:

Na2MoO4 · 2H2O

44,0

Zásobní roztok 7:

MnCl2 · 4H2O

180,0

Zásobní roztok 8:

FeCl3 · 6H2O

760,00

EDTA dvojsodný-dihydrát

1 500,00

Zásobní roztoky 2 a 3 a odděleně 4 až 7 se mohou sloučit (je třeba brát v úvahu požadované koncentrace).

Pro prodloužení životnosti se zásobní roztoky zpracují v autoklávu při 121 °C po dobu 20 min nebo se alternativně provede sterilní filtrace (0,2 μm). Pro zásobní roztok 8 se důrazně doporučuje sterilní filtrace (0,2 μm).

Příprava konečné koncentrace STEINBERGova média (upraveného):

20 ml zásobních roztoků 1, 2 a 3 (viz Tabulka 2) se přidá do přibližně 900 ml deionizované vody, aby se předešlo vysrážení.

Přidá se 1,0 ml zásobních roztoků 4, 5, 6, 7 a 8 (viz Tabulka 3).

pH se nastaví na 5,5 ± 0,2 (nastaví se přidáním minimálního objemu roztoku NaOH nebo HCl).

Doplní se vodou do 1 000 ml.

Jestliže se zásobní roztoky sterilizují a použije se vhodná voda, není další sterilizace nutná. Jestliže se sterilizace provádí s konečným médiem, zásobní roztok 8 se přidá po zpracování v autoklávu (při teplotě 121 oC po dobu 20 min).

Příprava 10násobně koncentrovaného STEINBERGova média (upraveného) pro středně dlouhé skladování.

20 ml zásobních roztoků 1, 2 a 3 (viz Tabulka 2) se přidá do přibližně 30 ml vody, aniž by došlo k vysrážení.

Přidá se 1,0 ml zásobních roztoků 4, 5, 6, 7 a 8 (viz Tabulka 3). Objem se doplní vodou do 100 ml.

Jestliže se zásobní roztoky sterilizují a použije se vhodná voda, není další sterilizace nutná. Jestliže se sterilizace provádí s konečným médiem, zásobní roztok 8 se přidá po zpracování v autoklávu (při teplotě 121 °C po dobu 20 min).

pH média (konečná koncentrace) by mělo být 5,5 ± 0,2.

6)

Doplňují se následující kapitoly C.31 až C.46:

C.31.   ZKOUŠKA SUCHOZEMSKÝCH ROSTLIN: ZKOUŠKA VZCHÁZIVOSTI OSIVA A RŮSTU SEMENÁČKŮ

ÚVOD

1.

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení 208 (2006). Zkušební metody se pravidelně přezkoumávají s ohledem na vědecký pokrok a aplikovatelnost pro zákonné použití. Tato aktualizovaná zkušební metoda je určena pro hodnocení potenciálních účinků chemických látek na vzcházivost osiva a růst semenáčků. Jako taková nepokrývá chronické účinky nebo účinky na reprodukci (tj. množství semen, tvorba květů, zrání plodů). Je třeba brát v úvahu podmínky expozice a vlastnosti chemické látky určené ke zkoušení, aby se zajistilo, že budou použity příslušné zkušební metody (např. při zkoušení kovů/kovových sloučenin je třeba počítat s efekty pH a s tím spojených protiiontů) (1). Tato zkušební metoda se netýká rostlin vystavených parám chemických látek. Zkušební metoda je vhodná pro zkoušení obecných chemických látek, biocidů a přípravků na ochranu plodin (rovněž známých jako přípravky na ochranu rostlin nebo pesticidy). Metoda byla vyvinuta na základě stávajících metod (2, 3, 4, 5, 6, 7). Rovněž byly zohledněny další dokumenty vztahující se ke zkoušení rostlin (8, 9, 10). Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.

PODSTATA ZKOUŠKY

2.

Zkouška hodnotí účinky na vzcházivost osiva a rané fáze růstu vyšších rostlin po expozici zkoušené chemické látce v půdě (nebo jiné vhodné půdní matrici). Semena se umístí do půdy vystavené působení zkoušené chemické látky a účinky se vyhodnotí obvykle 14 až 21 dnů poté, co vzejde 50 % osiva v kontrolní skupině. Cílovými ukazateli jsou vizuální hodnocení vzcházivosti osiva, hmotnost suchých výhonků (alternativně hmotnost čerstvých výhonků) a v určitých případech výška výhonků a rovněž hodnocení viditelných škodlivých účinků na různé části rostlin. Tato měření a pozorování se porovnají s neexponovanými kontrolními rostlinami.

3.

V závislosti na očekávaném způsobu expozice se zkoušená chemická látka buď zapracuje do půdy (nebo případně do umělé půdní matrice) nebo se aplikuje na povrch půdy, což správně představuje potenciální způsob expozice chemické látce. Zapracování do půdy se provede zpracováním půdy v objemu. Po aplikaci se půda přemístí do květináčů a semena daného rostlinného druhu se vysejí do půdy. Povrchová aplikace se provádí na půdu v květináčích, do které již byla vsazena semena. Zkoušené jednotky (kontrolní a exponované půdy se semeny) se pak umístí do prostoru s vhodnými podmínkami pro podporu klíčení/růstu rostlin.

4.

Zkoušku lze provádět tak, aby se stanovila křivka dávka-odezva nebo pro jednotlivou koncentraci/dávku jako limitní zkoušku podle účelu studie. Jestliže výsledky ze zkoušky s jednou koncentrací/dávkou překročí určitou úroveň toxicity (např. jsou-li pozorovány účinky vyšší než x %), provede se orientační zkouška pro stanovení horní a dolní meze toxicity; následuje zkouška s několika koncentracemi/dávkami pro stanovení křivky dávka-odezva. Použije se příslušná metoda statistické analýzy pro získání účinné koncentrace ECx nebo účinné dávky ERx vyvolávající účinek (např. EC25, ER25, EC50, ER50) pro nejcitlivější významný(é) parametr(y). Při této zkoušce je možno rovněž vypočítat koncentraci bez pozorovaných účinků (NOEC) a nejnižší koncentraci s pozorovaným účinkem (LOEC).

INFORMACE O ZKOUŠENÉ CHEMICKÉ LÁTCE

5.

Následující informace jsou užitečné pro identifikaci očekávaného způsobu expozice chemické látce a pro uspořádání zkoušky: strukturní vzorec, čistota, rozpustnost ve vodě, rozpustnost v organických rozpouštědlech, rozdělovací koeficient 1-oktanol/voda, sorpční chování půdy, tlak par, stabilita chemické látky ve vodě a na světle a biologická rozložitelnost.

PLATNOST ZKOUŠKY

6.

Aby byla zkouška uznána za platnou, musí být v kontrolních vzorcích splněna následující kritéria platnosti:

vzcházivost osiva je alespoň 70 %,

semenáčky nevykazují žádné viditelné fytotoxické účinky (např. chloróza, nekróza, vadnutí, deformace listů a stonků) a rostliny vykazují pouze normální odchylky v růstu a morfologii pro příslušný druh,

střední hodnota přežití vzešlých kontrolních semenáčků je alespoň 90 % po dobu trvání studie,

podmínky prostředí pro příslušný druh jsou identické a růstová média obsahují stejné množství půdní matrice, podpůrných médií nebo substrátu ze stejného zdroje.

REFERENČNÍ CHEMICKÁ LÁTKA

7.

Referenční chemická látka se může zkoušet v pravidelných intervalech pro ověření, zda se účinnost zkoušky a odezva příslušných zkoušených rostlin a zkušebních podmínek v průběhu zkoušky významně nezměnily. Alternativně je možné použít dřívější měření biomasy nebo růstu kontrolních vzorků pro vyhodnocení fungování zkušebního systému v příslušných laboratořích a výsledky mohou sloužit jako měřítko kontroly kvality pro danou laboratoř.

POPIS METODY

Přírodní půda – umělý substrát

8.

Rostliny se mohou pěstovat v květináčích v půdě písčitohlinité, hlinitopísčité nebo písčitojílovitohlinité obsahující až 1,5 % organického uhlíku (přibližně 3 % organické hmoty). Rovněž se dá použít běžně prodávaný substrát nebo syntetická půdní směs, která obsahuje do 1,5 % organického uhlíku. Jílovité půdy by se neměly používat, jestliže je o zkoušené chemické látce známo, že vykazuje vysokou afinitu k jílu. Půda z pole se musí prosít na velikost částic 2 mm, aby se homogenizovala a odstranily se hrubé částice. V závěrečné zprávě se musí uvést typ a textura půdy, procentuální zastoupení organického uhlíku, pH a obsah solí měřením elektrické vodivosti konečné připravené půdy. Půda by měla být klasifikována podle standardního klasifikačního systému (11). Půdu je možné pasterizovat nebo tepelně ošetřit, aby se snížil účinek půdních patogenů.

9.

Přírodní půda může komplikovat interpretaci výsledků a zvýšit variabilitu způsobenou měnícími se fyzikálně/chemickými vlastnostmi a mikrobiálními populacemi. Tyto proměnné zase mění schopnost zadržovat vlhkost, kapacitu vázat chemické látky, provzdušňování a obsah živin a stopových prvků. Kromě kolísání těchto fyzikálních faktorů se budou rovněž vyskytovat odchylky v chemických vlastnostech, jako je pH a oxidačně-redukční potenciál, což může ovlivnit biologickou dostupnost zkoušené chemické látky (12, 13, 14).

10.

Umělé substráty se obvykle nepoužívají ke zkoušení přípravků na ochranu rostlin, lze je ale použít ke zkoušení běžných chemických látek nebo v případech, kdy je žádoucí minimalizovat variabilitu přírodních půd a zlepšit srovnatelnost výsledků zkoušek. Použité substráty by měly být složeny z inertních materiálů, které minimalizují interakce se zkoušenou chemickou látkou, nosným rozpouštědlem nebo s oběma. Jako vhodné inertní materiály se ukázaly křemenný písek vypraný kyselinou, minerální vlna a skleněné kuličky (např. o průměru 0,35 až 0,85 mm), které minimálně absorbují zkoušenou chemickou látku (15) a tím zajišťují, že chemická látka bude v maximální míře k dispozici pro sazenice příjmem kořeny. Nevhodnými substráty jsou vermikulit, perlit nebo jiné vysoce absorpční materiály. Rostlinám je třeba pro jejich růst poskytnout živiny, aby se předešlo strádání rostlin kvůli nedostatku živin, a tam, kde je to možné, je třeba stav vyhodnotit chemickou analýzou nebo vizuálním posouzením kontrolních rostlin.

Kritéria pro výběr zkušebního druhu

11.

Spektrum vybraných druhů by mělo být rozumně široké, např. s ohledem na taxonomickou rozmanitost v rostlinné říši, distribuci druhů, jejich hojnost, druhově specifické charakteristiky životního cyklu a oblast přírodního výskytu, aby bylo možno stanovit rozsah odezvy (8, 10, 16, 17, 18, 19, 20). Při výběru je třeba brát v úvahu následující charakteristiky možných zkušebních druhů:

druhy mají jednotná semena, která jsou přímo dostupná ze spolehlivých standardních zdrojů semen a která zajišťují konzistentní, spolehlivé a rovnoměrné klíčení, a rovněž jednotný růst semenáčků,

rostlina je vhodná pro zkoušení v laboratoři a může poskytnout spolehlivé a reprodukovatelné výsledky v rámci jedné zkušební laboratoře i mezi zkušebními laboratořemi navzájem,

citlivost zkoušených druhů by měla být konzistentní s odezvami rostlin v přírodním prostředí vystaveným účinku chemické látky,

byly použity v určitém rozsahu v dřívějších zkouškách toxicity a jejich použití, například při biologických zkouškách herbicidů, screeningu těžkých kovů, zátěžových testech vztahujících se ke slanosti nebo obsahu minerálů nebo alelopatických studiích, ukazuje citlivost na širokou škálu stresových faktorů,

jsou kompatibilní s růstovými podmínkami zkušební metody,

splňují kritéria platnosti zkoušky.

Některé v minulosti nejčastěji používané zkušební druhy jsou uvedeny v dodatku 2 a možné neplodinové druhy v dodatku 3.

12.

Počet druhů určených ke zkoušení závisí na příslušných právních požadavcích, proto není v této zkušební metodě specifikován.

Aplikace zkoušené chemické látky

13.

Chemická látka se aplikuje ve vhodném nosiči (např. voda, aceton, etanol, polyethylenglykol, arabská guma, písek). Zkoušeny mohou být rovněž směsi (upravené produkty nebo přípravky) obsahující účinné složky a různé pomocné látky.

Zapracování do půdy/umělého substrátu

14.

Chemické látky rozpustné ve vodě nebo suspendované ve vodě se mohou rozmíchat ve vodě a roztok se pak promíchá s půdou ve vhodném mísícím zařízení. Tento typ zkoušky může být vhodný, jestliže k expozici chemické látce dochází prostřednictvím půdy nebo vody v půdních pórech a jestliže je cílem sledovat příjem kořeny. Přidáním zkoušené chemické látky by neměla být překročena retenční vodní kapacita půdy. Objem přidané vody by měl být stejný pro každou zkušební koncentraci, ale měl by být omezen, aby se zabránilo hromadění shluků v půdě.

15.

Chemické látky s nízkou rozpustností ve vodě se rozpustí ve vhodném těkavém rozpouštědle (např. aceton, ethanol) a promíchají s pískem. Rozpouštědlo se pak odstraní z písku pomocí proudu vzduchu za stálého promíchávání písku. Takto zpracovaný písek se pak promíchá s experimentální půdou. Připraví se druhý kontrolní vzorek, ve kterém bude pouze písek a rozpouštědlo. Do vzorků o všech expozičních úrovních a do druhého kontrolního vzorku se přidají stejná množství písku se zamíchaným a s odstraněným rozpouštědlem. V případě pevných, nerozpustných zkoušených chemických látek se suchá půda a chemická látka promíchají ve vhodném míchacím zařízení. Půda se pak přidá do květináčů a ihned se zasejí semena.

16.

Je-li namísto půdy použit umělý substrát, chemické látky rozpustné ve vodě se mohou rozpustit v živném roztoku bezprostředně před začátkem zkoušky. Chemické látky, které jsou nerozpustné ve vodě, ale které se dají ve vodě suspendovat použitím nosného rozpouštědla, se přidají s nosičem do živného roztoku. Ve vodě nerozpustné chemické látky, pro které není k dispozici žádný netoxický nosič rozpustný ve vodě, se rozpustí ve vhodném těkavém rozpouštědle. Roztok se promíchá s pískem nebo skleněnými kuličkami a odpaří v rotační vakuové odparce, přičemž vznikne jednotný povlak chemické látky na písku nebo kuličkách. Zvážený podíl kuliček se extrahuje stejným organickým rozpouštědlem a chemická látka se stanoví před naplněním květináčů.

Povrchová aplikace

17.

V případě přípravků na ochranu rostlin se pro aplikaci zkoušené chemické látky často používá postřik povrchu půdy zkoušeným roztokem. Veškeré zařízení použité při provádění zkoušek, včetně vybavení použitého k přípravě a dávkování zkoušené chemické látky, by mělo mít takovou konstrukci a kapacitu, aby zkoušky zahrnující toto zařízení mohly být provedeny přesně a poskytly reprodukovatelné pokrytí. Pokrytí by mělo být jednotné po celém půdním povrchu. Pozornost je třeba věnovat tomu, aby se předešlo možnosti, že by chemická látka byla adsorbována nebo reagovala s vybavením (např. s plastovými trubkami a lipofilními chemikáliemi nebo ocelovými částmi a elementy). Zkoušená chemická látka se nastříkne na půdní povrch, čímž se simuluje typický postřik aplikovaný v nádržích. Obecně by objemy postřiku měly být v rozmezí normální zemědělské praxe a objemů (množství vody atd. je třeba uvést v závěrečné zprávě). Typ trysky se zvolí tak, aby umožnil jednotné pokrytí půdního povrchu. Jestliže se používají rozpouštědla a nosiče, připraví se druhá skupina kontrolních rostlin, na kterou se aplikuje pouze rozpouštědlo/nosič. To není nezbytné u přípravků na ochranu rostlin, u nichž se testuje složení.

Ověření koncentrace/dávky zkoušené chemické látky

18.

Koncentrace/aplikační dávky se musí ověřit vhodnou analytickou metodou. U rozpustných chemických látek se ověření všech zkušebních koncentrací/dávek může provést analýzou nejvyšší koncentrace zkoušeného roztoku použitého při zkoušce; zaznamená se následné zředění a použití kalibrovaných pomůcek (např. kalibrovaného analytického laboratorního skladu, kalibrovaného vybavení pro aplikaci postřiku). V případě nerozpustných chemikálií musí být spolu s ověřením materiálu složek uvedeny hmotnosti zkoušené chemické látky přidané do půdy. Jestliže je nutné prokázat homogenitu, může být nutné provést analýzu půdy.

POSTUP

Uspořádání zkoušky

19.

Semena stejného druhu se vysejí do květináčů. Počet semen vysetých v květináči závisí na druhu, velikosti květináče a době trvání zkoušky. Počet rostlin v květináči by měl poskytovat adekvátní podmínky růstu a předejít přeplnění během trvání zkoušky. Maximální hustota rostlin je okolo 3–10 semen na 100 cm2 v závislosti na velikosti semen. Například se doporučuje jedna až dvě rostliny kukuřice, sóji, rajčete, okurky nebo cukrové řepy v 15cm květináči; tři rostliny řepky nebo hrachu v 15cm květináči; a 5 až 10 cibulových, pšeničných nebo jiných malých semen v 15cm květináči. Počet semen a paralelních květináčů (paralelní vzorek je definován jako květináč, proto rostliny ve stejném květináči nejsou považovány za paralelní vzorek) by měl být dostatečný pro optimální statistickou analýzu (21). Je třeba poznamenat, že variabilita bude větší u zkušebních druhů s velkými semeny, kterých se dává méně na květináč (opakování) ve srovnání se zkušebním druhem s malými semeny, jichž je možné použít větší počet na jeden květináč. Vysetím stejného počtu semen do každého květináče lze tuto variabilitu minimalizovat.

20.

Kontrolní skupiny se používají, aby bylo jisté, že pozorované účinky jsou spojeny pouze s expozicí zkoušené chemické látce, nebo je lze této expozici přisoudit. Příslušná kontrolní skupina by měla být v každém ohledu identická se zkoušenou skupinou s výjimkou expozice zkoušené chemické látce. Během dané zkoušky by všechny zkušební rostliny, včetně kontrolních, měly být ze stejného zdroje. Aby se zabránilo systematickým chybám, je vyžadováno náhodné přiřazení zkušebních a kontrolních květináčů.

21.

Semena pokrytá insekticidy nebo fungicidy (tzv. ‚oblečená‘ semena) se musí vyloučit. Avšak některé regulační orgány použití určitých nesystemických kontaktních fungicidů (např. kaptan, thiram) povolují (22). Jestliže je obava z patogenů vnesených semeny, mohou se semena nechat krátce nasáknout ve slabém 5 % roztoku chlornanu, pak důkladně opláchnout pod tekoucí vodou a osušit. Není povoleno žádné léčivé ošetření jiným přípravkem na ochranu rostlin.

Zkušební podmínky

22.

Zkušební podmínky by měly napodobit podmínky nezbytné pro normální růst zkoušených druhů a odrůd (v dodatku 4 jsou uvedeny příklady zkušebních podmínek). Vyvíjející se rostliny je třeba udržovat v podmínkách správné zahradnické praxe v řízeném prostředí komor, fytotronů nebo skleníků. Při použití růstových zařízení tato praxe obvykle zahrnuje regulaci a dostatečně časté (např. jednou za den) zaznamenávání teploty, vlhkosti, koncentrace oxidu uhličitého, světelných podmínek (intenzity, vlnové délky, fotosynteticky aktivního záření), doby osvětlení, prostředků zavlažování atd.; tím se zajistí dobrý růst rostlin, což se posuzuje pomocí kontrolních rostlin zvoleného druhu. Teplota ve skleníku by se měla regulovat pomocí systémů ventilace, vytápění anebo chlazení. Pro zkoušení ve sklenících jsou obecně doporučeny následující podmínky: