1.1.

„Akčním limitem“ se rozumí množství dané látky stanovené v příloze doporučení 2013/711/EU, které vede k zahájení šetření za účelem zjištění zdroje uvedené látky v případech, kdy jsou zjištěny zvýšené hodnoty příslušné látky.

1.2.

„Screeningovými metodami“ se rozumí metody používané k identifikaci vzorků s obsahem PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem převyšujícím maximální nebo akční limity. Tyto metody musí umožňovat nákladově efektivní analýzu velkého množství vzorků, čímž se zvyšuje možnost zjistit nové případy, při nichž může vysoká expozice vést k ohrožení zdraví spotřebitelů. Screeningové metody musí být založeny na bioanalytických metodách nebo metodách GC-MS. Výsledky u vzorků, které překročily mezní hodnotu pro kontrolu dodržení maximálních limitů, musí být ověřeny úplnou opětovnou analýzou z původního vzorku pomocí konfirmační metody.

1.3.

„Konfirmačními metodami“ se rozumí metody, které poskytují úplné nebo doplňující informace pro jednoznačnou identifikaci a kvantifikaci PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem u maximálního nebo, v případě potřeby, akčního limitu. Tyto metody využívají plynovou chromatografii / hmotnostní spektrometrii s vysokým rozlišením (GC-HRMS) nebo plynovou chromatografii / tandemovou hmotnostní spektrometrii (GC-MS/MS).

1.4.

„Bioanalytickými metodami“ se rozumí metody založené na využití biologických principů, jako jsou buněčné testy, receptorové testy nebo imunologické testy. Neposkytují výsledky na úrovni kongeneru, ale pouze orientační hodnoty (1) úrovně TEQ, vyjádřené v bioanalytických ekvivalentech (BEQ), aby byla zohledněna skutečnost, že ne všechny sloučeniny přítomné v extraktu vzorku, který při zkoušce dává odezvu, nutně splňují všechny požadavky principu TEQ.

1.5.

„Zjevnou výtěžností biologické zkoušky“ se rozumí hodnota BEQ vypočtená z kalibrační křivky TCDD nebo PCB 126 upravená o hodnoty slepého stanovení a poté vydělená hodnotou TEQ určenou konfirmační metodou. Jejím účelem je korekce činitelů, jako je ztráta PCDD/PCDF a sloučenin s dioxinovým efektem během extrakce a čištění, současně extrahované sloučeniny zesilující nebo tlumící odezvu (agonistické a antagonistické účinky), kvalita kalibrace nebo rozdíly mezi hodnotami TEF a REP. Zjevná výtěžnost biologické zkoušky se vypočte z vhodných referenčních vzorků s reprezentativním zastoupením kongenerů kolem maximálního nebo akčního limitu.

1.6.

„Opakovanou analýzou“ se rozumí samostatná analýza sledovaných analytů na základě druhého alikvotu téhož homogenizovaného vzorku.

1.7.

„Schválenou specifickou mezí stanovitelnosti (2) jednotlivého kongeneru ve vzorku“ se rozumí nejnižší obsah analytu, který může být změřen s rozumnou mírou statistické jistoty, splňující identifikační kritéria popsaná v mezinárodně uznávaných normách, jako je například norma EN 16215:2012 („Krmiva – stanovení dioxinů a PCB s dioxinovým efektem pomocí GC/HRMS a indikátorových PCB pomocí GC/HRMS“) a/nebo v metodách EPA 1613 a 1668 ve znění pozdějších revizí.

Mez stanovitelnosti jednotlivého kongeneru může být identifikována jako:

1.8.

„Horním odhadem“ se rozumí koncept, který vyžaduje pro příspěvek každého nekvantifikovaného kongeneru použití hodnoty meze stanovitelnosti.

1.9.

„Dolním odhadem“ se rozumí koncept, který vyžaduje pro příspěvek každého nekvantifikovaného kongeneru použití nulové hodnoty.

1.10.

„Středním odhadem“ se rozumí koncept, který vyžaduje pro výpočet příspěvku každého nekvantifikovaného kongeneru použití poloviny hodnoty meze stanovitelnosti.

1.11.

„Šarží“ se rozumí identifikovatelné množství potravinové komodity dodané ve stejném okamžiku, u nějž příslušný pracovník zjistil jednotné vlastnosti, jako je původ, druh, typ obalu, balírna, zasílatel nebo označení. U ryb a produktů rybolovu musí být srovnatelná také velikost ryb. I v případě, že velikost a/nebo hmotnost ryb nejsou v rámci zásilky srovnatelné, lze zásilku považovat za šarži, musí se však použít specifický postup odběru vzorků.

1.12.

„Částí šarže“ se rozumí určitá část velké šarže vyčleněná k tomu, aby z ní byl proveden odběr vzorků. Každá část šarže musí být fyzicky samostatná a identifikovatelná.

1.13.

„Dílčím vzorkem“ se rozumí množství materiálu odebrané z jednoho místa šarže nebo části šarže.

1.14.

„Souhrnným vzorkem“ se rozumí souhrn všech dílčích vzorků odebraných ze šarže nebo části šarže.

1.15.

„Laboratorním vzorkem“ se rozumí reprezentativní část nebo množství souhrnného vzorku určené pro laboratoř.

BEQ

Bioanalytické ekvivalenty

GC

Plynová chromatografie

HRMS

Hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením

LRMS

Hmotnostní spektrometrie s nízkým rozlišením

MS/MS

Tandemová hmotnostní spektrometrie

PCB

Polychlorovaný bifenyl

PCB bez dioxinového efektu

PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 a PCB 180

PCDD

Polychlorované dibenzo-p-dioxiny

PCDF

Polychlorované dibenzofurany

QC

Kontrola kvality

REP

Relativní účinnost

TEF

Faktor toxické rovnocennosti

TEQ

Toxické ekvivalenty

TCDD

2,3,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioxin

U

Rozšířená nejistota měření

—

Pokud vzorkovaná šarže obsahuje malé ryby (jednotlivé ryby o hmotnosti < přibližně 1 kg), odebírá se jako dílčí vzorek k vytvoření souhrnného vzorku celá ryba. Pokud je hmotnost takto vytvořeného souhrnného vzorku větší než 3 kg, může dílčí vzorek sestávat ze středních částí ryb tvořících souhrnný vzorek, přičemž každá tato část má hmotnost alespoň 100 g. Celá část, na niž se vztahuje maximální limit, se použije k homogenizaci vzorku.

Střední část ryby je část, v níž je těžiště. To se zpravidla nachází v hřbetní ploutvi (pokud ryba takovou ploutev má) nebo v polovině mezi žaberním a řitním otvorem.

—

Pokud vzorkovaná šarže obsahuje větší ryby (jednotlivé ryby o hmotnosti větší než přibližně 1 kg), tvoří dílčí vzorek střední část ryby. Hmotnost každého dílčího vzorku je alespoň 100 gramů.

U ryb s průměrnou velikostí (přibližně 1–6 kg) se dílčí vzorek odebírá jako řez od páteře k břichu ve střední části ryby.

U velmi velkých ryb (tj. > přibližně 6 kg) je dílčí vzorek odebrán ze svaloviny na pravé straně (pohled zpředu) hřbetu a boku ve střední části ryby. Pokud by odebrání takového kusu ze střední části způsobilo významnou hospodářskou škodu, lze za dostatečné považovat odebrání alespoň tří dílčích vzorků o alespoň 350 gramech, a to bez ohledu na velikost šarže, nebo lze případně odebrat rovnocennou část svaloviny z blízkosti ocasu a z blízkosti hlavy z téže ryby, což představuje dílčí vzorek, jenž je reprezentativní z hlediska množství dioxinů v celé rybě.

—

Pokud jde o strukturu vzorku, použijí se ustanovení bodu III.3.

—

Pokud převládá určitá třída/kategorie velikosti nebo hmotnosti (přibližně 80 % nebo větší podíl šarže), odebere se vzorek z ryb s převládající velikostí nebo hmotností. Takový vzorek se považuje za reprezentativní pro celou šarži.

—

Pokud žádná konkrétní třída/kategorie velikosti nebo hmotnosti nepřevládá, musí se zajistit, aby ryby vybrané do vzorku byly pro danou šarži reprezentativní. Zvláštní pokyny pro takové případy jsou stanoveny v „Pokynech pro odběr vzorků z celých ryb různé velikosti a/nebo hmotnosti“ (2).

—

provedené screeningovou metodou s mírou falešně vyhovujících vzorků nižší než 5 % naznačuje, že hladina nepřekračuje příslušný maximální limit pro PCDD/PCDF a pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem stanovené v nařízení (ES) č. 1881/2006,

—

provedené konfirmační metodou nepřekročí příslušný maximální limit pro PCDD/PCDF a pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem stanovené v nařízení (ES) č. 1881/2006, při zohlednění rozšířené nejistoty měření (5).

—

Na každém stupni odběru vzorků a analýzy se musí přijmout opatření k zamezení křížové kontaminaci.

—

Vzorky musí být uchovávány a přepravovány ve skleněných, hliníkových, polypropylenových nebo polyethylenových nádobách vhodných pro skladování bez jakéhokoli vlivu na úrovně PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem ve vzorcích. Z nádoby na vzorky musí být odstraněny stopy papírového prachu.

—

Vzorky musí být uchovávány a přepravovány tak, aby byla zachována integrita vzorku potraviny.

—

Pokud je to relevantní, jednotlivé laboratorní vzorky se jemně rozemelou a důkladně promísí postupem, u něhož je prokázáno, že se jím dosáhne úplné homogenizace (např. rozemletím a proséváním přes síto s průměrem oček 1 mm); je-li vlhkost vzorků příliš vysoká, musí se vzorky před rozemletím sušit.

—

Je vždy důležité zkontrolovat činidla, pomůcky ze skla a vybavení z hlediska možného vlivu na výsledky založené na TEQ nebo BEQ.

—

Provede se slepý pokus, při němž se provede celý analytický postup bez vzorku.

—

U bioanalytických metod je velmi důležité, aby u veškerých pomůcek ze skla a rozpouštědel použitých při analýze bylo zkouškou potvrzeno, že jsou prosty sloučenin, které mohou bránit zjištění cílových sloučenin v pracovním rozsahu. Skleněné pomůcky se vypláchnou rozpouštědly nebo/a zahřejí na teploty vhodné pro odstranění stop PCDD/PCDF, sloučenin s dioxinovým efektem a interferujících sloučenin z jejich povrchu.

—

Množství vzorku použité pro extrakci musí být dostatečné, aby byly splněny požadavky s ohledem na dostatečně nízký pracovní rozsah včetně koncentrací maximálních nebo akčních limitů.

—

Specifické postupy přípravy vzorku použité pro zkoumané produkty musí splňovat mezinárodně uznávané metodiky.

—

Z ryb se musí odstranit kůže, vzhledem k tomu, že maximální limit se vztahuje na svalovinu bez kůže. Je však nutné, aby všechna zbylá svalovina a tuková tkáň na vnitřní straně kůže byly z kůže pečlivě a úplně seškrabány a přidány k analyzovanému vzorku.

—

V souladu s nařízením (ES) č. 882/2004 musí být laboratoře akreditovány uznaným subjektem působícím v souladu s pokyny ISO Guide 58, aby bylo zaručeno, že uplatňují postupy zajištění analytické kvality. Laboratoře musí být akreditovány podle normy EN ISO/IEC 17025. V příslušném případě je třeba se řídit zásadami popsanými v technických pokynech pro odhad nejistoty měření a meze stanovitelnosti pro analýzu PCDD/PCDF a PCB (1).

—

Způsobilost laboratoře prokazuje soustavná úspěšná účast v mezilaboratorních studiích týkajících se stanovení PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem v příslušných matricích potravin a koncentračních rozpětích.

—

Laboratoře, které pro rutinní kontrolu vzorků používají screeningové metody, by měly úzce spolupracovat s laboratořemi používajícími konfirmační metodu, za účelem jak kontroly kvality, tak konfirmace výsledku analýzy podezřelých vzorků.

—

V případě PCDD/PCDF musí být zjistitelná množství z důvodu extrémní toxicity některých těchto sloučenin na horní úrovni femtogramů (10– 15 g). V případě většiny kongenerů PCB je dostatečná již mez stanovitelnosti na úrovni nanogramů (10– 9 g). Pro měření toxičtějších kongenerů PCB s dioxinovým efektem (zejména non-orto substituovaných kongenerů) však musí nejspodnější část pracovního rozsahu dosahovat nízkých úrovní pikogramů (10– 12 g).

—

Je třeba rozlišit PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem a řadu jiných sloučenin, které se extrahují společně s těmito látkami, mohou rušit při jejich stanovování a jsou přítomny v koncentracích až o několik řádů vyšších než koncentrace sledovaných analytů. U metod založených na plynové chromatografii / hmotnostní spektrometrii (GC-MS) je nezbytné rozlišení mezi různými kongenery, např. mezi toxickými kongenery (např. sedmnácti PCDD/PCDF substituovanými v polohách 2,3,7,8 a dvanácti PCB s dioxinovým efektem) a ostatními kongenery.

—

Bioanalytické metody musí být schopny detekovat cílové sloučeniny jako sumu PCDD/PCDF a/nebo PCB s dioxinovým efektem. Přečištění vzorku se zaměří na odstranění sloučenin způsobujících falešně nevyhovující výsledky nebo sloučenin, které mohou způsobovat snížení odezvy vedoucí k falešně vyhovujícím výsledkům.

—

U metod GC-MS musí stanovení poskytovat správný odhad skutečné koncentrace ve vzorku. Vysoká správnost (správnost měření: těsnost shody mezi výsledkem měření a skutečnou nebo přidělenou hodnotou) je nezbytná k tomu, aby nedošlo k zamítnutí výsledku analýzy vzorku na základě malé spolehlivosti stanovené úrovně TEQ. Správnost je vyjádřena pravdivostí (rozdílem mezi střední naměřenou hodnotou analytu v certifikovaném materiálu a jeho certifikovanou hodnotou, vyjádřeným v procentech této hodnoty) a přesností (RSDR je relativní směrodatná odchylka vypočtená z výsledků získaných za podmínek reprodukovatelnosti).

—

Pro bioanalytické metody se určí zjevná výtěžnost biologické zkoušky.

—

Laboratoře musí prokázat výkonnost metody v rozsahu kolem maximálního limitu, např. v polovině, jednonásobku a dvojnásobku maximálního limitu, a to s přijatelným variačním koeficientem pro opakovanou analýzu, a sice během validace a/nebo během rutinní analýzy.

—

Jako opatření v rámci vnitřní kontroly kvality se provádějí pravidelná slepá kontrolní stanovení, stanovení s obohacenými vzorky nebo analýzy kontrolních vzorků (nejlépe certifikovaného referenčního materiálu, je-li k dispozici). Ze slepých kontrolních stanovení, stanovení s obohacenými vzorky nebo analýz kontrolních vzorků se vyhotoví a ověří grafy kontroly kvality, aby bylo zajištěno, že analytická výkonnost je v souladu s požadavky.

—

Pro bioanalytické screeningové metody není stanovení meze stanovitelnosti nezbytné, příslušná metoda však musí prokázat, že umožňuje rozlišení mezi hodnotou slepého stanovení a mezní hodnotou. Při poskytování úrovně BEQ se stanoví oznamovací mez pro vzorky s odezvou nižší než tato mez. Musí být prokázáno, že se oznamovací mez významně (nejméně trojnásobně) liší od slepých vzorků odrážejících celý pracovní postup s odezvou nižší než pracovní rozsah. Vypočte se proto ze vzorků obsahujících cílové sloučeniny přibližně v požadované minimální úrovni, a nikoli z poměru signál-šum nebo ze slepé zkoušky.

—

Mez stanovitelnosti u konfirmačních metod činí přibližně jednu pětinu maximálního limitu.

—

Pro spolehlivé výsledky konfirmačních nebo screeningových metod musí být v rozsahu maximálního limitu splněna následující kritéria pro hodnotu TEQ a BEQ, ať už je určena jako celkový TEQ nebo celkový BEQ (jako suma PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem), nebo samostatně pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem.

—

Pro screening mohou být použity jak metody GC-MS, tak bioanalytické metody. V případě metod GC-MS platí požadavky uvedené v bodě 6. Pro buněčné bioanalytické metody jsou zvláštní požadavky stanoveny v bodě 7.

—

Laboratoře, které pro rutinní kontrolu vzorků používají screeningové metody, by měly úzce spolupracovat s laboratořemi používajícími konfirmační metodu.

—

Během rutinní analýzy je nutné ověřovat výkonnost příslušné screeningové metody, a to kontrolou kvality při analýzách a průběžnou validací metody. Musí být zaveden stálý program kontroly vyhovujících výsledků.

—

Kontrola možného potlačení buněčné odezvy a cytotoxicity.

20 % extraktů vzorků se změří při rutinním screeningu bez přidání a s přidáním TCDD v množství odpovídajícím maximálnímu nebo akčnímu limitu, aby se zjistilo, zda odezva není potlačována interferujícími látkami přítomnými v extraktu vzorku. Naměřená koncentrace u obohaceného vzorku se porovná se sumou koncentrace neobohaceného extraktu a koncentrace obohacující látky. Pokud je tato naměřená koncentrace o více než 25 % nižší než vypočtená (souhrnná) koncentrace, svědčí to o tom, že možná dochází k potlačení odezvy, a dotčený vzorek musí být podroben konfirmační analýze. Výsledky musí být zaznamenány v grafech kontroly kvality.

—

Kontrola kvality u vyhovujících vzorků

Potvrzeno musí být přibližně 2 % až 10 % vyhovujících vzorků, v závislosti na matrici vzorků a zkušenostech laboratoře.

—

Určení míry falešně vyhovujících vzorků na základě údajů z kontroly kvality

Určí se míra falešně vyhovujících výsledků na základě screeningu nižších a vyšších než maximální nebo akční limit. Skutečný podíl falešně vyhovujících výsledků musí být nižší než 5 %.

Poté, co je k dispozici nejméně 20 potvrzených výsledků z kontroly kvality vyhovujících vzorků na matrici/matricovou skupinu, vyvodí se z těchto výsledků závěry ohledně míry falešně vyhovujících výsledků. Do minimálního počtu 20 výsledků pro hodnocení míry falešně vyhovujících výsledků se mohou zahrnout i výsledky ze vzorků analyzovaných pomocí kruhových testů nebo při kontaminačních aférách, které pokrývají rozpětí koncentrace až např. do dvojnásobku maximálního limitu. Vzorky musí zahrnovat nejčastější zastoupení kongenerů, které představují různé zdroje.

Ačkoli se mají screeningové testy přednostně zaměřit na zjištění vzorků přesahujících akční limit, je kritériem pro stanovení míry falešně vyhovujících vzorků maximální limit, s přihlédnutím k rozšířené nejistotě měření konfirmační metody.

—

Případné nevyhovující výsledky ze screeningu musí být vždy ověřeny kompletní opakovanou analýzou původního vzorku pomocí konfirmační metody. Tyto vzorky mohou být také použity pro vyhodnocení podílu falešně nevyhovujících výsledků. U screeningových metod je mírou falešně nevyhovujících výsledků podíl výsledků, které konfirmační analýza potvrdí jako vyhovující, zatímco při předchozím screeningu bylo vysloveno podezření, že je vzorek nevyhovující. Hodnocení výhodnosti použití screeningové metody však musí vycházet z porovnání falešně nevyhovujících vzorků a celkového počtu kontrolovaných vzorků. Tento poměr musí být dostatečně nízký, aby bylo možné považovat používání příslušného screeningového nástroje za výhodné.

—

Bioanalytické metody musí alespoň při validačních podmínkách poskytovat platné údaje o úrovni TEQ, vypočtené a vyjádřené jako BEQ.

—

Pro bioanalytické metody prováděné za podmínek opakovatelnosti je vnitrolaboratorní RSDr obvykle menší než reprodukovatelnost RSDR.

—

Rozdíl mezi horním odhadem a dolním odhadem nesmí překročit 20 %, aby bylo potvrzeno překročení maximálního nebo v případě potřeby akčního limitu.

—

Vnitřní standardy 2,3,7,8-chlor-substituovaných PCDD/PCDF značené izotopem 13C a standardy PCB s dioxinovým efektem značené izotopem 13C musí být přidány na samém začátku analýzy, např. před extrakcí, aby bylo možné validovat analytický postup. Alespoň jeden kongener musí být přidán pro každou z tetra až okta-chlorovaných homologických skupin PCDD/PCDF a alespoň jeden kongener pro každou z homologických skupin PCB s dioxinovým efektem (nebo alespoň jeden kongener pro každou skupinu vybraných iontů při použití hmotnostní spektrometrie v režimu registrace vybraných iontů použitou pro sledování PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem). V případě konfirmačních metod se použije všech 17 vnitřních standardů 2,3,7,8-substituovaných PCDD/PCDF značených izotopem 13C a všech 12 vnitřních standardů PCB s dioxinovým efektem značených izotopem 13C.

—

Relativní faktory odezvy se s pomocí vhodných kalibračních roztoků stanoví také pro kongenery, pro něž nebyly přidány sloučeniny značené izotopem 13C.

—

U potravin rostlinného původu a potravin živočišného původu s obsahem tuku nižším než 10 % je přidání vnitřních standardů povinné před extrakcí. U potravin živočišného původu s obsahem tuku vyšším než 10 % lze vnitřní standardy přidat buď před extrakcí tuku, nebo po ní. Vhodným způsobem se validuje účinnost extrakce, a to v závislosti na fázi, ve které se přidávají vnitřní standardy, a podle toho, zda se vydávané výsledky vztahují na výrobek nebo na tuk ve výrobku obsažený.

—

Před analýzou metodou GC-MS musí být přidány 1 nebo 2 obohacené standardy (recovery standardy) pro stanovení výtěžnosti.

—

Kontrola výtěžnosti je nezbytná. U konfirmačních metod se výtěžnost jednotlivých vnitřních standardů musí pohybovat v rozmezí 60 až 120 %. Nižší nebo vyšší hodnota výtěžnosti u jednotlivých kongenerů, zejména některých hepta- a okta-chlorovaných dibenzo-p-dioxinů a dibenzofuranů, je přípustná pod podmínkou, že jejich příspěvek k hodnotě TEQ nepřesáhne 10 % celkové hodnoty TEQ (na základě sumy PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem). Hodnota výtěžnosti u screeningových metod GC-MS se musí pohybovat mezi 30 a 140 %.

—

Oddělení PCDD/PCDF od interferujících chlorovaných sloučenin, jako jsou PCB bez dioxinového efektu a chlorované difenylethery, se provede vhodnými chromatografickými technikami (nejlépe na florisilové, aluminové a/nebo uhlíkové koloně).

—

Oddělení isomerů pomocí plynové chromatografie musí být dostatečné (< 25 % překryvu mezi píky 1,2,3,4,7,8-HxCDF a 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

—

Rozsah kalibrační křivky musí pokrývat odpovídající rozpětí maximálních nebo akčních limitů.

—

Pro GC-HRMS:

—

Pro GC-MS/MS:

—

Při výpočtu koncentrace z kalibrační křivky TCDD vykáží hodnoty na horním konci křivky velký křivkový rozptyl (vysoký variační koeficient (CV)). Pracovní rozsah je oblast, kde je tento CV menší než 15 %. Nejspodnější část pracovního rozsahu (oznamovací mez) musí být stanovena tak, aby výrazně (nejméně trojnásobně) přesahovala hodnoty slepých vzorků odrážejících celý pracovní postup. Horní část pracovního rozsahu obvykle představuje hodnota EC70 (70 % maximální účinné koncentrace), je však nižší, pokud je CV v tomto rozpětí vyšší než 15 %. Pracovní rozsah se stanoví během validace. Mezní hodnoty (viz bod 7.3) musí být uvnitř pracovního rozsahu.

—

Standardní roztoky a extrakty vzorku se zkouší třikrát nebo alespoň duplicitně. Při duplicitních zkouškách musí standardní roztok nebo kontrolní extrakt zkoušený ve 4–6 jamkách rozložených na destičce poskytnout odezvu nebo koncentraci (možné pouze v pracovním rozsahu) vycházející z CV < 15 %.

—

Za účelem výpočtu úrovně BEQ v extraktu a následně ve vzorku lze úroveň ve vzorcích odhadnout srovnáním jejich odezvy s odezvou kalibrační křivky TCDD (nebo PCB 126 nebo standardní směsi PCDD/PCDF/PCB s dioxinovým efektem).

—

Kalibrační křivky musí obsahovat 8 až 12 koncentrací (alespoň duplicitních), s dostatečným počtem koncentrací ve spodní části křivky (pracovním rozsahu). Zvláštní pozornost musí být věnována kvalitě proložení kalibračních bodů křivkou v pracovním rozsahu. Hodnota R2 sama o sobě má pouze zanedbatelný nebo žádný význam při hodnocení kvality proložení kalibračních bodů křivkou při nelineární regresi. Lepšího proložení se dosáhne minimalizací rozdílu mezi vypočtenými a zjištěnými úrovněmi v pracovním rozsahu křivky (např. minimalizací sumy druhých mocnin reziduí).

—

Od odhadované úrovně v extraktu vzorku se následně odečte úroveň BEQ vypočtená pro slepý vzorek matrice nebo rozpouštědla (aby se zohlednily nečistoty z použitých rozpouštědel a chemikálií) a provede se korekce na zjevnou výtěžnost (vypočtenou na základě úrovně BEQ vhodných referenčních vzorků s reprezentativním zastoupením kongenerů kolem maximálního nebo akčního limitu). Pro provedení korekce na výtěžnost musí být zjevná výtěžnost vždy v požadovaném rozmezí (viz bod 7.1.4). Referenční vzorky použité pro korekci na výtěžnost musí splňovat požadavky uvedené v bodě 7.2.

—

Referenční vzorky musí představovat matrice vzorku, zastoupení kongenerů a rozpětí koncentrací pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem kolem maximálního nebo akčního limitu.

—

Každá série zkoušek musí zahrnovat slepý vzorek odrážející celý pracovní postup, či nejlépe slepý matriční vzorek, a referenční vzorek maximálního nebo akčního limitu. Tyto vzorky musí být extrahovány a zkoušeny současně a za stejných podmínek. Referenční vzorek musí vykázat jasně vyšší odezvu v porovnání s odezvou slepého vzorku, čímž je zajištěna vhodnost zkoušky. Tyto vzorky mohou být použity pro korekci o hodnoty slepého stanovení a korekci na výtěžnost.

—

Referenční vzorky vybrané pro provedení korekce na výtěžnost musí být reprezentativní pro zkušební vzorky, což znamená, že zastoupení kongenerů nesmí vést k podhodnocení úrovní.

—

Pro prokázání odpovídající výkonnosti zkoušky ve sledovaném rozsahu pro kontrolu maximálního nebo akčního limitu lze kromě toho zahrnout ještě referenční vzorky o např. poloviční a dvojnásobné koncentraci, než je maximální nebo akční limit. Dohromady mohou být tyto vzorky použity pro výpočet úrovní BEQ ve zkušebních vzorcích (viz bod 7.1.2.2).

BEQDL

je BEQ odpovídající rozhodovací mezi u konfirmační metody, což je maximální limit včetně rozšířené nejistoty měření

sy,x

je reziduální směrodatná odchylka

t α,f = m – 2

je kvantil Studentova t-rozdělení (α = 5 %, f = stupně volnosti, jednostranný)

m

je celkový počet kalibračních bodů (index j)

n

je počet opakování na každé úrovni

xi

je koncentrace vzorku (v TEQ) v kalibračním bodě i stanovená konfirmační metodou

je průměr koncentrací (v TEQ) všech kalibračních vzorků

i

=

index pro kalibrační bod i

SDR

je směrodatná odchylka výsledků biologické zkoušky na BEQDL, měřeno za podmínek vnitrolaboratorní reprodukovatelnosti.

1.

Z nižší části 95 % predikčního intervalu na úrovni rozhodovací meze konfirmační metody;

2.

z vícenásobné analýzy vzorků (n ≥ 6) kontaminovaných na úrovni rozhodovací meze konfirmační metody jakožto nižší část distribuce údajů (v grafu je znázorňuje křivka ve tvaru zvonu) na odpovídající průměrné hodnotě BEQ.

—

Vzhledem k tomu, že při bioanalytických metodách nelze použít žádné vnitřní standardy, provedou se zkoušky opakovatelnosti pro získání informací o směrodatné odchylce v rámci zkoušek a mezi sériemi zkoušek. Opakovatelnost musí být nižší než 20 %, vnitrolaboratorní reprodukovatelnost pak nižší než 25 %. To musí vycházet z vypočtených úrovní v BEQ po odečtení hodnot slepého stanovení a korekci na výtěžnost.

—

Jako součást postupu validace musí být prokázáno, že zkouška umožňuje rozlišit slepý vzorek a úroveň ve výši mezní hodnoty, a umožňuje tak identifikovat vzorky nad příslušnou mezní hodnotou (viz bod 7.1.2).

—

Je třeba určit cílové sloučeniny, možné interference a nejvyšší přípustný obsah ve slepém vzorku.

—

Procentní směrodatná odchylka odezvy nebo koncentrace vypočtená z odezvy (možné pouze v pracovním rozsahu) trojnásobného stanovení extraktu vzorku nesmí být vyšší než 15 %.

—

Pro hodnocení výkonnosti bioanalytické metody v daném časovém období se použijí nekorigované výsledky referenčního vzorku (referenčních vzorků) vyjádřené v BEQ (pro slepý vzorek a maximální nebo akční limit).

—

Pro slepé vzorky odrážející celý pracovní postup a pro každý typ referenčního vzorku se zaznamenávají a ověřují grafy kontroly kvality, aby bylo zajištěno, že analytická výkonnost je v souladu s příslušnými požadavky, u slepých vzorků odrážejících celý pracovní postup zejména s ohledem na požadovanou minimální odlišnost v nejnižší části pracovního rozsahu a u referenčních vzorků zejména s ohledem na vnitrolaboratorní reprodukovatelnost. Slepé vzorky odrážející celý pracovní postup musí být důkladně kontrolovány, aby se zamezilo falešně vyhovujícím výsledkům po jejich odečtení.

—

Výsledky konfirmačních metod u podezřelých vzorků a 2 až 10 % vyhovujících vzorků (minimálně 20 vzorků na jednu matrici) se zaznamenají a použijí se pro hodnocení výkonnosti screeningové metody a vztahu mezi BEQ a TEQ. Tuto databázi lze použít pro přehodnocení mezních hodnot platných pro běžné vzorky pro validované matrice.

—

Dobrou výkonnost metody lze rovněž prokázat v kruhových testech. Výsledky vzorků analyzovaných v kruhových testech, které pokrývají rozsah koncentrací až do např. dvojnásobku maximálního limitu, se rovněž mohou zahrnout do hodnocení podílu falešně vyhovujících výsledků, je-li laboratoř schopna prokázat dobrou výkonnost. Vzorky musí zahrnovat nejčastější zastoupení kongenerů, které představují různé zdroje.

—

Při incidentech lze mezní hodnoty přehodnotit, aby odrážely konkrétní matrici a zastoupení kongenerů tohoto konkrétního incidentu.

—

Analytické výsledky musí obsahovat hodnoty jednotlivých kongenerů PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem a hodnoty TEQ se vydávají jako dolní, horní a střední odhad, aby se do vydávání výsledků zahrnulo co nejvíce informací, a umožnil se tak výklad výsledků podle příslušných zvláštních požadavků.

—

Protokol musí také zahrnovat metodu použitou pro extrakci PCDD/PCDF, PCB s dioxinovým efektem a lipidů. Obsah lipidů ve vzorku musí být stanoven a vydán pro potravinové vzorky s maximálními limity vztaženými na tuk a očekávané koncentrace tuku v rozmezí 0–2 % (v souladu se stávajícími předpisy). U ostatních vzorků je stanovení obsahu lipidů nepovinné.

—

Pokud výtěžnost leží mimo rozpětí uvedené v bodě 6.2, je-li překročen maximální limit (v tomto případě výtěžnosti pro jednu ze dvou opakovaných analýz) nebo v ostatních případech na žádost musí být dány k dispozici hodnoty výtěžnosti pro jednotlivé vnitřní standardy.

—

Protože se má při rozhodování o souladu vzorku přihlédnout také k rozšířené nejistotě měření, je třeba poskytnout také tento parametr. Analytické výsledky se proto vydají ve tvaru „x +/– U“, kde x je výsledek analýzy a U je rozšířená nejistota měření, přičemž se použije faktor pokrytí 2, který odpovídá míře spolehlivosti přibližně 95 %. V případě samostatného stanovení PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem se pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem musí použít suma odhadované rozšířené nejistoty měření samostatných výsledků analýzy pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem.

—

Výsledky se vyjádří ve stejných jednotkách a stejným počtem platných číslic jako maximální limity stanovené v nařízení (ES) č. 1881/2006.

—

Výsledek screeningu se vyjádří jako vyhovující nebo podezřelý jako nevyhovující („podezřelý“).

—

Kromě toho je možné vydat orientační výsledek pro PCDD/PCDF a/nebo PCB s dioxinovým efektem vyjádřený v BEQ (nikoli TEQ) (viz bod 1). Vzorky s odezvou nižší než oznamovací mez musí být vyjádřeny jako nižší než oznamovací mez. Vzorky s odezvou vyšší než pracovní rozsah se vydávají jako vzorky překračující pracovní rozsah a úroveň odpovídající horní části pracovního rozsahu se uvede v BEQ.

—

Pro každý typ matrice vzorku musí protokol uvádět maximální nebo akční limit, z něhož hodnocení vychází.

—

Protokol musí uvádět použitý typ zkoušky, základní principy zkoušky a druh kalibrace.

—

Protokol musí také zahrnovat metodu použitou pro extrakci PCDD/PCDF, PCB s dioxinovým efektem a lipidů. Obsah lipidů ve vzorku musí být stanoven a vydán pro potravinové vzorky s maximálními limity vztaženými na tuk a očekávané koncentrace tuku v rozmezí 0–2 % (v souladu se stávajícími předpisy). U ostatních vzorků je stanovení obsahu lipidů nepovinné.

—

V případě vzorků podezřelých jako nevyhovující musí protokol obsahovat poznámku o tom, jaká opatření mají být učiněna. Koncentraci PCDD/PCDF a sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem v těchto vzorcích se zvýšeným obsahem je třeba stanovit/potvrdit konfirmační metodou.

—

Nevyhovující výsledky se vydávají pouze tehdy, pokud byly zjištěny konfirmační analýzou.

—

Výsledek screeningu se vyjádří jako vyhovující nebo podezřelý jako nevyhovující („podezřelý“).

—

Pro každý typ matrice vzorku musí protokol uvádět maximální nebo akční limit, z něhož hodnocení vychází.

—

Kromě toho mohou být hodnoty jednotlivých kongenerů PCDD/PCDF a/nebo PCB s dioxinovým efektem a hodnoty TEQ udávány jako dolní, horní a střední odhad. Výsledky se vyjádří ve stejných jednotkách a (alespoň) se stejným počtem platných číslic jako maximální limity stanovené v nařízení (ES) č. 1881/2006.

—

Pokud výtěžnost leží mimo rozpětí uvedené v bodě 6.2 a v ostatních případech na žádost musí být dány k dispozici hodnoty výtěžnosti pro jednotlivé vnitřní standardy.

—

V protokolu musí být uvedeno, která metoda GC-MS byla použita.

—

Protokol musí také zahrnovat metodu použitou pro extrakci PCDD/PCDF, PCB s dioxinovým efektem a lipidů. Obsah lipidů ve vzorku musí být stanoven a vydán pro potravinové vzorky s maximálními limity vztaženými na tuk a očekávané koncentrace tuku v rozmezí 0–2 % (v souladu se stávajícími předpisy). U ostatních vzorků je stanovení obsahu lipidů nepovinné.

—

V případě vzorků podezřelých jako nevyhovující musí protokol obsahovat poznámku o tom, jaká opatření mají být učiněna. Koncentraci PCDD/PCDF a sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem v těchto vzorcích se zvýšeným obsahem je třeba stanovit/potvrdit konfirmační metodou.

—

O nevyhovění může být rozhodnuto pouze konfirmační analýzou.

—

Relativní retenční čas ve vztahu k vnitřním standardům nebo referenčním standardům (s přijatelnou odchylkou ± 0,25 %).

—

Separace PCB bez dioxinového efektu plynovou chromatografií od interferujících látek, zejména současně se eluujících PCB, zvláště jsou-li úrovně vzorků v rozmezí limitů stanovených právními předpisy a případné nevyhovění má být teprve potvrzeno (1).

—

Techniky GC-MS:

—

Pro GC-ECD:

Konfirmace výsledků překračujících maximální limit s dvěma kolonami GC se stacionární fází jiné polarity.

—

Použití vhodných vnitřních standardů s fyzikálně-chemickými vlastnostmi porovnatelnými se sledovanými analyty.

—

Přidání vnitřních standardů:

—

Požadavky na metody s využitím všech šesti izotopicky značených kongenerů PCB bez dioxinového efektu:

—

Požadavky na metody, které nevyužívají všech šesti izotopicky značených vnitřních standardů nebo jiných vnitřních standardů:

—

Výtěžnosti neoznačených kongenerů se ověří pomocí obohacených vzorků nebo vzorků pro kontrolu kvality s koncentracemi v rozsahu maximálního limitu. Přijatelné výtěžnosti těchto kongenerů jsou mezi 60 a 120 %.

—

Analytické výsledky musí obsahovat hodnoty jednotlivých kongenerů PCB bez dioxinového efektu a sumu PCB bez dioxinového efektu uváděných jako dolní, horní a střední odhad, aby se do vydávání výsledků zahrnulo co nejvíce informací, a umožnil se tak výklad výsledků podle příslušných zvláštních požadavků.

—

Protokol musí také zahrnovat metodu použitou pro extrakci PCB a lipidů. Obsah lipidů ve vzorku musí být stanoven a uváděn pro potravinové vzorky s maximálními limity vztaženými na tuk a očekávané koncentrace tuku v rozmezí 0–2 % (v souladu se stávajícími předpisy). U ostatních vzorků je stanovení obsahu lipidů nepovinné.

—

Pokud výtěžnost leží mimo rozpětí uvedené v bodě 6, je-li překročen maximální limit nebo v ostatních případech na žádost musí být dány k dispozici hodnoty výtěžnosti pro jednotlivé vnitřní standardy.

—

Protože se má při rozhodování o vyhovění vzorku přihlédnout také k rozšířené nejistotě měření, je třeba poskytnout také tento parametr. Analytické výsledky se proto uvádějí ve tvaru „x +/– U“, kde x je výsledek analýzy a U je rozšířená nejistota měření, přičemž se použije faktor pokrytí 2, který odpovídá míře spolehlivosti přibližně 95 %.

—

Výsledky se vyjádří ve stejných jednotkách a stejným počtem platných číslic jako maximální limity stanovené v nařízení (ES) č. 1881/2006.