1991R2568 — CS — 01.01.2014 — 025.001

---

Tento dokument je třeba brát jako dokumentační nástroj a instituce nenesou jakoukoli odpovědnost za jeho obsah

►B	NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 2568/91 ze dne 11. července 1991 o charakteristikách olivového oleje a olivového oleje z pokrutin a o příslušných metodách analýzy (Úř. věst. L 248 5.9.1991, s. 1)

Ve znění:

		Úřední věstník
		No	page	date
►M1	NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 3682/91 ze dne 17. prosince 1991,	L 349	36	18.12.1991
►M2	NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 1429/92 ze dne 26. května 1992,	L 150	17	2.6.1992
M3	COMMISSION REGULATION (EEC) No 1683/92 of 29 June 1992 (*)	L 176	27	30.6.1992
M4	COMMISSION REGULATION (EEC) No 1996/92 of 15 July 1992 (*)	L 199	18	18.7.1992
►M5	NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 3288/92 ze dne 12. listopadu 1992,	L 327	28	13.11.1992
►M6	NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 183/93 ze dne 29. ledna 1993,	L 22	58	30.1.1993
M8	COMMISSION REGULATION (EEC) No 620/93 of 17 March 1993 (*)	L 66	29	18.3.1993
M9	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 177/94 ze dne 28. ledna 1994,	L 24	33	29.1.1994
M10	COMMISSION REGULATION (EC) No 2632/94 of 28 October 1994 (*)	L 280	43	29.10.1994
►M11	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 656/95 ze dne 28. března 1995,	L 69	1	29.3.1995
M12	COMMISSION REGULATION (EC) No 2527/95 of 27 October 1995 (*)	L 258	49	28.10.1995
►M13	COMMISSION REGULATION (EC) No 2472/97 of 11 December 1997 (*)	L 341	25	12.12.1997
M14	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 282/98 ze dne 3. února 1998,	L 28	5	4.2.1998
M15	COMMISSION REGULATION (EC) No 2248/98 of 19 October 1998 (*)	L 282	55	20.10.1998
M16	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 379/1999 ze dne 19. února 1999,	L 46	15	20.2.1999
►M17	COMMISSION REGULATION (EC) No 455/2001 of 6 March 2001 (*)	L 65	9	7.3.2001
M18	COMMISSION REGULATION (EC) No 2042/2001 of 18 October 2001 (*)	L 276	8	19.10.2001
►M19	COMMISSION REGULATION (EC) No 796/2002 of 6 May 2002 (*)	L 128	8	15.5.2002
►M20	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 1989/2003 ze dne 6. listopadu 2003,	L 295	57	13.11.2003
►M21	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 702/2007 ze dne 21. června 2007,	L 161	11	22.6.2007
►M22	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 640/2008 ze dne 4. července 2008,	L 178	11	5.7.2008
►M23	NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) č. 61/2011 ze dne 24. ledna 2011,	L 23	1	27.1.2011
M24	PROVÁDĚCÍ NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) č. 661/2012 ze dne 19. července 2012,	L 192	3	20.7.2012
►M25	PROVÁDĚCÍ NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) č. 299/2013 ze dne 26. března 2013,	L 90	52	28.3.2013

Opraveno:

►C1	Oprava, Úř. věst. L 048, 23.2.2011, s.  19 (61/2011)

(*)	Tento akt nebyl nikdy publikován v češtině.

---

▼B

NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 2568/91

ze dne 11. července 1991

o charakteristikách olivového oleje a olivového oleje z pokrutin a o příslušných metodách analýzy

▼M20

Článek 1

1.  Oleje s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodech 1 a 2 přílohy I tohoto nařízení, jsou považovány za panenské olivové oleje ve smyslu bodu 1 písm. a) a b) přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

2.  Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 3 přílohy I tohoto nařízení, je považován za lampantový olivový olej ve smyslu bodu 1 písm. c) přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

3.  Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 4 přílohy I tohoto nařízení, je považován za rafinovaný olivový olej ve smyslu bodu 2 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

4.  Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 5 přílohy I tohoto nařízení, je považován za olivový olej obsahující směs rafinovaného olivového oleje a panenského olivového oleje ve smyslu bodu 3 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

5.  Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 6 přílohy I tohoto nařízení, je považován za surový olivový olej z pokrutin ve smyslu bodu 4 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

6.  Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 7 přílohy I tohoto nařízení, je považován za rafinovaný olivový olej z pokrutin ve smyslu bodu 5 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

7.  Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 8 přílohy I tohoto nařízení, je považován za olivový olej z pokrutin ve smyslu bodu 6 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

▼B

Článek 2

1.  Charakteristiky olivových olejů uvedených v příloze I se stanoví v souladu s těmito metodami analýzy:

▼M19

▼B

▼M21

▼M20 —————

▼B

▼M20 —————

▼M11

▼M13

▼M19

▼M23

▼M19

2.  Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3.  When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

▼M17

4.   ►M20  Pro účely ověření podle odstavce 3 se analýzy uvedené v přílohách II, III, IX, X a XII, jakož i případné kontrolní analýzy stanovené vnitrostátními právními předpisy, provádějí před datem minimální trvanlivosti. Pokud se odběr vzorků provede více než čtyři měsíce před datem minimální trvanlivosti, analýzy se provedou nejpozději ve čtvrtém měsíci po odebrání vzorku. Pro ostatní analýzy tohoto nařízení neplatí žádné lhůty. ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5.  For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M25

Článek 2a

1.  Pro účely tohoto článku se pojmem „olivový olej uváděný na trh“ rozumí celkové množství olivového oleje a olivového oleje z pokrutin příslušného členského státu, které se v uvedeném členském státě spotřebuje nebo které se z uvedeného členského státu vyveze.

2.  Členské státy zajistí, aby kontroly shody byly prováděny selektivně, na základě analýzy rizik a s přiměřenou četností s cílem zajistit, aby olivový olej uváděný na trh byl v souladu s deklarovanou kategorií.

3.  Kritéria pro posouzení rizika mohou zahrnovat:

4.  Členské státy předem stanoví:

Ročně se provádí alespoň jedna kontrola shody na každých tisíc tun olivového oleje uváděného na trh v členském státě.

5.  Členské státy ověří dodržování shody:

▼M19 —————

▼M25

Článek 3

Pokud se zjistí, že určitý olej neodpovídá popisu kategorie, do níž patří, uloží daný členský stát, aniž jsou dotčeny jakékoli další sankce, účinné, přiměřené a odrazující sankce, jejichž výše se stanoví podle závažnosti zjištěné nesrovnalosti.

Pokud jsou při kontrolách zjištěny závažné nesrovnalosti, zvýší členské státy četnost kontrol ve vztahu k etapě uvádění na trh, kategorii oleje, původu nebo jiným kritériím.

▼M5

Článek 4

▼M19

1.  The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2.  Pokud členský stát narazí na potíže při sestavování zkušebních komisí na svém území, může povolat zkušební komisi schválenou v jiném členském státě.

3.  Každý členský stát vypracuje seznam zkušebních komisí sestavených profesionálními nebo mezioborovými organizacemi za podmínek stanovených v odstavci 1 a zajistí dodržování těchto podmínek.

▼M19 —————

▼B

Článek 6

1.  Obsah oleje u pokrutin z oliv a jiných zbytků po extrakci olivového oleje (podpoložky 2306 90 11 a 2306 90 19 ) se stanoví metodou uvedenou v příloze XV.

2.  Obsah oleje, na který odkazuje odstavec 1, se vyjadřuje v procentech hmotnosti oleje v sušině.

▼M20

Článek 7

Pokud jde o přítomnost kontaminujících látek, použijí se příslušné předpisy Společenství.

Pokud jde o halogenovaná rozpouštědla, zavádějí se pro všechny kategorie olivového oleje tyto limity:

▼M25

Článek 7a

Fyzické či právnické osoby a skupiny fyzických či právnických osob vlastnící z profesionálních či obchodních důvodů olivový olej a olivový olej z pokrutin od extrakce v lisovně až po fázi plnění, musí pro každou z kategorií těchto olejů vést evidenci vstupů a výstupů.

Členský stát zajistí, aby byla povinnost stanovená v prvním odstavci řádně dodržována.

▼M25

Článek 8

1.  Členské státy sdělí Komisi opatření přijatá k provádění tohoto nařízení. Rovněž Komisi uvědomí o veškerých následných změnách.

▼B

2.  Členské státy předají Komisi na začátku každého pololetí souhrn analytických údajů, které se vztahují ke zkouškám provedeným během předchozího pololetí.

Výsledky budou přezkoumány Řídícím výborem pro oleje a tuky postupem podle článku 39 nařízení č. 136/66/EHS.

▼M25

3.  Oznámení uvedená v tomto nařízení se provádějí v souladu s nařízením Komise (ES) č. 792/2009 ( 5 ).

▼B

Článek 9

Nařízení (EHS) č. 1058/77 se zrušuje.

Článek 10

1.  Toto nařízení vstupuje v platnost třetím dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropských společenství.

Metoda uvedená v příloze XII se však použije ode dne ►M1  1. listopadu 1992 ◄ , s výjimkou případů, kdy se jedná o intervenční opatření.

▼M5

Tato metoda se nepoužije u panenského olivového oleje stočeného před 1. listopadem 1992.

▼B

2.  Toto nařízení se nepoužije na olivový olej a olivový olej z pokrutin stočený do obalů před vstupem tohoto nařízení v platnost a uvedený na trh do 31. října 1992.

Toto nařízení je závazné v celém rozsahu a přímo použitelné ve všech členských státech.

---

PŘÍLOHA

Obsah

▼M23

---

PŘÍLOHA I

CHARAKTERISTIKY OLIVOVÉHO OLEJE

▼M20

---

PŘÍLOHA I A

ODBĚR VZORKŮ ZE ŠARŽÍ OLIVOVÉHO OLEJE NEBO OLIVOVÉHO OLEJE Z POKRUTIN VE SPOTŘEBITELSKÝCH OBALECH O OBJEMU NEJVÝŠE 100 LITRŮ

Tato metoda odběru vzorků se týká dodávek olivového oleje nebo olivového oleje z pokrutin nepřesahujících 125 000 litrů, stočených do spotřebitelských obalů o objemu nejvýše 100 litrů.

Pokud daná dodávka obsahuje více než 125 000 litrů, rozdělí se na přibližně stejně velké šarže o objemu nejvýše 125 000 litrů. Pokud dodávka obsahuje méně než 125 000 litrů, pak představuje jednu šarži. Metoda se pak použije u každé šarže.

Minimální počet odebraných dílčích vzorků závisí na velikosti šarže podle tabulky uvedené v bodu 1.

Velikost dílčího vzorku se určuje na základě objemu spotřebitelského obalu podle tabulky uvedené v bodu 2.1.

Dodávkou, dílčím vzorkem a laboratorním vzorkem se rozumějí definice uvedené v normě EN ISO 5555.

„Šarže“ se skládá z více prodejních jednotek, které jsou produkovány, vyrobeny a baleny za takových okolností, že olej obsažený v každé prodejní jednotce se považuje za homogenní vzhledem ke všem svým analytickým charakteristikám.

1.   POČET DÍLČÍCH VZORKŮ, KTERÉ JE NUTNO ODEBRAT

Minimální počet odebraných dílčích vzorků závisí na velikosti šarže a odpovídá dále uvedené tabulce:

Spotřebitelské obaly daného dílčího vzorku musí pocházet s navzájem sousedících míst šarže.

V případě pochybností členské státy zvýší počet odebraných dílčích vzorků.

2.   OBSAH DÍLČÍCH VZORKŮ

2.1

Každý dílčí vzorek se skládá: V případě spotřebitelských obalů o objemu: Dílčí vzorek musí obsahovat olej: a)  nejméně 5 litrů a)  ze 3 spotřebitelských obalů b)  nejméně 3 litrů, ale méně než 5 litrů b)  ze 3 spotřebitelských obalů c)  nejméně 2 litrů, ale méně než 3 litry c)  ze 3 spotřebitelských obalů d)  nejméně 1 litru, ale méně než 2 litrů d)  z 6 spotřebitelských obalů e)  nejméně 0,75 litru, ale méně než 1 litr e)  z 6 spotřebitelských obalů f)  méně než 0,75 litru f)  z trojnásobného množství oleje z minimálního počtu obalů, jejichž celkový objem je větší než 1,5 litru

2.2	Dílčí vzorky musí být uchovány ve spotřebitelských obalech až do doby provedení analýzy. Olej z dílčích vzorků se pak rozdělí do tří laboratorních vzorků pro provedení: a) analýz uvedených v přílohách II, III, IX a X; b) analýz uvedených v příloze XII; c) ostatních analýz.

2.3	Obaly tvořící dílčí vzorek musí být rozděleny v souladu s kontrolními postupy, stanovenými vnitrostátními právními předpisy.

3.   ANALÝZY A VÝSLEDKY

▼M20

---

PŘÍLOHA I B

ROZHODOVACÍ SCHÉMA PRO OVĚŘENÍ SOULADU VZORKU OLIVOVÉHO OLEJE S DEKLAROVANOU KATEGORIÍ

Soulad olivového oleje nebo olivového oleje z pokrutin je možné přezkoušet takto:

Nezávisle na tom se provádějí analýzy nutné pro ověření souladu s normami Společenství, pokud jde o případné kontaminující látky.

Rozhodovací schéma platí pro všechny kategorie olivového oleje a olivového oleje z pokrutin. Skládá se z tabulek, očíslovaných 1 až 11, které se použijí na základě deklarované kategorie daného oleje v pořadí, stanoveném ve všeobecné tabulce.

Klíč k všeobecné tabulce a k tabulkám 1 až 11:

---

DODATEK 1

Srovnávací tabulka mezi prílohami tohoto narízení a analýzami uvedenými v rozhodovacím schématu

---

DODATEK 2

Tabulka 1

Tabulka 2

Tabulka 3

Tabulka 4

Tabulka 7

Tabulka 8

Tabulka 11

▼B

---

PŘÍLOHA II

▼M21

STANOVENÍ VOLNÝCH MASTNÝCH KYSELIN, METODA ZA STUDENA

▼B

1.   STANOVENÍ KYSELOSTI

Stanovení volných mastných kyselin v olivových olejích. Obsah volných mastných kyselin je vyjádřen jako kyselost vypočtená obvyklým způsobem.

1.1.   Podstata metody

Vzorek se rozpustí ve směsi rozpouštědel. Přítomné volné mastné kyseliny se potom titrují ethanolickým roztokem hydroxidu draselného.

1.2.   Chemikálie

Všechna činidla musí mít čistotu p. a., voda destilovaná nebo odpovídající čistoty.

1.2.1

Směs diethyletheru a 95 % ethanolu 1:1 (V/V). Poznámka: diethylether je vysoce hořlavý a může vytvářet výbušné peroxidy. Při jeho používání je třeba dbát zvýšené opatrnosti. Neutralizuje se těsně před použitím pomocí roztoku hydroxidu draselného (1.2.2) a přidá se 0,3 ml fenolftaleinového roztoku (1.2.3) na 100 ml směsi. Poznámka: není-li možné použít diethylether, může se použít směsné rozpouštědlo obsahující ethanol a toluen. V případě potřeby může být ethanol nahrazen 2-propanolem.

1.2.2

Hydroxid draselný, titrační ethanolický roztok o koncentraci c(KOH) přibližně 0,1 mol/l, nebo v případě potřeby přibližně 0,5 mol/l. Přesná koncentrace ethanolického roztoku hydroxidu draselného musí být známa a zkontrolována těsně před použitím. Použije se roztok připravený nejméně pět dnů před použitím a dekantovaný v láhvi z hnědého skla s gumovou zátkou. Roztok musí být bezbarvý nebo pouze slabě zbarvený. Poznámka: stabilní bezbarvý roztok hydroxidu draselného je možné připravit takto: do varu se uvede 1 000 ml ethanolu s 8 g hydroxidu draselného a 0,5 g hliníkových hoblin a nechá se jednu hodinu vařit pod zpětným chladičem. Okamžitě se destiluje. V destilátu se rozpustí požadované množství hydroxidu draselného. Několik dnů se nechá stát a oddělí se čistá kapalina od usazeniny uhličitanu draselného. Tento roztok je též možné připravit bez destilace takto: do 1 000 ml ethanolu se přidá 4 ml aluminium-butylátu a směs se nechá několik dní stát. Odsazená kapalina se slije a v ní se rozpustí požadované množství hydroxidu draselného. Roztok je připraven k použití.

1.2.3

Fenolftalein, roztok o koncentraci 10 g/l, v 95 % - 96 % ethanolu (V/V), nebo alkalická modř (v případě silně zbarvených tuků), roztok o koncentraci 20 g/l, v 95 % - 96 % ethanolu (V/V).

1.3   Přístroje a pomůcky

Obvyklé laboratorní přístroje a pomůcky, mj.:

1.3.1

analytické váhy,

1.3.2

Erlenmeyerova baňka na 250 ml,

1.3.3

byreta na 10 ml s hodnotou dílku 0,05 ml.

1.4   Postup

1.4.1

Příprava vzorku na testování (Testování se provádí s filtrovaným vzorkem. Pokud celkový obsah vody a nečistot činí méně než 1 %, provede se testování s nefiltrovaným vzorkem.)

1.4.2

Odběr vzorku Hmotnost vzorku se řídí podle očekávaného obsahu volných mastných kyselin (podle údajů v dále uvedené tabulce). Očekávaný obsah volných mastných kyselin Hmotnost vzorku (g) Přesnost vážení na (g) < 1 20 0,05 1 až 4 10 0,02 4 až 15 2,5 0,01 15 až 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Vzorek se naváží v Erlenmeyerově baňce (1.3.2).

1.4.3

Stanovení Vzorek (1.4.2) se rozpustí v 50 až 150 ml předem neutralizované směsi diethyletheru a ethanolu (1.2.1). Titruje se za současného míchání roztokem hydroxidu draselného o koncentraci přibližně 0,1 mol/l (1.2.2) (viz poznámka 2), dokud nedojde k barevné změně indikátoru (růžová zbarvení fenolftaleinu musí trvat nejméně 10 sekund). Poznámky: 1. Pokud přidané množství vody nevyvolá rozložení fází, lze titrační ethanolický roztok hydroxidu draselného (1.2.2) nahradit vodným roztokem hydroxidu draselného nebo sodného. Poznámky: 2. Pokud je k titraci potřeba více než 10 ml roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 0,1 mol/l, je nutno použít roztok o koncentraci 0,5 mol/l. Poznámky: 3. Pokud se během titrace roztok zakalí, je nutno přidat dostačující množství rozpouštědel (1.2.1), aby roztok byl opět čirý.

1.5   Výpočet obsahu volných mastných kyselin vyjádřených jako procento kyseliny olejové

Obsah volných mastných kyselin v % hmotnostních se vypočítá podle vzorce:

kde

V

=

spotřeba titračního roztoku hydroxidu draselného v ml;

c

=

přesná koncentrace roztoku hydroxidu draselného v mol/l;

M

=

molární hmotnost v g na mol kyseliny použité pro výpočet (= 282);

m

=

hmotnost vzorku v g.

Za výsledek se považuje aritmetický průměr ►M6  ze dvou stanovení ◄ .

---

PŘÍLOHA III

STANOVENÍ PEROXIDOVÉHO ČÍSLA

1.   PŘEDMĚT

tato metoda popisuje postup stanovení peroxidového čísla v olejích a tucích.

2.   OBLAST POUŽITÍ

tato metoda platí pro živočišné a rostlinné oleje a tuky.

3.   DEFINICE

Peroxidové číslo je množství těchto látek ve vzorku, vyjádřené v milimolech aktivního kyslíku na kg, které oxidují jodid draselný za popsaných pracovních podmínek.

4.   PODSTATA

Reakce vzorku s jodidem draselným v roztoku kyseliny octové a chloroformu. Titrace uvolněného jodu standardizovaným roztokem thiosíranu sodného.

5.   PŘÍSTROJE

Všechna zařízení musí být zbavena redukčních a oxidačních látek.

Poznámka: zábrusy nesmí být mazány tukem.

5.1	Skleněná váženka na 3 ml.

5.2	Baňky na 250 ml se zábrusy, předem vysušené a naplněné čistým, suchým inertním plynem (dusík, nebo lépe oxid uhličitý).

5.3	Byreta na 25 nebo 50 ml, s hodnotou dílku 0,1 ml.

6.   CHEMIKÁLIE

6.1	Chloroform čistoty p. a., zbavený kyslíku probubláváním proudem suchého inertního plynu.

6.2	Ledová kyselina octová čistoty p. a., zbavená kyslíku probubláváním proudem suchého inertního plynu.

6.3	Jodid draselný, nasycený vodný roztok, čerstvě připravený, zbavený jodu a jodičnanů.

6.4	Thiosíran sodný, vodný roztok o koncentraci přesně 0,01 nebo 0,002 mol/l, připravený těsně před použitím.

6.5	Škrobový roztok, vodní disperze 10 g/l, čerstvě připravený z přírodního rozpustného škrobu.

7.   VZOREK

Vzorek je nutno odebrat a skladovat v temnu a chladu ve zcela naplněném skleněném obalu, hermeticky uzavřeném zabroušenou skleněnou, nebo korkovou zátkou.

8.   POSTUP

Stanovení musí být prováděno v rozptýleném denním světle, nebo při umělém osvětlení. Vzorek se naváží ve skleněné vážence (5.1) nebo v baňce (5.2) s přesností na 0,001 g s ohledem na očekávaná peroxidové čísla podle dále uvedené tabulky:

Z baňky (5.2) se vyjme zátka a vloží se do ní váženka obsahující vzorek. Přidá se 10 ml chloroformu (6.1). Vzorek se rychle rozpustí zamícháním. Přidá se 15 ml kyseliny octové (6.2) a potom 1 ml roztoku jodidu draselného (6.3). Baňka se ihned uzavře, 1 minutu protřepává a nechá se stát přesně 5 minut v temnu při teplotě 15 °C a 25 °C.

Přidá se přibližně 75 ml destilované vody. Uvolněný jod se po přídavku škrobového roztoku (6.5) jako indikátoru za silného protřepávání titruje roztokem thiosíranu sodného (6.4) při použití koncentrace 0,002 mol/l roztoku pro předpokládané peroxidové číslo do 12, nebo roztokem o koncentraci 0,01 mol/l pro předpokládané peroxidové číslo větší než 12.

Z jednoho analytického vzorku se provedou dvě stanovení.

Spolu s vlastním stanovením se provádí slepý pokus. Jestliže výsledky slepého pokusu přesáhnou 0,05 ml roztoku thiosíranu sodného o koncentraci 0,01 mol/l (6.4), je nutno vyměnit znečištěná činidla.

9.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Peroxidové číslo (PV) vyjádřené v miliekvivalentech aktivního kyslíku na kg se vypočítá podle vzorce:

V

=

objem roztoku thiosíranu sodného (6.4), použitého pro stanovení, korigovaný s ohledem na slepý pokus;

T

=

přesná molarita použitého roztoku thiosíranu sodného (6.4);

m

=

hmotnost zkušebního vzorku v g.

Za výsledek se považuje aritmetický průměr dvou stanovení.

▼M21

---

PŘÍLOHA IV

STANOVENÍ OBSAHU VOSKU POMOCÍ KAPILÁRNÍ PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE

1.   PŘEDMĚT

Tato metoda popisuje postup stanovení obsahu vosku v olivových olejích. Vosky se dělí podle počtu atomů uhlíku. Tuto metodu lze použít zejména k rozlišení mezi olivovým olejem získaným lisováním a extrakcí (olivový olej z pokrutin).

2.   PODSTATA METODY

K tuku nebo oleji se přimísí vhodný vnitřní standard a poté se provádí chromatografická frakční destilace na hydratované silikagelové koloně. Získaná frakce eluovaná nejprve při testovacích podmínkách (jejíž polarita je menší než polarita triglyceridů) se přímo analyzuje pomocí kapilární plynové chromatografie.

3.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

3.1	Kónická 25ml baňka.

3.2	Skleněná chromatografická plynová kolona o vnitřním průměru 15 mm a délce 30 až 40 cm vybavená ventilem.

3.3

Plynový chromatograf vhodný pro použití s kapilární kolonou a vybavený přímým vstřikováním, obsahující: 3.3.1 Termostatickou komoru pro kolony vybavenou programátorem teploty. 3.3.2 Studené nástřikové zařízení pro přímé zavádění do kolony. 3.3.3 Plameno-ionizační detekční čidlo a konverzní zesilovač. 3.3.4 Integrátor se zapisovačem, vhodný pro provoz s konverzním zesilovačem (3.3.3), s rychlostí odezvy nižší než 1 sekundu a s nastavitelnou rychlostí posunu papíru. (Lze též použít informační systémy, které umožňují získávání dat z plynové chromatografie pomocí PC.) 3.3.5 Kapilární kolona, ze skla nebo taveného křemene, dlouhá 8 až 12 m s vnitřním průměrem 0,25 až 0,32 mm, obsahující kapalnou fázi, o jednotné tloušťce 0,10 až 0,30 μm. (Kapalné fáze SE 52 nebo SE 54 vhodné k použití v obchodu.)

3.4	Mikrostříkačka na 10 μl pro přímý vstřik do kolony opatřená tvrzenou jehlou.

3.5	Elektrický vibrátor.

3.6	Rotační odpařovač.

3.7	Muflová pec.

3.8	Analytické váhy s přesností měření ± 0,1 mg.

3.9	Běžné laboratorní skleněné nádoby.

4.   REAKČNÍ ČINIDLA

4.1	Silikagel s velikostí zrna od 60 do 200 μm. Silikagel se umístí alespoň na čtyři hodiny do pece o teplotě 500 °C. Nechá se ochladit a přidají se 2 % vody v poměru k odebranému množství silikagelu. Řádným protřepáním se směs homogenizuje. Před použitím se ponechá nejméně 12 hodin ve tmě.

4.2	n-hexan pro chromatografii.

4.3	Diethylether pro chromatografii.

4.4	n-heptan pro chromatografii.

4.5	Standardní roztok 0,1 % (m/V) laurylarachidátu v hexanu (vnitřní standard). (Lze též použít palmityl palmitát a myristyl stearát.) 4.5.1 Sudan 1 (1-fenyl-azo-2-naftol).

4.6	Nosný plyn: vodík nebo čisté helium pro plynovou chromatografii.

4.7	Pomocné plyny: — vodík, čistý pro plynovou chromatografii, — vzduch, čistý pro plynovou chromatografii.

5.   POSTUP

5.1   Příprava chromatografické kolony

Provede se suspenze 15 g silikagelu (4.1) v n-hexanu (4.2) a zavede se do kolony (3.2). Po spontánní sedimentaci se tato dokončí pomocí elektrického vibrátoru (3.5), aby byla chromatografická vrstva co nejhomogennější. Provede se perkolace 30 ml n-hexanu za účelem odstranění případných nečistot. Pomocí vah (3.8) se naváží přesně 500 mg vzorku do baňky (3.1) a přidá se vhodné množství vnitřního standardu (4.5) v závislosti na předpokládaném obsahu vosku. Např. 0,1 mg laurylu arachidátu v případě olivového oleje a 0,25 až 0,5 mg v případě olivového oleje z pokrutin. Získaný vzorek se za pomoci dvou dávek 2 ml n-hexanu (4.2) převede do chromatografické kolony.

Umožní se, aby hladina rozpouštědla poklesla tak, aby byla 1 mm nad horní úrovní absorbentu, a poté se provede perkolace 70 ml doplňkového n-hexanu za účelem odstranění n-alkanů, které jsou přirozeně přítomny. Poté se zahájí chromatografické eluování, odejme se 180 ml směsi n-hexanu/diethyletheru v poměru 99:1 při průtoku přibližně 15 kapek za 10 sekund. Eluování vzorku se musí provést při teplotě okolí 22 °C ± 4.

Poznámky:

Získaná frakce se usuší v rotačním odpařovači (3.6), až je téměř všechno rozpouštědlo odstraněno. Poslední 2 ml rozpouštědla se odstraní za pomoci slabého proudu dusíku; poté se přidá 2–4 ml n-heptanu.

5.2   Analýza plynovou chromatografií

5.2.1   Přípravné práce

Kolona se spojí s plynovým chromatografem (3.3), vstupní port se připojí ke kolonovému systému (on-column system) a výstupní port k detekčnímu činidlu. Poté se plynový chromatograf překontroluje (těsnost plynových vedení, funkce detekčního činidla a záznamníku atd.).

Kapilární kolony, které mají být použity poprvé, je nutno nejprve kondicionovat. Kapilární kolonou se nechá protékat malé množství nosného plynu, poté se zapne plynový chromatograf a nechá se postupně zahřívat. Postupně se zahřívá, dokud není zhruba po 4 hodinách dosaženo teploty 350 °C. Tato teplota se udržuje nejméně dvě hodiny a poté se provede regulace pracovních podmínek (regulace průtoku plynu, zapálení plamene, připojení elektronického zapisovače (3.3.4), nastavení teploty kolonové komory, detekčního činidla atd.) a signál se nastaví na citlivost, která činí nejméně dvojnásobek nejvyšší úrovně uvažované pro provedení analýzy. Základní linie záznamu musí být rovná, bez jakýchkoli píků nebo driftů.

Záporné drifty jsou známkou nedokonalé těsnosti spojů kolony, zatímco kladné svědčí o nedostatečné kondicionaci kolony.

5.2.2   Výběr pracovních podmínek

Pracovní podmínky, které je třeba všeobecně dodržovat, jsou tyto:

Tyto podmínky mohou být upraveny podle charakteristik kolony a plynového chromatografu s cílem oddělit všechny vosky, dosáhnout dostatečného rozpuštění píků (viz obrázek) a retenčního času vnitřního standardu C32, který musí být 18 ± 3 minuty. Nejreprezentativnější pík vosku musí dosáhnout nejméně 60 % z plného rozsahu.

Parametry pro integraci píků se nastaví tak, aby došlo ke správnému vyhodnocení ploch uvažovaných píků.

Poznámka:Vzhledem k tomu, že konečná teplota je vysoká, připouští se kladný drift, který nesmí přesáhnout 10 % z plného rozsahu.

5.3   Provedení analýzy

Do mikrostříkačky na 10 μl se natáhne 1 μl roztoku; píst mikrostříkačky se povytáhne tak, aby se vyprázdnila jehla. Jehla se zavede přes septum vstřikové komory a přibližně po jedné nebo dvou sekundách se rychle nastříkne roztok; přibližně po pěti sekundách se jehla pomalu vytáhne.

Zaznamenávání je prováděno, dokud vosky nejsou zcela eluovány.

Základní linie záznamu musí vždy odpovídat požadavkům.

5.4   Identifikace píků

Identifikace jednotlivých píků se provádí podle retenčních časů a porovnáním se směsmi vosků, jejichž retenční časy jsou známé a které byly analyzovány za stejných podmínek.

Chromatogram vosků panenského olivového oleje je znázorněn na obrázku.

5.5   Kvantitativní vyhodnocení

Pomocí integrátoru se vypočítají plochy píků odpovídajících vnitřnímu standardu a alifatickým esterům C40 až C46.

Obsah vosku jednotlivých esterů vyjádřený v mg/kg tukové látky se vypočítá podle vzorce:

kde:

Ax

=

plocha píku každého esteru v milimetrech čtverečních;

As

=

plocha píku vnitřního standardu v milimetrech čtverečních;

ms

=

hmotnost přidaného vnitřního standardu v miligramech;

m

=

hmotnost vzorku použitého pro stanovení v gramech.

6.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Uvádí se souhrn obsahů jednotlivých vosků C40 až C46v mg/kg tukové látky (ppm).

Poznámka:Sloučeniny, které je třeba kvantifikovat, se stanoví vzhledem k píkům esterů s počtem uhlíků mezi C40 a C46 podle příkladu chromatogramu vosků olivového oleje uvedeného na následujícím obrázku. Pokud se ester C46 objeví dvakrát, doporučuje se pro jeho identifikaci provést analýzu frakce vosků olivového oleje z pokrutin, v níž je pík C46 snadno rozpoznatelný, jelikož jasně převažuje.

Výsledky se vyjádří s přesností na jedno desetinné místo.

Obrázek

Chromatogram vosků olivového oleje ( 6 )

Vysvětlivky:

I.S.

=

Lauryl arachidátu;

1

=

Estery diterpenu;

2 + 2′

=

Estery C40;

3 + 3′

=

Estery C42;

4 + 4′

=

Estery C44;

5

=

Estery C46;

6

=

Estery sterolů a triterpenický alkohol.

---

DODATEK

Stanovení lineární rychlosti plynu

Do plynového chromatografu nastaveného na normální pracovní podmínky se vstříkne 1 až 3 μl methanu nebo propanu. Změří se doba průchodu plynu kolonou od počátku vstřiku do okamžiku eluce píků (tM).

Lineární rychlost proudění v cm/s je dána poměrem L/tM, kde L je délka kolony v cm a (tM) je čas změřený v sekundách.

▼B

---

PŘÍLOHA V

STANOVENÍ SLOŽENÍ A OBSAHU STEROLŮ POMOCÍ KAPILÁRNÍ PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE

1.   PŘEDMĚT

Tato metoda popisuje postup stanovení obsahu a složení sterolů v tukové látce.

2.   PODSTATA METODY

Zmýdelnění tukové látky, k níž je přidán β-cholestanol jako vnitřní standard, pomocí ethanolického roztoku hydroxidu draselného a extrakce nezmýdelnitelných látek pomocí diethyletheru.

Pomocí chromatografie na bazické silikagelové desce se z nezmýdelnitelného extraktu oddělí sterolová frakce. Steroly oddělené ze silikagelu se převedou na trimethylsilylether a analyzují pomocí kapilární plynové chromatografie.

3.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

3.1	Baňka na 250 ml vybavená zpětným chladičem se zábrusem.

3.2	Dělicí nálevky na 500 ml.

3.3	Baňky na 250 ml.

3.4	Kompletní zařízení pro tenkovrstvou chromatografii se skleněnými deskami o rozměrech 20 × 20 cm.

3.5	Ultrafialová lampa s vlnovou délkou 366 nebo 254 nm.

3.6	Mikrostříkačky na 100 μl a 500 μl.

3.7	Filtrační nálevka ze sintrovaného skla pórovitou fritou G3 (pórovitost 15 až 40 μm) o průměru přibližně 2 cm a výšce přibližně 5 cm, vybavená uzávěrem pro vakuovou filtraci a s vnějším zábrusem 12/21.

3.8	Odsávací baňka na 50 ml s vnitřním zábrusem 12/21 pro použití s filtrační nálevkou (3.7).

3.9	Zkumavka na 10 ml s kónickým dnem a zátkou.

3.10

Plynový chromatograf vhodný pro použití s kapilární kolonou a opatřený dělicím systémem složeným: 3.10.1 z termostatické kolonové komory, nastavitelné na požadovanou teplotu s přesností ± 1 °C; 3.10.2 z odpařovací jednotky s termostatem (vstřikové komory) s povlakem ze silanizovaného skla, 3.10.3 z plameno-ionizačního detektoru se zesilovačem, 3.10.4 z integrátoru se zapisovačem vhodného pro provoz se zesilovačem (3.10.3), s dobou odezvy nejvýše jednu sekundu a s proměnnou rychlostí papíru.

3.11	Kapilární kolona ze skla nebo taveného křemene dlouhá 20 až 30 m, s vnitřním průměrem 0,25 až 0,32 mm, obsahující kapalnou fázi SE-52 nebo SE-54 nebo ekvivalentní, o tloušťce filmu 0,10 až 0,30 μm.

3.12	Mikrostříkačka pro plynovou chromatografii na 10 μl s tvrzenou jehlou.

4.   CHEMIKÁLIE

4.1

Hydroxid draselný ve formě ethanolického roztoku o koncentraci přibližně 2 mol/l: 130 g přibližně 85 % hydroxidu draselného se za současného chlazení rozpustí ve 200 ml destilované vody a doplní se do jednoho litru ethanolem. Tento roztok je nutno uchovávat v dobře uzavřené skleněné láhvi z tmavého skla.

4.2	Diethylether čistoty p. a.

4.3	Bezvodý síran sodný čistoty p. a.

4.4	Silikagelem potažené skleněné desky bez fluorescenčního indikátoru o tloušťce 0,25 mm (obchodně dostupné).

4.5	Hydroxid draselný ve formě ethanolického roztoku o koncentraci 0,2 mol/l: 13 g hydroxidu draselného se rozpustí ve 20 ml destilované vody a doplní se do jednoho litru ethanolem.

4.6	Benzen pro chromatografii (viz 5.2.2).

4.7	Aceton pro chromatografii (viz 5.2.2).

4.8	Hexan pro chromatografii (viz 5.2.2).

4.9	Diethylether pro chromatografii (viz 5.2.2).

4.10	Chloroform čistoty p. a.

4.11	Referenční roztok pro tenkovrstvou chromatografii: ►M6  2 % ◄ roztok cholesterolu nebo fytosterolu v chloroformu.

4.12	0,2 % ethanolický roztok 2,7-dichlor-fluoresceinu, mírně zásaditý přidáním několika kapek alkoholového roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 2 mol/l.

4.13	Bezvodý pyridin pro chromatografii.

4.14	Hexamethyl-disilazan.

4.15	Trimethyl-chlorsilan.

4.16	Referenční roztoky sterol(trimethylsilyl)etherů. Připraví se z čistých sterolů nebo ze směsí sterolů získaných z olejů, které je obsahují, těsně před použitím.

4.17	0,2 % roztok α-cholestanolu v chloroformu (m/V) (vnitřní standard).

4.18	Nosné plyny: vodík nebo helium, čisté pro plynovou chromatografii.

4.19	Pomocné plyny: vodík a vzduch, čisté pro plynovou chromatografii.

5.   POSTUP

5.1

Příprava nezmýdelnitelných látek 5.1.1 Pomocí mikrostříkačky na 500 μl se do baňky na 250 ml dá pro účely analýzy 0,2 % roztok α-cholestanolu v chloroformu (4.17), obsahující množství cholestanolu rovnající se přibližně 10 % obsahu sterolu v části vzorku, která má být odebrána za účelem analýzy. Například při analýze oleje se na 5 g vzorku přidá 500 μl 0,2 % roztoku α-cholestanolu, a 1 500 μl při analýze ►M6  ————— ◄ olivového oleje z pokrutin. V dusíku se vzorek odpaří do sucha a do stejné baňky se naváží přesně 5 g vysušeného přefiltrovaného vzorku. ►M6  Oleje ◄ obsahující větší množství cholesterolu mohou vykazovat pík s retenčním časem shodným s cholestanolem. Pokud k tomu dojde, musí být sterolová frakce analyzována jednou s vnitřním standardem, a jednou bez něj. ►M6  Namísto cholestanolu je možné použít také betulinol. ◄ 5.1.2 Přidá se 50 ml ethanolického roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 2 mol/l, připojí se zpětný chladič a zahřeje se do mírného varu na parní lázni za nepřetržitého míchání během zahřívání, dokud nedojde ke zmýdelnění (roztok se vyčeří). V zahřívání se pokračuje dalších 20 minut a poté se přes chladič přidá 50 ml destilované vody. Chladič se pak odpojí a baňka se vychladí na teplotu přibližně 30 °C. 5.1.3 Obsah baňky se kvantitativně převede do dělicí nálevky na 500ml a propláchne 2 x 25 ml destilované vody. Přidá se přibližně 80 ml diethyletheru, vše se protřepe po dobu 30 sekund a nechá se odstát (poznámka 1). Spodní vodná fáze se převede do druhé nálevky. Stejným způsobem se provedou další dvě extrakce vodné fáze vždy s použitím 60 až 70 ml diethyletheru. Poznámka 1Emulze je možné odstranit přidáním malých množství ethanolu nebo methanolu formou postřiku. 5.1.4 Diethyletherové extrakty se smíchají v dělicí nálevce a promyjí destilovanou vodou (50 ml v jedné dávce), dokud promývací voda nevykáže neutrální reakci. Odstraní se vodná fáze, etherová fáze se vysuší bezvodým síranem sodným a přefiltruje se do předem zvážené baňky na 250 ml, přičemž nálevka a filtr se promyjí malými množstvími diethyletheru, které se přidá k celkovému množství. 5.1.5 Ether se pozvolným zahříváním odpařuje, až jej zbude jen několik ml, a zbytek se vysuší v mírném vakuu nebo pod proudem dusíku. Vysušení se dokončí v sušárně při teplotě 100 °C po dobu přibližně 15 minut a zbytek po se zváží po vychlazení v exsikátoru.

5.2

Separace sterolové frakce 5.2.1 Příprava bazických desek. Silikagelové desky (4.4) se na 10 sekund zcela ponoří do ethanolického roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 2 mol/l (4.5), poté se nechají dvě hodiny sušit v digestoři a nakonec na jednu hodinu umístí do sušárny vyhřáté na 100 °C. Desky se vyjmou ze sušárny a až do okamžiku použití uloží do exsikátoru s chloridem vápenatým. Takto upravené desky musí být použity během 15 dnů. Poznámka 2 Jsou-li pro separaci alkoholové frakce použity bazické silikagelové desky, není nutné upravovat nezmýdelnitelné látky pomocí AlO (oxidu hlinitého). Dojde tak k zadržení všech kyselých sloučenin (mastných kyselin apod.) na počátku, a tím se zřetelně oddělí pásmo sterolů od pásma alifatických a triterpenických alkoholů. 5.2.2 Vyvíjecí komora se naplní roztokem benzenu a acetonu v poměru 95: 5 (V/V) do výšky přibližně 1 cm. Jinak je možné použít směs hexanu a diethyletheru 65:35 (V/V). Vyvíjecí komora se uzavře a nejméně půl hodiny ponechá v klidu, aby se mohla vytvořit rovnováha mezi parami a kapalinou. Na vnitřní povrch vyvíjecí komory je možné připojit proužky filtračního papíru namočené v eluční směsi za účelem zkrácení doby vyvolávání přibližně o jednu třetinu a dosílení stejnoměrnější, pravidelní eluce složek. Poznámka 3 Vyvíjecí roztok musí být pro každou analýzu vyměněn, aby bylo dosaženo reprodukovatelných podmínek vyvíjení. 5.2.3 Připraví se 5 % roztok nezmýdelnitelných látek (5.1.5) v chloroformu a 300 μl tohoto roztoku se pomocí mikrostříkačky na 100 μl nastříkne jako co nejrovnoměrnější a co nejtenčí pruh na tenkovrstvou desku přibližně 2 cm od dolního okraje desky. Ve stejné úrovni se nanese 2 až 3 μl referenčního roztoku sterolů (4.11) za účelem stanovení sterolového pásma po dokončení vyvíjení. 5.2.4 Deska se umístí do vyvíjecí komory uvedené v odstavci 5.2.2. Teplota se udržuje mezi 15 a 20 °C. Vyvíjecí komora se okamžitě uzavře a vzorek se nechá eluovat, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne přibližně 1 cm od horního okraje desky. Deska se poté vyjme z vyvíjecí komory a rozpouštědlo se nechá odpařit pod proudem horkého vzduchu nebo se deska na chvíli nechá v digestoři. 5.2.5 Deska se lehce a rovnoměrně postříká roztokem 2,7-dichlor-fluoresceinu a pozoruje se pod ultrafialovým zářením. Sterolové pásmo se stanoví porovnáním skvrn vytvořených referenčním roztokem. Obrysy pásma podél okrajů fluorescence se vyznačí černým značkovačem. 5.2.6 Silikagel se z označené oblasti seškrábe pomocí kovové špachtle. Odebraná hmota se rozmělní na malé části a převede do filtrační nálevky (3.7). Přidá se 10 ml horkého chloroformu. Obsah se důkladně promíchá kovovou stěrkou a vakuově přefiltruje. Filtrát se shromáždí v baňce, připojené na filtrační nálevku. Zbytek v nálevce se propláchne 3 × 10 ml diethyletheru. Filtrát se přitom sbírá do stejné baňky připojené k nálevce. Filtrát se odpaří na objem přibližně 4 až 5 ml a zbytkový roztok se převede do předem zvážené zkumavky na 10 ml (3.9). Zkumavka se vysuší lampou pod mírným proudem dusíku. Zbytek se znovu rozpustí několika kapkami acetonu, opět vysuší a na deset minut vloží do sušárny vyhřáté na 105 °C, vyjme, vychladí v exsikátoru a zváží. Zbytek ve zkumavce je tvořen sterolovou frakcí.

5.3

Příprava trimethylsilyletherů 5.3.1 Do zkumavky obsahující sterolovou frakci se přidá činidlo pro silylaci tvořené směsí pyridinu, hexamethyl-disilazanu a trimethyl-chlorsilanu v poměru 9:3:1 (V/V/V) (poznámka 4) v množství 50 μl na každý mg sterolů. Přitom je nutné zabránit jakékoli absorpci vlhkosti (poznámka 5). Poznámka 4 Roztoky připravené k použití jsou obchodně dostupné: silanizační činidla, jako například N, O-bis-(trimethylsilyl)trifluoracetamid + 1 % trimethyl-chlor-silan pro smíchání se stejným objemem bezvodého pyridinu. 5.3.2 Zkumavka se uzavře a pečlivě protřepe bez převracení, dokud se steroly nerozpustí. Poté se nechá v klidu nejméně 15 minut při laboratorní teplotě a potom několik minut odstřeďuje. Čirý roztok je připraven pro plynovou chromatografickou analýzu. Poznámka 5 Vznik slabé opalescence je normální a není nijak rušivý. Tvorba bílých vloček nebo existence růžového zabarvení jsou známkami přítomné vlhkosti nebo degradace činidla. V tomto případě je třeba zkoušku opakovat.

5.4

Analýza plynovou chromatografií 5.4.1 Přípravné operace a kondicionace kapilární kolony 5.4.1.1 Kapilární kolona se připojí k plynovému chromatografu tak, že začátek kolony se připojí k odpařovací jednotce, která je spojena s oddělovacím systémem. Konec kolony se připojí k detektoru. Provede se kompletní kontrola plynového chromatografu (těsnost plynových spojovacích prvků, účinnost detektoru, účinnost oddělovacího a zapisovacího systému atd.). 5.4.1.2 Kapilární kolony, které mají být použity poprvé, je nutno nejprve kondicionovat. Kapilární kolonou se nechá protékat malé množství nosného plynu, poté se zapne plynový chromatograf a nechá se postupně zahřívat, dokud není dosaženo teploty nejméně o 20 °C vyšší, než je laboratorní teplota (viz poznámka 6). Tato teplota se udržuje nejméně dvě hodiny a poté se systém převede do pracovních podmínek (regulace průtoku plynu, oddělování, zapálení plamene, připojení elektronického zapisovače, nastavení teploty kolonové komory, detektoru, injektoru atd.) a signál se nastaví na citlivost, která činí nejméně dvojnásobek nejvyšší úrovně uvažované pro provedení analýzy. Základní linie záznamu musí být rovná, bez jakýchkoli píků nebo driftů. Záporné drifty jsou známkou nedokonalé těsnosti spojů kolony, zatímco kladné svědčí o nedostatečné kondicionaci kolony. Poznámka 6 Teplota kondicionace musí být nejméně o 20 °C nižší než maximální teplota použitelná pro uvažovanou stacionární fázi. 5.4.2 Výběr pracovních podmínek 5.4.2.1 Všeobecné pracovní podmínky jsou tyto: — teplota kolony: 260 ± 5 °C, — teplota odpařovací jednotky: 280 °C, — teplota detektoru: 290 °C, — lineární rychlost nosného plynu: helium 20 až 35 cm/s, vodík 30 až 50 cm/s, — oddělovací poměr: 1:50 až 1:100, — citlivost přístroje: 4 až 16násobek minimálního útlumu, — citlivost záznamu: 1 až 2 mV f.s., — rychlost posunu papíru, nastavitelná na hodnoty mezi 30 až 60 cm/hod, — množství nastříknuté látky: 0,5 až 1 μl trimethylsilyletherového roztoku. Výše uvedené podmínky mohou být upraveny podle charakteristik kolony a plynového chromatografu s cílem zajistit, aby chromatogramy splňovaly tyto podmínky: — retenční čas betasitosterolu musí být 20 ± 5 minut, — pík kampesterolu musí být u olivového oleje (střední obsah 3 %) 0 ± 20 % plného rozsahu a u sojového oleje (střední obsah 20 %) 40 ± 20 % plného rozsahu; — všechny přítomné steroly musí být odděleny. Kromě separace musí být píky též zcela rozlišeny, tj. dráha záznamu píku se musí vrátit na základní linii dříve, než se zvedne do dalšího píku. Neúplné rozlišení je však tolerováno za předpokladu, že pík s relativním retenčním časem 1,02 je možné kvantifikovat pomocí kolmé úsečky. 5.4.3 Provedení analýzy 5.4.3.1 Do mikrostříkačky na 10 μl se natáhne 1 μl hexanu, poté 0,5 μl vzduchu a nakonec 0,5 až 1 μl zkušebního roztoku. Píst mikrostříkačky se povytáhne tak, aby se vyprázdnila jehla. Jehla se zavede přes septum vstřikové komory a přibližně po jedné nebo dvou sekundách se rychle vstříkne roztok. Přibližně po pěti sekundách se jehla pomalu vytáhne. 5.4.3.2 Zaznamenávání je prováděno, dokud přítomná trimethylsilyletherová směs sterolů není zcela eluována. Základní linie záznamu musí vždy odpovídat požadavkům odstavce 5.4.1.2. 5.4.4 Identifikace píků Identifikace jednotlivých píků se provádí podle retenčních časů a porovnáním se standardní směsí trimethylsilyletherů analyzovanou za stejných podmínek. Steroly jsou eluovány v tomto pořadí: cholesterol, brassikasterol, 24-methyl-en-cholesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, delta-7-kampesterol, delta-5, 23-stigmastadienol, chlerosterol, betasitosterol, sitostanol, delta-5-avenasterol, delta-5, 24-stigmastadienol, delta-7-stigmastenol a delta-7-avenasterol. Retenční časy sitosterolu v případě kolon SE-52 a SE-54 jsou uvedeny v tabulce 1. Chromatogram typický pro některé oleje je vidět na obrázku 1 a 2. 5.4.5 Kvantitativní vyhodnocení 5.4.5.1 Pomocí integrátoru se vypočítá plocha píků α-cholestanolu a sterolů. Píky jakýchkoli sloučenin, které nejsou mezi sloučeninami uvedenými v tabulce 1. Koeficient odezvy β-cholestanolu musí být roven 1. 5.4.5.2 Obsah jednotlivých sterolů vyjádřený v mg/100 g tuku se vypočítá podle vzorce: kde Ax = plocha píku sterolu x ►M6  ————— ◄ , As = plocha β-cholestanolu ►M6  ————— ◄ , ms = množství přidaného β-cholestanolu v mg,, m = množství vzorku použitého pro stanovení v g.

6.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

6.1	Uvádí se obsah jednotlivých sterolů v mg/100 g tuku a souhrn „obsah sterolů celkem“.

6.2	Procentní podíl jednotlivých sterolů z poměru plochy příslušného píku k celkové ploše píků sterolůse vypočítá podle vzorce: kde Ax = plocha píku sterolu x, ΣA = celková plocha píků sterolů.

---

DODATEK

Stanovení lineární rychlosti plynu

Do plynového chromatografu nastaveného na normální pracovní podmínky se vstříkne 1 až 3 μl methanu nebo propanu a pomocí stopek se změří doba průchodu plynu kolonou od počátku vstřiku do okamžiku eluce píků (tM).

Lineární rychlost proudění v cm/s je dána poměrem L/tM, kde L je délka kolony v cm a (tM) je čas v sekundách, změřený stopkami.

Obrázek 1 Plynový chromatogram sterolové frakce surového olivového oleje

Obrázek 2 Plynový chromatogram sterolové frakce rafinovaného olivového oleje

---

PŘÍLOHA VI

STANOVENÍ ERYTHRODIOLU A UVAOLU

ÚVOD

Erythrodiol (obvykle chápaní jako úhrn glykolů erythrodiol a uvaolu) je složkou nezmýdelnitelného podílu, charakteristického pro některé typy tukových látek. V olivovém oleji extrahovaném pomocí rozpouštědel se nachází ve významně vyšších koncentracích než v ostatních olejích, jako například lisovaném olivovém oleji a v hroznovém oleji, které erythrodiol také obsahují, a tak jeho přítomnost může prokázat existenci olivového oleje extrahovaného pomocí rozpouštědel.

1.   PŘEDMĚT

Tato metoda popisuje postup stanovení přítomnosti erythrodiolu v tukové látce.

2.   PODSTATA METODY

Zmýdelnění tukové látky pomocí ethanolického roztoku hydroxidu draselného. Extrakce nezmýdelnitelných látek pomocí diethyletheru. Vyčištění průchodem kolonou s oxidem hlinitým.

Nezmýdelnitelné látky se podrobují tenkovrstvé chromatografii na silikagelové desce, dokud nejsou oddělena pásma odpovídající sterolové a erythrodiolové frakce. Steroly a erythrodiol oddělené ze silikagelu se převedou na trimethylsilylether a analyzují pomocí kapilární plynové chromatografie.

Výsledek je vyjádřen jako procentní podíl erythrodiolu ve směsi erythrodiolu a sterolů.

3.   PŘÍSTROJE APOMŮCKY

3.1	Přístroje a pomůcky uvedené v příloze V (Stanovení obsahu a složení sterolů).

4.   CHEMIKÁLIE

4.1	Chemikálie uvedené v příloze V (Stanovení obsahu a složení sterolů).

4.2	Referenční 0,5 % roztok erythrodiolu v chloroformu.

5.   POSTUP

5.1   Příprava nezmýdelnitelných látek

Viz přílohu V odst. 5.1.2.

5.2   Separace erythrodiolu a sterolů

5.2.1

Viz přílohu V odst. 5.2.1.

5.2.2

Viz přílohu V odst. 5.2.2.

5.2.3

Připravte 5 % roztok nezmýdelnitelných látek v chloroformu. 300 μl tohoto roztoku se pomocí mikrostříkačky na 0,1 ml nastříkne jako co nejrovnoměrnější a co nejtenčí pruh na tenkovrstvou desku přibližně 1,5 cm od dolního okraje desky Na jeden konec desky se nanese několik mikrolitrů roztoků cholesterolu a erythrodiolu, které budou sloužit jako referenční látka.

5.2.4

Deska se umístí do vyvíjecí komory uvedené v odstavci 5.2.1. Teplota se udržuje kolem 20 °C. Vyvíjecí komora se okamžitě uzavře a vzorek se nechá eluovat, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne přibližně 1 cm od horního okraje desky. Deska se poté vyjme z vyvíjecí komory a rozpouštědlo se nechá odpařit pod proudem horkého vzduchu.

5.2.5

Deska se lehce a rovnoměrně postříká alkoholovým roztokem 2,7-dichlor-fluoresceinu a pozoruje se pod ultrafialovým zářením. Erythrodiolová pásma je možno stanovit porovnáním s referenčním roztokem. Obrysy pásma podél okrajů fluorescence se vyznačí černým značkovačem.

5.2.6

Silikagel se z označené oblasti seškrábe pomocí kovové špachtle. Odebraná hmota se převede do baňky na 50 ml. Přidá se 15 ml horkého chloroformu, dobře protřepe a přefiltruje přes nálevku s diskem ze sintrovaného skla tak, aby se silikagel převedl do filtru. Třikrát se propere horkým chloroformem (vždy 10 ml) a filtrát se shromáždí v baňce na 100 ml. Filtrát se odpaří na objem přibližně 4 až 5 ml a zbytkový roztok se převede do kalibrované kónické vakuové baňky na 10 ml, vysuší pod mírným proudem dusíku a zváží.

5.3   Příprava trimethylsilyletherů

Viz odst. 5.3 přílohy V.

5.4   Analýza plynovou chromatografií

Viz popis v odstavci 5.4 předchozí metody. Pracovní podmínky plynového chromatografu při analýze musí být takové, aby umožnily provedení analýzy sterolů a separace trimethylsilyletheru od erythrodiolu a uvaolu.

Po nastříknutí vzorku je prováděno zaznamenávání, dokud přítomná směs sterolů, erythrodiolu a uvaolu není zcela eluována. Pak určete píky (relativní retenční časy vzhledem k betasitosterolu jsou u erythrodiolu přibližně 1,45 a u uvaolu 1,55) a vypočtěte obsahy ploch jako v případě sterolů.

6.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

kde

A1

=

plocha píku erythrodiolu ►M6  ————— ◄

A2

=

plocha píku uvaolu ►M6  ————— ◄

Asterolů

=

celková plocha píků sterolů ►M6  ————— ◄ .

Výsledek se vypočítá s přesností na jedno desetinné místo.

▼M21

---

PŘÍLOHA VII

STANOVENÍ PROCENTUÁLNÍHO PODÍLU 2-GLYCERIL MONOPALMITÁTU

1.   PŘEDMĚT A ROZSAH POUŽITÍ

Tato metoda popisuje analytický postup stanovení procentuálního podílu kyseliny palmitové ve 2. pozici triglyceridů hodnocením 2-glyceril monopalmitátu.

Tato metoda se použije na tekuté rostlinné oleje při teplotě okolí (20 °C).

2.   PODSTATA METODY

Po přípravě se vzorek oleje podrobí účinku pankreatické lipázy. Parciální a specifická hydrolýza v pozici 1 a 3 molekuly triglyceridu způsobuje, že monoglyceridy se objeví na 2. pozici. Procentuální podíl 2-glyceril monopalmitátu v monoglycerické frakci se stanoví po silylaci pomocí kapilární plynové chromatografie.

3.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

3.1	Kónická 25ml baňka.

3.2	Kádinky na 100, 250 a 300 ml.

3.3	Skleněná chromatografická kolona o vnitřním průměru 21–23 mm a délce 400 mm s vložkou ze sintrovaného skla a kohoutem.

3.4	Nedělené pipety na 10, 50, 100 a 200 ml.

3.5	Baňky na 100 a 250 ml.

3.6	Rotační odpařovač.

3.7	Centrifugační zkumavky s konickým dnem na 10 ml se zabroušenou skleněnou zátkou.

3.8	Odstředivka pro zkumavky o obsahu 10 a 100 ml.

3.9	Termostat umožňující udržet teplotu na 40 °C s přesností na 0,5 °C.

3.10	Dělené pipety na 1 a 2 ml.

3.11	Hypodermická stříkačka na 1 ml.

3.12	Mikrostříkačka na 100 μl.

3.13	Nálevka na 1 000 ml.

3.14	Plynový chromatograf pro kapilární kolony se studeným nástřikovým zařízením on column pro přímé zavádění vzorku do kolony a s termostatem, který je schopen udržovat žádanou teplotu s přesností na 1 °C.

3.15	Studené nástřikové zařízení on column pro přímé zavádění vzorku do kolony.

3.16	Plameno-ionizační detektor a elektrometr.

3.17	Integrátor se zapisovačem, vhodný pro elektrometr, s rychlostí odezvy nižší než 1 sekundu a s nastavitelnou rychlostí posunu papíru.

3.18	Kapilární kolona, ze skla nebo taveného křemene, dlouhá 8 až 12 m s vnitřním průměrem 0,25 až 0,32 mm, obsahující methylpolysiloxan nebo 5 %-fenyl-methylpolysiloxan, o tloušťce 0,10 až 0,30 μm, kterou je možno použít při 370 °C.

3.19	Mikrostříkačka na 10 μl pro přímý vstřik do kolony opatřená tvrzenou jehlou o délce min. 7,5 cm.

4.   CHEMIKÁLIE

4.1

Silikagel s velikostí zrna od 0,063 až po 0,200 mm (70/280 mesh), který se připraví takto: silikagel se položí do porcelánové misky, suší se v sušárně po dobu 4 hodin při teplotě 160 °C, pak se nechá ochladit v exsikátoru při pokojové teplotě. Přidá se voda o objemu shodném s 5 % váhy silikagelu takto: do 500 ml baňky se naváží 152 g silikagelu a přidá se 8 g destilované vody, baňka se zazátkuje a jemně protřepá, aby se voda rozložila rovnoměrně. Nechá se odstát na alespoň 12 hodin před použitím.

4.2	n-hexan pro chromatografii.

4.3	Isopropanol.

4.4	Isopropanol, vodný roztok 1/1 (V/V).

4.5	Pankreatická lipáza. Použitá lipáza musí mít aktivitu mezi 2,0 A 10 jednotkami lipázy na mg (v obchodě existují pankreatické lipázy s aktivitou mezi 2 a 10 jednotkami na mg enzymu).

4.6	Tlumivý roztok trihydroxy-methyl-aminomethanu: 1 M vodný roztok upravený na pH 8 (kontrola potenciometrem) přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové (1/1 V/V).

4.7	Cholát sodný (enzymatické kvality), vodný roztok o koncentraci 0,1 % (tento roztok se musí použít do 15 dnů po přípravě).

4.8	Chlorid vápenatý, vodný roztok o koncentraci 22 %.

4.9	Diethylether pro chromatografii.

4.10	Vyvíjecí rozpouštědlo: směs n-hexanu/diethyletheru (87/13) (V/V).

4.11	Hydroxid sodný, roztok o koncentraci 12 % hmotnostních.

4.12	Fenolftalein, 1 % roztok ethanolu.

4.13	Nosný plyn: vodík nebo helium, pro plynovou chromatografii.

4.14	Pomocné plyny: – vodík o minimální čistotě 99 %, bez vlhkosti a organických látek, a vzduch, pro plynovou chromatografii stejná čistota.

4.15	Silanizační činidla: směs pyridinu/hexametyldisilazanu, trimetylchlorosilanu 9/3/1 (V/V/V) (Roztoky připravené k použití jsou na trhu. Mohou se použít jiná silylační činidla, zejména bis-trimethylsilyl trifluoracetamid + 1 % trimetylchlorosilan, zředěná stejným objemem bezvodého pyridinu.)

4.16	Referenční vzorky: čisté monoglyceridy nebo směsi, které mají podobné procentuální složení jako vzorek.

5.   POSTUP

5.1   Příprava vzorku

5.1.1

Oleje, které mají volnou kyselost nižší než 3 %, nemusí být neutralizovány před chromatografií na silikagelové koloně. Oleje, které mají volnou kyselost vyšší než 3 %, musí být neutralizovány podle bodu 5.1.1.1. 5.1.1.1 Do nálevky na 1 000 ml (3.13) se vleje 50 g oleje a 200 ml n-hexanu. Přidá se 100 ml isopropanolu a množství roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 12 % (4.11) odpovídající volné kyselosti oleje, plus 5 % navíc. Jednu minutu se důkladně protřepe. Přidá se 50 ml destilované vody, znovu se protřepe a nechá se usadit. Po dělení se odstraní spodní mýdlová vrstva. Odstraní se také jakékoli mezilehlé vrstvy (sliz, nerozpustné hmoty). Hexanový roztok neutralizovaného oleje se promyje následnými dávkami 50 až 60 ml roztoku isopropanolu/vody 1/1 (V/V) (4.4), dokud růžové zabarvení fenolftaleinu nezmizí. Většina hexanu se odstraní destilací ve vakuu (např. v rotačním odpařovači) a olej se přelije do baňky na 100 ml (3.5). Olej se suší ve vakuu, dokud nebude rozpouštědlo zcela odstraněno. K tomu musí být kyselost oleje nižší než 0,5 %.

5.1.2

Do kónické 25 ml baňky (3.1) se převede olej připravený podle výše uvedeného způsobu a rozpustí se ve vyvíjecím rozpouštědle (10 ml, 4.10). Roztok se nechá odstát na alespoň 15 minut před chromatografií na silikagelové koloně. Pokud je roztok kalný, odstředí se, aby byly zabezpečeny optimální podmínky pro chromatografii. (Mohou se použít kartony silikagelu SPE na 500 mg, které jsou připraveny k použití.)

5.1.3

Příprava chromatografické kolony Do kolony se vlije (3.3) zhruba 30 ml vyvíjecího rozpouštědla (4.10) a pomocí skleněné tyčinky se do spodní části kolony zavede kousek vaty. Stlačí se, aby se odstranil vzduch. V kádince se připraví suspenze 25 g silikagelu (4.1) ve zhruba 80 ml vyvíjecího rozpouštědla a naleje se do kolony za pomoci nálevky. Ověří se, zda je celý silikagel zaveden do kolony; vymyje se vyvíjecím rozpouštědlem (4.10), otevře se kohoutek a hladina kapaliny se nechá dostoupit zhruba 2 mm nad horní úroveň silikagelu.

5.1.4

Kolonová chromatografie Do 25 ml baňky (3.1) se naváží přesně 1,0 g připraveného vzorku podle bodu 5.1. Vzorek se rozpustí v 10 ml vyvíjecího rozpouštědla (4.10). Roztok se vlije do připravené chromatografické kolony podle bodu 5.1.3. Zabrání se tomu, aby se plocha kolony hýbala. Otevře se kohoutek a roztok vzorku se nechá odkapat, než dosáhne hladiny silikagelu. Rozpustí se pomocí 150 ml vyvíjecího rozpouštědla. Průtok se upraví na 2 ml/min (tak, aby 150 ml proteklo do kolony přibližně za 60–70 minut). Do baňky na 250 ml, která byla předtím zvážena, se odebere eluát. Rozpouštědlo se ve vakuu odpaří a jeho zbylé stopy se odstraní pod proudem dusíku. Baňka se zváží a vypočítá se množství získaného extraktu. (V případě použití už hotových silikagelových patron SPE se postupuje takto: zavede se 1 ml roztoku (5.1.2) do předem připravených patron s 3 ml n-hexanu. Po perkolování roztoku se vyvíjí 4 ml n-hexanu/dietyleteru v objemovém poměru 9/1 (V/V). Eluát se odebere do 10 ml zkumavky a odpařuje se pod proudem dusíku až do vysušení. Suché reziduum se podrobí pankreatické lipáze (5.2). Základem je ověřit složení mastných kyselin před a po přechodu patronou SPE.)

5.2   Hydrolýza pankreatickou lipázou

5.2.1

Do centrifugační zkumavky se odváže 0,1 g oleje připraveného podle bodu 5.1. Přidá se 2 ml tlumivého roztoku (4.6), 0,5 ml roztoku cholátu sodného (4.7) a 0,2 ml roztoku chloridu vápenatého, přičemž po každém přidání se protřepe řádně směsí. Zkumavka se uzavře zábrusovou zátkou a umístí se do termostatu při teplotě 40 ± 0,5 °C.

5.2.2

Přidá se 20 mg lipázy, opatrně se protřepe (tak, aby se nenamočila zátka), a zkumavka se dá do termostatu přesně na 2 minuty, potom se vybere, během 1 minuty důkladně protřepává a nechá se vychladit.

5.2.3

Přidá se 1 ml dietyleteru, zazátkuje se a důkladně protřepe, potom se odstředí a pomocí mikrostříkačky se roztok etheru přenese do čisté a suché zkumavky.

5.3   Příprava silanizovaných derivátů a plynová chromatografie

5.3.1

Pomocí mikrostříkačky se 100 μl roztoku (5.2.3) zavede do 10 ml zkumavky s kónickým dnem.

5.3.2

Rozpouštědlo se odstraní pod slabým proudem dusíku, přidá se 200 μl silanizačního činidla (4.15), zkumavka se uzavře zátkou a nechá 20 minut odstát.

5.3.3

Po 20 minutách se přidá 1 až 5 ml n-hexanu (v závislosti na chromatografických podmínkách): výsledný roztok je připravený pro plynovou chromatografii.

5.4   Plynová chromatografie

Pracovní podmínky jsou tyto:

5.4.1   Identifikace píků

Identifikace jednotlivých monoglyceridů se provádí podle retenčních časů a porovnáním se standardními směsmi monoglyceridů, které byly analyzovány za stejných podmínek.

5.4.2   Kvantitativní vyhodnocení

Plocha každého píku se vypočítá pomocí elektronického integrátoru.

6.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Procentuální obsah glyceryl monopalmitátu se vypočítá na základě vztahu mezi plochou odpovídajícího píku a součtem ploch píků všech monoglyceridů (viz obrázek 2), podle vzorce:

Glycéril monopalmitate (%):

(Glycéril monopalmitate = glyceril monopalmitát)

kde:

Ax

=

plocha píku, který odpovídá glyceril monopalmitátu;

ΣA

=

součet ploch všech píků, které odpovídají monoglyceridům;

Výsledek se uvádí s přesností na jedno desetinné místo.

7.   ZPRÁVA O ANALÝZE

Zpráva o analýze musí uvádět:

Obrázek 1

Chromatogram produktů z reakce silanizace, které byly získány lipázou na rafinovaném olivovém oleji s přidáním 20 % esterifikovaného oleje (100 %)

Vysvětlivky: „acides gras libres“ = volné mastné kyseliny; „Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée“ = rafinovaný olivový olej + 20 % esterifikovaný olej; „1-2 monopalmitoléine“ = 1-2 monopalmitolein; „1-2 mono C18 insat.“ = nenasycený 1-2 mono C18; „squalene“ = squalen.

Obrázek 2

Chromatogram:

A)

neesterifikovaného olivového oleje po lipáze; po silanizaci; za těchto podmínek (kapilární kolona 8–12 m) je vosková frakce eluovaná zároveň s frakcí diglyceridu nebo krátce poté. Po lipáze by obsah triglyceridů neměl překročit 15 % Vysvětlivky: 1 = Volné mastné kyseliny 2 = Monoglyceridy 3 = Diglyceridy 4 = Triglyceridy * = 2-monopalmitin ** = Triglycerid C54

Chromatogram:

B)

esterifikovaného olivového oleje po lipáze; po silanizaci; za těchto podmínek (kapilární kolona 8–12 m) je vosková frakce eluovaná zároveň s frakcí diglyceridu nebo krátce poté. Po lipáze by obsah triglyceridů neměl překročit 15 % Vysvětlivky: 1 = Volné mastné kyseliny 2 = Monoglyceridy 3 = Diglyceridy 4 = Triglyceridy * = 2-monopalmitin ** = Triglycerid C54

8.   POZNÁMKY

PŘÍPRAVA LIPÁZY

Lipázy s dostatečnou aktivitou jsou obchodně dostupné. Je ale rovněž možné je připravit v laboratoři takto:

5 kg čerstvé vepřové slinivky břišní se vychladí na 0 °C; okolní sádlo a vazivová tkáň se oddělí a v míchadle se rozmělní, dokud nevznikne tekutá mazlavá pasta. Tato pasta se protřepe po dobu 4 až 6 hodin s 2,5 l bezvodého acetonu a poté odstředí. Zbytek se extrahuje třikrát pomocí stejného množství bezvodého acetonu, potom dvakrát pomocí směsi acetonu a diethyletheru 1:1 (V/V) a dvakrát pomocí diethyletheru.

Zbytek se po 48 hodin suší ve vakuu za účelem získání stabilního prášku, který je možné dlouho skladovat v ledničce chráněný před vlhkostí.

KONTROLA AKTIVITY LIPÁZY

Emulze olivového oleje se připraví takto:

V míchadle se po 10 minut protřepává směs složená ze 165 ml roztoku arabské gumy o koncentraci 100 g/l, 15 g drceného ledu a 20 ml předem neutralizovaného oleje.

Do 50 ml kádinky se zavede 10 ml této emulze, poté se postupně přidá 0,3 ml roztoku cholátu sodného o koncentraci 0,2 g/ml a 20 ml destilované vody.

Kádinka se vloží do termostatu udržovaného na teplotě 37 °C; vloží se elektrody pH metru a spirálovité míchadlo.

Pomocí byrety se po kapkách přidává roztok hydroxidu sodného 0,1 N, dokud hodnota pH nedosáhne 8,3.

Přidá se objem vodní suspenze lipázy (0,1 g/ml lipázy). Jakmile pH metr začne ukazovat pH 8,3, zapnou se stopky a po kapkách se přikapává roztok hydroxidu sodného takovou rychlostí, aby se udržovala hodnota pH 8,3. Zaznamená se objem spotřebovaného roztoku za minutu.

Údaje se zaznamenávají do grafového systému souřadnic tak, že osa nezávisle proměnných (x-ová osa) ponese časové údaje a na ose závisle proměnných se uvede počet mililitrů alkalického roztoku 0,1 N spotřebovaného na udržení konstantního pH. Výsledný graf musí být lineární.

Aktivita lipázy vyjádřená v lipázových jednotkách na 1 mg je pak dána tímto vzorcem:

kde:

A	je aktivita vyjádřená v jednotkách lipázy/mg;

V	je počet ml roztoku hydroxidu sodného 0,1 N za minutu (vypočítaný z grafu);

N	je molarita roztoku hydroxidu sodného;

m	je hmotnost zkušební lipázy v mg.

Jednotka lipázy je definovaná jako množství enzymu, které uvolní 10 mikro-ekvivalentů kyseliny za minutu.

▼M20 —————

▼M25

---

PŘÍLOHA IX

SPEKTROFOTOMETRICKÁ ANALÝZA V ULTRAFIALOVÉ OBLASTI SPEKTRA

ÚVOD

Spektrofotometrická analýza v ultrafialové oblasti spektra může poskytnout informace o jakosti tuku, stavu jeho zachovalosti a změnách způsobených technologickými procesy.

Absorpce při vlnových délkách specifikovaných v metodě je dána přítomností systémů konjugovaných dienů a trienů. Tyto absorpce jsou vyjádřeny jako specifické extinkce E1 % 1 cm (extinkce vyvolaná 1 % roztokem tuku v předepsaném rozpouštědle při tloušťce vrstvy 1 cm) obvykle označované písmenem K (též zmiňované jako „extinkční koeficient“).

1.   OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato metoda popisuje postup spektrofotometrické analýzy olivového oleje v ultrafialové oblasti spektra (jak je popsáno v dodatku).

2.   PODSTATA METODY

Zkoumaný tuk se rozpustí v požadovaném rozpouštědle a poté se určí extinkce roztoku při určitých vlnových délkách proti čistému rozpouštědlu. Z výsledků spektrofotometrických měření se vypočtou specifické extinkce. Vypočítá se specifická absorbance při 232 nm a 268 nm v isooktanu nebo při 232 nm a 270 nm v cyklohexanu pro koncentraci 1 g/100 ml v 10 mm kyvetě.

3.   VYBAVENÍ

3.1

Spektrofotometr pro měření extinkce v ultrafialové oblasti spektra mezi 220 nm a 360 nm s možností odečítání jednotlivých nanometrických jednotek. Před použitím spektrometru se doporučuje ověřit vlnovou délku a rozsah absorbance následujícím způsobem. 3.1.1  Rozsah vlnových délek: rozsah vlnových délek se může ověřit pomocí referenčního materiálu tvořeného optickým skleněným filtrem obsahujícím oxid holmia, který má různá absorpční pásma. Referenční materiál slouží k ověřování a kalibraci stupnice vlnových délek spektrofotometrů ve viditelné a ultrafialové oblasti spektra s nominální spektrální šířkou pásma 5 nm nebo méně. Filtr z holmiového skla se měří v režimu absorbance proti vzdušnému slepému vzorku v rozsahu vlnových délek o 640 do 240 nm. Pro každou šířku spektrálního pásma (0,10 – 0,25 – 0,50 – 1,00 – 1,50 – 2,00 a 3,00) se provede základní korekce na prázdný držák kyvety. Vlnové délky spektrálních pásem jsou uvedeny v osvědčení referenčního materiálu v normě ISO 3656. 3.1.2  Stupnice absorbance: ověřit ji lze pomocí referenčního materiálu tvořeného čtyřmi roztoky dichromanu draselného v kyselině chloristé uzavřenými ve čtyřech křemenných kyvetách pro UV k měření linearity a referenční fotometrické přesnosti v UV oblasti spektra. Kyvety plněné dichromanem draselným (40 mg/ml, 60 mg/ml, 80 mg/ml a 100 mg/ml) se měří proti slepému vzorku čisté kyseliny chloristé. Čisté hodnoty absorbance jsou uvedeny v osvědčení referenčního materiálu v normě ISO 3656.

3.2	Obdélníkové křemenné kyvety s víčky, o optické délce 1 cm. Naplněné vodou nebo jiným vhodným rozpouštědlem by se neměly vzájemně lišit o více než o 0,01 jednotky extinkce.

3.3	Odměrné baňky (25 ml)

3.4	Analytické váhy, které lze odečítat s přesností na 0,0001 g.

4.   ČINIDLA

Není-li uvedeno jinak, používají se pouze chemikálie analytické čistoty.

Rozpouštědlo: isooktan (2,2,4-trimethylpentan) pro měření při 232 nm a 268 nm, nebo cyklohexan pro měření při 232 nm a 270 nm, s absorbancí nižší než 0,12 při 232 nm a nižší než 0,05 při 250 nm proti destilované vodě, měřeno v 10 mm kyvetě.

5.   POSTUP

5.1	Zkoumaný vzorek musí být dokonale homogenní a bez suspendovaných nečistot. Oleje, které jsou při normální teplotě kapalné, se přefiltrují přes papír při teplotě přibližně 30 °C, pevné tuky je třeba homogenizovat a přefiltrovat při teplotě nejvýše o 10 °C vyšší, než je jejich bod tání.

5.2

Takto připraveného vzorku se odváží přibližně 0,25 g (s přesností na 1 mg) do odměrné baňky o objemu 25 ml, doplní se po rysku předepsaným rozpouštědlem a homogenizuje se. Výsledný roztok musí být dokonale čirý. Je-li roztok zakalený nebo obsahuje nečistoty, je nutno jej rychle přefiltrovat přes papír.

5.3

Křemenná kyveta se naplní získaným roztokem a změří se extinkce při odpovídajících vlnových délkách od 232 do 276 nm; jako referenční roztok slouží použité rozpouštědlo. Zaznamenané hodnoty extinkce musí ležet v rozmezí od 0,1 do 0,8. Pokud tomu tak není, musí se měření zopakovat s koncentrovanějšími nebo případně ředěnějšími roztoky. POZNÁMKA: Není nutné měřit absorbanci v plném rozsahu vlnových délek.

6.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

6.1

Zaznamenávají se specifické extinkce (extinkční koeficienty) při různých vlnových délkách vypočtené ze vzorce: kde: Κλ = specifická extinkce při vlnové délce λ, Ελ = extinkce měřená při vlnové délce λ; c = koncentrace roztoku v g/100 ml; s = tloušťka křemenné kyvety v cm. Výsledek se vyjádří s přesností na dvě desetinná místa.

6.2

Změna specifické extinkce (ΔΚ) V souladu s oficiální metodou podle právních přepisů Unie zahrnuje spektrofotometrická analýza olivového oleje také stanovení změny absolutní hodnoty specifické extinkce (ΔΚ), která je dána vzorcem: kde Km je specifická extinkce při vlnové délce m. Vlnová délka při maximální absorpci je v závislosti na použitém rozpouštědle 270 nm pro cyklohexan a 268 nm na isooktan.

---

Dodatek

▼B

---

PŘÍLOHA X A

ANALÝZA METHYLESTERŮ MASTNÝCH KYSELIN PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1.   PODSTATA

Tato metoda popisuje použití plynové chromatografie s náplňovými nebo kapilárními kolonami pro stanovení kvalitativního a kvantitativního složení směsi methylesterů mastných kyselin, získaných podle metody uvedené v příloze X B.

Metoda není použitelná pro polymerní mastné kyseliny.

2.   CHEMIKÁLIE

2.1   Nosný plyn

Inertní plyn (dusík, helium, argon, vodík atd.), dokonale vysušený a s obsahem kyslíku menším než 10 mg/kg.

Poznámka 1

Vodík, který je používán pouze na kapilárních kolonách, umožňuje dvakrát zvýšit rychlost analýzy, ale je nebezpečný. Bezpečnostní zařízení jsou dostupná.

2.2   Pomocné plyny

2.2.1

Vodík (čistoty vyšší než 99,9 %), neobsahující organické nečistoty.

2.2.2

Vzduch nebo kyslík, neobsahující organické nečistoty.

2.3   Referenční standard

Směs methylesterů čistých mastných kyselin, nebo methylestery z oleje známého složení; výhodné je složení podobné analyzovanému vzorku.

Pozornost je nutno věnovat ochraně polynenasycených mastných kyselin před oxidací.

3.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Uvedené pokyny se vztahují na obvyklá zařízení používaná pro plynovou chromatografii, používající náplňové, nebo kapilární kolony a plameno-ionizační detektor. Vhodné jsou přístroje dosahující účinnosti a rozlišení uvedené v odstavci 4.1.2.

3.1   Plynový chromatograf

Plynový chromatograf, obsahující následující části:

3.1.1   Injektor

Používá se injektor buď

Poznámka 2

Pokud nejsou přítomny mastné kyseliny s méně než 16 atomy uhlíku, může být použit injektor s pohyblivou jehlou.

3.1.2   Termostat

Termostat má mít schopnost vyhřát kolonu na teplotu nejméně 260 °C a udržovat žádanou teplotu s přesností na 1 °C v případě náplňové kolony a na 0,1 °C v případě kapilární kolony. Poslední požadavek je důležitý při použití křemenných kolon.

Použití ohřevu s programovanou teplotou je doporučeno ve všech případech, zejména pro mastné kyseliny s méně než 16 atomy uhlíku.

3.1.3   Náplňové kolony

3.1.3.1

Kolona má být vyrobena z materiálu, který je inertní k analyzovaným látkám (např. sklo nebo korozivzdorná ocel), a má mít následující rozměry: a) délka: 1 m až 3 m. Relativně kratší kolony by mohly být použity za přítomnosti mastných kyselin s dlouhým řetězcem (nad C20). Při analýzách kyselin se 4 nebo 6 uhlíkovými atomy se doporučuje použít kolonu o délce 2 m; b) vnitřní průměr: 2 až 4 mm. Poznámka 3 Jestliže jsou analyzovány polyenové kyseliny s více než třemi dvojnými vazbami, může na koloně z korozivzdorné oceli docházet k jejich rozložení. Poznámka 4 Může být použit systém s dvěma náplňovými kolonami.

3.1.3.2

Náplň zahrnuje tyto části: a)  nosič: kyselinou praná a silanizovaná křemelina, nebo jiný vhodný inertní nosič s úzkým rozsahem velikosti částic (25 μm v rozmezí mezi 125 μm až 200 μm), přičemž průměrná velikost částic má vztah k vnitřními průměru a délce kolony; b)  stacionární fáze: polární fáze polyesterového typu (např. diethylenglykoljantarát polyester, butandioljantarát polyester, ethylenglykoladipat polyester atd.), kyanosilikony nebo jiné kapaliny splňující požadavky na chromatografickou separaci (viz bod 4). Stacionární fáze by měla tvořit 5 % až 20 % (m/m) z náplně. Pro určitá dělení může být použita nepolární stacionární fáze.

3.1.3.3

Kondicionace kolony Připravená kolona odpojená od detektoru, je-li to možné, se postupně ohřeje v termostatu na teplotu 185 °C za průtoku inertního plynu rychlostí 20 ml/min až 60 ml/min, nechá se nejméně 16 hodin při této teplotě a další dvě hodiny při 195 °C.

3.1.4   Kapilární kolona

3.1.4.1

Trubice má být vyrobena z materiálu, který je inertní k analyzovaným látkám (např. sklo nebo tavený křemen). Vnitřní průměr by se měl pohybovat mezi 0,2 mm až 0,8 mm. Vnitřní povrch by měl být přiměřeným způsobem upraven (např. příprava povrchu, inaktivace). Délka 25 m je ve většině případů dostatečná.

3.1.4.2

Stacionární fáze, obvykle polyethylenglykolového typu (polyethylenglykol 20 000 ), polyestery (butandioljantarát polyester) nebo polární polysiloxany (kyanosilikony). Vhodné jsou vázané stacionární fáze (zesíťované). Poznámka 5 Při použití polárních polysiloxanů je nebezpečí obtížné identifikace a separace kyseliny linolenové a kyselin C20. Pokrytí by mělo být tenké, např. 0,1 μm až 0,2 μm.

3.1.4.3

Montáž a kondicionace kolony Je nutno zachovat běžnou opatrnost při montáži kapilární kolony, např. úprava kolony v termostatu (nosič), výběr a provedení spojů (netěsné spoje), poloha konce kolony v injektoru a detektoru (zmenšení mrtvých prostorů). Kolono se nechá protékat nosný plyn (např. 0 kPa pro kolonu délky 25 mm a vnitřním průměru 0,3 mm). Kolona se ohřívá v termostatu za programované teploty rychlostí 3 °C/min od teploty okolí do teploty 10 °C pod limitní hodnotu, při které dochází k rozložení stacionární fáze. Termostat se udržuje při této teplotě po dobu jedné hodiny, dokud nedojde k ustálení základní linie. Potom se termostat ochladí na 180 °C a pracuje se za isotermních podmínek. Poznámka 6 Vhodné kondiciované kolony jsou obchodně dostupné.

3.1.5

Detektor; vhodnější je detektor vyhřívaný na teplotu vyšší, než je teplota kolony.

3.2   Stříkačka

Stříkačka o maximálním objemu 10 μl, dělená po 0,1 μl.

3.3   Zapisovač

Jestliže je pro výpočet složení analyzované směsi použit záznam zapisovače, je nutno použit elektronický zapisovač s vysokou přesností, slučitelný s přístrojem. Zapisovač by měl mít následující charakteristiky:

3.4   Integrátor nebo kalkulátor (volitelný)

Rychlý a přesný výpočet může být proveden pomocí elektronického integrátoru nebo kalkulátoru. Ten má poskytovat lineární odezvu s odpovídající citlivostí a uspokojivou korekcí na opravu základní linie.

4.   POSTUP

Postup popsaný v odstavcích 4.1 až 4.3 se týká použití plameno-ionizačního detektoru.

Může být použít plynový chromatograf vybavený detektorem pracujícím na principu tepelné vodivosti (katarometrem), který pracuje na principu změn tepelné vodivosti. Pracovní podmínky je třeba v tomto případě upravit tak, jak je uvedeno v bodu 6.

4.1   Zkušební podmínky

4.1.1

Výběr optimálních pracovních podmínek 4.1.1.1 Náplňové kolony Při výběru pracovních podmínek je nutno přihlížet k následujícím proměnným: a) délka a průměr kolony; b) povaha a množství stacionární fáze; c) teplota kolony; d) průtok nosného plynu; e) požadované rozlišení; f) velikost nástřiku zvolená tak, aby sestava detektoru a elektrometru dávala lineární odezvu; g) trvání analýzy. Obecně hodnoty uvedené v tabulkách 1 a 2 povedou k požadovaným výsledkům, tj. nejméně 2 000 teoretických pater na metr délky kolony pro methylstearát a jeho eluci v průběhu přibližně 15 minut. Jestliže to přístrojové vybavení dovolí, měla by být teplota injektoru přibližně 200 °C a detektoru stejná nebo vyšší než je teplota kolony. Platí pravidlo, že poměr průtoku vodíku přiváděného do plameno-ionizačního detektoru k průtoku nosného plynu by se měl pohybovat v rozmezí 1:2 až 1:1 v závislosti na průměru kolony. Průtok kyslíku by měl být 5krát až 10krát vyšší než průtok vodíku. Tabulka 1 Vnitřní průměr kolony mm Průtok nosného plynu ml/min 2 15 až 25 3 20 až 40 4 40 až 60 Tabulka 2 Koncentrace stacionární fáze % (m/m) Teplota kolony °C 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2 Kapilární kolona Účinnost a permeabilita kapilární kolony způsobují, že dělení složek a doba trvání analýzy jsou značně závislé na průtoku nosného plynu kolonou. Je proto nezbytné optimalizovat pracovní podmínky působením na tyto parametry (nebo jednodušeji na tlakovou ztrátu na koloně) podle toho, zda je cílem zlepšit dělení, nebo zrychlit analýzu.

4.1.2

Stanovení počtu teoretických pater (účinnosti) a rozlišení (viz obrázek 1) Provede se analýza směsi přibližně stejného množství methylstearátu a methyloleátu (např. methylestery z kakaového másla). Teplota kolony a průtok nosného plynu se nastaví tak, aby maximum píku methylstearátu bylo zaznamenáno přibližně 15 minut po píku rozpouštědla. Použijte dostatečné množství směsi methylesterů, aby výška píku methylstearátu dosahovala přibližně tří čtvrtin rozsahu stupnice. Počet teoretických pater n (účinnost) se vypočítá podle vzorce: a rozlišení R podle vzorce: kde dr1 je vzdálenost v mm od počátku chromatogramu do maxima píku methylstearátu; ω1 a ω2 jsou šířky v mm píků methylstearátu a methyloleátu změřené mezi průsečíky tangent vedenými inflexními body na píku a základní linií; Δ je vzdálenost mezi maximy píků methylstearátu a methyloleátu v mm; ▼M2 a rozlišovací index Ir pomocí vzorce kde a = výška nejnižšího píku měřená od základní linie a b = výška nejnižšího bodu sedla mezi dvěma sousedními píky měřená od základní linie. ▼B Obrázek 1 Chromatogram pro stanovení počtu teoretických pater (účinnosti) a rozlišení Při stanovení by měly být nastaveny pracovní podmínky poskytující nejméně 2 000 teoretických pater na jeden metr délky kolony pro methylstearát a rozlišení nejméně 1,25.

4.2   Nástřik vzorku

Za použití stříkačky (3.2) se na kolonu chromatografu nastříkne 0,1 μl až 2 μl roztoku methylesterů připravených podle přílohy X B.

Pokud methylestery nejsou v roztoku, připraví se roztok přibližně 100 mg v 1 ml heptanu pro chromatografii a nastřikuje se 0,1 μl až 1 μl tohoto roztoku.

Jestliže jsou analyzovány složky přítomné pouze ve stopových množstvích, velikost nástřiku může být zvýšena (až desetinásobně).

4.3   Analýza

Pracovní podmínky by měly být nastaveny podle odstavce 4.1.1.

Pokud jsou analyzovány mastné kyseliny s méně než 12 atomy uhlíku, lze pracovat při nižší teplotě. Při analýzách mastných kyselin s více než 20 atomy uhlíku lze pracovat naopak při teplotě vyšší. Je také možno použít v obou těchto případech programové teploty. Např. při analýze vzorku, který obsahuje methylestery mastných kyselin s méně než 12 atomy uhlíku nastřikujeme vzorek při teplotě 100 °C (nebo 50 °C až 60 °C, je-li přítomna kyselina máselná) a okamžitě se zvyšuje teplota rychlostí 4 Co/min až 8 °C/min až na optimální hodnotu. V některých případech mohou být oba postupy kombinovány.

Po ukončení programovaném ohřevu pokračuje eluce při konstantní teplotě, dokud nejsou eluovány všechny složky. Jestliže přístroj není vybaven programováním teploty, je možno použít dvě teploty mezi 100 °C a 195 °C.

Jestliže je to nutné, je doporučeno provést analýzu na dvou zakotvených fázích o různé polaritě, aby byla ověřena nepřítomnost maskovaných píků, například v případě současného výskytu C18:3 a C20:0, nebo C18:3 a konjugovaných C18:2.

4.4   Příprava referenčního chromatogramu a referenčních grafů

Provádí se analýza referenční standardní směsi (2.3) za stejných pracovních podmínek, které byly použity při analýze vzorku, měřením retenčních časů nebo retenčních vzdáleností pro základní mastné kyseliny. Do semilografického grafu se vynesou logaritmy retenčních časů nebo vzdáleností pro jednotlivé stupně nasycenosti proti počtu atomů uhlíku. Za isotermních podmínek by měla být závislost pro kyseliny s rovným řetězcem stejného stupně nasycenosti lineární. Tyto přímky by měly být přibližně rovnoběžné.

Je nutné stanovit podmínky k vyvarování se přítomnosti „maskovaných píků“ v případě, že rozlišení je nedostatečné k rozdělení dvou složek.

5.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

5.1   Kvalitativní analýza

Provede se identifikace píků methylesterů pro vzorek z grafu podle 4.4; podle potřeby se interpoluje.

5.2   Kvantitativní analýza

5.2.1   Určení složení

Až na výjimečné případy lze použít metody vnitřní normalizace, tj. za předpokladu, že všechny složky vzorku jsou zaznamenány na chromatogramu, představuje celková plocha píků 100 % (celková eluce).

Jestliže je přístroj vybaven integrátorem, použijí se výsledky získané tímto způsobem. Není-li integrátor k dispozici, vypočte se plocha každého píku vynásobením výšky píku šířkou píku v poloviční výšce a podle potřeby se použije ve výpočtu změna zeslabení použitá při záznamu chromatogramu.

5.2.2   Výpočet

5.2.2.1

Obecný případ Obsah složky i vyjádřený v hmotnostních procentech methylesterů se vypočítá určením plochy odpovídajícího píku vzhledem k součtu ploch všech píků podle vzorce: kde Ai je plocha píku odpovídající složce i, ΣA je součet ploch všech píků. Výsledek se vypočítá s přesností na jedno desetinné místo. Poznámka 7 V tomto obecném případě je výsledek založen na předpokladu, že plocha píku představuje hmotnostní procenta. V případech, že tento předpoklad neplatí, viz 5.2.2.2.

5.2.2.2

Použití korekčních faktorů V některých případech, zvláště za přítomnosti mastných kyselin s méně než 8 atomy uhlíku, nebo kyselin se sekundární skupinou v případě použití detektoru pracujícího na principu tepelné vodivosti, nebo je-li požadována zvláště vysoká přesnost, by měly být použity korekční faktory k převedení plochy píku vyjádřené v procentech na hmotnostní procenta složek. Určení korekčních faktorů za pomoci chromatogramu referenční směsi methylesterů známého složení se provádí za stejných pracovních podmínek, jaké byly použity při analýze vzorku. Pro tyto referenční směsi se obsah v hmotnostních procentech vypočte podle vzorce: kde mi je hmotnost složky i v referenční směsi, Σm je celková hmotnost všech složek v referenční směsi. Z chromatogramu referenční směsi (4.4) se vypočítá procentní podíl ploch (plocha/plocha) pro složku i takto: kde Ai je plocha píku odpovídající složce i, ΣA součet ploch všech píků. Korekční faktor se vypočítá podle vzorce Obecně se korekční faktory vyjádří ve vztahu ke KC16 jako relativní faktor: Pro vzorek se vyjádří obsah každé složky i v hmotnostních procentech methylesteru jako: Výsledky se vypočítají s přesností na jedno desetinné místo.

5.2.2.3

Použití vnitřního standardu V některých případech (např. když nejsou kvantifikovány všechny mastné kyseliny, k čemuž dochází, jsou-li přítomny kyseliny se čtyřmi a šesti atomy uhlíku současně s kyselinami s 16 a 18 atomy uhlíku, nebo když je třeba určit absolutní množství mastných kyselin ve vzorku) by měl být použit vnitřní standard. Jako vnitřní standard se používají nejčastěji methylestery mastných kyselin s 5, 15 nebo 17 atomy uhlíku. Pro vnitřní standard by měl být stanoven korekční faktor (pokud se použije). Hmotnostní procenta složky i vyjádřená jako methylester lze vypočítat podle vzorce: kde Ai je plocha píku odpovídající složce i, As plocha píku odpovídající vnitřnímu standardu, K′i korekční faktor pro složku i (vztažený na KC16), K′s korekční faktor pro vnitřní standard (vztažený na KC16), m hmotnost zkušebního vzorku v mg, ms hmotnost vnitřního standardu v mg. Výsledek se vypočítá s přesností na jedno desetinné místo.

▼M2

6.   ZVLÁŠTNÍ PŘÍPAD – STANOVENÍ TRANS-ISOMERŮ

Obsah trans-isomerů mastných kyselin s počtem atomů uhlíku mezi 10 až 24 je možné stanovit separací methylesterů pomocí kapilární plynové chromatografie s kolonami se specifickou polaritou.

6.1	Kapilární kolona z křemene o vnitřním průměru 0,25 až 0,32 mm a délce 50 m, potažená vrstvou kyanopropisilikonu o tloušťce 0,1 až 0,3 μm (typ SP 2380, C. P. sil 88, silor 10 a podobné typy).

▼M21

6.2	Metylestery se připraví postupem B uvedeným v další příloze X „B“. Tuky nebo oleje s obsahem volných kyselin vyšším než 3 % musí být dopředu neutralizovány v souladu s bodem 5.1.1 přílohy VII.

▼M2

6.3

Laboratorní podmínky pro plynovou chromatografii jsou tyto: — teplota kolony nastavitelná na teplotu od 150 do 230 °C (například 165 °C po dobu 15 minut a poté narůstající o 5 °C za minutu na 200 °C), — teplota vstřikovací jednotky: 250 °C při nástřiku pomocí děliče (split type), nebo počáteční teplota kolony při použití systému nástřiku bez dělení přímo na kolonu (on column), — teplota detektoru: 260 °C, — rychlost průtoku nosného plynu (helium a vodík): 1,2 ml za minutu. Vstříknuté množství musí být takové, aby za daných podmínek citlivosti byla výška píku odpovídajícího methylesteru kyseliny arachidové nejméně 20 % spodní části škály.

6.4

Stanovení jednotlivých methylesterů se provádí na základě retenčních časů, které jsou porovnány s retenčními časy referenčních směsí (viz bod 2.3.). Estery trans-mastných kyselin se eluují před odpovídajícími cis-isomery. Příklad chromatogramu je uveden na obrázku 2. Obrázek 2 Chromatogram pro stanovení trans-isomerů mastných kyselin pomocí kapilární plynové chromatografie

6.5	Účinnost kolony podle bodu 4.1.2. musí umožňovat separaci určitých kritických párů, například páru tvořeného masívem píků kyseliny trans-olejové a píkem kyseliny cis-olejové, trans- C18:1/cis- C18:1, s rozlišovacím indexem vyšším než 2.

6.6

Procentní podíl jednotlivých trans-mastných kyselin se vypočítá na základě vztahu mezi danými plochami píků a součtem ploch všech přítomných píků. Pro jednotlivé kyseliny se berou v úvahu tyto procentní podíly: — trans-oktadecenové kyseliny (T 18: 1) podle přílohy I k tomuto nařízení jako úhrn trans-isomerů kyseliny olejové, — cis-trans- a trans-cis-oktadekadienové kyseliny [(CT/TC) 18: 2] podle přílohy I tohoto nařízení jako úhrn trans-isomerů kyseliny linolové, — trans-cis-trans-, cis-cis-trans-, cis-trans-cis- a trans-cis-cis-oktadekatrienové kyseliny [(TCT + CCT + CTC + TCC)18: 3] podle přílohy I tohoto nařízení jako úhrn trans-isomerů kyseliny linolenové. Poznámka 8:S přihlédnutím ke zvláštním charakteristikám této metody je výsledky nutno uvádět na dvě desetinná místa.

▼B

7.   SPECIÁLNÍ PŘÍPAD: POUŽITÍ KATAROMETRU (DETEKTORU PRACUJÍCÍHO NA PRINCIPU ZMĚN TEPELNÉ VODIVOSTI)

Plynový chromatograf vybavený detektorem pracujícím na principu změn tepelné vodivosti (katarometr) může být rovněž použit pro kvalitativní a kvantitativní stanovení složení směsi methylesterů mastných kyselin. Při jeho použití by podmínky uvedené v odstavcích 3 a 4 měly být upraveny podle tabulky 3.

Pro kvantitativní analýzu je definováno použití korekčních faktorů v 5.2.2.2.

8.   PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol musí obsahovat odkaz na použitou metodu pro přípravu methylesterů a jejich stanovení plynovou chromatografií a získané výsledky. Dále zahrnuje všechny pracovní podrobnosti nespecifikované v této mezinárodní normě nebo považované za volitelné, jakož i další okolnosti, které mohou ovlivnit výsledek.

Protokol musí obsahovat všechny informace nutné pro kompletní identifikaci vzorku.

▼M19

---

ANNEX X B

PREPARATION OF THE FATTY ACID METHYL ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

The following two methods are recommended for preparing the fatty acid methyl esters from olive oils and olive-pomace oils:

Method A

:

Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

Method B

:

Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium.

Each method will be applied according to the analytical parameter to be determined and the oil category as indicated below:

PURIFICATION OF OIL SAMPLES

When necessary, the samples will be purified by passing the oil through a silica gel column, eluting with hexane/diethyl ether (87:13, v/v) as described in IUPAC method 2.507.

Alternatively, solid-phase extraction on silica gel phase cartridges can be used. A silica gel cartridge (1 g, 6 ml) is placed in a vacuum elution apparatus and washed with 6 ml of hexane. The vacuum is released to prevent the column from becoming dry and then a solution of the oil (0,12 g approximately) in 0,5 ml of hexane is loaded into the column and vacuum is applied. The solution is pulled down and then eluted with 10 ml of hexane/diethyl ether (87:13 v/v) under vacuum. The combined eluates are homogenised and divided in two similar volumes. An aliquot is evaporated to dryness in a rotary evaporator under reduced pressure at room temperature. The pomace is dissolved in 1 ml of heptane and the solution is ready for fatty acid analysis by GC. The second aliquot is evaporated and the pomace is dissolved in 1 ml of acetone for triglyceride analysis by HPLC, if necessary.

METHODS FOR PREPARING THE FATTY ACID METHYL ESTERS

1.   Method A: Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

1.1.   Purpose

This rapid method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free fatty acid content of less than 3,3 %. Free fatty acids are not esterified by potassium hydroxide. Fatty acid ethyl esters are trans-esterified at a lower rate than glyceridic esters and may be only partially methylated.

1.2.   Principle

Methyl esters are formed by trans-esterification with methanolic potassium hydroxide as an intermediate stage before saponification takes place (title 5 in ISO-5509:2000, title 5 in IUPAC method 2.301).

1.3.   Reagents

Methanol containing not more than 0,5 % (m/m) water.

Heptane, chromatographic quality.

Potassium hydroxide, approximately 2 N methanolic solution: dissolve 11,2 g of potassium hydroxide in 100 ml of methanol.

1.4.   Apparatus

Screw-top test tubes (5 ml volume) with cap fitted with a PTFE joint.

Graduated or automatic pipettes, 2 ml and 0,2 ml

1.5.   Procedure

In a 5 ml screw-top test tube weigh approximately 0,1 g of the oil sample. Add 2 ml of heptane, and shake. Add 0,2 ml of 2 N methanolic potassium hydroxide solution, put on the cap fitted with a PTFE joint, tighten the cap, and shake vigorously for 30 seconds. Leave to stratify until the upper solution becomes clear. Decant the upper layer containing the methyl esters. The heptane solution is suitable for injection into the gas chromatograph. It is advisable to keep the solution in the refrigerator until gas chromatographic analysis. Storage of the solution for more than 12 hours is not recommended.

2.   Method B: Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium

2.1.   Purpose

This method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free fatty acid content of more than 3,3 %.

2.2.   Principle

Neutralisation of the free fatty acids and alkaline methanolysis of the glycerides, followed by esterification of the fatty acids in acid medium (title 4.2. in IUPAC method 2.301).

2.3.   Reagents

2.4.   Apparatus

2.5.   Procedure

Transfer about 0,25 g of the oil sample into a 50 ml ground-necked volumetric flask. With the aid of a funnel, add 10 ml of 0,2 N sodium methylate in methanol and the boiling chips. Fit a reflux condenser, shake, and bring to the boil. The solution should become clear, which usually occurs in about 10 minutes. The reaction is complete after 15 minutes. Remove the flask from the source of heat, wait until the reflux stops, remove the condenser, and add two drops of phenolphthalein solution. Add a few ml of 1 N sulphuric acid in methanol solution until the solution becomes colourless and then add 1 ml in excess. Fit the condenser and boil again for 20 minutes. Withdraw from the source of heat and cool the flask under running water. Remove the condenser, add 20 ml of saturated sodium chloride solution, and shake. Add 5 ml of heptane, plug the flask, and shake vigorously for 15 seconds.

Leave to settle until the two phases have separated. Add saturated sodium chloride solution again until the aqueous layer reaches the lower end of the flask neck. The upper layer containing the methyl esters fills the flask neck. This solution is ready to be injected in the GC.

Caution: Methylation by method B must be done under a hood.

2.6.   Alternatives to methylation Method B

2.6.1.   Method C

2.6.1.1.   Principle

The fatty matter undergoing analysis is treated with methanol-hydrochloric acid, in a sealed vial, at 100 °C.

2.6.1.2.   Apparatus

2.6.1.3.   Reagents

Solution of hydrochloric acid in 2 % methanol. This is prepared from gaseous hydrochloric acid and anhydrous methanol (Note 1).

Hexane, chromatographic quality.

Commercial solutions of hydrogen chloride in methanol can be used. Small amounts of gaseous hydrochloric acid can easily be prepared in the laboratory by simple displacement from the commercial solution (p = 1,18) by dripping concentrated sulphuric acid. Since hydrochloric acid is very rapidly absorbed by methanol, it is advisable to take the usual precautions when dissolving it, e.g. introduce the gas through a small inverted funnel with the rim just touching the surface of the liquid. Large quantities of methanolic hydrochloric acid solution can be prepared in advance, as it keeps perfectly in glass-stoppered bottles stored in the dark. Alternatively, this reagent can be prepared by dissolution of acetyl chloride in anhydrous methanol.

2.6.1.4.   Procedure

2.6.2.   Method D

2.6.2.1.   Principle

The fatty matter undergoing analysis is heated under reflux with methanol-hexane-sulphuric acid. The methyl esters obtained are extracted with petroleum ether.

2.6.2.2.   Apparatus

2.6.2.3.   Reagents

2.6.2.4.   Procedure

Place 0,1 g of oil in the 20 ml test tube and add 5 ml of methylation reagent.

Fit the reflux condenser and heat for 30 minutes in a boiling water bath (Note 2).

Transfer quantitatively the mixture into a 50 ml separating funnel, with the aid of 10 ml distilled water and 10 ml petroleum ether. Shake vigorously, and allow the phases to separate, remove the aqueous phase and wash the ether layer twice with 20 ml distilled water. Add to the separating funnel a small quantity of anhydrous sodium sulphate, shake, allow to settle for a few minutes and filter, collecting the filtrate in a 15 ml test tube with a conical base.

Evaporate the solvent over a water bath in a current of nitrogen.

Note 2: To control boiling, insert a glass rod into the test tube and limit the temperature of the water bath to 90 °C.

3.   Precision parameters

The statistical evaluation of the precision of methods A and B was published by the International Olive Oil Council in its method COI/T.20/CO. No 24.

RECOMMENDATIONS FOR GAS CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS OF THE FATTY ACID ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

1.   Procedure

The gas chromatographic analysis of solutions of fatty esters in heptane is to be carried out according to standard ISO-5508 using a capillary column (50 m length x 0,25 or 0,32 mm i.d.) impregnated with cyanopropylsilicone phase as indicated for the determination of fatty acid trans-isomers (COI/T.20/Doc. no. 17).

Figure 1 gives the typical gas chromatographic profile of an olive-pomace oil containing methyl and ethyl esters of fatty acids, and trans-isomers of methyl esters.

2.   Calculations

2.1.

For the calculation of the fatty acid composition and ΔECN42, all the following fatty acids will be taken into account: Myristic (C14:0). Palmitic (C16:0). Sum of the areas of the peaks corresponding to the methyl and ethyl esters. Palmitoleic (C16:1). Sum of the areas of the peaks corresponding to the ω9 and ω7 isomers of the methyl ester. Margaric (C17:0). Margaroleic (C17:1). Stearic (C18:0). Oleic (C18:1). Sum of the areas of the peaks corresponding to the ω9 and ω7 isomers of the methyl ester, ethyl ester, and trans-isomers of the methyl ester. Linoleic (C18:2). Sum of the areas of the peaks corresponding to the methyl and ethyl esters, and the trans-isomers of the methyl ester. Arachidic (C20:0). Linolenic (C18:3). Sum of the areas of the methyl ester and the trans-isomers of the methyl ester. Eicosenoic (C20:1). Behenic (C22:0). Lignoceric (C24:0). Squalene will not be taken into account for the calculation of the total area.

2.2.

For the calculation of the percentage of trans-C18:1 the peak corresponding to the methyl esters of this fatty acid is to be used. For the sum [trans-C18:2 + trans-C18:3], all the peaks corresponding to the trans-isomers of these two fatty acids are to be added together. For the calculation of the total area, all the peaks mentioned in 2.1. are to be taken into account (see COI/T.20/Doc. No. 17). The calculation of the percentage of each fatty acid will be carried out according to the formula: Figure 1: Gas chromatographic profile obtained by the cold methylation method from olive-pomace oil. The chromatographic peaks correspond to the methyl and ethyl esters except where otherwise indicated.

▼B

---

PŘÍLOHA XI

STANOVENÍ OBSAHU TĚKAVÝCH HALOGENOVANÝCH ROZPOUŠTĚDEL V OLIVOVÉM OLEJI

1.   PODSTATA

Tato metoda popisuje analýzu plynovou chromatografií s použitím techniky parního prostoru (head space).

2.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

2.1	Plynový chromatograf vybavený detektorem elektronového záchytu (ECD).

2.2	Zařízení pro přípravu vzorku v parním prostoru (head space).

2.3	Skleněná kolona pro plynovou chromatografii o délce 2 m a průměru 2 mm se stacionární fází tvořenou 10 % OV101 nebo ekvivalentem, zachycenou v kyselinou prané a silanizované křemelině s velikostí částic 80-100 mesh.

2.4	Nosný a pomocný plyn: dusík pro plynovou chromatografii, vhodný pro detektor elektronového záchytu.

2.5	Skleněné baňky na 10 až 15 ml s teflonovým povlakem a hliníkovým uzávěrem s vybavením pro vpich stříkačky.

2.6	Hermeticky těsnící svorky.

2.7	Plynová stříkačka na 0,5 až 2 ml.

3.   CHEMIKÁLIE

Standard: halogenovaná rozpouštědla se stupněm čistoty vhodným pro plynovou chromatografii.

4.   POSTUP

4.1

Do skleněné baňky se přesně naváží přibližně 3 g oleje (nesmí být použita opakovaně); baňka se hermeticky uzavře. Baňka se vloží na jednu hodinu do termostatu nastaveného na 70 °C. Pomocí stříkačky se opatrně odebere 0,2 až 0,5 ml z parního prostoru. Obsah stříkačky se nastříkne na kolonu chromatografu nastaveného takto: — teplota vstřiku: 150 °C, — teplota kolony: 70 až 80 °C, — teplota detektoru: 200 až 250 °C. Mohou být použity i jiné teploty, pokud se dosáhne ekvivalentních výsledků.

4.2	Referenční roztoky: s použitím rafinovaného olivového oleje beze stop rozpouštědel se připraví standardní roztoky s různými koncentracemi těkavých halogenovaných rozpouštědel o hodnotách 0,05 mg/kg až 1 mg/kg. V případě potřeby se halogenovaná rozpouštědla rozředí pentanem.

4.3

Kvantitativní vyhodnocení: porovnejte plochy nebo výšky píků vzorku a standardního roztoku, jehož koncentrace se nejvíce blíži předpokládané koncentraci. Je-li odchylka větší než 10 %, analýza musí být opakována, tj. musí být provedeno porovnání s dalším standardním roztokem, dokud nebude odchylka menší než 10 %. Obsah se stanoví na základě průměru jednotlivých vstřiků.

4.4	Vyjádření výsledků: v mg/kg (ppm). Detekční limit činí u této metody 0,01 mg/kg.

▼M22

---

PŘÍLOHA XII

METODA MEZINÁRODNÍ RADY PRO OLIVOVÝ OLEJ PRO ORGANOLEPTICKÉ HODNOCENÍ PANENSKÉHO OLIVOVÉHO OLEJE

1.   PŘEDMĚT A OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda je založena na rozhodnutí Mezinárodní rady pro olivový olej č. DEC-21/95-V/2007 ze dne 16. listopadu 2007, které se týká upravené metody pro organoleptické hodnocení vlastností panenského olivového oleje. Jejím cílem je stanovit postup hodnocení organoleptických vlastností panenského olivového oleje ve smyslu bodu 1 přílohy XVI nařízení (ES) č. 1234/2007 a stanovit metodu jeho klasifikace na základě těchto vlastností. Metoda obsahuje rovněž pokyny týkající se nepovinného označování etiketami.

Popsaná metoda se vztahuje pouze na panenský olivový olej a na jeho klasifikaci nebo jeho označování etiketami podle intenzity vnímaných vad, ovocné chuti a vůně a dalších pozitivních znaků, které stanoví skupina vybraných vyškolených a vyzkoušených posuzovatelů tvořících zkušební komisi.

2.   OBECNÉ INFORMACE

Pokud jde o obecný základní slovník, o výrazy zkušební místnost a skleněná nádobka pro hodnocení olivového oleje a všechny další otázky spojené s touto metodou, doporučuje se dodržovat pravidla Mezinárodní rady pro olivový olej, zejména rozhodnutí č. DEC-21/95-V/2007 ze dne 16. listopadu 2007, které se týká upravené metody pro organoleptické hodnocení vlastností panenského olivového oleje.

3.   SPECIFICKÝ SLOVNÍK

3.1   Pozitivní znaky

Ovocná chuť a vůně :

soubor čichových a/nebo chuťových počitků, které závisí na odrůdě oliv a vlastnostech oleje pocházejícího ze zdravých a čerstvých plodů, zelených nebo zralých, a které jsou vnímány přímo nosem nebo retronasální metodou čichání.

Ovocná chuť a vůně se označuje za nezralou, pokud čichové počitky připomínají zelené plody, což je charakteristické pro olej získaný ze zelených plodů.

Ovocná chuť a vůně se označuje za zralou, pokud čichové počitky připomínají zralé plody, což je charakteristické pro olej získaný ze zelených a zralých plodů.

Hořký : základní charakteristická chuť oleje získaného ze zelených nebo nazelenalých oliv, kterou vnímáme hrazenými papilami, tvořícími na jazyku uskupení ve tvaru písmene V.

Štiplavý : taktilní počitek svrbění typický pro olivový olej vyrobený na začátku hospodářského roku převážně z ještě zelených oliv, možno jej vnímat v celé ústní dutině, zejména v hrdle.

3.2   Negativní znaky

Zatuchlý / Po kalném sedimentu : chuťově-čichový počitek typický pro olivový olej získaný z oliv skladovaných na hromadách, kde plody prošly pokročilým stupněm anaerobní fermentace, nebo pro olej získaný dekantací ze sedliny z kádí a podzemních nádrží, jež rovněž prošel procesem anaerobní fermentace.

Po plísních a vlhkosti : chuťově-čichový počitek typický pro olivový olej získaný z oliv napadených plísněmi a kvasinkami v důsledku několikadenního uskladnění ve vlhku.

Vinný-octový / Kyselý-nakyslý : chuťově-čichový počitek typický pro některý olivový olej připomínající víno nebo ocet. Vzniká hlavně v důsledku aerobního kvašení oliv nebo zbytků olivové pasty na lisovacích rohožích, které nebyly dobře umyté, což má za následek tvorbu kyseliny octové, ethylacetátu a ethanolu.

Kovový : chuťově-čichový počitek připomínající kov. Je typický pro olivový olej, který byl dlouhou dobu ve styku s kovovými povrchy během mletí, míchání, lisování nebo skladování.

Žluklý : chuťově-čichový počitek typický pro všechny oleje, které prodělaly intenzivní proces autooxidace.

Přehřátý nebo připálený : chuťově-čichový počitek typický pro olivový olej získaný nadměrným a/nebo dlouhodobým ohřevem během zpracování, zejména je-li pasta míchána za nevhodných tepelných podmínek.

Trávový-dřevový : chuťově-čichový počitek typický pro olivový olej získaný ze sušených oliv.

Hrubý : chuťově-taktilní počitek vyvolaný některým starým olejem, který způsobuje v ústech hustý, kašovitý pocit.

Olejový : chuťově-čichový počitek olivového oleje připomínající naftu, mazací tuky nebo minerální olej.

Po šťávě z plodů : chuťově-čichový počitek, který olej získá při dlouhodobém kontaktu se šťávou z plodů, která prošla procesem fermentace.

Slaný : chuťově-čichový počitek typický pro olivový olej získaný z oliv, které byly konzervovány v solném roztoku.

Espartový : chuťově-čichový počitek typický pro olivový olej získaný z oliv lisovaných v nových espartových rohožích. Může se lišit v závislosti na tom, zda byly rohože vyrobeny ze zeleného nebo sušeného esparta.

Zemitý : chuťově-čichový počitek typický pro olivový olej získaný z oliv sklizených s nánosem zeminy nebo bláta a neopraných.

Po červech : chuťově-čichový počitek typický pro olivový olej získaný z oliv, které byly silně napadeny larvami mouchy olivové (Bactrocera Oleae).

Po okurkách : chuťově-čichový počitek typický pro olivový olej po delší dobu hermeticky uzavřený, zejména do plechovek, pocházející z 2-6-nonadienalu.

Po vlhkém dřevu : chuťově-čichový počitek typický pro olivový olej získaný z oliv, které byly na stromě zasaženy mrazem.

3.3   Nepovinná terminologie pro účely označování etiketami

Předseda zkušební komise může na požádání potvrdit, že hodnocené oleje splňují definice a rozpětí odpovídající těmto uvedeným pojmům a přívlastkům v závislosti na intenzitě a vnímání znaků:

4.   ZKUŠEBNÍ KOMISE

Zkušební komise se skládá z předsedy zkušební komise a z osmi až dvanácti posuzovatelů.

Předseda zkušební komise je kvalitně vyškolená osoba, která má nezbytné odborné znalosti pro posuzování jednotlivých druhů olivových olejů. Odpovídá za zkušební komisi, za její organizaci a činnost, za přípravu, kódové označení vzorků a jejich předkládání posuzovatelům, jakož i za sběr a statistické vyhodnocení zkušebních údajů.

Předseda zkušební komise vybere posuzovatele a dbá na jejich odbornou přípravu a kontrolu jejich výkonnosti, aby zajistil, že udržují své schopnosti na přiměřené úrovni.

Podle průvodce Mezinárodní rady pro olivový olej pro výběr, výcvik a kontrolu odborných posuzovatelů panenského olivového oleje musí být posuzovatelé pro organoleptické zkoušky olivového oleje vybráni a vyškoleni podle jejich schopnosti rozlišovat mezi podobnými vzorky.

Zkušební komise se musí zavázat k účasti na organoleptických hodnoceních na vnitrostátní úrovni, úrovni Společenství nebo mezinárodní úrovni za účelem pravidelné kontroly a harmonizace hodnotících kritérií. Kromě toho musí zkušební komise schválené v souladu s ustanoveními čl. 4 odst. 1 tohoto nařízení každoročně poskytovat dotyčnému členskému státu veškeré informace o svém složení a o počtu hodnocení provedených z titulu schválené zkušební komise.

5.   POSTUP PŘI ORGANOLEPTICKÉM HODNOCENÍ A KLASIFIKACE

5.1   Používání profilového listu posuzovatelem

Profilový list, který posuzovatel použije, je uveden v dodatku A této metody.

Každý posuzovatel, který je členem zkušební komise, musí cítit a následovně ochutnat olivový olej, který je předmětem hodnocení. Na profilový list, který má k dispozici, musí dále uvést na 10cm stupnici pociťovanou intenzitu všech pozitivních a negativních znaků ( 7 ). V případě, že posuzovatel vnímá zralost nebo nezralost znaku ovocné chuti a vůně, zaškrtne v profilovém listu příslušný rámeček.

Zjistí-li posuzovatel další negativní znaky neuvedené na profilovém listu, zapíše je s použitím termínu nebo termínů, které je co nejpřesněji popisují, v rubrice „jiné“.

5.2   Použití údajů předsedou zkušební komise

Předseda zkušební komise shromáždí profilové listy vyplněné jednotlivými posuzovateli; zkontroluje intenzity přidělené různým znakům; v případě, že bude zjištěna nesrovnalost, vyzve posuzovatele, aby svůj profilový list zkontroloval a v případě nutnosti zkoušku zopakoval.

Předseda komise může zadat údaje jednotlivých posuzovatelů do počítačového programu pro metodu statistického výpočtu mediánu uvedenou v dodatku B. Údaje se zadávají pomocí matice složené z deseti sloupců odpovídajících deseti organoleptickým vlastnostem a z počtu řádků odpovídajících počtu posuzovatelů zkušební komise.

Pokud více než 50 % členů zkušební komise vnímalo negativní znak a uvedlo to v rubrice „jiné“, vypočítá se medián této vady a olej se následně klasifikuje.

Pokud jde o pojmy „nezralý“ a „zralý“, předseda zkušební komise může potvrdit, že hodnocený olej splňuje podmínky uvedené v bodě 3.3 pouze v tom případě, pokud minimálně 50 % členů zkušební komise upozornilo na vnímání zralosti nebo nezralosti u znaku ovocné chuti a vůně.

V případě analýz, které se provádějí v rámci kontrol shody, je provedena zkouška. V případě kontrolních analýz musí předseda zkušební komise zabezpečit, aby se analýza opakovala. V případě, že se výsledky analýz vzájemně vylučují, se hodnocení musí provést třikrát. V těchto případech se medián znaků vypočítá na základě průměru mediánů. Všechna opakování těchto analýz se musí provést během odlišných zasedání.

5.3   Klasifikace olivových olejů

Olivový olej se zařadí pod následující kategorie podle mediánu vad a mediánu znaku ovocné chuti a vůně. Medián vad se stanovuje jako medián vady vnímané s největší intenzitou. Medián vad a medián ovocné chuti a vůně jsou vyjádřeny s přesností na jedno desetinné číslo a hodnota robustního variačního koeficientu, který je vyjadřuje, musí být nižší nebo rovná 20 %.

Klasifikace oleje se provádí porovnáváním hodnoty mediánu vad a mediánu ovocné chuti a vůně s níže uvedenými referenčními intervaly. Při stanovování hranice těchto intervalů se zohlednila chyba metody, proto se tyto hranice považují za absolutní. Počítačové programy umožňují vizuální klasifikaci v tabulce statistických údajů nebo na grafu.

a)	Extra panenský olivový olej : medián vad se rovná 0 a medián ovocné chuti a vůně a vůně je vyšší než 0;

b)	Panenský olivový olej : medián vad je vyšší než 0 a nižší nebo rovný 3,5 a medián ovocné chuti a vůně je vyšší než 0;

c)	Lampantový panenský olivový olej : medián vad je vyšší než 3,5; nebo medián vad je nižší nebo rovný 3,5 a medián ovocné chuti a vůně se rovná 0.

5.4   Zvláštní případ

Pokud medián jiného pozitivního znaku než chuť a vůně je vyšší než 5,0, předseda zkušební komise tuto skutečnost uvede do protokolu o zkoušce olejového oleje.

---

Dodatek A

Profilový list panenského olivového oleje

---

Dodatek B

METODA VÝPOČTU MEDIÁNU A INTERVALY SPOLEHLIVOSTI

Medián

Medián je definován jako reálné číslo Xm, pro které platí, že pravděpodobnost (P), že hodnoty rozdělení (X) jsou nižší než toto číslo (Xm), je nižší nebo rovná 0,5 a zároveň, že pravděpodobnost, že hodnoty rozdělení jsou nižší nebo rovné Xm, je vyšší nebo rovná 0,5. Jiná definice považuje medián za padesátý percentil rozdělení čísel seřazených podle vzestupného pořadí. Zjednodušeně řečeno: medián představuje prostřední hodnotu řady složené z lichých čísel nebo průměr dvou prostředních hodnot řady složené ze sudých čísel.

Robustní směrodatná odchylka

Za účelem získání spolehlivého odhadu variability, která se vytváří kolem mediánu, je třeba použít robustní směrodatné odchylky podle Stuarta a Kendalla. Následující vzorec uvádí odchylku asymptotického typu, tj. robustní odhad variability zvažovaných údajů, kde N je počet pozorování a IQR je mezikvartilové rozpětí, které obsahuje přesně 50 % případů jakéhokoli rozdělení pravděpodobnosti.

Výpočet mezikvartilového rozpětí se provádí výpočtem velikosti rozdílu odchylky mezi 75. a 25. percentilem.

IQR = 75. percentil – 25. percentil

Percentil je hodnota Xpc pro kterou platí, že pravděpodobnost (P), že hodnoty rozdělení jsou nižší než Xpc, je nižší nebo rovná stanovené setině a zároveň, že pravděpodobnost (P), že hodnoty rozdělení jsou nižší nebo rovné Xpc, je vyšší nebo rovná uvedené setině. Setina označuje použitý zlomek rozdělení. U mediánu se tento zlomek rovná 50/100.

V praxi představuje percentil hodnotu rozdělení, která odpovídá určené ploše vyznačené od křivky rozdělení nebo hustoty. Například 25. percentil představuje hodnotu rozdělení odpovídající ploše, která se rovná 0,25 nebo 25/100.

Robustní variační koeficient (%)

Robustní variační koeficient (CVR) představuje bezrozměrné číslo, které udává procento variability analyzované řady čísel. Z tohoto důvodu je tento koeficient velice užitečný pro ověření spolehlivosti členů zkušební komise.

95 % intervaly spolehlivosti mediánu

95 % intervaly spolehlivosti (hodnota chyby prvního druhu se rovná 0,05 nebo 5 %) představují interval, v němž by se hodnota mediánu mohla měnit za předpokladu, že by bylo možné pokus donekonečna opakovat. V praxi tento interval označuje interval proměnlivosti pokusu za stanovených provozních podmínek za předpokladu, že by se pokus mohl vícekrát opakovat. Stejně jako v případě CVR interval napomáhá při hodnocení spolehlivosti pokusu.

ICsup = Me + (c.S*)

ICinf = Me – (c.S*)

Kde se c, v případě intervalu spolehlivosti 0,95, rovná 1,96.

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

---

PŘÍLOHA XV

1.   STANOVENÍ OBSAHU OLEJE V OLIVOVÝCH POKRUTINÁCH

1.1   Přístroje a pomcky

1.2   Chemikálie

Technický hexan, jehož odparek nesmí být větší než 2 mg na 100 ml rozpouštědla.

2.   POSTUP

2.1   Příprava zkušebního vzorku

V případě potřeby se k rozemletí laboratorního vzorku použije předem dobře vyčištěný mechanický mlýnek, aby částice zcela prošly sítem.

Asi jedna dvacetina vzorku se použije pro vyčištění mlýnku; tento rozemletý materiál se vyhodí. Zbytek se rozemele a shromáždí, důkladně promíchá a neprodleně analyzuje.

2.2   Velikost zkušebního vzorku

Po dokončení mletí se naváží asi 10 g vzorku s přesností na 0,01 g.

2.3   Příprava extrakční patrony

Zkušební vzorek se převede do extrakční patrony a utěsní se vatovým tamponem. Je-li použit filtrační papír, zkušební vzorek se do něj zabalí.

2.4   Vysušení předem

Jsou-li olivové pokrutiny velmi vlhké (tj. vlhkost a obsah těkavých látek je vyšší než 10 %), provede se vysušení předem umístěním naplněné extrakční patrony (nebo filtračního papíru) na vhodnou dobu do sušárny vyhřáté na teplotu nejvýše 80 °C, aby došlo ke snížení vlhkosti a obsahu těkavých látek na hodnotu menší než 10 %.

2.5   Příprava extrakční baňky

Extrakční baňka s několika kousky pemzy, která byla předem vysušena v sušárně při teplotě 103 ± 2 °C a zchlazena po dobu nejméně 1 hodiny v exsikátoru, se zváží s přesností na 1 mg.

2.6   První extrakce

Extrakční patrona (nebo filtrační papír) se zkušebním vzorkem se vloží do extrakčního přístroje. Do baňky se nalije potřebné množství hexanu. Extrakční baňka se nasadí na extrakční přístroj a to celé se umístí na elektricky vyhřívanou lázeň. Extrakční baňka se zahřívá tak, aby kondenzace extrakčního rozpouštědla byla nejméně 3 kapky za sekundu (tzn. mírný, ne prudký var). Extrahuje se 4 hodiny. Potom se extrakční přístroj nechá vychladnout. Extrakční patrona se vyjme z extrakčního přístroje a postaví se do proudu vzduchu, aby se odpařila většina rozpouštědla.

2.7   Druhá extrakce

Obsah extrakční patrony se vysype do mikromlýnku a co nejjemněji se rozemele. Rozemletá směs se převede zpět do extrakční patrony, která se vloží zpět do extrakčního přístroje.

Znovu se extrahuje další dvě hodiny do téže extrakční baňky, obsahující již prvou část extraktu.

Roztok obsažený v extrakční baňce musí být čirý. Není-li tomu tak, je nutno jej přefiltrovat přes filtrační papír, přičemž původní baňka a filtrační papír se několikrát propláchnou hexanem. Filtrát a proplachovací rozpouštědlo se převede do druhé předem vysušené baňky zvážené s přesností na 1 mg.

2.8   Odstranění rozpouštědla a vážení extraktu

Větší část rozpouštědla se z extrakční baňky odstraní oddestilováním na elektricky vyhřívané lázni. Poslední stopy rozpouštědla se odstraní zahříváním extrakční baňky po dobu 20 minut v sušárně při 103 ± 2 °C. Zbytku rozpouštědla se mohou odstranit proudem vzduchu, anebo výhodněji inertním plynem zaváděným do baňky po krátkou dobu, nebo pod vakuem.

Baňky s vyextrahovaným olejem se nechají vychladnout na okolní teplotu po dobu nejméně jedné hodiny a zváží se s přesností na 1 mg.

Zvážené baňky se za stejných podmínek znovu zahřívají po dobu 10 minut, opět se nechají vychladnout v exsikátoru a znovu se zváží.

Rozdíl mezi dvěma váženími nesmí být vyšší než 10 mg. Pokud je rozdíl vyšší, opakuje se zahřívání, vychlazení a vážení tak dlouho, dokud rozdíl mezi dvěma po sobě následujícími váženími je nejvýše 10 mg. Potom se zaznamená konečná hmotnost baňky.

Na stejném zkušebním vzorku se vždy provedou dvě zkoušky;.

3.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

3.1   Metoda výpočtu a vzorec

3.2   Opakovatelnost

Absolutní rozdíl mezi dvěma jednotlivými na sobě nezávislými výsledky zkoušky, získanými stejným pracovníkem v rozmezí krátkého časového intervalu nebo souběžně může činit nejvýše 0,2 g hexanového extraktu na 100 g zkušebního vzorku.

Pokud je rozdíl větší, analýza se opakuje na dalších dvou zkušebních vzorcích. Pokud je rozdíl opět vyšší než 0,2 g, za výsledek se považuje aritmetický průměr všech čtyřech stanovení.

---

PŘÍLOHA XVI

STANOVENÍ JODOVÉHO ČÍSLA

1.   OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato mezinárodní norma specifikuje metodu stanovení jodového čísla v živočišných a rostlinných tucích a olejích, dále jen „tuky“.

2.   DEFINICE

Pro účely této mezinárodní normy platí tato definice:

2.1	Jodové číslo: vyjadřuje hmotnost jodu vázaného na vzorek za pracovních podmínek specifikovaných touto mezinárodní normou. Jodové číslo je vyjádřeno v g jodu na 100 g vzorku.

3.   PODSTATA ZKOUŠKY

Zkušební vzorek se rozpustí v rozpouštědle a přidá se Wijsovo činidlo. Po stanoveném čase se přidá roztok jodidu draselného a voda a uvolněný jod se titruje roztokem thiosíranu sodného.

4.   CHEMIKÁLIE

Všechna činidla musí mít čistotu p. a.

4.2	Jodid draselný, 100 g/l roztoku; nesmí obsahovat volný jod nebo jodičnany.

4.3	Škrobový roztok. 5 g rozpustného škrobu se smísí se 30 ml vody a ke směsi se přidá 1 000 ml vroucí vody, vaří se tři minuty a roztok se nechá vychladnout.

4.4	Thiosíran sodný, standardní odměrný roztok c(Na2S2O3.5H2O) = 0,1 mol/l, standardizovaný ne déle než 7 dnů před použitím.

4.5	Rozpouštědlo připravené smícháním stejných objemů cyklohexanu a kyseliny octové.

4.6	Wijsovo činidlo, obsahující jodmonochlorid v kyselině octové. Doporučuje se použít Wijsovo činidlo obchodně dostupné. Poznámka:Činidlo obsahuje 9 g ICl3 + 9 g I v kyselině octové.

5.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Běžné laboratorní vybavení, a zejména:

5.1	Skleněná váženka, odpovídající hmotnosti zkušebního vzorku a hodící se do baňky (5.2).

5.2	Erlenmeyerovy baňky na 500 ml se skleněnou zabroušenou zátkou, dokonale vysušené.

6.   PŘÍPRAVA ZKUŠEBNÍHO VZORKU

Homogenizovaný vzorek se vysuší síranem sodným a přefiltruje.

7.   POSTUP ZKOUŠKY

7.1

Zkušební vzorek Hmotnost zkušebního vzorku se liší podle očekávaného jodového čísla, viz tabulka 1. Tabulka 1 Očekávané jodové číslo Hmotnost zkušebního vzorku v g Méně než 5 3,00 5 až 20 1,00 21 až 50 0,40 51 až 100 0,20 101 až 150 0,13 151 až 200 0,10 Zkušební vzorek se navažuje s přesností 0,1 mg do skleněné váženky (5.1).

7.2

Stanovení Váženka se zkušebním vzorkem se vloží do 500ml baňky (6.2). Přidá se 20 ml rozpouštědla (4.5), a tuk se rozpustí. Přidá se přesně 25 ml Wijsova činidla (4.6), baňka se uzavře zátkou, obsah se promíchá a baňka se umístí na tmavé místo. Pipetování Wijsova činidla se neprovádí ústy. Stejným způsobem se připraví slepý pokus s přídavkem rozpouštědla a Wijsova činidla, ale vynechá se zkušební vzorek. Pro vzorky s jodovým číslem nižším než 150 se baňka ponechá 1 hodinu v temnotě, pro vzorky s jodovým číslem nad 150, pro polymerované výrobky a výrobky ve značné míře oxidované je nutno dobu prodloužit na 2 hodiny. Po této době se do každé baňky přidá 20 ml roztoku jodidu draselného (4.2) a 150 ml vody (4.1). Obsah baňky se titruje standardním odměrným roztokem thiosíranu sodného (4.4), dokud téměř nezmizí žluté zbarvení jodu. Potom se přidá několik kapek škrobového roztoku (4.3) a pokračuje se v titraci, dokud po intenzivním protřepání nezmizí modré zabarvení. Poznámka:Připouští se stanovení bodu ekvivalence potenciometrickou indikací.

7.3	Počet stanovení Z jednoho zkušebního vzorku se provádějí dvě stanovení.

8.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Jodové číslo se vypočítá podle vzorce:

kde

c

=

přesná koncentrace standardního odměrného roztoku thiosíranu sodného (4.4) v mol/l,

V1

=

objem použitého standardního odměrného roztoku thiosíranu sodného (4.4) na slepý pokus v ml,

V2

=

objem použitého standardního odměrného roztoku thiosíranu sodného (4.4) pro vlastní stanovení v ml,

m

=

hmotnost zkušebního vzorku v g (7.1).

Jako výsledek se uvádí aritmetický průměr dvou stanovení za předpokladu, že je splněna podmínka opakovatelnosti.

▼M11

---

PŘÍLOHA XVII

METODA PRO STANOVENÍ STIGMASTADIENOLŮ V ROSTLINNÝCH OLEJÍCH

1.   ÚČEL

Stanovení stigmastadienolů v rostlinných olejích obsahujících nízké koncentrace těchto uhlovodíků, zejména v panenském olivovém oleji a surovém olivovém oleji z pokrutin.

2.   OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato norma může být použita pro všechny rostlinné oleje, ačkoliv měření jsou spolehlivá jedině tehdy, leží-li obsah těchto uhlovodíků mezi 0,01 a 4,0 mg/kg. Metoda je obzvlášť vhodná pro zjišťování přítomnosti rafinovaných rostlinných olejů (olivového oleje, olivového oleje z pokrutin, slunečnicového oleje, palmového oleje atd.) v panenském olivovém oleji, protože na rozdíl od panenských olejů rafinované oleje obsahují stigmastadienoly.

3.   PODSTATA METODY

Izolace nezmýdelnitelného extraktu. Separace steroidové uhlovodíkové frakce kolonovou chromatografií na silikagelu a analýza pomocí kapilární plynové chromatografie.

4.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

4.1	250 ml baňky pro použití se zpětným chladičem.

4.2	Dělicí nálevky na 500 ml.

4.3	100 ml baňky s kulatým dnem.

4.4	Rotační odpařovač.

4.5

Skleněná chromatografická kolona (vnitřní průměr 1,5 až 2,0 cm, délka 50 cm) s teflonovým kohoutem a se dnem se zátkou ze skelné vaty nebo s kotoučem ze sintrovaného skla. Za účelem připravení silikagelové kolony se do chromatografické kolony nalije hexan do výšky přibližně 5 cm a poté se kolonu naplní suspenzí tvořenou 15 g silikagelu a ve 40 ml hexanu pomocí dávek hexanu. Nechá se úplně usadit pomocí mírných vibrací. Přidá se bezvodý síran sodný do výšky přibližně 0,5 cm a nadbytečný hexan se nakonec eluuje.

4.6	Plynový chromatograf s plameno-ionizačním detektorem, vstřikovacím systémem pro nástřik pomocí děliče nebo studeným vstřikovacím systémem typu on-column a termostatickou komorou, nastavitelnou na požadovanou teplotu s přesností ± 1 °C.

4.7	Kapilární kolona z taveného křemene pro plynovou chromatografii (vnitřní průměr 0,25 nebo 0,32 mm, délka 25 m) potažená 5 % fenylmethylsilikonem o tloušťce filmu 0,25 mm. Poznámka 1: Mohou být použity jiné kolony s podobnou nebo nižší polaritou.

4.8	Zapisovač s integrátorem s možností integrace mezi dvěma minimálními hodnotami.

4.9	Mikrostříkačka na 5 až 10 ml pro plynovou chromatografii opatřená tvrzenou jehlou.

4.10	Elektrický ohřívací plášť nebo topná deska.

5.   ČINIDLA

Všechna činidla musí být čistoty p. a., není-li uvedeno jinak. Používá se destilovaná voda nebo voda přinejmenším ekvivalentní čistoty.

5.1	Hexan nebo směs alkanů s bodem varu v rozmezí od 65 do 70 °C, destilované v rektifikační koloně. Poznámka 2: Rozpouštědlo musí být destilováno za účelem odstranění nečistot.

5.2	96 % ethanol (V/V).

5.3	Bezvodý síran sodný.

5.4	10 % alkoholový roztok hydroxidu draselného. 10 ml vody se přidá k 50 g hydroxidu draselného, zamíchá se a doplní se ethanolem na objem 500 ml. Poznámka 3: Stáním alkoholový uhličitan draselný hnědne. Měl by být připraven každý den čerstvý a uchováván v dobře uzavřených lahvích z tmavého skla.

5.5

Silikagel 60 pro kolonovou chromatografii, s velikostí částic 70-230 mesh (Merck, č. zboží 7734 apod.). Poznámka 4: Obvykle může být silikagel použit přímo z balení bez jakéhokoli úpravy. Některé šarže silikagelu však mohou vykazovat nízkou aktivitu, která vede k neuspokojivým chromatografickým separacím. V takových případech je nutno postupovat takto: silikagel se aktivuje nejméně 4hodinovým zahříváním na teplotu 550 °C. Po zahřátí se silikagel vloží do exsikátoru a po vychladnutí se převede do uzavíratelné baňky. Přidá se 2 % vody a protřepává se, dokud nezmizí hrudky a dokud se prášek volně nepřesýpá. Šarže silikagelů, jejichž výsledkem jsou chromatogramy se vzájemně se překrývajícími píky, je nutno upravit výše uvedeným způsobem. Jinou alternativou může být použití extra čistého silikagelu 60 (Merck, č. zboží 7754).

5.6	Zásobní roztok (200 ppm) cholesta-3, 5-dienu (Sigma, 99 % čistoty) v hexanu (10 mg v 50 ml).

5.7	Standardní roztok cholesta-3, 5-dienu v hexanu o koncentraci 20 ppm získaný naředěním výše uvedeného roztoku. Poznámka 5: Roztoky 5.6 a 5.7 uchovávané při teplotě do 4 °C jsou stabilní po dobu nejméně čtyř měsíců.

5.8	Roztok n-nonakosanu v hexanu o koncentraci přibližně 100 ppm.

5.9	Nosný plyn pro chromatografii: helium nebo vodík o 99,9990 % čistotě.

5.10	Pomocné plyny pro plameno-ionizační detektor: vodík o 99,9990 % čistotě a čistý vzduch.

6.   POSTUP

6.1   Příprava nezmýdelnitelných látek

6.1.1

Do 250ml baňky (4.1) se naváží 20 ± 0, 1 g oleje, přidá se 1 ml standardního roztoku cholesta-3, 5-dienu (20 μg) a 75 ml 10 % alkoholového roztoku hydroxidu draselného, připojí se zpětný chladič a zahřívá se na mírný var po dobu 30 minut. Baňka obsahující vzorek se odstraní ze zdroje tepla a roztok se nechá mírně vychladnout (nenechá se vychladnout úplně, protože vzorek by se usadil). Přidá se 100 ml vody a roztok se převede do dělící nálevky (4.2) pomocí 100 ml hexanu. Směs se po 30 sekund energicky protřepe a nechá se stát až do separace fází. Poznámka 6: Pokud vznikne emulze, která hned znovu nezmizí, přidávají se malá množství ethanolu.

6.1.2

Spodní vodná fáze se převede do druhé dělící nálevky a znovu se extrahuje 100 ml hexanu. Spodní fáze se nechá znovu vypustit a hexanové extrakty (smíchané v jiné dělící nálevce) se třikrát properou pokaždé 100 ml směsi ethanolu a vodu (1:1), dokud se nedocílí neutrální hodnoty pH.

6.1.3

Hexanový roztok se nechá projít bezvodým síranem sodným (50 g), propere se 20 ml hexanu a odpaří se v rotačním odpařovači do sucha při 30 °C a za sníženého tlaku.

6.2   Separace steroidové uhlovodíkové frakce

6.2.1

Zbytek se převede do rektifikační kolony pomocí dvou 1ml množství hexanu, vzorek se zavede do kolony tak, že se hladina roztoku nechá poklesnout na úroveň síranu sodného, a zahájí se chromatografická eluce s hexanem s rychlostí průtoku přibližně 1 ml/min. Prvních 25 až 30 ml eluátu se vyhodí a použije se dalších 40 ml frakce. Tato frakce se převede do 100ml baňky s kulatým dnem (4.3). Poznámka 7: První frakce obsahuje nasycené uhlovodíky (obrázek 1a) a druhá frakce steroidové uhlovodíky. Další eluce poskytuje squalen a příbuzné sloučeniny. Pro dosažení dobré separace nasycených a steroidových uhlovodíků je nutná optimalizace objemů frakcí. Za tímto účelem je nutno objem první frakce upravit tak, aby při analýze druhé frakce byly píky reprezentující nasycené uhlovodíky nízké (viz obrázek 1c). Pokud se žádné takové píky neobjeví, avšak standardní píky mají zároveň pouze omezenou velikost, je třeba objem první frakce snížit. Úplná separace složek první a druhé frakce navíc není nutná, poněvadž během analýzy plynovou chromatografií za podmínek popsaných v bodě 6.3.1 nedochází k žádnému překrývání píků. Optimalizace objemu druhé frakce není zpravidla nutná, protože další složky se dobře separují. Nicméně přítomnost většího píku s retenčním časem přibližně o 1,5 minuty nižším než u standardu je způsobena squalenem a svědčí o špatné separaci.

6.2.2

Druhá frakce se zcela odpaří v rotačním odpařovači při 30 °C v mírném vakuu a zbytek se rozpustí neprodleně v 0,2 ml hexanu. Roztok se až do analýzy uchovává v ledničce. Poznámka 8: Zbytky 6.1.3 a 6.2.2 by neměly být přechovávány v suchém stavu a při pokojové teplotě. Jakmile jsou zbytky získány, je nutno k nim přidat neprodleně rozpouštědla a roztoky uchovávat v ledničce.

6.3   Plynová chromatografie

6.3.1

Pracovní podmínky pro nástřik pomocí děliče: — teplota vstřikovací komůrky: 300 °C, — teplota detektoru: 320 °C, — integrátor se zapisovačem: parametry pro integraci by měly být zvoleny tak, aby se správně určily plochy píků. Doporučuje se integrace mezi dvěma minimy, — citlivost: zhruba 16násobek nejmenšího útlumu, — množství nastříknutého roztoku: 1 μl roztoku, — programu termostatu: 6minutová izoterma o hodnotě 235 °C, potom nárůst na teplotu 285 °C rychlostí 2 °C/min, — vstřikovací komůrka s rozdělovačem toku (dělicí poměr 1:15), — nosný plyn: helium nebo vodík o tlaku asi 120 kPa. Tyto podmínky mohou být upraveny podle specifikací chromatografu a kolony tak, aby poskytly chromatogramy splňující následující podmínky: pík vnitřního standardu se musí objevit během pěti minut před, nebo po čase uvedeném v bodu 6.3.2 a musí dosáhnout nejméně 80 % plného rozsahu stupnice. Systém plynové chromatografie je nutno přezkoušet nástřikem směsi zásobního roztoku cholestadienu (5.6) a roztoku n-nonakosanu (5.8). Pík cholesta-3, 5-dienu se musí objevit dříve, než pík n-nonakosanu (obrázek 1c). Pokud se neobjeví, je možno snížit teplotu termostatu a/nebo nahradit kolonu pro plynovou chromatografii kolonou s nižší polaritou.

6.3.2

Identifikace píků Pík vnitřního standardu se objeví přibližně za 19 minut a píky stigmastadienolů s relativním retenčním časem přibližně 1,29 (viz obrázek 1b). Stigmasta-3, 5-dien se objevuje s malými množstvími izomeru a obvykle se obě tyto látky eluují současně jako jediný pík. Je-li však kolona příliš polární nebo vykazuje-li vysokou rozlišovací schopnost, může se izomer objevit jako malý pík těsně před píkem stigmasta-3, 5-dienu (obrázek 2). Aby byla zajištěna eluce stigmastadienolů jako jednoho píku, doporučuje se nahradit kolonu kolonou s nižší polaritou, nebo kolonou s větším vnitřním průměrem. Poznámka 9: Referenční chromatogram pro stigmastadienoly je možné získat analýzou rafinovaných rostlinných olejů s použitím menšího vzorku (1 až 2 g). Stigmastadienoly vytvářejí nápadný a snadno identifikovatelný pík.

6.3.3

Kvantitativní analýza Obsah stigmastadienolů se stanoví podle vzorce: mg/kg stigmastadienolů = kde: As = plochy píků stigmastadienolů (jestliže je pík rozdělen, součet ploch obou izomerů), Ac = plochy píků vnitřního standardu (cholestadienu), Mc = hmotnost přidaného standardu v mikrogramech, Mo = hmotnost navážených olejů v gramech. Detekční limit: asi 0,01 mg/kg.

Obrázek č. 1

Plynové chromatogramy vzorků olivového oleje analyzovaných v kapilární koloně z taveného křemene (vnitřní průměr 0,25 mm, délka 25 m) potažené 5 % fenylmethylsilikonem o tloušťce filmu 0,25 μm.

Obrázek č. 2

Plynový chromatogram získaný ze vzorku rafinovaného olivového oleje analyzovaného na koloně DB-5, vykazující izomer stigmasta-3, 5-dienu.

▼M25

---

PŘÍLOHA XVIII

STANOVENÍ ROZDÍLU MEZI SKUTEČNÝM A TEORETICKÝM OBSAHEM TRIACYLGLYCEROLŮ S EKVIVALENTNÍM POČTEM UHLÍKOVÝCH ATOMŮ 42 (ECN 42)

1.   OBLAST PŮSOBNOSTI

Stanovení absolutního rozdílu mezi experimentálními hodnotami triacylglycerolů (TAG) s ekvivalentním počtem atomů uhlíku 42, které byly v oleji stanoveny vysoce účinnou kapalinovou chromatografií (ECN42HPLC), a teoretickou hodnotou TAG s ekvivalentním počtem atomů uhlíku 42 vypočtenou ze složení mastných kyselin (ECN 42teoretická).

2.   OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda je použitelná pro olivové oleje. Metoda je použitelná pro určení přítomnosti malých množství semenného oleje (bohatého na linoleovou kyselinu) v olivových olejích všech tříd.

3.   PRINCIP

Obsah triacylglycerolů ECN42 stanovený analyticky pomocí HPLC a teoretický obsah triacylglycerolů ECN42 (vypočítaný ze stanovení složení mastných kyselin pomocí GLC) odpovídá v jistém rozmezí pravému olivovému oleji. Pokud je rozdíl větší, než hodnoty přijaté pro každý druh oleje, znamená to, že olej obsahuje semenné oleje.

4.   METODA

Metoda výpočtu teoretického obsahu triacylglycerolů s ECN 42 a rozdílu od údajů získaných HPLC je v podstatě provedená kombinací analytických údajů získaných jinými metodami. Dala by se rozdělit do tří fází: stanovení složení mastných kyselin kapilární plynovou chromatografií, výpočet teoretického složení triacylglycerolů s ECN 42, stanovení triacylglycerolů s ECN 42 pomocí HPLC.

4.1    Přístroje a pomůcky

4.1.1

Baňky s kulatým dnem (250 ml a 500 ml)

4.1.2

Kádinky (100 ml)

4.1.3

Skleněná chromatografická kolona o vnitřním průměru 21 mm, délce 450 mm, s kohoutem a standardně ukončená na horním konci spojkou s vnitřním zábrusem

4.1.4

Dělicí nálevky (250 ml) s normalizovaným kohoutem na spodu kužele, vhodné ke spojení s horní částí kolony

4.1.5

Skleněná tyčinka o délce 600 mm

4.1.6

Skleněná nálevka o průměru 80 mm

4.1.7

Odměrné baňky (50 ml)

4.1.8

Odměrné baňky (20 ml)

4.1.9

Rotační odparka

4.1.10

Vysoce účinný kapalinový chromatograf s termostatickou regulací teploty kolony

4.1.11

Dávkovače na nástřik 10 μl dávek

4.1.12

Detektor: diferenciální refraktometr; schopnost měření v rozsahu nejméně 10–4 jednotky refrakčního indexu

4.1.13

Kolona: korozivzdorná trubice o délce 250 mm a vnitřním průměru 4,5 mm plněná silikagelem o průměru částic 5 μm a obsahu uhlíku ve formě oktadecylsilanu 22 % až 23 %

4.1.14

Programové vybavení pro zpracování dat

4.1.15

Nádobky (přibližně 2 ml) se septy potaženými teflonem a šroubovými uzávěry

4.2    Činidla

Reakční činidla by měla být analytické čistoty. Eluční rozpouštědla by měla být odplyněna a mohou být několikrát recyklována, aniž by ovlivnila separaci.

4.2.1

Petrolether pro chromatografii (40–60 °C) nebo hexan

4.2.2

Čerstvě destilovaný diethylether bez peroxidu

4.2.3

Eluční rozpouštědla pro čištění oleje směsí petroletheru/diethyletheru 87/13 (v/v) pro sloupcovou chromotografii

4.2.4

Silikagel typu Merck 7734 o velikosti částic 70–230 s normalizovaným obsahem vody 5 % hmotnostních

4.2.5

Skelná vata

4.2.6

Aceton pro HPLC

4.2.7

Acetonitril nebo propionitril pro HPLC

4.2.8

Eluční rozpouštědlo pro HPLC: acetonitril + aceton (poměr se upraví podle požadované separace; začíná se se směsí o poměru 50:50) nebo propionitril

4.2.9

Solubilizační rozpouštědlo: aceton

4.2.10

Referenční triglyceridy: mohou se použít komerční triglyceridy (tripalmitin, triolein atd.); retenční časy se pak vynesou podle ekvivalentního počtu atomů uhlíku, nebo se mohou použít referenční chromatogramy pro sojový olej, směs sojového oleje a olivového oleje v poměru 30:70 a olivový olej (viz poznámky 1 a 2 a obrázky 1 až 4).

4.2.11

Kolonka (6 ml) pro extrakci na pevnou fázi se silikagelem (1 g)

4.3    Příprava vzorků

Vzhledem k celé řadě rušivých látek, které mohou vést k falešným pozitivním výsledkům, musí být vzorek vždy čištěn podle metody 2.507 IUPAC používané pro stanovení polárních sloučenin a tuků na smažení.

4.3.1    Příprava chromatografické kolony

Kolona (4.1.3) se naplní 30 ml elučního rozpouštědla (4.2.3). Pak se dovnitř kolony vsune trochu skelné vaty (4.2.5) a zatlačí se směrem dolů za pomocí skleněné tyčinky (4.1.5).

V 100 ml kádince se rozmíchá 25 g silikagelu (4.2.4) v 80 ml eluční směsi (4.2.3), poté se za pomocí skleněné nálevky (4.1.6) nalije do kolony.

Aby se veškerý silikagel vpravil do kolony, vypláchne se kádinka elučním roztokem a tento podíl se rovněž nalije do kolony.

Otevře se kohout a rozpouštědlo se nechá z kolony eluovat tak dlouho, dokud jeho hladina není přibližně 1 cm nad úrovní silikagelu.

4.3.2    Kolonová chromatografie

Olej se přefiltruje, homogenizuje a případně zbaví vody; poté se do 50 ml odměrné baňky (4.1.7) odváží 2,5 ± 0,1 g oleje s přesností na 0,001 g.

Olej se rozpustí přibližně ve 20 ml elučního rozpouštědla (4.2.3.). Pro snazší rozpouštění se případně lehce zahřeje. Poté se zchladí na pokojovou teplotu a objem se doplní elučním rozpouštědlem.

Za pomocí odměrné pipety se do kolony vpraví 20 ml roztoku připraveného podle bodu 4.3.1, otevře se kohout a rozpouštědlo se nechá eluovat na úroveň silikagelu.

Poté se eluuje 150 ml elučního rozpouštědla (4.2.3); průtok rozpouštědla se nastaví přibližně na 2 ml/min (150 ml projde kolonou přibližně za 60–70 minut).

Eluát se jímá do 250 ml baňky s kulatým dnem (4.1.1) předem vysušené v sušárně a přesně zvážené. Rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku v rotační odparce (4.1.9) a residuum se zváží. Residuum se použije pro přípravu roztoku k analýze HPLC a pro přípravu methylesteru.

Výtěžek vzorku z kolony musí být nejméně 90 % pro kategorie extrapanenský, panenský, rafinovaný a olivový olej, a nejméně 80 % pro lampantový olej a olivový olej z pokrutin.

4.3.3    Přečištění SPE

Silikagelová kolona SPE se aktivuje průchodem 6 ml hexanu (4.2.3) ve vakuu, aby se zabránilo vysušení.

Množství 0,12 g se s přesností na 0,001 g odváží do 2 ml lahviček (4.1.15) a rozpustí se v 0,5 ml hexanu (4.2.3).

Roztok se vlije do kolony SPE a eluuje se ve vakuu s 10 ml roztoku hexan–diethylether (87:13 v/v) (4.2.3).

Shromážděné frakce se odpaří do sucha v rotačním odparce (4.1.9) za sníženého tlaku a při pokojové teplotě. K analýze triacylglycerolů (TAG) se reziduum rozpustí ve 2 ml acetonu (4.2.6).

4.4    Analýza HPLC

4.4.1    Příprava vzorků pro chromatografickou analýzu

5 % roztok analyzovaného vzorku se připraví odvážením 0,5 ± 0,001 g vzorku do a 10 ml odměrné baňky a doplněním solubilizačním rozpouštědlem (4.2.9) na objem 10 ml.

4.4.2    Postup

Nastavení chromatografického systému. Eluční rozpouštědlo (4.2.8) se pumpuje rychlostí 1,5 ml/min, aby se celý systém propláchl. Počká se, až se ustálí základní linie.

Velikost nástřiku vzorku připraveného podle bodu 4.3 je 10 μl.

4.4.3    Výpočet a vyjádření výsledků

Používá se metoda normalizace plochy, tj. předpokládá se, že součet ploch všech píků odpovídajících triacylglycerolům s ECN42 až ECN52 je roven 100 %.

Relativní procentní zastoupení jednotlivých triglyceridů se vypočítá podle vzorce:

.

Výsledky by měly být uvedeny alespoň na dvě desetinná místa.

Viz poznámky 1 až 4.

4.5    Výpočet triacylglycerolového složení (% molární) z údajů o složení mastných kyselin (% plochy)

4.5.1    Stanovení složení mastných kyselin

Složení mastných kyselin se určuje podle ISO 5508 pomocí kapilární kolony. Methylestery se připraví podle COI/T.20/Doc. No 24.

4.5.2    Mastné kyseliny pro výpočet

Glyceridy se seskupují podle ekvivalentního počtu uhlíkových atomů (ECN) a zohledňuje se následná ekvivalence mezi ECN a mastnými kyselinami. V úvahu se berou pouze mastné kyseliny s počtem uhlíkových atomů mezi 16 a 18, protože jedině takové mastné kyseliny jsou významné z hlediska olivového oleje. Mastné kyseliny se normalizují do 100 %.

4.5.3    Převod plochy (%) na moly pro všechny mastné kyseliny (1)

4.5.4    Normalizace molů mastných kyselin na 100 % (2)

Výsledkem je procentní zastoupení každé mastné kyseliny v % molárních ve všech (1,2,3-) polohách triacylglycerolů.

Celkové množství nasycených mastných kyselin (SFA) P a S a nenasycených mastných kyselin (UFA) Po, O, L a Ln se vypočítá:

4.5.5    Výpočet složení mastných kyselin v pozicích 2- a 1,3- triacylglycerolů

Mastné kyseliny jsou rozděleny do tří skupin takto: jedna s polohou 2- a dvě stejné s polohou 1- a 3-, s různými koeficienty pro nasycené kyseliny (P a S) a nenasycené kyseliny (Po, O, L a Ln).

4.5.5.1   Nasycené mastné kyseliny s polohou 2- [P(2) a S(2)]

4.5.5.2   Nenasycené mastné kyseliny s polohou 2- [Po(2), O(2), L(2) a Ln(2)] (5):

4.5.5.3   Mastné kyseliny s polohou 1,3- [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) a Ln(1,3)] (6):

4.5.6    Výpočet triacylglycerolů

4.5.6.1   Triacylglyceroly s jednou mastnou kyselinou (AAA, zde LLL, PoPoPo) (7)

4.5.6.2   Triacylglyceroly se dvěma mastnými kyselinami (AAB, zde PoPoL, PoLL) (8)

4.5.6.3   Triacylglyceroly se třemi různými mastnými kyselinami (ABC, zde OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)

4.5.6.4   Triacylglyceroly s ekvivalentním počtem uhlíkových atomů 42

Triacylglyceroly s ECN42 se vypočítávají podle rovnic 7, 8 a 9 a jsou poté uvedeny v pořadí podle předpokládané eluce při HPLC (obvykle pouze tři píky).

Triacylglyceroly s ECN42 se vyjádří jako součet devíti triacylglycerolů včetně jejich polohových izomerů. Výsledky by měly být uvedeny alespoň na dvě desetinná místa.

5.   HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ

Porovná se vypočtený teoretický obsah a obsah stanovený analýzou HPLC. Pokud je absolutní hodnota rozdílu výsledku z HPLC a výsledku určeného teoreticky vyšší než hodnota stanovená normou pro příslušnou kategorii oleje, vzorek obsahuje semenný olej.

Výsledky se uvádí na dvě desetinná místa.

6.   PŘÍKLAD (ČÍSELNÉ ODKAZY SE VZTAHUJÍ NA ODDÍL TEXTU POPISUJÍCÍ METODU)

— 4.5.1    Výpočet % molárních mastných kyselin z údajů GLC (% normalizované oblasti)

Následující údaje o složení mastných kyselin byly získány pomocí GLC:

— 4.5.3    Převedení plochy (%) na látkové množství (mol) pro všechny mastné kyseliny (viz vzorec (1))

mol P

=

mol S

=

mol Po

=

mol O

=

mol L

=

mol Ln

=

Celkem

=

0,35821 mol TAG

— 4.5.4    Normalizace mastných kyselin (mol) na 100 % (viz vzorec (2))

mol % P(1,2,3)

=

mol % S(1,2,3)

=

mol % Po(1,2,3)

=

mol % O(1,2,3)

=

mol % L(1,2,3)

=

mol % Ln(1,2,3)

=

Celkem % molárních

=

100 %

Součet nasycených a nenasycených mastných kyselin v poloze 1,2,3- TAG (viz vzorec (3):

— 4.5.5    Výpočet složení mastných kyselin v polohách 2- a 1,3- TAG

— 4.5.5.1   Nasycené mastné kyseliny v poloze 2- [P(2) a S(2)] (viz vzorec (4))

— 4.5.5.2   Nenasycené mastné kyseliny v poloze 2- [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) a Ln(1,3)] (viz vzorec (5))

— 4.5.5.3   Mastné kyseliny v poloze 1,3- [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) a Ln(1,3)] (viz vzorec (6))

— 4.5.6    Výpočet triacylglycerolů

Z vypočítaného složení mastných kyselin v polohách 2- a 1,3-:

se vypočítají následující triacylglyceroly:

— 4.5.6.1.   Triacylglyceroly s jednou mastnou kyselinou (LLL, PoPoPo) (viz vzorec (7))

= 0,09706 mol LLL

— 4.5.6.2   Triacylglyceroly se dvěma mastnými kyselinami (PoLL, SLnLn, PoPoL) (viz vzorec (8))

0,03210 mol PoLL

0,00094 mol SLnLn

0,00354 mol PoPoL

— 4.5.6.3   Triacylglyceroly se třemi různými mastnými kyselinami (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) viz vzorec (9)

0,00761 mol PPoLn

0,43655 mol OLLn

0,06907 mol PLLn

0,04812 mol PoOLn

ECN42 = 0,69512 mol TAG

Poznámka 1 Pořadí eluce je možné stanovit výpočtem ekvivalentního počtu atomů uhlíku, často definovaných jako , kde CN je počet atomů uhlíku a n je počet dvojných vazeb. Výpočet může být přesnější, pokud se vezme v úvahu původ dvojné vazby. Pokud jsou no, nl a nln počty dvojných vazeb náležejících olejové, linoleové resp. linolenové kyselině, ekvivalentní počet atomů uhlíku se může vypočítat použitím následujícího vzorce:

kde se koeficienty do, dl a dln mohou vypočítat použitím referenčních triglyceridů. Za podmínek popsaných v této metodě platí přibližně tento vztah:

Poznámka 2 S několika referenčními triglyceridy je rovněž možné vypočítat rozlišení vzhledem k trioleinu:

trioleinza použití sníženého retenčního času

.

Grafické vyjádření závislosti log α na f (počtu dvojných vazeb) umožňuje určit retenční hodnoty všech triglyceridů mastných kyselin obsažených v referenčních triglyceridech – viz obrázek 1.

Poznámka 3 Účinnost kolony by měla umožnit jasné oddělení píku trilinoleinu od píků triglyceridů s blízkým retenčním časem RT. Eluce se zastaví po píku odpovídajícímu ECN 52.

Poznámka 4 Správnost měření ploch píků sledovaných v rámci tohoto stanovení je zajištěna, pokud druhý pík odpovídající ECN 50 je 50 % plného rozsahu záznamové stupnice.

Obrázek 1

Graf závislosti log α na f (počtu dvojných vazeb)

Počet dvojných vazeb

La: laurová kyselina; My: myristová kyselina; P: palmitová kyselina; S: stearová kyselina; O: olejová kyselina; L: linoleová kyselina; Ln: linolenová kyselina

Obrázek 2

Olivový olej s nízkým obsahem linoleové kyseliny

a

Rozpouštědlo: aceton/acetonitril

Profil a: hlavní složky chromatografických píků: ECN42: (1) LLL + PoLL; (2) OLLn + PoOLn; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL + PoOL; (5) OOLn + PLL; (6) POLn + PPoPo; (7) OOL + PoOO; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; (12) PLP; ECN48: (13) OOO + PoPP; (14 + 15) SOL + POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS.

b

Rozpouštědlo: propionitril

Profil b: hlavní složky chromatografických píků: ECN42: (1) LLL; (2) OLLn + PoLL; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL; (5) OOLn + PoOL; (6) PLL + PoPoO; (7) POLn + PPoPo + PPoL; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; (12) PLP; ECN48: (13) OOO + PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS

Obrázek 3

Olivový olej s vysokým obsahem linoleové kyseliny

a)

Rozpouštědlo: aceton/acetonitril (50:50)

Profil a: hlavní složky chromatografických píků: ECN42: (1‘) LLL + PoLL; (2‘) OLLn + PoOLn; (3‘) PLLn; ECN44: (4‘) OLL + PoOL; (5‘) OOLn + PLL; (6‘) POLn + PPoPo; ECN46: (7‘) OOL + PoOO; (8‘) PLO + SLL + PoOP; (9‘) PLP + PoPP; ECN48: (10‘) OOO; (11‘) POO + SLL + PPoO; (12‘) POP + PLS; ECN50: (13‘) SOO; (14‘) POS + SLS

b)

Rozpouštědlo: propionitril

Profil b: hlavní složky chromatografických píků: ECN42: (1) LLL; (2 + 2‘) OLLn + PoLL; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL; (5) OOLn + PoOL; (6) PLL + PoPoO; (7) POLn + PPoPo + PPoL; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; ECN48: (12) PLP; (13) OOO + PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS; ECN52: (19) AOO.

▼M19

---

ANNEX XIX

DETERMINATION OF ALIPHATIC ALCOHOLS CONTENT BY CAPILLARY GAS CHROMATOGRAPHY

1.   OBJECT

The procedure describes a method for the determination of aliphatic alcohols content in oils and fats.

2.   PRINCIPLE OF THE METHOD

The fatty substance, with 1-eicosanol added as internal standard, is saponified with ethanolic potassium hydroxide and then the unsaponifiable matter extracted with ethyl ether. The alcoholic fraction is separated from the unsaponifiable matter by chromatography on a basic silica gel plate; the alcohols recovered from the silica gel are transformed into trimethylsilyl ethers and analysed by capillary gas chromatography.

3.   EQUIPMENT

4.   REAGENTS

5.   PROCEDURE

5.1.   Preparation of the unsaponifiables

5.1.1.

Using a 500 μl microsyringe place, into a 250 ml round-bottom flask, a volume of 0,1 % 1-eicosanol solution in chloroform (4.17) containing a quantity of 1-eicosanol approximately equal to 10 % of the aliphatic alcohols content in that portion of sample to be taken for analysis. For example, to 5 g of sample add 250 μl of the 0,1 % 1-eicosanol solution if olive oil and 1 500 μl if olive pomace oil. Evaporate to dryness in current of nitrogen and then weigh accurately 5 g of the dry filtered sample into the same flask.

5.1.2.

Add 50 ml of 2 N potassium hydroxide ethanolic solution, fit the reflux condenser and heat the apparatus to slight boiling on a steam bath, stirring continuously throughout the heating process until saponification has taken place (the solution becomes clear). Continue heating for a further 20 minutes and then add 50 ml of distilled water through the condenser. The condenser is then disconnected and the flask cooled to approximately 30 °C.

5.1.3.

The contents of the flask are quantitatively transferred to a separating funnel of 500 ml capacity by adding distilled water several times, using a total of around 50 ml distilled water. Add approximately 80 ml of ethyl ether, shake vigorously for approximately 30 seconds and allow to settle (Note 1). Separate off the lower aqueous phase collecting it in a second separating funnel. Two further extractions are effected on the aqueous phase, in the same manner, using each time 60 to 70 ml ethyl ether. Note 1: Emulsions may be eliminated by adding, using as a spray, small quantities of ethyl alcohol or methyl alcohol.

5.1.4.

The ethyl ether extracts are combined in a separating funnel and washed with distilled water (50 ml at a time) until the washing water gives a neutral reaction. Discard the washing water, dry with anhydrous sodium sulphate and filter, into a flask of 250 ml capacity which has been weighed beforehand, the funnel and filter being washed with small quantities of ethyl ether which are added to the total.

5.1.5.

Distil the ether down to a few ml, then bring to dryness under a slight vacuum or in a current of nitrogen, completing drying in an oven at 100 °C for approximately a quarter of an hour, and then weigh after cooling in a desiccator.

5.2.   Separation of alcoholic fractions

5.2.1.

Preparation of basic TLC plates: the silica gel plates (4.4) are immersed completely, in 0,2 N potassium hydroxide solution (4.5) for 10 seconds, and then left to dry for two hours under an extractor hood and finally placed in an oven at 100 °C for one hour. Remove from the oven and keep in a calcium chloride desiccator until required for use (plates treated in this way must be used within 15 days). Note 2: When basic silica gel plates are used to separate the alcoholic fraction there is no need to treat the unsaponifiables with alumina. It follows that all acid compounds (fatty acids and others) are retained at the origin thereby obtaining both aliphatic alcohol and terpenic alcohol bands which are both separated distinctly from the sterol band.

5.2.2.

Place a 65/35 by volume hexane/ethyl ether mixture in the plate-developing chamber to a depth of approximately 1 cm ( 8 ). Close the chamber using an appropriate cover and leave for half an hour to allow equilibration between vapour and liquid. Strips of filter paper dipping into the eluent may be affixed to the inside surfaces of the tank to reduce the development time by approximately one third and obtain more uniform, regular elution of the components. Note 3: The developing solution must be replaced for each analysis in order to obtain reproducible developing conditions.

5.2.3.

An approximately 5 % solution of unsaponifiable matter (5.1.5) in chloroform is prepared and 0,3 ml of the solution is streaked as a uniform strip of minimum thickness, using the 100 μl microsyringe, on a TLC plate at approximately 2 cm from the bottom of the TLC plate. Aligned with the origin, 2 to 3 μl of the aliphatic alcohols reference solution (4.11) are spotted for the identification of the aliphatic alcohols band after development has been completed.

5.2.4.

Place the plate inside the development tank as stated in 5.2.2. The ambient temperature should be maintained between 15 and 20 °C. Immediately close the chamber with the cover and allow to elute until the solvent front reaches approximately 1 cm from the upper edge of the plate. The plate is then removed from the development chamber and the solvent evaporated under a hot air current or the plate is left for a while under the extractor hood.

5.2.5.

The plate is sprayed lightly and evenly with the solution of 2', 7'-dichlorofluorescein when the plate is observed under ultra violet light. The aliphatic alcohols band can be identified through being aligned with the stain obtained from the reference solution: mark the limits of the band with a black pencil; outlining the band of aliphatic alcohols and the band immediately above that, which is the terpenic alcohols band, together. Note 4: The aliphatic alcohols band and the terpenic alcohols band are to be grouped together in view of the possible migration of some aliphatic alcohols into the triterpenic alcohols band.

5.2.6.

Using a metal spatula scrape off the silica gel in the marked area. Place the finely comminuted material removed into the filter funnel (3.7). Add 10 ml of hot chloroform, mix carefully with the metal spatula and filter under vacuum, collecting the filtrate in the conical flask (3.8) attached to the filter funnel. Wash the pomace in the flask three times with ethyl ether (approximately 10 ml each time) collecting the filtrate in the same flask attached to the funnel. Evaporate the filtrate to a volume of 4 to 5 ml, transfer the residual solution to the previously weighed 10 ml test tube (3.9), evaporate to dryness by mild heating in a gentle flow of nitrogen, make up again using a few drops of acetone, evaporate again to dryness, place in an oven at 105 °C for approximately 10 minutes and then allow to cool in a desiccator and weigh. The pomace inside the test tube is composed of the alcoholic fraction.

5.3.   Preparation of the trimethylsilyl ethers

5.3.1.

The reagent for silylation, consisting of a mixture of 9:3:1 by volume (Note 5) of pyridine-hexamethyldisilazane-trimethylchlorosilane in the proportion of 50 μl for each milligram of aliphatic alcohols, is added to the test tube containing the alcoholic fraction, avoiding all absorption of moisture (Note 6). Note 5: Solutions which are ready for use are available commercially. Other silanising reagents such as, for example, bis-trimethylsilyl, trifluor acetamide + 1 % trimethyl chlorosilane, which has to be diluted with an equal volume of anhydrous pyridine, are also available. Note 6: The slight opalescence which may form is normal and does not cause any interference. The formation of a white floc or the appearance of a pink colour are indicative of the presence of moisture or deterioration of the reagent. If these occur the test must be repeated.

5.3.2.

Stopper the test tube, shake carefully (without overturning) until the aliphatic alcohols are completely dissolved. Stand for at least 15 minutes at ambient temperature and then centrifuge for a few minutes. The clear solution is ready for gas chromatographic analysis.

5.4.   Gas chromatography analysis

5.4.1.   Preliminary operations, column packing

5.4.1.1.

Fit the column in the gas chromatograph, attaching the inlet end to the injector connected to the splitting system and the outlet end to the detector. Carry out a general check of the gas chromatography assembly (tightness of gas fittings, efficiency of the detector, efficiency of the splitting system and of the recording system, etc.).

5.4.1.2.

If the column is being used for the first time it is recommended that it should be subjected to conditioning. A little carrier gas is passed through the capillary column and then the gas chromatography assembly is switched on and gradually heated until a temperature not less than 20 °C above the operating temperature (see Note 7) is attained. That temperature is held for not less than two hours and then the assembly is brought to the operating conditions (regulation of gas flow, split flame ignition, connection to the electronic recorder, adjustment of the temperature of the capillary column oven, the detector and the injector, etc.) and the signal is adjusted to a sensitivity not less than twice the highest level contemplated for the execution of the analysis. The course of the base line must be linear, without peaks of any kind, and must not drift. A negative straight-line drift indicates leakage from the column connections; a positive drift indicates inadequate conditioning of the column. Note 7: The conditioning temperature shall be at least 20 °C less than the maximum temperature contemplated for the liquid phase employed.

5.4.2.   Choice of operating conditions

5.4.3.   Analytical procedure

5.4.4.   Peak identification

The identification of individual peaks is effected according to the retention times and by comparison with the standard TMSE mixture, analysed under the same conditions.

A chromatogram of the alcoholic fraction of a virgin olive oil is shown in Figure 1.

5.4.5.   Quantitative evaluation

6.   EXPRESSION OF THE RESULTS

The contents of the individual aliphatic alcohols in mg/1 000 g of fatty substance and the sum of the ‘total aliphatic alcohols’ are reported.

---

APPENDIX

Determination of the linear velocity of the gas

1 to 3 μl of methane or propane are injected into the gas chromatograph set at normal operating conditions and the time taken for the methane or propane to flow through the column from the instant of injection to the instant the peak elutes (tM) is measured using a stop clock.

The linear velocity in cm/s is given by L/tM, where L is the length of the column in centimetres and tM is the measured time in seconds.

Figure 1 — Chromatogram of the alcoholic fraction of virgin oil

1

=

Eicosanol

2

=

Decosanol

3

=

Tricosanol

4

=

Tetracosanol

5

=

Pentacosanol

6

=

Hexacosanol

7

=

Heptacosanol

8

=

Octacosanol

▼M23

---

PŘÍLOHA XX

Metoda stanovení obsahu vosků, methylesterů mastných kyselin a ethylesterů mastných kyselin kapilární plynovou chromatografií

1.   ÚČEL

Tato metoda slouží ke stanovení obsahu vosků, methylesterů mastných kyselin a ethylesterů mastných kyselin v olivových olejích. Jednotlivé vosky a alkylestery jsou separovány podle počtu atomů uhlíku. Metoda je doporučeným nástrojem pro rozlišení mezi olivovým olejem a olivovým olejem z pokrutin a stanoví jakostní parametr pro extra panenský olivový olej, což umožňuje rozeznat podvodně smíchané extra panenské olivové oleje s oleji nižší kvality, ať už se jedná o panenské, lampantové či jiné dezodorizované oleje.

2.   PODSTATA METODY

K oleji se přimísí vhodný vnitřní standard a poté se provádí chromatografická frakční destilace na hydratované silikagelové koloně. Získaná frakce eluovaná při testovacích podmínkách (jejíž polarita je menší než polarita triglyceridů) se přímo analyzuje pomocí kapilární plynové chromatografie.

3.   ZAŘÍZENÍ

3.1.	Kónická 25ml baňka.

3.2.	Skleněná kolona pro kapalnou chromatografii o vnitřním průměru 15 mm a délce 30 až 40 cm vybavená vhodným kohoutem.

3.3.

Plynový chromatograf, vhodný pro použití s kapilární kolonou a vybavený systémem pro přímý nástřik na kolonu, obsahující následující části: 3.3.1. termostaticky ovládatelná kolonová komora s nastavitelnou teplotou; 3.3.2. studené nástřikové zařízení pro přímé zavádění do kolony; 3.3.3. plameno-ionizační detektor a konverzní zesilovač; 3.3.4. integrátor se zapisovačem (poznámka 1), vhodný pro provoz s konverzním zesilovačem (bod 3.3.3), s rychlostí odezvy nižší než 1 sekunda a s nastavitelnou rychlostí posunu papíru; Poznámka 1:  Jsou-li data plynové chromatografie zadávána do počítače, lze také použít počítačem řízené systémy. 3.3.5. kapilární kolona z taveného křemene (pro analýzu vosků, methylesterů a ethylesterů), dlouhá 8 až 12 m s vnitřním průměrem 0,25 až 0,32 mm, obsahující kapalnou fázi (poznámka 2), o jednotné tloušťce 0,10 až 0,30 μm; Poznámka 2:  Pro tento účel jsou k dispozici vhodné komerční kapalné fáze, např. SE52, SE54 atd.

3.4.	mikrostříkačka na 10 μl pro přímý vstřik do kolony opatřená tvrzenou jehlou;

3.5.	elektrický vibrátor;

3.6.	rotační odparka;

3.7.	muflová pec;

3.8.	analytická váha pro vážení s přesností ± 0,1 mg;

3.9.	běžné laboratorní sklo.

4.   ČINIDLA

4.1.	Silikagel, 60–200 μm mesh. Silikagel se umístí alespoň na čtyři hodiny do muflové pece o teplotě 500 °C. Nechá se ochladit a přidají se 2 % vody v závislosti na množství použitého silikagelu. Řádným protřepáním se směs homogenizuje a před použitím se ponechá nejméně 12 hodin v exsikátoru.

4.2.

N-hexan čistoty pro chromatografii nebo pro residuální analýzu (čistota musí být kontrolována). POZOR! - Výpary se mohou vznítit. Chraňte před zdroji tepla, jiskrami či přímým plamenem. Ujistěte se, že jsou láhve vždy řádně uzavřeny. Při použití zajistěte řádné větrání. Zabraňte hromadění výparů a eliminujte veškeré příčiny možného vzniku požáru, jako jsou topná tělesa a elektrická zařízení, jež nejsou vyrobena z nehořlavého materiálu. Vdechnutí je škodlivé, neboť může dojít k poškození nervových buněk. Zabraňte vdechnutí výparů. V případě nutnosti použijte vhodný respirační přístroj. Zabraňte styku s očima a s pokožkou.

4.3.

Ethylether pro chromatografii POZOR! - Vysoce hořlavý a mírně jedovatý. Dráždí pokožku. Vdechnutí je škodlivé. Může způsobit poškození zraku. Účinky mohou být opožděné. Může vytvářet výbušné peroxidy. Výpary se mohou vznítit. Chraňte před zdroji tepla, jiskrami či přímým plamenem. Ujistěte se, že jsou láhve vždy řádně uzavřeny. Při použití zajistěte řádné větrání. Zabraňte hromadění výparů a eliminujte veškeré příčiny možného vzniku požáru, jako jsou topná tělesa a elektrická zařízení, jež nejsou vyrobena z nehořlavého materiálu. Neodpařujte do sucha nebo téměř do sucha. Přidání vody nebo vhodného redukčního prvku může omezit tvorbu peroxidů. Nepijte. Zabraňte vdechnutí výparů. Zabraňte dlouhotrvajícímu či opakovanému styku s pokožkou.

4.4.

N-heptan čistoty pro chromatografii nebo isooktan. POZOR! - Hořlavý. Vdechnutí je škodlivé. Chraňte před zdroji tepla, jiskrami či přímým plamenem. Ujistěte se, že jsou láhve vždy řádně uzavřeny. Při použití zajistěte řádné větrání. Zabraňte vdechnutí výparů. Zabraňte dlouhotrvajícímu či opakovanému styku s pokožkou.

4.5.	Standardní roztok 0,05 % (m/V) laurylcharidátu (poznámka 3) v heptanu (vnitřní standard pro vosky). Poznámka 3:  Lze také použít palmityl-palmitát, myristyl-stearát či arachidyl-laureát.

4.6.	Standardní roztok 0,02 % (m/V) methylheptakaprinátu v heptanu (vnitřní standard pro methylestery a ethylestery).

4.7.	Sudan 1 (1-fenylazo-2-naftol).

4.8.

Nosný plyn: vodík či helium, čistý pro plynovou chromatografii. POZOR! Vodík. Pod tlakem vysoce hořlavý. Chraňte před zdroji tepla, jiskrami, přímým plamenem a uchovávejte mimo dosah elektrických přístrojů z hořlavého materiálu. Ujistěte se, zda je ventil láhve po použití vodíku vždy uzavřen. Používejte vždy s redukčním ventilem. Před otevřením ventilu láhve uvolněte pnutí pružiny redukčního ventilu. Při otvírání ventilu nestůjte před výpustným otvorem láhve. Při použití zajistěte řádné větrání. Nepřepouštějte vodík z jedné láhve do druhé. Nemíchejte plyn v láhvi. Ujistěte se, že láhve nelze převrhnout. Chraňte je před slunečním světlem a před zdroji tepla. Skladujte v nekorozivním prostředí. Nepoužívejte poškozené nebo neoznačené láhve. Helium. Vysoce stlačený plyn. Snižuje množství kyslíku pro dýchání. Uchovávejte v zavřené láhvi. Při použití zajistěte řádné větrání. Nevstupujte do skladovacích prostor, pokud nejsou řádně větrány. Používejte vždy s redukčním ventilem. Před otevřením ventilu láhve uvolněte pnutí pružiny redukčního ventilu. Nepřepouštějte plyn z jedné láhve do druhé. Ujistěte se, že láhve nelze převrhnout. Při otvírání ventilu nestůjte před výpustným otvorem láhve. Chraňte je před slunečním světlem a před zdroji tepla. Skladujte v nekorozivním prostředí. Nepoužívejte poškozené nebo neoznačené láhve. Nevdechujte. Používejte výhradně pro technické účely.

4.9.

Pomocné plyny: — Vodík, čistý pro plynovou chromatografii. — Vzduch, čistý pro plynovou chromatografii. POZOR! Vzduch. Vysoce stlačený plyn. Dbejte opatrnosti při použití v přítomnosti hořlavých látek, protože teplota pro samovznícení většiny organických složek vzduchu je při vysokém tlaku znatelně nižší. Ujistěte se, že je ventil láhve po použití vždy uzavřen. Vždy používejte redukční ventil. Před otevřením ventilu láhve uvolněte pnutí pružiny redukčního ventilu. Při otvírání ventilu nestůjte před výpustným otvorem láhve. Nepřepouštějte plyn z jedné láhve do druhé. Nemíchejte plyn v láhvi. Ujistěte se, že láhve nelze převrhnout. Chraňte je před slunečním světlem a před zdroji tepla. Skladujte v nekorozivním prostředí. Nepoužívejte poškozené nebo neoznačené láhve. Vzduch pro technické účely nesmí být vdechován nebo používán v respiračních přístrojích.

5.   POSTUP

5.1.    Příprava chromatografické kolony

15 g silikagelu (bod 4.1) se suspenduje v n-hexanu (bod 4.2) a zavede do kolony (bod 3.2). Po spontánní sedimentaci se tato dokončí pomocí elektrického vibrátoru, aby byla chromatografická vrstva co nejhomogennější. Provede se perkolace 30 ml n-hexanu za účelem odstranění případných nečistot. Do 25ml baňky (bod 3.1) se na analytické váze (bod 3.8) naváží přesně 500 mg vzorku a přidá se vhodné množství vnitřního standardu (bod 4.5) v závislosti na předpokládaném obsahu vosku, např. 0,1 mg laurylcharidátu v případě olivového oleje, 0,25 až 0,5 mg v případě olivového oleje z pokrutin a 0,05 mg methylheptakaprinátu v případě olivových olejů (bod 4.6).

Získaný vzorek se za pomoci dvou dávek 2 ml n-hexanu (bod 4.2) převede do chromatografické kolony.

Umožní se, aby hladina rozpouštědla poklesla tak, aby byla 1 mm nad horní úrovní absorbentu. Perkoluje se další n-hexan/diethyleter (99:1) a odebere se 220 ml při průtoku přibližně 15 kapek za 10 sekund. (Tato frakce obsahuje methylestery, ethylestery a vosky.) (poznámka 4) (poznámka 5)

Získaná frakce se usuší v rotačním odpařovači, až je téměř všechno rozpouštědlo odstraněno. Poslední 2 ml rozpouštědla se odstraní za pomoci slabého proudu dusíku. Odebere se frakce obsahující methylestery a ethylestery tak, že se naředí 2 až 4 ml n-heptanu nebo isooktanu.

5.2.    Plynová chromatografická analýza

5.2.1.    Přípravné práce

Kolona se spojí s plynovým chromatografem (bod 3.3), vstupní port se připojí ke kolonovému systému (on-column system) a výstupní port k detektoru. Poté se plynový chromatograf překontroluje (těsnost plynových vedení, funkce detektoru a záznamníku atd.).

Kolonu, která má být použita poprvé, je nutno nejprve kondicionovat. Kolonou se nechá protékat malé množství nosného plynu, poté se zapne plynový chromatograf. Nechá se postupně zahřívat, dokud není po přibližně čtyřech hodinách dosaženo teploty 350 °C.

Tato teplota se udržuje nejméně dvě hodiny a poté se systém převede do předepsaných podmínek (regulace průtoku plynu, zapálení plamene, připojení elektronického zapisovače (bod 3.3.4), nastavení teploty kolonové komory, detektoru, atd.). Signál se nastaví na citlivost, která činí nejméně dvojnásobek nejvyšší úrovně uvažované pro provedení analýzy. Základní linie záznamu musí být rovná, bez jakýchkoli píků nebo driftů.

Záporné drifty jsou známkou nedokonalé těsnosti spojů kolony, zatímco kladné svědčí o nedostatečné kondicionaci kolony.

5.2.2.    Výběr pracovních podmínek pro vosky, methylestery a ethylestery (poznámka 6).

Všeobecné pracovní podmínky jsou tyto:

—	Teplota kolony : 20 °C/min 5 °C/min počáteční teplota 80 °C (1′) 140 °C 335 °C (20)

—	Teplota detektoru : 350 °C.

—	Množství nastříknuté látky : 1 μl roztoku n-heptanu (2 až 4 ml).

—	Nosný plyn : helium nebo vodík při optimální lineární rychlosti pro zvolený plyn (viz dodatek A).

—	Citlivost přístroje : vhodná pro dosažení výše uvedených podmínek.

Tyto podmínky mohou být upraveny podle charakteristik kolony a plynového chromatografu s cílem oddělit veškeré vosky, methylestery mastných kyselin a ethylestery mastných kyselin a dosáhnout přijatelné separace píků (viz obrázky 2, 3 a 4) a retenčního času vnitřního standardu laurylcharidátu 18 ± 3 minuty. Nejreprezentativnější pík vosků musí dosáhnout 60 % z plného rozsahu, vnitřní standard methylheptakaprinát pro methylestery a ethylestery musí dosáhnout plného rozsahu.

Parametry pro integraci píků se nastaví tak, aby došlo ke správnému vyhodnocení ploch uvažovaných píků.

5.3.    Provedení analýzy

Do 10μl mikrostříkačky se natáhne 10 μl roztoku; píst mikrostříkačky se povytáhne tak, aby se vyprázdnila jehla. Jehla se zavede do vstřikové komory a po jedné nebo dvou sekundách se rychle nastříkne roztok. Přibližně po pěti sekundách se jehla pomalu vytáhne.

Zaznamenávání je prováděno, dokud vosky nebo stigmastadieny nejsou zcela eluovány v závislosti na analyzované frakci.

Základní linie záznamu musí vždy odpovídat požadovaným podmínkám.

5.4.    Identifikace píků

Identifikace jednotlivých píků se provádí podle retenčních časů a porovnáním se směsmi vosků, jejichž retenční časy jsou známy a které byly analyzovány za stejných podmínek. Alkylestery se identifikují ze směsí methylesterů a ethylesterů hlavních mastných kyselin v olivových olejích (palmitová a olejová).

Chromatogram vosků panenského olivového oleje je znázorněn na obrázku 1. Obrázky 2 a 3 zobrazují chromatogramy dvou maloobchodně prodávaných extra panenských olivových olejů, jeden obsahuje methylestery a ethylestery, v druhém obsaženy nejsou. Na obrázku 4 jsou chromatogramy extra panenského olivového oleje nejvyšší třídy a stejného oleje uměle obohaceného 20 % dezodorizovaného oleje.

5.5.    Kvantitativní vyhodnocení vosků

Pomocí integrátoru se vypočítají plochy píků odpovídajících vnitřnímu standardu laurylcharidátu a alifatickým esterům C40 až C46.

Celkový obsah vosků se vypočítá sečtením jednotlivých vosků v mg/kg tukové látky takto:

kde:

Ax

=

plocha píku příslušného esteru vypočtená počítačem

As

=

plocha píku vnitřního standardu laurylcharidátu vypočtená počítačem

ms

=

hmotnost přidaného vnitřního standardu laurylcharidátu v mg;

m

=

hmotnost vzorku použitého pro stanovení v gramech.

5.5.1.    Kvantitativní vyhodnocení methylesterů a ethylesterů

Pomocí integrátoru se vypočítají plochy píků odpovídajících vnitřnímu standardu methylheptakaprinátu, methylesterů mastných kyselin C16 a C18 a ethylesterů mastných kyselin C16 a C18.

Obsah každého alkylesteru v mg/kg tukové látky se vypočítá takto:

kde:

Ax

=

plocha píku příslušného esteru C16 a C18 vypočtená počítačem

As

=

plocha píku vnitřního standardu methylheptakaprinátu vypočtená počítačem

ms

=

hmotnost přidaného vnitřního standardu methylheptakaprinátu v mg;

m

=

hmotnost vzorku použitého pro stanovení v gramech.

6.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Uvádí se souhrn obsahů jednotlivých vosků C40 až C46 (poznámka 7) v mg/kg tukové látky.

Uvádí se souhrn obsahů jednotlivých methylesterů a ethylesterů C16 až C18 a celkový součet methylesterů a ethylesterů.

Výsledky se zaokrouhlují na celé mg/kg.

Uvádí se poměr mezi ethylestery a methylestery.

Obrázek 1

Příklad plynového chromatogramu frakce vosků olivového oleje ( 9 )

Píky methylesterů a ethylesterů mastných kyselin s retenční dobou 5 až 8 minut.

Vysvětlivky:

I.S.

=

(vnitřní standard) Laurylcharidát

1

=

Estery diterpenu

2+2′

=

Estery C40

3+3′

=

Estery C42

4+4′

=

Estery C44

5

=

Estery C46

6

=

Estery sterolů a triterpenické alkoholy

Obrázek 2

Methylestery, ethylestery a vosky v panenském olivovém oleji

Vysvětlivky:

1

–

Methyl C16

2

–

Ethyl C16

3

–

Vnitřní standard methylheptakaprinát

4

–

Methyl C18

5

–

Ethyl C18

6

–

Squalene

7

–

Vnitřní standard laurylcharidát

A

–

Estery diterpenů

B

–

Vosky

C

–

Estery sterolů a triterpenů

Obrázek 3

Methylestery, ethylestery a vosky v extra panenském olivovém oleji

Vysvětlivky:

1

–

Vnitřní standard methylheptakaprinát

2

–

Methyl C18

3

–

Ethyl C18

4

–

Squalen

5

–

Vnitřní standard laurylcharidát

A

–

Estery diterpenů

B

–

Vosky

C

–

Estery sterolů a triterpenů

Obrázek 4

Část chromatogramu extra panenského olivového oleje a stejného oleje uměle obohaceného dezodorizovaným olejem

Vysvětlivky:

1

–

Vnitřní standard methyl-myristát

2

–

Methyl-palmitát

3

–

Ethyl-palmitát

4

–

Vnitřní standard methylheptakaprinát

5

–

Methyl-linoleát

6

–

Methyl-oleát

7

–

Methyl-stearát

8

–

Ethyl-linoleát

9

–

Ethyl-oleát

10

–

Ethyl-stearát

---

Dodatek A

Stanovení lineární rychlosti plynu

Do plynového chromatografu nastaveného na normální pracovní podmínky se nastříkne 1:3 μl methanu (nebo propanu). Pomocí stopek se změří doba průchodu plynu kolonou od počátku vstřiku do okamžiku vzniku píků (tM).

Lineární rychlost proudění v cm/s je dána poměrem L/tM, kde L je délka kolony v cm a tM je čas v sekundách, změřený stopkami.

▼M25

---

PŘÍLOHA XXI

---

( 1 ) Úř. věst. 172, 30.9.1966, s. 3025/66.

( 2 ) Úř. věst. L 353, 17.12.1990, s. 23.

( 3 ) Úř. věst. L 128, 24.5.1977, s. 6.

( 4 ) Úř. věst. L 166, 1.7.1988, s. 10.

( 5 ) Úř. věst. L 228, 1.9.2009, s. 3.

( 6 ) Po eluování esterů sterolů musí být chromatografická linie bez významných píků (triglyceridů).

( 7 ) Posuzovatel může odmítnout ochutnávání oleje, pokud při přímém čichovém vnímání zaznamená, že některý z negativních znaků je extrémně intenzivní. Do profilového listu zaznamená tuto výjimečnou okolnost.

( 8 ) In these cases in particular, a 95/5 by volume benzene/acetone eluent mixture must be used to obtain distinct band separation.

( 9 ) Po eluaci esterů sterolů nesmí chromatogram vykazovat žádné výrazné píky (triacylglyceroly).