PŘÍLOHA I

METODY ODBĚRU VZORKŮ

1.   ÚČEL A ROZSAH POUŽITÍ

Vzorky určené pro úřední kontroly krmiv se odebírají podle níže popsaných metod. Takto získané vzorky jsou považovány za reprezentativní vzorky z dané partie.

2.   ZAMĚSTNANCI PROVÁDĚJÍCÍ ODBĚR VZORKŮ

Odběr vzorků provádí osoby pověřené za tímto účelem členskými státy.

3.   DEFINICE

Vzorkovaná partie: množství produktů, které tvoří určitou jednotku a u nichž se předpokládají stejné vlastnosti.

Dílčí vzorek: množství odebrané v jednom bodě vzorkované partie.

Souhrnný vzorek: souhrn dílčích vzorků odebraných ze stejné vzorkované partie.

Redukovaný vzorek: reprezentativní část souhrnného vzorku, která se získá redukcí jeho množství.

Konečný vzorek: část redukovaného vzorku nebo homogenizovaného souhrnného vzorku.

4.   NÁSTROJE

4.1	Nástroje určené k odběru vzorků musí být vyrobeny z materiálů, které nemohou kontaminovat produkty, u nichž má být odběr vzorků proveden. Tyto nástroje mohou být oficiálně schváleny členskými státy.

4.2   Nástroje doporučené pro odběr vzorků tuhých krmiv

4.2.1   Ruční odběr vzorků

4.2.1.1

Lopatka s rovným dnem a vertikálními okraji.

4.2.1.2

Vzorkovač s dlouhým žlábkem nebo vzorkovací krabice. Rozměry vzorkovače musí být přiměřené vlastnostem vzorkované partie (hloubce nádoby, rozměrům pytle apod.) a velikosti částic krmiva.

4.2.2   Mechanický odběr vzorků

Pro odběr vzorků krmiva v pohybu lze použít schválená mechanická zařízení.

4.2.3   Dělicí nástroj

Nástroje určené k dělení vzorků na přibližně stejné části mohou být použity pro odběr dílčích vzorků i pro úpravu redukovaných či konečných vzorků.

5.   KVANTITATIVNÍ POŽADAVKY

5.A	Týkající se kontroly látek nebo produktů obsažených rovnoměrně v krmivech
5.A.1	Vzorkovaná partie Velikost vzorkované partie musí být taková, aby bylo možné odebrat vzorky ze všech jejích částí.
5.A.2	Dílčí vzorky
5.A.2.1	Volně ložené krmivo:	Minimální počet dílčích vzorků:
5.A.2.1.1	vzorkované partie o hmotnosti nepřevyšující 2,5 tuny	sedm
5.A.2.1.2	vzorkované partie o hmotnosti vyšší než 2,5 tuny	√ 20krát počet tun, který tvoří vzorkovanou partii (1), maximálně 40 dílčích vzorků
5.A.2.2	Balené krmivo:	Minimální počet balení, z nichž má být odebrán vzorek (2):
5.A.2.2.1	Balení o hmotnosti vyšší než jeden kilogram:
5.A.2.2.1.1	vzorkované partie obsahující jedno až čtyři balení	všechna balení
5.A.2.2.1.2	vzorkované partie obsahující pět až 16 balení	čtyři
5.A.2.2.1.3	vzorkované partie obsahující více než 16 balení	√ počtu balení, který tvoří vzorkovanou partii (1), maximálně 20 balení
5.A.2.2.2	Balení o hmotnosti nepřevyšující 1 kg	čtyři
5.A.2.3	Tekuté nebo polotekuté krmivo:	Minimální počet nádob, z nichž má být odebrán vzorek (2):
5.A.2.3.1	Nádoby o obsahu vyšším než jeden litr:
5.A.2.3.1.1	vzorkované partie obsahující jednu až čtyři nádoby	všechny nádoby
5.A.2.3.1.2	vzorkované partie obsahující pět až 16 nádob	čtyři
5.A.2.3.1.3	vzorkované partie obsahující více než 16 nádob	√ počtu nádob, které tvoří vzorkovanou partii (1), maximálně 20 nádob
5.A.2.3.2	Nádoby o obsahu nepřevyšujícím jeden litr	čtyři
5.A.2.4	Krmivo v blocích a minerální lizy	Minimální počet bloků nebo lizů, z nichž má být odebrán vzorek (2): jeden blok nebo liz na jednu vzorkovanou partii obsahující 25 jednotek, maximálně čtyři bloky nebo lizy
5.A.3	Souhrnný vzorek Požaduje se jediný souhrnný vzorek na jednu vzorkovanou partii. Celkový počet dílčích vzorků, které tvoří souhrnný vzorek, nesmí být nižší než:
5.A.3.1	Volně ložené krmivo	4 kg
5.A.3.2	Balené krmivo:
5.A.3.2.1	balení o hmotnosti vyšší než 1 kg	4 kg
5.A.3.2.2	balení o hmotnosti nepřevyšující 1 kg	hmotnost obsahu čtyř originálních balení
5.A.3.3	Tekuté nebo polotekuté krmivo:
5.A.3.3.1	nádoby o obsahu vyšším než jeden litr	čtyři litry
5.A.3.3.2	nádoby o obsahu nepřevyšujícím jeden litr	obsah čtyř originálních nádob
5.A.3.4	Krmiva v blocích nebo minerální lizy:
5.A.3.4.1	o hmotnosti vyšší než 1 kg/kus	4 kg
5.A.3.4.2	o hmotnosti nižší než 1 kg/kus	hmotnost čtyř originálních bloků nebo lizů
5.A.4	Konečné vzorky Konečný vzorek se získá ze souhrnného vzorku po případné redukci. Požaduje se provedení zkoušky alespoň u jednoho konečného vzorku. Množství v konečném vzorku pro zkoušku nesmí být nižší než:
	Tuhé krmivo	500 g
	Tekuté nebo polotekuté krmivo	500 ml
5.B	Týkající se kontroly nežádoucích látek nebo produktů obsažených nerovnoměrně v krmivech, jako jsou aflatoxiny, námel žitný, skočec obecný a crotalaria (3) v krmných surovinách
5.B.1	Vzorkovaná partie: viz 5.A.1
5.B.2	Dílčí vzorky
5.B.2.1	Volně ložené krmivo: viz 5.A.2.1
5.B.2.2	Balené krmivo:	Minimální počet balení, z nichž má být odebrán vzorek:
5.B.2.2.1	vzorkované partie obsahující jedno až čtyři balení	všechna balení
5.B.2.2.2	vzorkované partie obsahující pět až 16 balení	čtyři
5.B.2.2.3	vzorkované partie obsahující více než 16 balení	√ počtu balení, který tvoří vzorkovanou partii (1), maximálně 40 balení
5.B.3	Souhrnné vzorky Počet souhrnných vzorků se bude lišit v závislosti na velikosti vzorkované partie. Minimální počet souhrnných vzorků na jednu vzorkovanou partii je uveden níže. Celková hmotnost dílčích vzorků, které tvoří každý souhrnný vzorek, nesmí být nižší než 4 kg
5.B.3.1	Volně ložené krmivo
	Hmotnost vzorkované partie v tunách:	Minimální počet souhrnných vzorků na jednu vzorkovanou partii:
	méně než 1	1
	od 1 do 10	2
	od 10 do 40	3
	více než 40	4
5.B.3.2	Balené krmivo
	Velikost vzorkované partie v počtu balení:	Minimální počet souhrnných vzorků na jednu vzorkovanou partii:
	1 až 16	1
	17 až 200	2
	201 až 800	3
	více než 800	4
5.B.4	Konečné vzorky Konečný vzorek se získá z každého souhrnného vzorku po redukci. Požaduje se provedení zkoušky alespoň u jednoho konečného vzorku na každý souhrnný vzorek. Hmotnost konečného vzorku pro zkoušku nesmí být nižší než 500 g.

6.   POKYNY TÝKAJÍCÍ SE ODBĚRU, PŘÍPRAVY A BALENÍ VZORKŮ

6.1   Obecné pokyny

Vzorky musí být odebrány a upraveny co možná nejrychleji a musí být dodržena nezbytná opatření pro zajištění toho, aby produkt nebyl narušen či kontaminován. Nástroje, plochy i nádoby na vzorky musí být čisté a suché.

6.2   Dílčí vzorky

6.2.A   Pokud jde o kontrolu látek nebo produktů obsažených rovnoměrně v krmivech

Odběry dílčích vzorků se provádí náhodně v celé vzorkované partii a jejich hmotnost nebo objem musí být přibližně stejné.

6.2.A.1   Volně ložené krmivo

Vzorkovaná partie se rozdělí pomyslně na přibližně stejné části. Náhodně se vybere počet částí odpovídající počtu dílčích vzorků požadovanému v bodě 5.A.2 a odebere se nejméně jeden vzorek z každé části.

Případně lze odebrat vzorky v průběhu pohybu vzorkované partie (nakládky či vykládky).

6.2.A.2   Balené krmivo

Poté, co byl vybrán požadovaný počet balení k odebrání vzorků, který je stanoven v bodě 5.A.2 odebere se část obsahu každého balení pomocí vzorkovače nebo lopatky. V případě potřeby se vzorky odeberou po vyprázdnění každého balení zvlášť. Hrudky se rozdrtí, v případě potřeby se nejprve oddělí a po rozdrcení se vrátí do vzorku, a sice u každého souhrnného vzorku zvlášť.

6.2.A.3   Homogenní nebo homogenizovaná tekutá nebo polotekutá krmiva

Poté, co byl vybrán požadovaný počet nádob k odebrání vzorků, který je stanoven v bodě 5.A.2, jejich obsah se v případě potřeby homogenizuje a z každé nádoby se odebere určité množství.

Dílčí vzorky mohou být odebrány během stáčení obsahu.

6.2.A.4   Nehomogenizovaná tekutá nebo polotekutá krmiva

Poté, co byl vybrán požadovaný počet nádob k odebrání vzorků, který je stanoven v bodě 5.A.2, provede se odběr v různých vrstvách.

Vzorky mohou být odebrány rovněž během stáčení obsahu, avšak až po odstranění prvních frakcí.

V obou případech nesmí být celkový objem odebraných vzorků nižší než 10 litrů.

6.2.A.5   Krmiva v blocích a minerální lizy

Poté, co byl vybrán požadovaný počet bloků nebo lizů k odebrání vzorků, který je stanoven v bodě 5.A.2 odebere se část z každého bloku nebo lizu.

6.2.B   Pokud jde o kontrolu nežádoucích látek nebo produktů obsažených nerovnoměrně v krmivech, jako jsou aflatoxiny, námel žitný, skočec obecný a crotalaria v krmných surovinách

Vzorkovaná partie se rozdělí pomyslně na přibližně stejné části, jejichž počet odpovídá počtu souhrnných vzorků stanovenému v bodě 5.B.3. Je-li tento počet vyšší než 1, celkový počet dílčích vzorků stanovený v bodě 5.B.2 je rozložen v různých částech přibližně stejně. Odeberou se vzorky přibližně stejné velikosti (4) tak, aby celková hmotnost vzorku z každé části nebyla nižší než minimální hmotnost 4 kg požadovaná pro souhrnný vzorek. Dílčí vzorky odebrané z různých částí nesmí být smíchány.

6.3   Příprava souhrnných vzorků

6.3.A   Pokud jde o kontrolu látek nebo produktů obsažených rovnoměrně v krmivech

Dílčí vzorky se smíchají, aby tvořily jeden souhrnný vzorek.

6.3.B   Pokud jde o kontrolu nežádoucích látek nebo produktů obsažených nerovnoměrně v krmivech, jako jsou aflatoxiny, námel žitný, skočec obecný a crotalaria v krmných surovinách

Dílčí vzorky z každé části vzorkované partie se smíchají a vytvoří se počet souhrnných vzorků stanovený v bodě 5.B.3 a zaznamená se původ každého souhrnného vzorku.

6.4   Příprava konečných vzorků

Materiál každého souhrnného vzorku se pečlivě smíchá, aby se získal homogenní vzorek (5). Pokud je to nutné, souhrnný vzorek se nejprve redukuje na nejméně 2 kg nebo 2 litry (redukovaný vzorek) buď pomocí mechanického, nebo automatického děliče nebo kvartací.

Potom se připraví nejméně tři konečné vzorky, které mají přibližně stejnou hmotnost nebo stejný objem a odpovídají kvantitativním požadavkům uvedeným v bodech 5.A.4 nebo 5.B.4. Každý vzorek se vloží do vhodné nádoby. Učiní se všechna nutná předběžná opatření pro to, aby nedošlo ke změně složení vzorku nebo kontaminaci či narušení během přepravy nebo skladování.

6.5   Balení konečných vzorků

Nádoby pro balení se zapečetí a opatří štítkem (celý štítek musí být součástí pečeti) tak, aby je nebylo možné otevřít bez porušení pečeti.

7.   PROTOKOL O ODBĚRU VZORKU

O každém odběru vzorku musí být veden protokol, který umožňuje jednoznačně identifikovat každou vzorkovanou partii.

8.   MÍSTO URČENÍ VZORKŮ

Za každý souhrnný vzorek se společně s údaji nutnými pro laboratorní zkoušení pošle co nejrychleji alespoň jeden konečný vzorek do pověřené zkušební laboratoře.

---

(1)  Pokud výsledné číslo tvoří zlomek, zaokrouhlí se nahoru na nejbližší celé číslo.

(2)  U balení nebo nádob, jejichž obsah není vyšší než 1 kg nebo jeden litr, a u bloků nebo lizů, jejichž hmotnost nepřevyšuje 1 kg, tvoří dílčí vzorek obsah jednoho originálního balení nebo nádoby, jednoho bloku nebo jednoho lizu.

(3)  Metody stanovené v bodě 5.A se použijí pro kontrolu aflatoxinů, námele žitného, skočce obecného a crotalaria v kompletních a doplňkových krmivech.

(4)  U baleného krmiva se pomocí vzorkovače nebo lopatky odebere část obsahu balení, ze kterých má být odebrán vzorek, v případě potřeby po vyprázdnění každého balení zvlášť.

(5)  Hrudky se rozdrtí (v případě potřeby se nejprve oddělí a po rozdrcení se vrátí do vzorku), a sice u každého souhrnného vzorku zvlášť.

PŘÍLOHA II

OBECNÁ USTANOVENÍ O METODÁCH LABORATORNÍHO ZKOUŠENÍ KRMIV

A.   ÚPRAVA VZORKŮ PRO LABORATORNÍ ZKOUŠENÍ

1.   Účel

Postupy popsané níže se týkají úpravy konečných vzorků pro laboratorní zkoušení, které byly zaslány do kontrolních laboratoří po odběru podle ustanovení v příloze I.

Tyto vzorky musí být upraveny tak, aby byly navážky stanovené v metodách laboratorního zkoušení homogenní a reprezentativní pro konečné vzorky.

2.   Předběžná opatření

Postup úpravy vzorku, který je třeba dodržet, závisí na použitých metodách zkoušení. Proto je velmi důležité zajistit, aby postup úpravy vzorku odpovídal použité metodě zkoušení.

Veškeré nezbytné úkony musí být prováděny tak, aby se pokud možno zabránilo kontaminaci vzorku a změnám jeho složení.

Rozmělňování, míchání a prosévání se provádí co možná nejrychleji s minimálním vystavením vzorku vlivům vzduchu a světla. Nepoužívají se mlýnky a drtiče, jež by mohly vzorek znatelně zahřát.

Ruční rozmělňování se doporučuje v případě krmiv, která jsou obzvláště citlivá na teplo. Rovněž je třeba zajistit, aby zdrojem kontaminace stopovými prvky nebyl samotný přístroj.

Pokud nelze úpravu provést bez zásadních změn obsahu vlhkosti ve vzorku, stanoví se obsah vlhkosti před úpravou a po úpravě na základě metody uvedené v části A přílohy III.

3.   Postup

Vzorek se rozdělí na odpovídající podvzorky pro zkoušku a pro srovnání použitím odpovídající techniky dělení, například střídavým odběrem lopatkou, stacionárním nebo otáčivým proséváním. Dělení vzorku kvartací se nedoporučuje, protože podvzorky vzniklé tímto dělením mohou být zatíženy velkou chybou. Vzorek pro srovnání se uloží do vhodné čisté a suché nádoby se vzduchotěsným uzávěrem a připraví se podvzorky pro zkoušku o minimální hmotnosti 100 g podle níže uvedeného postupu.

3.1   Krmiva, která mohou být rozmělněna ihned

Nestanoví-li metody laboratorního zkoušení jinak, celý vzorek se proseje přes síto s čtvercovými oky o délce strany 1 mm (v souladu s doporučením ISO R565), v případě potřeby až po rozmělnění. Je třeba se vyvarovat nadměrného rozmělnění.

Prosetý vzorek se promíchá a odebere do vhodné čisté a suché nádoby se vzduchotěsným uzávěrem. Těsně před odebráním navážky pro zkoušku se vzorek opět promíchá.

3.2   Krmiva, která mohou být rozmělněna až po usušení

Nestanoví-li metody laboratorního zkoušení jinak, vzorek se suší tak dlouho, dokud se jeho obsah vlhkosti nesníží na úroveň 8 až 12 %, a sice postupem pro předsoušení popsaným v bodě 4.3 metody pro stanovení obsahu vlhkosti uvedené v části A přílohy III. Poté se postupuje podle bodu 3.1.

3.3   Tekutá nebo polotekutá krmiva

Vzorek se odebere do vhodné čisté a suché nádoby se vzduchotěsným uzávěrem. Těsně před odebráním navážky pro zkoušku se vzorek opět důkladně promíchá.

3.4   Ostatní krmiva

Vzorky, které nemohou být upraveny jedním z výše uvedených postupů, se upravují jakýmkoliv jiným postupem, který zajistí, že navážky pro zkoušku budou homogenní a reprezentativní pro konečné vzorky.

4.   Skladování vzorků

Vzorky musí být skladovány při takové teplotě, která nezmění jejich složení. Vzorky určené ke zkoušce na obsah vitaminů nebo látek, které jsou obzvláště citlivé na světlo, se skladují v nádobách z hnědého skla.

B.   USTANOVENÍ O CHEMIKÁLIÍCH A PŘÍSTROJÍCH A POMŮCKÁCH POUŽÍVANÝCH PŘI METODÁCH LABORATORNÍHO ZKOUŠENÍ

1.	Nestanoví-li metody laboratorního zkoušení jinak, veškeré chemikálie pro zkoušení musí být analyticky čisté. Pokud se provádí zkouška na stopové prvky, čistota chemikálií musí být zkontrolována slepou zkouškou. V závislosti na získaných výsledcích může být požadováno další čištění chemikálií.

2.

U jakýchkoliv úkonů spojených s úpravou roztoků, ředěním, proplachováním nebo propíráním, jak je uvedeno v metodách laboratorního zkoušení, kdy není specifikována povaha rozpouštědla nebo ředidla, se předpokládá, že musí být použita voda. Obvykle se použije voda demineralizovaná nebo destilovaná. Ve zvláštních případech, které jsou uvedeny v metodách laboratorního zkoušení, se musí podrobit zvláštním čistícím procedurám.

3.	Pokud jde o vybavení běžně používané v kontrolních laboratořích, uvádějí se v metodách laboratorního zkoušení pouze speciální zařízení a přístroje nebo zařízení a přístroje, které vyžadují zvláštní použití. Musí být čisté, a to zejména v případě, kdy je třeba stanovit velmi malá množství látek.

C.   UPLATŇOVÁNÍ METOD LABORATORNÍHO ZKOUŠENÍ A VYJADŘOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

1.   Extrakční postup

Některé metody vyžadují zvláštní extrakční postup. Obecně platí, že jiné extrakční postupy, než jsou postupy uvedené v příslušných metodách, mohou být použity jen pod podmínkou, že se prokáže, že použitý extrakční postup má rovnocennou extrakční účinnost na zkoušenou matrici jako postup uvedený v příslušné metodě.

2.   Postup čištění

Některé metody vyžadují zvláštní postup čištění. Obecně platí, že jiné postupy čištění, než jsou postupy uvedené v příslušných metodách, mohou být použity jen pod podmínkou, že se prokáže, že použitý postup čištění vykazuje rovnocenné výsledky zkoušky pro zkoušenou matrici jako postup uvedený v příslušné metodě.

3.   Zpráva o použité metodě laboratorního zkoušení

Obvykle je pro stanovení každé látky v krmivu určena jediná metoda laboratorního zkoušení. Je-li uvedeno více metod, musí být v protokolu o zkoušce uvedeno, kterou konkrétní metodu kontrolní laboratoř použila.

4.   Počet stanovení

Výsledek uvedený v protokolu o zkoušce představuje průměrnou hodnotu získanou nejméně ze dvou stanovení provedených na různých částech vzorku, jejichž opakovatelnost je uspokojivá.

Pokud je však v případě zkoušky na nežádoucí látky výsledek prvního stanovení výrazně (> 50 %) nižší než specifikace, jež má být zkontrolována, není zapotřebí žádných dalších stanovení, jestliže byly dodrženy vhodné postupy kontroly kvality.

Pokud v případě kontroly deklarovaného obsahu látky nebo složky výsledek prvního stanovení potvrdí deklarovaný obsah, tj. jestliže výsledek zkoušky spadá do přijatelného rozsahu odchylky od deklarovaného obsahu, není zapotřebí žádných dalších stanovení, jestliže byly dodrženy vhodné postupy kontroly kvality.

V některých případech je tento přijatelný rozsah odchylky stanoven v právních předpisech, např. ve směrnici Rady 79/373/EHS (1).

5.   Zpráva o výsledku zkoušky

Výsledek zkoušky se vyjadřuje způsobem, který je stanoven v metodě laboratorního zkoušení, příslušným počtem platných číslic a v případě potřeby se opraví v závislosti na obsahu vlhkosti v konečném vzorku před úpravou.

6.   Nejistota měření a výtěžnost v případě zkoušky na nežádoucí látky

Pokud jde o nežádoucí látky ve smyslu směrnice 2002/32/ES, včetně dioxinů a PCB s dioxinovým efektem, produkt určený ke krmení se považuje za nevyhovující stanovenému maximálnímu obsahu, pokud se na základě výsledku zkoušky pokládá maximální obsah za překročený, přičemž se zohlední rozšířená nejistota měření a korekce na výtěžnost. K posouzení shody se použije zkoušená koncentrace poté, co byla korigovaná na výtěžnost, a poté, co byla odečtena rozšířená nejistota měření. Tento postup se použije pouze v případě, že metoda laboratorního zkoušení umožňuje odhad nejistoty měření a korekci na výtěžnost (nelze jej použít např. v případě mikroskopického zkoušení).

Výsledek zkoušky (pokud použitá metoda laboratorního zkoušení umožňuje odhad nejistoty měření a výtěžnosti) se uvede v této podobě:

a)	korigovaný na výtěžnost s uvedením míry výtěžnosti. Korekce na výtěžnost není nutná v případě, že výtěžnost je v rozmezí 90–110 %;

b)	ve tvaru „x +/– U“, kde „x“ je výsledek zkoušky a „U“ je rozšířená nejistota měření, přičemž se použije faktor pokrytí 2, který odpovídá hladině spolehlivosti asi 95 %.

Pokud je však výsledek zkoušky výrazně (> 50 %) nižší než specifikace, jež má být zkontrolována, pokud byly dodrženy vhodné postupy kontroly kvality a pokud zkouška slouží jen pro účely kontroly dodržení ustanovení právních předpisů, může být podána zpráva o výsledku zkoušky bez korekce na výtěžnost a v těchto případech lze vynechat údaje o výtěžnosti a o nejistotě měření.

---

(1)  Úř. věst. L 86, 6.4.1979, s. 30.

PŘÍLOHA III

METODY ZKOUŠENÍ PRO KONTROLU SLOŽENÍ KRMNÝCH SUROVIN A KRMNÝCH SMĚSÍ

A.   STANOVENÍ OBSAHU VLHKOSTI

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu vlhkosti v krmivech. V případě, že krmivo obsahuje těkavé látky, např. organické kyseliny, je třeba si uvědomit, že spolu s obsahem vlhkosti se stanoví i značné množství těkavých látek.

Nevztahuje se na zkoušení mléčných výrobků jako krmných surovin, zkoušení minerálních látek a směsí, které jsou tvořeny převážně minerálními látkami, zkoušení živočišných a rostlinných tuků a olejů ani na zkoušení olejnatých semen a plodů.

2.   Princip

Vzorek se suší za předepsaných podmínek, které závisejí na druhu krmiva. Úbytek hmotnosti se stanoví vážkově. U pevných krmiv s vysokým obsahem vlhkosti je nutné provést předsoušení.

3.   Přístroje a pomůcky

3.1

Laboratorní mlýnek z materiálu, který neabsorbuje vlhkost, snadno se čistí, umožňuje rychlé a rovnoměrné rozemletí, aniž by došlo ke znatelnému ohřevu, pokud možno zabraňuje kontaktu s okolním vzduchem a který odpovídá požadavkům uvedeným v bodech 4.1.1 a 4.1.2 (např. úderové křížové mikromlýnky, vodou chlazené mikromlýnky, rozebíratelné kuželové mlýnky, mlýnky s pomalým chodem a drtiče s ozubenými kolečky).

3.2	Analytická váha s přesností na 1 mg.

3.3	Vysoušečky z nekorodujícího kovu nebo ze skla, se vzduchotěsně uzavíratelnými víčky; užitková plocha umožňující rozprostření 0,3 g zkoušeného vzorku na 1 cm2.

3.4	Elektrická laboratorní sušárna (±2 oC), která zaručuje rychlou regulaci teploty a je vybavena kvalitním větráním (1).

3.5	Elektricky vyhřívaná vakuová sušárna s regulací teploty a olejovým čerpadlem, která je vybavena buď zařízením pro přívod teplého a suchého vzduchu nebo vysoušecím prostředkem (např. oxidem vápenatým).

3.6	Exsikátor se silnou perforovanou deskou z kovu nebo porcelánu, který obsahuje účinný vysoušecí prostředek.

4.   Postup

Poznámka

:

Postupy uvedené v tomto bodě musí být provedeny ihned po otevření obalů vzorků. Zkouška musí být provedena nejméně dvakrát.

4.1   Příprava

4.1.1   Krmiva mimo krmiva uvedená v bodech 4.1.2 a 4.1.3

Odebere se minimálně 50 g vzorku. Pokud je to nutné, vzorek se rozemele takovým způsobem, aby nedošlo ke změně obsahu vlhkosti (viz bod 6).

4.1.2   Obiloviny a krupky

Odebere se minimálně 50 g vzorku. Toto množství se rozemele tak, aby alespoň 50 % částic prošlo sítem s oky o velikosti 0,5 mm a zbytek na sítě s kulatými oky velikosti 1 mm byl maximálně 10 %.

4.1.3   Tekutá nebo pastovitá krmiva a krmiva, která jsou složena převážně z tuků

Odebere se 25 g vzorku s přesností na 10 mg, smíchá se s odpovídajícím množstvím předem vysušeného písku zváženého s přesností na 10 mg, až vznikne homogenní hmota.

4.2   Sušení

4.2.1   Krmiva mimo krmiva uvedená v bodech 4.2.2 a 4.2.3

Vysoušečka s víčkem (3.3) se zváží s přesností na 1 mg. Do předem zvážené vysoušečky se naváží asi 5 g vzorku s přesností na 1 mg a rovnoměrně se rozprostře. Vysoušečka se po sejmutí víčka umístí do laboratorní sušárny předehřáté na 103 oC. Aby se zabránilo příliš rychlému poklesu teploty, je třeba vložit vysoušečku do sušárny co nejrychleji. Sušení probíhá 4 hodiny, přičemž doba sušení se počítá od okamžiku, kdy teplota v laboratorní sušárně opět dosáhla 103 oC. Potom se vysoušečka uzavře víčkem, vyjme ze sušárny, nechá vychladnout 30–45 minut v exsikátoru (3.6) a nakonec se zváží s přesností na 1 mg.

U krmiv, která se skládají převážně z olejů a tuků, se suší ještě dalších 30 minut při teplotě 130 oC a znovu se zváží. Rozdíl mezi těmito dvěma váženími nesmí být větší než 0,1 % vlhkosti.

4.2.2   Obiloviny, mouka, kroupy a krupice

Vysoušečka s víčkem (3.3) se zváží s přesností na 0,5 mg. Do předem zvážené vysoušečky se naváží asi 5 g rozemletého vzorku s přesností na 1 mg a rovnoměrně se rozprostře. Vysoušečka se po sejmutí víčka umístí do laboratorní sušárny předehřáté na 130 oC. Aby se zabránilo příliš rychlému poklesu teploty, je třeba vložit vysoušečku do sušárny co nejrychleji. Sušení probíhá 2 hodiny, přičemž doba sušení se počítá od okamžiku, kdy teplota v laboratorní sušárně opět dosáhla 130 oC. Potom se vysoušečka uzavře víčkem, vyjme ze sušárny, nechá vychladnout 30–45 minut v exsikátoru (3.6) a nakonec se zváží s přesností na 1 mg.

4.2.3

Krmné směsi s obsahem sacharózy nebo laktózy vyšším než 4 %: krmné suroviny jako šrot ze svatojánského chleba, hydrolyzované vedlejší výrobky z obilovin, sladový květ, cukrovarnické řízky, rybí vývar, cukr solubles; krmné směsi s více než 25 % minerálních látek obsahujících krystalickou vodu. Vysoušečka s víčkem (3.3) se zváží s přesností na 0,5 mg. Do předem zvážené vysoušečky se naváží asi 5 g vzorku s přesností na 1 mg a rovnoměrně se rozprostře. Vysoušečka se po sejmutí víčka umístí do laboratorní vakuové sušárny (3.5) předehřáté na 80–85 oC. Aby se zabránilo příliš rychlému poklesu teploty, je třeba vložit vysoušečku do sušárny co nejrychleji. Tlak se upraví na 100 torrů a vzorek se suší při tomto tlaku 4 hodiny buď pomocí přívodu horkého a suchého vzduchu, nebo pomocí vysoušecího prostředku (přibližně 300 g na 20 vzorků). V tomto druhém případě se přeruší spojení s vakuovou pumpou, jakmile bylo dosaženo předepsaného tlaku. Doba sušení se počítá od okamžiku, kdy bylo v laboratorní sušárně opět dosaženo teploty 80–85 oC. Potom se tlak v sušárně opatrně upraví zpět na atmosférický tlak. Po otevření vakuové laboratorní sušárny se vysoušečka ihned uzavře víčkem, vyjme ze sušárny, nechá vychladnout 30–45 minut v exsikátoru (3.6) a nakonec se zváží s přesností na 1 mg. Vysoušečka se suší dalších 30 minut ve vakuové laboratorní sušárně při teplotě 80–85 oC a znovu se zváží. Rozdíl mezi těmito dvěma váženími nesmí být větší než 0,1 % vlhkosti.

4.3   Předsoušení

4.3.1   Krmiva mimo krmiva uvedená v bodě 4.3.2

Pevná krmiva s vysokým obsahem vlhkosti, která způsobuje obtíže při mletí, se musí předsoušet takto:

Naváží se 50 g nerozemletého vzorku s přesností na 10 mg (v případě potřeby se provede hrubé rozemletí u lisovaných krmiv nebo u krmiv v kusech) do vhodné nádoby (např. do hliníkové misky 20 × 12 cm s okrajem 0,5 cm). Suší se v laboratorní sušárně při teplotě 60–70 oC až do snížení obsahu vlhkosti na hodnotu 8–12 %. Vysoušečka se vyjme ze sušárny, nechá se 1 hodinu volně chladit a pak se zváží s přesností na 10 mg. Podle druhu krmiva se pak rozemele způsobem uvedeným v bodě 4.1.1 a suší způsobem uvedeným v bodě 4.2.1 nebo 4.2.3.

4.3.2   Obiloviny

Zrna, jejichž obsah vlhkosti je vyšší než 17 %, se musí předsoušet takto:

Do vhodné nádoby (např. do hliníkové misky 20 × 12 cm s okrajem 0,5 cm) se naváží 50 g nerozemletých zrn s přesností na 10 mg. Suší se v laboratorní sušárně po dobu 5–7 minut při teplotě 130 oC. Vyjme se ze sušárny, nechá se 2 hodiny volně chladit a pak se zváží s přesností na 10 mg. Pak se ihned rozemele způsobem uvedeným v bodě 4.1.2 a suší způsobem uvedeným v bodě 4.2.2.

5.   Výpočet a vyjádření výsledků

Obsah vlhkosti (X) jako procento vzorku se vypočte podle následujícího vzorce:

5.1   Sušení bez předsoušení

kde:

m	=	počáteční hmotnost zkoušeného vzorku v gramech
m0	=	hmotnost sušeného zkoušeného vzorku v gramech.

5.2   Sušení s předsoušením

kde:

m	=	počáteční hmotnost zkoušeného vzorku v gramech
m1	=	hmotnost zkoušeného vzorku po předsoušení v gramech
m2	=	hmotnost zkoušeného vzorku po rozemletí nebo rozmělnění v gramech
m0	=	hmotnost sušeného zkoušeného vzorku v gramech.

5.3   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení obsahu vlhkosti provedených na stejném vzorku nesmí překročit absolutní hodnotu vlhkosti 0,2 %.

6.   Poznámka

Pokud je nutné provést rozemletí vzorku a pokud se na základě toho musí počítat se změnou obsahu vlhkosti materiálu, je nutno korigovat výsledky zkoušky jednotlivých složek krmiva podle obsahu vlhkosti vzorku v jeho původním stavu.

B.   STANOVENÍ OBSAHU VLHKOSTI V ŽIVOČIŠNÝCH A ROSTLINNÝCH TUCÍCH A OLEJÍCH

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu vody a těkavých látek v živočišných a rostlinných tucích a olejích.

2.   Princip

Vzorek se vysuší do konstantní hmotnosti při 103 oC (úbytek hmotnosti mezi dvěma po sobě následujícími váženími musí být maximálně 1 mg). Úbytek hmotnosti se stanoví vážkově.

3.   Přístroje a pomůcky

3.1	Miska s plochým dnem z nekorodujícího materiálu, průměr 8–9 cm a výška asi 3 cm.

3.2	Rtuťový teploměr se zesílením na vrcholu a expanzní trubicí na horním konci, se stupnicí asi od 80 oC alespoň do 110 oC, asi 10 cm dlouhý.

3.3	Písková lázeň nebo elektrická topná deska.

3.4	Exsikátor s účinným vysoušecím prostředkem.

3.5	Analytické váhy.

4.   Postup

Do misky (3.1), předem vysušené a zvážené, opatřené teploměrem (3.2) se naváží asi 20 g homogenizovaného vzorku s přesností na 1 mg. Zahřívá se na pískové lázni nebo na topné desce (3.3) za stálého promíchávání teploměrem tak, aby teplota během asi 7 minut dosáhla 90 oC.

Zahřívání se sníží a sleduje se intenzita tvorby bublinek, které stoupají ode dna misky. Teplota nesmí přesáhnout 105 oC. V důkladném míchání ode dna misky se pokračuje, dokud se nepřestanou tvořit bubliny.

Během zahřívání se vzorek několikrát zahřeje na 103 ± 2 oC a ochladí na 93 oC, aby se zajistilo úplné odstranění vlhkosti. Poté se nechá vychladnout na laboratorní teplotu v exsikátoru (3.4) a zváží se. Tato operace se opakuje, dokud není dosaženo úbytku hmotnosti mezi dvěma následujícími váženími nižšího než 2 mg.

Poznámka

:

Zvýšení hmotnosti vzorku po opakovaném zahřívání je způsobeno oxidací tuku. V tomto případě se výsledek počítá z vážení provedeného bezprostředně před tím, než se hmotnost začala zvyšovat.

5.   Výpočet a vyjádření výsledků

Obsah vlhkosti (X) jako procento vzorku se vypočte podle následujícího vzorce:

kde:

m	=	hmotnost zkoušeného vzorku v gramech
m1	=	hmotnost misky s obsahem před ohřevem v gramech
m2	=	hmotnost misky s obsahem po ohřevu v gramech

Výsledky nižší než 0,05 % musí být uváděny jako „nižší než 0,05 %“.

Opakovatelnost

Rozdíl ve vlhkosti mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí překročit 0,05 % v absolutní hodnotě.

C.   STANOVENÍ OBSAHU DUSÍKATÝCH LÁTEK

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu dusíkatých látek v krmivech na základě stanovení obsahu dusíku metodou podle Kjeldahla.

2.   Princip

Vzorek se mineralizuje horkou kyselinou sírovou za přítomnosti katalyzátoru. Kyselý roztok se alkalizuje roztokem hydroxidu sodného. Amoniak se vydestiluje a jímá se do odměřeného množství kyseliny sírové a přebytek se titruje standardním roztokem hydroxidu sodného.

Uvolněný amoniak se případně vydestiluje do přebytku roztoku kyseliny borité a následně se titruje roztokem kyseliny chlorovodíkové nebo kyseliny sírové.

3.   Chemikálie

3.1	Síran draselný.

3.2	Katalyzátory: oxid měďnatý (CuO) nebo síran měďnatý, pentahydrát (CuSO4 5 H2O).

3.3	Granulovaný zinek.

3.4	Kyselina sírová, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5	Kyselina sírová, standardní odměrný roztok, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6	Kyselina sírová, standardní odměrný roztok, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7	Kyselina sírová, standardní odměrný roztok, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8	Indikátor methylčerveň: 300 mg methylčerveně se rozpustí ve 100 ml ethanolu, σ = 95–96 % (v/v).

3.9	Roztok hydroxidu sodného (může být použit technicky čistý), β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10	Hydroxid sodný, standardní odměrný roztok, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11	Hydroxid sodný, standardní odměrný roztok, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12	Granulovaná pemza, praná v kyselině chlorovodíkové a vysušená.

3.13	Acetanilid (bod tání = 114 oC, obsah N = 10,36 %).

3.14	Sacharóza (dusíku prostá).

3.15	Kyselina boritá (H3BO3).

3.16	Roztok methylčerveně: 100 mg methylčerveně se rozpustí ve 100 ml ethanolu nebo methanolu.

3.17	Roztok bromokresolové zeleně: 100 mg bromokresolové zeleně se rozpustí ve 100 ml ethanolu nebo methanolu.

3.18

Roztok kyseliny borité (10 g/l až 40 g/l v závislosti na použitém přístroji). Pokud se použije kolorimetrická detekce bodu ekvivalence, do roztoků kyseliny borité se musí přidat methylčerveň a bromokresol. Pokud se připravuje 1 litr roztoku kyseliny borité, před úpravou objemu se přidá 7 ml roztoku methylčerveně (3.16) a 10 ml roztoku bromokresolové zeleně (3.17). V závislosti na použité vodě se může pH jednotlivých roztoků kyseliny borité lišit. Často je nezbytná úprava pomocí malého množství zásadité látky, aby se získalo vhodné pH. Poznámka : Přidání 3–4 ml NaOH (3.11) do 1 litru 10 g/l kyseliny borité obvykle představuje vhodnou úpravu. Roztok se skladuje při laboratorní teplotě a během skladování musí být chráněn před světlem a zdrojem amoniakových výparů.

3.19	Kyselina chlorovodíková, standardní odměrný roztok, c(HCl) = 0,10 mol/l. Poznámka : Lze použít i jiné koncentrace odměrných roztoků (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 a 3.19), pokud je tato skutečnost korigována ve výpočtech. koncentrace se vždy vyjadřují s přesností na čtyři desetinná místa.

4.   Přístroje a pomůcky

Přístroje vhodné pro provedení mineralizace, destilace a titrace podle Kjeldahlovy metody.

5.   Postup

5.1   Mineralizace

Do mineralizační baňky se naváží 1 g vzorku s přesností na 0,001 g. Přidá se 15 g síranu draselného (3.1) a vhodné množství katalyzátoru (3.2) (0,3–0,4 g oxidu měďnatého nebo 0,9–1,2 g pentahydrátu síranu měďnatého, 25 ml kyseliny sírové (3.4) a několik granulí pemzy (3.12) a zamíchá se.

Baňka se zahřívá nejprve mírně a podle potřeby se občas zamíchá, dokud nedojde ke zuhelnatění hmoty a neustane pěnění; potom se intenzita zahřívání zvyšuje, dokud se kapalina ustáleně nevaří. Zahřívání je odpovídající, pokud vroucí kyselina kondenzuje na stěnách baňky. Nesmí docházet k přehřívání stěn baňky a k ulpívání organických částic na stěnách baňky.

Jakmile se roztok stane čirým a získá světle zelené zabarvení, pokračuje se v ohřevu ještě 2 hodiny a potom se ponechá vychladnout.

5.2   Destilace

Opatrně se přidá tolik vody, aby došlo k úplnému rozpuštění sulfátů. Nechá se vychladnout a potom se přidá několik granulí zinku (3.3), pokud je třeba. Dále se postupuje podle bodu 5.2.1 nebo 5.2.2.

5.2.1   Destilace do kyseliny sírové

Do předlohy destilačního zařízení se odměří přesně 25 ml kyseliny sírové (3.5) nebo (3.7) podle předpokládaného obsahu dusíku. Přidá se několik kapek methylčerveně (3.8).

Mineralizační baňka se připojí ke kondenzátoru destilačního přístroje a konec kondenzátoru se ponoří do kapaliny v předloze do hloubky nejméně 1 cm (viz poznámka 8.3). Do mineralizační baňky se zvolna přilije 100 ml hydroxidu sodného (3.9) tak, aby nedošlo ke ztrátám amoniaku (viz poznámka 8.1). Baňka se zahřívá, dokud se nepředestiluje veškerý amoniak.

5.2.2   Destilace do kyseliny borité

V případě manuální titrace amoniakového obsahu destilátu se použije níže popsaný postup. Pokud je destilační jednotka plně automatická a zahrnuje titraci amoniakového obsahu destilátu, dodrží se pokyny výrobce pro provoz destilační jednotky.

Předloha s obsahem 25–30 ml roztoku kyseliny borité (3.18) se umístí pod otvor kondenzátoru tak, že jeho vývod je ponořen pod hladinu přebytku roztoku kyseliny borité. Destilační jednotka se upraví na dávkování 50 ml roztoku hydroxidu sodného (3.9). S destilační jednotkou se pracuje podle pokynů výrobce a oddestiluje se amoniak uvolněný přidáním roztoku hydroxidu sodného. Destilát se jímá do roztoku kyseliny borité. Množství destilátu (doba destilace párou) závisí na množství dusíku ve vzorku. Je třeba dodržet pokyny výrobce.

Poznámka

:

V poloautomatické destilační jednotce se doplnění přebytku hydroxidu sodného a destilace párou provádí automaticky.

5.3   Titrace

Postupuje se podle bodu 5.3.1 nebo 5.3.2.

5.3.1   Kyselina sírová

Přebytek kyseliny sírové v předloze se titruje roztokem hydroxidu sodného (3.10 nebo 3.11) podle použité koncentrace kyseliny sírové do dosažení bodu ekvivalence.

5.3.2   Kyselina boritá

Obsah předlohy se titruje se standardním odměrným roztokem kyseliny chlorovodíkové (3.19) nebo se standardním odměrným roztokem kyseliny sírové (3.6) s použitím byrety a odečte se množství použitého titračního činidla.

Pokud se použije kolorimetrická detekce bodu ekvivalence, je bodu ekvivalence dosaženo při prvním zbarvení obsahu do růžova. Odečte se objem byretou s přesností na 0,05 ml. Bod ekvivalence bude zřetelnější při použití osvětlené magnetické míchačky nebo fotometrického detektoru.

Lze provést automaticky s použitím parního destilátoru s automatickou titrací.

Je třeba dodržet pokyny výrobce pro provoz konkrétního destilačního přístroje nebo destilačního/titračního přístroje.

Poznámka

:

Při použití automatického titračního systému začíná titrace ihned po zahájení destilace a použije se 1 % roztok kyseliny borité (3.18). Při použití plně automatické destilační jednotky lze automatickou titraci amoniaku provést rovněž pomocí detekce bodu ekvivalence s použitím potenciometrického systému pH. V tomto případě se použije automatický titrační přístroj s pH metrem. pH metr je správně kalibrován v rozsahu pH 4–7 podle běžných laboratorních postupů pro kalibraci pH. Takto bude pH bodu ekvivalence titrace dosaženo při hodnotě pH 4,6, přičemž se jedná o nejstrmější skok na titrační křivce (inflexní bod).

5.4   Slepá zkouška

Pro potvrzení, že všechny použité chemikálie jsou prosté dusíku, se provede slepá zkouška (mineralizace, destilace a titrace) s 1 g sacharózy (3.14) místo vzorku.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Výpočet se provede podle bodu 6.1 nebo 6.2.

6.1   Výpočet pro titraci podle bodu 5.3.1

Obsah dusíkatých látek vyjádřený v procentech hmotnosti se vypočítá podle následujícího vzorce:

kde:

V0	=	spotřeba NaOH (3.10 nebo 3.11) na slepou zkoušku v ml
V1	=	spotřeba NaOH (3.10 nebo 3.11) na titraci vzorku v ml
c	=	koncentrace hydroxidu sodného (3.10 nebo 3.11) v mol/l
m	=	hmotnost vzorku v g.

6.2   Výpočet pro titraci podle bodu 5.3.2

6.2.1   Titrace kyselinou chlorovodíkovou

Obsah dusíkatých látek vyjádřený v procentech hmotnosti se vypočítá podle následujícího vzorce:

kde:

m	=	hmotnost zkoušeného vzorku v g
c	=	koncentrace standardního odměrného roztoku hydroxidu sodného (3.19) v mol/l
V0	=	spotřeba kyseliny chlorovodíkové na slepou zkoušku v ml
V1	=	spotřeba kyseliny chlorovodíkové na zkušební vzorek v ml.

6.2.2   Titrace kyselinou sírovou

Obsah dusíkatých látek vyjádřený v procentech hmotnosti se vypočítá podle následujícího vzorce:

kde:

m	=	hmotnost zkušebního vzorku v g
c	=	koncentrace standardního odměrného roztoku kyseliny sírové (3.6) v mol/l
V0	=	spotřeba kyseliny sírové (3.6) na slepou zkoušku v ml
V1	=	spotřeba kyseliny sírové (3.6) na zkušební vzorek v ml.

7.   Verifikace metody

7.1   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit:

—	0,2 % v absolutní hodnotě u obsahů dusíkatých látek nižších než 20 %,

—	1,0 % relativně vzhledem k vyšší hodnotě, u obsahů dusíkatých látek od 20 % do 40 %,

—	0,4 % v absolutní hodnotě u obsahů dusíkatých látek vyšších než 40 %.

7.2   Přesnost

Provede se zkouška (mineralizace, destilace a titrace) s 1,5–2,0 g acetanilidu (3.13) a 1 g sacharózy (3.14); spotřeba kyseliny sírové (3.5) na 1 g acetanilidu je 14,80 ml. Výtěžnost musí být nejméně 99 %.

8.   Poznámky

8.1

Přístroje mohou být manuální, poloautomatické nebo automatické. Pokud zařízení vyžaduje převod mezi mineralizačním a destilačním krokem, musí být tento krok proveden bez ztrát. Pokud k baňce destilačního přístroje není připojena přikapávací nálevka, přilévá se hydroxid sodný opatrně po stěně bezprostředně před připojením baňky ke kondenzátoru.

8.2	Pokud mineralizát po zchladnutí ztuhne, opakuje se stanovení s větším množstvím kyseliny sírové (3.4), než je uvedeno výše.

8.3	U produktů s nízkým obsahem dusíku může být objem kyseliny sírové (3.7) snížen na 10 nebo 15 ml a doplní se vodou na objem 25 ml.

8.4

Při rutinní zkoušce lze pro stanovení dusíkatých látek použít alternativní metody, ale referenční metodou je Kjeldahlova metoda uvedená v části C. Ekvivalence výsledků získaných alternativní metodou (např. DUMAS) v porovnání s referenční metodou musí být prokázána samostatně pro každou matrici. Jelikož výsledky získané alternativní metodou se mohou i v případě ověření ekvivalence nepatrně odchylovat od výsledků získaných referenční metodou, je zapotřebí uvést v protokolu o zkoušce metodu laboratorního zkoušení použitou pro stanovení dusíkatých látek.

D.   STANOVENÍ OBSAHU MOČOVINY

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu močoviny v krmivech.

2.   Princip

Vzorek s čeřicím činidlem se rozmíchá ve vodě. Suspenze se přefiltruje. Obsah močoviny ve filtrátu se stanoví po přidání 4-dimethylaminobenzaldehydu (4-DMAB) spektrofotometricky při vlnové délce 420 nm.

3.   Chemikálie

3.1	Roztok 4-dimethylaminobenzaldehydu: 1,6 g 4-DMAB se rozpustí v 100 ml 96 % ethanolu a přidá se 10 ml kyseliny chlorovodíkové (ρ201,19 g/ml). Skladovatelnost tohoto roztoku je nejvýše dva týdny.

3.2	Carrezovo činidlo I: 21,9 g dihydrátu octanu zinečnatého (CH3CO2)2Zn . 2H2O se rozpustí ve vodě a přidají se 3 ml ledové kyseliny octové. Doplní se vodou na objem 100 ml.

3.3	Carrezovo činidlo II: 10,6 g trihydrátu hexakyanoželeznatanu tetradraselného [K4Fe(CN)6] . 3H2O se rozpustí ve vodě. Doplní se vodou na objem 100 ml.

3.4	Aktivní uhlí, které neabsorbuje močovinu (musí být ověřeno).

3.5	Močovina, 0,1% roztok (w/v).

4.   Přístroje a pomůcky

4.1	Míchací zařízení: frekvence otáčení asi 35–40 otáček/min.

4.2	Zkumavky: 160 mm × 16 mm se zabroušenou zátkou.

4.3	Spektrofotometr.

5.   Postup

5.1   Analýza vzorku

Do 500ml odměrné baňky se naváží 2 g vzorku ± 1 mg a přidá se 1 g aktivního uhlí (3.4). Přidá se 400 ml vody a 5 ml Carrezova činidla I (3.2), míchá se po dobu 30 sekund a přidá se 5 ml Carrezova činidla II (3.3). Míchá se po dobu třiceti minut na míchacím zařízení. Doplní se vodou po značku, promíchá a přefiltruje.

Do zkumavek se zabroušenými skleněnými zátkami se odpipetuje 5 ml čirého, bezbarvého filtrátu, přidá se 5 ml roztoku 4-DMAB (3.1) a promíchá. Zkumavky se vloží do vodní lázně nastavené na teplotu 20 oC (+/– 4 oC). Po patnácti minutách se změří absorbance roztoku na spektrofotometru při vlnové délce 420 nm. Porovná se slepou zkouškou roztoku činidel.

5.2   Kalibrační křivka

Do odměrných baněk na 100 ml se napipetuje 1, 2, 4, 5 a 10 ml roztoku močoviny (3.5) a doplní se po značku vodou. Z těchto roztoků se odpipetuje 5 ml, ke každému se přidá 5 ml roztoku 4-DMAB (3.1), homogenizuje se a změří se absorbance, jak je uvedeno výše, a porovná s kontrolním roztokem obsahujícím 5 ml 4-DMAB a 5 ml vody bez močoviny. Sestaví se kalibrační křivka.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Stanoví se množství močoviny ve vzorku s použitím kalibrační křivky.

Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

7.   Poznámky

7.1	V případě, že vzorek obsahuje více než 3 % močoviny, vzorek se redukuje na 1 g nebo se původní roztok zředí tak, aby v něm nebylo více než 50 mg močoviny na 500 ml roztoku.

7.2	V případě nízkého obsahu močoviny se vzorek zvětšuje tak dlouho, až je filtrát čirý a bezbarvý.

7.3	V případě, že vzorek obsahuje jednoduché dusíkaté sloučeniny, jako například aminokyseliny, absorbance se změří při vlnové délce 435 nm.

E.   STANOVENÍ OBSAHU TĚKAVÝCH DUSÍKATÝCH BÁZÍ

I.   MIKRODIFUZE

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu těkavých dusíkatých látek vyjádřených jako amoniak v krmivech.

2.   Princip

Vzorek se extrahuje vodou, roztok se vyčeří a přefiltruje. Těkavé dusíkaté báze se po přidání roztoku uhličitanu draselného vytěsní a mikrodifuzí se zachycují v roztoku kyseliny borité a titrují se kyselinou sírovou.

3.   Chemikálie

3.1	Kyselina trichloroctová, roztok 20 % (w/v).

3.2	Indikátor: 33 mg bromokresolové zeleně a 65 mg methylčerveně se rozpustí ve 100 ml 95–96 % (v/v) ethanolu.

3.3

Roztok kyseliny borité: v odměrné baňce o objemu 1 l se rozpustí 10 g kyseliny borité v 200 ml 95–96 % (v/v) ethanolu a 700 ml vody. Přidá se 10 ml indikátoru (3.2). Roztok se promíchá a v případě potřeby se přidá roztok hydroxidu sodného, dokud roztok nezíská světle červenou barvu. 1 ml tohoto roztoku může vázat až 300 μg NH3.

3.4	Nasycený roztok uhličitanu draselného: 100 g uhličitanu draselného se rozpustí ve 100 ml vroucí vody. Po ochlazení se roztok filtruje.

3.5	Kyselina sírová, 0,01 mol/l.

4.   Přístroje a pomůcky

4.1	Míchací zařízení: přibližně 35 až 40 otáček/min.

4.2	Skleněné nebo plastové Conwayovy misky (viz vyobrazení).

4.3	Mikrobyrety s dělením 1/100 ml.

5.   Postup

Do 200 ml odměrné baňky se naváží 10 g vzorku s přesností na 1 mg, přidá se 100 ml vody a míchá se 30 minut v míchacím zařízení. Pak se přidá 50 ml kyseliny trichloroctové (3.1), doplní vodou po značku, důkladně se protřepe a přefiltruje přes skládaný filtr.

Na střed Conwayovy misky se napipetuje 1 ml roztoku kyseliny borité (3.3), okolo ní po obvodu misky se napipetuje 1 ml přefiltrovaného vzorku. Miska se částečné zakryje víkem, potřeným tukem, pak se rychle přidá 1 ml nasyceného roztoku uhličitanu draselného (3.4) na obvod misky a miska se vzduchotěsně uzavře. Aby s jistotou došlo ke smíchání reagenčních činidel, je nutno miskou opatrně otáčet ve vodorovné poloze. Pak se nechá směs stát minimálně 4 hodiny při laboratorní teplotě nebo 1 hodinu při teplotě 40 oC.

Těkavé dusíkaté báze v roztoku kyseliny borité se pak titrují kyselinou sírovou (3.5) pomocí mikrobyrety (4.3).

Stejným způsobem se provede slepá zkouška bez zkoušeného vzorku.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

1 ml 0,01 mol/l H2SO4 odpovídá 0,34 mg amoniaku.

Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí přesáhnout:

—	10 % relat. u obsahu amoniaku nižšího než 1,0 %,

—	0,1 % absol. u obsahu amoniaku 1,0 % nebo vyššího.

7.   Poznámka

Obsahuje-li vzorek více než 0,6 % amoniaku, je nutno původní filtrát zředit.

CONWAYOVA MISKA

Poměr 1/1

II.   DESTILACE

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu těkavých dusíkatých bází, vyjádřených jako amoniak, v rybích moučkách, které neobsahují prakticky žádnou močovinu. Metoda je použitelná pouze u obsahu amoniaku nižšího než 0,25 %.

2.   Princip

Vzorek se extrahuje vodou, roztok se vyčeří a přefiltruje. Těkavé dusíkaté báze se vytěsní za varu po přidání oxidu hořečnatého a zachycují se v předepsaném množství kyseliny sírové. Přebytek kyseliny sírové se titruje roztokem hydroxidu sodného.

3.   Chemikálie

3.1	Kyselina trichloroctová, roztok 20 % (w/v).

3.2	Oxid hořečnatý.

3.3	Odpěňovací emulze (např. silikonový olej).

3.4	Kyselina sírová, 0,05 mol/l.

3.5	Roztok hydroxidu sodného, 0,1 mol/l.

3.6	Roztok methylčerveně 0,3 % v 95–96 % (v/v) ethanolu.

4.   Přístroje a pomůcky

4.1	Míchací zařízení: přibližně 35 až 40 otáček/min.

4.2	Kjeldahlova destilační aparatura.

5.   Postup

Do 200 ml odměrné baňky se naváží 10 g vzorku s přesností na 1 mg, přidá se 100 ml vody a míchá se 30 minut v míchacím zařízení. Pak se přidá 50 ml roztoku kyseliny trichloroctové (3.1), doplní se vodou po značku, důkladně se protřepe a přefiltruje přes skládaný filtr.

Podle předpokládaného obsahu těkavých dusíkatých bází se odpipetuje odpovídající množství čirého filtrátu (obvykle 100 ml), zředí se na 200 ml a přidají se 2 g oxidu hořečnatého (3.2) a několik kapek odpěňovací emulze (3.3). Roztok musí na lakmusový papírek reagovat alkalicky; v opačném případě je nutno ještě přidat oxid hořečnatý (3.2). Dále se postupuje podle bodů 5.2 a 5.3 metody laboratorního zkoušení pro stanovení obsahu dusíkatých látek (část C této přílohy).

Stejným způsobem se provede slepá zkouška, ale bez zkoušeného vzorku.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

1 ml 0,05 mol/l H2SO4 odpovídá 1,7 mg amoniaku.

Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí překročit hodnotu 10 % amoniaku v relativní hodnotě.

F.   STANOVENÍ OBSAHU AMINOKYSELIN (KROMĚ TRYPTOFANU)

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu volných (syntetických a přírodních) a celkových (peptidy vázané a volné) aminokyselin v krmivech za použití analyzátoru aminokyselin. Metoda je použitelná pro tyto aminokyseliny: cyst(e)in, methionin, lysin, threonin, alanin, arginin, kyselinu asparagovou, kyselinu glutamovou, glycin, histidin, isoleucin, leucin, fenylalanin, prolin, serin, tyrosin a valin.

Tato metoda nerozlišuje mezi solemi aminokyselin a nemůže také u aminokyselin rozlišovat mezi formami D a L. Není použitelná pro stanovení tryptofanu nebo hydroxyanalogů aminokyselin.

2.   Princip

2.1   Volné aminokyseliny

Volné aminokyseliny se extrahují zředěnou kyselinou chlorovodíkovou. Současně extrahované dusíkaté makromolekuly se vysráží kyselinou sulfosalicylovou a odstraní se filtrací. Přefiltrovaný roztok se upraví na pH 2,20. Aminokyseliny se separují katexovou chromatografií a stanoví se po reakci s ninhydrinem fotometrickou detekcí při 570 nm.

2.2   Celkové aminokyseliny

Zvolený proces závisí na zkoumaných aminokyselinách. Cyst(e)in a methionin musí být před hydrolýzou oxidovány na kyselinu cysteovou a na methioninsulfon. Tyrosin se musí stanovovat v hydrolyzátech neoxidovaných vzorků. Ostatní aminokyseliny uvedené v bodě 1 mohou být stanovovány buď v oxidovaném, nebo v neoxidovaném vzorku.

Oxidace se provádí při 0 oC směsí kyseliny permravenčí a fenolu. Nadbytečné oxidační činidlo se rozloží dvojsíranem sodným. Oxidovaný nebo neoxidovaný vzorek se hydrolyzuje kyselinou chlorovodíkovou (3.20) po 23 hodin. Hydrolyzát se upraví na pH 2,20. Aminokyseliny se separují katexovou chromatografií a stanovují se po reakci s ninhydrinem fotometrickou detekcí při 570 nm (440 nm pro prolin).

3.   Chemikálie

Musí být použita dvakrát destilovaná voda nebo voda obdobné jakosti (vodivost < 10 μS).

3.1	Peroxid vodíku, w (w/w) = 30 %.

3.2	Kyselina mravenčí, w (w/w) = 98–100 %.

3.3

Fenol.

3.4	Disiřičitan sodný.

3.5	Hydroxid sodný.

3.6	Kyselina 5-sulfosalicylová, dihydrát.

3.7	Kyselina chlorovodíková o hustotě přibližně 1,18 g/ml.

3.8	Citronan sodný, dihydrát.

3.9	2,2'-thiodiethanol (thiodiglykol).

3.10	Chlorid sodný.

3.11	Ninhydrin.

3.12	Petrolether, bod varu 40–60 o C.

3.13	Norleucin nebo jiná sloučenina použitelná jako vnitřní standard.

3.14	Dusík, plyn (< 10 ppm kyslíku).

3.15	1-oktanol.

3.16	Aminokyseliny.

3.16.1

Standardní látky uvedené v bodě 1. Čisté sloučeniny neobsahující krystalizační vodu. Vysuší se ve vakuu nad P2O5 nebo H2SO4 týden před použitím.

3.16.2

Kyselina cysteová.

3.16.3

Methioninsulfon.

3.17	Roztok hydroxidu sodného, c = 7,5 mol/l: 300 g NaOH (3.5) se rozpustí ve vodě a doplní na 1 litr.

3.18	Roztok hydroxidu sodného, c = 1 mol/l: 40 g NaOH (3.5) se rozpustí ve vodě a doplní na 1 litr.

3.19	Roztok kyseliny mravenčí a fenolu: smíchá se 889 g kyseliny mravenčí (3.2) se 111 g vody a přidá se 4,73 g fenolu (3.3).

3.20	Hydrolyzační směs, c = 6 mol HCl/l s přídavkem 1 g fenolu/l: do 492 ml HCl (3.7) se přidá 1 g fenolu (3.3) a doplní se vodou na 1 litr.

3.21	Extrakční směs, c = 0,1 mol HCl/l s přídavkem 2 % thiodiglykolu: 8,2 ml HCl (3.7) se rozředí přibližně 900 ml vody, přidá se 20 ml thiodiglykolu (3.9) a doplní se vodou na 1 litr (nemíchat 3.7 a 3.9 přímo).

3.22	Kyselina 5-sulfosalicylová, β = 6 %: 60 g kyseliny 5-sulfosalicylové (3.6) se rozpustí ve vodě a doplní se vodou na 1 litr.

3.23

Oxidační směs (kyselina permravenčí – fenol): v malé kádince se smíchá 0,5 ml peroxidu vodíku (3.1) s 4,5 ml roztoku kyseliny mravenčí a fenolu (3.19). Ponechá se v klidu jednu hodinu při 20–30 oC, aby se utvořila kyselina permravenčí, před přidáním ke vzorku se směs ochladí v lázni s ledovou vodou (15 minut). Pozor: je nutno zamezit kontaktu s kůží a používat ochranný oděv.

3.24	Citrátový tlumivý roztok, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: v přibližně 800 ml vody se rozpustí 19,61 g citronanu sodného (3.8), 5 ml thiodiglykolu (3.9), 1 g fenolu (3.3) a 16,50 ml HCl (3.7). pH se upraví na 2,20. Doplní se vodou na 1 litr.

3.25	Eluční tlumivé roztoky připravované podle podmínek pro použitý analyzátor (4.9).

3.26	Ninhydrinové činidlo připravované podle podmínek pro použitý analyzátor (4.9).

3.27	Standardní roztoky aminokyselin. Tyto roztoky se uchovávají při teplotě pod 5 oC.

3.27.1

Zásobní standardní roztok aminokyselin (3.16.1), c = 2,5 μmol/ml pro každou aminokyselinu v kyselině chlorovodíkové. Tento roztok lze obdržet i komerčně připravený.

3.27.2

Zásobní standardní roztok kyseliny cysteové a methioninsulfonu, c = 1,25 μmol/ml. Do 1 000 ml odměrné baňky se naváží 0,2115 g kyseliny cysteové (3.16.2) a 0,2265 g methioninsulfonu (3.16.3), rozpustí se v citrátovém tlumivém roztoku (3.24) a doplní se jím po značku. Skladuje se při teplotě pod 5 oC nejdéle 12 měsíců. Tento roztok se nepoužívá, pokud zásobní standardní roztok (3.27.1) obsahuje kyselinu cysteovou a methioninsulfon.

3.27.3

Zásobní standardní roztok vnitřního standardu, např. norleucinu, c = 20 μmol/ml. Do 250 ml odměrné baňky se naváží 0,6560 g norleucinu (3.13), rozpustí se v citrátovém tlumivém roztoku (3.24) a doplní se jím po značku. Skladuje se při teplotě pod 5 oC nejdéle 6 měsíců.

3.27.4

Kalibrační standardní roztok aminokyselin pro použití s hydrolyzáty, c = 5 nmol/50 μl u kyseliny cysteové a methioninsulfonu a c = 10 nmol/50 μl u ostatních aminokyselin. Ve 100ml kádince se rozpustí 2,2 g chloridu sodného (3.10) v 30 ml citrátového tlumivého roztoku (3.24). Přidají se 4,00 ml zásobního standardního roztoku aminokyselin (3.27.1), 4,00 ml zásobního standardního roztoku kyseliny cysteové a methioninsulfonu (3.27.2) a 0,50 ml zásobního standardního roztoku vnitřního standardu (3.27.3), pokud se používá. pH se upraví na 2,20 hydroxidem sodným (3.18). Roztok se kvantitativně převede do 50ml odměrné baňky, doplní se po značku citrátovým tlumivým roztokem (3.24) a zamíchá. Skladuje se při teplotě pod 5 oC nejdéle 3 měsíce. Viz také poznámka 9.1.

3.27.5

Kalibrační standardní roztok aminokyselin pro použití s hydrolyzáty připravenými podle bodu 5.3.3.1 a s extrakty (5.2). Kalibrační roztok se připravuje podle bodu 3.27.4 s vynecháním chloridu sodného. Skladuje se při teplotě pod 5 oC nejdéle 3 měsíce.

4.   Přístroje a pomůcky

4.1	Baňka s kulatým dnem o obsahu 100 nebo 250 ml opatřená zpětným chladičem.

4.2	Láhev z borosilikátového skla o obsahu 100 ml se šroubovým uzávěrem s gumovým nebo teflonovým těsněním (např. Duran, Schott) pro použití v sušárně.

4.3	Sušárna s nuceným větráním a tepelnou regulací s přesností lepší než ±2 oC.

4.4	pH metr (tři desetinná místa).

4.5	Membránový filtr (0,22 μm).

4.6	Odstředivka.

4.7	Rotační vakuová odparka.

4.8	Mechanická třepačka nebo magnetické míchací zařízení.

4.9

Analyzátor aminokyselin nebo zařízení HPLC s katexovou kolonou, zařízením pro ninhydrin postkolonovou derivatizaci a fotometrickým detektorem. Kolona se naplní sulfonovanou polystyrenovou pryskyřicí, která umožňuje vzájemné oddělení aminokyselin a oddělení od jiných ninhydrin-pozitivních látek. Průtok tlumivého roztoku a ninhydrinu zajišťují čerpadla se stálostí průtoku ±0,5 % po dobu zahrnující standardní kalibraci i zkoušku vzorku. Některé analyzátory aminokyselin je možno použít také v případě, že hydrolyzát vykazuje koncentraci sodíkových iontů c = 0,8 mol/l a obsahuje zbytkovou kyselinu mravenčí z oxidačního kroku. Jiné analyzátory nezaručují uspokojivé oddělení určitých aminokyselin, obsahuje-li hydrolyzát nadbytečnou kyselinu mravenčí a/nebo vysoké koncentrace sodíkových iontů. V takovém případě se sníží objem kyseliny před úpravou pH odpařením hydrolyzátu na objem asi 5 ml. Odpaření se provádí ve vakuu při teplotě nejvýše 40 oC.

5.   Postup

5.1   Příprava vzorku

Vzorek se upraví mletím tak, aby prošel sítem s oky 0,5 mm. Vzorky s vysokou vlhkostí se musí před mletím vysušit na vzduchu při teplotě nepřesahující 50 oC nebo při zmrazení. Vzorky s vysokým obsahem tuku se před mletím extrahují petroletherem (3.12).

5.2   Stanovení volných aminokyselin v krmivech a v premixech

Do kónické baňky se naváží příslušné množství (1–5 g) upraveného vzorku (5.1) s přesností na 0,2 mg a přidá se 100,0 ml extrakční směsi (3.21). Směs se třepe 60 minut na mechanické třepačce nebo míchá na magnetickém míchacím zařízení (4.8). Po usazení sedimentu se odpipetuje 10,0 ml supernatantu do 100 ml kádinky.

Za stálého míchání se přidá 5,0 ml roztoku sulfosalicylové kyseliny (3.22) a pokračuje se v míchání na magnetickém míchacím zařízení dalších 5 minut. Supernantant se přefiltruje nebo odstředí tak, aby se odstranila veškerá sraženina. 10,0 ml odstředěného roztoku se přenese do 100 ml kádinky, pH se upraví na 2,20 pomocí roztoku hydroxidu sodného (3.18), potom se roztok převede pomocí citrátového tlumivého roztoku (3.24) do odměrné baňky přiměřené velikosti a doplní po značku tlumivým roztokem (3.24).

Použije-li se vnitřní standard, přidá se 1,00 ml roztoku vnitřního standardu (3.27.3) na každých 100 ml odstředěného roztoku a potom se doplní po značku tlumivým roztokem (3.24).

Dále se pokračuje podle bodu 5.4 – chromatografie.

Nejsou-li extrakty zkoušeny týž den, uchovávají se při teplotě pod 5 oC.

5.3   Stanovení celkových aminokyselin

5.3.1   Oxidace

0,1–1 g upraveného vzorku (5.1) se odváží s přesností na 0,2 mg:

—	do 100 ml baňky s kulatým dnem (4.1) pro otevřenou hydrolýzu (5.3.2.3) nebo

—	do 250 ml baňky s kulatým dnem (4.1), požaduje-li se nízká koncentrace sodíku (5.3.3.1), nebo

—	do nádoby o obsahu 100 ml se šroubovací uzávěrem (4.2) (pro uzavřenou hydrolýzu 5.3.2.4).

Navážka vzorku musí mít obsah dusíku asi 10 mg a obsah vlhkosti nepřesahující 100 mg.

Baňka/nádoba se umístí do lázně s ledovou vodou a ochladí se na 0 oC, potom se přidá 5 ml oxidační směsi (3.23) a promíchá se skleněnou lžící se zahnutou špičkou. Baňka/nádoba se uzavře i se lžící vzduchotěsnou fólií a vloží se i s lázní s ledovou vodou do chladničky a ponechá se v ní 16 hodin při 0 oC. Po 16 hodinách se vyjme z chladničky a přebytečné oxidační činidlo se rozloží přidáním 0,84 g disiřičitanu sodného (3.4).

Dále se postupuje podle bodu 5.3.2.1.

5.3.2   Hydrolýza

5.3.2.1    Hydrolýza oxidovaných vzorků

K oxidovanému vzorku připravenému podle bodu 5.3.1 se přidá 25 ml hydrolyzační směsi (3.20) tak, aby neulpěl žádný vzorek na stěnách nádoby ani na lžíci.

Podle zvoleného postupu hydrolýzy se pokračuje podle bodu 5.3.2.3 nebo 5.3.2.4.

5.3.2.2    Hydrolýza neoxidovaných vzorků

Do baňky s kulatým dnem o obsahu 100 ml nebo 250 ml (4.1) nebo do láhve o obsahu 100 ml se šroubovacím uzávěrem (4.2) se naváží 0,1–1 g upraveného vzorku (5.1) s přesností na 0,2 mg. Navážka vzorku musí mít obsah dusíku asi 10 mg. Opatrně se přidá 25 ml hydrolyzační směsi (3.20) a smíchá se vzorkem. Dále se postupuje podle bodu 5.3.2.3 nebo 5.3.2.4.

5.3.2.3    Otevřená hydrolýza

Ke směsi v baňce (připravené podle bodu 5.3.2.1 nebo 5.3.2.2) se přidají 3 skleněné kuličky a směs se uvede do mírného varu pod zpětným chladičem na dobu 23 hodin. Po skončení hydrolýzy se zpětný chladič promyje 5 ml citrátového tlumivého roztoku (3.24). Baňka se odpojí a ochladí se v ledové lázni.

Dále se postupuje podle bodu 5.3.3.

5.3.2.4    Uzavřená hydrolýza

Baňka se směsí připravenou podle bodu 5.3.2.1 nebo 5.3.2.2 se umístí do sušárny (4.3) při 110 oC. Aby se během první hodiny zabránilo narůstání tlaku (v důsledku vyvíjení plynných látek) a aby nedošlo k výbuchu, položí se šroubovací uzávěr volně na baňku. Nádoba se neuzavírá. Po uplynutí jedné hodiny se uzávěr zašroubuje a uzavřená baňka se ponechá v sušárně (4.3) 23 hodin. Po skončení hydrolýzy se baňka vyjme ze sušárny, opatrně se odšroubuje uzávěr a baňka se postaví do lázně s ledovou vodou. Nechá se vychladnout.

Podle zvoleného postupu pro úpravu pH (5.3.3) se obsah baňky kvantitativně převede pomocí citrátového tlumivého roztoku (3.24) do 250ml kádinky nebo do 250ml baňky s kulatým dnem.

Dále se postupuje podle bodu 5.3.3.

5.3.3   Úprava pH

Podle toho, jakou toleranci k sodíku má analyzátor aminokyselin (4.9), postupuje se při úpravě pH podle bodu 5.3.3.1 nebo 5.3.3.2.

5.3.3.1    Pro chromatografické systémy (4.9) vyžadující nízkou koncentraci sodíku

Pokud analyzátor aminokyselin vyžaduje nízkou koncentraci sodíku (má-li se snížit obsah kyselin), doporučuje se použít vnitřní zásobní standardní roztok (3.27.3).

V takovém případě se před odpařováním přidají do hydrolyzátu 2,00 ml vnitřního zásobního standardního roztoku (3.27.3).

Do hydrolyzátu připraveného podle bodu 5.3.2.3 nebo 5.3.2.4 se přidají 2 kapky 1-oktanolu (3.15).

Na rotační odparce (4.7) se sníží objem na 5–10 ml za vakua při 40 oC. Pokud by se objem při odpařování snížil pod 5 ml, hydrolyzát je třeba odstranit a zkoušku zahájit znovu.

pH se upraví na 2,20 roztokem hydroxidu sodného (3.18) a dále se postupuje podle bodu 5.3.4.

5.3.3.2    Pro všechny ostatní analyzátory aminokyselin (4.9)

Hydrolyzáty připravené podle bodu 5.3.2.3 nebo 5.3.2.4 se částečně zneutralizují opatrným přidáním 17 ml roztoku hydroxidu sodného (3.17) za stálého míchání a při zaručené teplotě pod 40 oC.

pH se upraví na 2,20 roztokem hydroxidu sodného (3.17) a nakonec roztokem hydroxidu sodného (3.18) při laboratorní teplotě. Dále se postupuje podle bodu 5.3.4.

5.3.4   Roztok vzorku pro chromatografii

Hydrolyzát (5.3.3.1 nebo 5.3.3.2) s upraveným pH se kvantitativně převede pomocí citrátového tlumivého roztoku (3.24) do 200 ml odměrné baňky a doplní se po značku tlumivým roztokem (3.24).

Nebyl-li dosud použit vnitřní standard, přidají se 2,00 ml vnitřního standardu (3.27.3) a potom se doplní po značku citrátovým tlumivým roztokem (3.24). Důkladně se promíchá.

Dále se pokračuje v chromatografii (5.4).

Nejsou-li roztoky vzorků zkoušeny týž den, uchovávají se při teplotě pod 5 oC.

5.4   Chromatografie

Před chromatografií musí mít extrakt (5.2) nebo hydrolyzát (5.3.4) laboratorní teplotu. Směs se protřepe a potřebné množství se přefiltruje membránovým filtrem 0,22 μm (4.5). Výsledný čirý roztok se podrobí katexové chromatografii s použitím analyzátoru aminokyselin (4.9).

Nástřik lze provést ručně nebo automaticky. Přitom je důležité, aby se do kolony přidávalo stejné množství roztoku ±0,5 % pro zkoušení standardů a vzorků s výjimkou případu, kdy je použit vnitřní standard. Rovněž poměr sodíku a aminokyselin by měl být v standardních roztocích a v roztocích vzorků co možná nejpodobnější.

Frekvence kalibrace závisí hlavně na stabilitě ninhydrinového činidla a analytického systému. Standard nebo vzorek se ředí citrátovým tlumivým roztokem (3.24) tak, aby plocha píku standardu tvořila 30–200 % plochy píku roztoku vzorků pro jednotlivé aminokyseliny.

Chromatografie aminokyselin se mírně liší v závislosti na typu použitého analyzátoru a použitého ionexu. Zvolený systém musí být schopen oddělit jednotlivé aminokyseliny od sebe navzájem i od ostatních ninhydrin-pozitivních materiálů. V rozsahu svého působení musí chromatografický systém lineárně reagovat na změny objemů aminokyselin přidaných do kolony.

Při zkoušení equimolárního roztoku (zkoušených aminokyselin) by mělo být při chromatografii dosaženo níže uvedených poměrů sedla k vrcholu píku. Tento equimolární roztok musí obsahovat nejméně 30 % maximálního obsahu jednotlivých aminokyselin, což může být přesně měřeno na použitém analyzátoru aminokyselin (4.9).

Při separaci threoninu a serinu nesmí poměr výšek sedla a vrcholu nižšího z píku překrývajících se aminokyselin na chromatogramu přesahovat 2 : 10 (pokud se stanovuje pouze cyst(e)in, methionin, threonin a lysin, je stanovení nepříznivě ovlivněno nedostatečnou separací od přilehlých píků). Pro všechny ostatní aminokyseliny musí být separace lepší než 1 : 10.

Systém musí zaručit, že lysin bude separován od „lysinových náhražek“ a ornithinu.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Plocha píků vzorku a standardu se měří pro každou jednotlivou aminokyselinu a vypočítává se množství (X) aminokyseliny v g na kg vzorku.

Je-li použit vnitřní standard, násobí se výsledek:

A	=	plocha píku hydrolyzátu nebo extraktu
B	=	plocha píku kalibračního standardního roztoku
C	=	plocha píku vnitřního standardu v hydrolyzátu nebo v extraktu
D	=	plocha píku vnitřního standardu v kalibračním standardním roztoku
M	=	molekulární hmotnost stanovované aminokyseliny
c	=	koncentrace standardu v μmol/ml
m	=	hmotnost navážky vzorku v g (korigovaná na původní hmotnost, pokud je vzorek vysušen nebo odtučněn)
V	=	celkový objem hydrolyzátu (5.3.4) v ml nebo celkový objem zředěného extraktu (6.1)

Cystin a cystein se v hydrolyzátech oxidovaného vzorku stanovují jako kyselina cysteová, ale vypočítávají se jako cystin (C6H12N2O4S2, MV 240,30 g/mol) s použitím MV 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Methionin se v hydrolyzátech oxidovaného vzorku stanovuje jako methioninsulfon, ale vypočítává se jako methionin s použitím MV methioninu: 149,21 g/mol.

Přidaný volný methionin se stanovuje po extrakci jako methionin, pro výpočet se použije stejná MV.

6.1	Celkový objem zředěného extraktu (F) při stanovení volných aminokyselin (5.2) se vypočítá podle následujícího vzorce: V = objem výsledného extraktu.

7.   Ověření metody

Tato metoda byla vyzkoušena porovnáním na mezinárodní úrovni v roce 1990 při použití čtyř různých krmiv (krmná směs pro prasata, kombinované krmivo pro brojlery, proteinový koncentrát, premix). Po vyloučení odlehlých hodnot jsou výsledky středních a standardních odchylek uvedeny v následujících tabulkách:

Střední hodnoty v g/kg

Referenční materiál	Aminokyselina
	Threonin	Cyst(e)in	Methionin	Lysin
Krmná směs pro prasata	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Kombinované krmivo pro brojlery	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Proteinový koncentrát	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Premix	58,42 n = 16	—	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n = počet zúčastněných laboratoří.

7.1   Opakovatelnost

Opakovatelnost vyjádřená jako „vnitrolaboratorní standardní odchylka“ je uvedena v následujících tabulkách:

Vnitrolaboratorní standardní odchylka (Sr) v g/kg

Referenční materiál	Aminokyselina
	Threonin	Cyst(e)in	Methionin	Lysin
Krmná směs pro prasata	0,13 n = 15	0,10 n = 17	0,11 n = 17	0,26 n = 13
Kombinované krmivo pro brojlery	0,20 n = 16	0,11 n = 18	0,16 n = 18	0,28 n = 16
Proteinový koncentrát	0,48 n = 16	0,13 n = 17	0,27 n = 17	0,99 n = 15
Premix	1,30 n = 16	—	2,19 n = 16	2,06 n = 16
n = počet zúčastněných laboratoří.

Variační koeficient (%) vnitrolaboratorní standardní odchylky (Sr)

Referenční materiál	Aminokyselina
	Threonin	Cyst(e)in	Methionin	Lysin
Krmná směs pro prasata	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Kombinované krmivo pro brojlery	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Proteinový koncentrát	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Premix	2,2 n = 16	—	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n = počet zúčastněných laboratoří.

7.2   Reprodukovatelnost

Výsledky pro mezilaboratorní standardní odchylku vyplývající z výše uvedeného srovnání jsou uvedeny v následující tabulce:

Mezilaboratorní standardní odchylka (SR) v g/kg

Referenční materiál	Aminokyselina
	Threonin	Cyst(e)in	Methionin	Lysin
Krmná směs pro prasata	0,28 n = 15	0,30 n = 17	0,23 n = 17	0,30 n = 13
Kombinované krmivo pro brojlery	0,48 n = 16	0,34 n = 18	0,55 n = 18	0,75 n = 16
Proteinový koncentrát	0,85 n = 16	0,62 n = 17	1,57 n = 17	1,24 n = 15
Premix	2,49 n = 16	—	6,20 n = 16	6,62 n = 16
n = počet zúčastněných laboratoří.

Variační koeficient (%) mezilaboratorní standardní odchylky (SR)

Referenční materiál	Aminokyselina
	Threonin	Cyst(e)in	Methionin	Lysin
Krmná směs pro prasata	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Kombinované krmivo pro brojlery	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Proteinový koncentrát	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Premix	4,3 n = 16	—	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n = počet zúčastněných laboratoří.

8.   Použití referenčních materiálů

Správné použití uvedené metody se ověřuje opakovaným měřením certifikovaných referenčních materiálů, jsou-li k dispozici. Doporučuje se kalibrace certifikovanými kalibračními roztoky aminokyselin.

9.   Poznámky

9.1

Vzhledem k rozdílům mezi analyzátory aminokyselin se výsledné koncentrace kalibračních roztoků standardů aminokyselin (viz 3.27.4 a 3.27.5) a hydrolyzátu (viz 5.3.4) považují za určující. Lineární rozsah přístroje je nutno zkontrolovat pro všechny aminokyseliny. Standardní roztok se ředí citrátovým tlumivým roztokem tak, aby se dosáhlo ploch píků uprostřed tohoto rozsahu.

9.2	Pokud je k analýze hydrolyzátů použito zařízení pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii, musí být podmínky zkoušek optimalizovány v souladu s doporučením výrobce.

9.3	Při použití této metody u krmiv obsahujících více než 1 % chloridu (koncentráty, minerální krmiva, doplňková krmiva) může dojít k podhodnocení obsahu methioninu, a musí se proto použít speciální postup.

G.   STANOVENÍ OBSAHU TRYPTOFANU

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu celkového a volného tryptofanu v krmivech. Nerozlišuje mezi D- a L- formou.

2.   Princip

Pro stanovení celkového tryptofanu se vzorek hydrolyzuje za alkalických podmínek nasyceným roztokem hydroxidu barnatého při 110 oC po dobu 20 hodin. Po hydrolýze se přidává vnitřní standard.

Pro stanovení volného tryptofanu se vzorek extrahuje za mírně kyselých podmínek v přítomnosti vnitřního standardu.

Tryptofan a vnitřní standard se stanoví v hydrolyzátu nebo extraktu metodou HPLC s fluorescenční detekcí.

3.   Chemikálie

3.1	Dvakrát destilovaná voda nebo voda stejné kvality (vodivost < 10 μS/cm).

3.2	Standardní látka: tryptofan (čistota/obsah ≥ 99 %), vakuově vysušený nad oxidem fosforečným.

3.3	Vnitřní standard: α-methyl-tryptofan (čistota/obsah ≥ 99 %), vakuově vysušený nad oxidem fosforečným.

3.4	Hydroxid barnatý, oktahydrát (Ba(OH)2 . 8 H2O), nesmí být nadměrně vystavován vzduchu, aby nedocházelo ke vzniku BaCO3, který by mohl narušovat stanovení (viz poznámka 9.3).

3.5	Hydroxid sodný.

3.6	Kyselina fosforečná, w (w/w) = 85 %.

3.7	Kyselina chlorovodíková, ρ201,19 g/ml.

3.8	Methanol, pro HPLC.

3.9	Petrolether, bod varu 40–60 oC.

3.10	Roztok hydroxidu sodného, c = 1 mol/l: 40,0 g NaOH (3.5) se rozpustí ve vodě a vodou (3.1) se doplní na 1 litr.

3.11	Kyselina chlorovodíková, c = 6 mol/l: 492 ml HCl (3.7) se doplní vodou na 1 litr.

3.12	Kyselina chlorovodíková, c = 1 mol/l: 82 ml HCl (3.7) se doplní vodou na 1 litr.

3.13	Kyselina chlorovodíková, c = 0,1 mol/l: 8,2 ml HCl (3.7) se doplní vodou na 1 litr.

3.14	Kyselina fosforečná, c = 0,5 mol/l: 34 ml kyseliny fosforečné (3.6) se doplní vodou (3.1) na 1 litr.

3.15	Koncentrovaný roztok tryptofanu (3.2), c = 2,50 μmol/ml: v 500 ml odměrné baňce se rozpustí 0,2553 g tryptofanu (3.2) v kyselině chlorovodíkové (3.13) a doplní se jí po značku. Skladuje se při –18 oC nejdéle 4 týdny.

3.16	Koncentrovaný vnitřní standardní roztok, c = 2,50 μmol/ml: v 500 ml odměrné baňce se rozpustí 0,2728 g α-methyl-tryptofanu (3.3) v kyselině chlorovodíkové (3.13) a doplní se jí po značku. Skladuje se při –18 oC nejdéle 4 týdny.

3.17

Kalibrační standardní roztok tryptofanu a vnitřního standardu: 2,00 ml koncentrovaného roztoku tryptofanu (3.15) a 2,00 ml koncentrovaného roztoku vnitřního standardu α-methyl-tryptofanu (3.16) se zředí vodou (3.1) a methanolem (3.8) přibližně na stejný objem a stejnou koncentraci methanolu (10–30 %) jako v konečném hydrolyzátu. Roztok musí být připravován čerstvý před použitím. Během přípravy musí být roztok chráněn před slunečním světlem.

3.18	Kyselina octová.

3.19	1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol.

3.20	Ethanolamin w (w/w) > 98 %.

3.21	Roztok 1 g 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanolu (3.19) ve 100 ml methanolu (3.8).

3.22	Mobilní fáze pro HPLC: 3,00 g kyseliny octové (3.18) + 900 ml vody (3.1) +50,0 ml roztoku (3.21) 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanolu (3.19) v methanolu (3.8) (1 g/100 ml). pH se upraví ethanolaminem (3.20) na hodnotu 5,00. Doplní se vodou (3.1) na 1 000 ml.

4.   Přístroje a pomůcky

4.1	HPLC vybavení s fluorometrickým detektorem.

4.2	Kolona pro kapalinovou chromatografii, 125 mm × 4 mm, C18, náplň 3 μm, nebo obdobná.

4.3

pH metr.

4.4	Nádoba polypropylenová s širokým hrdlem a šroubovacím uzávěrem o objemu 125 ml.

4.5	Membránový filtr, 0,45 μm.

4.6	Autokláv, 110 (±2) oC, 1,4 (±0,1) bar.

4.7	Mechanická třepačka nebo magnetické míchací zařízení.

4.8	Ponorný mixér.

5.   Postup

5.1   Příprava vzorků

Vzorek se upraví mletím tak, aby prošel sítem s oky 0,5 mm. Vzorky s vysokým obsahem vlhkosti musí být před mletím předsušeny buď na vzduchu při teplotě do 50 oC, nebo při zmrazení. Vzorky s vysokým obsahem tuku se před mletím extrahují petroletherem (3.9).

5.2   Stanovení volného tryptofanu (extrakt)

Vhodné množství (1–5 g) upraveného vzorku (5.1) se naváží s přesností na 1 mg do kónické baňky. Přidá se 100,0 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové (3.13) a 5,00 ml koncentrovaného roztoku vnitřního standardu (3.16). Směs se třepe nebo míchá 60 minut na mechanické třepačce nebo magnetickém míchacím zařízení (4.7). Sediment se nechá usadit a odpipetuje se 10,0 ml supernatantu do kádinky. Přidá se 5 ml roztoku kyseliny fosforečné (3.14). pH se upraví roztokem hydroxidu sodného (3.10) na 3,0. Přidá se tolik methanolu (3.8), aby jeho konečná koncentrace v roztoku byla 10–30 %. Roztok se převede do odměrné baňky vhodného objemu a zředí se vodou na objem potřebný pro chromatografické stanovení (přibližně stejný objem, jako mají kalibrační standardní roztoky (3.17)).

Před nástřikem na kolonu HPLC se přefiltruje několik ml roztoku přes 0,45 μm membránový filtr (4.5). Dále se postupuje podle bodu 5.4 – chromatografie.

Standardní roztok a extrakty je nutno chránit před přímým slunečním světlem. Pokud není možné provést zkoušku tentýž den, extrakty lze skladovat při 5 oC nejvýše tři dny.

5.3   Stanovení celkového tryptofanu (hydrolyzát)

Do polypropylenové nádoby (4.4) se naváží 0,1–1 g upraveného vzorku (5.1) s přesností na 0,2 mg. Obsah dusíku v navážce vzorku je asi 10 mg. Přidá se 8,4 g oktahydrátu hydroxidu barnatého (3.4) a 10 ml vody. Promíchá se ponorným mixerem (4.8) nebo na magnetickém míchacím zařízení (4.7). Magnet s teflonovým povrchem se ponechá ve směsi. Stěny nádoby se opláchnou 4 ml vody. Nádoba se uzavře a víčko se volně dotáhne. Uzavřená nádoba se umístí na 30–60 minut do autoklávu (4.6) s vroucí vodou a párou. Potom se autokláv uzavře a směs se hydrolyzuje 20 hodin při teplotě 110 (± 2) oC.

Před otevřením autoklávu se sníží teplota pod 100 oC. Aby se zabránilo krystalizaci Ba(OH)2 . 8 H2O, přidá se k horké směsi 30 ml vody o laboratorní teplotě. Mírně se zamíchá nebo protřepe. Přidají se 2,00 ml roztoku koncentrovaného vnitřního standardu α-methyl-tryptofanu (3.16). Nádoba se vychladí 15 minut ve vodní lázni s ledem.

Dále se přidá 5 ml roztoku kyseliny fosforečné (3.14). Nádoba se ponechá v ledové lázni a za stálého míchání se neutralizuje roztokem kyseliny chlorovodíkové (3.11) a potom se pH upraví roztokem kyseliny chlorovodíkové (3.12) na hodnotu 3,0. Přidá se tolik methanolu, aby jeho výsledná koncentrace v konečném objemu byla 10–30 %. Roztok se převede do odměrné baňky vhodného objemu a zředí se vodou na stanovený objem, který je nutný pro chromatografické stanovení (např. 100 ml). Přídavek methanolu nesmí způsobit tvorbu sraženiny.

Před nástřikem na kolonu HPLC se přefiltruje několik ml roztoku přes 0,45 μm membránový filtr (4.5). Dále se postupuje podle bodu 5.4 – chromatografie.

Standardní roztok a hydrolyzáty je nutno chránit před přímým slunečním světlem. Pokud není možné provést zkoušku tentýž den, hydrolyzáty lze skladovat při 5 oC nejvýše tři dny.

5.4   Stanovení HPLC

Následující podmínky izokratické eluce jsou pouze doporučené; mohou být použity jiné podmínky za předpokladu, že poskytují rovnocenné výsledky (viz poznámky 9.1 a 9.2):

Kolona pro kapalinovou chromatografii (4.2):	125 mm  ×  4 mm, C18, náplň 3 μm, nebo obdobná
Teplota kolony:	laboratorní teplota
Mobilní fáze (3.22):	3,00 g kyseliny octové (3.18) + 900 ml vody (3.1) +50,0 ml roztoku (3.21) 1,1,1- trichlor-2-methyl-2-propanolu (3.19) v methanolu (3.8) (1 g/100 ml). pH se upraví na 5,00 ethanolaminem (3.20). Objem se doplní na 1 000 ml vodou (3.1).
Průtok:	1 ml/min
Celková doba zkoušky:	asi 34 minut
Detekční vlnová délka:	excitace: 280 nm, emise: 356 nm
Objem nástřiku:	20 μl.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Obsah tryptofanu (X) v g na 100 g vzorku se vypočte podle následujícího vzorce:

A	=	plocha píku vnitřního standardu v kalibračním standardním roztoku (3.17)
B	=	plocha píku tryptofanu v extraktu (5.2) nebo hydrolyzátu (5.3)
V1	=	objem koncentrovaného roztoku tryptofanu (3.15) přidaného do kalibračního roztoku (3.17) v ml (2 ml)
c	=	koncentrace tryptofanu v koncentrovaném roztoku tryptofanu (3.15) přidaném do kalibračního roztoku (3.17) v μmol/ml (= 2,50)
V2	=	objem koncentrovaného roztoku vnitřního standardu (3.16) přidaný při extrakci (5.2) (= 5,00 ml) nebo do hydrolyzátu (5.3) v ml (= 2,00 ml)
C	=	plocha píku vnitřního standardu v extraktu (5.2) nebo hydrolyzátu (5.3)
D	=	plocha píku tryptofanu v kalibračním standardním roztoku (3.17)
V3	=	objem koncentrovaného roztoku vnitřního standardu (3.16) přidaného do kalibračního standardního roztoku (3.17) v ml (= 2,00 ml)
m	=	hmotnost navážky vzorku v g (korigovaná na původní hmotnost, pokud byl vzorek vysušen a/nebo odtučněn)
M	=	molekulární hmotnost tryptofanu (= 204,23 g/mol).

7.   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí překročit 10 % relat. z hodnoty nejvyššího výsledku.

8.   Výsledky kruhových testů

ES uspořádala kruhové testy (4. porovnání) pro tři vzorky, které byly zkoušeny ve 12 laboratořích, aby byl ověřen postup stanovení celkového tryptofanu (hydrolýza). Každý vzorek byl zkoušen pětkrát. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

	Vzorek 1 Krmivo pro prasata	Vzorek 2 Krmivo pro prasata s přidaným L-tryptofanem	Vzorek 3 Koncentrát pro prasata
L	12	12	12
n	50	55	50
Průměr (g/kg)	2,42	3,40	4,22
sr (g/kg)	0,05	0,05	0,08
r (g/kg)	0,14	0,14	0,22
CVr (%)	1,9	1,6	1,9
SR (g/kg)	0,15	0,20	0,09
R (g/kg)	0,42	0,56	0,25
CVR (%)	6,3	6,0	2,2

L	=	počet laboratoří, které poskytly výsledky
n	=	počet jednotlivých výsledků po vyloučení odlehlých hodnot (určených Cochranovým a Dixonovým testem)
sr	=	standardní odchylka opakovatelnosti
SR	=	standardní odchylka reprodukovatelnosti
r	=	opakovatelnost
R	=	reprodukovatelnost
CVr	=	variační koeficient opakovatelnosti v %
CVR	=	variační koeficient reprodukovatelnosti v %

Další kruhový test ES (3. porovnání) byl proveden na dvou vzorcích ve 13 laboratořích pro ověření postupu extrakce volného tryptofanu. Každý vzorek byl zkoušen pětkrát. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

	Vzorek 4 Směs pšenice a sóji	Vzorek 5 Směs pšenice a sóji (= vzorek 4) s přidaným tryptofanem (0,457 g/kg)
L	12	12
n	55	60
Průměr (g/kg)	0,391	0,931
sr (g/kg)	0,005	0,012
r (g/kg)	0,014	0,034
CVr (%)	1,34	1,34
SR (g/kg)	0,018	0,048
R (g/kg)	0,050	0,134
CVR (%)	4,71	5,11

L	=	počet laboratoří, které poskytly výsledky
n	=	počet jednotlivých výsledků po vyloučení odlehlých hodnot (určených Cochranovým a Dixonovým testem)
sr	=	standardní odchylka opakovatelnosti
SR	=	standardní odchylka reprodukovatelnosti
r	=	opakovatelnost
R	=	reprodukovatelnost
CVr	=	variační koeficient opakovatelnosti v %
CVR	=	variační koeficient reprodukovatelnosti v %

Další kruhový test ES byla proveden na na čtyřech vzorcích v 7 laboratořích pro ověření hydrolýzy tryptofanu. Každý vzorek byl zkoušen pětkrát. Výsledky jsou uvedeny níže.

	Vzorek 1 Krmná směs pro prasata (CRM 117)	Vzorek 2 Nízkotučná rybí moučka (CRM 118)	Vzorek 3 Sójová moučka (CRM 119)	Vzorek 4 Sušené odstředěné mléko (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Průměr (g/kg)	2,064	8,801	6,882	5,236
sr (g/kg)	0,021	0,101	0,089	0,040
r (g/kg)	0,059	0,283	0,249	0,112
CVr (%)	1,04	1,15	1,30	0,76
SR (g/kg)	0,031	0,413	0,283	0,221
R (g/kg)	0,087	1,156	0,792	0,619
CVR (%)	1,48	4,69	4,11	4,22

L	=	počet laboratoří, které poskytly výsledky
n	=	počet jednotlivých výsledků po vyloučení odlehlých hodnot (určených Cochranovým a Dixonovým testem)
sr	=	standardní odchylka opakovatelnosti
SR	=	standardní odchylka reprodukovatelnosti
r	=	opakovatelnost
R	=	reprodukovatelnost
CVr	=	variační koeficient opakovatelnosti v %
CVR	=	variační koeficient reprodukovatelnosti v %.

9.   Poznámky

9.1

Pro lepší oddělení tryptofanu a α-methyl-tryptofanu jsou doporučeny níže uvedené zvláštní podmínky pro chromatografii. Po izokratické eluci následuje gradientové čištění kolony: Kolona pro kapalinovou chromatografii: 125 mm  ×  4 mm, C18, náplň 5 μm, nebo obdobná Teplota kolony: 32 oC Mobilní fáze: A: 0,01 mol/l KH2PO4 a methanol, 95 + 5 (V+V) B: methanol Gradient: 0 min 100 % A 0 % B   15 min 100 % A 0 % B   17 min 60 % A 40 % B   19 min 60 % A 40 % B   21 min 100 % A 0 % B   33 min 100 % A 0 % B Průtok: 1,2 ml/min Celková doba zkoušky: asi 33 minut.

9.2

Chromatografie se může měnit podle typu HPLC a náplně kolony. Zvolený systém musí být schopen oddělit tryptofan a vnitřní standard až na základní „baseline“. Navíc je důležité, aby byly degradační produkty dobře odděleny od tryptofanu a vnitřního standardu. Pro kontrolu obsahu nečistot, které by se mohly eluovat ve stejném čase jako vnitřní standard, se provede zkouška hydrolyzátu bez přidaného vnitřního standardu. Je důležité, aby celková doba zkoušky byla dostatečná pro dokonalé vymytí všech degradačních produktů, jinak může docházet v následujících chromatografiích k interferencím. Chromatografický systém musí v rozsahu měření poskytovat lineární odezvu. Lineární odezva se měří s konstantní (normální) koncentrací vnitřního standardu a různými koncentracemi tryptofanu. Je důležité, aby velikost píků tryptofanu i vnitřního standardu byla v lineárním rozsahu HPLC/fluorescenčního systému. Pokud jsou píky tryptofanu a/nebo vnitřního standardu příliš velké nebo příliš malé, zkouška se zopakuje s jinou navážkou vzorku a/nebo s jiným konečným objemem.

9.3	Hydroxid barnatý Stárnutím hydroxidu barnatého se zhoršuje jeho rozpustnost, což způsobuje, že roztok pro stanovení HPLC není čirý a výsledky obsahu tryptofanu mohou být nízké.

H.   STANOVENÍ OBSAHU TUKU

1.   Účel a rozsah

Touto metodou se stanoví obsah tuku v krmivech. Metoda se nevztahuje na zkoušení olejnatých semen a plodin.

Podle druhu a složení krmiva a podle účelu, pro který se zkouška provádí, se použije jeden ze dvou níže uvedených postupů.

1.1   Postup A – přímo extrahovatelné tuky

Tato metoda je použitelná pro krmiva rostlinného původu s výjimkou těch, která jsou uvedena v postupu B.

1.2   Postup B – celkové tuky

Tato metoda je použitelná pro krmiva živočišného původu a pro všechny krmné směsi. Používá se pro všechny materiály, z nichž není možné tuk zcela extrahovat bez předchozí hydrolýzy (např. lepky, kvasnice, bramborové proteiny a výrobky, které byly podrobeny zpracování, jako je vytlačování, vločkování a zahřívání).

1.3   Interpretace výsledků

Ve všech případech, kdy se dosáhlo postupem B vyššího výsledku než postupem A, je třeba považovat za platnou hodnotu výsledek dosažený postupem B.

2.   Princip

2.1   Postup A

Vzorek se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo se oddestiluje, zbytek se vysuší a zváží.

2.2   Postup B

Vzorek se hydrolyzuje za horka s kyselinou chlorovodíkovou. Směs se ochladí a přefiltruje. Zbytek na filtru se promyje a vysuší a dále se pokračuje ve stanovení podle postupu A.

3.   Chemikálie

3.1	Petrolether, bod varu: 40–60 oC. Bromové číslo musí být menší než 1 a zbytek po odpaření menší než 2 mg/100 ml.

3.2	Síran sodný, bezvodý.

3.3	Kyselina chlorovodíková, c = 3 mol/l.

3.4	Filtrační prostředek, např. Kieselguhr, Hyflo-supercel.

4.   Přístroje a pomůcky

4.1	Extrakční přístroj. Pokud je opatřen sifonem (typ Soxhlet), rychlost refluxu je taková, aby docházelo k 10 přetokům za hodinu; pokud se jedná o typ bezsifonový, reflux je 10 ml za minutu.

4.2	Extrakční patrony neobsahující látky rozpustné v petroletheru a s porozitou odpovídající požadavkům uvedeným v bodu 4.1.

4.3	Sušárna, buď vakuová s teplotou 75 ± 3 oC, nebo horkovzdušná s teplotou 100 ± 3 oC.

5.   Postup

5.1   Postup A (viz bod 8.1)

Do extrakční patrony (4.2) se naváží 5 g vzorku s přesností na 1 mg a patrona se uzavře tukuprostou vatou.

Patrona se umístí do extrakčního přístroje (4.1) a extrahuje se šest hodin petroletherem (3.1). Petroletherový extrakt se jímá do suché, předem zvážené baňky s varnými kamínky (2).

Rozpouštědlo se oddestiluje, zbytek v baňce se vysuší 1,5 hodiny v sušárně (4.3). Nechá se vychladnout v exsikátoru a zváží se. Suší se dalších 30 minut, aby se zajistila konstantní hmotnost tuku (rozdíl mezi dvěma následujícími váženími musí být maximálně 1 mg).

5.2   Postup B

Do 400 ml kádinky nebo do 300ml kónické baňky se naváží 2,5 g vzorku s přesností na 1 mg (viz bod 8.2) a přidá se 100 ml kyseliny chlorovodíkové (3.3) a varné kamínky. Kádinka se přikryje hodinovým sklem nebo se kónická baňka napojí na refluxní chladič. Směs se zahřívá k varu na kahanu nebo na topné desce a potom se udržuje v mírném varu jednu hodinu. Během varu se nesmí částečky vzorku usazovat na stěnách nádoby.

Směs se vychladí a přidá se dostatečné množství filtračního prostředku (3.4), aby se zabránilo ztrátám tuku během filtrace. Filtruje se přes zvlhčený dvojitý filtr, který neobsahuje žádný tuk. Zbytek na filtru se promývá studenou vodou, dokud není filtrát neutrální. Provede se kontrola, zda filtrát neobsahuje žádný tuk, jinak je nutné před hydrolýzou provést extrakci petroletherem podle postupu A.

Dvojitý filtr se zbytkem po hydrolýze se umístí na hodinové sklo a suší se 1,5 hodiny v sušárně (4.3) při 100 ± 3 oC.

Dvojitý filtr s vysušeným zbytkem se vloží do extrakční patrony (4.2) a utěsní se tukuprostou vatou. Patrona se umístí do extrakčního přístroje (4.1) a dále se postupuje podle druhého a třetího odstavce bodu 5.1.

6.   Vyjádření výsledku

Hmotnost zbytku po extrakci se vyjádří jako % tuku ve vzorku.

7.   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku týmž laborantem nesmí překročit:

—	0,2 % v absolutní hodnotě u obsahu tuku do 5 %,

—	4,0 % relat. z hodnoty nejvyššího výsledku u obsahu 5–10 %,

—	0,4 % v absolutní hodnotě u obsahu nad 10 %.

8.   Poznámky

8.1

U výrobků s vysokým obsahem tuků, které se obtížně melou nebo u kterých je obtížné odebrat homogenní redukovaný vzorek, se postupuje následujícím způsobem: Naváží se 20 g vzorku s přesností na 1 mg, promíchá se s 10 nebo více gramy bezvodého síranu sodného (3.2). Extrahuje se petroletherem (3.1) podle bodu 5.1. Získaný extrakt se doplní petroletherem (3.1) na objem 500 ml a promíchá. Do malé, suché, předem zvážené baňky s varnými kamínky se odměří 50 ml tohoto roztoku. Rozpouštědlo se oddestiluje a po vysušení se postupuje podle posledního odstavce bodu 5.1. Ze zbytku po extrakci v patroně se odstraní veškeré rozpouštědlo a zbytek se umele tak, aby prošel sítem s oky 1 mm. Potom se vrátí do extrakční patrony (síran sodný se již nepřidává) a postupuje se podle druhého a třetího odstavce bodu 5.1. Obsah tuku se vypočítá jako procento ze vzorku podle následujícího vzorce: (10m1 + m2)  ×  5 kde: m1 = hmotnost zbytku po první extrakci v gramech (alikvotní části extraktu) m2 = hmotnost zbytku po druhé extrakci v gramech.

8.2	U výrobků s nízkým obsahem tuku se může zvýšit navážka vzorku na 5 g.

8.3	Krmiva pro domácí zvířata, která mají vysoký obsah vody, je třeba před hydrolýzou a extrakcí podle postupu B smíchat s bezvodým síranem sodným.

8.4	V bodě 5.2 může být účinnější při promývání filtračního zbytku použít horkou vodu místo studené.

8.5	U některých krmiv může být zapotřebí prodloužit dobu sušení nad 1,5 hod. Je však třeba zamezit přílišnému vysoušení, které může vést k nižším výsledkům. Je možno použít i mikrovlnnou sušárnu.

8.6	Předextrakce podle postupu A před hydrolýzou a další extrakce podle postupu B se doporučuje u krmiv s obsahem tuku nad 15 %. Do jisté míry to závisí na druhu krmiva a druhu tuku v krmivu.

I.   STANOVENÍ OBSAHU VLÁKNINY

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovit v krmivu organické látky, které neobsahují tuk, jsou nerozpustné v roztoku kyseliny a louhu a jsou běžně nazývány vláknina.

2.   Princip

Vzorek se v případě potřeby odtuční a působí se na něj postupně vroucím roztokem kyseliny sírové a hydroxidu draselného o přesně stanovené koncentraci. Zbytek se oddělí filtrací přes skleněný filtrační kelímek, promyje, vysuší, zváží a spálí při teplotě 475–500 oC. Úbytek váhy po spálení odpovídá obsahu vlákniny ve zkoušeném vzorku.

3.   Chemikálie

3.1	Kyselina sírová, c = 0,13 mol/l.

3.2	Odpěňovací činidlo (např. n-oktanol).

3.3	Filtrační pomůcka (Celit 545 nebo obdobná) žíhaná při 500 oC po 4 hodiny (8.6).

3.4

Aceton.

3.5	Petrolether, bod varu 40–60 oC.

3.6	Kyselina chlorovodíková, c = 0,5 mol/l.

3.7	Roztok hydroxidu draselného, c = 0,23 mol/l.

4.   Přístroje a pomůcky

4.1	Zahřívací jednotka pro hydrolýzu roztokem kyseliny sírové a hydroxidu draselného, s oporou pro filtrační kelímky (4.2) a vybavená vypouštěcím potrubím s kouhoutem na vypouštěné tekutiny a vakuum, popřípadě stlačený vzduch. Každý den se zařízení před použitím pět minut předehřívá s vroucí vodou.

4.2	Skleněný filtrační kelímek s porézní vložkou (fritou) o velikosti pórů 40–90 μm. Před prvním použitím se kelímek několik minut zahřeje na 500 oC a potom vychladí (8.6).

4.3	Hydrolyzační nádobka o obsahu nejméně 270 ml s refluxním chladičem, vhodná pro vaření.

4.4	Laboratorní sušárna s regulací teploty.

4.5	Muflová pec s regulací teploty.

4.6	Extrakční jednotka s oporou pro filtrační kelímky (4.2) vybavená vypouštěcím potrubím s kouhoutem na vakuum a vypouštěné tekutiny.

4.7	Spojovací kroužky pro spojení zahřívací jednotky (4.1), filtračních kelímků (4.2) a hydrolyzační nádobky (4.3) a pro připojení kelímků ke studené extrakční jednotce (4.6).

5.   Postup

Do filtračního kelímku (4.2) se naváží 1 g upraveného vzorku s přesností na 1 mg (viz poznámky 8.1, 8.2 a 8.3) a přidá se 1 g filtrační pomůcky (3.3).

Filtrační kelímek (4.2) se připojí k zahřívací jednotce (4.1) a poté k hydrolyzační nádobce (4.3). Do spojené hydrolyzační nádobky a filtračního kelímku se nalije 150 ml vroucího roztoku kyseliny sírové (3.1) a v případě potřeby se přidá několik kapek odpěňovacího činidla (3.2).

Zahřeje se během 5 (±2) minut k varu a intenzivně se vaří přesně 30 minut.

Otevře se vypouštěcí ventil (4.1) a kyselina sírová se odsaje za použití vakua přes filtrační kelímek a zbytek se promyje asi třikrát 30 ml horké vody, vždy po úplném odsátí kapaliny z kelímku.

Vypouštěcí ventil se uzavře, přidá se 150 ml vroucího roztoku hydroxidu draselného (3.7) do spojené hydrolyzační nádobky a filtračního kelímku a přidá se několik kapek odpěňovacího činidla (3.2). Kapalina se přivede během 5 (±2) minut k varu a intenzivně se vaří přesně 30 minut. Potom se zopakuje filtrace a promývání jako po varu s kyselinou sírovou.

Po skončení promývání a odsávání se odpojí filtrační kelímek se svým obsahem a připojí se ke studené extrakční jednotce (4.6). Za použití vakua se promyje zbytek ve filtračním kelímku třikrát 25 ml acetonu (3.4), promývá se vždy do úplného odsátí acetonu.

Filtrační kelímek se vysuší do konstantní hmotnosti v sušárně při teplotě 130 oC. Po každém vysušení a ochlazení v exsikátoru se vždy rychle zváží. Filtrační kelímek se vloží do muflové pece a spaluje při 475–500 oC nejméně 30 minut do konstantní hmotnosti (úbytek hmotnosti mezi dvěma váženími nesmí být větší než 2 mg).

Po každém spalování a ochlazení nejprve v peci a potom v exsikátoru se zváží.

Provede se slepá zkouška bez zkoušeného vzorku. Úbytek hmotnosti po spalování nesmí být větší než 4 mg.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Obsah vlákniny jako procento vzorku se vypočítá podle následujícho vzorce:

kde:

m	=	hmotnost vzorku v g
m0	=	úbytek hmotnosti po spálení při vlastním stanovení v g
m1	=	úbytek hmotnosti po spálení při slepé zkoušce v g.

7.   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí překročit:

—	0,6 % v absolutní hodnotě u obsahu vlákniny nižšího než 10 %,

—	6 % relat. z hodnoty vyššího výsledku u obsahu vlákniny 10 % a více.

8.   Poznámky

8.1

Krmiva, která obsahují více než 10 % tuku, musí být před zkouškou odtučněna petroletherem (3.5). Filtrační kelímek (4.2) s obsahem se připojí ke studené extrakční jednotce (4.6) a zbytek se promyje třikrát 30 ml petroletheru za použití vakua až do úplného odsátí. Potom se kelímek připojí k zahřívací jednotce (4.1) a pokračuje se podle bodu 5.

8.2

Krmiva obsahující tuk, který nelze přímo extrahovat petroletherem (3.5), musí být odtučněna podle bodu 8.1 a potom ještě jednou po varu s kyselinou. Po varu s kyselinou a následném promytí se filtrační kelímek s obsahem připojí ke studené extrakční jednotce (4.6) a promyje se třikrát 30 ml acetonu a následně třikrát 30 ml petroletheru. Odsaje se do sucha za použití vakua a pokračuje se ve zkoušce podle bodu 5 od přidání hydroxidu draselného.

8.3

Pokud krmivo obsahuje více než 5 % uhličitanů vyjádřených jako uhličitan vápenatý, připojí se filtrační kelímek (4.2) s naváženým vzorkem k zahřívací jednotce (4.1). Vzorek se promyje třikrát 30 ml kyseliny chlorovodíkové (3.6). Po každém přidání kyseliny se filtruje po minutové prodlevě. Nakonec se promyje 30 ml vody a pokračuje se podle bodu 5.

8.4	Pokud se používá přístroj, u kterého je několik filtračních kelímků připojeno k jedné zahřívací jednotce, neprovádí se obě paralelní stanovení u téhož vzorku ve stejné sérii.

8.5	Pokud je po varu s kyselinou nebo louhem obtížné roztok přefiltrovat, použije se stlačený vzduch z vypouštěcího ventilu zahřívací jednotky a potom se pokračuje ve filtraci.

8.6	Teplota spalování nesmí přesáhnout 500 oC, aby se prodloužila životnost skleněných filtračních kelímků. Během zahřívání a ochlazování nesmí být kelímky vystaveny nadměrnému teplotnímu šoku.

J.   STANOVENÍ OBSAHU CUKRŮ

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu redukujících cukrů a veškerých cukrů po inverzi vyjádřených jako glukóza nebo sacharóza s použitím faktoru 0,95. Je použitelná pro krmné směsi. Pro ostatní krmiva jsou používány zvláštní metody. Je-li to nutné, může být obsah laktózy zjištěn zvlášť a potom zahrnut do celkového výsledku.

2.   Princip

Cukry se vyextrahují zředěným ethanolem. Extrakt se vyčeří Carrezovými činidly I a II. Ethanol se odstraní a množství cukru před a po inverzi se stanoví metodou podle Luff-Schorla.

3.   Chemikálie

3.1	Ethanol, 40% roztok (v/v), hustota: 0,948 g/ml při 20 oC, neutralizovaný na fenolftalein.

3.2	Carrezovo činidlo I: ve vodě se rozpustí 21,9 g octanu zinečnatého Zn (CH3COO)2 . 2H2O a 3 g ledové kyseliny octové. Doplní se vodou na 100 ml.

3.3	Carrezovo činidlo II: ve vodě se rozpustí 10,6 g kyanoželeznatanu draselného (ferrokyanidu draselného) K4Fe(CN)6 . 3H2O. Doplní se vodou na 100 ml.

3.4	Methyloranž, 0,1% roztok (w/v).

3.5	Kyselina chlorovodíková 4 mol/l.

3.6	Kyselina chlorovodíková 0,1 mol/l.

3.7	Roztok hydroxidu sodného, 0,1 mol/l.

3.8

Luff-Schoorlovo činidlo: Za opatrného míchání se nalije roztok kyseliny citrónové (3.8.2) do roztoku uhličitanu sodného (3.8.3). Přidá se roztok síranu měďnatého (3.8.1) a doplní se vodou na 1 litr. Nechá se přes noc usadit a pak se přefiltruje. Zkontroluje se koncentrace takto získaného činidla (Cu – 0,05 mol/l; Na2CO3 – 1 mol/l), viz poslední odstavec bodu 5.4. pH tohoto roztoku je přibližně 9,4.

3.8.1

Roztok síranu měďnatého: ve 100 ml vody se rozpustí 25 g síranu měďnatého (Cu SO4 . 5H2O) prostého železa.

3.8.2

Roztok kyseliny citrónové: v 50 ml vody se rozpustí 50 g kyseliny citrónové (C6H8O7 . H2O).

3.8.3

Roztok uhličitanu sodného: v přibližně 300 ml teplé vody se rozpustí 143,8 g bezvodého uhličitanu sodného. Nechá se vychladnout.

3.9	Roztok thiosíranu sodného 0,1 mol/l.

3.10	Roztok škrobu: ve 30 ml vody se rozpustí 5 g škrobu a tato směs se přidá do jednoho litru vroucí vody. Vaří se tři minuty, nechá se vychladnout a v případě potřeby se přidá 10 mg jodidu rtuťnatého jako stabilizátoru.

3.11	Kyselina sírová 3 mol/l.

3.12	Roztok jodidu draselného 30 % (w/v).

3.13	Granulovaná pemza vyvařená v kyselině chlorovodíkové, propraná ve vodě a vysušená.

3.14	3-methylbutan-1-ol (isopenthanol).

4.   Přístroje a pomůcky

Míchací zařízení: přibližně 35–40 otáček/min.

5.   Postup

5.1   Extrakce vzorku

Do 250 ml odměrné baňky se naváží 2,5 g vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se 200 ml ethanolu (3.1) a míchá se po dobu jedné hodiny na míchacím zařízení. Přidá se 5 ml Carrezova činidla I (3.2) a asi 30 sekund se míchá. Přidá se 5 ml Carrezova činidla II (3.2) a znovu se míchá jednu minutu. Doplní se po značku ethanolem (3.1), homogenizuje a přefiltruje. Odpipetuje se 200 ml filtrátu a odpaří se na polovinu objemu, aby se odstranila většina ethanolu. Zbytek po odpařování se kvantitativně převede do 200 ml odměrné baňky pomocí horké vody. Zchladí se, doplní se vodou po značku, homogenizuje a v případě potřeby přefiltruje. Tento roztok se použije pro stanovení obsahu redukujících cukrů a, po inverzi, pro stanovení obsahu veškerých cukrů.

5.2   Stanovení redukujících cukrů

Odpipetuje se maximálně 25 ml roztoku, který obsahuje nejvýše 60 mg redukujících cukrů vyjádřených jako glukóza. V případě potřeby se odpipetovaný objem doplní destilovanou vodou na 25 ml. Obsah redukujících cukrů se stanoví metodou podle Luff-Schorla. Výsledek se vyjádří jako procentní obsah glukózy ve vzorku.

5.3   Stanovení obsahu veškerých cukrů po inverzi

Do 100 ml odměrné baňky se odpipetuje 50 ml roztoku. Přidá se několik kapek roztoku methyloranže (3.4) a potom se za stálého, opatrného míchání přidá kyselina chlorovodíková (3.5), až se kapalina trvale zbarví do červena. Poté se přidá 15 ml kyseliny chlorovodíkové (3.6) a baňka se rychle ponoří do vařící vodní lázně, kde se ponechá třicet minut. Rychle se vychladí na 20 oC a přidá se 15 ml roztoku hydroxidu sodného (3.7). Doplní se vodou do 100 ml a homogenizuje. Odpipetuje se maximálně 25 ml roztoku, který obsahuje nejvýše 60 mg redukujících cukrů vyjádřených jako glukóza. V případě potřeby se odpipetovaný objem doplní destilovanou vodou na 25 ml. Obsah redukujících cukrů se stanoví metodou podle Luff-Schorla. Výsledek se vyjádří jako procento glukózy nebo, kde je to vhodné, jako sacharózy po vynásobení faktorem 0,95.

5.4   Titrace (metoda podle Luff-Schoorla)

Do 300 ml Erlenmeyerovy baňky se odpipetuje 25 ml Luff-Schoorlova činidla (3.8); přidá se přesně 25 ml vyčeřeného cukerného roztoku. Přidají se dvě granule pemzy (3.13) a při ručním míchání se zahřívá nad otevřeným plamenem střední délky tak, aby se kapalina uvedla do varu přibližně za dvě minuty. Pak se Erlenmeyerova baňka neprodleně umístí na azbestem potaženou drátěnou síťku s otvorem o průměru přibližně 6 cm, pod kterou je zapálen plamen. Tento plamen musí být regulován tak, aby se zahřívalo pouze dno Erlenmeyerovy baňky. K Erlenmeyerově baňce se připojí zpětný chladič a vaří se přesně deset minut. Potom se baňka ihned vychladí ve studené vodě a přibližně po pěti minutách se titruje takto:

Do baňky se přidá 10 ml roztoku jodidu draselného (3.12) a ihned poté (opatrně a pomalu, vzhledem k riziku nadměrného pěnění) se přidá 25 ml kyseliny sírové (3.11). Titruje se roztokem thiosíranu sodného (3.9), až se objeví kalně žlutá barva. Pak se přidá škrobový indikátor (3.10) a dokončí se titrace.

Stejná titrace se provede s přesně odměřenou směsí 25 ml Luff-Schoorlova činidla (3.8) a 25 ml vody, 10 ml roztoku jodidu draselného (3.12) a 25 ml kyseliny sírové (3.11) bez vaření.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

S použitím tabulky se stanoví obsah glukózy v mg, který odpovídá rozdílu mezi hodnotami obou titrací vyjádřených v mg thiosíranu sodného 0,1 mol/l. Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

7.   Zvláštní postupy

7.1

V případě krmiv bohatých na melasu nebo jiných krmiv, která nejsou zcela homogenní, se do 1 000 ml odměrné baňky naváží 20 g vzorku a přidá se 500 ml vody. Míchá se jednu hodinu na míchacím zařízení. Vyčeří se Carrezovými činidly I a II (3.2 a 3.3), jak je uvedeno v odstavci 5.1, ale v tomto případě se čtyřnásobným množstvím obou činidel. Doplní se po značku 80% ethanolem (v/v). Homogenizuje se a přefiltruje. Ethanol se odstraní postupem uvedeným v odstavci 5.1. Pokud ve směsi není žádný dextrinovaný škrob, doplní se po značku destilovanou vodou.

7.2

V případě melas a krmných surovin, které jsou bohaté na cukry a téměř bez škrobu (svatojánský chléb, sušené řepné řízky), se odváží 5 g, vloží se do 250 ml odměrné baňky, přidá se 200 ml destilované vody a míchá se na míchacím zařízení po dobu jedné hodiny a v případě potřeby i déle. Vyčeří se Carrezovými činidly I a II (3.2 a 3.3), jak uvedeno v odstavci 5.1. Doplní se po značku studenou vodou, homogenizuje a přefiltruje. Pro stanovení obsahu veškerých cukrů se dále postupuje podle bodu 5.3.

8.   Poznámky

8.1	Pro zamezení pěnění se doporučuje přidat (bez ohledu na množství vzorku) přibližně 1 ml isopenthanolu (3.14) před varem s Luff-Schoorlovým činidlem.

8.2	Rozdíl mezi obsahem veškerých cukrů po inverzi vyjádřených jako glukóza a obsahem redukujících cukrů vyjádřených jako glukóza vynásobený koeficientem 0,95 udává procentní obsah sacharózy.

8.3	Pro stanovení obsahu redukujících cukrů, s výjimkou laktózy, mohou být použity dvě metody:

8.3.1

Pro přibližný výpočet se obsah laktózy stanovený jinou metodou zkoušení vynásobí koeficientem 0,675 a výsledek se odečte od obsahu redukujících cukrů.

8.3.2

Pro přesný výpočet obsahu redukujících cukrů, s výjimkou laktózy, se stejný vzorek musí použít pro dvě konečná stanovení. Jedna zkouška se provede s částí roztoku získaného podle bodu 5.1, druhá zkouška se provede s částí roztoku získaného při stanovení laktózy metodou určenou pro tento účel (po fermentaci ostatních druhů cukrů a vyčeření). V obou případech se obsah přítomného cukru stanoví metodou podle Luff-Schoorla a vyjádří v mg glukózy. Jeden údaj se odečte od druhého a rozdíl se vyjádří jako procento ve vzorku. Příklad: Oba objemy odpovídají pro každé stanovení hmotnosti navážky vzorku 250 mg. V prvním případě je spotřebováno 17 ml roztoku thiosíranu sodného 0,1 mol/l, což odpovídá 44,2 mg glukózy. V druhém případě je spotřebováno 11 ml téhož roztoku, což odpovídá 27,6 mg glukózy. Rozdíl činí 16,6 mg glukózy. Obsah redukujících cukrů (s výjimkou laktózy) vyjádřených jako glukóza je tedy:

Tabulka hodnot pro 25 ml Luff-Schoorlova činidla

ml roztoku thiosíranu sodného (Na2S2O3) 0,1 mol/l, dvě minuty zahřívání k varu a deset minut varu

Na2S2O3 0,1 mol/l	Glukóza, fruktóza, invertní cukry C6H12O6		Laktóza C12H22O11		Maltóza C12H22O11		Na2S2O3 0,1 mol/l
ml	mg	rozdíl	mg	rozdíl	mg	rozdíl	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6	3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

K.   STANOVENÍ OBSAHU LAKTÓZY

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení množství laktózy v krmivech obsahujících více než 0,5 % laktózy.

2.   Princip

Cukry se vyextrahují ze vzorku vodou. Extrakt se vystaví fermentačnímu účinku kvasinek Saccharomyces cerevisiae, které ponechají laktózu v nezměněném stavu. Po vyčeření a filtraci se obsah laktózy ve filtrátu stanoví metodou podle Luff-Schoorla.

3.   Chemikálie

3.1	Kvasinky Saccharomyces cerevisiae, suspenze: ve 100 ml vody se suspenduje 25 g čerstvého droždí. Suspenze vydrží v chladničce maximálně jeden týden.

3.2	Carrezovo činidlo I: ve vodě se rozpustí 21,9 g octanu zinečnatého, Zn (CH3COO)2 . 2H2O a 3 g ledové kyseliny octové. Doplní se vodou na 100 ml.

3.3	Carrezovo činidlo II: ve vodě se rozpustí 10,6 g kyanoželeznatanu draselného (ferrokyanidu draselného) K4Fe(CN)6 . 3H2O. Doplní se vodou na 100 ml.

3.4

Luff-Schoorlovo činidlo: Za opatrného míchání se nalije roztok kyseliny citrónové (3.4.2) do roztoku uhličitanu sodného (3.4.3). Přidá se roztok síranu měďnatého (3.4.1) a doplní se vodou na 1 litr. Nechá se přes noc usadit a potom se přefiltruje. Zkontroluje se koncentrace takto získaného činidla (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l). pH tohoto roztoku je přibližně 9,4.

3.4.1

Roztok síranu měďnatého: ve 100 ml vody se rozpustí 25 g síranu měďnatého (Cu SO4 . 5H2O) prostého železa.

3.4.2

Roztok kyseliny citrónové: v 50 ml vody se rozpustí 50 g kyseliny citrónové (C6H8O7 · H2O).

3.4.3

Roztok uhličitanu sodného: v přibližně 300 ml teplé vody se rozpustí 143,8 g bezvodého uhličitanu sodného. Nechá se vychladnout.

3.5	Granulovaná pemza vyvařená v kyselině chlorovodíkové, promytá vodou a vysušená.

3.6	Roztok jodidu draselného 30 % (w/v).

3.7	Kyselina sírová 3 mol/l.

3.8	Roztok thiosíranu sodného 0,1 mol/l.

3.9	Roztok škrobu: ve 30 ml vody se rozpustí 5 g škrobu a směs se přidá do jednoho litru vroucí vody. Vaří se tři minuty, nechá se vychladnout a bude-li třeba, přidá se 10 g jodidu rtuťnatého jako stabilizátoru.

4.   Přístroje a pomůcky

Vodní lázeň s termostatem nastaveným na 38–40 oC.

5.   Postup

Do 100 ml odměrné baňky se naváží 1 g vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se 25–30 ml vody. Baňka se umístí do vroucí vodní lázně na třicet minut a pak se ochladí přibližně na 35 oC. Přidá se 5 ml suspenze kvasinek (3.1) a homogenizuje. Obsah baňky se nechá stát po dobu dvou hodin ve vodní lázni o teplotě 38–40 oC a potom se vychladí se na teplotu přibližně 20 oC.

Přidá se 2,5 ml Carrezova činidla I (3.2) a třicet vteřin se míchá. Potom se přidá 2,5 ml Carrezova činidla II (3.3) a znovu se míchá třicet vteřin. Doplní se vodou na 100 ml, zamíchá se a přefiltruje. Do 300 ml Erlenmeyerovy baňky se odpipetuje část filtrátu, nejvýše 25 ml, která obsahuje asi 40–80 mg laktózy. Pokud je třeba, doplní se vodou na 25 ml.

Stejným způsobem se provede slepá zkouška s 5 ml suspenze kvasinek (3.1). Stanoví se obsah laktózy metodou podle Luff-Schoorla tímto způsobem: přidá se přesně 25 ml Luff-Schoorlova činidla (3.4) a dvě granule pemzy (3.5). Ručně se zamíchá při zahřívání na volném plameni střední výšky a kapalina se přivede do varu přibližně během dvou minut. Pak se Erlenmeyerova baňka neprodleně umístí na azbestem potaženou drátěnou síťku s otvorem o průměru přibližně 6 cm, pod kterou byl zapálen plamen. Tento plamen musí být regulován tak, aby se zahřívalo pouze dno Erlenmeyerovy baňky. K Erlenmeyerově baňce se připevní zpětný chladič. Vaří se přesně deset minut. Potom se baňka ihned ochladí ve studené vodě a přibližně po pěti minutách se titruje takto:

Přidá se 10 ml roztoku jodidu sodného (3.6) a ihned poté (opatrně a pomalu, vzhledem k riziku nadměrného pěnění) se přidá 25 ml kyseliny sírové (3.7). Titruje se roztokem thiosíranu sodného (3.8), až se objeví kalně žlutá barva. Pak se přidá škrobový indikátor (3.9) a dokončí se titrace.

Stejná titrace se provede s přesně odměřenou směsí 25 ml Luff-Schoorlova činidla (3.4) a 25 ml vody, po přidání 10 ml roztoku jodidu sodného (3.6) a 25 ml kyseliny sírové (3.7) bez vaření.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

S použitím přiložené tabulky se stanoví množství laktózy v mg, které odpovídá rozdílu mezi výsledky dvou titrací, vyjádřených v ml roztoku thiosíranu sodného 0,1 mol/l.

Výsledek se vyjádří jako bezvodá laktóza vyjádřená jako procento ve vzorku.

7.   Poznámka

U látek obsahujících více než 40% zkvasitelného cukru se použije více než 5 ml kvasinkové suspenze (3.1).

Tabulka hodnot pro 25 ml Luff-Schoorlova činidla

ml roztoku thiosíranu sodného (Na2S2O3) 0,1 mol/l, dvě minuty zahřívání k varu a deset minut varu

Na2S2O3 0,1 mol/l	Glukóza, fruktóza, invertní cukry C6H12O6		Laktóza C12H22O11		Maltóza C12H22O11		Na2S2O3 0,1 mol/l
ml	mg	rozdíl	mg	rozdíl	mg	rozdíl	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6	3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

L.   STANOVENÍ OBSAHU ŠKROBU

– POLARIMETRICKÁ METODA –

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu škrobu a degradačních produktů škrobu s vysokou molekulární hmotností v krmivech za účelem kontroly shody s obsahem metabolizovatelné energie (ustanovení v příloze VII) a se směrnicí Rady 96/25/ES (3).

2.   Princip

Metoda zahrnuje dvě stanovení. Nejprve je vzorek podroben působení zředěné kyseliny chlorovodíkové. Po vyčeření a filtraci je optická otáčivost roztoku měřena polarimetricky.

Potom je vzorek extrahován 40% ethanolem. Po okyselení filtrátu kyselinou chlorovodíkovou, vyčeření a filtraci je optická otáčivost roztoku měřena stejně jako u prvního stanovení.

Rozdíl mezi těmito dvěma měřeními násobený známým faktorem udává obsah škrobu ve vzorku.

3.   Chemikálie

3.1	Kyselina chlorovodíková, roztok 25 % (w/w), hustota: 1,126 g/ml.

3.2	Kyselina chlorovodíková, roztok 1,13 % (w/v). Koncentrace se musí zkontrolovat titrací za použití roztoku 0,1 mol/l hydroxidu sodného a přítomnosti 0,1 % (w/v) methylčerveně v 94% (v/v) ethanolu. Pro neutralizaci 10 ml je zapotřebí 30,94 ml NaOH 0,1 mol/l.

3.3	Carrezovo činidlo I: ve vodě se rozpustí 21,9 g octanu zinečnatého Zn (CH3COO)2 . 2H2O a 3 g ledové kyseliny octové. Doplní se vodou na 100 ml.

3.4	Carrezovo činidlo II: 10,6 g kyanoželeznatanu draselného (ferrokyanidu draselného K4Fe(CN)6 . 3H2O) se rozpustí ve vodě. Doplní se vodou na 100 ml.

3.5	Ethanol, roztok 40 % (v/v), hustota: 0,948 g/ml při 20 oC.

4.   Přístroje a pomůcky

4.1	250 ml Erlenmeyerova baňka se standardním skleněným zábrusem a zpětným chladičem.

4.2	Polarimetr nebo sacharimetr.

5.   Postup

5.1   Příprava vzorku

Vzorek se upraví mletím tak, aby prošel sítem s kruhovými otvory o velikosti 0,5 mm.

5.2   Stanovení celkové optické otáčivosti (P nebo S) (viz poznámka 7.1)

Do 100 ml odměrné baňky se naváží 2,5 g umletého vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se 25 ml kyseliny chlorovodíkové (3.2), protřepe se, aby se vzorek rovnoměrně rozprostřel, a potom se přidá dalších 25 ml kyseliny chlorovodíkové (3.2). Baňka se ponoří do vroucí vodní lázně a první tři minuty se s ní intenzivně třepe, aby nedošlo k tvorbě shluků. Množství vody ve vodní lázni musí být takové, aby při ponoření baňky do lázně nedošlo k přerušení varu. Během protřepávání nesmí být baňka vyjmuta z lázně. Přesně po 15 minutách se baňka vyjme z lázně, přidá se 30 ml studené vody a ihned se ochladí na 20 oC.

Přidá se 5 ml Carrezova činidla I (3.3) a asi 30 sekund se protřepává. Přidá se 5 ml Carrezova činidla II (3.4) a opět se protřepává asi 30 sekund. Baňka se doplní po značku vodou, promíchá a přefiltruje. Pokud není filtrát zcela čirý (k tomu dochází pouze výjimečně), stanovení se zopakuje s použitím většího množství Carrezových činidel I a II, například 10 ml.

Optická otáčivost roztoku se měří na polarimetru nebo sacharimetru v 200 mm trubici.

5.3   Stanovení optické otáčivosti (P' nebo S') látek rozpustných ve 40% ethanolu

Do 100 ml odměrné baňky se naváží 5 g vzorku s přesností na 1 mg a přidá se asi 80 ml ethanolu (3.5) (viz poznámka 7.2). Baňka se nechá stát 1 hodinu při laboratorní teplotě; během této doby se šestkrát důkladně protřepe, aby se zkoušený vzorek zcela promísil s ethanolem. Doplní se ethanolem (3.5) po značku, promíchá a přefitruje.

Odpipetuje se 50 ml filtrátu (= 2,5 g vzorku) do 250 ml Erlenmeyerovy baňky, přidá se 2,1 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1) a důkladně se protřepe. Na Erlenmeyerovu baňku se připojí zpětný chladič a baňka se ponoří do vroucí vodní lázně. Přesně po 15 minutách se baňka vyjme z lázně, její obsah se převede do 100 ml odměrné baňky, varná baňka se vypláchne malým množstvím studené vody a ochladí se na 20 oC.

Potom se vyčeří Carrezovými činidly I a II (3.3 a 3.4), doplní se vodou po značku, promíchá a přefiltruje. Při měření optické otáčivosti se postupuje podle druhého a třetího odstavce bodu 5.2.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Obsah škrobu (v %) se vypočte podle následujících vzorců:

6.1   Měření na polarimetru

P	=	celková optická otáčivost v úhlových stupních
P'	=	optická otáčivost v úhlových stupních látek rozpustných ve 40% (v/v) ethanolu
	=	specifická optická otáčivost čistého škrobu. Konvenční hodnoty D přijaté pro tento faktor jsou následující: + 185,9o: rýžový škrob, + 185,7o: bramborový škrob, + 184,6o: kukuřičný škrob, + 182,7o: pšeničný škrob, + 181,5o: ječný škrob, + 181,3o: ovesný škrob, + 184,0o: ostatní typy škrobu a škrobových směsí v krmných směsích.

6.2   Měření na sacharimetru

S	=	celková optická otáčivost ve stupních sacharizace
S'	=	optická otáčivost ve stupních sacharizace látek rozpustných ve 40% (v/v) ethanolu
N	=	navážka sacharózy v g ve 100 ml vody, která poskytne ve 200mm trubici optickou otáčivost rovnou 100o sacharizace 16,29 g pro francouzské sacharimetry 26,00 g pro německé sacharimetry 20,00 g pro směsné sacharimetry
	=	specifická optická otáčivost čistého škrobu (viz 6.1).

6.3   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí překročit 0,4 % v absolutní hodnotě u obsahu škrobu do 40 % a 1 % relat. u obsahu škrobu 40 % a více.

7.   Poznámky

7.1	Pokud vzorek obsahuje více než 6 % uhličitanů, vyjádřených jako uhličitan vápenatý, musí být přítomné uhličitany před stanovením celkové optické otáčivosti rozloženy přesně odpovídajícím množstvím zředěné kyseliny sírové.

7.2

U výrobků s vysokým obsahem laktózy, jako např. sušené mléčné sérum nebo sušené odstředěné mléko, postupuje se po přidání 80 ml ethanolu (3.5) níže uvedeným způsobem. Na baňku se upevní zpětný chladič a baňka se ponoří do vodní lázně o teplotě 50 oC na 30 minut. Nechá se vychladnout a dále se pokračuje podle bodu 5.3.

7.3

Pokud jsou v krmivu ve významném množství přítomny níže uvedené krmné suroviny, dochází k interferencím při stanovení škrobu polarimetrickou metodou, což může způsobit nesprávné výsledky: — produkty z (cukrové) řepy jako (cukrová) řepná pulpa, (cukrová) řepná melasa, směs (cukrové) řepné drti a melasy, (cukrová) řepná vináza, (řepný) cukr, — citrusová pulpa, — lněné semeno; lněné expelery; extrahované lněné semeno, — řepkové semeno; řepkové expelery; extrahované řepkové semeno; loupané řepkové semeno, — slunečnicové semeno; extrahované slunečnicové semeno; slunečnicové semeno, částečně loupané a extrahované, — expelery z kopry; extrahovaná kopra, — bramborová pulpa, — sušené kvasnice, — produkty bohaté na inulín (např. chipsy a moučka z topinambur), — škvarky.

M.   STANOVENÍ OBSAHU POPELA

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu popela v krmivech.

2.   Princip

Vzorek se zpopelní při 550 oC; zbytek se zváží.

3.   Chemikálie

Dusičnan amonný, roztok 20 % (w/v).

4.   Přístroje a pomůcky

4.1	Topná deska.

4.2	Elektrická muflová pec s termostatem.

4.3	Spalovací kelímky z křemíku, porcelánu nebo platiny, buď pravoúhlé (asi 60 × 40 × 25 mm) nebo kulaté (průměr 60–70 mm, výška 20–40 mm).

5.   Postup

Do spalovacího kelímku, který byl předem zahřát na teplotu 550 oC, ochlazen a zvážen, se s přesností na 1 mg naváží 5 g vzorku (2,5 g v případě látek, které mají během spalování tendenci zvětšovat svůj objem). Potom se kelímek vloží na topnou desku a postupně se zahřívá, až látka zuhelnatí. Spaluje se podle bodu 5.1 nebo 5.2.

5.1	Spalovací kelímek se vloží do muflové pece zahřáté na 550 oC. Při této teplotě se spaluje, dokud nevznikne bílý, lehce šedý nebo načervenalý popel, který se zdá být prostý zuhelnatělých částic. Kelímek se vloží do exsikátoru, nechá se vychladnout a ihned se zváží.

5.2

Spalovací kelímek se vloží do muflové pece zahřáté na 550 oC. Spaluje se 3 hodiny. Kelímek se vloží do exsikátoru, nechá se vychladnout a ihned se zváží. Spaluje se dalších 30 minut, aby se zajistilo, že je dosažená hmotnost popela konstantní (úbytek hmotnosti mezi dvěma váženími nesmí být větší než 1 mg).

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Vypočítá se hmotnost zbytku po odečtení hmotnosti kelímku (táry).

Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

7.   Poznámky

7.1

Popel látek, které se obtížně zpopelňují, se musí spalovat nejméně po dobu tří hodin. Po vychladnutí se přidá několik kapek 20% roztoku dusičnanu amonného nebo vody (opatrně, aby nedošlo k rozptylu popela anebo ke tvoření hrudek). Po vysušení v sušárně se pokračuje v žíhání. Postup se opakuje podle potřeby tak dlouho, až je zpopelnění úplné.

7.2

V případě látek, které jsou rezistentní na proces popsaný v bodě 7.1, se postupuje takto: po spalování po dobu tří hodin se popel rozmíchá v horké vodě a přefiltruje se přes malý bezpopelný filtr. Filtr s popelem se dále spaluje v původním kelímku. Filtrát se převede do vychlazeného kelímku, odpaří do sucha, opět se spálí a popel se zváží.

7.3	V případě olejů a tuků se přesně naváží 25 g vzorku do kelímku vhodné velikosti. Zuhelnatí se zapálením látky proužky bezpopelného papírového filtru. Po spálení se zvlhčí co nejmenším množstvím vody. Vysuší se a spálí podle popisu v bodu 5.

N.   STANOVENÍ OBSAHU POPELA NEROZPUSTNÉHO V KYSELINĚ CHLOROVODÍKOVÉ

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu minerálních látek nerozpustných v kyselině chlorovodíkové v krmivech. Podle druhu vzorku mohou být použity dvě různé metody.

1.1	Metoda A: použije se pro krmné suroviny organického původu a pro většinu krmných směsí.

1.2	Metoda B: použije se pro minerální suroviny a minerální krmné směsi a pro krmné směsi, u nichž je obsah látek nerozpustných v kyselině chlorovodíkové, stanovený metodou A, vyšší než 1 %.

2.   Princip

2.1	Metoda A: vzorek se zpopelní, popel se povaří s kyselinou chlorovodíkovou a nerozpuštěný zbytek se přefiltruje a zváží.

2.2	Metoda B: vzorek se rozpustí v kyselině chlorovodíkové. Roztok se přefiltruje, zbytek na filtru se zpopelní a dále se postupuje podle metody A.

3.   Chemikálie

3.1	Kyselina chlorovodíková 3 mol/l.

3.2	Kyselina trichloroctová, 20% roztok (w/v).

3.3	Kyselina trichloroctová, 1% roztok (w/v).

4.   Přístroje a pomůcky

4.1	Topná deska.

4.2	Elektrická muflová pec s termostatem.

4.3	Spalovací kelímky z křemíku, porcelánu nebo platiny, buď pravoúhlé (asi 60 × 40 × 25 mm) nebo kulaté (průměr 60–75 mm, výška 20–40 mm).

5.   Postup

5.1   Metoda A

Vzorek se zpopelní podle postupu uvedeného v metodě pro stanovení obsahu popela. Může se použít rovněž popel získaný při uvedeném stanovení.

Popel se pomocí 75 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1) převede do 250–400 ml kádinky. Uvede se pomalu do varu a mírně se vaří patnáct minut. Teplý roztok se přefiltruje přes bezpopelný papírový filtr a zbytek na filtru se promyje teplou vodou do vymizení kyselé reakce. Filtr s promytým zbytkem se vysuší a potom zpopelní v předem zváženém kelímku při teplotě minimálně 550 oC a maximálně 700 oC. Nechá se vychladnout v exsikátoru a zváží se.

5.2   Metoda B

Do 250–400 ml kádinky se naváží 5 g vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se postupně 25 ml vody a 25 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1), promíchá se a nechá se stát, dokud neustane pěnění. Přidá se dalších 50 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1). Po ukončení vývoje plynu se kádinka umístí na vroucí vodní lázeň, kde se ponechá 30 minut nebo v případě potřeby déle, aby mohlo dojít k hydrolýze veškerého přítomného škrobu. Přefiltruje se za horka přes bezpopelný papírový filtr a filtr se promyje 50 ml horké vody (viz poznámka 7). Filtr se zbytkem se vloží do spalovacího kelímku, vysuší se a potom zpopelní při teplotě minimálně 550 oC a maximálně 700 oC. Po spálení se popel převede pomocí 75 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1) do 250–400 ml kádinky; pokračuje se podle druhého odstavce bodu 5.1.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Vypočítá se hmotnost zbytku po odečtení hmotnosti kelímku (táry). Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

7.   Poznámka

Jestliže je filtrace obtížná, je možno nahradit 50 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1) 50 ml 20% kyseliny trichloroctové (3.2) a zbytek na filtru promývat teplým roztokem 1% kyseliny trichloroctové (3.3).

O.   STANOVENÍ OBSAHU UHLIČITANŮ

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu uhličitanů vyjádřených obvykle jako uhličitan vápenatý ve většině krmiv.

Nicméně v některých případech (např. u uhličitanu železnatého) musí být použita zvláštní metoda.

2.   Princip

Uhličitany se rozloží v kyselině chlorovodíkové; vzniklý oxid uhličitý se změří v kalibrované trubici a jeho objem se porovná s objemem plynu uvolněného za stejných podmínek ze známého množství uhličitanu vápenatého.

3.   Chemikálie

3.1	Kyselina chlorovodíková, hustota 1,10 g/ml.

3.2	Uhličitan vápenatý.

3.3	Kyselina sírová, přibližně 0,05 mol/l, obarvená methylčervení.

4.   Přístroje a pomůcky

Scheibler-Dietrichův přístroj (viz obrázek) nebo obdobný přístroj.

5.   Postup

Podle obsahu uhličitanů ve vzorku se naváží:

—	0,5 g u produktů obsahujících 50–100 % uhličitanů vyjádřených jako uhličitan vápenatý,

—	1 g u produktů obsahujících 40–50 % uhličitanů vyjádřených jako uhličitan vápenatý,

—	2 až 3 g u ostatních produktů.

Navážka vzorku se umístí do zvláštní nádobky (4) přístroje, vybavené malou trubicí z nerozbitného materiálu, která obsahuje 10 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1), a nádobka se připojí k přístroji. Trojcestný kohout (5) se otočí tak, aby trubice (1) byla spojena s vnějším prostorem. Pomocí mobilní trubice (2), která je naplněna obarvenou kyselinou sírovou (3.3) a spojena s kalibrovanou trubicí (1), se vyrovnají hladiny na nulu. Kohout (5) se otočí tak, aby byly spojeny trubice (1) a (3), a zkontroluje se, zda je hladina na nule.

Pomalým nakláněním nádobky (4) se kyselina chlorovodíková (3.1) nalije na navážku vzorku. Tlak se vyrovná snížením trubice (2). Nádobkou (4) se třepe tak dlouho, dokud zcela neustane uvolňování oxidu uhličitého.

Tlak se obnoví vyrovnáním kapalin v trubicích (1) a (2) na stejnou hladinu. Po několika minutách, až se ustálí tlak plynu, se odečte jeho hodnota.

Provede se kontrolní zkouška za stejných podmínek s navážkou 0,5 g uhličitanu vápenatého (3.2).

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Obsah uhličitanů vyjádřených jako uhličitan vápenatý se vypočítá podle následujícho vzorce:

kde:

X	=	% (w/w) uhličitanů vyjádřených jako uhličitan vápenatý ve vzorku
V	=	ml CO2 uvolněné z navážky vzorku
V1	=	ml CO2 uvolněné z 0,5 g CaCO3
m	=	hmotnost navážky vzorku v gramech.

7.   Poznámky

7.1	Pokud je hmotnost navážky vzorku větší než 2 g, přidá se ke vzorku v nádobce (4) nejprve 15 ml destilované vody a před zahájením zkoušky se promíchá. Při kontrolní zkoušce se použije stejný objem vody.

7.2	Pokud se používá přístroj s jiným objemem než u Schleibler-Dietrichova přístroje, musí se upravit velikost navážky vzorku a kontrolní látky a musí se upravit výpočet výsledků.

P.   STANOVENÍ OBSAHU CELKOVÉHO FOSFORU

FOTOMETRICKÁ METODA

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu celkového fosforu v krmivech. Je vhodná především pro zkoušení krmiv s nízkým obsahem fosforu. V určitých případech (u produktů s vysokým obsahem fosforu) je možno použít gravimetrickou metodu.

2.   Princip

Vzorek se mineralizuje buď suchou cestou (zejména u organických krmiv), nebo mokrou cestou (zejména u minerálních sloučenin a tekutých krmiv), a převede se do kyselého roztoku. K tomuto roztoku se přidá molybdátovanadátové činidlo. Absorbance žlutě zbarveného roztoku se měří při 430 nm pomocí spektrofotometru.

3.   Chemikálie

3.1	Uhličitan vápenatý.

3.2	Kyselina chlorovodíková, ρ20 = 1,10 g/ml (přibližně 6 mol/l).

3.3	Kyselina dusičná, ρ20 = 1,045 g/ml.

3.4	Kyselina dusičná, ρ20 = 1,38–1,42 g/ml.

3.5	Kyselina sírová, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.6	Molybdátovanadátové činidlo: v odměrné baňce o objemu 1 l se smíchá 200 ml roztoku heptamolybdenanu amonného (3.6.1) s 200 ml roztoku vanadičnanu amonného (3.6.2) a se 134 ml kyseliny dusičné (3.4) a doplní se vodou po značku.

3.6.1

Roztok heptamolybdenanu amonného: 100 g heptamolybdenanu amonného (NH4)6Mo7O24 . 4H2O se rozpustí v horké vodě. Přidá se 10 ml amoniaku (hustota 0,91g/ml) a doplní se vodou na 1 litr.

3.6.2

Roztok vanadičnanu amonného: 2,35 g vanadičnanu amonného NH4VO3 se rozpustí ve 400 ml horké vody. Za stálého míchání se pomalu přilévá 20 ml zředěné kyseliny dusičné (7 ml HNO3 (3.4) + 13 ml H2O) a doplní se vodou na 1 litr.

3.7	Standardní roztok 1 mg fosforu na ml: 4,387 g dihydrogenfosforečnanu draselného KH2PO4 se rozpustí ve vodě. Doplní se vodou na 1 litr.

4.   Přístroje a pomůcky

4.1	Křemenné, porcelánové nebo platinové spalovací kelímky.

4.2	Elektrická muflová pec s termostatem, regulovaná na teplotu 550 oC.

4.3	Kjeldahlova baňka, 250 ml.

4.4	Odměrné baňky a přesné pipety.

4.5	Spektrofotometr.

4.6	Zkumavky, průměr asi 16 mm, se zátkou o průměru 14,5 mm; objem: 25–30 ml.

5.   Postup

5.1   Příprava roztoku

Podle druhu vzorku se připraví roztok způsobem, který je uveden v bodě 5.1.1 nebo 5.1.2.

5.1.1   Obvyklý postup

Do Kjeldahlovy baňky se naváží 1 g nebo větší množství vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se 20 ml kyseliny sírové (3.5), baňka se důkladně protřepe, aby se vzorek a kyselina dobře spojily a aby se zabránilo usazování vzorku na stěnách baňky; pak se roztok zahřeje a 10 minut vaří. Po mírném ochlazení se přidají 2 ml kyseliny dusičné (3.4); slabě se zahřeje a opět mírně ochladí. Pak se opět přidá trochu kyseliny dusičné (3.4) a uvede se opět do varu. Postup se opakuje tolikrát, až se získá čirý roztok. Potom se ochladí, přidá se trochu vody, kapalina se převede do 500 ml odměrné baňky a Kjeldahlova baňka se vypláchne horkou vodou. Po ochlazení se baňka doplní vodou po značku, homogenizuje a přefiltruje.

5.1.2   Postup pro vzorky, které obsahují organické látky, ale neobsahují dihydrogenfosforečnan vápenatý a hořečnatý

Do spalovacího kelímku se naváží přibližně 2,5 g vzorku s přesností na 1 mg a dokonale se promíchá s 1 g uhličitanu vápenatého (3.1). V muflové peci se spaluje při teplotě 550 oC tak dlouho, dokud se nezíská popel bílé nebo šedé barvy (malé množství uhlíkatých částic není na závadu). Popel se převede do 250 ml kádinky, přidá se 20 ml vody a potom se přidává kyselina chlorovodíková (3.2), dokud neustane pěnění; nakonec se přidá dalších 10 ml kyseliny chlorovodíkové (3.2). Kádinka se postaví na pískovou lázeň a odpaří se do sucha, aby se vyloučily křemičitany. Zbytek se rozpustí v 10 ml kyseliny dusičné (3.3) a 5 minut vaří na pískové lázni nebo na topné desce tak, aby nedošlo k úplnému vysušení. Kapalina se převede do 500 ml odměrné baňky a kádinka se několikrát vymyje horkou vodou. Po ochlazení se doplní vodou po značku, homogenizuje a přefiltruje.

5.2   Vývoj zbarvení a měření absorbance

Alikvotní množství filtrátu připraveného podle bodu 5.1.1 nebo 5.1.2 se zředí tak, aby koncentrace fosforu byla maximálně 40 μg/ml. 10 ml tohoto roztoku se odpipetuje do zkumavky (4.6) a přidá se 10 ml molybdátovanadátového činidla (3.6). Homogenizuje se a nechá se stát minimálně po dobu 10 minut při teplotě 20 oC. Pak se měří absorbance ve spektrofotometru při 430 nm proti roztoku připravenému z 10 ml vody a 10 ml molybdátovanadátového činidla (3.6).

5.3   Kalibrační křivka

Ze standardního roztoku (3.7) se připraví roztoky, které obsahují 5, 10, 20, 30 a 40 μg fosforu na jeden ml. Ke každým 10 ml těchto roztoků se přidá 10 ml molybdátovanadátového činidla (3.6). Homogenizuje se a nechá se stát minimálně po dobu 10 minut při teplotě 20 oC. Pak se měří absorbance, jak je uvedeno v bodě 5.2. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením hodnot absorbancí proti odpovídajícím množstvím fosforu. Křivka je lineární při koncentraci fosforu 0–40 μg/ml.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Obsah fosforu ve zkoušeném vzorku se stanoví pomocí kalibrační křivky.

Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí přesáhnout:

—	3 % relat. z hodnoty vyššího výsledku u vzorků s obsahem fosforu nižším než 5 %,

—	0,15 % v absolutní hodnotě u vzorků s obsahem fosforu 5 % a více.

Q.   STANOVENÍ OBSAHU VE VODĚ ROZPUSTNÝCH CHLORIDŮ

1.   Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu ve vodě rozpustných chloridů obvykle vyjadřovaných jako chlorid sodný. Tato metoda je vhodná pro všechna krmiva.

2.   Princip

Chloridy se rozpustí ve vodě. Jestliže produkt obsahuje organickou hmotu, roztok se vyčeří. Roztok se mírně okyselí kyselinou dusičnou a chloridy se vysrážejí pomocí roztoku dusičnanu stříbrného jako chlorid stříbrný. Přebytek dusičnanu stříbrného se titruje roztokem thiokyanatanu amonného podle Volhardovy metody.

3.   Chemikálie

3.1	Roztok thiokyanatanu amonného 0,1 mol/l.

3.2	Roztok dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l.

3.3	Nasycený roztok síranu železitoamonného (NH4)Fe(SO4)2.

3.4	Kyselina dusičná, hustota: 1,38 g/ml.

3.5	Diethylether.

3.6

Aceton.

3.7	Carrezovo činidlo I: ve vodě se rozpustí 21,9 g octanu zinečnatého Zn (CH3COO)2 . 2H2O a 3 g ledové kyseliny octové. Doplní se vodou na 100 ml.

3.8	Carrezovo činidlo II: ve vodě se rozpustí 10,6 g kyanoželeznatanu draselného (ferrokyanidu draselného) K4Fe(CN)6 . 3H2O. Doplní se vodou na 100 ml.

3.9	Aktivní uhlí, chloridů prosté a neabsorbující chloridy.

4.   Přístroje a pomůcky

Míchací zařízení: přibližně 35–40 otáček/min.

5.   Postup

5.1   Příprava roztoku

Příprava vzorku závisí na druhu vzorku a roztok se připraví podle odstavce 5.1.1, 5.1.2 nebo 5.1.3.

Současně se provede slepá zkouška bez zkoušeného vzorku.

5.1.1   Vzorky bez organické hmoty

Do 500 ml odměrné baňky se naváží maximálně 10 g vzorku s přesností na 1 mg tak, aby navážka obsahovala nejvýše 3 g ve vodě rozpustných chloridů, přidá se asi 400 ml vody a třicet minut se míchá na míchacím zařízení při teplotě asi 20 oC. Potom se doplní po značku, homogenizuje a přefiltruje.

5.1.2   Vzorky obsahující organickou hmotu, kromě produktů uvedených v bodě 5.1.3

Do 500 ml odměrné baňky se naváží asi 5 g vzorku s přesností na 1 mg a 1 g aktivního uhlí. Přidá se 400 ml vody o teplotě přibližně 20 oC a 5 ml Carrezova činidla I (3.7), asi 30 sekund se míchá, pak se přidá 5 ml Carrezova činidla II (3.8). Třicet minut se míchá na míchacím zařízení, potom se doplní po značku, homogenizuje a přefiltruje.

5.1.3   Tepelně opracovaná krmiva, lněné pokrutiny, lněná moučka, směsi s jejich převážným obsahem a jiné produkty bohaté na rostlinný sliz nebo koloidní látky (např. dextrinovaný škrob)

Roztok se připraví podle bodu 5.1.2, ale nefiltruje se. Místo toho se dekantuje nebo v případě potřeby odstředí. Do 200 ml odměrné baňky se odpipetuje 100 ml supernatantu, smíchá se s acetonem (3.6) a doplní se tímto rozpouštědlem po značku. Homogenizuje se a přefiltruje.

5.2   Titrace

Do Erlenmayerovy baňky se odpipetuje 25–100 ml filtrátu (podle předpokládaného obsahu chlóru) získaného podle bodu 5.1.1, 5.1.2 nebo 5.1.3. Alikvotní část nesmí obsahovat více než 150 ml chlóru (Cl). V případě potřeby se doplní vodou na minimálně 50 ml, přidá se 5 ml kyseliny dusičné (3.4), 20 ml nasyceného roztoku síranu železitoamonného (3.3) a dvě kapky roztoku thiokyanatanu amonného (3.1) z byrety naplněné ke značce nula. Jinou byretou se přidá roztok dusičnanu stříbrného (3.2) tak, aby se získal přebytek 5 ml. Dále se přidá 5 ml diethyletheru (3.5) a silně se protřepe, aby sraženina dobře koagulovala. Přebytek dusičnanu stříbrného se titruje s roztokem thiokyanatanu amonného (3.1), dokud není dosaženo červenohnědého zabarvení, které vydrží jednu minutu.

6.   Výpočet a vyjádření výsledků

Obsah ve vodě rozpustných chloridů (X) vyjádřených jako procento chloridu sodného se vypočítá podle následujícího vzorce:

kde:

V1	=	přidaný roztok dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l v ml
V2	=	roztok thiokyanatanu amonného 0,1 mol/l použitý pro titraci v ml
m	=	hmotnost vzorku

Jestliže byl při slepé zkoušce roztok dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l spotřebován, odečte se tato hodnota z objemu (V1 - V2).

7.   Poznámky

7.1	Titraci lze provádět také potenciometricky.

7.2	V případě produktů velmi bohatých na oleje a tuky se vzorek nejprve odtuční diethyletherem nebo petroletherem.

7.3	V případě rybích mouček lze titraci provést Mohrovou metodou.

---

(1)  Laboratorní sušárna určená pro sušení obilí, mouky, krup a krupice musí mít takovou tepelnou kapacitu, aby, pokud je nastavena na teplotu 131 oC, této teploty opět dosáhla v době kratší než 45 minut poté, co byl do sušárny umístěn maximální počet zkoušených vzorků, které se mají sušit současně. Větrání musí být takové, že když se všechny vzorky pšenice obecné, které může sušárna pojmout, současně suší po dobu dvou hodin, vykazují s ohledem na výsledky čtyřhodinového sušení rozdíl, který je nižší než 0,15 %.

(2)  Pokud má být vyextrahovaný tuk použit pro další zkoušky kvality, nahradí se varné kamínky skleněnými kuličkami.

(3)  Úř. věst. L 125, 23.5.1996, s. 35.