„I“

:

за транзит през територията на трета страна на живи животни, предназначени за незабавно клане или на животни за угояване от рода на едрия рогат добитък, изпратени от държава-членка и с местоназначение друга държава-членка в камиони, запечатани с пломба със сериен номер.

Номерът на пломбата трябва да бъде въведен в здравния сертификат, издаден в съответствие с образеца, установен в приложение Е към Директива 64/432/ЕИО (6) за живи животни от рода на едрия рогат за клане и угояване и в съответствие с образец I от приложение Д към Директива 91/68/ЕИО (7) за овце и кози за клане.

Освен това пломбата трябва да бъде цяла при пристигането на определения за влизане в Съюза граничен инспекционен пункт и номерът ѝ да е регистриран в интегрираната компютризирана ветеринарна система на Съюза (TRACES).

Сертификатът трябва да бъде подпечатан на изходния пункт на Съюза от компетентните ветеринарни органи преди транзитното преминаване през една или повече трети страни с печат, носещ следния надпис: „САМО ЗА ТРАНЗИТ МЕЖДУ РАЗЛИЧНИ ЧАСТИ НА ЕВРОПЕЙСКИЯ СЪЮЗ ПРЕЗ БИВША ЮГОСЛАВСКА РЕПУБЛИКА МАКЕДОНИЯ/ЧЕРНА ГОРА/СЪРБИЯ (8)  (9)“

Животните за угояване от рода на едрия рогат добитък трябва да бъдат директно транспортирани до стопанството на местоназначение, определено от компетентния ветеринарен орган на местоназначението. Посочените животни не трябва да бъдат местени от посоченото стопанство, освен за незабавно клане.

„II“

:

територия, призната за официално свободна от туберкулоза за целите на износа в Съюза на животни, сертифицирани в съответствие с образеца на сертификат BOV-X.

„III“

:

територия, призната за официално свободна от бруцелоза за целите на износа в Съюза на животни, сертифицирани в съответствие с образеца на сертификат BOV-X.

„IVa“

:

територия, призната за официално свободна от ензоотична левкоза по говедата (ЕЛГ) за целите на износа в Съюза на животни, сертифицирани в съответствие с образеца на сертификат BOV -X.

„IVb“

:

територия с одобрени стопанства, признати за официално свободни от ензоотична левкоза по говедата (ЕЛГ) за целите на износа в Съюза на животни, сертифицирани в съответствие с образеца на сертификат BOV -X.

„V“

:

територия, призната за официално свободна от бруцелоза за целите на износа в Съюза на животни, сертифицирани в съответствие с образеца на сертификат OVI-X.

„VI“

:

Географски ограничения:

„VII“

:

територия, призната за официално свободна от туберкулоза за целите на износа в Съюза на животни, сертифицирани в съответствие с образеца на сертификат RUM.

„VIII“

:

територия, призната за официално свободна от бруцелоза за целите на износа в Съюза на животни, сертифицирани в съответствие с образеца на сертификат RUM.

„IX“

:

територия, призната за официално свободна от болестта на Ауески за целите на износа в Съюза на животни, сертифицирани в съответствие с образеца на сертификат POR-Х.

„BOV-X“

:

образец на ветеринарен сертификат за домашни животни от рода на едрия рогат добитък (включително видовете Bubalus и Bison, и техните кръстоски), предназначени за отглеждане и/или разплод след внос.

„BOV-Y“

:

образец на ветеринарен сертификат за домашни животни от рода на едрия рогат добитък (включително видовете Bubalus и Bison и техните кръстоски), предназначени за незабавно клане след внос.

„OVI-X“

:

образец на ветеринарен сертификат за домашни животни от рода на овцете (Ovis aries) и домашни животни от рода на козите (Capra hircus), предназначени за отглеждане и/или разплод след внос.

„OVI-Y“

:

образец на ветеринарен сертификат за домашни животни от рода на овцете (Ovis aries) и домашни животни от рода на козите (Capra hircus), предназначени за незабавно клане след внос.

„POR-X“

:

образец на ветеринарен сертификат за домашни животни от рода на свинете (Sus scrofa), предназначени за отглеждане и/или разплод след внос;

„POR-Y“

:

образец на ветеринарен сертификат за домашни животни от рода на свинете (Sus scrofa), предназначени за незабавно клане след внос.

„RUM“

:

образец на ветеринарен сертификат за животни от разред Чифтокопитни (без животни от рода на едрия рогат добитък (включително видовете Bubalus и Bison и техните кръстоски), Ovis aries, Capra hircus, Свине и Пекари) и от семействата Носорози и Слонове.

„SUI“

:

образец на ветеринарен сертификат за дивечови животни от семейства Свине, Пекари и Тапирови.

„CAM“

:

образец на специално удостоверение за животни, внесени от Сен Пиер и Микелон съгласно условията, предвидени в част 7 от приложение I.

„A“

:

гаранции по отношение на изследванията за син език и епизоотична хеморагична болест, проведени върху животни, сертифицирани в съответствие с образеца на сертификат BOV-X (точка II.2.8 Б), OVI-X (точка II.2.6 Г) и RUM (точка II.2.6).

„B“

:

гаранции по отношение на изследванията за везикулозна болест по свинете и класическа чума по свинете, проведени върху животни, сертифицирани в съответствие с образеца на сертификат POR-X (точка II.2.4 Б) и SUI (точка II.2.4 Б).

„C“

:

гаранции по отношение на изследването за бруцелоза, проведено върху животни, сертифицирани в съответствие с образеца на сертификат POR-X (точка II.2.4 В) и SUI (точка II.2.4 В).

I.

Те трябва да са под контрола на официален ветеринарен лекар.

II.

Всеки един от тях трябва да е разположен в центъра на район с диаметър най-малко 20 km, където в съответствие с официалните данни не е имало случай на шап най-малко 30 дни преди тяхното използване като одобрени събирателни центрове.

III.

Преди всяко използване като одобрени събирателни центрове те трябва да бъдат почистени и дезинфекцирани с дезинфектант, официално разрешен в страната износител като ефикасен за борба с болестта шап.

IV.

В тях трябва да има, като се вземе предвид капацитета им за прием на животни:

V.

Когато са в действие, в тях трябва да има достатъчно ветеринарни лекари за изпълнението на всички задължения, посочени в част 5.

VI.

Те трябва да приемат само животни, които са били индивидуално идентифицирани, така че да се гарантира проследимостта. За тази цел, когато се приемат животни, собственикът на събирателния център или длъжностното лице, отговарящо за центъра, трябва да гарантира, че животните са надлежно идентифицирани и придружени от здравни документи или сертификати за въпросните видове и категории.

Освен това, собственикът на събирателния център или длъжностното лице, отговарящо за центъра, записва в регистър или база данни и съхранява в продължение на най-малко три години името на собственика, произхода на животните, датата на тяхното влизане и напускане, идентификационния номер на животните или регистрационния номер на стадото на произход и стопанството на местоназначение, както и регистрационния номер на превозвача и регистрационния номер на камиона, доставящ или взимащ животни от събирателния център.

VII.

Всички животни, преминаващи през събирателните центрове, трябва да отговарят на здравните условия, установени за внос на съответната категория животни в Съюза.

VIII.

Животни, предназначени за въвеждане в Съюза, които минават през събирателен център, трябва в рамките на шест дни от пристигането в събирателния център да бъдат натоварени и отправени директно към границата на страната износител:

IX.

Където условията за износ на животни в Съюза изискват да бъде направено изследване в определен период от време преди натоварването, този период включва всеки период за събиране, с продължителност до шест дни, считано от момента на пристигането на животните в одобрения център за събиране.

Х.

Третата страна износител трябва да определи центровете, одобрени за животни за разплод и отглеждане и центровете, одобрени за животни за клане, и да уведоми Комисията и компетентните централни органи на държавите-членки за имената и адресите на такива съоръжения. Тази информация трябва редовно да се актуализира.

XI.

Третата страна износител определя процедурата за официален надзор на одобрените събирателни центрове и осигурява осъществяването на такъв надзор.

XII.

Одобрените събирателни центрове трябва да бъдат редовно инспектирани от компетентния орган на третата страна, за да се проверява, дали изискванията за одобрение, установени в точки I—XI, продължават да се спазват.

Ако инспекциите покажат, че условията вече не се изпълняват, статутът на одобрен център може да бъде отменен. Статутът на одобрен център може да бъде възстановен, когато компетентният орган на третата страна бъде напълно удовлетворен от съответствието на центъра с условията, посочени в точки I—XI.

1.

Подходящи микротитърни плаки за ELISA.

2.

Антиген: доставен като екстрахиран клетъчен концентрат, приготвен, както е описано по-долу, и съхраняван при температура –20 °C или –70 °C.

3.

Блокиращ буфер: фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), съдържащ 0,3 % отрицателен по отношение на син език серум от възрастни говеда, 0,1 % (v/v) Tween-20 (доставен като сироп на полиоксиетилен сорбитон монолаурат) в PBS.

4.

Моноклонално антитяло: 3-17-A3 (доставено като супернатант от хибридомна тъканна култура), насочено срещу групово специфичния полипептид VP7, съхраняван при температура–20 °C или лиофилизиран и разреден в пропорция 1/100 с блокиращ буфер преди употреба.

5.

Конюгат: заешки антимиши глобулин (адсорбиран и елюиран), конюгиран с пероксидаза от хрян и съхраняван на тъмно при температура 4 °C.

6.

Хромоген и субстрат: Ортофенилен диамин (ОФД-хромоген) при крайна концентрация от 0,4 mg/ml в стерилна дестилирана вода. Водороден пероксид (30 % w/v-субстрат) 0,05 % v/v, добавени непосредствено преди употреба (5μl H2 O2 на 10 ml ОФД). (да се борави внимателно с ОФД — да се носят гумени ръкавици — предполагаем мутаген).

7.

Едномоларна сярна киселина: 26,6 ml киселина, добавена към 473,4 ml дестилирана вода. (Важно! Винаги се прибавя киселината към водата и никога — водата към киселината).

8.

Орбитален шейкър.

9.

Четец за плаки ELISA (тестът може да бъде отчитан визуално).

Контролна проба с конюгат (Cс)

:

ямки 1A и 1B съдържат празна проба, състояща се от антиген на син език и конюгат. Тя може да бъде използвана за калибриране на четеца на плаки ELISA.

Контролна проба с моноклонално антитяло (Cm)

:

Графи 1 и 2, редове Ж и З представляват контролната проба с моноклонално антитяло, съдържаща антиген на син език, моноклонално антитяло и конюгат. В тези ямки се появява максималното оцветяване. Средната отчетена оптическа плътност от тази контролна проба е 0 % от стойността на инхибиране.

Положителна проба (C++, C+)

:

Графи 1 и 2, редове В-Г-Д-Е. В тези ямки има антиген на син език, съответно силно и слабо положителен антисерум, моноклонално антитяло и конюгат.

Отрицателна контролна проба (C–)

:

Ямки 2A и 2Б са отрицателните проби, които съдържат антиген на син език, негативен по отношение на син език антисерум, моноклонално антитяло и конюгат.

Тест-серуми

:

За обширни серологични изследвания и бърз скрининг серумите могат да се изследват при единично разреждане от 1:5 (допълнение 1). Като алтернатива, могат да бъдат изследвани 10 серума при разреждане, вариращо от 1:5 до 1:640 (допълнение 2). Това ще даде определени индикации за титъра на антитела в изследваните серуми.

1.

Антиген на син език се разрежда до предварително титруваната концентрация в PBS, разбърква се за кратко с ултразвукова бъркалка, за да се диспергират вирусните агрегати (ако не е наличен ултразвуков апарат, се бърка енергично с пипета) и се прибавят по 50 μl към всички ямки на плаката за ELISA. За диспергиране на антигена се почукват страните на плаката.

2.

Инкубира се на 37 °C в продължение на 60 минути в орбитален шейкър. Плаките се измиват три пъти чрез напълване и изпразване на ямките с нестерилен PBS и се изсушават с помощта на попивателна хартия.

3.

Контролни ямки: Прибавят се 100 µl блокиращ буфер към ямките с контролна проба конюгат (Cc). Прибавят се по 50 µl положителни и отрицателни контролни серумни проби при разреждане 1:5 (10 µl серумни проби + 40 µl блокиращ буфер), към съответните ямки C–, C + и C++. Прибавят се 50 µl блокиращ буфер към контролните ямки с моноклонално антитяло.

Метод на точковото титруване: добавя се от всеки тест-серум, разреден в съотношение 1:5 с блокиращ буфер, за да се дублират ямките на графи 3—12 (10 µl серум +40 µl блокиращ буфер),

или

Метод за титруване на серума: приготвят се серии двукратни разреждания на всяка от пробите за анализ (от 1:5 до 1:640) в блокиращ буфер в осем ямки на единични графи 3—12.

4.

Веднага след прибавянето на тест-серумите се разрежда моноклоналното антитяло в съотношение 1:100 в блокиращ буфер и се добавят 50 µl към всички ямки на плаката, освен в тази за празната проба.

5.

Инкубира се на 37 °C в продължение на 60 минути в орбитален шейкър. Плаката се измива три пъти с PBS и се изсушава с попивателна хартия.

6.

Разрежда се заешки антимиши концентрат до съотношение 1/5 000 в блокиращ буфер и се добавят 50 µl към всички ямки на плаката.

7.

Инкубира се на 37 °C в продължение на 60 минути в орбитален шейкър. Плаката се измива три пъти с PBS и се изсушава с попивателна хартия.

8.

Разтопява се О-фенилендиамин дихидрохлорид (ОФД) и непосредствено преди употреба се добавят 5 µl водороден пероксид с концентрация 30 % за всеки 10 ml ОФД. Добавят се 50 µl към всички ямки на плаката. Изчаква се в продължение на приблизително 10 минути оцветяването да се прояви и реакцията се спира с едномоларна сярна киселина (50 µl на ямка). Оцветяване следва да се появи в контролните ямки, съдържащи моноклонално антитяло и в онези ямки, които съдържат серуми без антитела на син език.

9.

Плаките се преглеждат и описват визуално или с използване на спектрофотометричен четец.

1.

40-60 плоски шишета (колби на Ру) със сливащи се бъбречни клетки на новородени хамстери BHK-21 се изплакват три пъти със среда на Eagle, която не съдържа серум, и се инфектират с вирус на син език от серотип 1 в среда на Eagle, несъдържаща серум.

2.

Инкубират се при 37 °C и се изследват ежедневно за цитопатичен ефект (ЦПЕ).

3.

Когато ЦПЕ обхване 90 до 100 % от слоя от клетки във всяко шише, вирусът се събира чрез разклащане на шишето, за да се отделят залепналите за стъклото клетки.

4.

Шишетата се подлагат на центрофугиране при 2 000 до 3 000 об./мин., за да се раздробят клетките.

5.

Супернатантът се отстранява и клетките се поставят отново в суспензия от приблизително 30 ml PBS, съдържащ 1 % „Sarkosyl“ и 2 ml фенилметилсулфонил флуорид (лизиращ буфер). Това може да бъде причина клетките да образуват гел, като за намаляване на този ефект може да бъде добавен повече лизиращ буфер. (NB: фенилметилсулфонил флуоридът е опасен — с него трябва да се борави с изключителна предпазливост.)

6.

Чрез използване на ултразвукова сонда в продължение на 60 секунди при амплитуда 30 микрона клетките се разрушават.

7.

Центрофугира се при 10 000 об./мин. в продължение на 10 минути.

8.

Супернатантът се съхранява при температура +4 °C, а останалата маса от клетки се поставя в 10 до 20 ml лизиращ буфер за получаване на нова суспензия.

9.

Въздейства се с ултразвук и се избистря общо три пъти, като при всеки етап супернатантът се съхранява.

10.

Супернатантите се обединяват и центрофугират при 24 000 об./мин. (100,000 g) в продължение на 120 минути при +4 °C върху подложка от 5 ml 40 % захароза (w/v в PBS), като се използват епруветки за центрофугиране Beckmann от 30 ml и ротор SW 28.

11.

Супернатантът се отстранява, епруветките се изплакват старателно и клетъчната маса отново се поставя в PBS, като чрез въздействие с ултразвук се получава суспензия. Антигенът се съхранява като аликвотни части при температура –20 °C.

1.

Разреден в PBS в съотношение 1:20 антиген на син език се титрува на микротитърна плака в серии от двукратно разредени проби (50 µl/ямка), като се използва многоканална пипета.

2.

Пробите се инкубират в продължение на един час на 37 °C върху орбитален шейкър.

3.

Плаките се измиват три пъти с PBS.

4.

Добавят се 50 µl моноклонално антитяло 3-17-A3 (разредено 1/100) към всяка ямка на микротитърната плака.

5.

Пробите се инкубират в продължение на един час на 37 °C върху орбитален шейкър.

6.

Плаките се измиват три пъти с PBS.

7.

Към всяка ямка на микротитърна плака се добавят 50 µl заешки антимиши глобулин, конюгиран с пероксидаза от хрян, разредена до предварително титрувана оптимална концентрация.

8.

Пробите се инкубират в продължение на един час на 37 °C върху орбитален шейкър.

9.

Добавят се субстрат и хромоген, както е описано по-горе. Реакцията се спира след 10 минути чрез добавяне на едномоларна сярна киселина (50 µl/ямка).

Процедура

:

1 % агароза, приготвена в боратен или натриев барбитолов буфер, с pH 8,5—9,0, се изсипва в блюдо на Петри до минимална дълбочина от 3,0 mm. В агара се изрязват седем сухи ямки, всяка с диаметър 5,0 mm. Конфигурацията се състои от една централна ямка и шест ямки, подредени около нея в кръг с радиус 3 cm. Централната ямка се запълва със стандартния антиген. Периферните ямки 2, 4 и 6 се пълнят с известен положителен серум, а ямки 1, 3 и 5 се пълнят с тест-серуми. Системата се инкубира в продължение на най-много 72 часа при стайна температура в затворена влажна камера.

Тълкуване

:

Тест-серумът е положителен, ако образува специфична линия на преципитация с антигена и формира непрекъсната идентификационна линия с контролния серум. Тест-серумът е отрицателен, ако не формира специфична линия с антигена и ако не изкривява линията на контролния серум; блюдата на Петри трябва да се изследват на тъмен фон и при индиректно осветление.

Процедура

:

1 % агароза, приготвена в боратен или натриев барбитолов буфер, с pH 8,5—9,0, се изсипва в блюдо на Петри до минимална дълбочина от 3,0 mm. В агара се изрязват седем сухи ямки, всяка с диаметър 5,0 mm. Конфигурацията се състои от една централна ямка и шест ямки, подредени около нея в кръг с радиус 3 cm. Централната ямка се запълва със стандартния антиген. Периферните ямки 2, 4 и 6 се пълнят с известен положителен серум, ямки 1, 3 и 5 се пълнят с тест-серуми. Системата се инкубира в продължение на най-много 72 часа при стайна температура в затворена влажна камера.

Тълкуване

:

Тест-серумът е положителен, ако образува специфична линия на преципитация с антигена и формира непрекъсната идентификационна линия с контролния серум. Тест-серумът е отрицателен, ако не формира специфична линия с антигена и ако не изкривява линията на контролния серум; блюдата на Петри трябва да се изследват на тъмен фон и при индиректно осветление.

Серум

:

Всички серуми се инактивират чрез загряване до 56 °C в продължение на 30 минути преди употреба.

Процедура

:

При изследването за константна серум-неутрализация по отношение на различни вируси върху микротитърни плаки се използват клетки от тип MDBK или други възприемчиви клетки. Colorado, Oxford или всеки друг референтен щам на вируса се използва при 100 TCID50 на 0,025 ml; инактивирани неразредени серумни проби се смесват с равен обем (0,025 ml) вирусна суспензия. Смесите вирус/серум се инкубират в продължение на 24 часа при температура 37 °C в микротитърни плаки, преди да бъдат добавени клетките от типа MDBK. Клетките се използват при концентрация, при която се след 24 часа се образува цялостен монослой.

Проверки

:

i) тест за вирусна инфекциозност, ii) проверки за серотоксичност, iii) проверки в незаразени клетъчни култури, iv) референтни антисеруми.

Тълкуване

:

Резултатите от изследването за неутрализация и титърът на използвания в изследването вирус се отчитат след три до шест дни инкубиране при температура 37 °C. Серумните титри се смятат за отрицателни, ако няма неутрализиране при разреждане 1/2 (неразреден серум).

Реактиви

:

Преди вземането на пробите се приготвя транспортна среда. От нея се разпределят обеми от два ml в толкова контейнера, колкото са животните, от които ще се вземат проби. Използваните контейнери трябва да издържат на замразяване върху твърд CO2 или в течен азот. Пробите се получават чрез използване на специално конструиран слюнков колектор или „пробанг“. За получаване на проба пробанг-чашката се прекарва през устата, над гърба на езика и надолу в горната част на хранопровода. Правят се опити да се изстърже повърхностния епител на горния хранопровод и фаринкса чрез движения, насочени странично и дорзално. След това пробангът се издърпва, за предпочитане след като животното е преглътнало. Чашката трябва да е пълна и да съдържа смес от слуз, слюнка, хранопроводна течност и клетъчни остатъци. Трябва да се внимава всяка проба да съдържа известно количество видим клетъчен материал. Трябва да се избягва грубо манипулиране, което причинява кървене. Пробите от някои животни могат да бъдат силно замърсени от преживна маса. Такива проби трябва да се отстранят и устата на животното да се изплакне с вода или за предпочитане с физиологичен разтвор, преди да се повтори вземането на проба.

Обработване на пробите

:

оценява се качеството на всяка проба, събрана в чашката на пробанга, и 2 ml от пробата се добавят към равен обем транспортна среда в контейнер, който може да издържи на замразяване. Контейнерите се затварят плътно, запечатват се, дезинфекцират се и се етикетират. Пробите се държат охладени (+4 °C) и се изследват в рамките на три до четири часа или се поставят върху сух лед (–69 °C) или течен азот и се държат замразени докато бъдат изследвани. Между две взимания на проби пробангът се дезинфекцира и измива три пъти с чиста вода.

Изследване за вируса на шап

:

пробите се инкубират в култури от първични клетки от щитовидна жлеза на говеда, като се използват най-малко три епруветки на проба. Могат да бъдат използвани и други възприемчиви клетки, напр. първични клетки от бъбреци на говеда или свине, но трябва да се има предвид, че те са по-малко чувствителни към някои щамове на вируса на шап. Епруветките се инкубират при температура 37 °C в ролерен апарат и в рамките на 48 часа ежедневно се изследват за наличието на цитопатичен ефект (ЦПЕ). Ако са отрицателни, културите са прехвърлят на случаен принцип върху нови култури и се изследват повторно в продължение на 48 часа. Специфичността на всеки ЦПЕ трябва да бъде потвърдена.

1.

0,08-моларен фосфатен буфер с pH 7,2, съдържащ 0,01 % говежди серумен албумин, 0,002 % фенолно червено и антибиотици.

2.

Среда за тъканна култура (напр. минимална основна среда (MEM) на Eagle), съдържаща 0,04-моларен Hepes буфер, 0,01 % говежди серумен албумин и антибиотици, с pH 7,2.

3.

Към транспортната среда трябва да бъдат добавяни антибиотици, напр. пеницилин 1 000 IU, неомицин сулфат 100 IU, полимиксин B сулфат 50 IU, микостатин 100 IU (на ml краен продукт).

Реактиви

:

Запасен антиген за вируса на шап се приготвя в клетъчни култури или върху говежди езици и се съхранява при температура –70 °C или по-ниска или при температура –20 °C след прибавяне на 50 % глицерин. Това е запасният антиген. При тези условия шапният вирус е стабилен и за период от няколко месеца неговите титри се променят незначително.

Процедура

:

Изследването се провежда в плоскодънни микротитърни плаки за тъканни култури, като се използват възприемчиви клетки като IB-RS-2, BHK-21 или клетки от телешки бъбрек. Серумите за изследването се разреждат в съотношение 1/4 със свободна от серуми среда за клетъчни култури с добавяне на 100 IU/ml неомицин или друг подходящ антибиотик. Серумите се инактивират при температура 56 °C в продължение на 30 минути и се използват количества от 0,05 ml за приготвяне на двойни серии върху микротитърни плаки, като се използват дозиращи тръбички от 0,05 ml. Към всяка ямка се добавя предварително титруван вирус, също разреден в свободна от серум среда за клетъчна култура и съдържащ 100 TCID50/0,05 ml. След инкубиране на 37 °C в продължение на един час, което позволява да се осъществи неутрализацията, към всяка ямка се добавя 0,05 ml от суспензията на клетки, съдържаща 0,5 до 1,0 × 106 клетки на 1 ml в среда за клетъчна култура, съдържаща серум, свободен от антитела на шап, и плаките се запечатват. Плаките се инкубират на 37 °C. Обикновено в рамките на 24 часа монослоевете се сливат. ЦПЕ е обичайно достатъчно напреднал за 48 часа за микроскопско отчитане на изследването. По това време може да бъде направено окончателно микроскопско отчитане или плаките могат да бъдат фиксирани и оцветени за макроскопско отчитане, например като се използва разтвор, съдържащ 10 % формалин, физиологичен разтвор и 0,05 % метиленово синьо.

Проверки

:

Проверките при всяко изследване включват хомоложен антисерум с известен титър, клетъчна проверка, проверка на серумната токсичност, проверка на средата и титруване на вируса, въз основа на които се изчислява действителното количество на вирус в изследването.

Тълкуване

:

Ямки с данни за ЦПЕ се считат за инфектирани и неутрализиращите титри се изразяват като реципрочна стойност на крайното разреждане на серума, наличен в смесите серум/вирус при крайна точка от 50 %, изчислена по метода на Spearman-Karber. (Karber, G., 1931, Archiv fuer Experimentelle Pathologie und Pharmokologie, 162, 480.). Изследванията се считат за валидни, когато действителното количество от вируса, използвано във всяка ямка при изследването, е между 101,5 и 102,5 TCID50 и когато титърът на референтния серум не е по-висок от двукратната стойност на неговия очакван титър, изчислен по начина на предишните титрувания. Когато проверките са извън тези граници, изследванията се повтарят. Краен титър, равен на 1/11 или по-малко, се приема за отрицателен.

Реактиви

:

Заешки антисеруми срещу антиген 146S от седем типа на вируса на шап, използвани при предварително определена оптимална концентрация в карбонатен/бикарбонатен буфер с pH 9,6. Антигените се приготвят от избрани щамове на вируса, отгледани върху монослоеве от клетки BHK-21. Непречистените супернатанти се използват и предварително се титруват съгласно протокола, но без серум, за се получи разреждане, което след добавяне на равен обем на PBST (фосфатно буфериран физиологичен разтвор, съдържащ 0,05 % Tween-20 и индикатор фенолно червено) биха дали оптическа плътност между 1,2 и 1,5. Могат да се използват инактивирани вируси. PBST се използва като разредител. Антисеруми от морски свинчета се приготвят чрез заразяване на морски свинчета с антиген 146S на всеки серотип. Предварително определената оптимална концентрация се приготвя в PBST, съдържащ 10 % нормален говежди серум и 5 % нормален заешки серум. Използва се заешки имуноглобулин против морски свинчета в комбинация с пероксидаза от хрян, разтворен в PBST, съдържащ 10 % нормален говежди серум и 5 % нормален заешки серум, при предварително определена оптимална концентрация. Тест-серумите се разреждат с PBST.

1.

Плаките за ELISA са покриват със слой от 50 µl заешки антивирусни серуми за една нощ във влажна камера при стайна температура.

2.

На плаки с множество U-образни ямки (носещи плаки) се приготвят петдесет микролитра двойни серии разреждания с фактор 2 на всеки тест-серум, като се започва с разреждане 1/4. Към всяка ямка се добавят петдесет микролитра постоянна доза антиген и смесите се оставят за една нощ при температура 4 °C. Добавянето на антиген намалява началното разреждане на антигена до 1/8.

3.

Плаките за ELISA се измиват пет пъти с PBST.

4.

Петдесет микролитра от смесите серум/антиген се пренасят от носещите плаки върху покритите със заешки серум плаки за ELISA, и се инкубират при температура 37 °C в продължение на един час на ротационен шейкър.

5.

След измиване, към всяка ямка се добавят 50 µl антисерум от морски свинчета срещу използвания в точка 4 антиген. Плаките се инкубират при температура 37 °C за един час върху ротационен шейкър.

6.

Плаките се измиват и към всяка ямка се добавят 50 µl заешки имуноглобулин против морски свинчета в комбинация с пероксидаза от хрян. Плаките се инкубират при температура 37 °C в продължение на един час върху ротационен шейкър.

7.

Плаките се измиват и към всяка ямка се добавят 50 µl ортофенилен диамин, съдържащ 0,05 % H2O2 (30 % w/v).

8.

Реакцията се спира след 15 минути с 1,25-моларна H2SO4.

Проверки

:

За всеки използван антиген 40 ямки не съдържат серум, а разреден в PBST антиген. Двойни серии разреждания с фактор 2 от хомоложен говежди референтен антисерум. Двойни серии разреждания с фактор 2 от отрицателен говежди серум.

Тълкуване

:

Титрите за определено антитяло се изразяват като крайното разреждане на тест-серумите, даващи 50 % от средната стойност на ОП, отчетени в контролните ямки с вирус, където отсъства тест-серум. Титрите над 1/40 се считат за положителни.

Препратки

:

Hamblin C, Barnett ITR and Hedger RS (1986), „A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA.“, Journal of Immunological Methods, 93, 115 до 121.11.

Серум

:

Всички серуми се инактивират чрез загряване до 56 °C в продължение на 30 минути преди употреба.

Процедура

:

При изследването за константна серум-неутрализация на различни вируси върху микротитърни плаки се използват клетки от типа MDBK или други възприемчиви клетки. Вирусът на болестта на Ауески се използва при 100 TCID50 на 0,025 ml; инактивирани неразредени серумни проби се смесват с равен обем (0,025 ml) вирусна суспензия. Смесите вирус/серум се инкубират в продължение на два часа при температура 37 °C в микротитърни плаки, преди да бъдат добавени подходящите клетки. Клетките се използват при концентрация, при която се след 24 часа се образува цялостен монослой.

Проверки

:

i) изследване за вирусна инфекциозност, ii) проверки за серумна токсичност, iii) проверки на незаразени клетъчни култури, iv) референтни антисеруми.

Тълкуване

:

Резултатите от неутрализационен тест и титърът на използвания в теста вирус се отчитат след три до седем дни инкубиране при 37 °C. Серумни титри, по-ниски от 1/2 (неразреден серум) се смятат за негативни.

Серум

:

Всички серуми се инактивират чрез загряване до 56 °C в продължение на 30 минути преди употреба.

Процедура

:

При изследването за константна серум-неутрализация на различни вируси върху микротитърни плаки се използват клетки А72 (кучешки тумор) или други чувствителни системи от клетки. Вирусът на трансмисивния гастроентерит се използва при 100 TCID50 на 0,025 ml; инактивирани неразредени серумни проби се смесват с равен обем (0,025 ml) вирусна суспензия. Смесите вирус/серум се инкубират в продължение на 30 до 60 минути при температура 37 °C в микротитърни плаки, преди да бъдат добавени подходящите клетки. Клетките се използват при концентрация, при която след 24 часа се образува цялостен монослой. Във всяка клетка се слага 0,1 ml клетъчна суспензия.

Проверки

:

i) изследване за вирусна инфекциозност, ii) проверки за серумна токсичност, iii) проверки на незаразени клетъчни култури, iv) референтни антисеруми.

Тълкуване

:

Резултатите от неутрализационния тест и титърът на използвания в теста вирус се отчитат след три до пет дни инкубиране при температура 37 °C. Серумни титри, по-ниски от 1/2 (крайно разреждане) се считат за отрицателни. Ако отделни неразредени серумни проби са токсични спрямо тъканните култури, тези серуми могат да бъдат разредени в съотношение 1/2, преди да бъдат използвани в изследването. Такова разреждане е еквивалентно на крайно разреждане от 1/4 на серума. В тези случаи серумни титри, по-ниски от 1/4 (крайно разреждане), се считат за отрицателни.

а)

в карантинната станция могат да влизат отделни пратки. При влизане в карантинната станция обаче, всички животни от един и същ вид в карантинното съоръжение трябва да се разглеждат като една група и с тях да се борави като с такава. Карантинният период за цялата група трябва да започва в момента, когато последното животно е влязло в карантинното съоръжение.

б)

в карантинната станция всяка конкретна група животни трябва да бъде държана в изолация и без да влиза в пряк или непряк контакт с каквито и да било други животни, включително такива от други пратки, които евентуално се намират там.

Всяка пратка животни трябва да бъде държана в одобрената карантинна станция и да бъде предпазвана от насекоми преносители на зараза.

в)

ако по време на карантинния период изолирането на група животни бъде нарушено и се допусне контакт с други животни, карантинният период трябва да започне отначало и да продължи толкова, колкото е било първоначално определено при влизането в карантинната станция.

г)

животни, които са предназначени за въвеждане в Съюза и които преминават през карантинна станция, трябва да бъдат натоварени и изпратени директно за Съюза:

а)

те трябва да са под контрола на официален ветеринарен лекар;

б)

те трябва да са разположени в центъра на район с диаметър най-малко 20 km, в който в съответствие с официалните данни не е имало случай на шап най-малко 30 дни преди тяхното използване като карантинни станции;

в)

преди всяко използване като карантинни станции те трябва да се почистват и дезинфекцират с дезинфектант, официално разрешен в Сен Пиер и Микелон и признат за ефикасен за борба с посочените в глава 2 болести;

г)

в тях трябва да работят, като се вземе предвид капацитета им за прием на животни:

д)

когато са в действие, в тях трябва да има достатъчно ветеринарни лекари за изпълнението на всички задължения;

е)

те трябва да приемат само животни, които са били индивидуално идентифицирани, така че да се гарантира проследимостта. За тази цел, когато се приемат животни, собственикът на карантинната станция или длъжностното лице, отговарящо за нея, трябва да гарантира, че животните са надлежно идентифицирани и придружени от здравни документи или сертификати за въпросните видове и категории. Освен това, собственикът на карантинната станция или длъжностното лице, отговарящо за нея, записва в регистър или база данни и съхранява в продължение на най-малко три години името на собственика, произхода на животните в пратката, датите на влизане и напускане на животните в пратката, идентификационния номер на животните в пратката и тяхното местоназначение.

ж)

компетентният орган трябва да определи процедурата за официален надзор на карантинните станции и да направи така, че да се осъществява такъв надзор; посоченият надзор трябва да включва редовни инспекции, за да се осигури, че изискванията за одобрение продължават да се спазват. В случай на оттегляне на одобрението вследствие на неизпълнение на посочените изисквания, одобрението може да бъде възстановено само когато компетентният орган бъде удовлетворен от съответствието на съоръженията в карантинната станция с всички условия, посочени в точки а)—ж).

а)

Изследване, което да бъде извършено: сравнителна проба за интрадермална реакция с използване на говежди пречистен протеинов дериват (ППД) и птичи ППД в съответствие със стандартите за производство на говежди и птичи туберкулини, както е описано в точка 2.1.2 от приложение Б към Директива 64/432/ЕИО.

Изследването трябва да бъде направено в областта зад рамото (аксиларната област), като се следва техниката, описана в точка 2.2.4 от приложение Б към Директива 64/432/ЕИО.

б)

Срокове за провеждане: животните трябва да бъдат изследвани до два дни от датата на пристигане в карантинната станция и 42 дни след датата на първото изследване.

в)

Тълкуване на изследванията

реакцията се счита за:

г)

Възможни действия след провеждане на изследването:

Ако интрадермалната реакция към говежди ППД на едно животно е положителна, то се изключва от групата, а другите животни следва да бъдат повторно изследвани, като се започне най-рано на 42-рия ден след датата на първото положително изследване, което се приема за първо изследване, така, както е определено в буква б).

Ако при повече от едно животно от групата се появи положителен резултат, износът на цялата група за Съюза се отказва.

Ако при едно или повече животни от групата се появи неясна реакция, цялата група следва да бъде повторно изследвана, като се започне най-рано на 42-рия ден след датата на първото положително изследване, което се приема за първо изследване, така, както е определено в буква б).

а)

Изследване, което да бъде извършено:

б)

Срокове за провеждане: животните трябва да бъдат изследвани до два дни от датата на пристигането им в карантинната станция и 42 дни след датата на първото изследване.

в)

Тълкуване на изследванията

Положителна реакция на изследването е тази, определена в приложение В към Директива 64/432/ЕИО.

г)

Възможни действия след провеждане на изследването:

Животните, чийто резултат от изследването е положителен, се изваждат от групата, а останалите животни се изследват повторно, като се започне най-рано на 42-рия ден след датата, на която е проведено първото положително изследване; посоченото изследване се счита за първо изследване, както е определено в буква б).

Единствено животните, чиито резултати от две последователни изследвания, проведени, както е описано в буква б), са отрицателни, се допускат за въвеждане в Съюза.

а)

Изследване, което да бъде извършено: изследване чрез агар-гел имунодифузия, както е описано в част 6 от приложение I към Регламент (ЕС) № 206/2010 (SANCO/4787/2009).

В случай на положителна реакция, животните следва да се изследват с конкурентен тест ELISA, както е описано в част 6 от приложение I към Регламент (ЕС) № 206/2010 (SANCO/4787/2009), за да се направи разграничаване между двете болести.

б)

Срокове за провеждане:

Животните трябва да бъдат изследвани на два пъти, като резултатите от изследванията трябва да бъдат отрицателни: първото изследване се прави до два дни от датата на пристигането в карантинната станция, а второто — най-малко 21 дни след датата на първото изследване.

в)

Възможни действия след провеждане на изследването:

а)

Изследване, което да бъде извършено: диагностични тестове (с пробанг и серологични), при които се използва ELISA и (вирус неутрализационни) (ВН) техники в съответствие с протоколите, описани в част 6 от приложение I към Регламент (ЕС) № 206/2010 (SANCO/4787/2009).

б)

Срокове за провеждане: животните трябва да бъдат изследвани на два пъти, при което резултатите от изследванията трябва да бъдат отрицателни: първото изследване се прави до два дни след датата на пристигането им в карантинната станция, а второто — най-малко 42 дни от датата на първото изследване.

в)

Възможни действия след провеждане на изследването: ако някое животно покаже положителен резултат при изследването за шап, в такъв случай нито едно животно от карантинната станция не може да бъде въведено в Съюза.

Забележка: Всяко откриване на антитела срещу структурни или неструктурни протеини на вируса на шап следва да се счита за резултат от предишна инфекция с шап, без значение какъв е ваксинационният статус на животното.

а)

Изследване, което да бъде извършено: конкурентният тест ELISA, както е описан в Ръководството за диагностични тестове и ваксини за сухоземни животни на OIE, последно издание, е препоръчваният при международна търговия тест, а също и тестът на първи избор в случая. Може да се използва и изследване чрез серум неутрализационен тест или други признати тестове в съответствие с протоколите, описани в съответните раздели на ръководството на OIE.

б)

Срокове за провеждане: животните следва да бъдат изследвани два пъти: първото изследване се прави до два дни от датата на пристигането им в карантинната станция, а второто — най-малко 42 дни от датата на първото изследване.

в)

Възможни действия след провеждане на изследването: ако някое животно покаже положителен резултат при изследването за чума по говедата, в такъв случай нито едно животно от карантинната станция не може да бъде въведено в Съюза.

а)

Изследване, което да бъде извършено: ELISA, вирус неутрализационен тест или други признати тестове в съответствие с протоколите, описани в съответните раздели на ръководството на OIE.

б)

Срокове за провеждане: животните следва да бъдат изследвани два пъти: първото изследване се прави до два дни от датата на пристигането им в карантинната станция, а второто — най-малко 42 дни от датата на първото изследване.

в)

Възможни действия след провеждане на изследването: ако някое животно покаже положителен резултат при изследването за везикулозен стоматит, в такъв случай нито едно животно от карантинната станция не може да бъде въведено в Съюза.

а)

Изследване, което да бъде извършено: ELISA; вирус неутрализационен тест или други признати тестове в съответствие с протоколите, описани в съответните раздели на ръководството на OIE.

б)

Срокове за провеждане: животните следва да бъдат изследвани два пъти: първото изследване се прави до два дни от датата на пристигането им в карантинната станция, а второто — най-малко 42 дни от датата на първото изследване.

в)

Възможни действия след провеждане на изследването: ако при някое животно се появят признаци за експозиция на причинителя на треска от долината Рифт, в такъв случай нито едно животно от карантинната станция не може да бъде въведено в Съюза.

а)

Изследване, което да бъде извършено: Серология с използване на ELISA; вирус неутрализационен тест или други признати тестове в съответствие с протоколите, описани в съответните раздели на ръководството на OIE.

б)

Срокове за провеждане: животните следва да бъдат изследвани два пъти: първото изследване се прави до два дни от датата на пристигането им в карантинната станция, а второто — най-малко 42 дни от датата на първото изследване.

в)

Възможни действия след провеждане на изследването: ако при някое животно се появят признаци за експозиция на заразен нодуларен дерматит, в такъв случай нито едно животно от карантинната станция не може да бъде въведено в Съюза.

а)

Изследване, което да бъде извършено: ELISA, вирус неутрализационен тест, имунофлуоресцентен тест или друг признат тест.

б)

Срокове за провеждане: животните следва да бъдат изследвани два пъти: първото изследване се прави до два дни от датата на пристигането им в карантинната станция, а второто — най-малко 42 дни от датата на първото изследване.

в)

Възможни действия след провеждане на изследването: ако при някое животно се появят признаци за експозиция на причинителя на Кримска-конго хеморагична треска, в такъв случай нито едно животно от карантинната станция не може да бъде въведено в Съюза.

а)

Изследване, което да бъде извършено: паразитният агент може да бъде идентифициран в концентрирани кръвни проби в съответствие с протоколите, описани в съответните раздели на ръководството на OIE.

б)

Срокове на провеждане: животните следва да бъдат изследвани два пъти: първото изследване се прави до два дни от датата на пристигането им в карантинната станция, а второто — най-малко 42 дни от датата на първото изследване.

в)

Възможни действия след провеждане на изследването: Ако у едно животно от пратката бъде открита T. evansi, то не може да бъде въведено в Съюза. Останалите животни от групата се подлагат на вътрешно и външно противопаразитно третиране, като се използват подходящи вещества, ефикасни срещу T. evansi.

а)

Изследване, което да бъде извършено: Откриване на вирусна ДНК въз основа на идентификация чрез имунофлуоресцентни или имуноцитохимични методи, като се използват протоколите, описани в съответните раздели на ръководството на OIE.

б)

Срокове за провеждане: животните следва да бъдат изследвани два пъти: първото изследване се прави до два дни от датата на пристигането им в карантинната станция, а второто — най-малко 42 дни от датата на първото изследване.

в)

Възможни действия след провеждане на изследването: ако при някое животно се появят признаци за експозиция на злокачествена катарална треска, в такъв случай нито едно животно от карантинната станция не може да бъде въведено в Съюза.

а)

Изследване, което да бъде извършено: изследване чрез агар-гел имунодифузия за ензоотична левкоза по говедата или блокиращ тест ELISA, в съответствие с протоколите, описани в ръководството на OIE, последно издание.

б)

Срокове за провеждане: животните следва да бъдат изследвани два пъти: първото изследване се прави до два дни от датата на пристигането им в карантинната станция, а второто — най-малко 42 дни от датата на първото изследване.

в)

Възможни действия след провеждане на изследването: животните, при които резултатът от изследването, описано в буква а) е положителен, се изваждат от групата животни в карантинната станция, а останалите животни се изследват повторно, като се започне най-рано от 21-рия ден след датата, на която е проведено първото положително изследване. посоченото изследване се счита за първо изследване, така, както е определено в буква б).

Могат да бъдат въведени в Съюза единствено животните, които сa показали отрицателни резултати при две последователни изследвания, проведени, както е описано в буква б).

„BOV“

:

Образец на ветеринарен сертификат за прясно месо, включително мляно месо, от домашни животни от рода на едрия рогат добитък (включително видовете Bison и Bubalus, и техните кръстоски).

„OVI“

:

Образец на ветеринарен сертификат за прясно месо, включително мляно месо, от домашни животни от рода на овцете (Ovis aries) и домашни животни от рода козите (Capra hircus).

„POR“

:

Образец на ветеринарен сертификат за прясно месо, включително мляно месо, от домашни животни от рода на свинете (Sus scrofa).

„EQU“

:

Образец на ветеринарен сертификат за прясно месо, без мляно месо, от домашни нечифтокопитни животни (Equus caballus, Equus asinus и техните кръстоски).

„RUF“

:

Образец на ветеринарен сертификат за прясно месо, без карантия и мляно месо, от отглеждани в стопанства дивечови животни от разред Чифтокопитни (без животни от рода на едрия рогат добитък (включително видовете Bubalus и Bison, и техните кръстоски), Ovis aries, Capra hircus, Свине и Пекари) и от семействата Носорози и Слонове.

„RUW“

:

Образец на ветеринарен сертификат за прясно месо, без карантия и мляно месо, от дивечови животни на свобода, от разред Чифтокопитни (без животни от рода на едрия рогат добитък (включително видовете Bubalus и Bison, и техните кръстоски), Ovis aries, Capra hircus, Свине и Пекари) и към семействата Носорози и Слонове.

„SUF“

:

Образец на ветеринарен сертификат за прясно месо, без карантия и мляно месо, от отглеждани в стопанства дивечови животни, принадлежащи към семействата Свине, Пекари или Тапирови.

„SUW“

:

Образец на ветеринарен сертификат за прясно месо, без карантия и мляно месо, от дивечови животни на свобода, от семейства Свине, Пекари или Тапирови.

„EQW“

:

Образец на ветеринарен сертификат за прясно месо, без карантия и мляно месо, от диви нечифтокопитни животни, принадлежащи към подрод Hippotigris (зебра).

„A“

:

гаранции по отношение на зреенето, измерването на pH и обезкостяването на прясно месо, с изключение на карантия, сертифицирано в съответствие с образците на ветеринарни сертификати BOV (точка II.2.6), OVI (точка II.2.6), RUF (точка II.2.7) и RUW (точка II.2.4).

„C“

:

гаранции по отношение на лабораторното изследване за откриване на класическа чума по свинете в кланични трупове, от които е добито прясно месо, сертифицирано в съответствие с образеца на ветеринарен сертификат SUW (точка II.2.3 Б).

„D“

:

гаранции по отношение на хранителните отпадъци в стопанството/ата, давани на животните, от които е било добито прясно месо, сертифицирано в съответствие с образеца на ветеринарен сертификат POR (точка II.2.3, буква г))

„E“

:

гаранции по отношение на изследването за откриване на туберкулоза у животните, от които е било добито прясно месо, сертифицирано в съответствие с образеца на ветеринарен сертификат BOV (точка II.2.4, буква г).

„F“

:

гаранции по отношение на зреенето и обезкостяването на прясно месо, с изключение на карантия, сертифицирано в съответствие с образците на ветеринарни сертификати BOV (точка II.2.6), OVI (точка II.2.6), RUF (точка II.2.6) и RUW (точка II.2.7).

„G“

:

гаранции по отношение на 1, изключването на карантия и гръбначен мозък; и 2, изследването и произхода на животни от семейство Плътнороги по отношение на хроничното линеене, както е посочено в образците на ветеринарни сертификати RUF (точка II.1.7) и RUW (точка II.1.8).

„H“

:

допълнителни гаранции, изисквани за Бразилия, по отношение на контактите между животни, програмите за ваксинация и наблюдението. Тъй като в щата Santa Catarina в Бразилия не се провеждат ваксинации срещу болестта шап обаче, препратката към програма за ваксинация не е приложима за месото, добито от животни, произхождащи от този щат и заклани там.

*

Изисквания в съответствие със Споразумението между Европейската общност и Конфедерация Швейцария относно търговията със селскостопански продукти (ОВ L 114, 30.4.2002 г., стр. 132).

-

Не са предвидени сертификати и вносът на прясно месо е забранен (с изключение на видовете, които са посочени на реда, отнасящ се за цялата страна).

а)

Ветеринарни сертификати се съставят от третата страна износител въз основа на образците, посочени в част 2 от приложения I, II и IV, както и на приложение III според оформлението на образеца, който отговаря на съответните живи животни/видове прясно месо.

Те съдържат, в указаната в образеца номерирана последователност, удостоверенията, които се изискват за всяка трета страна и — когато е необходимо — допълнителните гаранции, изисквани за третата страна износител или за част от нея.

Ако държавата-членка по местоназначение налага допълнителни сертификационни изисквания за съответните живи животни/видове прясно месо, в оригиналния формуляр на ветеринарния сертификат се включват и удостоверения, че посочените изисквания са удовлетворени.

б)

В случаите, когато в даден образец на сертификат е посочено, че определено твърдение се оставя според случая, твърденията, които не отговарят на действителността, се зачеркват, парафират и подпечатват от сертифициращия служител, или напълно се заличават от сертификата.

в)

Трябва да се осигури отделен и уникален сертификат за живите животни/прясното месо, изнасяни/о от територия или територии на една и съща страна износител, посочена в графи 2 и 3 на част 1 от приложения I, II или IV, които са изпратени на едно и също местоназначение и се транспортират в един и същ железопътен вагон, камион, самолет или кораб.

г)

Оригиналът на всеки сертификат се съставя на един лист хартия или — ако необходимият текстът е по-дълъг —, сертификатът се съставя в такава форма, че всички необходими листове хартия да съставляват единно и неделимо цяло.

д)

Ветеринарният сертификат се съставя най-малко на един от официалните езици на държавата-членка, в която ще се извърши инспекцията на граничния пункт на въвеждане на пратката в Съюза, и на езика на държавата-членка по местоназначение. Посочените държави-членки могат обаче да разрешат и съставянето на сертификат на официалния език на друга държава-членка, придружен, ако е необходимо, от официален превод.

е)

Ако по причини, свързани с идентификацията на артикулите от пратката (таблица в точка I.28 от образеца на ветеринарен сертификат), към сертификата се прилагат допълнителни листове, като тези листове също се считат за част от оригинала на сертификата чрез полагането на подписа и печата на сертифициращия служител върху всяка страница.

ж)

Когато сертификатът, включително допълнителните таблици, посочени в буква е), съдържа повече от една страница, всяка страница се номерира (номер на страница) от (общ брой на страниците) в долния край на страницата, а в горния край на страницата се нанася референтният номер на сертификата, който е бил определен от компетентния орган.

з)

Оригиналът на сертификата трябва да бъде попълнен и подписан от официален ветеринарен лекар или от друг определен официален инспектор, когато това се изисква от образеца на ветеринарния сертификат. В случая на живи животни сертификатът трябва да бъде попълнен и подписан в рамките на 24 часа преди натоварване на пратката за въвеждане в Съюза. Компетентните органи на третата страна износител гарантират, че сертифицирането е извършено при спазване на правила, еквивалентни на установените в Директива 96/93/ЕО (1).

Цветът на подписа е различен от този на печатния текст. Това изискване се прилага също и към печатите, с изключение на онези, които са релефни или с воден знак.

и)

Референтният номер на сертификата, посочен в клетки I.2 и II.a., трябва да бъде издаден от компетентния орган.