ПРИЛОЖЕНИЕ I

(член 1)

СПИСЪК НА РЕФЕРЕНТНИТЕ МЕТОДИ

Индекс мин. = минимум, макс. = максимум, приложение = приложение към цитирания регламент, СВБМ = сухо вещество без мазнини, ПЧ = пероксидно число, ВВ = външен вид, В = вкус, К = консистенция, ОБЧ = общо бактериално число, Терм. = термофилно бактериално число, ДЧ = държава-членка, IDF = Международна федерация на млякото, ISO = Международна организация по стандартизация, IUPAC = Международен съюз за теоретична и приложна химия, ADPI = Американски институт по млечните продукти, ПКМ = подсладено кондензирано мляко, СМС = сгъстено мляко или сметана.

ЧАСТ А

Регламент на Комисията	Продукт	Параметър	Граница (1)	Референтен метод	Забележки
Регламент (ЕО) № 2771/1999 — Публично складиране	Неосолено масло	Мазнини	мин. 8 2 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Вода	до 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		СВБМ	до 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Киселинност на мазнината	1,2 mmol/100g мазнина	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		ПЧ (макс.)	0,3 meq. кислород/1 000  g мазнина	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Забележка 1
		Форми на коли бактерии	Не се откриват в 1 g	Приложение Х	Забележка 3
		Немлечна мазнина	Не се открива чрез триглицериден анализ	Приложение ХХ
		Стеролни маркери за проследяване	Не се открива, β-ситостерин ≤ 40 mg/kg	Приложение VIII
		Други маркери за проследяване
		— ванилин	Не се открива	Приложение VI
		— етилов естер на каротинова киселина	≤ 6 mg/kg	Приложение VII
		— триглицериди на енантова киселина	Не се открива	Приложение V
		Сензорни характеристики	Най-малко 4 от 5 точки за външен вид, вкус и консистенция	Приложение IV
		Водна дисперсия	Най-малко 4 точки	ISO 7586:1985 — IDF 112A:1989
Регламент (ЕО) № 2771/1999 — Частно складиране	Неосолено масло	Мазнини	мин. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Вода	до 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		СВБМ	до 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
Регламент (ЕО) № 2771/1999 — Частно складиране	Осолено масло	Мазнини	мин. 80 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Вода	до 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		СВБМ (с изключение на сол)	до 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Сол	до 2 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
Регламент (ЕО) № 1898/2005, глава II	Неосолено масло	Мазнини	мин. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Немлечна мазнина		Приложение ХХ
		Вода	до 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		СВБМ	до 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Маркери за проследяване:
		— стероли	Виж приложение VIII	Приложение VIII
		— ванилин	Виж приложение VI	Приложение VI
		— етилов естер на каротинова киселина	Виж приложение VII	Приложение VII
		— триглицериди на енантова киселина	Виж приложение V	Приложение V
Регламент (ЕО) № 1898/2005, глава II	Осолено масло	Мазнини	мин. 80 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Немлечна мазнина		Приложение ХХ
		Вода	до 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		СВБМ (с изключение на сол)	до 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Сол	до 2 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
		Маркери за проследяване:
		— стероли	Виж приложение VIII	Приложение VIII
		— ванилин	Виж приложение VI	Приложение VI
		— етилов естер на каротинова киселина	Виж приложение VII	Приложение VII
		— триглицериди на енантова киселина	Виж приложение V	Приложение V
Регламент (ЕО) № 1898/2005, глава II	Концентрирано масло	Мазнини	мин. 99,8 % m/m	IDF 24:1964
		Вода и СВБМ	до 0,2 % m/m	ISO 5536:2002|IDF 23:2002 (влага) IDF 24:1964 (СВБМ)
		Киселинност на мазнината	1,2 mmol/100g мазнина	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		ПЧ (макс.)	0,5 meq. кислород/1 000 g мазнина	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Забележка 1
		Немлечна мазнина	Отсъствие	Приложение ХХ
		Вкус	Чист
		Мирис	Липса на странични миризми
		Други	Липса на неутрализиращи агенти, антиоксиданти и консерванти
		Маркери за проследяване:
		— стероли	Виж приложение VIII	Приложение VIII
		— ванилин	Виж приложение VI	Приложение VI
		— етилов естер на каротинова киселина	Виж приложение VII	Приложение VII
		— триглицериди на енантова киселина	Виж приложение V	Приложение V
Регламент (ЕО) № 1898/2005, глава II	Сметана	Мазнини	мин. 35 % m/m	ISO 2450:1999/IDF 16 C:1987
		Немлечна мазнина		Приложение ХХ
		Маркери за проследяване:
		— стероли	Виж приложение VIII		Забележка 2
		— ванилин	Виж приложение VI	Приложение VI
		— етилов естер на каротинова киселина	Виж приложение VII		Забележка 2
		— триглицериди на енантова киселина	Виж приложение V	Приложение V
Регламент (ЕО) № 1898/2005, глава III	Концентрирано масло	Мазнини	мин. 96 % m/m		Забележка 2
		Немлечна мазнина		Приложение ХХ
		СВБМ	до 2 % m/m		Забележка 2
		Маркери за проследяване:
		— стигмастерол (95 % m/m)	15 g/100 kg концентрирано масло	Приложение VIII
		— стигмастерол (85 % m/m)	17 g/100 kg концентрирано масло	Приложение VIII
		— триглицериди на енантова киселина	10,34 kg/t концентрирано масло	Приложение V
		— етилов естер на бутирова киселина и стигмастерол		— етилов естер на бутирова киселина — стигмастерол: приложение VIII	Забележка 2
		— етилов естер на бутирова киселина и триглицериди на енантова киселина		— етилов естер на бутирова киселина — триглицериди на енантова киселина: приложение V	Забележка 2
		лецитин (E 322)	до 0,5 % m/m		Забележка 2
		NaC1	до 0,75 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
		Киселинност на мазнината	1,2 mmol/100g мазнина	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		ПЧ (макс.)	до 0,5 meq. кислород/1 000  g мазнина	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Забележка 1
		Вкус	Чист
		Мирис	Липса на странични миризми
		Други	Липса на неутрализиращи агенти, антиоксиданти и консерванти
Регламент (ЕО) № 1898/2005, глава IV	Неосолено масло	Мазнини	мин. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Вода	до 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		СВБМ	до 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
Регламент (ЕО) № 1898/2005, глава IV	Осолено масло	Мазнини	мин. 80 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Вода	до 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		СВБМ (с изключение на сол)	до 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Сол	до 2 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
Член 9 и раздел II от Регламент (ЕО) № 1255/1999	Сирене от овче и/или козе мляко	Краве мляко	< 1 % m/m	Приложение IX
Регламент (ЕИО) № 2921/90	Приложение I — Кисел казеин	Вода	до 12,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Мазнини	до 1,75 % m/m	ISO 5543:2004|IDF127:2004
		Свободна киселинност	до 0,30 ml от 0,1 N NaOH разтвор/g	ISO 5547:1978/IDF 91:1979
Регламент (ЕИО) № 2921/90	Приложение I — Сирищен казеин	Вода	до 12,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Мазнини	до 1,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Шлака	мин. 7,50 % m/m	ISO 5545:1978/IDF 90:1979
Регламент (ЕИО) № 2921/90	Приложение I — Казеинати	Вода	до 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Млечен протеин	мин. 88,00 % m/m	ISO 5549:1978/IDF 92:1979
		Мазнини и шлака	до 6,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Фиксирана шлака		ISO 5544:1978/IDF 89:1979
		Шлака		ISO 5545:1978/IDF 90:1979
Регламент (ЕИО) № 2921/90	Приложение II — Кисел казеин	Вода	до 10,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Мазнини	до 1,50 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Свободна киселинност	до 0,20 ml от 0,1 N NaOH разтвор/g	ISO 5547:1978/IDF 91:1979
		ОБЧ (макс.)	30 000 / g	ISO 4833:2003	Забележка 3
		Форми на коли бактерии	Отсъствие в 0,1 g	Приложение Х	Забележка 3
		Терм. (макс.)	5 000 / g	ISO 4833:2003	Забележки 3 и 4
Регламент (ЕИО) № 2921/90	Приложение II — Сирищен казеин	Вода	до 8,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Мазнини	до 1,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Шлака	мин. 7,50 % m/m	ISO 5545:1978/IDF 90:1979
		ОБЧ (макс.)	30 000 / g	ISO 4833:2003	Забележка 3
		Форми на коли бактерии	Отсъствие в 0,1 g	Приложение Х	Забележка 3
		Терм. (макс.)	5 000 / g	ISO 4833:2003	Забележки 3 и 4
Регламент (ЕИО) № 2921/90	Приложение II — Казеинати	Вода	до 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Млечен протеин	мин. 88,00 % m/m	ISO 5549:1978/IDF 92:1979
		Мазнини и шлака	до 6,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004 ISO 5544:1978/IDF 89:1979 или ISO 5545:1978/IDF 90:1979
		ОБЧ (макс.)	30 000 / g	ISO 4833:2003	Забележка 3
		Форми на коли бактерии	Отсъствие в 0,1 g	Приложение Х	Забележка 3
		Терм. (макс.)	5 000 / g	ISO 4833:2003	Забележки 3 и 4
Регламент (ЕИО) № 2921/90	Приложение III — Казеинати	Вода	до 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Млечен протеин	мин. 85,00 % m/m	ISO 5549:1978/IDF 92:1979
		Мазнини	до 1,50 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Лактоза	до 1,00 % m/m	ISO 5548:2004|IDF 106:2004
		Шлака	до 6,50 % m/m	ISO 5544:1978/IDF 89:1979 или ISO 5545:1978/IDF 90:1979
		ОБЧ (макс.)	30 000 / g	ISO 4833:2003	Забележка 3
		Форми на коли бактерии	Отсъствие в 0,1 g	Приложение Х	Забележка 3
		Терм. (макс.)	5 000 / g	ISO 4833:2003	Забележки 3 и 4
Регламент (ЕО) № 2799/1999	Комбинирани фуражи и обезмаслено мляко на прах (ОМП) (за използване в храна за животни)	Вода (кисела мътеница на прах)	до 5 % m/m	Приложение XIX
		Протеин	31,4 % m/m (мин.) от сухото вещество без мазнини	ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001
		Вода (ОМП)	до 5 % m/m	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Мазнини (ОМП)	до 11 % m/m	ISO 1736:2000/IDF 9C:1987
		Сирищна суроватка (ОМП)	Отсъствие	Приложение XIII	Забележка 6
		Скорбяла (ОМП)	Отсъствие	Приложение XVII
		Вода (смеси)	До 5 % m/m от сухото вещество без мазнини	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Мазнини (смеси)		Директива 84/4/ЕИО на Комисията (ОВ L 15, 18.1.1984 г., стр. 29)
		Сирищна суроватка (смеси)	Отсъствие	Приложение XIII
		ОМП съдържание (на крайния продукт)	мин. 50 % m/m	Приложение XVI
		Мазнини (в крайния продукт)	мин. 2,5 % m/m или 5 % m/m	Директива 84/4/ЕИО на Комисията (ОВ L 15, 18.1.1984 г., стр. 29)	Забележка 7
		Скорбяла (в крайния продукт)	мин. 2 % m/m	Приложение XVII	Забележка 8
		Мед (в крайния продукт)	25 ppm	Директива 78/633/ЕИО на Комисията (ОВ L 206, 26.7.1987 г., стр. 43)
Регламент (ЕО) № 214/2001	ОМП (спрей)	Мазнини	до 1,0 % m/m	ISO 1736:2000/IDF 9C:1987
		Протеин	31,4 % (2)m/m (мин.) от сухото вещество без мазнини	ISO 8968-1|2:2001|IDF 20-1|2:2001
		Вода	до 3,5 % m/m	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Киселинност	до 19,5 ml, 0,1 N NaOH, 10g сухо вещество без мазнини	ISO 6091:1980/IDF 86:1981
		Лактати	до 150 mg/100g сухо вещество без мазнини	ISO 8069:2005|IDF 69:2005
		Фосфати	Отрицателно	ISO 11816-1:2006|IDF 155-1:2006
		Индекс на неразтворимост	до 0,5 ml при 24 °C	ISO 8156:2005|IDF 129:2005
		Обгорели частички	Филтър A или Б (15,0 mg)	ADPI (1990)
		ОБЧ	40 000 / g	ISO 4833:2003	Забележка 3
		Форми на коли бактерии	Отрицателно/0,1 g	Приложение Х	Забележка 3
		Мътеница	Отрицателно	Приложение XIV
		Сирищна суроватка	Отрицателно	Приложение ХII
		Кисела суроватка	Отрицателно		Забележка 2
		Антимикробни агенти		Приложение XV

ЧАСТ Б

Референтните методи, изброени в част Б, могат да бъдат използвани за анализ на продуктите, обхванати от всеки един от регламентите, изброени в колона 1.

Регламент на Комисията	Продукт	Код по КН	Параметър	Граница	Референтен метод	Бележка
Регламент (ЕИО) № 2658/87 Регламент (ЕО) № 2535/2001 Регламент (ЕО) № 1282/2006	Мляко и сметана, неконцентрирани, нито подсладени със захар или друг подсладител	0401	Мазнина (≤ 6 % m/m)	Границите са тези, определени в описанието на кода по КН за съответния продукт, дефинирани допълнително, когато е приложимо, в Регламент (ЕИО) № 3846/87 на Комисията (ОВ L 366, 24.12.1987 г., стр. 1), част 9 от експортната номенклатура или Регламент (ЕО) № 2535/2001 (ОВ L 341, 22.12.2001 г., стр. 29)	ISO 1211:2001/IDF 1D:1996
			Мазнина (> 6 % m/m)		ISO 2450:1999/IDF 16C:1987
	Мляко и сметана, концентрирани или с прибавка на захар или друг подсладител	0402	Мазнини (течна форма)		ISO 1737:1999/IDF 13C:1987
			Мазнини (твърда форма)		ISO 1736:2000/IDF 9C:1987
			Протеин		ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001
			Захароза (нормално съдържание)		ISO 2911:2004| IDF 35:2004
			Захароза (ниско съдържание)			Забележка 2
			Сухо вещество (ПКМ)		ISO 6734:1989/IDF 15B:1991
			Сухо вещество (СМС)		ISO 6731:1989/IDF 21B:1987
			Вода (мляко на прах)		ISO 5537:2004/IDF 26:2004
			Вода (сметана на прах)		Приложение ХVIII
	Мътеница, ферментирали или подкиселени млека и сметана, концентрирани или неконцентрирани, с прибавка на захар или друг подсладител	0403	Мазнини		ISO 1211:2001/IDF 1D:1996 ISO 1736:2000/IDF 9C:1987 ISO 2450:1999/IDF 16 C:1987 ISO 7208:1999/IDF 22B:1987 ISO 8262-3:2005/IDF 124-3:2005
			Протеин		ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001
			Захароза (нормално съдържание)		ISO 2911:2004|IDF 35:2004
			Захароза (ниско съдържание)			Забележка 2
			Вода (кисела мътеница на прах)		Приложение XIX
			Вода (сладка мътеница на прах)		ISO 5537:2004|IDF26:2004
			Сухо вещество (други продукти)		Методи, одобрени от компетентния орган
	Суроватка, дори концентрирана или с прибавка на захар или други подсладители; продукти от естествени съставки на млякото	0404	Мазнини		ISO 1736:2000/IDF 9C:1987 ISO 2450:1999/IDF 16C:1987 ISO 7208:1999/IDF 22B:1987
			Протеин		ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001
			Захароза (нормално съдържание)		ISO 2911:2004|IDF 35:2004
			Захароза (ниско съдържание)			Забележка 2
		0404 90	Протеин		ISO 8968 1|2 2001|IDF 20-1|2:2001
			Вода		IDF 21B:1987
			Сухо вещество		ISO 6734:1989/IDF 15B:1991
			(Концентрирани продукти)		ISO 6731:1989/IDF 21B:1987
	Масло и други млечни мазнини; млечни пасти за намазване	0405	Мазнина (ако ≤ 85 % m/m)		ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Масло	Вода		ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
			СВБМ		ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
			NaCl		ISO 15648:2004|IDF 179:2004
			Мазнина (ако > 99 % m/m)		IDF 24:1964
	Млечна мазнина (butteroil)		Вода (ако мазнината е < 99 % m/m)		ISO 5536:2002|IDF 23:2002
	Сирена и извара	0406	Мазнини		ISO 1735:2004|IDF 5:2004
			Сухо вещество		ISO 5534:2004|IDF 4:2004
			Сухо вещество (Рикота)		ISO 2920:2004|IDF 58:2004
			NaCl		ISO 5943:2006|IDF 88:2006
			Лактоза		ISO 5765-1|2:2002|IDF 79-1|2:2002
Регламент (ЕИО) № 2658/87	Комбинирани фуражи	2309	Лактоза		Приложение XI

Забележки към списъка на референтните методи на Европейския съюз:

Забележка 1: Изолиране на млечни мазнини, както е описано в ISO 1740:1991 (защита от светлина).

Забележка 2: Не е създаден референтен метод. Методи, одобрени от компетентния орган.

Забележка 3: Следва да бъде подготвена проба в съответствие с ISO 8261:2001|IDF 122:2001.

Забележка 4: Инкубация за 48 часа при температура от 55 °C; следва да се положат грижи за предотвратяване изсушаването на средата на пробата.

Забележка 5: % m/m СВБМ = % m/m сухо вещество — % m/m мазнина.

Забележка 6: Директива 84/4/ЕИО на Комисията.

Забележка 7: Регламент (ЕО) № 2799/1999 на Комисията (ОВ L 340, 31.12.1999 г., стр. 3-27).

Забележка 8: Директива 78/633/ЕИО на Комисията.

---

(1)  Без да се засягат разпоредбите на съответния специален регламент.

(2)  Минималното съдържание на протеин ще бъде 34 % към 1 септември 2009 г.

ПРИЛОЖЕНИЕ II

(член 3)

ОЦЕНКА НА СЪОТВЕТСТВИЕТО НА ДАДЕНА ПАРТИДА СЪС ЗАКОННО УСТАНОВЕНИТЕ ГРАНИЧНИ СТОЙНОСТИ

1.   ПРИНЦИП

В случаите, в които съответното законодателство предвижда подробни процедури за вземане на проби, се следват тези процедури. Във всички останали случаи се използва проба от най-малко три единични проби, взети на случаен принцип от партидата, подлежаща на контрол. Възможно е подготвянето на съставна проба. Полученият резултат се сравнява с установените гранични стойности чрез изчисляване на 95 % доверителен интервал като 2 х стандартно отклонение, където съответното стандартно отклонение зависи от това дали: 1. методът е валидиран посредством международно сътрудничество със стойности за σr и σR, или 2. в случай на вътрешно валидиране, е била изчислена вътрешната възпроизводимост. Този доверителен интервал в такъв случай ще се равнява на неопределеността на резултата при измерването.

2.   МЕТОДЪТ Е ВАЛИДИРАН ПОСРЕДСТВОМ МЕЖДУНАРОДНО СЪТРУДНИЧЕСТВО

В такъв случай стандартното отклонение при повторяемост σr и стандартното отклонение при възпроизводимост σR са установени и лабораторията може да покаже съответствие с работните характеристики на валидирания метод.

Изчисляване на аритметичната стойност

на n пъти повторените измервания.

Изчисляване на разширената неопределеност (k = 2) на

като

Ако крайният резултат x от измерването се изчислява с използването на формула от вида: x = y 1 + y 2, x = y 1 – y 2, x = y 1 · y 2, или x = y 1 / y 2, трябва да се спазват обичайните процедури за съчетаване на стандартни отклонения в подобни случаи.

Партидата се преценява като несъответстваща с горната законно установена гранична стойност UL, ако

в противен случай се преценява като съответстваща на UL.

Партидата се преценява като несъответстваща с долната законно установена гранична стойност LL, ако

в противен случай се преценява като съответстваща на LL.

3.   ВЪТРЕШНО ВАЛИДИРАНЕ С ИЗЧИСЛЯВАНЕ НА СТАНДАРТНОТО ОТКЛОНЕНИЕ НА ВЪТРЕШНА ВЪЗПРОИЗВОДИМОСТ

В случаите, когато се използват методи, непосочени в настоящия регламент, и не са били въведени измервания за точност, следва да се извърши вътрешно валидиране. Във формулите за изчисляване на разширената неопределеност U е необходимо да се използват стандартното отклонение на вътрешна повторяемост sir и стандартното отклонение на вътрешна възпроизводимост siR вместо съответно σr и σ R .

Правилата за вземане на решение са същите като по точка 1. Ако обаче партидата се прецени като несъответстваща със законно установената гранична стойност, измерванията следва да бъдат повторени с метода, посочен в настоящия регламент, и решението да бъде взето съгласно описаното в 1.

ПРИЛОЖЕНИЕ III

(член 4)

ОЦЕНКА НА ОЦЕНИТЕЛИТЕ И НАДЕЖДНОСТТА НА РЕЗУЛТАТИТЕ ОТ СЕНЗОРНИТЕ АНАЛИЗИ

Ако се използват методи със скала (IDF стандарт 99C:1997), се прилагат следните процедури:

А.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА „ИНДЕКСА НА ПОВТОРЯЕМОСТ“

В рамките на 12 месеца оценителят анализира най-малко десет проби като дублирания на празни проби. Обикновено това се извършва на няколко етапа. Резултатите за отделните характеристики на продукта се оценяват чрез използване на следната формула:

където:

wI	:	:индекс на повторяемост
xi1	:	резултат за първата оценка на проба xi
xi2	:	резултат за втората оценка на проба xi
n	:	брой проби

Пробите, които се оценяват, би следвало да покриват широк качествен обхват. wI не би следвало да превишава 1,5 (5-точкови скали).

Б.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА „ИНДЕКСА НА ОТКЛОНЕНИЕ“

Този индекс служи за проверка дали оценителят използва същата скала за оценка на качеството, както използваната от група оценители с опит. Получените от оценителя резултати се сравняват със средната стойност на резултатите, получени от групата оценители.

Следната формула се използва за оценка на резултатите:

където:

xi1; xi2	:	виж раздел А
;	:	среден резултат на групата оценители, съответно за първата и втората оценка на пробата xi
n	:	брой проби (най-малко десет за 12 месеца).

Пробите, които се оценяват, трябва да покриват широк качествен обхват. DI не трябва да превишава 1,5 (5-точкови скали).

Държавите-членки трябва да съобщават за всички трудности, срещнати при прилагането на тази процедура.

Ако бъде установено, че конкретните оценители надвишават границата от 1,5 за отклонение или повторяемост, експертите на официалния орган трябва да извършат една или повече случайни повторни проверки на работата по проби, оценени от тези оценители през последните няколко седмици, или да проведат една или повече съвместни проверки с тях. Необходим е задълбочен мониторинг, за да бъде решено дали ще се използват техните услуги. Констатациите се документират и запазват като доказателство за последващи действия.

В.   СРАВНЕНИЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ, ПОЛУЧЕНИ В РАЗЛИЧНИ РЕГИОНИ НА ДЪРЖАВА-ЧЛЕНКА И В РАЗЛИЧНИ ДЪРЖАВИ-ЧЛЕНКИ

Когато е приложимо, най-малко веднъж годишно трябва да бъде организиран тест за сравняване на резултатите, които са получени от оценители от различни региони. Ако се наблюдават значителни разлики, се предприемат необходимите стъпки за идентифициране на причините и получаване на сравними резултати.

Държавите-членки могат да организират тестове, за да сравняват резултатите, получени от техните оценители и от оценители от съседни държави-членки. Значителните разлики са предмет на задълбочено проучване с цел получаването на сравними резултати.

Държавите-членки уведомяват Комисията за резултатите от тези сравнения.

ПРИЛОЖЕНИЕ IV

(член 4)

СЕНЗОРНА ОЦЕНКА НА МАСЛО

1.   ОБХВАТ

Целта на настоящата процедура за сензорна оценка на масло е да осигури еднакъв метод, приложим във всички държави-членки.

За повече подробности да се направи справка с настоящия международен IDF стандарт за мляко и млечни продукти, IDF 99 — части 1, 2, 3 за сензорната оценка.

2.   ОПРЕДЕЛЕНИЯ

„Сензорна оценка“ означава проверка на белезите на продукт чрез сетивата.

„Панел“ означава група от избрани оценители, които работят по време на оценяването без вътрешни комуникации и без да се влияят един от друг.

„Оценител“ се дефинира като лице, избрано заради способността му да извършва сензорен тест. Този вид оценител може да има ограничен опит.

„Оценител експерт“ се дефинира като лице с висока степен на сензорна чувствителност и опит в сензорната методология, което може да извършва последователни и достоверни сензорни оценки на различни продукти. Този вид оценител има добра дългосрочна сензорна памет.

„Оценка на резултатите“ означава сензорна оценка от панел чрез използване на цифрова скала. Трябва да бъде използвана номенклатура на дефектите.

„Степенуване“ означава класификация на качеството, която се извършва на базата на оценката на резултатите.

„Контролни документи“: документи, използвани за отчитане на индивидуалните резултати за всеки белег и окончателното степенуване на продукта. (Този документ може да бъде използван и за отчитане на химически състав.)

3.   СТАЯ ЗА ТЕСТОВЕ

За повече подробности да се направи справка с ISO 8589 и ISO/DIS 22935—2 | IDF 99—2, част 7.

Трябва да бъдат взети предварителни мерки, за да не могат оценителите в стаята за тестове да се влияят от външни фактори.

В стаята за тестове не трябва да има чужди миризми, както и стаята да е лесна за почистване. Стените трябва да са светли и неотразяващи светлината.

Стаята за тестове и нейното осветление трябва да бъдат такива, че качествата на оценяваните продукти да не се засягат.

В стаята трябва да има подходящ термостатичен контрол, така че да се осигури поддържане на постоянна температура на маслото. По време на оценяването маслото следва да бъде с температура 12 °C (±2 °C).

4.   ИЗБОР НА ОЦЕНИТЕЛИ

Оценителят трябва да е запознат с продуктите от масло и да е компетентен да извършва сензорно оценяване. Неговата/нейната компетентност се контролира редовно (най-малко веднъж годишно) от компетентния орган.

4.1.   За подробности относно общи изисквания и скринингови тестове, които могат да се използват преди официалното използване на нов оценител, да се направи справка с ISO/DIS 22935—1| IDF 99—1 част 4 (набиране) и част 5.1.

От основна важност е осигуряването на непрекъснато обучение и редовното провеждане на общи сесии. За обучението на панелите да се направи справка с ISO 8586—1.

4.2.   Първоначалното обучение обхваща следното:

—	обща теория и практическа важност на сензорното оценяване,

—	методи, скали и описание на сензорните усещания,

—	откриване и разпознаване на сензорни характеристики и специфични сензорни термини,

—	обучение за познания в областта на производството на масло,

—	валидирани референции и проби, които да помогнат на оценителя да идентифицира специфични вкусове и интензивност на вкусове в продукта.

5.   ИЗИСКВАНИЯ ЗА ПАНЕЛА

Броят на оценителите в панела не трябва да е четен, като минималният брой е трима души. Множеството оценители трябва да бъдат служители на компетентния орган или упълномощени лица, които не работят в млечната промишленост.

За цялата процедура отговаря ръководител на панела, който също може да участва в работата му.

С оглед извършването на оптимална работа от лицата, преди оценката трябва да бъдат взети предвид определен брой фактори:

—	лицата не трябва да страдат от болест, която би могла да засегне работата им. В обратния случай съответният оценител се заменя в панела от друг,

—	лицата трябва да се явяват навреме, за да участват в оценката, и да имат достатъчно време за извършването на индивидуалната оценка,

—	лицата не трябва да използват субстанции със силен аромат като парфюм, лосион за след бръснене, дезодорант и т. н. и избягват храни със силен вкус (напр. силни подправки) и т.н.,

—	в рамките на половин час преди оценката на лицата не се разрешава да пушат, да се хранят или да пият, с изключение на вода.

6.   ПОСТИЖЕНИЯ

Всички оценители трябва да участват редовно в панели за сензорно оценяване, за да поддържат уменията си. Честотата ще зависи от обема и производството на масло и, когато е възможно, следва да бъде най-малко един панел месечно.

Старшите оценители също трябва да участват в определен брой панели всяка година и, когато е възможно, най-малко веднъж на тримесечие.

7.   ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ И ПОДГОТОВКА НА ПРОБИТЕ

От основна важност е идентичността на пробите да не бъде разкривана по време на оценката, за да се избягва всяка възможна грешка. Пробите са кодирани.

Това трябва се организира преди оценяването. Необходимо е да се определят изисквания за температурата на маслото по време на транспортирането му до стаята за тестове (6 °C ± 2 °C).

Когато сензорната оценка се извършва в хладилен склад, пробата се взема чрез използване на инструмент за вземане на проби от масло. Когато сензорната оценка се извършва на друго място, различно от хладилен склад, то тогава се взема най-малко 500 g проба. По време на оценяването маслото трябва да е с температура 12 °C (±2 °C) (за справка ISO/DIS 22935—2 | IDF 99—2, където температурата за оценяване на маслото е 14 °C ± 2 °C). На всяка цена се избягват големи отклонения от тази температура.

8.   ОЦЕНКА НА СТОЙНОСТТА НА ВСЕКИ БЕЛЕГ

8.1.   Сензорната оценка се извършва по отношение на следните три белега: външен вид, консистенция и вкус.

Външният вид включва следните характеристики: цвят, видима степен на хомогенност, липса на механични примеси, липса на растеж на плесени и водна дисперсия. Водната дисперсия се тества съгласно IDF-стандарт 112A/1989.

Консистенцията включва следните характеристики: плътност, текстура и твърдост. Способността за намазване може да се контролира чрез физически средства, ако дадена държава-членка пожелае да я провери, за да задоволи изискванията на потребителите. Комисията може да реши в бъдеще да хармонизира методологията.

Тялото е термин, препращащ към добрата плътност на продукта при консумация. Обикновено се свързва с твърдостта и способността за намазване и трябва да бъде еднородна в целия продукт. Тялото е тясно свързано с текстурата и представлява способността на продукта да стои под въздействието на собственото си тегло. То се определя от съпротивлението при рязане и може да бъде измерено механично чрез опитване в уста и опипване с пръсти.

Вкусът е характеристиката такава, каквато се усеща в устата, предимно от вкусовите папили на езика.

Мирисът е характеристика, възприемана от носа и обонянието.

При значително отклонение на препоръчваната температура не е възможна надеждна оценка на консистенцията и вкуса. Температурата е от изключително значение.

Оценяването на маслото трябва да се отложи, ако температурата излиза извън препоръчаните граници.

8.2.   Всеки белег се оценява сензорно поотделно. Оценяването на резултата трябва да бъде направено съгласно таблица 1.

8.3.   С оглед постигането на унифициране може да е небходимо, преди началото на оценката, оценителите да оценяват заедно външния вид, консистенцията и вкуса на една или две референтни проби.

8.4.   Оценките на резултатите са, както следва:

Да се направи справка с част 7 — Номенклатура и описание на критериите за оценяване.

	Максимална оценка	Изисквана оценка
Външен вид	5	4
Консистенция	5	4
Вкус/мирис	5	4

—	Когато необходимата оценка не е получена, следва да бъде дадено описание на дефекта.

—	Оценката, дадена от всеки оценител за всеки белег, трябва да бъде записана в контролния документ.

—	Продуктът се приема или отхвърля на базата на решение, прието с мнозинство.

—	Случаи, в които разликите между индивидуалните оценки за всеки белег са по-големи от 1 точка, не би следвало да възникват често (не повече от веднъж на 20 проби). В противен случай ръководителят на панела проверява компетентността на панела.

9.   НАДЗОР

За цялата процедура отговаря ръководителят на панела, който трябва да бъде официален служител на компетентния орган и може да бъде член на панела. Той трябва да записва индивидуалните оценки за всеки белег в контролния документ и да удостоверява дали продуктът е приет или отхвърлен.

10.   НОМЕНКЛАТУРА

Да се направи справка с приложената таблица 2.

11.   ЗА СПРАВКА

FIL-IDF 99C:1997 Сензорно оценяване на млечни продукти чрез скала на резултатите — Референтен метод

ISO/DIS 22935 | IDF 99 Международен стандарт за мляко и млечни продукти — Сензорен анализ — части 1—3

ISO 8586—1 Сензорен анализ — Общи насоки за подбор, обучение и мониторинг на оценителите — част 1

ISO 8589 Сензорен анализ — Общи насоки за стаите за тестове

FIL-IDF 112A:1989 Масло — Определяне на стойността на водната дисперсия

Таблица 1

Оценяване на резултатите на масло

Външен вид			Консистенция			Вкус + мирис
Точки	№ (1)	Забележки	Точки (клас на качество)	№ (1)	Забележки	Точки (клас на качество)	№ (1)	Забележки
5		Много добър идеален тип най-високо качество (еднакво сух)	5		Много добра идеален тип най-високо качество (добра способност за намазване)	5		Много добър идеален тип най-високо качество (абсолютно чист и фин мирис)
4		Добър  (2) без видими дефекти	4	17 18	Добра  (2) твърда мека	4		Добър  (2) без видими дефекти
3	1 2 3 4 5 6 7 8	Задоволителен (леки дефекти) воднисто, влага нееднакво, двуцветно неравномерно оцветено изпъстрено като мрамор на петна отделяне на течна мазнина прекалено оцветено слаба, пореста консистенция	3	14 15 16 17 18	Задоволителна (леки дефекти) сипкава, трошлива, на бучки тестява, мазна лепкава твърда мека	3	21 22 25 27 33 34 35	Задоволителен (леки дефекти) нечист чужд привкус кисел вкус на печено вкус на прегорено вкус на фураж стипчив, горчив пресолен
2	1 3 4 5 6 10 11 12	Незадоволителен (видими дефекти) воднисто, влага неравномерно оцветено изпъстрено като мрамор на петна отделяне на течна мазнина чужди съставки плесенясало неразтворена сол	2	14 15 16 17 18	Незадоволителна (видими дефекти) сипкава, трошлива, на бучки тестява, мазна лепкава твърда мека	2	21 22 23 25 32 33 34 35 36 38	Незадоволителна (видими дефекти) нечист чужд привкус вкиснал кисел привкус на окислено, метален привкус вкус на фураж стипчив, горчив пресолен тинест, застоял, гнил химически вкус
1	1 3 4 5 6 7 9 10 11 12	Лош (големи дефекти) воднисто, влага неравномерно оцветено изпъстрено като мрамор на петна отделяне на течна мазнина прекалено оцветено зърнесто чужди съставки плесенясало неразтворена сол	1	14 15 16 17 18	Лоша (големи дефекти) сипкава, трошлива, на бучки тестява, мазна лепкава твърда мека	1	22 24 25 26 28 29 30 31 32 34 35 36 37 38	Лош (големи дефекти) чужд привкус сиренен, привкус на кисело сирене кисел ферментирал вкус на мухъл гранясал мазен, с вкус на риба лоен привкус на окислено, метален привкус стипчив, горчив пресолен тинест, застоял, гнил малцов химически вкус

Таблица 2

Таблица на дефектите на масло

I. Външен вид

1. воднисто, влага

2. нееднакво, двуцветно

3. неравномерно оцветено

4. изпъстрено като мрамор

5. на петна

6. отделяне на течна мазнина

7. прекалено оцветено

8. слаба, пореста консистенция

9. зърнисто

10. чужди съставки

11. плесенясало

12. неразтворена сол

II. Консистенция

14. сипкава, трошлива, на бучки

15. тестява, мазна

16. лепкава

17. твърда

18. мека

III. Вкус и мирис

20. без вкус

21. нечист (3)

22. чужд привкус

23. вкиснал

24. сиренен, привкус на кисело сирене

25. кисел

26. ферментирал

27. а) вкус на печено

б) вкус на прегорено

28. вкус на мухъл

29. гранясал

30. мазен, с вкус на риба

31. лоен

32. а) привкус на окислено

б) метален вкус

33. вкус на фураж

34. стипчив, горчив

35. пресолен

36. тинест, застоял, гнил

37. малцов

38. химически вкус

---

(1)  Таблица 2.

(2)  Дефектите, включени в графа „добър“, са само много малки отклонения от идеалния тип.

(3)  Това наименование следва да се използва възможно най-рядко и само когато дефектът не може да бъде описан по-точно.

ПРИЛОЖЕНИЕ V

(член 5)

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА ТРИГЛИЦЕРИД НА ЕНАНТОВАТА КИСЕЛИНА В МАСЛО, МЛЕЧНА МАЗНИНА (BUTTEROIL) И СМЕТАНА ЧРЕЗ ГАЗОВ ХРОМАТОГРАФСКИ АНАЛИЗ НА ТРИГЛИЦЕРИДИ

1.   ОБХВАТ

Този метод постановява метод за определяне на съдържанието на триглицерид на енантовата киселина в масло, млечна мазнина (butteroil) и сметана.

2.   ТЕРМИНИ И ДЕФИНИЦИЯ

Съдържание на енантова киселина: съдържанието на триглицерид на енантовата киселина, определено чрез процедурата, изложена в този метод.

Забележка: Съдържанието на енантова киселина се изразява в килограми на тон продукт за млечна мазнина (butteroil) и масло и в килограми на тон млечна мазнина за сметана.

3.   ПРИНЦИП

Млечната мазнина се извлича от различните продукти съгласно ISO 14156 | IDF 172:2001. Количественото определяне на съдържанието на триглицерид на енантовата киселина в извлечената мазнина се извършва чрез капилярна газова хроматография (GC). Резултатът, получен за пробата, се оценява чрез съпоставяне с триглицерида на капроновата киселина като вътрешен стандарт.

Забележка: Бе установено, че трибутиринът също е задоволителен вътрешен стандарт.

4.   РЕАГЕНТИ

Използват се само реагенти с признато аналитично качество.

4.1.   n-хексан

4.2.   Стандартен триглицерид на капроновата киселина с чистота най-малко 99 %

4.3.   Стандартен триглицерид на енантовата киселина с чистота най-малко 99 %

4.4.   Натриев сулфат (анхидрид) (Na2SO4)

5.   АПАРАТУРА

Обичайна лабораторна апаратура, и по-специално следното:

5.1.   Аналитична везна с чувствителност 1 mg

5.2.   Мерителни колби с капацитет 10 ml и 20 ml

5.3.   Центрофужни епруветки с капацитет 30 ml

5.4.   Ротативен изпарител

5.5.   Пещ, в която може да бъде поддържана температура 50 °C ±5 °C

5.6.   Филтърна хартия, средно филтриране, диаметър около 15 cm

Оборудване за газова хроматография

5.7.1.   Газов хроматограф, оборудван с инжектор със/без разделяне на пробата или с колонен инжектор и пламъчно-йонизационен детектор (ПИД)

Колона за газов хроматограф с неподвижна фаза, която е била успешно използвана за отделяне на триглицерид (100 % диметилполисилоксан или 5 % фенил-95 % метилполисилоксан). Избира се неподвижната фаза, дължината на колоната (между 4 m и 15 m), вътрешния диаметър (между 0,22 mm и 0,50 mm) и дебелината на слоя (0,12 μm или повече), като се взема предвид лабораторният опит и използваната инжекционна система. Във всички случаи избраната колона трябва да осъществява както пълно разделяне между пика на разтворителя и триглицерида на капроновата киселина, така и разделяне до основната линия между пиковете на триглицерида на капроновата и на енантовата киселина. По-долу са изложени примери за приложими условия.

5.7.2.1.   Пример за приложими условия с използване на инжектор с разделяне на пробата:

—	газ носител: хелий

—	входно налягане в колоната: 100 KPa

—	колона: кварцова капилярна колона с дължина 12 m, вътрешен диаметър 0,5 mm, дебелина на слоя 0,1 μm

—	неподвижна фаза: 100 % диметилполисилоксан или 5 % фенил-95 % диметилполисилоксан (например HT5)

—	температура на колоната: първоначална температура 130 °C, поддържана в продължение на 1 минута, увеличавана с по 20 °C на минута до 260 °C, след това увеличавана с 30 °C на минута до 360 °C; поддържана в продължение на 10 минути на 360 °C

—	температура на детектора: 370 °C

—	температура на инжектора: 350 °C

—	съотношение на разделяне 1:30

—	впръскано количество от пробата: 1 μl.

5.7.2.2.   Пример за приложими условия с използване на колонен инжектор:

—	газ носител: водород (система на постоянен поток)

—	входно налягане в колоната: 89 kPa

—	колона: кварцова капилярна колона с дължина 4 m, вътрешен диаметър 0,32 mm, дебелина на слоя 0,25 μm

—	неподвижна фаза: 5 % фенил, 95 % диметилполисилоксан

—	температура на колоната: първоначална температура 60 °C, поддържана в продължение на 2 минути, увеличавана с 35 °C на минута до 340 °C, поддържана при тази температура в продължение на 5 минути

—	температура на детектора: 350 °C

—	впръскано количество от пробата: 1 μl.

5.8.   Спринцовка за впръскване с капацитет 5 μl.

6.   ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ

Важно е лабораторията да получи проба, която да е напълно представителна и да не е била повредена или подменена по време на транспортирането или съхранението.

Вземането на проби не е част от метода, уточнен в този международен стандарт. Препоръчителен метод за вземане на проби се дава в IDF: стандарт 50C:1995 или ISO 707—1997 — Мляко и млечни продукти — Методи за вземане на проби.

7.   ПРОЦЕДУРА

7.1.   Подготовка на тестовата проба и тестовата доза

Действа се съгласно ISO 14156 | IDF 172:2001

7.1.1.   Млечна мазнинa (butteroil), масло

7.1.1.1.   Разтапят се 50 g до 100g от тестовата проба в пещта (5.5)

7.1.1.2.   Поставят се 0,5 g до 1,0 g натриев сулфат анхидрид (5.4) в сгъната филтърна хартия

7.1.1.3.   Мазнината се филтрира през филтърната хартия, съдържаща натриев сулфат анхидрид, като филтратът се събира в бехерова чаша, държана в пещта (5.5). Когато се отцежда разтопеното масло върху филтърната хартия, да се внимава да не се изсипе и суроватка

7.1.2.   Сметана

7.1.2.1.   Тестовата проба се загрява до температура 20 °C±2 °C

7.1.2.2.   Пробата се разбърква внимателно

7.1.2.3.   Разрежда се подходящо количество от тестовата проба така, че да се получи 100 ml тестова доза с приблизително 4 % масов процент на мазнина.

7.1.2.4.   Работи се както със сурово или с хомогенизирано мляко (вж. ISO 14156|IDF 172:2001, §8.3) за извличане на мазнината от сметаната

7.1.2.5.   В мерителна колба от 10 ml (5.2) се претегля 1 g от извлечената мазнина с точност до 1 mg. Прибавя се 1 ml от разтвор 7.2.2. Долива се до 10 ml с n-хексан (4.1) и се хомогенизира

7.1.2.6.   1 ml от разтвора 7.1.1.2 се сипва в мерителна колба от 10 ml (5.2) и се разрежда до 10 ml с n-хексан (4.1)

7.2.   Приготвяне на стандартите за калибриране

7.2.1.   Разтварят се 100 mg триглицерид на енантовата киселина (4.3) в 10 ml n-хексан (4.1)

7.2.2.   Разтварят се 100 mg триглицерид на капроновата киселина (4.2) в 10 ml n-хексан (4.1).

7.2.3.   1 ml от разтвор 7.2.2 се сипва в 10 ml мерителна колба (5.2). Допълва се до 10 ml с n-хексан (4.1)

7.2.4.   1 ml от разтвор 7.2.1 и 1 ml от разтвор 7.2.2 се сипват в 10 ml мерителна колба (5.2). Допълва се до 10 ml с n-хексан (4.1)

7.2.5.   1 ml от разтвор 7.2.4 се сипва в мерителна колба от 10 ml (5.2) и се допълва до 10 ml с n-хексан (4.1)

7.3.   Хроматографско определяне

7.3.1.   Впръсква се 1 µl от стандартния разтвор 7.2.5 двукратно.

7.3.2.   Впръсква се по 1 μl от всеки пробен разтвор

Забележка: Ако е възприета системата с колонен инжектор, следва да се приложи по-голямо разреждане както към стандартния, така и към пробните разтвори.

7.3.3.   Операция 7.3.1 се повтаря на всеки 3 проби, така че пробите да се обхванат между двойни стандартни впръсквания. Резултатите се базират на средните коефициенти на чувствителност от стандартните хроматограми

8.   ИЗЧИСЛЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

За всяка хроматограма се интегрира площта на пика, свързана с триглицеридите на енантовата киселина и на капроновата киселина.

Тези инструкции се спазват за всяка обхваната серия, т.е. за набор от обградени проби, като стандартът, двукратно впръскан непосредствено преди тях, е STD1, а стандартът, двукратно впръскан непосредствено след тях, е STD2.

8.1.   Калибриране

8.1.1.   Изчисляване на коефициента на чувствителност за всяко дублиране на STD1, Rf1(a) и Rf1(б)

Rf1 (a) или (б) = (Площ на пика за триглицерид на капроновата киселина/Площ на пика за триглицерид на енантовата киселина) × 100

Изчисляване на средния коефициент на чувствителност, Rf1

Rf1 = (Rf1(a) + Rf1(б) / 2

8.1.2.   По същия начин се изчислява средният коефициент на чувствителност STD2, Rf2

8.1.3.   Изчислява се средният коефициент на чувствителност Rf

Rf = (Rf1 + Rf2) /2

8.2.   Тестови проби

За всяка хроматограма на проба, получена между STD1 и STD2, се изчислява съдържанието на енантова киселина C (kg/t):

С = (Площ на пика за триглицерид на енантовата киселина × Rf × 100) / (Площ на пика за триглицерид на капроновата киселина × Wt × 1 000)

където:

—	Wt = тегло на взетата мазнина (g),

—	100 = обем на разтваряне за пробата,

—	1 000 = преобразуващ коефициент (от μg/g в kg/t)

За проби от масло се взема под внимание съдържанието на мазнина в маслото и се изчислява коригирана стойност на концентрация, Cмасло (kg/t масло)

Cмасло = Cмазнина × F

където F е съдържанието на мазнина в маслото.

9.   ТОЧНОСТ

В точка 12 са дадени подробности за междулабораторен тест съгласно ISO 5725—1 и ISO 5725—2 относно метода за точност.

Стойностите за границата на повторяемост и възпроизводимост са изразени за равнище на вероятност от 95 % и могат да не са приложими към редове и матрици на концентрация, различни от дадените.

9.1.   Повторяемост

Абсолютните разлики между два индивидуални единични тестови резултата, получени с един и същ метод върху идентичен тестов материал в същата лаборатория от един и същ оператор, използващ едно и също оборудване в рамките на кратък период от време, надвишават 0,35 kg/t в не повече от 5 % от случаите.

9.2.   Възпроизводимост

Абсолютните разлики между два индивидуални единични тестови резултата, получени с един и същ метод върху идентичен тестов материал в различни лаборатории от различни оператори, използващи различно оборудване, надвишават 0,66 kg/t в не повече от 5 % от случаите.

10.   ГРАНИЦИ НА ТОЛЕРАНС: ДОЛНИ ГРАНИЦИ (СЛУЧАЙ С НЕДОСТАТЪЧНИ КОЛИЧЕСТВА)

10.1.    От маркирания продукт трябва да бъдат взети три проби за проверка на коректността на маркирането на продукта.

10.2.   Масло и концентрирано масло

10.2.1.   Количеството за смесване е 11 kg от най-малко 95 % триглицерид на чиста енантова киселина на тон масло, т.e. 10,45 kg/t.

10.2.2.   Резултатите от трите проби, получени от анализа на продукта, се използват за проверяване на размера и хомогенността на смесване на маркера, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните гранични стойности:

—	9,51 kg/t (95 % от минималния размер за смесване на триглицерид на 95 % чиста енантова киселина, еднократно определяне),

—	6,89 kg/t (70 % от минималния размер за смесване на триглицерид на 95 % чиста енантова киселина, еднократно определяне),

—	използва се концентрацията на маркера в пробата с най-ниския резултат заедно с интерполация съответно между 9,51 kg/t и 6,89 kg/t.

10.3.   Сметана

10.3.1.   Количеството за смесване е 10 kg от най-малко 95 % триглицерид на чиста енантова киселина на тон млечна мазнина (butteroil), т.e. 9,50 kg/t маркирана млечна мазнина.

10.3.2.   Резултатите от трите проби, получени от анализа на продукта, се използват за проверяване на степента на хомогенност на смесване на маркера, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните гранични стойности:

—	8,60 kg/t (95 % от минималния размер за смесване на триглицерид на 95 % чиста енантова киселина, еднократно определяне).

—	6,23 kg/t (70 % от минималния размер за смесване на триглицерид на 95 % чиста енантова киселина, еднократно определяне).

—	Използва се концентрацията на маркера в пробата с най-ниския резултат, заедно с интерполация съответно между 8,60 kg/t и 6,23 kg/t.

11.   ГРАНИЦИ НА ТОЛЕРАНС: ГОРНИ ГРАНИЦИ (СЛУЧАЙ С ПРЕВИШАВАНЕ НА КОЛИЧЕСТВОТО С ПОВЕЧЕ ОТ 20 %)

11.1.    От маркирания продукт трябва да бъдат взети три проби за проверка на коректността на маркирането на продукта

11.2.   Масло и концентрирано масло

11.2.1.   Резултатите от трите проби, получени от анализа на продукта, се използват за проверяване на размера и хомогенността на смесване на маркера, като средната стойност на тези резултати се сравнява със следните гранични стойности:

—	горната граница е 12,96 kg/t

11.3.   Сметана

11.3.1.   Резултатите от трите проби, получени от анализа на продукта, се използват за проверяване на размера и хомогенността на смесване на маркера, като средната стойност на тези резултати се сравнява със следните гранични стойности:

—	горната граница е 11,82 kg/t.

12.   ДОПЪЛНИТЕЛНА ИНФОРМАЦИЯ: СТАТИСТИЧЕСКИ АНАЛИЗ НА РЕЗУЛТАТИ ОТ ОПРЕДЕЛЯНЕТО НА ТРИХЕПТАНОАТ В МАЗНИНАТА В МАСЛОТО ЧРЕЗ АНАЛИЗ НА ТРИГЛИЦЕРИДИ

Бяха проведени четири съвместни опита за определяне на съдържанието на трихептаноат в маркирано масло.

В първия кръг на тестовете участваха девет лаборатории, като не бяха дадени спецификации за това какви аналитични методи да бъдат използвани.

Във втория кръг на тестовете участваха десет лаборатории и бяха приложени 4 различни метода:

—	Количествено определяне на метилхептаноат чрез използване на n-нонан или метилнонаноат като вътрешен стандарт

—	Количествено определяне на трихептаноат чрез използване на трикапроат като вътрешен стандарт

—	Количествено определяне на метилхептаноат чрез използване на проба/смес за калибриране

—	Количествено определяне на метилхептаноат чрез използване на смес за калибриране.

Освен това при анализа на FAME бяха използвани два различни метода за метилиране (De Francesco и Christopherson & Glass).

Въз основа на получените резултати бяха избрани два метода за извършване на третия кръг от тестове:

—	Количествено определяне на метилхептаноат чрез използване на n-нонан или метилнонаноат като вътрешен стандарт

—	Количествено определяне на трихептаноат чрез използване на трикапроат като вътрешен стандарт.

Резултатите на 7 лаборатории показаха, че методът FAME създава по-голяма вариативност, поради което бе решено да се използва само определянето на трихептаноат като триглицерид съгласно процедурата за количествено определяне на трихептаноат чрез използване на трикапроат като вътрешен стандарт. Освен това анализът на триглицеридите трябваше да се извършва с капилярна колона.

В четвъртия кръг на тестовете бяха изпратени четири проби (A, Б, В, Г), а девет лаборатории върнаха резултати (таблици 1—2).

Две лаборатории (DE и UE) анализираха пробите с използване на метода FAME.

Поради ограничения брой лаборатории статистическото изчисляване бе извършено както върху целия обем от данни (фигури 1—2), включително резултатите от FAME, така и върху данните, получени от анализа на триглицериди

Тестове за извънредни стойности:

—	проба А. Тестове по Dixon, Cochran и Grubbs на равнища 1 и 5 % показаха един лабораторен случай на извънредни стойности.

—	проба Б. Тест по Grubbs на равнище 5 % показа един лабораторен случай на извънредни стойности.

—	проба В. Тестове по Dixon и Grubbs на равнища 1 и 5 % показаха един лабораторен случай на извънредни стойности.

—	проба Г. Тестове по Dixon и Grubbs на равнища 1 и 5 % показаха един лабораторен случай на извънредни стойности.

Случаят с извънредни стойности бе изключен от изчислението.

Съществено е да се отбележи, че резултатите, получени чрез метода FAME, никога не са били разглеждани като извънредни стойности от приложените тестове.

Параметри за точност

В таблици 1 и 2 са изложени резултатите от всички лаборатории и параметрите за точност, изчислени за приемлив брой (8) лаборатории, но които за съжаление не произтичат от един и същ аналитичен метод.

В таблици 3 и 4 са изложени резултатите, произтичащи само от триглициридния метод и съответните параметри за точност. Приемането на тези параметри е обусловено от приемането на малкия брой лаборатории (6).

На фигури 2 и 3 са показани тенденциите за Sr и SR, изчислени въз основа на 4-те проби от двата комплекта данни, описани по-горе.

В таблица 5 са изложени стойностите на Sr и SR, както и съответните групирани стойности и общи параметри r и R.

Накрая критичната разлика бе изчислена на равнище на вероятност 95 %.

Таблица 1

Статистически резултати от триглициридния метод и метода FAME*

Проба A		R1	R2	Средно	Брой избрани лаборатории след елиминиране на извънредните стойности	8
RENNES	FR1	11,0	11,1	11,1	Брой извънредни стойности	1
RIKILT	NL	11,2	11,2	11,2	Извънредни стойности	DК
ZPLA	DE*	11,6	11,8	11,7	Средна стойност	11,3
ADAS	GB	11,4	11,2	11,3	Реална стойност	11,0
CNEVA	FR2	11,4	11,4	11,4	Стандартно отклонение на възпроизводимост (Sr)	0,09
LODI	IT	11,1	11,3	11,2	Стандартно относително отклонение на повторяемост (RSDr%)	0,80
EELA	FI	11,3	11,2	11,3	Повторяемост r (95 %)	0,26
ISPRA	UE*	11,0	11,0	11,0	Относителна повторяемост r %	2,24
D.V.F.A.	DK	13,3	11,8	12,6	Стандартно отклонение на възпроизводимост (SR)	0,23
					Стандартно относително отклонение на възпроизводимост (RSDR%)	2,04
					Възпроизводимост R (95 %)	0,84
					Относителна възпроизводимост R %	5,71
Проба Б		R1	R2	Средно	Брой избрани лаборатории след елиминиране на извънредните стойности	8
RENNES	FR1	12,7	12,8	12,8	Брой извънредни стойности	1
RIKILT	NL	13,5	13,3	13,4	Извънредни стойности	DK
ZPLA	DE*	14,0	13,8	13,9	Средна стойност	13,4
ADAS	GB	13,4	13,5	13,5	Реална стойност	13,5
CNEVA	FR2	13,3	13,4	13,4	Стандартно отклонение на възпроизводимост (Sr)	0,14
LODI	IT	13,9	13,5	13,7	Стандартно относително отклонение на повторяемост (RSDr%)	1,04
EELA	FI	13,4	13,2	13,3	Повторяемост r (95 %)	0,40
ISPRA	UE*	13,2	13,3	13,3	Относителна повторяемост r %	2,91
D.V.F.A.	DK	14,1	14,8	14,5	Стандартно отклонение на възпроизводимост (SR)	0,35
					Стандартно относително отклонение на възпроизводимост (RSDR%)	2,61
					Възпроизводимост R (95 %)	0,99
					Относителна възпроизводимост R %	7,31

Таблица 2

Статистически резултати от триглициридния метод и метода FAME*

Проба В		R1	R2	Средно	Брой избрани лаборатории след елиминиране на извънредните стойности	8
RENNES	FR1	8,9	9,2	9,1	Брой извънредни стойности	1
RIKILT	NL	9,2	9,3	9,3	Извънредни стойности	DK
ZPLA	DE*	9,2	9,4	9,3	Средна стойност	9,3
ADAS	GB	9,5	9,3	9,4	Реална стойност	9,3
CNEVA	FR2	9,4	9,4	9,4	Стандартно отклонение на възпроизводимост (Sr)	0,14
LODI	IT	9,2	9,5	9,4	Стандартно относително отклонение на повторяемост (RSDr%)	1,50
EELA	FI	9,4	9,6	9,5	Повторяемост r (95 %)	0,40
ISPRA	UE*	9,4	9,3	9,4	Относителна повторяемост r %	4,20
D.V.F.A.	DK	10,7	10,9	10,8	Стандартно отклонение на възпроизводимост (SR)	0,17
					Стандартно относително отклонение на възпроизводимост (RSDR%)	1,82
					Възпроизводимост R (95 %)	0,47
					Относителна възпроизводимост R %	5,10
Проба Г		R1	R2	Средно	Брой избрани лаборатории след елиминиране на извънредните стойности	8
RENNES	R1	1,6	1,6	1,6	Брой извънредни стойности	1
RIKILT	NL	2,1	2,1	2,1	Извънредни стойности	DK
ZPLA	DE*	2,3	2,3	2,3	Средна стойност	2,1
ADAS	GB	2,1	2,2	2,2	Реална стойност	2,1
CNEVA	FR2	2,1	2,1	2,1	Стандартно отклонение на възпроизводимост (Sr)	0,08
LODI	IT	2,2	1,9	2,1	Стандартно относително отклонение на повторяемост (RSDr %)	3,81
EELA	FI	2,3	2,3	2,3	Повторяемост r (95 %)	0,22
ISPRA	UE*	2,3	2,3	2,3	Относителна повторяемост r %	10,67
D.V.F.A.	DK	3,4	2,9	3,2	Стандартно отклонение на възпроизводимост (SR)	0,24
					Стандартно относително отклонение на възпроизводимост (RSDR %)	11,43
					Възпроизводимост R (95 %)	0,67
					Относителна възпроизводимост R %	32,00

Таблица 3

Статистически резултати от триглициридния метод и метода FAME*

Проба A		R1	R2	Средно	Брой избрани лаборатории след елиминиране на извънредните стойности	6
RENNES	FR1	11,0	11,1	11,1	Брой извънредни стойности	1
RIKILT	NL	11,2	11,2	11,2	Извънредни стойности	DК
ADAS	GB	11,4	11,2	11,3	Средна стойност	11,2
CNEVA	FR2	11,4	11,4	11,4	Реална стойност	11,0
LODI	IT	11,1	11,3	11,2	Стандартно отклонение на възпроизводимост (Sr)	0,09
ЕЕLA	FI	11,3	11,2	11,3	Стандартно относително отклонение на повторяемост (RSDr%)	0,80
D.V.F.A.	DK	13,3	11,8	12,6	Повторяемост r (95 %)	0,25
					Относителна повторяемост r %	2,24
					Стандартно отклонение на възпроизводимост (SR)	0,13
					Стандартно относително отклонение на възпроизводимост (RSDR%)	1,16
					Възпроизводимост R (95 %)	0,36
					Относителна възпроизводимост R %	3,25
Проба Б		R1	R2	Средно	Брой избрани лаборатории след елиминиране на нетипичните случаи	6
RENNES	FR1	12,7	12,8	12,8	Брой извънредни стойности	1
RIKILT	NL	13,5	13,3	13,4	Извънредни стойности	DК
ADAS	GB	13,4	13,5	13,5	Средна стойност	13,3
CNEVA	FR2	13,3	13,4	13,4	Реална стойност	13,5
LODI	IT	13,9	13,5	13,7	Стандартно отклонение на възпроизводимост (Sr)	0,15
EELA	FI	13,4	13,2	13,3	Стандартно относително отклонение на повторяемост (RSDr%)	1,13
D.V.F.A.	DK	14,1	14,8	14,5	Повторяемост r (95 %)	0,42
					Относителна повторяемост r %	3,16
					Стандартно отклонение на възпроизводимост (SR)	0,33
					Стандартно относително отклонение на възпроизводимост (RSDR%)	2,48
					Възпроизводимост R (95 %)	0,93
					Относителна възпроизводимост R %	6,94

Таблица 4

Статистически резултати от триглициридния метод

Проба В		R1	R2	Средно	Брой избрани лаборатории след елиминиране на извънредните стойности	6
RENNES	FR1	8,9	9,2	9,1	Брой извънредни стойности	1
RIKILT	NL	9,2	9,3	9,3	Извънредни стойности	DК
ADAS	GB	9,5	9,3	9,4	Средна стойност	9,3
CNEVA	FR2	9,4	9,4	9,4	Реална стойност	9,3
LODI	IT	9,2	9,5	9,4	Стандартно отклонение на възпроизводимост (Sr)	0,15
ЕЕLA	FI	9,4	9,6	9,5	Стандартно относително отклонение на повторяемост (RSDr%)	1,61
D.V.F.A.	DK	10,7	10,9	10,8	Повторяемост r (95 %)	0,42
					Относителна повторяемост r %	4,51
					Стандартно отклонение на възпроизводимост (SR)	0,19
					Стандартно относително отклонение на възпроизводимост (RSDR%)	2,04
					Възпроизводимост R (95 %)	0,53
					Относителна възпроизводимост R %	5,71
Проба Г		R1	R2	Средно	Брой избрани лаборатории след елиминиране на извънредните стойности	6
RENNES	FR1	1,6	1,6	1,6	Брой извънредни стойности	1
RIKILT	NL	2,1	2,1	2,1	Извънредни стойности	DK
					Средна стойност	2,1
ADAS	GB	2,1	2,2	2,2	Реална стойност	2,1
CNEVA	FR2	2,1	2,1	2,1	Стандартно отклонение на възпроизводимост (Sr)	0,09
LODI	IT	2,2	1,9	2,1	Стандартно относително отклонение на повторяемост (RSDr%)	4,29
EELA	FI	2,3	2,3	2,3	Повторяемост r (95 %)	0,26
D.V.F.A.	DK	3,4	2,9	3,2	Относителна повторяемост r %	12,01
					Стандартно отклонение на възпроизводимост (SR)	0,25
					Стандартно относително отклонение на възпроизводимост (RSDR%)	11,90
					Възпроизводимост R (95 %)	0,69
					Относителна възпроизводимост R %	33,32

Таблица 5

Повторяемост и възпроизводимост (с FAME*)

	Брой	Извънредни	Повторяемост Sr (95 %)	Възпроизводимост SR (95 %)
Проба А	8	1	0,09	0,23
Проба Б	8	1	0,14	0,35
Проба В	8	1	0,14	0,17
Проба Г	8	1	0,08	0,24
Групирана стойност			0,116	0,256
			r	R
Групирана стойност* 2,8			0,324	0,716
CrD95 = 0,40 Минимална чистота, установена за трихептаноат = 95 % Минимална граница, установена за трихептаноат в мазнината на масло = 11 kg/t Като се вземе предвид критичната разлика за равнище на вероятност 95 %, стойността на двата резултата следва да бъде не по-малка от:   в случай на прибавяне на 95 % чист трихептаноат 10,05 kg/t.

Повторяемост и възпроизводимост (без FAME)

	Брой лаборатории	Извънредни	Повторяемост Sr (95 %)	Възпроизводимост SR (95 %)
Проба А	6	1	0,09	0,13
Проба Б	6	1	0,15	0,33
Проба В	6	1	0,15	0,19
Проба Г	6	1	0,09	0,25
Групирана стойност			0,124	0,237
			r	R
Групирана стойност* 2,8			0,347	0,663
CrD95 = 0,36 Минимална чистота, установена за трихептаноат = 95 % Минимална граница, установена за трихептаноат в мазнината на масло = 11 kg/t Като се вземе предвид критичната разлика за равнище на вероятност 95 %, стойността на двата резултата следва да бъде не по-малка от:   в случай на прибавяне на 95 % чист трихептаноат 10,09 kg/t.

Фигура 1 (*1)

Опитни резултати: проба А

14,0

13,5

Нетипичен случай

13,0

12,5

kg/t

R1

12,0

Нетипичен случай

R2

mean

true

11,5

11,0

10,5

10,0

FR1

NL

DE (*)

GB

FR2

IT

FI

UE (*)

DK

labs

Опитни резултати: проба Б

16,0

15,5

Нетипичен случай

15,0

14,5

Нетипичен случай

kg/t

R1

14,0

R2

mean

13,5

true

13,0

12,5

12,0

FR1

NL

DE (*)

GB

FR2

IT

FI

UE (*)

DK

labs

Опитни резултати: проба В

12,0

11,5

Нетипичен случай

11,0

Нетипичен случай

10,5

kg/t

R1

R2

10,0

mean

true

9,5

9,0

8,5

8,0

FR1

NL

DE (*)

GB

FR2

IT

FI

UE (*)

DK

labs

Опитни резултати: проба Г

4,0

3,5

Нетипичен случай

3,0

Нетипичен случай

2,5

kg/t

R1

2,0

R2

mean

1,5

true

1,0

0,5

0,0

FR1

NL

DE (*)

GB

FR2

IT

FI

UE (*)

DK

labs

Фигура 2

Repeatability and Reproducibility standard deviation at different levels (TG+FAME)

0,4

0,3

S(r,R)

0,2

Sr

SR

0,1

0

0

2

4

6

8

10

12

14

Mean values (kg/t)

Фигура 3

Repeatability and Reproducibility standard deviation at different levels (TG)

0,35

0,3

0,25

S(r,R)

0,2

Sr

0,15

SR

0,1

0,05

0

0

2

4

6

8

10

12

14

Mean values (kg/t)

Фигура 4

Пример с използване на колонен инжектор

mV

Триглицериди на капронова киселина

Триглицериди на енантова киселина

2

3

4

5

6

7

8

9

10

(мин)

Час

---

(*1)  Метод FAME.

ПРИЛОЖЕНИЕ VI

(член 5)

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА ВАНИЛИН В КОНЦЕНТРИРАНО МАСЛО, МАСЛО ИЛИ СМЕТАНА ЧРЕЗ ВИСОКОЕФЕКТИВНА TЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЯ

1.   ОБХВАТ И ПРИЛОЖНО ПОЛЕ

Методът описва процедура за количествено определяне на ванилин в концентрирано масло, масло или сметана.

2.   ПРИНЦИП

Извличане на известно количество проба със смес от изопропанол/етанол/ацетонитрил (1:1:2). Утаяване на по-голямата част от мазнините чрез охлаждане между –15 °C и –20 °C, последвано от центрофугиране.

След разреждане с вода, определяне на съдържанието на ванилин чрез високоефективна течна хроматография (HPLC).

3.   АПАРАТУРА

Обичайна лабораторна апаратура, и по-специално следното:

3.1.   Хладилник с температура на охлаждане от –15 °C до –20 °C

3.2.   Еднократни спринцовки с обем от 2 ml

3.3.   Мембранни микрофилтри с размер на порите 0,45 µm, резистентни на разтвор, съдържащ 5 % екстрактен разтвор (4.4)

3.4.   Система за течна хроматография, състояща се от помпа (поток от 1,0 ml/min), инжектор (20 µl впръскване, автоматично или ръчно), UV-детектор (функциониращ при 306 nm, 0,01 ÅU цялата скала), пишещо устройство или интегратор, и колонен термостат, функциониращ при 25 °C

3.5.   Аналитична колона (250 mm × 4,6 mm ID), запълнена с LiChrospher RP 18 (Merck, 5 µm) или еквивалентен материал

3.6.   Предпазна колона (около 20 mm × 3 mm ID), запълнена с LiChrospher RP 18 (от 5 до 10 µm) или еквивалентен материал

3.7.   Центрофуга, работеща с 2 000 оборота в минута.

4.   РЕАГЕНТИ

Всички използвани реагенти трябва да са с признато аналитично качество.

4.1.   Изопропанол

4.2.   Етанол 96 % (v/v)

4.3.   Ацетонитрил

4.4.   Екстрактен разтвор

Смесват се изопропанол (4.1), етанол (4.2) и ацетонитрил (4.3) в съотношение 1:1:2 (v/v).

Ванилин (4 хидрокси-3-метоксибензалдехид) ≥ 98 %

4.5.1.   Основен разтвор на ванилин (= 500 µg/ml)

Около 50 mg (СМ mg) ванилин (4.5) се претегля с точност до 0,1 mg в 100 ml мерителна колба, добавят се 25 ml екстрактен разтвор (4.4) и се долива вода.

4.5.2.   Стандартен разтвор на ванилин (= 10 µg/ml)

5 ml от основния разтвор на ванилин (4.5.1) се капват в мерителна колба от 250 ml и се долива вода.

4.5.3.    Метанол с качество за HPLC

4.5.4.    Оцетна киселина на кристали

4.5.5.    Вода с качество за HPLC

4.5.6.   HPLC-мобилна фаза

300 ml метанол (4.5.3) се смесват с около 500 ml вода (4.5.5) и 20 ml оцетна киселина (4.5.4) в мерителна колба от 1 000 ml и се долива вода (4.5.5). Филтрира се през 0,45 µm филтър (3.3).

5.   ПРОЦЕДУРА

5.1.   Подготовка на тестовата проба

5.1.1.   Масло

Пробата се загрява, докато започне топенето. Избягва се прегряване над около 30 °C. Във всички случаи маслото не бива да се разделя на две фракции. Когато пробата стане достатъчно пластична, се хомогенизира чрез разклащане. Маслото се разбърква за 15 секунди преди вземането на пробата. Около 5g (SМ g) масло се претеглят с точност до 1 mg в 100 ml мерителна колба.

5.1.2.   Концентрирано масло

Непосредствено преди вземането на пробата съдът с концентрираното масло се поставя в пещ при 40 до 50 °C, докато маслото се разтопи напълно. Пробата се смесва чрез разклащане или бъркане, като се избягва образуването на мехурчета въздух от прекалено силно бъркане. Около 4g (SМ g) концентрирано масло се претегля с точност до 1 mg в 100 ml мерителна колба.

5.1.3.   Сметана

Пробата се загрява във водна баня или инкубатор при температура от 35 до 40 °C. Мазнината се разпределя хомогенно чрез разклащане и, ако е необходимо — чрез бъркане. Пробата се охлажда бързо до 20 ± 2 °C. Тя трябва да изглежда хомогенна, в противен случай процедурата следва да бъде повторена. Около 10g (SМ g) сметана се претегля с точност до 1 mg в 100 ml мерителна колба.

5.2.   Подготовка на тестовия разтвор

Прибавят се около 75 ml екстрактен разтвор (4.4) към тестовата доза (5.1.1, 5.1.2 или 5.1.3), разбърква се или се разклаща силно за около 15 минути и се допълва с екстрактен разтвор (4.4). Около 10 ml от този екстракт се поставят в реагентна стъклена чаша със запушалка. Реагентната стъклена чаша се поставя в хладилник (3.1) и се оставя да престои около 30 минути. Студеният екстракт се центрофугира за около 5 минути при приблизително 2 000 об./мин. и веднага се прелива. Прелетият разтвор се оставя да се охлади до стайна температура. 5 ml от прелетия разтвор се капват в 100 ml мерителна колба и се долива вода. Една аликвотна част се филтрира през мембранен филтър (3.3) с помощта на спринцовка (3.2). Филтратът е готов за определяне чрез HPLC.

5.3.   Калибриране

5 ml стандартен разтвор ванилин (4.5.2) се капват в 100 ml мерителна колба. Добавят се 5 ml екстрактен разтвор (4.4) и се долива до маркировката с вода. Този разтвор съдържа 0,5 µg/ml ванилин.

5.4.   Определяне чрез HPLC

Хроматографската система се оставя да се стабилизира за около 30 минути. Впръсква се стандартният разтвор (5.3). Това се повтаря, докато разликата в площта на пика или височината на пика между две последователни впръсквания стане по-малка от 2 %. При описаните условия времето на задържане на ванилина е около 9 минути. Стандартният разтвор (5.3) се анализира двукратно чрез впръскване на 20 µl. Впръскват се 20 µl от тестовите разтвори (5.2). Определят се получените площ на пика или височина на пика за ванилина. Двукратното впръскване на стандартния разтвор (5.3) се повтаря след 10 впръсквания на тестови проби (5.2).

6.   ИЗЧИСЛЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Изчислява се средната площ (или височина) на пика (AC) на ванилина, свързана с обграждащите двукратни впръсквания за всяка партида от тестовите разтвори (общо четири площи или височини).

Изчислява се коефициентът на чувствителност (R):

където СМ е масата на ванилина в mg (4.5.1).

Съдържанието (mg/kg) на ванилин (C) в тестовата проба е дадено от:

където:

AS	=	площ или височина на пика на ванилина в тестовата проба
SM	=	маса на тестовата проба в g (5.1.1, 5.1.2 или 5.1.3).

Забележка: Когато се анализира сметана за съдържание на ванилин, концентрацията на маркера трябва да бъде изразена като mg маркер/kg млечни мазнини. Това се извършва чрез умножаване на C по 100/f, където f е съдържанието на мазнини в сметаната, изразено в проценти (m/m).

20	=	коефициент, който взема предвид разрежданията в стандартната и в тестовата проба
0,96	=	корекционен коефициент за съдържанието на мазнини в първото разреждане на тестовата проба

Забележка: Вместо площта на пика могат да бъдат използвани височините на пика (виж 8.3).

7.   ТОЧНОСТ НА ПРОЦЕДУРАТА

7.1.   Повторяемост (r)

Разликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 16 mg/kg.

7.2.   Възпроизводимост (R)

Разликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и при използване на различна апаратура върху идентичен тестов материал, не може да надвишава 27 mg/kg.

8.   ГРАНИЦИ НА ТОЛЕРАНС

8.1.   От маркирания продукт трябва да бъдат взети три проби за проверка на хомогенността.

Маркерите се получават или от ванилин, или от синтетичен ванилин.

8.2.1.   Размерът за смесване за 4-хидрокси-3-метоксибензалдехид е 250g за тон концентрирано масло или масло. Когато се маркира сметана, размерът за смесване е 250g за тон млечни мазнини.

8.2.2.   Резултатите от трите проби, получени от анализа на продукта, се използват за проверяване на размера и хомогенността на смесване на маркера, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните гранични стойности:

—	220,8 mg/kg (95 % от минималния размер за смесване),

—	158,3 mg/kg (70 % от минималния размер за смесване).

Използва се концентрацията на маркера в пробата с най-ниския резултат заедно с интерполация между 220,8 mg/kg и 158,3 mg/kg.

Маркер, получен изключително от ванилови зърна или интегрални екстракти от тях:

8.3.1.   Размерът за смесване за 4-хидрокси-3-метоксибензалдехид е 100g за тон концентрирано масло или масло. Когато се маркира сметана, размерът за смесване е 100g за тон млечни мазнини.

8.3.2.   Резултатите от трите проби, получени от анализа на продукта, се използват за проверяване на размера и хомогенността на смесване на маркера, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните гранични стойности:

—	78,3 mg/kg (95 % от минималния размер за смесване),

—	53,3 mg/kg (70 % от минималния размер за смесване).

Използва се концентрацията на маркера в пробата с най-ниския резултат, заедно с интерполация между 78,3 mg/kg и 53,3 mg/kg.

9.   ЗАБЕЛЕЖКИ

9.1.   Откриването на добавен ванилин в количество от 250 mg/kg масло варира от 97,0 до 103,8. Откритото средно съдържание бе 99,9 % със стандартно отклонение от 2,7 %.

9.2.   Стандартният разтвор съдържа 5 % екстрактен разтвор, за да се компенсира разширяването на пика, причинено от присъствието на 5 % екстрактен разтвор на тестовите проби. Това позволява количествено определяне чрез височината на пика.

9.3.   Анализът се базира на нормална линия на калибриране с нулева отсечка.

9.4.   Чрез използване на подходящи разреждания на стандартния разтвор (4.5.2) линейността би следвало да бъде проверена първия път, когато се извършва анализът, а след това — на редовни интервали от време и при промени или ремонтиране на оборудването за HPLC. Ванилинът може да бъде разложен до ванилинова киселина, диванилин и други съставки от вътрешните ензими в непастьоризирана сметана или продукти от такава сметана.

ПРИЛОЖЕНИЕ VII

(член 5)

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЕТИЛОВ ЕСТЕР НА БЕТА-AПО-8'-КАРОТИНОВА КИСЕЛИНА В КОНЦЕНТРИРАНО МАСЛО И МАСЛО ЧРЕЗ СПЕКТРОМЕТРИЯ

1.   ОБХВАТ И ПРИЛОЖНО ПОЛЕ

Методът описва процедура за количествено определяне на етилов естер на бета-апо-8'-каротинова киселина (апокаротинов естер) в концентрирано масло и масло. Апо-каротинният естер е сборът от всички субстанции, намиращи се в екстракт от проби, получени при описаните в метода условия, които абсорбират светлината при 440 nm.

2.   ПРИНЦИП

Мазнините на маслото се разтварят в петролен естер и абсорбцията се измерва при 440 nm. Съдържанието на апо-каротинен естер се определя чрез външен стандарт.

3.   АПАРАТУРА

3.1.   Капкомери — градуирани, с капацитет 0,25, 0,50, 0,75 и 1,0 ml

3.2.   Спектрофотометър — подходящ за използване при 440 nm (и 447-449 nm) и оборудван с кювети с оптична дължина на траекторията 1 сm.

3.3.   Мерителни колби, 20 ml и 100 ml

3.4.   Аналитична везна с чувствителност от 0,1 mg, претегляща с точност 1 mg, с деления на 0,1 mg

3.5.   Пещ, 45 °C ± 1 °C

3.6.   Бързофилтриращи безпепелни филтри.

4.   РЕАГЕНТИ

Всички реагенти трябва да са с признато аналитично качество.

Суспензия на апо-каротинен естер (приблизително 20 %)

4.1.1.   Съдържанието на суспензията се установява, както следва:

Суспензията се загрява между 45 °C и 50 °C и се хомогенизира в неотворената оригинална опаковка. Претеглят се около 400 mg в мерителна колба (100 ml), разтварят се в 20 ml хлороформ (4.4) и обемът се допълва с циклохексан (4.5). 5 ml от този разтвор се разреждат в 100 ml циклохексан (разтвор A). 5 ml от разтвор A се разтварят до 100 ml в циклохексан. Абсорбцията се измерва при 447—449 nm (измерва се максимумът спрямо циклохексана като празна проба с използване на кювети с 1 cm оптична дължина на траекторията).

Съдържанието на апокаротинов естер P (%) = (Abs max × 40 000) / (Msusp × 2 550) или развито: (Absmax / 2 550) × (100/5) × (100/5) × (100 / Msusp)

Absmax	=	максимална абсорбция на измервания разтвор
Msusp	=	маса на суспензията (g)
2 550	=	референтна Abs (1 %, 1 cm) стойност
P	=	чистота (съдържание) на суспензията (%)

Забележка: Суспензията на апо-каротинен естер е чувствителна към въздух, топлина и светлина. В затворен, оригинален съд (запечатан в азотна среда) и на хладно място тя може да бъде съхранявана около 12 месеца. След отварянето съдържанието трябва да се използва за кратък период от време.

4.1.2.   Стандартен разтвор на апо-каротинен естер, прибл. 0,2 mg/ml

Около 0,100g суспензия на апо-каротинен естер (4.1.1) (W) се измерва с точност до 1 mg и се разтваря в петролен етер (4.2); количеството се прехвърля в мерителна колба с вместимост 100 ml и се долива до маркировката с петролен етер.

Този разтвор съдържа (W × P) / 10 mg/ml апо-каротинен естер.

Забележка: Разтворът трябва да се съхранява на хладно и тъмно. Неизползваният разтвор се изхвърля след един месец.

4.2.   Петролен етер (40-60 °C)

4.3.   Натриев сулфат, дехидратиран, гранулат, предварително изсушен при 102 °C за два часа

4.4.   Хлороформ

4.5.   Циклохексан

5.   ПРОЦЕДУРА

5.1.   Подготовка на тестовата проба

5.1.1.   Концентрирано масло

Пробата се стапя в пещта при приблизително 45 °C.

5.1.2.   Масло

Пробата се стапя в пещта при приблизително 45 °C и представителна доза от нея се филтрира през филтър, който съдържа около 10g дехидратиран натриев сулфат (4.3), в среда, защитена от силна естествена и изкуствена светлина, и при постоянно поддържана температура от 45 °C. Взема се подходящо количество мазнина.

5.2.   Определяне

Отмерва се с точност до 1 mg приблизително 1g концентрирано масло (или извлечена мазнина от масло (5.1.2), (М). Количеството се прехвърля в 20 ml (V) мерителна колба с използване на петролен етер (4.2), допълва се до маркировката и внимателно се смесва.

Една аликвотна част се прехвърля в кювета от 1 cm и се измерва абсорбцията при 440 nm, като се сравнява с празна проба на петролен етер. Концентрацията на апо-каротинен естер в разтвора се получава чрез позоваване на графиката на стандарта (C µ/ml).

5.3.   Калибриране

0, 0,25, 0,5, 0,75 и 1,0 ml стандартен разтвор на апо-каротинен естер (4.1.2) се капват съответно в пет 100 ml мерителни колби. Разрежда се до допълване на обема с петролен етер (4.2) и се разбърква.

Приблизителните концентрации на разтворите са в обхвата от 0 до 2 µg/ml и се изчисляват точно чрез позоваване на концентрацията на стандартния разтвор (4.1.2) (W × P) / 10 mg/ml. Абсорбциите се измерват при 440 nm, като се сравняват с празната проба на петролен етер (4.2).

Стойностите на абсорбцията се записват в y-координатата срещу концентрацията на апо-каротинен естер в х-координатата. Изчислява се уравнението на стандартната крива.

6.   ИЗЧИСЛЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

6.1.   Съдържанието на апо-каротинен естер, изразено като mg/kg продукт, се получава чрез:

Концентрирано масло: (C × V)/M

Масло: 0,82 (C × V)M

където:

C	=	съдържание на апо-каротинен естер, µg/ml, разчетено от графиката на калибриране (5.3)
V	=	обем (ml) на тестовия разтвор (5.2)
M	=	маса (g) на тестовата доза (5.2)
0,82	=	корекционен коефициент за съдържанието на мазнини в масло.

7.   ТТОЧНОСТ НА ПРОЦЕДУРАТА

7.1.   Повторяемост

7.1.1.   Анализ на масло

Разликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 1,4 mg/kg

7.1.2.   Анализ на концентрирано масло

Разликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 1,6 mg/kg

7.2.   Възпроизводимост

7.2.1.   Анализ на масло

Разликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и при използване на различна апаратура върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 4,7 mg/kg.

7.3.   2. Анализ на концентрирано масло

Разликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и при използване на различна апаратура върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 5,3 mg/kg.

7.4.   Източник на данните за точност

Данните за точност бяха определени от експеримент, проведен през 1995 г. и обхващащ 11 лаборатории и 12 маркирани проби (шест празни дублирания) за масло и 12 маркирани проби (шест празни дублирания) за концентрирано масло.

8.   ГРАНИЦИ НА ТОЛЕРАНС

8.1.   От маркирания продукт трябва да бъдат взети три проби за проверка на коректността на маркирането на продукта.

8.2.   Масло

8.2.1.   Размерът за смесване за масло, като се вземе предвид основната абсорбция, е 22 mg/kg

8.2.2.   Резултатите от трите проби, получени от анализа на продукта, се използват за проверяване на размера и хомогенността на смесване на маркера, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните гранични стойности:

—	17,7 mg/kg (95 % от минималния размер за смесване),

—	12,2 mg/kg (70 % от минималния размер за смесване).

Използва се концентрацията на маркера в пробата с най-ниския резултат заедно с интерполация между 17,7 mg/kg и 12,2 mg/kg.

8.3.   Концентрирано масло

8.3.1.   Размерът за смесване за концентрирано масло, като се вземе предвид основната абсорбция, е 24 mg/kg.

Резултатите от трите проби, получени от анализа на продукта, се използват за проверяване на размера и хомогенността на смесване на маркера, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните гранични стойности:

—	19,2 mg/kg (95 % от минималния размер за смесване),

—	13,2 mg/kg (70 % от минималния размер за смесване).

Използва се концентрацията на маркера в пробата с най-ниския резултат заедно с интерполация между 19,2 mg/kg и 13,2 mg/kg.

ПРИЛОЖЕНИЕ VIII

(член 5)

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СИТОСТЕРИН ИЛИ СТИГМАСТЕРОЛ В МАСЛО ИЛИ КОНЦЕНТРИРАНО МАСЛО ЧРЕЗ ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ С КАПИЛЯРНА КОЛОНА

1.   ОБХВАТ И ПРИЛОЖНО ПОЛЕ

Методът описва процедура за количествено определяне на ситостерин или стигмастерол в масло и концентрирано масло. Ситостеринът се взема като сума от β-ситостерин и 22 дихидро-β-ситостерин, като другите ситостерини се приемат за незначителни.

2.   ПРИНЦИП

Маслото или концентрираното масло се хидролизира с разтвор на калиев хидроксид и нехидролизираните съставки се извличат с диетилов етер.

Стеролите се превръщат в триметил-силил етери и се анализират чрез газова хроматография с капилярна колона, с бетулин като вътрешен стандарт.

3.   АПАРАТУРА

3.1.   150 ml колба за хидролиза с обратен хладник с връзки от шлифовано стъкло

3.2.   Делителни фунии от 500 ml

3.3.   Колби от 250 ml

3.4.   Фунии за изравняване на налягането от 250 ml или подобни за събирането на остатъка от диетиловия естер

3.5.   Стъклена колона, 350 mm × 20 mm, със запушалка от синтеровано стъкло

3.6.   Водна баня или кожух

3.7.   Реакционни епруветки от 2 ml

Газова хроматография, подходяща за използване с капилярна колона, снабдена със система за разделяне, състояща се от:

3.8.1.   термостатична камера за колони, в която може да се поддържа желаната температура с точност ±1 °C;

3.8.2.   отделение за изпаряване с настройване на температурата;

3.8.3.   пламъчно-йонизационен детектор и преобразувател-усилвател;

3.8.4.   интегратор-пишещо устройство, подходящ за използване с преобразувател-усилвателя (3.8.3)

3.9.   Кварцова капилярна колона, изцяло обвита с BP1 или еквивалентен материал (или всякаква друга колона с най-малко същата степен на разделяне) с равномерна дебелина от 0,25 µm; колоната трябва да може да разделя триметил-силил производни на ланостерин и ситостерин. Подходяща е колона с дължина 12 m и вътрешен диаметър от 0,2 mm.

3.10.   Микроспринцовка от 1 µl за газова хроматография със закалена игла

4.   РЕАГЕНТИ

Всички реагенти трябва да бъдат с признато аналитично качество. Използваната вода трябва да е дестилирана или да с еквивалентна степен на чистота.

4.1.   Етанол с чистота най-малко 95 %

4.2.   Калиев хидроксид, 60 % разтвор (600 g калиев хидроксид (минимум 85 %) се разтваря във вода и се долива до един литър с вода

Бетулин, най-малко 99 % чисто съдържание

Разтвори на бетулин в диетилов етер (4.4)

4.3.1.1.   Концентрацията на бетулиновия разтвор, използван за определянето на ситостерин, следва да бъде 1,0 mg/ml

4.3.1.2.   Концентрацията на бетулиновия разтвор, използван за определянето на стигмастерол, следва да бъде 0,4 mg/ml

4.4.   Диетилов етер с аналитична степен на чистота (без прекиси или утайки)

4.5.   Натриев сулфат, дехидратиран, гранулат, предварително изсушен при 102 °C за два часа.

4.6.   Силилов реагент, например TRI-SIL (наличен от Pierce Chemical Co, кат. № 49001) или подобен (Важно: TRI-SIL е възпламеним, токсичен, разяждащ и е възможно да е канцерогенен. Лабораторният персонал трябва да е запознат с данните за безопасност във връзка с TRI-SIL и да вземе необходимите предпазни мерки.)

4.7.   Ланостерин

Ситостерин с известна степен на чистота, с не по-малко от 90 % чисто съдържание (P)

Забележка 1: Степента на чистота на използваните стандартни материали за калибриране трябва да бъде определена чрез използване на метода на нормализиране. Приема се, че всички стероли, налични в пробата, са представени върху хроматограмата, като общата площ на пика представлява 100 % от стеролните съставки, и че стеролите дават един и същ детекторен сигнал. Линейността на системата трябва да бъде валидирана за разглежданите равнища на концентрация.

4.8.1.   Стандартен разтвор на ситостерин — приготвя се разтвор, съдържащ с точност до 0,001 mg/ml приблизително 0,5 mg/ml (W1) ситостерин (4.8) в диетилов етер (4.4).

Стигмастерол с известна степен на чистота, с не по-малко от 90 % чисто съдържание (P)

4.9.1.   Стандартен разтвор на стигмастерол — приготвя се разтвор, съдържащ с точност до 0,001 mg/ml приблизително 0,2 mg/ml (W1) стигмастерол (4.9) в диетилов етер (4.4).

4.10.   Тестов разтвор за проверка на разделянето. Приготвя се разтвор, съдържащ 0,05 mg/ml ланостерин (4.7) и 0,5 mg/ml ситостерин (4.8) в диетилов етер (4.4)

5.   МЕТОД

5.1.   Приготвяне на стандартни разтвори за хроматография

Вътрешният стандартен разтвор (4.3.1) трябва да се добави към подходящ стеролов стандартен разтвор едновременно с добавянето му към хидролизираната проба (вж. 5.2.2).

5.1.1.   Стандартен хроматографски разтвор на ситостерин: 1 ml стандартен разтвор на ситостерин (4.8.1) се поставя във всяка от двете реакционни епруветки (3.7) и диетиловият етер се отстранява чрез струя азот. Добавя се 1 ml вътрешен разтвор (4.3.1.1) и диетиловият етер се отстранява чрез струя азот.

5.1.2.   Стандартен хроматографски разтвор на стигмастерол: 1 ml стандартен разтвор на стигмастерол (4.9.1) се поставя във всяка от двете реакционни епруветки (3.7) и диетиловият етер се отстранява чрез струя азот. Добавя се 1 ml вътрешен стандартен разтвор (4.3.1.2) и диетиловият етер се отстранява чрез струя азот

5.2.   Подготовка на нехидролизираните съставки

5.2.1.   Пробата масло се стопява при температура, която не надвишава 35 °C и се смесва старателно чрез бъркане

В 150 ml колба (3.1) се измерва с точност до 1 mg приблизително 1 g масло (W2) или концентрирано масло (W2). Добавя се 50 ml етанол (4.1) и 10 ml разтвор на калиев хидроксид (4.2). Поставя се обратният хладник и се загрява до приблизително 75 °C за 30 минути. Обратният хладник се откача и колбата се охлажда до температура, близка до стайната.

5.2.2.   В колбата се добавя 1,0 ml вътрешен стандартен разтвор (4.3.1.1), ако трябва да се определи ситостеринът или (4.3.1.2) ако трябва да се определи стигмастеролът. Смесва се старателно. Съдържанието на колбата се прехвърля в 500 ml отделителна фуния (3.2), като колбата последователно се измива с 50 ml вода и 250 ml диетилов етер (4.4). Отделителната фуния се разклаща силно за две минути и се оставя за отделяне на фазите. Долният воден слой се отстранява и етеровият слой се измива чрез разклащане с четири последователни аликвотни части вода от по 100 ml

Забележка 2: За да се избегне образуването на емулсия, е съществено първите две измивания с вода да се извършват леко (10 превъртания). При третото измиване може да се разклаща силно за 30 секунди. Ако се образува емулсия, тя може да бъде разрушена с прибавяне на 5—10 ml етанол. Ако се добавя етанол, е важно да се извършат две допълнителни енергични измивания с вода.

5.2.3.   Чистият нехидролизиран етеров слой се оставя да изтече през стъклена колона (3.5), съдържаща 30 g дехидратиран натриев сулфат (4.5). Етерът се събира в 250 ml колба (3.3). Добавя се една гранула против кипене с енергично отделяне на пара и се изпарява почти до изсушаване във водна баня или кожух, като се събират остатъците от разтворителите.

Забележка 3: Ако екстрактите от пробата бъдат напълно изсушени при прекалено висока температура, може да настъпи загуба на стерол.

5.3.   Приготвяне на триметилсилил етери

5.3.1.   Етеровият разтвор, останал в колбата, се поставя в 2 ml реакционна епруветка (3.7) заедно с 2 ml диетилов етер, след което етерът се отстранява чрез струя азот. Колбата се измива с две допълнителни аликвотни части от 2 ml диетилов етер, който се поставя в епруветката и всеки път се отстранява с азот.

5.3.2.   Пробата се силилира чрез добавяне на 1 ml TRI-SIL (4.6). Епруветката се затваря и се разклаща силно, за да се разтвори. Ако разтварянето е непълно, се подгрява до 65—70 °C. Оставя се да престои най-малко пет минути преди впръскването в газовия хроматограф. Стандартите се силилират по същия начин като пробите. Тестовият разтвор за проверка на разтварянето (4.10) се силилира по същия начин като пробите.

Забележка 4: Силилирането трябва да се извършва в безводна среда. Непълното силилиране на бетулин се индикира с втори пик, близък до този на бетулина.

Присъствието на етанол на етапа на силилиране влияе на силилирането. Това може да е резултат от недостатъчно измиване на етапа на екстракцията. Ако този проблем продължава, на етапа на екстракцията може да бъде въведено пето измиване, като се разклаща силно за 30 секунди.

5.4.   Газовохроматографски анализ

5.4.1.   Избор на оперативни условия

Газовият хромотограф се настройва съгласно инструкциите на производителя.

Ориентировъчните условия на работа са, както следва:

—	температура на колоната: 265 °C

—	температура на инжектора: 265 °C

—	температура на детектора: 300 °C

—	скорост на струята на газа носител: 0,6 ml/min

—	налягане на водорода: 84 kPa,

—	налягане на въздуха: 155 kPa

—

разделяне на пробата: 10:1 до 50:1; съотношението на разделяне трябва да бъде оптимизирано съгласно инструкциите на производителя и линейността на отговора на детектора и след това да бъде валидирано за стойностите на концентрация, които ни интересуват. Забележка 5: Изключително важно е тръбичката на инжектора да се почиства редовно.

—	количество на впръсканата субстанция: 1 µl разтвор TMSE.

Преди започването на какъвто и да е анализ системата се оставя да се уравновеси и да даде удовлетворителен постоянен сигнал отговор.

Тези условия трябва да варират в светлината на характеристиките на колоната и на газовия хроматограф, така че да се получат хроматограми, които изпълняват следните условия:

—	пикът на ситостерин трябва да бъде добре отделен от ланостерина. На фигура 1 е показана типична хроматограма, която следва да се получи от силилирания тестов разтвор за проверка на разделянето (4.10),

—	относителното време на задържане на следните стероли следва да бъде приблизително: — холестерол: 1,0 — стигмастерол: 1,3 — ситостерин: 1,5 — бетулин: 2,5,

—	времето на задържане за бетулин следва да бъде приблизително 24 минути.

5.4.2.   Аналитична процедура

Впръсква се 1 µl силилиран стандартен разтвор (стигмастерол или ситостерин) и се настройват параметрите за калибриране на интегратора.

Впръсква се допълнително 1 µl силилиран стандартен разтвор, за да се определят коефициентите на чувствителност по отношение на бетулина.

Впръсква се 1 µl силилиран разтвор на пробата и се измерват площите на пика. Всяка хроматографска серия трябва да бъде обграждана с впръскване на стандарти.

Като указание във всяка обградена серия следва да са включени шест впръсквания на проба.

Забележка 6: Интегрирането на пика на стигмастерол следва да включва всички размивания на пика, както са определени от точки 1, 2 и 3 на фигура 2б.

Интегрирането на ситостериновия пик би следвало да включва площта на пика на 22-дихидро-β-ситостерин (стигмастанол), който се елуира веднага след ситостерина (вж. фигура 3б), когато се оценява общото съдържание на ситостерин.

6.   ИЗЧИСЛЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

6.1.   Площта на пика на стерол и на бетулин се определя в двата стандарта, обграждащи дадена партида, и се изчислява R1:

R1 = (средна площ на пика на стерол в стандарта)/(средна площ на пика на бетулин в стандарта)

Определя се площта на пика на стерол (стигмастерол и ситостерин) и на бетулин в пробата и се изчислява R2:

R2 = (площ на пика на стерол в пробата)/(площ на пика на бетулин в пробата)

W1	=	съдържание на стерол в стандарта (mg), което се съдържа в 1 ml стандартен разтвор (4.8.1 или 4.9.1)
W2	=	тегло на пробата (g) (5.2.1)
P	=	чистота на стандартния стерол (4.8 или 4.9)

Съдържание на стерол в пробата (mg/kg) = ((R2)/(R1)) × ((W 1)/(W 2)) × P × 10

7.   ТОЧНОСТ НА МЕТОДА

7.1.   Масло

7.1.1.   Повторяемост

7.1.1.1.   Стигмастерол

Разликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 19,3 mg/kg

7.1.1.2.   Ситостерин

Разликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 23,0 mg/kg

7.1.2.   Възпроизводимост

7.1.2.1.   Стигмастерол

Разликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и при използване на различна апаратура върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 31,9 mg/kg.

7.1.2.2.   Ситостерин

Разликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и при използване на различна апаратура върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 8,7 % спрямо средната стойност от определянето.

7.1.3.   Източник на данните за точност

Данните за точност бяха определени от експеримент, проведен през 1992 г. и обхващащ осем лаборатории и шест проби (три празни дублирания) за стигмастерол и шест проби (три празни дублирания) за ситостерин.

7.2.   Концентрирано масло

7.2.1.   Повторяемост

7.2.1.1.   Стигмастерол

Разликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 10,2 mg/kg.

7.2.1.2.   Ситостерин

Разликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 3,6 % спрямо средната стойност от определянето.

7.2.2.   Възпроизводимост

7.2.2.1.   Стигмастерол

Разликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и при използване на различна апаратура върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 25,3 mg/kg.

7.2.2.2.   Ситостерин

Разликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и при използване на различна апаратура върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 8,9 % спрямо средната стойност от определянето.

7.2.3.   Източник на данните за точност

Данните за точност бяха определени от експеримент, проведен през 1991 г. и обхващащ девет лаборатории и шест проби (три празни дублирания) за стигмастерол и шест проби (три празни дублирания) за ситостерин.

8.   ГРАНИЦИ НА ТОЛЕРАНС

8.1.   От маркирания продукт трябва да бъдат взети три проби за проверка на коректността на маркирането на продукта.

8.2.   Масло

8.2.1.   Стигмастерол

8.2.1.1.   Количеството за смесване за стигмастерол е 150 g от най-малко 95 % чист стигмастерол на тон масло, т.е. 142,5 mg/kg, или 170 g от най-малко 85 % чист стигмастерол на тон масло, т.e. 144,5 mg/kg.

8.2.1.2.   Резултатите от трите проби, получени от анализа на продукта, се използват за проверяване на размера и хомогенността на смесване на маркера, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните гранични стойности:

—	115,8 mg/kg (95 % от минималното количество за смесване за 95 % чист стигмастерол),

—	117,7 mg/kg (95 % от минималното количество за смесване за 85 % чист стигмастерол),

—	80,1 mg/kg (70 % от минималното количество за смесване за 95 % чист стигмастерол),

—	81,5 mg/kg (70 % oт минималното количество за смесване за 85 % чист стигмастерол).

Използва се концентрацията на маркера в пробата с най-ниския резултат заедно с интерполация съответно между 115,8 mg/kg и 80,1 mg/kg, или 117,7 mg/kg и 81,5 mg/kg.

8.2.2.   Ситостерин

8.2.2.1.   Количеството за смесване за ситостерин е 600 g от най-малко 90 % чист ситостерин на тон масло, т.e. 540 mg/kg

8.2.2.2.   Резултатите от трите проби, получени от анализа на продукта, се използват за проверяване на размера и хомогенността на смесване на маркера, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните гранични стойности:

—	482,6 mg/kg (95 % от минималното количество за смесване за 90 % чист ситостерин),

—	347,6 mg/kg (70 % от минималното количество за смесване за 90 % чист ситостерин).

Използва се концентрацията на маркера в пробата с най-ниския резултат заедно с интерполация между 482,6 mg/kg и 347,6 mg/kg.

8.3.   Концентрирано масло

8.3.1.   Стигмастерол

8.3.1.1.   Количеството за смесване за стигмастерол е 150 g от най-малко 95 % чист стигмастерол на тон концентрирано масло, т.e. 142,5 mg/kg, или 170 g от най-малко 85 % чист стигмастерол на тон концентрирано масло, т.e. 144,5 mg/kg

8.3.1.2.   Резултатите от трите проби, получени от анализа на продукта, се използват за проверяване на размера и хомогенността на смесване на маркера, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните гранични стойности:

—	118,5 mg/kg (95 % от минималното количество за смесване за 95 % чист стигмастерол),

—	120,4 mg/kg (95 % от минималното количество за смесване за 85 % чист стигмастерол),

—	82,9 mg/kg (70 % от минималното количество за смесване за 95 % чист стигмастерол),

—	84,3 mg/kg (70 % oт минималното количество за смесване за 85 % чист стигмастерол).

Използва се концентрацията на маркера в пробата с най-ниския резултат заедно с интерполация съответно между 118,5 mg/kg и 82,9 mg/kg, или 120,4 mg/kg и 84,3 mg/kg.

8.3.2.   Ситостерин

8.3.2.1.   Количеството за смесване за ситостерин е 600 g от най-малко 90 % чист ситостерин на тон концентрирано масло, т.e. 540 mg/kg

8.3.2.2.   Резултатите от трите проби, получени от анализа на продукта, се използват за проверяване на размера и хомогенността на смесване на маркера, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните гранични стойности:

—	480,9 mg/kg (95 % от минималното количество за смесване за 90 % чист ситостерин),

—	345,9 mg/kg (70 % от минималното количество за смесване за 90 % чист ситостерин).

Използва се концентрацията на маркера в пробата с най-ниския резултат заедно с интерполация между 480,9 mg/kg и 345,9 mg/kg.

Figure 1

Chromatogram of resolution test mixture

Complete resolution is preferable, i.e. the peak trace for lanosterol should return to baseline before leaving for the sitosterol peak although incomplete resolution is tolerable.

β-sitosterol

Lanosterol

Stigmastanol

FID Detector response

0

4

8

12

16

20

Time (mins)

Figure 2a	Figure 2b
Stigmasterol standard	Butter sample denatured with stigmasterol
Note: Integration of the stigmasterol peak should include any tailing as defined by points 1, 2 and 3.

Figure 3a	Figure 3b
Sistosterol standard	Butter sample denatured with β-Sitosterol
Note: β-sitosterol often contains an impurity (identified as stigmastanol) which elutes immediately after β-sitosterol. The areas of these two peaks should be summed when evaluating the total β-sitosterol present.

ПРИЛОЖЕНИЕ IX

(член 6)

РЕФЕРЕНТЕН МЕТОД ЗА ОТКРИВАНЕ НА КРАВЕ МЛЯКО И КАЗЕИНАТИ В СИРЕНА ОТ ОВЧЕ МЛЯКО, КОЗЕ МЛЯКО ИЛИ БИВОЛСКО МЛЯКО, ИЛИ СМЕСИ ОТ ОВЧЕ, КОЗЕ И БИВОЛСКО МЛЯКО

1.   ОБХВАТ

Откриване на краве мляко и казеинати в сирена, произведени от овче мляко, козе мляко, биволско мляко, или смеси от овче, козе и биволско мляко чрез изоелектрическо фокусиране на γ-казеини след плазминолиза.

2.   ОБЛАСТ НА ПРИЛОЖЕНИЕ

Методът е подходящ за чувствително и специфично откриване на натурално и топлинно обработвано краве мляко и казеинати в пресни и узрели сирена, произведени от овче мляко, козе мляко, биволско мляко, или смеси от овче, козе и биволско мляко. Той не е подходящ за откриване на подправяне на мляко и сирене чрез топлинно обработени концентрати на суроватъчен протеин от краве мляко.

3.   ПРИНЦИП НА МЕТОДА

3.1.   Изолиране на казеини от сирене и от референтните проби.

3.2.   Разтваряне на изолираните казеини и разграждане чрез плазмин (EC.3.4.21.7).

3.3.   Изоелектрическо фокусиране на обработени с плазмин казеини в присъствието на урея и оцветяване на протеините

3.4.   Оценка на оцветените γ3 и γ2-ивици на казеин (доказателство за краве мляко) чрез сравняване на получените от пробата ивици с тези, които са получени в същия гел от референтните проби, съдържащи 0 % и 1 % краве мляко.

4.   РЕАГЕНТИ

Ако не е посочено друго, трябва да бъдат използвани химикали с аналитично качество. Водата трябва да е двойно дестилирана или с еквивалента степен на чистота.

Забележка: Указанията по-долу се прилагат за лаборатория, която е подготвила полиакриламидни гелове, съдържащи урея, с размери 265 × 125 × 0,25 mm. Когато се използват други размери и типове гел, може да е необходимо коригиране на условията за отделяне.

Изоелектрическо фокусиране

4.1.   Реагенти за получаване на полиакриламидни гелове, съдържащи урея

4.1.1.   Основен разтвор на гел

Разтварят се:

4,85 g акриламид

0,15 g N, N'-метиленбисакриламид (BIS)

48,05 g урея

15,00 g глицерин (87 % w/w),

във вода, допълва се до 100 ml и се съхранява в бутилка от кафяво стъкло в хладилник.

Забележка: Вместо цитираните определени дози невротоксични акриламиди може да се използва готов разтвор акриламид/BIS, наличен в търговската мрежа. Когато такъв разтвор съдържа 30 % w/v акриламид и 0,8 % w/v BIS, вместо определените дози за сместа трябва да бъде използван обем от 16,2 ml. Годността на основния разтвор е максимум 10 дни; ако неговата проводимост е повече от 5 µS, той се дейонизира чрез разклащане с 2 g Амберлит MB-3 за 30 минути, след това се филтрира през мембрана от 0,45 µm.

4.1.2.   Разтвор на гел

Приготвя се разтвор на гел чрез смесването на добавки и амфолити с основния разтвор на гел (виж 4.1.l).

9,0 ml основен разтвор

24 mg β-аланин

500 µl амфолит pH 3,5—9,5 (1)

250 µl амфолит pH 5—7 (1)

250 µl амфолит pH 6—8 (1).

Разтворът на гел се смесва и се дегазира за две до три минути в ултразвукова баня или във вакуум.

Забележка: Разтворът на гел се приготвя непосредствено преди изливането му (вж. 6.2).

4.1.3.   Катализаторни разтвори

4.1.3.1.   N, N, N' N' — тетраметилетилендиамин (Temed).

4.1.3.2.   40 % w/v амониев персулфат (PER):

800 mg PER се разтварят във вода и се долива до 2 ml

Забележка: Винаги се използва прясно приготвен разтвор на PER.

4.2.   Контактна течност

Керосин или течен парафин

4.3.   Aноден разтвор

5,77 g фосфорна киселина (85 % w/w) се разтваря във вода и се разрежда до 100 ml.

4.4.   Катоден разтвор

2,00 g натриев хидроксид се разтваря във вода и се разрежда до 100 ml с вода.

Подготовка на проби

4.5.   Реагенти за изолиране на протеин

4.5.1.    Разредена оцетна киселина (25,0 ml ледена оцетна киселина с добавена вода до 100 ml)

4.5.2.    Дихлорметан

4.5.3.    Ацетон

4.6.   Неутрализатор за разтваряне на протеин

Разтварят се:

5,75 g глицерин (87 % w/w)

24,03 g урея

250 mg дитиотрейтол,

във вода и се долива до 50 ml

Забележка: Съхранява се в хладилник, максимална годност — една седмица.

4.7.   Реагенти за разграждане на казеини чрез плазмин

4.7.1.   Неутрализатор — амониев карбонат

0,2 mol/l разтвор на амониев бикарбонат (1,58 g/100 ml вода), съдържащ 0,05 mol/l етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA, 1,46 g/100 ml), се титрува с 0,2 mol/l разтвор на амониев кaрбонат (1,92 g/100 ml вода), съдържащ 0,05 mol/l EDTA, до pH 8.

4.7.2.    Говежди плазмин (EC. 3.4.21.7) с активност най-малко 5 U/ml

4.7.3.   Разтвор на ε-аминокапронова киселина за инхибиране на ензими

2,624 g ε-аминокапронова киселина (6 амино-n-хексанова киселина) се разтварят в 100 ml 40 % (v/v) етанол.

4.8.   Стандарти

4.8.1.    Сертифицирани референтни стандартни проби от смес от подсирени овче и козе обезмаслено мляко, съдържащи 0 % и 1 % краве мляко, могат да се намерят от Института за референтни материали и метрология на Комисията, B-2440 Гил, Белгия.

4.8.2.   Подготовка на вътрешни лабораторни стандартни проби от подсирено биволско мляко, съдържащо 0 % и 1 % краве мляко

Обезмасленото мляко се приготвя чрез центрофугиране на сурово непакетирано биволско или краве мляко при 37 °C (2 500 g, 20 минути). След бързо охлаждане на съда и съдържанието му до 6—8 °C горният слой мазнина се отстранява напълно. За подготовката на 1 %-на стандартна проба към 495 ml биволско обезмаслено мляко се добавя 5,00 ml краве обезмаслено мляко в 1l бехерова чаша и се постига pH 6,4 чрез прибавяне на разредена млечна киселина (10 % w/v). Температурата се довежда до 35 °C и се прибавят 100 µl телешко сирище (активност 1: 10 000, c. 3 000 U/ml), разклаща се за 1 минута и бехеровата чаша се оставя покрита с алуминиево фолио при 35 °C за един час, за да може съдържанието да се съсири. След образуването на съсирека цялото подсирено мляко се суши чрез сублимиране без предварително хомогенизиране или отцеждане на суроватката. След сушенето чрез сублимиране то се смила ситно на хомогенен прах. За подготовката на 0 %-на стандартна проба се извършва същата процедура с използване на натурално биволско обезмаслено мляко. Стандартните проби трябва да бъдат съхранявани при –20 °C.

Забележка: Препоръчително е да се проверява чистотата на биволското мляко чрез изоелектрическо фокусиране на третираните с плазмин казеини преди подготовката на стандартните проби.

Реагенти за оцветяване на протеин

4.9.   Фиксатор

150 g трихлороцетна киселина се разтварят във вода и се долива до 1 000 ml.

4.10.   Обезцветяващ разтвор

500 ml метанол и 200 ml ледена оцетна киселина се разреждат до 2 000 ml с дестилирана вода.

Забележка: Всеки ден се приготвя пресен обезцветяващ разтвор; той може да бъде приготвен чрез смесване на равни обеми основни разтвори на 50 % (v/v) метанол и 20 % (v/v) ледена оцетна киселина.

4.11.   Оцветяващи разтвори

4.11.1.   Оцветяващ разтвор (основен разтвор 1)

3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) се разтваря в 1 000 ml 90 % (v/v) метанол с използване на магнитна бъркалка (приблизително 45 минути), филтрира се през два нагънати филтъра.

4.11.2.   Оцветяващ разтвор (основен разтвор 2)

5,0 g меден сулфат пентахидрат се разтваря в 1 000 ml 20 % (v/v) оцетна киселина.

4.11.3.   Оцветяващ разтвор (работен разтвор)

Смесват се по 125 ml от всеки от основните разтвори (4.11.1, 4.11.2) непосредствено преди оцветяването.

Забележка: Оцветяващият разтвор следва да бъде приготвен в деня, в който се използва.

5.   ОБОРУДВАНЕ

5.1.   Стъклени плочи (265 × 125 × 4 mm); каучукова ролка (ширина 15 cm); маса с регулируема височина

5.2.   Лист носител на гел (265 × 125 mm)

5.3.   Покривен лист (280 × 125 mm). По двете му дължини отстрани се поставя самозалепваща лента (280 × 6 × 0,25 mm) (вж. фигура 1)

5.4.   Камера за електрофокусиране с охлаждаща плоча (напр. 265 × 125 mm) и подходящо електрическо захранване (≥ 2,5 kV) или автоматично устройство за електрофореза

5.5.   Криостат с циркулация, термостатно контролиран на 12 ± 0,5 °C

5.6.   Центрофуга, регулируема за 3 000 g

5.7.   Електродни ленти (с дължина ≥ 265 mm)

5.8.   Пластмасови флакони за капене на анодните и катодните разтвори

5.9.   Апликатори за проби (10 × 5 mm, вискозна филтърна хартия или филтърна хартия с ниска абсорбция на протеин)

5.10.   Ножици, скалпели и пинсети от неръждаема стомана

5.11.   Съдове от неръждаема стомана или от стъкло за оцветяване и обезцветяване (напр. 280 × 150 mm таблички за инструменти)

5.12.   Приспособим хомогенизатор (с диаметър на оста 10 mm), от 8 000 до 20 000 оборота в минута.

5.13.   Магнитна бъркалка

5.14.   Ултразвукова баня

5.15.   Апарат за залепване на листовете

5.16.   25 µl микрокапкомери

5.17.   Вакуумен концентратор или сушилня чрез сублимиране

5.18.   Термостатично контролирана водна баня, регулируема за 35 и за 40 ± 1 °C с възможност за разбъркване

5.19.   Денсиметър, четящ при λ = 634 nm

6.   ПРОЦЕДУРА

6.1.   Подготовка на проби

6.1.1.   Изолиране на казеини

Количество, еквивалентно на 5 g сухо вещество сирене, или референтните стандартни проби се претеглят в 100 ml центрофужна епруветка, прибавя се 60 g дестилирана вода и се хомогенизира с хомогенизатор (от 8 000 до 10 000 rpm). Регулира се до pH 4,6 с разредена оцетна киселина (4.5.1) и се центрофугира (5 минути, 3 000 g). Мазнината и суроватката се отделят, утайката се хомогенизира при 20 000 rpm в 40 ml дестилирана вода, регулирана до pH 4,5 с разредена оцетна киселина (4.5.1), добавят се 20 ml дихлорметан (4.5.2), отново се хомогенизира и се центрофугира (5 минути, 3 000 g). Казеиновият слой, който се намира между водната и органичната фази (вж. фигура 2), се отстранява със шпатула и двете фази се отделят. Казеинът се хомогенизира отново в 40 ml дестилирана вода (виж по-горе) и 20 ml дихлорметан (4.5.2) и се центрофугира. Тази процедура се повтаря, докато двете фази на екстракцията останат безцветни (от два до три пъти). Утайката от протеин се хомогенизира с 50 ml ацетон (4.5.3) и се филтрира през нагъната филтърна хартия. Утайката върху филтъра се измива с две отделни части от 25 ml ацетон и се оставя да се изсуши на въздух или в струя азот, след което се стрива на фин прах в хаван.

Забележка: Сухият изолиран казеин следва да бъде съхраняван при –20 °C.

6.1.2.   Разграждане чрез плазмин на β-казеини за интензифициране на γ-казеини

25 mg изолирани казеини (6.1.1) се разпръскват в 0,5 ml неутрализатор — амониев карбонат (4.7.1) и се хомогенизират за 20 минути, например чрез използване на ултразвук. Подгрява се до 40 °C и се добавя 10 µl плазмин (4.7.2), смесва се и се инкубира за един час при 40 °C с непрекъснато разклащане. За да се инхибира ензимът, се добавя 20 µl разтвор на ε-аминокапронова киселина (4.7.3), след това се добавят 200 mg твърда урея и 2 mg дитиотрейтол.

Забележка: За да се получи по-голяма симетрия на фокусираните казеинови ивици е препоръчително разтворът да се изсуши чрез сублимиране след добавянето на ε-аминокапронова киселина, като след това утайките се разредят в 0,5 ml неутрализатор за разтваряне на протеин (4.6).

6.2.   Приготвяне на полиакриламидни гелове, съдържащи урея

С помощта на няколко капки вода листът носител на гел (5.2) се разстила върху стъклена плоча (5.1), като излизащата навън вода се отстранява с хартиена салфетка. По същия начин покривният лист (5.3) с ограничители (0,25 mm) се разстила върху друга стъклена плоча. Плочата се поставя хоризонтално върху нивелирана маса.

Към приготвения и с отстранен въздух разтвор на гел (4.1.2) се добавят 10 µl Temed (4.1.3.1), разклаща се и се добавят 10 µl разтвор на PER (4.1.3.2), внимателно се смесва и веднага се излива равномерно в центъра на покривния лист. Единият край на плочата с носителя на гела (с листа надолу) се поставя върху плочата с покривния лист и плочата се сваля бавно надолу, така че между листовете да се образува и разстеле равномерно филм от гел, без да се образуват мехурчета (фигура 3). Плочата с носителя на гела се оставя внимателно да легне напълно с помощта на тънка шпатула и върху нея се поставят още три стъклени плочи за тежест. След завършването на полимеризацията (около 60 минути) полимеризираният гел върху плочата носител на гела и върху покривния лист се изважда чрез разделяне на стъклените плочи. Обратната страна на листа носител се почиства внимателно, за да се отстранят остатъците от гела и уреята. „Гел-сандвичът“ се навива и залепва на тръбичка и се съхранява в хладилник (максимум шест седмици).

Забележка: Покривният лист с ограничителите може да бъде използван повторно. Полиакриламидният гел може да бъде нарязан на по-малки части, което е препоръчително, когато има няколко проби или ако се използва автоматично устройство за електрофореза (два гела, с размер 4,5 × 5 сm).

6.3.   Изоелектрическо фокусиране

Настройва се охлаждащият термостат на 12 °C. Обратната страна на листа носител на гел се избърсва с керосин, след това в центъра на охлаждащия блок се капват няколко капки керосин (4.2.). След това „гел-сандвичът“ се разстила върху него със страната на носителя надолу, като се внимава да не се образуват мехурчета. Излишният керосин се избърсва и покривният лист се отстранява. Електродните ленти се напояват с електродните разтвори (4.3, 4.4), изрязват се до дължината на гела и се поставят на предвидените места (разстояние на електродите 9,5 cm).

Условия за изоелектрическо фокусиране:

6.3.1.   Размер на гела 265 × 125 × 0,25 mm

Стъпка	Време (min)	Напрежение (V)	Ток (mA)	Мощност (W)	Волтчасове (Vh)
1. Предварително фокусиране	30	максимум 2 500	максимум 15	постоянна 4	около 300
2. Фокусиране на пробата (2)	60	максимум 2 500	максимум 15	постоянна 4	около 1 000
3. Окончателно фокусиране	60	максимум 2 500	максимум 5	максимум 20	около 3 000
	40	максимум 2 500	максимум 6	максимум 20	около 3 000
	30	максимум 2 500	максимум 7	максимум 25	около 3 000

Забележка: Ако плътността или ширината на геловете се променят, стойностите за електрически ток и мощност следва да се адаптират по подходящ начин (напр. удвояване на стойностите за електрически ток и за мощност, ако се използва гел с размери 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2.   Пример за програмиране на автоматично устройство за електрофореза (2 гела с размери 5,0 × 4,5 cm); електродите без ленти се поставят направо върху гела

Стъпка	Напрежение	Ток	Мощност	Температура	Волтчасове
1. Предварително фокусиране	1 000 V	10,0 mA	3,5 W	8 °C	85 Vh
2. Фокусиране на пробата	250 V	5,0 mA	2,5 W	8 °C	30 Vh
3. Фокусиране	1 200 V	10,0 mA	3,5 W	8 °C	80 Vh
4. Фокусиране	1 500 V	5,0 mA	7,0 W	8 °C	570 Vh

В стъпка 2 апликаторът на пробата се поставя на 0 Vh.

В стъпка 2 апликаторът на пробата се отстранява при 30 Vh.

6.4.   Оцветяване на протеин

6.4.1.   Фиксиране на протеин

Електродните ленти се отстраняват веднага след изключване на захранването и гелът незабавно се поставя в съд за оцветяване/обезцветяване, пълен с 200 ml фиксатор (4.9); оставя се за 15 минути, като непрекъснато се разклаща.

6.4.2.   Измиване и оцветяване на плочата с гел

Фиксаторът се отцежда внимателно и плочата с гел се измива два пъти за по 30 секунди, всеки път със 100 ml обезцветяващ разтвор (4.10). Обезцветяващият разтвор се излива и съдът се пълни с 250 ml оцветяващ разтвор (4.11.3); оставя се да се оцвети за 45 минути с леко разклащане.

6.4.3.   Обезцветяване на плочата с гел

Оцветяващият разтвор се излива, плочата с гел се измива два пъти, като всеки път се използва по 100 ml обезцветяващ разтвор (4.10), след това се разклаща с 200 ml обезцветяващ разтвор за 15 минути и обезцветяването се повтаря най-малко два или три пъти, докато основата стане чиста и безцветна. След това плочата с гел се изплаква с дестилирана вода (2 × 2 минути) и се изсушава на въздух (от 2 до 3 часа) или със сешоар (от 10 до 15 минути).

Забележка 1: Фиксирането, измиването, оцветяването и обезцветяването се извършват при 20 °C. Не се използват високи температури.

Забележка 2: Ако се предпочита по-чувствително оцветяване със сребро (напр. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code No 17—1150—01), пробите от казеин, третирани с плазмин, следва да бъдат разредени до 5 mg/ml

7.   ОЦЕНЯВАНЕ

Оценяването се извършва чрез сравняване на ивиците на протеините в непознатата проба с референтни проби върху същия гел. Откриването на краве мляко в сирена, произведени от овче мляко, козе мляко, биволско мляко, или смеси от овче, козе и биволско мляко се извършва чрез γ3- и γ2-казеини, чийто обхват на изоелектрически точки е между pH 6,5 и pH 7,5 (фигури 4 a, б, фигура 5). Границата на откриване е по-ниска от 0,5 %.

7.1.   Визуална оценка

За визуална оценка на количеството краве мляко се препоръчва да се адаптират концентрациите на пробите и стандартите за получаване на същото ниво на интензивност на овчи, кози и/или биволски γ2- и γ3-казеини (виж „γ2 E,G,B“ и „γ3 E,G,B“ на фигури 4 a и б и фигура 5). След това количеството на кравето мляко (по-малко от, равно на или по-голямо от 1 %) в непознатата проба може да бъде оценявано директно чрез сравняване на интензитета на краве γ3- и γ2-казеини (виж „γ3 C“ и „γ2 C“ на фигури 4 a, б и фигура 5) с тези на 0 % и 1 % референтни стандарти (овца, коза) или вътрешнолабораторни стандарти (биволица).

7.2.   Денсиметрична оценка

Ако е приложимо, за определянето на съотношението на площта на пика на краве спрямо овчи, кози и/или биволски γ2- и γ3-казеини (вж. фигура 5) се използва денсиметър (5.19). Тази стойност се сравнява със съотношението на площта на пика на γ2- и γ3-казеини от 1 % референтния стандарт (овца, коза) или вътрешнолабораторен стандарт (биволица), анализирани върху същия гел.

Забележка: Методът функционира задоволително, ако има ясен положителен сигнал за двата краве γ2- и γ3-казеина в 1 % референтния стандарт, но не и в 0 % референтния стандарт. Ако няма, процедурата се оптимизира, като точно се спазват детайлите на метода.

Пробата се оценява като положителна, ако двата краве γ2- и γ3-казеина или съответните съотношения на площта на пиковете са равни или по-големи от нивото на 1 % референтен стандарт.

8.   ЗА СПРАВКА

1.	Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708—711 (1990).

2.	Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83—85 (1995).

3.

Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp 389—393, Bode-Verlag, München (1989).

4.	Krause Ι., Belitz H.—D., Kaiser K.—P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195—199 (1982).

5.	Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50—100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43—56 (1980).

Фигура 1

Схематично представяне на покривния лист

Spacer tape

0,25 mm

Polyester sheet

6 mm

125 mm

280 mm

Фигура 2

Слой казеин между водната и органичната фази след центрофугиране

H2O-Phase

Casein

CH2Cl2-Phase

Фигура 3

Техника на захлупване за изливане на свръхтънки полиакриламидни гелове

a = разделителна лента (0,25 mm); b = покривен лист (5.3); c, e = стъклени плочи (5.1); d = разтвор на гел (4.1.2); f = лист носител на гел (5.2)

Фигура 4а

Изоелектрическо фокусиране на третирани с плазмин казеини от сирене, произведено от овче или от козе мляко, съдържащи различни количества краве мляко

% CM = процент краве мляко, C = крава, E = овца, G = коза

Показана е горната половина на гел IEF.

Фигура 4б

Изоелектрическо фокусиране на третирани с плазмин казеини от сирене, произведено от смеси от овче, козе и биволско мляко и съдържащо различни количества краве мляко

% CM = процент краве мляко; 1 + = проба, съдържаща 1 % краве мляко и прибавен чист краве казеин в средата на пътеката. C = крава, E = овца, G = коза, B = биволица

Показано е общото разстояние на разделяне на гела IEF.

Фигура 5

Наслагване на денситограмите на стандартните проби (STD) и пробите сирене, произведено от смес от овче и козе мляко, след изоелектрическо фокусиране

a,b = стандарти, съдържащи 0 и 1 % краве мляко; c-g = проби сирене, съдържащи 0, 1, 2, 3 и 7 % краве мляко. C = крава, E = овца, G = коза.

Сканирана е горната половина от гела IEF при λ = 634 nm.

---

(1)  Продуктите Ampholine® pH 3,5—9,5 (Pharmacia) и Resolyte® pH 5—7 и pH 6—8 (BDH, Merck) са се доказали като особено подходящи за получаване на необходимото отделяне на γ-казеини.

(2)  Поставяне на пробата: след предварителното фокусиране (стъпка 1) върху апликаторите на проби (10 × 5 mm) се капват 18 μl от пробата и от стандартните разтвори, поставят се върху гела на разстояние 1 mm един от друг и на 5 mm надлъжно от анода и се притискат леко. Извършва се фокусирането при горните условия, като апликаторите на проби се отстраняват внимателно след 60 минути фокусиране.