ПРИЛОЖЕНИЕ

към регламент на Комисията от 11 февруари 2008 година за определяне на фиксирани вносни стойности за определяне на входната цена на някои плодове и зеленчуци

(EUR/100 kg)
Код по КН	Кодове на трети страни (1)	Фиксирана вносна стойност
0702 00 00	IL	143,2
	MA	45,8
	MK	36,8
	TN	111,3
	TR	91,9
	ZZ	85,8
0707 00 05	EG	208,2
	JO	202,1
	MA	175,9
	TR	140,0
	ZZ	181,6
0709 90 70	MA	48,0
	TR	140,3
	ZZ	94,2
0709 90 80	EG	349,4
	ZZ	349,4
0805 10 20	EG	48,2
	IL	55,1
	MA	54,0
	TN	50,2
	TR	70,8
	ZZ	55,7
0805 20 10	IL	106,6
	MA	114,6
	TR	72,2
	ZZ	97,8
0805 20 30, 0805 20 50, 0805 20 70, 0805 20 90	CN	41,9
	EG	83,3
	IL	73,1
	JM	97,3
	MA	131,7
	TR	80,4
	ZZ	84,6
0805 50 10	EG	78,7
	IL	114,8
	MA	77,4
	TR	123,0
	ZZ	98,5
0808 10 80	CA	102,8
	CN	88,7
	MK	40,9
	US	114,4
	ZZ	86,7
0808 20 50	CN	68,2
	US	119,3
	ZA	106,6
	ZZ	98,0

---

(1)  Номенклатура на страните, определена с Регламент (ЕО) № 1833/2006 на Комисията (ОВ L 354, 14.12.2006 г., стр. 19). Код „ZZ“ означава „друг произход“.

ПРИЛОЖЕНИЕ

ЕНЗИМЕН МЕТОД ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА СКОРБЯЛА ИЛИ НИШЕСТЕ В ПРЕПАРАТИ ОТ ВИДОВЕТЕ, ИЗПОЛЗВАНИ ЗА ХРАНА НА ЖИВОТНИ, ЧРЕЗ ВИСОКОЕФЕКТИВНА ТЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЯ (HPLC)

1.   Обхват

Този метод описва ензимното определяне на съдържанието на скорбяла или нишесте в храната за животни. Количеството на скорбялата или нишестето се определя чрез количествено измерване на глюкозата след ензимно разпадане на наличните скорбяла или нишесте в глюкоза. Приема се, че цялото количество измерена глюкоза е извлечено от скорбялата или нишестето, съдържащи се в пробата.

2.   Определения

Този метод измерва съдържанието на скорбяла или нишесте и на продуктите от неговото разпадане, които имат висока молекулна маса и са неразтворими в 40-процентен етанол. Съдържанието на скорбяла или нишесте се изразява в тегловни проценти (m/m).

3.   Принцип

Пробите се хомогенизират посредством смилане. Пробата се промива с 40-процентен етанол, за да се отстранят разтворимите захари и разтворимите продукти от разпадането на скорбялата или нишестето.

Към суспензията се добавя ензимът термоустойчива алфа-амилаза. Този ензим разгражда скорбялата или нишестето на по-малки вериги при 100 °C, независимо от това дали скорбялата или нишестето са изцяло разтворени.

Големите бучки от скорбяла или нишесте се разпадат много бавно. Затова е необходимо пробата да е изцяло разтворена или да е под формата на суспензия, съдържаща много малки твърди частици.

След това се добавя вторият ензим — амилоглюкозидаза, който хидролизира разпаднатите глюкозни вериги в глюкоза при 60 °C.

След избистряне на течността и филтруване се отстраняват наличните протеини, мазнини и утайки, при което се получава разтвор, който може да се използва за HPLC.

Разделянето на съдържащите се захари се извършва чрез HPLC.

4.   Реактиви и други материали

Да се използват реактиви с доказани аналитични качества и деминерализирана вода.

4.1.   Етанол 40 % vol воден разтвор

4.2.   Глюкоза, мин. 99 %

4.3.   Разтвор на амилоглюкозидаза (1,4-алфа-D-глюкан глюкохидролаза) от Aspergillus niger (ензимна активност > 5 000 U/ml). Да се съхранява при около 4 °C

Като алтернатива може да се използва и амилоглюкозидаза на прах.

4.4.   Термоустойчива алфа-амилаза (1,4-алфа-D-глюкан-глюканохидролаза). Да се съхранява при около 4 °C

4.5.   Цинков ацетат дихидрат, чист за анализ

4.6.   Калиев хексацианоферат (II) (K4[Fe(CN)]6.3H2O), свръхчист

4.7.   Натриев ацетат, безводен, чист за анализ

4.8.   Ледена оцетна киселина, 100 % (v/v)

4.9.   Буферен разтвор на натриев ацетат (0.2 mol/l)

Измерете 16,4 грама натриев ацетат (4.7) в бехерова чаша. Разтворете във вода и прехвърлете количествено в мерителна колба от 1 000 мл. Разредете с вода до марката и регулирайте pH на 4,7 с оцетна киселина (като използвате pH-метър (5.11). Този разтвор може да се използва в рамките на 6 месеца, като се съхранява при температура от 4 °C.

4.10.   Разтвор на амилоглюкозидаза (ензимна активност > 250 U/ml)

Пригответе разтвор от 5 ml амилоглюкозидаза — разтвор (4.3), или 660 mg амилоглюкозидаза на прах до 100 ml, като използвате буферен разтвор на натриев ацетат (4.9). Пригответе непосредствено преди употреба.

4.11.   Референтен разтвор

Пригответе разтвор на глюкоза във вода, такъв какъвто се използва стандартно при HPLC анализа.

4.12.   Реактив за избистряне (Карез I)

Разтворете 219,5 грама цинков ацетат (4.5) с вода в бехерова чаша. Прехвърлете количеството в мерителна колба от 1 000 ml, добавете 30 ml оцетна киселина (4.8). Разбъркайте добре и долейте с вода. Този разтвор може да се използва в рамките на 6 месеца, като се съхранява при стайна температура.

Могат да се използват и други реактиви за избистряне, еквивалентни на Карез разтвор.

4.13.   Реактив за избистряне (Карез II)

Разтворете 106,0 грама калиев хексацианоферат (II) (4.6) с вода в бехерова чаша. Изсипете в мерителна колба от 1 000 ml. Смесете добре и долейте с вода. Този разтвор може да се използва в рамките на 6 месеца, като се съхранява при стайна температура.

Могат да се използват и други реактиви за избистряне, еквивалентни на Карез разтвор.

4.14.   Мобилна фаза

Подготвя се мобилна фаза, която се използва стандартно при HPLC анализа на захари. В случай че се използва например колона с пълнеж от аминопропил силикагел, обичайната мобилна фаза е смес от вода и ацетонитрил.

5.   Апаратура

5.1.   Стандартна лабораторна стъклария

5.2.   Центрофуга с вместимост от 1 000 g или повече (измерена в центъра на съдината)

5.3.   Центрофужни стъклени епруветки от 100 ml

5.4.   Магнитна бъркалка

5.5.   Магнитни перки

5.6.   Нагънати филтри, например 185 mm

5.7.   Филтри за спринцовки, 0,45 μm, подходящи за водни разтвори

5.8.   Шишенца за проби, подходящи за HPLC аутосамплер

5.9.   100 ml мерителни колби

5.10.   Пластмасови спринцовки, 5 и 10 ml

5.11.   pH-метър

5.12.   Водна баня с термостат, регулируем на 60 °C и 100 °C

5.13.   Котлони с магнитни бъркалки

5.14.   HPLC апарат

5.14.1.   Помпа, подходяща за нулева пулсация

5.14.2.   Аутосамплер

5.14.3.   Колона и предколона, подходяща за анализ на захари

5.14.4.   Кожух за колоните, с температурен диапазон от стайна температура до 40 °C

5.14.5.   Детектор, подходящ за анализ на захари, например детектор с рефрактивен индекс

5.14.6.   Интегрираща система

6.   Процедура

6.1.   Основно правило

Пробите се анализират поотделно.

6.2.   Подготвяне на проба за няколко вида продукти

Продуктът се хомогенизира чрез смилане.

6.3.   Порция за изпитване

Съдържанието на скорбяла или нишесте се изчислява с помощта на декларацията за съдържание. Количеството на порцията за изпитване (измерено с точност до 0,1 mg) може да се изчисли по следната формула:

6.4.   Определяне на празна проба

Празна проба се определя чрез извършване на цялостен анализ (както е описано в 6.5), без прибавяне на порцията за изпитване. Резултатът от измерването на празна проба се използва за изчисляване на съдържанието на нишесте (7.1).

6.5.   Анализ

6.5.1.   Подготовка на пробите

Разбъркайте пробата чрез разклащане и разбъркване. Избраната порция за изпитване (6.3) се претегля в центрофужна епруветка (5.3) и се добавят 50 ml етанол 40 % (4.1). Разбъркайте с магнитна бъркалка за 20 минути при стайна температура. Оставете магнитната перка в епруветката и центрофугирайте за пет минути. Отпипетирайте внимателно да премахнете течната фаза (например с пипета „Пастьор“). Повторете процедурата на екстрахиране с два пъти по 25 ml етанол (4.1). Прехвърлете остатъка в мерителна колба 100 ml (5.9) с около 70 ml вода. След разтварянето или получаването на суспензия добавете 100 микролитра термоустойчива алфа-амилаза (4.4) и загрейте до 100 °C за 1 час, например на водна баня (5.12). Охладете до 60 °С във водната баня и добавете 5 ml разтвор на амилоглюкозидаза (4.10). Поставете колбата за 30 минути на водна баня при 60 °C. Охладете до стайна температура, избистрете пробата, като добавите 1 ml Карез I (4.12), разклатете и след това добавете 1 ml Карез II (4.13). Карез I и II могат да се добавят преди или след охлаждането. Допълнете с вода до марката, хомогенизирайте и филтрувайте разтвора през нагънат филтър (5.6). Съберете екстракта от пробата.

6.5.2.   Обработване на екстракта от пробата

Филтрувайте през дисков филтър (5.7) със спринцовка (5.10), който е бил предварително промит с екстракта. Съберете филтрата в шишенца (5.8).

Забележка: Дисковият филтър може да се използва неколкократно. Трябва да се промива със следващия екстракт, за да се предотврати замърсяването на предишния.

6.6.   Хроматография

HPLC се използва като конвенционален метод за анализ на захари. Тъй като пробите се извличат с етанол/вода, глюкозата е основната захар, която се изследва. Ако HPLC анализът покаже следи от малтоза, това може да означава непълно превръщане на нишестето.

7.   Изчисляване и изразяване на резултатите

7.1.   Изчисляване на резултатите от HPLC

Съдържанието на глюкоза (%, m/m) се изчислява на базата на резултатите от HPLC анализа. Ензимният разтвор на амилоглюкозидаза (4.3) се стабилизира с глюкоза. Освен това термоустойчивата алфа-амилаза (4.4) се стабилизира със захароза, която може частично да се превърне в глюкоза чрез инвертазна активност на амилоглюкозидазата. Следователно измерената концентрация на глюкоза (%, m/v) трябва да се коригира с концентрацията на глюкоза (%, m/v) в празната проба. Съдържанието на глюкоза (%, m/m), коригирана с празната проба, се изчислява от коригираната глюкозна концентрация, теглото на пробата и калибрирането с референтни разтвори (4.11).

7.2.   Изчисляване на съдържанието на скорбяла или нишесте

Съдържанието на скорбяла или нишесте (%, m/m) се изчислява от съдържанието на глюкоза (%, m/m) след корекцията, която отчита контролното измерване.

Съдържание на скорбяла или нишесте = 0,9 * коригирана глюкоза

8.   Прецизност

8.1.   Междулабораторно изпитване

Данните от междулабораторното изпитване относно прецизността на метода са обобщени в 8.4.

8.2.   Повторяемост

Абсолютната разлика между два независими единични тестови резултата, получени чрез използването на един и същ метод върху идентичен тестов материал, в една и съща лаборатория, от един и същ оператор, чрез използването на едно и също оборудване, в кратък интервал от време, не трябва да надвишава границата на повторяемост от 1,.1 % (m/m) в повече от 5 % от случаите. Границата на повторяемост е определена на базата на обобщени резултати от междулабораторно изпитване (вж. 8.4).

8.3.   Възпроизводимост

Абсолютната разлика между два независими единични тестови резултата, получени чрез използването на един и същ метод върху идентичен тестов материал, в различни лаборатории, от различни оператори, при използване на различно оборудване, не трябва да надвишава границата на възпроизводимост от 3,7 % (m/m) в повече от 5 % от случаите. Границата на възпроизводимост е определена на базата на обобщени резултати от междулабораторно изпитване (вж. 8.4).

8.4.   Резултати от междулабораторно изпитване

През 2005 и 2006 г. беше проведено междулабораторно изпитване с участието на европейските митнически лаборатории. Този тест беше извършен в съответствие с ISO 5725 и протокола IUPAC (W. Horwitz, Pure and Applied Chemistry, том. 67, 1995 г., стр. 331—343). Данните относно прецизността са дадени в таблицата по-долу.

Статистически резултати от междулабораторно изследване

	Проба
	1	2	3	4	5
Брой лаборатории след елиминиране на отдалечените стойности	25	26	26	25	24
Брой приети резултати	50	52	52	50	48
Средно съдържание на скорбяла или нишесте (%, m/m)	31,2	14,4	25,1	12,9	27,8
Стандартно отклонение при повторяемост sr (%, m/m)	0,4	0,3	0,6	0,2	0,3
Граница на повторяемост r (%, m/m)	1,1	0,8	1,7	0,7	0,9
Стандартно отклонение при възпроизводимост sR (%, m/m)	1,7	0,8	1,7	0,9	1,3
Граница на възпроизводимост R (%, m/m)	4,8	2,2	4,7	2,5	3,7
Проби 1 : суха кучешка храна 2 : суха котешка храна 3 : суха котешка храна (проба 2) с добавено нишесте 4 : суха котешка храна (проба 2) с добавени резенки от цвекло 5 : фабрична храна за домашни животни