относно методите за анализ, необходими за проверка на състава на козметичните продукти

като взе предвид Договора за създаване на Европейската общност,

като взе предвид Директива 76/768/ЕИО на Съвета от 27 юли 1976 г. относно сближаването на законодателствата на държавите-членки, свързана с козметични продукти (1), последно изменена с Директива 94/32/ЕО на Комисията (2), и по-специално член 8, параграф 1 от нея,

като има предвид, че Директива 76/768/ЕИО регламентира условията за официално изследване на козметичните продукти с цел да се гарантира, че разпоредбите на Комисията по отношение състава на козметичните продукти са изпълнени;

като има предвид, че всички необходими методи за анализ трябва да бъдат въведени в най-кратък срок; като има предвид, че такива методи са вече приети с Директива 80/1335/ЕИО на Комисията (3), изменена с Директива 87/143/ЕИО (4), 82/434/ЕИО (5), изменена с Директиви 90/207/ЕИО (6), 83/514/ЕИО (7), 85/490/ЕИО (8) и 93/73/ЕИО (9);

като има предвид, че идентификацията и определянето на бензоена киселина, 4-хидроксибензоена киселина, сорбинова киселина, салицилова киселина и пропионова киселина, както и идентификацията и определянето на хидрохинон, хидрохинон монометилов етер, хидрохинон моноетилов етер и хидрохинон монобензилов етер представляват една шеста стъпка в тази насока;

като има предвид, че предвидените в тази директива мерки са в съответствие със становището на Комитета по адаптиране на Директива 76/768/ЕИО към техническия прогрес,

Държавите-членки предприемат всички необходими действия, с които да гарантират, че по време на официалното изследване на козметичните продукти:

се провеждат в съответствие с описаните в приложението методи.

1. Държавите-членки въвеждат в сила всички необходими законови, подзаконови и административни разпоредби, за да се съобразят с настоящата директива, не по-късно от 30 септември 1996 г. Те уведомяват незабавно Комисията за това.

Когато държавите-членки приемат тези разпоредби, в тях се съдържа позоваване на тази директива или то се прави по време на официалното им публикуване. Начинът на това позоваване се определя от държавите-членки.

2. Държавите-членки съобщават на Комисията разпоредбите от националните си законодателства, които те приемат в областта, обхваната от настоящата директива.

Настоящата директива влиза в сила на двадесетия ден след публикуването ѝ в Официален вестник на Европейските общности.

Адресати на настоящата директива са държавите-членки.

Съставено в Брюксел на 7 юли 1995 година.

За Комисията

Emma BONINO

Член на Комисията

I. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОПРЕДЕЛЯНЕ НА БЕНЗОЕНА КИСЕЛИНА, 4-ХИДРОКСИБЕНЗОЕНА КИСЕЛИНА, СОРБИНОВА КИСЕЛИНА, САЛИЦИЛОВА КИСЕЛИНА И ПРОПИОНОВА КИСЕЛИНА В КОЗМЕТИЧНИ ПРОДУКТИ

Методът се прилага за идентификация и определяне на бензоена киселина, 4-хидроксибензоена киселина, сорбинова киселина, салицилова киселина и пропионова киселина в козметични продукти. Отделни процедури описват идентификацията на тези консерванти; определянето на пропионова киселина, 4-хидроксибензоена киселина, салицилова киселина, сорбинова киселина и бензоена киселина.

Количествата на бензоена киселина, 4-хидроксибензоена киселина, сорбинова киселина, салицилова киселина и пропионова киселина, определени по този метод, се изразяват като процент от масата на свободните киселини.

След киселинно-основна екстракция на консервантите екстрактът се анализира чрез тънкослойна хроматография (ТСХ), използвайки непосредствена дериватизация. В зависимост от резултатите идентификацията се потвърждава чрез високоефективна течна хроматография (ВЕТХ) или за пропионовата киселина - чрез газова хроматография.

Всички реактиви трябва да са с квалификация „чист за анализ“ (ч.з.а.), водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

Приготвят се 0,1 % (m/V) разтвори (100 mg/100 ml) от всеки от петте консерванта (2.13 до 2.17) в диетилов етер.

0,5 % (m/V) разтвор на 2-бром-2′-ацетонафтон (2.12) в ацетонитрил (2.4) (50 mg/10 ml). Този разтвор се приготвя всяка седмица и се съхранява в хладилник.

0,3 % (m/V) разтвор на литиев карбонат (2.11) във вода (300 mg/100 ml). Този разтвор се приготвя непосредствено преди употреба.

3.1. Водна баня, която може да поддържа температура 60 °С

3.4. Плаки за тънкослойна хроматография Kieselgel 60 - без флуоресцентен индикатор, 20 × 20 cm, дебелина на слоя 0,25 mm, с концентрираща зона 2,5 × 20 cm (Merck 11 845 или еквивалентни)

3.7. Сушилня, която може да поддържа температура 105 °С

3.8. Стъклени епруветки 50 ml със запушалки на винт

3.9. Филтърна хартия - диаметър 90 mm, Schleicher & Schull, Weissband № 5892 или еквивалентна

3.10. Универсална рН-индикаторна хартия - рН 1-11

3.12. Ротационен изпарител (Rotavapor или еквивалентен)

В стъклена епруветка 50 ml (3.8) се претегля около 1 g от пробата. Прибавят се 4 капки 4 M солна киселина (2.8) и 40 ml ацетон (2.2). За силно алкални продукти като тоалетни сапуни е необходимо да се прибавят 20 капки 4 М солна киселина (2.8). Проверява се стойността на рН дали е около 2 с индикаторна хартия (3.10). Епруветката се запушва и се разклаща енергично в продължение на 1 min.

Ако е необходимо да се улесни екстрахирането на консервантите в ацетоновата фаза, сместа се нагрява леко до около 60 °С за стопяване на течната фаза.

Разтворът се охлажда до стайна температура и се филтрува през филтърна хартия (3.9) в конична колба.

20 ml от филтрата се прехвърлят в конична колба 200 ml, прибавят се 20 ml вода и се разбърква. рН на сместа се довежда до около 10 с 4 М калиева основа (2.9), като за измерване на рН се използва индикаторна хартия (3.10).

Прибавя се 1 g калциев хлорид (2.10) и се разклаща енергично. Филтрува се през филтърна хартия (3.9) в делителна фуния от 250 ml, съдържаща 75 ml диетилов етер (2.3), и се разклаща енергично в продължение на 1 min. Оставя се да се разделят слоевете и водният слой се излива в конична колба 250 ml. Етерният слой се отстранява. Като се използва индикаторна хартия (3.10), рН на водния слой се довежда до около 2 с помощта на 4 М солна киселина (2.8). Прибавят се 10 ml диетилов етер (2.3), колбата се запушва и се разбърква енергично в продължение на 1 min. Оставя се да се разделят слоевете и етерният слой се прехвърля в ротационен изпарител (3.12). Водният слой се изхвърля.

Етерният слой се изпарява почти до сухо и остатъкът се разтваря в 1 ml диетилов етер (2.3). Разтворът се прехвърля в шишенце за проби (3.11).

За всички стандартни разтвори и от проби, които ще се хроматографират, се нанасят със спринцовка (3.5) по около 3 µl от разтвора на литиев карбонат (2.20) на еднакви разстояния върху стартовата линия на концентриращата зона на плаката за ТСХ (3.4) и тя се изсушава в поток от студен въздух.

Плаката се поставя върху нагревателната плоча (3.13), загрята до 40 °С, за да останат петната колкото е възможно по-малки. С микроспринцовка (3.5) точно върху петната от литиев карбонат се нанасят по 10 µl от стандартните разтвори (2.18) и от разтвора на пробата (4.1) върху стартовата линия на плаката.

Накрая се нанасят по около 15 µl от реактива за дериватизация (2.19) (2-бром-2′-ацетонафтон) отново точно върху петната, където са нанесени стандартните разтвори/разтворът на пробата, както и разтворът на литиев карбонат.

Плаката се нагрява в сушилня (3.7) при температура 80 °С в продължение на 45 min. След охлаждане плаката се поставя в хроматографската вана (3.2), която предварително е доведена до равновесие за 15 min (без да се прилага облицоване с филтърна хартия) с подвижната фаза 2.21 (толуен/ацетон). Плаката престоява, докато фронтът на разтворителя достигне разстояние 15 cm от стартовата линия (това може да отнеме приблизително 80 min).

Плаката се изсушава в поток от студен въздух и получените петна се изследват под УВ светлина (3.3). За засилване на флуоресценцията на бледите петна плаката може да се потопи в смес от течен парафин и n-хексан (2.22).

Сравнява се Rf-стойността и поведението при УВ-облъчване на петната от пробата и петната от стандартните разтвори.

Прави се предварително заключение относно присъствието и идентичността на наличните консерванти. Провежда се ВЕТХ, описана в раздел Б, или ако се докаже наличието на пропионова киселина - газова хроматография (ГХ), описана в раздел В. Сравняват се получените времена на задържане с тези на стандартните разтвори.

Обобщават се резултатите от ТСХ, ВЕТХ или ГХ и на тази база се определя окончателната идентификация на присъстващите в пробата консерванти.

Б. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА БЕНЗОЕНА КИСЕЛИНА, 4-ХИДРОКСИБЕНЗОЕНА КИСЕЛИНА, СОРБИНОВА КИСЕЛИНА И САЛИЦИЛОВА КИСЕЛИНА

След подкисляване пробата се екстрахира със смес от етанол и вода. След филтруване консервантите се определят посредством високоефективна течна хроматография (ВЕТХ).

2.1. Всички реактиви трябва да са с квалификация „чист за анализ“ (ч.з.а.), а където е необходимо - с чистота „за ВЕТХ“. Използваната вода трябва да бъде дестилирана или с еквивалентна чистота.

Смесват се девет обема етанол (2.2) и един обем вода (2.1)

Приготвя се разтвор, който съдържа около 1 g 2-метоксибензоена киселина (2.12) в 500 ml смес етанол/вода (2.13).

2.15.1. Ацетатен буфер: към 1 l вода се прибавят 6,35 g натриев ацетат (2.7) и 20,0 ml оцетна киселина (2.8) и се разбърква.

2.15.2. Подвижната фаза се приготвя чрез смесване на 9 обема ацетатен буфер (2.15.1) и един обем ацетонитрил (2.9).

Претеглят се с точност 0,001 g около 0,05 g 4-хидроксибензоена киселина (2.3), 0,2 g салицилова киселина (2.4), 0,2 g бензоена киселина (2.5) и 0,05 g сорбинова киселина (2.6) в мерителна колба от 50 ml и се долива до марката със смес етанол/вода (2.13). Разтворът се съхранява в хладилник и е стабилен в продължение на една седмица.

В серия от мерителни колби от 20 ml се поставят съответно 8,00, 4,00, 2,00, 1,00 и 0,50 ml от основния разтвор (2.16). Във всяка колба се прибавят по 10,00 ml от разтвора за вътрешен стандарт (2.14) и по 0,5 ml 2 М сярна киселина (2.10). Допълва се до марката със смес етанол/вода (2.13). Тези разтвори се приготвят непосредствено преди употреба.

3.2. Високоефективен течен хроматограф с УВ детектор с променлива дължина на вълната и 10 µl дозираща капиляра.

Неръждаема стомана, дължина: 12,5 до 25 cm, вътрешен диаметър: 4,6 mm, пълнеж: Nucleosil 5C18 или еквивалентен.

3.4. Филтърна хартия - диаметър 90 mm, Schleicher & Schull, Wiessband № 5892 или еквивалентна.

3.5. Стъклени епруветки от 50 ml със запушалки на винт

3.7. Парченца карборунд за кипене, размер 2 до 4 mm или еквивалентни

4.1.1. Приготвяне на проба без добавяне на вътрешен стандарт

В стъклена епруветка (3.5) 50 ml се претегля 1 g от пробата с точност до 0,001 g. С пипета в епруветката се прибавя 1,00 ml 2 М сярна киселина (2.10) и 40 ml смес етанол/вода (2.13). Прибавя се около 1 g карборунд (3.7), епруветката се затваря и се разклаща енергично поне 1 минута, докато се получи хомогенна суспензия. За улесняване екстракцията на консервантите в етанолната фаза епруветката се поставя във водна баня (3.1), нагласена на 60 °С, точно за 5 минути.

Епруветката незабавно се охлажда със студена вода и екстрактът престоява 1 час при температура 5 °С, след което се филтрува през филтърна хартия (3.4).

Около 2 ml от екстракта се прехвърлят в шишенце за проби (3.6). Екстрактът се съхранява при 5 °С и се анализира чрез ВЕТХ в рамките на 24 часа от приготвянето.

4.1.2. Приготвяне на проба с добавяне на вътрешен стандарт

В стъклена епруветка от 50 ml (3.5) се претегля 1 g от пробата с точност до 0,001 g. С пипета в епруветката се прибавя 1,00 ml 2 М сярна киселина (2.10) и 30 ml смес етанол/вода (2.13). Прибавя се около 1 g карборунд (3.7) и 10,00 ml разтвор за вътрешен стандарт (2.14), епруветката се затваря и се разклаща енергично поне 1 минута, докато се получи хомогенна суспензия. За улесняване екстракцията на консервантите в етанолната фаза епруветката се поставя във водна баня при 60 °С точно за 5 минути.

Епруветката незабавно се охлажда със студена вода и екстрактът престоява 1 час при температура 5 °С,

след което се филтрува през филтърна хартия (3.4). Около 2 ml от екстракта се прехвърлят в шишенце за проби (3.6). Екстрактът се съхранява при 5 °С и се анализира чрез ВЕТХ в рамките на 24 часа от приготвянето.

Подвижна фаза - ацетонитрил/ацетатен буфер (2.15).

Скоростта на подвижната фаза през колоната се нагласява на 2,0 ± 0,5 ml/min. Детекторът се настройва на 240 nm.

В течния хроматограф (3.2) се дозират по 10 µl от всеки от стандартните разтвори на консервантите (2.17). За всеки разтвор се определя отношението между височината на пиковете на изследваните консерванти към височината на пика на вътрешния стандарт, получени от хроматограмите. Построява се графика за всеки консервант, като се нанасят отношенията на височините на пика спрямо съответните концентрации на всеки стандартен разтвор.

Проверява се дали получените зависимости за всеки стандартен разтвор са линейни.

В течния хроматограф (3.2) се дозират 10 µl от екстракта на пробата (4.1.1) и се записва хроматограмата. Дозират се 10 µl от стандартния разтвор на консерванти (2.17) и се записва хроматограмата. Сравняват се получените хроматограми. Ако в хроматограмата на екстракта на пробата (4.1.1) няма пик с приблизително същото време на задържане както това на 2-метоксибензоената киселина (препоръчвания вътрешен стандарт), в течния хроматограф се дозират 10 µl от екстракта на пробата с добавен вътрешен стандарт (4.1.2) и се записва хроматограмата.

Ако на хроматограмата на екстракта от пробата (4.1.1) се наблюдава пречещ пик, който има време на задържане като на 2-метоксибензоената киселина, трябва да се избере друг подходящ вътрешен стандарт. (Ако един от изследваните консерванти отсъства от хроматограмата, този консервант може да бъде използван като вътрешен стандарт).

Получените хроматограми на стандартния разтвор и на разтвора на пробата трябва да отговарят на следните изисквания:

За изчисляване на концентрацията на киселините-консерванти в разтвора на пробата се използват отношенията на височините на пиковете на изследваните консерванти към височината на пика на вътрешния стандарт (2-метоксибензоена киселина) от стандартната крива. Съдържанието на бензоена киселина, 4-хидроксибензоена киселина, сорбинова киселина или салицилова киселина се изчислява в проценти от масата (xi) по формулата:

b= концентрацията на консерванта в екстракта на пробата (4.1.2), получена от стандартната крива, в mg/ml.

За съдържание на 4-хидроксибензоена киселина от 0,40 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля по абсолютна стойност 0,035 %.

За съдържание на бензоена киселина от 0,50 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля по абсолютна стойност 0,050 %.

За съдържание на салицилова киселина от 0,50 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля по абсолютна стойност 0,045 %.

За съдържание на сорбинова киселина от 0,60 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля по абсолютна стойност 0,035 %.

7.1. Резултатите от проведения тест за допустими отклонения от методиката показват, че количеството сярна киселина, която се добавя при екстракцията на киселините от пробата, е критично и границите за количеството на обработваната проба трябва да се поддържат в посочения интервал.

7.2. По желание може да се използва подходяща предколона.

Този метод е подходящ за определяне на пропионова киселина с максимална концентрация 2 % (m/m) в козметични продукти.

Концентрацията на пропионова киселина, измерена по този метод, се изразява като процент (m/m) от масата на продукта.

След екстракция на пропионовата киселина от продукта определянето се извършва чрез газова хроматография с използване на 2-метилпропионова киселина като вътрешен стандарт.

Всички реактиви трябва да са с квалификация „чисти за анализ“ (ч.з.а.). Използваната вода е дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.5. Стандартен разтвор на пропионова киселина

В мерителна колба 50 ml се претегля около 1,00 g (p грама) с точност 0,001 g пропионова киселина и се долива до марката с етанол (4.1).

В мерителна колба 50 ml се претегля около 1,00 g (е грама) с точност 0,001 g 2-метилпропионова киселина и се долива до марката с етанол (4.1).

5.2. Газов хроматограф с пламъчно-йонизационен детектор

5.3. Стъклена епруветка (2 × 15 cm) със запушалка на винт

5.5. Стъклена спринцовка 10 ml с мембранен филтър (диаметър на порите 0,45 µm)

6.1.1. Приготвяне на проба без вътрешен стандарт

В стъклена епруветка (5.3) се претегля около 1 g с точност 0,001 g от пробата. Прибавят се 0,5 ml фосфорна киселина (4.4) и 9,5 ml етанол (4.1).

Епруветката се затваря и се разклаща енергично. Ако е необходимо, епруветката се поставя на водна баня, нагрята до 60 °С (5.4), за 5 min за пълно разтваряне на липидната фаза. Охлажда се бързо на течаща вода. Част от разтвора се филтрува през мембранен филтър (5.5). Филтратът се хроматографира същия ден.

6.1.2. Приготвяне на проба с вътрешен стандарт

В стъклена епруветка (5.3) се претегля 1 g (а грама) с точност 0,001 g от пробата. Прибавят се 0,5 ml фосфорна киселина (4.4), 0,50 ml от разтвора за вътрешен стандарт (4.6) и 9,0 ml етанол (4.1).

Епруветката се затваря и се разклаща енергично. Ако е необходимо, епруветката се поставя на водна баня, нагрята до 60 °С (5.4), за 5 min за разтваряне на липидната фаза. Охлажда се бързо на течаща вода. Част от разтвора се филтрува през мембранен филтър (5.5). Филтратът се хроматографира същия ден.

В серия мерителни колби от 20 ml се поставят съответно 0,25, 0,50, 1,00, 2,00 и 4,00 ml разтвор на пропионова киселина (4.5). Във всяка колба се добавя с пипета 1,00 ml от разтвора за вътрешен стандарт (4.6), долива се до марката с етанол (4.1) и се разбърква. Приготвените по този начин разтвори съдържат е mg/ml 2-метилпропионова киселина като вътрешен стандарт (т.е. 1 mg/ml, ако е = 1 000) и р/4, р/2, р, 2р и 4р mg/ml пропионова киселина (т.е. 0,25, 0,50, 1,00, 2,00 и 4,00 mg/ml, ако р = 1 000).

Инжектират се по 1 µl от всеки от тези разтвори и се построява стандартна крива, като на абсцисата се нанасят отношенията на масите на пропионовата киселина към 2-метилпропионовата киселина, а по ординатата - отношенията на съответните площи на пиковете им.

За всеки разтвор се правят по три инжектирания и се изчислява средната площ на пиковете.

Инжектира се 1 µl от филтрата на пробата 6.1.1. Получената хроматограма се сравнява с тези на стандартните разтвори (6.3.1). Ако пикът има приблизително същото време на задържане както 2-метилпропионовата киселина, се сменя вътрешният стандарт. Ако не се наблюдава интерференция, се инжектира 1 µl от филтрата на пробата (6.1.2) и се измерват площите на пика на пропионовата киселина и на пика на вътрешния стандарт.

Правят се три инжектирания за всеки разтвор и се изчислява средната площ на пиковете.

7.1. От стандартната крива, получена в 6.3.1, се отчита отношението на масите (К), съответстващо на отношението на площите на пиковете, получени в 6.3.2.

7.2. От така полученото отношение на масите се изчислява съдържанието на пропионова киселина (X) в проценти от масата, като се използва формулата:

е= масата на вътрешния стандарт, получена в 4.6, в g,

За съдържание на пропионова киселина от 2 % (m/m) разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава 0,12 %.

II. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ХИДРОХИНОН, ХИДРОХИНОН МОНОМЕТИЛОВ ЕТЕР, ХИДРОХИНОН МОНОЕТИЛОВ ЕТЕР И ХИДРОХИНОН МОНОБЕНЗИЛОВ ЕТЕР В КОЗМЕТИЧНИ ПРОДУКТИ

Методът се прилага за откриване и идентификация на хидрохинон, хидрохинон монометилов етер, хидрохинон моноетилов етер и хидрохинон монобензилов етер (монобензон) в козметични продукти за избелване на кожата.

Хидрохинонът и неговите етери се идентифицират чрез тънкослойна хроматография (ТСХ).

Всички реактиви трябва да са с квалификация „чист за анализ“ (ч.з.а.).

3.10. Хидрохинон монобензилов етер (монобензон)

Стандартните разтвори трябва да бъдат приготвени непосредствено преди употреба и са стабилни един ден.

3.11.1. В градуирана епруветка от 10 ml се претеглят 0,05 g хидрохинон (3.7). Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 ml етанол (3.1). Добавя се амоняк (3.5), докато рН достигне 10, и се долива до обем 10 ml с етанол (3.1).

3.11.2. В градуирана епруветка от 10 ml се претеглят 0,05 g хидрохинон монометилов етер (3.8). Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 ml етанол (3.1). Добавя се амоняк (3.5), докато рН достигне 10, и се долива до обем 10 ml с етанол (3.1).

3.11.3. В градуирана епруветка от 10 ml се претеглят 0,05 g хидрохинон моноетилов етер (3.9). Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 ml етанол (3.1). Добавя се амоняк (3.5), докато рН достигне 10, и се долива до обем 10 ml с етанол (3.1).

3.11.4. В градуирана епруветка от 10 ml се претеглят 0,05 g хидрохинон монобензилов етер (3.10). Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 ml етанол (3.1). Добавя се се амоняк (3.5), докато рН достигне 10, и се долива до обем 10 ml с етанол (3.1).

Към 5 % (m/V) воден разтвор на сребърен нитрат (3.12) се прибавя амоняк (3.5), докато образувалата се утайка се разтвори.

Разтворът става експлозивно нестабилен при престояване и след употреба трябва да се изхвърли.

3.16.2. 10 % (m/V) разтвор на 12-молибденфосфорна киселина (3.13) в етанол (3.1).

3.16.3. Приготвя се 1 % (m/V) воден разтвор на калиев ферицианид (3.14) и 2 % (m/V) воден разтвор на ферихлорид (3.15). Преди употреба се смесват равни части от двата разтвора.

4.2. Готови плаки за ТСХ - силикагел GHR/UV254; 20 × 20 cm (Machery, Nagel или еквивалентни); дебелина на слоя: 0,25 mm

В градуирана епруветка от 10 ml се претеглят 3,0 g от пробата. Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 ml етанол (3.1). Добавя се амоняк (3.5), докато рН достигне 10, и се долива до обем 10 ml с етанол (3.1). Епруветката се затваря със запушалка и се хомогенизира в ултразвукова вана за 10 min. Филтрува се през филтърна хартия или се центрофугира при 3 000 rpm.

5.2.1. Хроматографската вана се насища с подвижна фаза (3.4).

5.2.2. Върху плаката се нанасят по 2 µl от стандартните разтвори (3.11) и 2 µl от разтвора на пробата (5.1). Хроматограмата се проявява на тъмно при стайна температура, докато фронтът на разтворителя достигне разстояние 15 cm от стартовата линия.

5.2.3. Плаката се изважда и се изсушава при стайна температура.

5.3.1. Плаката се изследва под УВ светлина при 254 nm и се отбелязва разположението на петната.

5.3.2. Плаката се напръсква с един от следните реактиви:

Сравняват се петната, получени от разтвора на пробата, с петната на стандартните разтвори по отношение на: техните Rf-стойности, цвета на петната при УВ облъчване и цвета на петната след оцветяване с реактивите за напръскване.

Прилага се ВЕТХ, описана в раздел (Б), и се сравняват времената на задържане на пика (пиковете) на пробата с тези на стандартните разтвори.

Обобщават се резултатите от ТСХ и ВЕТХ, за да се потвърди присъствието на хидрохинон и/или неговите етери.

При описаните условия се наблюдават следните Rf-стойности:

Методът се прилага за определяне на хидрохинон, хидрохинон монометилов етер, хидрохинон моноетилов етер и хидрохинон монобензилов етер в козметични продукти за избелване на кожата.

Пробата се екстрахира със смес вода/метанол при слабо нагряване до стопяване на всички липидни материали. Всички търсени вещества се определят посредством течна хроматография с обърнати фази и УВ детектор.

3.1. Всички реактиви трябва да са с квалификация „чисти за анализ“ (ч..з.а.), а водата – дестилирана или поне с еквивалентна чистота.

3.6. Хидрохинон монобензилов етер (монобензон)

3.8. Смес вода/метанол = 1:1 (V/V). Смесват се един обем вода с един обем метанол (3.2).

3.9. Подвижна фаза - смес: тетрахидрофуран/вода = 45:55 (V/V). Смесват се 45 обема тетрахидрофуран (3.7) и 55 обема вода.

В мерителна колба 50 ml се претеглят с точност 0,06 g хидрохинон (3.3), 0,08 g хидрохинон монометилов етер (3.4), 0,10 g хидрохинон моноетилов етер (3.5) и 0,12 g хидрохинон монобензилов етер (3.6). Разтварят се и се долива до марката с метанол (3.2). Стандартният разтвор се приготвя чрез разреждане на 10,00 ml от този разтвор до 50,00 ml със смес вода/метанол (3.8). Тези разтвори се приготвят непосредствено преди употреба.

4.2. Високоефективен течен хроматограф с УВ детектор с променяща се дължина на вълната и дозатор с 10 µl капиляра

Хроматографска колона от неръждаема стомана, дължина 250 mm, вътрешен диаметър 4,6 mm, пълнеж Zorbax фенил (химически свързан фенетилсилан върху Zorbax SIL, допълнително дезактивиран (end-capped) с триметилхлорсилан), размер на частиците 6 µm или еквивалентен. Да не се използва предколона, различна от „phenyl guard“ или еквивалентна.

4.4. Филтърна хартия, диаметър 90 mm, Schleicher & Schull, Weissband, № 5892 или еквивалентна.

В мерителна колба 50 ml се претегля 1 g от пробата (а грама) с точност до 0,001 g. Пробата се диспергира в 25 ml смес вода/метанол (3.8). Колбата се запушва и се разклаща енергично до получаване на хомогенна суспензия. Разклаща се в продължение поне на 1 min. Колбата се поставя във водна баня (4.1) при 60 °С за ускоряване на екстракцията, след което се охлажда и долива до марката със смес вода/метанол (3.8). Екстрактът се филтрува с филтърна хартия (4.4). ВЕТХ определянето трябва да се извърши в рамките на 24 часа от приготвянето на екстракта.

5.2.1. Скоростта на подвижната фаза (3.9) се нагласява на 1,0 ml/min, а дължината на вълната на детектора се настройва на 295 nm.

5.2.2. Дозират се 10 µl от разтвора на пробата, получен съгласно описанието в 5.1, и се записва хроматограмата. Измерва се площта на пиковете. Извършва се калибриране, както е описано в 5.2.3. Сравняват се хроматограмите, получени за пробата и за стандартния разтвор. Използват се площите на пиковете и коефициентите на детектора (RF), получени съгласно 5.2.3, за изчисляване на концентрациите на анализираните вещества в разтвора на пробата.

Инжектират се 10 µl от стандартния разтвор (3.10) и се записва хроматограмата. Инжектирането продължава, докато се получи постоянна площ на пика.

За изчисляване на концентрацията (концентрациите) на анализираното вещество (вещества) в пробата се използват площите на пиковете на анализираните вещества. Концентрацията на анализираното вещество в пробата се изчислява като процент от масата (xi) по формулата:

7.1. За съдържание на хидрохинон от 2,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,13 %.

7.2. За съдържание на хидрохинон монометилов етер от 1,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,1 %.

7.3. За съдържание на хидрохинон моноетилов етер от 1,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,11 %.

7.4. За съдържание на хидрохинон монобензилов етер от 1,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,11 %.

8.1. За съдържание на хидрохинон от 2,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба при различни условия (различни лаборатории, различни аналитици, различни апарати и/или различно време) не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,37 %.

8.2. За съдържание на хидрохинон монометилов етер от 1,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба при различни условия (различни лаборатории, различни аналитици, различни апарати и/или различно време) не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,21 %.

8.3. За съдържание на хидрохинон моноетилов етер от 1,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба при различни условия (различни лаборатории, различни аналитици, различни апарати и/или различно време) не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,19 %.

8.4. За съдържание на хидрохинон монобензилов етер от 1,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба при различни условия (различни лаборатории, различни аналитици, различни апарати и/или различно време) не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,11 %.

9.1. Когато се установи съдържание на хидрохинон, значително по-голямо от 2 %, и се изисква по-прецизна оценка на съдържанието му, екстрактът от пробата (5.1) трябва да се разреди до концентрацията, която би се получила от проба, съдържаща 2 % хидрохинон, след което определянето се повтаря.

(При някои апарати абсорбцията може да бъде извън интервала на линейност на детектора при високи концентрации на хидрохинон.)

Описаният метод дава възможност за определяне на хидрохинон и неговите етери при единично изократично хроматографиране. Използването на „фенил“ колона осигурява достатъчно време на задържане на хидрохинона, което не може да се гарантира при използването на С18 колона с описаната подвижна фаза.

Освен това методът е податлив на интерференции от редица парабени. В тези случаи определянето се повтаря, като се използват различни системи подвижна/неподвижна фаза. Подходящи методи могат да бъдат намерени в позовавания 1 и 2, а именно:

Тези условия са подходящи за хидрохинона (4).

(3) M. Herpol-Borremans et M.-O. Masse, Identification et dosage de l'hydroquinone et de ses éthers méthylique et benzylique dans les produits cosmétiques pour blanchir la peau. Int. j. Cosmet. Sci. 8-203-214 (1986).

(4) J. Firth and I. Rix, Determination of hydroquinone in skin toning creams, Analyst (1986), 111, p. 129.

pi	=	площта на пика на хидрохинона, хидрохинон монометиловия етер, хидрохинон моноетиловия етер или хидрохинон монобензиловия етер,
c i	=	концентрацията на стандартния разтвор (3.10) на хидрохинона, хидрохинон монометиловия етер, хидрохинон моноетиловия етер или хидрохинон монобензиловия етер в g/50 ml.

а	=	масата на пробата в g;
bi	=	площта на пика на анализираното вещество в пробата.

хидрохинон	0,32
хидрохинон монометилов етер	0,53
хидрохинон моноетилов етер	0,55
хидрохинон монобензилов етер	0,58