ПРИЛОЖЕНИЕ
Приложенията към Регламент за изпълнение (ЕС) 2016/1240 се изменят, както следва:
|
1) |
Приложение IV се изменя, както следва:
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
2) |
В приложение V се вмъква следната част Iа: „ЧАСТ Iа Методи за анализ на обезмаслено мляко на прах за публична интервенция
Допълнение I ОБЕЗМАСЛЕНО МЛЯКО НА ПРАХ: КОЛИЧЕСТВЕНО ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ФОСФАТИДИЛСЕРИН И ФОСФАТИДИЛЕТАНОЛАМИН Метод: HPLC с обърнати фази. 1. ЦЕЛ И ПРИЛОЖНО ПОЛЕ Методът описва процедура за количествено определяне на фосфатидилсерин (PS) и фосфатидилетаноламин (PE) в обезмаслено мляко на прах (ОМП) и е подходящ за откриване на сухо вещество на мътеница в ОМП. 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Съдържание на PS и PE: масов процент на субстанцията, определена чрез използване на посочената тук процедура. Резултатът е изразен в милиграми фосфатидилетаноламин дипалмитоил (PEDP) на 100 g прах. 3. ПРИНЦИП НА МЕТОДА Извличане на аминофосфолипиди с метанол от възстановено мляко на прах. Определяне на PS и PE като o-фталдиалдехид (OPA) производни чрез HPLC с обърнати фази и флуоресцентно откриване. Определяне на количеството на PS и PE, съдържащи се в тестовата проба, чрез позоваване на стандартна проба, съдържаща познато количество PEDP. 4. РЕАГЕНТИ Всички реагенти трябва да бъдат с признато аналитично качество. Водата трябва да е дестилирана или с най-малко еквивалентна чистота, ако не е определено друго. 4.1. Материал за стандарта: PEDP с чистота най-малко 99 % Забележка: Стандартният материал трябва да бъде съхраняван при – 18 °C. 4.2. Реагенти за стандартна проба и подготовка на тестовата проба 4.2.1. Метанол за HPLC 4.2.2. Хлороформ за HPLC 4.2.3. Триптамин-монохидрохлорид 4.3. Реагенти за o-фталдиалдехид дериватизация 4.3.1. Натриев хидроксид, 12 М воден разтвор 4.3.2. Борна киселина, 0,4 M воден разтвор, регулиран до pH 10,0 с натриев хидроксид (4.3.1) 4.3.3. 2-меркаптоетанол 4.3.4. o-фталдиалдехид (OPA) 4.4. HPLC-елуиращи разтворители 4.4.1. Елуиращите разтворители трябва да бъдат приготвени, като се използват реагенти за HPLC. 4.4.2. Вода за HPLC 4.4.3. Метанол с тествана флуориметрична чистота 4.4.4. Тетрахидрофуран 4.4.5. Натриев дихидроген фосфат 4.4.6. Натриев ацетат 4.4.7. Оцетна киселина 5. АПАРАТУРА 5.1. Аналитична везна, претегляща с точност 1 mg, с деления на 0,1 mg 5.2. Бехерови чаши с обем от 25 и 100 ml 5.3. Капкомери, с които могат да се подават 1 и 10 ml 5.4. Магнитна бъркалка 5.5. Градуирани капкомери, които могат да подават 0,2, 0,5 и 5 ml 5.6. Мерителни колби с обем от 10, 50 и 100 ml 5.7. Спринцовки с обем 20 и 100 μl 5.8. Ултразвукова баня 5.9. Центрофуга, работеща при 27 000 × g 5.10. Стъклени съдове с обем около 5 ml 5.11. Градуиран цилиндър с обем 25 ml 5.12. Измервател на pH с точност до 0,1 pH единици 5.13. Оборудване за HPLC 5.13.1. Градиентна помпена система с възможност да функционира с 1,0 ml/min при 200 bar 5.13.2. Автоматичен уред за вземане на проби с възможност за дериватизация 5.13.3. Колонен нагревател, който може да поддържа колоната на 30 °C ± 1 °C 5.13.4. Флуоресцентен детектор, работещ при 330 nm дължина на вълната при възбуждане и 440 nm дължината на вълната при емитиране. 5.13.5. Интегратор или софтуер за обработка на данни, с възможност за измерване на площи на пика 5.13.6. Колона LiChrospher® — 100 (250 × 4,6 mm) или еквивалентна колона, запълнена с октадецилсилан (C 18) с размер на частиците 5 μm 6. ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ Вземането на проби трябва да се извършва в съответствие със стандарт ISO 707. 7. ПРОЦЕДУРА 7.1. Приготвяне на вътрешния стандартен разтвор 7.1.1. 30,0 ± 0,1 mg триптамин-монохидрохлорид (4.2.3) се претеглят в 100 ml мерителна колба (5.6) и се долива до белега с метанол (4.2.1). 7.1.2. Капва се 1 ml (5.3) от този разтвор в 10 ml мерителна колба (5.6) и се долива до белега с метанол (4.2.1), с оглед да се получи концентрация на триптамин от 0,15 mM. 7.2. Подготовка на разтвор на тестовата проба 7.2.1. Претегля се 1,000 ± 0,001 g от ОМП-пробата в 25 ml бехерова чаша (5.2). Добавят се 10 ml дестилирана вода при 40 °C ± 1 °C с капкомер (5.3) и се разбърква с магнитна бъркалка (5.4) за 30 минути, за да се разтворят всички бучки. 7.2.2. От възстановеното мляко се капват 0,2 ml (5.5) в 10 ml мерителна колба (5.6), добавят се 100 μl от 0,15 mM триптаминов разтвор (7.1) със спринцовка (5.7) и се долива до обема с метанол (4.2.1). Разбърква се внимателно с преобръщане и се извършва дисперсия с помощта на ултразвук (5.8) за 15 min. 7.2.3. Центрофугира се (5.9) при 27 000 g × g за 10 минути и супернатантът се събира в стъклен съд (5.10). Забележка: Разтворът на тестовата проба следва да се съхранява при 4 °C, докато се извърши HPLC-анализ. 7.3. Подготовка на външния стандартен разтвор 7.3.1. 55,4 mg PEDP (4.1) се отмерват в 50 ml мерителна колба (5.6) и се добавят около 25 ml хлороформ (4.2.2), като се използва градуиран цилиндър (5.11). Затворената колба се загрява до 50 °C ± 1 °C и се разбърква внимателно, докато се разтвори PEDP. Колбата се охлажда до 20 °C, обемът се долива с метанол (4.2.1) и се разбърква с преобръщане. 7.3.2. Капва се 1 ml (5.3) от този разтвор в 100 ml мерителна колба (5.6) и се долива до обема с метанол (4.2.1). Капва се 1 ml (5.3) от този разтвор в 10 ml мерителна колба (5.6), добавят се 100 μl (5.7) от 0,15 mM триптаминов разтвор (7.1) и обемът се долива с метанол (4.2.1). Разбърква се с преобръщане. Забележка: Разтворът на стандартната проба следва да се съхранява при 4 °C, докато се извърши HPLC-анализ. 7.4. Подготовка на дериватизиращия реагент В 10 ml мерителна колба (5.6) се отмерват 25,0 ± 0,1 mg OPA (4.3.4), добавя се 0,5 ml (5.5) метанол (4.2.1) и се разбърква внимателно, за да се разтвори OPA. Долива се до белега с разтвор на борна киселина (4.3.2) и се добавят 20 μl от 2-меркаптоетанол (4.3.3) със спринцовка (5.7). Забележка: Дериватизиращият реагент следва да се съхранява при 4 °C в тъмен флакон; той е годен една седмица. 7.5. Определяне чрез HPLC 7.5.1. Елуиращи разтворители (4.4) Разтворител А: Разтвор на 0,3 mM натриев дихидроген фосфат и разтвор на 3 mM натриев ацетат (регулиран до pH 6,5 ± 0,1 с оцетна киселина): метанол: тетрахидрофуран = 558:440:2 (v/v/v) Разтворител Б: метанол 7.5.2. Предложен елуиращ градиент:
Забележка: Елуиращият градиент може да изисква лека модификация, с оглед да се постигне разделянето, показано на фигура 1. Температура на колоната: 30 °C. 7.5.3. Обем на впръскване: 50 μl дериватизиращ реагент и 50 μl разтвор на пробата 7.5.4. Балансиране на колоната При ежедневното пускане на системата колоната се промива със 100 % разтворител Б за 15 минути, след това се настройва на A:Б = 40:60 и се балансира при 1 ml/min за 15 минути. Чрез впръскването на метанол (4.2.1) се извършва празна серия. Забележка: Преди дългосрочно съхранение колоната се промива с метанол: хлороформ = 80:20 (v/v) в продължение на 30 минути. 7.5.5. Определяне на съдържанието на PS + PE в тестовата проба 7.5.6. Извършва се последователността от хроматографски анализи, като времето от серия до серия се поддържа константно с оглед да се получат константни времена на задържане. Външният стандартен разтвор (7.3) се впръсква на всеки 5—10 разтвора на тестовите проби, за да може да се оцени факторът на сигнала. Забележка: Колоната трябва да бъде почиствана чрез промиване със 100 % разтворител Б (7.5.1) за най-малко 30 минути на всеки 20—25 серии. 7.6. Метод на интегриране 7.6.1. Пик на PEDP PEDP се елуира като един отделен пик. Площта на пика се определя чрез интегриране от впадина до впадина. 7.6.2. Пик на триптамина Триптаминът се елуира като един отделен пик (фигура 1). Площта на пика се определя чрез интегриране от впадина до впадина. 7.6.3. Групи на пикове PS и PE При описаните условия (фигура 1) PS се елуира като два основни частично неразделени пика, предшествани от по-малък пик. PE се елуира като три основни частично неразделени пика. Определя се цялата площ на всяка група пикове, като се очертава базовата линия, както е показано на фигура 1. 8. ИЗЧИСЛЯВАНЕ И ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Съдържанието на PS и PE в тестовата проба се изчислява, както следва: C = 55,36 × ((A2)/(A1)) × ((T1)/(T2)) където:
9. ТОЧНОСТ НА ПРОЦЕДУРАТА Забележка: Стойностите за повторяемост бяха изчислени в съответствие с международен стандарт IDF (*). 9.1. Повторяемост Относителното стандартно отклонение на повторяемостта, което изразява варирането на резултатите от независим аналитичен анализ, получени от същия оператор чрез използване на същата апаратура и при същите условия върху същия тестов материал и в кратък период от време, не трябва да надвишава относителната стойност от 2 %. Ако при тези условия са получени две определяния, относителната разлика между двата резултата не трябва да бъде по-голяма от 6 % от средноаритметичната стойност на резултатите. 9.2. Възпроизводимост Ако са направени две определяния от оператори в различни лаборатории чрез използване на различна апаратура, при различни условия за анализа на същия тестов материал, относителната разлика между двата резултата не трябва да бъде по-голяма от 11 % от средноаритметичната стойност на резултатите. 10. ЗА СПРАВКА 10.1. Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., ‘Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids’ (Откриване на сухо вещество на мътеница в обезмаслено мляко на прах чрез HPLC-определяне на количеството на аминофосфолипиди). Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988). Фигура 1 HPLC-модели на OPA-производни на фосфатидилсерин (PS) и фосфатидилетаноламин (РЕ) в метанолов екстракт от възстановено обезмаслено мляко на прах. Представен е методът на интегриране за пиковете на PS, РЕ и триптамин (вътрешен стандарт) 
Minutes Флуоресценция (в произволни единици) Допълнение II ОТКРИВАНЕ НА СИРИЩНА СУРОВАТКА В ОБЕЗМАСЛЕНО МЛЯКО НА ПРАХ, ПРЕДНАЗНАЧЕНО ЗА ОБЩЕСТВЕНО СКЛАДИРАНЕ, ЧРЕЗ ОПРЕДЕЛЯНЕТО НА КАЗЕИНОМАКРОПЕПТИДИ ЧРЕЗ ВИСОКОЕФЕКТИВНА ТЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЯ (HPLC) 1. ОБХВАТ И ПРИЛОЖНО ПОЛЕ Този метод позволява откриването на сирищна суроватка в обезмаслено мляко на прах, предназначено за публично складиране, чрез определянето на казеиномакропептиди. 2. ЗА СПРАВКА Международен стандарт ISO 707 — Мляко и млечни продукти. Указания за вземане на проби 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Съдържанието на сухо вещество на сирищна суроватка се дефинира като процент от масата, както е определено от казеиномакропептидното съдържание чрез описаната процедура. 4. ПРИНЦИП
5. РЕАКТИВИ Всички реагенти трябва да бъдат с признато аналитично качество. Използваната вода трябва да е дестилирана или да е с еквивалентна степен на чистота. 5.1. Разтвор на трихлорооцетна киселина 240 g трихлорооцетна киселина (CCl3COOH) се разтварят във вода и се долива до 1 000 ml. Разтворът трябва да бъде прозрачен и безцветен. 5.2. Елуентен разтвор, pH 6,0 1,74 g дикалиев хидроген фосфат (K2HPO4), 12,37 g калиев дихидроген фосфат (KH2PO4) и 21,41 g натриев сулфат (Na2SO4) се разтварят в около 700 ml вода. Регулира се, ако е необходимо, до pH 6,0, като се използва разтвор на фосфорна киселина или калиев хидроксид. Долива се до 1 000 ml с вода и се хомогенизира. Забележка: Съставът на елуента може да се актуализира така, че да съответства със сертификата на стандартите или с препоръките на производителя на пълнежа на колоната. Елуентният разтвор се филтрира, преди да се използва, през мембранен филтър с 0,45 μm диаметър на порите. 5.3. Промиващ разтворител Един обем ацетонитрил (CH3CN) се смесва с девет обема вода. Преди да се използва, сместа се филтрира през мембранен филтър с 0,45 μm диаметър на порите. Забележка: Може да бъде използван всеки друг промиващ разтворител с бактерициден ефект, който не уврежда ефективността на разделянето в колоната. 5.4. Стандартни проби 5.4.1. Обезмаслено мляко на прах, което изпълнява изискванията на настоящия регламент (т.e. [0]) 5.4.2. Същото обезмаслено мляко на прах, подправено с 5 % (m/m) сирищна суроватка на прах със стандартен състав (т.e. [5]). 6. АПАРАТУРА 6.1. Аналитична везна 6.2. Незадължително: центрофуга, която може да достигне центробежна сила от 2 000 g, снабдена със запушени центрофужни епруветки с капацитет около 50 ml 6.3. Механичен шейкър 6.4. Магнитна бъркалка 6.5. Стъклени фунии с диаметър около 7 cm 6.6. Филтърна хартия, средно филтриране, диаметър около 12,5 cm 6.7. Стъклено оборудване за филтриране с мембранен филтър с диаметър на порите 0,45 μm 6.8. Градуирани пипети, които позволяват подаване на 10 ml (ISO 648, клас A, или ISO/R 835), или система, която може да подаде 10,0 ml за две минути 6.9. Система за подаване, която може да подаде 20,0 ml вода при приблизително 50 °C 6.10. Термостатна водна баня, регулирана на 25 ± 0,5 °C 6.11. Оборудване за HPLC, състоящо се от:
7. ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ 7.1. Пробите се вземат в съответствие с процедурата, определена в Международен стандарт ISO 707. Държавите членки обаче може да използват друг метод за вземане на проби, при условие че той е в съответствие с принципите на гореупоменатия стандарт. 7.2. Пробата се съхранява при условия, които изключват всякакво увреждане или промяна на състава. 8. ПРОЦЕДУРА 8.1. Подготовка на тестовата проба Млякото на прах се прехвърля в съд, снабден с уплътнен капак, и с вместимост, която е около два пъти обема на праха. Съдът се затваря веднага. Млечният прах се смесва добре чрез многократно обръщане на съда. 8.2. Маса на пробата за анализ Претеглят се 2,000 ± 0,001 g от пробата за анализ в центрофужна епруветка (6.2) или подходяща запушена колба (50 ml). 8.3. Отстраняване на мазнината и протеините 8.3.1. Към тестовата доза се прибавят 20,0 ml топла вода (50 °C). Прахът се разтваря чрез разклащане за пет минути при използването на механичен шейкър (6.3). Епруветката се поставя във водната баня (6.10) и се оставя да се темперира до 25 °C. 8.3.2. Прибавят се 10,0 ml разтвор на трихлорооцетна киселина (5.1.) с температура около 25 °C за две минути, като същевременно се разбърква енергично с магнитната бъркалка (6.4). Епруветката се поставя във водната баня (6.10) и се оставя за 60 минути. 8.3.3. Центрофугира се (6.2) в продължение на 10 минути при 2 200 g или се филтрира през хартия (6.6), като се изхвърлят първите 5 ml филтрат. 8.4. Хроматографски анализ 8.4.1. От 15 до 30 μl точно измерен супернатант или филтрат (8.3.3) се впръскват в апарат за HPLC (6.11), който работи при дебит 1,0 ml елуентен разтвор (5.2) на минута. Забележка 1: Може да се използва и друг дебит в зависимост от вътрешния диаметър на използваните колони или указанията на производителя на колоните. Забележка 2: Колоните се изплакват с вода при всяко прекъсване. Елуентният разтвор (5.2) никога не се оставя в тях. Преди всяко прекъсване за повече от 24 часа колоните се изплакват с вода, след това се измиват с разтвор (5.3) за най-малко три часа при дебит 0,2 ml на минута. 8.4.2. Резултатите от хроматографския анализ на тестовата проба [E] се получават под формата на хроматограма, в която всеки пик е показан чрез времето му на задържане RT, както следва:
Изборът на колоните може съществено да повлияе на времето на задържане на отделните пикове. Интеграторът (6.11.6) автоматично изчислява площта A на всеки пик:
Съществено е да се изследва вида на всяка хроматограма преди количественото тълкуване, за да се открият всякакви отклонения, които се дължат или на неправилното функциониране на апаратурата, или на колоните, или на произхода и естеството на анализираната проба. Анализът се повтаря, ако има съмнения. 8.5. Калибриране 8.5.1. Процедурата, описана в точки 8.2—8.4.2, се прилага с точност за стандартните проби (5.4). Използват се прясно приготвени разтвори, тъй като CMP се разрушават в 8 %-на трихлорооцетна среда. Загубата се оценява на 0,2 % на час при 30 °C. 8.5.2. Преди хроматографския анализ на пробите колоните се подготвят чрез многократно впръскване на стандартната проба (5.4.2) в разтвора (8.5.1), докато площта и времето на задържане на пика, съответстващ на CMP, станат постоянни. 8.5.3. Определят се факторите на сигнала R чрез впръскване на същия обем филтрати (8.5.1), какъвто е използван за пробите. 9. ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ 9.1. Метод на изчисление и формули 9.1.1. Изчисляване на факторите на сигнала R:
където:
където:
9.1.2. Изчисляване на относителната площ на пиковете в пробата [E]
където:
9.1.3. Изчисляване на относителното време на задържане на пик III на проба [E]: RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5]) където:
9.1.4. Експериментите показаха, че има линейна връзка между относителното време на задържане на пик III, т.e. RRTIII [E], и процента на прибавена суроватка на прах до 10 %
Допустимата неопределеност за стойностите на RRTIII е ± 0,002. Обикновено стойността на RRTIII [0] се отклонява малко от 1,034. В зависимост от състоянието на колоните стойността може да се доближава до 1,000, но трябва винаги да бъде по-голяма. 9.2. Изчисляване на процента на сирищна суроватка на прах в пробата: W = SIII[E] – [1,3 + (SIII[0] – 0, 9)] където:
9.3. Точност на процедурата 9.3.1. Повторяемост Разликата между резултатите от две определяния, извършени едновременно или едно след друго от същия анализатор и при използване на същата апаратура върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 0,2 % m/m. 9.3.2. Възпроизводимост Разликата между два отделни и независими резултата, получени в две различни лаборатории върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 0,4 % m/m. 9.4. Тълкуване 9.4.1. Приема се, че липсва суроватка, ако относителната площ на пик III, SIII [E], изразена в грамове сирищна суроватка за 100 g продукт, е ≤ 2,0 + (SIII [0] – 0,9), където:
9.4.2. Ако относителната площ на пик III, SIII [E], е > 2,0 + (SIII [0] – 0,9) и относителната площ на пик II, SII [E], ≤ 160, съдържанието на сирищна суроватка се определя, както е посочено в точка 9.2. 9.4.3. Ако относителната площ на пик III, SIII [E], е > 2,0 + (SIII [0] – 0,9) и относителната площ на пик II, SII [E], ≤ 160, се определя общото съдържание на протеин (P %); след това се изследват графики 1 и 2. 9.4.3.1. Данните, получени след анализа на пробите на неподправено обезмаслено мляко на прах с високо общо съдържание на протеин, са събрани в графики 1 и 2. Непрекъснатата линия представлява линейна регресия, чиито коефициенти са изчислени чрез метода на най-малките квадрати. Пунктираната права линия определя горната граница на относителната площ на пик III с вероятност, че няма да се надвишава в 90 % от случаите. Уравненията за пунктираните прави линии на графики 1 и 2 са:
където съответно:
Тези уравнения са еквивалентни по стойност на 1,3, посочено в точка 9.2. Разликата (T1 и T2) между установената относителна площ SIII [E] и относителната площ SIII се изразява чрез следното: T1 = SIII[E] – [(0,376 P% – 10,7) + (SIII[0] – 0,9)]T2 = SIII[E] – [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] – 0,9)].
Съдържанието на сирищна суроватка се изчислява по следната формула: W = T2 + 0,91 където: 0,91 е разстоянието на вертикалната ос между непрекъснатата и пунктираната прави линии. 
Пик II Обезмаслено мляко на прах общо съдържание на протеин (%) Пик III Пик III Обезмаслено мляко на прах Допълнение III ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СУХО ВЕЩЕСТВО НА СИРИЩНА СУРОВАТКА В ОБЕЗМАСЛЕНО МЛЯКО НА ПРАХ 1. ЦЕЛ: ОТКРИВАНЕ НА ПРИБАВЯНЕТО НА СУХО ВЕЩЕСТВО НА СИРИЩНА СУРОВАТКА КЪМ ОБЕЗМАСЛЕНО МЛЯКО НА ПРАХ 2. ЗА СПРАВКА: МЕЖДУНАРОДЕН СТАНДАРТ ISO 707 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Съдържанието на сухо вещество на сирищна суроватка се дефинира като масовата концентрация от казеиномакропептидното съдържание, определена чрез описаната процедура. 4. ПРИНЦИП Пробите се анализират за казеиномакропептид A с високоефективна течна хроматография с обърнати фази (процедура за HPLC). Оценката на резултата се получава чрез позоваване на стандартни проби, съдържащи обезмаслено мляко на прах със или без известен процент суроватка на прах. Резултатите, които са по-високи от 1 % (m/m), показват наличие на сухо вещество на сирищна суроватка. 5. РЕАГЕНТИ Всички реагенти трябва да бъдат с признато аналитично качество. Използваната вода трябва да е дестилирана или да е с еквивалентна степен на чистота. Ацетонитрилът следва да бъде със спектроскопично качество или с HPLC-качество. 5.1. Разтвор на трихлорооцетна киселина 240 g трихлорооцетна киселина (CCl3COOH) се разтварят във вода и се долива до 1 000 ml. Разтворът трябва да бъде прозрачен и безцветен. 5.2. Елуенти A и Б Eлуент A: 150 ml ацетонитрил (CH3CN), 20 ml изопропанол (CH3CHOHCH3) и 1,00 ml трифлуорооцетна киселина (TFA, CF3COOH) се поставят в 1 000 ml измерителна колба. Долива се до 1 000 ml с вода. Елуент Б: 550 ml ацетонитрил, 20 ml изопропанол и 1,00 ml TFA се поставят в 1 000 ml измерителна колба. Долива се до 1 000 ml с вода. Елуентният разтвор се филтрира, преди да се използва, през мембранен филтър с 0,45 μm диаметър на порите. 5.3. Съхранение на колоната След анализа колоната се изплаква с елуент Б (чрез градиент) и впоследствие се изплаква с ацетонитрил (чрез градиент за 30 минути). Колоната се съхранява в ацетонитрил. 5.4. Стандартни проби 5.4.1. Обезмаслено мляко на прах, което изпълнява изискванията за публично складиране (т. e. [0]). 5.4.2. Същото обезмаслено мляко на прах, подправено с 5 % (m/m) сирищна суроватка на прах със стандартен състав (т.e. [5]). 5.4.3. Същото обезмаслено мляко на прах, подправено с 50 % (m/m) сирищна суроватка на прах със стандартен състав (т.e. [50]). 6. АПАРАТУРА 6.1. Аналитични везни 6.2. Незадължително: центрофуга, която може да достигне центробежна сила от 2 200 g, снабдена със запушени центрофужни епруветки с капацитет около 50 ml 6.3. Механичен шейкър 6.4. Магнитна бъркалка 6.5. Стъклени фунии с диаметър около 7 cm 6.6. Филтърна хартия, средно филтриране, диаметър около 12,5 cm 6.7. Стъклено оборудване за филтриране с мембранен филтър с диаметър на порите 0,45 μm 6.8. Градуирани капкомери, които позволяват подаване на 10 ml (ISO 648, клас A, или ISO/R 835), или система, която може да подаде 10,0 ml за две минути. 6.9. Система за подаване, която може да подаде 20,0 ml вода при приблизително 50 °C 6.10. Термостатна водна баня, регулирана на 25 ± 0,5 °C 6.11. Оборудване за HPLC, състоящо се от:
7. ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ 7.1. Пробите се вземат в съответствие с процедурата, определена в Международен стандарт ISO 707. Държавите членки обаче може да използват друг метод за вземане на проби, при условие че той е в съответствие с принципите на гореупоменатия стандарт. 7.2. Пробата се съхранява при условия, които изключват всякакво увреждане или промяна на състава. 8. ПРОЦЕДУРА 8.1. Подготовка на тестовата проба Млякото на прах се прехвърля в съд, снабден с уплътнен капак, и с вместимост, която е около два пъти обема на праха. Съдът се затваря веднага. Млечният прах се смесва добре чрез многократно обръщане на съда. 8.2. Маса на пробата за анализ Претеглят се 2,00 ± 0,001 g от пробата за анализ в центрофужна епруветка (6.2) или подходяща запушена колба (50 ml). Забележка: Когато се анализират смеси, се претегля такова количество от тестовата проба, че обезмаслената част от пробата да съответства на 2,00 g. 8.3. Отстраняване на мазнината и протеините 8.3.1. Към тестовата доза се прибавят 20,0 ml топла вода (50 °C). Прахът се разтваря чрез разклащане за пет минути при използването на механичен шейкър (6.3). Епруветката се поставя във водната баня (6.10) и се оставя да се темперира до 25 °C. 8.3.2. Прибавят се 10,0 ml разтвор на трихлорооцетна киселина с температура около 25 °C (5.1) постоянно за две минути, като същевременно се разбърква енергично с магнитната бъркалка (6.4). Епруветката се поставя във водната баня (6.10) и се оставя за 60 минути. 8.3.3. Центрофугират се (6.2) 2 200 g в продължение на 10 минути или се филтрират през хартия (6.6), като първите 5 ml филтрат се изхвърлят. 8.4. Хроматографски анализ 8.4.1. HPLC-методът с обърната фаза изключва възможността да има фалшиви положителни резултати, дължащи се на наличието на кисела мътеница на прах. 8.4.2. Преди извършването на HPLC анализа с обърната фаза условията на градиента следва да бъдат оптимизирани. Времето на задържане от 26 ± 2 минути за CMP Α е оптимално за системите с градиент с мъртъв обем от около 6 ml (обем от точката, в която разредителите се събират, до обема на пръстена на инжектора включително). Системите с градиент с по-малък мъртъв обем (напр. 2 ml) следва да използват 22 минути като оптимално време за задържане. Вземат се разтвори от стандартните проби (5.4) без и със 50 % сирищна суроватка. 100 μl супернатант или филтрат (8.3.3) се впръсква в апарата за HPLC, който функционира при условията на тестовия градиент, дадени в таблица 1. Таблица 1 Условия на тестовия градиент за оптимизиране на хроматографията
Сравнението на двете хроматограми следва да разкрива мястото на пика на GMPA. Чрез използване на формулата, дадена по-долу, може да бъде изчислен първоначалният състав на разредителя, който ще се използва за нормалния градиент (вж. 8.4.3): % Б = 10 – 2,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) * 30 / 27 % Б = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) * 1,11 където:
8.4.3. Анализ на разтвори на тестовите проби Впръскват се 100 μl точно измерен супернатант или филтрат (8.3.3) в апарата за HPLC, който работи при дебит 1,0 ml елуентен разтвор (5.2) в минута. Съставът на елуента в началото на анализа се получава съгласно 8.4.2. Той обичайно е близък до A:Б = 76:24 (5.2). Непосредствено след впръскването се стартира линеен градиент, което води до 5 % по-висок процент на Б след 27 минути. След това се стартира линеен градиент, с който съставът на елуента става 90 % Б за пет минути. Този състав се поддържа пет минути, след което съставът се променя чрез линеен градиент за пет минути към първоначалния състав. В зависимост от вътрешния обем на помпената система следващото впръскване може да бъде направено 15 минути след постигането на първоначалните условия. Забележка 1. Времето на задържане на CMPA следва да бъде 26 ± 2 минути. Това може да бъде постигнато чрез вариране на изходните и крайните условия на първия градиент. Разликата обаче в % Б за изходните и крайните условия на първия градиент трябва да остане 5 % Б. Забележка 2. Елуентите следва да бъдат дегазирани в достатъчна степен и да се запазят такива. Това е от основна важност за доброто функциониране на помпената система за градиента. Стандартното отклонение за времето на задържане на пика CMPA трябва да бъде по-малко от 0,1 минути (n = 10). Забележка 3. Референтната проба [5] трябва да бъде впръсквана на всеки пет проби и използвана за изчисляване на нов фактор на сигнала R (9.1.1). 8.4.4. Резултатите от хроматографския анализ на тестовата проба (E) се получават под формата на хроматограма, в която пикът CMPA се идентифицира чрез времето си на задържане от около 26 минути. Интеграторът (6.11.6) автоматично изчислява височината H на пика CMPA. Във всяка хроматограма следва да се проверява мястото на базовата линия. Анализът или интегрирането трябва да бъдат повторени, ако базовата линия е определена неправилно. Забележка: Ако пикът на CMPA е достатъчно отделен от други пикове, следва да се използва базовата линия от впадина до впадина; в противен случай се използват перпендикулярните проекции върху обща базова линия, която би трябвало да започва близо до пика на CMPA (следователно не при t = 0 min!). За стандартния разтвор и за пробите се използва един и същ тип интегриране, а при обща базова линия се проверява нейната съгласуваност за пробите и стандартния разтвор. Съществено е да се изследва видът на всяка хроматограма преди количественото тълкуване, за да се открият всякакви отклонения, които се дължат или на неправилното функциониране на апаратурата, или на колоната, или на произхода и естеството на анализираната проба. Анализът се повтаря, ако има съмнения. 8.5. Калибриране 8.5.1. Процедурата, описана в точки 8.2—8.4.4, се прилага с точност за стандартните проби (5.4.1—5.4.2). Използват се прясно приготвени разтвори, тъй като CMP се разрушават в 8 %-на трихлорооцетна среда при стайна температура. При 4 °C разтворът остава стабилен за 24 часа. В случай на дълги аналитични серии е желателно в автоматичния инжектор да се използва охладена подложка за проби. Забележка: 8.4.2. може да бъде пропусната, ако % Б при първоначалните условия е известен от предходни анализи. Хроматограмата на референтната проба [5] следва да е аналогична с представеното на фигура 1. На тази фигура пикът на CMPA се предхожда от два малки пика. Важно е да се получи подобно разделяне. 8.5.2. Преди хроматографския анализ на пробите се впръскват 100 μl стандартна проба без сирищна суроватка [0] (5.4.1). Хроматограмата не следва да показва пик във времето на задържане на пика CMPA. 8.5.3. Определят се факторите на сигнала R чрез впръскване на същия обем от филтрата (8.5.1), какъвто е използван за пробите. 9. ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ 9.1. Метод на изчисление и формули 9.1.1. Изчисляване на фактора на сигнала R: Пик на CMPA: R = W/H където:
9.2. Изчисляване на процента на сирищна суроватка на прах в пробата W(E) = R × H(E) където:
Ако W(E) надвишава 1 % и разликата между времето на задържане и това на стандартната проба [5] е по-малка от 0,2 минути, тогава има наличие на сухо вещество на сирищна суроватка. 9.3. Точност на процедурата 9.3.1. Повторяемост Разликата между резултатите от две определяния, извършени едновременно или едно след друго от същия анализатор и при използване на същата апаратура върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 0,2 % m/m. 9.3.2. Възпроизводимост Не е определена. 9.3.3. Линейност От 0 до 16 % сирищна суроватка трябва да даде линейна зависимост с коефициент на корелация > 0,99. 9.4. Тълкуване Границата от 1 % включва неопределеността, свързана с възпроизводимостта. Фигура 1 Ni—4.6 стандарт 
Абсорбция (220 nm) Време (в минути) CMP A
|
|
3) |
Добавят се следните приложения: „ПРИЛОЖЕНИЕ VI Методи за анализ на масло за частно складиране
„ПРИЛОЖЕНИЕ VII Методи за анализ на обезмаслено мляко на прах за частно складиране
„ПРИЛОЖЕНИЕ VIII Методи за анализ на сирена за частно складиране
„Допълнение МЕТОД ЗА ОТКРИВАНЕ НА КРАВЕ МЛЯКО И КАЗЕИНАТИ В СИРЕНА ОТ ОВЧЕ МЛЯКО, КОЗЕ МЛЯКО ИЛИ БИВОЛСКО МЛЯКО, ИЛИ СМЕСИ ОТ ОВЧЕ, КОЗЕ И БИВОЛСКО МЛЯКО 1. ОБХВАТ Откриване на краве мляко и казеинати в сирена, произведени от овче мляко, козе мляко, биволско мляко, или смеси от овче, козе и биволско мляко, чрез изоелектрическо фокусиране на γ-казеини след плазминолиза. 2. ПРИЛОЖНО ПОЛЕ Методът е подходящ за чувствително и специфично откриване на натурално и топлинно обработвано краве мляко и казеинати в пресни и узрели сирена, произведени от овче мляко, козе мляко, биволско мляко, или смеси от овче, козе и биволско мляко. Той не е подходящ за откриване на подправяне на мляко и сирене чрез топлинно обработени концентрати на суроватъчен протеин от краве мляко. 3. ПРИНЦИП НА МЕТОДА 3.1. Изолиране на казеини от сирене и от референтните проби. 3.2. Разтваряне на изолираните казеини и разграждане чрез плазмин (EC.3.4.21.7). 3.3. Изоелектрическо фокусиране на обработени с плазмин казеини в присъствието на уреа и оцветяване на протеините. 3.4. Оценка на оцветените γ3 и γ2-ивици на казеин (доказателство за краве мляко) чрез сравняване на получените от пробата ивици с тези, които са получени в същия гел от референтните проби, съдържащи 0 % и 1 % краве мляко. 4. РЕАГЕНТИ Ако не е посочено друго, трябва да бъдат използвани химикали с аналитично качество. Водата трябва да е двойно дестилирана или с еквивалента степен на чистота. Забележка: Указанията по-долу се прилагат за лаборатория, която е подготвила полиакриламидни гелове, съдържащи уреа, с размери 265 × 125 × 0,25 mm. Когато се използват други размери и типове гел, може да е необходимо коригиране на условията за отделяне. Изоелектрическо фокусиране 4.1. Реагенти за получаване на полиакриламидни гелове, съдържащи уреа 4.1.1. Основен разтвор на гел Разтварят се:
във вода, допълва се до 100 ml и се съхранява в бутилка от кафяво стъкло в хладилник. Забележка: Вместо цитираните определени дози невротоксични акриламиди може да се използва готов разтвор акриламид/BIS, наличен в търговската мрежа. Когато такъв разтвор съдържа 30 % w/v акриламид и 0,8 % w/v BIS, вместо определените дози за сместа трябва да бъде използван обем от 16,2 ml. Годността на основния разтвор е максимум 10 дни; ако неговата проводимост е повече от 5 μS, той се дейонизира чрез разклащане с 2 g Амберлит MB-3 за 30 минути, след това се филтрира през мембрана от 0,45 μm. 4.1.2. Разтвор на гел Приготвя се разтвор на гел чрез смесване на добавките и амфолити (*) с основния разтвор на гел (виж 4.1.1).
Разтворът на гел се смесва и се дегазира за две до три минути в ултразвукова баня или във вакуум. Забележка: Разтворът на гел се приготвя непосредствено преди изливането му (вж. 6.2). 4.1.3. Катализаторни разтвори 4.1.3.1. N, N, N′ N′ — тетраметилетилендиамин (Temed) 4.1.3.2. 40 % w/v амониев персулфат (PER): 800 mg PER се разтварят във вода и се долива до 2 ml Забележка: Винаги се използва прясно приготвен разтвор на PER. 4.2. Контактна течност Керосин или течен парафин 4.3. Aноден разтвор 5,77 g фосфорна киселина (85 % w/w) се разтваря във вода и се разрежда до 100 ml. 4.4. Катоден разтвор 2,00 g натриев хидроксид се разтваря във вода и се разрежда до 100 ml с вода. Подготовка на пробите 4.5. Реагенти за изолиране на протеин 4.5.1. Разредена оцетна киселина (25,0 ml ледена оцетна киселина с добавена вода до 100 ml) 4.5.2. Дихлорометан 4.5.3. Ацетон 4.6. Буфер за разтваряне на протеин Разтварят се:
във вода и се долива до 50 ml. Забележка: Съхранява се в хладилник, максимална годност — една седмица. 4.7. Реагенти за разграждане на казеини чрез плазмин 4.7.1. Буфер — амониев карбонат 0,2 mol/l разтвор на амониев бикарбонат (1,58 g/100 ml вода), съдържащ 0,05 mol/l етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA, 1,46 g/100 ml), се титрува с 0,2 mol/l разтвор на амониев кaрбонат (1,92 g/100 ml вода), съдържащ 0,05 mol/l EDTA, до pH 8. 4.7.2. Говежди плазмин (EC. 3.4.21.7) с активност най-малко 5 U/ml 4.7.3. Разтвор на ε-аминокапронова киселина за инхибиране на ензими 2,624 g ε-аминокапронова киселина (6 амино-n-хексанова киселина) се разтварят в 100 ml 40 % (v/v) етанол. 4.8. Стандартни проби 4.8.1. Сертифицирани референтни стандартни проби от смес от подсирени овче и козе обезмаслено мляко, съдържащи 0 % и 1 % краве мляко, могат да се намерят от Института за референтни материали и метрология на Комисията, B-2440 Гил, Белгия. 4.8.2. Подготовка на вътрешни лабораторни стандартни проби от подсирено биволско мляко, съдържащо 0 % и 1 % краве мляко Обезмасленото мляко се приготвя чрез центрофугиране на сурово непакетирано биволско или краве мляко при 37 °C (2 500 g, 20 минути). След бързо охлаждане на съда и съдържанието му до 6—8 °C, горният слой мазнина се отстранява напълно. За подготовката на 1 %-на стандартна проба към 495 ml биволско обезмаслено мляко се добавя 5,00 ml краве обезмаслено мляко в 1 l бехерова чаша и се постига pH 6,4 чрез прибавяне на разредена млечна киселина (10 % w/v). Температурата се довежда до 35 °C и се прибавят 100 μl телешко сирище (активност 1: 10 000, около 3 000 U/ml), разклаща се за 1 минута и бехеровата чаша се оставя покрита с алуминиево фолио при 35 °C за един час, за да може съдържанието да се съсири. След образуването на съсирека цялото подсирено мляко се суши чрез сублимиране без предварително хомогенизиране или отцеждане на суроватката. След сушенето чрез сублимиране то се смила ситно на хомогенен прах. За подготовката на 0 %-ната стандартна проба се извършва същата процедура с използване на натурално биволско обезмаслено мляко. Стандартните проби трябва да бъдат съхранявани при – 20 °C. Забележка: Препоръчително е да се проверява чистотата на биволското мляко чрез изоелектрическо фокусиране на третираните с плазмин казеини преди подготовката на стандартните проби. Реагенти за оцветяване на протеин 4.9. Фиксатор 150 g трихлорооцетна киселина се разтварят във вода и се долива до 1 000 ml. 4.10. Обезцветяващ разтвор 500 ml метанол и 200 ml ледена оцетна киселина се разреждат до 2 000 ml с дестилирана вода. Забележка: Всеки ден се приготвя пресен обезцветяващ разтвор; той може да бъде приготвен чрез смесване на равни обеми основни разтвори на 50 % (v/v) метанол и 20 % (v/v) ледена оцетна киселина. 4.11. Оцветяващи разтвори 4.11.1. Оцветяващ разтвор (основен разтвор 1) 3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) се разтваря в 1 000 ml 90 % (v/v) метанол, като се използва магнитна бъркалка (приблизително 45 минути), филтрира се през два нагънати филтъра със средна скорост. 4.11.2. Оцветяващ разтвор (основен разтвор 2) 5,0 g меден сулфат пентахидрат се разтваря в 1 000 ml 20 % (v/v) оцетна киселина. 4.11.3. Оцветяващ разтвор (работен разтвор) Смесват се по 125 ml от всеки от основните разтвори (4.11.1, 4.11.2) непосредствено преди оцветяването. Забележка: Оцветяващият разтвор следва да бъде приготвен в деня, в който се използва. 5. ОБОРУДВАНЕ 5.1. Стъклени плочи (265 × 125 × 4 mm); каучукова ролка (ширина 15 cm); нивелирна маса 5.2. Лист носител на гел (265 × 125 mm) 5.3. Покривен лист (280 × 125 mm). По двете му дължини отстрани се поставя самозалепваща лента (280 × 6 × 0,25 mm) (вж. фигура 1) 5.4. Камера за електрофокусиране с охлаждаща плоча (напр. 265 × 125 mm) и подходящо електрическо захранване (≥ 2,5 kV) или автоматично устройство за електрофореза 5.5. Криостат с циркулация, термостатно контролиран на 12 ± 0,5 °C 5.6. Центрофуга, регулируема за 3 000g 5.7. Електродни ленти (с дължина ≥ 265 mm) 5.8. Пластмасови флакони за капене на анодните и катодните разтвори 5.9. Апликатори за проби (10 × 5 mm, вискозна филтърна хартия или филтърна хартия с ниска абсорбция на протеин) 5.10. Съдове от неръждаема стомана или от стъкло за оцветяване и обезцветяване (напр. 280 × 150 mm таблички за инструменти) 5.12. Регулируем хомогенизатор (с диаметър на оста 10 mm), от 8 000 до 20 000 об./мин. 5.13. Магнитна бъркалка 5.14. Ултразвукова баня 5.15. Апарат за залепване на листовете 5.16. 25 μl микро-капкомери 5.17. Вакуумен концентратор или сушилня чрез сублимиране 5.18. Термостатично контролирана водна баня, регулируема за 35 и за 40 ± 1 °C с възможност за разбъркване 5.19. Денсиметър, четящ при λ = 634 nm 6. ПРОЦЕДУРА 6.1. Подготовка на пробите 6.1.1. Изолиране на казеини Количество, еквивалентно на 5 g сухо вещество сирене, или референтните стандартни проби се претеглят в 100 ml центрофужна епруветка, прибавя се 60 ml дестилирана вода и се хомогенизира с хомогенизатор (от 8 000 до 10 000 об./мин). Регулира се до pH 4,6 с разредена оцетна киселина (4.5.1) и се центрофугира (5 минути, 3 000 g). Мазнината и суроватката се отделят, утайката се хомогенизира при 20 000 об./мин в 40 ml дестилирана вода, регулирана до pH 4,5 с разредена оцетна киселина (4.5.1), добавят се 20 ml дихлорометан (4.5.2), отново се хомогенизира и се центрофугира (5 минути, 3 000 g). Казеиновият слой, който се намира между водната и органичната фази (вж. фигура 2), се отстранява със шпатула и двете фази се отделят. Казеинът се хомогенизира отново в 40 ml дестилирана вода (виж по-горе) и 20 ml дихлорометан (4.5.2) и се центрофугира. Тази процедура се повтаря, докато двете фази на екстракцията останат безцветни (от два до три пъти). Утайката от протеин се хомогенизира с 50 ml ацетон (4.5.3) и се филтрира през нагъната филтърна хартия със средна скорост. Утайката върху филтъра се измива с две отделни части от 25 ml ацетон и се оставя да се изсуши на въздух или в струя азот, след което се стрива на фин прах в хаван. Забележка: Сухият изолиран казеин следва да бъде съхраняван при – 20 °C. 6.1.2. Разграждане чрез плазмин на β-казеини за интензифициране на γ-казеини 25 mg изолирани казеини (6.1.1) се разпръскват в 0,5 ml буфер с амониев карбонат (4.7.1) и се хомогенизират за 20 минути, например чрез обработка с ултразвук. Подгрява се до 40 °C и се добавя 10 μl плазмин (4.7.2), смесва се и се инкубира за един час при 40 °C с непрекъснато разклащане. За да се инхибира ензимът, се добавя 20 μl разтвор на ε-аминокапронова киселина (4.7.3), след това се добавят 200 mg твърда уреа и 2 mg дитиотрейтол. Забележка: За да се получи по-голяма симетрия на фокусираните казеинови ивици е препоръчително разтворът да се изсуши чрез сублимиране след добавянето на ε-аминокапронова киселина, като след това утайките се разредят в 0,5 ml буфер за разтваряне на протеин (4.6). 6.2. Приготвяне на полиакриламидни гелове, съдържащи уреа С помощта на няколко капки вода листът носител на гел (5.2) се разстила върху стъклена плоча (5.1), като излизащата навън вода се отстранява с хартиена салфетка. По същия начин покривният лист (5.3) с ограничители (0,25 mm) се разстила върху друга стъклена плоча. Плочата се поставя хоризонтално върху нивелирна маса. Към приготвения и с отстранен въздух разтвор на гел (4.1.2) се добавят 10 μl Temed (4.1.3.1), разклаща се и се добавят 10 μl разтвор на PER (4.1.3.2), внимателно се смесва и веднага се излива равномерно в центъра на покривния лист. Единият край на плочата с носителя на гела (с листа надолу) се поставя върху плочата с покривния лист и плочата се сваля бавно надолу, така че между листовете да се образува и разстеле равномерно филм от гел, без да се образуват мехурчета (фигура 3). Плочата с носителя на гела се оставя внимателно да легне напълно с помощта на тънка шпатула и върху нея се поставят още три стъклени плочи за тежест. След завършването на полимеризацията (около 60 минути) полимеризираният гел върху плочата носител на гела и върху покривния лист се изважда чрез разделяне на стъклените плочи. Обратната страна на листа носител се почиства внимателно, за да се отстранят остатъците от гела и уреата. „Гел-сандвичът“ се навива и залепва на тръбичка и се съхранява в хладилник (максимум шест седмици). Забележка: Покривният лист с ограничителите може да бъде използван повторно. Полиакриламидният гел може да бъде нарязан на по-малки части, което е препоръчително, когато има няколко проби или ако се използва автоматично устройство за електрофореза (два гела, с размер 4,5 × 5 сm). 6.3. Изоелектрическо фокусиране Охлаждащият термостат се настройва на 12 °C. Обратната страна на листа носител на гел се избърсва с керосин, след това в центъра на охлаждащия блок се капват няколко капки керосин (4.2.). След това „гел-сандвичът“ се разстила върху него със страната на носителя надолу, като се внимава да не се образуват мехурчета. Излишният керосин се избърсва и покривният лист се отстранява. Електродните ленти се напояват с електродните разтвори (4.3, 4.4), изрязват се до дължината на гела и се поставят на предвидените места (разстояние на електродите 9,5 cm). Условия за изоелектрическо фокусиране: 6.3.1. Размер на гела 265 × 125 × 0,25 mm
Забележка: Ако плътността или ширината на геловете се променят, стойностите за електрически ток и мощност следва да се адаптират по подходящ начин (напр. удвояване на стойностите за електрически ток и за мощност, ако се използва гел с размери 265 × 125 × 0,5 mm). 6.3.2. Пример за програмиране на автоматично устройство за електрофореза (2 гела с размери 5,0 × 4,5 cm); електродите без ленти се поставят направо върху гела
В стъпка 2 апликаторът на пробата се поставя на 0 Vh. В стъпка 2 апликаторът на пробата се отстранява при 30 Vh. 6.4. Оцветяване на протеин 6.4.1. Фиксиране на протеин Електродните ленти се отстраняват веднага след изключване на захранването и гелът незабавно се поставя в съд за оцветяване/обезцветяване, пълен с 200 ml фиксатор (4.9); оставя се за 15 минути, като непрекъснато се разклаща. 6.4.2. Измиване и оцветяване на плочата с гел Фиксаторът се отцежда внимателно и плочата с гел се измива два пъти за по 30 секунди, всеки път със 100 ml обезцветяващ разтвор (4.10). Обезцветяващият разтвор се излива и съдът се пълни с 250 ml оцветяващ разтвор (4.11.3); оставя се да се оцвети за 45 минути с леко разклащане. 6.4.3. Обезцветяване на плочата с гел Оцветяващият разтвор се излива, плочата с гел се измива два пъти, като всеки път се използва по 100 ml обезцветяващ разтвор (4.10), след това се разклаща с 200 ml обезцветяващ разтвор за 15 минути и обезцветяването се повтаря най-малко два или три пъти, докато основата стане чиста и безцветна. След това плочата с гел се изплаква с дестилирана вода (2 × 2 минути) и се изсушава на въздух (от 2 до 3 часа) или със сешоар (от 10 до 15 минути). Забележка 1: Фиксирането, измиването, оцветяването и обезцветяването се извършват при 20 °C. Да не се използват високи температури. Забележка 2: Ако се предпочита по-чувствително сребърно оцветяване (напр. кит за сребърно оцветяване, протеин, Pharmacia Biotech, код No 17-1150-01), пробите от казеин, третирани с плазмин, следва да бъдат разредени до 5 mg/ml. 7. ОЦЕНКА Оценяването се извършва чрез сравняване на ивиците на протеините в непознатата проба с референтни проби върху същия гел. Откриването на краве мляко в сирена, произведени от овче мляко, козе мляко, биволско мляко, или смеси от овче, козе и биволско мляко, се извършва чрез γ3- и γ2-казеини, чийто обхват на изоелектрически точки е между pH 6,5 и pH 7,5 (фигури 4 a и б, фигура 5). Границата на откриване е по-ниска от 0,5 %. 7.1. Визуална оценка За визуална оценка на количеството краве мляко се препоръчва да се адаптират концентрациите на пробите и стандартите за получаване на същото ниво на интензивност на овчи, кози и/или биволски γ2- и γ3-казеини (виж „γ2 E,G,B“ и „γ3 E,G,B“ на фигури 4 a и б и фигура 5). След това количеството на кравето мляко (по-малко от, равно на или по-голямо от 1 %) в непознатата проба може да бъде оценявано директно чрез сравняване на интензитета на крави γ3- и γ2-казеини (виж „γ3 C“ и „γ2 C“ на фигури 4 a и б и фигура 5) с тези на 0 % и 1 % референтни стандарти (овчи, кози) или вътрешнолабораторни стандарти (биволски). 7.2. Денсиметрична оценка Ако е приложимо, за определянето на съотношението на площта на пика на крави спрямо овчи, кози и/или биволски γ2- и γ3-казеини (вж. фигура 5) се използва денсиметър (5.19). Тази стойност се сравнява със съотношението на площта на пика на γ2- и γ3-казеини от 1 % референтния стандарт (овчи, кози) или вътрешнолабораторен стандарт (биволски), анализирани върху същия гел. Забележка: Методът функционира задоволително, ако има ясен положителен сигнал за двата крави γ2- и γ3-казеина в 1 % референтния стандарт, но не и в 0 % референтния стандарт. Ако няма, процедурата се оптимизира, като точно се спазват детайлите на метода. Пробата се оценява като положителна, ако двата крави γ2- и γ3-казеина или съответните съотношения на площта на пиковете са равни или по-големи от нивото на 1 % референтен стандарт. 8. ЗА СПРАВКА Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. (Използване на плазмин за увеличаване на чувствителността на откриване на краве мляко в овче и/или козе сирене с изоелектрическо фокусиране с гел на γ2-казеини). Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990 г.). Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting (Контролен метод за откриване на краве мляко в овче и биволско сирене чрез използване на имуноблотинг). Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995 г.). Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier (Чувствително откриване на краве мляко в овче и козе мляко и сирене чрез амфолит-носител и амфолит-носител/неутрализиран pH градиент — изоелектрическо фокусиране на γ-казеини с помощта на плазмин като индикаторен фермент) в: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.), стр 389—393, Bode-Verlag, München (1989 г.). Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen (Откриване на краве мляко в овче и козе мляко и сирене чрез изоелектрическо фокусиране в полиакриламидни гелове, съдържащи уреа). Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982). Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films (Изоелектрическо фокусиране със свръхтънък слой в 50-100 μm полиакриламидни гелове върху силанизирани стъклени съдове или полиестерни филми). Electrophoresis 1, 43-56 (1980 г.). Фигура 1 Схематично представяне на покривния лист 
Полиестерен лист Разделителна лента Фигура 2 Слой казеин между водната и органичната фази след центрофугиране 
H2O-фаза Казеин CH2Cl2-фаза Фигура 3 Техника на захлупване за изливане на свръхтънки полиакриламидни гелове
a = разделителна лента (0,25 mm); b = покривен лист (5.3); c, e = стъклени плочи (5.1); d = разтвор на гел (4.1.2); f = лист носител на гел (5.2) Фигура 4a Изоелектрическо фокусиране на третирани с плазмин казеини от сирене, произведено от овче и от козе мляко и съдържащо различни количества краве мляко
% CM = процент краве мляко, C = краве, E = овче, G = козе Показана е горната половина на гел IEF. Фигура 4б Изоелектрическо фокусиране на третирани с плазмин казеини от сирене, произведено от смеси от овче, козе и биволско мляко и съдържащо различни количества краве мляко
% CM = процент краве мляко; 1 + = проба, съдържаща 1 % краве мляко и прибавен чист крави казеин в средата на пътеката. C = краве, E = овче, G = козе, B = биволско Показано е общото разстояние на разделяне на гела IEF. Фигура 5 Поредица денситограми на стандартните проби (STD) и пробите сирене, произведено от смес от овче и козе мляко, след изоелектрическо фокусиране
a,b = стандартни проби, съдържащи 0 и 1 % краве мляко; c-g = проби сирене, съдържащи 0, 1, 2, 3 и 7 % краве мляко. C = краве, E = овче, G = козе. Сканирана е горната половина от гела IEF при λ = 634 nm. „ПРИЛОЖЕНИЕ IX Оценка на анализите 1. Осигуряване на качеството Анализите се извършват от лаборатории, определени в съответствие с член 12 от Регламент (ЕО) № 882/2004 (**), или определени от компетентните органи на държавата членка. 2. Вземане на проби и оспорвания на резултатите от анализите
„Допълнение Оценка на съответствието на дадена партида със законно установените гранични стойности 1. Принцип В случаите, в които законодателството относно публичната интервенция и помощта за частно складиране предвижда подробни процедури за вземане на проби, се следват тези процедури. Във всички останали случаи се използва проба от най-малко три единични проби, взети на случаен принцип от партидата, подлежаща на контрол. Възможно е подготвянето на съставна проба. Полученият резултат се сравнява със законно установените гранични стойности чрез изчисляване на 95 % доверителен интервал като 2 х стандартно отклонение, където съответното стандартно отклонение зависи от това дали: 1. методът е валидиран посредством международно сътрудничество със стойности за σr и σR, или 2. в случай на вътрешно валидиране, е била изчислена вътрешната възпроизводимост. Този доверителен интервал в такъв случай ще се равнява на неопределеността на резултата при измерването. 2. Методът е валидиран посредством международно сътрудничество В такъв случай стандартното отклонение на повторяемостта σr и стандартното отклонение на възпроизводимостта σR са установени и лабораторията може да докаже, че се спазват работните характеристики на валидирания метод. Изчислява се средноаритметичната стойност Изчислява се разширената неопределеност (k = 2) за
Ако крайният резултат x от измерването се изчислява с използването на формула от вида:, x = y 1 + y 2, x = y 1 – y 2, x = y 1 · y 2 или x = y 1/y 2, трябва да се спазват обичайните процедури за съчетаване на стандартни отклонения в подобни случаи. Партидата се преценява като несъответстваща с горната законно установена гранична стойност UL, ако
в противен случай се преценява като съответстваща на UL. Партидата се преценява като несъответстваща с долната законно установена гранична стойност LL, ако
в противен случай се преценява като съответстваща на LL. 3. Вътрешно валидиране с изчисляване на стандартното отклонение на вътрешната възпроизводимост В случаите, когато се използват методи, непосочени в настоящия регламент, и не са били въведени измервания за точност, се извършва вътрешно валидиране. Във формулите за изчисляване на разширената неопределеност U се използват стандартното отклонение на вътрешната повторяемост σir и стандартното отклонение на вътрешната възпроизводимост σi R вместо съответно σr и σ R . Правилата, които трябва да се следват, за да се установи спазването на законно установените гранични стойности, са посочени в точка 1. Ако обаче партидата се прецени като несъответстваща със законно установената гранична стойност, измерванията се повтарят с метода, посочен в настоящия регламент, и резултатът се оценява съгласно точка 1.
“ |
(1) Методът, който ще бъде използван, се одобрява от разплащателната агенция.
(2) Анализите на обгорели частички може да се извършват систематично. Те обаче се извършват винаги, когато не се провеждат сензорни проверки.
(3) Методът, който ще бъде използван, се одобрява от разплащателната агенция (един или двата метода).
(4) Методът, който ще бъде използван, се одобрява от разплащателната агенция.
(5) Сензорни проверки се извършват, когато това се счита за необходимо след анализ на риска, одобрен от разплащателната агенция.
(6) Методът, който ще бъде използван, се одобрява от разплащателната агенция.
(7) Поставяне на пробата: след предварителното фокусиране (стъпка 1) върху апликаторите на проби (10 × 5 mm) се капват 18 μl от пробата и от стандартните разтвори, поставят се върху гела на разстояние 1 mm един от друг и на 5 mm надлъжно от анода и се притискат леко. Извършва се фокусирането при горните условия, като апликаторите на проби се отстраняват внимателно след 60 минути фокусиране.