1.1.1.1.

Натоварете плаките ELISA с рекомбиниран вирус на АЧК-4 VP7, разреден в карбонатно-бикарбонатен буфер с pH 9,6. Инкубирайте плаките в продължение на една нощ при 4 °C.

1.1.1.2.

Промийте петкратно плаките с дестилирана вода, съдържаща 0,01 % (v/v) Tween 20 (измиващ разтвор). Внимателно оставете плаките върху абсорбиращ материал, за да премахнете остатъчен измиващ разтвор.

1.1.1.3.

Накапете плаките с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) с pH 7,2 + 5 % (w/v) обезмаслено мляко (обезмаслено сухо мляко Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/ямка за 1 час при 37 °C.

1.1.1.4.

Отстранете блокиращия разтвор и подсушете внимателно плаките с абсорбиращ материал.

1.1.2.1.

Серумните проби за тестване, положителните и отрицателните контролни серуми се разреждат 1 към 25 във фосфатно буфериран физиологичен разтвор + 5 % (w/v) обезмаслено мляко + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl за ямка. Инкубирайте в продължение на 1 час при температура 37 °C.

За титруване направете двойна серия разреждане от 1 към 25 (100 μl/ямка), един серум на колонка от плаки, и направете същото с положителните и с отрицателните контроли. Инкубирайте в продължение на 1 час при температура 37 °C.

1.1.2.2.

Промийте петкратно плаките с дестилирана вода, съдържаща 0,01 % (v/v) Tween 20 (измиващ разтвор). Внимателно оставете плаките върху абсорбиращ материал, за да премахнете остатъчен измиващ разтвор.

1.1.3.1.

Смесете 100 μl/ямка от пероксидаза от хрян — смесена с антиконски гама-глобулин, разреден във фосфатно буфериран физиологичен разтвор + 5 % мляко + 0,05 % Tween 20 с pH 7,2. Инкубирайте в продължение на 1 час при температура 37 °C.

1.1.3.2.

Промийте петкратно плаките с дестилирана вода, съдържаща 0,01 % (v/v) Tween 20 (измиващ разтвор). Внимателно оставете плаките върху абсорбиращ материал, за да премахнете остатъчен измиващ разтвор.

1.1.4.1.

Добавете 200 μl/ямка от разтвор хромоген/субстрат (10 ml от 80,6 mM DMAB (диметил аминобензалдехид) + 10 ml от 1,56 mM MBTH (3-метил-2-бензо-тиазолин хидразон хидрохлорид) + 5 μl H2O2).

Цветната реакция се спира чрез прибавяне на 50 μl 3N H2SO4 след около 5—10 минути (преди отрицателната контрола да започне да се оцветява).

Други хромогени като ABTS (2,2′-Азино-бис-[3-етилбензоатиазолин-6-сулфонова киселина]), TMB (тетраметил бензидин) или OPD (орто-фетилдиамин) могат също да се използват.

1.1.4.2.

Отчетете плаките при 600 nm (или 620 nm).

1.2.1.

Изчислете праговата стойност чрез добавяне на 0,06 към стойността на отрицателната контрола (0,06 е стандартното отклонение, получено от група от 30 отрицателни серума).

1.2.2.

Тестови проби, даващи стойности на поглъщане под праговата стойност, се считат за отрицателни.

1.2.3.

Тестови проби, даващи стойности на поглъщане над праговата стойност + 0,15 се считат за положителни.

1.2.4.

Тестови проби, даващи усреднени стойности на поглъщане, се считат за недостатъчни за формулиране на заключение и трябва да се приложи втора техника за потвърждаване на резултата.

2.1.1.1.

Плаките ELISA се покриват с 50-100 ng рекомбинант AHSV-4 VP7, разреден с карбонатен/бикарбонатен буфер, pH 9,6. Инкубирайте плаките за една нощ при 4 °C.

2.1.1.2.

Измийте плаките три пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) 0,1x, съдържащ 0,135 M NaCl и 0,05 % (v/v) Tween 20. Внимателно оставете плаките върху абсорбиращ материал, за да премахнете остатъчен измиващ разтвор.

2.1.2.1.

Серумните проби за тестване, положителните и отрицателните контролни серуми се разреждат 1 към 5 в разредител, съдържащ 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 и 0,1 % Kathon, 100 μl за ямка. Инкубирайте в продължение на 1 час при температура 37 °C.

За титруване направете двойна серия разреждане на тестовите серуми от 1 към 10 до 1 към 280 в 8 ямки (100 μl/ямка), един серум на колонка от плаки, и направете същото с положителните и с отрицателните контроли. Инкубирайте в продължение на 1 час при температура 37 °C.

2.1.2.2.

Измийте плаките пет пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) 0,1×, съдържащ 0,135 M NaCl и 0,05 % (v/v) Tween 20. Внимателно оставете плаките върху абсорбиращ материал, за да премахнете остатъчен измиващ разтвор.

2.1.3.1.

Смесете 100 μl/ямка от пероксидаза от хрян — конюгиран Mab анти-VP7. Преди това този Mab е бил разреден 1/5 000–1/15 000 в 1/1 разтвор на StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics. Reference: SZ03) в дестилирана вода. Инкубирайте 30 минути при температура 37 °C.

2.1.3.2.

Измийте плаките пет пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) 0,1×, съдържащ 0,135 M NaCl и 0,05 % (v/v) Tween 20. Внимателно оставете плаките върху абсорбиращ материал, за да премахнете остатъчен измиващ разтвор.

2.2.1.

Определете процента на блокиране (BP) на всяка проба, като прилагате следната формула, в която съкращението Abs означава антитела:

2.2.2.

Проби, чиято BP стойност е по-висока от 50 %, следва да се считат за положителни за антитела на вируса на АЧК.

2.2.3.

Проби, чиято BP стойност е по-ниска от 45 %, следва да се считат за отрицателни за антитела на вируса на АЧК.

2.2.4.

Проби, чиято BP стойност е между 45 % и 50 %, следва да се считат за недостатъчни за формулиране на заключение и трябва повторно да бъдат подложени на тест. Ако резултатът отново е недостатъчен за формулиране на заключение, животните следва отново да бъдат изследвани не по-рано от две седмици след вземането на пробата, която е счетена за недостатъчна за формулиране на заключение.

—

фенол-хлороформно извличане на нуклеинови киселини;

—

адсорбция на нуклеинови киселини върху филтърна система;

—

адсорбция на нуклеинови киселини върху система от магнитни топчета.

1.1.

1 g тъканна проба се хомогенизира с 1 ml денатуриран разтвор (4 M гуанидиум тиоцианат, 25 mM натриев цитрат, 0,1 М 2-меркаптоетанол, 0,5 % саркозил).

1.2.

След центрофугирането към супернатанта се добавят 1 μg от РНК от дрожди, 0,1 ml от 2 M натриев ацетат, pH 4, 1 ml от фенол и 0,2 ml смес хлороформ/изоамилов алкохол (49/1).

1.3.

Суспензията се разклаща енергично и се охлажда върху лед за 15 минути.

1.4.

След центрофугирането РНК, присъстваща във водната фаза, се извлича във фенол, утаява се в етанол и повторно се суспендира в стерилна вода.

—

прав праймер

5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′

—

обратен праймер

5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′

—

сонда MGB-TaqMan

5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′

2.1.1.

Концентрацията на праймерите се разрежда до работна концентрация от 8 μM („8 μM работен запас (сток) от праймер“), а сондата се разрежда до работна концентрация 50 μM („50 μM работен запас от сонда“). Формулата на тестовата плака следва да бъде проектирана и въведена в софтуера на машината за PCR в реално време. Като за ориентир се използва формулата, 2,5 μl от всеки работен запас от праймера от 8 μM се добавя към всяка ямка, която съдържа проби от РНК, положителни и/или отрицателни контроли (окончателната концентрация на праймера е 1 μM в 20 μl смес RT-PCR). Плаката се държи върху лед.

2.1.2.

2 μl от изолирана РНК (тестови проби и положителни контроли) или 2 μl вода без РНКаза в контролна проба с отрицателна реакция се смесва с прав и обратен праймер. Тази смес се денатурира чрез нагряване при температура 95 °C в продължение на 5 минути, след което бързо се охлажда върху лед в продължение на най-малко 5 минути.

2.1.3.

Съгласно инструкциите на производителя се подготвя необходимият обем от едностъпална RT-PCR в реално време (основна смес) за няколко проби за изследване. 0,1μl от работен запас от сондата от 50 μM се добавя към всяка ямка, съдържаща проби от РНК (окончателната концентрация на сондата е 0,25 μM във всяка ямка, съдържаща проби от РНК). 13 μl от основната смес от едностъпална RT-PCR в реално време се разпределя във всяка ямка на PCR плаката, съдържаща денатурираните праймери и РНК.

2.1.4.

Плаката се поставя в термоциклер за анализ в реално време, програмиран за обратна транскриптаза и за откриване на кДНК амплификация/флуоресценция. Условията за амплификация се състоят от: като първа стъпка обратна транскриптаза при 48 °C в продължение на 25 минути, последвано от 10 минути при температура 95 °C („hot start“) и 40 цикъла от 15 секунди при температура 95 °C, 35 секунди при температура 55 °C и 30 секунди при температура 72 °С (или 40 цикъла при температура 97 °C в продължение на 2 секунди и 55 °C в продължение на 30 секунди, ако се използват реагенти и термоциклер, позволяващи бърза реакция). Данните за флуоресценция се получават в края на стъпката при 55 °C.

2.1.5.

Анализът се счита за невалиден, ако се получат атипични криви на амплификацията, и трябва да се повтори.

Пробите се считат за положителни, ако Ct стойността (стойност на цикъла, при която генерираната при реакцията флуоресценция преминава прага на флуоресценцията) е по-ниска от или равна на определения Ct праг (35) в рамките на 40 PCR цикъла (Ct ≤ 35).

Пробите се считат за недостатъчни за формулиране на заключение, ако Ct стойността е над определения Ct праг (35) в рамките на 40 PCR цикъла (Ct ≥ 35).

Пробите се считат за отрицателни, ако се получи хоризонтална крива на амплификацията, която не преминава прага в рамките на 40 PCR цикли.

—

прав праймер

5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′

—

обратен праймер

5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′

—

сонда MGB-TaqMan

5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′

2.2.1.

Смесите на стоков разтвор от праймер и сонда се приготвят в концентрация 25× при 5 μΜ за прави и обратни праймери и 3 μΜ за сондата. Формулата на тестовата плака следва да бъде проектирана и въведена в софтуера на машината за PCR в реално време. Като за ориентир се използва формулата, към съответните ямки на плаката се добавят 5 μl от РНК пробите, включително тестови проби и положителни и отрицателни контроли съгласно структурата.

2.2.2.

РНК се денатурира чрез нагряване при температура 95 °C в продължение на 5 минути, последвано от бързо охлаждане върху лед в продължение на най-малко 3 минути.

2.2.3.

Съгласно инструкциите на производителя се подготвя необходимият обем от едностъпална RT-PCR в реално време (основна смес) за няколко проби за изследване. 1 μl от концентрирания 25× стоков разтвор от праймер и сонда (от точка 2.2.1 по-горе) се включва в основната смес, за да може във всяка ямка да се получи крайна концентрация от 200 nM за всеки праймер и 120 nM за сондата. 20 μl от основната смес се разпределя във всяка ямка на PCR плаката, съдържаща денатурирана РНК.

2.2.4.

Плаката се поставя в термоциклер в реално време, програмиран за обратна транскриптаза и за откриване на cDNA амплификация/флуоресценция съгласно насоките на производителите. Условията за амплификация включват например като първа стъпка обратна транскриптаза при температура 48 °C в продължение на 10 минути, последвано от 10 минути при температура 95 °C и 40 цикъла в продължение на 15 секунди при температура 95 °C и 45 секунди при 60 °C.

2.2.5.

Пробите се считат за положителни, ако нормализираната флуоресценция за анализа RT-PCR на вируса на АЧК надвишава прага от 0,1 в рамките на 36 PCR цикъла във всички повтарящи се проби.

Пробите се считат за недостатъчни за формулиране на заключение, ако нормализираната флуоресценция за анализа RT-PCR на вируса на АЧК надвишава прага от 0,1 между 36 и 40 PCR цикъла във всички повтарящи се проби.

Пробите се считат за отрицателни, ако нормализираната флуоресценция за анализа RT-PCR на вируса на АЧК не надвишава прага от 0,1 в рамките на 40 PCR цикъла във всички повтарящи се проби и ако нормализираната флуоресценция за патентования синтетичен външен контрол надвишава прага от 0,1 в рамките на 33 PCR цикъла.“