относно вземането на проби и приемането на подробни правила във връзка с физическите прегледи на говежди разфасовки без кости, които подлежат на възстановяване при износ

като взе предвид Договора за създаване на Европейската общност,

като взе предвид Регламент (ЕО) № 1254/1999 на Съвета от 17 май 1999 г. относно общата организация на пазара на говеждо и телешко месо (1), последно изменен с Регламент (ЕО) № 2345/2001 на Комисията (2), и по-специално член 33, параграф 12 от него,

като взе предвид Регламент (ЕИО) № 386/90 на Съвета от 12 февруари 1990 г. относно контрола върху износа на селскостопански продукти, за които се отпускат възстановявания или други суми (3), последно изменен с Регламент (ЕО) № 163/94 (4), и по-специално член 6 от него,

1. Настоящият регламент се прилага в случаите на физически проверки на естеството и характеристиките на продуктите, по смисъла на член 2, буква а) от Регламент (ЕИО) № 386/90 относно:

2. Описанието на продуктите, посочени в параграф 1, ще бъде това, което се съдържа в номенклатурата за селскостопанските продукти, подлежащи на получаване на възстановявания при износ, установена в сектор 5 от приложение I към Регламент (ЕИО) № 3846/87 на Комисията.

1. За целите на физическите проверки пробите ще включват два цели кашона, взети от различни части на партидата. Първият кашон ще е за органите, отговорни за проверките, докато вторият ще бъде пазен като резерва под надзора на митническите власти.

2. Цялото количество продукти, за които се отнасят една от следните декларации, ще се смята, че съставляват една партида:

За целите на проверките относно спазване условията, посочени в член 1, параграф 1, буква а), митническите власти ще проверяват дали всяка разфасовка в първия кашон от пробата, посочена в член 2, е опакована поотделно, и че никой от пакетите не съдържа повече от един вид разфасовки. Ако това не е така, на същата проверка ще бъде подложен и вторият кашон.

Когато, при съпоставяне на двата кашона, не повече от една разфасовка се окаже опакована не поотделно или само един от пакетите съдържа повече от един вид разфасовки, а всички други условия за предоставяне на възстановяване при износ са спазени, партидата няма да бъде сметната за невалидна. Ако не са спазени тези условия, се отбелязва нарушение.

Когато се установи нарушение, възстановяването, което следва да бъде изплатено за тази партида, ще бъде изчислено на базата на коригираното тегло. Коригираното тегло ще се получава като от декларираното нетно тегло се извади определен процент, отговарящ на теглото на разфасовките, които не отговарят на изискванията по отношение на общото нетно тегло на пробата.

За целите на проверките на условието за произход, посочено в член 1, параграф 1, буква б), пробата за анализ ще включва една или две разфасовки, подбрани произволно от първия кашон от пробата, посочена в член 2. Когато анализът покаже, че в пробата е налично месо, различно от месо говеждо с произход възрастни мъжки животни от рода на едрия рогат добитък, няма да бъде отпускано никакво възстановяване.

Проверките ще се извършват в съответствие с методологията, описана в приложението към настоящия регламент.

Без да се засягат по-нататъшни проверки в случаите, когато има подозрения за нарушение, проверките ще се извършват произволно, покривайки всички експортни операции на не по-малко от една трета от операциите, избрани за извършване на физическата проверка.

За целите на проверките относно спазване на условието, посочено в член 1, параграф 1, буква в), цялото съдържание на първия кашон от пробата, посочена в член 2 ще бъде накълцано, докато се получи хомогенна смес. Когато съдържанието на месо без тлъстини е под минималното определено количество, съдържанието на втория кашон ще бъде изследвано по същия начин. Когато средната стойност за двата кашона е под средното съдържание на месо без тлъстини, няма да бъде отпускано никакво възстановяване.

В съответствие с член 68 и без да се засяга член 78 от Регламент (ЕИО) № 2913/92 на Съвета (13), пробите ще се събират и проверяват по начина, определен в настоящия регламент, веднага след като са приети и проверени декларациите, посочени в член 2, параграф 2.

Настоящият регламент влиза в сила на 1 юли 2002 г.

Той ще се прилага за операции, за които се прилага декларация, посочена в член 2, параграф 2, като такава декларация се прилага от 1 юли 2002 г.

ПРИЛОЖЕНИЕ

АНАЛИЗ НА ПРОИЗХОДА НА НЯКОИ ГОВЕЖДИ РАЗФАСОВКИ БЕЗ КОСТИ С ПРОИЗХОД ВЪЗРАСТНИ МЪЖКИ ЖИВОТНИ ОТ РОДА НА ЕДРИЯ РОГАТ ДОБИТЪК

Методология, която следва да бъде прилагана при определяне пола на животното, от което е месото

Методологията, която следва да бъде прилагана, се базира на полимеразна верижна реакция (ПВР) и включва избиране на проба, екстрахиране на ДНК, полимеразна верижна реакция и електрофореза на гел.

1. Избиране на проба и част от пробата

Частта от пробата следва да бъде разрязана от вътрешната част на предоставеното парче месо, като се използва стерилен (*) нож (скалпел или подобен нож). Същата проба след това следва да бъде смляна, използвайки мелачка за ситно мелене на месо, или разрязана на по-малки парченца, за да се осигури разумна ефикасност на екстрахирането.

Пробите трябва да се приготвят на различно работно място от това, което се използва за провеждане на полимеразната верижна реакция. Боравенето с материала трябва да се извършва в среда, която може да се почиства лесно, по възможност на чиста работна маса, за да се гарантира, че няма да се получи взаимно замърсяване с други проби.

За приготовлението на месната проба следва да се използват стерилни (*) остриета, скалпели или подобни инструменти.

2. Екстрахиране и пречистване на ДНК

Екстрахиране и пречистване на ДНК трябва да бъде постигнато или като се използват общоприети процедури (1), предварително подготвени и готови за употреба комплекти от инструменти (базирани на следния принцип: разтваряне на месната проба в лизисен буфер, който съдържа сурфактанти, детергенти и протеиназа К, прилагане на разтворената проба към фиксираща смола за ДНК, отстраняване на субстанции с произход, различен от ДНК, чрез неколкократно измиване, и накрая прехвърляне на пречистената ДНК във вода или буферен разтвор с ниско съдържание на соли), или екстрахирането на ДНК на стане чрез потапянето ѝ в разтвор от натриев хидроксид (2).

Препоръчва се контрол на ефикасността на екстрахиране чрез електрофореза на гел, но това не е задължително.

Валидация: за всяка група проби, от които ще се екстрахира ДНК, паралелно ще се провежда една контролна екстракция (т.е. ще се изтегля от проба, която не съдържа месо), с цел да се докаже верността на приложената процедура.

3. Полимеразна верижна реакция (ПВР)

Принцип: принципът на полимеразната верижна реакция е процедура от три етапа (денатурация, хибридиране на праймери, елонгация), която следва да се повтори от 25 до 40 пъти (брой на „циклите“ в метода). Реагентите (буферен разтвор за реакцията, MgCl2, дезоксинуклеотиди, праймери, устойчива на топлина ДНК-полимераза, стерилна вода) се смесват съгласно разработения метод, като така се получава реакционна смес. Специално отделени пипети следва да бъдат използвани за приготвянето на тази реакционна смес. Реакционната смес след това се прибавя към ДНК-шаблона (екстрахираната ДНК). Реакцията се провежда в термоцикличен уред. След края на полимеразната верижна реакция нейните продукти се анализират чрез електрофореза на гел или се съхраняват при температури 4 °С или при –20 °С.

Препоръчителният (3) метод, който следва да се прилага по отношение на шаблона, трябва да допълни или ред от локус от амелогенин (когато се касае за хомологов ген), или ред от региона ZFX/Y (полимеразна верижна реакция, специфична за всеки алел).

Специфични матрици за тези два метода са следните:

Amelogenin forward: 5'-CAGCCAAACCTCCCTCTGC-3'

Amelogenin reverse: 5'-CCCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC-3'

(Ennis, S., and Gallagher, T.F. (1994) Anim. Genet. 25: 425-427)

Amelogenin forward: 5'-AAATTCTCTCACAGTCCAAG-3'

Amelogenin reverse: 5'-CAACAGGTAATTTTCCTTTAG-3'

(Chen, C.M., Hu, C.L., Wang, C.H., Hung, C.M., Wu, H.K., Choo, K.B., and Cheng, W.T.K. (1999) Mol. Reprod. Dev. 54, 209-214)

ZFX (алел-специфична полимеразна верижна реакция), forward: 5'-GACAGCTGAACAAGTGTTACTG-3'

ZFX (алел-специфична полимеразна верижна реакция), reverse: 5'-AATGTCACACTTGAATCGCATC-3'

ZFY (алел-специфична полимеразна верижна реакция), forward: 5'-GAAGGCCTTCGAATGTGATAAC-3'

ZFY (алел-специфична полимеразна верижна реакция), reverse: 5'-CTGACAAAAGGTGGCGATTTCA-3'

(Kirkpatrick, B.W., and Monson, R.L. (1993) J. Reprod. Fertil. 98: 335-340)

ZFX forward: 5'-AGCTGAACAAGGGTTACTG-3'

ZFY forward: 5'-CAAGCTTACCAGCAAGTCA-3'

ZFX/Y reverse: 5'-CCAGTATGGATTCGCATGT-3'

(Zinovieva, N., Palma, G., Müller, M., and Brem G. (1995) Theriogenology 43: 265)

Т.нар. реакционни смеси на полимеразната верижна реакция трябва да се приготвят на чиста работна маса, която предварително е почистена от замърсители след предишна работа, използвайки детергенти и ултравиолетови лъчи.

—

Развиване на методи: може да се наложат промени в така публикуваните методи, например в точното съдържание на реакционната смес (например концентрацията на магнезиевия хлорид (MgCl2), концентрацията на матриците), количеството използвана ДНК и адаптирана температурна програма (температури и време на престой). Появата на неспецифични продукти за допълване ще довежда до оптимизиране (например температура на хибридиране, концентрация на магнезиевия хлорид, концентрация на матриците, и т.н.), за да се гарантира точността на резултатите.

—

Валидация: методът, който следва да се използва в рутинните анализи, трябва да се оцени по подходящ начин. Анализ на следните контролни проби трябва да бъде включен в комплекта проби: екстрахиране на ДНК от контролна проба (в която няма месо), отрицателна проба на полимеразна верижна реакция и контролни проби (говеждо месо от мъжко и женско животно, както и една проба от месо, различно от говеждо). Нещо повече, повторна валидация ще се прилага, ако ключовите компоненти в процедурата са сменени, например ДНК-полимеразата (различен доставчик на продукта) или матриците (нова партида).

—	Добрите лабораторни практики ще се смятат за задължителни, например правилно почистване и отстраняване на замърсявания от работното място и използваните инструменти, разпределяне на матриците на равни части, използване на специално пригодени пипети и т.н.

4. Анализ на ампликони чрез електрофореза върху гел

Фрагментите, получени в резултат от полимеразната верижна реакция (ампликони), следва да бъдат анализирани чрез електрофореза на гел. След завършване на електрофорезното отделяне могат да се използват или агарни гелове, оцветени с етидиев бромид или полиакриламидни гелове, примесени със сребро. За да се определи приблизителния размер на получените ампликони, върху гела трябва да се използва подходящ маркер на молекулярното тегло.

5. Документация

Получените резултати трябва да се документират по подходящ начин (изображение чрез гел, описание на резултатите, обръщане внимание на каквито и да било неочаквани резултати).

(*) Незамърсени с ДНК.

(1) Така, както това е описано в: Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (eds) in: Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989).

(2) Така, както това е описано в: Elphinestone, J.G., Hennessey, J., Wilson, J.K., and Stead, D.E. (1996) Bulletin OEPP/EPPO 26, 663-678.

(3) Методи на полимеразна верижна реакция освен препоръчителния, подлежат на одобрение от официално посочена референтна лаборатория.