„ПРИЛОЖЕНИЕ IV

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ВОСЪЧНОТО СЪДЪРЖАНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ГАЗОВО-ТЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЯ С КАПИЛЯРНА КОЛОНА

1.   ОБХВАТ

Този метод описва процедурата за установяване на восъчното съдържание на някои масла и мазнини при съответните опитни условия.

Методът може да се използва специално за разграничаване на маслиново масло, получено чрез пресоване и маслиново масло, получено чрез екстракция (масло от маслиново кюспе).

2.   ПРИНЦИП

Добавяне на подходящ вътрешен стандарт към мазнина или масло, след което се разделя на фракции посредством хроматография с колона с хидриран силициев гел.

3.   АПАРАТУРА

3.1.   Ерлен-майерова епруветка от 25 мл.

3.2.   Стъклена колба за хроматография, с вътрешен диаметър 15 мм и дължина 30-40 см.

Подходящ газово-течен хроматограф с капилярна колба, снабдена със система за директно въвеждане в колбата, състояща се от следното:

3.3.1.   Пещ с термостат за колбите, с капацитет да поддържа необходимата температура с точност до 1 °С.

3.3.2.   Студен инжектор за пряко въвеждане в колбата.

3.3.3.   Детектор с пламъчно йонизиране и конвертор-усилвател.

3.3.4.   Записващо-интегриращо устройство, приспособено за работа с конвертора-усилвател (3.3.3.), степен на реагиране под 1 секунда, с променлива скорост на хартията.

3.3.5.   Капилярна колба, стъклена или от силициева сплав, с дължина от 10 до 15 м и вътрешен диаметър от 0,25 до 0,32 мм, с вътрешно покритие от течност SE-52 или SЕ-54 или нейни еквиваленти, с еднаква дебелина на слоя от 0,10 до 0,30 μm.

3.4.   Микроспринцовка, приспособена за инжектиране в колба с капацитет от 10 μl, снабдена със закалена игла.

4.   РЕАГЕНТИ

4.1.   Силициев гел, сито 70/230, позиция 7754 по Мерк.

Гелът се поставя във фурна на 500 °С в продължение на 4 часа. Оставя се да се охлади, след това се добавя 2 % вода. Разклаща се до получаване на хомогенна каша. Държи се на тъмно най-малко 12 часа преди използване.

4.2.   n-хексан за хроматографията.

4.3.   Етилов етер за хроматографията.

4.4.   n-хептан за хроматографията.

4.5.   Стандартен разтвор на лаурил, арахидат, минимум 0,1 % (m/v) в хексан (вътрешен стандарт).

4.6.   Газ-носител: водород, чист, за газово-течната хроматография.

4.7.   Помощни газове:

—	чист водород, за газово-течната хроматография,

—	чист въздух, за газово-течната хроматография.

5.   ПРОЦЕДУРА

5.1.   Отделяне на восъчната фракция.

5.1.1.   Подготовка на хроматографската колба.

Разтваря се 15 г силициев гел, хидриран в 2 % в анхидриден n-хексан и се въвежда в колбата.

Оставя се да се утаи. Утаяването се завършва с помощта на електрически шейкър, за да се придаде по-голяма хомогенност на хроматографската лента. Вливат се 30 мл n-хексан, така че да се отстранят всички примеси.

5.1.2.   Хроматография в колба.

Претеглят се точно 500 мг от пробата в 25-милилитрова колба и се добавят подходящо количество вътрешен стандарт в зависимост от предполагаемото съдържание на восък, добавя се 0,1 мг лаурил арахидат в случай на маслиново масло и от 0,25 до 0,50 мг в случай на масло от маслинено кюспе.

Прехвърля се подготвената проба в хроматографската колба, подготвена в съответствие с точка 5.1., с помощта на две части от 2 мл n-хексан.

Оставя се разтворителят да изплува до 1 мм над горното ниво на абсорбента. След това се започва хроматографското елюиране; събират се 140 мл от разтвора n-хексан (етилов етер, в съотношение 99:1, при дебит от около 15 капки на всеки 10 секунди (2.1 мл/минута).

Изсушава се получената фракция в ротационен изпарител до отстраняването на почти целия разтворител. Последните два или три милилитра от разтворителя се отстраняват с помощта на слаб азотен ток, след което се добавят 10 мл n-хептан.

5.2.   Газово-течен хроматографски анализ.

5.2.1.   Предварителна процедура, подготовка на колбата.

5.2.1.1.   Монтира се колбата към газово-течния хроматограф, като се свързва входящият отвор към системата за връзка с колбата, а изходящият отвор — към детектора.

Проверява се апаратура за газово-течна хроматография (функциониране на газовите серпентини, работа на детектора и записващото устройство и т.н.).

5.2.1.2.   Ако колбата се използва за първи път, препоръчително е да бъде доведена до работно състояние. Прокарва се малък поток от газ през нея, след което се включва апаратурата за газово-течна хроматография. Постепенно се увеличава температурата до минимум 20 °С над работната температура (виж забележката). Тази температура се поддържа в продължение на минимум два часа, след което апаратурата се регулира до работни условия (регулира се притокът на газ, запалва се пламъкът, свързва се към електронното записващо устройство, регулира се температурата на пещта за колбата, регулира се детекторът и др.). Записва се сигналът при чувствителност минимум два пъти по-висока от изискваната за осъществяване на анализа. Основната графика трябва да бъде линейна, да няма никакви пикови точки и да отразява всички отклонения.

Негативните праволинейни отклонения показват, че свръзките с колбата не са в необходимото състояние; позитивните отклонения показват, че колбата не е била доведена до работно състояние по правилния начин.

Забележка: При подготовката се поддържа температура по всяко време с минимум 20 °С под максималната температура, препоръчана за използвания елюент.

5.2.2.   Избор на работни условия.

5.2.2.1.   Работните условия трябва да отговарят на следните общи изисквания:

—	температура на колбата: 80 °С първоначално, покачваща се с 30 °С/минута до 120 °С, след това се програмира покачване с 5 °С/минута до 340 °С,

—	температура на детектора: 350 °С,

—	линейна скорост на газа-носител: водород, 20 до 35 см/секунда,

—	чувствителност на инструмента: от 4 до 16 пъти по-голяма от минималното затихване,

—	чувствителност на записващо устройство: 1—2 mV, от долния край на скалата,

—	скорост на хартията: 30 см/час,

—	инжектирано количество: 0,5—1 μl разтвор.

Тези условия могат да претърпят изменения в зависимост от характеристиките на колбата и на газово-течната хроматографска апаратура (с цел получаване на хроматограми, отговарящи на следните изисквания: времето за задържане на вътрешния стандарт С32 трябва да бъде 25 ± 2 минути, като най-представителната върхова точка за восъците трябва да лежи между 60 и 100 % от дъното на скалата).

5.2.2.2.   Определят се пиковите интеграционни параметри по такъв начин, че да се получи правилна оценка на съответните върхови области.

5.2.3.   Провеждане на анализа.

5.2.3.1.   Взема се един μl от разтвора с помощта на 10 μl-микроспринцовка; изтегля се буталото до изпразване на иглата. Вкарва се иглата на спринцовката в инжекционната система и се инжектира бързо след 1 или 2 секунди. След около 5 секунди леко се изтегля иглата.

5.2.3.2.   Записването продължава до пълното елюиране на восъците.

Базовата линия трябва винаги да отговаря на изискванията (5.2.1.2).

5.2.4.   Определяне на пиковите стойности.

Определят се пиковите стойности на периодите на задържане, като се сравняват с тези на восъчни смеси, чиито стойности на периодите на задържане са известни, като последните са анализирани при еднакви условия.

Фигура 1 представя восъчната хроматограма на необработено маслиново масло.

5.2.5.   Качествен анализ.

5.2.5.1.   Определят се площите на пиковите стойности в съответствие с вътрешния стандарт и алифатните естери от С40 до С46 с помощта на интегратора.

5.2.5.2.   Определя се восъчното съдържание на всеки един от естерите в мг/кг от мазнината, с помощта на следната формула:

където:

Ах	=	площта на пиковата стойност на всеки естер;
Аs	=	площта на пиковата стойност на лаурил арахидата;
ms	=	масата на добавения лаурил арахидат, в мг;
m	=	на масата на взетата за установяване проба, в грамове

6.   ИЗРАЗЯВЯНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Отразяват се различните съдържания на восък, както и сборът на тези съдържания, в мг/кг мазнина.

„ПРИЛОЖЕНИЕ ХIV

ДОПЪЛНИТЕЛНИ БЕЛЕЖКИ 2, 3 И 4 КЪМ ГЛАВА 15 ОТ КОМБИНИРАНАТА НОМЕНКЛАТУРА

А.   Позиции 1509 и 1510 включват само маслата, получени единствено при преработка на маслини, чийто киселинен и стеролен състав има следните аналитични характеристики:

Таблица I: Състав на мастните киселини като % от общото съдържание на мастните киселини		Таблица II: Състав на стеролите като % от общото съдържание на стероли
Миристинова киселина	M 0,1	Холестерол	M 0,5
Линоленова киселина	M 0,9	Брасикастерол	M 0,2
Арахидонова киселина	M 0,7	Кампестерол	M 4,0
Ойкозенонова киселина	M 0,5	Стигмастерол (4)	< Кампестерол
Бееникова киселина	M 0,3	Бета-ситостерол (5)	m 93,0
Лигноцеринова киселина	M 0,5	Делта-7-стигмастерол	M 0,5
M= максимум m= минимум

Позиции 1509 и 1510 не включват химически преработено маслиново масло (и по-специално рe-естерифицирано маслиново масло) и смесите от маслиново масло и други масла. Наличието на ре-естерифицирано масло и други масла се установява посредством методите, включени в приложения V, VIII, Х А и Х Б към Регламент (ЕИО) № 2568/91.

Подпозиция 1509 10 включва само маслиново масло, определено в раздели I и II по-долу, получено единствено посредством механични или други физически средства при условия — и особено топлинни условия, — които не водят до нарушаване качествата на маслото и които не са били обект на никаква друга преработка освен измиване, декантиране, центрофугиране или филтриране. Маслата, получени от маслини посредством използването на разтворители, са включени в позиция 1510.

I.   По смисъла на подпозиция 1509 10 10„необработено маслиново масло за осветление“, независимо от неговата киселинност, означава маслиново масло със следните характеристики:

а)	съдържание на алифатни алкохоли не по-голямо от 400 мг/кг;

б)	съдържание на еритродиол и уваол под 4.5 %;

в)	съдържание на наситени мастни киселини в позиция 2 на триглицеридите не по-голямо 1.3 %; и/или

г)	сборът от олеинови трансизомери е не по-голям от 0,10 %, а сборът линолеинови трансизомери + олеинови трансизомери е не по-голям от 0,10 %;

д)

една или повече от следните характеристики: i) пероксидно число, по-голямо от 20 meq активен кислород на кг; ii) общо съдържание на летливи халогенирани разтворители, по-голямо от 0,1 мг/кг за всеки един от тях. iii) коефициент на екстинкция К270 (100) по-голям от 0,250, а след обработка на маслото с активиран алуминиев оксид — не по-голям от 0,11. Фактически някои мазнини със съдържание на свободни мастни киселини, изразено като олеинова киселина, надхвърлящо 3,3 г на 100 г, могат след преминаване през активиран алуминиев оксид в съответствие с метода, съдържащ се в приложение IХ към Регламент (ЕИО) № 2568/91, да имат коефициент на екстинкция К270, надвишаващ 0,10. В такъв случай, след неутрализация и обезцветяване в лабораторията в съответствие с метода, посочен в приложение ХIII към цитирания регламент, те трябва да притежават следните характеристики: — коефициент на екстинкция К270, не по-голям от 1,20, — изменение на коефициента на екстинкция (Делта К) в областта на 270 nm по-високо от 0,01, но не по-високо от 0,16, т.е.: Km = коефициент на екстинкция на дължина на вълната на пика на абсорбционната крива в областта на 270 nm, Km-4 a Km+4 = коефициентите на екстинкция на дължини на вълната 4 nm по-ниско и по-високо от дължина на вълната Km; iv) органолептични качества, включващи разпознаваеми дефекти, надхвърлящи определените допустими граници, както и общ резултат от изпитванията, провеждани от дегустационна комисия, по-нисък от 3,5 в съответствие с разпоредбите на приложение ХII към Регламент (ЕИО) № 2568/91.

II.   По смисъла на подпозиция 1509 10 90„необработено маслиново масло (virgin)“ означава маслиново масло, притежаващо следните характеристики:

а)	киселинно съдържание, изразено в олеинова киселина, не по-голямо от 3,3 г на 100 г;

б)	пероксидно число, не по-голямо от 20 mеq активен О2/кг;

в)	съдържание на алифатни алкохоли, не по-голямо от 300 мг/кг;

г)	общо съдържание на летливи халогенирани разтворители, не по-голямо от 0,2 кг/кг и не по-голямо от 0,1 мг/кг за всеки един от тях;

д)	коефициент на екстинкция К270, не по-голям от 0,250, а след обработка на маслото с активиран алуминиев оксид, не по-голям от 0,10;

е)	изменение на коефициента на екстинкция (Делта К) в областта на 270 nm не по-голямо от 0,01.

ж)	органолептични качества, включващи разпознаваеми дефекти, надхвърлящи определените допустими граници, както и общ резултат от изпитванията, провеждани от дегустационна комисия, по-нисък от 3,5 в съответствие с разпоредбите на приложение ХII към Регламент (ЕИО) № 2568/91.

з)	съдържание на еритродиол и уваол, не по-голямо от 4,5 %;

и)	съдържание на наситени мастни киселини в позиция 2 на триглицеридите, не по-голямо от 1,3 %;

й)	сборът от олеинови трансизомери е не по-голям от 0,05 %, а сборът линолеинови трансизомери + олеинови трансизомери е не по-голям от 0,03 %.

В.   Подпозиция 1509 90 00 включва маслиново масло, получено от обработката на маслиново масло, включено в подпозиции 1509 10 10 или 1509 10 90, дори несмесено с необработено маслиново масло (virgin), което има следните характеристики:

а)	киселинно съдържание, изразено в олеинова киселина не по-голямо от 3,3 г на 100 г;

б)	съдържание на алифатни алкохоли не по-голямо от 350 мг/кг;

в)	коефициент на екстинкция К270 (100) по-голям от 0,250 и не по-голям от 1,20, а след обработка на маслото с активиран алуминиев оксид, не по-голям от 0,10;

г)	изменение на коефициента на екстинкция (Делта К) в областта на 270 nm по-голямо от 0,01 и не по-голямо от 0,16;

д)	съдържание на еритродиол и уваол не по-голямо от 4,5 %;

е)	съдържание на наситени мастни киселини в позиция 2 на триглицеридите не по-голямо от 1,5 %;

ж)	сборът от олеинови трансизомери е не по-голям от 0,20 %, а сборът линолеинови трансизомери + олеинови трансизомери е не по-голям от 0,30 %.

Г.   По смисъла на подпозиция 1510 00 10, „сурови масла“ означава по-специално маслиново кюспе, имащо следните характеристики:

а)	киселинно съдържание, изразено в олеинова киселина, по-голямо от 2 г на 100 г;

б)	съдържание на еритродиол и уваол по-голямо от 12 %;

в)	съдържание на наситени мастни киселини в позиция 2 на триглицеридите не по-голямо от 1,8 %;

г)	сборът от олеинови трансизомери е не по-голям от 0,20 %, а сборът линолеинови трансизомери + олеинови трансизомери е не по-голям от 0,10 %.

Д.   Подпозиция 1510 00 90 включва маслата, получени от обработката на маслата, попадащи под подпозиция 1510 00 10, дори несмесени с необработено маслиново масло (virgin), както и тези масла, които не притежават характеристиките на маслата, посочени в допълнителни бележки 2Б, 2В и 2Г. Маслата от настоящата позиция трябва да имат съдържание на наситени мастни киселини в позиция 2 на триглицеридите не по-голямо от 2 %, сборът от олеинови трансизомери да е по-малък от 0,40 % и сборът от линолеинови трансизомери плюс олеинови трансизомери да е не по-голям от 0,35 %.

3.   Подпозиции 1522 00 31 и 1522 00 39 не включват:

а)	остатъците, получени от обработката на продукти, съдържащи мазнини, чието йонно число, определено в съответствие с метода, предвиден в приложение ХVI към Регламент (ЕИО) № 2568/91, е по-малко от 70 или по-голямо от 100;

б)

остатъчните вещества, получени от обработката на продукти, съдържащи мазнини, чието йодно число се включва между 70 и 100, но площта на пика, представящ обема на задържане на бета-ситостерола (6), определен в съответствие с приложение V към Регламент (ЕИО) № 2568/91, е по-малка от 93 % от общата площ на стеролните пикове.

4.   Методите за анализ, използвани за установяване характеристиките на посочените по-горе продукти, са методите, посочени в приложението към Регламент (ЕИО) № 2568/91.