»BILAG I

PRØVEUDTAGNINGSMETODER

1.   FORMÅL OG ANVENDELSESOMRÅDE

Prøver, der er bestemt til offentlig kontrol af foder, udtages i overensstemmelse med de nedenfor anførte metoder. De således fremkomne prøver skal betragtes som repræsentative for de portioner, der prøvetages af.

Formålet med repræsentativ prøveudtagning er at udtage en brøkdel af et parti på en sådan måde, at fastlæggelsen af de særlige karakteristika ved denne brøkdel repræsenterer gennemsnitsværdien af partiets karakteristika. Der udtages prøver af partiet ved gentagne gange at udtage enkeltprøver på forskellige steder i partiet. Disse enkeltprøver kombineres ved sammenblanding, så de udgør en samleprøve, hvorfra der klargøres repræsentative slutprøver ved hjælp af repræsentativ prøveneddeling.

Hvis det ved en visuel kontrol eller på grundlag af andre relevante oplysninger viser sig, at en del af det foder, der skal udtages prøver af, er af en anden kvalitet end resten af foderet i samme parti, adskilles de pågældende dele fra resten af foderet og behandles som et særskilt delparti. Hvis det ikke er muligt at opdele foderet i særskilte delpartier, udtages prøver som fra et parti. I sådanne tilfælde nævnes dette i prøveudtagningsrapporten.

Såfremt det konstateres, at foder, der udtages prøver af i overensstemmelse med bestemmelserne i denne forordning, og som ikke opfylder EU's krav og udgør en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse, antages det, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU's krav.

Prøveudtagning kan også omfatte foder, der udbydes til salg af ledere af foderstofvirksomheder ved hjælp af fjernkommunikationsteknik i overensstemmelse med artikel 11, stk. 3, i Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 767/2009 (1). Prøveudtagning af foder, der udbydes til salg ved hjælp af fjernkommunikationsteknik, er i princippet omfattet af de punkter, der er omhandlet i nærværende bilag. Specifikke aspekter ved prøveudtagning af fjernsalgsprøver er beskrevet i punkt 11.

2.   DEFINITIONER

—

Parti (lot eller batch): En identificerbar mængde foder, hvorom det er fastslået, at det har fælles karakteristika såsom oprindelse, type, emballagetype, pakkevirksomhed, afsender eller mærkning og i tilfælde af en produktionsproces en produktionsenhed fra ét anlæg, hvor der anvendes ensartede produktionsparametre, eller et antal af sådanne enheder, når de er fremstillet fortløbende og oplagres sammen.

—	Portion, der prøvetages af: Et parti eller en identificerbar del af partiet eller delpartiet.

—	Plomberet prøve: En prøve, der er plomberet på en måde, som forhindrer enhver adgang til prøven uden at bryde eller fjerne plomben.

—	Enkeltprøve: En mængde, som er udtaget på et enkelt sted i den portion, der prøvetages af.

—	Samleprøve: En samling af enkeltprøverne, udtaget fra den portion, der prøvetages af.

—	Reduceret prøve: En del af en samleprøve, fremkommet ved repræsentativ reduktion af denne.

—	Slutprøve: En del af samleprøven (blandet), af den reducerede prøve eller af den homogeniserede samleprøve, afhængigt af typen af kontrol (se punkt 9.4).

—	Laboratorieprøve: Prøve bestemt til laboratorieundersøgelse (som modtaget af laboratoriet), der kan være en slutprøve, en reduceret prøve eller en samleprøve.

—	Fjernsalgsprøve: Prøve af et parti foder, der udbydes til salg ved hjælp af fjernkommunikationsteknik.

3.   ALMINDELIGE BESTEMMELSER

—	Prøverne skal udtages af personer, som er autoriseret hertil af den kompetente myndighed.

—	For så vidt angår en fjernsalgsprøve skal den kompetente myndighed ved hjælp af fjernkommunikationsteknik anmode lederen af foderstofvirksomheden om at udtage en mængde foder.

—	Prøven plomberes på en måde, som forhindrer enhver adgang til prøven uden at bryde eller fjerne plomben.

Plombens etiket skal være klart identificerbar og synlig.

—	Identifikation af prøven: Prøven skal være mærket på en uudslettelig måde og skal identificeres på en sådan måde, at der er en utvetydig forbindelse til prøveudtagningsrapporten.

—

Fra hver enkelt samleprøve eller reducerede prøve udtages følgende slutprøver: én til offentlig kontrol (håndhævelsesformål) og én til lederen af foderstofvirksomheden (kontraprøve). Endelig kan der udtages endnu én slutprøve til referenceformål. Hvis hele samleprøven homogeniseres, udtages slutprøverne af den homogeniserede samleprøve, medmindre denne fremgangsmåde er i modstrid med medlemsstaternes forskrifter for så vidt angår rettighederne for lederen af en foderstofvirksomhed.

—

I overensstemmelse med artikel 15, stk. 1 og 2, i forordning (EU) 2017/625 skal ledere af foderstofvirksomheder, når det er nødvendigt for at gennemføre officiel prøvetagning, og når det kræves af de kompetente myndigheder: — give de kompetente myndigheders personale adgang til udstyr under deres kontrol, herunder, om nødvendigt, stille prøvetagningsudstyr og personlige værnemidler til rådighed. — bistå og samarbejde med de kompetente myndigheders personale for at gøre prøvetagningen mulig, herunder stille foder til rådighed for de kompetente myndigheders personale.

4.   APPARATUR

4.1.   Det apparatur, der anvendes til prøveudtagning, skal være udført i materialer, der ikke kan forurene de produkter, der skal udtages prøver af. Apparatur, der er bestemt til at blive anvendt flere gange, skal være let at rengøre for at undgå krydsforurening.

4.2.   Anbefalet apparatur til udtagning af prøver af foder i fast form.

4.2.1.   Manuel prøveudtagning

4.2.1.1.

Prøveudtagningsskovl med flad bund og lodrette sider.

4.2.1.2.

Prøveudtagningsspyd med lang spalte eller inddelt i kamre. Prøveudtagningsspyddets dimensioner skal være afpasset efter de forhold, hvorunder den del, der udtages prøver af, befinder sig (beholderens dybde, sækkenes dimensioner osv.), og efter størrelsen af de partikler, foderet består af. Hvis prøveudtagningsspyddet har flere åbninger for at sikre, at prøverne udtages på forskellige steder langs spyddet, skal åbningerne være adskilt af kamre eller sekventielt forskudte åbninger.

4.2.2.   Mekanisk prøveudtagning

Passende mekanisk apparatur kan anvendes til udtagning af prøver af foder i bevægelse. Det mekaniske apparatur anses for at være passende, når der som minimum udtages prøver af hele flowets tværsnit.

Prøveudtagning af foder i bevægelse (med høj flowhastighed) kan udføres med automatisk prøvetagningsudstyr.

4.2.3.   Prøvedeler

Til neddeling af prøver på en repræsentativ måde anvendes apparatur, der deler prøverne i tilnærmelsesvis lige store dele, hvis det er muligt og hensigtsmæssigt.

5.   KVANTITATIVE KRAV FOR SÅ VIDT ANGÅR ANTALLET AF ENKELTPRØVER

—

De kvantitative krav i punkt 5.1 og 5.2, for så vidt angår antallet af enkeltprøver, gælder for portioner, der prøvetages af, med en vægt på op til 500 ton, og hvoraf der kan udtages prøver på en repræsentativ måde. Den anførte fremgangsmåde for prøveudtagning gælder også for mængder, som er større end den foreskrevne maksimale størrelse af portioner, der prøvetages af, hvis der ses bort fra det højeste antal enkeltprøver, som er angivet i nedenstående tabeller under punkt 5.1.1, 5.1.3 og 5.1.5, og antallet af enkeltprøver fastlægges ved hjælp af den kvadratrodsformel, der er fastsat i den relevante del af fremgangsmåden (jf. punkt 5.3), og den mindste størrelse af samleprøven øges proportionelt hermed. Dette forhindrer ikke, at et stort parti kan opdeles i mindre delpartier, og at der udtages prøver af hvert delparti i overensstemmelse med fremgangsmåden i punkt 5.1 og 5.2.

—	Størrelsen af portionen, der prøvetages af, skal være således, at der kan udtages enkeltprøver af alle dens bestanddele.

—	I tilfælde af meget store partier eller delpartier (> 500 ton) og partier, som transporteres eller oplagres på en sådan måde, at der ikke kan udtages prøver i overensstemmelse med den fremgangsmåde, der er fastsat i punkt 5.1 og 5.2, anvendes den i punkt 5.3 fastsatte fremgangsmåde.

—	For så vidt angår fjernsalgsprøver er størrelsen på det parti, som mængden skal tages fra, som regel ikke kendt af den kompetente myndighed. Derfor kan proceduren omhandlet i punkt 5.1 og 5.2 ikke følges. I dette tilfælde anvendes proceduren beskrevet i punkt 11.

—

Hvis lederen af foderstofvirksomheden i henhold til lovgivningen har pligt til at overholde bestemmelserne i denne forordning som led i et obligatorisk overvågningssystem, kan lederen af foderstofvirksomheden afvige fra de kvantitative krav, som er fastsat i dette punkt, for at tage hensyn til operationelle karakteristika, forudsat at lederen af foderstofvirksomheden over for den kompetente myndighed har godtgjort ækvivalensen af fremgangsmåden for prøveudtagning med hensyn til repræsentativitet og efter godkendelse fra den kompetente myndighed.

—

I særlige tilfælde, hvis det ikke er muligt at anvende den fastsatte prøveudtagningsmetode for så vidt angår de kvantitative krav på grund af uacceptabel forretningsmæssig beskadigelse af partiet (som følge af emballeringsform, transportmiddel, opbevaringsforhold osv.), kan der anvendes en alternativ prøveudtagningsmetode, under forudsætning af at den er så repræsentativ som muligt og beskrives og dokumenteres fuldt ud.

5.1.   Kvantitative krav for så vidt angår enkeltprøver i forbindelse med kontrol af stoffer og produkter, der er homogent fordelt i foderet

5.1.1.   Uemballeret foder i fast form

Størrelsen af den portion, der prøvetages af	Mindste antal enkeltprøver
≤ 2,5 ton	7
> 2,5 ton	Kvadratroden af 20 gange det antal ton, som den portion, der prøvetages af (*1) , vejer, op til 40 enkeltprøver

5.1.2.   Uemballeret foder i flydende form

Størrelsen af den portion, der prøvetages af	Mindste antal enkeltprøver
≤ 2,5 ton eller≤ 2 500 liter	4  (*2)
> 2,5 ton eller > 2 500 liter	7  (*2)

5.1.3.   Emballeret foder

Foder (i fast og flydende form) kan være emballeret i sække, poser, dåser, tønder mv., der i nedenstående tabel er omhandlet som enheder. Af store enheder (≥ 500 kg eller liter) udtages prøver i overensstemmelse med bestemmelserne for uemballeret foder (jf. punkt 5.1.1 og 5.1.2).

Størrelsen af den portion, der prøvetages af	Mindste antal enheder, hvoraf (mindst) én enkeltprøve skal udtages (*3)
1 til 20 enheder	1 enhed (*4)
21 til 150 enheder	3 enheder (*4)
151 til 400 enheder	5 enheder (*4)
> 400 enheder	¼ af kvadratroden af antallet af enheder, som udgør den portion, der prøvetages (*5) , op til 40 enheder

5.1.4.   Foderblokke og mineralske sliksten

Der skal udtages prøver af mindst én blok eller sliksten pr. parti bestående af 25 enheder, dog højst fire blokke eller sliksten.

For blokke eller sliksten, der ikke vejer over 1 kg stykket, udgøres en enkeltprøve af indholdet af én blok eller én sliksten.

5.1.5.   Grovfoder/foderplanter

Størrelsen af den portion, der prøvetages af	Mindste antal enkeltprøver (*6)
≤ 5 ton	5
> 5 ton	Kvadratroden af 5 gange det antal ton, som den portion, der prøvetages af (*7) , vejer, op til 40 enkeltprøver

5.2.   Kvantitative krav for så vidt angår enkeltprøver i forbindelse med kontrol af bestanddele eller stoffer, der sædvanligvis er uhomogent fordelt i foderet

Disse kvantitative krav for så vidt angår enkeltprøver skal anvendes i følgende situationer:

—	kontrol med forekomst af aflatoksin, meldrøje, andre mykotoksiner og skadelige botaniske urenheder i fodermidler

—	kontrol af krydsforurening fra en bestanddel, herunder genmodificeret materiale eller stof, der sædvanligvis er uhomogent fordelt i fodermidler.

Hvis kontrolmyndigheden har stærk mistanke om, at der forekommer en uhomogen fordeling, og i tilfælde af krydsforurening fra en bestanddel eller et stof i en foderblanding, kan de kvantitative krav i nedenstående tabel anvendes.

Størrelsen af den portion, der prøvetages af	Mindste antal enkeltprøver
< 80 ton	Jf. de kvantitative krav i punkt 5.1. Antal enkeltprøver, som skal udtages, ganges med 2,5
≥ 80 ton	100

5.3.   Kvantitative krav for så vidt angår enkeltprøverne i tilfælde af meget store partier

I tilfælde af store portioner, der prøvetages af (> 500 ton), er antallet af enkeltprøver, der skal udtages = 40 enkeltprøver + kvadratroden af antal ton i forbindelse med kontrol af stoffer og produkter, der er homogent fordelt i foderet, eller 100 enkeltprøver + kvadratroden af antal ton i forbindelse med kontrol af bestanddele eller stoffer, der sædvanligvis er uhomogent fordelt i foder.

6.   KVANTITATIVE KRAV FOR SÅ VIDT ANGÅR SAMLEPRØVER

Der skal være én samleprøve for hver portion der prøvetages af.

	Fodertype	Minimumsstørrelse af samleprøven (*8)  (*9)
6.1.	Uemballeret foder	4 kg
6.2.	Emballeret foder	4 kg (*10)
6.3.	Flydende eller halvflydende foder	4 liter
6.4.	Foderblokke eller mineralske sliksten:
6.4.1.	med en stykvægt på over 1 kg	4 kg
6.4.2.	med en stykvægt på højst 1 kg	vægten af fire originale blokke eller sliksten
6.5.	Grovfoder/foderplanter	4 kg (*11)

7.   KVANTITATIVE KRAV FOR SÅ VIDT ANGÅR SLUTPRØVER

Slutprøver

Der kræves analyse af mindst én slutprøve. Mængden af slutprøven, der skal analyseres, må ikke være mindre end:

Foder i fast form	500 g (*12)  (*13)  (*14)  (*15)
Flydende eller halvflydende foder	500 ml (*12)

8.   PRØVEUDTAGNINGSMETODE FOR MEGET STORE PARTIER ELLER PARTIER, SOM OPBEVARES ELLER TRANSPORTERES PÅ EN MÅDE, SÅ PRØVEUDTAGNING I HELE PARTIET IKKE ER MULIG

8.1.   Generelle principper

Hvis transport eller opbevaring af et parti forhindrer udtagning af enkeltprøver i hele partiet, bør prøveudtagning af sådanne partier foretages, når partiet er i flow.

I tilfælde af store lagerbygninger, der er bestemt til oplagring af foder, bør virksomhederne opfordres til at installere udstyr i lagerbygningerne, som (automatisk) foretager prøveudtagning i hele det oplagrede parti.

Ved anvendelse af de fremgangsmåder for prøveudtagning, som er omhandlet i dette punkt, underrettes lederen af foderstofvirksomheden eller dennes repræsentant om den pågældende fremgangsmåde for prøveudtagning. Hvis lederen af foderstofvirksomheden eller dennes repræsentant anfægter denne fremgangsmåde for prøveudtagning, skal lederen af foderstofvirksomheden eller dennes repræsentant give den kompetente myndighed mulighed for at udtage prøver af hele det pågældende parti for vedkommendes regning.

8.2.   Store partier, som transporteres med skib

8.2.1.   Dynamisk prøveudtagning af store partier, som transporteres med skib

Prøveudtagning af store partier i skibe foretages bedst, mens produktet er i flow (dynamisk prøveudtagning).

Prøveudtagningen skal foretages pr. lastrum (enhed, der fysisk kan adskilles). Lastrummene tømmes imidlertid ikke hver for sig, så den oprindelige fysiske adskillelse eksisterer ikke længere efter overførslen til lagerfaciliteter. Prøveudtagning kan derfor foretages enten på baggrund af den oprindelige fysiske adskillelse eller på baggrund af opdelingen efter overførslen til lagerfaciliteterne.

Losningen af et skib kan vare flere dage. Normalt gennemføres prøveudtagningen med regelmæssige mellemrum under hele losningens varighed. Det er dog ikke altid muligt eller hensigtsmæssigt, at en officiel inspektør er til stede med henblik på prøveudtagning i løbet af hele lossearbejdet. Det er derfor tilladt at gennemføre prøveudtagning på en del (den del, der udtages prøver fra) af hele partiet. Antallet af enkeltprøver bestemmes under hensyntagen til størrelsen af den portion, der prøvetages af.

Hvis der er udtaget prøver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse, og det konstateres, at denne del af partiet ikke opfylder EU's krav, antages det, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU's krav.

Selv om den officielle prøve udtages automatisk, skal der være en inspektør til stede. Såfremt den automatiske prøveudtagning gennemføres med forudindstillede parametre, som ikke kan ændres under prøveudtagningen, og enkeltprøverne indsamles i en plomberet beholder, som forhindrer eventuelt svig, er inspektørens tilstedeværelse kun nødvendig ved påbegyndelsen af prøveudtagningen, hver gang prøvebeholderen skal udskiftes og ved afslutningen af prøveudtagningen.

8.2.2.   Prøveudtagning af partier, som transporteres med skib ved statisk prøveudtagning

Hvis prøveudtagningen udføres på en statisk måde, anvendes den samme fremgangsmåde som den, der gælder for lagerfaciliteter (siloer), som er tilgængelige ovenfra (jf. punkt 8.4.1).

Prøveudtagningen gennemføres på den tilgængelige del (ovenfra) af partiet/lastrummet. Antallet af enkeltprøver bestemmes under hensyntagen til størrelsen af den portion, der prøvetages af. Hvis der er udtaget prøver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse, og det konstateres, at denne del af partiet ikke opfylder EU's krav, antages det, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU's krav.

8.3.   Prøveudtagning af store partier, der er oplagret i lagerbygninger

Prøveudtagningen gennemføres på den tilgængelige del af partiet. Antallet af enkeltprøver bestemmes under hensyntagen til størrelsen af den portion, der prøvetages af. Hvis der er udtaget prøver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse, og det konstateres, at denne del af partiet ikke opfylder EU's krav, antages det, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU's krav.

8.4.   Udtagning af prøver fra lagerfaciliteter (siloer)

8.4.1.   Udtagning af prøver fra siloer, som er (let) tilgængelige ovenfra

Prøveudtagningen gennemføres på den tilgængelige del af partiet. Antallet af enkeltprøver bestemmes under hensyntagen til størrelsen af den portion, der prøvetages af. Hvis der er udtaget prøver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse, og det konstateres, at denne del af partiet ikke opfylder EU's krav, antages det, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU's krav.

8.4.2.   Udtagning af prøver fra siloer, som ikke er tilgængelige ovenfra (lukkede siloer)

8.4.2.1.   Siloer, som ikke er tilgængelige ovenfra (lukkede siloer) med en størrelse på > 100 ton

Der kan ikke udtages prøver af foder, der er oplagret i sådanne siloer, på en statisk måde. Hvis der skal udtages prøver af foder i en sådan silo, og det ikke er muligt at flytte partiet, skal der derfor træffes aftale med virksomhedslederen om, at vedkommende meddeler inspektøren, hvornår den pågældende silo vil blive tømt, så der kan udtages prøver, mens foderet er i flow.

8.4.2.2.   Siloer, som ikke er tilgængelige ovenfra (lukkede siloer) med størrelse på < 100 ton

Fremgangsmåden for prøveudtagning indebærer overførsel til en beholder af en størrelse på 50-100 kg, hvorfra prøven udtages. Størrelsen af samleprøven skal svare til hele partiet, og antallet af enkeltprøver skal beregnes på baggrund af mængden i den silo, hvorfra der overføres foder til en beholder med henblik på prøveudtagning. Hvis der er udtaget prøver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse, og det konstateres, at denne del af partiet ikke opfylder EU's krav, antages det, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU's krav.

8.5.   Udtagning af prøver af uemballeret foder i store lukkede beholdere

Der kan som regel kun udtages prøver af sådanne partier, når beholderne aflæsses. Det er i visse tilfælde ikke muligt at aflæsse beholderne ved indførsel eller kontrol, og prøveudtagningen bør derfor gennemføres, når beholderne aflæsses.

9.   FREMGANGSMÅDE VED UDTAGNING, KLARGØRING OG EMBALLERING AF PRØVERNE

9.1.   Generelt

Prøverne udtages og klargøres så hurtigt som muligt under hensyntagen til de forholdsregler, som er nødvendige for at undgå, at produktet forandres eller forurenes. Instrumenter, overflader og beholdere, som er beregnet til at rumme prøverne, skal være rene og tørre.

9.2.   Enkeltprøver

Enkeltprøver skal udtages tilfældigt og jævnt fordelt fra hele den portion, der prøvetages af. Deres størrelse skal være tilnærmelsesvis ens.

Enkeltprøvens størrelse skal være på mindst 100 g eller 25 g i tilfælde af grovfoder eller foderplanter med lav massefylde.

I tilfælde af at der i henhold til den fremgangsmåde for prøveudtagning, der er fastsat i afsnit 8, skal udtages færre end 40 enkeltprøver, fastlægges størrelsen af enkeltprøverne på baggrund af den størrelse, der kræves for samleprøver (jf. afsnit 6).

I tilfælde af prøveudtagning af prøver af mindre partier af emballeret foder, hvor der i henhold til de kvantitative krav skal udtages et begrænset antal enkeltprøver, skal en enkeltprøve udgøres af indholdet af én original enhed, hvis indhold ikke overstiger 1 kg eller 1 liter.

I tilfælde af prøveudtagning af emballeret foder, der består af små enheder (f.eks. < 250 g), afhænger antallet af enkeltprøver af enhedernes størrelse.

I tilfælde af fjernsalgsprøver afhænger enkeltprøvens størrelse af enhedens størrelse og kan også i enkelte tilfælde indeholde mindre end 100 g eller 100 ml.

9.2.1.   Uemballeret foder

Hvor det er passende, kan prøveudtagningen foretages, mens partiet er i bevægelse (pålæsning eller aflæsning).

9.2.2.   Emballeret foder

Efter at det i punkt 5 fastsatte antal enheder til prøveudtagning er udvalgt, udtages en del af indholdet af hver enhed ved hjælp af spyd eller skovl. Om nødvendigt skal prøverne udtages, efter at enhederne er tømt hver for sig.

9.2.3.   Flydende eller halvflydende foder, som er homogent eller kan gøres homogent

Efter at det i punkt 5 fastsatte antal enheder til prøveudtagning er udvalgt, homogeniseres indholdet om nødvendigt, og der udtages en mængde fra hver enhed.

Enkeltprøverne kan eventuelt udtages under aftapning af partiet.

9.2.4.   Flydende eller halvflydende foder, som ikke kan gøres homogent

Efter at det i punkt 5 fastsatte antal enheder til prøveudtagning er udvalgt, udtages prøver fra forskellige niveauer.

Enkeltprøver kan ligeledes udtages, når partiet aftappes, men de første fraktioner kasseres.

Under alle omstændigheder må den samlede udtagne mængde ikke være mindre end 10 liter.

9.2.5.   Foderblokke og mineralske sliksten

Efter at det i punkt 5 fastsatte antal blokke eller sliksten til prøveudtagning er udvalgt, kan der udtages en del af hver blok eller sliksten. I tilfælde af mistanke om en uhomogen blok eller sliksten, kan hele blokken eller slikstenen udtages som prøve.

For blokke eller sliksten, der ikke vejer over 1 kg stykket, udgøres en enkeltprøve af indholdet af én blok eller én sliksten.

9.3.   Klargøring af samleprøver

Enkeltprøverne sammenblandes, så de udgør en enkelt samleprøve.

9.4.   Klargøring af slutprøver

Samleprøven blandes omhyggeligt (2).

Hver prøve anbringes i en egnet beholder. Alle nødvendige forholdsregler tages for at undgå, at prøven forurenes eller forfalskes, eller at sammensætningen ændres under transport eller opbevaring.

9.4.1.   Homogent fordelte stoffer

Ved kontrol af bestanddele eller stoffer, der er homogent fordelt i foderet, kan samleprøven reduceres på en repræsentativ måde til mindst 2,0 kg eller 2,0 liter (reduceret prøve) (3) helst ved anvendelse af en mekanisk eller en automatisk prøvedeler. Ved kontrol af forekomst af pesticidrester i bælgfrugter, korn og trænødder er minimumsstørrelsen af den reducerede prøve 3 kg. Hvis fodertypen umuliggør anvendelse af en prøvedeler, eller hvis der ikke er en prøvedeler til rådighed, kan prøven reduceres ved firdeling (kvartning).

Fra samleprøven eller de reducerede prøver udtages slutprøverne (til kontrol-, kontraprøve- og eventuelt referenceformål) af tilnærmelsesvis samme størrelse og under overholdelse af de kvantitative krav i punkt 7.

9.4.2.   Uhomogent fordelte stoffer

Ved kontrol af bestanddele, herunder genetisk modificeret materiale eller stoffer, der sædvanligvis er uhomogent fordelt i foder, skal samleprøven være:

i)	fuldstændigt homogeniseret. Fra den homogeniserede samleprøve klargøres derefter slutprøverne (til kontrol-, kontraprøve- og eventuelt referenceformål) af tilnærmelsesvis samme størrelse og under overholdelse af de kvantitative krav i punkt 7, eller

ii)

reduceret til mindst 2 kg eller 2 liter (4) ved anvendelse af en mekanisk eller automatisk prøvedeler. Kun i tilfælde, hvor fodertypen forhindrer anvendelse af en prøvedeler, kan prøven om nødvendigt reduceres ved firdeling. Med henblik på kontrol af forekomst af genetisk modificeret materiale i henhold til forordning (EU) nr. 619/2011 skal den reducerede prøve indeholde mindst 35 000 frø/korn for at opnå de slutprøver, der kræves til håndhævelses-, kontraprøve- og referenceformål på mindst 10 000 frø/korn (jf. fodnote (**) i punkt 6 og fodnote (*) i punkt 7).

Fra den reducerede prøve udtages derefter slutprøverne af tilnærmelsesvis samme størrelse og under overholdelse af de kvantitative krav i punkt 7.

9.5.   Emballering af prøver

Beholdere eller pakninger plomberes og forsynes med etiketter på en sådan måde, at de ikke kan åbnes, uden at plomben beskadiges. Hele etiketten skal anbringes inden for plomben. Alternativt kan prøven anbringes i en beholder, der kan lukkes på en sådan måde, at den ikke kan åbnes uden at medføre uoprettelig skade på beholderen, så man undgår genanvendelse af beholderen.

9.6.   Forsendelse af prøver til laboratoriet

Prøven sendes så hurtigt som muligt til det udpegede analyselaboratorium sammen med de for analysen nødvendige oplysninger.

10.   REGISTRERING AF PRØVEUDTAGNING

Hver prøve skal registreres, således at portionen, der prøvetages af, og dens størrelse utvetydigt kan identificeres.

Desuden skal enhver afvigelse fra den fremgangsmåde for prøveudtagning, der er fastsat i denne forordning, registreres.

De registrerede oplysninger stilles til rådighed for det officielle kontrollaboratorium samt for lederen af foderstofvirksomheden og/eller det laboratorium, som er udpeget af foderstofvirksomheden.

11.   FJERNSALGSPRØVE

—

For så vidt angår fjernsalgsprøver skal lederen af foderstofvirksomheden anmodes om foderet ved hjælp af fjernkommunikationsteknikker. I dette tilfælde, når der anmodes om foder, behøver den kompetente myndighed ikke at identificere sig med en officiel identitet over for lederen af foderstofvirksomheden og kan anvende en skjult identitet.

—

Samleprøven og slutprøverne af fjernsalgsprøven skal udtages omgående ved modtagelse af sendingen af personer, der er bemyndiget dertil. Til samleprøven skal der udtages et passende antal enkeltprøver tilfældigt og jævnt fordelt i hele den modtagne mængde, som er omhyggeligt blandet/homogeniseret, så vidt muligt i overensstemmelse med de principper, der er fastsat i punkt 5, 9.2 og 9.3. Hvis foderet er emballeret i særskilte enheder, skal der indhentes mindst fire enheder, hvorfra der skal udtages mindst én enkeltprøve. Hvis det efter en konkret vurdering viser sig, at de indhentede enheder stammer fra forskellige partier, skal antallet af enheder, der udtages prøver fra, reduceres og begrænses til de enheder, der stammer fra det samme parti. Ved analyse af fjernsalgsprøver for bestanddele eller stoffer, der er uhomogent fordelt i foderet, skal antallet af enkeltprøver være mindst 2,5 gang højere end for prøver, der analyseres for stoffer, der er homogent fordelt i foderet. Fra samleprøven udtages derefter de tilhørende slutprøver (til kontrol, som kontraprøve og eventuelt referenceformål) så vidt muligt i overensstemmelse med principperne i punkt 9.4, og det skal fremgå af registreringen af prøveudtagningen, at prøven er en fjernsalgsprøve. Den kompetente myndighed informerer omgående lederen af foderstofvirksomheden om prøveudtagningen. Lederen af foderstofvirksomheden får også oplyst, at der, om muligt, stilles en prøve (som kontraprøve) til rådighed af den kompetente myndighed på et angivet sted, og at prøven anvendes som kontraprøve eller sendes til lederen af foderstofvirksomheden eller til det laboratorium, der er udpeget af lederen af foderstofvirksomheden i overensstemmelse med de gældende nationale regler. Hvis prøven sendes direkte til det officielle laboratorium, skal slutprøven forberedes og forsegles på laboratoriet af personer, der er bemyndiget dertil, eller under tilstedeværelse af personer, der er bemyndiget dertil. Registreringen af prøveudtagningen af fjernsalgsprøven skal, umiddelbart efter at slutprøverne er udtaget, sendes til den kompetente myndighed, som oplyser lederen af foderstofvirksomheden om prøveudtagningen. Den mængde, der leveres af lederen af foderstofvirksomheden til den kompetente myndighed, anses for at repræsentere en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse. I overensstemmelse med artikel 15 i Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 178/2002 (5) antages det, hvis denne del af partiet ikke opfylder EU's krav, også i tilfælde af en fjernsalgsprøve, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang (efter behov ved kontrol på stedet) ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU's krav.«

»BILAG II

ALMINDELIGE BESTEMMELSER VEDRØRENDE ANALYSEMETODER FOR FODER

A.   KLARGØRING AF PRØVER TIL ANALYSE

1.   Formål

De nedenfor beskrevne fremgangsmåder i nærværende bilag omhandler klargøring til analyse af prøver, der efter udtagning sendes til kontrollaboratorierne i overensstemmelse med bilag I.

Laboratorieprøverne klargøres således, at de i henhold til analysemetoderne afvejede mængder er homogene og repræsentative for slutprøverne.

Ud over de i nærværende bilag beskrevne fremgangsmåder skal retningslinjerne for klargøring af prøver som omhandlet i EN ISO 6498 følges.

2.   Forholdsregler

Fremgangsmåden for klargøring af prøven afhænger af, hvilke analysemetoder der skal anvendes, og hvilke bestanddele eller stoffer der skal kontrolleres. Det er derfor yderst vigtigt, at den fremgangsmåde for klargøring af prøven, der følges, passer til den anvendte analysemetode og til de bestanddele eller stoffer, der skal kontrolleres.

Alle nødvendige arbejdsgange udføres, så det så vidt muligt undgås at forurene prøven og ændre dens sammensætning.

Formaling, blanding og sigtning gennemføres så hurtigt som muligt, og således at prøven udsættes mindst muligt for luft og lys. Der anvendes ikke kværne og andre formalingsapparater med væsentlig tilbøjelighed til at frembringe varme i prøven.

Særligt varmefølsomt foder bør formales manuelt. Det sikres tillige, at apparaturet i sig selv ikke forurener.

Homogenisering af prøven ved at lave en opslæmning med vand ved »high shear mixing« har i visse tilfælde vist sig at give mere homogene delprøver end tør homogenisering/formaling, særlig i tilfælde af uensartet fordelte kemiske stoffer. Men homogenisering ved tilstrækkelig formaling kan også give homogene delprøver.

I visse tilfælde, f.eks. til bestemmelse af meldrøje, skadelige botaniske urenheder osv., kan homogeniseringen af prøven ikke finde sted ved formaling, men ved i tilstrækkelig grad at blande prøven.

Kan klargøringen ikke foretages uden væsentlige ændringer af prøvens vandindhold, bestemmes vandindholdet før og efter klargøringen efter den metode, der er fastsat i del A i bilag III.

3.   Fremgangsmåde

3.1.   Generel fremgangsmåde

Testdelprøven udtages af den homogeniserede slutprøve. Neddeling efter keglemetoden og firdeling (kvartning) kan ikke anbefales, da disse metoder giver risiko for uhomogene delprøver.

3.1.1.   Foder, der kan formales direkte

—	Slutprøven blandes og opsamles i en egnet, ren og tør beholder med lufttæt lukning. Slutprøven blandes igen for at sikre fuldstændig homogenisering umiddelbart før afvejning til analyse (testdelprøve).

3.1.2.   Foder, der kan formales efter tørring

—	Medmindre andet er angivet for analysemetoden, tørres slutprøven, så den får et vandindhold på 8-12 %, i overensstemmelse med den fremgangsmåde for fortørring, der er anført i punkt 4.3 om metoden til bestemmelse af vandindhold i del A i bilag III. Der fortsættes som beskrevet i punkt 3.1.1.

3.1.3.   Flydende eller halvflydende foder

—	Slutprøven opsamles i en ren, tør og egnet beholder med lufttæt lukning. Slutprøven blandes grundigt for at sikre fuldstændig homogenisering umiddelbart før afvejning til analyse (testdelprøve).

3.1.4.   Andet foder

—	Slutprøver, der ikke kan klargøres i overensstemmelse med en af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder, behandles på anden måde, så der skabes sikkerhed for, at de mængder, der afvejes til analyse (testdelprøve), er homogene og repræsentative for slutprøverne.

3.2.   Særlig fremgangsmåde i tilfælde af undersøgelse ved visuel eller ved mikroskopisk kontrol eller i tilfælde, hvor samleprøven er homogeniseret

—	I tilfælde af en undersøgelse ved visuel kontrol (uden anvendelse af mikroskop) anvendes hele samleprøven eller slutprøven til undersøgelsen.

—	I tilfælde af en mikroskopisk undersøgelse kan laboratoriet reducere samleprøven eller reducere den reducerede prøve yderligere. Slutprøver til kontraprøve- og eventuelt referenceformål udtages efter en fremgangsmåde svarende til den fremgangsmåde, der følges for slutprøver til kontrolformål.

—	Hvis hele samleprøven er homogeniseret, udtages slutprøverne fra den homogeniserede samleprøve.

—

Til bestemmelse af meldrøje og skadelige botaniske urenheder skal slutprøven opdeles i to delprøver med samme vægt på ca. 500 gram. Den ene delprøve undersøges. Hvis resultatet af delprøverne er lig med eller under 50 % (analytisk tærskel) af maksimalgrænseværdien, er prøven compliant ift. maksimalgrænseværdien. Hvis resultatet er over 50 % af maksimalgrænseværdien, skal endnu en delprøve undersøges, og gennemsnittet af resultaterne af de to delprøver anvendes til at kontrollere, om maksimalgrænseværdien er overholdt.

4.   Opbevaring af prøverne

Prøverne opbevares ved en temperatur, der ikke ændrer deres sammensætning. Prøver, der er bestemt til analyse af vitaminer eller særligt lysfølsomme stoffer, opbevares under sådanne betingelser, at prøven ikke påvirkes negativt af lys.

B.   KRAV TIL REAGENSER OG APPARATUR, DER ANVENDES I FORBINDELSE MED ANALYSEMETODERNE

1.

Medmindre andet er angivet for analysemetoderne, skal alle reagenser være af analysekvalitet (p.a.). Ved udførelse af en sporstofanalyse kontrolleres reagensernes renhed ved en blindprøve. Resultatet af blindprøven er afgørende for, om der kræves yderligere oprensning af reagenserne.

2.

Til alle former for fremstilling af opløsninger, fortynding, skylning eller vaskning, der er angivet i forbindelse med analysemetoderne, uden at opløsnings- eller fortyndingsmidlets art er omtalt, anvendes vand. Som generel regel gælder det, at der anvendes demineraliseret eller destilleret vand. I særlige tilfælde, som angivet i de beskrevne analysemetoder, er det nødvendigt at underkaste vandet særlige oprensningsprocesser.

3.

Standardapparatur, der normalt findes på kontrollaboratorier, er ikke omtalt i forbindelse med analysemetoderne; derimod omtales specialinstrumenter og -udstyr samt instrumenter og udstyr, hvis brug der stilles særlige krav til. Instrumenter og apparatur skal være rene, især ved bestemmelse af meget små stofmængder.

C.   ANVENDELSE AF ANALYSEMETODERNE OG ANGIVELSE AF RESULTATER

1.   Ekstraktionsprocedure

Der er flere metoder, der omfatter en specifik ekstraktionsprocedure. Som hovedregel kan der anvendes andre ekstraktionsprocedurer end den i metoden angivne, under forudsætning af at den anvendte ekstraktionsprocedure bevisligt frembyder en ekstraktionseffektivitet for den analyserede matrix, der svarer til effektiviteten af den i metoden omtalte fremgangsmåde.

2.   Oprensningsprocedure

Der er flere metoder, der omfatter en specifik oprensningsprocedure. Som hovedregel kan der anvendes andre oprensningsprocedurer end den i metoden angivne, under forudsætning af at den anvendte oprensningsprocedure bevisligt giver analyseresultater for den analyserede matrix, der svarer til de resultater, som opnås med den i metoden omtalte fremgangsmåde.

3.   Antal bestemmelser

I forbindelse med analyse af uønskede stoffer gælder det, at hvis resultatet af den første bestemmelse er væsentligt (> 50 %) lavere end den specifikation, der skal kontrolleres, er yderligere bestemmelser ikke påkrævet, såfremt der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer. I andre tilfælde er det nødvendigt at foretage en ekstra analyse (anden bestemmelse) for at udelukke muligheden for intern krydsforurening eller utilsigtet sammenblanding af prøver. Gennemsnittet af de to bestemmelser anvendes til en nærmere gennemgang.

I forbindelse med kontrol af minimums- eller maksimumsniveauer af fodertilsætningsstoffer gælder det, at hvis resultatet af den første bestemmelse er højere end minimumsniveauet eller lavere end maksimumsniveauet, er yderligere bestemmelser ikke påkrævet, såfremt der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer. I andre tilfælde er det nødvendigt at foretage en ekstra analyse (anden bestemmelse) for at udelukke muligheden for intern krydsforurening eller utilsigtet sammenblanding af prøver. Gennemsnittet af de to bestemmelser anvendes til en nærmere gennemgang.

Ved kontrol af det angivne indhold af et stof eller en ingrediens gælder det, at hvis resultatet af den første bestemmelse bekræfter det angivne indhold, dvs. hvis analyseresultatet ligger inden for det acceptable variationsområde for det angivne indhold, er yderligere bestemmelser ikke påkrævet, såfremt der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer. I andre tilfælde er det nødvendigt at foretage en ekstra analyse (anden bestemmelse) for at udelukke muligheden for intern krydsforurening eller utilsigtet sammenblanding af prøver. Gennemsnittet af de to bestemmelser anvendes til en nærmere gennemgang (det gennemsnitlige analyseresultat ligger eller ligger ikke inden for det acceptable variationsområde for det angivne indhold).

I visse tilfælde er det acceptable variationsområde fastsat i lovgivningen, som f.eks. i Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 767/2009 og Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EU) 2019/4 (1).

4.   Afrapportering af anvendt analysemetode

Analyserapporten skal angive den anvendte analysemetode.

5.   Afrapportering af analyseresultater

Analyseresultatet angives som anført i analysemetoden med et tilstrækkeligt antal betydende cifre og korrigeres om nødvendigt til samme vandindhold, som slutprøven havde før prøveklargøringen.

De fleste lovbestemte niveauer (f.eks. maksimumsniveau og minimumsniveau) i EU-lovgivning om dyrefoder er fastsat i henhold til foder med et vandindhold på 12 %. For at vurdere analyseresultatet, der er målt på prøven i forhold til det lovbestemte niveau, skal analyseresultatet i disse tilfælde først divideres med tørstofindholdet i prøven (i %) ganget med 88, som angivet i følgende formel:

hvor:

Mc	:	prøvens vandindhold (i %). 100 — Mc udgør derfor prøvens tørstofindhold (i %).
Rana	:	analyseresultat som målt på prøven
R12 %	:	resultat for foder med et vandindhold på 12 %; skal vurderes i forhold til det lovbestemte niveau.

Desuden, hvis følgende betingelser er opfyldt:

—	analyseresultatet er væsentligt (> 50 %) lavere eller højere end de mærkningsoplysninger/den specifikation, der skal kontrolleres (afhængigt af om mærkningsoplysningerne/specifikationen er et maksimums- eller minimumsniveau)

—

vandindholdet i det foder, der udtages prøver af, er kendt, og det kan fastslås, at vurderingen ikke vil blive ændret ved at foretage korrektion af vandindhold, kan det, på betingelse af at der anvendes passende kvalitetsprocedurer, og at analysen kun har til formål at kontrollere overholdelse af gældende lovgivning, undlades at foretage korrektion af vandindhold (f.eks. i tilfælde, hvor der ikke er nogen specifikation eller noget lovbestemt niveau), medmindre det er nødvendigt af hensyn til fortolkning.

Hvis analyseresultatet rettes til vandindholdet, skal den tilhørende måleusikkerhed også rettes som led i den samme fremgangsmåde.

I tilfælde af at der bestemmes meldrøje eller skadelige botaniske urenheder ved visuel eller mikroskopisk undersøgelse, er det ikke nødvendigt at foretage korrektion af vandindhold.

6.   Måleusikkerhed og genfindingsprocent i forbindelse med analyse af uønskede stoffer

For så vidt angår uønskede stoffer som omhandlet i direktiv 2002/32/EF bør et produkt til foderbrug anses for ikke at overholde det fastsatte maksimumsindhold, hvis analyseresultatet som et gennemsnit af to uafhængige bestemmelser beregnet ved et vandindhold på 12 % vurderes at overstige maksimumsindholdet under hensyntagen til den ekspanderede måleusikkerhed og korrektion for genfinding, idet der anvendes en dækningsfaktor på 2, hvilket giver et konfidensniveau på ca. 95 % og korrektion for genfinding. Det betyder, at for at vurdere, om maksimumsindholdet er overholdt, anvendes analyseresultatet korrigeret for genfinding og fratrukket den ekspanderede måleusikkerhed. Denne fremgangsmåde gælder kun i tilfælde, hvor analysemetoden tillader vurdering af den ekspanderede måleusikkerhed og korrektion for genfinding (hvilket f.eks. ikke er tilfældet ved visuel eller mikroskopisk undersøgelse).

Hvis analyseresultatet af den prøve, der er taget som kontraprøve, er højere end maksimumsindholdet (uden at der tages hensyn til den ekspanderede måleusikkerhed), og i mangel af specifikke nationale regler på området, bekræfter dette den manglende overensstemmelse, der er fastslået med kontrolprøven.

Analyseresultatet skal afrapporteres som følger (hvis den anvendte analysemetode tillader vurdering af den ekspanderede måleusikkerhed):

a)

ved korrektion for genfinding, hvis det er relevant og formålstjenligt, med angivelse af, hvorvidt der er korrigeret. Genfindingsprocenten skal angives, medmindre der med den pågældende procedure automatisk foretages korrektion for bias, hvor bias er forskellen mellem den målte værdi og referencekoncentrationen. Ved en genfindingsprocent på 90–110 % er korrektion for genfinding ikke påkrævet.

b)	som »x +/– U«, hvor x er analyseresultatet og U er den ekspanderede måleusikkerhed, idet der anvendes en dækningsfaktor på 2 (2), hvilket giver et konfidensniveau på ca. 95 %.

Hvis resultatet af analysen er væsentligt (> 50 lavere end den specifikation, der skal kontrolleres, og på betingelse af, at der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer, og analysen udelukkende har til formål at kontrollere, at gældende lovgivning er overholdt, kan det måske undlades at indberette genfindingsprocent og ekspanderet måleusikkerhed (f.eks. i tilfælde, hvor der ikke er nogen specifikation eller noget lovbestemt niveau) medmindre måleusikkerheden er nødvendig af hensyn til fortolkning.

7.   Måleusikkerhed og genfindingsprocent i forbindelse med analyse af indhold af fodertilsætningsstoffer

For at kontrollere overholdelse af godkendt minimums- og maksimumsindhold af fodertilsætningsstoffer, anses tilstedeværelsen af et fodertilsætningsstof for ikke at overholde det gældende minimums- og maksimumsindhold, hvis analyseresultatet som et gennemsnit af to uafhængige bestemmelser i forhold til foder med et vandindhold på 12 %, vurderes at:

—

overstige maksimumsindholdet under hensyntagen til den ekspanderede måleusikkerhed og korrektion for genfinding. Det betyder, at for at vurdere, om minimums- og maksimumsindholdet er overholdt, anvendes den analyserede koncentration (dvs. et gennemsnit af to bestemmelser), efter at der er korrigeret for genfinding og fratrukket ekspanderet måleusikkerhed.

—

være lavere end minimumsindholdet under hensyntagen til den ekspanderede måleusikkerhed og korrektion for genfinding. Det betyder, at for at vurdere, om minimums- og maksimumsindholdet er overholdt, anvendes den analyserede koncentration (dvs. et gennemsnit af to bestemmelser), efter at der er korrigeret for genfinding og tillagt ekspanderet måleusikkerhed.

Hvis analyseresultatet af den prøve, der er taget som kontraprøve, er højere end maksimumsindholdet (uden at der tages hensyn til den ekspanderede måleusikkerhed), og i mangel af specifikke nationale regler på området, bekræfter dette den manglende overensstemmelse, der er fastslået med kontrolprøven.

Analyseresultatet skal afrapporteres som følger (hvis den anvendte analysemetode tillader vurdering af den ekspanderede måleusikkerhed):

a)

ved korrektion for genfinding, hvis det er relevant og formålstjenligt, med angivelse af, hvorvidt der er korrigeret. Genfindingsprocenten skal angives, medmindre der med den pågældende procedure automatisk foretages korrektion for bias, hvor bias er forskellen mellem den målte værdi og referencekoncentrationen. Ved en genfindingsprocent på 90–110 % er korrektion for genfinding ikke påkrævet.

b)	som »x +/– U«, hvor x er analyseresultatet (gennemsnit af to bestemmelser) og U er den ekspanderede måleusikkerhed, idet der anvendes en dækningsfaktor på 2 (3), hvilket giver et konfidensniveau på ca. 95 %.

»BILAG III

ANALYSEMETODER TIL KONTROL AF SAMMENSÆTNINGEN AF FODERMIDLER OG FODERBLANDINGER

A.   BESTEMMELSE AF VANDINDHOLD

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme vandindholdet i foder. For så vidt angår foder indeholdende flygtige stoffer, såsom organiske syrer, skal det bemærkes, at der sammen med vandindholdet også bestemmes et betydeligt antal flygtige stoffer.

Metoden er ikke beregnet på analyse af mejeriprodukter, der anvendes som fodermidler, og foderblandinger, der primært består af mejeriprodukter, analyse af animalsk og vegetabilsk fedt eller analyse af olieholdige frø og frugter.

Vandindholdet i olieholdige frø bestemmes ved anvendelse af den metode, der er omhandlet i EN ISO 665 Oliefrø — Bestemmelse af indhold af vand og flygtige substanser, idet det forudsættes, at sojabønner skal formales, før vandindholdet bestemmes.

2.   Princip

Prøven tørres under nærmere angivne betingelser, som er afhængige af foderets art. Vægttabet bestemmes ved vejning. For fast foder med højt vandindhold er yderligere fortørring nødvendig.

3.   Apparatur

3.1.

Formalingsapparat udført i et materiale, der ikke er fugtabsorberende, og som er let at gøre rent, muliggør en hurtig og ensartet formaling uden mærkbar varmeudvikling, så vidt muligt forhindrer kontakt med den omgivende luft og opfylder kravene i punkt 4.1.1 og 4.1.2 (f.eks. mikrohammermøller, mikroformalingsapparater med vandkøling, demontable keglemøller, langsomtløbende keglemøller og tandskivemøller).

3.2.

Analysevægt med 1 mg aflæsningsnøjagtighed.

3.3.

Tørre vejekar af korrosionsbestandigt metal eller glas med lufttæt lukning; nyttearealet skal være stort nok til, at prøven kan fordeles med ca. 0,3 g/cm2.

3.4.

Elektrisk opvarmet, temperaturreguleret tørreskab (± 2 °C), som sikrer hurtig regulering af temperaturen og med god ventilation (1).

3.5.

Elektrisk opvarmet justerbart vakuumtørreskab med oliepumpe, som enten er forsynet med en anordning til tilførsel af tørret varmluft eller med et tørremiddel (f.eks. calciumoxid).

3.6.

Ekssikkator med tyk, perforeret plade af metal eller porcelæn indeholdende et virksomt tørringsmiddel.

4.   Fremgangsmåde

NB!	De under dette punkt beskrevne arbejdsgange skal udføres straks efter åbningen af de pakninger, som indeholder prøverne. Analyserne skal foretages mindst to gange.

4.1.   Klargøring

4.1.1.   Foder, bortset fra det under punkt 4.1.2 og 4.1.3 nævnte

Der udtages mindst 50 g af prøven, som — om nødvendigt — formales eller neddeles på fornøden vis for at undgå varierende fugtighedsgrader (se punkt 6).

4.1.2.   Korn og gryn

Der udtages mindst 50 g af prøven. Den formales, så kornstørrelsen ved sigtning med masker på 0,5 mm tillader passage af mindst 50 %, og at der ved sigtning med runde masker på 1 mm bliver højst 10 % tilbage.

4.1.3.   Flydende eller grødagtigt foder; foder overvejende bestående af fedt

Der udtages ca. 25 g af prøven, afvejet med 10 mg nøjagtighed, som blandes med en tilsvarende mængde vandfrit sand, afvejet med 10 mg nøjagtighed, indtil der fremkommer en homogen vare.

4.2.   Tørring

Et vejekar med låg (punkt 3.3) tørres i et tørreskab ved 103 °C i 30 minutter +/- 1 minut. Karret tages ud af tørreskabet og henstilles til afkøling til rumtemperatur i ekssikkatoren (punkt 3.6).

4.2.1.   Foder, bortset fra det under punkt 4.2.2 og 42.3 nævnte

Et vejekar med låg vejes med 1 mg nøjagtighed. Ca. 5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i det tarerede kar og fordeles jævnt. Karret stilles efter aftagning af låget ind i et til 103 °C opvarmet tørreskab. For at temperaturen i tørreskabet ikke skal falde for stærkt, skal karret stilles hurtigt ind i skabet. Der tørres i fire timer, idet tørringstiden regnes fra det tidspunkt, hvor temperaturen i tørreskabet atter er kommet op på 103 °C. Efter åbning af tørreskabet lukkes karret straks med låget, tages ud af skabet, henstilles til afkøling i 30-45 minutter i ekssikkatoren (punkt 3.6) og vejes derefter med 1 mg nøjagtighed.

For prøver af foder overvejende (> 50 %) bestående af fedt af animalsk eller vegetabilsk oprindelse foretages yderligere en tørring på 30 minutter i tørreskabet ved 103 °C. Forskellen mellem de to vejeresultater må ikke overstige 0,1 % vandindhold.

4.2.2.   Korn, mel, gryn og grutning

Et vejekar med låg vejes med 0,5 mg nøjagtighed. Ca. 5 g af den formalede prøve afvejes med 1 mg nøjagtighed i det tarerede kar og fordeles jævnt. Karret stilles efter aftagning af låget ind i et til 130 °C opvarmet tørreskab. For at temperaturen i tørreskabet ikke skal falde for stærkt, skal karret stilles hurtigt ind i skabet. Der tørres i to timer, idet tørringstiden regnes fra det tidspunkt, hvor temperaturen i tørreskabet atter er kommet op på 130 °C. Efter åbning af tørreskabet lukkes karret straks med låget, tages ud af skabet, henstilles til afkøling i 30-45 minutter i ekssikkatoren (punkt 3.6) og vejes derefter med 1 mg nøjagtighed.

4.2.3.   Foderblandinger indeholdende mere end 4 % saccharose eller lactose: fodermidler såsom johannesbrødskrå, hydrolyserede kornprodukter, maltspirer, sukkerroesnitter, fiskepressevand og sukker.

Et vejekar med låg vejes med 0,5 mg nøjagtighed. Ca. 5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i det tarerede kar og fordeles jævnt. Karret stilles efter aftagning af låget ind i et til 80-85 °C opvarmet vakuumtørreskab (punkt 3.5). For at temperaturen i tørreskabet ikke skal falde for stærkt, skal karret stilles hurtigt ind i skabet.

Trykket indstilles til 100 torr, og prøven tørres i fire timer ved dette tryk enten under tilførsel af varm, tør luft eller ved hjælp af et tørringsmiddel (ca. 300 g til 20 prøver). I sidstnævnte tilfælde afbrydes forbindelsen til vakuumpumpen, så snart det foreskrevne tryk er nået. Tørringstiden regnes fra det tidspunkt, hvor temperaturen i tørreskabet atter er kommet op på 80-85 °C. Efter tørringstidens udløb bringes tørreskabet forsigtigt op på atmosfærisk tryk. Efter åbning af tørreskabet lukkes karret straks med låget, tages ud af skabet, henstilles til afkøling i 30-45 minutter i ekssikkatoren (punkt 3.6) og vejes derefter med 1 mg nøjagtighed. Der tørres i yderligere 30 minutter under vakuum i tørreskabet ved 80-85 °C, og derefter vejes på ny. Forskellen mellem de to vejeresultater må ikke overstige 0,1 % vandindhold.

4.3.   Fortørring (delvis tørring)

Det er nødvendigt at foretage en delvis tørring af »vådt« foder, der har en vægtprocent på mindre end 85 % tørstof (f.eks. foderplanter, blandede rationer, (ikke-)flydende foder), før det formales fint for at analysere indholdet af stabile stoffer. For så vidt angår ustabile stoffer, er det ikke muligt at foretage delvis tørring.

Delvis tørring kan foretages enten ved anvendelse af en varmluftovn, en mikroovn eller ved frysetørring. Bortset fra delvis tørring ved frysetørring er formået at tørre foderet, samtidig med at prøvens temperatur holdes under 60 °C, så den kemiske sammensætning påvirkes minimalt. Tørring ved temperaturer over 60 °C forårsager kemiske ændringer i foderet (f.eks. nedbrydning af protein). Det tørrede foder skal henstå i ca. 15 minutter ved rumtemperatur for at komme i ligevægt, før der foretages en måling af indholdet af delvis tørt stof for at minimere de mulige ændringer i vandindholdet, der kan forekomme ved formaling og opbevaring. Tørring ved temperaturer under 60 °C fjerner ikke alt vandet fra foderet, og derfor repræsenterer den (første) delvise tørring ikke det samlede indhold af tørstof i foderet. Efter tørring formales og analyseres delprøven for (endeligt) indhold af tørstof i den delvist tørrede prøve (de resterende 3-15 % vand), når andre kemiske bestanddele bestemmes.

Derfor anbefales det at følge en to-trins-procedure til bestemmelse af tørstof. Først bestemmes indholdet af delvis tørt stof (hvis der er mindre end 85 % tørstof). Derefter bestemmes det resterende tørstofindhold ud fra en formalet testprøve, og indholdet af delvis tørt stof ganges med det resterende tørstofindhold for at bestemme det samlede tørstofindhold.

5.   Beregning af resultater

Prøvens vandindhold (X) i procent beregnes efter følgende formler:

5.1.   Tørring uden fortørring

hvor:

m	=	prøvens begyndelsesvægt i gram
m0	=	den tørre prøves vægt i gram.

5.2.   Tørring med fortørring (2)

hvor:

m	=	prøvens begyndelsesvægt i gram
m1	=	prøvens vægt i gram efter fortørring
m2	=	prøvens vægt i gram efter formaling
m0	=	den tørre prøves vægt i gram.

5.3.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 0,2 % vandindhold i absolut værdi, undtagen vådfoder til selskabsdyr og tyggepinde og tyggeben til hunde, hvor forskellen ikke må overstige 0,5 % vandindhold i absolut værdi.

6.   Bemærkning

Hvis det viser sig at være nødvendigt med formaling, og der i den forbindelse må påregnes en ændring af materialets vandindhold, skal analyseresultaterne for foderets bestanddele korrigeres i overensstemmelse med originalprøvens vandindhold.

B.   BESTEMMELSE AF VANDINDHOLDET I ANIMALSK OG VEGETABILSK FEDT

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme animalske og vegetabilske fedtstoffers og oliers vandindhold (vand og flygtige stoffer).

2.   Princip

Prøven tørres ved 103 °C, indtil vægten ikke mere formindskes (vægttabet mellem to på hinanden følgende vejninger må højst være på 1 mg). Vægttabet bestemmes ved vejning.

3.   Apparatur

3.1.

Fladbundet beholder af korrosionsbestandigt materiale, diameter: 8-9 cm, højde: ca. 3 cm.

3.2.

Termometer med forstærket kugle og udvidelsesrum i den øverste ende, inddelt i grader fra ca. 80 °C til mindst 110 °C, længde: ca. 10 cm.

3.3.

Sandbad eller elektrisk varmeplade.

3.4.

Ekssikkator indeholdende et effektivt tørremiddel.

3.5.

Analysevægt.

4.   Fremgangsmåde

Ca. 20 g af den homogeniserede prøve afvejes med 1 mg nøjagtighed i den tørre, tarerede beholder (punkt 3.1), hvori termometret (punkt 3.2) er anbragt. Prøven opvarmes på sandbadet eller varmepladen (punkt 3.3) under stadig omrøring med termometret, så den når en temperatur på 90 °C i løbet af ca. syv minutter.

Varmen dæmpes efter den hyppighed, med hvilken boblerne stiger op fra beholderens bund. Temperaturen må ikke overstige 105 °C. Bliv ved med at røre og skrabe bunden, indtil der ikke dannes flere bobler.

For at sikre, at fugtigheden helt er fjernet, gentages opvarmningen til 103 °C ± 2 ° flere gange, med afkøling til 93 °C mellem de på hinanden følgende opvarmninger. Derefter henstilles til afkøling til rumtemperatur i ekssikkatoren (punkt 3.4) og vejes. Denne proces gentages, indtil vægttabet mellem to afvejninger ikke overstiger 2 mg.

NB!	Hvis prøvens vægt øges efter gentagne opvarmninger, er dette tegn på oxidering af fedtstoffet. I så fald beregnes resultatet af den afvejning, der er blevet foretaget, umiddelbart inden vægtforøgelsen begyndte.

5.   Beregning af resultater

Prøvens vandindhold (X) i procent beregnes efter følgende formel:

hvor:

m	=	prøvens vægt i gram
m1	=	beholderens og indholdets vægt i gram inden opvarmning
m2	=	beholderens og indholdets vægt i gram efter opvarmning.

Resultater på under 0,05 % opføres som »mindre end 0,05 %«.

Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 0,1 % vandindhold i absolut værdi.

C.   BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF NITROGEN OG BEREGNING AF INDHOLDET AF RÅPROTEIN

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af råprotein i foder på basis af nitrogenindholdet (Kjeldahls metode) (3).

2.   Princip

Prøven destrueres med svovlsyre under tilstedeværelse af en katalysator. Syreopløsningen gøres alkalisk med en natriumhydroxidopløsning. Ammoniakken destilleres og opsamles i en nøjagtigt afmålt mængde svovlsyre, idet den overskydende mængde svovlsyre titreres med en standardnatriumhydroxidopløsning.

Alternativt destilleres den frigjorte ammoniak i et overskud af borsyreopløsning, hvorefter der titreres med en saltsyre- eller svovlsyreopløsning.

3.   Reagenser

3.1.

Kaliumsulfat

3.2.

Katalysator: kobber(II)oxid (CuO) eller kobber(II)sulfatpentahydrat CuSO4 5H2O

3.3.

Granuleret zink

3.4.

Svovlsyre, ρ20 = 1,84 g/ml

3.5.

Svovlsyre, standardopløsning, c(H2SO4) = 0,25 mol/liter

3.6.

Svovlsyre, standardopløsning, c(H2SO4) = 0,10 mol/liter

3.7.

Svovlsyre, standardopløsning, c(H2SO4) = 0,05 mol/liter

3.8.

Indikator af methylrødt; 300 mg methylrødt opløses i 100 ml ethanol, σ = 95-96 % (v/v)

3.9.

Natriumhydroxidopløsning (teknisk kvalitet kan bruges), β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %)

3.10.

Natriumhydroxid, standardopløsning, c(NaOH) = 0,25 mol/liter

3.11.

Natriumhydroxid, standardopløsning, c(NaOH) = 0,10 mol/liter

3.12.

Granuleret pimpsten, vasket i saltsyre og udglødet

3.13.

Acetanilid (smeltepunkt = 114 °C, N-indhold = 10,36 %)

3.14.

Saccharose (nitrogenfri)

3.15.

Borsyre (H3BO3)

3.16.

Indikatoropløsning af methylrødt: 100 mg methylrødt opløses i 100 ml ethanol eller methanol

3.17.

Opløsning af bromcresolgrønt: 100 mg bromcresolgrønt opløses i 100 ml ethanol eller methanol

3.18.

Borsyreopløsning (10–40 g/liter, afhængigt af det anvendte apparatur) Anvendes kolorimetrisk endpointbestemmelse, skal borsyreopløsningerne tilføres methylrødt- og bromcresolgrøntindikatorer. Fremstilles 1 liter borsyreopløsning, tilsættes der, inden tilpasning af volumen, 7 ml indikatoropløsning af methylrødt (punkt 3.16) og 10 ml opløsning af bromcresolgrønt (punkt 3.17). Borsyreopløsningens pH-værdi vil kunne variere fra batch til batch afhængigt af vandet, der bruges. Borsyreopløsningens pH-værdi skal ligge mellem 4,3 og 4,7. Det vil ofte være nødvendigt at justere med en lille mængde alkali for at opnå en positiv blindprøve. NB! En god justering opnås normalt ved at tilsætte ca. 3-4 ml NaOH (punkt 3.11) til 1 liter borsyreopløsning på 10 g/liter. Opløsningen opbevares ved rumtemperatur og beskyttes under opbevaringen mod lys og ammoniakdampe.

3.19.

Standardsaltsyreopløsning, c(HCl) = 0,10 mol/liter NB! Der kan anvendes opløsninger i andre koncentrationer (punkt 3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 og 3.19), forudsat at der korrigeres herfor i beregningerne. Koncentrationen skal altid angives med fire decimaler.

4.   Apparatur

Apparat egnet til destruktion, destillation og titrering efter Kjeldahls metode.

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Destruktion

1 g af prøven afvejes med 0,001 g nøjagtighed og overføres til destruktionskolben. Der tilsættes 15 g kaliumsulfat (punkt 3.1), en passende mængde katalysator (punkt 3.2) (0,3–0,4 g kobber(II)oxid eller 0,9–1,2 g kobber(II)sulfatpentahydrat), 25 ml svovlsyre (punkt 3.4) og eventuelt nogle få korn pimpsten (punkt 3.12) og blandes.

Kolben opvarmes, forsigtigt i begyndelsen, og omrystes om nødvendigt af og til forsigtigt, indtil prøven er forkullet og skummet forsvundet. Derefter opvarmes kraftigere, indtil væsken koger jævnt. Opvarmningen er tilstrækkelig, hvis den kogende syre fortætter sig på kolbens væg. Det må forhindres, at siderne bliver overophedet, og at organiske partikler klæber til dem.

Når opløsningen bliver klar og lysegrøn, fortsættes kogningen i yderligere to timer. Derefter henstilles kolben til afkøling.

5.2.   Destillation

Der tilsættes forsigtigt tilstrækkeligt vand til, at sulfaterne opløses fuldstændigt. Kolben henstår til afkøling, hvorefter der om nødvendigt tilsættes nogle få zinkkorn (punkt 3.3). Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.2.1 eller 5.2.2.

5.2.1.   Destillation i svovlsyre

I destillationsapparatets opsamlingskolbe anbringes en nøjagtigt afmålt mængde på 25 ml svovlsyre (punkt 3.5 eller 3.7) afhængigt af det formodede nitrogenindhold. Der tilsættes nogle få dråber indikator af methylrødt (punkt 3.8).

Destruktionskolben forbindes med destillationsapparatets svaler, og svalerens nederste del nedsænkes i væsken i opsamlingskolben til en dybde af mindst 1 cm (se bemærkning punkt 8.3). 100 ml natriumhydroxidopløsning (punkt 3.9) overføres forsigtigt til destruktionskolben, uden at der mistes ammoniak (se bemærkning punkt 8.1). Kolben opvarmes, indtil ammoniakken er destilleret over.

5.2.2.   Destillation i borsyre

Foretages titreringen af destillatets ammoniakindhold manuelt, følges den nedenfor beskrevne fremgangsmåde. Er destillationsenheden fuldt automatiseret, så også titreringen af destillatets ammoniakindhold sker automatisk, følges brugsanvisningen til destillationsenheden.

En opsamlingskolbe med 25-30 ml af borsyreopløsningen (punkt 3.18) anbringes under svalerens afløbsåbning, således at tilførselsrøret befinder sig under overfladen i den overskydende borsyreopløsning. Destillationsenheden indstilles til at give 50 ml natriumhydroxidopløsning (punkt 3.9). Destillationsenheden betjenes i overensstemmelse med brugsanvisningen, og den ammoniak, der er frigivet ved tilførslen af natriumhydroxidopløsningen, afdampes. Destillatet opsamles i forlaget med borsyre. Destillatmængden (dampdestillationstiden) afhænger af mængden af nitrogen i prøven. Brugsanvisningen følges.

NB!	I en halvautomatisk destillationsenhed sker tilførslen af overskydende natriumhydroxid samt dampdestillationen automatisk.

5.3.   Titrering

Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.1 eller 5.3.2.

5.3.1.   Svovlsyre

Den overskydende svovlsyre i opsamlingskolben titreres med natriumhydroxidopløsning (punkt 3.10 eller 3.11) afhængigt af koncentrationen af den anvendte svovlsyre, indtil ækvivalenspunktet er nået.

5.3.2.   Borsyre

Med en burette titreres opsamlingskolbens indhold med standardsaltsyreopløsningen (punkt 3.19) eller med standardsvovlsyreopløsningen (punkt 3.6), og den anvendte titrantmængde aflæses.

Anvendes kolorimetrisk endpointbestemmelse, er ækvivalenspunktet nået ved det første tegn på pinkfarvning af indholdet. Buretteaflæsningen anslås med 0,05 ml nøjagtighed. En oplyst magnetisk omrørerplade eller en fotometrisk detektor vil kunne lette visualiseringen af ækvivalenspunktet.

Processen kan gøres automatisk ved anvendelse af en dampdestillationsenhed med automatisk titrering.

Brugsanvisningen til den enkelte destillationsenhed eller destillationsenhed/titrator følges.

NB!	Anvendes et automatisk titreringssystem, begynder titreringen umiddelbart efter, at destillationen er begyndt, og borsyreopløsningen på 1 % (punkt 3.18) anvendes.

Gøres der brug af en fuldautomatisk destillationsenhed, kan den automatiske titrering af ammoniakken også foretages med endpointbestemmelse, idet der så anvendes et potentiometrisk pH-system.

I dette tilfælde anvendes en automatisk titrator med pH-meter. pH-metret skal være korrekt kalibreret i området pH 4-pH 7 i overensstemmelse med almindelige laboratorie-pH-kalibreringsprocedurer.

pH-titreringsækvivalenspunktet nås ved en pH-værdi på 4,6, som er det sted på titreringskurven, hvor hældningen er stejlest.

5.4.   Blindprøve

For at sikre, at reagenserne er nitrogenfrie, foretages der en blindprøve (destruktion, destillation og titrering) ved brug af 1 g saccharose (punkt 3.14) i stedet for prøven.

6.   Beregning af resultater

Beregningerne foretages som beskrevet i punkt 6.1 eller 6.2.

6.1.   Titreringsberegning, jf. punkt 5.3.1

Indholdet af råprotein, udtrykt i vægtprocent, beregnes efter følgende formel:

hvor:

V0	=	mængde (ml) NaOH (punkt 3.10 eller 3.11) forbrugt i blindprøven
V1	=	mængde (ml) NaOH (punkt 3.10 eller 3.11) forbrugt ved titreringen af prøven
c	=	koncentration (mol/liter) af natriumhydroxid (punkt 3.10 eller 3.11)
m	=	prøvens vægt i gram.

6.2.   Titreringsberegning, jf. punkt 5.3.2

6.2.1.   Titrering med saltsyre

Indholdet af råprotein, udtrykt i vægtprocent, beregnes efter følgende formel:

hvor:

m	=	testportionens vægt i gram
c	=	koncentration (mol/liter) af standardsaltsyreopløsningen (punkt 3.19)
V0	=	mængde (ml) saltsyre anvendt i blindprøven
V1	=	mængde (ml) saltsyre anvendt i testportionen.

6.2.2.   Titrering med svovlsyre

Indholdet af råprotein, udtrykt i vægtprocent, beregnes efter følgende formel:

hvor:

m	=	testportionens vægt i gram
c	=	koncentration (mol/liter) af standardsvovlsyreopløsningen (punkt 3.6)
V0	=	mængde (ml) svovlsyre (3.6) anvendt i blindprøven
V1	=	mængde (ml) svovlsyre (3.6) anvendt i testportionen.

7.   Kontrol af metoden

7.1.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige:

—	0,4 % i absolut værdi for råproteinindhold på under 20 %

—	2,0 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for råproteinindhold på 20-40 %

—	0,8 % i absolut værdi for råproteinindhold på over 40 %.

7.2.   Reproducerbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser udført på samme prøve på forskellige laboratorier må ikke overstige:

—	1,8 % i absolut værdi for råproteinindhold på under 20 %

—	9,0 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for råproteinindhold på 20-40 %

—	3,6 % i absolut værdi for råproteinindhold på over 40 %.

7.3.   Nøjagtighed

Analysen (destruktion, destillation og titrering) foretages på en passende mængde acetanilid (punkt 3.13) (f.eks. 0,2-0,3 g) under tilstedeværelse af 1 g saccharose (punkt 3.14). 1 g acetanilid kræver 14,80 ml svovlsyre (punkt 3.5). Genfindingsprocenten skal være mindst 99 %.

8.   Bemærkninger

8.1.

Apparaturet kan være manuelt, halvautomatisk eller automatisk. Hvis apparaturet kræver overførsel mellem destruktions- og destillationstrinet, skal sådan overførsel kunne ske uden tab. Hvis destillationsapparatets kolbe ikke har skilletragt, tilsættes natriumhydroxiden, lige inden kolben forbindes med svaleren, idet væsken hældes langsomt ned langs siden.

8.2.

Hvis destruktionsproduktet størkner, gentages bestemmelsen med brug af en større mængde svovlsyre (punkt 3.4) end angivet under punkt 5.1.

8.3.

For produkter med lavt nitrogenindhold kan mængden af svovlsyre (punkt 3.7), der skal bruges i opsamlingskolben, om nødvendigt mindskes til 10 eller 15 ml og fyldes op med vand til 25 ml.

8.4.

Til rutineanalyser kan der anvendes alternative analysemetoder til bestemmelse af råprotein, men Kjeldahls metode som beskrevet her i del C er referencemetoden. Det skal for hver enkelt matrix godtgøres, at de resultater, der opnås med den alternative metode (f.eks. DUMAS), svarer til dem, der opnås med referencemetoden. Eftersom resultaterne, der opnås med en alternativ metode, kan afvige en smule fra de resultater, der opnås med referencemetoden, selv efter ækvivalenskontrol, er det nødvendigt i analyserapporten at angive, hvilken analysemetode der er anvendt til bestemmelse af råprotein.

D.   BESTEMMELSE AF URINSTOF

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af urinstof anvendt som fodertilsætningsstof i foder til drøvtyggere.

2.   Princip

Prøven opslæmmes i vand under tilsætning af et klaringsmiddel. Suspensionen filtreres. Filtratets indhold af urinstof bestemmes, efter tilsætning af 4-dimethylaminobenzaldehyd (4-DMAB), ved måling af ekstinktionen ved en bølgelængde på 420 nm.

3.   Reagenser

3.1.

4-Dimethylaminobenzaldehydopløsning: 1,6 g 4-DMAB opløses i 100 ml 96 % ethanol, og der tilsættes 10 ml saltsyre (ρ20 = 1,19 g/ml). Dette reagens kan højst holde sig i to uger.

3.2.

Carrez-reagens I: 21,9 g zinkacetat, Zn(CH3COO)2 2H2O, og 3 g iseddike opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.

3.3.

Carrez-reagens II: 10,6 g kaliumferrocyanid, K4Fe(CN)6 3H2O, opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.

3.4.

Aktivt kul, der ikke absorberer urinstoffet (skal kontrolleres).

3.5.

Urinstof, 0,1 % opløsning (w/v).

4.   Apparatur

4.1.

Mekanisk rysteapparat: ca. 35–40 omdrejninger i minuttet.

4.2.

Reagensglas: 160 × 16 mm, med slibprop.

4.3.

Spektrofotometer.

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Analyse af prøven

2 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og kommes sammen med 1 g aktivt kul (punkt 3.4) i en 500 ml målekolbe. Der tilsættes 400 ml vand og 5 ml Carrez-reagens I (punkt 3.2) og blandes i ca. 30 sekunder, hvorefter der tilsættes 5 ml Carrez-reagens II (punkt 3.3). Væsken blandes i 30 minutter i rysteapparatet. Der fyldes op med vand til mærket, omrystes og filtreres.

5 ml af de klare og farveløse filtrater udtages med pipette og hældes i reagensglassene med slibprop, hvorefter der tilsættes 5 ml 4-DMAB-opløsning (punkt 3.1) og blandes. Glassene anbringes i vandbad ved 20 °C (+/- 4 °C). Efter 15 minutter måles ekstinktionen i prøveopløsningen i spektrofotometret ved 420 nm. Der sammenlignes med reagensernes blindprøveopløsning.

5.2.   Kalibreringskurve

Der udtages volumener på 1, 2, 4, 5 og 10 ml af urinstofopløsningen (punkt 3.5), disse hældes i 100 ml målekolber, og der fyldes op med vand til mærket. Der udtages 5 ml af hver opløsning, hver af dem tilsættes 5 ml 4-DMAB-opløsning (punkt 3.1), der homogeniseres, og ekstinktionen måles, som angivet ovenfor, ved sammenligning med en kontrolopløsning, som indeholder 5 ml 4-DMAB og 5 ml vand uden urinstof. Kalibreringskurven tegnes.

6.   Beregning af resultater

Bestem mængden af urinstof i prøven ved benyttelse af kalibreringskurven.

Resultatet angives i mg urinstof pr. kg prøve.

7.   Evaluering af metoden

7.1.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser udført på den samme prøve på det samme laboratorium og af den samme person må ikke overstige:

—

Ved 420 nm — 50 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for urinstofindhold fra 3 000 mg/kg til under 5 000 mg/kg — 25 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for urinstofindhold fra 5 000 mg/kg til under 7 000 mg/kg — 20 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for urinstofindhold på 7 000 mg/kg eller derover.

—

Ved 435 nm — 40 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for urinstofindhold fra 3 000 mg/kg til under 5 000 mg/kg — 25 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for urinstofindhold fra 5 000 mg/kg til under 9 000 mg/kg — 5 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for urinstofindhold på 9 000 mg/kg eller derover.

7.2.   Reproducerbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser udført på den samme prøve på forskellige laboratorier og/eller af forskellige personer må ikke overstige:

—	Ved 420 nm — 3 000 mg/kg i absolut værdi for urinstofindhold fra 3 000 mg/kg til under 12 000 mg/kg — 4 500 mg/kg i absolut værdi for urinstofindhold på 12 000 mg/kg eller derover.

—	Ved 435 nm — 50 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for urinstofindhold fra 3 000 mg/kg til under 8 000 mg/kg — 25 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for urinstofindhold på 8 000 mg/kg eller derover.

8.   Resultater af ringanalyse

Der blev foretaget en sammenligning mellem laboratorier i EU, hvor 18 laboratorier deltog. Der blev analyseret fem positive foderblandinger til drøvtyggere (i tabel 1 og 2 benævnt MAT) (én analyse) ved blindbestemmelse med dobbeltprøver, mens én blindprøve af foderblanding til drøvtyggere blev analyseret én gang.

Der blev foretaget beregninger for grænserne for repeterbarhed (r) og reproducerbarhed (R) som fastsat i henhold til internationale retningslinjer efter fjernelse af outliers ved hjælp af variationsanalyse af de gyldige værdier.

De beregnede tal for metodens ydeevne (repeterbarhed, reproducerbarhed) præsenteres i tabellerne nedenfor. Blandt alle de testede prøver, herunder blindprøverne, blev der ikke fundet falske positive eller falske negative.

Tabel 1

Karakteristika for metodens ydeevne for urinstof målt ved λ = 420 nm i alle materialer

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Får	Kvæg	Får	Får	Kvæg
Målvægtprocent (mg kg-1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Gennemsnitlig vægtprocent (mg kg-1)	4 241	6 993	7 830	9 962	12 071
Standardafvigelse for reproducerbarhed sR (mg kg-1)	1 141	1 303	985	994	1 711
Standardafvigelse for repeterbarhed sR (mg kg-1)	723	601	549	712	737
Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed RSDR (%)	27	19	13	10	14
Relativ standardafvigelse for repeterbarhed RSDr (%)	17	9	7	7	6
Grænse for reproducerbarhed, R [R = 2,8 × sR ]	3 195	3 649	2 759	2 784	4 790
Grænse for repeterbarhed, r [r = 2,8 × sr ]	2 024	1 684	1 536	1 994	2 064

Tabel 2

Karakteristika for metodens ydeevne for urinstof målt ved λ = 435 nm i alle materialer

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Får	Kvæg	Får	Får	Kvæg
Målvægtprocent (mg kg-1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Gennemsnitlig vægtprocent (mg kg-1)	4 101	6 467	7 890	10 062	11 642
Standardafvigelse for reproducerbarhed sR (mg kg-1)	706	1 194	675	745	1 378
Standardafvigelse for repeterbarhed sR (mg kg-1)	570	628	613	196	167
Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed RSDR (%)	17	18	9	7	12
Relativ standardafvigelse for repeterbarhed RSDr (%)	14	10	8	2	1
Grænse for reproducerbarhed, R [R = 2,8 × sR ]	1 977	3 344	1 889	2 087	3 859
Grænse for repeterbarhed, r [r = 2,8 × sr ]	1 596	1 759	1 715	549	467

9.   Bemærkninger

9.1.

Hvis indholdet af urinstof er større end 3 %, reduceres analyseprøven til 1 gram, eller den oprindelige opløsning fortyndes så meget, at der ikke er mere end 50 mg urinstof i 500 ml.

9.2.

Hvis indholdet af urinstof er ringe, forøges prøvens volumen i det omfang, filtratet vedbliver at være klart og farveløst.

9.3.

Ovenstående resultater fra ringanalyserne viser ikke, at der er væsentlig forskel i nøjagtighed mellem urinstof målt ved 420 nm og 435 nm.

E.   BESTEMMELSE AF AMINOSYRER (BORTSET FRA TRYPTOPHAN)

Følgende analysemetoder skal anvendes til bestemmelse af aminosyrer (bortset fra tryptophan):

—	EN ISO 13903 Foderstoffer — Bestemmelse af aminosyreindhold

—	EN ISO 17180 Foderstoffer — Bestemmelse af lysin, methionin og threonin i kommercielle produkter og forblandinger med aminosyrer (4)

—	den analysemetode, der er beskrevet nedenfor i punkt 1-10.

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af frie (syntetiske og naturlige) og totale (peptidbundne og frie) aminosyrer i fodermidler, foderblandinger og forblandinger, der indeholder mindre end 10 % (5) af hver aminosyre, ved brug af en aminosyreanalysator. Metoden kan anvendes til følgende aminosyrer: cyst(e)in, methionin, lysin, threonin, alanin, arginin, asparaginsyre, glutaminsyre, glycin, histidin, isoleucin, leucin, phenylalanin, prolin, serin, tyrosin og valin.

Metoden skelner ikke mellem de forskellige salte af aminosyrer og kan ikke differentiere mellem D- og L-former af aminosyrer. Den er ikke anvendelig til bestemmelse af tryptophan- eller hydroxyanaloger af aminosyrer.

2.   Princip

2.1.   Frie aminosyrer

Frie aminosyrer ekstraheres med fortyndet saltsyre. Kvælstofholdige makromolekyler, der ekstraheres samtidig, udfældes med sulfosalicylsyre og fjernes ved filtrering. Den filtrerede opløsnings pH-værdi justeres til 2,20. Aminosyrerne adskilles ved ionbytningskromatografi og bestemmes ved reaktion med ninhydrin ved fotometrisk påvisning ved 570 nm.

2.2.   Totale aminosyrer

Den valgte metode afhænger af de aminosyrer, der skal undersøges. Cyst(e)in og methionin skal oxideres til henholdsvis cysteinsyre og methioninsulfon inden hydrolyse. Tyrosin skal bestemmes i hydrolysater af uoxiderede prøver. Alle de øvrige aminosyrer, der er nævnt i punkt 1 (Formål og anvendelsesområde), kan bestemmes i enten den oxiderede eller den uoxiderede prøve.

Oxidering sker ved 0 °C med en phenolholdig permyresyre. Overskydende oxideringsreagens destrueres med natriumdisulfit. Den oxiderede eller uoxiderede prøve hydrolyseres med saltsyre (punkt 3.20) i 23 timer. Hydrolysatets pH-værdi justeres til 2,20. Aminosyrerne adskilles ved ionbytningskromatografi og bestemmes ved reaktion med ninhydrin ved fotometrisk påvisning ved 570 nm (440 nm for prolin).

3.   Reagenser

Der skal anvendes dobbeltdestilleret vand eller vand af tilsvarende kvalitet (ledningsevne: < 10 μS).

3.1.

Hydrogenperoxid, w (w/v) = 30 %

3.2.

Myresyre, w (w/v) = 98-100 %

3.3.

Phenol

3.4.

Natriumdisulfit

3.5.

Natriumhydroxid

3.6.

5-Sulfosalicylsyre-dihydrat

3.7.

Saltsyre, massefylde: ca. 1,18 g/ml

3.8.

Tri-natriumcitrat-dihydrat

3.9.

2,2 »-Thiodiethanol (thiodiglycol)

3.10.

Natriumchlorid

3.11.

Ninhydrin

3.12.

Petroleumsether, kogepunktsinterval: 40–60 °C

3.13.

Norleucin eller anden forbindelse, der er egnet til brug som intern standard

3.14.

Nitrogengas (< 10 ppm oxygen)

3.15.

1-Octanol

3.16.

Aminosyrer

3.16.1.

Standardstoffer af de aminosyrer, der er anført i punkt 1 (Formål og anvendelsesområde). Rene forbindelser, der ikke indeholder krystalvand. Tørres under vakuum over P2O5 eller H2SO4 i en uge inden brug.

3.16.2.

Cysteinsyre

3.16.3.

Methioninsulfon

3.17.

Natriumhydroxidopløsning, c = 7,5 mol/liter: 300 g NaOH (punkt 3.5) opløses i vand, og der fyldes op til 1 liter.

3.18.

Natriumhydroxidopløsning, c = 1 mol/liter: 40 g NaOH (punkt 3.5) opløses i vand, og der fyldes op til 1 liter.

3.19.

Phenolholdig myresyreopløsning: 889 g myresyre (punkt 3.2) blandes med 111 g vand, og der tilsættes 4,73 g phenol (punkt 3.3).

3.20.

Hydrolyseblanding, c = 6 mol HCl/liter indeholdende 1 g phenol/liter: Der tilsættes 1 g phenol (punkt 3.3) til 492 ml HCl (punkt 3.7) og fyldes op med vand til 1 liter.

3.21.

Ekstraktionsopløsning, c = 0,1 mol HCl/liter indeholdende 2 % thiodiglycol: 8,2 ml HCl (punkt 3.7) opløses i ca. 900 ml vand, hvorefter der tilsættes 20 ml thiodiglycol (punkt 3.9) og fyldes op med vand til 1 liter (punkt 3.7 og 3.9 må ikke blandes direkte).

3.22.

5-Sulfosalicylsyreopløsning, ß = 6 %: 60 g 5-sulfosalicylsyre (punkt 3.6) opløses i vand, og der fyldes op med vand til 1 liter.

3.23.

Oxideringsreagens (permyresyre-phenol): 0,5 ml hydrogenperoxid (punkt 3.1) blandes med 4,5 ml phenolholdig myresyreopløsning (punkt 3.19) i et lille bægerglas. Inkuberes ved 20–30 °C i 1 time for at danne permyresyre. Herefter afkøles opløsningen i isbad (15 minutter), inden den tilsættes prøven. Advarsel: Undgå kontakt med huden, og bær beskyttelsesbeklædning.

3.24.

Citratbuffer, c = 0,2 mol Na+/liter, pH 2,20: 19,61 g natriumcitrat (punkt 3.8), 5 ml thiodiglycol (punkt 3.9), 1 g phenol (punkt 3.3) og 16,50 ml HCl (punkt 3.7) opløses i ca. 800 ml vand. pH justeres til 2,20. Der fyldes op med vand til 1 liter.

3.25.

Elueringsbuffere fremstillet ifølge betingelserne for den benyttede analysator (punkt 4.9)

3.26.

Ninhydrinreagens fremstillet ifølge betingelserne for den benyttede analysator (punkt 4.9)

3.27.

Standardopløsninger af aminosyrer. Opløsningerne opbevares ved < 5 °C

3.27.1.

Standardstamopløsning af aminosyrer (punkt 3.16.1) c = 2,5 μmol/ml af hver i saltsyre Kan fås i handelen.

3.27.2.

Standardstamopløsning af cysteinsyre og methioninsulfon, c = 1,25 μmol/ml 0,2115 g cysteinsyre (punkt 3.16.2) og 0,2265 g methioninsulfon (punkt 3.16.3) opløses i citratbuffer (punkt 3.24) i en 1 liter målekolbe, og der fyldes op til mærket med citratbuffer. Opløsningen opbevares ved < 5 °C i højst 12 måneder. Denne opløsning benyttes ikke, hvis standardstamopløsningen (punkt 3.27.1) indeholder cysteinsyre og methioninsulfon.

3.27.3.

Standardstamopløsning af den interne standard, f.eks. norleucin, c = 20 μmol/ml 0,6560 g norleucin (punkt 3.13) opløses i citratbuffer (punkt 3.24) i en målekolbe, og der fyldes op med citratbuffer til 250 ml. Opløsningen opbevares ved < 5 °C i højst seks måneder.

3.27.4.

Kalibreringsopløsning af standardaminosyrer til brug med hydrolysater, c = 5 nmol/50 μl cysteinsyre og methioninsulfon og c = 10 nmol/50 μl af de øvrige aminosyrer. 2,2 g natriumchlorid (punkt 3.10) opløses i et 100 ml bægerglas med 30 ml citratbuffer (punkt 3.24). Der tilsættes 4,00 ml standardstamopløsning af aminosyrer (3.27.1), 4,00 ml standardstamopløsning af cysteinsyre og methioninsulfon (punkt 3.27.2) og, hvis benyttet, 0,50 ml standardstamopløsning af intern standard (punkt 3.27.3). pH justeres til 2,20 med natriumhydroxid (punkt 3.18). Opløsningen overføres kvantitativt til en 50 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med citratbuffer (punkt 3.24) og blandes. Opløsningen opbevares ved < 5 °C i højst tre måneder. Se også bemærkninger punkt 9.1.

3.27.5.

Kalibreringsopløsning af standardaminosyrer til brug med hydrolysater fremstillet under punkt 5.3.3.1 og til brug med ekstrakter (5.2). Kalibreringsopløsningen fremstilles efter punkt 3.27.4, men der tilsættes ikke natriumchlorid. Opløsningen opbevares ved < 5 °C i højst tre måneder.

4.   Apparatur

4.1.

100 eller 250 ml rundbundet kolbe med tilbagesvaler

4.2.

100 ml borsilikatglasflaske med skruelåg forsynet med gummi/teflonpakning (f.eks. Duran, Schott) til brug i tørreskab

4.3.

Tørreskab med motordreven ventilation og temperaturindstilling med en nøjagtighed på ± 2 oC

4.4.

pH-meter (aflæsning med tre decimaler)

4.5.

Membranfilter (0,22 μm)

4.6.

Centrifuge

4.7.

Rotationsvakuumfordamper

4.8.

Mekanisk rysteapparat eller magnetomrører

4.9.

Aminosyreanalysator eller HPLC-udstyr med ionbyttekolonne, anordning til ninhydrin-postkolonne-derivatisering og fotometrisk detektor Kolonnen pakkes med sulfoneret polystyrenresin, der kan adskille aminosyrerne fra hinanden og fra andre ninhydrinpositive stoffer. Pumperne til buffer- og ninhydrinopløsningen skal i den tid, der omfatter såvel standardkalibreringskørslen som prøveanalysen, have en flowstabilitet på ± 0,5 %. Nogle aminosyreanalysatorer kan benyttes, hvor hydrolysatet har en natriumkoncentration på c = 0,8 mol/liter og indeholder den resterende myresyre fra oxideringstrinnet. Andre analysatorer giver ikke tilfredsstillende adskillelse af visse aminosyrer, hvis hydrolysatet indeholder overskydende myresyre og/eller høje natriumionkoncentrationer. I så fald reduceres syrevolumen ved inddampning til ca. 5 ml efter hydrolysen og inden pH-justeringen. Inddampningen foretages under vakuum ved højst 40 °C.

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Klargøring af prøven

Prøven formales, så den kan passere gennem en 0,5 mm sigte. Meget fugtige prøver skal inden formalingen enten lufttørres ved højst 50 °C eller frysetørres. Prøver med et højt fedtindhold ekstraheres med petroleumsether (punkt 3.12) inden formaling.

5.2.   Bestemmelse af frie aminosyrer

En passende mængde (1–5 g) af den klargjorte prøve (punkt 5.1) afvejes med en nøjagtighed på 0,2 mg i en konisk kolbe, og der tilsættes 100,0 ml ekstraktionsopløsning (punkt 3.21). Blandingen rystes i 60 minutter på mekanisk rysteapparat eller magnetomrører (punkt 4.8). Efter henstand og bundfældning afpipetteres 10,0 ml af supernatanten i et 100 ml bægerglas.

Der tilsættes 5,0 ml sulfosalicylsyreopløsning (punkt 3.22) under omrøring, og der omrøres fortsat med magnetomrører i fem minutter. Supernatanten filtreres eller centrifugeres for at fjerne eventuelt bundfald. 10,0 ml af den klarede opløsning kommes i et 100 ml bægerglas, og pH justeres til 2,20 med natriumhydroxidopløsning (punkt 3.18). Opløsningen overføres med citratbuffer (punkt 3.24) til en målekolbe af passende størrelse, og der fyldes op til mærket med citratbufferopløsningen (punkt 3.24).

Hvis der bruges en intern standard, tilsættes 1,00 ml intern standard (punkt 3.27.3) for hver 100 ml slutopløsning, og der fyldes op til mærket med bufferopløsningen (punkt 3.24).

Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4.

Hvis ekstraktet ikke kromatograferes samme dag, skal det opbevares ved < 5 °C.

5.3.   Bestemmelse af totale aminosyrer

5.3.1.   Oxidering

0,1-1 g af den klargjorte prøve (punkt 5.1) afvejes med en nøjagtighed på 0,2 mg i:

—	en 100 ml rundbundet kolbe (punkt 4.1) til åben hydrolyse (punkt 5.3.2.3), eller

—	en 250 ml rundbundet kolbe (punkt 4.1), hvis der kræves en lav natriumkoncentration (punkt 5.3.3.1), eller

—	en 100 ml flaske med skruelåg (punkt 4.2) til lukket hydrolyse (punkt 5.3. - 2.4).

Den afvejede prøveportion skal have et kvælstofindhold på ca. 10 mg og et vandindhold på højst 100 mg.

Kolben/flasken anbringes i isbad og nedkøles til 0 °C, hvorefter der tilsættes 5 ml oxideringsblanding (punkt 3.23) og omrøres ved hjælp af en glasspatel med bøjet spids. Kolben/flasken, der indeholder spatelen, lukkes med lufttæt film. Isbadet med den lukkede beholder anbringes i et køleskab ved 0 °C og henstår i 16 timer. Efter 16 timer tages det ud af køleskabet, og det overskydende oxideringsreagens destrueres ved tilsætning af 0,84 g natriumdisulfit (punkt 3.4).

Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.2.1.

5.3.2.   Hydrolyse

5.3.2.1.

Hydrolyse af oxiderede prøver Den oxiderede prøve (punkt 5.3.1) tilsættes 25 ml hydrolyseblanding (punkt 3.20). Alle prøverester, der måtte sidde fast på beholderen og spatelen, skal omhyggeligt vaskes ned. Alt efter den benyttede hydrolysemetode fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4.

5.3.2.2.

Hydrolyse af uoxiderede prøver 0,1–1 g af den klargjorte prøve (punkt 5.1) afvejes med en nøjagtighed på 0,2 mg i en 100 ml eller 250 ml rundbundet kolbe (4.1) eller en 100 ml flaske med skruelåg (punkt 4.2). Den afvejede prøveportion skal have et kvælstofindhold på ca. 10 mg. Der tilsættes forsigtigt 25 ml hydrolyseblanding (punkt 3.20), som blandes med prøven. Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4.

5.3.2.3.

Åben hydrolyse Der tilsættes tre glasperler til blandingen i kolben (klargjort som beskrevet i punkt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2). Den opvarmes til kogning og holdes under konstant kogning med tilbagesvaler i 23 timer. Efter afslutning af hydrolysen skylles tilbagesvaleren med 5 ml citratbuffer (3.24). Kolben aftages og afkøles i isbad. Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.3.

5.3.2.4.

Lukket hydrolyse Flasken med blandingen klargjort som beskrevet i punkt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2 anbringes i et tørreskab (punkt 4.3) ved 110 °C. For at forhindre trykopbygning (på grund af udvikling af gasser) og undgå eksplosion lægges skruelåget i den første time løst på flasken. Flasken må ikke lukkes med skruelåget. Efter en times forløb lukkes flasken med skruelåget og henstår i tørreskabet (punkt 4.3) i 23 timer. Efter afslutning af hydrolysen tages flasken ud af tørreskabet, skruelåget åbnes forsigtigt, og kolben anbringes i isbad, hvor den henstår til afkøling. Alt efter metoden for justering af pH-værdien (punkt 5.3.3) overføres kolbens indhold kvantitativt med citratbuffer (punkt 3.24) til et 250 ml bægerglas eller til en 250 ml rundbundet kolbe. Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.3.

5.3.3.   Justering af pH-værdien

Alt efter aminosyreanalysatorens (punkt 4.9) natriumtolerance foretages justeringen af pH-værdien som beskrevet i punkt 5.3.3.1 eller 5.3.3.2.

5.3.3.1.

For kromatografisystemer (4.9), der kræver en lav natrium-koncentration: Det er tilrådeligt at bruge en intern standardstamopløsning (punkt 3.27.3), hvis der benyttes aminosyreanalysatorer, der kræver en lav natriumkoncentration (hvor syreindholdet skal reduceres). I så fald tilsættes 2,00 ml af den interne standardstamopløsning (punkt 3.27.3) til hydrolysatet før inddampningen. Der tilsættes 2 dråber 1-octanol (punkt 3.15) til det efter punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4 frembragte hydrolysat. Volumen reduceres ved hjælp af rotationsfordamperen (punkt 4.7) til 5–10 ml under vakuum ved 40 °C. Hvis volumen ved et uheld reduceres til under 5 ml, kasseres hydrolysatet, og analysen gentages. pH justeres til 2,20 med natriumhydroxidopløsning (punkt 3.18), og der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.4.

5.3.3.2.

For andre aminosyreanalysatorer (punkt 4.9): Det efter punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4 frembragte hydrolysat neutraliseres delvis ved under omrøring at tilsætte 17 ml natriumhydroxidopløsning (punkt 3.17), samtidig med at temperaturen holdes under 40 °C. pH justeres til 2,20 med natriumhydroxidopløsning (punkt 3.17 og 3.18) ved rumtemperatur. Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.4.

5.3.4.   Prøveopløsning til kromatografi

Hydrolysatet (punkt 5.3.3.1 eller 5.3.3.2) justeret til en pH-værdi på 2,20 overføres med citratbuffer (punkt 3.24) kvantitativt til en 200 ml målekolbe, og der fyldes op til mærket med buffer (punkt 3.24).

Hvis en intern standard anvendes, og denne ikke allerede er tilsat, tilsættes der 2,00 ml intern standard (punkt 3.27.3) og fyldes op til mærket med citratbuffer (punkt 3.24). Der blandes omhyggeligt.

Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4.

Hvis prøveopløsningen ikke kromatograferes samme dag, skal den opbevares ved < 5 °C.

5.4.   Kromatografi

Inden kromatografi opvarmes ekstraktet (punkt 5.2) eller hydrolysatet (punkt 5.3.4) til rumtemperatur. Blandingen rystes, og en passende mængde filtreres gennem et 0,22 μm membranfilter (punkt 4.5). Der foretages ionbytningskromatografi af den fremstillede klarede opløsning ved brug af en aminosyreanalysator (punkt 4.9).

Indsprøjtningen kan foretages manuelt eller automatisk. Hovedsagen er, at der altid tilsættes samme mængde opløsning ± 0,5 % til kolonnen til analyse af standardopløsninger og prøveopløsninger, undtagen i tilfælde, hvor der bruges en intern standard. Forholdet mellem natrium og aminosyre i standard- og prøveopløsningerne skal være så ens som muligt.

Kalibreringshyppigheden afhænger normalt af stabiliteten af ninhydrinreagenset og det anvendte analysatorsystem. Standard- eller prøveopløsningen fortyndes med citratbuffer (punkt 3.24), således at der for standarden fremkommer et topareal på 30-200 % af arealet af toppene for aminosyrerne i prøveopløsningen.

Kromatografien af aminosyrerne vil variere lidt afhængigt af den anvendte type analysator og kolonnematerialet. Systemet skal kunne adskille aminosyrerne fuldstændigt fra hinanden og fra øvrige ninhydrinpositive stoffer. Kromatografisystemet skal i sit arbejdsområde give lineært respons på ændringer i mængderne af aminosyrer, der tilsættes kolonnen.

Hvis der analyseres en ækvimolær opløsning (af de aminosyrer, der skal bestemmes), skal der ved kromatografien opnås nedenstående forhold mellem dal og tophøjde. Den ækvimolære opløsning skal indeholde mindst 30 % af den største mængde af hver aminosyre, der kan måles præcist med aminosyreanalysatoren (punkt 4.9).

Ved adskillelsen af threonin og serin må forholdet mellem dal og tophøjde for den laveste af de to sammenhængende aminosyretoppe ikke være større end 2:10. (Hvis der kun bestemmes cyst(e)in, methionin, threonin og lysin, vil utilstrækkelig adskillelse fra nabotoppe indvirke uheldigt på bestemmelsen.) For alle øvrige aminosyrer skal adskillelsen være bedre end 1:10.

Systemet skal sikre, at lysin adskilles fra artefakter fra andre lysinlignende stoffer og ornithin.

6.   Beregning af resultater

Arealet af toppene i prøve- og standardopløsningerne måles for hver enkelt aminosyre, og mængden (X) beregnes i gram aminosyre pr. kg prøve:

Ved anvendelse af en intern standard multipliceres med:

A	=	topareal for hydrolysat eller ekstrakt
B	=	topareal for standardkalibreringsopløsning
C	=	topareal for intern standard i hydrolysat eller ekstrakt
D	=	topareal for intern standard, standardkalibreringsopløsning
M	=	molarvægt af den aminosyre, der skal bestemmes
c	=	standardopløsningens koncentration i μmol/ml
m	=	prøvens vægt i gram (korrigeret til oprindelig vægt hvis tørret eller affedtet)
V	=	ml totalhydrolysat (punkt 5.3.4) eller ml beregnet total fortyndingsvolumen af ekstraktet (punkt 6.1).

Såvel cystin som cystein bestemmes som cysteinsyre i hydrolysater af den oxiderede prøve, men beregnes som cystin (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) ved anvendelse af M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Methionin bestemmes som methioninsulfon i hydrolysater af den oxiderede prøve, men beregnes som methionin ved anvendelse af M af methionin: 149,21 g/mol.

Tilsat fri methionin bestemmes efter ekstraktion som methionin, hvorved der benyttes samme M til beregningen.

6.1.

Totale fortyndingsvolumen af ekstrakter (F) til bestemmelse af frie aminosyrer (punkt 5.2) beregnes som følger: V = slutekstraktets volumen.

7.   Evaluering af metoden

Metoden er blevet afprøvet ved en international ringanalyse i 1990 med anvendelse af fire forskellige typer foder (svinefoderblanding, slagtefjerkræblanding, proteinkoncentrat og en forblanding).

NB!	Metoden er blevet testet i endnu en international ringanalyse i 2003 ved blindbestemmelse med dobbeltprøver af slutfoder til slagtefjerkræ, startfoder til slagtefjerkræ, majs, fiskemel og fjerkræmel. Få flere oplysninger i EN ISO 13903.

Resultaterne af middel- og standardafvigelse efter fjernelse af outliers i ringanalysen fra 1990 er vist i tabellerne under dette punkt:

Middelværdi i g/kg

Reference-materiale	Aminosyre
	Threonin	Cyst(e)in	Methionin	Lysin
Svinefoder-blanding	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Slagtefjerkræ-blanding	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Protein-koncentrat	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Forblanding	58,42 n = 16	—	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n = antal deltagende laboratorier

7.1.   Repeterbarhed

Repeterbarheden for de undersøgte aminosyrer udtrykt som »standardafvigelse inden for laboratorier« for de ovennævnte prøver er gengivet i nedenstående tabel.

Variationskoefficient (%) for repeterbarhed (CVr)

Reference-materiale	Aminosyre
	Threonin	Cyst(e)in	Methionin	Lysin
Svinefoder-Blanding	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Slagtefjerkræ-Blanding	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Protein-koncentrat	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Forblanding	2,2 n = 16	—	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n = antal deltagende laboratorier

7.2.   Reproducerbarhed

Resultaterne af standardafvigelse mellem laboratorier for ovennævnte undersøgelser er vist i nedenstående skema:

Variationskoefficient (%) for reproducerbarhed (CVR)

Reference-materiale	Aminosyre
	Threonin	Cyst(e)in	Methionin	Lysin
Svinefoder-Blanding	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Slagtefjerkræ-Blanding	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Protein-Koncentrat	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Forblanding	4,3 n = 16	—	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n = antal deltagende laboratorier

8.   Anvendelse af referencematerialer

Det undersøges, om metoden er brugt korrekt, ved at foretage gentagne målinger af certificerede referencematerialer, når sådanne forefindes. Det anbefales at kalibrere med certificeret aminosyrekalibreringsopløsning.

9.   Bemærkninger

9.1.

På grund af forskelle mellem aminosyreanalysatorer skal slutkoncentrationerne af kalibreringsopløsningerne af standardaminosyrerne (se punkt 3.27.4 og 3.27.5) og hydrolysatet (se punkt 5.3.4) betragtes som en retningslinje. Apparatets lineære responsskala skal kontrolleres for alle aminosyrer. Standardopløsningen fortyndes med citratbuffer for at opnå toparealer midt på skalaen.

9.2.

Hvis der anvendes HPLC-udstyr til at analysere hydrolysaterne, skal kørselsbetingelserne optimeres i henhold til fabrikantens anbefaling.

9.3.

Hvis metoden anvendes på foderblandinger eller forblandinger, der indeholder mere end 1 % chlorid (koncentrat, mineralfoder, tilskudsfoder), vil der kunne ske en undervurdering af methionin, og der skal foretages en særlig behandling.

10.   Kriterier for ydeevne

Indsamling af resultaterne (bortset fra tyrosin) fra de to ringanalyser (fra 1990 omhandlet i punkt 7 ovenfor og fra 2005 omhandlet i EN/ISO 13903) giver nedenstående kriterier for repeterbarhed og reproducerbarhed. Værdierne, der er udledt af disse to sammenlignende test mellem laboratorier, er måske ikke gældende for andre end de angivne koncentrationsintervaller og matricer.

10.1.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser udført på den samme prøve på det samme laboratorium og af den samme person må ikke overstige:

—	6 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for totale aminosyrer i tilfælde af glycin, alanin, lysin, prolin, glutaminsyre, isoleucin og histidin

—	8 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for totale aminosyrer i tilfælde af threonin, phenylalanin, methionin, asparaginsyre og leucin

—	10 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for totale aminosyrer i tilfælde af arginin og valin

—	12 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for total aminosyre i tilfælde af serin

—	15 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for total aminosyre i tilfælde af cyst(e)in.

10.2.   Reproducerbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser udført på den samme prøve på forskellige laboratorier og/eller af forskellige personer må ikke overstige:

—	15 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for totale aminosyrer i tilfælde af glycin, alanin og threonin

—	20 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for totale aminosyrer i tilfælde af lysin, prolin, phenylanalin, methionin og asparaginsyre

—	22 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for totale aminosyrer i tilfælde af glutaminsyre og leucin

—	27 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for total aminosyre i tilfælde af arginin

—	32 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for total aminosyre i tilfælde af isoleucin

—	35 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for totale aminosyrer i tilfælde af arginin og valin

—	40 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for total aminosyre i tilfælde af histidin

—	50 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for total aminosyre i tilfælde af cyst(e)in.

F.   BESTEMMELSE AF TRYPTOPHAN

Følgende analysemetoder skal anvendes til bestemmelse af tryptophan

—	EN ISO 13904 Foderstoffer — Bestemmelse af tryptofanindhold

—	den analysemetode, der er beskrevet nedenfor i punkt 1-9.

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme det samlede indhold af tryptophan (totaltryptophan) og frit tryptophan i foder. Der differentieres ikke mellem D- og L-former.

2.   Princip

Til bestemmelse af totaltryptophan hydrolyseres prøven i basisk miljø i en mættet bariumhydroxidopløsning og holdes opvarmet til 110 °C i 20 timer. Efter hydrolysen tilsættes der intern standard.

Til bestemmelse af frit tryptophan ekstraheres prøven i svagt sur væske under tilstedeværelse af intern standard.

Tryptophanet og den interne standard i hydrolysatet eller i ekstraktet bestemmes ved HPLC med fluorescensdetektor.

3.   Reagenser

3.1.

Der benyttes dobbeltdestilleret vand eller vand af tilsvarende kvalitet (ledningsevne: < 10 μS/cm)

3.2.

Standardstof: tryptophan (renhedsgrad/indhold≥ 99 %), tørret i vakuum over phosphorpentoxid

3.3.

Internt standardstof: α-methyltryptophan (renhedsgrad/indhold≥ 99 %), tørret i vakuum over phosphorpentoxid

3.4.

Bariumhydroxidoctahydrat (man skal passe på ikke at udsætte Ba(OH)2.8 H2O for meget for luft, da der ellers dannes BaCO3, som kan interferere med bestemmelsen) (se bemærkning punkt 9.3)

3.5.

Natriumhydroxid

3.6.

Orthophosphorsyre, w (w/w) = 85 %

3.7.

Saltsyre, ρ20 = 1,19 g/ml

3.8.

Methanol, svarende til HPLC-kvalitet

3.9.

Petroleumsether, kogepunktsinterval: 40–60 °C

3.10.

Natriumhydroxidopløsning, c = 1 mol/liter: 40,0 g NaOH (punkt 3.5) opløses i vand, og der fyldes op med vand (punkt 3.1) til 1 liter

3.11.

Saltsyre, c = 6 mol/liter: 492 ml saltsyre (punkt 3.7) fortyndes til 1 liter med vand

3.12.

Saltsyre, c = 1 mol/liter: 82 ml saltsyre (punkt 3.7) fortyndes til 1 liter med vand

3.13.

Saltsyre, c = 0,1 mol/liter: 8,2 ml saltsyre (punkt 3.7) fortyndes til 1 liter med vand

3.14.

Orthophosphorsyre, c = 0,5 mol/liter: 34 ml orthophosphorsyre (punkt 3.6) fortyndes til 1 liter med vand (punkt 3.1)

3.15.

Koncentreret opløsning af tryptophan (punkt 3.2), c = 2,50 μmol/ml: I en 500 ml målekolbe opløses 0,2553 g tryptophan (punkt 3.2) i saltsyre (punkt 3.13), og der fyldes op til mærket med saltsyre (punkt 3.13). Opløsningen opbevares ved – 18 °C i højst fire uger.

3.16.

Koncentreret opløsning af intern standard, c = 2,5 μmol/ml: I en 500 ml målekolbe opløses 0,2728 g α-methyltryptophan (punkt 3.3) i saltsyre (punkt 3.13), og der fyldes op til mærket med saltsyre (punkt 3.13). Opløsningen opbevares ved – 18 °C i højst fire uger.

3.17.

Standardkalibreringsopløsning af tryptophan og intern standard: 2,00 ml koncentreret opløsning af tryptophan (punkt 3.15) og 2,00 ml koncentreret opløsning af intern standard (α-methyltryptophan) (punkt 3.16) fortyndes med vand (punkt 3.1) og methanol (punkt 3.8) til omtrent samme volumen og omtrent samme methanolkoncentration (10-30 %) som det færdige hydrolysat. Opløsningen skal fremstilles umiddelbart før brugen. Der sørges for beskyttelse mod direkte sollys under fremstillingen.

3.18.

Eddikesyre

3.19.

1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol

3.20.

Ethanolamin, w (w/w) > 98 %

3.21.

Opløsning af 1 g 1,1,1-trichlor-2-methyl-2-propanol (punkt 3.19) i 100 ml methanol (punkt 3.8)

3.22.

Mobil fase til HPLC: 3,00 g eddikesyre (3.18) + 900 ml vand (3.1) + 50,0 ml af opløsningen (punkt 3.21) af 1,1,1-trichlor- 2-methyl-2-propanol (punkt 3.19) i methanol (punkt 3.8) (1 g pr. 100 ml). pH justeres til 5,00 med ethanolamin (punkt 3.20). Der fyldes op med vand (punkt 3.1) til 1 000 ml.

4.   Apparatur

4.1.

HPLC-udstyr med spektrofluorometrisk detektor

4.2.

HPLC-kolonne, 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm pakkemateriale, eller tilsvarende

4.3.

pH-meter

4.4.

Polypropylenflaske, 125 ml, med vid hals og skruelåg

4.5.

Membranfilter, 0,45 μm

4.6.

Autoklav, 110 (± 2) °C, 1.4 (± 0.1) bar

4.7.

Mekanisk rysteapparat eller magnetomrører

4.8.

Vortex-blander

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Klargøring af prøver

Prøven formales, så den kan passere gennem en 0,5 mm sigte. Meget fugtige prøver skal inden formalingen enten lufttørres ved højst 50 °C eller frysetørres. Prøver med et højt fedtindhold ekstraheres med petroleumsether (punkt 3.9) inden formaling.

5.2.   Bestemmelse af frit tryptophan (ekstrakt)

En passende mængde (1–5 g) af den klargjorte prøve (punkt 5.1) afvejes med en nøjagtighed på 1 mg i en konisk kolbe. Der tilsættes 100,0 ml saltsyre (punkt 3.13) og 5,00 ml koncentreret opløsning af intern standard (punkt 3.16). Der omrystes eller blandes i 60 minutter på mekanisk rysteapparat eller magnetomrører (punkt 4.7). Efter henstand og bundfældning afpipetteres 10,0 ml af supernatanten i et bægerglas. Der tilsættes 5 ml orthophosphorsyre (punkt 3.14). pH justeres til 3 med natriumhydroxid (punkt 3.10). Der tilsættes så meget methanol (punkt 3.8), at slutkoncentrationen af methanol bliver 10–30 %. Opløsningen overføres til en målekolbe af passende størrelse og fortyndes med vand til et volumen, der passer til kromatografien (ca. samme volumen som standardkalibreringsopløsningen (punkt 3.17)).

Nogle få ml af opløsningen filtreres gennem et 0,45 μm membranfilter (punkt 4.5), inden den indsprøjtes på HPLC-kolonnen. Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4.

Standardopløsninger og ekstrakter beskyttes mod direkte sollys. Hvis ekstrakterne ikke kan analyseres samme dag, kan de opbevares ved 5 °C i højst tre dage.

5.3.   Bestemmelse af totaltryptophan (hydrolysat)

Med en nøjagtighed på 0,2 mg afvejes 0,1–1 g af den klargjorte prøve (punkt 5.1) i polypropylenflasken (punkt 4.4). Den afvejede prøveportion skal have et kvælstofindhold på ca. 10 mg. Der tilsættes 8,4 g bariumhydroxidoctahydrat (punkt 3.4) og 10 ml vand. Der blandes på vortex-blander (punkt 4.8) eller magnetomrører (punkt 4.7). Den teflonbelagte magnetpind efterlades i blandingen. Flaskens vægge skylles med 4 ml vand. Skruelåget skrues løst på flasken, der sættes ind i autoklaven (punkt 4.6) med kogende vand og damper i 30–60 minutter. Autoklaven lukkes, og der autoklaveres ved 110 (± 2) °C i 20 timer.

Temperaturen i autoklaven sænkes til lige under 100 °C, inden den åbnes. For at undgå udkrystallisering af Ba(OH)2.8 H2O tilsættes der til den varme blanding 30 ml stuevarmt vand. Der omrystes eller omrøres forsigtigt og tilsættes 2,00 ml koncentreret intern standardopløsning (α-methyltryptophan) (punkt 3.16). Flasken afkøles i vand/isbad i 15 minutter.

Derefter tilsættes 5 ml orthophosphorsyre (punkt 3.14). Medens flasken stadig står i kølebadet, neutraliseres der med saltsyre (3.11) under omrøring, og pH justeres til 3,0 med saltsyre (punkt 3.12). Der tilsættes så meget methanol, at slutkoncentrationen af methanol bliver 10–30 %. Opløsningen overføres til en målekolbe af passende størrelse og fortyndes med vand til et volumen, der passer til kromatografien (f.eks. 100 ml). Der må ikke ske udfældning under methanoltilsætningen.

Nogle få ml af opløsningen filtreres gennem et 0,45 μm membranfilter (punkt 4.5), inden den indsprøjtes på HPLC-kolonnen. Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4.

Standardopløsninger og hydrolysater beskyttes mod direkte sollys. Hvis hydrolysaterne ikke kan analyseres samme dag, kan de opbevares ved 5 °C i højst tre dage.

5.4.   HPLC-bestemmelse

Nedenstående betingelser for isokratisk eluering er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater (se også bemærkning punkt 9.1 og 9.2).

HPLC-kolonne (punkt 4.2):	125 mm × 4 mm, C18, 3 μm pakkemateriale eller tilsvarende
Kolonnetemperatur:	Rumtemperatur
Mobil fase (punkt 3.22):	3,00 g eddikesyre (punkt 3.18) + 900 ml vand (punkt 3.1) + 50,0 ml af opløsningen (punkt 3.21) af 1,1,1-trichlor- 2-methyl-2-propanol (punkt 3.19) i methanol (punkt 3.8) (1 g pr. 100 ml). pH justeres til 5,00 medethanolamin (punkt 3.20). Der fyldes op med vand (punkt 3.1) til 1 000 ml
Flow:	1 ml/minuttet
Total gennemløbstid:	ca. 34 minutter
Detektionsbølgelængde:	excitation: 280 nm, emission: 356 nm
Injektionsvolumen:	20 μl

6.   Beregning af resultater

Mængden af tryptophan (X) beregnes i gram pr. 100 g prøve:

A	=	topareal for intern standard, standardkalibreringsopløsning (punkt 3.17)
B	=	topareal for tryptophan, ekstrakt (punkt 5.2) eller hydrolysat (punkt 5.3)
V1	=	volumen i ml (2 ml) af den mængde koncentreret tryptophanopløsning (punkt 3.15), der er tilsat til kalibreringsopløsningen (punkt 3.17)
c	=	koncentration i μmol/ml (= 2,50) af den koncentrerede tryptophanopløsning (punkt 3.15), der er tilsat til kalibreringsopløsningen (punkt 3.17)
V2	=	volumen i ml af den mængde koncentreret opløsning af intern standard (punkt 3.16), der er tilsat til ekstraktet (punkt 5.2) (= 5,00 ml) eller til hydrolysatet (punkt 5.3) (= 2,00 ml)
C	=	topareal for intern standard, ekstrakt (punkt 5.2) eller hydrolysat (punkt 5.3)
D	=	topareal for tryptophan, standardkalibreringsopløsning (punkt 3.17)
V3	=	volumen i ml (= 2,00 ml) af den mængde koncentreret opløsning af intern standard (punkt 3.16), der er tilsat til standardkalibreringsopløsningen (punkt 3.17)
m	=	prøvens vægt i gram (korrigeret til oprindelig vægt, hvis den er tørret og/eller affedtet)
M	=	tryptophans molarvægt (= 204,23 g/mol).

7.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 10 % i relativ værdi (af det højeste resultat).

8.   Resultater af ringanalyse

Der er gennemført en EU-ringanalyse (fjerde ringanalyse), hvor tre prøver blev analyseret i op til 12 laboratorier med henblik på certificering af hydrolysemetoden. Der blev foretaget femdobbelt bestemmelse på hver prøve. Resultaterne er vist i nedenstående tabel:

	Prøve 1 Svinefoder	Prøve 2 Svinefoder suppleret med L-tryptophan	Prøve 3 Foderkoncentrat til svin
L	12	12	12
n Middelværdi [g/kg]	50 2,42	55 3,40	50 4,22
sr [g/kg]	0,05	0,05	0,08
r [g/kg]	0,14	0,14	0,22
CVr [%]	1,9	1,6	1,9
SR [g/kg]	0,15	0,20	0,09
R [g/kg]	0,42	0,56	0,25
CVR [%]	6,3	6,0	2,2
L = antal laboratorier, der har indleveret resultater n = antal enkeltværdier efter fjernelse af outliers (Cochran-Dixon outlier-test) sr = standardafvigelse for repeterbarhed SR = standardafvigelse for reproducerbarhed r = repeterbarhed R = reproducerbarhed CVr = variationskoefficient for repeterbarhed, % CVR = variationskoefficient for reproducerbarhed, %.

Der er også gennemført en EU-ringanalyse (tredje ringanalyse), hvor to prøver blev analyseret i op til 13 laboratorier med henblik på certificering af metoden til ekstraktion af frit tryptophan. Der blev foretaget femdobbelt bestemmelse på hver prøve. Resultaterne er vist i nedenstående tabel:

	Prøve 4 Blanding af soja og hvede	Prøve 5 Blanding af soja og hvede (= prøve 4) med tilsætning af tryptophan (0,457 g/kg)
L n	12 55	12 60
Middelværdi [g/kg]	0,391	0,931
sr [g/kg]	0,005	0,012
r [g/kg]	0,014	0,034
CVr [%]	1,34	1,34
SR [g/kg]	0,018	0,048
R [g/kg]	0,050	0,134
CVR [%]	4,71	5,11
L = antal laboratorier, der har indleveret resultater n = antal enkeltværdier efter fjernelse af outliers (Cochran-Dixon outlier-test) sr = standardafvigelse for repeterbarhed SR = standardafvigelse for reproducerbarhed r = repeterbarhed R = reproducerbarhed CVr = variationskoefficient for repeterbarhed, % CVR = variationskoefficient for reproducerbarhed, %.

Der er gennemført endnu en EU-ringanalyse, hvor fire prøver blev analyseret i op til syv laboratorier med henblik på certificering af tryptophan med hensyn til hydrolyse. Resultaterne er vist herunder. Der blev foretaget femdobbelt bestemmelse på hver prøve.

	Prøve 1 Svinefoderblanding (CRM 117)	Prøve 2 Fiskemel med lavt fedtindhold (CRM 118)	Prøve 3 Sojamel (CRM 119)	Prøve 4 Skummetmælkspulver (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Middelværdi [g/kg]	2,064	8,801	6,882	5,236
sr [g/kg]	0,021	0,101	0,089	0,040
r [g/kg]	0,059	0,283	0,249	0,112
CVr [%]	1,04	1,15	1,30	0,76
SR [g/kg]	0,031	0,413	0,283	0,221
R [g/kg]	0,087	1,156	0,792	0,619
CVR [%]	1,48	4,69	4,11	4,22
L = antal laboratorier, der har indleveret resultater n = antal enkeltværdier efter fjernelse af outliers (Cochran-Dixon outlier-test) sr = standardafvigelse for repeterbarhed SR = standardafvigelse for reproducerbarhed r = repeterbarhed R = reproducerbarhed CVr = variationskoefficient for repeterbarhed, % CVR = variationskoefficient for reproducerbarhed, %.

9.   Bemærkninger

9.1.

Nedenstående særlige kromatograferingsbetingelser kan give bedre adskillelse af tryptophan og α-methyltryptophan. Isokratisk eluering efterfulgt af gradientrensning af kolonnen som følger: HPLC-kolonne: 125 mm × 4 mm, C18, 5 μm pakkemateriale, eller tilsvarende Kolonnetemperatur: 32 °C Mobil fase: A: 0,01 mol/liter KH2PO4/methanol, 95 + 5 (v + v) B: Methanol Gradientprogram: 0 minutter 100 % A 0 % B 15 minutter 100 % A 0 % B 17 minutter 60 % A 40 % B 19 minutter 60 % A 40 % B 21 minutter 100 % A 0 % B 33 minutter 100 % A 0 % B Flow: 1,2 ml/minuttet Total gennemløbstid: ca. 33 minutter

9.2.

Kromatograferingen varierer, alt efter hvilken type HPLC og kolonnemateriale der benyttes. Der skal vælges et system, der giver adskillelse til basislinjen mellem tryptophan og den interne standard. Det er desuden vigtigt, at nedbrydningsprodukter adskilles helt fra tryptophan og den interne standard. Der køres hydrolysater uden intern standard for at kontrollere, at der ikke ligger urenheder på basislinjen under den interne standard. Det er vigtigt, at gennemløbstiden er lang nok til, at alle nedbrydningsprodukter elueres, da toppe med lang elueringstid ellers kan interferere i efterfølgende kromatograferinger. Kromatografisystemet skal i sit arbejdsområde give lineært respons. Det lineære respons kontrolleres med konstant (dvs. den normale) koncentration af intern standard og varierende koncentrationer af tryptophan. Det er vigtigt, at både toppen for tryptophan og toppen for intern standard ligger inden for HPLC/fluorescenssystemets lineære område. Hvis enten tryptophantoppen og/eller toppen for intern standard er for lav eller for høj, gentages analysen med en anden prøvestørrelse og/eller et andet slutvolumen.

9.3.   Bariumhydroxid

Bariumhydroxid bliver med tiden vanskeligere at opløse. Det medfører, at opløsningen til HPLC-bestemmelse bliver uklar, hvilket kan betyde, at resultaterne for tryptophan bliver for lave.

G.   BESTEMMELSE AF RÅFEDT

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode anvendes til bestemmelse af råfedtindholdet i foder.

Anvendelsen af de to fremgangsmåder, der er beskrevet nedenfor, afhænger af arten og sammensætningen af foderet og af grunden til, at analysen gennemføres.

Til bestemmelse af råfedtindholdet i olieholdige frø og frugter samt i foder, hvor råfedtindholdet er over 15 %, skal ekstraktionen foretages ved metode A og reekstraktion ved metode B (punkt 5.3)

1.1.   Metode A — Råfedt, som kan ekstraheres direkte

Denne metode anvendes til vegetabilske fodermidler med undtagelse af dem, der er medtaget under metode B.

1.2.   Metode B — Råfedt i alt

Denne metode anvendes til animalske fodermidler samt til alle foderblandinger. Den skal anvendes til alle materialer, hvorfra råfedt ikke kan ekstraheres fuldstændigt uden forudgående hydrolyse, såsom gluten, gær, kartoffelproteiner og produkter, der underkastes processer som ekstrudering, omdannelse til flager og opvarmning.

1.3.   Fortolkning af resultater

I samtlige tilfælde, hvor der opnås et højere resultat ved anvendelse af metode B end ved metode A, skal de resultater, der er opnået ved metode B, accepteres som den sande værdi.

2.   Princip

2.1.   Metode A

Prøven ekstraheres med petroleumsether. Opløsningsmidlet afdampes, og remanensen tørres og vejes.

2.2.   Metode B

Prøven behandles med saltsyre under opvarmning. Blandingen afkøles og filtreres. Den vaskede og tørrede remanens behandles herefter som beskrevet under metode A.

3.   Reagenser

3.1.

Petroleumsether, kogepunktsinterval: 40–60 °C. Bromtallet skal være under 1, og inddampningsresten under 2 mg/100 ml.

3.2.

Natriumsulfat, vandfrit.

3.3.

Saltsyre, c = 3 mol/liter:

3.4.

Filtreringsmiddel, f.eks. kiselgur, Hyflo-supercel.

4.   Apparatur

4.1.

Ekstraktionsapparat. Dersom apparatet er udstyret med et hævertrør (Soxhlet-apparat), indstilles varmekilden, så der sker ca. 10 tømninger i timen; dersom apparatet ikke er udstyret med hævertrør, skal tilbageløbet være på ca. 10 ml i minuttet.

4.2.

Ekstraktionshætter skal være fri for stof, der er opløseligt i petroleumsether, og skal have en porøsitet i overensstemmelse med kravene under 4.1.

4.3.

Tørreskab, enten et vakuumtørreskab indstillet til 75 °C ± 3 °C eller et tørreskab med luftcirkulation indstillet til 100 °C ± 3 °C.

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Metode A (se punkt 8.1)

5 g af prøven afvejes med en nøjagtighed på 1 mg, overføres til en ekstraktionshætte (punkt 4.2) og tildækkes med en affedtet vatprop.

Hætten anbringes i et ekstraktionsapparat (punkt 4.1), og der ekstraheres i seks timer med petroleumsether (punkt 3.1). Petroleumsetherekstraktet opsamles i en tør, tareret kolbe indeholdende stykker af pimpsten (6).

Opløsningsmidlet afdampes. Remanensen tørres derpå i kolben i 1 ½ time i tørreskab (punkt 4.3). Efter afkøling i ekssikkator vejes remanensen. Der tørres i yderligere 30 minutter for at sikre, at fedtets vægt forbliver konstant (vægttabet mellem to på hinanden følgende vejninger må højst være på 1 mg).

5.2.   Metode B

2,5 g af prøven afvejes med en nøjagtighed på 1 mg (se punkt 8.2) og overføres til et 400 ml bægerglas eller en 300 ml konisk kolbe, hvorefter der tilsættes 100 ml saltsyre (punkt 3.3) og stykker af pimpsten. Bægerglasset tildækkes med et urglas, eller hvis der anvendes en konisk kolbe, forsynes denne med en tilbagesvaler. Blandingen bringes til let kogning over en svag flamme eller på varmeplade i ca. en time. Materialet skal forhindres i at sætte sig fast på beholderens sider.

Beholderen afkøles, og der tilsættes så meget filtreringsmiddel (punkt 3.4), at der ikke opstår noget fedttab ved filtreringen. Der filtreres gennem et fugtigt, fedtfrit dobbelt filtrerpapir. Remanensen vaskes med koldt vand, indtil filtratet er neutralt. Det kontrolleres, at filtratet ikke indeholder fedt. Tilstedeværelse af fedt viser, at der inden hydrolysen skal foretages en ekstraktion af prøven med petroleumsether ved anvendelse af metode A.

Det dobbelte filtrerpapir med remanensen lægges på et urglas og tørres i tørreskab (punkt 4.3) ved 100 °C ± 3 °C i 1 ½ time.

Det dobbelte filtrerpapir med den tørre remanens anbringes i ekstraktionshætte (punkt 4.2) og tildækkes med en affedtet vatprop. Hætten anbringes i et ekstraktionsapparat (punkt 4.1), hvorefter der fortsættes som beskrevet i punkt 5.1, andet og tredje afsnit.

5.3.   Metode A og reekstraktion ved metode B

Til bestemmelse af råfedtindholdet i olieholdige frø og frugter samt i foder, hvor råfedtindholdet er over 15 %, skal ekstraktionen foretages ved metode A og reekstraktion ved metode B.

Det betyder, at efter ekstraktion med petroleumsether (metode A), reekstraheres remanensen eller en portion af remanensen med saltsyre (metode B). Råfedtindholdet er summen af resultatet af metode A og B.

6.   Angivelse af resultater

Remanensens vægt angives i procent af prøven.

7.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført af den samme person på den samme prøve må ikke overstige:

—	0,2 % i absolut værdi for råfedtindhold på under 5 %

—	4,0 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for indhold på 5–10 %

—	0,4 % i absolut værdi for indhold på over 10 %.

8.   Bemærkninger

8.1.

For produkter med højt fedtindhold, som er vanskelige at formale, eller som ikke egner sig til udtagning af en reduceret homogen prøve, anvendes følgende fremgangsmåde: 20 g af prøven afvejes med en nøjagtighed på 1 mg og blandes med mindst 10 g vandfrit natriumsulfat (3.2). Derpå ekstraheres med petroleumsether (3.1) som angivet under punkt 5.1. Det herved opsamlede ekstrakt tilsættes petroleumsether (3.1) ad 500 ml, og blandingen rystes. Af opløsningen udtages 50 ml, som hældes i en lille, tør, tareret kolbe indeholdende stykker af pimpsten. Opløsningsmidlet afdampes; derpå tørres og fortsættes som beskrevet i punkt 5.1, sidste afsnit. Ekstraktionsresten i hætten befries for opløsningsmidlet og formales til en kornstørrelse på 1 mm, hvorefter den hældes tilbage i ekstraktionshætten (der tilsættes ikke natriumsulfat); derpå fortsættes som beskrevet i punkt 5.1, andet og tredje afsnit. Fedtindholdet beregnes som en procentdel af prøven ved anvendelse af nedenstående formel: hvor: m1 = vægt i gram af remanensen efter den første ekstraktion (den alikvote del af ekstraktet) m2 = vægt i gram af remanensen efter den anden ekstraktion.

8.2.

For nogle produkter (f.eks. med lavt fedtindhold) kan prøven gøres større.

8.3.

Foder med højt vandindhold til selskabsdyr vil det kunne være nødvendigt at blande med vandfrit natriumsulfat forud for hydrolyse og ekstraktion som ved metode B.

8.4.

I punkt 5.2 vil det kunne være mere effektivt at anvende varmt vand i stedet for koldt vand til vaskning af remanensen efter filtrering.

8.5.

Det kan for visse typer foder være nødvendigt at forlænge tørringstiden på 1 ½ time. Overdreven tørring undgås, da en sådan kan føre til lave resultater. En mikrobølgeovn kan også anvendes.

H.   BESTEMMELSE AF TRÆSTOF

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af fedtfri organiske stoffer i foder, som er uopløselige i fortyndede syre- og baseopløsninger, og som normalt betegnes som træstof.

Metoden er ikke relevant for træcellulose og vegetabilsk kul (partiklerne er for fine).

2.   Princip

Prøven, der om nødvendigt er affedtet, behandles i kogende opløsninger af først svovlsyre og derefter kaliumhydroxid i bestemte koncentrationer. Remanensen adskilles ved filtrering i en glasfilterdigel, hvorefter det vaskes, tørres, vejes og foraskes ved 475–500 °C. Vægttabet ved foraskningen svarer til træstofindholdet i prøven.

3.   Reagenser

3.1.

Svovlsyre, c = 0,13 mol/liter

3.2.

Skumdæmpende middel (f.eks. n-octanol)

3.3.

Filtreringshjælpemiddel (Celite 545 el. lign.) opvarmet til 500 °C i fire timer (punkt 8.6)

3.4.

Acetone

3.5.

Petroleumsether, kogepunktsinterval: 40–60 °C

3.6.

Saltsyre, c = 0,5 mol/liter

3.7.

Kaliumhydroxidopløsning, c = 0,23 mol/liter

4.   Apparatur

4.1.

Varmeenhed til kogning med svovlsyre og kaliumhydroxid med holder til filterdiglen (punkt 4.2) og afgangsrør med hane til væskeafløb samt vakuumpumpe, eventuelt med trykluft. Enheden forvarmes før daglig brug med kogende vand i fem minutter.

4.2.

Glasfilterdigel med filterplade af sintret glas, porestørrelse: 40–90 μm. Inden den første gang tages i anvendelse, opvarmes den i nogle få minutter til 500 °C og afkøles (punkt 8.6).

4.3.

Kogecylinder på mindst 270 ml med tilbagesvaler

4.4.

Tørreskab med termostat

4.5.

Muffelovn med termostat

4.6.

Ekstraktionsapparat med holder til filterdiglen (punkt 4.2) og afgangsrør med hane til væskeafløb samt vakuumpumpe.

4.7.

Forbindelsesringe til samling af varmeenhed (punkt 4.1), filterdigel (punkt 4.2) og kogecylinder (punkt 4.3) og til samling af koldekstraktionsapparat (4.6) og filterdigel.

5.   Fremgangsmåde

I glasfilterdiglen (punkt 4.2) afvejes med 1 mg nøjagtighed 1 g af den klargjorte prøve (se bemærkning punkt 9.1, 9.2 og 9.3), og der tilsættes 1 g filtreringshjælpemiddel (punkt 3.3).

Varmeenheden (punkt 4.1) og filterdiglen (punkt 4.2) samles. Kogecylinderen (punkt 4.3) forbindes til diglen. 150 ml svovlsyre (punkt 3.1), der er opvarmet til kogepunktet, overføres til kogecylinderen, og om nødvendigt tilsættes nogle få dråber skumdæmpende middel (punkt 3.2).

Væsken opvarmes til kogepunktet i løbet af 5 ± 2 minutter og koges livligt i nøjagtig 30 minutter.

Afgangshanen (punkt 4.1) åbnes, og svovlsyren filtreres under vakuum gennem filterdiglen. Remanensen på filterdiglen vaskes under vakuum tre gange med 30 ml kogende vand hver gang. Filtret med remanensen suges tørt efter hver vask.

Afgangshanen lukkes, og 150 ml kogende kaliumhydroxidopløsning (punkt 3.7) overføres til kogecylinderen. Der tilsættes nogle få dråber skumdæmpende middel (punkt 3.2). Væsken opvarmes til kogepunktet i løbet af 5 ± 2 minutter og koges livligt i nøjagtig 30 minutter. Remanensen filtreres og vaskes på samme måde som efter behandling med svovlsyre.

Efter den sidste vask suges bundfaldet tørt, og diglen med indhold forbindes til koldekstraktionsapparatet (punkt 4.6). Remanensen i diglen vaskes under vakuum tre gange med 25 ml acetone (punkt 3.4) hver gang og suges tørt efter hver vask.

Filterdiglen med indhold tørres i tørreskabet ved 130 °C indtil konstant vægt. Efter hver tørring afkøles diglen i en ekssikkator og vejes straks. Herefter anbringes den i muffelovnen, og indholdet foraskes ved 475–500 °C i mindst 30 minutter. Dette gentages indtil konstant vægt (vægttabet mellem to på hinanden følgende vejninger må højst være på 2 mg).

Efter hver foraskning afkøles diglen først i ovnen og derefter i ekssikkatoren, inden den vejes.

Der foretages en blindprøve uden prøve. Vægttabet ved foraskningen må ikke overstige 4 mg.

6.   Beregning af resultater

Træstofindholdet som procent af prøven beregnes efter følgende formel:

hvor:

m	=	prøvens vægt i gram
m0	=	vægttabet i gram efter foraskning under bestemmelsen
m1	=	vægttabet i gram ved foraskning af remanensen af blindprøven.

7.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige:

—	0,6 % i absolut værdi for træstofindhold på under 10 %

—	6 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for træstofindhold på 10 % og derover.

8.   Reproducerbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser udført på samme prøve på forskellige laboratorier må ikke overstige:

—	1,0 % i absolut værdi for træstofindhold på under 10 %

—	10 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for træstofindhold på 10 % og derover.

9.   Bemærkninger

9.1.

Foder, der indeholder over 10 % råfedt, skal affedtes med petroleumsether (punkt 3.5) inden analysen. Filterdiglen (punkt 4.2) med indhold forbindes med koldekstraktionsapparatet (punkt 4.6) og vaskes under vakuum tre gange med 30 ml petroleumsether hver gang. Prøven suges tør, og diglen med indhold forbindes til varmeenheden (punkt 4.1). Derefter fortsættes som beskrevet i punkt 5.

9.2.

Foder, der indeholder fedt, som ikke kan ekstraheres direkte med petroleumsether (punkt 3.5), skal affedtes som beskrevet i punkt 8.1 og efter kogning med syre affedtes endnu en gang. Efter kogning med syre og efterfølgende vask forbindes diglen med indhold til koldekstraktionsapparatet (punkt 4.6) og vaskes tre gange med 30 ml acetone efterfulgt af tre gange vask med 30 ml petroleumsether. Filtret suges tørt, og analysen fortsættes som beskrevet i punkt 5 med behandlingen med kaliumhydroxid.

9.3.

Hvis foderet indeholder over 5 % carbonater, udtrykt som calciumcarbonat, forbindes diglen (punkt 4.2) med den afvejede prøve til varmeenheden (punkt 4.1). Prøven vaskes tre gange med 30 ml saltsyre (punkt 3.6). Efter hver tilsætning skal prøven henstå i ca. et minut, inden den filtreres. Der vaskes én gang med 30 ml vand, hvorefter der fortsættes som beskrevet i punkt 5.

9.4.

Hvis der anvendes apparatur i form af et stativ (flere digler forbundet med samme varmeenhed), må der aldrig foretages to enkeltbestemmelser af samme analyseprøve i samme prøverække.

9.5.

Hvis det efter kogning viser sig vanskeligt at filtrere syre- og baseopløsningerne, føres der trykluft gennem varmeenhedens afgangsrør, hvorefter filtreringen fortsættes.

9.6.

Udglødningstemperaturen må ikke være over 500 °C, hvilket skal sikre, at diglerne af sintret glas holder længst muligt. Der drages omsorg for at undgå store temperaturudsving under opvarmning og afkøling.

I.   BESTEMMELSE AF SUKKER

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af reducerende sukker og totalsukker efter invertering, udtrykt som glucose eller, ved omregning med faktoren 0,95, som saccharose. Metoden finder anvendelse på foderblandinger. Der er fastsat særlige metoder for andre typer foder. Om nødvendigt bestemmes lactosen særskilt, idet der tages hensyn hertil ved beregningen af resultaterne.

Denne metode skal anvendes til bestemmelse af sukkerindhold til brug til beregning af foderets energiindhold.

Hvis sukkerindholdet skal bestemmes til andre formål, kan der benyttes andre analysemetoder.

2.   Princip

Sukkeret opløses i fortyndet ethanol; opløsningen klares ved hjælp af Carrez-reagens I og II. Efter afdampning af ethanol foretages bestemmelserne før og efter inverteringen efter Luff-Schoorl-metoden.

3.   Reagenser

3.1.

Ethanol, 40 % opløsning (v/v), massefylde: 0,948 g/ml ved 20 °C, neutraliseret til phenolphthalein

3.2.

Carrez-reagens I: 21,9 g zinkacetat, Zn(CH3COO)2 2H2O, og 3 g iseddike opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.

3.3.

Carrez-reagens II: 10,6 g kaliumferrocyanid, K4 Fe (CN)6 3H2O, opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.

3.4.

Methylorange, 0,1 % opløsning (w/v)

3.5.

Saltsyre, 4 mol/liter

3.6.

Saltsyre, 0,1 mol/liter

3.7.

Natriumhydroxidopløsning, 0,1 mol/liter

3.8.

Luff-Schoorl-reagens: Under forsigtig omrøring hældes citronsyreopløsningen (punkt 3.8.2) over i natriumcarbonatopløsningen (punkt 3.8.3). Kobbersulfatopløsningen (punkt 3.8.1) tilsættes, og der fyldes op med vand til 1 liter. Det henstår natten over og filtreres. Koncentrationen af det således opnåede reagens kontrolleres (Cu 0,05 mol/liter; Na2 CO3 1 mol/liter), se punkt 5.4, sidste afsnit. Opløsningens pH-værdi skal være ca. 9,4.

3.8.1.

Kobbersulfatopløsning: 25 g kobbersulfat, Cu SO4 5H2O, frit for jern, opløses i 100 ml vand.

3.8.2.

Citronsyreopløsning: 50 g citronsyre, C6H8O7•H2O, opløses i 50 ml vand.

3.8.3.

Natriumcarbonatopløsning: 143,8 g vandfrit natriumcarbonat opløses i ca. 300 ml varmt vand. Opløsningen henstilles til afkøling.

3.9.

Natriumthiosulfatopløsning, 0,1 mol/liter

3.10.

Stivelsesopløsning: 5 g opløselig stivelse tilsættes 30 ml vand og opblandes i 1 liter kogende vand. Der koges i tre minutter, henstilles til afkøling og tilsættes eventuelt 10 mg kviksølviodid som konserveringsmiddel.

3.11.

Svovlsyre, 3 mol/liter

3.12.

Kaliumiodid, 30 % opløsning (w/v)

3.13.

Granuleret pimpsten udkogt i saltsyre, vasket med vand og tørret

3.14.

3-methylbutan-1-ol.

4.   Apparatur

Mekanisk rysteapparat: ca. 35–40 omdrejninger i minuttet.

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Ekstraktion af prøven

2,5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og hældes i en 250 ml målekolbe. Der tilsættes 200 ml ethanol (punkt 3.1) og blandes i en time i rysteapparatet. Der tilsættes 5 ml Carrez-reagens I (punkt 3.2) og omrøres i ca. 30 sekunder. Derefter tilsættes 5 ml Carrez-reagens II (punkt 3.3) og omrøres på ny i et minut. Der fyldes op til mærket med ethanol (punkt 3.1), hvorefter der homogeniseres og filtreres. 200 ml af filtratet udtages og inddampes til ca. halvdelen af volumenet, hvorved størstedelen af ethanolen fordamper. Fordampningsresten overføres kvantitativt ved hjælp af varmt vand til en 200 ml målekolbe og afkøles, der fyldes op til mærket med vand og homogeniseres, og om nødvendigt filtreres. Denne opløsning benyttes til bestemmelse af reducerende sukker samt, efter invertering, af totalsukker.

5.2.   Bestemmelse af reducerende sukker

Med pipette udtages højst 25 ml af opløsningen indeholdende under 60 mg reducerende sukker, udtrykt som glucose. Om nødvendigt fyldes op med destilleret vand til 25 ml, og indholdet af reducerende sukker bestemmes efter Luff-Schoorl-metoden. Resultatet angives i procent glucose.

5.3.   Bestemmelse af totalsukker efter invertering

Med pipette udtages 50 ml opløsning, som overføres til en 100 ml målekolbe. Der tilsættes nogle få dråber methylorangeopløsning (punkt 3.4) og derefter, forsigtigt og under stadig omrøring, saltsyre (punkt 3.5), indtil der sker et tydeligt omslag til rødt. Der tilsættes 15 ml saltsyre (punkt 3.6), og kolben anbringes på vandbad i stærk kogning og efterlades der i 30 minutter. Der afkøles hurtigt til ca. 20 °C og tilsættes 15 ml natriumhydroxidopløsning (punkt 3.7). Der fyldes op med vand til 100 ml og homogeniseres. Der udtages en mængde, der ikke overstiger 25 ml, og som indeholder mindre end 60 mg reducerende sukker, udtrykt som glucose. Om nødvendigt fyldes op med destilleret vand til 25 ml, og indholdet af reducerende sukker bestemmes efter Luff-Schoorl-metoden. Resultatet angives i procent glucose eller, ved multiplikation med faktoren 0,95, saccharose.

5.4.   Titrering efter Luff-Schoorl-metoden

Med pipette udtages 25 ml af Luff-Schoorl-reagenset (punkt 3.8), som overføres til en 300 ml erlenmeyerkolbe; der tilsættes nøjagtig 25 ml af den klarede sukkeropløsning. Der tilsættes 2 korn pimpsten (punkt 3.13) og opvarmes under omrystning med hånden over en fri flamme af middelhøjde, og væsken bringes i kog på ca. to minutter. Erlenmeyerkolben anbringes umiddelbart derefter på en metaltrådsdug, som er forsynet med et asbesttrådnet med et hul på ca. 6 cm i diameter, hvorunder man i forvejen har tændt en flamme. Denne skal være afpasset således, at alene erlenmeyerkolbens bund opvarmes. Kolben forbindes med en tilbagesvaler. Væsken koges i nøjagtig 10 minutter Derpå afkøles der straks ved hjælp af koldt vand, og efter ca. fem minutters forløb titreres der som følger:

Der tilsættes 10 ml kaliumiodidopløsning (punkt 3.12) og straks derefter (forsigtigt på grund af risikoen for dannelse af skum i stor mængde) 25 ml svovlsyre (punkt 3.11). Der titreres så med natriumthiosulfatopløsning (punkt 3.9), indtil der viser sig en matgul farve, hvorefter der tilsættes stivelse (punkt 3.10) som indikator, og titreringen færdiggøres.

Den samme titrering foretages med en nøjagtigt afmålt blanding af 25 ml Luff-Schoorl-reagens (punkt 3.8) og 25 ml vand, efter at der er tilsat 10 ml kaliumiodidopløsning (punkt 3.12) og 25 ml svovlsyre (punkt 3.11), dog uden at bringe den i kog.

6.   Beregning af resultater

Ved hjælp af tabellen beregnes den mængde glucose i mg, der svarer til forskellen mellem resultaterne af de to titreringer, udtrykt i ml natriumthiosulfat 0,1 mol/liter. Resultatet angives i procent af prøven.

7.   Specielle fremgangsmåder

7.1.

For så vidt angår foder med et højt melasseindhold og andet lidet homogent foder afvejes 20 g, som anbringes i en 1 liter målekolbe med 500 ml vand. Blandes i en time i rysteapparatet og klares ved hjælp af Carrez-reagens I (punkt 3.2) og II (punkt 3.3), som beskrevet i punkt 5.1, idet der dog benyttes en fire gange større mængde af hvert reagens. Der fyldes op til mærket med 80 % ethanol (v/v). Derefter homogeniseres og filtreres. Ethanolen afdampes som beskrevet i punkt 5.1. Findes der ikke dekstrineret stivelse, fyldes der op med destilleret vand.

7.2.

For så vidt angår melasse og fodermidler med et højt indhold af sukker, men praktisk talt ingen stivelse (johannesbrød, tørrede sukkerroesnitter osv.) afvejes 5 g i en 250 ml målekolbe, hvorefter der tilsættes 200 ml destilleret vand og blandes i 1 time eller mere, om nødvendigt, i rysteapparatet. Blandingen klares ved hjælp af Carrez-reagens I (punkt 3.2) og II (punkt 3.3), som beskrevet i punkt 5.1. Der fyldes op til mærket med koldt vand, homogeniseres og filtreres. Til bestemmelse af totalsukker benyttes fremgangsmåden, der er beskrevet under punkt 5.3.

8.   Bemærkninger

8.1.

Det anbefales at tilsætte ca. 1 ml 3-methylbutan-1-ol (punkt 3.14) (uden hensyntagen til volumenet) før kogning med Luff-Schoorl-reagenset for at undgå skumdannelse.

8.2.

Forskellen mellem indholdet af totalsukker efter invertering, udtrykt som glucose, og indholdet af reducerende sukker, udtrykt som glucose, giver, multipliceret med 0,95, procentindholdet af saccharose.

8.3.

Til bestemmelse af indholdet af reducerende sukker, med undtagelse af lactose, kan der anvendes to metoder:

8.3.1.

For at foretage en omtrentlig beregning multipliceres med 0,675 det ved en separat bestemmelse konstaterede indhold af lactose, og det fundne resultat trækkes fra indholdet af reducerende sukker.

8.3.2.

For at foretage en præcis beregning af det reducerende sukker, med undtagelse af lactosen, er det nødvendigt at lægge den samme analyseprøve til grund ved de to definitive bestemmelser. Den ene analyse udføres på en del af opløsningen, der opnås efter punkt 5.1, den anden på en del af opløsningen, der opnås ved bestemmelsen af lactose efter den hertil fastlagte metode (efter gæring af de andre sukkerarter og klaring). I begge tilfælde bestemmes det tilstedeværende indhold af sukker efter Luff-Schoorl-metoden og beregnes i mg glucose. De to værdier trækkes fra hinanden, og forskellen angives i procent af prøven. Eksempel De to udtagne volumener svarer for hver bestemmelse til en analyseprøve på 250 mg. I det første tilfælde forbruges der 17 ml natriumthiosulfatopløsning 0,1 mol/liter, hvad der svarer til 44,2 mg glucose; i det andet tilfælde forbruges der 11 ml, hvad der svarer til 27,6 mg glucose. Forskellen andrager 16,6 mg glucose. Indholdet af reducerende sukker (uden lactose) beregnet som glucose er altså: Tabel over værdierne for 25 ml Luff-Schoorl-reagens ml Na2 S2 O3 0,1 mol/liter, to minutters opvarmning, 10 minutters kogning Na2 S2 O3 0,1 mol/liter Glucose, fructose, inverteret sukker C6 H12 O6 Lactose C12 H22 O11 Na2 S2 O3 0,1 mol/liter ml mg forskel mg forskel ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

J.   BESTEMMELSE AF LACTOSE

1.   Formål og anvendelsesområde

Metoden gør det muligt at bestemme indholdet af lactose i foder, der indeholder mere end 0,5 % heraf.

2.   Princip

Sukkeret opløses i vand. Opløsningen underkastes en gæring med Saccharomyces cerevisiae, som ikke angriber lactosen. Efter klaring og filtrering bestemmes filtratets lactoseindhold efter Luff-Schoorl-metoden.

3.   Reagenser

3.1.

Saccharomyces cerevisiae-opslæmning: 25 g frisk gær opslæmmes i 100 ml vand. Suspensionen kan holde sig i højst en uge i køleskab.

3.2.

Carrez-reagens I: 21,9 g zinkacetat, Zn (CH3 COO)2 2H2O, og 3 g iseddike opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.

3.3.

Carrez-reagens II: 10,6 g kaliumferrocyanid, K4 Fe (CN)6 3H2O, opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.

3.4.

Luff-Schoorl-reagens: Under forsigtig omrøring hældes citronsyreopløsningen (punkt 3.4.2) over i natriumcarbonatopløsningen (punkt 3.4.3). Kobbersulfatopløsningen (punkt 3.4.1) tilsættes, og der fyldes op med vand til 1 liter. Det henstår natten over og filtreres. Koncentrationen af det således opnåede reagens kontrolleres (Cu 0,05 mol/liter; Na2 CO3 1 mol/liter). Opløsningens pH-værdi skal være ca. 9,4.

3.4.1.

Kobbersulfatopløsning: 25 g kobbersulfat, Cu SO4 5H2O, frit for jern, opløses i 100 ml vand.

3.4.2.

Citronsyreopløsning: 50 g citronsyre, C6H8O7•H2O, opløses i 50 ml vand.

3.4.3.

Natriumcarbonatopløsning: 143,8 g vandfrit natriumcarbonat opløses i ca. 300 ml varmt vand. Opløsningen henstilles til afkøling.

3.5.

Granuleret pimpsten udkogt i saltsyre, vasket med vand og tørret.

3.6.

Kaliumiodid, 30 % opløsning (w/v).

3.7.

Svovlsyre, 3 mol/liter.

3.8.

Natriumthiosulfatopløsning, 0,1 mol/liter.

3.9.

Stivelsesopløsning: 5 g opløselig stivelse tilsættes 30 ml vand og opblandes i 1 liter kogende vand. Der koges i tre minutter, henstilles til afkøling og tilsættes eventuelt 10 mg kviksølviodid som konserveringsmiddel.

4.   Apparatur

Vandbad forsynet med termostat, indstillet til 38–40 °C.

5.   Fremgangsmåde

1 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed, og denne portion anbringes i en 100 ml målekolbe. Der tilsættes 25–30 ml vand. Kolben opvarmes i 30 minutter i kogende vandbad, hvorefter der afkøles til ca. 35 °C. Der tilsættes 5 ml gærsuspension (punkt 3.1) og homogeniseres. Kolben henstår i to timer i vandbad ved en temperatur på 38–40 °C. Afkøles derpå til ca. 20 °C.

Der tilsættes 2,5 ml Carrez-reagens I (punkt 3.2), og blandingen rystes i 30 sekunder; dernæst tilsættes 2,5 ml Carrez-reagens II (punkt 3.3), og der rystes på ny i 30 sekunder. Der fyldes op med vand til 100 ml, blandes og filtreres. Med pipette udtages en mængde filtrat, der ikke overstiger 25 ml, og som så vidt muligt indeholder 40–80 mg lactose, og dette overføres til en 300 ml erlenmeyerkolbe. Om nødvendigt fyldes op med vand til 25 ml.

På samme måde udføres en blindprøve med 5 ml gærsuspension (punkt 3.1). Lactoseindholdet bestemmes efter Luff-Schoorl-metoden som følger: Der tilsættes nøjagtig 25 ml Luff-Schoorl-reagens (punkt 3.4) og to korn pimpsten (punkt 3.5). Der opvarmes under omrystning med hånden over en fri flamme af middelhøjde, og væsken bringes i kog på ca. to minutter. Erlenmeyerkolben anbringes umiddelbart derefter på en metaltrådsdug, som er forsynet med et asbesttrådnet med et hul på ca. 6 cm i diameter, hvorunder man i forvejen har tændt en flamme. Denne skal være afpasset således, at alene erlenmeyerkolbens bund opvarmes. Kolben forbindes med en tilbagesvaler. Væsken koges i nøjagtig 10 minutter. Derpå afkøles der straks ved hjælp af koldt vand, og efter ca. fem minutters forløb titreres der som følger:

Der tilsættes 10 ml kaliumiodidopløsning (punkt 3.6) og straks derefter (forsigtigt på grund af risikoen for dannelse af skum i stor mængde) 25 ml svovlsyre (punkt 3.7). Der titreres så med natriumthiosulfatopløsning (punkt 3.8), indtil der viser sig en matgul farve, hvorefter der tilsættes stivelse (punkt 3.9) som indikator, og titreringen færdiggøres.

Den samme titrering foretages med en nøjagtigt afmålt blanding af 25 ml Luff-Schoorl-reagens (punkt 3.4) og 25 ml vand, efter at der er tilsat 10 ml kaliumiodidopløsning (punkt 3.6) og 25 ml svovlsyre (punkt 3.7), dog uden at bringe den i kog.

6.   Beregning af resultater

Ved hjælp af nedenstående tabel beregnes den mængde lactose i mg, der svarer til forskellen mellem resultaterne af de to titreringer, udtrykt i ml natriumthiosulfatopløsning 0,1 mol/liter.

Resultatet for vandfri lactose angives i procent af prøven.

7.   Bemærkning

1.

Til produkter, der indeholder mere end 40 % gæringsdygtigt sukker, skal der benyttes mere end 5 ml gærsuspension (punkt 3.1).

2.

I »laktosereduceret« foder (f.eks. kattemælk) omdannes laktose til fruktose, der ikke er færdiggæret inden for to timer, hvilket giver højere eller falsk positive resultater (fordi der er remnanter af fruktose i ekstraktet). Tabel over værdierne for 25 ml Luff-Schoorl-reagens ml Na2 S2 O3 0,1 mol/liter, 2 minutters opvarmning, 10 minutters kogning Na2 S2 O3 0,1 mol/liter Glucose, fructose, inverteret sukker C6 H12 O6 Lactose C12 H22 O11 Na2 S2 O3 0,1 mol/liter ml mg forskel mg forskel ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

K.   BESTEMMELSE AF STIVELSE

POLARIMETRISK METODE

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af stivelse og nedbrydningsprodukter heraf med høj molekylvægt i foder til kontrol af, om reglerne vedrørende angivelse af energiindholdet (jf. bilag VII) og forordning (EF) nr. 767/2009 er overholdt.

Denne metode skal anvendes til bestemmelse af stivelsesindhold til brug til beregning af foderets energiindhold.

Hvis stivelsesindholdet skal bestemmes til andre formål, kan der benyttes andre analysemetoder.

2.   Princip

Metoden er baseret på dobbeltbestemmelse. Ved den første bestemmelse behandles prøven med fortyndet saltsyre. Efter klaring og filtrering måles opløsningens optiske drejning polarimetrisk.

Ved den anden bestemmelse ekstraheres prøven med 40 % ethanol. Efter behandling af filtratet med saltsyre klares og filtreres, og den optiske drejning måles under samme betingelser som ved den første bestemmelse.

Forskellen mellem de to målinger, multipliceret med en kendt faktor, giver prøvens stivelsesindhold.

3.   Reagenser

3.1.

Saltsyre, 25 % opløsning (w/w), massefylde: 1,126 g/ml.

3.2.

Saltsyre, 1,13 % opløsning (w/v). Koncentrationen skal kontrolleres ved titrering med 0,1 mol/liter natriumhydroxidopløsning under tilstedeværelse af 0,1 % (w/v) methylrødt i 94 % (v/v) ethanol. Til neutralisering af 10 ml kræves der 30,94 ml NaOH 0,1 mol/liter.

3.3.

Carrez-reagens I: 21,9 g zinkacetat, Zn (CH3 COO)2 2H2O, og 3 g iseddike opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.

3.4.

Carrez-reagens II: 10,6 g kaliumferrocyanid, K4 Fe (CN)6 3H2O, opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.

3.5.

Ethanol, 40 % opløsning (v/v), massefylde: 0,948 g/ml ved 20 °C.

4.   Apparatur

4.1.

250 ml erlenmeyerkolbe med standardslibhals og tilbagesvaler.

4.2.

Polarimeter eller saccharimeter.

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Klargøring af prøven

Prøven formales, så den kan passere fuldstændigt gennem en sigte med 0,5 mm runde masker.

5.2.   Bestemmelse af den totale optiske drejning (P eller S) (se bemærkning punkt 7.1)

2,5 g af den formalede prøve afvejes med 1 mg nøjagtighed i en 100 ml målekolbe, og der tilsættes 25 ml saltsyre (punkt 3.2). Kolben rystes, indtil prøvematerialet er jævnt fordelt, og der tilsættes yderligere 25 ml saltsyre (punkt 3.2). Derefter nedsænkes kolben i et kogende vandbad. I de første tre minutter rystes kolben kraftigt og med regelmæssige mellemrum for at forhindre klumpdannelse. Vandmængden i vandbadet skal være tilstrækkelig til fortsat at holde vandet i kog, når kolben nedsænkes. Under omrystningen må kolben ikke tages op af vandbadet. Efter nøjagtig 15 minutter tages kolben op af vandbadet, hvorefter der tilsættes 30 ml koldt vand og straks afkøles til 20 °C.

Der tilsættes 5 ml Carrez-reagens I (punkt 3.3) og omrystes i ca. 30 sekunder. Derpå tilsættes 5 ml Carrez-reagens II (punkt 3.4), og der omrystes atter i ca. 30 sekunder. Der fyldes op med vand til mærket, blandes og filtreres: Hvis filtratet ikke er fuldstændig klart, hvilket sjældent forekommer, skal bestemmelsen gentages med en større mængde Carrez-reagens I og II, f.eks. 10 ml.

Opløsningens optiske drejning måles i et 200 mm rør med et polarimeter eller et saccharimeter.

5.3.   Bestemmelse af den optiske drejning (P' eller S') for de i 40 % ethanol opløselige stoffer

5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i en 100 ml målekolbe, og der tilsættes ca. 80 ml ethanol (punkt 3.5) (se bemærkning punkt 7.2). Kolben henstår i en time ved rumtemperatur. I dette tidsrum rystes kolben kraftigt seks gange, så prøvematerialet blandes omhyggeligt med ethanolen. Der fyldes op med ethanol (punkt 3.5) til mærket, blandes og filtreres.

50 ml af filtratet (svarende til 2,5 g af prøven) afpipetteres i en 250 ml erlenmeyerkolbe, og der tilsættes 2,1 ml saltsyre (punkt 3.1). Kolben rystes kraftigt, sluttes til en tilbagesvaler og nedsænkes i et bad med kogende vand. Efter nøjagtig 15 minutter tages erlenmeyerkolben op af vandbadet, og indholdet skylles over i en 100 ml målekolbe med en lille mængde koldt vand og afkøles til 20 °C.

Derpå klares med Carrez-reagens I (punkt 3.3) og II (punkt 3.4), fyldes op med vand til mærket, blandes og filtreres, og den optiske drejning måles som beskrevet i punkt 5.2, andet og tredje afsnit.

6.   Beregning af resultater

Indholdet af stivelse (%) beregnes som følger:

6.1.   Polarimetriske målinger

P	=	total optisk drejning i cirkelgrader
P'	=	optisk drejning i cirkelgrader af de i 40 % (v/v) ethanol opløselige stoffer
	=	den rene stivelses specifikke optiske drejning. Til denne faktor anvendes følgende generelt accepterede værdier:

+ 185,9°	:	risstivelse
+ 185,7°	:	kartoffelstivelse
+ 184,6°	:	majsstivelse
+ 182,7°	:	hvedestivelse
+ 181,5°	:	bygstivelse
+ 181,3°	:	havrestivelse
+ 184,0°	:	andre typer stivelse og stivelsesblandinger i foderblandinger

6.2.   Saccharimetriske målinger

S	=	total optisk drejning i saccharimetergrader
S'	=	optisk drejning i saccharimetergrader af de i 40 % (v/v) ethanol opløselige stoffer
N	=	saccharosens vægt i gram i 100 ml vand ved en vejlængde på 200 mm, som giver en optisk drejning på 100 saccharimetergrader. Denne vægt varierer alt efter saccharimetertype: 16,29 g for franske saccharimetre 26,00 g for tyske saccharimetre 20,00 g for blandede saccharimetre.
	=	den rene stivelses specifikke optiske drejning (se punkt 6.1).

6.3.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ved indhold på under 40 % stivelse ikke overstige 0,4 i absolut værdi og ved indhold på 40 % og derover ikke overstige 1 % i relativ værdi.

7.   Bemærkninger

7.1.

Hvis prøven indeholder over 6 % carbonater, beregnet som calciumcarbonat, skal de destrueres med den nøjagtige mængde fortyndet svovlsyre inden bestemmelsen af den totale optiske drejning.

7.2.

For produkter med højt lactoseindhold, f.eks. mælkeserum i pulverform eller skummetmælkspulver, anvendes efter tilsætning af 80 ml ethanol (punkt 3.5) følgende fremgangsmåde: Kolben tilsluttes en tilbagesvaler og nedsænkes i et vandbad på 50 °C i 30 minutter. Efter afkøling fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.

7.3.

Ved tilstedeværelse i foder i større mængde kan følgende fodermidler interferere ved bestemmelse af stivelsesindholdet efter den polarimetriske metode, som derved kan give forkerte resultater: — (sukker)roeprodukter, såsom ekstraherede (sukker)roesnitter, (sukker)roemelasse, ekstraherede (sukker)roesnitter tilsat melasse, (sukker)roevinasse, (roe)sukker — citruskvas — hørfrø hørfrøkage hørfrøskrå — rapsfrø rapskage rapsskrå rapsskaller — solsikkefrø solsikkeskrå solsikkeskrå, delvis afskallet — kokoskage kokosskrå — kartoffelkvas — tørret gær — produkter med stort inulinindhold (f.eks. snitter og skrå af jordskokker) — grever — sojabønneprodukter. I disse tilfælde kan analysemetoden som omhandlet i Kommissionens forordning (EF) nr. 121/2008 (7) anvendes. Denne metode kan også anvendes til foder, der indeholder mindre end 1 % stivelse.

L.   BESTEMMELSE AF RÅASKE

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af råaske i foder.

2.   Princip

Prøven foraskes ved 550 °C, remanensen vejes.

3.   Reagenser

Ammoniumnitrat, 20 % opløsning (w/v).

4.   Apparatur

4.1.

Varmeplade

4.2.

Elektrisk muffelovn med termostat

4.3.

Foraskningsdigler af kvarts, porcelæn eller platin, rektangulære (ca. 60 × 40 × 25 mm) eller runde (diameter: 60–75 mm, højde: 20–40 mm).

5.   Fremgangsmåde

Ca. 5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed (2,5 g for produkter, der har tendens til at svulme op) i en foraskningsdigel, der i forvejen er opvarmet til 550 °C, afkølet og tareret. Diglen anbringes på varmepladen og opvarmes gradvist, indtil stoffet forkuller. Der foraskes som beskrevet i punkt 5.1 eller 5.2.

5.1.

Diglen stilles ind i den kalibrerede muffelovn, der er indstillet på 550 °C. Den henstår ved denne temperatur, indtil der fås hvid, lysegrå eller rødlig aske, der tilsyneladende er fri for kulpartikler. Diglen anbringes i en ekssikkator, henstilles til afkøling og vejes med det samme.

5.2.

Diglen stilles ind i den kalibrerede muffelovn, der er indstillet på 550 °C. Der foraskes i tre timer. Diglen anbringes i en ekssikkator, henstilles til afkøling og vejes med det samme. Der foraskes i yderligere 30 minutter for at sikre, at askens vægt forbliver konstant (vægttabet mellem to på hinanden følgende vejninger må højst være på 1 mg).

6.   Beregning af resultater

Vægten af remanensen beregnes, idet taraen trækkes fra.

Resultatet angives i procent af prøven.

7.   Bemærkninger

7.1.

Asken af de stoffer, der er vanskelige at foraske, skal underkastes en første foraskning på mindst tre timer, afkøles og tilsættes nogle få dråber 20 % ammoniumnitratopløsning eller vand (dog forsigtigt for at undgå, at asken spredes eller danner klumper). Foraskningen fortsættes efter tørring i tørreskab. Gentag processen, indtil foraskningen er fuldstændig.

7.2.

For stoffer, der ikke kan behandles efter den i punkt 7.1. beskrevne metode, benyttes følgende fremgangsmåde: Efter tre timers foraskning bringes asken ved hjælp af varmt vand over på et lille askefrit filter. Filtret med indhold foraskes i den oprindelige digel. Filtratet anbringes i den afkølede digel, inddampes til tørhed, foraskes og vejes.

7.3.

Når det drejer sig om fedtstoffer, afvejes med størst mulig nøjagtighed en prøve på 25 g i en digel af passende størrelse. Prøven forkulles ved at antænde stoffet ved hjælp af en lunte af askefrit filtrerpapir. Fugtes efter forbrændingen med den mindste mængde vand, der er nødvendig. Tørres og foraskes som beskrevet i punkt 5.

M.   BESTEMMELSE AF ASKE UOPLØSELIG I SALTSYRE

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet i foder af mineralske bestanddele, som er uopløselige i saltsyre. Der er fastsat to fremgangsmåder alt afhængigt af prøvens art.

1.1.

Fremgangsmåde A finder anvendelse på organiske fodermidler og på de fleste typer foderblandinger.

1.2.

Fremgangsmåde B: finder anvendelse på mineralstoffer og mineralstofblandinger såvel som på foderblandinger, hvis indhold af aske uopløselig i saltsyre, bestemt efter fremgangsmåde A, er større end 1 %.

2.   Princip

2.1.

Fremgangsmåde A Prøven foraskes, asken koges med saltsyre, og den uopløselige remanens frafiltreres og vejes.

2.2.

Fremgangsmåde B: Prøven behandles med saltsyre. Opløsningen filtreres, remanensen foraskes, og den fundne aske behandles som beskrevet under fremgangsmåde A.

3.   Reagenser

3.1.

Saltsyre, 3 mol/liter

3.2.

Trichloreddikesyre, 20 % opløsning (w/v)

3.3.

Trichloreddikesyre, 1 % opløsning (w/v).

4.   Apparatur

4.1.

Varmeplade

4.2.

Elektrisk muffelovn med termostat

4.3.

Foraskningsdigler af kvarts, porcelæn eller platin, rektangulære (ca. 60 × 40 × 25 mm) eller runde (diameter: 60–75 mm, højde: 20–40 mm)

4.4.

Askefrie filtre.

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Fremgangsmåde A

Prøven foraskes efter den fremgangsmåde, der er beskrevet for bestemmelse af råaske. Man kan også benytte den aske, der opnås ved denne bestemmelse.

Asken anbringes i et 250–400 ml bægerglas med 75 ml saltsyre (punkt 3.1). Væsken bringes forsigtigt til kogning og koges sagte i 15 minutter. Den varme opløsning filtreres gennem et askefrit filtrerpapir, og remanensen vaskes med varmt vand, indtil den sure reaktion forsvinder. Filtret med remanensen tørres, og der foraskes i en tareret digel ved en temperatur på mindst 550 °C og højst 700 °C. Afkøles i en ekssikkator og vejes.

5.2.   Fremgangsmåde B

5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i et 250–400 ml bægerglas. Der tilsættes 25 ml vand og derefter 25 ml saltsyre (punkt 3.1), blandes og ventes, indtil opbrusningen ophører. Der tilsættes yderligere 50 ml saltsyre (punkt 3.1). Det afventes, at en eventuel luftudvikling er overstået, hvorefter bægerglasset anbringes på kogende vandbad og efterlades dér i 30 minutter eller mere, om nødvendigt, så eventuelt forekommende stivelse hydrolyseres fuldstændigt. Der varmfiltreres gennem et askefrit filter, og filtret vaskes med 50 ml varmt vand (se punkt 7, »Bemærkning«). Filtret med remanensen anbringes i en foraskningsdigel, og der tørres og foraskes ved en temperatur på mindst 550 °C og højst 700 °C. Asken anbringes i et 250–400 ml bægerglas med 75 ml saltsyre (punkt 3.1). Derefter fortsættes som beskrevet i punkt 5, andet afsnit.

6.   Beregning af resultater

Vægten af remanensen beregnes, idet taraen trækkes fra. Resultatet angives i procent af prøven.

7.   Bemærkning

Hvis filtreringen viser sig vanskelig, gentages bestemmelsen, idet de 50 ml saltsyre (3.1) erstattes med 50 ml trichloreddikesyreopløsning på 20 % (punkt 3.2), og idet filtret vaskes med en varm trichloreddikesyreopløsning på 1 % (punkt 3.3).

N.   BESTEMMELSE AF TOTALPHOSPHOR

Totalphosphor bestemmes ved

—	anvendelse af den analysemetode, der er omhandlet i EN 15510 Foderstoffer: Prøveudtagnings- og analysemetoder — Bestemmelse af calcium, natrium, fosfor, magnesium, kalium, jern, zink, kobber, mangan, kobolt, molybdæn og bly ved ICP-AES eller

—	anvendelse af den analysemetode, der er omhandlet i EN 15621 Foderstoffer: Prøveudtagnings- og analysemetoder — Bestemmelse af calcium, natrium, phosphor, magnesium, kalium, svovl, jern, zink, kobber, mangan og kobolt ved ICP-AES efter trykoplukning eller

—	den fotometriske metode, som beskrevet nedenfor.

FOTOMETRISK METODE

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af totalphosphor i foder. Metoden er specielt egnet til undersøgelse af foder med et ringe phosphorindhold. I bestemte tilfælde (phosphorrige produkter) kan der anvendes en gravimetrisk metode.

2.   Princip

Prøven destrueres enten ved forbrænding (når der er tale om organisk foder) eller ved syreoplukning (mineralske stoffer og flydende foder) og opløses i syre. Opløsningen behandles med vanadatmolybdatreagenset. Ekstinktionen af den gulfarvede opløsning måles ved 430 nm i spektrofotometret.

3.   Reagenser

3.1.

Calciumcarbonat

3.2.

Saltsyre, ρ20 = 1,10 g/ml (ca. 6 mol/liter)

3.3.

Salpetersyre, ρ20 = 1,045 g/ml

3.4.

Salpetersyre, ρ20 = 1,38 til 1,42 g/ml

3.5.

Svovlsyre, ρ20 = 1,84 g/ml

3.6.

Vanadatmolybdatreagens: 200 ml ammoniumheptamolybdatopløsning (punkt 3.6.1) blandes med 200 ml ammoniummonovandatopløsning (punkt 3.6.2) og 134 ml salpetersyre (punkt 3.4) i en 1 liter målekolbe, hvorefter der fyldes op med vand til mærket.

3.6.1.

Ammoniumheptamolybdatopløsning: 100 g ammoniumheptamolybdat (NH4) 6Mo7O24.4H2O opløses i varmt vand. Der tilsættes 10 ml ammoniakvand (massefylde: 0,91 g/ml) og fyldes op med vand til 1 liter.

3.6.2.

Ammoniummonovanadatopløsning: 2,35 g ammoniummonovanadat, NH4VO3 opløses i 400 ml varmt vand. 20 ml fortyndet salpetersyre (7 ml HNO3 (3.4) + 13 ml H2O) tilsættes langsomt under stadig omrøring, og der fyldes op med vand til 1 liter.

3.7.

Standardphosphoropløsning på 1 mg pr. ml: 4,387 g kaliumdihydrogenphosphat, KH2PO4, opløses i vand, og der fyldes op med vand til 1 liter.

4.   Apparatur

4.1.

Foraskningsdigler af kvarts, porcelæn eller platin

4.2.

Elektrisk muffelovn med termostat indstillet på 550 °C

4.3.

250 ml Kjeldahlkolbe

4.4.

Målekolber og mikromålepipetter

4.5.

Spektrofotometer

4.6.

Reagensglas, ca. 16 mm diameter med NS 14,5; rumindhold: 25–30 ml.

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Fremstilling af opløsningen

Alt efter prøvens art fremstilles opløsningen som beskrevet i punkt 5.1.1 eller 5.1.2.

5.1.1.   Normal metode

1 g eller mere af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og hældes i en Kjeldahlkolbe. Der tilsættes 20 ml svovlsyre (3.5), hvorefter der omrystes for at gennemvæde materialet med syren og for at forhindre, at materialet sætter sig fast på kolbens inderside. Derpå opvarmes blandingen og holdes i kog i 10 minutter. Efter en let afkøling tilsættes der 2 ml salpetersyre (3.4); der opvarmes svagt og afkøles atter noget. Herefter tilsættes på ny lidt salpetersyre (3.4) og opvarmes til kogetemperatur, og dette gentages, indtil opløsningen er farveløs. Derpå afkøles der; der tilsættes lidt vand, og væsken overføres kvantitativt til en 500 ml målekolbe ved skylning af Kjeldahlkolben med varmt vand. Efter afkøling fyldes der op med vand til mærket, homogeniseres og filtreres.

5.1.2.   Metode for prøver, der indeholder organiske stoffer, men er fri for calcium- og magnesium-dihydrogenphosphater

Ca. 2,5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i en foraskningsdigel og blandes omhyggeligt med 1 g calciumcarbonat (punkt 3.1). I muffelovnen foraskes der ved 550 °C, indtil asken er hvid eller grå (små mængder kul er ikke et problem). Asken overføres til et 250 ml bægerglas. Der tilsættes 20 ml vand og saltsyre (punkt 3.2), indtil opbrusningen ophører. Der tilsættes yderligere 10 ml saltsyre (punkt 3.2). Derpå anbringes bægerglasset på sandbad, og der inddampes til fuldstændig tørhed for at gøre kiselsyren uopløselig. Remanensen opløses i 10 ml salpetersyre (punkt 3.3) og opvarmes til kogetemperatur i 5 minutter på sandbad eller varmeplade, idet remanensen dog ikke skal tørre helt. Væsken overføres til en 500 ml målekolbe, idet bægerglasset gentagne gange skylles med varmt vand. Efter afkøling fyldes der op med vand til mærket, homogeniseres og filtreres.

5.2.   Udvikling af farvningen og måling af ekstinktionen

En alikvot del af det efter punkt 5.1.1 eller 5.1.2 udvundne filtrat fortyndes for at få en koncentration af phosphor på højst 40 μg/ml. 10 ml af denne opløsning overføres til et reagensglas (punkt 4.6), og der tilsættes 10 ml vanadatmolybdatreagens (punkt 3.6). Blandingen homogeniseres og henstår i mindst 10 minutter ved 20 °C. Derpå måles ekstinktionen i spektrofotometret ved 430 nm i forhold til en opløsning af 10 ml vand og 10 ml vanadatmolybdatreagens (punkt 3.6).

5.3.   Kalibreringskurve

Af standardopløsningen (punkt 3.7) fremstilles opløsninger, der indeholder henholdsvis 5, 10, 20, 30 og 40 μg phosphor pr. ml. Til hver 10 ml af disse opløsninger tilsættes 10 ml vanadatmolybdatreagens (punkt 3.6). Der homogeniseres, og blandingen henstår i mindst 10 minutter ved 20 °C. Derpå måles ekstinktionen under de ovenfor i punkt 5.2 beskrevne betingelser. Kalibreringskurven tegnes, idet ekstinktionsværdierne indtegnes op ad ordinaten, og den tilsvarende phosphormængde ud ad abscissen. Kurven er lineær for phosphorkoncentrationer på 0–40 μg/ml.

6.   Beregning af resultater

Indholdet af phosphor i prøven bestemmes ved benyttelse af kalibreringskurven.

Resultatet angives i procent af prøven.

Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige:

—	3 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for phosphorindhold på mindre end 5 %

—	0,15 % i absolut værdi for phosphorindhold på 5 % og derover.

O.   BESTEMMELSE AF CHLOR AF CHLORIDER

1.   Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af chlor af vandopløselige chlorider, der normalt udtrykkes som natriumchlorid. Den kan anvendes på alt foder.

2.   Princip

Chloriderne opløses i vand. Dersom produktet indeholder organisk stof, foretages en klaring. Opløsningen gøres let sur ved tilsætning af salpetersyre, og chloriderne bundfældes i form af sølvchlorid ved hjælp af en sølvnitratopløsning. Overskuddet af sølvnitrat titreres med en ammoniumthiocyanatopløsning efter Volhards metode.

3.   Reagenser

3.1.

Ammoniumthiocyanatopløsning, 0,1 mol/liter

3.2.

Sølvnitratopløsning, 0,1 mol/liter

3.3.

Mættet ammoniumferrisulfatopløsning (NH4)Fe(SO4)2

3.4.

Salpetersyre, massefylde: 1,38 g/ml

3.5.

Diethylether

3.6.

Acetone

3.7.

Carrez-reagens I: 21,9 g zinkacetat, Zn (CH3 COO)2 2H2O, og 3 g iseddike opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.

3.8.

Carrez-reagens II: 10,6 g kaliumferrocyanid, K4 Fe (CN)6 3H2O, opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.

3.9.

Aktivt kul, chloridfrit og ikke-chloridadsorberende.

4.   Apparatur

Mekanisk rysteapparat: ca. 35–40 omdrejninger i minuttet.

5.   Fremgangsmåde

5.1.   Fremstilling af opløsningen

Alt efter prøvens art fremstilles en opløsning som beskrevet i punkt 5.1.1., 5.1.2 eller 5.1.3.

Der udføres til sammenligning en blindprøve uden analyseprøven.

5.1.1.   Prøver uden organisk stof

Der afvejes med 1 mg nøjagtighed en analyseprøve på ikke mere end 10 g, der ikke indeholder mere end 3 g chlor i form af chlorider, og denne anbringes i en 500 ml målekolbe med 400 ml vand på ca. 20 °C. Væsken blandes i 30 minutter i rysteapparatet, og der fyldes op til mærket, homogeniseres og filtreres.

5.1.2.   Prøver, der indeholder organisk stof, med undtagelse af de i punkt 5.1.3. anførte

Ca. 5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og anbringes med 1 g aktivt kul i en 500 ml målekolbe. Der tilsættes 400 ml vand på ca. 20 °C og 5 ml Carrez-reagens I (3.7), omrøres i 30 sekunder og tilsættes derefter 5 ml Carrez-reagens II (3.8). Væsken blandes i 30 minutter i rysteapparatet, og der fyldes op til mærket, homogeniseres og filtreres.

5.1.3.   Bagt foder, hørfrøkager og hørfrøskrå, produkter med et stort indhold af hørfrøskrå og andre produkter med et stort indhold af planteslim eller af kolloidale stoffer (f.eks. forklistret stivelse)

Opløsningen fremstilles som beskrevet i punkt 5.1.2, men filtreres ikke. Opløsningen dekanteres (om nødvendigt centrifugeres), med pipette udtages 100 ml af supernatanten, og dette overføres til en 200 ml målekolbe. Der blandes med acetone (punkt 3.6) og fyldes op til mærket med denne opløsningsvæske, hvorefter der homogeniseres og filtreres.

5.2.   Titrering

Med pipette overføres til en erlenmeyerkolbe 25–100 ml af filtratet (alt efter det formodede chlorindhold), der er opnået efter punkt 5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3. Den alikvote mængde må ikke indeholde mere end 150 mg klor (Cl). Om nødvendigt fortyndes med vand op til mindst 50 ml, hvorefter der tilsættes 5 ml salpetersyre (punkt 3.4), 20 ml mættet ammoniumferrisulfatopløsning (punkt 3.3) og 2 dråber ammoniumthiocyanatopløsning (punkt 3.1), som påfyldes ved hjælp af en burette, der er fyldt til nulpunktstregen. Dernæst påfyldes ved hjælp af en burette sølvnitratopløsningen (punkt 3.2), således at der opnås et overskud på 5 ml. Der tilsættes 5 ml diethylether (punkt 3.5) og omrystes kraftigt for at sikre fuldstændig udfældning. Overskuddet af sølvnitrat titreres med ammoniumthiocyanatopløsning (punkt 3.1), indtil omslaget til den brunrøde farve har holdt sig i et minut.

6.   Beregning af resultater

Mængden af chlor (X), udtrykt i % natriumchlorid, beregnes efter følgende formel:

hvor:

V1	=	tilsatte ml sølvnitratopløsning 0,1 mol/liter
V2	=	ml ammoniumthiocyanatopløsning 0,1 mol/liter, forbrugt ved titreringen
m	=	prøvens vægt i g i den udtagne aliquot.

Hvis blindprøven viser et forbrug af sølvnitratopløsning 0,1 mol/liter, trækkes denne værdi fra volumenet (V1 – V2).

7.   Bemærkninger

7.1.

Titreringen kan også foregå ved potentiometri.

7.2.

For meget fedtholdige produkter foretages der en forudgående affedtning med diethylether eller petroleumsether.

7.3.

For så vidt angår fiskemel kan titreringen foretages efter Mohrs metode.«