1991R2568 — BG — 01.04.2011 — 023.001

Този документ е средство за документиране и не обвързва институциите

Изменен с

▼B

РЕГЛАМЕНТ (ЕИО) № 2568/91 НА КОМИСИЯТА

от 11 юли 1991 година

относно характеристиките на маслиновото масло и маслиновото масло от остатъчен материал и съответните методи за анализ

▼M20

Член 1

1.  Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точки 1 и 2 от приложение I към настоящия регламент, се считат за необработено маслиново масло virgin по смисъла на точка 1, а) и б) от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

2.  Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 3 от приложение I към настоящия регламент се счита за маслиново масло за осветление по смисъла на точка 1, в) от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

3.  Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 4 от приложение I към настоящия регламент се счита за рафинирано маслиново масло по смисъла на точка 2 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

4.  Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 5 от приложение I към настоящия регламент се счита за маслиново масло съставено от рафинирани маслинови масла и необработени маслинови масла virgin по смисъла на точка 3 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

5.  Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 6 от приложение I към настоящия регламент се счита за сурово маслиново масло от остатъчен материал по смисъла на точка 4 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

6.  Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 7 от приложение I към настоящия регламент се счита за рафинирано маслиново масло от остатъчен материал по смисъла на точка 5 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

7.  Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 8 от приложение I към настоящия регламент се счита за маслиново масло от остатъчен материал по смисъла на точка 6 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

▼B

Член 2

1.  Характеристиките на маслата, установени в приложение I, се определят в съответствие с методите, описани по-долу:

▼M19

▼B

▼M21

▼M20 —————

▼B

▼M20 —————

▼M11

▼M13

▼M19

▼M23

▼M19

2.  Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3.  When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

▼M17

За целите на проверката, предвидена в параграф 3, анализите посочени в приложения II, III, IX, X и XII, и където е приложимо, всички необходими контра-анализи в съответствие с националното законодателство трябва да бъдат проведени преди датата на минималната трайност. Когато пробите са взети повече от четири месеца преди датата на минималната трайност, анализите се провеждат не по-късно от четвъртия месец след месеца, в който е взета пробата. За другите анализи, предвидени в посочения регламент, не се прилага срок.

 ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5.  For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M20

Член 2а

Националните власти или техните представители могат да проверяват дали една мостра съответства на декларираната категория:

▼M19 —————

▼M5

Член ►M19  3 ◄

Ако се установи, че органолептичните характеристики на маслиновото масло не отговарят на описанието им, заинтересуваните държави-членки, без да се засягат останалите санкции, налагат административно-финансови наказания, чийто размер се определя в зависимост от степента на констатираната нередност.

При оценяването на нередността се обръща специално внимание на естествените изменения в характеристиките на маслиновото масло, настъпващи при нормални условия на съхранение.

В началото на всяко полугодие държавите-членки информират Комисията за броя и вида на констатираните нередности и за наложените наказания през предходното полугодие.

▼M5

Член 4

▼M19

1.  The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2.  Когато държавите-членки изпитват затруднения при създаването на групи от дегустатори на тяхната територия, те могат да се обърнат към група от дегустатори, одобрени в друга държава-членка.

3.  Всяка държава-членка съставя списък на групите от дегустатори, създадени от професионални или междубраншови организации в съответствие с условията, установени в параграф 1 и гарантира, че тези условия се спазват.

▼M19 —————

▼B

Член 6

1.  Масленото съдържание на кюспето и другите остатъчни материали от добиването на маслиново масло (кодове по КН 2306 90 11 и 2306 90 19) се определя чрез използване на метода, изложен в приложение XV.

2.  Масленото съдържание, посочено в параграф 1, се изразява като процентно съотношение от теглото на маслото към теглото на сухото вещество.

▼M20

Член 7

Разпоредбите на Общността, отнасящи се до наличието на примеси се прилагат:

По отношение на халогенираните разтворители, ограниченията за всички категории маслиново масло са, както следва:

▼B

Член 8

1.  Държавите-членки уведомяват Комисията за предприетите мерки по прилагането на настоящия регламент.

2.  В началото на всяко полугодие държавите-членки изпращат на Комисията извлечение с аналитичните данни от тестовете, проведени в хода на предходното полугодие.

Резултатите се разглеждат от Управителния комитет по масла и мазнини в съответствие с процедурата, установена в член 39 от Регламент № 136/66/ЕИО.

Член 9

Регламент (ЕИО) № 1058/77 се отменя.

Член 10

1.  Настоящият регламент влиза в сила на третия ден след публикуването му в Официален вестник на Европейските общности.

Въпреки това методът, описан в приложение XII, се прилага от ►M1  1 ноември 1992 г. ◄ , освен за действия, свързани с режима на интервенция.

▼M5

Този метод не се прилага за необработено маслиново масло, подготвено за предлагане на пазара преди 1 ноември 1992 г.

▼B

2.  Настоящият регламент не се прилага спрямо маслиновото масло и маслиновото масло от остатъчен материал, опаковани преди неговото влизане в сила и пуснати на пазара до 31 октомври 1992.

Настоящият регламент е задължителен в своята цялост и се прилага пряко във всички държави-членки.

ПРИЛОЖЕНИЯ

Съдържание

▼M20 —————

▼B

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

▼M23

▼M23

ПРИЛОЖЕНИЕ I

ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ВИДОВЕТЕ МАСЛИНОВО МАСЛО

▼M20

ПРИЛОЖЕНИЕ Iа

Вземане на проби маслиново масло или маслиново масло от остатъчен материал при директно опаковане на не повече от 100 литра

Методът на вземане на проби се прилага за доставки на маслиново масло или маслиново масло от остатъчен материал, непревишаващи 125 000 литра, поставени в директни опаковки, непревишаващи 100 литра.

Ако доставката превишава 125 000 литра, тя трябва да бъде разделена на партиди от по 125 000 литра или по-малко. Ако доставката е по-малка от 125 000 литра, тя трябва да представлява една партида. След това методът се прилага за всяка партида.

Минималният брой на подлежащите на вземане първични проби се определя от размера на партидата в съответствие със съставената в точка 1 таблица.

Размерът на първичната проба се определя на базата на капацитета на директното пакетиране в съответствие със съставената в точка 2.1 таблица.

Доставката, първичната проба и лабораторната проба трябва да отговарят на определенията, посочени в стандарт EN ISO 5555.

Под „партида“ се разбира набор продажни единици, които са произведени, изработени и опаковани в условия, позволяващи маслото, съдържащо се във всяка продажна единица да бъде считано за хомогенно в смисъла на всички аналитични характеристики.

1.   БРОЙ НА НЕОБХОДИМИТЕ ПЪРВИЧНИ ПРОБИ

Минималният брой на необходимите първични проби се определя от размера на партидата в съответствие със следната таблица:

Избраните за формиране на първична проба директни опаковки трябва да бъдат съседни една на друга в партидата.

В случай на съмнение, държавите-членки увеличават броя на първичните проби, подлежащи на вземане.

2.   СЪДЪРЖАНИЕ НА ПЪРВИЧНИТЕ ПРОБИ

2.1   Първичните проби трябва да съдържат следното:

2.2.   Първичните проби следва да бъдат съхранявани в в директни опаковки до времето за анализ. След това масло в първичните проби се разделя на три лабораторни проби, за да могат да бъдат извършени:

2.3.   опаковките, съдържащи първични проби, се разделят в съответствие с националното законодателство.

3.   АНАЛИЗИ И РЕЗУЛТАТИ

▼M20

ПРИЛОЖЕНИЕ Iб

СХЕМА НА РЕШЕНИЯТА ЗА ПРОВЕРКА НА СЪВМЕСТИМОСТТА НА ПРОБАТА ОТ МАСЛИНОВО МАСЛО С ДЕКЛАРИРАНАТА КАТЕГОРИЯ

Анализът за проверка на съвместимостта на едно маслиново масло или маслиново масло от остатъчен материал с декларираната категория може да бъде извършен:

Анализите, свързани с примесите, необходими за проверка на съвместимостта със стандартите на Европейската Общност, трябва да бъдат извършени отделно.

Схемата на решенията важи за всички категории маслиново масло и маслиново масло от остатъчен материал. То се състои от таблици номерирани от 1 до 11, които трябва да бъдат третирани на базата на декларираната категория на въпросното масло в реда, определен в общата таблица.

Легенда за общите таблици до 11:

Обща таблица

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Таблица 6

Таблица 7

Таблица 8

Таблица 9

Таблица 10

Таблица 11

Допълнение 1

Таблица на сътоветствието между приложенията към настоящия регламент и анализите, определени в схемата на решения

Допълнение 2

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 7

Таблица 8

Таблица 11

▼B

ПРИЛОЖЕНИЕ II

▼M21

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СВОБОДНИТЕ МАСТНИ КИСЕЛИНИ, СТУДЕН МЕТОД

▼B

1.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА КИСЕЛИННОСТТА

Определянето на свободните мастни киселини в маслиновото масло. Съдържанието на свободни мастни киселини се изразява като стандартно изчислена киселинност.

1.1.   Принцип

Проба се разтваря в смес от разтворители и наличните свободни мастни киселини се титруват, като се използва етанолов разтвор на калиев хидроксид.

1.2.   Реактиви

Всички реактиви трябва да са с признато качество за аналитични цели, а водата, която се използва, да е или дестилирана, или с еквивалентна чистота.

1.3.   Апаратура

Обикновено лабораторно оборудване, включващо:

1.4.   Ход на опита

1.5.   Киселинност: изразена като процентно съдържание на олеинова киселина

Киселинността в проценти е равна на:

където:

Като резултат се приема средната аритметична стойност ►M6  от две калкулации ◄ .

ПРИЛОЖЕНИЕ III

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ПЕРОКИСНОТО ЧИСЛО

1.   ОБХВАТ

Стандартът описва метод за определянето на перокисното число на маслата и мазнините.

2.   ПРИЛОЖНО ПОЛЕ

Стандартът е приложим за животински и растителни масла и мазнини.

3.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Перокисното число е количеството на тези вещества в пробата, изразени в милиеквиваленти активен кислород на килограм, които окисляват калиевия йодид, съгласно описаната опитна постановка.

4.   ПРИНЦИП

Обработка на част от пробата в разтвор на оцетна киселина и хлороформ с разтвор на калиев йодид.

5.   АПАРАТУРА

Цялото оборудване трябва да е свободно от редуциращи или оксидиращи вещества.

Бележка: Не бива да се омазняват стените.

6.   РЕАКТИВИ

7.   ПРОБА

Пробата следва да се вземе и съхранява без достъп на светлина, на студено и да се съхранява в изцяло запълнени стъклени контейнери, херметично запечатани със запушалки от шлифовано стъкло или корк.

8.   ХОД НА ОПИТА

Опитът се провежда при разсеяна светлина или при изкуствено осветление. Измерва се в стъклена лопатка (5.1.) или, ако това е невъзможно, в колба (5.2.), с точност до 0,001 g, маса от пробата в съответствие със следната таблица, съгласно очакваното перокисно число:

Отпушва се колбата (5.2.) и се поставя стъклената лъжичка, съдържаща частта от пробата. Прибавят се 10 ml хлороформ (6.1.). Разтваря се частта от пробата чрез бързо разбъркване. Добавят се 15 ml оцетна киселина (6.2.) и след това — 1 ml разтвор на калиев йодид (6.3.). Поставя се бързо запушалката, разклаща се в продължение на една минута и се оставя в покой за точно пет минути, без достъп на светлина, при температура от 15 до 25 °C.

Прибавя се около 75 ml дестилирана вода. Титрира се освободеният йод с разтвор на натриев тиосулфат (6.4.) (0,002 Mol/L разтвор за очаквани стойности по-малки от 12 и 0,01 Mol/L разтвор за очаквани стойности над 12), като се разклаща енергично при използването на разтвор на скорбяла като индикатор.

Провеждат се две определяния на същата опитна проба.

Провежда се едновременно контролен опит. Ако резултатът от контролния опит превишава 0,05 ml от 0,01 Mol/L разтвор на натриев тиосулфат (6.4.) нечистите реактиви се подменят.

9.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Перокисното число (ПЧ), изразено в милиеквиваленти активен кислород на килограм, е представено чрез формулата:

където:

За резултат се приема средната аритметична стойност от две проведени определяния.

▼M21

ПРИЛОЖЕНИЕ IV

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА ПАРАФИНИ ЧРЕЗ КАПИЛЯРНА ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ

1.   ПРЕДМЕТ

Този метод описва способ за определяне на съдържанието на парафини в маслиново масло. Парафините се анализират съобразно броя въглеродни атоми. Методът може да се използва по-специално за диференциране на маслиновото масло, получено чрез пресоване, от това, което е получено чрез екстракция (маслиново масло от остатъчен материал).

2.   ПРИНЦИП

Мастното вещество, към което е добавен подходящ вътрешен стандарт, се фракционира чрез хроматография върху колонка от хидратиран силикагел; снема се фракцията, която първа се елуира в опитните условия (при полярност, по-ниска от тази на триглицеридите), след което се анализира директно чрез капилярна газова хроматография.

3.   ОБОРУДВАНЕ

4.   РЕАКТИВИ

5.   РАБОТЕН РЕЖИМ

5.1.   Подготовка на хроматографската колонка

Потопете 15 g силикагел (4.1) в n-хексан (4.2) и го поставете в колонката (3.2). Компенсирайте бързата седиментация с помощта на електрическа бъркалка (3.5), за да направите хроматографския пласт по-хомогенен. Перколирайте 30 ml n-хексан, за да отстраните евентуалните примеси. Претеглете с помощта на везните (3.8) точно 500 mg от пробата в ерленмайеровата колба с вместимост 25 ml (3.1), добавете нужното количество вътрешен стандарт (4.5), в зависимост от предполагаемото съдържание на парафини. Например, когато се касае за маслиново масло, добавете 0,1 mg лауринов арахидат, а когато става въпрос за маслиново масло от остатъчен материал — 0,25 до 0,5 mg. Прехвърлете така приготвената проба в хроматографската колонка с помощта на две дози n-хексан, всяка по 2 ml (4.2).

Оставете разтворителя да изтече, така че да достигне на 1 mm от горното ниво на абсорбента, след което перколирайте допълнително 70 ml n-хексан, за да отстраните естествено наличните n-алкани. После започнете хроматографското елуиране, събирайки 180 ml от сместа n-хексан/етилов етер, в съотношение 99:1, като поддържате дебит от около 15 капки на 10 секунди. Елуирането на пробата трябва да се извърши при стайна температура 22 ± 4 °C.

Бележки:

Изсушете така получената фракция в ротационен изпарител (3.6) до практически пълното отстраняване на разтворителя. Последните 2 ml от разтворителя се отстраняват с помощта на слаб азотен поток; след това добавете 2-4 ml n-хептан.

5.2.   Анализ чрез газова хроматография

5.2.1.   Предварителни операции

Поставете колонката в газовия хроматограф (3.3), свързвайки входния извод към системата on-column, а изходния — към детектора. Извършете основните проверки на апаратурата за газова хроматография (здравина на газовите контури, ефективност на детектора и на записващата система и т. н.).

Ако колонката се използва за първи път, се препоръчва да пристъпите към кондиционирането ѝ. Прокарайте през колонката малко газ, след което включете апаратурата за газова хроматография. Нагрейте постепенно до достигане, след около 4 часа, на температура 350 °C. Поддържайте тази температура в продължение на минимум 2 часа, след което пристъпете към настройката на апаратурата към условията на работа (настройка на газовия поток, запалване на пламъка, включване към електронното записващо устройство (3.3.4), настройка на температурата на камерата за колонката, на детектора и т. н.) и настройте сигнала на чувствителност поне 2 пъти по-висока от предвидената за провеждане на анализа. Ходът на основната линия трябва да бъде линеен, без пикове от каквото и да е естество, и не трябва да показва отклонения.

Отрицателното праволинейно отклонение е показател за неизправни връзки на колонката; положителното отклонение е показател за недостатъчно кондициониране на колонката.

5.2.2.   Избор на работните условия

Общо взето, работните условия, които следва да се спазват, са следните:

Тези условия могат да варират в зависимост от характеристиките на колонката и на газовия хроматограф по такъв начин, че да се постигне анализиране на всички парафини, задоволителна разделителна способност на пиковете (виж фигурата); времето на задържане на вътрешния стандарт C32 следва да бъде 18 ± 3 минути. Най-изразеният пик на парафините следва да се намира на минимум 60 % височина от основата на скалата.

Параметрите на интегриране на пиковете следва да се определят по начин, който позволява правилно изчисление на лицата на пиковете, взети под внимание.

Бележка. Като се има предвид високата крайна температура, се допуска положително отклонение, което не бива да надвишава 10 % височина от основата на скалата.

5.3.   Провеждане на анализа

С помощта на микроспринцовка с вместимост 10 μl вземете 1 μl от разтвора; издърпайте буталото на спринцовката, така че иглата да остане празна. Вкарайте иглата в инжекционния прибор и след 1—2 секунди бързо инжектирайте разтвора; след около 5 секунди бавно извадете иглата.

Проведете запис на анализа до пълното елуиране на парафините.

Основната линия следва винаги да отговаря на необходимите условия.

5.4.   Идентифициране на пиковете

Идентифицирането на различните пикове следва да се извършва въз основа на времената на задържане и в сравнение със смеси от парафини с познати времена на задържане, анализирани при същите условия.

Фигурата представя хроматограма на парафините в необработено маслиново масло.

5.5.   Количествено изчисление

С помощта на интегратора пристъпете към изчислението на лицата на пиковете на вътрешния стандарт и на алифатните естери от C40 до C46.

Изчислете съдържанието на парафин във всеки един от естерите, в mg/kg мастно вещество, по формулата:

където:

6.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Отбележете сумата на съдържанията на отделните парафини от C40 до C46, в mg/kg мастно вещество (ppm).

Забележка. Компонентите, които трябва да се определят, се отнасят до пиковете с четно въглеродно число между естерите C40 и C46, съгласно примера на хроматограмата на парафините в маслиновото масло, посочена на фигурата по-долу. Ако естерът C46 се появи двойно, се препоръчва за идентифицирането му да се анализира фракцията на парафините в маслиново масло от остатъчен материал, където пикът C46 се идентифицира лесно, тъй като е най-изразеният.

Резултатите се дават с точност до една десета.

Фигура

Хроматограма на парафините в маслиново масло ( 5 )

Легенда:

Допълнение

Определяне на линейната скорост на газа

Инжектирайте от 1 до 3 μl метан (или пропан) в газовия хроматограф след настройката му към нормални условия на работа. Засечете с хронометър времето, необходимо на газа да премине през колонката, от момента на инжектирането му до момента, в който пикът се очертае (tM).

Линейната скорост, в cm/s, се изчислява по формулата L/tM, където L е дължината на колонката в сантиметри, а tM е засеченото време в секунди.

▼B

ПРИЛОЖЕНИЕ V

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪСТАВА И СЪДЪРЖАНЕТО НА СТЕРОЛИ ЧРЕЗ КАПИЛЯРНОКОЛОНКОВА ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ

1.   ОБХВАТ

Методът описва процедура за определяне на отделното количество и общото количество на съдържанието на стероли в мастните вещества.

2.   ПРИНЦИП НА МЕТОДА

Мастното вещество, след добавянето на β-холестанол като вътрешен стандарт, се осапунява с етанолов разтвор на калиев хидроксид и неосапуняемите съставки се екстрахират с помощта на диетилов етер.

Стероловата фракция се отделя от неосапуняемия екстракт чрез хроматография на основна плака със силикагел. Стеролите, възстановени от силикагела, се преобразуват в триметилсилил етери и се анализират чрез капилярно-колонкова газова хроматография.

3.   АПАРАТУРА

4.   РЕАКТИВИ

5.   ХОД НА ОПИТА

6.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

ДОПЪЛНЕНИЕ

Определяне на линейната скорост на газа

1 до 3 μl метан (или пропан) се инжектират в газовия хроматограф, настроен на нормални условия за работа, и се измерва времето, необходимо на метана или пропана за преминаване през колонката от момента на инжектиране до момента на появяване на пика (tM).

Линейната скорост на газа, в cm/sec, е представена чрез L/tM, където L е дължината на колоната, в сантиметри, а tM е измереното времето, в секунди.

Фигура 1

Газова хроматограма на стероловата фракция на нерафинирано маслиново масло

Фигура 2

Газова хроматограма на стероловата фракция на рафинирано маслиново масло

ПРИЛОЖЕНИЕ VI

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА ЕРИТРОДИОЛ И УВАОЛ

ВЪВЕДЕНИЕ

Еритродиолът (често подразбиран като гликолите еритродиол и уваол взети заедно) е съставка на неосапуняемата фракция, характерна за някои типове мастни вещества. Намира се в значително високи концентрации в екстрахираното с разтворители маслиново масло и в други масла, такива като пресованото маслиново масло и маслото от семената на гроздето, които също го съдържат, така че неговото наличие може да показва наличието на екстрахирано с разтворители маслиново масло.

1.   ОБХВАТ

Методът описва процедура за откриване на еритродиол в мастни вещества.

2.   ПРИНЦИП НА МЕТОДА

Мастното вещество се осапунява с етанолов разтвор на калиев хидроксид. След това неосапуняемата фракция се екстрахира с диетилов етер и се пречиства чрез пасиране върху колона от диалуминиев триоксид.

След това неосапуняемите вещества се подлагат на тънкослойна хроматография върху плаки със силикагел, докато ивиците, съответстващи на стероловата и еритродиоловата фракция, се разделят. Стеролите и еритродиолът, възстановени от плаката, се преобразуват в триметилсилил етери и сместа се анализира чрез газова хроматография.

Резултатът се изразява като процентното съдържание на еритродиол в сместа от еритродиол и стероли.

3.   АПАРАТУРА

4.   РЕАКТИВИ

5.   ХОД НА ОПИТА

5.1.   Подготовка на неосапуняемите вещества

Както е описано в параграф 5.1.2. от приложение V.

5.2.   Отделяне на еритродиола и стеролите.

5.3.   Подготовка на триметилсилил естерите

Както е описано в параграф 5.3. от приложение V.

5.4.   Газовохроматографски анализ

Както е описано в параграф 5.4. на гореописания метод. Условията за работа на газовият хроматограф при анализа трябва да са такива, че да се извърши стероловият анализ и да се отделят ТМСЕ от еритродиола и уваола.

След като пробата е била инжектирана, записването се продължава докато наличните стероли, еритродиолът и уваолът бъдат отмити. След това се идентифицират пиковете (времената за задържане на еритродиола и уваола, отнесени към β-ситостерола, са съответно около 1,45 и 1,55) и се изчисляват лицата както при стеролите.

6.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

където:

Резултатът се изразява до една цифра след десетичната запетая.

▼M21

ПРИЛОЖЕНИЕ VII

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ПРОЦЕНТНОТО СЪДЪРЖАНИЕ НА 2-ГЛИЦЕРИЛ МОНОПАЛМИТАТ

1.   ПРЕДМЕТ И СФЕРА НА ПРИЛОЖЕНИЕ

Този метод описва аналитичната процедура за определяне на процентното съдържание на палмитинова киселина в позиция 2 на триглицеридите посредством анализа на 2-глицерил монопалмитат.

Методът е приложим за течни растителни масла при стайна температура (20 °C).

2.   ПРИНЦИП

След подготовката ѝ маслената проба се подлага на въздействието на панкреатична липаза: частична хидролиза, специфична за позиции 1 и 3 на молекулата на триглицерида, води до появата на моноглицериди в позиция 2. Процентното съдържание на 2-глицерил монопалмитат в моноглицеридната фракция се определя, след силилация, посредством капилярна газова хроматография.

3.   АПАРАТУРА И ЛАБОРАТОРНО ОБОРУДВАНЕ

4.   РЕАКТИВИ

5.   ПРОЦЕДУРА

5.1.   Подготовка на пробата

5.2.   Хидролиза с панкреатична липаза

5.3.   Подготовка на силанизираните деривати и на газовата хроматография

5.4.   Газова хроматография

Условията на работа са следните:

5.4.1.   Идентифициране на пиковете

Идентифицирането на индивидуалните моноглицериди се извършва в съответствие с получените времена на задържане и в сравнение със стандартните смеси моноглицериди, анализирани при същите условия.

5.4.2.   Количествена преценка

Лицето на всеки пик се изчислява с помощта на електронен интегратор.

6.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Процентното съдържание на глицерил монопалмитат се изчислява от съотношението между лицето на съответния пик и сбора от лицата на пиковете на всички моноглицериди (виж фигура 2) по формулата:

където:

Резултатът се дава с точност до една десета.

7.   ПРОТОКОЛ ОТ АНАЛИЗА

Протоколът от анализа следва да посочва:

Фигура 1

Хроматограма на продуктите от реакцията на силанизация, получени чрез действието на липазата върху рафинирано маслиново масло, към което е добавено 20 % естерифицирано масло (100 %)

Легенда: „acides gras libres“ = свободни мастни киселини; „Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée“ = рафинирано маслиново масло + 20 % естерифицирано масло; „1-2 monopalmitoléine“ = 1-2 монопалмитолеин; „1-2 mono C18 insat.“ = 1-2 моно C18 ненаситени; „squalene“ = скуален

Фигура 2

Хроматограма на:

A)

неестерифицирано маслиново масло, след липаза; след силанизация; в тези условия (капилярна колонка 8—12 m) парафиновата фракция се елуира едновременно с диглицеридната фракция или малко след това. След липаза съдържанието на триглицериди не би следвало да надвишава 15 %. Легенда: 1 = Свободни мастни киселини 2 = Моноглицериди 3 = Диглицериди 4 = Триглицериди * = 2-монопалмитин ** = Триглицерид C54

Хроматограма на:

Б)

естерифицирано масло след липаза; след силанизация; в тези условия (капилярна колонка 8—12 m), парафиновата фракция се елуира едновременно с диглицеридната фракция или малко след това. След липаза съдържанието на триглицериди не би следвало да надвишава 15 %. Легенда: 1 = Свободни мастни киселини 2 = Моноглицериди 3 = Диглицериди 4 = Триглицериди * = 2-монопалмитин ** = Триглицерид C54

8.   БЕЛЕЖКИ

В търговската мрежа се предлагат липази със задоволителна липазна активност. Възможно е и да бъдат приготвени лабораторно по следния начин:

Охладете до 0 °C 5 kg пресен свински панкреас. Отстранете околните твърда мазнина и съединителна тъкан и раздробете добре в ножова мелница до получаване на гладка кремообразна смес. Разбъркайте в продължение на 4 до 6 часа с 2,5 литра безводен ацетон, след което центрофугирайте. Екстрахирайте утайката още три пъти със същото количество безводен ацетон, след това два пъти със смес от равни части ацетон и диетилов етер и два пъти с диетилов етер.

Изсушете остатъка под вакуум за 48 часа до получаването на устойчив прах, който трябва да се съхранява в хладилник и на сухо.

Пригответе емулсия от маслиново масло, както следва:

Разбъркайте в смесител в продължение на 10 минути смес от 165 ml от разтвор на гуми арабика при 100 g/l, 15 g натрошен лед и 20 ml предварително неутрализирано маслиново масло.

Сипете последователно в бехерова чаша с вместимост 50 ml 10 ml от тази емулсия, а след това 0,3 ml разтвор на натриев холат при 0,2 g/ml и 20 ml дестилирана вода.

Поставете бехеровата чаша в термостат, настроен на 37 °C; потопете електродите на pH метъра и спиралната бъркалка.

Прибавете, капка по капка, с помощта на бюрета, разтвор на натриев хидроокис (0,1 N), докато pH достигне 8,3.

Добавете един обем водна суспензия на липазен прах (0,1 g/ml липаза). Веднага щом pH метърът покаже pH 8,3, включете хронометъра и добавете разтвора на натриевия хидроокис, капка по капка, така че да се поддържа pH от 8,3. Отчитайте всяка минута обема на консумирания разтвор.

Нанесете данните в координатна система, чиято абсциса съответства на времето, а ординатата ѝ — на милилитрите алкален разтвор (0,1 N), нужни за поддържането на постоянно pH. Трябва да се получи линейна графика.

Активността на липазата, измерена в липазни единици/mg, се изчислява по следната формула:

където:

Единица липаза се дефинира като количеството ензим, което отделя 10 микроеквивалента киселина в минута.

▼M20 —————

▼B

ПРИЛОЖЕНИЕ IX

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧНО ИЗСЛЕДВАНЕ В УЛТРАВИОЛЕТОВИЯ СПЕКТЪР

ПРЕДИСЛОВИЕ

Спектрофотометричното изследване в ултравиолетовия спектър може да осигури информация за качеството на дадена мазнина, състоянието ѝ на запазеност и промените, настъпили в нея при технологичните процеси.

Абсорбцията на вълните с дължина, упомената в метода, е вследствие на конюгирани системи от диени и триени. Тези абсорбции са изразени като специфични екстинкции Е1 % 1 cm (екстинкцията на 1 % разтвор на мазнината в упоменатия разтворител, при дебелина на слоя 1 cm), обикновено обозначавани като К (наричан още „коефициент на екстинкция“).

1.   ОБХВАТ

Методът описва процедурата за извършване на спектрофотометрично изследване на маслиново масло в ултравиолетовия спектър.

2.   ПРИНЦИП НА МЕТОДА

Въпросната мазнина се разтваря в нужния разтворител и след това екстинкцията на разтвора се определя при определени дължини на вълната срещу чистия разтворител. Специфичните екстинкции се изчисляват от спектрофотометричните показания.

3.   ОБОРУДВАНЕ

▼M6

▼B

4.   РЕАКТИВИ

5.   ХОД НА ОПИТА

6.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

ДОПЪЛНЕНИЕ I

Приготвяне на диалуминиевия триоксид и изпитване на неговата активност

А.1.1.   Приготвяне на диалуминиевия триоксид

Поставя се диалуминиевият триоксид, който е бил предварително изсушен в пещ при 380 до 400 °С, за три часа в херметично затворен контейнер, добавя се дестилирана вода в съотношение 5 ml за 100 g диалуминиев триоксид, веднага се затваря контейнерът, разклаща се непрекъснато, след което се оставя да престои поне 12 часа преди употреба.

А.1.2.   Проверка на активността на диалуминиевия триоксид

Подготвя се хроматографска колонка с 30 g диалуминиев триоксид. Като се работи, както е описано в параграф 5.4., се пасира смес, състояща се от:

през колонката.

Ако след пасиране през колонката сместа има специфична екстинкция от повече от 0,11 при 268 nm, диалуминиевият триоксид се допуска за работа, ако не е — нивото на дехидратация трябва да се увеличи.

ДОПЪЛНЕНИЕ II

Калибриране на спектрофотометъра

ПРИЛОЖЕНИЕ X A

ГАЗОВОХРОМАТОГРАФСКИ АНАЛИЗ НА МЕТИЛОВИТЕ ЕСТЕРИ НА МАСТНИТЕ КИСЕЛИНИ

1.   ОБХВАТ

Този метод дава общи насоки за прилагането на газова хроматография, като се използват запълнени или капилярни колонки за определяне на качествения и количествен състав на сместа от метилови естери на мастните киселини, получени в съответствие с метода, указан в приложение X Б.

Методът не е приложим за полимеризирани мастни киселини.

2.   РЕАКТИВИ

2.1.   Газ носител

Инертен газ (азот, хелий, аргон, водород и т.н.), щателно подсушен и с кислородно съдържание не по-малко от 10 mg/kg.

Бележка 1: Водородът, който се използва само с капилярни колонки, може да удвои скоростта на анализа, но е опасен. Достъпни са средства за безопасност.

2.2.   Спомагателни газове

2.3.   Референтен стандарт

Смес от метилови естери на химически чисти мастни киселини или метиловите естери на мазнина с известен състав, за предпочитане по-близък до този на мастното вещество, което ще се анализира.

Трябва да се вземат мерки за предотвратяване на оксидирането на полиненаситените мастни киселини.

3.   АПАРАТУРА

Дадените инструкции се отнасят до обикновеното оборудване, използвано за газова хроматография, включващо запълнени и/или капилярни колонки и детектор за пламъчна йонизация. Всеки апарат, показващ ефективността и разделителната способност, указани в 4.1.2., е подходящ.

3.1.   Газов хроматограф

Газовият хроматограф се състои от следните елементи.

3.1.1.   Система за инжектиране

Използва се система за инжектиране или:

Бележка 2: При отсъствието на мастни киселини с по-малко от 16 въглеродни атома, може да се използва инжектор с подвижна игла.

3.1.2.   Пещ

Пещта трябва да е в състояние на нагрява колонката до температура от поне 260 °С и да поддържа желаната температура с точност до 1 °С за запълнена колонка и с точност до 0,1 °С за капилярна колонка. Последното изискване е особено важно, когато се използва епруветка от кварц.

Използването на програмирано температурно нагряване се препоръчва във всички случаи и в частност за мастни киселини с по-малко от 16 въглеродни атома.

3.1.3.   Запълнена колонка

3.1.4.   Капилярна колонка

3.2.   Спринцовка

Спринцовката трябва да има максимална вместимост 10 μl и да е градуирана на деления от 0,1 μl.

3.3.   Записващо устройство

Ако ще се използва кривата от записващото устройство за изчисляване на състава на анализираната смес, се изисква електронно записващо устройство с висока прецизност, съвместимо с използвания апарат. Записващото устройство трябва да има следните характеристики:

3.4.   Интегратор

С помощта на електронен интегратор могат да се извършват бързи и точни изчисления. Настоящият трябва да дава линеен отговор с адекватна чувствителност, а корекцията на изместването на основната линия трябва да е задоволителна.

4.   ХОД НА ОПИТА

Дейностите, описани от 4.1. до 4.3., се отнасят до използването на детектор с пламъчна йонизация.

Като алтернатива може да се използва газов хроматограф, използващ катарометричен детектор (работещ на принципа на промяна в топлинната проводимост). Условията за работа тогава се изменят, както е описано в клауза 6.

4.1.   Условия на опита

4.2.   Размер на пробата

С помощта на спринцовката (3.2.) се изтеглят 0,1 до 2 μl от разтвора на метиловите естери, приготвен съгласно приложение X Б, и се инжектират в колонката.

В случай, че естерите не са включени в разтвор, се приготвя разтвор в хептан с чистота за хроматография в концентрация от приблизително 100 mg/ml и се инжектират 0,1 до 1 ml от настоящия разтвор.

Ако се провежда анализ за съставките, налични само като следи, размерът на пробата може да се увеличи (до 10 пъти).

4.3.   Анализ

Най-общо условията на работа трябва да са тези, определени в 4.1.1.

Независимо от това е възможно да се работи при по-ниска температура на колонката, когато се изисква определянето на мастни киселини с по-малко от 12 въглеродни атома, или при по-висока температура, когато се определят мастни киселини с повече от 20 въглеродни атома. Понякога е възможно да се използва автоматично регулиране на температурата и в двата случая. Например ако пробата съдържа метиловите естери на мастни киселини с по-малко от 12 въглеродни атома, пробата се инжектира при 100 °С (или при 50 до 60 °С ако има наличие на маслена киселина), а температурата веднага се повишава със скорост 4 до 8 °С/min до оптимума. В определени случаи двете процедури могат да се съчетават.

След програмираното повишаване на температурата, отмиването се продължава при постоянна температура до отмиването на всички съставки. Ако уредът не разполага с автоматично регулиране на температурата, той се използва при две фиксирани нива на температурата между 100 и 195 °С.

Ако е необходимо, се препоръчва извършване на анализ върху две неподвижни фази с различни полярности за потвърждаването на отсъствието на маскирани пикове, например в случай че има едновременно наличие на чифтови С18:3 и С20:0 или С18:3 и С18:2.

4.4.   Изготвяне на референтната хроматограма и на референтните графики

Анализира се референтната стандартна смес (2.3.) при използването на същите условия на работа като тези, използвани за пробата, и се измерват времената за задържане или разстоянията на задържане за съставните мастни киселини. Построяват се на полулогаритмична хартия, за всяко ниво на ненаситеност, графиките, показващи логаритъма на времето на задържане като функция на броя на въглеродните атоми. При изотермални условия, графиките за правоверижните киселини с еднакво ниво на ненаситеност трябва да са прави линии. Тези линии трябва да са приблизително успоредни.

Необходимо е да се избягват условия, поради съществуването на „маскирани пикове“, при които разделителната способност не позволява разделянето на двете съставки.

5.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

5.1.   Качествен анализ

Разпознават се пиковете на метиловите естери за пробата от графиките, изготвени в 4.4., ако е необходимо чрез интерполация.

5.2.   Количествен анализ

5.2.1.   Определяне на състава

Освен в изключителни случаи, се използва вътрешният метод за нормализация, т.е. приема се, че всички съставки са представени на хроматограмата, така че сборът от лицата под пиковете представлява 100 % от съставките (общо отмиване).

Ако оборудването включва интегратор, използват се данните, получени от него. Ако ли не, определя се лицето под всеки пик чрез умножаване на височината на пика по неговата ширина при средата на височината, а където е необходимо, се вземат предвид различните намалявания, използвани по време на записа.

5.2.2.   Метод за изчисляване

▼M2

6.   СПЕЦИАЛЕН СЛУЧАЙ — ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ТРАНСИЗОМЕРИ

Възможно е да се определи съдържанието на трансизомерите в мастни киселини с брой на въглеродните атоми между 10 и 24 чрез разделяне на метиловите естери като се използват газхроматографски капилярни колони със специфична полярност.

▼M21

▼M2

6.4.

Идентификацията на различните метилови естери се извършва въз основа на времената на задържане, които се сравняват с тези на сравнителните смеси (както е показано в точка 2.3.) Естерите на трансмастните киселини се извличат преди съответните цисизомери. На фигура 2 е даден пример за хроматограма. Фигура 2: Газхроматограма на трансизомерите на мастна киселина, като се използва капилярна колона 18 :2 CC solvente 18 :1 C 16 :0 18 :0 18 :1 W7 C 18 :3 CCT 18 :3 CTC 18 :3 TCC 18 :3 TCT 18 :2 TT 18 :2 CT 18 :2 TC 18 :1 T 18 :3 CCC 16 : 1 C

▼B

►M2  7. ◄    СПЕЦИАЛЕН СЛУЧАЙ — ИЗПОЛЗВАНЕ НА КАТАРОМЕТРИЧЕН ДЕТЕКТОР (РАБОТЕЩ НА ПРИНЦИПА НА ПРОМЕНИТЕ В ТОПЛИННАТА ПРОВОДИМОСТ)

Газов хроматограф, използващ детектор, работещ на принципа на промените в топлинната проводимост (катарометър), може също да се използва за определяне на качествения и количествен състав на сместа от метилови естери на мастните киселини. Ако се използва такъв, условията, определени в клауза 3 и клауза 4, трябва да се изменят, както е показано в таблица 3.

За количествен анализ се използват факторите за корекция, определени в 5.2.2.2.

►M2  8. ◄    ДОКЛАД ЗА ОПИТА

Докладът за опита трябва да описва методите, използвани за приготвянето на метиловите естери, за газовия хроматографски анализ и за получените резултати. Също така той трябва да включва всички подробности около извършването, които не са упоменати в настоящия Международен стандарт, или разгледани като незадължителни, както и подробности относно всички инциденти, които може да са повлияли на резултатите.

Докладът за опита трябва да включва цялата информация, необходима за пълното разпознаване на пробата.

▼M19

ANNEX X B

PREPARATION OF THE FATTY ACID METHYL ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

The following two methods are recommended for preparing the fatty acid methyl esters from olive oils and olive-pomace oils:

Method A : Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

Method B : Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium.

Each method will be applied according to the analytical parameter to be determined and the oil category as indicated below:

PURIFICATION OF OIL SAMPLES

When necessary, the samples will be purified by passing the oil through a silica gel column, eluting with hexane/diethyl ether (87:13, v/v) as described in IUPAC method 2.507.

Alternatively, solid-phase extraction on silica gel phase cartridges can be used. A silica gel cartridge (1 g, 6 ml) is placed in a vacuum elution apparatus and washed with 6 ml of hexane. The vacuum is released to prevent the column from becoming dry and then a solution of the oil (0,12 g approximately) in 0,5 ml of hexane is loaded into the column and vacuum is applied. The solution is pulled down and then eluted with 10 ml of hexane/diethyl ether (87:13 v/v) under vacuum. The combined eluates are homogenised and divided in two similar volumes. An aliquot is evaporated to dryness in a rotary evaporator under reduced pressure at room temperature. The pomace is dissolved in 1 ml of heptane and the solution is ready for fatty acid analysis by GC. The second aliquot is evaporated and the pomace is dissolved in 1 ml of acetone for triglyceride analysis by HPLC, if necessary.

METHODS FOR PREPARING THE FATTY ACID METHYL ESTERS

1.   Method A: Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

1.1.   Purpose

This rapid method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free fatty acid content of less than 3,3 %. Free fatty acids are not esterified by potassium hydroxide. Fatty acid ethyl esters are trans-esterified at a lower rate than glyceridic esters and may be only partially methylated.

1.2.   Principle

Methyl esters are formed by trans-esterification with methanolic potassium hydroxide as an intermediate stage before saponification takes place (title 5 in ISO-5509:2000, title 5 in IUPAC method 2.301).

1.3.   Reagents

Methanol containing not more than 0,5 % (m/m) water.

Heptane, chromatographic quality.

Potassium hydroxide, approximately 2 N methanolic solution: dissolve 11,2 g of potassium hydroxide in 100 ml of methanol.

1.4.   Apparatus

Screw-top test tubes (5 ml volume) with cap fitted with a PTFE joint.

Graduated or automatic pipettes, 2 ml and 0,2 ml

1.5.   Procedure

In a 5 ml screw-top test tube weigh approximately 0,1 g of the oil sample. Add 2 ml of heptane, and shake. Add 0,2 ml of 2 N methanolic potassium hydroxide solution, put on the cap fitted with a PTFE joint, tighten the cap, and shake vigorously for 30 seconds. Leave to stratify until the upper solution becomes clear. Decant the upper layer containing the methyl esters. The heptane solution is suitable for injection into the gas chromatograph. It is advisable to keep the solution in the refrigerator until gas chromatographic analysis. Storage of the solution for more than 12 hours is not recommended.

2.   Method B: Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium

2.1.   Purpose

This method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free fatty acid content of more than 3,3 %.

2.2.   Principle

Neutralisation of the free fatty acids and alkaline methanolysis of the glycerides, followed by esterification of the fatty acids in acid medium (title 4.2. in IUPAC method 2.301).

2.3.   Reagents

2.4.   Apparatus

2.5.   Procedure

Transfer about 0,25 g of the oil sample into a 50 ml ground-necked volumetric flask. With the aid of a funnel, add 10 ml of 0,2 N sodium methylate in methanol and the boiling chips. Fit a reflux condenser, shake, and bring to the boil. The solution should become clear, which usually occurs in about 10 minutes. The reaction is complete after 15 minutes. Remove the flask from the source of heat, wait until the reflux stops, remove the condenser, and add two drops of phenolphthalein solution. Add a few ml of 1 N sulphuric acid in methanol solution until the solution becomes colourless and then add 1 ml in excess. Fit the condenser and boil again for 20 minutes. Withdraw from the source of heat and cool the flask under running water. Remove the condenser, add 20 ml of saturated sodium chloride solution, and shake. Add 5 ml of heptane, plug the flask, and shake vigorously for 15 seconds.

Leave to settle until the two phases have separated. Add saturated sodium chloride solution again until the aqueous layer reaches the lower end of the flask neck. The upper layer containing the methyl esters fills the flask neck. This solution is ready to be injected in the GC.

Caution: Methylation by method B must be done under a hood.

2.6.   Alternatives to methylation Method B

2.6.1.   Method C

2.6.1.1.   Principle

The fatty matter undergoing analysis is treated with methanol-hydrochloric acid, in a sealed vial, at 100 °C.

2.6.1.2.   Apparatus

2.6.1.3.   Reagents

Solution of hydrochloric acid in 2 % methanol. This is prepared from gaseous hydrochloric acid and anhydrous methanol (Note 1).

Hexane, chromatographic quality.

Commercial solutions of hydrogen chloride in methanol can be used. Small amounts of gaseous hydrochloric acid can easily be prepared in the laboratory by simple displacement from the commercial solution (p = 1,18) by dripping concentrated sulphuric acid. Since hydrochloric acid is very rapidly absorbed by methanol, it is advisable to take the usual precautions when dissolving it, e.g. introduce the gas through a small inverted funnel with the rim just touching the surface of the liquid. Large quantities of methanolic hydrochloric acid solution can be prepared in advance, as it keeps perfectly in glass-stoppered bottles stored in the dark. Alternatively, this reagent can be prepared by dissolution of acetyl chloride in anhydrous methanol.

2.6.1.4.   Procedure

2.6.2.   Method D

2.6.2.1.   Principle

The fatty matter undergoing analysis is heated under reflux with methanol-hexane-sulphuric acid. The methyl esters obtained are extracted with petroleum ether.

2.6.2.2.   Apparatus

2.6.2.3.   Reagents

2.6.2.4.   Procedure

Place 0,1 g of oil in the 20 ml test tube and add 5 ml of methylation reagent.

Fit the reflux condenser and heat for 30 minutes in a boiling water bath (Note 2).

Transfer quantitatively the mixture into a 50 ml separating funnel, with the aid of 10 ml distilled water and 10 ml petroleum ether. Shake vigorously, and allow the phases to separate, remove the aqueous phase and wash the ether layer twice with 20 ml distilled water. Add to the separating funnel a small quantity of anhydrous sodium sulphate, shake, allow to settle for a few minutes and filter, collecting the filtrate in a 15 ml test tube with a conical base.

Evaporate the solvent over a water bath in a current of nitrogen.

To control boiling, insert a glass rod into the test tube and limit the temperature of the water bath to 90 °C.

3.   Precision parameters

The statistical evaluation of the precision of methods A and B was published by the International Olive Oil Council in its method COI/T.20/CO. No 24.

RECOMMENDATIONS FOR GAS CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS OF THE FATTY ACID ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

1.   Procedure

The gas chromatographic analysis of solutions of fatty esters in heptane is to be carried out according to standard ISO-5508 using a capillary column (50 m length x 0,25 or 0,32 mm i.d.) impregnated with cyanopropylsilicone phase as indicated for the determination of fatty acid trans-isomers (COI/T.20/Doc. no. 17).

Figure 1 gives the typical gas chromatographic profile of an olive-pomace oil containing methyl and ethyl esters of fatty acids, and trans-isomers of methyl esters.

2.   Calculations

2.2.

For the calculation of the percentage of trans-C18:1 the peak corresponding to the methyl esters of this fatty acid is to be used. For the sum [trans-C18:2 + trans-C18:3], all the peaks corresponding to the trans-isomers of these two fatty acids are to be added together. For the calculation of the total area, all the peaks mentioned in 2.1. are to be taken into account (see COI/T.20/Doc. No. 17). The calculation of the percentage of each fatty acid will be carried out according to the formula: Figure 1: Gas chromatographic profile obtained by the cold methylation method from olive-pomace oil. The chromatographic peaks correspond to the methyl and ethyl esters except where otherwise indicated.

▼B

ПРИЛОЖЕНИЕ XI

ОПРЕДЕЛЯНЕ СЪДЪРЖАНИЕТО НА ЛЕТЛИВИТЕ ХАЛОГЕНИРАНИ РАЗТВОРИТЕЛИ В МАСЛИНОВОТО МАСЛО

1.   МЕТОД

Газов хроматографски анализ по способа на височинния газов обем.

2.   ОБОРУДВАНЕ

3.   РЕАКТИВИ

Стандартни: халогенирани разтворители със степен на чистота, подходящи за газова хроматография.

4.   ХОД НА ОПИТА

▼M22

ПРИЛОЖЕНИЕ XII

МЕТОД НА МЕЖДУНАРОДНИЯ СЪВЕТ ЗА МАСЛИНОВОТО МАСЛО ЗА ОРГАНОЛЕПТИЧЕН АНАЛИЗ НА НЕОБРАБОТЕНО МАСЛИНОВО МАСЛО

1.   ЦЕЛ И ОБЛАСТ НА ПРИЛОЖЕНИЕ

Настоящият метод се основава на Решение № DEC-21/95-V/2007 от 16 ноември 2007 г. относно преразгледания метод на Международния съвет за маслиновото масло за органолептичен анализ на необработеното маслиново масло. Той има за цел да установи процедура за анализ на органолептичните свойства на необработеното маслиново масло по смисъла на приложение XVI, точка 1 от Регламент (ЕО) № 1234/2007 и да установи метод за тяхното класифициране въз основа на тези характеристики. Методът съдържа също така указания за етикетиране по избор.

Описаният метод се прилага само за необработеното маслиново масло и за неговото класифициране или етикетиране в зависимост от интензитета на разграничените недостатъци, на вкуса на плодове и на другите положителни признаци, определени от подбрани, обучени и проверени дегустатори, които работят в група.

2.   ОБЩИ ПОЛОЖЕНИЯ

По отношение на общия основен речник, залата за дегустация, чашата за дегустация на маслиново масло и всички останали въпроси, свързани с настоящия метод, се препоръчва да се спазват изискванията на Международния съвет за маслиновото масло, и по-специално тези, предвидени в Решение № DEC-21/95-V/2007 от 16 ноември 2007 г. относно преразгледания метод за органолептичен анализ на необработеното маслиново масло.

3.   СПЕЦИФИЧЕН РЕЧНИК

3.1.   Положителни признаци

съвкупност от усещанията, свързани с обонянието, характерни за маслиновото масло, в зависимост от сорта на маслините, произтичащи от здрави и пресни маслини, зелени или зрели, възприети пряко и/или непряко през носа.

Признакът „с вкус на плодове“ се категоризира като вкус на зелен плод, когато усещанията, свързани с обонянието, напомнят тези от зелените плодове, характерни за маслото, получено от зелени плодове.

Признакът „с вкус на плодове“ се категоризира като вкус на зрял плод, когато усещанията, свързани с обонянието, напомнят тези от зрелите плодове, характерни за маслото, получено от зелени и зрели плодове.

Горчив : основен вкус, характерен за масло, получено от зелени маслини или от маслини в начален стадий на зреене, възприет от рецепторите във V-образната част на езика.

Стипчив : сложното усещане за стягане и щипене в устата, характерно за масло, произведено в началото на кампанията, предимно от все още зелени маслини, което може да се възприеме чрез цялата устна кухина и в частност чрез гърлото.

3.2.   Отрицателни признаци

Мухлясало/кални отлагания : характерен вкус на масло, получено от маслини, складирани на купчини или съхранявани при такива условия, че са достигнали напреднал стадий на анаеробна ферментация или на масло, което е било в контакт с отложена „кал“, в която също се е развил процес на анаеробна ферментация в бъчвите и подземните цистерни.

Плесен—влага : характерен вкус на масло, получено от маслини, в които са се развили големи количества плесен и ферменти поради съхранението на плодовете на влага в продължение на няколко дни.

Винено-оцетен/кисело-горчив : характерен за някои видове масло вкус, който напомня за вино или оцет. Дължи се основно на образуването на ацетатна киселина, етил ацетат и етанол в резултат на процес на окисляване на маслините или на кюспето, пресовани в недостатъчно добре измити съдове.

Металически : вкус, който напомня за метал. Характерен за масло, престояло в продължителен контакт с метални повърхности при нарязването, смесването, пресоването или съхранението.

Граниво : вкус на масло, преминало през интензивен процес на самоокисляване.

Затоплено или прегорено : характерен вкус на масло, предизвикан от прекалено и/или продължително загряване при получаването, особено когато пастираното вещество се смесва температурно, ако това е извършено при неподходящи температурни условия.

Сено—дърво : характерен вкус на някои масла, получени от сухи маслини.

Груб : характерен за някои стари масла, които в устата създават усещане за плътност и кашкавост.

Мазно : вкус на масло, който напомня вкуса на петролни продукти, смазочни материали или минерални масла.

Зеленчукова вода : вкус, придобит от масло в резултат на продължителен контакт със зеленчуковата вода, в която е започнал процес на ферментация.

Саламура : вкус на масло, извлечено от маслини, които са държани в солен разтвор.

Коило : характерен вкус на масло, получено от маслини, които са били пресовани върху нови подложки от коило. Вкусът може да се различава в зависимост от това, дали подложките са направени от зелено или сушено коило.

С мирис на почва : вкус на масло, получено от маслини, които са били събрани кални или покрити с почва, без да бъдат измити.

С вкус на ларви : вкус на масло, получено от маслини, които са били нападнати и силно заболели от ларвата на маслиновата мушичка (Bactrocera Oleae).

Краставица : вкус, получен, когато маслото е престояло пакетирано херметически прекалено дълго, най-вече в тенекиени кутии, и който се дължи на образуването на 2,6 нонадиенал.

Влажно дърво : вкус, характерен за масло, извлечено от маслини, замръзнали на дървото.

3.3.   Терминология за използване по избор при етикитирането

При поискване организаторът на групата дегустатори може да удостовери, че изпитваните масла съответстват на определенията и скалите, които отговарят на следните изрази и прилагателни в зависимост от интензитета и възприятието на признаците:

4.   ГРУПА ДЕГУСТАТОРИ

Групата дегустатори се състои от организатор на групата и от 8 до 12 дегустатори.

Организаторът на групата трябва да е преминал стабилно обучение и да е познавач и компетентен специалист по различните видове масло. Той носи отговорност за групата, за организацията и функционирането ѝ, подготвянето, кодирането и представянето на пробите на дегустаторите, както и за събирането и статистическата обработка на данните.

Организаторът на групата дегустатори подбира дегустаторите и се грижи за обучението им и контрола на тяхната работа, за да гарантира запазването на способностите им на необходимото равнище.

Дегустаторите за органолептичните проверки на маслиновото масло трябва да бъдат подбрани и обучени в зависимост от тяхната способност да правят разлика между подобни проби в съответствие с ръководството на Международния съвет за маслиновото масло за подбора, обучението и контрола на квалифицираните дегустатори на необработени маслинови масла.

Групите дегустатори трябва да се ангажират да участват в органолептичните оценки, предвидени на национално и международно равнище, както и на равнището на Общността за периодичен контрол и хармонизиране на критериите за възприятие. Освен това в случай на групи дегустатори, одобрени съгласно разпоредбите на член 4, параграф 1 от настоящия регламент, те трябва всяка година да предоставят на съответната държава-членка цялата информация относно техния състав и броя на извършените оценки в качеството им на одобрени групи дегустатори.

5.   ПРОЦЕДУРА ЗА ОРГАНОЛЕПТИЧНА ОЦЕНКА И КЛАСИФИКАЦИЯ

5.1.   Ползване на профилиращия лист от страна на дегустатора

Профилиращият лист, който следва да се ползва от дегустатора, е даден в допълнение А към настоящия метод.

Всеки дегустатор — член на групата трябва да помирише и после да дегустира маслото, подложено на оценка. След това той трябва да нанесе върху скалите от по 10 cm на своя профилиращ лист интензитета, с който възприема всеки от положителните и отрицателните признаци ( 6 ). В случай на възприятие на признака „с вкус на плодове“, категоризиран като „вкус на зелен плод“ или „вкус на зрял плод“, дегустаторът зачертава съответното поле върху профилиращия лист.

В случай че се установят отрицателни признаци, които не са посочени върху профилиращия лист, те се вписват в рубриката „други“, като се използват терминът или термините, които ги описват най-точно измежду определените по-горе.

5.2.   Ползване на данните от страна на организатора на групата дегустатори

Организаторът на групата трябва да събере профилиращите листи, попълнени от всеки от дегустаторите; той трябва да провери интензитетите, които са вписани за различните признаци; ако се констатира аномалия, той изисква от дегустатора да провери своя профилиращ лист и ако е необходимо, да повтори опита.

Организаторът на групата може да въведе данните на всеки дегустатор в компютърна програма, която изчислява медианата по статистическия метод в допълнение Б. Въвеждането на данните за една проба се осъществява с помощта на матрица, съставена от 9 колони, отговарящи на 9 сетивни признаци и от n редове, отговарящи на n дегустатори от групата.

Когато негативен признак, установен от поне 50 % от групата, е вписан в рубриката „други“, медианата на този недостатък се изчислява и маслото се класифицира съответно.

Организаторът на групата може да удостовери, че оценяваното масло изпълнява условията, посочени в точка 3.3, буква а), що се отнася до термините „вкус на зелен плод“ и „вкус на зрял плод“ само ако поне 50 % от членовете на групата са посочили, че са установили зеления или зрял характер на признака „с вкус на плодове“.

В случай на анализи, извършвани в рамките на проверки на съответствието, се извършва един опит. В случай на противоречиви анализи организаторът на групата трябва да осъществи провеждането на двоен анализ. В случай на анализи за отмяна оценяването трябва да се извърши три пъти. В тези случаи медианата на признаците се изчислява въз основа на средното аритметично от медианите. Всички повторни оценки трябва да се проведат по време на различни сеанси.

5.3.   Класифициране на маслото

Маслото се класифицира в категориите, посочени по-долу, в зависимост от медианата на недостатъците и от медианата на признака „с вкус на плодове“. Медианата на недостатъците се определя като медианата на недостатъка, за който е установен най-висок интензитет. Медианата на недостатъците и медианата на признака „с вкус на плодове“ се изразяват с един десетичен знак и стойността на стабилния коефициент на отклонение при повторяемост не трябва да надхвърля 20 %.

Класифицирането на маслото се осъществява чрез сравнение на стойността на медианата на недостатъците и на медианата на признака „с вкус на плодове“ с референтните скали, посочени по-долу. При определянето на границите на тези скали е взета предвид грешката на метода и те се считат за абсолютни. Компютърните програми позволяват класифициране под формата на таблица със статистически данни или на графика.

5.4.   Специален случай

Когато медианата на положителен признак, различен от признака „с вкус на плодове“, е по-висока от 5,0, организаторът на групата го отбелязва върху сертификата за анализ на маслото.

Допълнение А

Профилиращ лист за необработено маслиново масло

Допълнение Б

МЕТОД ЗА ИЗЧИСЛЯВАНЕ НА МЕДИАНАТА И НА ДОВЕРИТЕЛНИТЕ ИНТЕРВАЛИ

Медиана

Медианата се определя като реалното число Xm, което се характеризира с факта, че вероятността (P) разпределените стойности (X) да са по-ниски от въпросното число (Xm) е по-малка или равна на 0,5 и че в същото време вероятността (P) разпределените стойности (X) да са по-ниски или равни на Xm е по-голяма или равна на 0,5. Според друго определение за медиана се приема 50-ия процентил на нарастваща редица от числа. С други думи, медианата представлява стойността посредата на подредена редица с нечетен брой стойности или пък средноаритметичното на двете стойности в средата на подредена редица с четен брой стойности.

Стабилно отклонение

За да се получи достоверна оценка на отклонението от медианата, трябва да се използва оценка на стабилното отклонение по Stuart и Kendall. Следната формула показва асимптотичното отклонение, т.е. стабилната оценка на отклонението на разглежданите данни, където N е броят наблюдения и IQR — интерквартилният размах, който обхваща точно 50 % от случаите при разпределение с дадена вероятност.

Изчисляването на интерквартилния размах се осъществява чрез изчисляване на величината на отклонение между 75-ия и 25-ия процентил.

IQR = 75-и процентил – 25-и процентил

Процентилът е стойността Xpc, която се характеризира с факта, че вероятността (P) разпределените стойности да са по-ниски от Xpc е по-малка или равна на определена стотна и че в същото време вероятността (P) разпределените стойности да са по-ниски или равни на Xpc е по-голяма или равна на същата стотна. Стотната указва използваната част от разпределението. В случая с медианата тя е равна на 50/100.

В практиката процентилът е стойността на разпределение, отговаряща на определена област, очертана от кривата на разпределението или на плътността. Например 25-ия процентил представлява стойността на разпределение, отговаряща на област, равна на 0,25 или 25/100.

Стабилен коефициент на отклонение

Стабилният коефициент на отклонение представлява чисто число, т.е. без мерна единица, което указва процентът на отклонение на редицата от анализирани числа. Поради тази причина този коефициент е много удобен за проверка на достоверността на работата на членовете на групата.

Доверителни интервали от 95 % на медианата

Доверителните интервали от 95 % (стойност на грешката от първи род, равна на 0,05 или 5 %) представляват интервалите, в които стойността на медианата може да се променя при хипотеза, че ще бъде възможно опитът да бъде повторен неограничен брой пъти. В практиката този интервал указва интервала на отклонение при опита при едни и същи условия на изпитване при хипотеза, че ще бъде възможно опитът да бъде повторен неограничен брой пъти. Интервалът помага да се оцени, както и в случая със стабилния коефициент на отклонение, достоверността на опита.

ICsup = Me + (c.S*)

ICinf = Me – (c.S*)

Където c, в случай на доверителен интервал от 0,95, е равно на 1,96.

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

ПРИЛОЖЕНИЕ XV

1.   МАСЛЕНО СЪДЪРЖАНИЕ НА ОСТАТЪЧНИЯ МАТЕРИАЛ

1.1.   Апаратура

1.2.   Реактив

Нормален хексан за технически цели, който след пълно изпаряване трябва да има остатък от по-малко от 0,002 g на 100 ml.

2.   ХОД НА ОПИТА

2.1.   Подготовка на опитната проба

Ако е необходимо се използва механичната мелница, която е била добре почистена предварително, за смилане на лабораторната проба с оглед на раздробяването ѝ до частици, които да могат напълно да преминават през ситото.

Използва се една двадесета от пробата за завършване на процеса по почистване на мелницата, раздробеният материал се отстранява, остатъкът се смила и събира, смесва се внимателно и се анализира незабавно.

2.2.   Размер на пробата

Веднага след извършването на операцията по смилане, се измерват около 10 g от пробата с точност до 0,01 g за извършване на опита.

2.3.   Подготовка на екстракционната гилза

Поставя се частта от пробата в гилзата и се запушва с памук. Ако се използва филтърна хартия, частта от пробата се обвива в нея.

2.4.   Предварително изсушаване

Ако остатъците от преработката на маслини са много влажни (т.е. съдържанието на влага и летливи вещества е повече от 10 %), се извършва предварително изсушаване чрез поставяне на заредената гилза (или филтърна хартия) в нагрятата пещ за подходящо време при не повече от 80 °С с оглед на намаляването на съдържанието на влага и летливи вещества до по-малко от 10 %.

2.5.   Подготовка на колбата с кръгло дъно

Претегля се с точност до 1 mg колбата, съдържаща една или две частици пемза, предварително изсушена в пещта при 103 ± 2 °С и след това охладена в десикатор за не по-малко от един час.

2.6.   Първоначална екстракция

В апарата за екстракция се поставя гилзата (или филтърната хартия), съдържаща частта от пробата. Налива се в колбата необходимото количество хексан. Свързва се колбата с апарата за екстракция и цялата система се поставя в банята с електрическо подгряване. Настройва се скоростта на подгряване по такъв начин, че скоростта на оросяване да не е по-малка от три капки за секунда (средно, не силно кипене). След екстракция в продължение на четири часа, се оставя да се охлади. Гилзата се отстранява от апарата за екстракция и се поставя под въздушна струя с оглед на издухване на влагата от импрегниращия разтворител.

2.7.   Повторна екстракция

Изтърсва се съдържанието на гилзата в миксер и се смила възможно най-фино. Връща се смляната смес в гилзата без загуби и тя се поставя отново в апарата за екстракция.

Екстракцията се продължава за още два часа, като се използва същата колба с кръгло дъно, която съдържа първоначалния екстракт.

Полученият разтвор в екстракционната колба трябва да е бистър. Ако не е, се филтрира през филтърна хартия, а колбата, в която е бил, и филтърната хартия се промиват няколко пъти с хексан. Филтратът и промивният разтворител се събират в друга колба с кръгло дъно, която е била изсушена и тарирана с точност до 1 mg.

2.8.   Премахване на разтворителя и претегляне на екстракта

По-голямата част от разтворителя се премахва чрез дестилация в баня с електрическо подгряване. Последните следи от разтворителя се премахват чрез нагряване на колбата в пещта при 103 ± 2 °С за 20 минути. Процесът на елиминация се подпомага или чрез продухване с въздух, или за предпочитане с инертен газ, през определени периоди от време, или чрез използването на ниско налягане.

Колбата се поставя в десикатор за охлаждане за поне един час и се претегля с точност до 1 mg.

Нагрява се отново в продължение на 10 минути при същите условия, охлажда се в десикатор и се претегля.

Разликата между двете измервания не трябва да превишава 10 mg. Ако превишава, се нагрява отново за периоди от 10 минути, последвани от охлаждане и претегляне докато разликата в теглата стане 10 mg или по-малко. Отбелязва се последното тегло на колбата.

Провеждат се дублиращи определяния на опитната проба.

3.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

3.1.   Метод за изчисляване и формула

3.2.   Повторяемост

Разликата между едновременно или бързо едно след друго проведените от същия аналитик дублиращи определяния не трябва да превишава 0,2 g хексанов екстракт на 100 g от пробата.

Ако това условие не е удовлетворено, анализът се повтаря с други две опитни части. Ако и в този случай разликата превишава 0,2 g, за резултат се приема средното аритметично от четирите определяния.

ПРИЛОЖЕНИЕ XVI

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЙОДНОТО ЧИСЛО

1.   ОБХВАТ

Настоящият Международен стандарт определя метод за определянето на йодното число на животинските и растителни мазнини и масла, наричани по-долу мазнини.

2.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ

За целите на Международния стандарт се прилага следното определение:

3.   ПРИНЦИП

Разтварянето на част от пробата в разтворител и добавяне на реактива на Вийс. След определено време, добавяне на разтвор на калиев йодид и вода и титруване с разтвор на натриев тиосулфат.

4.   РЕАКТИВИ

Всички реактиви трябва да са с признато за аналитични цели качество:

5.   АПАРАТУРА

Обикновена лабораторна апаратура и, по-специално, следното:

6.   ПОДГОТОВКА НА ПРОБАТА

Хомогенизираната проба се подсушава върху натриев сулфат и се филтрира.

7.   ХОД НА ОПИТА

8.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТА

Йодният клапан се изразява чрез израза

където:

c = е цифровата стойност на точната концентрация, в мол на литър, на използвания стандартен обемен содиев триофосфатен разтвор (4.4.).

V1 = е цифровата стойност на обема, в милилитри, на стандартния обемен содиев триофосфатен разтвор (4.4.), използван за празната проба.

V2 = е цифровата стойност на обема в милилитри, на стандартния обемен содиев триофосфатен разтвор (4.4.), използван при определянето

m = е цифровата стойност на масата, в грамове от пробата (7.1.).

Като резултат се отчита средно аритметично от двете определяния, при условие че изискването за повторяемост (9.2.) е спазено.

▼M11

ПРИЛОЖЕНИЕ ХVII

МЕТОД ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СТИГМАСТАДИЕНИ В РАСТИТЕЛНИ МАСЛА

1.   ЦЕЛ

Определяне на стигмастадиени в растителни масла, съдържащи ниски концентрации на тези въглеводороди и по-специално в необработеното маслиново масло (virgin) и в суровото маслиново масло от остатъчен материал.

2.   ОБХВАТ

Стандартът може да се прилага за всички растителни масла, въпреки че измерванията са надеждни само когато съдържанието на тези въглеводороди е между 0,01 и 4,0 мг/кг. Методът е особено подходящ за откриване на наличие на рафинирани растителни масла (от маслини, остатъчен материал, слънчоглед, палмови ядки и т.н.) в необработеното маслиново масло (virgin), тъй като рафинираните масла съдържат стигмастадиени, а необработеното маслиново масло не съдържа такива вещества.

3.   ПРИНЦИП

Изолиране на неосапунващи се съединения. Отделяне на стероидна въглеводородна фракция посредством колбена хроматография върху силициев гел и анализ посредством капилярна газова хроматография.

4.   АПАРАТУРА

5.   РЕАГЕНТИ

Всички реагенти са с качество на анализи, освен ако не е посочено друго. Използва се дестилирана вода или вода с поне еквивалентна чистота.

6.   ПРОЦЕДУРА

6.1.   Подготовка на неосапунващи се материи

6.2.   Отделяне на фракция от стероиден въглеводород

6.3.   Газова хроматография

Фигура 1

Газови хроматограми, получени от мостри на маслиново масло, анализирани на капилярна колона от стопен силиций (вътрешен диаметър 0,25 мм на 25 м), покрити с фенилметилсиликон 5 %, дебелина на слоя 0,25 микрометра.

Фигура 2

Газова хроматограма, получена от мостра на рафинирано маслиново масло, анализирана на колона DB-5, показваща изомера на 3,5-стигмастадиена.

STIG-3,5

I.8.

isomer

0

10

20

min

▼M13

ANNEX XVIII

DETERMINATION OF TRIACYLGLYCEROLS WITH ECN 42 (DIFFERENCE BETWEEN HPLC DATA AND THEORETICAL CONTENT)

1.   Scope

Determination of the composition of triacylglycerols (TAGs) in olive oils, in terms of their equivalent carbon number by differences between the analytical results obtained by high performance liquid chromatography (HPLC) and the theoretical content, calculated starting from the fatty acid composition.

2.   Field application

The standard is applicable to olive oils. The method is applicable to the detection of the presence of small amounts of seed oils (rich in linoleic acid) in every class of olive oils.

3.   Principle

The content of triacylglycerols with ECN42 determined by HPLC analysis and the theoretical content of triacylglycerols with ECN42 (calculated on the basis of GLC determination of fatty acid composition) correspond within a certain limit for pure oils. A difference larger than the values stated in the Regulation for each type of oil points out that the oil contains seed oils.

4.   Method

The method for calculation of theoretical content of triacylglycerols with ECN42 and of the difference between the HPLC data and this one essentially is made by the coordination of analytical data obtained by means of other methods: it is possible to distinguish three phases: determination of fatty acid composition by capillary gas chromatography, calculation of theoretical composition of triacylglycerols with ECN42, HPLC determination of ECN42 triacylglycerols

4.1.   Apparatus

4.2.   Reagents

The reagents should be of analytical purity. Elution solvents should be de-gassed, and may be recycled several times without effect on the separations.

4.3.   Sample preparation

As a number of interfering substances can rise false positive results, the sample must always be purified according to IUPAC method 2.507, used for determination of polar substances in oxidised oils.

4.3.1.   Chromatographic column preparation

Fill the column (4.1.3) with about 30 ml of elution solvent (4.2.3), then introduce inside the column some glass wool (4.2.5) pushing it to the bottom of the column by means of the glass rod (4.1.5).

In a 100 ml beaker, suspend 25 g of silicagel (4.2.4) in 80 ml of elution mixture (4.2.3), then transfer it inside the column, by means of a glass funnel (4.1.6).

To ensure the complete transfer of silicagel inside the column, wash the beaker with the elution mixture and transfer the washing portions inside the column, too.

Open the cock and let solvent elute from the column until its level is about 1 cm over the silicagel.

4.3.2.   Column chromatography

Weigh with the accuracy of 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g of oil, previously filtered, homogenized and anhydrified, if necessary, in a 50 ml volumetric flask (4.1.7). Solve it in about 20 ml of elution solvent (4.2.3), if necessary, slightly heat it to make the dissolution easily. Cool at room temperature and adjust the volume with elution solvent.

By means of a volumetric pipette, introduce 20 ml of solution inside the column prepared according to 4.3.1, open the cock and let solvent elute to the silicagel layer level.

Then elute with 150 ml of elution solvent (4.2.3), adjusting the solvent rate at about 2 ml/min (150 ml will take about 60 to 70 minutes to pass through the column).

The eluated is recovered in a 250 ml round bottom flask (4.1.1) previously tared in an oven and exactly weighted. Eliminate solvent at reduce pressure (Rotavapor) and weigh the residue that will be used to prepare the solution for HPLC analysis and for methyl ester preparation.

The sample recovery from the column must be 90 % at least for extra virgin, virgin, ordinary refined and olive oil categories, and a minimum of 80 % for lampante and residue olive oils.

4.4.   HPLC analysis

4.4.1.   Preparation of the samples for chromatographic analysis

A 5 % solution of the sample to be analysed is prepared by weighing 0,5 ± 0,001 g of the sample into a 10 ml graduated flask and making up to 10 ml with the solubilization solvent (4.2.9).

4.4.2.   Procedure

Set up the chromatographic system. Pump elution solvent (4.2.8) at a rate of 1,5 ml/min to purge the entire system. Wait until a stable base line is obtained. Inject 10 μl of the sample prepared as in 4.3.

4.4.3.   Calculation and expression of results

Use the area normalization method, i.e. assume that the sum of the areas of the peaks corresponding to TAGs from ECN42 up to ECN52 is equal to 100 %. Calculate the relative percentage of each triglyceride using the formula:

% triglyceride = area of peak × 100/ sum of peak areas.

The results are to be given to within at least two decimal places.

Note 1:

The elution order can be determined by calculating the equivalent carbon numbers, often defined by the relation ECN = CN-2n, where CN is the carbon number and n is the number of double bounds, it can be calculated more precisely by taking into account the origin of the double bond. If no, nl and nln are the numbers of double bonds attributed to oleic, linoleic and linolenic acids respectively, the equivalent carbon number can be calculated by means of the relation of the formula:

ECN = CN - dono - dlnl - dlnnln,

where the coefficient do, dl and dln can be calculated by means of the reference triglycerides. Under the conditions specified in this method, the relation obtained will be close in:

ECN = CN - (2,60 no) - (2,35 nl) - (2,17 nln)

Note 2:

Note 3:

With several reference triglycerides, it is also possible to calculate the resolution with respect to triolein:

α = RT' / RT triolein

by use of the reduced retention time RT' = RT - RT solvent.

The graph of log α against f (number of double bonds) enables the retention values to be determined for all the triglycerides of fatty acids contained in the reference triglycerides — see figure 2.

Note 4:

The efficiency of the column should permit clear separation of the peak of trilinoein from the peaks of the triglycerides with an adjacent RT. The elution is carried out up to ECN52 peak.

Note 5:

A correct measure of the areas of all peaks of interest for the present determination is ensured if the second peak corresponding to ECN50 is 50 % of full scale of the recorder.

4.5.   Calculation of triacylglycerols composition

4.5.1.   Determination of fatty acid composition

Fatty acid composition is carried out by means of the EEC gas chromatographic method reported in Annex X A of Regulation (EEC) No 2568/91, by means of a capillary column. The methyl esters preparation is carried out according to Annex X B (sodium methylate alcohol solution).

4.5.2.   Fatty acids for calculation

Glycerides are grouped by their equivalent carbon number (ECN), taking into account the following equivalencies between ECN and fatty acids. Only fatty acids with 16 and 18 carbon atoms were taken in consideration, because only these are important for olive oil.

4.5.3.   Conversion of area % into moles for all fatty acids

moles P = area % PMW Pmoles S = area % SMW Smoles Po = area % PoMW Po	(1)
moles O = area % OMW Omoles L = area % LMW Lmoles Ln = area % LnMW Ln

4.5.4.   Normalization of fatty acids to 100 %

moles % P 1,2,3 = moles P * 100moles P + S + Po + O + L + Ln	(2)
moles % S 1,2,3 = moles S * 100moles P + S + Po + O + L + Ln
moles % Po 1,2,3 = moles Po * 100moles P + S + Po + O + L + Ln
moles % O 1,2,3 = moles O * 100moles P + S + Po + O + L + Ln
moles % L 1,2,3 = moles L * 100moles P + S + Po + O + L + Ln
moles % Ln 1,2,3 = moles Ln * 100moles P + S + Po + O + L + Ln

The result gives the percentage of each fatty acid in moles % in the overall (1,2,3-) position of the TAGs.

Then the sum of the saturated fatty acids P and S (SFA) and the unsaturated fatty acids Po, O, L and Ln (UFA) are calculated:

moles % SFA = moles % P + moles % S	(3)
moles UFA = 100 - moles % SFA

4.5.5.   Calculation of the fatty acid composition in 2- and 1,3- positions of TAGs

The fatty acids are distributed to three pools as follows: two identical for 1- and 3- positions and one for 2- position, with different coefficients for the saturated (P and S) and unsaturated acids (Po, O, L and Ln).

4.5.5.1.

Saturated fatty acids in 2- position [P(2) and S(2)] moles % P(2) = moles % P (1,2,3) * 0,06 (4) moles % S(2) = moles % S (1,2,3) * 0,06

4.5.5.2.

Unsaturated fatty acids in 2- position [Po(2), O(2), L(2) and Ln(2)]: moles % Po2 = moles % Po1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - moles % S2 (5) moles % O2 = moles % O1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - mol % S2 moles % L2 = moles % L1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - moles % S2 moles % Ln2 = moles % Ln1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - moles % S2

4.5.5.3.

Fatty acids in 1,3-positions [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) and Ln(1,3)]: moles % P1,3 = moles % P1,2,3 - moles % P22 + moles % P1,2,3 (6) moles % S1,3 = moles % S1,2,3 - moles % S22 + moles % S1,2,3 moles % Po1,3 = moles % Po1,2,3 - moles % Po22 + moles % Po1,2,3 moles % O1,3 = moles % O1,2,3 - moles % O22 + moles % O1,2,3 moles % L1,3 = moles % L1,2,3 - moles % L22 + moles % L1,2,3 moles % Ln1,3 = moles % Ln1,2,3 - moles % Ln22 + moles % Ln1,2,3

4.5.6.   Calculation of triacylglycerols