”I”

:

För transitering genom ett tredjelands område av levande djur för omedelbar slakt eller av levande nötkreatur för gödning som har sänts från en medlemsstat och är på väg till en annan medlemsstat i lastbilar som har försetts med en försegling med löpnummer.

Förseglingens nummer ska anges på det hälsointyg som utfärdats för levande nötkreatur för slakt och gödning i enlighet med förlagan i bilaga F till direktiv 64/432/EEG (6) och för får och get för slakt i enlighet med förlaga I i bilaga E till direktiv 91/68/EEG (7).

Förseglingen ska dessutom vara intakt vid ankomsten till den gränskontrollstation som utsetts för införsel till unionen och förseglingens nummer ska registreras i det integrerade veterinärdatasystemet (Traces).

Den behöriga veterinärmyndigheten ska stämpla intyget vid utförselstället från unionen före transitering till ett eller flera tredjeländer med följande text: ”ENDAST FÖR TRANSITERING MELLAN OLIKA DELAR AV EUROPEISKA UNIONEN VIA F.D. JUGOSLAVISKA REPUBLIKEN MAKEDONIEN/MONTENEGRO/SERBIEN (8)  (9)”.

Nötkreatur för gödning ska transporteras direkt till den bestämmelseanläggning som utsetts av den behöriga myndigheten på bestämmelseorten. Djuren får förflyttas från denna anläggning endast för omedelbar slakt.

”II”

:

Område som erkänts som officiellt tuberkulosfritt vid export till unionen av levande djur för vilka intyg utfärdats i enlighet med intygsförlaga BOV-X.

”III”

:

Område som erkänts som officiellt brucellosfritt vid export till unionen av levande djur för vilka intyg utfärdats i enlighet med intygsförlaga BOV-X.

”IVa”

:

Område som erkänts som officiellt fritt från enzootisk bovin leukos (EBL) vid export till unionen av levande djur för vilka intyg utfärdats i enlighet med intygsförlaga BOV-X.

”IVb”

:

Område med godkända anläggningar som erkänts som officiellt fria från enzootisk bovin leukos (EBL) vid export till unionen av levande djur för vilka intyg utfärdats i enlighet med intygsförlaga BOV-X.

”V”

:

Område som erkänts som officiellt brucellosfritt vid export till unionen av levande djur för vilka intyg utfärdats i enlighet med intygsförlaga OVI-X.

”VI”

:

Geografiska restriktioner:

”VII”

:

Område som erkänts som officiellt tuberkulosfritt vid export till unionen av levande djur för vilka intyg utfärdats i enlighet med intygsförlaga RUM.

”VIII”

:

Område som erkänts som officiellt brucellosfritt vid export till unionen av levande djur för vilka intyg utfärdats i enlighet med intygsförlaga RUM.

”IX”

:

Område som erkänts som officiellt fritt från Aujeszkys sjukdom vid export till unionen av levande djur för vilka intyg utfärdats i enlighet med intygsförlaga POR-X.

”BOV-X”

:

Förlaga till veterinärintyg för tamdjur av nötkreatur (inklusive arter av Bubalus och Bison samt korsningar av dessa) avsedda för avel och/eller produktion efter import.

”BOV-Y”

:

Förlaga till veterinärintyg för tamdjur av nötkreatur (inklusive arter av Bubalus och Bison samt korsningar av dessa) avsedda för omedelbar slakt efter import.

”OVI-X”

:

Förlaga till veterinärintyg för tamfår (Ovis aries) och tamgetter (Capra hircus) avsedda för avel och/eller produktion efter import.

”OVI-Y”

:

Förlaga till veterinärintyg för tamfår (Ovis aries) och tamgetter (Capra hircus) avsedda för omedelbar slakt efter import.

”POR-X”

:

Förlaga till veterinärintyg för tamsvin (Sus scrofa) avsedda för avel och/eller produktion efter import.

”POR-Y”

:

Förlaga till veterinärintyg för tamsvin (Sus scrofa) avsedda för omedelbar slakt efter import.

”RUM”

:

Förlaga till veterinärintyg för djur av ordningen Artiodactyla (utom nötkreatur (inklusive arter av Bubalus och Bison samt korsningar av dessa), Ovis aries, Capra hircus, Suidae och Tayassuidae) och av familjerna Rhinocerotidae och Elephantidae.

”SUI”

:

Förlaga till veterinärintyg för icke-domesticerade Suidae, Tayassuidae och Tapiridae.

”CAM”

:

Förlaga till särskilt intyg för djur som importeras från Saint-Pierre och Miquelon enligt villkoren i del 7 i bilaga I.

”A”

:

Garantier avseende tester för blåtunga och epizootisk hemorragisk sjukdom på djur för vilka intyg utfärdats i enlighet med intygsförlagorna BOV-X (punkt II.2.8 B), OVI-X (punkt II.2.6 D) och RUM (punkt II.2.6).

”B”

:

Garantier avseende tester för vesikulär svinsjuka och klassisk svinpest på djur för vilka intyg utfärdats i enlighet med intygsförlagorna POR-X (punkt II.2.4 B) och SUI (punkt II.2.4 B).

”C”

:

Garantier avseende tester för brucellos på djur för vilka intyg utfärdats i enlighet med intygsförlagorna POR-X (punkt II.2.4 C) och SUI (punkt II.2.4 C).

I.

De ska stå under en officiell veterinärs tillsyn.

II.

Varje uppsamlingscentral ska ligga mitt i ett område med minst 20 km i diameter där det enligt officiella uppgifter inte har förekommit något fall av mul- och klövsjuka på minst 30 dagar innan den började användas som godkänd uppsamlingscentral.

III.

Uppsamlingscentralerna ska varje gång innan de används som godkända uppsamlingscentraler rengöras och desinficeras med ett desinfektionsmedel som i exportlandet är officiellt godkänt som effektivt för bekämpning av mul- och klövsjuka.

IV.

De ska beroende på mottagningskapaciteten ha följande:

V.

När uppsamlingscentralen är i drift ska det finnas tillräckligt många veterinärer för att utföra alla de uppgifter som anges i del 5.

VI.

Uppsamlingscentralerna får endast ta emot djur som är individuellt märkta så att spårbarheten kan säkerställas. Uppsamlingscentralens ägare eller den som är ansvarig för uppsamlingscentralen ska därför se till att djuren är korrekt identifierade och åtföljs av de hälsodokument eller intyg som krävs för de berörda arterna och kategorierna.

Uppsamlingscentralens ägare eller den som är ansvarig för uppsamlingscentralen ska dessutom i ett register eller en databas föra in uppgifter, som ska sparas i minst tre år, om namn på ägare, djurens ursprung, dag då djuren anlände till respektive lämnade centralen, djurens identifikationsnummer eller ursprungsbesättningens registreringsnummer samt deras bestämmelseanläggning, transportföretagets registreringsnummer samt registreringsnummer på den lastbil med vilken djur levereras till eller hämtas från uppsamlingscentralen.

VII.

Alla djur som passerar uppsamlingscentralen ska uppfylla de hälsovillkor som fastställts för införsel av den berörda djurkategorin till unionen.

VIII.

Djur som ska föras in till unionen och som passerar en uppsamlingscentral ska, inom sex dagar från ankomsten till uppsamlingscentralen, lastas och avsändas direkt till exportlandets gräns

IX.

Om villkoren för export av djuren till unionen kräver att ett test utförs inom en viss tidsperiod före lastningen, ska den perioden innefatta all tid för uppsamling, dock högst sex dagar, från den dag då djuren anlände till den godkända uppsamlingscentralen.

X.

Det exporterande tredjelandet ska utse de uppsamlingscentraler som är godkända för djur avsedda för avel och produktion och de uppsamlingscentraler som är godkända för djur avsedda för slakt, och det ska anmäla centralernas namn och adresser till kommissionen och medlemsstaternas centrala behöriga myndigheter. Dessa uppgifter ska uppdateras regelbundet.

XI.

Det exporterande tredjelandet ska fastställa förfarandet för den offentliga tillsynen av godkända uppsamlingscentraler och se till att sådan tillsyn utförs.

XII.

Den behöriga myndigheten i tredjelandet ska regelbundet inspektera de godkända uppsamlingscentralerna för att kontrollera att kraven för godkännande i I–XI fortfarande uppfylls.

Om det vid inspektionerna framgår att villkoren inte längre uppfylls ska uppsamlingscentralens godkännande tillfälligt återkallas. Godkännandet kan återfås först när den behöriga myndigheten i tredjelandet har förvissat sig om att uppsamlingscentralen uppfyller samtliga villkor i I–XI.

1.

Mikrotiterplattor för ELISA-test.

2.

Antigen: levereras som ett koncentrat extraherat ur celler, bereds enligt nedanstående beskrivning och lagras vid –20 °C eller –70 °C.

3.

Blockerande buffert: fosfatbuffert (PBS) med 0,3 % BTV-negativt serum från vuxna nötkreatur, 0,1 % (v/v) Tween-20 (levereras som polyoxietylensorbitonmonolaurat-lösning) i PBS.

4.

Monoklonal antikropp: 3-17-A3 (levereras som supernatant från odling av hybridomceller) riktad mot den gruppspecifika polypeptiden VP7, lagras vid –20 °C eller frystorkad och spädd 1:100 med blockerande buffert före användning.

5.

Konjugat: kanin-antimusglobulin (adsorberat och eluerat) konjugerat med pepparrotsperoxidas och förvarat mörkt vid 4 °C.

6.

Kromogen och substrat: o-fenylendiamin (OPD-kromogen) med en slutlig koncentration på 0,4 mg/ml i sterilt destillerat vatten. 0,05 % (v/v) väteperoxid (30 % w/v substrat) tillsätts omedelbart före användning (5 µl H2O2 per 10 ml OPD). (Var försiktig vid hantering av OPD – använd gummihandskar – misstänks vara mutagent.)

7.

1 M svavelsyra: 26,6 ml svavelsyra i 473,4 ml destillerat vatten. (Kom ihåg – tillsätt alltid syra i vatten, aldrig vatten i syra.)

8.

Orbitalskak.

9.

ELISA-spektrofotometer (testet kan avläsas visuellt).

Konjugatkontroll (Cc)

:

Brunnarna 1A och 1B är blankprov som består av BTV-antigen och konjugat. Dessa kan användas för att nollställa ELISA-spektrofotometern.

Mab-kontroll (Cm)

:

Kolumnerna 1 och 2, raderna G och H är monoklonal antikropp-kontroll och innehåller BTV-antigen, monoklonal antikropp och konjugat. Dessa brunnar motsvarar den kraftigaste färgreaktionen. Medelvärdet av absorbansvärdena från denna kontroll motsvarar 0 % inhibering.

Positiv kontroll (C++, C+)

:

Kolumnerna 1 och 2, raderna C-D-E-F. Dessa brunnar innehåller BTV-antigen, starkt respektive svagt BTV-positivt antiserum, monoklonal antikropp och konjugat.

Negativ kontroll (C-)

:

Brunnarna 2A och 2B är de negativa kontrollerna som innehåller BTV-antigen, BTV-negativt antiserum, monoklonal antikropp och konjugat.

Testserum

:

För storskaliga serologiska undersökningar och snabb screening kan serum testas i en enda spädning på 1:5 (tillägg 1). Alternativt kan tio serum testas i spädningar mellan 1:5 och 1:640 (tillägg 2). Detta ger en viss indikation om antikroppstitern i testserumen.

1.

Späd BTV-antigen till förtitrerad koncentration i PBS, och sonikera ett ögonblick för att sprida ackumulerat virus (pipettera kraftigt om det inte finns någon sonikator) och tillsätt 50 μl till alla brunnar i ELISA-plattan. Knacka på plattans sidor så att antigenet sprids.

2.

Inkubera vid 37 °C i 60 minuter i orbitalskak. Tvätta plattorna tre gånger genom att fylla brunnarna med osteril PBS och tömma dem, och torka sedan med absorberande papper.

3.

Kontrollbrunnar: Tillsätt 100 µl blockerande buffert till Cc-brunnarna. Tillsätt 50 µl positivt och negativt kontrollserum i spädningen 1:5 (10 µl serum +40 µl blockerande buffert) till brunnarna C-, C+ respektive C++. Tillsätt 50 µl blockerande buffert till Mab-kontrollbrunnarna.

Spottitrering: Tillsätt vart och ett av testserumen i spädningen 1:5 till dubbla brunnar i kolumnerna 3–12 (10 µl serum +40 µl blockerande buffert).

eller

Serumtitrering: Bered en spädningsserie i 1:2-steg av varje prov (från 1:5 till 1:640) i blockerande buffert i åtta brunnar i vardera av kolumnerna 3–12.

4.

Späd monoklonal antikropp 1:100 i blockerande buffert omedelbart efter det att testserumen tillsatts och tillsätt 50 µl till alla brunnar i plattan utom blankprovet.

5.

Inkubera vid 37 °C i 60 minuter i orbitalskak. Tvätta tre gånger med PBS och torka med absorberande papper.

6.

Späd kanin-antimuskoncentrat 1:5 000 i blockerande buffert och tillsätt 50 µl till alla brunnar i plattan.

7.

Inkubera vid 37 °C i 60 minuter i orbitalskak. Tvätta tre gånger med PBS och torka med absorberande papper.

8.

Tina o-fenylendiamindihydroklorid (OPD) och tillsätt omedelbart före användning 5 μl av 30 % väteperoxid för varje 10 ml OPD. Tillsätt 50 µl till alla plattans brunnar. Låt färg utvecklas i ungefär 10 minuter och avsluta reaktionen med 1 M svavelsyra (50 μl per brunn). Färg bör utvecklas i Mab-kontrollbrunnarna och i de brunnar som innehåller serum utan BTV-antikroppar.

9.

Undersök och registrera plattorna, antingen visuellt eller med hjälp av en spektrofotometer.

1.

Skölj ur 40–60 odlingsflaskor med konfluenta BHK-21-celler tre gånger med serumfritt Eagles-medium och infektera med blåtungevirus serotyp 1 i serumfritt Eagles-medium.

2.

Inkubera vid 37 °C och undersök dagligen för cytopatisk effekt (CPE).

3.

Samla in viruset när CPE är fullständig i 90 % till 100 % av cellagret i varje odlingsflaska genom att skaka av alla celler som fortfarande sitter kvar på glaset.

4.

Centrifugera vid 2 000-3 000 rpm för att pressa samman cellerna.

5.

Avlägsna supernatanten och slamma upp cellerna på nytt i cirka 30 ml PBS med 1 % ”Sarkosyl” och 2 ml fenylmetylsulfonylfluorid (lyseringsbuffert). Detta kan få cellerna att bilda en gel, vilket kan motverkas genom att mer lyseringsbuffert tillsätts. (OBS: Fenylmetylsulfonylfluorid är skadligt – hanteras med yttersta försiktighet.)

6.

Slå sönder cellerna i 60 sekunder med en ultraljudssond med en amplitud på 30 µm.

7.

Centrifugera vid 10 000 rpm i 10 minuter.

8.

Lagra supernatanten vid +4 °C och slamma på nytt upp den återstående cellpelleten i 10–20 ml lyseringsbuffert.

9.

Sonikera, låt klarna och ta vara på supernatanten. Detta upprepas sammanlagt tre gånger.

10.

Slå samman supernatanterna och centrifugera vid 24 000 rpm (100,000 g) i 120 minuter vid +4 °C på en 5 ml kudde bestående av 40 % sackaros (w/v i PBS) med 30 ml Beckmann centrifugrör och en SW 28-rotor.

11.

Ta bort supernatanten, töm rören helt och lös de centrifugerade cellerna igen i PBS genom att sonikera. Lagra antigenen i alikvoter vid –20 °C.

1.

BTV-antigen som spätts 1:20 i PBS titreras på mikrotiterplattan i en spädningsserie i 1:2-steg (50 µl per brunn) med hjälp av en flerkanalspipett.

2.

Inkubera vid 37 °C i en timme i orbitalskak.

3.

Tvätta plattorna tre gånger med PBS.

4.

Tillsätt 50 µl monoklonal antikropp 3-17-A3 (spädning 1:100) till varje brunn på mikrotiterplattan.

5.

Inkubera vid 37 °C i en timme i orbitalskak.

6.

Tvätta plattorna tre gånger med PBS.

7.

Tillsätt 50 μl kanin-antimusglobulin konjugerat med pepparrotsperoxidas, utspätt till en optimal förtitrerad koncentration, till varje brunn på mikrotiterplattan.

8.

Inkubera vid 37 °C i en timme i orbitalskak.

9.

Tillsätt substrat och kromogen enligt den tidigare beskrivningen. Avsluta reaktionen efter 10 minuter genom att tillsätta 1 M svavelsyra (50 μl per brunn).

Metod

:

1 % agaros som beretts i borat eller natriumbarbitolbuffert, pH 8,5–9,0, hälls i en petriskål så att en gel på minst 3,0 mm erhålls. Ett mönster bestående av sju fuktfria brunnar, var och en 5,0 mm i diameter, skärs i agargelen. Mönstret ska utgöras av en mittbrunn och sex brunnar runt den i en cirkel med radien 3 cm. Mittbrunnen fylls med standardantigen. De yttre brunnarna 2, 4 och 6 fylls med känt positivt serum och brunnarna 1, 3 och 5 med testserum. Systemet inkuberas i upp till 72 timmar vid rumstemperatur i en sluten fuktkammare.

Tolkning

:

Ett testserum är positivt om det bildar en specifik fällningslinje med antigenet och en obruten identitetslinje med kontrollserumet. Ett testserum är negativt om det inte bildar en specifik linje med antigenet och om det inte böjer kontrollserumets linje. Petriskålarna måste undersökas mot en mörk bakgrund och med indirekt belysning.

Metod

:

1 % agaros som beretts i borat eller natriumbarbitolbuffert, pH 8,5–9,0, hälls i en petriskål så att en gel på minst 3,0 mm erhålls. Ett mönster bestående av sju fuktfria brunnar, var och en 5,0 mm i diameter, skärs i agargelen. Mönstret ska utgöras av en mittbrunn och sex brunnar runt den i en cirkel med radien 3 cm. Mittbrunnen fylls med standardantigen. De yttre brunnarna 2, 4 och 6 fylls med känt positivt serum och brunnarna 1, 3 och 5 med testserum. Systemet inkuberas i upp till 72 timmar vid rumstemperatur i en sluten fuktkammare.

Tolkning

:

Ett testserum är positivt om det bildar en specifik fällningslinje med antigenet och en obruten identitetslinje med kontrollserumet. Ett testserum är negativt om det inte bildar en specifik linje med antigenet och om det inte böjer kontrollserumets linje. Petriskålarna måste undersökas mot en mörk bakgrund och med indirekt belysning.

Serum

:

Alla serum inaktiveras genom uppvärmning till 56 °C i 30 minuter före användning.

Metod

:

Vid det konstanta virusvarierande serumneutralisationstestet i mikrotiterplattor används MDB-cellerK eller andra mottagliga celler. Colorado, Oxford eller någon annan referensstam av viruset används vid 100 TCID50 per 0,025 ml. Inaktiverade outspädda serumprov blandas med motsvarande mängd (0,025 ml) virussuspension. Virus-/serumblandningarna inkuberas i 24 timmar vid 37 °C på mikrotiterplattorna innan MDBK-cellerna tillsätts. Cellerna används i en sådan koncentration att de bildar ett fullständigt enskiktslager efter 24 timmar.

Kontroller

:

i) Virusinfektivitetstest, ii) serumtoxicitetskontroller, iii) kontroller av oympad cellkultur, iv) referensantiserum.

Tolkning

:

Resultaten av neutralisationstestet och titern för det virus som används i testet registreras efter tre till sex dagars inkubation vid 37 °C. Serumtitrar betraktas som negativa om det inte sker någon neutralisation vid en spädning på 1:2 (outspätt serum).

Reagens

:

Före provtagningen förbereds transportmediet. Volymer om 2 ml fördelas i så många behållare som det finns djur att provta. De behållare som används måste tåla frysning över fast koldioxid eller flytande kväve. Provet tas med en särskilt utformad spottsamlare eller probang. För probangskålen genom munnen, över tungryggen och ner i övre delen av matstrupen. Försök att skrapa av ytepitelet i övre matstrupen och svalget genom laterala och dorsala rörelser. Ta sedan ut probangen, om möjligt efter det att djuret har svalt. Skålen måste vara full och innehålla en blandning av slem, saliv, vätska från matstrupen och cellmaterial. Var noga med att se till att varje prov innehåller synligt cellmaterial. Undvik onödigt hårdhänt behandling som orsakar blödning. Prov från vissa djur kan vara kraftigt förorenade av våminnehåll. Sådana prov måste kasseras och djurets mun sköljas med vatten, eller ännu hellre med fysiologisk koksaltlösning, innan ett nytt prov tas.

Behandling av prov

:

Varje prov som tagits med probangskålen ska genomgå en kvalitativ undersökning och 2 ml tillsätts till en lika stor mängd transportmedium i en behållare som tål frysning. Behållarna tillsluts noga, förseglas, desinficeras och märks. Proven förvaras svalt (+4 °C) och undersöks inom tre till fyra timmar eller ställs över kolsyreis (–69 °C) eller flytande kväve och hålls frysta tills de ska undersökas. Probangen desinficeras mellan varje djur och sköljs tre gånger i rent vatten.

Test för FMD-virus

:

Proven ympas in i primära bovina sköldkörtelcellkulturer i minst tre rör per prov. Andra mottagliga celler, t.ex. primära njurceller från nötkreatur eller svin, kan användas men det måste beaktas att de är mindre mottagliga för vissa stammar av FMD-virus. Rören inkuberas vid 37 °C i en rollerapparat och undersöks dagligen i 48 timmar för förekomst av cytopatisk effekt (CPE). Om resultatet är negativt överförs kulturerna blint till nya kulturer och undersöks igen i 48 timmar. Eventuell CPE:s specificitet ska fastställas.

1.

0,08 M fosfatbuffert, pH 7,2, med 0,01 % bovint serumalbumin, 0,002 % fenolrött och antibiotika.

2.

Vävnadsodlingsmedium (t.ex. Eagles MEM) med 0,04 M Hepesbuffert, 0,01 % bovint serumalbumin och antibiotika, pH 7,2.

3.

Antibiotika (per ml slutprodukt) ska tillsättas till transportmediet, t.ex. penicillin 1 000 IE, neomycinsulfat 100 IE, polymyxin B-sulfat 50 IE, mycostatin 100 IE.

Reagens

:

Stam-FMDV-antigener bereds i cellkulturer eller på nötkreaturstungor och lagras vid –70 °C eller mindre eller vid –20 °C efter det att 50 % glycerol tillsatts. Detta är stamantigenet. FMDV är stabilt under dessa förhållanden och titern varierar mycket lite under en period på flera månader.

Metod

:

Testet utförs i en flatbottnad mikrotiterplatta av vävnadskulturgrad med hjälp av mottagliga celler som t. ex. IB-RS-2, BHK-21 eller kalvnjureceller. Serum för testet späds 1:4 i serumfritt cellkulturmedium med tillsats av 100 IU/ml neomycin eller annan lämplig antibiotika. Serum inaktiveras vid 56 °C i 30 minuter och volymer om 0,05 ml används för att bereda en spädningsserie i 1:2-steg på mikrotiterplattor med spädningssteg på 0,05 ml. Förtitrerat virus som också är utspätt i serumfritt odlingsmedium och innehåller 100 TCID50/0,05 ml tillsätts sedan till varje brunn. Efter inkubation vid 37 °C i en timme för att låta neutralisation äga rum tillsätts till varje brunn 0,05 ml cellsuspension som innehåller 0,5–1,0 × 106 celler/ml cellkulturmedium innehållande serum utan FMD-antikroppar, och plattorna förseglas. Plattorna inkuberas vid 37 °C. Enskiktslagren är vanligtvis utväxta inom 24 timmar. CPE har vanligtvis framskridit tillräckligt efter 48 timmar för att det ska gå att avläsa testet i mikroskop. Vid den tidpunkten kan en slutlig mikroskopisk avläsning göras eller så kan plattorna fixeras och färgas för en makroskopisk avläsning, till exempel med 10 % formaldehyd och 0,05 % metylenblått.

Kontroller

:

Kontrollerna av varje test omfattar homologt antiserum av känd titer, cellkontroll, serumtoxicitetskontroll, odlingsmediekontroll och virustitrering med hjälp av vilken den verkliga virusmängden i provet beräknas.

Tolkning

:

Brunnar som visar tecken på CPE anses vara infekterade och neutralisationstitrarna uttrycks som det reciproka värdet av den slutliga serumspädningen i virus-/serumblandningarna vid sluttitern 50 % uppskattad enligt Spearman-Karbermetoden. (Karber, G., 1931, Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie, 162, 480.) Test betraktas som giltiga när den verkliga virusmängd som använts per brunn är mellan 101,5 och 102,5 TCID50 och när referensserumets titer är mindre än dubbelt så hög som den väntade titern, uppskattad utifrån tidigare titreringars modus. Om kontrollvärdena ligger utanför dessa intervall upprepas testen. En sluttiter på 1:11 eller mindre betraktas som negativ.

Reagens

:

Kaninantiserum till 146S-antigen av sju typer av mul- och klövsjukevirus (FMDV) som används i en förutbestämd optimal koncentration i karbonat/bikarbonatbuffert, pH 9,6. Antigen bereds av utvalda virusstammar som odlats i enskiktslager av BHK-21-celler. De ej renade supernatanterna används och förtitreras enligt protokollet men utan serum, för att ge en spädning som efter tillsats av en lika stor mängd PBST (fosfatbuffrad saltlösning med 0,05 % Tween-20 och fenolrött som indikator) ger en absorbans på 1,2–1,5. Inaktiverat virus kan användas. Spädning görs med PBST. Marsvinsantiserum bereds genom att marsvin ympas med 146S-antigen av varje serotyp. En förutbestämd optimal koncentration bereds i PBST med 10 % normalt bovint serum och 5 % normalt kaninserum. Kanin-antimarsvinsimmunoglobulin konjugerat med pepparotsperoxidas används i en förutbestämd optimal koncentration i PBST med 10 % normalt bovint serum och 5 % normalt kaninserum. Testserum späds i PBST.

1.

ELISA-plattor beläggs med 50 µl kaninantivirusserum och inkuberas över natten i en fuktkammare vid rumstemperatur.

2.

50 µl av en dubbel spädningsserie i 1:2-steg av varje testserum, med början vid 1:4, bereds i rundbottnade flerbrunnsplattor (bärarplattor). 50 µl antigen med konstant koncentration tillsätts till varje brunn och blandningarna får stå över natten vid 4 °C. Tillsatsen av antigen gör att den första serumspädningen blir 1:8.

3.

ELISA-plattorna tvättas fem gånger med PBST.

4.

50 µl av serum-/antigenblandningar överförs sedan från bärarplattorna till de kaninserumtäckta ELISA-plattorna och inkuberas vid 37 °C i en timme i en roterande skak.

5.

Efter tvättning tillsätts 50 μl marsvinsantiserum till den antigen som används i punkt 4 till varje brunn. Plattorna inkuberas vid 37 °C i en timme i en roterande skak.

6.

Plattorna tvättas och 50 µl kanin-antimarsvinsimmunoglobulin konjugerat med pepparotsperoxidas tillsätts till varje brunn. Plattorna inkuberas vid 37 °C i en timme i en roterande skak.

7.

Plattorna tvättas och 50 μl ortofenylendiamin innehållande 0,05 % H2O2 (30 %) w/v tillsätts till varje brunn.

8.

Reaktionen avslutas efter 15 minuter med 1,25 M H2SO4.

Kontroller

:

För varje använd antigen innehåller 40 brunnar inget serum utan antigen utspätt i PBST. En dubbel spädningsserie i 1:2-steg av homologt bovint referensantiserum. En dubbel spädningsserie i 1:2-steg av negativt bovint serum.

Tolkning

:

Antikroppstitrarna uttrycks som den slutspädning av testserum som ger 50 % av det genomsnittliga OD-värde som uppmätts i viruskontrollbrunnarna utan testserum. Titrar som är högre än 1:40 betraktas som positiva.

Referenser

:

Hamblin, C., Barnett, I.T.R. och Hedger, R.S. (1986), A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA. Journal of Immunological Methods, 93, s. 115–121.11.

Serum

:

Alla serum inaktiveras genom uppvärmning till 56 °C i 30 minuter före användning.

Metod

:

Vid det konstanta virusvarierande serumneutralisationstestet i mikrotiterplattor används Vero-celler eller andra mottagliga cellsystem. AJD-virus används vid 100 TCID50 per 0,025 ml. Inaktiverade outspädda serumprov blandas med motsvarande mängd (0,025 ml) virussuspension. Virus-/serumblandningarna inkuberas i två timmar vid 37 °C på mikrotiterplattorna innan cellerna tillsätts. Cellerna används i en sådan koncentration att de bildar ett fullständigt enskiktslager efter 24 timmar.

Kontroller

:

i) Virusinfektivitetstest, ii) serumtoxicitetskontroller, iii) kontroller av oympad cellkultur, iv) referensantiserum.

Tolkning

:

Resultaten av neutralisationstestet och titern för det virus som används i testet registreras efter tre till sju dagars inkubation vid 37 °C. Serumtitrar under 1:2 (outspätt serum) betraktas som negativa.

Serum

:

Alla serum inaktiveras genom uppvärmning till 56 °C i 30 minuter före användning.

Metod

:

Vid det konstanta virusvarierande serumneutralisationstestet på mikrotiterplattor används A72-celler (hundtumör) eller andra mottagliga cellsystem. TGE-virus används vid 100 TCID50 per 0,025 ml. Inaktiverade outspädda serumprov blandas med motsvarande mängd (0,025 ml) virussuspension. Virus-/serumblandningarna inkuberas i 30–60 minuter vid 37 °C på mikrotiterplattorna innan cellerna tillsätts. Cellerna används i en sådan koncentration att de bildar ett fullständigt enskiktslager efter 24 timmar. Till varje brunn tillsätts 0,1 ml cellsuspension.

Kontroller

:

i) Virusinfektivitetstest, ii) serumtoxicitetskontroller, iii) kontroller av oympad cellkultur, iv) referensantiserum.

Tolkning

:

Resultaten av neutralisationstestet och titern för det virus som används i testet registreras efter tre till fem dagars inkubation vid 37 °C. Serumtitrar under 1:2 (slutspädning) betraktas som negativa. Om outspädda serumprov har en toxisk effekt på vävnadsodlingen får dessa serum spädas 1:2 innan de används i testet. Det motsvarar en slutspädning av serumet på 1:4. Serumtitrar på mindre än 1:4 (slutspädning) betraktas som negativa i dessa fall.

a)

Djuren kan föras in på karantänsstationen i separata sändningar. Vid införandet på karantänstationen ska dock samtliga djur av en och samma art på den enskilda karantänen betraktas som en enda grupp och det bör hänvisas till dem som en enda grupp. Karantänsperioden för gruppen som helhet inleds när det sista djuret förs in på den enskilda karantänen.

b)

På karantänsstationen ska de enstaka grupperna av djur hållas isolerade utan någon direkt eller indirekt kontakt med andra djur, ej heller med djur från andra sändningar som eventuellt finns på stationen.

Varje sändning ska hållas på den godkända karantänsstationen och skyddas mot insektsvektorer.

c)

Om isoleringen av en grupp djur bryts under karantänsperioden och djuren har kontakt med andra djur, ska en ny karantänsperiod påbörjas som är lika lång som den som föreskrevs när djuren ursprungligen togs in på karantänsstationen.

d)

Djur som ska föras in till unionen och som passerar genom karantänsstationen ska lastas och avsändas direkt till unionen

a)

De ska stå under en officiell veterinärs tillsyn.

b)

De ska ligga mitt i ett område med minst 20 km i diameter där det enligt officiella uppgifter inte har förekommit något fall av mul- och klövsjuka på minst 30 dagar innan de började användas som karantänsstation.

c)

De ska innan de används som karantänsstation rengöras och desinficeras med ett desinfektionsmedel som i Saint-Pierre och Miquelon är officiellt godkänt som effektivt för bekämpning av sjukdomarna i kapitel 2.

d)

De ska beroende på mottagningskapaciteten ha följande:

e)

När karantänanläggningen är i drift ska det finnas tillräckligt många veterinärer för att utföra alla uppgifter.

f)

De får endast ta emot djur som är individuellt märkta så att spårbarheten kan säkerställas. Karantänsstationens ägare eller den som är ansvarig för karantänsstationen ska därför se till att djuren är korrekt identifierade och åtföljs av de hälsointyg som krävs för de berörda arterna och kategorierna. Karantänsstationens ägare eller den som är ansvarig för karantänsstationen ska dessutom i ett register eller en databas föra in uppgifter, som ska sparas i minst tre år, om namn på ägare, ursprung för de djur som ingår i sändningen, dag då dessa djur anlände till respektive lämnade karantänsstationen, djurens identifikationsnummer samt deras bestämmelseort.

g)

Den behöriga myndigheten ska fastställa förfarandet för den offentliga tillsynen av karantänsstationen och se till att sådan tillsyn utförs. Denna tillsyn ska omfatta regelbundna besiktningar för att fastställa om kraven för godkännande fortfarande uppfylls. Om dessa inte uppfylls och godkännandet tillfälligt återkallas kan det återfås först när den behöriga myndigheten har förvissat sig om att karantänanläggningen uppfyller samtliga villkor i a–g.

a)

Test som ska användas: Jämförande intradermalt reaktionstest med bovint PPD och aviärt PPD som uppfyller framställningsnormerna för bovint och aviärt tuberkulin i punkt 2.1.2 i bilaga B till direktiv 64/432/EEG.

Testet ska göras i området bakom skuldran (armhålan) enligt den teknik som beskrivs i punkt 2.2.4 i bilaga B till direktiv 64/432/EEG.

b)

Tidpunkt: Djuren ska testas inom två dagar från ankomsten till karantänsstationen och 42 dagar efter det första testet.

c)

Tolkning av testresultaten:

Reaktionen ska anses vara

d)

Möjliga åtgärder efter testning:

Om ett djur uppvisar ett positivt resultat på det intradermala provet med bovint PPD ska detta djur uteslutas ur gruppen och de andra djuren ska testas på nytt med början minst 42 dagar efter det att det första positiva testet genomfördes. Detta ska anses vara det första testet enligt b.

Om mer än ett djur i gruppen uppvisar positivt resultat ska hela gruppen nekas export till unionen.

Om ett eller flera djur i samma grupp uppvisar ett tveksamt resultat ska hela gruppen testas på nytt med början minst 42 dagar efter det att det första testet genomfördes. Detta ska anses vara det första testet enligt b.

a)

Test som ska användas:

b)

Tidpunkt: Djuren ska testas inom två dagar från ankomsten till karantänsstationen och 42 dagar efter det första testet.

c)

Tolkning av testresultaten:

En positiv reaktion följer definitionen i bilaga C till direktiv 64/432/EEG.

d)

Möjliga åtgärder efter testning:

Djur som uppvisar positivt resultat på ett av testen ska uteslutas ur gruppen och de andra djuren ska testas på nytt med början minst 42 dagar efter det att det första positiva testet genomfördes. Detta ska anses vara det första testet enligt b.

Endast djur som uppvisar negativa resultat i två test i följd som genomförts enligt b ska få föras in till unionen.

a)

Test som ska användas: AGID-test enligt beskrivningen i del 6 i bilaga I till förordning (EU) nr 206/2010 (SANCO/4787/2009).

Om reaktionen är positiv ska djuren testas med kompetitivt ELISA-test enligt beskrivningen i del 6 bilaga I till förordning (EU) nr 206/2010 (SANCO/4787/2009) för att skilja på sjukdomarna.

b)

Tidpunkt:

Djuren ska uppvisa negativt resultat på två test: det första inom två dagar från ankomsten till karantänsstationen och det andra minst 21 dagar efter det första testet.

c)

Möjliga åtgärder efter testning:

a)

Test som ska användas: Diagnostiska test (probang och serologi) med ELISA och virusneutralisation enligt protokollen i del 6 i bilaga I till förordning (EU) nr 206/2010 (SANCO/4787/2009).

b)

Tidpunkt: Djuren ska uppvisa negativt resultat på två test: det första inom två dagar från ankomsten till karantänsstationen och det andra minst 42 dagar efter det första testet.

c)

Möjliga åtgärder efter testning: Om något djur reagerar positivt på mul- och klövsjukevirus får inget av djuren på karantänsstationen föras in till unionen.

Anmärkning: Påvisande av antikroppar mot strukturella eller icke-strukturella proteiner från mul- och klövsjukevirus ska anses som ett resultat av tidigare infektion i mul- och klövsjuka oberoende av vaccinationsstatus.

a)

Test som ska användas: Kompetitivt ELISA-test enligt beskrivningen i senaste versionen av OIE:s Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals är det test som föreskrivs vid internationell handel och det test som ska väljas. Serumneutralisation eller andra godkända test enligt protokollen i relevanta avsnitt av OIE:s manual får också användas.

b)

Tidpunkt: Djuren ska testas två gånger: det första testet inom två dagar från ankomsten till karantänsstationen och det andra minst 42 dagar efter det första testet.

c)

Möjliga åtgärder efter testning: Om något djur reagerar positivt på boskapspestvirus får inget av djuren på karantänsstationen föras in till unionen.

a)

Test som ska användas: ELISA, virusneutralisation eller andra godkända test enligt protokollen i relevanta avsnitt av OIE:s manual.

b)

Tidpunkt: Djuren ska testas två gånger: det första testet inom två dagar från ankomsten till karantänsstationen och det andra minst 42 dagar efter det första testet.

c)

Möjliga åtgärder efter testning: Om något djur reagerar positivt på virus för vesikulär stomatit får inget av djuren på karantänsstationen föras in till unionen.

a)

Test som ska användas: ELISA, virusneutralisation eller andra godkända test enligt protokollen i relevanta avsnitt av OIE:s manual.

b)

Tidpunkt: Djuren ska testas två gånger: det första testet inom två dagar från ankomsten till karantänsstationen och det andra minst 42 dagar efter det första testet.

c)

Möjliga åtgärder efter testning: Om något djur visar tecken på exponering för smittämnet för Rift Valley-feber får inget av djuren på karantänsstationen föras in till unionen.

a)

Test som ska användas: Serologi med ELISA, virusneutralisation eller andra godkända test enligt protokollen i relevanta avsnitt av OIE:s manual.

b)

Tidpunkt: Djuren ska testas två gånger: det första testet inom två dagar från ankomsten till karantänsstationen och det andra minst 42 dagar efter det första testet.

c)

Möjliga åtgärder efter testning: Om något djur visar tecken på exponering för lumpy skin disease får inget av djuren på karantänsstationen föras in till unionen.

a)

Test som ska användas: ELISA, virusneutralisation, immunofluorescens eller andra godkända test.

b)

Tidpunkt: Djuren ska testas två gånger: det första testet inom två dagar från ankomsten till karantänsstationen och det andra minst 42 dagar efter det första testet.

c)

Möjliga åtgärder efter testning: Om något djur visar tecken på exponering för smittämnet för Krim-Kongo hemorragisk feber får inget av djuren på karantänsstationen föras in till unionen.

a)

Test som ska användas: Den parasit som är smittämne kan identifieras i koncentrerade blodprov enligt protokollen i relevanta avsnitt av OIE:s manual.

b)

Tidpunkt: Djuren ska testas två gånger: det första testet inom två dagar från ankomsten till karantänsstationen och det andra minst 42 dagar efter det första testet.

c)

Möjliga åtgärder efter testning: Om T. evansi påvisas hos något av djuren i sändningen får detta djur inte föras in till unionen. De återstående djuren i gruppen ska därefter genomgå en invärtes och utvärtes behandling mot parasiter med lämpliga medel som är verksamma mot T. evansi.

a)

Test som ska användas: Påvisande av virus-DNA utifrån identifiering genom immunofluorescens eller immuncytokemi enligt protokollen i relevanta avsnitt av OIE:s manual.

b)

Tidpunkt: Djuren ska testas två gånger: det första testet inom två dagar från ankomsten till karantänsstationen och det andra minst 42 dagar efter det första testet.

c)

Möjliga åtgärder efter testning: Om något djur visar tecken på exponering för elakartad katarralfeber får inget av djuren på karantänsstationen föras in till unionen.

a)

Test som ska användas: AGID eller blockerande ELISA enligt protokollen i senaste versionen av OIE:s manual.

b)

Tidpunkt: Djuren ska testas två gånger: det första testet inom två dagar från ankomsten till karantänsstationen och det andra minst 42 dagar efter det första testet.

c)

Möjliga åtgärder efter testning: Djur som uppvisar positivt resultat på testet i a ska uteslutas ur gruppen på den enskilda karantänen och de andra djuren ska testas på nytt med början minst 21 dagar efter det att det första positiva testet genomfördes. Detta ska anses vara det första testet enligt b.

Endast djur som uppvisar negativa resultat i två test i följd som genomförts enligt b ska få föras in till unionen.

”BOV”

:

Förlaga till veterinärintyg för färskt kött, inbegripet malet kött, från tamdjur av nötkreatur (inklusive arter av Bison och Bubalus samt korsningar av dessa).

”OVI”

:

Förlaga till veterinärintyg för färskt kött, inbegripet malet kött, från tamfår (Ovis aries) och tamget (Capra hircus).

”POR”

:

Förlaga till veterinärintyg för färskt kött, inbegripet malet kött, från tamsvin (Sus scrofa).

”EQU”

:

Förlaga till veterinärintyg för färskt kött, utom malet kött, från tama hästdjur (Equus caballus, Equus asinus samt korsningar av dessa).

”RUF”

:

Förlaga till veterinärintyg för färskt kött, utom slaktbiprodukter och malet kött, från hägnade icke-domesticerade djur av ordningen Artiodactyla (utom nötkreatur (inklusive arter av Bison och Bubalus samt korsningar av dessa), Ovis aries, Capra hircus, Suidae och Tayassuidae) och av familjerna Rhinocerotidae och Elephantidae.

”RUW”

:

Förlaga till veterinärintyg för färskt kött, utom slaktbiprodukter och malet kött, från frilevande icke-domesticerade djur av ordningen Artiodactyla (utom nötkreatur (inklusive arter av Bison och Bubalus samt korsningar av dessa), Ovis aries, Capra hircus, Suidae och Tayassuidae) och av familjerna Rhinocerotidae och Elephantidae.

”SUF”

:

Förlaga till veterinärintyg för färskt kött, utom slaktbiprodukter och malet kött, från hägnade icke-domesticerade djur av familjerna Suidae, Tayassuidae och Tapiridae.

”SUW”

:

Förlaga till veterinärintyg för färskt kött, utom slaktbiprodukter och malet kött, från frilevande icke-domesticerade djur av familjerna Suidae, Tayassuidae och Tapiridae.

”EQW”

:

Förlaga till veterinärintyg för färskt kött, utom slaktbiprodukter och malet kött, från frilevande hästdjur av undersläktet Hippotigris (zebra).

”A”

:

Garantier avseende mognadslagring, pH-mätning och urbening av färskt kött, utom slaktbiprodukter, för vilket intyg utfärdats i enlighet med förlagorna till veterinärintyg BOV (punkt II.2.6), OVI (punkt II.2.6), RUF (punkt II.2.7) och RUW (punkt II.2.4).

”C”

:

Garantier för att laboratorietest för klassisk svinpest har utförts på slaktkroppar från vilka färskt kött har erhållits för vilket intyg utfärdats i enlighet med förlaga till veterinärintyg SUW (punkt II.2.3 B).

”D”

:

Garantier avseende utfodring med matavfall på anläggningar av djur från vilka färskt kött har erhållits för vilket intyg utfärdats i enlighet med förlaga till veterinärintyg POR (punkt II.2.3 d).

”E”

:

Garantier för att tuberkulostest har utförts på djur från vilka färskt kött har erhållits för vilket intyg utfärdats i enlighet med förlaga till veterinärintyg BOV (punkt II.2.4 d).

”F”

:

Garantier avseende mognadslagring och urbening av färskt kött, utom slaktbiprodukter, för vilket intyg utfärdats i enlighet med förlagorna till veterinärintyg BOV (punkt II.2.6), OVI (punkt II.2.6), RUF (punkt II.2.6) och RUW (punkt II.2.7).

”G”

:

Garantier avseende 1) undantag för slaktbiprodukter och ryggmärg samt 2) testning och ursprung för hjortdjur när det gäller chronic wasting disease (CWD) enligt förlagorna till veterinärintyg RUF (punkt II.1.7) och RUW (punkt II.1.8).

”H”

:

Tilläggsgarantier som krävs för Brasilien rörande kontakter med djur, vaccinationsprogram och övervakning. Eftersom delstaten Santa Catarina i Brasilien inte vaccinerar mot mul- och klövsjuka, gäller hänvisningen till ett vaccinationsprogram emellertid inte kött som kommer från djur som har sitt ursprung i och slaktas i den delstaten.

*

Krav enligt avtalet mellan Europeiska gemenskapen och Schweiziska edsförbundet om handel med jordbruksprodukter (EGT L 114, 30.4.2002, s. 132).

-

Inget intyg har fastställts och import av färskt kött är inte tillåten (utom för de arter som anges på raden för hela landet).

a)

Veterinärintyg ska utfärdas av det exporterande tredjelandet på grundval av förlagorna i del 2 i bilagorna I, II och IV samt i bilaga III, i enlighet med förlagan för respektive levande djur/färska kött.

De ska i den nummerordning som anges i förlagan innehålla de intyganden som krävs för det berörda tredjelandet och, i tillämpliga fall, de tilläggsgarantier som krävs för det exporterande tredjelandet eller delen därav.

Om bestämmelsemedlemsstaten kräver att de berörda levande djuren/det berörda färska köttet uppfyller extra intygskrav, ska det i originalet till veterinärintyget intygas att dessa krav uppfylls.

b)

Om det i förlagan till intyg anges att ej tillämpliga förklaringar ska strykas, får intygsutfärdaren stryka över, parafera och stämpla förklaringar som inte är relevanta eller stryka dem ur intyget.

c)

Ett separat och unikt intyg ska utfärdas för de levande djur/det färska kött som exporteras från ett eller flera områden i ett och samma exportland som omnämns i kolumnerna 2 och 3 i del 1 i bilaga I, II eller IV och som sänds till samma destination och transporteras i samma järnvägsvagn, lastbil, flygplan eller fartyg.

d)

Originalet till varje intyg ska bestå av ett enda blad eller, om mer text krävs, utformas på ett sådant sätt att alla blad som behövs utgör en enda odelbar enhet.

e)

Veterinärintyget ska vara avfattat på minst ett av de officiella språken i den medlemsstat där den gränskontrollstation där sändningen förs in till unionen ligger och på minst ett av de officiella språken i bestämmelsemedlemsstaten. Dessa medlemsstater kan dock tillåta att intyget avfattas på det officiella språket i en annan medlemsstat och vid behov åtföljs av en officiell översättning.

f)

Om det för identifiering av varorna i sändningen (schemat i punkt I.28 i förlagan till veterinärintyg) bifogas ytterligare blad till intyget, ska även dessa blad betraktas som en del av originalintyget och intygsutfärdaren ska underteckna och stämpla på varje sida.

g)

Om intyget, med de ytterligare sidor som avses i f, består av mer än en sida ska varje sida numreras – (sidans nummer) av (det totala antalet sidor) – längst ned på sidan, medan intygets kodnummer, som fastställts av den behöriga myndigheten, ska anges högst upp på sidan.

h)

Intygets original ska fyllas i och undertecknas av en officiell veterinär eller av en annan utsedd officiell inspektör då detta föreskrivs i förlagan till veterinärintyg. När det gäller levande djur ska intyget fyllas i och undertecknas högst 24 timmar innan sändningen lastas för införsel till unionen. De behöriga myndigheterna i det exporterande tredjelandet ska se till att de bestämmelser om utfärdande av intyg som följs är likvärdiga med dem som anges i direktiv 96/93/EG (1).

Underskriften ska ha annan färg än den tryckta texten. Detta gäller även för stämplar, med undantag för präglade stämplar och vattenstämplar.

i)

Det intygsnummer som anges i fälten I.2 och II.a ska tilldelas av den behöriga myndigheten