Help Print this page 

Document 32016R0266

Title and reference
Kommissionens förordning (EU) 2016/266 av den 7 december 2015 om ändring, för anpassning till den tekniska utvecklingen, av förordning (EG) nr 440/2008 om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach) (Text av betydelse för EES)

C/2015/8529
  • In force
OJ L 54, 1.3.2016, p. 1–446 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2016/266/oj
Languages, formats and link to OJ
BG ES CS DA DE ET EL EN FR GA HR IT LV LT HU MT NL PL PT RO SK SL FI SV
HTML html BG html ES html CS html DA html DE html ET html EL html EN html FR html HR html IT html LV html LT html HU html MT html NL html PL html PT html RO html SK html SL html FI html SV
PDF pdf BG pdf ES pdf CS pdf DA pdf DE pdf ET pdf EL pdf EN pdf FR pdf HR pdf IT pdf LV pdf LT pdf HU pdf MT pdf NL pdf PL pdf PT pdf RO pdf SK pdf SL pdf FI pdf SV
Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal Display Official Journal
 To see if this document has been published in an e-OJ with legal value, click on the icon above (For OJs published before 1st July 2013, only the paper version has legal value).
Multilingual display
Text

1.3.2016   

SV

Europeiska unionens officiella tidning

L 54/1


KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EU) 2016/266

av den 7 december 2015

om ändring, för anpassning till den tekniska utvecklingen, av förordning (EG) nr 440/2008 om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach)

(Text av betydelse för EES)

EUROPEISKA KOMMISSIONEN HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING

med beaktande av fördraget om Europeiska unionens funktionssätt,

med beaktande av Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 av den 18 december 2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach), inrättande av en europeisk kemikaliemyndighet, ändring av direktiv 1999/45/EG och upphävande av rådets förordning (EEG) nr 793/93 och kommissionens förordning (EG) nr 1488/94 samt rådets direktiv 76/769/EEG och kommissionens direktiv 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG och 2000/21/EG (1), särskilt artikel 13.2, och

av följande skäl:

(1)

I kommissionens förordning (EG) nr 440/2008 (2) fastställs testmetoder som ska användas för tillämpning av förordning (EG) nr 1907/2006 när det gäller bestämning av kemikaliers fysikalisk-kemiska egenskaper, toxicitet och ekotoxicitet.

(2)

Det är nödvändigt att uppdatera förordning (EG) nr 440/2008 för att införa nya och uppdaterade testmetoder som nyligen har antagits av OECD, i syfte att ta hänsyn till tekniska framsteg och säkerställa minskning av antalet djur som används för försök, i enlighet med Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU (3). Samråd har förts med berörda parter om detta utkast.

(3)

Anpassningen omfattar tjugo testmetoder: en ny metod för bestämning av fysikalisk-kemiska egenskaper, elva nya testmetoder och tre uppdaterade testmetoder för bedömning av ekotoxicitet samt fem nya testmetoder för att bedöma omvandling, spridning och fördelning i miljön.

(4)

Förordning (EG) nr 440/2008 bör därför ändras i enlighet med detta.

(5)

De åtgärder som föreskrivs i denna förordning är förenliga med yttrandet från den kommitté som inrättats i enlighet med artikel 133 i förordning (EG) nr 1907/2006.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 ska ändras i enlighet med bilagan till den här förordningen.

Artikel 2

Denna förordning träder i kraft den tredje dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.

Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater.

Utfärdad i Bryssel den 7 december 2015.

På kommissionens vägnar

Jean-Claude JUNCKER

Ordförande


(1)  EUT L 396, 30.12.2006, s. 1.

(2)  Kommissionens förordning (EG) nr 440/2008 av den 30 maj 2008 om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach) (EUT L 142, 31.5.2008, s. 1).

(3)  Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (EUT L 276, 20.10.2010, s. 33).


BILAGA

Bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 ska ändras på följande sätt:

(1)

En anmärkning införs i början av bilagan, före del A:

”Anmärkning:

Innan någon av följande testmetoder används för att testa ett multikomponentämne, ett ämne med okänd eller varierande sammansättning, komplexa reaktionsprodukter och biologiskt material (UVCB-ämne), eller en blandning, och där metodens tillämplighet för att testa multikomponentämnen, UVCB-ämnen eller blandningar inte anges i respektive testmetod, bör det övervägas om metoden är lämplig för det avsedda regleringssyftet.

Om testmetoden används för att testa ett multikomponentämne, ett UVCB-ämne eller en blandning ska tillräcklig information om ämnets/blandningens sammansättning göras tillgänglig så långt detta är möjligt, t.ex. genom angivande av beståndsdelarnas kemiska identitet, kvantitativa förekomst och relevanta egenskaper.”

(2)

Kapitel A.24 ska läggas till:

A.24.   FÖRDELNINGSKOEFFICIENT (N-OKTANOL/VATTEN), VÄTSKEKROMATOGRAFIMETODEN (HPLC)

INLEDNING

Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 117 (2004).

1.

Fördelningskoefficienten (P) definieras som förhållandet mellan jämviktskoncentrationerna för ett ämne som lösts i ett tvåfassystem bestående av två i stort sett icke blandbara lösningsmedel. När det gäller n-oktanol och vatten är

Formula

Eftersom fördelningskoefficienten är kvoten av två koncentrationer är den dimensionslös. Den uttrycks vanligen i form av en 10-logaritm.

2.

Pow är en viktig parameter i studier av kemiska ämnens omvandling, spridning och fördelning i miljön. Ett högsignifikant förhållande mellan Pow för icke-joniserade ämnen och deras bioackumulering i fisk har påvisats. Det har också visats att Pow är en användbar parameter vid uppskattning av adsorption till jord och sediment och för fastställande av kvantitativa struktur-aktivitetssamband för ett stort antal biologiska effekter.

3.

Det ursprungliga förslaget till denna testmetod grundades på en artikel av C. V. Eadsforth och P. Moser (1). Utvecklingen av testmetoden och OECD:s jämförelse mellan laboratorier samordnades av den federala tyska miljöskyddsmyndigheten (Umweltbundesamt) under 1986

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN

4.

Värden för log Pow i området – 2 till 4 (ibland upp till 5 eller däröver) (1) kan bestämmas experimentellt genom skakkolvmetoden (kapitel A.8 i denna bilaga, OECD:s testriktlinje 107). HPLC-metoden omfattar log Pow i intervallet 0 till 6 (1) (2) (3) (4) (5). Denna metod kan kräva en uppskattning av Pow för att välja ut lämpliga referensämnen och underbygga de slutsatser som dras utifrån erhållna testdata. Beräkningsmetoderna diskuteras kortfattat i tillägget till denna testmetod. HPLC-driftläget är isokratiskt.

5.

Värdena för Pow beror på miljöfaktorer såsom temperatur, pH, jonstyrka osv., och dessa bör definieras i experimentet för en korrekt tolkning av Pow-data. För joniserbara ämnen kan en annan metod (t.ex. utkast till OECD-riktlinjer för den pH-metriska metoden för joniserade ämnen (6)) komma att bli tillgänglig och skulle kunna användas som alternativ metod. Även om detta utkast till OECD-riktlinjer kan vara lämpligt för att bestämma Pow för sådana joniserbara ämnen är det i vissa fall lämpligare att använda HPLC-metoden vid ett miljömässigt relevant pH-värde (se punkt 9).

PRINCIP FÖR TESTMETODEN

6.

Omvänd-fas-kromatografi utförs på analyskolonner som är packade med en kommersiellt tillgänglig fast fas innehållande långa kolvätekedjor (t.ex. C8, C18), vilka är kemiskt bundna till kiseldioxid.

7.

En kemikalie som injiceras i en sådan kolonn kommer att fördelas mellan den mobila lösningsmedelsfasen och den stationära kolvätefasen när den transporteras genom kolonnen av den mobila fasen. Ämnena hålls kvar i proportion till sin fördelningskoefficient kolväte/vatten. Hydrofila ämnen elueras ut först och lipofila ämnen sist. Retentionstiden beskrivs av kapacitetsfaktorn k, som ges av formeln

Formula

där tR är testämnets retentionstid och t0 är dödtiden, dvs. den genomsnittliga tid det tar för en lösningsmedelsmolekyl att passera genom kolonnen. Det krävs inga kvantitativa analysmetoder, och endast bestämningen av retentionstiderna är nödvändig.

8.

Fördelningskoefficienten oktanol/vatten för ett testämne kan beräknas genom att man experimentellt bestämmer dess kapacitetsfaktor k och därefter för in k i formeln

Formula

där

a, b

=

linjära regressionskoefficienter.

Ovanstående formel kan erhållas genom linjär regression av log av fördelningskoefficienterna oktanol/vatten för referensämnena mot log av kapacitetsfaktorerna för referensämnena.

9.

Metoden med omvänd-fas-kromatografi gör det möjligt att uppskatta fördelningskoefficienter i log Pow-området mellan 0 och 6, men kan i undantagsfall utvidgas till att omfatta log Pow-området mellan 6 och 10. Detta kan innebära att den mobila fasen måste modifieras (3). Metoden kan inte användas för starka syror och baser, metallkomplex, ämnen som reagerar med eluenten eller ytaktiva medel. Mätningar på joniserbara ämnen kan utföras på den icke-joniserade formen (fri syra eller fri bas) endast genom användning av en lämplig buffert med ett pH-värde under pKa för en fri syra eller över pKa för en fri bas. Alternativt kan den pH-metriska metoden för testning av joniserbara ämnen (6) komma att bli tillgänglig och skulle kunna användas som alternativ metod (6). Om log Pow-värdet fastställs för att användas i en miljöfarlighetsklassificering eller miljöriskbedömning, bör testet utföras med ett pH-värde som är relevant för den naturliga miljön, dvs. på mellan 5,0 och 9.

10.

I vissa fall kan orenheter göra det svårt att tolka resultaten, eftersom toppvärdena blir osäkra. För blandningar med ett oupplöst band anges en övre och nedre gräns för log Pow, och areaprocenten för varje log Pow-topp ska rapporteras. För blandningar som utgörs av en grupp homologer bör även det vägda genomsnittet för log Pow anges (7), beräknat på de enskilda Pow-värdena och motsvarande areaprocentvärden (8). Alla toppar som bidrar med minst 5 % av den totala topparean bör beaktas i beräkningen (9):

Formula

Det vägda genomsnittet för log Pow gäller endast för ämnen eller blandningar (t.ex. talloljor) som består av homologer (t.ex. alkanserier). Blandningar kan mätas med meningsfulla resultat förutsatt att den analytiska detektor som används har samma känslighet för alla ämnen i blandningen och en lämplig upplösning kan erhållas.

INFORMATION OM TESTÄMNET

11.

Dissociationskonstant, strukturformel och löslighet i den mobila fasen bör vara kända innan metoden används. Dessutom kan information om hydrolys vara till nytta.

KVALITETSKRITERIER

12.

För att öka mätningens tillförlitlighet ska dubbla bestämningar göras.

Repeterbarhet: Värdet på log Pow från upprepade mätningar som gjorts under identiska förhållanden och med användning av samma uppsättning referensämnen ska ligga inom ± 0,1 logaritmenheter.

Reproducerbarhet: Om mätningarna upprepas med en annan uppsättning referensämnen kan resultaten skilja sig åt. Vanligtvis är korrelationskoefficienten R för förhållandet mellan log k och log Pow för en uppsättning testämnen omkring 0,9, vilket motsvarar en fördelningskoefficient oktanol/vatten på log Pow ± 0,5 logaritmenheter.

13.

Jämförelsen mellan laboratorier har visat att man med HPLC-metoden kan erhålla värden på log Pow som ligger inom ± 0,5 enheter av värdena från skakkolvmetoden (2). Andra jämförelser återfinns i referenserna (4) (5) (10) (11) (12). Korrelationsdiagram baserade på strukturellt besläktade referensämnen ger tillförlitligast resultat (13).

REFERENSÄMNEN

14.

För att kunna korrelera den uppmätta kapacitetsfaktorn k för ett ämne med dess Pow måste en kalibreringskurva med minst 6 punkter upprättas (se punkt 24). Det är upp till användaren att välja lämpliga referensämnen. Referensämnena bör normalt sett ha log Pow-värden som omger testämnets log Pow-värde, dvs. minst ett referensämne bör ha ett Pow-värde som ligger över testämnets, och minst ett bör ha ett Pow-värde som ligger under testämnets. Extrapolering bör endast användas i undantagsfall. Referensämnena ska helst vara strukturellt besläktade med testämnet. Referensämnenas log Pow-värden för kalibreringen bör baseras på tillförlitliga experimentella data. För ämnen med högt log Pow-värde (normalt över 4) kan dock beräknade värden användas om tillförlitliga experimentella data inte finns tillgängliga. Om extrapolerade värden används bör ett gränsvärde anges.

15.

Det finns omfattande listor över log Pow-värden för många grupper av kemikalier (14) (15). Om data rörande fördelningskoefficienter för strukturellt besläktade ämnen inte finns att tillgå kan en mer allmän kalibrering med andra referensämnen användas. Rekommenderade referensämnen och deras Pow-värden anges i tabell 1. För joniserbara ämnen gäller de angivna värdena den icke-joniserade formen. Värdena kontrollerades i fråga om trovärdighet och kvalitet i samband med jämförelsen mellan laboratorierna.

Tabell 1

Rekommenderade referensämnen

 

CAS-nummer

Referensämne

Log Pow

pKa

1

78-93-3

2-Butanon

(metyletylketon)

0,3

 

2

1122-54-9

4-Acetylpyridin

0,5

 

3

62-53-3

Anilin

0,9

 

4

103-84-4

Acetanilid

1,0

 

5

100-51-6

Bensylalkohol

1,1

 

6

150-76-5

4-Metoxifenol

1,3

pKa = 10,26

7

122-59-8

Fenoxiättiksyra

1,4

pKa = 3,12

8

108-95-2

Fenol

1,5

pKa = 9,92

9

51-28-5

2,4-Dinitrofenol

1,5

pKa = 3,96

10

100-47-0

Bensonitril

1,6

 

11

140-29-4

Bensylcyanid

1,6

 

12

589-18-4

4-Metylbensenalkohol

1,6

 

13

98-86-2

Acetofenon

1,7

 

14

88-75-5

2-Nitrofenol

1,8

pKa = 7,17

15

121-92-6

3-Nitrobensoesyra

1,8

pKa = 3,47

16

106-47-8

4-Kloranilin

1,8

pKa = 4,15

17

98-95-3

Nitrobensen

1,9

 

18

104-54-1

Kanelalkohol

1,9

 

19

65-85-0

Bensoesyra

1,9

pKa = 4,19

20

106-44-5

p-Kresol

1,9

pKa = 10,17

21

140-10-3

(trans)

Kanelsyra

2,1

pKa = 3,89 (cis)

4,44 (trans)

22

100-66-3

Anisol

2,1

 

23

93-58-3

Metylbensoat

2,1

 

24

71-43-2

Bensen

2,1

 

25

99-04-7

3-Metylbensoesyra

2,4

pKa = 4,27

26

106-48-9

4-Klorfenol

2,4

pKa = 9,1

27

79-01-6

Trikloretylen

2,4

 

28

1912-24-9

Atrazin

2,6

 

29

93-89-0

Etylbensoat

2,6

 

30

1194-65-6

2,6-Diklorbensonitril

2,6

 

31

535-80-8

3-Klorbensoesyra

2,7

pKa = 3,82

32

108-88-3

Toluen

2,7

 

33

90-15-3

1-Naftol

2,7

pKa = 9,34

34

608-27-5

2,3-Dikloranilin

2,8

 

35

108-90-7

Klorbensen

2,8

 

36

1746-13-0

Allylfenyleter

2,9

 

37

108-86-1

Bromobensen

3,0

 

38

100-41-4

Etylbensen

3,2

 

39

119-61-9

Bensofenon

3,2

 

40

92-69-3

4-Fenylfenol

3,2

pKa = 9,54

41

89-83-8

Tymol

3,3

 

42

106-46-7

1,4-Diklorbensen

3,4

 

43

122-39-4

Difenylamin

3,4

pKa = 0,79

44

91-20-3

Naftalen

3,6

 

45

93-99-2

Fenylbensoat

3,6

 

46

98-82-8

Isopropylbensen

3,7

 

47

88-06-2

2,4,6-Triklorfenol

3,7

pKa = 6

48

92-52-4

Bifenyl

4,0

 

49

120-51-4

Bensylbensoat

4,0

 

50

88-85-7

2,4-Dinitro-6-sek-butylfenol

4,1

 

51

120-82-1

1,2,4-Triklorbensen

4,2

 

52

143-07-7

Laurinsyra

4,2

pKa = 5,3

53

101-84-8

Difenyleter

4,2

 

54

85-01-8

Fenantren

4,5

 

55

104-51-8

n-Butylbensen

4,6

 

56

103-29-7

Dibensyl

4,8

 

57

3558-69-8

2,6-Difenylpyridin

4,9

 

58

206-44-0

Fluoranten

5,1

 

59

603-34-9

Trifenylamin

5,7

 

60

50-29-3

DDT

6,5

 

BESKRIVNING AV TESTMETODEN

Preliminär uppskattning av fördelningskoefficienten

16.

Om det är nödvändigt att uppskatta testämnets fördelningskoefficient kan detta företrädesvis göras genom en beräkning (se tillägg) eller, i förekommande fall, genom att använda testämnets lösningsgrad i rena lösningsmedel.

Utrustning

17.

För testet krävs en vätskekromatograf försedd med en pulsfri pump och lämplig detekteringsutrustning. En UV-detektor för våglängden 210 nm eller en RI-detektor kan användas för ett stort antal kemiska grupper. Närvaron av polära grupper i den stationära fasen kan avsevärt försämra HPLC-kolonnens effektivitet. De stationära faserna bör därför ha lägsta möjliga procentuella innehåll av polära grupper (16). Ett kommersiellt mikroniserat packmaterial med omvänd fas eller färdigpackade kolonner kan användas. Eventuellt kan en förkolonn placeras mellan injektionssystemet och analyskolonnen.

Mobil fas

18.

Metanol av HPLC-kvalitet och destillerat eller avjonat vatten används för att framställa elueringsvätskan, som avgasas före användning. Isokratisk eluering bör användas. Den använda metanol/vattenblandningen ska innehålla minst 25 % vatten. Vanligtvis är en 3:1 (v/v) blandning av metanol/vatten lämplig för eluering av ämnen med ett log P-värde på 6 inom en timme, om flödeshastigheten är 1 ml/min. För ämnen med log P-värden över 6 kan det vara nödvändigt att minska elueringstiden (även för referensämnena) genom att använda en mindre polär mobil fas eller en kortare kolonn.

19.

Testämnet och referensämnena ska vara lösliga i den mobila fasen i en tillräckligt hög koncentration för att de ska kunna påvisas. Tillsatser får endast i undantagsfall användas i metanol/vattenblandningen, eftersom de ändrar kolonnens egenskaper. I sådana fall måste man se till att retentionstiden för test- och referensämnena inte påverkas. Om en metanol/vattenblandning inte är lämplig kan andra organiska lösningsmedel/vattenblandningar användas, t.ex. etanol/vatten, acetonitril/vatten eller isopropylalkohol (2-propanol)/vatten.

20.

Elueringsvätskans pH-värde är av största vikt för joniserbara ämnen. Värdet ska ligga inom kolonnens pH-värde under drift, normalt mellan 2 och 8. Det rekommenderas att man använder en buffert. Det är viktigt att undvika saltutfällning och försämring av kolonnen, vilket kan förekomma med vissa blandningar av organisk fas och buffert. HPLC-mätningar med kiseldioxidbaserade stationära faser med pH över 8 rekommenderas normalt inte, eftersom användning av en alkalisk mobil fas kan leda till att kolonnens effektivitet snabbt försämras.

Lösta ämnen

21.

Test- och referensämnena ska vara tillräckligt rena för att topparna i kromatogrammen ska kunna tillskrivas respektive ämne. Ämnen avsedda att användas för testning och kalibrering löses i den rörliga fasen om så är möjligt. Om ett annat lösningsmedel än den mobila fasen används för test- och referensämnena bör den mobila fasen användas för den slutliga utspädningen före injicering.

Testbetingelser

22.

Temperaturen under mätningarna bör inte variera med mer än ± 1 °C.

Bestämning av dödtiden t0

23.

Dödtiden t0 kan mätas med hjälp av organiska ämnen som inte hålls kvar (t.ex. tiourea eller formamid). En mer exakt dödtid kan härledas från de uppmätta retentionstiderna eller en uppsättning på ungefär sju komponenter i en homolog serie (t.ex. n-alkylmetylketoner) (17). Retentionstiderna tR (nC + 1) plottas mot tR (nC), där nC är antalet kolatomer. En rak linje, tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, erhålls, där A, som motsvarar k(nC + 1)/k(nC), är konstant. Dödtiden t0 erhålls från skärningspunkten mellan (1 – A)t0 och riktningskoefficienten A.

Regressionsformel

24.

Nästa steg består i att plotta en korrelation log k mot log P för lämpliga referensämnen med log P-värden som ligger nära det förväntade värdet för testämnet. I praktiken injiceras mellan 6 och 10 referensämnen samtidigt. Retentionstiderna bestäms, helst med en integrationsskrivare som är kopplad till detektionssystemet. Motsvarande logaritmer för kapacitetsfaktorerna, log k, plottas som en funktion av log P. Regressionsformeln beräknas regelbundet, minst en gång om dagen, så att hänsyn kan tas till eventuella ändringar i kolonnens effektivitet.

BESTÄMNING AV POW FÖR TESTÄMNET

25.

Minsta detekterbara mängd av testämnet injiceras. Dubbla bestämningar av retentionstiden görs. Fördelningskoefficienten för testämnet erhålls genom att interpolera den beräknade kapacitetsfaktorn på kalibreringskurvan. Vid mycket låga och mycket höga fördelningskoefficienter är det nödvändigt att extrapolera. Särskilt i dessa fall måste regressionslinjens konfidensgränser beaktas. Om retentionstiden för ett prov ligger utanför intervallet för de retentionstider som erhållits för referensämnena bör ett gränsvärde anges.

DATA OCH RAPPORTERING

Testrapport

26.

Följande ska ingå i rapporten:

om en bestämning gjorts ska den preliminära uppskattningen av fördelningskoefficienten, de uppskattade värdena och den metod som använts ingå, och om en beräkningsmetod använts ska en fullständig beskrivning ingå, inklusive identifiering av databasen och detaljerad information om val av fragment,

test- och referensämnen: renhetsgrad, strukturformel och CAS-nummer,

beskrivning av utrustningen och testbetingelserna: analyskolonn, förkolonn,

mobil fas, detektionssystem, temperaturområde, pH,

elueringsprofiler (kromatogram),

dödtiden och hur den uppmätts,

retentionsdata och publicerade referensvärden för log Pow för referensämnen som använts vid kalibrering,

närmare uppgifter om den anpassade regressionslinjen (log k mot log Pow) och korrelationskoefficienten på linjen inklusive konfidensintervallen,

genomsnittliga retentionsdata och interpolerat log Pow-värde för testämnet,

för blandningar: kromatogram för elueringsprofiler med angivna gränsvärden,

log Pow-värden i förhållande till areaprocenten för log Pow-toppen,

beräkning med hjälp av en regressionslinje,

i förekommande fall, beräknade vägda genomsnittsvärden för log Pow.

LITTERATUR

(1)

C. V. Eadsforth och P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss och H. J. Poremski. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

(3)

C. V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

(4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt och R. Fuerer (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide Science. 12, 219.

(5)

B. McDuffie (1981). Estimation of Octanol/Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

(6)

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Utkast till riktlinje, november 2000.

(7)

OSPAR (1995). ’Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995’, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), bilaga 10, Oviedo, 20–24 februari 1995.

(8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez och C. C. Karman. (1999). A User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3 augusti.

(9)

E. A. Vik, S. Bakke och K. Bansal. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, s. 529–537.

(10)

L. O. Renberg, S. G. Sundström och K. Sundh-Nygård. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

(11)

W. E. Hammers, G. J.Meurs och C.L. De-Ligny. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

(12)

J. E. Haky och A. M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

(13)

S. Fujisawa och E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates, Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

(14)

C. Hansch och A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Wiley, New York.

(15)

C. Hansch, ordförande; A. J. Leo, direktör. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity. Kan rekvireras från Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

R. F. Rekker och H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(17)

G. E. Berendsen, P. J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony och J. Inczédy. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

Tillägg

Beräkningsmetoder för POW

INLEDNING

1.

Detta tillägg ger en kort introduktion till beräkningen av Pow. För ytterligare uppgifter hänvisas läsaren till läroböcker (1) (2).

2.

Beräknade värden på Pow används för

att bestämma vilken försöksmetod som ska användas: skakkolvmetoden för log Pow-värden mellan – 2 och 4 och HPLC-metoden för log Pow-värden mellan 0 och 6,

valet av testförhållanden för HPLC (referensämnen, förhållandet metanol/vatten),

kontroll av rimligheten för de värden som erhålls genom experimentella metoder,

att tillhandahålla en uppskattning för fall där experimentella metoder inte kan användas.

Princip för beräkningsmetoderna

3.

De beräkningsmetoder som föreslås här bygger på teoretisk fragmentering av molekylen i lämpliga understrukturer för vilka tillförlitliga log Pow-inkrementer är kända. Log Pow erhålls genom att summera fragmentvärdena och korrigeringsfaktorerna för intramolekylär växelverkan. Förteckningar över fragmentkonstanter och korrigeringsfaktorer finns tillgängliga (1) (2) (3) (4) (5) (6). Vissa av dem uppdateras regelbundet (3).

Tillförlitlighet för beräknade värden

4.

I allmänhet minskar beräkningsmetodernas tillförlitlighet i takt med att komplexiteten hos de undersökta ämnena ökar. För enkla molekyler med låg molekylvikt och en eller två funktionella grupper kan man förvänta sig en avvikelse på 0,1–0,3 log Pow-enheter mellan resultaten av de olika fragmenteringsmetoderna och de uppmätta värdena. Felmarginalen beror på de använda fragmentkonstanternas tillförlitlighet, förmågan att känna igen intramolekylära växelverkningar (t.ex. vätebindningar) och den korrekta användningen av korrigeringsfaktorer. För joniserbara ämnen måste laddningen och graden av jonisering beaktas (10).

Fujita-Hansch π-metod

5.

Konstanten för hydrofoba substituenter, π, som ursprungligen infördes av Fujita m.fl. (7), definieras som:

πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH)

där PhX är ett aromatiskt derivat och PhH modersubstansen.

T.ex.

πCl

= log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6)

= 2,84 – 2,13

= 0,71

π-metoden är huvudsakligen av intresse för aromatiska föreningar. π-värden för ett stort antal substituenter finns tillgängliga (4) (5).

Rekkers metod

6.

Med Rekkers metod (8) beräknas log Pow-värdet på följande sätt:

Formula

där ai är antalet gånger ett visst fragment förekommer i molekylen och fi är log Pow-inkrementet för fragmentet. Samspelstermerna kan uttryckas som en integral multipel av en enda konstant Cm (den s.k. magiska konstanten). Fragmentkonstanterna fi och Cm har fastställts på grundval av en tabell med 1 054 experimentellt bestämda Pow-värden för 825 ämnen med hjälp av flerdimensionell regressionsanalys (6) (8). Fastställandet av samspelstermerna utförs i enlighet med fastställda regler (6) (8) (9).

Hansch-Leos metod

7.

Med Hansch-Leos metod (4) beräknas log Pow-värdet på följande sätt:

Formula

där fi är en fragmentkonstant, Fj en korrigeringsfaktor, och ai och bj är motsvarande förekomstfrekvenser. Förteckningarna över atom- och gruppfragmentvärden och korrigeringsfaktorerna Fj har tagits fram genom trial-and-error på grundval av experimentellt bestämda värden på Pow. Korrigeringsfaktorerna har delats in i flera olika klasser (1) (4). Programpaket har utvecklats som tar hänsyn till alla regler och korrigeringsfaktorer (3).

KOMBINERAD METOD

8.

Beräkningen av log Pow för komplexa molekyler kan förbättras betydligt om molekylen delas upp i större delstrukturer för vilka tillförlitliga log Pow-värden finns tillgängliga, antingen i tabeller (3) (4) eller från utförda mätningar. Sådana fragment (t.ex. heterocykler, antrakinon, azobensen) kan sedan kombineras med Hanschs π-värden eller med Rekkers eller Leos fragmentkonstanter.

Anmärkningar

i)

Beräkningsmetoderna är endast tillämpliga på helt eller delvis joniserade ämnen om de nödvändiga korrigeringsfaktorerna beaktas.

ii)

Om intramolekylära vätebindningar kan antas förekomma måste motsvarande korrigeringsfaktorer (cirka + 0,6 till + 1,0 log Pow-enheter) läggas till (1). Indikationer på närvaron av sådana bindningar kan erhållas från stereomodeller eller spektroskopiska data.

iii)

Om flera tautomeriska former är möjliga ska den mest sannolika formen användas som grund för beräkningen.

iv)

Revisioner av listor med fragmentkonstanter bör följas noggrant.

LITTERATUR OM BERÄKNINGSMETODER

(1)

W. J. Lyman, W. F. Reehl och D.H. Rosenblatt (red.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York (1982).

(2)

W. J. Dunn, J. H. Block och R. S. Pearlman (red.). Partition Coefficient, Determination and Estimation, Pergamon Press, Elmsford (New York) och Oxford (1986).

(3)

Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 92711, USA, log P-databas och medicinsk-kemisk mjukvara (programmet CLOGP-3).

(4)

C. Hansch och A. J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York (1979).

(5)

Leo, C. Hansch och D. Elkins. (1971) Partition coefficients and their uses. Chemical Reviews. 71, 525.

(6)

R. F. Rekker och H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(7)

Toshio Fujita, Junkichi Iwasa och Corwin Hansch (1964). A New Substituent Constant, π, Derived from Partition Coefficients. J. Amer. Chem. Soc. 86, 5175.

(8)

R. F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Vol. 1, Elsevier, New York (1977).

(9)

C. V. Eadsforth och P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(10)

R. A. Scherrer. ACS – Symposium Series 255, s. 225, American Chemical Sociery, Washington, D.C. (1984).

(3)

Kapitel C.3 ska ersättas med följande:

C.3.   BESTÄMNING AV TILLVÄXTHÄMNING HOS SÖTVATTENSALGER OCH CYANOBAKTERIER

INLEDNING

1.

Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 201 (2006, bilaga rättad 2011). Det finns ett behov av att utvidga testmetoden till att omfatta ytterligare arter och att uppdatera den för att uppfylla kraven beträffande farobedömning och klassificering av kemikalier. Revideringen har gjorts på grundval av betydande praktisk erfarenhet, den vetenskapliga utvecklingen när det gäller toxicitetstester på alger, samt en omfattande användning av den tidigare versionen av dokumentet för normerande ändamål.

2.

De definitioner som används finns i tillägg 1.

PRINCIP FÖR TESTMETODEN

3.

Syftet med testet är att bestämma vilka effekter ett kemiskt ämne har på tillväxten hos sötvattenslevande mikroalger och/eller cyanobakterier. De exponentiellt tillväxande testorganismerna exponeras för testämnet i batchkulturer under en tidsperiod på vanligen 72 timmar. Trots att testperioden är relativt kort kan effekterna på flera generationer bedömas.

4.

Systemets respons innebär att tillväxten i en serie algkulturer (testenheter) som exponeras för olika koncentrationer av en testkemikalie minskar. Responsen betraktas som en funktion av exponeringskoncentrationen jämfört med den genomsnittliga tillväxten för icke-exponerade kontrollreplikat. För att testsystemet ska kunna ge full respons på en toxisk testkemikalie (optimal känslighet) får kulturerna tillväxa exponentiellt utan några begränsningar, samt med tillräcklig näringstillgång och i kontinuerligt ljus, under den tid som krävs för att minskningen i specifik tillväxthastighet ska bli mätbar.

5.

Tillväxtens och tillväxtminskningens storlek bestäms genom mätningar av algbiomassans förändring över tiden. Algbiomassa definieras som torrvikten alger per volymenhet, t.ex. mg alger/liter testlösning. Torrvikt är dock svårt att mäta, varför man kan använda sig av olika alternativa parametrar. Av dessa används oftast cellantal. Andra alternativa parametrar inbegriper cellvolym, flourescens, optisk täthet etc. En omvandlingsfaktor mellan den uppmätta alternativa parametern och biomassan bör vara känd.

6.

Endpoint i testet är tillväxthämning, där tillväxt uttrycks som den logaritmiska ökningen av biomassan (den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten) under exponeringsperioden. Från de genomsnittliga specifika tillväxthastigheter som uppmätts i en serie testlösningar fastställer man den koncentration av testkemikalien som ger upphov till en bestämd minskning av tillväxthastigheten, x % (t.ex. 50 %). Värdet uttrycks som ErCx (t.ex. ErC50).

7.

I den här testmetoden används även producerad mängd biomassa som responsvariabel, något som kan vara nödvändigt för att uppfylla gällande krav i vissa länder. Denna variabel definieras som biomassans storlek vid exponeringstidens slut minus biomassans storlek vid exponeringstidens början. Med utgångspunkt i den mängd biomassa som producerats i en serie testlösningar beräknar man den koncentration av testämnet som ger upphov till en bestämd minskning av mängden producerad biomassa, x % (t.ex. 50 %). Detta värde uttrycks som EyCx (t.ex. EyC50).

8.

Den lägsta koncentrationen med observerad effekt (LOEC) och den högsta koncentrationen utan observerad effekt (NOEC) kan också bestämmas statistiskt.

INFORMATION OM TESTKEMIKALIEN

9.

Information om testkemikalien som kan vara av värde när man fastställer testbetingelserna är bland annat strukturformel, renhetsgrad, ljusbeständighet, stabilitet under testbetingelserna, ljusabsorberande förmåga, pKa samt resultat från undersökningar av kemikaliens omvandling, inklusive bionedbrytbarhet i vatten.

10.

Testkemikaliens vattenlöslighet, fördelningskoefficient oktanol/vatten (Pow) och ångtryck ska vara kända, och det ska finnas en validerad metod för kvantitativ bestämning av kemikalien i testlösningarna. Metodens utbyte och detektionsgräns ska vara kända.

TESTETS GILTIGHET

11.

För att testresultaten ska vara giltiga måste följande effektivitetskriterier vara uppfyllda:

Biomassan i kontrollkulturerna ska ha ökat exponentiellt med minst en faktor 16 inom testperioden (72 timmar). Detta motsvarar en specifik tillväxthastighet på 0,92/dygn– 1. De mest använda arterna har vanligen en betydligt högre tillväxthastighet (se tillägg 2). Kravet kan dock inte alltid uppfyllas när man använder sig av arter som växer långsammare än de som anges i tillägg 2. Testperioden ska då förlängas så att man erhåller en minst 16-faldig tillväxt i kontrollkulturerna, och tillväxten måste vara exponentiell under hela testperioden. Testperioden kan även förkortas ända ner till 48 timmar om detta krävs för att uppnå obegränsad exponentiell tillväxt under testet. Ett villkor för detta är dock att tillväxtfaktorn är minst 16-faldig.

Variationskoefficientens medelvärde för sektionsvisa specifika tillväxthastigheter (dagarna 0–1, 1–2 och 2–3 för 72-timmarstester) i kontrollkulturerna (se tillägg 1 under ’variationskoefficient’) får inte överskrida 35 %. I punkt 49 beskrivs hur man beräknar den sektionsvisa specifika tillväxthastigheten. Detta kriterium tillämpas på medelvärdet för de variationskoefficienter som beräknats för kontrollreplikaten.

I tester med Pseudokirchneriella subcapitata och Desmodesmus subspicatus får variationskoefficienten för genomsnittlig specifik tillväxthastighet i kontrollreplikaten inte överskrida 7 % under hela testperioden. För arter som inte används så ofta i testsammanhang får värdet inte överstiga 10 %.

REFERENSKEMIKALIE

12.

Referenskemikalie(r), t.ex. 3,5-diklorfenol, som används i det internationella ringtestet (1), kan testas för att kontrollera testförfarandet. För grönalger kan även kaliumdikromat användas som referenskemikalie. Referenskemikalier bör testas minst två gånger per år.

TESTMETODENS TILLÄMPBARHET

13.

Denna testmetod är lättast att tillämpa på vattenlösliga kemikalier som under testförhållandena sannolikt kommer att stanna kvar i vattnet. Om man vill testa kemikalier som är flyktiga, starkt adsorberande, färgade, svårlösliga i vatten eller som kan påverka tillgången på näringsämnen och mineraler i testmediet kan det krävas vissa modifieringar av den beskrivna metoden (t.ex. slutna system, anpassningar av testkärlen). Några exempel på lämpliga modifieringar ges i (2) (3) och (4).

BESKRIVNING AV TESTMETODEN

Utrustning

14.

Testkärl och annan utrustning som kommer i kontakt med testlösningarna ska vara tillverkade uteslutande av glas eller något annat kemiskt inert material. Utrustningen rengörs noggrant, så att inga organiska eller oorganiska föroreningar påverkar algernas tillväxt eller testlösningarnas sammansättning.

15.

Testkärlen är normalt glaskolvar vars storlek tillåter mätningar på en tillräckligt stor volym av testkulturen under testet och ett tillräckligt högt utbyte av CO2 med den omgivande luften (se punkt 30). Observera att vätskevolymen måste vara tillräckligt stor för analytiska bestämningar (se punkt 37).

16.

Dessutom behövs åtminstone en del av följande utrustning:

Odlingsutrustning. Man bör använda ett odlingsskåp eller en odlingskammare där inkuberingstemperaturen kan regleras med en noggrannhet av ± 2 °C.

Instrument för ljusmätning. Observera att mätvärdena för ljusintensitet kan påverkas av mätmetoden, särskilt typen av ljussensor (mottagare). Mätningarna bör helst göras med en sfärisk (4 π) sensor (som mäter både direkt och reflekterat ljus från alla vinklar ovanför och under mätplanet), eller en 2 π -sensor (som mäter ljus från alla vinklar ovanför mätplanet).

Utrustning för att bestämma algbiomassa. Cellantal, som är den oftast använda alternativa parametern för algbiomassa, kan bestämmas med hjälp av elektronisk partikelräknare, mikroskop utrustat med räknekammare eller flödescytometer. Andra alternativ till biomassa kan mätas med hjälp av flödescytometer, fluorimeter, spektrofotometer eller kolorimeter. Man bör helst beräkna omvandlingsfaktorn mellan cellantal och torrvikt. När koncentrationen av biomassa är låg kan det vid spektrofotometriska mätningar vara nödvändigt att använda sig av kyvetter med en strålgång på minst 4 cm för att få fram användbara mätvärden.

Testorganismer

17.

Ett stort antal arter icke-fastsittande mikroalger och cyanobakterier kan användas. De stammar som förtecknas i tillägg 2 har visat sig vara lämpliga för denna testmetod.

18.

Om man använder sig av andra arter ska stammen och/eller ursprunget anges. Bekräfta att de alger som används kan tillväxa exponentiellt under hela testperioden under rådande testförhållanden.

Odlingsmedium

19.

Det rekommenderas att man använder antingen OECD-mediet eller AAP-mediet som odlingsmedium. Sammansättningen av dessa medier framgår av tillägg 3. Observera att de två medierna har olika utgångsvärde för pH och olika buffringsförmåga (motverkar pH-ökningar). Testresultaten kan därför variera beroende på vilket medium som används, särskilt när man testar joniserande kemikalier.

20.

Det kan ibland vara nödvändigt att modifiera odlingsmediet, t.ex. då man testar metaller eller kelatbildare, eller då testerna görs vid skilda pH-värden. Användning av modifierade medier ska beskrivas i detalj och motiveras (3) (4).

Biomassans startkoncentration

21.

Biomassans startkoncentration ska vara densamma för alla testkulturer. Den ska också vara tillräckligt låg för att möjliggöra exponentiell tillväxt under hela inkuberingen utan att några näringsämnen tar slut. Startvärdet får inte överskrida 0,5 mg/l, räknat på torrvikt. Följande cellkoncentrationer rekommenderas:

Pseudokirchneriella subcapitata

5 × 103 – 104 celler/ml

Desmodesmus subspicatus

2–5 × 103 celler/ml

Navicula pelliculosa

104 celler/ml

Anabaena flos-aquae

104 celler/ml

Synechococcus leopoliensis

5 × 104 – 105 celler/ml

Testkemikaliens koncentrationer

22.

Det koncentrationsområde där det är troligt att testkemikalien ger effekt kan bestämmas på grundval av resultat från preliminära tester (range-finding tests). För det slutliga testet bör minst fem koncentrationer väljas i en geometrisk serie vars faktor inte överstiger 3,2. För testkemikalier med plan dos-responskurva kan det vara befogat att använda en högre faktor. Koncentrationsserien bör helst omfatta ett intervall som minskar algernas tillväxthastighet med 5–75 %.

Replikat och kontroller

23.

För varje koncentration av testkemikalien ska det finnas tre replikat. Om NOEC inte behöver bestämmas kan man ändra testupplägget så att antalet koncentrationer ökas medan antalet replikat per koncentration minskas. Minst tre kontrollreplikat ska användas, och helst bör de vara dubbelt så många som antalet replikat för varje koncentration av testkemikalien.

24.

En extra serie testlösningar kan beredas för analytisk bestämning av testkemikaliens koncentrationer (se punkterna 36 och 38).

25.

Om ett lösningsmedel används för att lösa upp testkemikalien måste man ta med ytterligare kontroller där koncentrationen av lösningsmedel är densamma som i testkulturerna.

Beredning av ympkultur

26.

En ympkultur bereds i testmedium 2–4 dagar innan testet påbörjas. Syftet med detta är att algerna ska kunna anpassa sig till testförhållandena och befinna sig i en exponentiell tillväxtfas när de senare ympas i testlösningarna. Algbiomassan bör regleras så att ympkulturen fortsätter att tillväxa exponentiellt till dess att testet inleds. Ympkulturen inkuberas under samma förhållanden som testkulturerna. En mätning görs av ökningen av ympkulturens biomassa, så att man kan förvissa sig om att tillväxten befinner sig inom det normala intervallet för den använda stammen under rådande odlingsbetingelser. I tillägg 4 ges ett exempel på en metod för algodling. Det kan krävas ett andra förökningssteg för ympkulturen för att undvika synkron celldelning under testet.

Beredning av testlösningar

27.

Alla testlösningar ska innehålla samma koncentration av odlingsmediet och samma startkoncentration av algbiomassan. Testlösningar av de valda koncentrationerna bereds vanligen genom att man blandar en stamlösning av testkemikalien med odlingsmedium och ympkultur. Stamlösningar brukar beredas genom upplösning av kemikalien i testmediet.

28.

Lösningsmedel som aceton, tert-butylalkohol och dimetylformamid kan användas som bärare när man tillsätter kemikalier med låg vattenlöslighet till testmediet (2) (3). Lösningsmedlets koncentration får inte överstiga 100 μl/l, och det tillsatta lösningsmedlet ska vara av samma koncentration för alla kulturer (inklusive kontroller) i testserien.

Inkubering

29.

Testkärlen försluts med luftgenomsläppliga proppar. Kärlen skakas och placeras sedan i odlingsutrustningen. Under testet måste man hålla algerna i suspension och underlätta ett tillräckligt stort utbyte av CO2. Därför ska innehållet hela tiden skakas eller röras om. Temperaturen i kulturerna ska vara 21–24 °C, och den ska kunna regleras med en noggrannhet av ± 2 °C. När det gäller arter som inte förtecknas i tillägg 2 (t.ex. tropiska arter) kan det vara lämpligt med en högre temperatur. Detta förutsätter dock att kriterierna för testresultatens giltighet är uppfyllda. Kolvarna bör placeras slumpvis i inkubatorn och flyttas om dagligen.

30.

Kontrollmediets pH får inte öka med mer än 1,5 enheter under testet. När det gäller metaller samt ämnen som delvis joniseras vid det använda pH-värdet kan det vara nödvändigt att begränsa pH-förskjutningen för att få fram reproducerbara och tydliga resultat. Det går att begränsa förskjutningen till mindre än 0,5 enheter om man ser till att utbytet av CO2 mellan testlösningen och den omgivande luften är tillräckligt högt, t.ex. genom att öka skakapparatens hastighet. En annan möjlighet är att reducera behovet av CO2 genom att minska biomassans startkoncentration eller testets längd.

31.

Den yta där kulturerna inkuberas ska kontinuerligt belysas med fluorescerande ljus av enhetligt slag, t.ex. kallt vitt ljus eller dagsljus. Olika stammar av alger och cyanobakterier kan ha olika ljuskrav. Ljusets intensitet ska anpassas efter den testorganism som används. För de rekommenderade grönalgsarterna ska intensiteten mätt vid testlösningarna ligga inom intervallet 60–120 μE · m– 2 · s– 1 när mätningen görs i det fotosyntetiskt verksamma våglängdsområdet 400–700 nm med lämplig sensor. Vissa arter, särskilt Anabaena flos-aquae, tillväxer utan problem vid låga ljusintensiteter och kan även skadas vid höga intensiteter. För sådana arter ska den genomsnittliga ljusintensiteten ligga på 40–60 μE · m– 2 · s– 1. (För mätinstrument som kalibrerats i lux motsvarar den rekommenderade ljusintensiteten 60–120 μE · m– 2 · s– 1 för kallt vitt ljus ungefär 4 440–8 880 lux.) Ljusintensiteten över inkuberingsytan ska ligga inom ± 15 % från genomsnittsvärdet.

Testets varaktighet

32.

Testet ska normalt pågå i 72 timmar. Man kan dock använda kortare eller längre testperioder, förutsatt att samtliga kriterier för testresultatens giltighet i punkt 11 är uppfyllda.

Mätningar och analytiska bestämningar

33.

Algbiomassan i varje kolv bestäms minst en gång per dag under testperioden. Om mätningarna görs på små volymer som pipetterats från testlösningarna ska dessa volymer inte ersättas.

34.

Biomassan bestäms genom manuell cellräkning i mikroskop eller med hjälp av en elektronisk partikelräknare (mätning av cellantal och/eller biovolym). Alternativa metoder, t.ex. flödescytometri, klorofyllfluorescens in vitro eller in vivo (5) (6) eller optisk täthet, kan också användas om man kan påvisa en tillfredsställande korrelation med biomassan för de värden på densamma som kan förekomma i testet.

35.

Lösningarnas pH mäts i början och slutet av testet.

36.

Om det finns en analytisk bestämningsmetod för testkemikalien i det valda koncentrationsintervallet ska testlösningarna analyseras för att kontrollera startkoncentrationerna och för att se till att exponeringskoncentrationerna inte förändras under testet.

37.

Om det är troligt att exponeringskoncentrationerna under testet kommer att variera med mindre än 20 % från de nominella värdena kan det räcka med att man i början och slutet av testet bestämmer testkemikaliens koncentration på tre nivåer: en hög koncentration, en låg koncentration och en koncentration runt det förväntade EC50-värdet. Om koncentrationerna av testkemikalien sannolikt inte kommer att hålla sig inom 80–120 % av de nominella värdena bör man i stället bestämma samtliga koncentrationer av testkemikalien vid testets början och slut. För flyktiga, instabila eller starkt adsorberande testkemikalier bör ytterligare prov för analys tas med 24 timmars mellanrum under hela exponeringstiden. På så vis får man ett säkrare mått på hur mycket av testkemikalien som försvinner. För dessa kemikalier kan extra replikat behövas. Under alla omständigheter behöver bestämningar av testkemikaliens koncentration bara göras på ett replikatkärl för varje testkoncentration (eller på det samlade innehållet från samtliga replikat).

38.

Testmedier som beretts särskilt för bestämning av exponeringskoncentrationer under testet ska behandlas på samma sätt som dem som används för tester, dvs. de ympas med alger och inkuberas under identiska förhållanden. Om den lösta testkemikaliens koncentration måste bestämmas kan det vara nödvändigt att isolera algerna från mediet. Isoleringen bör helst göras genom centrifugering vid lågt g-tal (men tillräckligt högt för att algerna ska kunna avskiljas).

39.

Om man kan visa att testkemikaliens koncentration på ett tillfredsställande sätt har hållits inom ± 20 % av den nominella eller uppmätta startkoncentrationen genom hela testet kan analysen av resultaten baseras på nominella eller uppmätta startvärden. Om avvikelsen från den nominella eller uppmätta startkoncentrationen inte ligger inom intervallet ± 20 % ska analysen av resultaten baseras på det geometriska medelvärdet av koncentrationen under exponeringen, eller på modeller som beskriver testkemikaliens avtagande koncentration (3) (7).

40.

Bestämning av tillväxthämning hos alger är en mer dynamisk testmetod än de flesta andra akvatiska toxicitetstester med kort testperiod. De faktiska exponeringskoncentrationerna kan därför vara svåra att bestämma, särskilt för adsorberande kemikalier som testas vid låga koncentrationer. Om kemikalien i sådana fall adsorberas till den ökande algbiomassan och därför inte längre återfinns i lösning innebär det dock inte att den försvinner från testsystemet. Vid analysen av testresultatet ska man undersöka om en minskad koncentration av testkemikalien under testperioden kan korreleras med en reducerad tillväxthämning. Om så är fallet bör man överväga att genom en lämplig modell beskriva testkemikaliens minskande koncentration (7). I annat fall kan det vara motiverat att basera resultatanalysen på testkemikaliens nominella eller uppmätta startkoncentration.

Övriga iakttagelser

41.

Kontrollera i mikroskop att ympkulturen ser normal och frisk ut. I slutet av testet ska man också notera eventuella avvikelser från algernas normala utseende (som kan ha orsakats av exponeringen för testkemikalien).

Toleranstest

42.

Under vissa omständigheter, t.ex. när ett preliminärt test tyder på att testkemikalien inte har några toxiska effekter vid koncentrationer upp till 100 mg/l eller upp till dess löslighetsgräns i testmediet (om denna är lägre), kan man utföra ett toleranstest. Man jämför då responsen mellan en kontrollgrupp och en testgrupp (med en koncentration på 100 mg/l eller motsvarande löslighetsgränsen). Det rekommenderas starkt att jämförelsen kompletteras med en bestämning av exponeringskoncentrationen. Alla testbetingelser samt kriterier för testresultatens giltighet som beskrivits tidigare gäller även för toleranstestet, med undantaget att antalet testreplikat ska vara minst sex. Responsvariablerna i kontroll- och testgruppen kan analyseras med hjälp av ett statistiskt test där man jämför medelvärden, t.ex. Students t-test. Om de båda grupperna inte har samma varians måste t-testet anpassas efter detta.

DATA OCH RAPPORTERING

Plottning av tillväxtkurvor

43.

Mängden biomassa i testkärlen kan uttryckas i enheten för den alternativa parameter som används vid mätningen (t.ex. cellantal, fluorescens).

44.

De framräknade värdena för biomassans koncentration i testkulturerna och kontrollerna förs in i en tabell tillsammans med testmaterialets koncentrationer och mättidpunkterna (noterade med en upplösning på minst hela timmar). Tabellvärdena används sedan för att ta fram plottade tillväxtkurvor. Både logaritmiska och linjära skalor kan vara användbara på detta inledande stadium, men logaritmiska skalor är obligatoriska, och de ger också i allmänhet en bättre uppfattning om variationer i tillväxtmönstret under testperioden. Observera att exponentiell tillväxt motsvaras av en rak linje när den plottas på en logaritmisk skala, och att kurvans lutning anger den specifika tillväxthastigheten.

45.

Kontrollera med hjälp av plottarna om kontrollkulturerna har tillväxt exponentiellt och med förväntad hastighet under hela testet. Alla datapunkter och kurvor bör undersökas kritiskt, och rådata samt metoder bör kontrolleras med avseende på eventuella fel. Kontrollera särskilt alla datapunkter som verkar avvika på grund av systematiska fel. Om man konstaterar uppenbara eller mycket sannolika fel i testutförandet ska de berörda datapunkterna markeras som avvikande värden (’outliers’) och inte tas med i den efterföljande statistiska analysen. (Om algkoncentrationen är noll i hälften eller en tredjedel av kärlen med replikat kan detta tyda på att kärlen inte ympats på rätt sätt eller inte rengjorts ordentligt.) Det ska tydligt framgå av testrapporten varför en datapunkt betraktats som avvikande och därför inte använts. Det enda giltiga skälet är (enstaka) misstag i utförandet av testet. Dålig precision räknas däremot inte som ett giltigt skäl. Statistiska metoder för att identifiera avvikande värden är av begränsat värde när det gäller den här typen av problem, och de kan inte ersätta expertbedömningar. Avvikande värden (som markerats som sådana) bör helst behållas bland de datapunkter som visas i senare presentationer av data i grafisk form eller tabellform.

Responsvariabler

46.

Syftet med testet är att bestämma testkemikaliens effekter på tillväxten hos alger. Eftersom olika jurisdiktioner har olika prioriteringar och lagstiftningsbehov används två responsvariabler i denna testmetod. För att testresultaten ska kunna godtas i alla jurisdiktioner ska effekterna bedömas med hjälp av båda de responsvariabler (a och b) som beskrivs nedan.

(a)    Genomsnittlig specifik tillväxthastighet : responsvariabel som beräknas utifrån den logaritmiska ökningen i biomassa under testperioden, uttryckt per dygn.

(b)    Producerad mängd biomassa : responsvariabel som motsvarar skillnaden mellan den ursprungliga mängden biomassa och biomassan vid testets slut.

47.

Observera att toxicitetsvärden som beräknats utifrån de två responsvariablerna inte är jämförbara, och att denna skillnad måste framgå när man tillämpar testresultaten. ECx-värden som grundar sig på den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten (ErCx) är i allmänhet högre än de som grundar sig på den producerade mängden biomassa (EyCx) om de föreskrivna testbetingelserna i denna metod är uppfyllda, beroende på den matematiska grunden i respektive fall. Detta ska dock inte tolkas som skillnader i känslighet mellan de två responsvariablerna; avvikelserna beror i stället på att de båda metoderna är olika matematiskt konstruerade. Variabeln genomsnittlig specifik tillväxthastighet är baserad på den allmänna exponentiella tillväxten hos alger i obegränsade kulturer, där toxiciteten bestäms utifrån dess effekter på tillväxthastigheten, utan att vara beroende av vare sig det absoluta värdet på kontrollens specifika tillväxthastighet, på dos-respons-kurvans lutning, eller på testets varaktighet. Resultat som i stället grundar sig på producerad mängd biomassa är däremot beroende av alla dessa övriga variabler. EyCx är beroende av den specifika tillväxthastigheten för den algart som används i varje enskilt test samt av den maximala specifika tillväxthastigheten – som kan variera mellan olika arter och t.o.m. mellan olika stammar. Denna responsvariabel ska därför inte användas för att jämföra känsligheten för toxiska ämnen mellan olika arter, eller ens olika stammar. Ur vetenskaplig synpunkt är värdet på den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten att föredra för bestämning av toxiciteten, men toxicitetsbestämning med hjälp av värdet på producerad mängd biomassa har tagits med i testmetoden för att tillgodose vissa länders nuvarande lagstiftningskrav.

Genomsnittlig tillväxthastighet

48.

Den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten under en period beräknas som den logaritmiska ökningen i biomassa för varje enskilt kärl med kontroller och testlösningar, enligt formeln [1]:

Formula

[1],

där

μi-j

är den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten under tidsperioden ij,

Xi

är biomassan vid tidpunkten i, och

Xj

är biomassan vid tidpunkten j.

Beräkna ett medelvärde av tillväxthastigheten för varje testgrupp och kontrollgrupp tillsammans med variansskattningar.

49.

Beräkna den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten för hela testperioden (vanligen dag 0–3). Som startvärde används det nominella värdet för ympad biomassa. Motsvarande uppmätta värde bör inte användas eftersom det i regel minskar precisionen. Om utrustningen för mätning av biomassa (t.ex. flödescytometer) ger ett tillräckligt noggrant värde på den lilla mängd som ympats kan dock biomassans uppmätta startkoncentration användas. Bestäm också den sektionsvisa tillväxthastigheten genom att beräkna den specifika tillväxthastigheten för varje dag under hela testperioden (dag 0–1, 1–2 och 2–3), och undersök om kontrollens tillväxthastighet förblir konstant (se kriterierna för testresultatens giltighet i punkt 11). En påtagligt lägre specifik tillväxthastighet under dag 1 jämfört med totalvärdet för genomsnittlig specifik tillväxthastighet kan tyda på att kulturen befinner sig i lagfas. I kontrollkulturer kan lagfasen praktiskt taget elimineras genom att förkulturen förökas på lämpligt sätt. I exponerade kulturer kan en lagfas däremot tyda på att algerna återhämtar sig efter inledande toxisk stress eller på att exponeringen minskat på grund av förlust av testkemikalien (t.ex. genom adsorption till algbiomassan) efter den inledande exponeringen. Den sektionsvisa tillväxthastigheten kan därför användas när man bestämmer testkemikaliens effekter under exponeringstiden. Stora skillnader mellan den sektionsvisa tillväxthastigheten och den genomsnittliga tillväxthastigheten tyder på att tillväxten inte varit konstant exponentiell. I sådana fall bör tillväxtkurvorna undersökas noggrant.

50.

Beräkna den procentuella minskningen av tillväxthastigheten för varje replikat med testlösning genom formeln [2]:

Formula

[2],

där

%Ir

är den procentuella minskningen av den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten,

μC

är medelvärdet för den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten (μ) i kontrollgruppen, och

μT

är den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten för replikatet med testlösning.

51.

Om man använder sig av lösningsmedel vid beredning av testlösningarna ska man vid beräkningen av procentuell tillväxthämning använda kontrollerna med lösningsmedel och inte kontrollerna utan lösningsmedel.

Producerad mängd biomassa

52.

Den producerade mängden biomassa motsvarar biomassan i slutet av testet minus den ursprungliga biomassan. Beräkningen görs för varje enskilt kärl med kontroller och testlösningar. Beräkna ett medelvärde av den producerade mängden biomassa för varje testkoncentration och kontrollgrupp tillsammans med variansskattningar. Den procentuella minskningen av den producerade mängden biomassa (%Iy) beräknas för varje replikat med testlösning med hjälp av formeln

Formula

[3]

där

%Iy

är den procentuella minskningen av den producerade mängden biomassa,

YC

är medelvärdet för den producerade mängden biomassa i kontrollgruppen, och

YT

är den producerade mängden biomassa i replikatet med testlösning.

Plottning av dos-respons-kurvan

53.

Plotta den procentuella tillväxthämningen mot logaritmen för testkemikaliens koncentration och undersök plotten noggrant. Datapunkter som konstaterats vara avvikande i den första fasen ska inte beaktas. För att man ska få en preliminär uppfattning om förhållandet mellan koncentration och respons sammanbinds datapunkterna med en jämn linje, antingen på fri hand eller med hjälp av datorbaserad interpolation. Använd därefter en mer ingående metod, helst en datorbaserad statistisk sådan. Beroende på ett flertal faktorer – t.ex. det avsedda användningsområdet för data, datakvalitet (precision), datamängd och tillgängliga analysverktyg för data – kan man (ibland på goda grunder) bestämma sig för att avsluta analysen av data på det här stadiet och enbart avläsa nyckeltalen EC50 och EC10 (och/eller EC20) från kurvan som ritats på fri hand (se även avsnittet om tillväxtstimulering nedan). Det finns flera giltiga skäl för att inte använda en statistisk metod, bland annat följande:

Det är inte troligt att man utifrån befintliga data får fram mer tillförlitliga resultat med hjälp av datorbaserade metoder än genom expertbedömningar. I sådana situationer kan det t.o.m. hända att vissa datorprogram ger ett helt otillförlitligt resultat (iterationer kanske inte konvergerar osv.).

Stimulerande tillväxtresponser kan inte hanteras på lämpligt sätt av programvaran (se nedan).

Statistisk behandling

54.

Målet är att bestämma det kvantitativa förhållandet mellan koncentration och respons med hjälp av regressionsanalys. Man kan använda viktad linjär regression efter att ha gjort en linjär transformation av responsdata, t.ex. till probit-, logit- eller Weibullvärden (8). Icke-linjära regressionsmetoder är dock att föredra, eftersom de är bättre anpassade för att hantera oundvikliga oregelbundenheter i data och avvikelser från jämna fördelningskurvor. I närheten av nollpunkten (ingen tillväxthämning) och fullständig tillväxthämning kan sådana oregelbundenheter bli felaktigt uppförstorade genom linjäriseringen och därigenom störa analysen (8). Observera att standardmetoder för analys med probit-, logit- eller Weibulltransformationer är avsedda för dikotoma data (dvs. tvåpunktsfördelade data, t.ex. dödlighet–överlevnad) och därför måste modifieras för att kunna användas för data om tillväxt eller producerad mängd biomassa. Speciella metoder för bestämning av ECx-värden ur kontinuerliga data återfinns i (9), (10) och (11). Tillämpningen av icke-linjär regressionsanalys beskrivs utförligare i tillägg 5.

55.

För varje analyserad responsvariabel används förhållandet mellan koncentration och respons för att göra punktskattningar av ECx-värden. Om möjligt ska 95-procentiga konfidensgränser bestämmas för varje skattning. Anpassningsgraden (’goodness of fit’) mellan responsdata och regressionsmodellen ska bestämmas antingen grafiskt eller statistiskt. Regressionsanalysen ska göras på responsvärden från enskilda replikat, inte på medelvärden från testgrupper. Om det är svårt eller omöjligt att göra en icke-linjär kurvanpassning på grund av alltför stor spridning av data kan man i stället göra regressionen utifrån gruppmedelvärdena. Detta är en praktisk metod för att minska påverkan från misstänkta avvikande värden. Om man använder sig av denna möjlighet ska det tas med i testrapporten som en avvikelse från det normala förförandet, och motiveras med att kurvanpassningar med enskilda replikat inte gav tillfredsställande resultat.

56.

När tillgängliga regressionsmodeller eller regressionsmetoder inte lämpar sig för de aktuella dataserierna kan skattningar av EC50-värden och konfidensgränser också bestämmas genom linjär interpolation och bootstrapping (13).

57.

För skattningar av LOEC (och därmed även av NOEC) för testkemikaliens inverkan på tillväxthastigheten jämförs medelvärden från testlösningarna med hjälp av variansanalysmetoder (ANOVA). Medelvärdet för varje koncentration jämförs sedan med medelvärdet för kontrollerna med hjälp av en lämplig metod för multipeljämförelse eller trendtest, t.ex. Dunnetts eller Williams test (12) (14) (15) (16) och (17). Man måste avgöra om antagandet för ANOVA om varianshomogenitet är uppfyllt. Detta kan göras grafiskt eller med ett etablerat test (17), t.ex. Levenes eller Bartletts test. Skulle antagandet om varianshomogenitet inte vara uppfyllt kan man ibland korrigera för detta genom logaritmisk transformation av data. Om heterogeniteten i variansen är extremt stor och inte kan korrigeras genom transformation, ska man överväga att göra analysen med t.ex. Jonkheeres trendtester av ’step-down’-typ. Mer information om bestämning av NOEC finns i (11).

58.

Nya forskningsrön har lett till att man avråder från användning av NOEC-värden. I stället rekommenderas att man använder punktskattningar av ECx baserade på regressionsanalys. För detta algtest har ännu inget passande värde på x fastställts. Ett intervall på 10–20 % förefaller dock vara lämpligt, beroende på vilken responsvariabel som används. Både EC10 och EC20 bör anges i testrapporten.

Tillväxtstimulering

59.

Ibland förekommer tillväxtstimulering (negativ hämning) vid låga koncentrationer. Detta kan antingen bero på hormesis (’toxisk stimulering’) eller på att stimulerande tillväxtfaktorer överförts från testmaterialet till det minimalmedium som används. Observera att tillsats av oorganiska näringsämnen inte bör ha någon direkt effekt, eftersom testmediet bör innehålla ett överskott av näringsämnen i förhållande till algernas behov under hela testperioden. Vid beräkningen av EC50 kan man vanligen bortse från stimulering vid låga koncentrationer, såvida inte stimuleringen är extremt stor. I det senare fallet – samt då man beräknar ECx för låga värden på x – kan det dock krävas särskilda åtgärder. Man ska så långt det är möjligt ta med stimulerande responser vid analysen av data, och om befintliga dataprogram för kurvanpassning inte kan hantera låggradig stimulering kan man i stället använda sig av linjär interpolation med bootstrapping. Om stimuleringen är extremt stor kan man överväga att använda en hormesis-modell (18).

Icke-toxisk tillväxthämning

60.

Ljusabsorberande testmaterial kan påverka tillväxthastigheten negativt eftersom de minskar mängden tillgängligt ljus. Sådana fysikaliska effekter måste kunna särskiljas från toxiska effekter genom att man ändrar testförhållandena, och fysikaliska effekter ska rapporteras separat. Riktlinjer återfinns i (2) och (3).

TESTRAPPORT

61.

Testrapporten ska innehålla följande uppgifter:

 

Testkemikalie:

fysikalisk form samt relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper, inbegripet löslighetsgräns i vatten,

kemiska identifieringsuppgifter (t.ex. CAS-nummer), inklusive renhetsgrad (föroreningar).

 

Testade arter:

stam, leverantör eller ursprung, samt odlingsförhållanden.

 

Testbetingelser:

startdatum och varaktighet för testet,

testupplägg: testkärl, kulturernas volym, biomassans koncentration i början av testet,

mediets sammansättning,

testkoncentrationer och replikat (t.ex. antal replikat, antal testkoncentrationer samt geometrisk serie),

metod för beredning av testlösningar, inbegripet användning av lösningsmedel m.m.,

odlingsutrustning,

ljusets intensitet och kvalitet (ljuskälla, homogenitet),

temperatur,

de koncentrationer som testats: de nominella testkoncentrationerna och resultaten av alla analyser för att fastställa koncentrationen av testkemikalien i testkärlen. Metodens utbyte och bestämningsgräns i matrisen,

alla avvikelser från denna testmetod,

metod för bestämning av biomassa, samt belägg för att det finns en korrelation mellan den uppmätta parametern och biomassans torrvikt.

 

Resultat:

pH-värde vid testets början och slut i alla testlösningar,

biomassa för varje kolv och varje mätpunkt, samt metod för att mäta biomassa,

tillväxtkurvor (plott där biomassan avsatts mot tiden),

beräknade responsvariabler för respektive testreplikat, inklusive medelvärden och variationskoefficient för replikaten,

grafisk framställning av förhållandet mellan koncentration och effekt,

toxicitetsbestämningar för responsvariablerna, t.ex. EC50, EC10 och EC20 samt dithörande konfidensintervall. Om man räknat fram LOEC- och NOEC-värden ska dessa anges, liksom de statistiska metoder som använts vid beräkningen,

om ANOVA-metoder har använts: storleken på observerad effekt (t.ex. minsta signifikanta skillnad),

eventuell tillväxtstimulans som har konstaterats i testlösningarna,

övriga observerade effekter, t.ex. morfologiska förändringar hos algerna,

diskussion av resultaten, inbegripet eventuell inverkan på testresultatet som kan tillskrivas avvikelser från denna testmetod.

LITTERATUR

(1)

Internationella standardiseringsorganisationen (1993). ISO 8692 Vattenundersökningar – Metod för bestämning av tillväxthämning hos encelliga sötvattenslevande grönalger.

(2)

Internationella standardiseringsorganisationen (1998). ISO/DIS 14442. Water quality – Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, nr 23. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris.

(4)

Internationella standardiseringsorganisationen (1998). ISO 5667-16 Vattenundersökningar – Provtagning – Del 16: Riktlinjer för biologiska tester.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R. och Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525–2531.

(6)

Slovacey, R. E. och Hanna, P. J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll. Limnology & Oceanography 22: 919–925.

(7)

Simpson, S. L., Roland, M. G. E., Stauber, J. L. och Batley, G. E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073–2079.

(8)

Christensen, E. R. och Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713–718.

(9)

Nyholm, N., Sørensen, P. S., Kusk, K. O. och Christensen, E. R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157–167.

(10)

Bruce, R. D. och Versteeg, D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485–1494.

(11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris.

(12)

Dunnett, C. W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096–1121.

(13)

Norberg-King, T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491.

(15)

Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117.

(16)

Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519–531.

(17)

Draper, N. R. och Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, andra upplagan. Wiley, New York.

(18)

Brain P. och Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research 29, 93–96.

Tillägg 1

Definitioner

Följande definitioner och förkortningar används i denna testmetod:

Biomassa : torrvikten av all levande substans i en population, uttryckt per volymenhet, t.ex. mg alger/liter testlösning. Biomassa definieras vanligen som en vikt, men i det här testet används alltså i stället vikt per volymenhet. Begreppet biomassa används också i testet för att ange resultatet av alternativa mätmetoder, t.ex. cellräkning och mätning av fluorescens.

Kemikalie : ett ämne eller en blandning

Variationskoefficient : dimensionslöst mått på en parameters variabilitet, definierat som förhållandet mellan standardavvikelsen och medelvärdet. Detta kan också uttryckas i procent. Variationskoefficientens medelvärde för den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten i kontrollreplikaten beräknas enligt följande:

1.

beräkna variationskoefficienten (i procent) för den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten utifrån de dagliga sektionsvisa tillväxthastigheterna för respektive replikat,

2.

beräkna medelvärdet för alla värden som erhållits i punkt 1 för att få fram den genomsnittliga variationskoefficienten för den dagliga sektionsvisa specifika tillväxthastigheten i kontrollreplikaten.

ECx : den koncentration av testkemikalien, löst i testmediet, som minskar testorganismens tillväxt med x % (t.ex. 50 %) efter en given exponeringstid (som tydligt måste anges om man avviker från den fulla eller normala testperioden). För att entydigt ange om EC-värdet bygger på tillväxthastighet eller producerad mängd biomassa används beteckningen ErC för tillväxthastighet och EyC för producerad mängd biomassa.

Odlingsmedium : det kompletta syntetiska medium som algerna växer i när de exponeras för testkemikalien. Testkemikalien är vanligen löst i testmediet.

Tillväxthastighet (genomsnittlig specifik tillväxthastighet): logaritmisk ökning av mängden biomassa under exponeringstiden.

Lägsta koncentration med observerad effekt (LOEC – ’Lowest Observed Effect Concentration’): den lägsta testade koncentration vid vilken man kan fastställa att testkemikalien har en statistiskt signifikant hämmande effekt på tillväxten (vid p < 0,05) efter en given exponeringstid, jämfört med kontrollen. Alla testkoncentrationer ovanför LOEC måste ha skadliga verkningar som är lika stora som eller större än de verkningar som observeras vid LOEC. Om dessa två villkor inte är uppfyllda måste en fullständig förklaring ges till hur man har valt LOEC (och därmed NOEC).

Nolleffektkoncentration (NOEC – ’No Observed Effect Concentration’): testkoncentrationen omedelbart under LOEC.

Responsvariabel : variabel för bestämning av toxicitet. Variabeln fås fram genom att olika beräkningsmetoder tillämpas på uppmätta parametrar för biomassa. För den här testmetoden är tillväxthastighet och producerad mängd biomassa responsvariabler som erhålls genom att biomassan mäts antingen direkt eller med någon av de angivna alternativa mätmetoderna.

Specifik tillväxthastighet : responsvariabel som definieras som kvoten av skillnaden mellan de naturliga logaritmerna för en observerad parameter (i den här testmetoden: biomassa) och motsvarande tidsperiod.

Testkemikalie : alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.

Producerad mängd biomassa : värdet på en mätvariabel i slutet av exponeringstiden minus motsvarande värde i början av exponeringstiden, använt som ett mått på ökningen av biomassa under testet.

Tillägg 2

Rekommenderade stammar

Grönalger

 

Pseudokirchneriella subcapitata (äldre namn: Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG

 

Desmodesmus subspicatus (äldre namn: Scenedesmus subspicatus) 86.81 SAG

Kiselalger

Navicula pelliculosa, UTEX 664

Cyanobakterier

 

Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A

 

Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1

Stammarnas ursprung

De rekommenderade stammarna finns att tillgå som monokulturer från följande samlingar (alfabetisk ordning):

 

ATCC: American Type Culture Collection

10801 University Boulevard

Manassas, Virginia 20110-2209

USA

 

CCAP: Culture Collection of Algae and Protozoa

Institute of Freshwater Ecology,

Windermere Laboratory

Far Sawrey, Amblerside

Cumbria LA22 0LP

STORBRITANNIEN

 

SAG: Sammlung von Algenkulturen

Albrecht-von-Haller-Institut

Universität Göttingen

Nikolausberger Weg 18

37073 Göttingen

TYSKLAND

 

UTEX Culture Collection of Algae

Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology

School of Biological Sciences

University of Texas at Austin

Austin, Texas 78712

USA

Form och övriga egenskaper hos rekommenderade arter

 

P. subcapitata

D. subspicatus

N. pelliculosa

A. flos-aquae

S. leopoliensis

Form

Böjda och vridna enskilda celler

Ovala, vanligen enskilda celler

Stavar

Kedjor av ovala celler

Stavar

Storlek (längd × bredd) (μm)

8–14 × 2–3

7–15 × 3–12

7,1 × 3,7

4,5 × 3

6 × 1

Volym (μm3/cell)

40–60 (2)

60–80 (2)

40–50 (2)

30–40 (2)

2,5 (3)

Torrvikt (mg/cell)

2–3 × 10– 8

3–4 × 10– 8

3–4 × 10– 8

1–2 × 10– 8

2–3 × 10– 9

Tillväxthastighet (4) (dygn– 1)

1,5 –1,7

1,2–1,5

1,4

1,1–1,4

2,0–2,4

Särskilda rekommendationer om odling och hantering av rekommenderade testarter

Pseudokirchneriella subcapitata och Desmodesmus subspicatus

Dessa grönalger brukar vara lätta att hålla i olika odlingsmedier. Råd om lämpliga medier kan fås från de institutioner som ansvarar för algsamlingarna. Cellerna är vanligen enskilda, och celltätheten kan enkelt bestämmas med hjälp av elektronisk partikelräknare eller mikroskop.

Anabaena flos-aquae

Olika odlingsmedier kan användas för stamkulturen. Det är mycket viktigt att batchkulturen fortfarande befinner sig i logfas då den förnyas, eftersom den annars har svårt att återhämta sig.

Anabaena flos-aquae bildar aggregat bestående av hopnystade kedjor av celler. Aggregatens storlek kan variera beroende på odlingsförhållandena. Om biomassan bestäms genom räkning i mikroskop eller med hjälp av en elektronisk partikelräknare kan det vara nödvändigt att först bryta sönder aggregaten.

Sonikering av prov kan användas för att bryta sönder kedjor av celler och därigenom minska variabiliteten vid räkning. Längre sonikering än vad som krävs för att bryta sönder kedjorna i småfragment kan dock förstöra cellerna. Sonikeringens intensitet och varaktighet ska vara densamma för varje testlösning.

Räkna tillräckligt många fält på hemocytometern (minst 400 celler) för att kompensera för variabiliteten. På så vis ökar tillförlitligheten hos de mikroskopiska täthetsbestämningarna.

Den totala cellvolymen för Anabaena kan bestämmas med hjälp av en elektronisk partikelräknare. Först måste dock cellkedjorna brytas sönder genom försiktig sonikering. Anpassa sonikeringsenergin så att cellerna inte sprängs.

Använd vortexblandare eller liknande för att se till att den algsuspension som används för att ympa testkärlen är väl blandad och har homogen konsistens.

Testkärlen placeras i ett skakbord med rund- eller längsgående rörelse, hastighet ca 150 rpm. Ett alternativ är att man med jämna mellanrum skakar kärlen för att undvika att Anabaena bildar klumpar. Om klumpar ändå bildas måste man se till att de prov som tas för mätning av biomassa är representativa. Det kan vara nödvändigt att skaka kärlen kraftigt före provtagning för att klumparna ska lösas upp.

Synechococcus leopoliensis

Olika odlingsmedier kan användas för stamkulturen. Råd om lämpliga medier kan fås från de institutioner som ansvarar för algsamlingarna.

Synechococcus leopoliensis växer som enskilda, stavformiga celler. Cellerna är mycket små, vilket försvårar bestämning av biomassan genom räkning av celler i mikroskop. Elektroniska partikelräknare anpassade för partiklar ned till ung. 1 μm kan användas, och man kan även göra fluorimetriska mätningar in vitro.

Navicula pelliculosa

Olika odlingsmedier kan användas för stamkulturen. Råd om lämpliga medier kan fås från de institutioner som ansvarar för algsamlingarna. Observera att mediet måste innehålla silikat.

Navicula pelliculosa kan under vissa odlingsförhållanden bilda aggregat. Detta beror på att fett som producerats av algerna ibland ansamlas i en ytfilm till vilken de enskilda algcellerna lätt vidhäftas. När detta sker måste man se till att de prov som tas för bestämning av biomassa är representativa, t.ex. genom kraftig skakning i vortexblandare.

Tillägg 3

Odlingsmedier

Man kan välja mellan två odlingsmedier:

OECD-medium: originalmedium enligt OECD TG 201, samt enligt ISO 8692

AAP-medium enligt den amerikanska miljöskyddsmyndigheten (EPA), samt enligt ASTM.

Vid beredning av medierna ska kemikalier av reagenskvalitet eller p.a.-kvalitet användas, och vattnet ska vara avjonat.

Sammansättningen av AAP-medium (enl. EPA) och OECD TG 201-medium

Komponent

AAP

OECD

 

mg/l

mM

mg/l

mM

NaHCO3

15,0

0,179

50,0

0,595

NaNO3

25,5

0,300

 

 

NH4Cl

 

 

15,0

0,280

MgCl2 · 6(H2O)

12,16

0,0598

12,0

0,0590

CaCl2 · 2(H2O)

4,41

0,0300

18,0

0,122

MgSO4 · 7(H2O)

14,6

0,0592

15,0

0,0609

K2HPO4

1,044

0,00599

 

 

KH2PO4

 

 

1,60

0,00919

FeCl3 · 6(H2O)

0,160

0,000591

0,0640

0,000237

Na2EDTA · 2(H2O)

0,300

0,000806

0,100

0,000269 *

H3BO3

0,186

0,00300

0,185

0,00299

MnCl2 · 4(H2O)

0,415

0,00201

0,415

0,00210

ZnCl2

0,00327

0,000024

0,00300

0,0000220

CoCl2 · 6(H2O)

0,00143

0,000006

0,00150

0,00000630

Na2MoO4 · 2(H2O)

0,00726

0,000030

0,00700

0,0000289

CuCl2 · 2(H2O)

0,000012

0,00000007

0,00001

0,00000006

pH

7,5

8,1

Det molara förhållandet mellan EDTA och järn ska vara något större än 1. På så vis förhindras utfällning av järn samtidigt som kelateringen av tungmetalljoner minimeras.

I testet med kiselalgen Navicula pelliculosa berikas båda medierna med Na2SiO3 · 9H2O så att koncentrationen av kisel (Si) blir 1,4 mg/l.

Mediets pH hålls i jämvikt genom karbonatsystemet i mediet och partialtrycket för CO2 i den omgivande luften. Ett ungefärligt förhållande mellan pH vid 25 °C och den molara koncentrationen av bikarbonat ges av formeln

pHeq = 11,30 + log[HCO3]

Med 15 mg NaHCO3/l är pHeq = 7,5 (AAP-medium enl. EPA), och med 50 mg NaHCO3/l är pHeq = 8,1 (OECD-medium).

Testmediernas grundämnessammansättning

Grundämne

AAP

OECD

 

mg/l

mg/l

C

2,144

7,148

N

4,202

3,927

P

0,186

0,285

K

0,469

0,459

Na

11,044

13,704

Ca

1,202

4,905

Mg

2,909

2,913

Fe

0,033

0,017

Mn

0,115

0,115

Beredning av OECD-medium

Näringsämne

Koncentration i stamlösningen

Stamlösning 1:

makro-näringsämnen

NH4Cl

1,5 g/l

MgCl2 · 6H2O

1,2 g/l

CaCl2 · 2H2O

1,8 g/l

MgSO4 · 7H2O

1,5 g/l

KH2PO4

0,16 g/l

Stamlösning 2:

järn

FeCl3 · 6H2O

64 mg/l

Na2EDTA · 2H2O

100 mg/l

Stamlösning 3:

mikro-näringsämnen

H3BO3

185 mg/l

MnCl2 · 4H2O

415 mg/l

ZnCl2

3 mg/l

CoCl2 · 6H2O

1,5 mg/l

CuCl2 · 2H2O

0,01 mg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7 mg/l

Stamlösning 4:

bikarbonat

NaHCO3

50 g/l

Na2SiO3 · 9H2O

 

Sterilisera stamlösningarna genom membranfiltrering (genomsnittlig pordiameter 0,2 μm) eller autoklavering (120 °C, 15 min). Lösningarna förvaras i mörker vid 4 °C.

Stamlösningarna 2 och 4 autoklaveras inte, utan steriliseras genom membranfiltrering.

Odlingsmediet bereds genom att man tillsätter lämpliga volymer av stamlösningarna 1–4 till vatten.

 

Till 500 ml steriliserat vatten tillsätts:

 

10 ml av stamlösning 1

 

1 ml av stamlösning 2

 

1 ml av stamlösning 3

 

1 ml av stamlösning 4

 

Späd till 1 000 ml med steriliserat vatten.

Vänta tills mediet befinner sig i jämvikt med den omgivande luften med avseende på CO2. Vid behov kan processen påskyndas genom att mediet bubblas med steril, filtrerad luft i några timmar.

Beredning av AAP-medium (enl. EPA)

1.

Tillsätt 1 ml av var och en av stamlösningarna i 2.1–2.7 till ung. 900 ml avjonat eller destillerat vatten och späd till 1 liter.

2.

Stamlösningar med makronäringsämnen bereds genom att kemikalierna nedan löses i 500 ml avjonat eller destillerat vatten. Reagensen 2.1, 2.2, 2.3 och 2.4 kan kombineras till en stamlösning.

2.1

NaNO3

12,750 g

2.2

MgCl2 · 6H2O

6,082 g

2.3

CaCl2 · 2H2O

2,205 g

2.4

Stamlösning med mikronäringsämnen (se 3)

2.5

MgSO4 · 7H2O

7,350 g

2.6

K2HPO4

0,522 g

2.7

NaHCO3

7,500 g

2.8

Na2SiO3 · 9H2O

Se anm. 1.

Anm. 1: Används bara för kiselalger. Kemikalien kan tillsättas direkt (202,4 mg) eller via en stamlösning. Slutkoncentrationen av kisel (Si) i mediet ska i båda fallen vara 20 mg/l.

3.

Stamlösningen med mikronäringsämnen bereds genom att kemikalierna nedan löses i 500 ml avjonat eller destillerat vatten.

3.1

H3BO3

92,760 mg

3.2

MnCl2 · 4H2O

207,690 mg

3.3

ZnCl2

1,635 mg

3.4

FeCl3 · 6H2O

79,880 mg

3.5

CoCl2 · 6H2O

0,714 mg

3.6

Na2MoO4 · 2H2O

3,630 mg

3.7

CuCl2 · 2H2O

0,006 mg

3.8

Na2EDTA · 2H2O

150,000 mg [dinatrium(etylendinitril)tetraacetat]

3.9

Na2SeO4 · 5H2O

0,005 mg. Se anm. 2.

Anm. 2: Används bara för stamkulturer av kiselalger.

4.

Justera pH till 7,5 ± 0,1 med 0,1 N eller 1,0 N NaOH eller HCl.

5.

Om man använder sig av en elektronisk partikelräknare ska mediet filtreras över till ett sterilt kärl genom ett membranfilter med en pordiameter på 0,22 μm. Om partikelräknare inte används ska filtrets pordiameter i stället vara 0,45 μm.

6.

Mediet lagras i mörker vid ung. 4 °C tills det används.

Tillägg 4

Exempel på en metod för algodling

Allmänna påpekanden

Syftet med odling enligt följande metod är att få fram algkulturer för toxicitetstester.

Man måste vidta lämpliga åtgärder för att förhindra att algkulturerna kontamineras med bakterier. Utgångsmaterialet ska bestå av monokulturer, och helst axeniska sådana.

Alla moment ska utföras under sterila förhållanden för att undvika kontaminering med bakterier eller andra alger.

Utrustning och material

Se under testmetod: Utrustning

Odling av algkulturer

Beredning av näringslösningar (näringsmedier):

Alla närsalter i mediet bereds som koncentrerade stamlösningar och lagras i mörker vid låg temperatur. Lösningarna steriliseras genom filtrering eller autoklavering.

Mediet bereds genom att man tillsätter angiven mängd stamlösning till sterilt destillerat vatten. Kontaminering med mikroorganismer måste undvikas. För fasta medier tillsätts 0,8 % agar.

Stamkultur:

Stamkulturerna är små algkulturer som regelbundet överförs till färskt medium och som används som utgångstestmaterial. Om kulturerna inte används regelbundet ska de strykas ut på böjda agarrör. Dessa överförs till färskt medium minst en gång varannan månad.

Stamkulturerna odlas i E-kolvar med lämpligt medium (volym ca 100 ml). Om algerna inkuberas vid 20 °C i kontinuerligt ljus måste överföringar göras en gång i veckan.

Vid detta moment överför man med hjälp av en steril pipett en viss mängd ’gammal’ kultur till en kolv med färskt medium så att initialkoncentrationen för snabbväxande arter är ca 100 gånger lägre än i den gamla kulturen.

Tillväxttakten för en viss art kan bestämmas utifrån tillväxtkurvan. Med hjälp av detta värde kan man sedan räkna fram vid vilken celltäthet kulturen ska överföras till nytt medium. Detta måste göras innan kulturen når deklinationsfasen.

Förkultur:

Avsikten med förkulturen är att få en mängd alger som är lämpliga för ympning av testkulturer. Förkulturen inkuberas under testbetingelser och används medan den ännu växer exponentiellt, vanligen efter en inkuberingsperiod på 2–4 dagar. Algkulturer som innehåller deformerade eller avvikande celler kastas bort.

Tillägg 5

Analys Av Data Med Icke-Linjär Regression

Allmänna överväganden

Responsen i algtester och andra tester som gäller mikrobiell tillväxt (tillväxt av biomassa) är per definition en kontinuerlig, eller metrisk, variabel. Det rör sig om hastigheten hos en process i de fall man mäter tillväxthastighet, och integralen av motsvarande kurva om man i stället mäter biomassa. Båda variablerna jämförs sedan med motsvarande genomsnittsrespons för icke-exponerade kontrollreplikat som uppvisar maximal respons under de rådande förhållandena – med ljus och temperatur som viktigaste faktorer i algtestet. Systemet kan vara uppdelat eller homogent, och biomassan kan anses utgöra en helhet där man inte behöver ta hänsyn till enskilda celler. Variansfördelningen för responsen i ett sådant system beror uteslutande på experimentella faktorer (där felen vanligen är lognormalfördelade eller normalfördelade). Detta ska jämföras med typiska responser i biologiska tester med dikotoma data där toleransen (som vanligen är binomialfördelad) hos enskilda organismer ofta antas vara det dominerande elementet i variansen. Responsen i kontrollerna är i detta fall noll eller har samma värde som bakgrundsnivån.

I det enklaste fallet minskar den normaliserade eller relativa responsen r monotont från värdet 1 (ingen tillväxthämning) till 0 (100 % tillväxthämning). Man bör vara medveten om att alla responser innehåller fel, och att uppenbar negativ hämning vid beräkningen uteslutande anses bero på slumpmässiga fel.

Regressionsanalys

Modeller

Syftet med en regressionsanalys är att kvantitativt beskriva dos-respons-kurvan i form av en matematisk regressionsfunktion, Y = f (C) eller – vanligare – F (Z), där Z = log C. Använd på motsatt sätt kan funktionen C = f– 1 (Y) utnyttjas för beräkning av ECx-värden, t.ex. EC50, EC10 och EC20, samt motsvarande 95-procentiga konfidensgränser. Ett flertal enkla matematiska funktioner har visat sig vara lämpliga för att beskriva förhållandet mellan koncentration och respons vid bestämning av tillväxthämning hos alger. Dessa funktioner innefattar t.ex. den logistiska ekvationen, den icke-symmetriska Weibull-ekvationen samt funktionen för lognormalfördelning. De är alla sigmoida kurvor som asymptotiskt närmar sig värdet noll för C → 0 och värdet ett då C → oändligheten.

Ett nyligen framlagt alternativ till asymptotiska modeller är modeller som bygger på kontinuerliga tröskelfunktioner (t.ex. Kooijman-modellen för tillväxthämning avseende populationer, se Kooijman m.fl. 1996). Modellen bygger på antagandet att det inte förekommer några effekter under ett visst tröskelvärde EC0+ som bestäms genom extrapolation av dos-respons-kurvan till den punkt där den korsar koncentrationsaxeln. Man använder sig då av en enkel kontinuerlig funktion som inte är differentierbar i startpunkten.

Observera att analysen kan bestå av en enkel minimering av residualkvadratsummor (om man antar att variansen är konstant) eller av viktade kvadrater, om man kompenserar för variansens heterogenitet.

Förfarande

Förfarandet är i korthet följande: Välj en lämplig funktion, Y = f(C), och anpassa den till data genom icke-linjär regression. För att man ska kunna få ut så mycket information som möjligt från mätdata bör man använda mätvärden från varje enskild kolv i stället för medelvärden för samtliga replikat. Om variansen å andra sidan är hög visar erfarenheten att medelvärden för replikaten troligen kan ge en matematisk uppskattning som är mer tillförlitlig och mindre påverkad av slumpmässiga fel i data än en metod där man behåller varje enskild datapunkt.

Plotta den anpassade kurvan och erhållna mätdata, och kontrollera att kurvans anpassning är godtagbar. Analys av residualer kan vara ett särskilt användbart verktyg för detta ändamål. Om den valda funktionen för anpassning av dos-respons-kurvan ger en otillfredsställande beskrivning av hela kurvan eller en väsentlig del av denna, t.ex. responsen vid låga koncentrationer, bör man välja en annan typ av kurvanpassning som inte är symmetrisk, t.ex. Weibull-funktionen. Negativ hämning kan ge problem då man använder sig av t.ex. funktionen för lognormalfördelning. Också i detta fall bör man välja en alternativ regressionsfunktion. Det är inte lämpligt att sådana negativa värden tilldelas värdet noll eller ett lågt positivt värde eftersom detta rubbar felfördelningen. Det kan vara befogat att göra separata anpassningar för olika delar av kurvan. Exempelvis kan värdet på EClow x uppskattas från den del av kurvan där tillväxthämningen är låg. Beräkna från den anpassade ekvationen (genom ’omvänd uppskattning’, C = f– 1 (Y)) karaktäristiska punktskattningar för ECx-värden. I rapporten ska åtminstone EC50 samt en eller två uppskattningar av EClow x tas med. Den praktiska erfarenheten har visat att algtestet vanligen medger en rimligt noggrann uppskattning vid 10 % tillväxthämning, förutsatt att det finns tillräckligt många datapunkter. Undantaget är de fall då tillväxtstimulering skett vid låga koncentrationer av testkemikalien. Uppskattningar av EC20 brukar ha betydligt högre precision än uppskattningar av EC10, eftersom EC20 vanligen befinner sig på den approximativt linjära delen av den centrala dos-respons-kurvan. Ibland kan EC10-värden vara svåra att tolka på grund av tillväxtstimulering. Även om man vanligen får fram EC10 med tillräckligt hög noggrannhet bör EC20 också alltid rapporteras.

Viktningsfaktorer

Eftersom den experimentella variansen vanligen inte är konstant och normalt sett innehåller en proportionell komponent bör man rutinmässigt göra en viktad regression. Viktningsfaktorerna vid en sådan analys antas vanligen vara omvänt proportionella mot variansen:

Wi = 1/Var(ri)

Många regressionsprogram har en funktion för viktad regressionsanalys där viktningsfaktorerna tas från en tabell. Det är lämpligt att man normaliserar viktningsfaktorerna genom att multiplicera dem med n/Σ wi (där n är antalet datapunkter) så att summan av dem blir ett.

Normalisering av responser

Normalisering med medelvärdet för kontrollernas responser innebär vissa principiella problem och leder också till en ganska komplicerad variansstruktur. Om man delar responsvärdena med medelvärdet för kontrollernas responser för att få fram den procentuella tillväxthämningen inför man samtidigt ett nytt fel på grund av det fel som är kopplat till medelvärdet för kontrollerna. Om detta fel inte är att betrakta som försumbart måste viktningsfaktorerna för regression och konfidensgränser korrigeras för kovariansen med kontrollen (Draper och Smith, 1981). För att den totala variansen för den relativa responsen ska kunna minimeras är det viktigt att det uppskattade medelvärdet för kontrollernas respons har en hög precision. Variansen uttrycks på följande sätt:

(Nedsänkt i hänför sig till koncentrationsnivån i, och nedsänkt 0 till kontrollerna.)

Yi = Relativ respons = ri/r0 = 1 – I = f(Ci)

med variansen Var(Yi) = Var( ri/r0) ≅ (∂Yi / ∂ ri)2 · Var(ri) + ((∂ Yi/ ∂ r0)2 · Var(r0)

och eftersom (∂ Yi/ ∂ ri) = 1/r0 och (∂ Y i/ ∂ r0) = ri/r0 2

med normalt fördelade data och replikaten mi och m0: Var(ri ) = σ2/mi

blir den totala variansen för den relativa responsen Yi således

Var(Yi) = σ2/(r0 2 · mi) + ri 2 · σ2/r0 4 · m0

Felet för medelvärdet för kontrollerna är omvänt proportionellt mot kvadratroten av genomsnittsvärdet för antalet kontrollreplikat. Det kan ibland vara befogat att ta med historiska data för att kraftigt minska felet. En alternativ metod går ut på att man inte normaliserar data eller anpassar de absoluta responserna – inbegripet responsvärden för kontroller – utan i stället tar med responsvärden för kontroller som en extra parameter som anpassas genom icke-linjär regression. Om man använder sig av en regressionsformel av standardtyp med två parametrar kräver metoden anpassning av tre parametrar, vilket innebär att det krävs fler datapunkter än vid icke-linjär regression av data som normaliserats med hjälp av en förvald kontrollrespons.

Omvända konfidensintervall

Beräkningen av konfidensintervall vid icke-linjär regression genom omvänd uppskattning är ganska komplex och förekommer inte som standardfunktion i normala statistikprogrampaket. Ungefärliga konfidensgränser kan erhållas med hjälp av standardprogram för icke-linjär regression med omparametrisering (Bruce och Versteeg, 1992), vilket innebär att den matematiska ekvationen skrivs om med önskade punktskattningar, t.ex. med EC10- och EC50-värden som de parametrar som ska uppskattas. (Låt funktionen vara I = f (α, β, koncentration) och använd definitionsrelationerna f (α, β, EC10) = 0,1 och f (α, β, EC50) = 0,5 för att ersätta f (α, β, koncentration) med en likvärdig funktion g (EC10, EC50, koncentration.)

En mer direkt beräkning (Andersen m.fl., 1998) kan göras genom att man behåller den ursprungliga ekvationen och använder sig av en Taylorexpansion runt medelvärdena för ri och r0.

Metoder med bootstrapping har blivit populära på senare tid. De går ut på att man uppskattar en empirisk variansfördelning med hjälp av erhållna mätdata i kombination med återkommande omsampling som styrs av en slumptalsgenerator.

LITTERATUR

Kooijman, S. A. L. M., Hanstveit, A. O. och Nyholm, N. (1996). No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625–1632.

Draper, N. R. och Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, andra upplagan. Wiley, New York.

Bruce, R. D. och Versteeg, D. J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Ecotoxicity Data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485–1494.

Andersen, J. S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. och Nyholm, N. (1998). Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405–420.

(4)

Kapitel C.11 ska ersättas med följande:

C.11.   RESPIRATIONSHÄMNINGSTEST FÖR AKTIVERAT SLAM (KOL- OCH AMMONIUMOXIDATION)

INLEDNING

1.

Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 209 (2010). Genom denna testmetod kan man bestämma effekterna av en kemikalie på mikroorganismer (främst bakterier) från aktiverat slam, genom att man mäter deras respirationshastighet (kol- och/eller ammoniumoxidation) under definierade förhållanden vid olika koncentrationer av testkemikalien. Testmetoden bygger på ETAD:s (Ecological and Toxicological Association of the Dyestuffs Manufacturing Industry) test (1) (2), på den tidigare OECD-testriktlinjen TG 209 (3) och på den reviderade ISO-standarden 8192 (4). Testets syfte är att tillhandahålla en snabb screeningmetod för bedömning av kemikaliers effekter på mikroorganismerna i sådant aktivt slam som används för biologisk (aerob) nedbrytning i avloppsreningsverk. Testresultaten kan även fungera som en indikator på lämpliga icke-hämmande koncentrationer för testkemikalier som ska användas i tester av bionedbrytbarhet (t.ex. kapitlen C.4 A–F, C.9, C.10, C.12 och C.29 i denna bilaga samt OECD:s testriktlinje 302C). I detta fall kan testet utföras som ett screeningtest, liknande ett preliminärt test eller ett toleranstest (se punkt 39), som endast beaktar den totala respirationen. Denna information bör dock användas med försiktighet när det gäller tester av lätt bionedbrytbarhet (kapitlen C.4 A–F och C.29 i denna bilaga) i vilka inokulatkoncentrationen är betydligt lägre än den som används i denna testmetod. Frånvaro av hämning i detta respirationstest innebär inte automatiskt icke-hämmande förhållanden i testerna av lätt bionedbrytbarhet i kapitel C.4 A–F eller C.29 i denna bilaga.

2.

I allmänhet verkar respirationshämningstestet ha tillämpats framgångsrikt ända sedan det först offentliggjordes, men i vissa fall har felaktiga resultat rapporterats, t.ex. (2) (4) (5). Koncentrationsrelaterade respirationskurvor blir ibland bifasiska, dos-responsplottar har förvanskats och EC50-värden har varit oväntat låga (5). Undersökningar har visat att sådana resultat uppstår när det aktiverade slam som används i testet genomgår betydande nitrifikation och testkemikalien har avsevärt större inverkan på oxidationen av ammonium än på den allmänna heterotrofa oxidationen. Man kan därför få bukt med dessa felaktiga resultat genom att utföra ytterligare tester med en särskild nitrifikationshämmare. Genom att mäta syreupptagningshastigheten både i närvaro och frånvaro av en sådan hämmare, t.ex. N-allyltiourea (ATU), kan man beräkna de separata totala syreupptagningshastigheterna för heterotrof oxidation och nitrifikation (4) (7) (8). De hämmande effekterna av en testkemikalie på dessa två processer kan fastställas och EC50-värden för både heterotrof oxidation av organiskt kol och ammoniumoxidation (nitrifikation) kan beräknas på vanligt sätt. Det bör noteras att den hämmande inverkan av N-allyltiourea i vissa sällsynta fall helt eller delvis kan upphävas genom komplexbildning med testkemikalier eller tillsatser till testmediet, t.ex. Cu++-joner (6). Cu++-joner är essentiella för Nitrosomonas, men giftiga i högre koncentrationer.

3.

Behovet av nitrifikation i den aeroba reningen av avloppsvatten, ett nödvändigt steg i processen för att avlägsna kväve från avloppsvattnet genom denitrifikation till gasformiga produkter, har blivit mycket akut, särskilt i europeiska länder. EU har nu fastställt lägre gränsvärden för kvävekoncentrationen i behandlat avloppsvatten som släpps ut i mottagande vattenmassor (5).

4.

För de flesta ändamål är det lämpligt att bara använda den metod som gäller effekter på oxidationen av organiskt kol. I vissa fall kan det dock krävas en undersökning av effekterna enbart på nitrifikationen, eller på både nitrifikationen och oxidationen av organiskt kol, fast var för sig, för att man ska kunna tolka resultaten och förstå effekterna.

PRINCIP FÖR TESTMETODEN

5.

Respirationshastigheterna i proven med aktiverat slam till vilka syntetiskt avloppsvatten tillförts mäts i en sluten cell med en syreelektrod efter en kontakttid på 3 timmar. Om exponeringsscenariot ska vara realistiskt kan det vara lämpligt med längre kontakttider. Om testkemikalien snabbt bryts ned, t.ex. abiotiskt genom hydrolys, eller är instabil och koncentrationen inte kan upprätthållas tillräckligt väl, kan även en kortare exponeringstid, t.ex. 30 minuter, användas. Känsligheten i varje parti aktiverat slam bör kontrolleras med en lämplig referenskemikalie på exponeringsdagen. Testet används vanligtvis för att bestämma ECx-värden (t.ex. EC50) för testkemikalien och/eller NOEC-värdet.

6.

Hämningen av syreupptagningen för mikroorganismer som oxiderar organiskt kol kan uttryckas separat från hämningen för mikroorganismer som oxiderar ammonium genom mätning av syreförbrukningshastigheten med och utan tillsats av n-allyltiourea, ett ämne som specifikt hämmar oxidationen av ammonium till nitrit hos de bakterier som utför första steget i nitrifikationen. I detta fall beräknas den procentuella hämningen av syreupptagningshastigheten genom en jämförelse av syreupptagningen i närvaro av testkemikalien med ett medelvärde för syreupptagningen i motsvarande kontrollprover utan testkemikalie, både i närvaro och frånvaro av n-allyltiourea.

7.

Eventuell syreupptagning till följd av abiotiska processer kan påvisas genom en bestämning av hastigheten i blandningar bestående av testkemikalie, syntetiskt avloppsvattensmedium och vatten, i vilka aktiverat slam utelämnats.

INFORMATION OM TESTKEMIKALIEN

8.

Testkemikaliens identifiering (helst CAS-nummer), namn (IUPAC), renhetsgrad, vattenlöslighet, ångtryck, flyktighet och adsorptionsegenskaper bör vara kända för att möjliggöra en korrekt tolkning av resultaten. I regel kan flyktiga kemikalier inte testas på lämpligt sätt om inte särskilda åtgärder vidtas (se punkt 21).

TESTMETODENS TILLÄMPBARHET

9.

Testmetoden kan tillämpas på vattenlösliga, svårlösliga och flyktiga kemikalier. Det är dock inte alltid möjligt att få fram EC50-värden med kemikalier som har begränsad löslighet, och giltiga resultat med flyktiga kemikalier kan endast uppnås om merparten (till exempel > 80 %) av testkemikalien återstår i reaktionsblandningen i slutet av exponeringsperioden eller -perioderna. Uppgifter som utgör ytterligare analytiskt stöd bör lämnas in så att bestämningen av ECx-koncentrationen kan förbättras om man är osäker på testkemikaliens stabilitet eller flyktighet.

REFERENSKEMIKALIER

10.

Referenskemikalier bör regelbundet testas för att säkerställa att testmetoden och testbetingelserna är tillförlitliga, och för att på exponeringsdagen kontrollera känsligheten hos varje parti aktiverat slam som används som mikrobiellt inokulat. Kemikalien 3,5-diklorfenol (3,5-DCP) är lämplig att använda som referensinhibitorsubstans, eftersom man vet att den hämmar respirationen och används i många olika typer av tillväxthämnings- och toxicitetstester (4). Även koppar(II)sulfatpentahydrat kan användas som referensämne för hämning av den totala respirationen (9). N-metylanilin kan användas som särskild referensinhibitorsubstans för nitrifikation (4).

KRITERIER FÖR TESTRESULTATENS GILTIGHET OCH REPRODUCERBARHET

11.

Blankproven (utan testkemikalie eller referenskemikalie) bör inte ha en syreupptagningshastighet som är mindre än 20 mg syre per gram aktiverat slam (torrvikt suspenderade fasta ämnen) per timme. Om hastigheten är lägre bör testet upprepas med tvättat aktiverat slam eller med slam från en annan källa. Variationskoefficienten för syreupptagningshastigheten i kontrollreplikaten bör inte vara mer än 30 % i slutet av det definitiva testet.

12.

I ett internationellt ringtest från 2004 som organiserades av ISO (4) och där man använde aktiverat slam från avloppsvatten från hushåll, befanns EC50 för 3,5-DCP ligga i intervallet 2–25 mg/l för den totala respirationen, 5–40 mg/l för den heterotrofa respirationen och 0,1–10 mg/l för respirationen vid nitrifikation. Om EC50 för 3,5-DCP inte ligger inom det förväntade intervallet bör testet upprepas med aktiverat slam från en annan källa. EC50 för koppar(II)sulfatpentahydrat bör ligga i intervallet 53–155 mg/l för den totala respirationen (9).

BESKRIVNING AV TESTMETODEN

Testkärl och annan utrustning

13.

Vanlig laboratorieutrustning samt följande krävs:

(a)

Testkärl – t.ex. 1 000 ml bägare som kan rymma 500 ml reaktionsblandning (se punkt 5 i figur 1).

(b)

Mätcell och anslutningsdon för mätning av halten löst syre, en lämplig syreelektrod, en kapslad cell som kan rymma provet utan något gasutrymme och en mätare (t.ex. 7, 8, 9 i figur 1 i tillägg 2). Alternativt kan en BOD-kolv användas med en lämplig övergångsmuff för att fästa syreelektroden mot flaskans hals (se figur 2 i tillägg 3). För att undvika förlust av undanträngd vätska när syreelektroden införs är det lämpligt att först föra in en tratt eller ett glasrör genom muffen, eller att använda kärl med utsvängda kanter. I båda fallen bör man använda en magnetomrörare eller en alternativ omrörningsmetod, t.ex. en självomrörande sond.

(c)

Magnetomrörare och magnetloppor, belagda med inert material för användning i mätkammaren och/eller testkärlen.

(d)

Luftningsanordning. Om så krävs leds den komprimerade luften genom ett lämpligt filter, så att partiklar och olja avlägsnas, samt genom tvättflaskor med vatten för att fuktas. Innehållet i kärlen luftas med pasteurpipetter eller andra luftningsanordningar som inte adsorberar kemikalier. En orbitalskak med hastigheten 150–250 rpm och med kolvar som rymmer t.ex. 2 000 ml kan användas för att tillgodose syrebehovet i slammet och lösa problemet med kemikalier som bildar stora mängder skum, är flyktiga och därför går förlorade, eller är svåra att dispergera när de luftas genom bubbling. Testsystemet består vanligen av ett antal bägare som luftas kontinuerligt, etableras sekventiellt (t.ex. med ca 10–15 minuters mellanrum) och sedan analyseras sekventiellt. Validerade instrument som möjliggör samtidig luftning och mätning av syreförbrukningshastigheten i blandningarna kan också användas.

(e)

pH-mätare.

(f)

Centrifug, allmän bänkcentrifug för slam med en kapacitet på 10 000 m/s2.

Reagens

14.

Reagens av analyskvalitet bör användas genomgående.

Vatten

15.

Destillerat eller avjonat vatten som innehåller mindre än 1 mg/l DOC bör användas, utom då klorfritt kranvatten anges.

Syntetiskt avloppsvatten

16.

Mediet bör beredas med följande beståndsdelar i angivna mängder:

pepton

16 g

köttextrakt (eller jämförbart vegetabiliskt extrakt)

11 g

urea

3 g

natriumklorid (NaCl)

0,7 g

kalciumkloriddihydrat (CaC12, 2H2O)

0,4 g

magnesiumsulfatheptahydrat (MgSO4, 7H2O)

0,2 g

vattenfritt kaliummonovätefosfat (K2HPO4)

2,8 g

destillerat eller avjonat vatten till 1 liter

 

17.

Lösningens pH bör vara 7,5 ± 0,5. Om det framställda mediet inte används omedelbart ska det förvaras mörkt vid 0–4 °C i högst en vecka eller under förhållanden som inte ändrar dess sammansättning. Det bör noteras att detta syntetiska avloppsvatten är 100 gånger mer koncentrerat än det som beskrivs i OECD:s tekniska rapport Proposed method for the determination of the biodegradability of surfactants used in synthetic detergents av den 11 juni 1976, och att dikaliumvätefosfat dessutom har tillsatts.

18.

Alternativt kan beståndsdelarna i mediet steriliseras var för sig innan förvaring, eller så kan pepton och köttextrakt tillsättas strax innan testet utförs. Mediet bör blandas grundligt före användning och pH-värdet justeras vid behov till pH 7,5 ± 0,5.

Testkemikalie

19.

En stamlösning ska beredas för lätt vattenlösliga testämnen endast upp till maximal vattenlöslighet (utfällning får inte ske). Ämnen med låg vattenlöslighet, blandningar med komponenter av olika vattenlöslighet och adsorberande ämnen bör vägas direkt i testkärlen. I dessa fall kan användning av stamlösningar vara ett alternativ om de lösta koncentrationerna av testkemikalien bestäms analytiskt i testkärlen (innan det aktiverade slammet tillsätts). Om man bereder en WAF (water accommodated fraction), är det också viktigt att göra en analytisk bestämning av de lösta koncentrationerna av testkemikalierna i testkärlen. Man bör undvika att använda organiska lösningsmedel, emulgeringsmedel eller dispergeringsmedel för att förbättra lösligheten. Behandling med ultraljud av stamlösningar och suspensioner innan de rörs om, t.ex. över natten, är möjligt när det finns tillräcklig information om testkemikaliens stabilitet under sådana förhållanden.

20.

Testkemikalien kan ha en negativ inverkan på pH-värdet i testsystemet. pH-värdet i blandningar som behandlats med testkemikalien bör fastställas före testet i ett preliminärt försök, för att ta reda på om det är nödvändigt att göra en justering av pH-värdet innan huvudtestet, och återigen på samma dag som huvudtestet. Lösningar eller suspensioner av testkemikalien i vatten bör vid behov neutraliseras innan inokulatet tillsätts. Beroende på undersökningens syfte kan dock ytterligare tester utföras för att bedöma effekten av testkemikalien på slammet utan pH-justering, eftersom neutraliseringen kan påverka kemikaliens kemiska egenskaper.

21.

De toxiska effekterna av flyktiga kemikalier, i synnerhet i tester där luft bubblas genom systemet, kan leda till att varierande effekter uppstår på grund av förlust av ämnet under exponeringstiden. Försiktighet bör iakttas när sådana ämnen används genom att man utför en ämnesspecifik analys av kontrollblandningar som innehåller ämnet och genom att man ändrar genomluftningen.

Referenskemikalie

22.

Om 3,5-diklorfenol används som referenskemikalie bereds en lösning med 1,00 g 3,5-diklorfenol i 1 000 ml vatten (15). Varmt vatten och/eller ultraljud används för att påskynda upplösningen och späda lösningen till önskad volym när den har svalnat till rumstemperatur. Det bör dock säkerställas att referenskemikalien inte förändras strukturellt. Lösningens pH-värde kontrolleras och justeras vid behov med NaOH eller H2SO4 till pH 7–8.

23.

Om koppar(II)sulfatpentahydrat används som referenskemikalie bereds lösningar med koncentrationerna 58 mg/l, 100 mg/l och 180 mg/l (en faktor 1,8). Ämnet vägs upp direkt i testkärlen (29 – 50 – 90 mg för en total volym på 500 ml) och löses sedan upp i 234 ml autoklaverat kranvatten. Koppar(II)sulfatpentahydrat är lättlösligt. När testet inleds tillsätts 16 ml syntetiskt avloppsvatten och 250 ml aktiverat slam.

Specifik hämning av nitrifikation

24.

En 2,32 g/l stamlösning av n-allyltiourea (ATU) bereds. Om 2,5 ml av denna lösning tillsätts i en inkuberingsblandning med slutlig volym på 500 ml blir resultatet en slutkoncentration på 11,6 mg ATU/l (10– 4 mol/l), vilket är tillräckligt (4) för att orsaka en 100-procentig hämning av nitrifikationen i ett nitrifierande aktiverat slam som innehåller 1,5 g/l suspenderade fasta ämnen.

Abiotisk kontroll

25.

I vissa sällsynta fall kan en testkemikalie med starkt reducerande egenskaper orsaka en mätbar abiotisk syreförbrukning. I sådana fall kan det vara nödvändigt att ha abiotiska kontroller för att skilja mellan testkemikaliens abiotiska syreförbrukning och mikrobiell respiration. Abiotiska kontroller kan beredas genom att man utelämnar inokulatet från testblandningarna. På samma sätt kan abiotiska kontroller utan inokulat inkluderas när analytiska stödmätningar utförs för att fastställa den uppnådda koncentrationen under testets exponeringsfas, t.ex. när man använder stamlösningar med kemikalier som är svårlösliga i vatten tillsammans med komponenter som har olika vattenlöslighet. I särskilda fall kan det vara nödvändigt att bereda en abiotisk kontroll med ett sterilt inokulat (t.ex. genom autoklavering eller tillsättning av steriliserande toxiska ämnen). Vissa kemikalier kan endast producera eller förbruka syre om ytarean är tillräckligt stor för att en reaktion ska inträffa, även om de normalt sett behöver mycket högre temperatur eller tryck för detta. I detta avseende bör särskild uppmärksamhet ägnas åt peroxidiska ämnen. Steriliserade inokulat ger en stor yta.

Inokulat

26.

Aktiverat slam för allmän användning samlas in från (eller nära) utloppet på luftningstanken hos ett väl fungerande reningsverk som huvudsakligen behandlar avloppsvatten från hushåll. Beroende på testets syfte kan även andra lämpliga typer av eller källor för aktiverat slam användas, t.ex. slam som framställts i laboratoriet. Slammet ska ha en lämplig koncentration av suspenderade fasta ämnen, 2–4 g/l. Slam från olika reningsverk har dock ofta olika egenskaper och känslighet.

27.

Slammet kan användas som det är när det samlas in, men grova partiklar bör avlägsnas genom sedimentering under en kort period, t.ex. 5–15 minuter, följt av dekantering av det översta skiktet med finkornigare fasta ämnen eller sållning (t.ex. genom en sikt med maskstorleken 1 mm). Alternativt kan slammet homogeniseras i blandare i ca 15 sekunder eller längre, men försiktighet krävs med tanke på de skjuvkrafter och temperaturförändringar som kan uppstå vid långa blandningstider.

28.

Det är ofta nödvändigt att tvätta slammet, t.ex. om den endogena respirationshastigheten är låg. Slammet bör först centrifugeras, t.ex. i 10 minuter vid ca 10 000 m/s2, så att det bildas en klar supernatant samt en pellet bestående av avloppsvattnets fasta beståndsdelar. Supernatanten kasseras och slammet återsuspenderas i klorfritt kranvatten under skakning. Tvättvattnet avlägsnas sedan genom att slammet åter centrifugeras och supernatanten kasseras. Tvätt och centrifugering upprepas vid behov. Torrvikten hos en känd volym av det återsuspenderade slammet fastställs, och slammet ska antingen koncentreras genom att vätska avlägsnas eller spädas ytterligare i klorfritt kranvatten så att man uppnår den erforderliga koncentrationen för slammets fasta beståndsdelar på 3 g/l. Det aktiverade slammet luftas kontinuerligt (t.ex. 2 l/minut) vid testtemperaturen, och det bör helst användas samma dag som det samlas in. Om detta inte är möjligt ska syntetiskt avloppsvatten (50 ml syntetiskt avloppsvatten/liter aktiverat slam) tillföras slammet dagligen i ytterligare två dagar. Slammet används därefter i testet och resultaten betraktas som giltiga, förutsatt att inga betydande förändringar av slammets aktivitet har inträffat. Detta avgörs genom en bestämning av slammets endogena heterotrofa och nitrifierande respirationshastighet.

29.

Svårigheter kan uppstå om skumbildning inträffar under inkuberingsfasen i sådan omfattning att skummet och de partiklar från slammet som är suspenderade i skummet svämmar ut ur luftningskärlen. Ibland förekommer skumbildning på grund av närvaron av syntetiskt avloppsvatten, men man måste räkna med skumbildning om testkemikalien består av eller innehåller ett ytaktivt ämne. Förlust av fasta ämnen i slammet från testblandningarna leder till artificiellt minskade respirationshastigheter som felaktigt kan tolkas som en följd av hämning. Det ytaktiva ämnet koncentreras dessutom i skumlagret vid luftning av lösningen med det ytaktiva ämnet. Förlust av skum från testsystemet sänker exponeringskoncentrationerna. Skumbildningen kan kontrolleras genom enkla mekaniska metoder (t.ex. sporadisk manuell omrörning med en glasstav) eller genom att tillsätta ett skumdämpande ämne bestående av en silikonemulsion som är fri från ytaktiva ämnen och/eller genom att lufta lösningen med skakkolvmetoden. Om problemet härrör från närvaron av syntetiskt avloppsvatten bör sammansättningen av avloppsvattnet modifieras genom att man tillsätter en skumdämpande reagens, med en mängd på t.ex. 50 μl/l. Om skumbildningen orsakas av testkemikalien bör den kvantitet som behövs för att dämpa skumbildningen fastställas vid den högsta testkoncentrationen, och därefter bör alla enskilda luftningskärl behandlas identiskt (inklusive kärl i vilka inget skum förekommer, t.ex. blankprov och referenskärl). Om skumdämpande medel används bör det inte förekomma någon interaktion med inokulatet och/eller testkemikalien.

TESTFÖRFARANDE

30.

Man kan fastställa hämningen av tre olika syreupptagningar: totalt, endast heterotrof, och syreupptagning på grund av nitrifikation. Normalt bör det räcka att mäta hämningen av den totala syreupptagningen. Man behöver känna till effekterna på den heterotrofa syreupptagningen vid oxidering av organiskt kol och på grund av oxidation av ammonium om det finns ett särskilt krav på dessa två endpoints för en viss kemikalie eller (alternativt) för att förklara atypiska dos-responskurvor genom hämning av den totala syreupptagningen.

Testbetingelser

31.

Testet bör utföras vid en temperatur på 20 ± 2 °C.

Testblandningar

32.

Testblandningar (FT som i tabell 1) som innehåller vatten, syntetiskt avloppsvatten och testkemikalien bereds så att olika nominella koncentrationer av testkemikalien erhålls (se tabell 1 för exempel på beståndsdelarnas mängder). Vid behov justeras pH-värdet till 7,5 ± 0,5. Blandningarna späds med vatten och inokulatet tillsätts så att lika slutvolymer i kärlen uppnås och luftningen kan inledas.

Referensblandningar

33.

Blandningar (FR) bereds på samma sätt som testblandningarna, med referenskemikalien, t.ex. 3,5-diklorfenol, som ersättare för testkemikalien.

Blankprov

34.

Blankprov (FB) bereds i början och slutet av exponeringstiden i prov där testbägarna upprättas sekventiellt med jämna mellanrum. Vid tester som görs med utrustning som möjliggör samtidiga mätningar av syreförbrukningen inkluderas minst två blankprov i varje parti som analyseras samtidigt. Blankproven ska innehålla samma volym aktiverat slam och syntetiskt medium men inga test- eller referenskemikalier. De späds med vatten till samma volym som test- och referensblandningarna.

Abiotisk kontroll

35.

Vid behov, t.ex. om testkemikalien är känd för eller misstänks ha starkt reducerande egenskaper, bör en blandning FA beredas för mätning av den abiotiska syreförbrukningen. Blandningen bör ha samma mängd testämne och syntetiskt avloppsvatten och samma volym som testblandningarna, men sakna aktiverat slam.

Allmänna förfaranden och mätningar

36.

Testblandningar, referensblandningar, blankprov och abiotiska kontroller inkuberas vid testtemperaturen under forcerad luftning (0,5–1 l/min) så att halten löst syre hålls över 60–70 % mättnad och det flockade slammet förblir suspenderat. Det är också nödvändigt med omrörning i kulturerna för att se till att det flockade slammet förblir suspenderat. Inkuberingen påbörjas när inokulatet med aktiverat slam för första gången kommer i kontakt med övriga beståndsdelar i den slutliga blandningen. Vid inkuberingens slut, efter den angivna exponeringstiden på vanligtvis 3 timmar, ska prover tas för mätning av hur snabbt halten löst syre avtar i den cell som utformats för detta ändamål (figur 2 i tillägg 3) eller i en helt fylld BOD-kolv. Det sätt på vilket inkuberingarna inleds beror också på den använda utrustningens kapacitet att mäta syreförbrukningshastigheten. Om det till exempel ingår en enda syresond görs mätningarna var och en för sig. I förevarande fall måste de olika blandningar som behövs för testet av syntetiskt avloppsvatten beredas men inokulatet bör inte tillsättas, och de erforderliga volymerna slam bör tillsättas i varje kärl i satsen. Varje inkubering bör inledas successivt efter lämpligt valda intervaller på t.ex. 10–15 minuter. Alternativt kan mätsystemet utgöras av flera sonder som möjliggör flera samtidiga mätningar. I sådana fall kan inokulatet tillsättas samtidigt i lämpliga grupper med kärl.

37.

Koncentrationen för det aktiverade slammet i alla test- och referensblandningar samt blankproven (men inte de abiotiska kontrollerna) är nominellt 1,5 g/l för suspenderade fasta ämnen. Syreförbrukningen bör mätas efter 3 timmars exponering. Ytterligare mätningar efter 30 minuters exponering bör utföras om så är lämpligt och på det sätt som beskrivs ovan i punkt 5.

Slammets nitrifikationspotential

38.

För att avgöra om slam nitrifieras och, om så är fallet, med vilket hastighet, bör man bereda blandningar (FB) som i blankproven och ytterligare ’kontroll’-blandningar (FN) men som även innehåller 11,6 mg/l n-allyltiourea. Blandningarna luftas och inkuberas vid 20 ± 2 °C i 3 timmar. Därefter mäts syreupptagningshastigheten, och hastigheten för syreupptagning på grund av nitrifikation beräknas.

Testupplägg

Preliminärt test

39.

Ett preliminärt test används vid behov för att uppskatta de koncentrationer av testkemikalien som behövs i det definitiva testet för bestämning av hämningen av syreförbrukningen. Alternativt kan det faktum att testkemikalien inte hämmar syreförbrukningen i ett preliminärt test visa att det definitiva testet är onödigt, men tre exemplar vid den högsta testade koncentrationen i det preliminära testet (vanligen 1 000 mg/l, men kravet på data avgör) bör inkluderas.

Tabell 1

Exempel på blandningar för det inledande testet

Reagens

Ursprunglig koncentration

Stamlösning med testkemikalie

10 g/l

Stamlösning med syntetiskt medium

Se punkt 16.

Suspenderad stamlösning med aktiverat slam

3 g/l suspenderade fasta ämnen

Beståndsdelar i blandningarna

Dosering i testkärlen (6)

FT1

FT2

FT3-5

FB1-2

FA

Stamlösning av testkemikalien (ml)

(punkterna 19–21)

0,5

5

50

0

50

Stamlösning med syntetiskt avloppsvatten (ml)

(punkt 16)

16

16

16

16

16

Suspenderad lösning med aktiverat slam (ml)

(punkterna 26–29)

250

250

250

250

0

Vatten

(punkt 15)

233,5

229

184

234

434

Blandningarnas totala volym (ml)

500

500

500

500

500

Koncentrationer i blandningen

 

 

 

 

 

Testsuspension (mg/l)

Aktiverat slam

10

10

1 000

0

1 000

(suspenderade fasta ämnen) (mg/l)

1 500

1 500

1 500

1 500

0

40.

Testet bör utföras med minst tre koncentrationer av testkemikalien, t.ex. 10 mg/l, 100 mg/l och 1 000 mg/l med ett blankprov och, vid behov, minst tre abiotiska kontroller med den högsta koncentrationen av testkemikalien (se tabell 1 som exempel). Helst ska de lägsta koncentrationerna inte ha någon inverkan på syreförbrukningen. Syreupptagningshastigheterna och nitrifikationshastigheten bör beräknas (om tillämpligt), och därefter bör den procentuella hämningen beräknas. Beroende på testets syfte är det även möjligt att helt enkelt fastställa toxiciteten för en koncentrationsgräns, t.ex. 1 000 mg/l. Om det inte förkommer några statistiskt signifikanta toxiska effekter vid denna koncentration är det inte nödvändigt att utföra ytterligare tester vid högre eller lägre koncentrationer. Det bör noteras att ämnen som är svårlösliga i vatten, blandningar med komponenter som har olika vattenlöslighet och adsorberande ämnen bör vägas upp direkt i testkärlen. I detta fall ska den volym som reserverats för stamlösningen med testämnet ersättas med utspädningsvatten.

Definitivt test

Hämning av den totala syreupptagningen

41.

Testet bör utföras med en serie koncentrationer som härleds från det preliminära testet. För att få fram både NOEC och ECx (t.ex. EC50) bör man i de flesta fall ha sex kontroller och fem testkoncentrationer i en geometrisk serie med fem replikat. Den abiotiska kontrollen behöver inte upprepas om det inte förelåg någon syreupptagning i det preliminära testet, men om det förekom betydande syreupptagning bör abiotiska kontroller inkluderas för varje koncentration av testkemikalien. Slammets känslighet bör kontrolleras med hjälp av referenskemikalien 3,5-diklorfenol. Slammets känslighet bör kontrolleras för varje testserie, eftersom känsligheten ofta varierar. Under alla omständigheter ska prover tas från testkärlen efter 3 timmar, och vid behov efter ytterligare 30 minuter, för mätning av syreupptagningshastigheten i syreelektrodcellen. På basis av insamlade data kan kontrollens och testblandningarnas särskilda respirationshastigheter beräknas, och den procentuella hämningen beräknas sedan med hjälp av ekvation 7 nedan.

Differentiering mellan hämningen av den heterotrofa respirationen och nitrifikationen

42.

Genom användning av den särskilda nitrifikationshämmaren, ATU, kan man direkt bedöma de hämmande effekterna av testkemikalierna på den heterotrofa oxideringen, och genom att subtrahera syreupptagningshastigheten med ATU från den totala upptagningshastigheten (utan ATU), kan effekterna på nitrifikationshastigheten beräknas. Två uppsättningar med reaktionsblandningar bör beredas i enlighet med de testupplägg för ECx eller NOEC som beskrivs i punkt 41, men ATU bör dessutom läggas till för varje blandning i en uppsättning med en slutlig koncentration på 11,6 mg/l, vilket har visat sig hämma nitrifikationen helt i slam med koncentrationer för suspenderade fasta ämnen på upp till 3 000 mg/l (4). Syreupptagningshastigheterna bör mätas efter exponeringstiden. Dessa direkta värden representerar endast den heterotrofa respirationen, och skillnaderna mellan dessa och motsvarande värden för den totala respirationen utgörs av nitrifikationen. De olika graderna av hämning ska därefter beräknas.

Mätningar

43.

Efter exponeringstiden överförs ett prov från det första luftningskärlet till syreelektrodcellen (figur 1 i tillägg 2) och halten löst syre mäts omedelbart. Om ett system med flera elektroder finns att tillgå kan mätningarna göras samtidigt. Det är av avgörande betydelse att omrörning (med hjälp av en belagd magnet) sker i samma takt som när elektroden kalibrerades för att se till att sonden svarar med minimal fördröjning på de växlande syrekoncentrationerna och för att möjliggöra regelbundna och reproducerbara mätningar av syre i mätkärlet. Det är ofta tillräckligt med det självomrörande sondsystem som vissa syreelektroder är utrustade med. Cellen bör sköljas med vatten mellan mätningarna. Alternativt kan provet användas för att fylla en BOD-kolv (figur 2 i tillägg 3) försedd med en magnetisk omrörare. En syresond med en övergångsmuff förs sedan in i flaskans hals och magnetomröraren sätts på. I båda fallen mäts halten löst syre kontinuerligt och registreras under en viss tid, vanligen fem till tio minuter eller till dess att syrekoncentrationen fallit under 2 mg/l. Elektroden avlägsnas därefter, och blandningen återförs till luftningskärlet, där luftningen och omrörningen fortsätter om det är nödvändigt att göra mätningar efter längre exponeringstider.

Kontroll av testkemikaliens koncentration

44.

För vissa ändamål kan det vara nödvändigt att mäta koncentrationen av testkemikalien i testkärlen. Det bör noteras att om stamlösningar av

ämnen som är svårlösliga i vatten,

blandningar som innehåller ämnen med olika vattenlöslighet, eller

ämnen med hög vattenlöslighet men där stamlösningens koncentration ligger nära den högsta vattenlösligheten

används är den lösta delen okänd, och den verkliga koncentrationen av testkemikalien som överförs till testkärlen är okänd. För att karakterisera exponeringen är det nödvändigt att göra en analytisk bedömning av testkemikaliens koncentrationer i testkärlen. För att förenkla saken bör den analytiska bedömningen utföras innan inokulatet tillsätts. Eftersom endast upplösta fraktioner överförs till testkärlen kan de uppmätta koncentrationerna vara mycket låga.

45.

För att undvika tidsödande och dyra analyser är det bäst att helt enkelt väga testkemikalien i testkärlen och att hänvisa till den ursprungliga vägda nominella koncentrationen för påföljande beräkningar. Det är inte nödvändigt att differentiera mellan upplösta, oupplösta eller adsorberade fraktioner av testkemikalien eftersom alla dessa fraktioner förekommer även under verkliga förhållanden i ett reningsverk, och de kan variera beroende på sammansättningen av avloppsvattnet. Syftet med testmetoden är att göra en bedömning av en icke-hämmande koncentration under realistiska förhållanden, och det är inte lämpligt att i detalj undersöka vilka fraktioner som bidrar till hämningen av organismerna i det aktiverade slammet. Slutligen bör de adsorptiva ämnena också vägas direkt i testkärlen, och kärlen bör silaniseras för att minimera förlusterna genom adsorption.

DATA OCH RAPPORTERING

Beräkning av syreupptagninghastigheter

46.

Syreupptagningshastigheterna bör beräknas utifrån medelvärdet av de uppmätta värdena, t.ex. utifrån den linjära delen av kurvorna för syrekoncentrationen avsatt mot tiden, och beräkningarna bör då inskränkas till syrekoncentrationer på mellan 2,0 mg/l och 7,0 mg/l eftersom högre och lägre koncentrationer i sig kan påverka förbrukningshastigheten. Avvikelser till koncentrationsintervaller under eller över dessa värden är ibland oundvikliga och nödvändiga, t.ex. när respirationen är starkt hämmad och följaktligen mycket långsam, eller om ett visst aktiverat slam respirerar mycket snabbt. Detta kan godtas under förutsättning att de utvidgade delarna av upptagningskurvan är raka och deras lutningar inte ändras när de passerar gränsvärdena på 2,0 mg/l eller 7,0 mg/l O2. Alla böjda delar av kurvan visar att mätsystemet håller på att stabiliseras eller att upptagningshastigheten håller på att ändras, och de bör inte användas för beräkning av respirationen. Syreupptagningshastigheten bör uttryckas i milligram per liter per timme (mg/lh) eller milligram per gram torrt slam per timme (mg/gh). Syreförbrukningshastigheten, R, i mg/lh kan beräknas eller interpoleras från den linjära delen av den registrerade syreminskningskurvan enligt ekvation 1:

R = (Q1 – Q2)/Δt × 60

(1)

där

Q1

är syrekoncentrationen i början av det utvalda avsnittet av den linjära fasen (mg/l),

Q2

är syrekoncentrationen i slutet av det utvalda avsnittet av den linjära fasen (mg/l),

Δt

är tidsintervallet mellan dessa två mätningar (min.).

47.

Den särskilda respirationshastigheten (RS) uttrycks som mängden förbrukat syre per g torrvikt slam per timme (mg/gh) enligt ekvation 2:

Rs = R/SS

(2)

där SS är koncentrationen av de suspenderade fasta ämnena i testblandningen (g/l).

48.

De olika exponenterna för R som kan kombineras är följande:

S

särskild hastighet

T

total respirationshastighet

N

hastighet på grund av respiration genom nitrifikation

H

hastighet på grund av heterotrof respiration

A

hastighet på grund av abiotiska processer

B

hastighet baserad på blankprov (medelvärde)

Beräkning av syreupptagningshastigheten på grund av nitrifikation

49.

Förhållandet mellan den totala resprationen (RT), respirationen genom nitrifikation (RN) och den heterotrofa respirationen (RH) beräknas med formel 3:

RN = RT – RH

(3)

där

RN

är syreupptagningshastigheten på grund av nitrifikation (mg/lh),

RT

är den uppmätta syreupptagningshastigheten i blankprovet (ingen ATU; FB) (mg/lh),

RH

är den uppmätta syreupptagningshastigheten i blankprovet med tillsats av ATU (FN) (mg/lh).

50.

Detta förhållande gäller för blankvärden (RNB, RTB, RHB), abiotiska kontroller (RNA, RTA, RHA) och prover med testkemikalier (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). Särskilda respirationshastigheter beräknas utifrån

RNS = RN/SS

(4)

RTS = RT/SS

(5)

RHS = RH/SS

(6)

51.

Om RN är obetydligt stor (t.ex. < 5 % av RT i blankproven) i ett preliminärt test kan man utgå från att den heterotrofa syreupptagningen är lika med den totala upptagningen och att ingen nitrifikation pågår. En alternativ källa för aktiverat slam behövs om testerna ska ta hänsyn till effekterna på heterotrofa och nitrifierande mikroorganismer. Ett definitivt test utförs om det finns tecken på hämmade syreupptagningshastigheter med olika koncentrationer av testkemikalien.

Beräkning av den procentuella hämningen

52.

Den procentuella hämningen IT av den totala syreförbrukningen vid varje koncentration av testkemikalien kan beräknas med ekvation 7:

IT = [1 – (RT – RTA)/RTB] × 100 %

(7)

53.

På samma sätt kan den procentuella hämningen av den heterotrofa syreupptagningen IH vid varje koncentration av testkemikalien beräknas med ekvation 8:

IH = [1 – (RH – RHA)/RHB] × 100 %

(8)

54.

Slutligen kan hämningen av syreupptagningen på grund av nitrifikation IN vid varje koncentration beräknas med ekvation 9:

IN = [1 – (RT – RH)/(RTB – RHB)] × 100 %

(9)

55.

Den procentuella hämningen av syreupptagningen plottas mot logaritmen av testkemikaliens koncentration (hämningskurva, se figur 3 i tillägg 4). Hämningskurvor plottas för varje luftningsperiod på 3 timmar eller dessutom efter ytterligare 30 minuter. Den koncentration av testkemikalien som hämmar syreupptagningen med 50 % (EC50) bör beräknas eller interpoleras utifrån kurvan. Om lämpliga data finns tillgängliga, kan de 95-procentiga konfidensgränserna för EC50, kurvans lutning, och lämpliga värden som markerar början (till exempel EC10 eller EC20) och slutet av hämningsintervallet (till exempel EC80 eller EC90) beräknas eller interpoleras.

56.

Det bör noteras att det mot bakgrund av den variabilitet som ofta förekommer i resultaten i många fall kan vara tillräckligt att redovisa resultaten i storleksordning, till exempel

EC50

< 1 mg/l

EC50

1 mg/l till 10 mg/l

EC50

10 mg/l till 100 mg/l

EC50

> 100mg/l

Tolkning av resultaten

ECx

57.

ECx-värden, inklusive deras sammanhörande nedre och övre 95-procentiga konfidensgränser för parametern i fråga, beräknas med hjälp av lämpliga statistiska metoder (t.ex. probit-analys, logistiska funktioner eller Weibull-funktioner, den modifierade Spearman-Kärbermetoden eller enkel interpolering (11)). ECx beräknas genom att ett värde som motsvarar x % av medelvärdet för kontrollen införs i den ekvation som erhållits. För att beräkna EC50 eller något annat ECx-värde bör en regressionsanalys utföras på medelvärdena för varje testkärl (x).

Uppskattning av NOEC

58.

Om en statistisk analys används för att bestämma NOEC är det nödvändigt att sammanställa statistiska uppgifter för varje enskilt kärl (enskilda kärl anses utgöra replikat). Lämpliga statistiska metoder bör användas i enlighet med OECD:s dokument Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application (11). I allmänhet ska negativa effekter av testkemikalien jämfört med kontrollsubstansen undersökas genom en ensidig (mindre) hypotesprövning vid p ≤ 0,05.

Testrapport

59.

Testrapporten ska innehålla följande information:

 

Testkemikalie

trivialnamn, kemiskt namn, CAS-nummer, renhet,

fysikalisk-kemiska egenskaper (t.ex. log Kow, vattenlöslighet, ångtryck, Henrys konstant (H) och helst information om testkemikaliens omvandling, spridning och fördelning, t.ex. adsorption till aktiverat slam),

 

Testsystem

källa, villkor för drift av reningsverk och inflöde, koncentration, förbehandling och underhåll av det aktiverade slammet,

 

Testbetingelser

temperatur, pH under testet och exponeringens varaktighet,

 

Resultat

kontrollernas specifika syreförbrukning (mg O2/(g slam × h),

alla uppmätta data, hämningskurva/-kurvor och metod för beräkning av EC50,

EC50 och, om möjligt, 95-procentiga konfidensgränser; eventuellt EC20, EC80. Eventuellt NOEC och de använda statistiska metoderna om EC50 inte kan fastställas,

resultat för den totala hämningen och, om så är lämpligt, den heterotrofa hämningen och nitrifikationshämningen,

abiotisk syreupptagning i den fysikalisk-kemiska kontrollen (om sådan används),

namn på referenskemikalien och de resultat som erhållits med denna kemikalie,

alla iakttagelser och avvikelser från det normala förfarandet som kan ha inflytande på resultatet.

LITTERATUR

(1)

Brown, D., Hitz, H. R. och Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245–261.

(2)

King, E. F. och Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27–39.

(3)

OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test. Testriktlinje nr 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Vattenundersökningar – Metod för bestämning av hämning av syreförbrukning hos mikroorganismer i aktivt slam (kol- och ammonium-oxidation), Internationella standardiseringsorganisationen.

(5)

Bealing, D. J. (2003). Dokument ISO/TC147/WGI/N.183, Internationella standardiseringsorganisationen.

(6)

Painter, H. A. och Jones, K. (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471–483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1: 515–524.

(8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig S. och Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test – acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 Nr 12b: 1556–1557.

(10)

ISO (1995). ISO 10634 Vattenundersökningar – Handledning för beredning och handhavande av i vatten svårlösliga organiska föreningar för efterföljande utvärdering av deras bionedbrytbarhet i vattenlösning, Internationella standardiseringsorganisationen.

(11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment nr 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.

Tillägg 1

Definitioner

Följande definitioner gäller för denna testmetod.

Kemikalie : ett ämne eller en blandning.

ECx (koncentration som orsakar x % effekt): den koncentration som orsakar en x-procentig effekt på testorganismerna efter en given exponeringstid jämfört med ett kontrollprov. EC50 är till exempel den koncentration som beräknas ha en effekt för en av testets endpoints på 50 % av en exponerad population under en fastställd exponeringstid.

Nolleffektkoncentrationen (NOEC, no observed effect concentration) : den högsta koncentrationen av testkemikalien vid vilken ingen effekt har observerats. I detta test har en halt som motsvarar NOEC ingen statistiskt signifikant effekt (p < 0,05) efter en given exponeringstid jämfört med ett kontrollprov.

Testkemikalie : alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.

Tillägg 2

Figur 1   Exempel på mätenhet

Image

Teckenförklaring

1

aktiverat slam

2

syntetiskt medium

3

testkemikalie

4

luft

5

blandningskärl

6

magnetomrörare

7

mätcell för syre

8

syreelektrod

9

mätinstrument för syre

10

registreringsinstrument

Tillägg 3

Figur 2:   Exempel på mätenhet vid användning av BOD-kolv

Image

Teckenförklaring

1

testkärl

2

syreelektrod

3

mätinstrument för syre

Tillägg 4

Figur 3:   Exempel på hämningskurvor

Image

Teckenförklaring

X

koncentration av 3,5-diklorfenol (mg/l)

Y

hämning (%)

Image

hämning av heterotrof respiration vid användning av ett nitrifierande slam

Image

hämning av nitrifiering vid användning av ett nitrifierande slam

(5)

Kapitel C.26 ska ersättas med följande:

C.26.   BESTÄMNING AV TILLVÄXTHÄMNING HOS LEMNA-ARTER (ANDMAT)

INLEDNING

1.

Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 221 (2006). Den är avsedd för bestämning av kemikaliers toxicitet för sötvattensväxter av släktet Lemna (andmat). Den bygger på befintliga metoder (1) (2) (3) (4) (5) (6), men har modifierats på några viktiga punkter i enlighet med nya forskningsrön och till följd av samråd. Testmetoden har validerats genom ett internationellt ringtest, dvs. en testjämförelse mellan olika laboratorier i världen (7).

2.

Metoden används för toxicitetstest på arterna Lemna gibba och Lemna minor. Båda dessa arter har studerats ingående och använts i test med de standardmetoder som det hänvisas till ovan. Taxonomin för Lemna spp. är komplicerad på grund av mångfalden fenotyper. Hos Lemna kan responsen på toxiska substanser variera p.g.a. genetiska skillnader, men för närvarande finns det inte tillräckligt med data om denna källa till variation för att man ska kunna rekommendera en bestämd klon för användning i den aktuella testmetoden. Observera att testet inte utförs axeniskt (dvs. med en monokultur fri från infektion av mikroorganismer), men åtgärder vidtas vid ett antal tillfällen under testets gång för att hålla kontaminationen från andra organismer så låg som möjligt.

3.

Dokumentet innehåller ingående beskrivningar av testförfaranden med regelbunden förnyelse av testlösningar (semistatiskt test och genomflödestest) och utan förnyelse av testlösningar (statiskt test). Beroende på lagstadgade krav och syftet med testet kan semistatiskt test eller genomflödestest komma i fråga i vissa fall, t.ex. för kemikalier som snabbt försvinner ur lösningen genom avdunstning, ljusnedbrytning, utfällning eller bionedbrytning. Närmare riktlinjer finns i (8).

4.

De definitioner som används finns i tillägg 1.

PRINCIP FÖR TESTMETODEN

5.

Exponentiellt växande växtkulturer av släktet Lemna får växa som monokulturer i olika koncentrationer av testkemikalien under loppet av sju dagar. Syftet är att genom bestämning av utvalda mätvariabler kvantifiera testkemikaliens effekter på tillväxten under tiden för testets genomförande. Antalet fronder är den primära mätvariabeln. Minst ytterligare en mätvariabel – total frondarea, torrvikt eller färskvikt – mäts, eftersom en del kemikalier kan påverka andra mätvariabler mer än de påverkar frondantalet. För att kvantifiera testkemikaliens effekter jämförs tillväxten i testlösningarna med tillväxten i kontrollerna. Därefter bestäms den koncentration som åstadkommer en bestämd procent (x) av tillväxthämning, t.ex. 50 %. Denna koncentration betecknas som ECx, t.ex. EC50 i fallet med 50 % tillväxthämning.

6.

Endpoint i testet är tillväxthämning, uttryckt som den logaritmiska ökningen av mätvariabeln (den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten) under exponeringstiden. Från de genomsnittliga specifika tillväxthastigheter som uppmätts i en serie testlösningar fastställer man den koncentration av testkemikalien som ger upphov till en specificerad minskning av tillväxthastigheten, x % (t.ex. 50 %). Värdet uttrycks som ErCx (t.ex. ErC50).

7.

I den här testmetoden används även producerad mängd biomassa som responsvariabel, något som kan vara nödvändigt för att uppfylla gällande krav i vissa länder. Den definieras som storleken på en mätvariabel vid exponeringstidens slut minus storleken på samma mätvariabel vid exponeringstidens början. Med utgångspunkt i den mängd biomassa som producerats i en serie testlösningar beräknar man den koncentration av testkemikalien som ger upphov till en viss, fastställd minskning av mängden producerad biomassa, x % (t.ex. 50 %). Detta värde uttrycks som EyCx (t.ex. EyC50).

8.

Den lägsta koncentrationen med observerad effekt (LOEC) och den högsta koncentrationen utan observerad effekt (NOEC) kan också bestämmas statistiskt.

INFORMATION OM TESTKEMIKALIEN

9.

Man bör ha tillgång till en analysmetod som är tillräckligt känslig för kvantitetsbestämning av testkemikalien i testmediet.

10.

Bland annat följande uppgifter om testkemikalien kan vara av värde när man fastställer testbetingelserna: strukturformel, renhetsgrad, vattenlöslighet, stabilitet i vatten och ljus, pKa, Kow, ångtryck och bionedbrytbarhet. Löslighet i vatten och ångtryck kan användas för att beräkna Henrys konstant, som visar om det är sannolikt att förlusterna av testkemikalien under testets genomförande kommer att vara betydande. Detta ger en indikation på om man behöver vidta åtgärder för att kontrollera dessa förluster. Om uppgifterna om testkemikaliens löslighet och stabilitet är osäkra, bör man bedöma dessa egenskaper under testbetingelserna, dvs. i det odlingsmedium, vid den temperatur och under de belysningsförhållanden som används i testet.

11.

När det är särskilt viktigt att reglera testmediets pH, t.ex. vid test av hydrolytiskt instabila metaller eller kemikalier (dvs. sådana som bryts ned i vatten), bör man tillsätta en buffert i odlingsmediet (se punkt 21). Närmare vägledning för testning av kemikalier vars fysikalisk-kemiska egenskaper gör dem svåra att testa finns i (8).

TESTETS GILTIGHET

12.

För att testresultaten ska vara giltiga måste fördubblingstiden för frondantalet i kontrollen vara mindre än 2,5 dagar (60 timmar). Det motsvarar en ökning på ca 700 % på 7 dagar och en genomsnittlig specifik tillväxthastighet på 0,275 d– 1. Med de testmedier och testbetingelser som beskrivs för den aktuella testmetoden kan detta kriterium uppfyllas med ett statiskt testförfarande (5). Kriteriet bör också kunna uppfyllas vid semistatiskt testförfarande och genomflödestest. Beräkningen av fördubblingstiden beskrivs i punkt 49.

REFERENSKEMIKALIE

13.

Referenskemikalie(r), t.ex. 3,5-diklorfenol, som används i det internationella ringtestet (7), kan testas för att kontrollera testförfarandet. Det är lämpligt att testa en referenskemikalie minst två gånger per år eller, om testen utförs mer sällan, parallellt med fastställandet av en testkemikalies toxicitet.

BESKRIVNING AV TESTMETODEN

Utrustning

14.

All utrustning som befinner sig i kontakt med testmedier ska vara av glas eller annat kemiskt inert material. Glasutrustning som används för odling och test ska vara rengjord från kemiska föroreningar som kan läcka in i testmediet, och glaset ska vara sterilt. Provkärlen ska vara så vida att fronderna från de olika kolonierna i kontrollerna kan växa utan att de täcker varandra i slutet av testet. Det gör inget om rötterna vidrör botten av provkärlen, men alla provkärl bör vara minst 20 mm djupa och ha en volym på minst 100 ml. Så länge dessa krav är uppfyllda har valet av provkärl ingen avgörande betydelse. Glasbägare och kristalliseringsskålar samt petriskålar av glas – alla med passande storlekar – har alla visat sig vara lämpliga. Provkärlen måste vara tillslutna för att avdunstning och oavsiktlig kontamination ska hållas så låg som möjlig, samtidigt som erforderlig luftväxling ska vara möjlig. Provkärlen – framför allt lock, proppar eller andra typer av förslutningar – måste vara sådana att det inte förekommer någon skuggverkan eller förändringar av ljusets spektrala egenskaper.

15.

Odlingar och provkärl får inte förvaras tillsammans. Bäst är att använda separata klimatodlingskammare, inkubatorer eller klimatrum. Belysning och temperatur måste kunna regleras och hållas på konstant nivå (se punkterna 35–36).

Testorganism

16.

Som organism för testet används Lemna gibba eller Lemna minor. Tillägg 2 innehåller kortfattade beskrivningar av andmatsarter som har använts för toxicitetstest. Växtmaterial kan tas från en kultursamling, införskaffas från ett annat laboratorium eller samlas in i naturen. Innan de används ska plantor som samlats in i naturen hållas i samma medium som används för testet under minst åtta veckor. Det får inte finnas några uppenbara kontaminationskällor på platser som används för insamling i naturen. Växtmaterial som införskaffas från andra laboratorier eller från kultursamlingar ska förvaras under minst tre veckor på samma sätt som plantor från naturen. Om ursprunget är känt ska detta alltid redovisas för växtmaterialet, de arter och den klon som används för testet.

17.

Man ska använda monokulturer utan synliga föroreningar i form av andra organismer såsom alger och protozoer. Friska plantor av L. minor består av kolonier med mellan två och fem fronder, medan friska kolonier av L. gibba kan omfatta upp till sju fronder.

18.

Kvaliteten och enhetligheten hos plantorna som används för testet har stor betydelse för testresultatet, och de bör därför väljas ut med omsorg. Man bör använda unga, snabbväxande plantor utan synliga skador eller missfärgningar (p.g.a. kloros). Att en kultur är av god kvalitet kännetecknas av att den har en stor andel kolonier med minst två fronder. Ett stort antal enstaka fronder är ett tecken på miljöstress, t.ex. på grund av näringsbrist. Växtmaterial från sådana kulturer bör inte användas för tester.

Odling

19.

För att göra odlingen mindre arbetskrävande – t.ex. när inga test av Lemna är inplanerade under en längre tid – kan kulturerna förvaras under reducerad belysning och temperatur (4–10 °C). Uppgifter om behandling av stamkulturer finns i tillägg 3. Om det finns tydliga tecken på föroreningar i form av alger eller andra organismer krävs ytsterilisering av ett delprov av fronder från Lemna. Detta förs sedan över till ett färskt medium (se tillägg 3). I detta fall måste den återstående delen av den kontaminerade kulturen kasseras.

20.

Minst sju dagar före testet förs en tillräcklig mängd kolonier aseptiskt över till färskt medium och odlas under 7–10 dagar under testbetingelser.

Testmedium

21.

För Lemna minor och Lemna gibba rekommenderas olika medier (se nedan). Man bör noggrant överväga om man ska tillsätta en pH-buffert i testmediet (MOPS (4-morfolinopropansulfonsyra, CAS-nr 1132-61-2) i mediet för L. minor och NaHCO3 i mediet för L. gibba) när man misstänker att mediet kan reagera med testkemikalien och påverka dess toxicitetseffekt. Steinbergs medium (9) kan också användas förutsatt att kriterierna för testresultatens giltighet är uppfyllda.

22.

En modifierad form av det odlingsmedium för Lemna som är standardiserat av det svenska standardiseringsorganet SIS rekommenderas för odling av och test med L. minor. Sammansättningen av detta medium återfinns i tillägg 4.

23.

Odlingsmediet 20X-AAP, som beskrivs i tillägg 4, rekommenderas för odling av och test med L. gibba.

24.

Steinbergs medium, som beskrivs i tillägg 4, passar också för L. minor men kan också användas för L. gibba så länge kriterierna för testresultatens giltighet är uppfyllda.

Testlösningar

25.

Testlösningarna bereds vanligtvis genom utspädning av en stamlösning. Stamlösningar av testkemikalien bereds normalt genom att kemikalien löses upp i ett odlingsmedium.

26.

Den högsta koncentrationen av testkemikalien bör normalt inte överskrida dess vattenlöslighet under testbetingelserna. Observera dock att Lemna spp. flyter på vätskeytan och kan exponeras för kemikalier som samlas i gränsytan mellan vatten och luft, t.ex. hydrofoba eller ytaktiva kemikalier eller kemikalier med låg vattenlöslighet. Under sådana omständigheter kommer plantan att exponeras för andra koncentrationer av kemikalien än de som förekommer i lösningen. Koncentrationerna kan därför – beroende på testkemikaliens egenskaper – överskrida vattenlösligheten. För testkemikalier med låg vattenlöslighet kan det bli nödvändigt att bereda en koncentrerad stamlösning eller en dispersion med hjälp av ett organiskt lösningsmedel eller dispergeringsmedel för att underlätta tillsatsen av exakta mängder testkemikalie i testmediet och bidra till dispergeringen och upplösningen av kemikalien. Man bör därför så långt som möjligt undvika att använda sådana ämnen. Det får inte uppstå fytotoxicictet på grund av att man tvingas använda lösnings- eller dispergeringsmedel för att bereda testlösningen. Exempel på vanliga lösningsmedel som inte förorsakar fytotoxicitet vid koncentrationer upp till 100 μl/l är aceton och dimetylformamid. Om ett lösnings- eller dispergeringsmedel används bör dess slutkoncentration redovisas och hållas så låg som möjligt (≤ 100 μl/l). Alla test- och kontrollösningar bör ha samma koncentration av lösnings- eller dispergeringsmedel. Mer information om användningen av dispergeringsmedel finns i (8).

Test- och kontrollgrupper

27.

Förkunskap om testkemikaliens toxicitet för Lemna, t.ex. erhållen genom ett preliminärt test av koncentrationsintervallet för toxiciteten, underlättar valet av lämpliga testkoncentrationer. I det slutliga toxicitetstestet ska det normalt finnas minst fem koncentrationer ordnade i geometrisk serie. Separationsfaktorn mellan testkoncentrationerna bör inte överskrida 3,2, men om dos-respons-kurvan är flack kan en större separationsfaktor användas. Om färre än fem koncentrationer används måste detta motiveras. Minst tre replikat ska användas för respektive testkoncentration.

28.

När man fastställer intervallet av testkoncentrationer (för det preliminära testet eller för det slutliga toxicitetstestet), ska man beakta följande:

För att bestämma en ECx-koncentration ska värdet på ECx ligga innanför intervallet för testkoncentrationerna för att man ska uppnå en lämplig konfidensgrad. Om man t.ex. ska bestämma EC50 ska den högsta testkoncentrationen vara högre än värdet på EC50. Om värdet på EC50 ligger utanför intervallet för testkoncentrationerna blir motsvarande konfidensintervall stora, och det kan då bli omöjligt att korrekt bedöma modellens statistiska lämplighet.

Om syftet är att bestämma LOEC eller NOEC ska den lägsta testkoncentrationen vara så låg att tillväxten inte är märkbart mindre än tillväxten i kontrollen. Den högsta testkoncentrationen ska vara så hög att tillväxten är märkbart lägre än i kontrollen. Om dessa villkor inte är uppfyllda måste testet göras om med ett annat koncentrationsintervall (såvida inte den högsta koncentrationen ligger på löslighetsgränsen eller är lika med den högsta erforderliga gränskoncentrationen, t.ex. 100 mg/l).

29.

I varje test ska ingå kontroller med samma näringsmedium, frondantal, antal kolonier, miljöbetingelser och förfaranden som för provkärlen, men utan testkemikalien. Om ett lösnings- eller dispergeringsmedel används som hjälpmedel i testet krävs ytterligare ett kontrollprov, nu med samma koncentration av lösnings- eller dispergeringsmedlet som i provkärlen med testkemikalien. Antalet replikatkärl med kontroller – och i tillämpliga fall kärl med lösnings- eller dispergeringsmedel – ska vara minst lika med, eller helst dubbelt så många som, antalet kärl som används för respektive testkoncentration.

30.

Om NOEC inte behöver bestämmas kan man ändra testupplägget så att antalet koncentrationer ökas medan antalet replikat per koncentration minskas. Antalet kontrollreplikat måste dock vara minst tre.

Exponering

31.

Kolonier med 2–4 synliga fronder förs över från ympkulturen och fördelas slumpmässigt i provkärlen under aseptiska förhållanden. Alla provkärl ska innehålla sammanlagt 9–12 fronder vardera. Antalet fronder och kolonier ska vara detsamma i alla provkärl. Erfarenheter från användning av denna metod och resultat från ringtest har visat att tre replikat per testlösning (testkoncentration), där alla replikat från början innehåller 9–12 fronder, är tillräckligt för att man ska upptäcka skillnader i tillväxt mellan testlösningarna på cirka 4–7 procents tillväxthämning (beräknad enligt tillväxthastighet) och 10–15 procents tillväxthämning (beräknad enligt producerad mängd biomassa) (7).

32.

Provkärlen måste placeras slumpmässigt i inkubatorn för att minimera inflytandet av rumsbetingade skillnader i ljusintensitet och temperatur. Det krävs också blockvis fördelning eller slumpmässig omplacering av kärlen vid varje mättillfälle, eller oftare.

33.

Om ett preliminärt stabilitetstest visar att koncentrationen av testkemikalien inte kan upprätthållas (dvs. den uppmätta koncentrationen sjunker under 80 % av den uppmätta startkoncentrationen) under tiden för testets genomförande (7 dagar), bör ett semistatiskt testförfarande användas. I det fallet exponeras kolonierna för nyberedda test- och kontrollösningar vid minst två tillfällen under testet, t.ex. på dag tre och dag fem. Intervallen för byte till färskt medium beror på stabiliteten hos testkemikalien. Det kan krävas kortare intervall för att upprätthålla nära nog konstanta koncentrationer av mycket instabila eller flyktiga kemikalier. I visa fall måste man använda genomflödestest (8)(10).

34.

Exponering genom besprutning av fronderna ingår inte i denna testmetod; se istället (11).

Inkuberingsförhållanden

35.

Kontinuerlig belysning med varmt eller kallt vitt ljus från lysrör används för att åstadkomma en ljusintensitet i intervallet 85–135 μE · m– 2s– 1, varvid intensiteten ska mätas inom ett fotosyntetiskt aktivt våglängdsområde (400–700 nm) i punkter på samma avstånd från ljuskällan som Lemna-fronderna (denna intensitet motsvarar en belysningsstyrka på 6 500–10 000 lux). Ljusintensiteten över testytan får inte variera med mer än ± 15 %. Metoden för detektering och mätning av ljuset, framför allt typen av ljussensor, påverkar mätvärdet. Sfäriska sensorer – som mäter ljuset från alla vinklar ovanför och under mätplanet – och sensorer av solsensortyp (med cosinuskoefficient för infallsvinkeln) – som mäter ljuset från alla vinklar ovanför mätplanet – är att föredra framför riktade sensorer. De förstnämnda sensorerna ger större mätutslag för en diffus ljuskälla av den typ som beskrivits här.

36.

Temperaturen i testkärlen bör vara 24 ± 2 °C. Kontrollmediets pH får inte öka med mer än 1,5 enheter under testet. En avvikelse på mer än 1,5 gör dock inte testresultaten ogiltiga om det kan visas att kriterierna för testresultatens giltighet är uppfyllda. I speciella fall, t.ex. vid test av instabila kemikalier eller metaller, måste förskjutningen av pH kontrolleras extra noggrant. Se vidare (8).

Varaktighet

37.

Testet ska avslutas sju dagar efter det att plantorna har placerats i provkärlen.

Mätningar och analytiska bestämningar

38.

Räkna och registrera frondantalet i provkärlen vid testets början. Se noga till att ta med alla uppstickande, väl synliga fronder. Bestäm antalet fronder – både sådana som framstår som normala och sådana som framstår som onormala – vid början av testet och därefter minst var tredje dag under exponeringstiden (dvs. vid minst två tillfällen under sjudagarsperioden), samt när testet avslutas. Registrera förändringar i plantutvecklingen. Det kan t.ex. gälla frondstorlek, utseende, tecken på nekros, kloros eller svullna fronder, kollaps av kolonier eller försämrad flytförmåga samt rötternas längd och utseende. Registrera också betydelsefulla iakttagelser från testmediet, t.ex. förekomst av oupplöst material och algtillväxt i provkärlet.

39.

Utöver bestämningar av frondantalet under testet ska de effekter testkemikalien har på en eller flera av följande mätvariabler bestämmas:

(i)

Total frondarea.

(ii)

Torrvikt.

(iii)

Färskvikt.

40.

Fördelen med variabeln ’total frondarea’ är att den kan bestämmas för alla prov- och kontrollkärl vid början, under och vid slutet av testet. Torr- eller färskvikt måste bestämmas vid början av testet med hjälp av ett prov från ympkulturen som är representativt för vad som används för att starta testet, och vid slutet av testet med hjälp av växtmaterial från alla prov- och kontrollkärl. Om frondarean inte bestäms är det bättre att fastställa torrvikten än färskvikten.

41.

Total frondarea, torrvikt och färskvikt kan bestämmas på följande sätt:

(i)

Total frondarea: Den sammanlagda frondarean hos alla kolonier bestäms genom bildanalys. Med en videokamera registrerar man en silhuett av provkärlet och plantorna (kärlet kan t.ex. placeras på en ljuslåda). Därefter digitaliseras bilderna. Genom kalibrering med plana former med känd area kan man sedan bestämma den totala frondarean i kärlet. Fel orsakade av inverkan av provkärlets överkant måste undvikas. En annan, mer arbetskrävande metod är att ta en fotokopia av provkärlet och plantorna, klippa ut den silhuett som kolonierna bildar och sedan bestämma deras area med hjälp av en bladytemätare eller ett millimeterpapper. Andra metoder – t.ex. bestämning av viktförhållandet mellan koloniernas silhuettyta och en ytenhet – kan också vara ändamålsenliga.

(ii)

Torrvikt: Alla kolonier samlas in från respektive provkärl och sköljs med destillerat eller avjonat vatten. Överskottsvattnet avlägsnas från kolonierna, t.ex. genom uppsugning med filterpapper, och de torkas sedan vid 60 °C tills vikten inte längre minskar. Även rotfragment måste tas med. Torrvikten bestäms med en noggrannhet på minst 0,1 mg.

(iii)

Färskvikt: Alla kolonier förs över till förvägda provrör av polystyren (eller annat inert material) med små (1 mm) hål i de rundade bottnarna. Provrören centrifugeras vid 3 000 varv/minut under 10 minuter vid rumstemperatur. Provrören, som nu innehåller torra kolonier, vägs på nytt. Färskvikten fås fram genom att subtrahera det tomma provrörets vikt.

Mätfrekvens och analytiska bestämningar

42.

Vid statiskt testförfarande ska pH-värdet i alla testlösningar (testkoncentrationer) mätas vid början och slutet av testet. Vid semistatiskt testförfarande mäts pH-värdet i varje färsk testlösning innan byte till ny lösning och i motsvarande förbrukade lösning.

43.

Ljusintensiteten ska mätas i odlingskammaren, inkubatorn eller klimatrummet i punkter på samma avstånd från ljuskällan som Lemna-fronderna. Mätningar ska göras minst en gång under testets genomförande. Temperaturen hos mediet i ett ersättningskärl med enbart testmedium som hålls under samma betingelser i odlingskammaren, inkubatorn eller klimatrummet ska registreras minst en gång per dag.

44.

Under testets gång ska testkemikaliens koncentrationer bestämmas med lämpliga intervaller. Vid ett statiskt testförfarande är minimikravet att koncentrationerna ska bestämmas vid början och slutet av testet.

45.

Om man vid ett semistatiskt testförfarande bedömer att koncentrationen av testkemikalien inte kommer att ligga kvar inom ± 20 % av den nominella koncentrationen, måste man analysera alla nyberedda testlösningar liksom alla förbrukade lösningar vid byte till ny färsk lösning (se punkt 33). För test i vilka den uppmätta startkoncentrationen av testkemikalien inte ligger inom ± 20 % av den nominella koncentrationen men tillräckliga bevis kan framläggas för att visa att startkoncentrationerna är repeterbara och stabila (dvs. inom intervallet 80–120 % av startkoncentrationen), räcker det om kemiska bestämningar utförs enbart för de högsta och lägsta testkoncentrationerna. I samtliga fall behöver bestämning av testkemikaliens koncentrationer före byte till färsk testlösning bara utföras på ett enda replikatkärl för varje testkoncentration (eller på det samlade innehållet från samtliga replikat för respektive testkoncentration).

46.

Vid genomflödestest kan man använda ett liknande förfarande som vid ett semistatiskt testförfarande – inklusive analys vid början, halvvägs igenom testet och vid slutet av testet – men i detta fall har mätning av förbrukade lösningar inte någon relevans. Vid genomflödestest ska daglig kontroll göras av flödeshastigheten hos spädningsmedlet och testkemikalien, eller hos stamlösningen av testkemikalien.

47.

Om man kan visa att testkemikaliens koncentration har hållits tillfredsställande inom ± 20 % av den nominella eller uppmätta startkoncentrationen genom hela testet kan analysen av resultaten baseras på nominella eller uppmätta startvärden. Om avvikelsen från den nominella eller uppmätta startkoncentrationen inte ligger inom ± 20 %, ska analysen av resultaten baseras på det geometriska medelvärdet av koncentrationen under exponeringen, eller på modeller som beskriver testkemikaliens avtagande koncentration (8).

Toleranstest

48.

Under vissa omständigheter, t.ex. när ett preliminärt test tyder på att testkemikalien inte har några toxiska effekter vid koncentrationer upp till 100 mg/l eller upp till dess löslighetsgräns i testmediet (om denna är lägre), kan man utföra ett toleranstest. Man jämför då responsen mellan en kontrollgrupp och en testgrupp (med en koncentration på 100 mg/l eller lika med löslighetsgränsen). Det rekommenderas starkt att jämförelsen kompletteras med en bestämning av exponeringskoncentrationen. Alla testbetingelser samt kriterier för testresultatens giltighet som beskrivits tidigare gäller även för toleranstest, med undantaget att antalet testreplikat ska vara dubbelt så stort. Tillväxten i kontrollgruppen och testgruppen kan analyseras med en statistisk metod för jämförelse av medelvärden, t.ex. t-test (Students t-test).

DATA OCH RAPPORTERING

Fördubblingstid

49.

Fördubblingstiden (Td ) för frondantalet är ett kriterium på testresultatens giltighet (se punkt 12). Den bestäms genom att infoga data från kontrollkärlen i följande formel:

Td = ln 2/μ

där μ är den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten enligt beskrivningen i punkterna 54–55.

Responsvariabler

50.

Syftet med testet är att bestämma testkemikaliens effekter på tillväxten av Lemna. I denna testmetod används två responsvariabler, eftersom olika jurisdiktioner har olika prioriteringar och lagstiftningsbehov. För att testresultaten ska kunna godtas i alla jurisdiktioner ska effekterna bedömas med hjälp av båda de responsvariabler (a och b) som beskrivs nedan.

(a)

Genomsnittlig specifik tillväxthastighet: Denna beräknas med hjälp av två variabler: 1) den tidsmässiga förändringen av det logaritmiska värdet av frondantalet, och 2) den tidsmässiga förändringen av det logaritmiska värdet av en andra variabel, som kan vara total frondarea, torrvikt eller färskvikt. Förändringarna bestäms i kontrollerna och respektive testgrupp. Tiden uttrycks i dagar. Denna responsvariabel kallas ibland relativ tillväxthastighet (12).

(b)

Producerad mängd biomassa: Denna beräknas med hjälp av förändringarna av frondantalet och förändringarna av en andra variabel, som kan vara total frondarea, torrvikt eller färskvikt. Förändringarna bestäms i kontrollerna och respektive testgrupp ända till slutet av testet.

51.

Observera att toxicitetsvärden som beräknats utifrån de två responsvariablerna inte är jämförbara, och att denna skillnad måste framgå när man tillämpar testresultaten. ECx-värden som grundar sig på den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten (ErCx) är i allmänhet högre än de som grundar sig på den producerade mängden biomassa (EyCx) förutsatt att testmetodens föreskrivna testbetingelser är uppfyllda, på grund av de matematiska förutsättningarna för respektive metod. Detta ska dock inte tolkas som skillnader i känslighet mellan de två responsvariablerna. Avvikelserna beror i stället på att värdena är olika ur matematisk synvinkel. Variabeln genomsnittlig specifik tillväxthastighet grundar sig på den allmänna exponentiella tillväxtutvecklingen hos andmat i obegränsade kulturer, där toxiciteten bestäms på basis av testkemikaliens inverkan på tillväxthastigheten, oberoende av den absoluta nivån på den specifika tillväxthastigheten i kontrollen, dos-responskurvans lutning och tiden för testets genomförande. Resultat som i stället grundar sig på producerad mängd biomassa är däremot beroende av alla dessa övriga variabler. EyCx är beroende både av den specifika tillväxthastigheten hos de andmatsarter som används i varje enskilt test och av den maximala specifika tillväxthastigheten, som kan variera mellan olika arter och till och med mellan olika kloner. Denna responsvariabel får inte användas för jämförelser av känsligheten för toxiska substanser mellan olika andmatsarter, inte ens mellan olika kloner. Ur vetenskaplig synpunkt är värdet på den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten att föredra för bestämning av toxiciteten, men toxicitetsbestämning med hjälp av värdet på producerad mängd biomassa har tagits med i testmetoden för att tillgodose de nuvarande lagstiftningskraven i vissa jurisdiktioner.

52.

Toxiciteten ska bestämmas med hjälp av frondantalet och ytterligare en mätvariabel (total frondarea, torrvikt eller färskvikt), eftersom vissa kemikalier kan påverka andra mätvariabler mycket mer än de påverkar frondantalet. Om man bara höll sig till frondantalet skulle man inte märka denna påverkan.

53.

Frondantalet samt övriga registrerade mätvariabler för respektive mättillfälle, t.ex. total frondarea, torrvikt eller färskvikt, förs in i en tabell tillsammans med koncentrationerna av testkemikalien. De efterföljande beräkningarna för att bestämma t.ex. LOEC, NOEC eller ECx ska grundas på värdena för de enskilda replikaten, inte på beräknade medelvärden för respektive testgrupp.

Genomsnittlig specifik tillväxthastighet

54.

Den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten för en given tidsperiod beräknas som den logaritmiska ökningen av två tillväxtvariabler: frondantal och ytterligare en mätvariabel (total frondarea, torrvikt eller färskvikt). Använd nedanstående formel för alla replikat av kontroll- och testlösningar:

Formula

där

μi-j

är genomsnittlig specifik tillväxthastighet från tidpunkten i till tidpunkten j,

Ni

är värdet på mätvariabeln i prov- respektive kontrollkärlet vid tidpunkten i,

Nj

är värdet på mätvariabeln i prov- respektive kontrollkärlet vid tidpunkten j, och

t

är tidslängden mellan tidpunkterna i och j.

Beräkna ett medelvärde av tillväxthastigheten för varje testgrupp och kontrollgrupp tillsammans med variansskattningar.

55.

Den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten ska beräknas för hela tiden för testets genomförande (’i’ i formeln betecknar början av tiden för testets genomförande, och ’j’ slutet). Beräkna ett medelvärde av den genomsnittliga tillväxthastigheten för varje testkoncentration och kontrollgrupp tillsammans med variansskattningar. Bestäm dessutom den sektionsvisa tillväxthastigheten för att kunna bedöma testkemikaliens effekter under exponeringstiden (t.ex. genom analys av logaritmiska tillväxtkurvor). Stora skillnader mellan den sektionsvisa tillväxthastigheten och den genomsnittliga tillväxthastigheten tyder på att tillväxten inte varit konstant exponentiell. I sådana fall bör tillväxtkurvorna undersökas noggrant. Vid en konservativ bedömning kan man i detta fall jämföra testlösningarnas specifika tillväxthastigheter under det tidsintervall som har den största tillväxthämningen med tillväxthastigheterna för kontrollerna under samma tidsintervall.

56.

Den procentuella tillväxthämningen (Ir) beräknas sedan för varje testkoncentration (testgrupp) med formeln

Formula

där

:

% Ir

:

är den procentuella minskningen av den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten,

:

μC

:

är medelvärdet av μ i kontrollgruppen, och

:

μT

:

är medelvärdet av μ i testgruppen.

Producerad mängd biomassa

57.

Effekterna på den producerade mängden biomassa bestäms med hjälp av två mätvariabler, varav den ena är frondantalet och den andra någon av variablerna total frondarea, torrvikt eller färskvikt. Mätningarna görs vid början och slutet av testet. För torrvikt och färskvikt bestäms den initiala biomassan med hjälp av ett prov bestående av fronder från samma kultur som används för att ympa provkärlen (se punkt 20). Beräkna ett medelvärde av den producerade mängden biomassa för varje testkoncentration och kontrollgrupp tillsammans med variansskattningar. Den genomsnittliga procentuella minskningen av den producerade mängden biomassa (%Iy) beräknas för varje testgrupp med formeln

Formula

där

%Iy

är den procentuella minskningen av den producerade mängden biomassa,

bC

är den slutliga biomassan minus den initiala biomassan för kontrollgruppen, och

bT

är den slutliga biomassan minus den initiala biomassan för testgruppen.

Plottning av dos-respons-kurvor

58.

Dos-respons-kurvor ska plottas som visar förhållandet mellan den genomsnittliga procentuella hämningen av responsvariabeln (Ir eller Iy, beräknad enligt punkt 56 eller 57) och logaritmen för testkemikaliens koncentration.

Bestämning av ECx

59.

Bestämningar av ECx – t.ex. EC50 – ska baseras både på genomsnittlig specifik tillväxthastighet (ErCx) och på producerad mängd biomassa (EyCx). De sistnämnda två responsvariablerna ska i sin tur bestämmas med hjälp av frondantal och en ytterligare mätvariabel (total frondarea, torrvikt eller färskvikt). Detta beror på att det finns testkemikalier vars inverkan på frondantalet skiljer sig från deras inverkan på andra mätvariabler. Toxicitetsparametrarna bör därför vara fyra ECx-värden för varje beräknad tillväxthämningsnivå x: ErCx (frondantal), ErCx (total frondarea, torrvikt eller färskvikt), EyCx (frondantal) och EyCx (total frondarea, torrvikt eller färskvikt).

Statistisk behandling

60.

Målet är att bestämma det kvantitativa förhållandet mellan koncentration och respons med hjälp av regressionsanalys. Man kan använda viktad linjär regression efter att ha gjort en linjär transformation av responsdata, t.ex. till probit-, logit- eller Weibullvärden (13). Icke-linjära regressionsmetoder är dock att föredra, eftersom de är bättre anpassade för att hantera oundvikliga oregelbundenheter i data och avvikelser från jämna fördelningskurvor. I närheten av nollpunkten (ingen tillväxthämning) och fullständig tillväxthämning kan sådana oregelbundenheter bli uppförstorade genom linjäriseringen och därigenom störa analysen (13). Observera att standardmetoder för analys med probit-, logit- eller Weibulltransformationer är avsedda för dikotoma data (dvs. tvåpunktsfördelade data, såsom dödlighet–överlevnad) och därför måste modifieras för att kunna användas för data rörande tillväxthastighet eller producerad mängd biomassa. Speciella metoder för bestämning av ECx-värden ur kontinuerliga data återfinns i (14), (15) och (16).

61.

För varje analyserad responsvariabel används förhållandet mellan koncentration och respons för att göra punktskattningar av ECx-värden. Om möjligt ska 95-procentiga konfidensgränser bestämmas för varje skattning. Anpassningsgraden (’goodness of fit’) mellan responsdata och regressionsmodellen ska bestämmas antingen grafiskt eller statistiskt. Regressionsanalysen ska göras på responsvärden från enskilda replikat, inte på medelvärden från testgrupper.

62.

När tillgängliga regressionsmodeller eller regressionsmetoder inte lämpar sig för de aktuella dataserierna kan skattningar av EC50-värden och konfidensgränser också bestämmas genom linjär interpolation och bootstrapping (17).

63.

För skattning av LOEC (och därmed även av NOEC) jämförs medelvärden från testlösningarna med hjälp av variansanalysmetoder (ANOVA). Medelvärdet för varje koncentration jämförs sedan med medelvärdet för kontrollerna med hjälp av en lämplig metod för multipeljämförelse eller trendtest, t.ex. Dunnetts eller Williams test (18) (19) (20) (21). Man måste avgöra om antagandet för ANOVA om varianshomogenitet är uppfyllt. Detta kan göras grafiskt eller med ett etablerat test (22). t.ex. Levenes eller Bartletts test. Skulle antagandet om varianshomogenitet inte vara uppfyllt kan man ibland korrigera för detta genom logaritmisk transformation av data. Om heterogeniteten i variansen är extremt stor och inte kan korrigeras genom transformation, ska man överväga att göra analysen med t.ex. Jonkheeres trendtester av ’step-down’-typ. Mer information om bestämning av NOEC finns i (16).

64.

Nya forskningsrön har lett till att man avråder från användning av NOEC-värden. I stället rekommenderas att man använder punktskattningar av ECx baserade på regressionsanalys. För detta Lemna-test har ännu inget passande värde på x fastställts. Ett intervall på 10–20 % förefaller dock vara lämpligt, beroende på vilken responsvariabel som används. Både EC10 och EC20 bör redovisas.

Rapportering

65.

Testrapporten ska innehålla följande uppgifter:

 

Testkemikalie:

fysikalisk form (gas, vätska eller fast form) och fysikalisk-kemiska egenskaper, inbegripet löslighetsgräns i vatten,

kemiska beteckningsuppgifter (t.ex. CAS-nummer), inklusive renhetsgrad (föroreningar).

 

Testade arter:

vetenskapligt namn, klon (om denna är känd) och ursprung.

 

Testbetingelser:

testförfarande (statiskt, semistatiskt eller genomflöde),

startdatum och varaktighet för testet,

testmedium,

beskrivning av testupplägget: provkärl och lock eller proppar (eller annan typ av förslutning), lösningsvolymer, antal kolonier och fronder per provkärl vid testets början,

testkoncentrationer (nominella respektive uppmätta värden) och antal replikat per koncentration,

metoder för beredning av stam- och testlösningar, med uppgift om användning av lösnings- eller dispergeringsmedel,

temperatur under testets gång,

ljuskälla, ljusintensitet och ljushomogenitet,

pH-värden i test- och kontrollmedier,

testkemikaliens koncentrationer och analysmetod med relevanta uppgifter för kvalitetsbedömning (kontroll av testresultatens giltighet, standardavvikelser eller konfidensgränser för analyserna),

metoder för bestämning av frondantal och andra mätvariabler, t.ex. torrvikt, färskvikt eller frondarea,

alla avvikelser från denna testmetod.

 

Resultat:

rådata: frondantal och andra mätvariabler i alla test- och kontrollprov vid respektive observation och analystillfälle,

medelvärden och standardavvikelser för respektive mätvariabel,

tillväxtkurvor för respektive koncentration (bör plottas med logaritmen av mätvariabeln; se punkt 55),

fördubblingstid och tillväxthastighet i kontrollen beräknade med hjälp av frondantal,

beräknade responsvariabler för respektive testreplikat, inklusive medelvärden och variationskoefficient för replikaten,

diagram över förhållandet mellan koncentration och tillväxthämmande effekt,

uppskattningar av toxiska endpoints för responsvariablerna, t.ex. EC50, EC10 och EC20 samt dithörande konfidensintervall. Om man räknat fram LOEC- och/eller NOEC-värden ska dessa anges, liksom de statistiska metoder som använts vid beräkningen,

om ANOVA-metoder har använts: storleken på observerad effekt (t.ex. minsta signifikanta skillnad),

eventuell tillväxtstimulans som har konstaterats i testlösningarna,

synliga tecken på fytotoxicitet samt observationer avseende testlösningarna,

diskussion av resultaten, inbegripet eventuell inverkan på testresultatet som kan tillskrivas avvikelser från denna testmetod.

LITTERATUR

(1)

ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test with Lemna gibba G3. E 1415-91 (förnyat godkännande 1998), s. 733–742. Återfinns i Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA, USA.

(2)

US EPA – United States Environmental Protection Agency. (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ’Public draft’. EPA 712-C-96-156. 8 s.

(3)

AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10 s.

(4)

SIS – Svenska standardiseringsinstitutet (1995). Vattenundersökningar – Bestämning av tillväxthämning (7 dygn) hos flytbladsväxten Lemna minor, andmat. SS 02 82 13, 15 s.

(5)

Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37, 120 s.

(6)

Environment Canada. (1993). Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.

(7)

Sims, I., Whitehouse, P. och Lacey, R. (1999). The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency.

(8)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris.

(9)

Internationella standardiseringsorganisationen. ISO DIS 20079. Vattenundersökningar – Toxicitetsmetod – Bestämning av tillväxthämning hos flytbladsväxten Lemna minor, andmat.

(10)

Walbridge, C. T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3-77 108. September 1977.

(11)

Lockhart, W. L., Billeck, B. N. och Baron, C. L. (1989). (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353–359.

(12)

Huebert, D.B. och Shay, J.M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481–483.

(13)

Christensen, E.R. och Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713–718.

(14)

Nyholm, N., Sørensen, P. S., Kusk, K. O. och Christensen, E. R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157–167.

(15)

Bruce R. D. och Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485–1494.

(16)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris.

(17)

Norberg-King, T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(18)

Dunnett, C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096–1121.

(19)

Dunnett, C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, 482–491.

(20)

Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103–117.

(21)

Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 519–531.

(22)

Brain, P. och Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research 29, 93–96.

Tillägg 1

Definitioner

Följande definitioner och förkortningar används i denna testmetod:

Biomassa : torrvikt av levande materia i en population. Begreppet biomassa används också i testet för att ange resultatet av alternativa mätmetoder, t.ex. antalet fronder eller deras totala area.

Kemikalie : ett ämne eller en blandning.

Kloros : gulning av bladvävnad.

Klon : en organism eller cell som uppstått från en enskild individ genom asexuell (vegetativ) förökning. Individer från samma klon är därför genetiskt identiska.

Koloni : samling av moder- och dotterfronder (vanligtvis 2–4 stycken) som sitter fast vid varandra. Ibland används termen ’planta’.

ECx : den koncentration av testkemikalien som är löst i testmediet och som reducerar tillväxten av Lemna med x % (t.ex. 50 %) efter en given exponeringstid (som tydligt måste anges om man avviker från den fulla eller normala testperioden). För att entydigt ange om EC-värdet bygger på tillväxthastighet eller producerad mängd biomassa används beteckningen ErC för tillväxthastighet och EyC för producerad mängd biomassa, åtföljt av mätvariabeln, t.ex. ErC (n), där n = ’antal fronder’.

Genomflödestest : test i vilket testlösningarna kontinuerligt ersätts med färsk lösning.

Frond : enskild bladliknande del av andmatsplantans struktur. Det är den minsta enhet, dvs. individ, som har förökningsförmåga.

Svullen frond : frond med ’buckligt’ eller svullet utseende.

Tillväxt : ökning av en mätvariabel – t.ex. frondantal, torrvikt, våtvikt eller total frondarea – mätt över tiden för testets genomförande.

Tillväxthastighet (genomsnittlig specifik tillväxthastighet): logaritmisk ökning av mängden biomassa under exponeringstiden.

Lägsta koncentration med observerad effekt (LOEC – ’Lowest Observed Effect Concentration’): den lägsta testade koncentration vid vilken man kan fastställa att testkemikalien har en statistiskt signifikant hämmande effekt på tillväxten (vid p < 0,05) efter en given exponeringstid, jämfört med kontrollen. Alla testkoncentrationer ovanför LOEC måste ha skadliga verkningar som är lika stora som eller större än de verkningar som observeras vid LOEC. Om dessa två villkor inte är uppfyllda måste en fullständig förklaring ges till hur man har valt LOEC (och därmed NOEC).

Mätvariabler : alla slags variabler som mäts för att uttrycka testets endpoint med hjälp av en eller flera responsvariabler. I den aktuella metoden används mätvariablerna frondantal, total frondarea, färskvikt och torrvikt.

Monokultur : kultur bestående av en enda art.

Nekros : död frondvävnad. Tecknet på detta är att vävnaden är vit eller vattenindränkt.

Nolleffektkoncentration (NOEC – ’No Observed Effect Concentration’): testkoncentrationen omedelbart under LOEC.

Fenotyp : observerbara egenskaper hos en organism vilka bestäms av interaktionen mellan organismens gener och dess omgivning.

Responsvariabel : variabel för bestämning av toxicitet. Variabeln fås fram genom att olika beräkningsmetoder tillämpas på uppmätta parametrar för biomassa. I den aktuella metoden är tillväxthastighet och producerad mängd biomassa responsvariabler som beräknas med hjälp av mätvariabler såsom frondantal, total frondarea, färskvikt eller torrvikt.

Semistatiskt testförfarande (med regelbunden förnyelse av testlösning) : test där testlösningen byts med bestämda intervall under testet.

Statiskt testförfarande : testmetod utan regelbunden förnyelse av testlösningen under testet.

Testkemikalie : varje ämne eller blandning som testas med denna testmetod.

Endpoint : den allmänna faktor som genom inverkan av en testkemikalie förändras jämfört med ett kontrollprov utan testkemikalie. I det aktuella testet används endpointen tillväxthämning, som kan uttryckas med olika responsvariabler baserade på en eller flera mätvariabler.

Testmedium : syntetiskt odlingsmedium i vilket testplantorna växer när de exponeras för testkemikalien. Testkemikalien är vanligen löst i testmediet.

Producerad mängd biomassa : värdet på en mätvariabel för biomassa i slutet av exponeringstiden minus motsvarande värde i början av exponeringstiden.

Tillägg 2

Beskrivning av Lemna spp.

Den vattenväxt som i allmänt språkbruk kallas andmat – Lemna spp. – tillhör familjen Lemnaceae, i vilken det ingår ett antal arter med världsvid utbredning. Dessa tillhör fyra släkten. Deras olika utseenden och taxonomi har beskrivits ingående (1) (2). Lemna gibba och L. minor är vanliga i tempererade zoner och används ofta i toxicitetstester. Bägge arterna lever i vatten med flytande eller nedsänkt skivlik stam (frond). Från mitten av den undre ytan på varje frond utgår en hårfin rot. Lemna spp. blommar sällan; plantorna förökar sig i stället vegetativt genom att bilda nya fronder (3). I jämförelse med äldre plantor tenderar de yngre att vara blekare, ha kortare rötter och bestå av två till tre fronder av olika storlek. Egenskaperna hos Lemna – liten storlek, enkel uppbyggnad, vegetativ förökning och kort generationstid – gör plantor av detta släkte mycket lämpade för laboratorietester (4) (5).

Eftersom känsligheten för toxisk påverkan sannolikt varierar mellan arterna, godtas enbart jämförelser av känsligheten inom en och samma art.

Exempel på Lemna-arter som har använts vid test: Hänvisningar, arter

 

Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiatavhandling 1996:2. Institutionen för systemekologi, Stockholms universitet.

 

Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. Phys. Chem., 29, 935–941.

 

Lemna minor : US EPA – United States Environmental Protection Agency. (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ’Public draft’. EPA 712-C-96-156, s. 8.

Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor, s. 10.

SIS – Svenska standardiseringsinstitutet. (1995). Vattenundersökningar – Bestämning av tillväxthämning (7 dygn) hos flytbladsväxten Lemna minor, andmat. SS 02 82 13, s. 15.

 

Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test with Lemna gibba G3. E 1415-91 (förnyat godkännande 1998), s. 733–742.

US EPA – United States Environmental Protection Agency. (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ’Public draft’. EPA 712-C-96-156, s. 8.

 

Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10, 1959–1969.

 

Lemna perpusilla : Clark, J. R. m.fl. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5, 87–96.

 

Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12, 481–483.

 

Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19, 2102–2111.

Lemna-arter för test kan erhållas från följande institutioner:

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria

Department of Botany, University of Toronto

Toronto, Ontario, KANADA, M5S 3 B2

Tfn: +1-416-978-3641

Fax: +1-416-978-5878

e-post: jacreman@botany.utoronto.ca

North Carolina State University

Forestry Dept

Duckweed Culture Collection

Campus Box 8002

Raleigh, NC 27695–8002

USA

Tfn: 001 (919) 515-7572

astomp@unity.ncsu.edu

Institutionen för tillämpad miljövetenskap (ITM), Stockholms universitet

SE-106 91

Stockholm

SVERIGE

Tfn: + 46 8 674 7240

Fax +46 8 674 7636

Umweltbundesamt (UBA)

FG III 3.4

Schichauweg 58

12307 Berlin

TYSKLAND

e-post: lemna@uba.de

LITTERATUR

(1)

Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27, 221–287.

(2)

Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Schweiz.

(3)

Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. Norges lantbruksvetenskapliga forskningsråd, Universitetet i Oslo.

(4)

Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11, 1–14.

(5)

Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52, 7–22.

Tillägg 3

Behandling av stamkulturer

Stamkulturer kan förvaras vid låg temperatur (4–10 °C) under lång tid utan att de behöver startas på nytt. Odlingsmediet för Lemna kan vara samma som det som används i testen, men för stamkulturer kan andra näringsrika medier användas.

Med jämna mellanrum flyttas ett bestämt antal unga, ljusgröna plantor över aseptiskt till nya odlingskärl med färskt medium. Under de kalla betingelser som här rekommenderas kan subodling utföras i upp till tre månader långa intervaller.

Använd kemiskt rena (syratvättade) och sterila odlingskärl av glas. Hanteringen ska ske med aseptiska metoder. Om stamkulturen kontamineras av t.ex. alger eller svampar måste man vidta åtgärder för att avlägsna de kontaminerande organismerna. För alger och de flesta andra kontaminerande organismer kan detta åstadkommas genom ytsterilisering. Ett prov tas av det kontaminerade växtmaterialet och rötterna skärs av. Materialet skakas om kraftigt i rent vatten och hålls sedan nedsänkt i en lösning med 0,5 volymprocent natriumhypoklorit i mellan 30 sekunder och 5 minuter. Växtmaterialet sköljs sedan med sterilt vatten och flyttas över satsvis till odlingskärl med färskt odlingsmedium. Många fronder dör av denna behandling, särskilt om exponeringstiderna är långa, men en del av de överlevande fronderna bör vara fria från kontamination. Dessa kan sedan användas för att ympa nya kulturer.

Tillägg 4

Media

Olika odlingsmedier bör användas för L. minor och L. gibba. För L. minor bör ett medium enligt modifierad svensk standard (SIS) användas, och för L. gibba bör 20X-AAP användas. Sammansättningarna av respektive medium visas i nedanstående tabell. Vid beredning av medierna ska kemikalier av reagenskvalitet eller p.a.-kvalitet användas, och vattnet ska vara avjonat.

Odlingsmedium för Lemna enligt svensk standard (SIS)

Sterilisera stamlösningarna I–V i autoklav (120 °C, 15 minuter) eller genom membranfiltrering (porstorlek ca 0,2 μm).

Sterilisera stamlösning VI (och i tillämpliga fall VII) endast genom membranfiltrering (ej autoklavering).

Förvara de sterila stamlösningarna kallt och mörkt. Kassera stamlösningarna I–V efter sex månader. Stamlösning VI (och i tillämpliga fall VII) kan lagras i en månad.

Stam-lösning nr

Ämne

Koncentration i stamlösning

(g/l)

Koncentration i testmedium

(mg/ߦl)

Testmedium

 

 

 

 

Grund-ämne

Koncentration

(mg/ߦl)

I

NaNO3

8,50

85

Na; N

32; 14

KH2PO4

1,34

13,4

K; P

6,0; 2,4

II

MgSO4 · 7H2O

15

75

Mg; S

7,4; 9,8

III

CaCl2 · 2H2O

7,2

36

Ca; Cl

17,5

IV

Na2CO3

4,0

20

C

2.3

V

H3BO3

1,0

1,00

B

0,17

MnCl2 · 4H2O

0,20

0,20

Mn

0,056

Na2MoO4 · 2H2O

0,010

0,010

Mo

0,0040

ZnSO4 · 7H2O

0,050

0,050

Zn

0,011

CuSO4 · 5H2O

0,0050

0,0050

Cu

0,0013

Co(NO3)2 · 6H2O

0,010

0,010

Co

0,0020

VI

FeCl3 · 6H2O

0,17

0,84

Fe

0,17

Na2-EDTA 2H2O

0,28

1,4

VII

MOPS (buffert)

490

490

Tillsätt följande mängder stamlösningar till 900 ml avjonat vatten för beredning av 1 liter SIS-medium:

10 ml stamlösning I

5 ml stamlösning II

5 ml stamlösning III

5 ml stamlösning IV

1 ml stamlösning V

5 ml stamlösning VI

1 ml stamlösning VII (i tillämpliga fall)

Anmärkning: Ytterligare stamlösning VII (MOPS-buffert) kan behövas för vissa testkemikalier (se punkt 11).

Justera pH till 6,5 ± 0,2 med 0,1 eller 1 mol HCl eller NaOH (beroende på utgångsvärdet). Tillsätt avjonat vatten så att volymen blir 1 liter.

Odlingsmedium 20X-AAP

Bered stamlösningar med sterilt destillerat eller avjonat vatten.

Förvara de sterila stamlösningarna kallt och mörkt. Under dessa förhållanden kan de lagras i minst 6–8 veckor.

Bered fem näringsstamlösningar (A1, A2, A3, B och C) med kemikalier av reagenskvalitet för 20X-AAP odlingsmedium. Tillsätt 20 ml av varje lösning i ca 850 ml avjonat vatten för beredning av odlingsmediet. Justera pH till 7,5 ± 0,1 med 0,1 eller 1 mol HCl eller NaOH (beroende på utgångsvärdet). Tillsätt avjonat vatten så att volymen blir 1 liter. Filtrera sedan mediet genom ett membranfilter med porstorlek på ca 0,2 μm ner i en steril behållare.

Bered odlingsmediet 1–2 dagar före testets genomförande så att pH hinner stabiliseras. Mät pH före testet och justera vid behov genom tillsats av 0,1 eller 1 mol NaOH eller HCl (beroende på utgångsvärdet).

Stam-lösning nr

Ämne

Koncentration i stamlösningen

(g/ߦl) (7)

Koncentration i testmediet

(mg/ߦl) (7)

Testmedium

 

 

 

 

Grund-ämne

Koncentration

(mg/ߦl) (7)

A1

NaNO3

26

510

Na;N

190;84

MgCl2 · 6H2O

12

240

Mg

58,08

CaCl2 · 2H2O

4,4

90

Ca

24,04

A2

MgSO4 · 7H2O

15

290

S

38,22

A3

K2HPO4 · 3H2O

1,4

30

K;P

9,4;3,7

B

H3BO3

0,19

3,7

B

0,65

MnCl2 · 4H2O

0,42

8,3

Mn

2,3

FeCl3 · 6H2O

0,16

3,2

Fe

0,66

Na2EDTA · 2H2O

0,30

6,0

ZnCl2

3,3 mg/l

66 μg/l

Zn

31 μg/l

CoCl2 · 6H2O

1,4 mg/l

29 μg/l

Co

7,1 μg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7,3 mg/l

145 μg/l

Mo

58 μg/l

CuCl2 · 2H2O

0,012 mg/l

0,24 μg/l

Cu

0,080 μg/l

C

NaHCO3

15

300

Na;C

220; 43

Steinbergs medium (enligt ISO 20079)

Koncentrationer och stamlösningar

Ett modifierat Steinbergs medium används i ISO 20079 uteslutande för Lemna minor (eftersom enbart denna art är tillåten i denna standard). Test har dock visat att goda resultat kan uppnås även med Lemna gibba.

Vid beredning av medierna ska kemikalier av reagenskvalitet eller p.a.-kvalitet användas, och vattnet ska vara avjonat.

Bered näringsmediet från stamlösningar eller från ett medium med 10 gånger högre koncentration än testmediet så att mediet får högsta möjliga koncentration utan utfällning.

Tabell 1

pH-stabiliserat Steinbergmedium (modifierat enligt Altenburger)

Komponent

Näringsmedium

Makroelement

Molmassa

mg/l

mmol/l

KNO3

101,12

350,00

3,46

Ca(NO3)2 · 4H2O

236,15

295,00

1,25

KH2PO4

136,09

90,00

0,66

K2HPO4

174,18

12,60

0,072

MgSO4 · 7H2O

246,37

100,00

0,41

Mikroelement

Molmassa

μg/l

μmol/l

H3BO3

61,83

120,00

1,94

ZnSO4 · 7H2O

287,43

180,00

0,63

Na2MoO4 · 2H2O

241,92

44,00

0,18

MnCl2 · 4H2O

197,84

180,00

0,91

FeCl3 · 6H2O

270,21

760,00

2,81

EDTA-dinatriumdihydrat

372,24

1 500,00

4,03


Tabell 2

Stamlösningar (makroelement)

1.

Makroelement (koncentrerat 50 ggr)

g/l

Stamlösning 1:

KNO3

17,50

KH2PO4

4,5

K2HPO4

0,63

Stamlösning 2:

MgSO4 · 7H2O

5,00

Stamlösning 3:

Ca(NO3)2 · 4H2O

14,75


Tabell 3

Stamlösningar (mikroelement)

2.

Mikroelement (koncentrerat 1 000 ggr)

mg/l

Stamlösning 4:

H3BO3

120,0

Stamlösning 5:

ZnSO4 · 7H2O

180,0

Stamlösning 6:

Na2MoO4 · 2H2O

44,0

Stamlösning 7:

MnCl2 · 4H2O

180,0

Stamlösning 8:

FeCl3 · 6H2O

760,00

EDTA-dinatriumdihydrat

1 500,00

Stamlösningarna 2 och 3 kan slås samman, liksom 4–7 (beakta då de fastställda koncentrationerna).

Sterilisera stamlösningarna i autoklav (121 °C, 20 minuter) eller gör en sterilfiltrering med porstorlek 0,2 μm, så kan de lagras längre. Stamlösning 8 behandlas genom sterilfiltrering med porstorlek 0,2 μm.

Beredning av slutkoncentrationen för ett modifierat Steinbergs medium

Tillsätt 20 ml av stamlösningarna 1, 2 och 3 (tabell 2) i ca 900 ml avjonat vatten för att undvika utfällning.

Tillsätt 1,0 ml av stamlösningarna 4, 5, 6, 7 och 8 (tabell 3).

pH ska vara 5,5 ± 0,2 (justera genom tillsats av minsta möjliga volym NaOH-lösning eller HCl).

Justera volymen med vatten till 1 000 ml.

Om stamlösningarna är steriliserade och lämpligt vatten används behövs ingen ytterligare sterilisering. Om slutmediet steriliseras ska stamlösning 8 tillsättas efter autoklavering (121 °C, 20 minuter).

Beredning av modifierat Steinbergmedium (koncentrerat 10 ggr) för temporär lagring

Tillsätt 20 ml av stamlösningarna 1, 2 och 3 (tabell 2) i ca 30 ml vatten för att undvika utfällning.

Tillsätt 1,0 ml av stamlösningarna 4, 5, 6, 7 och 8 (tabell 3). Justera volymen med vatten till 100 ml.

Om stamlösningarna är steriliserade och lämpligt vatten används behövs ingen ytterligare sterilisering. Om slutmediet steriliseras ska stamlösning 8 tillsättas efter autoklavering (121 °C, 20 minuter).

pH (vid slutkoncentrationen) ska vara 5,5 ± 0,2.

(6)

Följande kapitel C.31–C.46 ska läggas till:

C.31.   TEST PÅ LANDVÄXTER: TEST AV GRODDPLANTORS UTVECKLING OCH TILLVÄXT

INLEDNING

1.

Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 208 (2006). Testmetoder ses regelbundet över med avseende på den vetenskapliga utvecklingen och tillämpligheten för lagstadgad användning. Syftet med denna uppdaterade testmetod är att bedöma de potentiella effekterna av kemikalier på groddplantors utveckling och tillväxt. Den omfattar inte kroniska effekter eller effekter på fortplantningen (dvs. fröproduktion, blomning, fruktmognad). Exponeringsförhållandena och testkemikaliens egenskaper måste beaktas för att säkerställa att lämpliga testmetoder används (t.ex. då man testar metaller eller metallföreningar bör man beakta effekterna av pH och tillhörande motjoner) (1). Denna testmetod omfattar inte plantor som utsätts för kemiska ångor. Testmetoden kan användas för kontroll av allmänna kemikalier, biocider och växtskyddsmedel (dvs. bekämpningsmedel). Den har utarbetats på grundval av befintliga metoder (2) (3) (4) (5) (6) (7). Andra hänvisningar som gäller växttester beaktades också (8) (9) (10). De definitioner som används återfinns i tillägg 1.

PRINCIP FÖR TESTMETODEN

2.

Testet utgör en utvärdering av effekterna på utvecklingen och tillväxten av högre växters groddplantor efter att de har exponerats för testkemikalien i jord (eller annan lämplig jordmatris). Fröna placeras i kontakt med jord som behandlats med testkemikalien och utvärderas i regel efter 14–21 dagar efter det att 50 % av plantorna i kontrollgruppen har grott. Som endpoints används visuell bedömning av fröplantornas grodd, groddarnas torrvikt (alternativt färskvikt) och i vissa fall groddarnas höjd, samt en bedömning av synliga skadliga effekter på plantans olika delar. Dessa mätningar och observationer jämförs med dem som görs på obehandlade kontrollväxter.

3.

Beroende på den förväntade exponeringsvägen blandas testkemikalien antingen ner i jorden (eller eventuellt i en syntetisk jordmatris) eller appliceras ovanpå jorden, vilket i båda fallen är lämpliga motsvarigheter för kemikaliens potentiella exponeringsvägar. Iblandning i jord sker genom att behandla jord i större partier. Efter iblandningen av kemikalien överförs jorden till krukor, och därefter planteras de växtarter som ska testas i jorden. Applicering ovanpå jorden ska göras i krukor i vilka fröna redan har planterats. Testenheterna (dvs. kontroller samt behandlad jord och frön) placeras sedan under förhållanden som främjar växternas grobarhet och tillväxt.

4.

Testet kan utföras för att fastställa dos-respons-kurvan, eller som ett toleranstest vid en enda koncentration/frekvens beroende på syftet med studien. Om resultaten från testet med en enda koncentration/frekvens överskrider en viss toxicitetsnivå (t.ex. om effekter större än x % observeras), ska ett preliminärt test utföras för att fastställa toxicitetens övre och nedre gränser, följt av ett test med flera olika koncentrationer/frekvenser för att generera en dos-responskurva. En lämplig statistisk analys används för att erhålla den effektiva koncentrationen ECx eller den effektiva appliceringsfrekvensen ERx (t.ex. EC25, EC50, ER25, ER50) för den/de känsligaste parametern/parametrarna som är av intresse. Den högsta koncentrationen utan observerad effekt (NOEC) och den lägsta koncentrationen med observerad effekt (LOEC) kan också beräknas i detta test.

INFORMATION OM TESTKEMIKALIEN

5.

Följande information är användbar för identifiering av förväntad exponeringsväg för kemikalien och vid utformningen av testet: strukturformel, renhetsgrad, vattenlöslighet, löslighet i organiska lösningsmedel, fördelningskoefficient 1-oktanol/vatten, sorptionsegenskaper i jord, ångtryck, kemisk stabilitet i vatten och ljus, samt bionedbrytbarhet.

TESTETS GILTIGHET

6.

För att testet ska anses vara giltigt måste följande kriterier uppfyllas för kontrollerna:

Fröplantornas grobarhet ska vara minst 70 %.

Fröplantorna får inte uppvisa synliga fytotoxiska effekter (t.ex. kloros, nekros, vissning, deformerade blad och stjälkar), och plantorna ska uppvisa normala variationer i tillväxt och morfologi för den berörda arten.

Den genomsnittliga överlevnaden för grodda fröplantor i kontrollerna är minst 90 % under testets gång.

Miljöförhållandena för en viss art ska vara identiska och växtmedierna ska innehålla samma mängd jordmatris, stödmedier eller substrat från samma källa.

REFERENSKEMIKALIE

7.

Ett referensämne kan testas regelbundet för att kontrollera att testets utförande, de aktuella testplantornas respons och provningsvillkoren inte förändrats nämnvärt under testets gång. Alternativt kan mätningshistoriken för biomassa eller tillväxt i kontrollerna användas för att utvärdera testsystemets prestanda vid ett särskilt laboratorium, och kan då fungera som en åtgärd för intern kvalitetskontroll.

BESKRIVNING AV TESTMETODEN

Naturlig jord – artificiellt substrat

8.

Växter kan odlas i krukor med lerig sand, sandjord eller sandig lättlera som innehåller upp till 1,5 % organiskt kol (ca 3 % organiskt material). Kommersiell planteringsjord eller syntetisk jord som innehåller upp till 1,5 % organiskt kol kan också användas. Lerjord bör inte användas om testkemikalien är känd för att ha en hög affinitet för lera. Jord tagen på fältet bör siktas till 2 mm partikelstorlek i syfte att homogenisera den och avlägsna grova partiklar. Typ och textur, procentandel organiskt kol, pH-värde och salthalt såväl som den elektroniska värmeledningsförmågan i den färdigberedda jorden ska rapporteras. Jorden bör klassificeras enligt ett enhetligt klassificeringssystem (11). Jorden kan pastöriseras eller värmebehandlas i syfte att minska effekterna av patogener.

9.

Naturlig jord kan försvåra tolkningen av resultaten och öka variabiliteten på grund av olika fysikaliska/kemiska egenskaper och populationer av mikroorganismer. Dessa variabler påverkar i sin tur vattenbindningsförmågan, förmågan att binda kemikalier, luftningen och innehållet av näringsämnen och spårelement. Utöver skillnaderna i dessa fysikaliska faktorer finns det även skillnader när det gäller kemiska egenskaper såsom pH och redoxpotential, som kan påverka testkemikaliens biotillgänglighet (12) (13) (14).

10.

Artificiella substrat används normalt inte för testning av bekämpningsmedel, men de kan användas för testning av allmänna kemikalier eller om man vill minimera variabiliteten i naturliga jordar och förbättra jämförbarheten i analysresultaten. De substrat som används bör bestå av inaktivt material som minimerar interaktionen med testkemikalien, lösningsmedlet, eller båda. Syratvättad kvartssand, mineralull och glaspärlor (t.ex. 0,35–0,85 mm i diameter) har konstaterats vara lämpliga inaktiva material som absorberar testkemikalien i lägsta möjliga grad (15) och gör det möjligt för fröplantan att ta upp största möjliga mängd av kemikalien via rötterna. Olämpliga substrat inbegriper vermikulit, perlit eller andra högabsorberande material. Näringsämnen för växternas tillväxt bör tillhandahållas för att se till att plantorna inte utsätts för stress på grund av näringsbrist, och om möjligt bör detta bedömas genom kemisk analys eller visuell bedömning av kontrollplantorna.

Kriterier för urvalet av testarter

11.

De arter som valts ut ska vara tillräckligt omfattande, t.ex. med tanke på deras taxonomiska mångfald inom växtriket, deras utbredning, mängd, artspecifika livscykelegenskaper och naturligt förekomstområde, så att en rad olika reaktioner uppstår(8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). Följande egenskaper hos eventuella testarter bör beaktas vid urvalet:

arten har likformiga frön som lätt kan erhållas från tillförlitliga standardutsädeskällor och som har enhetlig, tillförlitlig och jämn grobarhet, liksom en enhetlig planttillväxt,

plantan kan enkelt laboratorietestas, och kan ge tillförlitliga och reproducerbara resultat inom och mellan provningsanläggningar,

känsligheten hos den art som testas bör överensstämma med reaktionen hos växter i miljön som exponeras för kemikalien,

arterna har i viss utsträckning använts i tidigare toxicitetstester, och deras användning exempelvis i bioanalyser av herbicider, undersökningar av tungmetaller, stresstester med salthalt eller mineraler eller allelopatistudier visar på känslighet för många olika stressfaktorer,

de är kompatibla med testmetodens tillväxtförutsättningar,

de uppfyller giltighetskriterierna för testet.

Vissa av de historiskt sett mest använda testarterna förtecknas tillägg 2 och potentiella växtarter som inte är grödor i tillägg 3.

12.

Det antal arter som ska testas beror på de tillämpliga lagstadgade kraven, och därför anges detta inte i denna testmetoden.

Applicering av testkemikalien

13.

Kemikalien ska appliceras via en lämplig vehikel (t.ex. vatten, aceton, etanol, polyetylenglykol, gummi arabicum, sand). Blandningar (sammansatta produkter eller beredningar) som innehåller olika aktiva substanser och hjälpämnen kan också testas.

Iblandning i jord/artificiellt substrat

14.

Kemikalier som är vattenlösliga eller suspenderade i vatten kan tillsättas i vatten, och lösningen kan sedan blandas med jord med en lämplig blandningsanordning. Denna typ av test kan vara lämplig om exponering för kemikalien sker via jord eller jordens porvatten och man oroar sig för plantans upptagning av kemikalien genom rötterna. Jordens vattenbindningsförmåga bör inte överskridas genom tillsättning av testkemikalien. Den mängd vatten som tillsatts ska vara samma för varje testkoncentration, men bör begränsas för att förhindra att jorden klumpar ihop sig.

15.

Ämnen med låg vattenlöslighet bör lösas upp i ett lämpligt flyktigt lösningsmedel (t.ex. aceton, etanol) och blandas med sand. Lösningsmedlet kan därefter avlägsnas från sanden med hjälp av en luftström medan sanden ständigt blandas. Den behandlade sanden blandas med testjorden. En andra kontroll bereds med endast sand och lösningsmedel. Lika stora mängder sand, med lösningsmedel som blandas i och avlägsnas, tillsätts alla behandlingsnivåer och den andra kontrollen. För fasta, olösliga testkemikalier blandas torr jord med kemikalien i en lämplig blandare. Därefter fylls krukorna med jord och fröna sås omedelbart.

16.

När ett artificiellt substrat används i stället för jord kan kemikalier som är lösliga i vatten upplösas i näringslösningen strax innan testet inleds. Kemikalier som är olösliga i vatten, men som kan suspenderas i vatten med hjälp av ett lösningsmedel, bör tillsättas näringslösningen med bärämnet. Icke vattenlösliga kemikalier, för vilka det inte finns något giftfritt vattenlösligt bärämne, bör lösas i ett lämpligt flyktigt lösningsmedel. Lösningen blandas med sand eller glaspärlor, placeras i en vacuumrotationsapparat och evaporeras, vilket gör att sanden eller glaspärlorna täcks med ett jämnt lager av kemikalien. En vägd andel pärlor bör extraheras med samma organiska lösningsmedel och testkemikalien innan krukorna fylls.

Applicering på ytan

17.

För växtskyddsprodukter appliceras testkemikalien ofta genom att jordytan besprutas med provlösningen. All utrustning som används i testerna, inklusive utrustning som används för att bereda och tillföra testkemikalien, bör ha sådan utformning och kapacitet att testerna där denna utrustning används kan genomföras på ett korrekt sätt och ger en reproducerbar täckning. Täckningen bör vara enhetlig på alla jordytor. Man bör undvika att kemikalierna adsorberas till eller reagerar med utrustningen (t.ex. plaströr och lipofila kemikalier eller delar av stål). Testkemikalien sprutas på jordytan på ett sätt som simulerar besprutning med typiska besprutningsbehållare. I allmänhet bör besprutningsvolymerna motsvara normal jordbrukspraxis och volymerna (mängd vatten etc.) bör rapporteras. Munstyckets typ bör väljas ut för att ge en jämn täckning av jordytan. Om lösningsmedel och bärämnen används bör en andra grupp kontrollplantor etableras som endast besprutas med lösningsmedlet eller bärämnet. Detta är inte nödvändigt för växtskyddsprodukter som testas som beredningar.

Kontroll av testkemikaliens koncentration/dos

18.

Koncentrationerna och appliceringsdosen måste bekräftas genom en lämplig analytisk kontroll. För lösliga kemikalier kan alla koncentrationer/doser bekräftas genom en analys av testlösningen med den högsta koncentrationen som används för testet och med dokumentering av senare utspädning och användning av kalibrerad appliceringsutrustning (t.ex. kalibrerade glaskärl för analys, kalibrerad besprutningsutrustning). För olösliga kemikalier måste en kontroll av ämnen som består av föreningar kompletteras med vikten av den testkemikalie som tillförs jorden. Om homogeniteten måste påvisas kan det bli nödvändigt att göra en analys av jorden.

FÖRFARANDE

Testupplägg

19.

Frön av samma arter planteras i krukor. Antalet frön per kruka beror på arten, krukstorleken och testets varaktighet. Antalet plantor per kruka bör inte vara större än att det finns lämpliga förutsättningar för tillväxt och att man undviker trängsel under hela testet. Högsta tillåtna planteringstäthet är cirka 3–10 frön per 100 cm2 beroende på frönas storlek. Till exempel är det lämpligt att ha en till två plantor av majs, sojabönor, tomat, gurka eller sockerbetor per 15 cm behållare, tre plantor av raps eller ärtor per 15 cm behållare, och fem till tio plantor av lök, vete eller andra små frön per 15 cm behållare. Antalet frön och replikatkrukor (replikatet definieras som en kruka, vilket betyder att plantor i samma kruka inte utgör ett replikat) bör vara lämpligt för att en optimal statistisk analys ska kunna utföras (21). Det bör noteras att variabiliteten blir större för arter med färre stora frön per kruka (replikat) jämfört med arter där det är möjligt att använda ett större antal små frön per kruka. Genom att plantera lika många frön i varje kruka kan denna variabilitet minimeras.

20.

Kontrollgrupperna används för att säkerställa att observerade effekter endast kan länkas till eller tillskrivas exponering för testkemikalien. En lämplig kontrollgrupp bör vara identisk i alla avseenden med testgruppen med undantag för exponeringen för testämnet. I ett givet test ska alla testplantor inklusive kontrollerna komma från samma källa. För att förhindra systematiska avvikelser måste en slumpmässig anvisning av test- och kontrollkrukor göras.

21.

Frön som behandlats med en insekticid eller fungicid (dvs. behandlade frön) bör undvikas. Användningen av vissa icke-systemiska kontaktfungicider (t.ex. kaptan, tiram) är dock tillåten enligt vissa tillsynsmyndigheter (22). Om utsädesburna patogener utgör ett problem får fröna kortvarigt doppas i en svag 5-procentig hypokloritlösning och sedan tvättas noggrant i rinnande vatten och torkas. Ingen efterbehandling med andra bekämpningsmedel är tillåten.

Testbetingelser

22.

Testförhållandena ska likna de nödvändiga förhållandena för normal tillväxt för de arter och sorter som testas (i tillägg 4 finns exempel på testförhållanden). De groende plantorna bör hållas enligt god odlingspraxis i miljökammare, fytotroner eller växthus. När man använder dessa drivanläggningar omfattar denna praxis vanligen kontroll och tillräckligt frekvent (t.ex. dagligen) registrering av temperatur, luftfuktighet, koldioxidhalt, belysning (ljusintensitet, våglängd, fotosyntetiskt aktiv strålning) och ljusperiod, bevattning, m.m. för att säkerställa god tillväxt, vilken bedöms genom kontroll av de utvalda arterna. Temperaturen i växthusen bör regleras genom ventilation, uppvärmning och/eller kylning. Följande förhållanden rekommenderas vanligen för tester i växthus:

temperatur: 22 ± 10 °C,