—

Om ett provtagningsparti innehåller små fiskar (där varje enskild fisks vikt < ca 1 kg), skall hela fisken utgöra ett delprov som skall ingå i samlingsprovet. Om det samlingsprov som då fås fram väger mer än 3 kg, kan delproven bestå av mittpartiet, som vart och ett skall väga minst 100 g, av de fiskar som ingår i samlingsprovet. Hela den del på vilken gränsvärdet är tillämpligt skall användas för homogenisering av provet.

Fiskens mittparti är där dess tyngdpunkt ligger, i de flesta fall vid ryggfenan (om fisken har en ryggfena) eller mitt emellan gälöppningen och anus.

—

Om provtagningspartiet innehåller stora fiskar (där varje enskild fisks vikt > ca 1 kg), skall delprovet bestå av fiskens mittparti. Varje delprov skall väga minst 100 g.

För fiskar av medelstorlek (ca 1–6 kg) skall delprovet bestå av ett stycke av fisken som tas som ett tvärsnitt från ryggbenet till buken i fiskens mittparti.

För mycket stora fiskar (t.ex. > ca 6 kg) skall delprovet tas av dorsolateralt muskelkött på högra sidan (framifrån sett) i fiskens mittparti. Om uttagning av ett sådant stycke ur fiskens mittparti skulle medföra betydande ekonomisk skada kan det betraktas som tillräckligt att ta tre delprov på minst 350 gram var oberoende av partiets storlek, eller också kan en lika stor del av muskelköttet nära fiskens stjärtparti och muskelköttet nära dess huvudparti betraktas som ett delprov som är representativt för dioxinhalten i hela fisken.

—

Bestämmelserna i avsnitt 4.3 skall tillämpas på provens sammansättning.

—

Om en viss storleks- eller viktkategori överväger (ca 80 % eller mer av partiet) skall provet tas från fiskar som har den storlek eller vikt som överväger. Detta prov skall betraktas som representativt för hela partiet.

—

Om ingen särskild storleks- eller viktkategori överväger, skall det säkerställas att de fiskar som väljs ut för provet är representativa för sändningen. Särskilda anvisningar för sådana fall finns i Guidance document for the sampling of lots of fish containing whole fishes of different size and/or weight  (2).

—

Genom beräkning av den utvidgade osäkerheten, varvid en täckningsfaktor på 2 används, vilket ger en konfidensgrad av omkring 95 %. Ett parti eller delparti uppfyller inte kraven om det uppmätta värdet minus U överstiger det tillåtna värde som fastställts. Om en bestämning av dioxiner och dioxinlika PCB:er har gjorts separat skall summan av den uppskattade utvidgade mätosäkerheten för de separata analysresultaten avseende dioxiner och dioxinlika PCB:er användas för summan av dioxiner och dioxinlika PCB:er.

—

Genom att fastställa beslutsgränsen (CCα) enligt kommissionens beslut 2002/657/EG av den 12 augusti 2002 om genomförande av rådets direktiv 96/23/EG avseende analysmetoder och tolkning av resultat (5) (punkt 3.1.2.5 i bilagan – ämnen med fastställd gräns). Ett parti eller delparti uppfyller inte kraven om det uppmätta värdet är lika med eller högre än CCα-värdet.

—

Åtgärder skall vidtas för att undvika korskontaminering under alla moment vid provtagning och analys.

—

Proven skall förvaras och transporteras i behållare av glas, aluminium, polypropylen eller polyeten. Spår av pappersdamm skall avlägsnas från provbehållaren. Behållare av glas skall sköljas med lösningar som intygats vara fria från dioxiner eller som tidigare kontrollerats med avseende på förekomst av dioxiner.

—

Proven skall förvaras och transporteras på ett sådant sätt att livsmedelsprovet bibehålls i oförändrat tillstånd.

—

Prov för laboratorieanalys skall vid behov finmalas och blandas omsorgsfullt enligt en metod som garanterar fullständig homogenisering (t.ex. så att de passerar en 1 mm sikt). Om vattenhalten är för hög skall proven torkas innan de mals.

—

En analys med blankprov skall göras genom att man utför hela analysprocessen och endast utelämnar provet.

—

Vikten på det prov som extraheras skall vara tillräckligt hög för att kraven på känslighet skall uppfyllas.

—

De särskilda provberedningsförfaranden som används för en eller flera givna produkter skall valideras enligt internationellt vedertagna riktlinjer.

—

När det gäller fisk skall skinnet avlägsnas eftersom gränsvärdet den högsta tillåtna halten avser muskelkött utan skinn. Det är dock nödvändigt att noggrant och fullständigt skrapa loss allt muskelkött och all fettvävnad på insidan av skinnet och ta med dessa rester av muskelkött och fettvävnad i det prov som analyseras.

—

Laboratorierna skall påvisa en metods prestanda inom intervallet för den givna nivån, t.ex. 0,5 gång, 1 gång och 2 gånger den givna nivån med en godtagbar variationskoefficient för upprepade analyser. Närmare uppgifter om kraven för godtagande anges i avsnitt 5.

—

Kvantifieringsgränsen för en konfirmeringsmetod skall motsvara ungefär en femtedel av den givna nivån.

—

Regelbundna blankprov och experiment med tillsatser eller analys av kontrollprov (helst med certifierat referensmaterial om sådant finns) skall utföras som interna åtgärder för kvalitetskontroll.

—

Laboratoriekompetensen skall påvisas genom fortlöpande medverkan i provningsjämförelser för bestämning av halten av dioxiner och dioxinlika PCB:er i den foder- eller livsmedelsmatris det gäller.

—

Enligt bestämmelserna i förordning (EG) nr 882/2004 skall laboratorierna ackrediteras av ett godkänt ackrediteringsorgan som verkar enligt ISO Guide 58 för att säkerställa att de tillämpar ett system för kvalitetssäkring av analysverksamheten. Laboratorierna skall ackrediteras enligt standarden EN ISO/IEC 17025.

—

Hög känslighet och låg detektionsgräns. Eftersom vissa typer av PCDD:er och PCDF:er är extremt toxiska måste detektionsgränsen för dessa ämnen ligga i storleksordningen pikogram TEQ (10-12 g). Det är känt att PCB:er brukar förekomma i högre halter än PCDD:er och PCDF:er. För de flesta PCB-kongener räcker det att känsligheten ligger i storleksordningen nanogram (10-9 g). Vid mätning av mer toxiska dioxinlika PCB-kongener (särskilt non-ortosubstituerade kongener) måste dock samma känslighet uppnås som för PCDD:er och PCDF:er.

—

Hög selektivitet (specificitet). PCDD:er, PCDF:er och dioxinlika PCB:er måste kunna skiljas från en stor mängd andra föreningar som extraheras samtidigt och ingår i koncentrationer flerfaldigt högre än hos den givna analyten och som kan påverka analysen. Metoder som bygger på gaskromatografi i kombination med masspektrometri (GC-MS) måste kunna särskilja mellan olika kongener, exempelvis mellan toxiska sådana (t.ex. de sjutton 2,3,7,8-substituerade PCDD:erna och PCDF:erna samt dioxinlika PCB:erna) och andra, icke-toxiska. Med bioassay skall det vara möjligt att fastställa TEQ-värden selektivt som summan av PCDD:er, PCDF:er och dioxinlika PCB:er.

—

Hög noggrannhet (riktighet och precision). Bestämningen skall ge en giltig uppskattning av den faktiska halten i ett prov. En hög noggrannhet (med mätningens noggrannhet avses hur väl mätresultatet överensstämmer med provets sanna eller angivna halt) krävs för att resultatet av en provanalys inte skall avvisas på grund av dålig tillförlitlighet när det gäller uppskattningen av TEQ-värdet. Noggrannheten uttrycks som riktighet (skillnaden mellan det medelvärde som har uppmätts för en analyt i ett certifierat material och dess certifierade värde, uttryckt som ett procenttal av detta värde) och precision (RSDR, dvs. den relativa standardavvikelsen beräknad utifrån de resultat som erhållits under reproducerbara förhållanden).

—

Interna standarder i form av 13C-märkt 2,3,7,8-klorsubstituerat PCDD/F och i form av 13C-märkta dioxinlika PCB-standarder skall tillsättas alldeles i början av analysen, t.ex. före extraktionen, för att validera analysmetoden. Minst en kongen för varje tetra- till oktaklorerad homolog grupp av PCDD/F:er och minst en kongen för varje homolog grupp av dioxinlika PCB:er skall tillsättas (alternativt tillsätts minst en kongen för varje masspektrometriska SIR-funktion [selektiv jonregistrering], som används för att kontrollera PCDD/F:er och dioxinlika PCB:er). Det avgjort bästa, särskilt för konfirmeringsmetoder, är att använda alla de sjutton 13C-märkta 2,3,7,8-substituerade interna PCDD/F-standarderna och alla de tolv 13C-märkta interna dioxinlika PCB-standarderna (om dioxinlika PCB:er skall bestämmas).

Med hjälp av lämpliga kalibreringslösningar skall de relativa responsfaktorerna också bestämmas för de kongener till vilka ingen 13C-märkt analog tillsätts.

—

För livsmedel av vegetabiliskt och livsmedel av animaliskt ursprung som innehåller mindre än 10 % fett skall interna standarder tillsättas innan extraktionen görs. För livsmedel av animaliskt ursprung som innehåller mer än 10 % fett kan interna standarder tillsättas antingen före eller efter extraktionen av fett. En lämplig validering av extraktionens effektivitet skall ske med hänsyn till när de interna standarderna tillsätts och till huruvida resultaten rapporteras på grundval av produkten eller fettet.

—

Innan en GC-MS-analys utförs skall en eller två utbytesstandarder (surrogat) tillsättas.

—

En kontroll av utbytet är nödvändig. För konfirmeringsmetoder skall utbytet av de enskilda interna standarderna ligga inom intervallet 60–120 %. Lägre eller högre utbytesgrad för enskilda kongener – särskilt för vissa hepta- och oktaklorerade dibensodioxiner och dibensofuraner – kan godtas under förutsättning att deras bidrag till det totala TEQ-värdet inte överstiger 10 % (bygger på summan av PCDD/F:er och dioxinlika PCB:er). För screeningmetoder skall utbytet ligga inom intervallet 30–140 %.

—

Dioxiner skall separeras från interfererande klorföreningar såsom icke-dioxinlika PCB:er och klorerade difenyletrar med hjälp av en lämplig kromatografisk teknik (lämpligtvis med hjälp av en florisil-, aluminiumoxid- och/eller kolkolonn).

—

Gaskromatografisk separation av isomerer är tillräcklig (< 25 % från topp till topp mellan 1,2,3,4,7,8-HxCDF och 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

—

Bestämningen skall ske enligt det amerikanska miljöskyddsorganets (Environment Protection Agency) metod 1613, revidering B: Tetra-through octa-chlorinated dioxins and furans by isotope dilution HRGC/HRMS eller någon annan metod med motsvarande resultatkriterier.

—

Skillnaden mellan den övre och den lägre beräknade halten får inte överstiga 20 % för livsmedel med en dioxinkontaminering på cirka 1 pg WHO-TEQ/g fett (bygger på summan av PCDD:er/PCDF:er och dioxinlika PCB:er). För livsmedel med låg fetthalt gäller samma krav vid kontamineringsnivåer på cirka 1 pg WHO-TEQ/g produkt. För lägre kontamineringsgrader, t.ex. 0,50 pg WHO-TEQ/g produkt, kan skillnaden mellan övre och lägre koncentrationer ligga inom ett intervall på 25–40 %.

—

Varje testserie skall innehålla ett blankprov och ett referensprov. Proven i serien skall extraheras och testas samtidigt under identiska förhållanden. Referensprovet måste visa klart högre respons än blankprovet.

—

Extra referensprov på 0,5 och 2 gånger den givna nivån skall tas med för att påvisa analysens tillförlitlighet inom ett relevant intervall för kontrollen av den givna nivån.

—

När andra matriser testas skall referensprovens användbarhet påvisas, helst genom att man tar med prov som vid bestämning med HRGC-HRMS visat sig innehålla ungefär samma TEQ-halt som referensprovet, eller ett blankprov där motsvarande mängd tillsatts.

—

Eftersom inga interna standarder kan användas i bioassay, skall test för att kontrollera repeterbarheten utföras för att bedöma standardavvikelsen inom en testserie. Variationskoefficienten skall vara under 30 %.

—

För bioassay skall det definieras vilka substanser som detekteras, möjliga interferenser samt de högsta värden för blankprov som är godtagbara.

—

GC-MS-metoder för analys samt bioassay kan användas vid screening. För GC-MS-metoder skall kraven i avsnitt 6 tillämpas. För cellbaserade bioassay fastställs särskilda krav i avsnitt 7.3 i denna bilaga och för bioassay i form av kit i avsnitt 7.4 i denna bilaga.

—

Det är nödvändigt med information om antalet falskt positiva och falskt negativa resultat från ett stort antal prov, vilkas halter ligger under respektive över de högsta tillåtna halterna eller åtgärdsgränserna, i jämförelse med de TEQ-värden som bestämts med en konfirmeringsmetod. Den faktiska frekvensen av falskt negativa resultat skall vara under 1 %. Frekvensen av falskt positiva prov skall vara så låg att det lönar sig att använda en screeningmetod.

—

Positiva resultat skall alltid kontrolleras med en konfirmeringsmetod – högupplösande gaskromatografi (HRGC) och högupplösande masspektrometri (HRMS). Prov från ett stort TEQ-intervall skall dessutom kontrolleras med HRGC-HRMS (cirka 2–10 % av de negativa proven). Uppgifter om överensstämmelse mellan resultaten från bioassay respektive HRGC-HRMS skall finnas tillgängliga.

—

När en bioassay används skall varje testkörning omfatta en serie av referenskoncentrationer av TCDD eller en blandning av dioxiner, furaner och dioxinlika PCB:er (fullständig dos-responskurva där R2 > 0,95). För screening kan dock en utvidgad lågnivåkurva för analys av prov med låga halter användas.

—

En TCDD-referenskoncentration (motsvarande ungefär 3 gånger kvantifieringsgränsen) på ett kvalitetskontrollformulär skall användas för resultatet från bioassayn under en konstant tidsperiod. Ett alternativ kan vara den relativa responsen från ett referensprov i jämförelse med TCDD-kalibreringskurvan, eftersom cellernas respons kan bero på många faktorer.

—

Kvalitetskontrolldiagram för varje typ av referensmaterial skall framställas och kontrolleras för att säkerställa att resultatet är i enlighet med de fastställda riktlinjerna.

—

Särskilt när det gäller kvantitativa beräkningar skall induktionen av det utspädda provet befinna sig inom den linjära delen av responskurvan. Prov ovanför den linjära delen av responskurvan skall spädas ut och testas på nytt. Därför skall att minst tre spädningar testas samtidigt.

—

Standardavvikelsen får inte överstiga 15 % vid tredubbel bestämning för varje provspädning och inte 30 % mellan tre oberoende försök.

—

Detektionsgränsen kan sättas till 3 gånger standardavvikelsen för blankprovlösningen eller bakgrundsresponsen. Ett annat tillvägagångssätt är att använda en respons som ligger över bakgrunden (induktionsfaktor 5 gånger blankprovlösningen) som beräknats från dagens kalibreringskurva. Kvantifieringsgränsen kan sättas till 5–6 gånger standardavvikelsen för blankprovlösningen eller bakgrundsresponsen, eller så kan man använda en respons som ligger klart över bakgrunden (induktionsfaktor 10 gånger blankprovlösningen) som beräknats från dagens kalibreringskurva.

—

Det skall säkerställas att bioassay i form av kit är tillräckligt känsliga och tillförlitliga för att få användas på livsmedel.

—

Tillverkarens anvisningar för beredning av prov och för analyser skall följas.

—

Testkit vars sista användningsdatum överskridits får inte användas.

—

Material eller komponenter som utformats för användning med andra kit får inte användas.

—

Testkit skall förvaras inom det angivna intervallet för lagringstemperatur och användas vid den angivna användningstemperaturen.

—

Detektionsgränsen för immunassay skall fastställas som 3 gånger standardavvikelsen vid 10 upprepade analyser av blankprovet, delat med lutningskoefficienten för den linjära regressionsekvationen.

—

Referensstandarder skall användas för laboratorietest för att säkerställa att responsen för standarden ligger inom ett godtagbart intervall.