1.1.

„Nivel de acțiune” înseamnă nivelul unei anumite substanțe, astfel cum este menționat în anexa la Recomandarea 2013/711/UE, care declanșează investigații pentru a identifica sursa respectivei substanțe în cazurile în care sunt detectate niveluri crescute ale substanței.

1.2.

„Metode de screening” înseamnă metodele utilizate pentru selectarea acelor probe cu niveluri de PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor care depășesc nivelurile maxime sau nivelurile de acțiune. Aceste metode au o capacitate mare de tratare a probelor, eficientă din punctul de vedere al costurilor, sporind astfel șansa de a descoperi noi cazuri în care un grad mare de expunere poate să ducă la riscuri de sănătate pentru consumatori. Metodele de screening se bazează pe metode bioanalitice sau GC-MS. Rezultatele probelor care depășesc valoarea de prag stabilită pentru verificarea conformității cu nivelul maxim trebuie să fie verificate printr-o nouă analiză completă din proba originală utilizând o metodă de confirmare.

1.3.

„Metode de confirmare” înseamnă metode care furnizează informații complete sau complementare care permit identificarea și cuantificarea certă a PCDD/F-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor la nivelul maxim sau, la nevoie, la nivelul de acțiune. Astfel de metode utilizează gaz-cromatografia cuplată cu spectrometria de masă de înaltă rezoluție (GC-HRMS) sau gaz-cromatografia cuplată cu spectrometria de masă în tandem (GC-MS/MS).

1.4.

„Metode bioanalitice” înseamnă metode bazate pe principii biologice, cum ar fi bioanalizele celulare, testele bazate pe receptori sau imunoanalizele. Ele nu dau rezultate la nivel de congener, ci oferă doar o indicație (1) a nivelului TEQ, exprimată în echivalente bioanalitice (BEQ), pentru a ține seama de faptul că este posibil ca nu toți compușii prezenți într-un extract de probă și care determină un răspuns în cadrul analizei să îndeplinească toate cerințele principiului TEQ.

1.5.

„Recuperarea aparentă a testului biologic” înseamnă valoarea nivelului BEQ, calculată pornind de la curba de calibrare a TCDD sau PCB 126, corectată cu proba-martor și apoi împărțită la valoarea nivelului TEQ, determinată prin metoda de confirmare. Aceasta vizează corectarea factorilor cum ar fi pierderea de compuși PCDD/F și de tipul dioxinelor în timpul etapelor de extracție și curățare, coextragerea compușilor care duc la intensificarea sau atenuarea răspunsului (efecte agoniste și antagoniste), calitatea ajustării curbei sau diferențele dintre valorile TEF și ale REP. Recuperarea aparentă a testului biologic se calculează pornind de la probe de referință adecvate cu modele pentru congeneri reprezentativi în jurul nivelului maxim sau al nivelului de acțiune.

1.6.

„Analiză duplicat” înseamnă analiza separată a analiților de interes, folosind o a doua parte alicotă din aceeași probă omogenizată.

1.7.

„Limită specifică acceptată de cuantificare (2) a unui congener individual într-o probă” înseamnă concentrația minimă a unui analit care poate fi măsurată cu certitudine statistică rezonabilă și îndeplinește criteriile de identificare, astfel cum sunt descrise în standarde recunoscute pe plan internațional, de exemplu EN 16215:2012 („Hrană pentru animale – Determinarea dioxinelor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor prin GC/HRMS și a PCB-urilor indicatori prin GC/HRMS”) și/sau în metodele EPA 1613 și 1668 revizuite.

Limita de cuantificare a unui congener individual poate fi definită ca:

1.8.

„Estimare superioară” înseamnă conceptul care presupune utilizarea limitei de cuantificare pentru contribuția fiecărui congener necuantificat.

1.9.

„Estimare inferioară” înseamnă conceptul care presupune utilizarea valorii zero pentru contribuția fiecărui congener necuantificat.

1.10.

„Estimare mediană” înseamnă conceptul care presupune ca, la calculul contribuției fiecărui congener necuantificat, să se utilizeze jumătate din limita de cuantificare.

1.11.

„Lot” înseamnă o cantitate identificabilă de produse alimentare, livrată odată, pentru care funcționarul stabilește că au caracteristici comune cum ar fi originea, varietatea, tipul de ambalaj, ambalatorul, expeditorul sau marcajele. În cazul peștilor și al produselor pescărești, mărimea peștilor trebuie să fie, de asemenea, comparabilă. În cazul în care mărimea și/sau greutatea peștilor nu sunt comparabile în cadrul unui transport, acesta poate să fie totuși luat în considerare ca fiind un lot, însă trebuie să i se aplice o procedură specifică de prelevare de probe.

1.12.

„Sublot” înseamnă o parte dintr-un lot mare, definită cu scopul de a aplica metoda de prelevare a probelor respectivei părți. Fiecare sublot trebuie să fie separat fizic și identificabil.

1.13.

„Probă elementară” înseamnă o cantitate de material prelevată dintr-un singur loc din lot sau sublot.

1.14.

„Probă agregată” înseamnă proba rezultată prin combinarea tuturor probelor elementare prelevate dintr-un lot sau sublot.

1.15.

„Probă de laborator” înseamnă o parte/cantitate reprezentativă din proba globală destinată laboratorului.

BEQ

Echivalente bioanalitice

GC

Gaz-cromatografie, cromatografie în fază gazoasă

HRMS

Spectrometrie de masă de înaltă rezoluție

LRMS

Spectrometrie de masă de joasă rezoluție

MS/MS

Spectrometrie de masă în tandem

PCB

Bifenil policlorurat

PCB-uri care nu sunt de tipul dioxinelor

PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 și PCB 180

PCDD

Dibenzo-p-dioxine policlorurate

PCDF

Dibenzofurani policlorurați

QC

Controlul calității

REP

Potență relativă

TEF

Factor de echivalență toxică

TEQ

Echivalente toxice

TCDD

2,3,7,8-tetraclordibenzo-p-dioxină

U

Incertitudine de măsurare extinsă

—

Atunci când lotul din care se prelevă probe conține pești mici (pești individuali care cântăresc mai puțin de aproximativ 1 kg), aceștia se prelevă întregi ca probe elementare pentru a constitui proba agregată. Atunci când proba agregată care rezultă cântărește mai mult de 3 kg, probele elementare pot fi constituite din partea de mijloc, cântărind fiecare cel puțin 100 de grame, a peștilor care formează proba agregată. Pentru omogenizarea probei, se utilizează întreaga parte căreia îi este aplicabil nivelul maxim.

Partea din mijloc a peștelui este cea unde se află centrul de greutate. Acesta este localizat, în cele mai multe cazuri, la nivelul aripioarei dorsale (în cazul în care peștele are aripioară dorsală) sau la mijlocul distanței dintre branhii și anus.

—

Atunci când lotul din care se prelevă probe conține pești mai mari (fiecare cântărind mai mult de aproximativ 1 kg), proba elementară este reprezentată de partea din mijloc a peștelui. Fiecare probă elementară cântărește cel puțin 100 de grame.

În cazul peștilor de mărime intermediară (aproximativ 1-6 kg), proba elementară constă într-o bucată prelevată în secțiune transversală între coloana vertebrală și abdomen, din partea din mijloc a peștelui.

În cazul peștilor foarte mari (de exemplu, mai mari de aproximativ 6 kg), proba elementară este prelevată din masa musculară dorso-laterală de pe partea dreaptă (vedere frontală), din partea de mijloc a peștelui. Atunci când prelevarea unei bucăți din partea de mijloc a peștelui ar însemna un prejudiciu economic semnificativ, se poate considera suficientă prelevarea a trei probe elementare cântărind fiecare cel puțin 350 de grame, indiferent de mărimea lotului sau, ca alternativă, se poate preleva câte o parte egală din masa musculară din apropierea cozii și din cea din apropierea capului unui pește pentru a se forma proba elementară reprezentativă pentru nivelul de dioxine din peștele întreg.

—

În ceea ce privește constituirea probei, se aplică dispozițiile de la punctul III.3.

—

Atunci când predomină o clasă/categorie de mărime sau de greutate (aproximativ 80 % sau mai mult din lot), proba se prelevă de la peștii de mărimea sau greutatea predominantă. Această probă se consideră reprezentativă pentru întregul lot.

—

Atunci când nu predomină o anumită clasă/categorie de mărime sau de greutate, trebuie să se asigure faptul că peștii selectați în vederea prelevării de probe sunt reprezentativi pentru lot. Instrucțiuni specifice pentru astfel de cazuri sunt puse la dispoziție în documentul „Ghid de prelevare de probe din pești întregi de mărime și/sau greutate diferită” (2).

—

efectuate printr-o metodă de screening cu o rată de rezultate fals conforme sub 5 % arată că nivelul nu depășește nivelul maxim respectiv de PCDD/F-uri și suma dintre PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor, astfel cum sunt prevăzute în Regulamentul (CE) nr. 1881/2006;

—

efectuate printr-o metodă de confirmare nu depășește nivelul maxim respectiv de PCDD/F-uri și suma dintre PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor, astfel cum sunt prevăzute în Regulamentul (CE) nr. 1881/2006, ținând seama de incertitudinea de măsurare extinsă (5).

—

Trebuie luate măsuri pentru a se evita contaminarea încrucișată în fiecare etapă a procedurii de prelevare de probe și de analizare.

—

Probele trebuie depozitate și transportate în recipiente de sticlă, aluminiu, polipropilenă sau polietilenă, corespunzătoare pentru depozitare, fără nicio influență asupra nivelurilor de PCDD/F-uri și de PCB-uri de tipul dioxinelor din probe. Urmele de praf de hârtie trebuie îndepărtate de pe recipientul cu probe.

—

Depozitarea și transportul probelor trebuie efectuate astfel încât să se păstreze integritatea probei de produs alimentar.

—

În măsura în care este relevant, fiecare probă de laborator se macină fin și se amestecă temeinic printr-un procedeu dovedit că realizează o omogenizare completă (de exemplu, proba este măcinată fin astfel încât să treacă printr-o sită cu ochiuri de 1 mm); probele trebuie uscate înainte de măcinare, în cazul în care conținutul de umiditate este prea mare.

—

Controlul reactivilor, al sticlăriei și al echipamentului în vederea detectării unei posibile influențe a rezultatelor bazate pe TEQ sau BEQ este de importanță generală.

—

Se efectuează o analiză-martor parcurgând întreaga procedură analitică, însă fără probă.

—

Pentru metodele bioanalitice, este de mare importanță ca toată sticlăria și toți solvenții utilizați în cadrul analizei să fie testați, pentru a nu conține compuși care interferează cu detectarea compușilor-țintă în intervalul de lucru. Sticlăria se clătește cu solvenți sau/și se încălzește la temperaturi adecvate pentru a elimina urmele de PCDD/F-uri, de compuși de tipul dioxinelor și de compuși interferenți de pe suprafața acesteia.

—

Cantitatea de probă utilizată pentru extracție trebuie să fie suficientă pentru a îndeplini cerințele referitoare la un interval de lucru într-o gamă de concentrații suficient de mici și care include concentrațiile la nivelurile maxime sau de acțiune.

—

Procedurile specifice de pregătire a probelor utilizate pentru produsele avute în vedere urmează orientări recunoscute la nivel internațional.

—

În cazul peștilor, pielea trebuie îndepărtată, deoarece nivelul maxim se aplică mușchiului fără piele. Cu toate acestea, este necesar ca întreg restul de țesut muscular și adipos de pe partea internă a pielii să fie îndepărtat de piele cu grijă și în întregime și adăugat la proba de analizat.

—

În conformitate cu dispozițiile Regulamentului (CE) nr. 882/2004, laboratoarele sunt acreditate de un organism recunoscut care funcționează în conformitate cu Ghidul ISO 58, pentru a se asigura aplicarea de către acestea a procedurilor de asigurare a calității analizelor. Laboratoarele sunt acreditate conform standardului EN ISO/IEC 17025. Dacă este cazul, trebuie respectate principiile descrise în Orientările tehnice pentru estimarea incertitudinii de măsurare și a limitelor de cuantificare pentru analiza PCDD/F-urilor și a PCB-urilor (1).

—

Competența laboratoarelor se demonstrează prin participarea continuă și cu succes la studiile interlaboratoare pentru determinarea PCDD/F-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor în matricele de produse alimentare și în intervalele de concentrații relevante.

—

Laboratoarele care aplică metode de screening pentru controlul de rutină al probelor stabilesc o cooperare strânsă cu laboratoarele care aplică metoda de confirmare, atât pentru controlul calității, cât și pentru confirmarea rezultatului analitic al probelor suspecte.

—

Pentru PCDD/F-uri, cantitățile detectabile trebuie să fie în gama superioară a femtogramelor (10–15 g) din cauza toxicității extreme a unora dintre acești compuși. Pentru majoritatea congenerilor PCB, limita de cuantificare de ordinul nanogramelor (10–9 g) este deja suficientă. Totuși, pentru măsurarea congenerilor PCB-urilor de tipul dioxinelor mai toxici (în special a congenerilor non-orto substituiți), zona inferioară a intervalului de lucru trebuie să ajungă în gama inferioară a picogramelor (10–12 g).

—

Este necesar să se facă o distincție între PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor și o multitudine de alți compuși coextrași care pot să interfereze și care sunt prezenți în concentrații cu până la câteva ordine de mărime mai mari decât cele ale analiților de interes. Pentru metodele bazate pe gaz-cromatografie/spectrometrie de masă (GC-MS), este necesară o diferențiere între diverșii congeneri, respectiv între cei toxici (de exemplu, cele șaptesprezece PCDD/F-uri 2,3,7,8-substituite și cele douăsprezece PCB-uri de tipul dioxinelor) și alți congeneri.

—

Metodele bioanalitice sunt capabile să detecteze compușii-țintă ca sumă de PCDD/F-uri și/sau de PCB-uri de tipul dioxinelor. Curățarea probelor are drept scop eliminarea compușilor care duc la rezultate fals neconforme sau a compușilor care pot atenua răspunsul, ducând la rezultate fals conforme.

—

Pentru metodele GC-MS, determinarea oferă o estimare valabilă a concentrației reale dintr-o probă. Acuratețea mare (acuratețea măsurătorii: concordanța cât mai bună între rezultatul unei măsurători și valoarea reală sau alocată a mărimii măsurabile) este necesară pentru a evita respingerea rezultatului analizei unei probe în temeiul fiabilității slabe a nivelului TEQ determinat. Acuratețea se exprimă prin fidelitate (diferența dintre valoarea medie măsurată pentru un analit pe un material certificat și valoarea sa certificată, exprimată ca procent din această valoare) și precizie (deviația standard relativă RSDR calculată pe baza rezultatelor generate în condiții de reproductibilitate).

—

Pentru metodele bioanalitice, se determină recuperarea aparentă a testului biologic.

—

În timpul procedurii de validare și/sau în timpul analizei de rutină, laboratoarele demonstrează performanța unei metode în intervalul nivelului maxim, de exemplu, 0,5x, 1x și 2x nivelul maxim, cu un coeficient de variație acceptabil pentru analize repetate.

—

Ca măsuri interne de control al calității, se efectuează periodic controale-martor, experimente cu îmbogățire sau analize ale unor probe de control (preferabil, dacă este posibil, cu material de referință certificat). Se înregistrează și se verifică grafice de control al calității (QC) pentru controalele-martor, experimentele cu îmbogățire sau analizele unor probe de control, pentru a se garanta că performanța analitică este conformă cerințelor.

—

Pentru o metodă bioanalitică de screening, stabilirea LDC nu este o cerință indispensabilă, însă metoda trebuie să demonstreze că poate face distincție între valoarea-martor și valoarea de prag. Atunci când se furnizează un nivel BEQ, se stabilește un nivel de raportare pentru a se lua decizii legate de probele care prezintă un răspuns sub acest nivel. Trebuie să se dovedească faptul că nivelul de raportare este diferit față de probele-martor din cadrul procedurii cu un factor de minimum trei, cu un răspuns inferior intervalului de lucru. Prin urmare, se calculează pornind de la probe care conțin compușii-țintă în concentrații din jurul nivelului minim prevăzut și nu de la un raport S/Z sau de la un test-martor.

—

Limita de cuantificare (LDC) pentru o metodă de confirmare este aproximativ o cincime din nivelul maxim.

—

Pentru ca metodele de confirmare sau de screening să ofere rezultate fiabile, în intervalul nivelului maxim trebuie să fie respectate următoarele criterii pentru valoarea TEQ, respectiv BEQ, indiferent dacă aceasta este determinată ca TEQ total sau ca BEQ total (ca sumă de PCDD/F-uri și de PCB-uri de tipul dioxinelor) sau separat pentru PCDD/F-uri și pentru PCB-uri de tipul dioxinelor.

—

Atât GC-MS, cât și metodele bioanalitice pot fi folosite pentru screening. Pentru metodele GC-MS, trebuie utilizate cerințele prevăzute la punctul 6. Pentru metodele bioanalitice bazate pe celule, sunt prevăzute cerințe specifice la punctul 7.

—

Laboratoarele care aplică metode de screening pentru controlul de rutină al probelor stabilesc o cooperare strânsă cu laboratoarele care aplică metoda de confirmare.

—

Performanța metodei de screening trebuie verificată în timpul analizei de rutină, printr-un control al calității analizelor și printr-o validare continuă a metodei. Trebuie să existe un program continuu pentru controlul rezultatelor conforme.

—

Verificarea posibilei suprimări a răspunsului celular și a citotoxicității

20 % din extractele de probe se măsoară în screeningul de rutină cu și fără TCDD care se adaugă în funcție de nivelul maxim sau de acțiune, pentru a verifica dacă răspunsul este, eventual, suprimat de către substanțele interferente prezente în extractul de probă. Concentrația măsurată a probei îmbogățite se compară cu suma dintre concentrația extractului neîmbogățit și concentrația cu îmbogățire. Dacă această concentrație măsurată este mai mică cu mai mult de 25 % față de concentrația (suma) calculată, aceasta indică posibilitatea eliminării semnalului, iar proba respectivă trebuie supusă analizei de confirmare. Rezultatele sunt monitorizate prin grafice de control al calității.

—

Controlul calității probelor conforme

Aproximativ 2-10 % din probele conforme, în funcție de matricea probei și de experiența laboratorului, se supun analizei de confirmare.

—

Determinarea ratelor de rezultate fals conforme pornind de la datele QC

Se determină rata rezultatelor fals conforme care rezultă din screeningul probelor sub și peste nivelul maxim sau de acțiune. Ratele reale de rezultate fals conforme trebuie să fie sub 5 %.

Atunci când, în urma controlului de calitate al probelor conforme, sunt disponibile cel puțin 20 de rezultate confirmate per matrice/grup de matrice, concluziile privind rata de rezultate fals conforme trebuie să fie desprinse din această bază de date. Rezultatele probelor analizate prin intermediul testărilor interlaboratoare sau în timpul incidentelor de contaminare, care acoperă un interval de concentrații de până la, de exemplu, 2x nivelul maxim (NM), pot fi, de asemenea, incluse în cele minimum 20 de rezultate pentru evaluarea ratei de rezultate fals conforme. Probele acoperă cele mai frecvente modele de congeneri, reprezentând diverse surse.

Deși testele de screening urmăresc în mod preferențial să detecteze probele care depășesc nivelul de acțiune, criteriul de determinare a ratelor de rezultate fals conforme este nivelul maxim, ținând seama de incertitudinea de măsurare extinsă a metodei de confirmare.

—

Probele potențial neconforme care rezultă în urma screeningului trebuie să fie întotdeauna verificate printr-o nouă analiză completă a probei originale printr-o metodă de confirmare. Aceste probe pot fi, de asemenea, folosite pentru a evalua rata rezultatelor fals neconforme. Pentru metodele de screening, rata rezultatelor fals neconforme este procentul rezultatelor confirmate ca fiind conforme în urma analizei de confirmare, în timp ce, în screeningul anterior, s-a declarat că proba este suspectată de a fi neconformă. În schimb, evaluarea caracterului avantajos al metodei de screening se bazează pe compararea probelor fals neconforme cu numărul total de probe verificate. Această rată trebuie să fie suficient de mică pentru a face ca utilizarea unui instrument de screening să fie avantajoasă.

—

Cel puțin în condiții de validare, metodele bioanalitice oferă o indicație valabilă a nivelului TEQ, calculat și exprimat ca BEQ.

—

De asemenea, pentru metodele bioanalitice aplicate în condiții de repetabilitate, valoarea RSDr intralaborator ar fi, de regulă, mai mică decât RSDR (reproductibilitate).

—

Diferența dintre nivelurile de la limita superioară și cele de la limita inferioară nu trebuie să fie mai mare de 20 % pentru confirmarea unei depășiri a nivelului maxim sau, în caz de nevoie, a nivelurilor de acțiune.

—

Pentru a se valida procedura analitică, la începutul efectuării analizei, de exemplu, înaintea fazei de extracție, trebuie să se adauge etaloane interne de PCDD/F-uri substituite cu clor la pozițiile 2,3,7,8 și marcate cu 13C, precum și etaloane interne de PCB-uri de tipul dioxinelor marcate cu 13C. Trebuie adăugat cel puțin un congener pentru fiecare din grupele omoloage tetra- până la octo-clorurate de PCDD/F-uri și cel puțin un congener pentru fiecare dintre grupele omoloage de PCB-uri de tipul dioxinelor (alternativ, cel puțin un congener pentru fiecare funcție de înregistrare a ionului selecționat prin spectrometrie de masă, utilizat pentru monitorizarea PCDD/F-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor). În cazul metodelor de confirmare, trebuie să fie utilizate toate cele 17 etaloane interne de PCDD/F-uri substituite la pozițiile 2,3,7,8 și marcate cu 13C, precum și toate cele 12 etaloane interne de PCB-uri de tipul dioxinelor marcate cu 13C.

—

De asemenea, se determină factorii de răspuns relativ pentru acei congeneri pentru care nu se adaugă niciun analog marcat cu 13C, utilizându-se soluții de calibrare corespunzătoare.

—

Pentru produsele alimentare de origine vegetală și cele de origine animală care conțin mai puțin de 10 % grăsime, este obligatorie adăugarea etaloanelor interne înainte de extracție. Pentru produsele alimentare de origine animală care conțin mai mult de 10 % grăsime, etaloanele interne se pot adăuga fie înainte, fie după extracția grăsimii. Se procedează la o validare corespunzătoare a eficacității extracției, în funcție de etapa în care se introduc etaloanele interne și de modul în care sunt prezentate rezultatele (pe bază de produs sau de grăsimi).

—

Înaintea analizei GC-MS, trebuie să se adauge unul sau două etaloane de recuperare (surogat).

—

Este necesar controlul recuperării. Pentru metodele de confirmare, recuperările de etaloane interne individuale trebuie să se situeze în intervalul 60-120 %. Sunt acceptabile recuperări inferioare sau superioare pentru congeneri individuali, în special pentru unele dibenzo-p-dioxine și unii dibenzofurani hepta- și octo-clorurați, atât timp cât contribuția acestora la valoarea TEQ nu depășește 10 % din valoarea TEQ totală (bazată pe suma dintre PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor). Pentru metodele de screening GC-MS, recuperarea trebuie să se situeze în intervalul 30-140 %.

—

Separarea PCDD/F-urilor de compușii clorurați interferenți, cum sunt PCB-urile care nu sunt de tipul dioxinelor și bifenileterii clorurați, se realizează prin tehnici cromatografice adecvate (de preferință pe coloană de florisil, alumină și/sau cărbune).

—

Separarea izomerilor prin gaz-cromatografie trebuie să fie suficientă (< 25 % de la pic la pic între 1,2,3,4,7,8-HxCDF și 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

—

Intervalul curbei de calibrare trebuie să acopere intervalul relevant de niveluri maxime sau de acțiune.

—

Pentru GC-HRMS:

—

Pentru GC-MS/MS:

—

Atunci când se calculează concentrațiile pornind de la o curbă de calibrare a TCDD, valorile la extremitatea superioară a curbei vor prezenta o variație importantă [coeficient de variație (CV) ridicat]. Intervalul de lucru este aria în care acest CV este mai mic de 15 %. Extremitatea inferioară a intervalului de lucru (limita de raportare) trebuie să fie fixată semnificativ (cel puțin cu un factor de trei) peste probele-martor din cadrul procedurii. Extremitatea superioară a intervalului de lucru este, de obicei, reprezentată de valoarea EC70 (70 % din concentrația maximă efectivă), dar mai scăzută dacă CV este mai mare de 15 % în acest interval. Intervalul de lucru este stabilit în timpul validării. Valorile de prag (a se vedea punctul 7.3) trebuie să se situeze în intervalul de lucru.

—

Soluțiile etalon și extractele de probe trebuie să fie testate în triplicat sau cel puțin în duplicat. Atunci când se utilizează duplicate, o soluție etalon sau un extract de control testat(ă) în patru până la șase godeuri repartizate pe placă produce un răspuns sau o concentrație (posibilă doar în intervalul de lucru) pe baza unui CV < 15 %.

—

Nivelurile din probe pot fi estimate prin compararea răspunsului la test cu o curbă de calibrare a TCDD (sau a PCB 126 sau a unui amestec etalon de PCDD/F-uri/PCB-uri de tipul dioxinelor) pentru a se calcula nivelul BEQ din extract și, prin urmare, din probă.

—

Curbele de calibrare conțin între opt și 12 concentrații (cel puțin în duplicat), cu un număr suficient de concentrații în partea inferioară a curbei (intervalul de lucru). Se acordă o atenție specială calității ajustării curbei în intervalul de lucru. Valoarea R2 ca atare are valoare redusă sau nicio valoare în estimarea calității ajustării în regresia nelineară. Se ajunge la o ajustare mai bună prin reducerea la minimum a diferenței dintre nivelurile calculate și cele observate în intervalul de lucru al curbei (de exemplu, prin reducerea la minimum a sumei pătratelor reziduurilor).

—

Nivelul estimat în extractul de probă este corectat ulterior cu nivelul BEQ calculat pentru o probă-martor de matrice sau de solvent (pentru a ține seama de impuritățile din solvenți și din substanțele chimice utilizate) și cu recuperarea aparentă (calculată pornind de la nivelul BEQ al unor probe de referință adecvate, cu modele reprezentative de congeneri în jurul nivelului maxim sau al nivelului de acțiune). Pentru a efectua o corecție cu recuperarea, recuperarea aparentă trebuie să fie situată întotdeauna în intervalul necesar (a se vedea punctul 7.1.4). Probele de referință utilizate pentru corecția cu recuperarea trebuie să respecte cerințele de la punctul 7.2.

—

Probele de referință reprezintă matricea probei, modelele de congeneri și intervalele de concentrație pentru PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor în jurul nivelului maxim sau al nivelului de acțiune.

—

În fiecare serie de teste, se include un martor pentru procedură sau, de preferință, un martor pentru matrice, precum și o probă de referință la nivelul maxim sau la nivelul de acțiune. Aceste probe trebuie extrase și testate în același timp și în condiții identice. Proba de referință trebuie să prezinte un răspuns clar mai puternic în comparație cu proba-martor, asigurând astfel caracterul adecvat al testului. Probele respective pot fi utilizate pentru corecțiile cu proba-martor și cu recuperarea.

—

Probele de referință alese pentru a efectua o corecție cu recuperarea sunt reprezentative pentru probele testate, în sensul că modelele de congeneri nu conduc la o subestimare a nivelurilor.

—

Se pot include probe de referință suplimentare, de exemplu de 0,5x și 2x nivelul maxim sau nivelul de acțiune, pentru a se demonstra eficacitatea testului în intervalul de interes pentru controlul nivelului maxim sau al nivelului de acțiune. Combinate, aceste probe pot fi utilizate pentru calcularea nivelurilor BEQ în probele de testare (a se vedea punctul 7.1.2.2).

BEQDL

BEQ care corespunde limitei de decizie aferente metodei de confirmare, fiind nivelul maxim care ține seama de incertitudinea de măsurare extinsă

sy,x

deviația standard reziduală

t α,f = m-2

factor student (α = 5 %, f = grade de libertate, o singură parte)

m

numărul total de puncte de calibrare (indice j)

n

numărul de repetări la fiecare nivel

xi

concentrația probei (în TEQ) în punctul de calibrare I determinată printr-o metodă de confirmare

media concentrațiilor (în TEQ) a tuturor probelor de calibrare

i

=

indice pentru punctul de calibrare i

SDR

deviația standard a rezultatelor testului biologic la BEQDL, măsurată în condiții de reproductibilitate intralaborator

1.

pornind de la sectorul inferior al intervalului de predicție de 95 % la limita de decizie aferentă metodei de confirmare;

2.

pornind de la analize multiple ale probelor (n ≥ 6) contaminate la limita de decizie aferentă metodei de confirmare, ca limită inferioară a distribuției datelor (reprezentată în figură printr-o curbă sub formă de clopot) la valoarea medie BEQ corespunzătoare.

—

Având în vedere faptul că nu se pot utiliza etaloane interne în metodele bioanalitice, se efectuează teste cu privire la repetabilitate pentru obținerea de informații privind deviația standard în cadrul unei serii de teste și între serii de teste. Repetabilitatea trebuie să fie sub 20 %, iar reproductibilitatea intralaborator sub 25 %. Aceasta se bazează pe nivelurile calculate în BEQ după corecția cu proba-martor și cu recuperarea.

—

Ca parte din procesul de validare, testul trebuie să permită diferențierea între o probă-martor și un nivel la valoarea de prag, permițând identificarea probelor peste valoarea de prag corespunzătoare (a se vedea punctul 7.1.2).

—

Se definesc compușii-țintă, interferențele potențiale și nivelurile maxime tolerabile ale probei-martor.

—

Deviația standard în procente a răspunsului sau a concentrației calculate pornind de la răspuns (posibilă numai în intervalul de lucru) a unei determinări triple a unui extract de probă nu trebuie să fie mai mare de 15 %.

—

Rezultatele necorectate ale probei (probelor) de referință exprimată (exprimate) în BEQ-uri (martor și la nivelul maxim sau la nivelul de acțiune) sunt utilizate pentru evaluarea performanței metodei bioanalitice pe o perioadă de timp constantă.

—

Graficele de control al calității (QC) pentru probele-martor ale procedurii și fiecare tip de probă de referință se înregistrează și se verifică pentru a se garanta că performanța analitică este în conformitate cu cerințele, în special pentru probele-mator ale procedurii cu privire la diferența minimă impusă la limita inferioară a intervalului de lucru și pentru probele de referință cu privire la reproductibilitatea intralaborator. Probele-martor din cadrul procedurii trebuie să fie atent controlate pentru a evita rezultatele fals conforme atunci când se efectuează operațiunea de scădere.

—

Rezultatele analizelor realizate prin metodele de confirmare pentru probele suspectate și pentru 2-10 % din probele conforme (minimum 20 de probe pentru fiecare matrice) sunt colectate și folosite pentru a evalua performanța metodei de screening și relația dintre BEQ-uri și TEQ-uri. Această bază de date ar putea fi utilizată pentru reevaluarea valorilor de prag aplicabile probelor de rutină pentru matricele validate.

—

Buna performanță a metodelor poate fi, de asemenea, demonstrată prin participarea la testările interlaboratoare. Rezultatele probelor analizate în testările interlaboratoare, care acoperă un interval de concentrații care ajunge până la, de exemplu, 2x nivelul maxim, pot fi, de asemenea, incluse în evaluarea ratei de rezultate fals conforme, în cazul în care un laborator este în măsură să demonstreze buna sa performanță. Probele acoperă cele mai frecvente modele de congeneri, reprezentând diverse surse.

—

În timpul incidentelor, valorile de prag pot fi reevaluate, reflectând matricea specifică și modelele de congeneri doar ale acelui incident individual.

—

Rezultatele analitice includ nivelurile de congeneri individuali ai PCDD/F-urilor și ai PCB-urilor de tipul dioxinelor și valorile TEQ și se raportează ca estimare inferioară, estimare superioară și estimare mediană, pentru a include o cantitate maximă de informații în raportarea rezultatelor, ceea ce permite o interpretare a rezultatelor în conformitate cu cerințele specifice.

—

Raportul include și metoda utilizată pentru extracția PCDD/F-urilor, a PCB-urilor de tipul dioxinelor și a lipidelor. Conținutul de lipide al probei se determină și se raportează pentru probe din produse alimentare cu niveluri maxime exprimate prin raportare la conținutul de grăsimi și cu o concentrație de grăsimi estimată în intervalul 0-2 % (în concordanță cu legislația existentă). Pentru alte probe, determinarea conținutului de lipide este opțională.

—

Recuperările etaloanelor interne individuale trebuie să fie disponibile în cazul în care recuperările se situează în afara intervalului menționat la punctul 6.2, atunci când nivelul maxim este depășit (în acest caz, recuperările pentru una dintre cele două analize duplicat), iar în celelalte cazuri, la cerere.

—

Întrucât, atunci când se decide conformitatea unei probe, se ține seama de incertitudinea de măsurare extinsă, și acest parametru trebuie să fie pus la dispoziție. De aceea, rezultatele analitice se raportează ca x ± U, unde x este rezultatul analitic și U este incertitudinea de măsurare extinsă, folosind un factor de acoperire 2, care conferă un nivel de încredere de aproximativ 95 %. În cazul unei determinări separate a PCDD/F-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor, suma incertitudinii extinse estimate a rezultatelor analitice separate ale PCDD/F-urilor și ale PCB-urilor de tipul dioxinelor se utilizează pentru suma PCDD/F-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor.

—

Rezultatele se exprimă în aceleași unități și prin același număr de cifre semnificative ca și nivelurile maxime prevăzute în Regulamentul (CE) nr. 1881/2006.

—

Rezultatul screeningului se exprimă cu termenii „conform” sau „suspectat a fi neconform” („suspectat”).

—

În plus, se poate da un rezultat indicativ pentru PCDD/F-uri și/sau PCB-uri de tipul dioxinelor exprimat în BEQ, nu în TEQ (a se vedea punctul 1). Rezultatul probelor cu un răspuns sub limita de raportare se exprimă ca fiind „sub limita de raportare”. Rezultatul probelor cu un răspuns peste intervalul de lucru se raportează ca „depășind intervalul de lucru”, iar nivelul corespunzător extremității superioare a intervalului de lucru se furnizează în BEQ.

—

Pentru fiecare tip de matrice a probei, raportul menționează nivelul maxim sau nivelul de acțiune pe care se bazează evaluarea.

—

Raportul menționează tipul de test aplicat, principiul de bază al testului și tipul de calibrare.

—

Raportul include și metoda utilizată pentru extracția PCDD/F-urilor, a PCB-urilor de tipul dioxinelor și a lipidelor. Conținutul de lipide al probei se determină și se raportează pentru probe din produse alimentare cu niveluri maxime exprimate prin raportare la conținutul de grăsimi și cu o concentrație de grăsimi estimată în intervalul 0-2 % (în concordanță cu legislația existentă). Pentru alte probe, determinarea conținutului de lipide este opțională.

—

În cazul probelor suspectate a fi neconforme, raportul trebuie să includă o notă privind măsurile care urmează a fi adoptate. Concentrația de PCDD/F-uri și suma dintre PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor din probele cu niveluri ridicate trebuie determinată/confirmată printr-o metodă de confirmare.

—

Rezultatele neconforme se raportează numai în urma analizei de confirmare.

—

Rezultatul screeningului se exprimă cu termenii „conform” sau „suspectat a fi neconform” („suspectat”).

—

Pentru fiecare tip de matrice a probei, raportul menționează nivelul maxim sau nivelul de acțiune pe care se bazează evaluarea.

—

În plus, nivelurile de congeneri individuali ai PCDD/F-urilor și/sau ai PCB-urilor de tipul dioxinelor și valorile TEQ se pot furniza ca estimare inferioară, estimare superioară și estimare mediană. Rezultatele se exprimă în aceleași unități și prin (cel puțin) același număr de cifre semnificative ca și nivelurile maxime menționate în Regulamentul (CE) nr. 1881/2006.

—

Recuperările etaloanelor interne individuale trebuie să fie puse la dispoziție în cazul în care recuperările se situează în afara intervalului menționat la punctul 6.2, iar în celelalte cazuri, la cerere.

—

Raportul menționează și metoda GC-MS aplicată.

—

Raportul include și metoda utilizată pentru extracția PCDD/F-urilor, a PCB-urilor de tipul dioxinelor și a lipidelor. Conținutul de lipide al probei se determină și se raportează pentru probe din produse alimentare cu niveluri maxime exprimate prin raportare la conținutul de grăsimi și cu o concentrație de grăsimi estimată în intervalul 0-2 % (în concordanță cu legislația existentă). Pentru alte probe, determinarea conținutului de lipide este opțională.

—

În cazul probelor suspectate a fi neconforme, raportul trebuie să includă o notă privind măsurile care urmează a fi adoptate. Concentrația de PCDD/F-uri și suma dintre PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor din probele cu niveluri ridicate trebuie determinată/confirmată printr-o metodă de confirmare.

—

Neconformitatea poate fi decisă numai în urma analizei de confirmare.

—

Timpul de retenție relativ în raport cu etaloanele interne sau cu etaloanele de referință (deviație acceptabilă ± 0,25 %).

—

Separarea gaz-cromatografică a PCB-urilor care nu sunt de tipul dioxinelor de substanțele interferente, în special PCB-uri coeluante, mai ales în cazul în care nivelurile probelor sunt în limite legale și neconformitatea trebuie să fie confirmată (1).

—

Pentru tehnicile GC-MS:

—

Pentru GC-ECD:

Confirmarea rezultatelor care depășesc nivelul maxim cu două coloane de GC cu fază staționară cu o polaritate diferită.

—

Utilizarea de etaloane interne corespunzătoare, cu proprietăți fizico-chimice comparabile cu cele ale analiților de interes.

—

Adăugarea de etaloane interne:

—

Cerințe privind metodele care utilizează toți cei șase congeneri ai PCB-urilor care nu sunt de tipul dioxinelor marcați cu un izotop:

—

Cerințe privind metodele care nu utilizează toate cele șase etaloane interne marcate cu un izotop sau alte etaloane interne:

—

Recuperările congenerilor nemarcați se verifică prin probe îmbogățite sau probe pentru controlul calității cu concentrații în intervalul nivelului maxim. Recuperările acceptabile pentru acești congeneri sunt între 60 % și 120 %.

—

Rezultatele analitice cuprind nivelurile de congeneri individuali ai PCB-urilor care nu sunt de tipul dioxinelor și suma PCB-urilor care nu sunt de tipul dioxinelor, raportate ca estimare inferioară, estimare superioară și estimare mediană, pentru a include o cantitate maximă de informații în raportarea rezultatelor, ceea ce permite o interpretare a rezultatelor în conformitate cu cerințele specifice.

—

Raportul include și metoda utilizată pentru extracția PCB-urilor și a lipidelor. Conținutul de lipide al probei se determină și se raportează pentru probe din produse alimentare cu niveluri maxime exprimate prin raportare la conținutul de grăsimi și cu o concentrație de grăsimi estimată în intervalul 0-2 % (în concordanță cu legislația existentă). Pentru alte probe, determinarea conținutului de lipide este opțională.

—

Recuperările etaloanelor interne individuale trebuie să fie disponibile în cazul în care recuperările se situează în afara intervalului menționat la punctul 6 și în cazul în care nivelul maxim este depășit, iar în celelalte cazuri, la cerere.

—

Întrucât, atunci când se decide conformitatea unei probe, se ține seama de incertitudinea de măsurare extinsă, și parametrul respectiv trebuie să fie pus la dispoziție. De aceea, rezultatele analitice se raportează ca x ± U, unde x este rezultatul analitic și U este incertitudinea de măsurare extinsă, folosind un factor de acoperire 2, care conferă un nivel de încredere de aproximativ 95 %.

—

Rezultatele se exprimă în aceleași unități și prin același număr de cifre semnificative ca și nivelurile maxime prevăzute în Regulamentul (CE) nr. 1881/2006.