1)

In deel A wordt het volgende hoofdstuk toegevoegd:

„A.25   DISSOCIATIECONSTANTEN IN WATER (TITRATIEMETHODE — SPECTROFOTOMETRISCHE METHODE — CONDUCTOMETRISCHE METHODE)

INLEIDING

Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 112 (1981) van de OESO.

Voorwaarden

Begeleidende informatie

Kwalificerende opmerkingen

Standaarddocumenten

Deze testmethode is gebaseerd op methoden die worden genoemd in de referenties onder Literatuur, en op de Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notices van het EPA van 18 augustus 1978.

METHODE — INLEIDING, DOEL, TOEPASSINGSGEBIED, RELEVANTIE, TOEPASSING EN BEPERKINGEN VAN DE TEST

De dissociatie van een stof in water is van belang bij de beoordeling van het effect van de stof op het milieu. Zij bepaalt de vorm van de stof, die op zijn beurt het gedrag en transport van de stof bepaalt. Ze kan van invloed zijn op de adsorptie van de chemische stof op bodems en sedimenten en op de absorptie in biologische cellen.

Definities en eenheden

Dissociatie is de omkeerbare splitsing in twee of meer chemische vormen, die ionisch kunnen zijn. Het proces wordt doorgaans beschreven door

RX ⇌ R ++ X –

en de concentratie-evenwichtsconstante die de reactie bepaalt, is

Voorbeeld: in het bijzondere geval waarin R waterstof is (de stof is een zuur), is de constante gelijk aan

of

Referentiestoffen

Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof de volgende referentiestoffen te gebruiken. Ze worden vooral gegeven zodat de methode van tijd tot tijd kan worden geijkt en om de resultaten te kunnen vergelijken wanneer een andere methode wordt toegepast.

Het is nuttig een stof met meerdere pK's te hebben, zoals hieronder aangegeven in Principe van de testmethode. Een voorbeeld van een dergelijke stof is:

Principe van de testmethode

Het beschreven chemische proces is in het voor het milieu relevante temperatuurbereik doorgaans slechts beperkt van de temperatuur afhankelijk. Voor de bepaling van de dissociatieconstante is een meting van de concentraties van de gedissocieerde en niet-gedissocieerde vormen van de chemische stof nodig. Op basis van de kennis van de stoichiometrie van de dissociatiereactie zoals hierboven in Definities en eenheden vermeld, kan de juiste constante worden bepaald. In het bijzondere geval dat in deze testmethode wordt beschreven, gedraagt de stof zich als een zuur of een base, en de bepaling kan het gemakkelijkst geschieden door de relatieve concentraties van de geïoniseerde en niet-geïoniseerde vormen van de stof en de pH van de oplossing te bepalen. Het verband tussen deze termen wordt hierboven gegeven in de vergelijking voor pKa in Definities en eenheden. Sommige stoffen vertonen meer dan één dissociatieconstante, waarvoor vergelijkbare vergelijkingen kunnen worden opgesteld. Enkele van de hierin beschreven methoden zijn ook geschikt voor niet-zuur/base-dissociatie.

Kwaliteitscriteria

Herhaalbaarheid

De dissociatieconstante moet in duplo worden bepaald (minimaal drie bepalingen) tot op ± 0,1 log-eenheden.

BESCHRIJVING VAN DE TESTPROCEDURES

Er zijn twee basisbenaderingen om pKa te bepalen. Bij de ene wordt een bekende hoeveelheid van de stof getitreerd met standaardzuur of -base, naargelang het geval; bij de andere worden de relatieve concentratie van de geïoniseerde en niet-geïoniseerde vormen en de pH-afhankelijkheid daarvan bepaald.

Voorbereidingen

Op deze beginselen gebaseerde methoden kunnen worden ingedeeld als titratie-, spectrofotometrische en conductometrische procedures.

Testoplossingen

Voor de titratiemethode en conductometrische methode wordt de chemische stof opgelost in gedestilleerd water. Voor de spectrofotometrische en overige methoden worden bufferoplossingen gebruikt. De concentratie van de teststof mag niet hoger zijn dan het minimum van 0,01 M of, als dat lager is, de helft van de verzadigingsconcentratie, en bij het bereiden van de oplossingen wordt een zo zuiver mogelijke vorm van de stof gebruikt. Als de stof slechts matig oplosbaar is, kan zij vóór toevoeging aan de hierboven genoemde concentraties worden opgelost in een kleine hoeveelheid van een met water mengbaar oplosmiddel.

Oplossingen worden met een Tyndall-kegel gecontroleerd op de aanwezigheid van emulsies, vooral als er een co-oplosmiddel is gebruikt om de oplosbaarheid te vergroten. Wanneer bufferoplossingen worden gebruikt, mag de bufferconcentratie niet hoger zijn dan 0,05 M.

Testomstandigheden

Temperatuur

De temperatuur wordt geregeld tot op ± 1 °C of beter. De bepaling vindt bij voorkeur plaats bij 20 °C.

Als een aanzienlijke temperatuurafhankelijkheid wordt vermoed, vindt de bepaling ook plaats bij ten minste twee andere temperaturen. De temperatuurintervallen zijn in dit geval 10 °C en de temperatuur wordt geregeld tot op ± 0,1 °C.

Analyses

De methode wordt bepaald door de aard van de stof die wordt getest. Zij moet voldoende gevoelig zijn om de verschillende vormen bij elke concentratie van de testoplossing te kunnen bepalen.

Uitvoering van de test

Titratiemethode

De testoplossing wordt bepaald door titratie met de basische of zure standaardoplossing, naargelang hetgeen van toepassing is, waarbij na elke toevoeging van titrant de pH wordt gemeten. Er moeten ten minste 10 incrementele toevoegingen plaatsvinden vóór het equivalentiepunt. Als het evenwicht voldoende snel wordt bereikt, mag een registrerende potentiometer worden gebruikt. Voor deze methode moeten zowel de totale hoeveelheid van de stof als haar concentratie nauwkeurig bekend zijn. Er moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen om koolstofdioxide uit te sluiten. Gedetailleerde gegevens van de procedure, voorzorgen en berekeningswijze worden gegeven in standaardtesten, bv. referenties (1), (2), (3) en (4).

Spectrofotometrische methode

Er wordt een golflengte gevonden waarbij de geïoniseerde en niet-geïoniseerde vormen van de stof aanmerkelijk verschillende extinctiecoëfficiënten hebben,. Het absorptiespectrum in uv/zichtbaar licht wordt verkregen van oplossingen met een constante concentratie bij pH's waarbij de stof hoofdzakelijk niet-geïoniseerd, dan wel volledig geïoniseerd, is en bij meerdere tussenliggende pH's. Dit kan worden gedaan hetzij door porties geconcentreerd(e) zuur (base) toe te voegen aan een relatief groot volume van een oplossing van de stof in een uit meerdere componenten bestaande buffer, in eerste instantie bij een hoge (lage) pH (referentie 5), of door gelijke volumes van een voorraadoplossing van de stof in bv. water of methanol toe te voegen aan constante volumes van verschillende bufferoplossingen die het gewenste pH-bereik bestrijken. Uit de pH- en extinctiewaarden bij de gekozen golflengte wordt een voldoende aantal waarden voor de pKa berekend met behulp van gegevens van ten minste 5 pH's waarbij de stof voor ten minste 10 procent en minder dan 90 procent is geïoniseerd. Nadere experimentele gegevens en de berekeningswijze zijn te vinden in referentie (1).

Conductometrische methode

Met behulp van een cel met een kleine, bekende celconstante wordt de geleidbaarheid van een ongeveer 0,1 M-oplossing van de stof in conductometrisch zuiver water gemeten. De geleidbaarheid van een aantal nauwkeurig gemaakte verdunningen van deze oplossing wordt ook gemeten. De concentratie wordt elke keer gehalveerd, en de reeks bestrijkt in concentratie ten minste een orde van grootte. De uiterste geleidbaarheid bij oneindige verdunning wordt gevonden door een vergelijkbaar experiment uit te voeren met het Na-zout en te extrapoleren. De mate van dissociatie kan dan met de Onsager-vergelijking worden berekend uit de geleidbaarheid van elk van de oplossingen, en daarna kan met de verdunningswet van Ostwald de dissociatieconstante worden berekend als K = α2C/(1 – α), waarin C de concentratie in mol per liter is en α de gedissocieerde fractie is. Er moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen om CO2 uit te sluiten. Nadere experimentele details en de berekeningswijze worden gegeven in standaardteksten en in de referenties (1), (6) en (7).

GEGEVENS EN RAPPORTAGE

Verwerking van de resultaten

Titratiemethode

De pKa wordt berekend voor 10 gemeten punten op de titratiecurve. Het gemiddelde en de standaardafwijking van deze pKa-waarden worden berekend. Een grafiek van de pH uitgezet tegen het volume van de standaardbase of het standaardzuur wordt vermeld, tezamen met een weergave in tabelvorm.

Spectrofotometrische methoden

Er wordt een tabel gemaakt met de extinctie en pH voor elk spectrum. Er worden ten minste vijf waarden voor de pKa berekend uit de tussenliggende spectrumgegevenspunten, en ook het gemiddelde en de standaardafwijking van deze resultaten worden berekend.

Conductometrische methode

De equivalente geleidbaarheid Λ wordt berekend voor elke concentratie van het zuur en voor elke concentratie van een mengsel van één equivalent zuur plus 0,98 equivalent carbonaatvrij natriumhydroxide. Het zuur is in overmaat om een overmaat aan OH– als gevolg van hydrolyse te voorkomen. 1/Λ wordt in een grafiek uitgezet tegen √C, en Λo van het zout wordt gevonden door extrapolatie naar een concentratie van nul.

Λo van het zuur kan worden berekend met behulp van waarden uit de literatuur voor H+ en Na+. De pKa kan worden berekend uit α = Λi /Λo en Ka = α2C/(1 – α) voor elke concentratie. Door te corrigeren voor mobiliteit en activiteit kunnen betere waarden voor Ka worden verkregen. Het gemiddelde en de standaardafwijking van de pKa-waarden moeten worden berekend.

Testverslag

Alle ruwe gegevens en berekende pKa-waarden worden ingediend met de berekeningsmethode (bij voorkeur in tabelvorm, zoals voorgesteld in referentie (1)) en de hierboven beschreven statistische parameters. Voor titratiemethoden worden de details van de standaardisatie van de titranten vermeld.

Voor de spectrofotometrische methode worden alle spectra ingediend. Voor de conductometrische methode worden de details van de bepaling van de celconstante gerapporteerd. Er wordt informatie verstrekt over de gebruikte techniek, analysemethoden en de aard van de eventueel gebruikte buffers.

De testtemperatu(u)r(en) worden gerapporteerd.

LITERATUUR

2)

In deel B wordt hoofdstuk B.5 vervangen door:

„B.5   ACUTE OOGIRRITATIE/-CORROSIE

INLEIDING

Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 405 (2012) van de OESO. De testrichtlijnen van de OESO voor het testen van chemische stoffen worden periodiek herzien om te waarborgen dat ze de beste wetenschappelijke methoden weerspiegelen. Bij eerdere herzieningen van deze testrichtlijn is bijzondere aandacht besteed aan mogelijke verbeteringen via de evaluatie van alle bestaande informatie over de teststof om onnodige tests bij proefdieren te vermijden en zodoende rekening te houden met de bezorgdheid omtrent het welzijn van dieren. In TG 405 (vastgesteld in 1981 en bijgewerkt in 1987, 2002 en 2012) is de aanbeveling opgenomen de bestaande relevante gegevens op bewijskracht te analyseren (1), alvorens de beschreven in-vivotest op acute oogirritatie/-corrosie wordt uitgevoerd. Wanneer er onvoldoende gegevens beschikbaar zijn, wordt aanbevolen deze aan te vullen door een sequentiële teststrategie te volgen (2) (3). De aanbevolen teststrategie omvat de uitvoering van gevalideerde en erkende in-vitrotests en is als supplement bij deze methode opgenomen. Voor de toepassing van Verordening (EG) nr. 1907/2006 inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH) (2) is in het relevante ECHA-richtsnoer (21) ook een geïntegreerde teststrategie opgenomen. Dierproeven mogen uitsluitend worden uitgevoerd als ze noodzakelijk worden geacht, nadat eerst de beschikbare alternatieve methoden zijn overwogen, en het gebruik ervan passend wordt geacht. Ten tijde van het opstellen van deze bijgewerkte testmethode zijn er gevallen bekend waarin het gebruik van deze testmethode hoe dan ook noodzakelijk is of vereist is uit hoofde van bepaalde regelgevingskaders.

De laatste bijwerking richtte zich vooral op het gebruik van analgetica en anesthetica en was niet van invloed op het basisconcept en de structuur van de testrichtlijn. ICCVAM (3) en een onafhankelijk internationaal wetenschappelijk peer review panel heeft de bruikbaarheid en de beperkingen van het routinematig gebruik van lokale anesthetica, systemische analgetica en humane eindpunten tijdens in-vivotests betreffende de veiligheid ten aanzien van oogirritatie (12) beoordeeld. De beoordeling leidde tot de conclusie dat het gebruik van lokale anesthetica en systemische analgetica pijn en nood grotendeels of volledig kan voorkomen zonder dat het de uitkomst van de test beïnvloedt, en tot de aanbeveling om deze stoffen altijd te gebruiken. Deze testmethode houdt rekening met deze beoordeling. Lokale anesthetica, systemische analgetica en humane eindpunten moeten routinematig worden gebruikt tijdens het uitvoeren van in-vivotests op acute oogirritatie/-corrosie. Uitzonderingen op hun gebruik moeten worden gemotiveerd. De in deze methode beschreven verfijningen zullen pijn en nood bij dieren in de meeste testsituaties waarbij in-vivotests op de veiligheid voor ogen nog noodzakelijk zijn, aanzienlijk verminderen of voorkomen.

Evenwichtige preventieve pijnbestrijding moet omvatten: i) routinematige voorbehandeling met een lokaal anestheticum (bv. proparacaïne of tetracaïne) en een systemische analgeticum (bv. buprenorfine), ii) schema voor routinematige nabehandeling met systemische analgetica (bv. buprenorfine en meloxicam), iii) geplande observatie, monitoring en registratie van dieren voor wat betreft klinische tekenen van pijn en/of nood, en iv) geplande observatie, monitoring en registratie van de aard, ernst en progressie van alle oogverwondingen. Verdere details zijn te vinden in de hieronder beschreven bijgewerkte procedures. Na toediening van de teststof mogen geen aanvullende lokale anesthetica of analgetica worden toegepast, om verstoring van het onderzoek te vermijden. Analgetica met ontstekingsremmende activiteit (bv. meloxicam) mogen niet lokaal worden toegepast, en de systemisch gebruikte doses mogen effecten op het oog niet verstoren.

De definities zijn opgenomen in het aanhangsel bij deze testmethode.

INLEIDENDE OVERWEGINGEN

In het belang van zowel wetenschappelijke kwaliteit als het dierenwelzijn mogen in-vivotests pas worden overwogen nadat alle beschikbare gegevens over de mogelijke oogcorrosie/-irritatie door de chemische stof zijn geëvalueerd op bewijskracht. Hierbij gaat het bijvoorbeeld om de resultaten van eerdere studies bij mensen en/of proefdieren, gegevens over oogcorrosie/irritatie door een of meer qua structuur verwante stoffen of mengsels van dergelijke stoffen, gegevens waaruit blijkt dat de chemische stof sterk zuur of sterk alkalisch is (4) (5), en resultaten van gevalideerde en erkende in-vitro- of ex-vivotests op huidcorrosie en oogcorrosie/-irritatie (6) (13) (14) (15) (16) (17). De studies kunnen al vóór de bewijskrachtanalyse zijn uitgevoerd, maar dit kan ook naar aanleiding van deze analyse gebeuren.

Voor bepaalde chemische stoffen kan uit een dergelijke analyse blijken dat er een in-vivo-onderzoek naar een mogelijke oogcorrosie/-irritatie door de chemische stof nodig is. In al dergelijke gevallen wordt bij voorkeur, voordat wordt overwogen om de in-vivo-oogtest te gebruiken, eerst een onderzoek naar de in vitro en/of in vivo corrosieve effecten van de chemische stof op de huid uitgevoerd en geëvalueerd in overeenstemming met de sequentiële teststrategie in testmethode B.4 (7) of de geïntegreerde teststrategie beschreven in ECHA-richtsnoer (21).

Een sequentiële teststrategie, waarin de uitvoering van gevalideerde in-vitro- of ex-vivotests op oogcorrosie/-irritatie is opgenomen, is als supplement bij deze testmethode en, voor de toepassing van REACH, in ECHA-richtsnoer (21) opgenomen. Aanbevolen wordt om een dergelijke teststrategie te volgen alvorens in-vivotests uit te voeren. Voor nieuwe chemische stoffen wordt een stapsgewijze testbenadering aanbevolen om wetenschappelijk verantwoorde gegevens over corrosie/-irritatie door de chemische stof te verkrijgen. Wanneer er voor bestaande chemische stoffen onvoldoende gegevens over de huid- en oogcorrosie/-irritatie beschikbaar zijn, kan de strategie worden gebruikt om ontbrekende gegevens aan te vullen. Voor het gebruik van een andere teststrategie of -procedure of de beslissing om geen stapsgewijze testbenadering te volgen moet een motivering worden gegeven.

PRINCIPE VAN DE IN-VIVOTEST

Na voorbehandeling met een systemisch analgeticum en inductie van passende lokale anesthetica, wordt de te testen chemische stof in één dosis aangebracht op een van de ogen van het proefdier; het onbehandelde oog dient als controle. De mate van oogirritatie/-corrosie wordt geëvalueerd door op bepaalde tijdstippen het letsel aan de conjunctiva, de cornea en de iris in te schalen. Ook andere effecten in het oog en schadelijke systemische effecten worden beschreven om een volledige evaluatie van de effecten mogelijk te maken. De duur van de studie moet voldoende zijn om te kunnen beoordelen of de effecten reversibel of irreversibel van aard zijn.

Dieren die in enig stadium van de test blijk geven van ernstige nood en/of hevige pijn of letsel vertonen dat overeenkomt met de in deze testmethode beschreven humane eindpunten (zie punt 26), worden op humane wijze gedood en de chemische stof wordt dienovereenkomstig beoordeeld. Criteria voor de beslissing om stervende en hevig lijdende dieren op humane wijze te doden zijn te vinden in een richtlijn van de OESO (8).

VOORBEREIDING VAN DE IN-VIVOTEST

Keuze van de diersoort

Als proefdier wordt de voorkeur gegeven aan het albinokonijn, en er worden gezonde jonge volwassen dieren gebruikt. Wanneer er een andere stam of soort wordt gebruikt, moet hiervoor een motivering worden gegeven.

Voorbereiding van de dieren

Beide ogen van ieder voorlopig voor de test geselecteerd proefdier worden binnen 24 uur vóór het begin van de test onderzocht. Dieren die aan oogirritatie, oogaandoeningen of een reeds bestaand cornealetsel lijden, mogen niet worden gebruikt.

Huisvestings- en voedingsomstandigheden

De dieren worden in aparte kooien gehuisvest. De temperatuur in de proefdierruimte dient voor konijnen 20 °C (± 3 °C) te zijn. De relatieve luchtvochtigheid moet ten minste 30 % zijn en (behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte) bij voorkeur niet hoger dan 70 % zijn, maar er moet worden gestreefd naar 50-60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. Een buitensporig hoge lichtintensiteit moet worden vermeden. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater.

TESTPROCEDURE

Gebruik van lokale anesthetica en systemische analgetica

De volgende procedures worden aanbevolen om pijn en nood in procedures voor tests betreffende de veiligheid voor de ogen te vermijden of tot een minimum te beperken. In plaats daarvan mogen ook alternatieve procedures worden gebruikt waarvan is vastgesteld dat zij pijn en nood even goed of beter voorkomen of verminderen.

Aanbrenging van de teststof

De teststof wordt bij elk dier aangebracht in de conjunctivaalzak van één oog, waarbij het onderste ooglid voorzichtig van de oogbol wordt weggetrokken. Vervolgens worden de oogleden ongeveer één seconde zachtjes dichtgehouden om verlies van het materiaal te voorkomen. Het andere oog, dat niet behandeld wordt, fungeert als controle.

Irrigatie

De ogen van de proefdieren mogen gedurende ten minste 24 uur na het indruppelen van de teststof niet worden uitgewassen, tenzij het om een vaste stof gaat (zie punt 18) of wanneer er sprake is van onmiddellijke corrosieve of irriterende effecten. Na 24 uur mogen de ogen eventueel worden uitgewassen.

Het gebruik van een satellietgroep om de invloed van het uitwassen te onderzoeken wordt niet aanbevolen, tenzij dit wetenschappelijk verantwoord is. Als er een satellietgroep nodig is, dienen hiervoor twee konijnen te worden gebruikt. De omstandigheden van het uitwassen worden zorgvuldig gedocumenteerd, bv. het tijdstip van uitwassen, de samenstelling en temperatuur van de uitwasoplossing, en duur, volume en snelheid van aanbrenging.

Dosisniveau

(1)   Vloeibare teststoffen

Bij vloeibare teststoffen wordt een dosis van 0,1 ml gebruikt. Er mogen geen sproeipompjes worden gebruikt om de chemische stof rechtstreeks in het oog te brengen. De vloeistof wordt na het sproeien opgevangen en vervolgens wordt 0,1 ml in het oog gedruppeld.

(2)   Vaste teststoffen

Bij het testen van vaste stoffen, pasta's en vaste deeltjes wordt een hoeveelheid met een volume van 0,1 ml of een gewicht van ten hoogste 100 mg gebruikt. De teststof wordt tot een fijn poeder vermalen. Alvorens het volume te meten wordt het vaste materiaal licht ingeklonken, bijvoorbeeld door tegen de houder te tikken. Als de vaste chemische stof op het eerste observatietijdstip (1 uur na de behandeling) nog niet door fysiologische mechanismen uit het oog van het proefdier is verwijderd, kan het oog met fysiologisch zout of gedestilleerd water worden uitgewassen.

(3)   Aerosol-teststoffen

Aanbevolen wordt alle sproeivloeistoffen en aerosolen op te vangen voordat ze in het oog worden gedruppeld. Er wordt alleen een uitzondering gemaakt voor chemische stoffen in spuitbussen onder druk, die niet kunnen worden opgevangen omdat ze verdampen. In deze gevallen wordt het oog opengehouden en wordt de teststof aan het oog toegediend door in één keer gedurende ongeveer één seconde vanaf een afstand van 10 cm recht voor het oog te spuiten. Deze afstand kan afhankelijk van de druk van de nevel en de inhoud worden aangepast. Er moet voor worden gezorgd dat het oog niet door de druk van de nevel wordt beschadigd. In bepaalde gevallen kan het nodig zijn na te gaan of een “mechanische” beschadiging van het oog door de druk van de nevel mogelijk is.

De dosis uit een spuitbus kan door een simulatie als volgt worden geraamd: de chemische stof wordt door een opening die zo groot is als het oog van een konijn en recht voor het papier wordt gehouden, op een weegpapiertje gespoten. De gewichtstoename van het papier wordt gebruikt voor een benadering van de hoeveelheid die in het oog wordt gespoten. Bij vluchtige stoffen kan de dosis worden geraamd door een opvangbakje voor en na de verwijdering van de teststof te wegen.

Voorlopige test (in-vivotest op oogirritatie/-corrosie met één dier)

Het is zeer wenselijk dat de in-vivotest in eerste instantie met één dier wordt uitgevoerd (zie het supplement bij deze testmethode: Een sequentiële teststrategie voor oogirritatie en -corrosie). Op basis van observaties moet het mogelijk zijn de ernst en reversibiliteit vast te stellen voordat verder wordt gegaan naar een bevestigende test bij een tweede dier.

Als de resultaten van deze test erop wijzen dat de chemische stof bij gebruik van de beschreven procedure corrosief of hevig irriterend is voor het oog, dienen er geen verdere tests op oogirritatie te worden uitgevoerd.

Bevestigende test (in-vivotest op oogirritatie met meer dieren)

Als er bij de voorlopige test geen corrosiereactie of hevige irritatie wordt waargenomen, moet de irritatie of negatieve reactie worden bevestigd met nog eens twee dieren. Als er bij de voorlopige test hevige irritatie wordt waargenomen, wordt aanbevolen de bevestigende test op sequentiële wijze bij één dier tegelijk uit te voeren en de twee andere dieren niet tegelijkertijd bloot te stellen. Als er bij het tweede dier corrosieve of hevig irriterende effecten optreden, wordt de test niet voortgezet. Als de resultaten van het tweede dier voldoende zijn om een gevarenindeling te maken, dienen geen verdere test te worden uitgevoerd.

Observatieperiode

De duur van de observatieperiode moet voldoende zijn om de omvang en de reversibiliteit van de waargenomen effecten volledig te kunnen beoordelen. Het experiment moet echter worden beëindigd zodra het dier tekenen van hevige pijn of ernstige nood vertoont (8). Om te bepalen of de effecten reversibel zijn, moeten de dieren normaal gesproken gedurende 21 dagen na de toediening van de teststof worden geobserveerd. Als al vóór het verstrijken van de 21 dagen wordt geconstateerd dat de effecten reversibel zijn, wordt het experiment op dat moment beëindigd.

Klinische observatie en inschaling van de oogreacties

De ogen worden één uur na TCA, en daarna ten minste dagelijks, uitvoerig beoordeeld op de aanwezigheid of afwezigheid van oogletsels. Dieren worden in de eerste 3 dagen meerdere keren per dag beoordeeld om ervoor te zorgen dat besluiten tot beëindiging tijdig worden genomen. Proefdieren worden gedurende de hele duur van de studie routinematig beoordeeld op klinische tekenen van pijn en/of nood (bv. herhaald krabben of wrijven van de ogen, buitensporig knipperen, buitensporig tranen) (9) (10) (11), ten minste tweemaal daags, met een minimum van 6 uur tussen de observaties, of vaker, indien nodig. Dit is nodig om i) dieren adequaat te beoordelen op tekenen van pijn en nood, teneinde onderbouwde beslissingen te kunnen nemen over de noodzaak om de dosering van analgetica te verhogen, en ii) dieren te beoordelen op tekenen van vastgestelde humane eindpunten, om onderbouwde beslissingen te kunnen nemen over de vraag of het aangewezen is om dieren op humane wijze te doden, en ervoor te zorgen dat dergelijke beslissingen tijdig worden genomen. Fluoresceïnekleuring wordt routinematig toegepast, en er wordt een spleetlampbiomicroscoop gebruikt wanneer dit passend wordt geacht (bv. beoordeling van de diepte van een verwonding bij ulceratie van de cornea) als hulpmiddel bij de detectie en meting van oogbeschadigingen, en om te beoordelen of is voldaan aan vastgestelde eindpuntcriteria voor humane euthanasie. Digitale foto's van waargenomen letsels kunnen worden verzameld als referentie en om een permanent dossier van de omvang van oogschade op te bouwen. De dieren worden niet langer dan nodig voor de test ingezet zodra er definitieve informatie is verkregen. Dieren die tekenen van hevige pijn of ernstige nood vertonen, worden onverwijld op humane wijze gedood en de chemische stof wordt dienovereenkomstig beoordeeld.

Dieren die na de indruppeling de volgende oogletsels ontwikkelen, worden op humane wijze gedood (zie tabel 1 voor een beschrijving van de klassen oogletsel): perforatie van de cornea, significante ulceratie van de cornea en stafyloom; bloed in de voorste oogkamer; klasse 4 troebelheid van de cornea; afwezigheid van een lichtreflex (iris-reactie klasse 2) die gedurende 72 uur aanhoudt; ulceratie van de conjunctivae; necrose van de conjunctivae of het knipvlies; of loslatend dood weefsel. De reden hiervoor is dat dergelijk oogletsel doorgaans niet reversibel is. Het wordt tevens aanbevolen de volgende oogletsels te gebruiken als humane eindpunten om studies vóór het einde van de geplande observatieperiode van 21 dagen te beëindigen. Deze oogletsels worden beschouwd als een voorteken van hevige irritatie of corrosie en verwondingen waarvan niet wordt verwacht dat ze vóór het einde van de observatieperiode van 21 dagen volledig zijn hersteld: grote diepte van verwonding (bv. ulceratie van de cornea die dieper gaat dan de oppervlakkige lagen van het stroma), destructie van de limbus > 50 % (blijkend uit bleking van het ooglidweefsel), en ernstige ooginfectie (afscheiding van pus). Een combinatie van: vascularisatie van het corneale oppervlak (d.w.z. pannus); geen afname van de oppervlakte van fluoresceïneverkleuring in de loop van de tijd op basis van een dagelijkse beoordeling; en/of het ontbreken van re-epithelisatie 5 dagen na aanbrenging van de teststof kunnen ook worden overwogen als potentieel bruikbare criteria die van invloed zijn op het klinische besluit om de studie vroegtijdig te beëindigen. Deze bevindingen afzonderlijk zijn echter onvoldoende om vroegtijdige beëindiging van de studie te rechtvaardigen. Wanneer eenmaal ernstige oogeffecten zijn vastgesteld, dient een behandelend of gekwalificeerd dierenarts met deskundigheid op het gebied van proefdieren of personeel dat is opgeleid om klinisch letsel vast te stellen, te worden geraadpleegd voor een klinisch onderzoek om te bepalen of de combinatie van deze effecten vroegtijdige beëindiging van de studie rechtvaardigt. De score van de oogreactie (conjunctivae, cornea en iris) wordt verkregen en geregistreerd op 1, 24, 48 en 72 uur na aanbrenging van de teststof (zie tabel 1). Wanneer de dieren geen oogletsel ontwikkelen, ag de test niet eerder dan 3 dagen na de indruppeling worden beëindigd. Dieren met oogletsel dat niet ernstig is, moeten worden geobserveerd tot het letsel verdwijnt of gedurende 21 dagen; op dat tijdstip wordt de test dan afgesloten. Observaties moeten ten minste bij 1 uur, 24 uur, 48 uur, 72 uur, 7 dagen, 14 dagen en 21 dagen plaatsvinden en worden opgetekend om de toestand van de letsels en de reversibiliteit of irreversibileit ervan vast te stellen. Frequentere observaties moeten plaatsvinden als dit nodig is om vast te stellen of het proefdier uit humane overwegingen moet worden geëuthanaseerd of vanwege negatieve resultaten uit de studie moet worden verwijderd.

Bij ieder onderzoek moeten de oogletsels (tabel 1) worden beoordeeld en opgetekend. Ook andere effecten in het oog (bv. pannus, verkleuring, veranderingen in de voorste kamer) en schadelijke systemische effecten worden gerapporteerd.

Het onderzoek van de reacties kan worden vergemakkelijkt met behulp van een binoculaire loep, een hand-spleetlamp, een biomicroscoop of andere geschikte instrumenten. Na de registratie van de observaties na 24 uur kunnen de ogen nader worden onderzocht met behulp van fluoresceïne.

De inschaling van oogreacties is per definitie subjectief. Om harmonisatie bij de inschaling van oogreacties te bevorderen en ter ondersteuning van de testlaboratoria en de personen die bij het uitvoeren en het interpreteren van de observatie betrokken zijn, moet het personeel dat de observatie uitvoert afdoende zijn opgeleid in het gebruikte scoringsysteem.

GEGEVENS EN RAPPORTAGE

Evaluatie van de resultaten

De scores voor de oogirritatie worden in samenhang met de aard en ernst van het letsel en de vraag of dit al dan niet reversibel is, beoordeeld. De individuele scores vormen geen absolute norm voor de irriterende eigenschappen van een chemische stof, aangezien ook andere effecten van de teststof worden beoordeeld. De individuele scores moeten veeleer als referentiewaarden worden beschouwd en zijn alleen zinvol wanneer ze worden ondersteund door een volledige beschrijving en evaluatie van alle observaties.

Testverslag

In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

Interpretatie van de resultaten

Een extrapolatie van de resultaten van het onderzoek naar oogirritatie bij proefdieren naar de mens heeft slechts een beperkte geldigheid. In veel gevallen is het albinokonijn gevoeliger voor stoffen die oogirritatie of -corrosie veroorzaken dan de mens.

Bij de interpretatie van de resultaten moet ervoor worden gezorgd dat irritatie ten gevolge van secundaire infectie wordt uitgesloten.

LITERATUUR

Tabel 1

Inschaling van het oogletsel

SUPPLEMENT BIJ TESTMETHODE B.5  (4)

EEN SEQUENTIËLE TESTSTRATEGIE VOOR OOGIRRITATIE EN -CORROSIE

Algemene overwegingen

In het belang van verantwoorde wetenschap en het welzijn van dieren is het belangrijk dat het onnodig gebruik van dieren wordt vermeden en dat tests waarvan hevige reacties bij dieren worden verwacht, tot een minimum worden beperkt. Alle informatie over een chemische stof die relevant is voor de mogelijke oogirritatie/corrosie door die stof moet worden geëvalueerd voordat een in-vivotest wordt overwogen. Wellicht bestaat er al voldoende bewijsmateriaal om een teststof qua mogelijke oogirritatie of -corrosie in te delen zonder dat er tests bij proefdieren behoeven te worden uitgevoerd. Daarom zal het gebruik van een bewijskrachtanalyse en een sequentiële teststrategie de noodzaak van in-vivotests tot een minimum beperken, vooral als er van de chemische stof hevige reacties worden verwacht.

Er wordt aanbevolen dat een bewijskrachtanalyse wordt gebruikt om bestaande informatie over oogirritatie en -corrosie door chemische stoffen te evalueren en om te bepalen of ander aanvullend onderzoek dan in-vivo-oogonderzoek moet worden uitgevoerd om te helpen bij de bepaling van deze mogelijke effecten. Wanneer nader onderzoek nodig is, wordt aanbevolen de sequentiële teststrategie te gebruiken om de relevante experimentele gegevens te verkrijgen. Voor stoffen die nog niet zijn getest, moet de sequentiële teststrategie worden gebruikt om de gegevens te vergaren die nodig zijn om de oogcorrosie/-irritatie te bepalen. De voorlopige-teststrategie die in dit supplement wordt beschreven, werd in een OESO-workshop ontwikkeld (1). Later is zij bevestigd en opgenomen in het „Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances”, die de steun heeft gekregen van de 28e gezamenlijke vergadering van het Comité chemische stoffen en de Werkgroep chemische stoffen in november 1998 (2), en in 2011 is bijgewerkt door een deskundigengroep van de OESO.

Hoewel deze teststrategie geen integrerend onderdeel van testmethode B.5 is, vormt zij de aanbevolen aanpak voor de bepaling van de eigenschappen qua oogirritatie/-corrosie. Deze aanpak houdt zowel een optimale gedragscode als een ethische referentie voor in-vivotests op oogirritatie/-corrosie in. De testmethode bevat een leidraad voor de uitvoering van de in-vivotest en geeft een overzicht van de factoren die vóór het overwegen van een dergelijke test in aanmerking moeten worden genomen. De sequentiële teststrategie levert een bewijskrachtbenadering voor de evaluatie van bestaande gegevens over de eigenschappen van chemische stoffen inzake oogirritatie/-corrosie en een trapsgewijze aanpak voor het vergaren van relevante gegevens over chemische stoffen waarvoor nader onderzoek nodig is of waarvoor nog geen onderzoek is uitgevoerd. De strategie omvat de uitvoering eerst van gevalideerde en erkende in-vitro- of ex-vivotests en daarna van testmethode B.4-onderzoeken onder specifieke omstandigheden (3) (4).

Beschrijving van de stapsgewijze teststrategie

Alvorens te beginnen met tests als onderdeel van de sequentiële teststrategie (zie figuur), moet alle beschikbare informatie worden geëvalueerd om te bepalen of in-vivo-oogonderzoek nodig is. Hoewel de evaluatie van individuele parameters (bv. een extreme pH) significante informatie kan opleveren, moet alle bestaande informatie worden geëvalueerd. Alle relevante gegevens over de effecten van de betrokken chemische stof en de qua structuur analoge verbindingen moeten bij het nemen van een beslissing over de bewijskracht worden geëvalueerd en er moet een motivering voor de beslissing worden gegeven. De nadruk moet in eerste instantie liggen op bestaande gegevens over de effecten van de chemische stof bij mens en dier en vervolgens op de resultaten van in-vitro- of ex-vivotests. Waar mogelijk moet in-vivo-onderzoek aan corrosieve chemische stoffen worden vermeden. Bij de teststrategie spelen de volgende factoren een rol:

TEST- EN EVALUATIESTRATEGIE VOOR OOGIRRITATIE/-CORROSIE

LITERATUUR

3)

In deel B wordt hoofdstuk B.10 vervangen door:

„B.10   In-vitrotest op chromosoomafwijkingen in zoogdieren

INLEIDING

Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 473 (2016) van de OESO. Zij maakt deel uit van een reeks testmethoden op het gebied van de genetische toxicologie. Er is een OESO-document opgesteld met beknopte informatie over genetisch-toxicologische tests en een overzicht van de recente wijzigingen van deze testrichtlijnen (1).

De in-vitrotest op chromosoomafwijkingen is bedoeld om te bepalen welke chemische stoffen structurele chromosoomafwijkingen bij gekweekte cellen van zoogdieren veroorzaken (2) (3) (4). Er zijn twee soorten structurele afwijkingen: het chromosoomtype en het chromatidetype. Polyploïdie (met inbegrip van endoreduplicatie) kan optreden in bepalingen van chromosoomafwijkingen in vitro. Hoewel aneugenen polyploïdie kunnen induceren, wijst polyploïdie alleen niet op een aneugeen potentieel en kan het ook wijzen op een verstoring van de celcyclus of op cytotoxiciteit (5). Deze test is niet bedoeld voor het meten van aneuploïdie. Voor de opsporing van aneuploïdie wordt een in-vitromicronucleustest (6) aanbevolen.

Bij de in-vitrotest op chromosoomafwijkingen kunnen culturen van permanente cellijnen of primaire celculturen van humane of knaagdierenoorsprong worden gebruikt. De gebruikte cellen moeten worden geselecteerd op basis van het groeivermogen in een cultuur, de stabiliteit van het karyotype (met inbegrip van het aantal chromosomen) en de frequentie van spontane chromosoomafwijkingen (7). Momenteel kunnen op basis van de beschikbare gegevens geen harde aanbevelingen worden gedaan, maar de gegevens wijzen erop dat het belangrijk is om bij de beoordeling van chemische gevaren rekening te houden met de p53-status, de genetische (karyotype) stabiliteit, het herstellend vermogen van het DNA en de oorsprong (knaagdier versus mens) van de voor de test geselecteerde cellen. De gebruikers van deze testmethode worden dan ook aangemoedigd om rekening te houden met de invloed van deze en andere celkenmerken op de prestaties van een cellijn bij het opsporen van de inductie van chromosoomafwijkingen, aangezien de kennis op dit gebied voortschrijdt.

Gebruikte definities worden gegeven in aanhangsel 1.

INLEIDENDE OVERWEGINGEN EN BEPERKINGEN

Bij in vitro uitgevoerde tests moet er meestal een exogene metabole activeringsbron worden gebruikt, tenzij de cellen qua metabolisme competent zijn met betrekking tot de teststoffen. Het exogene metabole activeringssysteem kan de omstandigheden in vivo niet volledig nabootsen. Omstandigheden die zouden kunnen leiden tot artefactuele positieve resultaten, dat wil zeggen, chromosoombeschadiging niet veroorzaakt door directe interactie tussen de teststoffen en chromosomen, moeten worden vermeden. Zulke omstandigheden zijn onder andere veranderingen in de pH of de osmolaliteit (8) (9) (10), interactie met de bestanddelen van het medium (11) (12) of een sterke cytotoxiciteit (13) (14) (15) (16).

Deze test wordt gebruikt voor het opsporen van chromosoomafwijkingen die het gevolg kunnen zijn van clastogene gebeurtenissen. De analyse van de inductie van chromosoomafwijkingen geschiedt met behulp van cellen in de metafase. Het is dus van groot belang dat cellen het stadium van mitose bereiken, zowel in behandelde als in onbehandelde culturen. Voor gefabriceerde nanomaterialen kunnen specifieke aanpassingen van deze testmethode noodzakelijk zijn, maar deze worden in deze testmethode niet beschreven.

Voordat de testmethode wordt gebruikt op een mengsel om gegevens te genereren voor een beoogd regelgevingsdoel, moet worden nagegaan of, en zo ja, waarom deze methode betrouwbare resultaten oplevert voor dat doel. Zulke overwegingen zijn niet nodig wanneer het testen van het mengsel wettelijk vereist is.

PRINCIPE VAN DE TEST

Culturen van menselijke cellen of andere zoogdiercellen worden blootgesteld aan de teststof met en zonder een exogene metabole activeringsbron, tenzij cellen met een toereikende metaboliseringscapaciteit worden gebruikt (zie punt 13). Op vooraf bepaalde tijdstippen na de blootstelling van de celculturen aan de teststof worden ze met een metafasestopper (bv. colcemid of colchicine) behandeld, geoogst en gekleurd en worden de cellen in de metafase microscopisch onderzocht op de aanwezigheid van afwijkingen in het chromatidetype of het chromosoomtype.

BESCHRIJVING VAN DE METHODE

Voorbereidingen

Cellen

Er kan een verscheidenheid aan cellijnen (bv. ovariumcellen van de Chinese hamster (CHO), longcellen van de Chinese hamster V79, longcellen van de Chinese hamster (CHL)/IU, TK6) of primaire cellen, met inbegrip van lymfocyten uit perifeer bloed van de mens of andere zoogdieren, worden gebruikt (7). Voor de keuze van de gebruikte cellijnen moet een wetenschappelijke verantwoording worden gegeven. Wanneer primaire cellen worden gebruikt moet met het oog op het dierenwelzijn worden overwogen om waar mogelijk primaire cellen van menselijke oorsprong te gebruiken en te bemonsteren in overeenstemming met de ethische beginselen en regelgeving voor mensen. Menselijke lymfocyten uit perifeer bloed dienen te worden verkregen van jonge (ongeveer 18-35 jaar oud) niet-rokers zonder bekende ziekten, die voor zover bekend onlangs niet zijn blootgesteld aan genotoxische stoffen (bv. chemische stoffen, ioniserende straling) op een niveau dat de achtergrondincidentie van chromosoomafwijkingen vergroot. Dit zorgt ervoor dat de achtergrondincidentie van chromosoomafwijkingen laag en consistent is. De basisincidentie van chromosoomafwijkingen neemt toe met de leeftijd, en deze trend is bij vrouwen sterker dan bij mannen (17) (18). Indien cellen van meer dan één donor voor gebruik worden gepoold, moet het aantal donors aangegeven worden. Er moet worden aangetoond dat de cellen zich vanaf het begin van de behandeling met de teststof tot aan de bemonstering van de cellen hebben gedeeld. De celculturen worden in een fase van exponentiële celgroei (cellijnen) gehouden of worden gestimuleerd om zich te delen (primaire culturen van lymfocyten), om de cellen in verschillende stadia van de celcyclus bloot te stellen, aangezien de gevoeligheid van de verschillende celstadia voor de teststoffen mogelijk niet bekend is. De primaire cellen die met mitogene middelen moeten worden gestimuleerd om zich te delen, zijn doorgaans niet meer gesynchroniseerd tijdens de blootstelling aan de teststof (bv. menselijke lymfocyten na 48 uur mitogene stimulatie). Het gebruik van gesynchroniseerde cellen tijdens de behandeling wordt niet aangeraden, maar kan aanvaardbaar zijn, mits het naar behoren wordt gemotiveerd.

Media en cultuuromstandigheden

Er moet worden gezorgd voor geschikte kweekmedia en incubatieomstandigheden voor de culturen (kweekvaten, vochtige atmosfeer van 5 % CO2 indien passend, incubatietemperatuur van 37 °C). De cellijnen moeten geregeld worden gecontroleerd om na te gaan of het modale aantal chromosomen stabiel is en er geen besmetting met mycoplasma heeft plaatsgevonden (7) (19). Indien er wel een besmetting heeft plaatsgevonden of indien het modale aantal chromosomen gewijzigd is, mogen de cellen niet worden gebruikt. De normale tijd voor de celcyclus bij de in het testlaboratorium gebruikte cellijnen of primaire culturen moet worden vastgesteld en moet overeenkomen met de gepubliceerde celkenmerken (20).

Prepareren van de culturen

Cellijnen: cellen uit stamculturen worden met een zodanige dichtheid in een kweekmedium geënt dat de cellen in suspensies of in monolagen tot de oogsttijd exponentieel zullen blijven groeien (voor cellen die in monolagen groeien, moet bijvoorbeeld samenvloeiing worden voorkomen).

Lymfocyten: met een stollingsremmer (bv. heparine) behandeld volledig bloed of geïsoleerde lymfocyten worden gekweekt (bv. gedurende 48 uur voor menselijke lymfocyten) in aanwezigheid van een mitogeen [bv. fytohemagglutinine (PHA) voor menselijke lymfocyten] om celdeling te induceren vóór blootstelling aan de teststof.

Metabolische activering

Exogene metabole activeringssystemen moeten worden gehanteerd bij het gebruik van cellen met ontoereikende endogene metabole capaciteit. Het meest gebruikte systeem dat als standaard wordt aanbevolen, tenzij anders wordt gemotiveerd, is een post-mitochondriale fractie aangevuld met een cofactor (S9), verkregen uit de lever van knaagdieren (doorgaans ratten) die zijn behandeld met enzym-inducerende stoffen als Aroclor 1254 (21) (22) (23) of een combinatie van fenobarbiton en β-naftoflavon (24) (25) (26) (27) (28) (29). De laatste combinatie druist niet in tegen het Verdrag van Stockholm inzake persistente organische verontreinigende stoffen (30). Bovendien is aangetoond dat zij even effectief is als Aroclor 1254 voor de inducering van oxidasen met gemengde functie (24) (25) (26) (28). De S9-fractie wordt meestal gebruikt bij een concentratie van 1 tot 2 % (v/v), maar mag worden verhoogd tot 10 % (v/v) in het uiteindelijke testmedium. Het gebruik van producten die de mitotische index verlagen, in het bijzonder calciumcomplex-vormende producten (31), moet worden vermeden tijdens de behandeling. De keuze van het type en de concentratie van het exogene metabole activeringssysteem dat of de metabole inductor die wordt gebruikt, kan worden beïnvloed door de klasse van de te testen chemische stof.

Teststofbereiding

Vaste teststoffen moeten in geschikte oplosmiddelen worden bereid en eventueel vóór de behandeling van de cellen worden verdund (zie punt 23). Vloeibare teststoffen kunnen direct aan het testsysteem worden toegevoegd en/of worden verdund vóór de behandeling van het testsysteem. Bij het testen van gassen of vluchtige teststoffen moeten geschikte aanpassingen van de standaardprotocollen worden gevolgd, zoals de behandeling in gesloten kweekvaten (32) (33) (34). Preparaten van de teststof moeten worden bereid vlak vóór de behandeling, tenzij met stabiliteitsgegevens is aangetoond dat bewaren van het preparaat aanvaardbaar is.

Testomstandigheden

Oplosmiddelen

Het oplosmiddel wordt zo gekozen dat het de oplosbaarheid van de te testen chemische stoffen vergroot zonder een negatieve invloed te hebben op het verloop van de test, bv. door veranderingen in de celgroei, aantasting van de integriteit van de teststof, reacties met kweekvaten, belemmering van het metabole activeringssysteem. Het wordt aanbevolen waar mogelijk eerst het gebruik van een waterig oplosmiddel (of kweekmedium) te overwegen. Gangbare oplosmiddelen zijn bijvoorbeeld water en dimethylsulfoxide. Organische oplosmiddelen mogen in de regel de 1 % (v/v) en waterige oplosmiddelen (fysiologisch zout of water) de 10 % (v/v) in het uiteindelijke behandelingsmedium niet overschrijden. Als er andere dan gangbare oplosmiddelen worden gebruikt (bv. ethanol of aceton), moeten gegevens worden verstrekt waaruit blijkt dat ze verenigbaar zijn met de teststof en het testsysteem, en dat zij geen genetische toxiciteit vertonen bij de gebruikte concentratie. Als die gegevens ontbreken, is het belangrijk ook onbehandelde controles mee te nemen (zie aanhangsel 1) om aan te tonen dat het gekozen oplosmiddel geen schadelijke of clastogene effecten induceert.

Meting van celproliferatie en cytotoxiciteit en keuze van behandelingsconcentraties

Bij de bepaling van de hoogste te testen concentratie van de teststof moeten concentraties worden vermeden die kunnen leiden tot artefactuele positieve reacties, zoals reacties die bovenmatige cytotoxiciteit (zie punt 22) voortbrengen, neerslag in het cultuurmedium (zie punt 23) of uitgesproken wijzigingen in pH of osmolaliteit (zie punt 5). Indien de teststof op het ogenblik van toevoeging een uitgesproken wijziging in de pH van het medium veroorzaakt, kan de pH worden aangepast door het uiteindelijke behandelingsmedium te bufferen zodat artefactuele positieve reacties worden vermeden en passende kweekomstandigheden in stand worden gehouden.

Metingen van celproliferatie worden verricht om er zeker van te zijn dat een voldoende aantal behandelde cellen tijdens de test mitose hebben ondergaan en dat de behandelingen worden uitgevoerd met de passende mate van cytotoxiciteit (zie punten 18 en 22). Cytotoxiciteit dient te worden bepaald met en zonder metabole activering in het hoofdexperiment met behulp van een passende indicatie van celdood en celgroei. Hoewel de evaluatie van cytotoxiciteit in een eerste test nuttig kan zijn om de in het hoofdexperiment te gebruiken concentraties beter te kunnen vaststellen, is een eerste test niet verplicht. Indien deze wel wordt uitgevoerd, mag deze de meting van cytotoxiciteit in het hoofdexperiment niet vervangen.

De relatieve populatieverdubbeling (RPD) of de relatieve toename van de celpopulatie (RICC) zijn passende methoden voor het beoordelen van cytotoxiciteit in cytogene tests (13) (15) (35) (36) (55) (zie aanhangsel 2 voor formules). In geval van een langlopende behandeling en bemonsteringstijdstippen na het begin van de behandeling langer dan 1,5 maal de normale lengte van een celcyclus (d.w.z. in totaal langer dan 3 maal de lengte van een celcyclus), kan RPD mogelijk leiden tot een onderschatting van de cytotoxiciteit (37). Onder deze omstandigheden zou RICC een betere maat kunnen zijn of zou de evaluatie van de cytotoxiciteit na 1,5 maal de normale lengte van een celcyclus met hulp van RPD een bruikbare schatting kunnen zijn.

Voor lymfocyten in primaire culturen is de mitotische index (MI) weliswaar een maat voor cytotoxische/cytostatische effecten, maar deze index is afhankelijk van het tijdstip na de behandeling waarop hij wordt gemeten, van het gebruikte mitogeen en van mogelijke ontregeling van de celcyclus. De MI is echter aanvaardbaar, omdat andere metingen van de cytotoxiciteit omslachtig en onpraktisch kunnen zijn en mogelijk niet geldig zijn voor de doelpopulatie van lymfocyten die groeit als gevolg van PHA-stimulatie.

Terwijl RICC en RPD voor cellijnen en MI voor primaire culturen van lymfocyten de aanbevolen cytotoxiciteitsparameters zijn, kunnen andere indicatoren (bv. celintegriteit, apoptose, necrose, celcyclus) nuttige aanvullende informatie verschaffen.

Er moeten ten minste drie testconcentraties (exclusief het oplosmiddel en positieve controles) die voldoen aan de aanvaardbaarheidscriteria (passende mate van cytotoxiciteit, aantal cellen enz.) worden geëvalueerd. Ongeacht het type cellen (cellijnen of primaire culturen van lymfocyten) kan bij elke geteste concentratie één behandelde cultuur worden gebruikt, maar ook duploculturen. Hoewel het gebruik van duploculturen raadzaam is, is het gebruik van één cultuur ook aanvaardbaar, mits voor één cultuur en duploculturen hetzelfde totale aantal cellen wordt gescoord. Het gebruik van één cultuur is in het bijzonder relevant wanneer meer dan 3 concentraties worden beoordeeld (zie punt 31). Voor de gegevensanalyse kunnen de resultaten verkregen in de onafhankelijke duploculturen bij een gegeven concentratie worden gepoold (38). Voor teststoffen die weinig of geen cytotoxiciteit vertonen, zijn intervallen tussen de testconcentraties van ongeveer een factor 2 tot 3 doorgaans passend. Wanneer er cytotoxiciteit optreedt, moeten de geselecteerde testconcentraties een interval bestrijken van een concentratie waarbij cytotoxiciteit optreedt zoals beschreven in punt 22, tot en met concentraties waarbij er matige en geen of vrijwel geen cytotoxiciteit is. Veel teststoffen vertonen een steile concentratie-responscurve, en om gegevens bij lage en matige cytotoxiciteit te verkrijgen of om in detail de dosis-responsrelatie te bestuderen zullen dichter bij elkaar liggende concentraties en/of meer dan drie concentraties moeten worden gebruikt (één cultuur of duplobepalingen), in het bijzonder in situaties waarin een herhalingsexperiment vereist is (zie punt 47).

Als de maximale concentratie is gebaseerd op cytotoxiciteit, moet de hoogste concentratie zo worden gekozen dat met behulp van de aanbevolen cytotoxiciteitsparameters (d.w.z. afname van RICC en RPD voor cellijnen en verlaging van MI voor primaire culturen van lymfocyten tot 45 ± 5 % van de tegelijkertijd gemeten negatieve controle) 55 ± 5 % cytotoxiciteit wordt bereikt. Bij de interpretatie van positieve resultaten moet ervoor worden gezorgd dat deze niet alleen worden gevonden in het hogere deel van dit 55 ± 5 % cytotoxiciteitsbereik (13).

Voor slecht oplosbare teststoffen die bij lagere concentraties dan de oplosbaarheidsgrens niet cytotoxisch zijn, moet de hoogste geanalyseerde concentratie troebelheid of een met het oog of met behulp van een omgekeerde microscoop aan het eind van de behandeling met de teststof zichtbaar neerslag opleveren. Zelfs indien cytotoxiciteit optreedt boven de oplosbaarheidsgrens, is het raadzaam de test uit te voeren bij slechts één concentratie die troebelheid of een zichtbaar neerslag oplevert, omdat het neerslag kan leiden tot artefactuele effecten. Bij de concentratie die neerslag oplevert, moet ervoor worden gezorgd dat het neerslag de uitvoering van de test (bv. kleuring of scoring) niet verstoort. Het kan nuttig zijn om voorafgaand aan het experiment de oplosbaarheid in het kweekmedium te bepalen.

Indien geen neerslag of beperkende cytotoxiciteit wordt waargenomen, moet de hoogste testconcentratie overeenkomen met de laagste van de volgende waarden: 10 mM, 2 mg/ml of 2 μl/ml (39) (40) (41). Wanneer de samenstelling van de teststof niet vastgesteld is, bv. in geval van een stof van onbekende of variabele samenstelling, complexe reactieproducten of biologisch materiaal (UVCB) (42), een milieu-extract enz., moet de hoogste concentratie bij het ontbreken van voldoende cytotoxiciteit mogelijk hoger zijn (bv. 5 mg/ml) om de concentratie van elk van de componenten te verhogen. Er zij echter opgemerkt dat deze eisen voor geneesmiddelen voor menselijk gebruik anders kunnen zijn (43).

Controles

Voor elk oogsttijdstip dienen gelijktijdige negatieve controles (zie punt 15) in het experiment te worden opgenomen, waaraan uitsluitend het oplosmiddel wordt toegediend en die verder op dezelfde manier worden behandeld als de culturen met teststof.

Gelijktijdige positieve controles zijn nodig om aan te tonen dat het laboratorium in staat is om onder de omstandigheden van het gebruikte testprotocol en de doeltreffendheid van het exogene metabole activeringssysteem, indien van toepassing, clastogenen te identificeren. Voorbeelden van voor positieve controle gebruikte chemische stoffen worden gegeven in tabel 1 hieronder. Er kunnen ook alternatieve positieve controlestoffen worden gebruikt, indien dat wordt gemotiveerd. Omdat in-vitrotests op genetische toxiciteit bij zoogdiercellen voldoende gestandaardiseerd zijn, mag het gebruik van positieve controles worden beperkt tot een clastogeen waarvoor metabole activering vereist is. Mits dit gelijktijdig met de niet-geactiveerde test met dezelfde behandelingsduur plaatsvindt, zal deze ene positieve-controlerespons zowel de activiteit van het metabole activeringssysteem als de gevoeligheid van het testsysteem aantonen. Een langlopende behandeling (zonder S9) moet echter haar eigen positieve controle hebben, omdat de behandelingsduur zal afwijken van de test waarbij metabole activering wordt toegepast. Elke positieve controle moet worden gebruikt bij een of meer concentraties waarvoor een reproduceerbare en detecteerbare stijging ten opzichte van het achtergrondniveau kan worden verwacht, om de gevoeligheid van het testsysteem aan te tonen (d.w.z. de effecten zijn duidelijk maar de gecodeerde objectglaasjes zijn niet onmiddellijk als zodanig herkenbaar), en de respons dient niet in het gedrang te komen door een mate van cytotoxiciteit die de in de testmethode gespecificeerde grenzen overschrijdt.

Tabel 1.

Aanbevolen referentiestoffen voor het beoordelen van de bekwaamheid van laboratoria en voor het selecteren van positieve controles.

PROCEDURE

Behandeling met teststof

Delende cellen worden zowel met als zonder metabool activeringssysteem met de teststof behandeld.

Oogsttijdstippen

Voor een gedegen evaluatie, die nodig is om een negatief resultaat vast te stellen, moet het experiment onder elk van de drie volgende omstandigheden worden verricht, met een kortlopende behandeling zowel met als zonder metabole activering en een langlopende behandeling zonder metabole activering (zie de punten 43, 44 en 45):

Indien een van de hierboven genoemde experimentele omstandigheden tot een positieve respons leidt, hoeven een of meer van de andere behandelingsregimes mogelijk niet te worden onderzocht.

Chromosoompreparaten

De celculturen worden meestal gedurende één tot drie uur vóór het oogsten behandeld met colcemid of colchicine. Elke celcultuur wordt afzonderlijk geoogst en behandeld voor het maken van chromosoompreparaten. Dit houdt in dat de cellen een hypotone behandeling krijgen, gevolgd door fixatie en kleuring. In monolagen kunnen aan het einde van de 3-6 uur durende behandeling mitotische cellen (herkenbaar aan hun ronde vorm en het feit dat ze loslaten van het oppervlak) aanwezig zijn. Omdat deze mitotische cellen gemakkelijk loskomen, kunnen ze verloren gaan wanneer het medium met de teststof wordt verwijderd. Als er aanwijzingen zijn voor een aanzienlijke toename van het aantal mitotische cellen vergeleken met de controlegroepen, wat een aanwijzing is voor het waarschijnlijk plotseling stoppen van de mitose, moeten de cellen door centrifugering worden verzameld en opnieuw aan de cultuur worden toegevoegd, opdat er geen cellen die in mitose zijn, en die gevaar voor chromosoomafwijking lopen, op het oogsttijdstip verloren gaan.

Analyse

Alle objectglaasjes, ook die van de positieve en negatieve controles, worden vóór de microscopische analyse op chromosoomafwijkingen onafhankelijk gecodeerd. Aangezien bij de fixatieprocedures vaak een gedeelte van de metafasecellen chromosomen verliest, moeten de gescoorde cellen een aantal centromeren bevatten dat gelijk is aan het modale aantal +/- 2.

Per concentratie en controle moeten minimaal 300 goed gespreide metafasen worden gescoord om te concluderen dat een teststof duidelijk negatief is (zie punt 45). De 300 cellen moeten gelijkelijk worden verdeeld over de duplobepalingen, wanneer duploculturen worden gebruikt. Wanneer één cultuur per concentratie wordt gebruikt (zie punt 21), moeten minimaal 300 goed gespreide metafasen worden gescoord in deze ene cultuur. Het scoren van 300 cellen heeft als voordeel dat het het statistisch onderscheidingsvermogen van de test vergroot en nulwaarden bovendien zelden zullen worden waargenomen (naar verwachting slechts 5 %) (44). Het aantal te scoren metafasen kan worden verlaagd wanneer hoge aantallen cellen met chromosoomafwijkingen worden waargenomen en de teststof als duidelijk positief wordt beschouwd.

Cellen met een of meer structurele chromosoomafwijkingen inclusief en exclusief hiaten moeten worden gescoord. Breuken en hiaten zijn gedefinieerd in aanhangsel 1, conform (45) (46). Afwijkingen in het chromatidetype of het chromosoomtype moeten afzonderlijk worden opgetekend en ingedeeld in subtypen (breuken, uitwisselingen). De in het laboratorium gebruikte procedures moeten ervoor zorgen dat de analyse van chromosoomafwijkingen wordt uitgevoerd door goed opgeleide scorers en zo nodig collegiaal wordt getoetst.

Hoewel de test bedoeld is om structurele chromosoomafwijkingen op te sporen, is het belangrijk dat bij waarneming van polyploïdie en endoreduplicatie ook de frequenties van deze verschijnselen worden opgetekend. (Zie punt 2).

Bekwaamheid van het laboratorium

Om voldoende ervaring met de test vast te stellen voordat deze wordt gebruikt voor routinetests, moet het laboratorium een reeks experimenten met positieve referentiestoffen die via verschillende mechanismen werken, en met verschillende negatieve controles (met verschillende oplosmiddelen/media) hebben uitgevoerd. Deze positieve en negatieve controleresponsen moeten in overeenstemming zijn met de literatuur. Dit geldt niet voor laboratoria die ervaring hebben, d.w.z. die beschikken over referentiegegevens uit het verleden zoals omschreven in punt 37.

Een selectie van positieve controlestoffen (zie tabel 1 in punt 26) moet worden onderzocht met kortlopende en langlopende behandelingen zonder metabole activering, en ook met korte behandelingen met metabole activering, teneinde bekwaamheid in het detecteren van clastogene chemische stoffen aan te tonen en de doeltreffendheid van het metabole activeringssysteem te bepalen. Er moet een bereik van concentraties van de geselecteerde chemische stoffen worden gekozen dat reproduceerbare en concentratiegerelateerde stijgingen tot boven het achtergrondniveau oplevert, om de gevoeligheid en het dynamisch bereik van het testsysteem aan te tonen.

Controlegegevens uit het verleden

Het laboratorium stelt vast:

Wanneer voor het eerst gegevens worden verkregen voor een verdeling van negatieve controles uit het verleden, moeten gelijktijdige negatieve controles consistent zijn met gepubliceerde controlegegevens, indien deze bestaan. Naarmate meer gegevens uit experimenten aan de controlespreiding worden toegevoegd, dienen gelijktijdige negatieve controles idealiter binnen de controlegrens van 95 % voor die spreiding te vallen (44) (47). De databank met gegevens over negatieve controles uit het verleden van het laboratorium dient aanvankelijk te worden samengesteld op basis van minimaal 10 experimenten, maar bestaat bij voorkeur uit ten minste 20 experimenten die onder vergelijkbare testomstandigheden werden uitgevoerd. Laboratoria dienen methodes voor kwaliteitscontrole, zoals regelkaarten (bv. C-kaart of X-kaart (48)), te gebruiken om na te gaan hoe variabel hun gegevens over positieve en negatieve controles zijn en om aan te tonen dat zij de methodologie “onder controle” hebben (44). Verdere aanbevelingen voor het samenstellen en gebruiken van de gegevens uit het verleden (d.w.z. criteria voor het opnemen van gegevens in en het uitsluiten ervan uit de historische gegevens en de aanvaardbaarheidscriteria voor een gegeven experiment) zijn te vinden in de literatuur (47).

Bij eventuele wijzigingen in het experimentele protocol moet rekening worden gehouden met hun consistentie met de bestaande databanken met historische controlegegevens van het laboratorium. Eventuele grote inconsistenties moeten leiden tot de oprichting van een nieuwe databank met historische controlegegevens.

Negatieve controlegegevens moeten bestaan uit de incidentie van cellen met chromosoomafwijkingen uit één cultuur of de som van de duploculturen zoals beschreven in punt 21. Gelijktijdige negatieve controles liggen idealiter binnen de 95 %-controlegrenzen van de verdeling van de databank met historische negatieve controlegegevens van het laboratorium (44) (47). Wanneer gegevens van gelijktijdige negatieve controles buiten de 95 %-controlegrenzen vallen, kan opneming ervan in de historische controleverdeling toch aanvaardbaar zijn, zolang deze gegevens geen extreme uitschieters zijn en er bewijs is dat het testsysteem 'onder controle' is (zie punt 37) en geen bewijs van technisch of menselijk falen.

GEGEVENS EN RAPPORTAGE

Presentatie van de resultaten

Het percentage cellen met een of meer structurele chromosoomafwijkingen moet worden geëvalueerd. Er moet een uitgesplitst overzicht worden gegeven van de afwijkingen in het chromatidetype en chromosoomtype ingedeeld in subtypen (breuken, uitwisselingen), met de aantallen en de frequentie waarmee ze in de behandelde en controleculturen voorkomen. Hiaten worden apart opgetekend en gerapporteerd, maar meestal niet in de totale frequentie van afwijkingen opgenomen. Het percentage polyploïde cellen en/of cellen met endoreduplicatie wordt gerapporteerd wanneer dergelijke cellen worden waargenomen.

Gelijktijdige metingen van de cytotoxiciteit voor alle behandelde, negatieve en positieve controleculturen bij het (de) hoofdexperiment(en) dienen te worden geregistreerd.

De gegevens moeten voor elke cultuur apart worden verstrekt. Daarnaast moet een overzicht van alle gegevens in tabelvorm worden gegeven.

Aanvaardbaarheidscriteria

Aanvaarding van een test geschiedt aan de hand van de volgende criteria:

Beoordeling en interpretatie van resultaten

Indien aan alle aanvaardbaarheidscriteria is voldaan, wordt de teststof als duidelijk positief beschouwd als in een of meer van de onderzochte experimentele omstandigheden (zie punt 28):

Wanneer aan al deze criteria is voldaan, wordt de teststof in staat geacht in gekweekte zoogdiercellen in dit testsysteem chromosoomafwijkingen te veroorzaken. Aanbevelingen voor de meest geschikte statistische methoden zijn te vinden in de literatuur (49) (50) (51).

Indien aan alle aanvaardbaarheidscriteria is voldaan, wordt de teststof als duidelijk negatief beschouwd als in alle onderzochte experimentele omstandigheden (zie punt 28):

De teststof wordt dan niet niet in staat geacht in gekweekte zoogdiercellen in dit testsysteem chromosoomafwijkingen te veroorzaken.

Een duidelijk positieve of negatieve reactie behoeft niet te worden bevestigd.

Indien de reactie noch duidelijk negatief noch duidelijk positief is zoals hierboven beschreven, of om de biologische relevantie van een resultaat te helpen vaststellen, moeten de gegevens door een deskundige en/of nader onderzoek worden beoordeeld. Het scoren van aanvullende cellen (indien van toepassing) of het uitvoeren van een herhalingsexperiment onder mogelijk aangepaste experimentele omstandigheden (bv. concentratie-intervallen, andere omstandigheden bij metabole activering (d.w.z. S9-concentratie of S9-herkomst)) kan nuttig zijn.

In zeldzame gevallen zal op basis van de gegevens, zelfs na nader onderzoek, niet kunnen worden geconcludeerd dat de resultaten positief of negatief zijn. De reactie op de teststof zal daarom als moeilijk te interpreteren worden beschouwd.

Een stijging van het aantal polyploïde cellen kan erop wijzen dat de teststoffen in staat zijn mitotische processen te remmen en numerieke chromosoomafwijkingen te induceren (52). Een stijging van het aantal cellen met endoreduplicatie van chromosomen kan erop duiden dat de teststoffen in staat zijn de voortgang van de celcyclus te remmen (53) (54) (zie punt 2). De incidentie van polyploïde cellen en cellen met endoreduplicatie van chromosomen moet daarom apart worden geregistreerd.

Testverslag

In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

LITERATUUR

4)

In deel B wordt hoofdstuk B.11 vervangen door:

„B.11   Test op chromosoomafwijkingen in beenmergcellen van zoogdieren

INLEIDING

Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 475 (2016) van de OESO. Zij maakt deel uit van een reeks testmethoden op het gebied van de genetische toxicologie. Er is een OESO-document opgesteld met beknopte informatie over genetisch-toxicologische tests en een overzicht van de recente wijzigingen van deze testrichtlijnen (1).

De in-vivotest op chromosoomafwijkingen in beenmergcellen van zoogdieren is met name van belang voor de beoordeling van genotoxiciteit, omdat factoren van het in-vivometabolisme, de farmacokinetiek en de DNA-herstelprocessen actief zijn en bijdragen aan de reacties op de test, hoewel deze aspecten per soort kunnen verschillen. Een in-vivobepaling is ook geschikt om in vitro gesignaleerde genotoxiciteit nader te onderzoeken.

De in-vivotest op chromosoomafwijkingen bij zoogdieren wordt gebruikt om te bepalen welke chemische stoffen structurele chromosoomafwijkingen bij beenmergcellen van dieren, meestal knaagdieren, veroorzaken (2) (3) (4) (5). Er zijn twee soorten structurele chromosoomafwijkingen: het chromosoomtype en het chromatidetype. Hoewel de meeste genotoxische door chemische stoffen geïnduceerde afwijkingen van het chromatidetype zijn, komt het chromosoomtype ook voor. Chromosoombeschadiging en soortgelijke voorvallen veroorzaken veel genetische ziekten bij de mens en het lijkt er sterk op dat deze beschadigingen en soortgelijke voorvallen, wanneer ze veranderingen in oncogenen en tumorsuppressorgenen veroorzaken, betrokken zijn bij de inductie van kanker bij de mens en bij proefdieren. Polyploïdie (met inbegrip van endoreduplicatie) kan optreden in bepalingen van chromosoomafwijkingen in vivo. Een toename van polyploïdie hoeft op zich echter niet te wijzen op een aneugeen potentieel en kan ook gewoon wijzen op een verstoring van de celcyclus of op cytotoxiciteit. Deze test is niet bedoeld voor het meten van aneuploïdie. Een in-vivomicronucleustest bij erythrocyten van zoogdieren (hoofdstuk B.12 van deze bijlage) of de in-vitromicronucleustest bij zoogdiercellen (hoofdstuk B.49 van deze bijlage) zijn respectievelijk de in-vivo- en in-vitrotests die worden aanbevolen voor de opsporing van aneuploïdie.

De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1.

INLEIDENDE OVERWEGINGEN

Gewoonlijk worden in deze test knaagdieren gebruikt, maar andere soorten kunnen in sommige gevallen geschikt zijn, indien dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is. Het doelweefsel in deze test is het beenmerg aangezien dit een sterk doorbloed weefsel is en een populatie snel delende cellen bevat die gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd en verwerkt. De wetenschappelijke rechtvaardiging voor het gebruik van andere soorten dan ratten en muizen moet in het verslag worden opgenomen. Als andere soorten dan knaagdieren worden gebruikt, wordt aanbevolen de meting van de chromosoomafwijkingen in beenmergcellen te integreren in een andere passende toxiciteitstest.

Als er aanwijzingen zijn dat de teststof(fen), of een of meer metabolieten daarvan, niet in het doelweefsel terechtkom(t)(en), is deze test mogelijk niet geschikt.

Voordat de testmethode wordt gebruikt op een mengsel om gegevens te genereren voor een beoogd regelgevingsdoel, moet worden nagegaan of, en zo ja, waarom deze methode betrouwbare resultaten oplevert voor dat doel. Zulke overwegingen zijn niet nodig wanneer het testen van het mengsel wettelijk vereist is.

PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

Dieren worden aan de teststof blootgesteld via een passende wijze van blootstelling en worden op een geschikt tijdstip na de behandeling op humane wijze gedood. Voordat de dieren worden gedood, worden ze behandeld met een metafasestopper (bv. colchicine of colcemid). Vervolgens worden chromosoompreparaten van de beenmergcellen gemaakt en gekleurd, en worden de cellen in de metafase geanalyseerd op chromosoomafwijkingen.

VERIFICATIE VAN DE BEKWAAMHEID VAN LABORATORIA

Bekwaamheidsonderzoek

Om voldoende ervaring met het uitvoeren van de bepaling vast te stellen voordat deze wordt gebruikt voor routinetests, moet het laboratorium hebben aangetoond in staat te zijn verwachte resultaten uit gepubliceerde gegevens (bv. (6)) te reproduceren voor frequenties van chromosoomafwijkingen met minimaal twee positieve controlestoffen (waaronder zwakke responsen geïnduceerd door lage doses positieve controles), zoals de stoffen vermeld in tabel 1 en met vergelijkbare medium-/oplosmiddelcontroles (zie punt 22). Bij deze experimenten moeten doses worden gebruikt die leiden tot reproduceerbare en dosisgerelateerde toenamen, en zij moeten de gevoeligheid en het dynamisch bereik van het testsysteem in het te onderzoeken weefsel (beenmerg) aantonen en gebruikmaken van de scoringmethode die binnen het laboratorium zal worden aangewend. Deze eis geldt niet voor laboratoria met ervaring, d.w.z. laboratoria die beschikken over referentiegegevens uit het verleden zoals omschreven in de punten 10-14.

Controlegegevens uit het verleden

Tijdens het bekwaamheidsonderzoek stelt het laboratorium vast:

Wanneer voor het eerst gegevens worden verkregen voor een verdeling van negatieve controles uit het verleden, moeten gelijktijdige negatieve controles consistent zijn met gepubliceerde controlegegevens, indien deze bestaan. Wanneer meer experimentele gegevens aan de verdeling van historische controles worden toegevoegd, moeten gelijktijdige negatieve controles idealiter binnen de 95 %-controlegrenzen van deze verdeling liggen. De databank met historische negatieve controlegegevens van het laboratorium moet statistisch robuust zijn om te waarborgen dat het laboratorium de verdeling van zijn negatieve controlegegevens kan beoordelen. Uit de literatuur komt naar voren dat daarvoor minimaal 10 experimenten nodig zijn, maar dat bij voorkeur ten minste 20 experimenten worden gebruikt die onder vergelijkbare experimentele omstandigheden zijn uitgevoerd. Laboratoria moeten methoden voor kwaliteitscontrole gebruiken, zoals controlekaarten (bv. C-kaarten of X-kaarten (7)), om vast te stellen hoe variabel hun gegevens zijn en om aan te tonen dat het laboratorium de methodologie “onder controle” heeft. Verdere aanbevelingen voor het opbouwen en gebruiken van de historische gegevens (d.w.z. criteria voor het opnemen van gegevens in en het uitsluiten ervan uit de historische gegevens en de aanvaardbaarheidscriteria voor een gegeven experiment) zijn te vinden in de literatuur (8).

Wanneer het laboratorium tijdens het bekwaamheidsonderzoek (zoals beschreven in punt 9) een onvoldoende aantal experimenten voltooit om een statistisch robuuste verdeling van negatieve controles vast te stellen (zie punt 11), is het aanvaardbaar de verdeling tijdens de eerste routinetests op te bouwen. Bij deze aanpak moeten de aanbevelingen worden gevolgd die in de literatuur zijn uiteengezet (8), en de negatieve controleresultaten die in deze experimenten worden verkregen, moeten consistent blijven met gepubliceerde negatieve controlegegevens.

Bij eventuele wijzigingen in het experimentele protocol moet rekening worden gehouden met hun implicaties voor de vraag of de resulterende gegevens consistent blijven met de databank met bestaande historische controlegegevens van het laboratorium. Alleen grote inconsistenties moeten leiden tot de oprichting van een nieuwe databank met historische controlegegevens, waarbij deskundigen bepalen welke controles afwijken van de eerdere verdeling (zie punt 11). Tijdens de hernieuwde opbouw is een volledige databank met negatieve controlegegevens mogelijk niet nodig om een echte test te mogen uitvoeren, mits het laboratorium kan aantonen dat zijn gelijktijdige negatieve controlewaarden consistent blijven met hetzij zijn eerdere databank hetzij de overeenkomstige gepubliceerde gegevens.

Negatieve controlegegevens moeten bestaan uit de incidentie van cellen met sctructurele chromosoomafwijkingen (exclusief hiaten) in elk dier. Gelijktijdige negatieve controles liggen idealiter binnen de 95 %-controlegrenzen van de verdeling van de verzameling historische negatieve controlegegevens van het laboratorium. Wanneer gegevens van gelijktijdige negatieve controles buiten de 95 %-controlegrenzen vallen, kan opneming ervan in de historische controleverdeling toch aanvaardbaar zijn zolang deze gegevens geen extreme uitschieters zijn en er bewijs is dat het testsysteem 'onder controle' is (zie punt 11) en er geen bewijs is van technisch of menselijk falen.

BESCHRIJVING VAN DE METHODE

Voorbereidingen

Keuze van de diersoort

Er dient gebruik te worden gemaakt van gezonde jonge volwassen dieren van in het laboratorium gangbare stammen. Meestal worden ratten gebruikt, maar muizen kunnen ook geschikt zijn. Een andere geschikte zoogdiersoort kan ook in aanmerking komen, mits in het verslag een wetenschappelijke motivering wordt gegeven.

Huisvestings- en voedingsomstandigheden van de dieren

De temperatuur in de proefdierruimte moet voor knaagdieren 22 °C (± 3 °C) zijn. Hoewel de relatieve vochtigheid idealiter 50-60 % is, dient deze minimaal 40 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % te zijn, behalve bij het reinigen van de ruimte. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende mengbaarheid met de teststof te zorgen, wanneer de stof via het voer wordt toegediend. Knaagdieren moeten worden gehuisvest in kleine groepen (niet meer dan vijf dieren per kooi) van hetzelfde geslacht en dezelfde behandelingsgroep als geen agressief gedrag wordt verwacht, bij voorkeur in kooien met een stevige vloer met passende milieuverrijking. De dieren mogen uitsluitend individueel worden gehuisvest als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is.

Voorbereiding van de dieren

Normaal gesproken worden gezonde jonge volwassen dieren gebruikt (voor knaagdieren idealiter 6-10 weken oud bij het begin van de behandeling, hoewel iets oudere dieren ook aanvaardbaar zijn) en aselect ingedeeld in de behandelde en controlegroepen. De afzonderlijke dieren krijgen op humane, minimaal invasieve wijze een unieke identificatie (bv. door het aanbrengen van een ring, tag, microchip of door biometrische identificatie, maar niet door het afknippen van oren of tenen) en krijgen minimaal vijf dagen de tijd om in het laboratorium te acclimatiseren. De kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. Kruisverontreiniging door de positieve controle en de teststof moet worden vermeden. Bij het begin van de studie moet per geslacht het gewichtsverschil tussen de dieren zo klein mogelijk zijn en mag dit niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht bedragen.

Voorbereiding van de doses

Vaste chemische teststoffen moeten worden opgelost of gesuspendeerd in geschikte oplosmiddelen of media of worden vermengd met voedsel of drinkwater voordat dit aan de dieren wordt gegeven. Vloeibare chemische teststoffen kunnen direct worden gegeven of eerst worden verdund. Voor blootstelling via inhalatie kunnen teststoffen worden toegediend als een gas, damp of een vaste/vloeibare aerosol, naargelang van de fysisch-chemische eigenschappen ervan. Er dienen verse preparaten van de teststof te worden toegepast, tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat bewaren van de preparaten aanvaardbaar is en blijkt wat de juiste bewaaromstandigheden zijn.

Oplosmiddel/medium

Het oplosmiddel/medium mag bij de gebruikte dosisniveaus geen toxische effecten veroorzaken en chemische reacties met de teststoffen moeten uitgesloten zijn. Als andere oplosmiddelen/media worden gebruikt dan de algemeen bekende, moet het gebruik ervan worden ondersteund met referentiegegevens die wijzen op de verenigbaarheid ervan. Het wordt aanbevolen waar mogelijk eerst het gebruik van een waterig oplosmiddel/medium te overwegen. Voorbeelden van vaak gebruikte compatibele oplosmiddelen/media zijn water, fysiologische zoutoplossing, methylcelluloseoplossing, natriumcarboxymethylcellulose-zoutoplossing, olijfolie en maïsolie. Bij het ontbreken van historische of gepubliceerde controlegegevens waaruit blijkt dat een gekozen atypisch oplosmiddel/medium geen structurele afwijkingen of andere schadelijke effecten veroorzaakt, dient een eerste onderzoek te worden uitgevoerd om vast te stellen dat de oplosmiddel/mediumcontrole aanvaardbaar is.

Controles

Positieve controles

Normaal gesproken wordt in elke test een groep dieren opgenomen die wordt behandeld met een positieve controlestof. Hiervan kan worden afgezien wanneer het testlaboratorium aantoonbare bekwaamheid heeft in het uitvoeren van de test en een bereik van historische positieve controles heeft vastgesteld. Wanneer geen gelijktijdige positieve controlegroep wordt opgenomen, moeten in elk experiment scoringcontroles (ongekleurde en ongefixeerde preparaten) worden opgenomen. Deze kunnen worden verkregen door in de scoring van de studie passende referentiemonsters op te nemen die zijn verkregen en bewaard van een apart positieve-controle-experiment dat op gezette tijden (bv. elke 6-18 maanden) wordt verricht in het laboratorium waar de test wordt uitgevoerd; bijvoorbeeld tijdens de bekwaamheidstoetsing en daarna op gezette tijden, indien nodig.

Positieve controlestoffen moeten op betrouwbare wijze leiden tot een detecteerbare stijging van de frequentie van cellen met structurele chromosoomafwijkingen ten opzichte van het spontane niveau. De doseringen van de positieve controles moeten zodanig worden gekozen dat de effecten duidelijk zijn, maar de gecodeerde monsters niet onmiddellijk als zodanig herkenbaar zijn voor de scorer. Het is aanvaardbaar dat de positieve controle langs een andere weg wordt toegediend dan de teststof, met behulp van een ander behandelingsschema, en dat bemonstering op slechts één tijdstip plaatsvindt. Tevens kan, waar dat van toepassing is, het gebruik van chemische stoffen uit een verwante chemische klasse als positieve controle worden overwogen. Voorbeelden van voor positieve controle gebruikte chemische stoffen staan vermeld in tabel 1.

Tabel 1

Voorbeelden van positieve controlestoffen

Negatieve controles

Dieren in een negatieve controlegroep moeten op alle bemonsteringstijdstippen worden opgenomen en ook verder op dezelfde wijze worden behandeld als de behandelingsgroepen, zij het dat zij geen teststof toegediend krijgen. Indien bij de toediening van de teststof van een oplosmiddel/medium gebruik wordt gemaakt, dient dit oplosmiddel/medium aan de controlegroep toegediend te worden. Als uit historische negatieve controlegegevens op ieder bemonsteringstijdstip voor het testlaboratorium een consistente spreiding over de dieren en consistente frequenties van cellen met structurele afwijkingen blijken, is mogelijk slechts één enkele bemonstering voor de negatieve controle nodig. Wanneer voor negatieve controles één bemonstering plaatsvindt, dient deze plaats te vinden op het eerste bemonsteringstijdstip dat in de studie wordt gebruikt.

PROCEDURE

Aantal en geslacht van de dieren

In het algemeen is de micronucleusrespons voor mannetjes en vrouwtjes vergelijkbaar (9) en er wordt verwacht dat dit ook voor structurele chromosoomafwijkingen het geval zal zijn: de meeste studies kunnen daarom bij beide geslachten worden uitgevoerd. Gegevens waaruit blijkt dat er relevante verschillen tussen vrouwtjes en mannetjes bestaan (bv. verschillen in systemische toxiciteit, metabolisme, biologische beschikbaarheid, toxiciteit voor het beenmerg enz., met inbegrip van bv. een bereikbepalingsonderzoek), zijn een aanmoediging om beide geslachten te gebruiken. In dit geval kan het passend zijn om een onderzoek bij beide geslachten uit te voeren, bijvoorbeeld als onderdeel van een toxiciteitsonderzoek bij herhaalde toediening. Het kan passend zijn om een factoriële onderzoeksopzet te gebruiken als beide geslachten worden gebruikt. Details over de wijze waarop de gegevens bij deze onderzoeksopzet moeten worden geanalyseerd, zijn te vinden in aanhangsel 2.

De vaststelling van de groepsgrootte aan het begin van het onderzoek moet erop gericht zijn minimaal 5 analyseerbare dieren van één geslacht, of van elk geslacht als beide worden gebruikt, per groep te krijgen. Wanneer de blootstelling aan een chemische stof bij de mens door het geslacht wordt bepaald, zoals dit bijvoorbeeld bij sommige geneesmiddelen het geval is, moet de test bij het desbetreffende geslacht worden uitgevoerd. Als richtsnoer voor de maximale typische behoefte aan dieren: voor een onderzoek in beenmerg op twee bemonsteringstijdstippen met drie dosisgroepen en een parallelle negatieve controlegroep, plus een positieve controlegroep (elke groep bestaande uit vijf dieren van één geslacht) zijn 45 dieren nodig.

Dosisniveaus

Als er een bereikbepalingsonderzoek wordt uitgevoerd omdat er nog geen bruikbare gegevens over de dosering beschikbaar zijn, moet dit in hetzelfde laboratorium gebeuren met dezelfde soort, dezelfde stam, hetzelfde geslacht en hetzelfde behandelingsschema als bij het hoofdonderzoek (10). Het onderzoek moet erop gericht zijn de maximaal verdraagbare dosis (maximum tolerated dose, MTD) vast te stellen, dat wil zeggen, de hoogste dosis die zal worden verdragen zonder aanwijzingen voor onderzoeksbeperkende toxiciteit, in verhouding tot de duur van de onderzoeksperiode (bv. door het veroorzaken van gewichtsverlies of cytotoxiciteit voor het hematopoïetisch systeem, maar geen dood of aanwijzingen voor pijn, lijden of nood die humane doding noodzakelijk maken (11)).

De hoogste dosis kan ook worden gedefinieerd als een dosis die enigerlei aanwijzing van toxiciteit voor het beenmerg oplevert.

Chemische stoffen die verzadiging van toxicokinetische eigenschappen vertonen, of detoxificatieprocessen induceren die kunnen leiden tot een afname van de blootstelling na langlopende behandeling, kunnen uitzonderingen zijn op de doseringscriteria en moeten per geval worden beoordeeld.

Om dosisresponsinformatie te krijgen, moet een volledig onderzoek een negatieve controlegroep omvatten en minimaal drie dosisniveaus die in het algemeen een factor 2, maar niet meer dan een factor 4, uit elkaar liggen. Als in een bereikbepalingsonderzoek of op basis van bestaande gegevens geen aanwijzingen voor toxiciteit van de teststof worden gevonden, moet de hoogste dosis voor een enkele toediening 2000 mg/kg lichaamsgewicht zijn. Als de teststof echter wel toxiciteit veroorzaakt, moet de MTD de hoogste toegediende dosis zijn en moeten de gebruikte dosisniveaus bij voorkeur een bereik dekken van maximale tot weinig of geen toxiciteit. Wanneer toxiciteit voor het doelweefsel (beenmerg) bij alle geteste dosisniveaus wordt waargenomen, wordt verder onderzoek bij niet-toxische doses aanbevolen. Voor onderzoek dat ten doel heeft de kwantitatieve dosisresponsinformatie volledig te kenschetsen, kunnen aanvullende dosisgroepen nodig zijn. Voor bepaalde typen teststoffen (bv. geneesmiddelen voor menselijk gebruik) waarvoor specifieke eisen gelden, kunnen deze limieten verschillen.

Limiettest

Als uit doseringsbereikstudies of bestaande gegevens bij gerelateerde dierstammen blijkt dat een behandelingsregime van minstens de limietdosis (zoals hieronder beschreven) geen waarneembare toxische effecten geeft (met inbegrip van achteruitgang van de proliferatie van beenmerg of andere aanwijzingen van toxiciteit voor het doelweefsel), en als op grond van in-vitro genotoxiciteitsstudies of gegevens bij structureel verwante chemische stoffen geen genotoxiciteit wordt verwacht, dan is een volledig onderzoek met drie dosisniveaus mogelijk niet nodig, mits is aangetoond dat de teststof(fen) het doelweefsel (beenmerg) bereik(t)(en). In zulke gevallen kan één dosisniveau, gelijk aan de limietdosis, voldoende zijn. Voor een toedieningsperiode van meer dan 14 dagen is de limietdosis 1000 mg/kg lichaamsgewicht/dag. Voor een toedieningsperiode van 14 dagen of minder is de limietdosis 2000 mg/kg lichaamsgewicht/dag.

Toediening van de doses

Bij de opzet van een test moet rekening worden gehouden met de verwachte blootstellingsroute bij mensen. Daarom kunnen andere blootstellingsroutes zoals voeding, drinkwater, lokaal, subcutaan, intraveneus, oraal (via sonde), inhalatie, intratracheaal of implantatie worden gekozen, als deze onderbouwd worden. De route moet in elk geval zodanig worden gekozen dat adequate blootstelling van het (de) doelweefsel(s) is gewaarborgd. Intraperitoneale injectie wordt in het algemeen niet aanbevolen, omdat zij bij mensen geen beoogde blootstellingsroute is, en zij mag uitsluitend worden toegepast met een specifieke wetenschappelijke motivering. Als de teststof wordt vermengd met voedsel of drinkwater, met name in geval van één toediening, moet ervoor worden gezorgd dat de tijdsduur tussen de consumptie van voedsel en water en de bemonstering voldoende is om de effecten te kunnen detecteren (zie de punten 33-34). Het maximale vloeistofvolume dat via sonde of injectie per keer kan worden toegediend, hangt af van de grootte van het proefdier. Het volume mag normaal gesproken niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht. Bij een waterige oplossing kan echter maximaal 2 ml/100 g lichaamsgewicht worden gebruikt. Hogere volumes dan dit moeten worden onderbouwd. Behalve bij irriterende of bijtende teststoffen, die normaal gesproken bij hogere concentraties hevigere effecten hebben, moeten volumeverschillen tot een minimum worden beperkt door de concentratie aan te passen, zodat er op alle dosisniveaus hetzelfde volume in verhouding tot het lichaamsgewicht wordt toegediend.

Behandelingsschema

De teststoffen worden normaal gesproken in één dosis toegediend, maar de dosis kan eventueel worden gesplitst (bv. twee of meer porties op dezelfde dag met een interval van niet meer dan 2-3 uur) om de toediening van een groot volume te vergemakkelijken. In deze omstandigheden, of wanneer de teststof wordt toegediend door inhalatie, moet het bemonsteringstijdstip worden gepland op basis van het tijdstip van de laatste dosistoediening of het einde van de blootstelling.

Er zijn voor deze test weinig gegevens over de geschiktheid van een protocol met herhaalde toediening beschikbaar. In omstandigheden waarin het wenselijk is om deze test te integreren met een toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening, moet verlies van mitotische cellen met chromosoombeschadigingen die bij toxische doses kunnen voorkomen, echter worden vermeden. Zo'n integratie is aanvaardbaar wanneer de hoogste dosis groter is dan of gelijk is aan de limietdosis (zie punt 29) en een dosisgroep voor de duur van de behandelingsperiode de limietdosis toegediend krijgt. De micronucleustest (testmethode B.12) moet worden beschouwd als de in-vivotest voor chromosoomafwijkingen die de voorkeur geniet wanneer integratie met andere onderzoeken gewenst is.

Beenmergmonsters worden na een dosis in één keer op twee aparte tijdstippen genomen. Voor knaagdieren ligt het eerste bemonsteringstijdstip op 1,5 maal de normale lengte van een celcyclus (deze cyclus duurt normaal gesproken 12-18 uur) na de behandeling. Aangezien de voor de opname en het metabolisme van de teststof(fen) vereiste tijd en de effecten op de kinetiek van de celcyclus gevolgen kunnen hebben voor het optimale tijdstip om chromosoomafwijkingen te detecteren, verdient het aanbeveling 24 uur na het eerste bemonsteringstijdstip opnieuw te bemonsteren. Op het eerste bemonsteringstijdstip worden alle dosisgroepen behandeld en worden monsters genomen voor de analyse; op het (de) latere bemonsteringstijdstip(pen) hoeft echter alleen de hoogste dosis te worden toegediend. Indien het doseringsschema op grond van een wetenschappelijke onderbouwing meer dan één dag beslaat, moet in het algemeen één bemonsteringstijdstip op maximaal ongeveer 1,5 maal de normale lengte van een celcyclus na de laatste toediening worden gebruikt.

Na de behandeling en voorafgaand aan de bemonstering, worden de dieren intraperitoneaal geïnjecteerd met een adequate dosis metafasestopper (bv. colcemid of colchicine) en worden de dieren na een adequate pauze bemonsterd. Voor muizen moet er ongeveer 3-5 uur worden gewacht tot de bemonstering, en voor ratten 2-5 uur. De cellen worden uit het beenmerg gehaald, opgebold, gefixeerd en gekleurd en op chromosoomafwijkingen geanalyseerd (12).

Observaties

Algemene klinische observaties van de proefdieren moeten ten minste eenmaal per dag plaatsvinden en klinische tekenen moeten ten minste eenmaal per dag worden geregistreerd, bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip en met inachtneming van de piekperiode van de te verwachten effecten na toediening. Gedurende de toedieningsperiode moeten alle dieren ten minste tweemaal per dag worden geobserveerd op ziekteverschijnselen en sterfte. Alle dieren moeten bij aanvang van het onderzoek, tijdens onderzoeken met herhaalde toediening ten minste eenmaal per week, en bij het doden worden gewogen. In onderzoeken met een duur van ten minste één week moet het voedselverbruik ten minste wekelijks worden gemeten. Als de teststof met het drinkwater wordt toegediend, moet het waterverbruik bij elke verversing van water en ten minste wekelijks worden gemeten. Dieren die niet-letale indicatoren van excessieve toxiciteit vertonen moeten voor afloop van de testperiode op humane wijze worden gedood (11).

Blootstelling van doelweefsel

Op een of meer passende tijdstippen moet een bloedmonster worden genomen en moeten de plasmaspiegels van de teststoffen worden onderzocht om aan te tonen dat blootstelling van het beenmerg heeft plaatsgevonden, in situaties waar dit gerechtvaardigd is en waar geen andere blootstellingsgegevens bestaan (zie punt 44).

Beenmerg en chromosoompreparaten

Onmiddellijk na humane doding worden uit de dijbenen of scheenbenen van de dieren beenmergcellen verwijderd, in een hypotone oplossing gebracht en gefixeerd. De metafasecellen worden vervolgens op objectglaasjes uitgesmeerd en gekleurd met vastgestelde methoden (zie (3) (12)).

Analyse

Alle objectglaasjes, ook die van de positieve en negatieve controles, worden vóór de analyse onafhankelijk gecodeerd en worden gerandomiseerd, zodat de scorer de behandelingssituatie niet kent.

Als maat voor de cytotoxiciteit wordt de mitotische index bepaald in ten minste 1000 cellen per dier voor alle behandelde dieren (ook de positieve controles), onbehandelde dieren voor de negatieve controle of dieren die medium/oplosmiddel toegediend hebben gekregen voor de negatieve controle.

Voor elk dier worden ten minste 200 metafasen geanalyseerd op structurele chromosoomafwijkingen, inclusief en exclusief hiaten (6). Als de databank met historische negatieve controlegegevens echter uitwijst dat de gemiddelde achtergrondfrequentie van structurele chromosoomafwijkingen in het testlaboratorium <1 % is, moet worden overwogen aanvullende cellen te scoren. Afwijkingen van het chromatidetype en chromosoomtype worden apart geregistreerd en ingedeeld in subtypen (breuken, uitwisselingen). De in het laboratorium gebruikte procedures moeten ervoor zorgen dat de analyse van chromosoomafwijkingen wordt uitgevoerd door goed opgeleide scorers en zo nodig collegiaal wordt getoetst. Aangezien bij de bereiding van de objectglaasjes vaak een gedeelte van de metafasecellen breekt, waarbij chromosomen verloren gaan, mogen de gescoorde cellen niet minder dan 2n ± 2 centromeren bevatten, waarin n het haploïde aantal chromosomen voor die soort is.

GEGEVENS EN RAPPORTAGE

Verwerking van de resultaten

Gegevens van individuele dieren moeten in tabelvorm worden gepresenteerd. De mitotische index, het aantal gescoorde metafasecellen, het aantal afwijkingen per metafasecel en het percentage cellen met een of meer structurele chromosoomafwijkingen moeten per dier worden geëvalueerd. Er moet een overzicht worden gegeven van de verschillende soorten structurele chromosoomafwijkingen met de aantallen en de frequentie waarmee ze in de behandelde en controlegroepen voorkomen. Hiaten, alsmede polyploïde cellen en cellen met endoreduplicatie van chromosomen worden apart geregistreerd. De frequentie van hiaten wordt geregistreerd, maar in het algemeen niet opgenomen in de analyse van de totale frequentie van structurele afwijkingen. Als er geen aanwijzingen zijn voor verschillen in reactie tussen de geslachten, kunnen de gegevens voor de statistische analyse worden gecombineerd. Gegevens over de toxiciteit en klinische tekenen bij dieren moeten eveneens worden gemeld.

Aanvaardbaarheidscriteria

Voor de aanvaardbaarheid van de test gelden de volgende criteria:

Beoordeling en interpretatie van resultaten

Indien aan alle aanvaardbaarheidscriteria is voldaan, wordt een teststof als duidelijk positief beschouwd als:

Indien op een bepaald bemonsteringstijdstip alleen de hoogste dosis wordt onderzocht, wordt een teststof als duidelijk positief beschouwd als er een statistisch significante stijging vergeleken met de gelijktijdige negatieve controle is en de resultaten buiten de verdeling van de historische negatieve controlegegevens vallen (bv. op Poisson-verdeling gebaseerde 95 %-controlegrenzen). Aanbevelingen voor de passende statistische methoden zijn te vinden in de literatuur (13). Wanneer een dosisresponsanalyse wordt uitgevoerd, moeten ten minste drie behandelde dosisgroepen worden geanalyseerd. De statistische toetsen moeten het dier als de proefeenheid gebruiken. Positieve resultaten in de test op chromosoomafwijkingen geven aan dat een teststof structurele chromosoomafwijkingen in het beenmerg van de geteste soort induceert.

Indien aan alle aanvaardbaarheidscriteria is voldaan, wordt een teststof als duidelijk negatief beschouwd als in alle onderzochte experimentele omstandigheden:

Aanbevelingen voor de meest passende statistische methoden zijn te vinden in de literatuur (13). Bewijs van blootstelling van het beenmerg aan een teststof kan zijn achteruitgang van de mitotische index of meting van het plasma of bloedspiegels van de teststof(fen). In geval van intraveneuze toediening is geen bewijs van blootstelling nodig. Als alternatief kunnen ADME-gegevens verkregen in een onafhankelijke studie met dezelfde toedieningsweg en dezelfde soort worden gebruikt om blootstelling van het beenmerg aan te tonen. Negatieve resultaten geven aan dat de teststof onder de testomstandigheden geen structurele chromosoomafwijkingen in het beenmerg van de onderzochte soort induceert.

Een duidelijk positieve of duidelijk negatieve reactie behoeft niet te worden bevestigd.

Indien de reactie noch duidelijk negatief noch duidelijk positief is en om de biologische relevantie van een resultaat te helpen vaststellen (bv. een zwakke of zeer lichte toename), moeten de gegevens door een deskundige en/of nader onderzoek van de bestaande voltooide experimenten worden beoordeeld. In sommige gevallen kan het nuttig zijn meer cellen te analyseren of een herhalingsexperiment onder aangepaste experimentele omstandigheden uit te voeren.

In zeldzame gevallen zal op basis van de gegevens, zelfs na nader onderzoek, niet kunnen worden geconcludeerd dat de teststof positieve of negatieve resultaten oplevert, en zal de studie daarom als moeilijk te interpreteren worden beschouwd.

De frequenties van polyploïde metafasen en metafasen met endoreduplicatie ten opzichte van het totale aantal metafasen moeten apart worden geregistreerd. Een stijging van het aantal polyploïde cellen en/of cellen met endoreduplicatie kan erop wijzen dat de teststof in staat is mitotische processen of de voortgang van de celcyclus te remmen (zie punt 3).

Testverslag

In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

Samenvatting

LITERATUUR

5)

In deel B wordt hoofdstuk B.12 vervangen door:

„B.12   Micronucleustest bij erytrocyten van zoogdieren

INLEIDING

Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 474 (2016) van de OESO. Zij maakt deel uit van een reeks testmethoden op het gebied van de genetische toxicologie. Er is een OESO-document opgesteld met beknopte informatie over genetisch-toxicologische tests en een overzicht van de recente wijzigingen van deze testrichtlijnen (1).

De in-vivomicronucleustest bij zoogdieren is met name van belang voor de beoordeling van genotoxiciteit, omdat factoren van het in-vivometabolisme, de farmacokinetiek en de DNA-herstelprocessen actief zijn en bijdragen aan de reacties op de test, hoewel deze aspecten per soort kunnen verschillen. Een in-vivobepaling is ook geschikt om in vitro gesignaleerde genotoxiciteit nader te onderzoeken.

De in-vivomicronucleustest bij zoogdieren wordt gebruikt om te bepalen of de teststof chromosoombeschadigingen of beschadiging van het mitotisch apparaat in de erytroblasten induceert. De test beoordeelt de vorming van micronuclei in erytrocyten die zijn verkregen uit het beenmerg of perifere bloedcellen van dieren, meestal knaagdieren.

De micronucleustest is bedoeld om chemische stoffen te signaleren die cytogenetische schade veroorzaken waarbij micronuclei ontstaan met achtergebleven chromosoomfragmenten of volledige chromosomen.

Wanneer een erytroblast uit het beenmerg zich ontwikkelt tot een onrijpe erytrocyt (ook polychromatische erytrocyt of reticulocyt genoemd), wordt de hoofdkern uitgestoten; wanneer een micronucleus is ontstaan, kan deze in het cytoplasma achterblijven. Omdat deze cellen geen hoofdkern bevatten, zijn de micronuclei gemakkelijk zichtbaar te maken of op te sporen. Een stijging van de frequentie waarmee bij behandelde dieren onrijpe erytrocyten met micronuclei worden aangetroffen, wijst op structurele of numerieke chromosoomafwijkingen.

Nieuwgevormde erytrocyten met micronuclei worden geïdentificeerd en kwantitatief bepaald door kleuring gevolgd door hetzij visuele scoring met een microscoop of geautomatiseerde analyse. Het tellen van voldoende rijpe erytrocyten in het perifeer bloed of beenmerg van volwassen dieren wordt veel gemakkelijker wanneer een geautomatiseerd scoringplatform wordt gebruikt. Zulke platforms zijn aanvaardbaar als alternatief voor handmatige beoordeling (2). Uit vergelijkend onderzoek is gebleken dat deze methoden, die gebruikmaken van passende kalibratiestandaarden, een betere inter- en intralaboratoriumreproduceerbaarheid en -gevoeligheid kunnen verschaffen dan het handmatig scoren met een microscoop (3) (4). Geautomatiseerde systemen die frequenties van erytrocyten met micronuclei kunnen meten, zijn onder andere flowcytometers (5), beeldanalyseplatforms (6) (7) en laserscanningcytometers (8).

Hoewel het in het kader van de test normaal gesproken niet wordt gedaan, kunnen chromosoomfragmenten aan de hand van een aantal criteria worden onderscheiden van hele chromosomen. Daartoe behoren de vaststelling van de aan- of afwezigheid van een kinetochoor- of centromeer-DNA, die beide kenmerkend zijn voor intacte chromosomen. De afwezigheid van een kinetochoor- of centromeer-DNA wijst erop dat de micronucleus uitsluitend fragmenten van chromosomen bevat, terwijl de aanwezigheid ervan wijst op verlies van chromosomen.

De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1.

INLEIDENDE OVERWEGINGEN

Het beenmerg van jonge volwassen knaagdieren is het doelweefsel voor genetische schade in deze test, aangezien in dit weefsel erytrocyten worden gevormd. De meting van micronuclei in onrijpe erytrocyten in perifeer bloed is aanvaardbaar bij andere zoogdiersoorten waarvan is aangetoond dat de gevoeligheid om chemische stoffen die structurele of numerieke chromosoomafwijkingen in deze cellen veroorzaken te detecteren, afdoende is (door inductie van micronuclei in onrijpe erytrocyten) en mits een wetenschappelijke motivering wordt gegeven. De frequentie van onrijpe erytrocyten met micronuclei is het belangrijkste eindpunt. De frequentie van rijpe erytrocyten in het perifere bloed met micronuclei kan ook als eindpunt van de bepaling worden gebruikt bij diersoorten zonder sterke selectie in de milt tegen cellen met micronuclei en wanneer de dieren gedurende een periode langer dan de levensduur van de erytrocyt in de gebruikte diersoort ononderbroken worden behandeld. (bv. 4 weken of langer voor muizen).

Als er aanwijzingen zijn dat de teststof(fen), of een of meer metabolieten daarvan, niet in het doelweefsel terechtkom(t)(en), is deze test mogelijk niet geschikt.

Voordat de testmethode wordt gebruikt op een mengsel om gegevens te genereren voor een beoogd regelgevingsdoel, moet worden nagegaan of, en zo ja, waarom deze methode betrouwbare resultaten oplevert voor dat doel. Zulke overwegingen zijn niet nodig wanneer het testen van het mengsel wettelijk vereist is.

PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

De dieren worden langs een geschikte weg aan de teststof blootgesteld. Als beenmerg wordt gebruikt, worden de dieren op een of meer geschikte tijdstippen na de behandeling op humane wijze gedood, wordt het beenmerg verwijderd en worden er preparaten gemaakt die worden gekleurd (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Wanneer perifeer bloed wordt gebruikt, wordt op een of meer geschikte tijdstippen na de behandeling bloed afgenomen en worden er preparaten gemaakt die worden gekleurd (12) (16) (17) (18). Wanneer acuut een behandeling wordt toegepast, is het belangrijk tijdstippen voor het oogsten van beenmerg of bloed te kiezen waarop de inductie van onrijpe erytrocyten met micronuclei als gevolg van de behandeling kan worden gedetecteerd. In geval van bemonstering van perifeer bloed, moet ook zoveel tijd zijn verstreken dat deze gebeurtenissen in het circulerende bloed zichtbaar worden. De preparaten worden onderzocht op de aanwezigheid van micronuclei, door visualisatie met een microscoop, beeldanalyse, flowcytometrie of laserscanningcytometrie.

VERIFICATIE VAN DE BEKWAAMHEID VAN LABORATORIA

Bekwaamheidsonderzoek

Om voldoende ervaring met het uitvoeren van de bepaling vast te stellen voordat deze wordt gebruikt voor routinetests, moet het laboratorium hebben aangetoond in staat te zijn verwachte resultaten uit gepubliceerde gegevens (17) (19) (20) (21) (22) te reproduceren voor frequenties van micronuclei met minimaal twee positieve controlestoffen (waaronder zwakke responsen geïnduceerd door lage doses positieve controles), zoals de stoffen vermeld in tabel 1 en met vergelijkbare medium-/oplosmiddelcontroles (zie punt 26). Bij deze experimenten moeten doses worden gebruikt die leiden tot reproduceerbare en dosisgerelateerde toenamen en moeten de gevoeligheid en het dynamisch bereik van het testsysteem in het te onderzoeken weefsel (beenmerg of perifeer bloed) aantonen en gebruikmaken van de scoringmethode die binnen het laboratorium zal worden aangewend. Deze eis geldt niet voor laboratoria met ervaring, d.w.z. laboratoria die beschikken over referentiegegevens uit het verleden zoals omschreven in de punten 14-18.

Controlegegevens uit het verleden

Tijdens het bekwaamheidsonderzoek stelt het laboratorium vast:

Wanneer voor het eerst gegevens worden verkregen voor een verdeling van negatieve controles uit het verleden, moeten gelijktijdige negatieve controles consistent zijn met gepubliceerde controlegegevens, indien deze bestaan. Wanneer meer experimentele gegevens aan de verdeling van historische controles worden toegevoegd, moeten gelijktijdige negatieve controles idealiter binnen de 95 %-controlegrenzen van deze verdeling liggen. De databank met historische negatieve controlegegevens van het laboratorium moet statistisch robuust zijn om te waarborgen dat het laboratorium de verdeling van zijn negatieve controlegegevens kan beoordelen. Uit de literatuur komt naar voren dat daarvoor minimaal 10 experimenten nodig zijn, maar dat bij voorkeur ten minste 20 experimenten worden gebruikt die onder vergelijkbare experimentele omstandigheden zijn uitgevoerd. Laboratoria moeten methoden voor kwaliteitscontrole gebruiken, zoals controlekaarten (bv. C-kaarten of X-kaarten (23)), om vast te stellen hoe variabel hun gegevens zijn en om aan te tonen dat het laboratorium de methodologie 'onder controle' heeft. Verdere aanbevelingen voor het opbouwen en gebruiken van de historische gegevens (d.w.z. criteria voor het opnemen van gegevens in en het uitsluiten ervan uit de historische gegevens en de aanvaardbaarheidscriteria voor een gegeven experiment) zijn te vinden in de literatuur (24).

Wanneer het laboratorium tijdens het bekwaamheidsonderzoek (zoals beschreven in punt 13) een onvoldoende aantal experimenten voltooit om een statistisch robuuste verdeling van negatieve controles vast te stellen (zie punt 15), is het aanvaardbaar de verdeling tijdens de eerste routinetests op te bouwen. Bij deze aanpak moeten de aanbevelingen worden gevolgd die in de literatuur zijn uiteengezet (24), en de negatieve controleresultaten die in deze experimenten worden verkregen, moeten consistent blijven met gepubliceerde negatieve controlegegevens.

Bij eventuele wijzigingen in het experimentele protocol moet rekening worden gehouden met hun implicaties voor de vraag of de resulterende gegevens consistent blijven met de databank met bestaande historische controlegegevens van het laboratorium. Alleen grote inconsistenties moeten leiden tot de oprichting van een nieuwe databank met historische controlegegevens, waarbij deskundigen bepalen welke controles afwijken van de eerdere verdeling (zie punt 15). Tijdens de hernieuwde opbouw is een volledige databank met negatieve controlegegevens mogelijk niet nodig om een echte test te mogen uitvoeren, mits het laboratorium kan aantonen dat zijn gelijktijdige negatieve controlewaarden consistent blijven met hetzij zijn eerdere databank hetzij de overeenkomstige gepubliceerde gegevens.

Negatieve controlegegevens moeten bestaan uit de incidentie van onrijpe erytrocyten met micronuclei in elk dier. Gelijktijdige negatieve controles liggen idealiter binnen de 95 %-controlegrenzen van de verdeling van de verzameling historische negatieve controlegegevens van het laboratorium. Wanneer gegevens van gelijktijdige negatieve controles buiten de 95 %-controlegrenzen vallen, kan opneming ervan in de historische controleverdeling toch aanvaardbaar zijn zolang deze gegevens geen extreme uitschieters zijn en er bewijs is dat het testsysteem 'onder controle' is (zie punt 15) en er geen bewijs is van technisch of menselijk falen.

BESCHRIJVING VAN DE METHODE

Voorbereidingen

Keuze van de diersoort

Er dient gebruik te worden gemaakt van gezonde jonge volwassen dieren van in het laboratorium gangbare stammen. Er kunnen muizen, ratten en andere geschikte zoogdiersoorten worden gebruikt. Wanneer perifeer bloed wordt gebruikt, moet worden vastgesteld dat verwijdering van cellen met micronuclei uit de bloedsomloop door de milt de detectie van geïnduceerde micronuclei in de gekozen soort niet in het gedrang brengt. Dit is voor perifeer bloed van muizen en ratten al aangetoond (2). De wetenschappelijke rechtvaardiging voor het gebruik van andere soorten dan ratten en muizen moet in het verslag worden opgenomen. Als andere soorten dan knaagdieren worden gebruikt, wordt aanbevolen de meting van geïnduceerde micronuclei te integreren in een andere passende toxiciteitstest.

Huisvestings- en voedingsomstandigheden van de dieren

De temperatuur in de proefdierruimte moet voor knaagdieren 22 °C (± 3 °C) zijn. Hoewel de relatieve vochtigheid idealiter 50-60 % is, dient deze minimaal 40 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % te zijn, behalve bij het reinigen van de ruimte. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende mengbaarheid met de teststof te zorgen, wanneer de stof via het voer wordt toegediend. Knaagdieren moeten worden gehuisvest in kleine groepen (niet meer dan vijf dieren per kooi) van hetzelfde geslacht en dezelfde behandelingsgroep als geen agressief gedrag wordt verwacht, bij voorkeur in kooien met een stevige vloer met passende milieuverrijking. De dieren mogen uitsluitend individueel worden gehuisvest als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is.

Voorbereiding van de dieren

Normaal gesproken worden gezonde jonge volwassen dieren gebruikt (voor knaagdieren idealiter 6-10 weken oud bij het begin van de behandeling, hoewel iets oudere dieren ook aanvaardbaar zijn) en aselect ingedeeld in de behandelde en controlegroepen. De afzonderlijke dieren krijgen op humane, minimaal invasieve wijze een unieke identificatie (bv. door het aanbrengen van een ring, tag, microchip of door biometrische identificatie, maar niet door het afknippen van oren of tenen) en krijgen minimaal vijf dagen de tijd om in het laboratorium te acclimatiseren. De kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. Kruisverontreiniging door de positieve controle en de teststof moet worden vermeden. Bij het begin van de studie moet per geslacht het gewichtsverschil tussen de dieren zo klein mogelijk zijn en mag dit niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht bedragen.

Voorbereiding van de doses

Vaste chemische teststoffen moeten worden opgelost of gesuspendeerd in geschikte oplosmiddelen of media of worden vermengd met voedsel of drinkwater voordat dit aan de dieren wordt gegeven. Vloeibare chemische teststoffen kunnen direct worden gegeven of eerst worden verdund. Voor blootstelling via inhalatie kunnen teststoffen worden toegediend als een gas, damp of een vaste/vloeibare aerosol, naargelang van de fysisch-chemische eigenschappen ervan. Er dienen verse preparaten van de teststof te worden toegepast, tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat bewaren van de preparaten aanvaardbaar is en blijkt wat de juiste bewaaromstandigheden zijn.

Testomstandigheden

Oplosmiddel/medium

Het oplosmiddel/medium mag bij de gebruikte dosisniveaus geen toxische effecten veroorzaken en chemische reacties met de teststoffen moeten uitgesloten zijn. Als andere oplosmiddelen/media worden gebruikt dan de algemeen bekende, moet het gebruik ervan worden ondersteund met referentiegegevens die wijzen op de verenigbaarheid ervan. Het wordt aanbevolen waar mogelijk eerst het gebruik van een waterig oplosmiddel/medium te overwegen. Voorbeelden van vaak gebruikte compatibele oplosmiddelen/media zijn water, fysiologische zoutoplossing, methylcelluloseoplossing, natriumcarboxymethylcellulose-zoutoplossing, olijfolie en maïsolie. Bij het ontbreken van historische of gepubliceerde controlegegevens waaruit blijkt dat een gekozen atypisch oplosmiddel/medium geen micronuclei en andere schadelijke effecten veroorzaakt, dient een eerste onderzoek te worden uitgevoerd om vast te stellen dat de oplosmiddel/mediumcontrole aanvaardbaar is.

Controles

Positieve controles

Normaal gesproken wordt in elke test een groep dieren opgenomen die wordt behandeld met een positieve controlestof. Hiervan kan worden afgezien wanneer het testlaboratorium aantoonbare bekwaamheid heeft in het uitvoeren van de test en een bereik van historische positieve controles heeft vastgesteld. Wanneer geen parallelle positieve controlegroep wordt opgenomen, moeten in elk experiment scoringcontroles (ongekleurde en ongefixeerde preparaten of celsuspensiemonsters, indien van toepassing voor de scoringmethode) worden opgenomen. Deze kunnen worden verkregen door in de scoring van de studie passende referentiemonsters op te nemen die zijn verkregen en bewaard van een apart positieve controle-experiment dat op gezette tijden (bv. elke 6-18 maanden) wordt verricht; bijvoorbeeld tijdens de bekwaamheidstoetsing en daarna op gezette tijden, indien nodig.

Positieve controlestoffen moeten op betrouwbare wijze leiden tot een detecteerbare stijging van de frequentie van micronuclei ten opzichte van het spontane niveau. Bij het handmatig scoren met een microscoop moeten de doseringen van de positieve controles zodanig worden gekozen dat de effecten duidelijk zijn, maar de gecodeerde monsters niet onmiddellijk als zodanig herkenbaar zijn voor de scorer. Het is aanvaardbaar dat de positieve controle langs een andere weg wordt toegediend dan de teststof, met behulp van een ander behandelingsschema, en dat bemonstering op slechts één tijdstip plaatsvindt. Tevens kan, waar dat van toepassing is, het gebruik van chemische stoffen uit een verwante chemische klasse als positieve controle worden overwogen. Voorbeelden van voor positieve controle gebruikte chemische stoffen staan vermeld in tabel 1.

Tabel 1

Voorbeelden van positieve controlestoffen.

Chemische stoffen en CAS RN

Ethylmethaansulfonaat [CAS RN 62-50-0]

Methylmethaansulfonaat [CAS RN 66-27-3]

Ethylnitrosoureum [CAS RN 759-73-9]

Mitomycine C [CAS RN 50-07-7]

Cyclofosfamide (monohydraat) [CAS RN 50-18-0 (CAS RN 6055-19-2)]

Triëthyleenmelamine [CAS RN 51-18-3]

Colchicine [CAS RN 64-86-8] of vinblastine [CAS RN 865-21-4] — als aneugenen

Negatieve controles

Dieren in een negatieve controlegroep moeten op alle bemonsteringstijdstippen worden opgenomen en ook verder op dezelfde wijze worden behandeld als de behandelingsgroepen, zij het dat zij geen teststof toegediend krijgen. Indien bij de toediening van de teststof van een oplosmiddel/medium gebruik wordt gemaakt, dient dit oplosmiddel/medium aan de controlegroep toegediend te worden. Als uit historische negatieve controlegegevens op ieder bemonsteringstijdstip voor het testlaboratorium een consistente spreiding over de dieren en consistente frequenties van cellen met micronuclei blijken, is mogelijk slechts één enkele bemonstering voor de negatieve controle nodig. Wanneer voor negatieve controles één bemonstering plaatsvindt, dient deze plaats te vinden op het eerste bemonsteringstijdstip dat in de studie wordt gebruikt.

Als perifeer bloed wordt gebruikt, kan een monster dat vóór de behandeling wordt genomen ook aanvaardbaar zijn in plaats van een gelijktijdige negatieve controle, maar alleen wanneer het gaat om een korte studie en wanneer de resultaten consistent zijn met de controlegegevens uit het verleden van het testlaboratorium. Voor ratten is aangetoond dat het nemen van kleine monsters (bv. minder dan 100 μl/dag) vóór de behandeling een minimaal effect heeft op de achtergrondfrequentie van micronuclei (25).

PROCEDURE

Aantal en geslacht van de dieren

In het algemeen is de micronucleusrespons voor mannetjes en vrouwtjes vergelijkbaar, en de meeste studies kunnen daarom bij beide geslachten worden uitgevoerd (26). Gegevens waaruit blijkt dat er relevante verschillen tussen vrouwtjes en mannetjes bestaan (bv. verschillen in systemische toxiciteit, metabolisme, biologische beschikbaarheid, toxiciteit voor het beenmerg enz., met inbegrip van bv. in een bereikbepalingsonderzoek), zijn een aanmoediging om beide geslachten te gebruiken. In dit geval kan het passend zijn om een onderzoek bij beide geslachten uit te voeren, bijvoorbeeld als onderdeel van een toxiciteitsonderzoek bij herhaalde toediening. Het kan passend zijn om een factoriële onderzoeksopzet te gebruiken als beide geslachten worden gebruikt. Details over de wijze waarop de gegevens bij deze onderzoeksopzet moeten worden geanalyseerd, zijn te vinden in aanhangsel 2.

De vaststelling van de groepsgrootte aan het begin van het onderzoek moet erop gericht zijn minimaal 5 analyseerbare dieren van één geslacht, of van elk geslacht als beide worden gebruikt, per groep te krijgen. Wanneer de blootstelling aan een chemische stof bij de mens door het geslacht wordt bepaald, zoals dit bijvoorbeeld bij sommige geneesmiddelen het geval is, moet de test bij het desbetreffende geslacht worden uitgevoerd. Als richtsnoer voor de maximale typische behoefte aan dieren: voor een onderzoek in beenmerg uitgevoerd volgens de in punt 37 vastgestelde parameters met drie dosisgroepen en parallelle negatieve en positieve controlegroepen (elke groep bestaande uit vijf dieren van één geslacht) zijn 25 tot 35 dieren nodig.

Dosisniveaus

Als er een bereikbepalingsonderzoek wordt uitgevoerd omdat er nog geen bruikbare gegevens over de dosering beschikbaar zijn, moet dit in hetzelfde laboratorium gebeuren met dezelfde soort, dezelfde stam, hetzelfde geslacht en hetzelfde behandelingsschema als bij het hoofdonderzoek (27). Het onderzoek moet erop gericht zijn de maximaal verdraagbare dosis (maximum tolerated dose, MTD) vast te stellen, dat wil zeggen, de hoogste dosis die zal worden verdragen zonder aanwijzingen voor onderzoeksbeperkende toxiciteit, in verhouding tot de duur van de onderzoeksperiode (bv. door het veroorzaken van gewichtsverlies of cytotoxiciteit voor het hematopoïetisch systeem, maar geen dood of aanwijzingen voor pijn, lijden of nood die humane doding noodzakelijk maken (28)).

De hoogste dosis kan ook worden gedefinieerd als een dosis die enigerlei aanwijzing van toxiciteit voor het beenmerg oplevert (bv. een daling van de verhouding tussen het aantal onrijpe erytrocyten en het totale aantal erytrocyten in het beenmerg of perifeer bloed met meer dan 50 %, maar tot niet lager dan 20 % van de controlewaarde). Bij het analyseren van CD71-positieve cellen in de perifere bloedsomloop (bv. door flowcytometrie) reageert deze zeer jonge fractie onrijpe erytrocyten sneller op toxische uitdagingen dan het grotere RNA-positieve cohort onrijpe erytrocyten. Daardoor kan bij opzetten met acute blootstelling waarin de fractie CD71-positieve onrijpe erytrocyten wordt onderzocht, een hogere klaarblijkelijke toxiciteit worden gevonden dan bij opzetten die onrijpe erytrocyten identificeren op basis van RNA-gehalte. Wanneer in experimenten wordt gewerkt met niet meer dan vijf behandelingsdagen, kan het hoogste dosisniveau voor de teststoffen die toxiciteit veroorzaken, dus worden gedefinieerd als de dosis die een statistisch significante verlaging veroorzaakt in de verhouding tussen CD71-positieve onrijpe erytrocyten en het totale aantal erytrocyten, maar tot niet minder dan 5 % van de controlewaarde (29).

Chemische stoffen die verzadiging van toxicokinetische eigenschappen vertonen, of detoxificatieprocessen induceren die kunnen leiden tot een afname van de blootstelling na langlopende toediening, kunnen uitzonderingen zijn op de doseringscriteria en moeten per geval worden beoordeeld.

Om dosisresponsinformatie te krijgen, moet een volledig onderzoek een negatieve controlegroep omvatten en minimaal drie dosisniveaus die in het algemeen een factor 2, maar niet meer dan een factor 4, uit elkaar liggen. Als in een bereikbepalingsonderzoek of op basis van bestaande gegevens geen aanwijzingen voor toxiciteit van de teststof worden gevonden, moet de hoogste dosis voor een toedieningsperiode van 14 dagen of langer 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag zijn, of voor een toedieningsperiode van minder dan 14 dagen 2 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag. Als de teststof echter wel toxiciteit veroorzaakt, moet de MTD de hoogste toegediende dosis zijn en moeten de gebruikte dosisniveaus bij voorkeur een bereik dekken van maximale tot weinig of geen toxiciteit. Wanneer toxiciteit voor het doelweefsel (beenmerg) bij alle geteste dosisniveaus wordt waargenomen, wordt verder onderzoek bij niet-toxische doses aanbevolen. Voor onderzoek dat ten doel heeft de kwantitatieve dosisresponsinformatie volledig te kenschetsen, kunnen aanvullende dosisgroepen nodig zijn. Voor bepaalde typen teststoffen (bv. geneesmiddelen voor menselijk gebruik) waarvoor specifieke eisen gelden, kunnen deze limieten verschillen.

Limiettest

Als uit doseringsbereikstudies of bestaande gegevens bij gerelateerde dierstammen blijkt dat een behandelingsregime van minstens de limietdosis (zoals hieronder beschreven) geen waarneembare toxische effecten geeft (met inbegrip van achteruitgang van de proliferatie van beenmerg of andere aanwijzingen van toxiciteit voor het doelweefsel), en als op grond van in-vitro genotoxiciteitsstudies of gegevens bij structureel verwante chemische stoffen geen genotoxiciteit wordt verwacht, dan is een volledig onderzoek met drie dosisniveaus mogelijk niet nodig, mits is aangetoond dat de teststof(fen) het doelweefsel (beenmerg) bereik(t)(en). In zulke gevallen kan één dosisniveau, gelijk aan de limietdosis, voldoende zijn. Voor een toedieningsperiode van 14 dagen of meer is de limietdosis 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag. Voor een toedieningsperiode van minder dan 14 dagen is de limietdosis 2 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag.

Toediening van de doses

Bij de opzet van een test moet rekening worden gehouden met de verwachte blootstellingsroute bij mensen. Daarom kunnen andere blootstellingsroutes zoals voeding, drinkwater, lokaal subcutaan, intraveneus, oraal (via sonde), inhalatie, intratracheaal of implantatie worden gekozen, als deze onderbouwd worden. De route moet in elk geval zodanig worden gekozen dat adequate blootstelling van het (de) doelweefsel(s) is gewaarborgd. Intraperitoneale injectie wordt in het algemeen niet aanbevolen, omdat zij bij mensen geen beoogde blootstellingsroute is, en zij mag uitsluitend worden toegepast met een specifieke wetenschappelijke motivering. Als de teststof wordt vermengd met voedsel of drinkwater, met name in geval van één toediening, moet ervoor worden gezorgd dat de tijdsduur tussen de consumptie van voedsel en water en de bemonstering voldoende is om de effecten te kunnen detecteren (zie punt 37). Het maximale vloeistofvolume dat via sonde of injectie per keer kan worden toegediend, hangt af van de grootte van het proefdier. Het volume mag normaal gesproken niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht. Bij een waterige oplossing kan echter maximaal 2 ml/100 g lichaamsgewicht worden gebruikt. Hogere volumes dan dit moeten worden onderbouwd. Behalve bij irriterende of bijtende teststoffen, die normaal gesproken bij hogere concentraties hevigere effecten hebben, moeten volumeverschillen tot een minimum worden beperkt door de concentratie aan te passen, zodat er op alle dosisniveaus hetzelfde volume in verhouding tot het lichaamsgewicht wordt toegediend.

Behandelingsschema

Bij voorkeur worden 2 of meer behandelingen uitgevoerd, toegediend met tussenpozen van 24 uur, in het bijzonder wanneer deze test wordt geïntegreerd met andere toxiciteitsonderzoeken. Als alternatief kunnen doses in één keer worden toegediend, als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is (bv. teststoffen waarvan bekend is dat ze de celcyclus blokkeren). De doses van de teststoffen kunnen eventueel worden gesplitst (bv. twee of meer porties op dezelfde dag met een interval van niet meer dan 2-3 uur) om de toediening van een groot volume te vergemakkelijken. In deze omstandigheden, of wanneer de teststof wordt toegediend door inhalatie, moet het bemonsteringstijdstip worden gepland op basis van het tijdstip van de laatste dosistoediening of het einde van de blootstelling.

De test kan bij muizen of ratten op een van de volgende drie manieren worden uitgevoerd:

Andere doserings- of bemonsteringsschema's kunnen worden gebruikt wanneer dat relevant en wetenschappelijk gerechtvaardigd is, en om integratie met andere toxiciteitstests te vergemakkelijken.

Observaties

Algemene klinische observaties van de proefdieren moeten ten minste eenmaal per dag plaatsvinden en klinische tekenen moeten ten minste eenmaal per dag worden geregistreerd, bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip en met inachtneming van de piekperiode van de te verwachten effecten na toediening. Gedurende de toedieningsperiode moeten alle dieren ten minste tweemaal per dag worden geobserveerd op ziekteverschijnselen en sterfte. Alle dieren moeten bij aanvang van het onderzoek, tijdens onderzoeken met herhaalde toediening ten minste eenmaal per week, en bij het doden worden gewogen. In onderzoeken met een duur van ten minste één week moet het voedselverbruik ten minste wekelijks worden gemeten. Als de teststof met het drinkwater wordt toegediend, moet het waterverbruik bij elke verversing van water en ten minste wekelijks worden gemeten. Dieren die niet-letale indicatoren van excessieve toxiciteit vertonen moeten voor afloop van de testperiode op humane wijze worden gedood (28). In bepaalde situaties kan de lichaamstemperatuur van dieren worden gecontroleerd, omdat door de behandeling geïnduceerde hyper- en hypothermie een rol spelen in het veroorzaken van foutieve resultaten (32) (33) (34).

Blootstelling van doelweefsel

Op een of meer passende tijdstippen moet een bloedmonster worden genomen en moeten de plasmaspiegels van de teststoffen worden onderzocht om aan te tonen dat blootstelling van het beenmerg heeft plaatsgevonden, in situaties waar dit gerechtvaardigd is en waar geen andere blootstellingsgegevens bestaan (zie punt 48).

Beenmerg/bloedpreparaten

Beenmergcellen worden doorgaans uit de dijbenen of scheenbenen van de dieren verwijderd, onmiddellijk na humane euthanasie. Gewoonlijk worden cellen verwijderd, geprepareerd en gekleurd met vastgestelde methoden. Kleine hoeveelheden perifeer bloed kunnen volgens passende normen inzake dierenwelzijn worden verkregen met een methode waarbij het proefdier blijft leven, zoals afname van bloed uit een ader in de staart of een ander geschikt bloedvat, of door hartpunctie of monstername uit een groot bloedvat bij de doding van het dier. Voor erytrocyten uit beenmerg of perifeer bloed kunnen cellen, afhankelijk van de analysemethode, onmiddellijk supravitaal worden gekleurd (16) (17) (18) of worden er uitstrijkpreparaten gemaakt die vervolgens worden gekleurd voor microscopie of gefixeerd en passend gekleurd voor flowcytometrische analyse. Door het gebruik van een DNA-specifieke kleurstof [bv. acridine oranje (35) of Hoechst 33258 plus pyronine-Y (36)] kunnen sommige artefacten die zich bij het gebruik van niet voor DNA specifieke kleurstoffen kunnen voordoen, worden voorkomen. Dit voordeel sluit het gebruik van conventionele kleurstoffen (bv. Giemsa voor microscopische analyse) niet uit. Ook andere systemen [zoals cellulosekolommen om cellen die een kern bevatten te verwijderen (37) (38)] kunnen worden gebruikt, mits is aangetoond dat deze systemen geschikt zijn voor monsterbereiding in het laboratorium.

Wanneer deze methoden van toepassing zijn, kunnen antikinetochore antilichamen (39), FISH met pancentromere DNA-proben (40) of geprepareerde in situ labeling met pancentromeer-specifieke primers, samen met de passende DNA-tegenkleuring (41) worden gebruikt om de aard (chromosoom/chromosoomfragment) van de micronuclei te identificeren, teneinde vast te stellen of het mechanisme van micronucleusinductie toe te schrijven is aan clastogene en/of aneugene activiteit. Andere methoden voor differentiatie tussen clastogenen en aneugenen kunnen worden gebruikt indien is aangetoond dat zij doeltreffend zijn.

Analyse (handmatig en geautomatiseerd)

Alle te analyseren objectglaasjes en monsters, ook die van positieve en negatieve controles, worden vóór willekeurig welk type analyse onafhankelijk gecodeerd en gerandomiseerd, zodat de handmatige scorer de behandelingssituatie niet kent; deze codering is niet nodig wanneer geautomatiseerde scoringsystemen worden gebruikt die niet vertrouwen op visuele inspectie en niet door hun bedieners kunnen worden beïnvloed. Voor elk dier wordt de verhouding tussen het aantal onrijpe erytrocyten en het totale aantal (onrijpe + rijpe) erytrocyten bepaald door in totaal voor het beenmerg ten minste 500 erytrocyten en voor het perifere bloed ten minste 2000 erytrocyten te tellen (42). Voor de bepaling van de frequentie waarmee onrijpe erytrocyten met micronuclei voorkomen, moeten ten minste 4000 onrijpe erytrocyten per dier worden gescoord (43). Als de databank met historische negatieve controlegegevens uitwijst dat de gemiddelde achtergrondfrequentie van onrijpe erytrocyten met micronuclei in het testlaboratorium < 0,1 % is, moet worden overwogen aanvullende cellen te scoren. Bij het analyseren van monsters mag de verhouding tussen het aantal onrijpe erytrocyten en het totale aantal erytrocyten in behandelde dieren niet lager zijn dan 20 % van de verhouding in de (medium/oplosmiddel) controles wanneer gescoord wordt met microscopie, en niet lager dan ongeveer 5 % van de verhouding in de (medium/oplosmiddel) controles wanneer CD71+ onrijpe erytrocyten gescoord worden met cytometrische methoden (zie punt 31) (29). Voorbeeld: voor een beenmergtest die wordt gescoord met microscopie, is de bovengrens voor de toxiciteit 10 % onrijpe erytrocyten als het aandeel onrijpe erytrocyten in het beenmerg in de controles 50 % is.

Omdat de milt bij ratten erytrocyten met micronuclei sekwestreert en vernietigt, geniet het de voorkeur de analyse van onrijpe erytrocyten met micronuclei te beperken tot de jongste fractie om bij het analyseren van perifeer bloed van ratten een hoge gevoeligheid van de test te behouden. Wanneer geautomatiseerde analysemethoden worden gebruikt, kunnen deze meest onrijpe erytrocyten worden geïdentificeerd op basis van hun hoge RNA-gehalte, of het hoge niveau van transferrinereceptoren (CD71+) aanwezig op hun oppervlak (31). Uit een directe vergelijking van verschillende kleuringsmethoden is echter gebleken dat met verschillende methoden, ook met conventionele kleuring met acridine oranje, bevredigende resultaten kunnen worden verkregen (3) (4).

GEGEVENS EN RAPPORTAGE

Verwerking van de resultaten

Gegevens van individuele dieren moeten in tabelvorm worden gepresenteerd. Voor elk onderzocht dier worden het aantal gescoorde onrijpe erytrocyten, het aantal onrijpe erytrocyten met micronuclei en het aandeel onrijpe erytrocyten op het totale aantal apart vermeld. Wanneer muizen ononderbroken worden behandeld gedurende een periode van ten minste 4 weken, moeten ook de gegevens over het aantal en het aandeel rijpe erytrocyten met micronuclei worden vermeld, indien deze zijn verzameld. Gegevens over de toxiciteit en klinische tekenen bij dieren moeten eveneens worden gemeld.

Aanvaardbaarheidscriteria

Voor de aanvaardbaarheid van de test gelden de volgende criteria:

Beoordeling en interpretatie van resultaten

Indien aan alle aanvaardbaarheidscriteria is voldaan, wordt een teststof als duidelijk positief beschouwd als:

Indien op een bepaald bemonsteringstijdstip alleen de hoogste dosis wordt onderzocht, wordt een teststof als duidelijk positief beschouwd als er een statistisch significante stijging vergeleken met de gelijktijdige negatieve controle is en de resultaten buiten de verdeling van de historische negatieve controlegegevens vallen (bv. op Poisson-verdeling gebaseerde 95 %-controlegrenzen). Aanbevelingen voor de meest geschikte statistische methoden zijn te vinden in de literatuur (44) (45) (46) (47). Wanneer een dosisresponsanalyse wordt uitgevoerd, moeten ten minste drie behandelde dosisgroepen worden geanalyseerd. De statistische toetsen moeten het dier als de proefeenheid gebruiken. Positieve resultaten bij de micronucleustest wijzen erop dat een teststof micronuclei induceert die ontstaan door chromosoombeschadigingen of beschadiging van het mitotisch apparaat in de erytroblasten van de geteste soort. Indien een test werd uitgevoerd om centromeren binnen micronuclei de detecteren, is een teststof die centromeer-bevattende micronuclei oplevert (centromeer-DNA of kinetochoor, indicatief voor verlies van hele chromosomen), bewijs dat de teststof een aneugeen is.

Indien aan alle aanvaardbaarheidscriteria is voldaan, wordt een teststof als duidelijk negatief beschouwd als in alle onderzochte experimentele omstandigheden:

Aanbevelingen voor de meest geschikte statistische methoden zijn te vinden in de literatuur (44) (45) (46) (47). Bewijs van blootstelling van het beenmerg aan een teststof kan zijn achteruitgang van de verhouding tussen rijpe en onrijpe erytrocyten of meting van de plasma- of bloedspiegels van de teststof. In geval van intraveneuze toediening is geen bewijs van blootstelling nodig. Als alternatief kunnen ADME-gegevens verkregen in een onafhankelijke studie met dezelfde toedieningsweg en dezelfde soort worden gebruikt om blootstelling van het beenmerg aan te tonen. Negatieve resultaten wijzen erop dat de teststof onder de testomstandigheden geen micronuclei in de onrijpe erytrocyten van de geteste soort veroorzaakt.

Een duidelijk positieve of duidelijk negatieve reactie behoeft niet te worden bevestigd.

Indien de reactie noch duidelijk negatief noch duidelijk positief is en om de biologische relevantie van een resultaat te helpen vaststellen (bv. een zwakke of zeer lichte toename), moeten de gegevens door een deskundige en/of nader onderzoek van de bestaande voltooide experimenten worden beoordeeld. In sommige gevallen kan het nuttig zijn meer cellen te analyseren of een herhalingsexperiment onder aangepaste experimentele omstandigheden uit te voeren.

In zeldzame gevallen zal op basis van de gegevens, zelfs na nader onderzoek, niet kunnen worden geconcludeerd dat de teststof positieve of negatieve resultaten oplevert, en zal de studie daarom als moeilijk te interpreteren worden beschouwd.

Testverslag

In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

LITERATUUR

6)

Deel B, hoofdstuk B.15, wordt geschrapt.

7)

Deel B, hoofdstuk B.16, wordt geschrapt.

8)

Deel B, hoofdstuk B.18, wordt geschrapt.

9)

Deel B, hoofdstuk B.19, wordt geschrapt.

10)

Deel B, hoofdstuk B.20, wordt geschrapt.

11)

Deel B, hoofdstuk B.24, wordt geschrapt.

12)

In deel B wordt hoofdstuk B.47 vervangen door:

„B.47   Bovine Corneal Opacity and Permeability- (BCOP-) testmethode voor de identificatie van i) chemische stoffen die ernstig oogletsel veroorzaken en ii) chemische stoffen waarvoor classificatie voor oogirritatie of ernstig oogletsel niet nodig is

INLEIDING

Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 437 (2013) van de OESO. De Bovine Corneal Opacity and Permeability- (BCOP-) testmethode werd in 2006 en 2010 geëvalueerd door het Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM), samen met het Europees Centrum voor de validering van alternatieve methoden (ECVAM) en het Japans Centrum voor de validatie van alternatieve methoden (JaCVAM) (1) (2). Bij de eerste evaluatie werd de BCOP-testmethode geëvalueerd op haar bruikbaarheid voor het identificeren van chemische stoffen (stoffen en mengsels) die ernstig oogletsel veroorzaken (1). Bij de tweede evaluatie werd de BCOP-testmethode geëvalueerd op haar bruikbaarheid voor het identificeren van chemische stoffen (stoffen en mengsels) waarvoor classificatie voor oogirritatie of ernstig oogletsel niet nodig is (2). De BCOP-valideringsdatabank bevatte in totaal 113 stoffen en 100 mengsels (2) (3). Op basis van deze evaluaties en hun collegiale toetsing werd geconcludeerd dat de testmethode in staat is zowel chemische stoffen (zowel stoffen als mengsels) die ernstig oogletsel veroorzaken (categorie 1), als chemische stoffen waarvoor classificatie voor oogirritatie of ernstig oogletsel niet nodig is, zoals gedefinieerd door het mondiaal geharmoniseerd classificatie- en etiketteringssysteem voor chemische stoffen (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals, GHS) van de Verenigde Naties (VN) (4) en Verordening (EG) nr. 1272/2008 betreffende de indeling, etikettering en verpakking van stoffen en mengsels (CLP-verordening) (7), correct te identificeren. De testmethode werd daarom voor beide doeleinden bekrachtigd als wetenschappelijk geldig. Onder “ernstig oogletsel” wordt verstaan weefselbeschadiging in het oog of een ernstige fysieke gezichtsvermindering na het aanbrengen van een teststof op het oppervlak aan de voorzijde van het oog, die binnen 21 dagen na het aanbrengen niet volledig omkeerbaar is. Teststoffen die ernstig oogletsel veroorzaken worden ingedeeld in VN-GHS-categorie 1. Chemische stoffen die niet zijn geclassificeerd voor oogirritatie of ernstig oogletsel, zijn gedefinieerd als chemische stoffen die niet voldoen aan de voorwaarden voor indeling in VN-GHS-categorie 1 of 2 (2A of 2B), d.w.z. er wordt naar verwezen als VN-GHS Geen categorie. Deze testmethode omvat het aanbevolen gebruik en de beperkingen van de BCOP-testmethode op basis van de evaluaties ervan. De belangrijkste verschillen tussen de oorspronkelijke versie van 2009 en de bijgewerkte versie van 2013 van de OESO-testrichtlijn hebben betrekking op, maar zijn niet beperkt tot: het gebruik van de BCOP-testmethode voor de identificatie van chemische stoffen waarvoor classificatie volgens het GHS-systeem van de VN niet nodig is (punten 2 en 7); verduidelijkingen van de toepasselijkheid van de BCOP-testmethode voor het testen van alcoholen, ketonen en vaste stoffen (punten 6 en 7) en van stoffen en mengsels (punt 8); verduidelijkingen van de manier waarop oppervlakteactieve stoffen en oppervlakteactieve stoffen bevattende mengsels moeten worden getest (punt 28); bijwerkingen en verduidelijkingen met betrekking tot de positieve controles (punten 39 en 40); een bijwerking van de beslissingscriteria van de BCOP-testmethode (punt 47); een bijwerking van de acceptatiecriteria van het onderzoek (punt 48); een bijwerking van de elementen van het testverslag (punt 49); een bijwerking van aanhangsel 1 betreffende definities; de toevoeging van aanhangsel 2 betreffende de voorspellingskracht van de BCOP-testmethode onder verschillende classificatiesystemen; een bijwerking van aanhangsel 3 betreffende de lijst van stoffen voor de bekwaamheidstoetsing; en een bijwerking van aanhangsel 4 betreffende de BCOP-corneahouder (punt 1) en betreffende de opacitometer (punten 2 en 3).

Momenteel wordt algemeen aangenomen dat er in de nabije toekomst geen in-vitrotest voor oogirritatie zal komen die de in-vivo-Draize-oogtest volledig zal kunnen vervangen om voorspellingen te doen voor het volledige bereik van irritatie voor verschillende klassen chemische stoffen. Strategische combinaties van meerdere alternatieve testmethoden binnen een (trapsgewijze) teststrategie kunnen de Draize-oogtest mogelijk echter wel vervangen (5). De top-downbenadering (5) is bedoeld om te worden gebruikt wanneer op basis van bestaande informatie verwacht wordt dat een chemische stof een hoog irritatiepotentieel heeft, terwijl de bottom-upbenadering (5) bedoeld is om te worden gebruikt wanneer op basis van bestaande informatie verwacht wordt dat een chemische stof onvoldoende oogirritatie zal veroorzaken om classificatie noodzakelijk te maken. De BCOP-testmethode is een in-vitrotestmethode die onder bepaalde voorwaarden en met specifieke beperkingen kan worden gebruikt voor de classificatie van gevaren voor de ogen en voor de etikettering van chemische stoffen. Hoewel de BCOP-testmethode niet geldig geacht wordt als zelfstandige vervanging van de in-vivo-oogtest bij konijnen, wordt de BCOP-testmethode aanbevolen als een eerste stap binnen een teststrategie zoals de top-downbenadering die door Scott et al. is voorgesteld (5) voor de identificatie van chemische stoffen die ernstig oogletsel veroorzaken, d.w.z. voor chemische stoffen die moeten worden ingedeeld in VN-GHS-categorie 1, zonder verdere tests (4). De BCOP-testmethode wordt ook aanbevolen voor de identificatie van chemische stoffen waarvoor classificatie voor oogirritatie of ernstig oogletsel niet nodig is, zoals gedefinieerd door het GHS van de VN (VN-GHS Geen categorie) (4), binnen een teststrategie zoals de bottom-upbenadering (5). Voor een chemische stof waarvoor met de BCOP-testmethode niet wordt voorspeld dat deze ernstig oogletsel veroorzaakt of dat classificatie voor oogirritatie/ernstig oogletsel niet nodig is, moeten echter aanvullende tests (in vitro en/of in vivo) worden uitgevoerd om tot een definitieve classificatie te komen.

Deze testmethode is bedoeld om de procedures te beschrijven die worden gebruikt om het mogelijke gevaar van een teststof voor de ogen te beoordelen aan de hand van het vermogen van deze chemische stof om troebelheid en verhoogde permeabiliteit in een afgezonderde boviene cornea te veroorzaken. Toxische effecten op de cornea worden als volgt gemeten: (i) verminderde lichttransmissie (troebelheid), en (ii) verhoogde doorlating van natriumfluoresceïne (permeabiliteit). De beoordelingen van de troebelheid en permeabiliteit van de cornea na blootstelling aan een teststof worden samengevoegd om een in-vitro-irritatiescore (IVIS) af te leiden, die gebruikt wordt om het irritatieniveau van de teststof te bepalen.

Definities worden gegeven in aanhangsel 1.

INLEIDENDE OVERWEGINGEN EN BEPERKINGEN

Deze testmethode is gebaseerd op het protocol van de BCOP-testmethode van het ICCVAM (6) (7), dat oorspronkelijk ontwikkeld werd op basis van informatie verkregen uit het protocol van het Institute for In Vitro Sciences (IIVS) en Protocol 124 van INVITTOX (8). Laatstgenoemde vertegenwoordigt het protocol dat gebruikt werd voor de door de Europese Gemeenschap gesteunde prevalideringsstudie die in 1997-1998 werd uitgevoerd. Beide protocollen waren gebaseerd op de BCOP-testmethode die voor het eerst werd beschreven door Gautheron et al. (9).

De BCOP-testmethode kan worden gebruikt om chemische stoffen te identificeren die ernstig oogletsel veroorzaken zoals gedefinieerd door het GHS van de VN, d.w.z. chemische stoffen die moeten worden ingedeeld in VN-GHS-categorie 1 (4). Wanneer de BCOP-testmethode voor dit doel wordt gebruikt, heeft zij een algemene nauwkeurigheid van 79 % (150/191), een percentage vals-positieve uitslagen van 25 % (32/126) en een percentage vals-negatieve uitslagen van 14 % (9/65), vergeleken met gegevens van de in-vivo-oogtest bij konijnen die werden ingedeeld volgens het GHS-classificatiesysteem van de VN (3) (zie aanhangsel 2, tabel 1). Wanneer teststoffen binnen bepaalde chemische (d.w.z. alcoholen, ketonen) of fysische (d.w.z. vaste stoffen) klassen worden uitgesloten van de databank, heeft de BCOP-testmethode een algemene nauwkeurigheid van 85 % (111/131), een percentage vals-positieve uitslagen van 20 % (16/81) en een percentage vals-negatieve uitslagen van 8 % (4/50) voor het GHS-classificatiesysteem van de VN (3). De mogelijke tekortkomingen van de BCOP-testmethode wanneer deze wordt gebruikt voor de identificatie van chemische stoffen die ernstig oogletsel veroorzaken (VN-GHS-categorie 1), zijn gebaseerd op de waargenomen hoge percentages vals-positieve uitslagen voor alcoholen en ketonen en de waargenomen hoge percentages vals-negatieve uitslagen voor vaste stoffen in de valideringsdatabank (1) (2) (3). Omdat echter niet voor alle alcoholen en ketonen sprake is van overpredictie door de BCOP-testmethode en sommige correct zijn voorspeld als VN-GHS-categorie 1, worden deze twee organische functionele groepen niet beschouwd als groepen die buiten het toepassingsgebied van de testmethode liggen. Het is aan de gebruiker van deze testmethode om te beslissen of een mogelijke overpredictie van een alcohol of keton kan worden geaccepteerd of dat verdere tests moeten worden uitgevoerd in een bewijskrachtbenadering. Wat betreft de percentages vals-negatieve uitslagen voor vaste stoffen, zij opgemerkt dat vaste stoffen kunnen leiden tot variabele en extreme blootstellingsomstandigheden in de in-vivo-Draize-test op oogirritatie, die irrelevante voorspellingen van het werkelijke irritatiepotentieel van deze stoffen kunnen opleveren (10). Er zij ook opgemerkt dat geen van de geïdentificeerde vals-negatieve uitslagen in de ICCVAM-valideringsdatabank (2) (3), in de context van de identificatie van chemische stoffen die ernstig oogletsel veroorzaken (VN-GHS-categorie 1), heeft geleid tot een IVIS ≤ 3, dat het criterium is dat wordt gebruikt om een teststof in te delen in VN-GHS Geen categorie. Vals-negatieve uitslagen van de BCOP-testmethode zijn in deze context bovendien niet kritiek, omdat alle teststoffen met 3 < IVIS ≤ 55 vervolgens worden getest met andere afdoend gevalideerde in-vitrotests, of als laatste optie bij konijnen, afhankelijk van de wettelijke voorschriften, met een sequentiële teststrategie in een op bewijskracht gebaseerde aanpak. Aangezien sommige vaste chemische stoffen door de BCOP-testmethode correct worden voorspeld als stoffen die behoren tot VN-GHS-categorie 1, wordt deze fysische toestand evenmin beschouwd als een toestand die buiten het toepassingsgebied van de testmethode ligt. Onderzoekers zouden kunnen overwegen deze testmethode te gebruiken voor alle typen chemische stoffen, waarbij een IVIS > 55 moet worden geaccepteerd als indicatief voor een respons die ernstig oogletsel veroorzaakt waardoor de teststof zonder verder tests moet worden ingedeeld in VN-GHS-categorie 1. Positieve resultaten die verkregen werden met alcoholen of ketonen, dienen echter, zoals reeds gezegd, met voorzichtigheid te worden geïnterpreteerd vanwege het risico van overpredictie.

De BCOP-testmethode kan ook worden gebruikt om chemische stoffen te identificeren die niet hoeven te worden ingedeeld voor oogirritatie of ernstig oogletsel volgens het VN-GHS-classificatiesysteem (4). Wanneer de BCOP-testmethode voor dit doel wordt gebruikt, heeft zij een algemene nauwkeurigheid van 69 % (135/196), een percentage vals-positieve uitslagen van 69 % (61/89) en een percentage vals-negatieve uitslagen van 0 % (0/107), vergeleken met gegevens van de in-vivo-oogtest bij konijnen die werden ingedeeld volgens het GHS-classificatiesysteem van de VN (3) (zie aanhangsel 2, tabel 2). Het verkregen percentage vals-negatieve uitslagen (in vivo in VN-GHS Geen categorie ingedeelde chemische stoffen die een IVIS > 3 opleveren, zie punt 47) is behoorlijk hoog, maar niet kritiek in deze context, omdat alle teststoffen met 3 < IVIS ≤ 55 vervolgens worden getest met andere afdoend gevalideerde in-vitrotests, of als laatste optie bij konijnen, afhankelijk van de wettelijke voorschriften, met een sequentiële teststrategie in een op bewijskracht gebaseerde aanpak. De BCOP-testmethode vertoont geen specifieke tekortkomingen voor het testen van alcoholen, ketonen en vaste stoffen, wanneer het doel van de test is chemische stoffen te identificeren waarvoor classificatie voor oogirritatie of ernstig oogletsel niet nodig is (VN-GHS Geen categorie) (3). Onderzoekers zouden kunnen overwegen deze testmethode te gebruiken voor alle typen chemische stoffen, waarbij een negatief resultaat (IVIS ≤ 3) moet worden geaccepteerd als een indicatie dat classificatie niet nodig is (VN-GHS Geen categorie). Aangezien de BCOP-testmethode slechts 31 % van de chemische stoffen waarvoor classificatie voor oogirritatie of ernstig oogletsel niet nodig is, correct kan identificeren, zou deze testmethode niet de eerste keuze moeten zijn om een bottom-upbenadering mee te beginnen (5) als er andere gevalideerde en erkende in-vitromethoden met een vergelijkbare hoge gevoeligheid maar een hogere specificiteit beschikbaar zijn.

De BCOP-valideringsdatabank bevatte in totaal 113 stoffen en 100 mengsels (2) (3). De BCOP-testmethode wordt daarom toepasbaar geacht voor het testen van zowel stoffen als mengsels.

De BCOP-testmethode wordt niet aanbevolen voor het identificeren van teststoffen die moeten worden ingedeeld als irriterend voor de ogen (VN-GHS-categorie 2 of categorie 2A) of teststoffen die moeten worden ingedeeld als licht irriterend voor de ogen (VN-GHS-categorie 2B), vanwege het aanzienlijke aantal chemische stoffen van VN-GHS-categorie 1 die te laag zijn ingedeeld in VN-GHS-categorie 2, 2A of 2B en het aanzienlijke aantal chemische stoffen van VN-GHS Geen categorie die te hoog zijn ingedeeld in VN-GHS-categorie 2, 2A of 2B (2) (3). Voor dit doel kan het nodig zijn verdere tests met een andere geschikte methode uit te voeren.

Bij alle procedures met boviene ogen en cornea's dienen de op de testinrichting toepasselijke regelgeving en procedures voor de behandeling van van dieren afkomstig materiaal te worden nageleefd, met inbegrip van maar niet beperkt tot weefsels en weefselvloeistoffen. Universele voorzorgsmaatregelen voor laboratoria zijn aanbevolen (11).

Hoewel de BCOP-testmethode geen rekening houdt met letsels van het ooglid en de iris, wordt wel gekeken naar effecten op het hoornvlies, die bij in-vivo-onderzoek de belangrijkste factor voor indeling zijn bij de VN-GHS-classificatie. De reversibiliteit van hoornvliesletsels op zichzelf kan niet worden beoordeeld met de BCOP-testmethode. Er is voorgesteld, op basis van studies op de ogen van konijnen, dat een beoordeling van de aanvankelijke diepte van het hoornvliesletsel kan worden gebruikt om een onderscheid te maken tussen reversibele en irreversibele effecten (12). Er is echter meer wetenschappelijke kennis nodig om te begrijpen hoe irreversibele effecten optreden die geen verband houden met de aanvankelijke diepte van het letsel. Tot slot kan de potentiële systemische toxiciteit die gepaard gaat met de blootstelling van het oog, met de BCOP-methode niet beoordeeld worden.

Deze testmethode zal periodiek worden bijgewerkt wanneer nieuwe informatie en gegevens in aanmerking worden genomen. Histopathologie kan bijvoorbeeld van nut zijn wanneer een vollediger karakterisering van schade aan de cornea nodig is. Zoals beschreven in OESO-leidraad nr. 160 (13), worden gebruikers aangemoedigd cornea's te bewaren en histopathologische specimens te prepareren die kunnen worden gebruikt om een databank en beslissingscriteria op te zetten die de nauwkeurigheid van deze testmethode verder kunnen verbeteren.

Elk laboratorium dat deze testmethode voor het eerst opstelt, dient gebruik te maken van de in aanhangsel 3 voorziene chemische stoffen voor bekwaamheidstoetsing. Een laboratorium kan deze chemische stoffen gebruiken om zijn technische bekwaamheden met betrekking tot het uitvoeren van de BCOP-testmethode aan te tonen, vooraleer het gegevens van de BCOP-testmethode indient voor de wettelijke gevarenclassificatie.

PRINCIPE VAN DE TEST

De BCOP-testmethode is een organotypisch model dat handhaving op korte termijn van de normale fysiologische en biochemische werking van de boviene cornea in vitro vereist. In deze testmethode wordt schade door de teststof beoordeeld door kwantitatieve metingen van de wijzigingen in de troebelheid en permeabiliteit van de cornea door gebruik van een opacitometer, respectievelijk een VIS-spectrofotometer. Beide metingen worden gebruikt om een IVIS te berekenen die gebruikt wordt om een in-vitro-irritatiegevarenclassificatie toe te kennen voor de voorspelling van de mogelijke in-vivo-oogirritatie door een teststof (zie beslissingscriteria in punt 48).

De BCOP-testmethode gebruikt afgezonderde cornea's van de ogen van pas geslacht vee. De troebelheid van cornea's wordt kwantitatief gemeten als de hoeveelheid lichttransmissie door de cornea. De permeabiliteit wordt kwantitatief gemeten als de hoeveelheid natriumfluoresceïne die door de volledige dikte van de cornea passeert, wat gemeten wordt in het medium dat zich bevindt in de achterkamer. Teststoffen worden aangebracht op de epitheellaag van de cornea door toevoeging aan de voorkamer van de corneahouder. Aanhangsel 4 geeft een beschrijving en een tekening van een corneahouder die wordt gebruikt in de BCOP-testmethode. Corneahouders zijn verkrijgbaar in de handel of kunnen zelf worden gemaakt.

Bron en ouderdom van runderogen en selectie van diersoorten

Vee dat naar de slachterij wordt gebracht, wordt meestal geslacht ofwel voor menselijke consumptie ofwel voor ander commercieel gebruik. Voor gebruik in de BCOP-testmethode worden enkel de cornea's van gezonde dieren die geschikt worden geacht voor de menselijke voedselketen in aanmerking genomen. Aangezien vee een grote verscheidenheid aan gewicht vertoont, afhankelijk van ras, leeftijd en geslacht, is er geen aanbevolen gewicht van het dier op het ogenblik van de slachting.

De afmetingen van de cornea's kunnen variëren als gevolg van het gebruik van de ogen van dieren van verschillende leeftijdscategorieën. Cornea's met een horizontale diameter van > 30,5 mm en een centrale corneale dikte (CCT) ≥ 1100 μm zijn meestal afkomstig van vee dat ouder is dan acht jaar, terwijl cornea's met een horizontale diameter van < 28,5 mm en een CCT < 900 μm meestal afkomstig zijn van vee dat jonger is dan vijf jaar (14). Om die reden worden doorgaans geen ogen gebruikt van vee dat ouder is dan 60 maanden. Ogen van vee jonger dan 12 maanden worden doorgaans niet gebruikt aangezien de ogen dan nog niet volgroeid zijn en de corneale dikte en diameter aanzienlijk kleiner zijn dan deze opgetekend voor ogen van volwassen vee. Het gebruik van cornea's van jonge dieren (d.w.z. 6 tot 12 maanden oud) is toegestaan aangezien hieraan voordelen verbonden zijn, zoals grotere beschikbaarheid, een nauwe leeftijdsgroep en minder gevaar met betrekking tot de blootstelling van werknemers aan boviene spongiforme encefalopathie (15). Aangezien nadere evaluatie van het effect van corneale grootte of dikte op de responsiviteit op corrosieve en irriterende chemische stoffen nuttig kan zijn, worden gebruikers aangemoedigd om de geschatte leeftijd en/of het gewicht van de dieren waarvan de cornea's in onderzoek worden gebruikt, te rapporteren.

Verzameling en vervoer van ogen naar het laboratorium

De ogen worden verzameld door werknemers van de slachterij. Om mechanische en andere vormen van oogschade te minimaliseren, dienen de ogen na de dood zo spoedig mogelijk verwijderd te worden en onmiddellijk na verwijdering en tijdens het vervoer gekoeld te worden. Om blootstelling van de ogen aan mogelijk irriterende chemische stoffen te voorkomen, mogen de werknemers van de slachterij geen detergent gebruiken bij het afspoelen van de kop van het dier.

De ogen dienen volledig te worden ondergedompeld in gekoelde Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) in een houder van aangepaste grootte en naar het laboratorium te worden vervoerd op een wijze die bederf en/of bacteriële contaminatie minimaliseert. Omdat de ogen worden verzameld tijdens het slachtproces, is het mogelijk dat ze blootgesteld worden aan bloed en andere biologische materialen zoals bacteriën en andere micro-organismen. Om die reden dient te worden verzekerd dat het risico op besmetting zo klein mogelijk is (bv. door de houder met de ogen tijdens de verzameling en het vervoer op nat ijs te plaatsen en door antibiotica toe te voegen aan de HBSS die gebruikt wordt om de ogen tijdens het vervoer te bewaren [bv. penicilline aan 100 IU/ml en streptomycine aan 100 μg/ml]).

Het tijdsinterval tussen de verzameling van de ogen en het gebruik van de cornea's in de BCOP-testmethode dient te worden beperkt tot een minimum (gewoonlijk verzameling en gebruik op dezelfde dag) en mag de onderzoeksresultaten niet in gevaar brengen. Deze resultaten zijn gebaseerd op de selectiecriteria voor de ogen alsook op de positieve en negatieve controleresponsen. Alle in het onderzoek gebruikte ogen dienen van dezelfde groep op een bepaalde dag verzamelde ogen te zijn.

Selectiecriteria voor in de BCOP-testmethode te gebruiken ogen

In het laboratorium aangekomen, worden de ogen zorgvuldig onderzocht voor gebreken zoals verhoogde troebelheid, krassen en neovascularisatie. Enkel cornea's zonder deze gebreken mogen worden gebruikt.

De kwaliteit van elke cornea wordt ook op latere tijdstippen van het onderzoek beoordeeld. Cornea's met een troebelheid van meer dan zeven eenheden of equivalent voor de gebruikte opacitometer en corneahouders na een initiële equilibreerperiode van een uur, dienen te worden weggegooid (OPMERKING: de opacitometer dient te worden geijkt met troebelheidsnormen die worden gebruikt voor de vaststelling van de troebelheidseenheden, zie aanhangsel 4).

Elke behandelingsgroep (teststof, tegelijkertijd gemeten negatieve en positieve controles) bevat minstens drie ogen. Drie cornea's dienen te worden gebruikt voor de negatieve controle in de BCOP-testmethode. Aangezien alle cornea's uit de oogbol worden verwijderd en in de corneale kamers worden geplaatst, bestaat het risico voor artefacten door de behandeling van de individuele corneale troebelheids- en permeabiliteitswaarden (met inbegrip van de negatieve controle). Bovendien worden de troebelheids- en permeabiliteitswaarden van de cornea's van de negatieve controle gebruikt om de troebelheids- en permeabiliteitswaarden van de met de teststof behandelde cornea's en de cornea's van de positieve controle in de IVIS-berekeningen te corrigeren.

PROCEDURE

Voorbereiding van de ogen

Cornea's zonder gebreken worden voorzichtig losgemaakt van de harde oogrok met een rand van 2 tot 3 mm, die nodig zal zijn voor de opeenvolgende handelingen, zodat geen schade ontstaat aan het corneale epitheel en endotheel. De afzonderlijke cornea's worden in een speciaal ontworpen corneahouder geplaatst die bestaat uit een voorkamer en een achterkamer die de epitheellaag, respectievelijk de endotheellaag van de cornea raken. Beide kamers zijn overvloedig gevuld met voorverwarmde Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) zonder fenolrood (eerst de achterkamer) om de vorming van bellen te voorkomen. Het apparaat wordt dan geëquilibreerd op 32 ± 1 °C voor een periode van ten minste één uur om de cornea's met het medium te laten equilibreren en een normale metabolische activiteit te bereiken voor zover mogelijk (de temperatuur van het hoornvliesoppervlak in vivo is ongeveer 32 °C).

Na het equilibreren wordt nieuwe voorverwarmde EMEM zonder fenolrood toegevoegd aan beide kamers en worden referentietroebelheidswaarden gemeten in elke cornea. Cornea's die macroscopische weefselschade (bv. krassen, pigmentatie, neovascularisatie) of een troebelheid van meer dan zeven eenheden of equivalent voor de gebruikte opacitometer en corneahouders vertonen, worden verwijderd. Minstens drie cornea's worden geselecteerd als cornea's voor negatieve (of oplosmiddel-) controle. De resterende cornea's worden dan onderverdeeld in een behandelings- en een positieve-controlegroep.

Aangezien de warmtecapaciteit van water groter is dan die van lucht, geeft water stabielere temperatuuromstandigheden voor incubatie. Om die reden wordt het gebruik van een waterbad aanbevolen om de temperatuur van de corneahouder met inhoud op 32 ± 1 °C te houden. Luchtincubators kunnen echter ook worden gebruikt met de nodige voorzorgsmaatregelen voor behoud van de temperatuurstabiliteit (bv. door voorverwarming van de houders en media).

Aanbrenging van de teststof

Twee verschillende behandelingsprotocollen worden gebruikt, één voor vloeistoffen en oppervlakteactieve stoffen (vaste stoffen en vloeistoffen), en één voor niet-oppervlakteactieve vaste stoffen.

Vloeistoffen worden onverdund getest. Halfvaste stoffen, pasta's en was worden gewoonlijk getest op dezelfde wijze als vloeistoffen. Zuivere oppervlakteactieve stoffen worden getest met een concentratie van 10 % g/v in een oplossing van 0,9 % natriumchloride, gedistilleerd water of een ander oplosmiddel waarvan geweten is dat het geen nadelig effect heeft op het testsysteem. Alternatieve verdunningen dienen te worden gemotiveerd. Mengsels die oppervlakteactieve stoffen bevatten, kunnen onverdund of verdund tot een passende concentratie worden getest, afhankelijk van het relevante blootstellingsscenario in vivo. De geteste concentratie dient te worden gemotiveerd. Cornea's worden blootgesteld aan vloeistoffen en oppervlakteactieve stoffen voor een periode van 10 minuten. Andere blootstellingsperioden dienen op adequate wetenschappelijke manier te worden gemotiveerd. Zie aanhangsel 1 voor een definitie van een oppervlakteactieve stof en een oppervlakteactieve stof bevattend mengsel.

Niet-oppervlakteactieve stoffen worden gewoonlijk getest als oplossingen of suspensies met een concentratie van 20 % g/v in een oplossing van 0,9 % natriumchloride, gedistilleerd water of een ander oplosmiddel waarvan geweten is dat het geen nadelig effect heeft op het testsysteem. In bepaalde omstandigheden en met de juiste wetenschappelijke verklaring, kunnen vaste stoffen ook zuiver getest worden door rechtstreekse aanbrenging op het cornea-oppervlak aan de hand van de open-kamermethode (zie punt 32). Cornea's worden blootgesteld aan vaste stoffen voor een periode van vier uur, maar zoals bij vloeistoffen en oppervlakteactieve stoffen kunnen met de juiste wetenschappelijke motivering alternatieve blootstellingsperioden worden gebruikt.

Verschillende behandelingsmethoden kunnen worden gebruikt afhankelijk van de fysische aard en chemische kenmerken (bv. vaste stoffen, vloeistoffen, viskeuze of niet-viskeuze vloeistoffen) van de teststof. Essentieel is dat de teststof de hele epitheellaag bedekt en dat deze chemische stof voldoende wordt verwijderd tijdens het uitwassen. Een gesloten-kamermethode wordt gewoonlijk gebruikt voor niet-viskeuze tot licht-viskeuze vloeibare teststoffen, terwijl een open-kamermethode gewoonlijk wordt gebruikt voor semi-viskeuze en viskeuze vloeibare teststoffen en voor zuiver vaste stoffen.

In de gesloten-kamermethode wordt voldoende teststof (750 μl) om de epitheelzijde van de cornea te bedekken, ingebracht in de voorkamer via de doseergaten aan de bovenzijde van de kamer, waarna de gaten tijdens de blootstelling met kamerstoppen worden verzegeld. Het is belangrijk na te gaan dat elke cornea gedurende het juiste tijdsinterval is blootgesteld aan een teststof.

In de open-kamermethode worden de afsluitring van het glas en het glas van de voorkamer verwijderd voor de behandeling. De controle- of teststof (750 μl of voldoende teststof om de cornea volledig te bedekken) wordt rechtstreeks op de epitheellaag van de cornea aangebracht met een micropipet. Als een teststof moeilijk te pipetteren is, kan de teststof met drukcompensatie in een plunjerpipet worden gebracht om de dosistoediening te vergemakkelijken. De pipetpunt van de plunjerpipet wordt ingebracht in de verdeelpunt van de spuit, zodat het materiaal onder druk kan worden opgeladen in de verdeelpunt. Gelijktijdig worden de spuitplunjer ingedrukt en de pipetzuiger opgetrokken. Als er zich luchtbellen vormen in de pipetpunt, dan wordt de teststof verwijderd (uitgedreven) en het proces herhaald tot de punt gevuld is zonder luchtbellen. Indien nodig, kan een gewone spuit (zonder naald) worden gebruikt, aangezien hiermee een nauwkeurige hoeveelheid teststof kan worden gemeten en de teststof gemakkelijk op de epitheellaag van de cornea kan worden aangebracht. Na de dosering wordt het glas van de voorkamer teruggeplaatst om opnieuw een gesloten systeem te creëren.

Incubatie na blootstelling

Na de blootstellingsperiode worden de teststof, de negatieve-controle- of de positieve-controlestof verwijderd uit de voorkamer en wordt het epitheel ten minste drie keer (of tot geen spoor van de teststof meer kan worden waargenomen) gewassen met EMEM (dat fenolrood bevat). Een medium dat fenolrood bevat, wordt voor het uitwassen gebruikt aangezien verkleuring van het fenolrood kan worden gecontroleerd om de doeltreffendheid van het uitwassen van zuurrijke of alkalische teststoffen te bepalen. De cornea's worden meer dan drie keer gewassen als het fenolrood nog steeds verkleurt (geel of purper) of als er nog teststof zichtbaar is. Zodra het medium vrij is van teststof, krijgen de cornea's een laatste uitwassing met EMEM (zonder fenolrood). EMEM (zonder fenolrood) wordt gebruikt als laatste uitwassing om te verzekeren dat alle fenolrood uit de voorkamer is verwijderd voordat de troebelheid wordt gemeten. De voorkamer wordt dan gevuld met nieuwe EMEM zonder fenolrood.

Voor vloeistoffen of oppervlakteactieve stoffen worden de cornea's eerst uitgewassen en vervolgens geïncubeerd op 32 ± 1 °C voor een bijkomende periode van twee uur. Langere post-blootstellingstijd kan nuttig zijn in bepaalde omstandigheden en kan geval per geval worden beschouwd. Met vaste stoffen behandelde cornea's worden grondig uitgewassen na een blootstelling van vier uur maar hebben geen bijkomende incubatietijd nodig.

Aan het einde van de incubatietijd na blootstelling voor vloeistoffen en oppervlakteactieve stoffen en aan het einde van vier uur blootstelling voor niet-oppervlakteactieve vaste stoffen, worden de troebelheid en permeabiliteit van elke cornea opgetekend. Elke cornea wordt eveneens visueel geobserveerd en relevante waarnemingen worden opgetekend (bv. loskomend weefsel, overblijvende teststof, niet-uniforme troebelheidspatronen). Deze waarnemingen kunnen belangrijk zijn aangezien ze kunnen worden weerspiegeld door variaties in de metingen van de opacitometer.

Controlestoffen

In elk experiment worden gelijktijdig negatieve controles of controles met oplosmiddel/medium en positieve controles uitgevoerd.

Bij het testen van een vloeistof aan 100 %, wordt een gelijktijdige negatieve controle (bv. 0,9 % natriumchlorideoplossing of gedistilleerd water) in de BCOP-testmethode opgenomen, zodat niet-specifieke wijzigingen in het testsysteem kunnen worden opgespoord. Dit levert tevens een referentiekader voor de eindpunten van het onderzoek. Het verzekert ook dat de omstandigheden van het onderzoek niet op ongepaste wijze leiden tot een irriterende respons.

Bij het testen van een verdunde vloeistof, oppervlakteactieve stof of vaste stof, wordt gelijktijdig een controlegroep met een oplosmiddel/medium in de BCOP-testmethode opgenomen zodat niet-specifieke wijzigingen in het testsysteem kunnen worden opgespoord; dit levert tevens een referentiekader voor de eindpunten van het onderzoek. Er kunnen enkel oplosmiddelen/media worden gebruikt waarvan geweten is dat ze geen nadelig effect op het testsysteem hebben.

In elk experiment wordt een chemische stof waarvan bekend is dat deze een positieve reactie geeft, opgenomen als gelijktijdige positieve controle om de integriteit van het testsysteem te verifiëren en na te gaan dat het experiment juist is uitgevoerd. Om te verzekeren dat de variabiliteit in de positieve-controlerespons doorheen de tijd kan worden beoordeeld, mag de grootte van de irriterende respons niet buitensporig zijn.

Voorbeelden van positieve controles voor vloeibare teststoffen zijn 100 % ethanol of 100 % dimethylformamide. Een voorbeeld van een positieve controle voor vaste teststoffen is een concentratie van 20 % g/v imidazool in een 0,9 % natriumchlorideoplossing.

IJkstoffen zijn nuttig voor de beoordeling van potentiële oogirritatie bij onbekende chemische stoffen uit een specifieke chemische klasse of productklasse of voor de beoordeling van potentiële relatieve irritatie van een voor het oog irriterende stof binnen een reeks van irritatieresponsen.

Gemeten eindpunten

De troebelheid wordt gemeten door de hoeveelheid lichttransmissie door de cornea. De corneale troebelheid wordt kwantitatief gemeten met behulp van een opacitometer. De resultaten zijn troebelheidswaarden op een continue schaal.

De permeabiliteit wordt bepaald door de hoeveelheid natriumfluoresceïne die alle corneale cellagen penetreert (d.w.z. van de epitheellaag aan het buitenste corneale oppervlak tot de endotheellaag aan de binnenkant). Eén ml natriumfluoresceïneoplossing (4 of 5 mg/ml voor vloeistoffen en oppervlakteactieve stoffen respectievelijk niet-oppervlakteactieve vaste stoffen) wordt toegevoegd aan de voorkamer van de corneahouder, die in verbinding staat met de epitheelzijde van de cornea, terwijl de achterkamer, die in verbinding staat met de endotheelzijde van de cornea, gevuld is met nieuwe EMEM. De houder wordt dan gedurende 90 ± 5 min op 32 ± 1 °C geïncubeerd in een horizontale positie. De hoeveelheid natriumfluoresceïne die doordringt naar de achterkamer wordt kwantitatief gemeten met behulp van UV/VIS-spectrofotometrie. Op 490 nm beoordeelde spectrofotometrische metingen worden opgetekend als optische dichtheid (OD490) of extinctiewaarden, die gemeten worden op een continue schaal. De permeabiliteitswaarden van fluoresceïne worden bepaald aan de hand van de OD490-waarden op basis van een VIS-spectrofotometer met een standaardweglengte van 1 cm.

Ook kan een 96-wells-microtiterplaatlezer gebruikt worden op voorwaarde dat (i) het lineaire bereik van de plaatlezer voor de vaststelling van fluoresceïne OD490-waarden kan worden vastgesteld; en (ii) de juiste hoeveelheid fluoresceïnemonsters in de 96-wells-plaat wordt gebruikt om OD490-waarden te verkrijgen die gelijk zijn aan een standaardweglengte van 1 cm (hiervoor kan een volledige well noodzakelijk zijn [meestal 360 μl]).

GEGEVENS EN RAPPORTAGE

Evaluatie van de gegevens

Zodra de troebelheids- en gemiddelde permeabiliteits-(OD490)-waarden gecorrigeerd zijn voor achtergrondtroebelheid en de permeabiliteits-OD490-waarden van de negatieve controle, dienen de gemiddelde troebelheids- en permeabiliteits-OD490-waarden voor elke behandelingsgroep als volgt samengevoegd te worden in een empirisch afgeleide formule om voor elke behandelingsgroep een in-vitro-irritatiescore (IVIS) te berekenen:

IVIS = gemiddelde troebelheidswaarde + (15 x gemiddelde permeabiliteits-OD490-waarde)

Sina et al. (16) schreef dat deze formule afgeleid was tijdens onderzoeken in eigen laboratorium en interlaboratoriumonderzoeken. De gegevens die gegenereerd werden voor een reeks van 36 verbindingen in een multilaboratoriumonderzoek werden onderworpen aan een multivariate analyse om de best passende verhouding tussen in-vivo- en in-vitrogegevens te bepalen. Wetenschappers van twee verschillende bedrijven hebben deze analyse uitgevoerd en kwamen op ongeveer identieke verhoudingen uit.

De troebelheids- en permeabiliteitswaarden dienen ook onafhankelijk van elkaar beoordeeld te worden om te bepalen of een teststof corrosiviteit of hevige irritatie opwekt via slechts een van de twee eindpunten (zie beslissingscriteria).

Beslissingscriteria

De IVIS-drempelwaarden voor de identificatie van teststoffen als chemische stoffen die ernstig oogletsel veroorzaken (VN-GHS-categorie 1) en teststoffen waarvoor classificatie voor oogirritatie of ernstig oogletsel niet nodig is (VN-GHS Geen categorie) zijn hieronder gegeven:

Acceptatiecriteria van het onderzoek

Een test wordt als aanvaardbaar beschouwd als de positieve controle een IVIS oplevert die tussen twee standaardafwijkingen van het huidige historische gemiddelde valt, dat minstens om de drie maanden wordt bijgewerkt of telkens als een aanvaardbare test wordt uitgevoerd in laboratoria waar op onregelmatige basis tests worden uitgevoerd (d.w.z. minder dan een keer per maand). De negatieve-controlerespons of controlerespons met oplosmiddel/medium dient te resulteren in troebelheids- en permeabiliteitswaarden die lager zijn dan de vastgestelde bovengrenswaarden voor achtergrondtroebelheid en permeabiliteit voor boviene cornea's die werden gebruikt voor de negatieve controle respectievelijk oplosmiddel/mediumcontrole. Eén test bestaande uit ten minste drie cornea's zou voldoende moeten zijn voor een teststof, indien de indeling ervan ondubbelzinnig is. Echter, bij grensgevallen in de eerste test moet een tweede test worden overwogen (maar deze is niet noodzakelijkerwijs vereist), evenals een derde test in geval van niet-concordante gemiddelde IVIS- resultaten tussen de eerste twee tests. In deze context wordt een resultaat in de eerste test als grensgeval beschouwd als de voorspellingen van de 3 cornea's niet concordant waren, in de zin dat:

Testverslag

Het testverslag dient de volgende informatie te bevatten, indien relevant voor het voeren van het onderzoek:

LITERATUUR

Aanhangsel 4

DE BCOP-CORNEAHOUDER

De BCOP-corneahouders zijn gemaakt van inert materiaal (bv. polypropyleen). De houders bestaan uit twee helften (een voorste en een achterste kamer) en hebben twee gelijke cilindrische inwendige kamers. Elke kamer heeft een inhoud van ongeveer 5 ml en is afgewerkt met een glazen venster waardoor de troebelheidsmetingen worden opgetekend. Elk van de inwendige kamers heeft een diameter van 1,7 cm en is 2,2 cm diep (11). De achterste kamer is voorzien van een o-ring om lekkage te voorkomen. De cornea's worden op de o-ring van de achterste kamers geplaatst met de endotheelzijde naar beneden en de voorste kamers worden op de epitheelzijde van de cornea's geplaatst. De kamers worden op hun plaats gehouden door drie schroeven van roestvrij staal die zich bevinden aan de randen van de kamer. Aan het einde van elke kamer bevindt zich een vensterglas, dat verwijderd kan worden voor gemakkelijke toegang tot de cornea. Tussen het vensterglas en de kamer bevindt zich eveneens een o-ring om lekkage te voorkomen. Elke kamer heeft bovenaan twee openingen voor toevoeging en verwijdering van media en teststoffen. Tijdens de behandeling en de incubatieperiode worden zij afgesloten met een rubberdop. De lichttransmissie door corneahouders kan mogelijk veranderen, omdat de effecten van slijtage of opeenstapeling van residuen van bepaalde chemische stoffen op de boorgaten of op het vensterglas van de inwendige kamers de verstrooiing of reflectie van licht kunnen beïnvloeden. Hierdoor zou de referentiewaarde voor de lichttransmissie (en omgekeerd de referentiewaarde voor de troebelheidsmetingen) door de corneahouders kunnen stijgen of dalen, en dit kan zichtbaar zijn door merkbare veranderingen in de verwachte initiële corneale referentietroebelheidsmetingen in de afzonderlijke kamers (d.w.z. de initiële corneale troebelheidswaarden in specifieke afzonderlijke corneahouders kunnen stelselmatig meer dan 2 of 3 troebelheidseenheden verschillen van de verwachte referentiewaarden). Elk laboratorium zou moeten overwegen een programma vast te stellen voor het beoordelen van veranderingen in de lichttransmissie door de corneahouders, afhankelijk van de aard van de geteste verbindingen en de gebruiksfrequentie van de kamers. Om referentiewaarden vast te stellen, kunnen corneahouders voordat tot routinegebruik wordt overgegaan, worden gecontroleerd door de referentietroebelheidswaarden (of lichttransmissie) van kamers gevuld met volledig medium, zonder cornea's, te meten. De corneahouders worden daarna op gezette tijden gecontroleerd op veranderingen in de lichttransmissie tijdens gebruiksperioden. Elk laboratorium kan de frequentie voor het controleren van de corneahouders vaststellen op basis van de geteste stoffen, de gebruiksfrequentie en waarnemingen van veranderingen in de referentietroebelheidswaarden van cornea's. Indien merkbare veranderingen in de lichttransmissie door de corneahouders worden waargenomen, moeten passende reinigings- en/of polijstprocedures voor de binnenkant van de corneahouders of vervanging ervan worden overwogen.

De corneahouder: Opengewerkte tekening

13)

In deel B wordt hoofdstuk B.48 vervangen door:

„B.48   Isolated Chicken Eye-testmethode voor de identificatie van i) chemische stoffen die ernstig oogletsel veroorzaken en ii) chemische stoffen waarvoor classificatie voor oogirritatie of ernstig oogletsel niet nodig is

INLEIDING

Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 438 (2013) van de OESO. De Isolated Chicken Eye- (ICE-) testmethode werd in 2006 en 2010 geëvalueerd door het Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM), samen met het Europees Centrum voor de validering van alternatieve methoden (ECVAM) en het Japans Centrum voor de validatie van alternatieve methoden (JaCVAM) (1) (2) (3). Bij de eerste evaluatie werd de ICE-testmethode bekrachtigd als een wetenschappelijk geldige testmethode voor gebruik als screeningtest voor de identificatie van chemische stoffen (stoffen en mengsels) die ernstig oogletsel veroorzaken (categorie 1) zoals gedefinieerd door het mondiaal geharmoniseerd classificatie- en etiketteringssysteem voor chemische stoffen (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals, GHS) van de Verenigde Naties (VN) (1) (2) (4) en Verordening (EG) nr. 1272/2008 betreffende de indeling, etikettering en verpakking van stoffen en mengsels (CLP-verordening) (12). Bij de tweede evaluatie werd de ICE-testmethode geëvalueerd op haar bruikbaarheid als screeningtest voor de identificatie van chemische stoffen die niet geclassificeerd zijn voor oogirritatie of ernstig oogletsel zoals gedefinieerd door het GHS van de VN (3) (4). Op basis van de resultaten van de valideringsstudie en de aanbevelingen van het peer review panel werd de oorspronkelijke aanbeveling gehandhaafd om de ICE-testmethode te gebruiken voor de classificatie van chemische stoffen die ernstig oogletsel veroorzaken (VN-GHS-categorie 1), omdat de beschikbare databank sinds de oorspronkelijke ICCVAM-validering ongewijzigd is gebleven. In dat stadium werden geen verdere aanbevelingen gedaan om het toepassingsgebied van de ICE-testmethode uit te breiden met andere categorieën. Met het oog op de beoordeling van de bruikbaarheid van de ICE-testmethode voor de identificatie van chemische stoffen waarvoor classificatie voor oogirritatie of ernstig oogletsel niet nodig is, werd de in-vitro- en in-vivo-gegevensverzameling die in de valideringsstudie werd gebruikt, opnieuw beoordeeld (5). Op grond van deze herbeoordeling werd geconcludeerd dat de ICE-testmethode ook kan worden gebruikt voor de identificatie van chemische stoffen waarvoor classificatie voor oogirritatie en ernstig oogletsel zoals gedefinieerd door het GHS van de VN niet nodig is (4) (5). Deze testmethode omvat de aanbevolen toepassingen en beperkingen van de ICE-testmethode op basis van deze evaluaties. De belangrijkste verschillen tussen de oorspronkelijke versie van 2009 en de bijgewerkte versie van 2013 van de testrichtlijn van de OESO hebben betrekking op, maar zijn niet beperkt tot, het gebruik van de ICE-testmethode voor de identificatie van chemische stoffen waarvoor classificatie volgens het GHS-classificatiesysteem van de VN niet nodig is, een bijwerking van de elementen van het testverslag, een bijwerking van aanhangsel 1 betreffende definities, en een bijwerking van aanhangsel 2 betreffende de stoffen voor de bekwaamheidstoetsing.

Momenteel wordt algemeen aangenomen dat er in de nabije toekomst geen in-vitrotest voor oogirritatie zal komen die de in-vivo-Draize-oogtest volledig zal kunnen vervangen om voorspellingen te doen voor het volledige bereik van irritatie voor verschillende klassen chemische stoffen. Strategische combinaties van meerdere alternatieve testmethoden binnen een (trapsgewijze) teststrategie kunnen de Draize-oogtest mogelijk echter wel vervangen (6). De top-downbenadering (7) is bedoeld om te worden gebruikt wanneer op basis van bestaande informatie verwacht wordt dat een chemische stof een hoog irritatiepotentieel heeft, terwijl de bottom-upbenadering (7) bedoeld is om te worden gebruikt wanneer op basis van bestaande informatie verwacht wordt dat een chemische stof onvoldoende oogirritatie zal veroorzaken om classificatie noodzakelijk te maken. De ICE-testmethode is een in-vitrotestmethode die onder bepaalde voorwaarden en met specifieke beperkingen zoals beschreven in de punten (8) tot en met (10) kan worden gebruikt voor de classificatie van gevaren voor de ogen en de etikettering van chemische stoffen. Hoewel de ICE-testmethode niet geldig geacht wordt als zelfstandige vervanging van de in-vivo-oogtest bij konijnen, wordt de ICE-testmethode aanbevolen als een eerste stap binnen een teststrategie zoals de top-downbenadering die door Scott et al. is voorgesteld (7) voor de identificatie van chemische stoffen die ernstig oogletsel veroorzaken, d.w.z. voor chemische stoffen die moeten worden ingedeeld in VN-GHS-categorie 1, zonder verdere tests (4). De ICE-testmethode wordt ook aanbevolen voor de identificatie van chemische stoffen waarvoor classificatie voor oogirritatie of ernstig oogletsel niet nodig is, zoals gedefinieerd door het GHS van de VN (VN-GHS Geen categorie) (4), en kan derhalve worden gebruikt als eerste stap in een bottom-upbenadering van een teststrategie (7). Voor een chemische stof waarvoor met de ICE-testmethode niet wordt voorspeld dat deze ernstig oogletsel veroorzaakt of dat classificatie voor oogirritatie/ernstig oogletsel niet nodig is, moeten echter aanvullende tests (in vitro en/of in vivo) worden uitgevoerd om tot een definitieve classificatie te komen. Bovendien moeten de toepasselijke regelgevingsinstanties worden geraadpleegd voordat de ICE-testmethode wordt gebruikt in een bottom-upbenadering volgens andere classificatiesystemen dan het GHS van de VN.

Deze testmethode is bedoeld om de procedures te beschrijven die worden gebruikt om het mogelijke gevaar van een teststof voor de ogen te beoordelen aan de hand van het vermogen van deze chemische stof om toxiciteit op te wekken in een verwijderd kippenoog. Toxische effecten op de cornea worden gemeten door (i) een kwalitatieve beoordeling van de troebelheid, (ii) een kwalitatieve beoordeling van de schade aan de epitheellaag op basis van aanbrenging van fluoresceïne op het oog (fluoresceïne-retentie), (iii) een kwantitatieve meting van toegenomen dikte (zwelling) en (iv) een kwalitatieve beoordeling van macroscopische morfologische schade aan het oppervlak. De beoordelingen van de corneale troebelheid, zwelling en schade na blootstelling aan een teststof worden individueel beoordeeld en daarna gecombineerd om een oogirritatieklasse te kunnen afleiden.

Definities worden gegeven in aanhangsel 1.

INLEIDENDE OVERWEGINGEN EN BEPERKINGEN

Deze testmethode is gebaseerd op het protocol dat is voorgesteld in OESO-leidraad nr. 160 (8) en ontwikkeld werd naar aanleiding van een internationale valideringsstudie van het ICCVAM (1) (3) (9) met bijdragen van het European Centre for the Validation of Alternative Methods, het Japanese Center for the Validation of Alternative Methods en TNO Quality of Life Department of Toxicology and Applied Pharmacology (Nederland). Het protocol is gebaseerd op informatie verkregen uit gepubliceerde protocollen alsook het huidige door TNO gebruikte protocol (10) (11) (12) (13) (14).

Bij de onderliggende validering van deze testmethode werd een groot aantal chemische stoffen getest en de empirische databank van de valideringsstudie bevatte 152 chemische stoffen, waarvan 72 stoffen en 80 mengsels (5). De testmethode is van toepassing op vaste stoffen, vloeistoffen, emulsies en gels. Vloeistoffen mogen waterig of niet-waterig zijn; vaste stoffen mogen al dan niet in water oplosbaar zijn. Gassen en aerosols zijn nog niet gevalideerd in een valideringsstudie.

De ICE-testmethode kan worden gebruik om chemische stoffen te identificeren die ernstig oogletsel veroorzaken en die moeten worden ingedeeld in VN-GHS-categorie 1 (4). Voor het doel van dit onderzoek zijn de geïdentificeerde beperkingen van de ICE-testmethode gebaseerd op het grote aantal vals-positieve uitslagen voor alcoholen en het grote aantal vals-negatieve uitslagen voor vaste stoffen en oppervlakteactieve stoffen (1) (3) (9). In deze context (VN-GHS-categorie 1 aangemerkt als niet tot VN-GHS-categorie 1 behorend) zijn vals-negatieve uitslagen echter niet kritiek omdat alle teststoffen die een negatief resultaat geven, vervolgens worden getest met (een) andere afdoend gevalideerde in-vitrotest(s), of als laatste optie bij konijnen, afhankelijk van de wettelijke voorschriften, met een sequentiële teststrategie in een op bewijskracht gebaseerde aanpak. Voorts zij opgemerkt dat vaste stoffen kunnen leiden tot variabele en extreme blootstellingsomstandigheden in de in-vivo-Draize-test op oogirritatie, die irrelevante voorspellingen van het werkelijke irritatiepotentieel van deze stoffen kunnen opleveren (15). Onderzoekers zouden kunnen overwegen deze testmethode te gebruiken voor alle typen chemische stoffen, waarbij een positief resultaat dient te worden aangenomen als een aanwijzing van ernstig oogletsel, d.w.z. om de stof zonder verdere tests in te delen in VN-GHS-categorie 1. Positieve resultaten die verkregen werden met alcoholen dienen echter met voorzichtigheid te worden geïnterpreteerd vanwege het risico van overpredictie.

Wanneer de ICE-testmethode wordt gebruikt om chemische stoffen die ernstig oogletsel veroorzaken (VN-GHS-categorie 1) te identificeren, heeft deze testmethode een algemene nauwkeurigheidsgraad van 86 % (120/140), een percentage vals-positieve uitslagen van 6 % (7/113) en een percentage vals-negatieve uitslagen van 48 % (13/27) vergeleken met gegevens van de in-vivo-oogtest bij konijnen die werden geclassificeerd volgens het GHS-classificatiesysteem van de VN (4) (5).

De ICE-testmethode kan ook worden gebruik om chemische stoffen te identificeren die niet hoeven te worden ingedeeld voor oogirritatie of ernstig oogletsel volgens het VN-GHS-classificatiesysteem (4). Voor de ICE-testmethode in een bottom-upbenadering volgens andere classificatiesystemen wordt gebruikt, dienen de toepasselijke regelgevingsinstanties te worden geraadpleegd. Deze testmethode kan worden gebruikt voor alle soorten chemische stoffen, waarbij een negatief resultaat kan worden aangenomen om een chemische stof niet in te delen voor oogirritatie en ernstig oogletsel. Op basis van één resultaat van de valideringsdatabank is de voorspelling voor aangroeiwerende oplosmiddelhoudende organische verven echter mogelijk te laag (5).

Wanneer de ICE-testmethode wordt gebruikt om chemische stoffen te identificeren die geen indeling voor oogirritatie en ernstig oogletsel behoeven, heeft deze testmethode een algemene nauwkeurigheidsgraad van 82 % (125/152), een percentage vals-positieve uitslagen van 33 % (26/79) en een percentage vals-negatieve uitslagen van 1 % (1/73) vergeleken met gegevens van de in-vivo-oogtest bij konijnen die werden geclassificeerd volgens het GHS-classificatiesysteem van de VN (4) (5). Wanneer teststoffen in bepaalde klassen (zoals aangroeiwerende oplosmiddelhoudende organische verven) worden uitgesloten van de databank, heeft de ICE-testmethode een nauwkeurigheidsgraad van 83 % (123/149), een percentage vals-positieve uitslagen van 33 % (26/78) en een percentage vals-negatieve uitslagen van 0 % (0/71) voor het VN-GHS-classificatiesysteem (4) (5).

De ICE-testmethode wordt niet aanbevolen voor het identificeren van teststoffen die moeten worden geclassificeerd als irriterend voor de ogen (VN-GHS-categorie 2 of categorie 2A) of teststoffen die moeten worden geclassificeerd als licht irriterend voor de ogen (VN-GHS-categorie 2B), vanwege het aanzienlijke aantal chemische stoffen van VN-GHS-categorie 1 die te laag zijn ingedeeld in VN-GHS-categorie 2, 2A of 2B en het aanzienlijke aantal chemische stoffen van VN-GHS Geen categorie die te hoog zijn ingedeeld in VN-GHS-categorie 2, 2A of 2B. Voor dit doel kan het nodig zijn verdere tests met een andere geschikte methode uit te voeren.

Alle procedures met kippenogen dienen de op de testinrichting toepasselijke regelgeving en procedures voor de behandeling van menselijke of van dieren afkomstige materialen na te leven, met inbegrip van maar niet beperkt tot weefsels en weefselvloeistoffen. Universele voorzorgsmaatregelen voor laboratoria zijn aanbevolen (16).

Hoewel de ICE-testmethode geen rekening houdt met letsels van het ooglid en de iris zoals die in de oogirritatietestmethode bij konijnen worden beoordeeld, wordt wel gekeken naar effecten op het hoornvlies, die bij in-vivo-onderzoek de belangrijkste factor voor indeling zijn bij de VN-GHS-classificatie. Hoewel de reversibiliteit van hoornvliesletsels op zichzelf niet kan worden beoordeeld in de ICE-testmethode, werd bovendien voorgesteld, op basis van studies op de ogen van konijnen, dat een beoordeling van de aanvankelijke diepte van het hoornvliesletsel kan worden gebruikt om sommige types irreversibele effecten te identificeren (17). Zo is er in het bijzonder meer wetenschappelijke kennis nodig om te begrijpen hoe irreversibele effecten optreden die geen verband houden met de aanvankelijke diepte van het letsel. Tot slot kan de ICE-testmethode niet worden gebruikt voor een beoordeling van de mogelijkheid van met blootstelling van het oog geassocieerde systemische toxiciteit.

Deze testmethode zal periodiek worden bijgewerkt wanneer nieuwe informatie en gegevens in aanmerking worden genomen. Histopathologie kan bijvoorbeeld van nut zijn wanneer een vollediger karakterisering van schade aan de cornea nodig is. Om die mogelijkheid te evalueren, worden de gebruikers aangemoedigd om ogen te bewaren en histopathologiespecimen te prepareren die kunnen worden gebruikt om een databank en beslissingscriteria te ontwikkelen die de nauwkeurigheid van deze testmethode verder kunnen verbeteren. De OESO heeft een leidraad over het gebruik van in-vitrotestmethoden voor oculaire toxiciteit uitgewerkt met gedetailleerde procedures voor het verzamelen van histopathologiespecimen en informatie over waar specimen en/of histopathologiegegevens kunnen worden ingediend (8).

Elk laboratorium dat dit onderzoek voor het eerst opstelt, dient gebruik te maken van de in bijlage 2 voorziene chemische stoffen voor bekwaamheidstoetsing. Een laboratorium kan deze chemicaliën gebruiken om zijn technische bekwaamheden met betrekking tot het uitvoeren van de ICE-testmethode aan te tonen vooraleer het ICE-onderzoeksgegevens indient voor de wettelijke gevarenclassificatie.

PRINCIPE VAN DE TEST

De ICE-testmethode is een organotypisch model dat handhaving op korte termijn van het kippenoog in vitro vereist. In deze testmethode wordt schade door de teststof beoordeeld door vaststelling van corneale zwelling, troebelheid en fluoresceïne-retentie. Daar waar de laatste twee parameters een kwalitatieve beoordeling vergen, vereist de analyse van de corneale zwelling een kwantitatieve beoordeling. Elke meting wordt ofwel omgezet in een kwantitatieve score die gebruikt wordt voor de berekening van een algemene irritatie-index, ofwel een kwalitatieve indeling toegekend die gebruikt wordt voor de toekenning van een in-vitro-indeling van het gevaar voor de ogen, hetzij als VN-GHS-categorie 1, hetzij als niet ingedeeld volgens VN-GHS. Elk van deze resultaten kan dan worden aangewend om het potentiële ernstige oogletsel in vivo of de afwezigheid van de noodzaak van indeling als gevaarlijk voor de ogen van een teststof te voorspellen (zie beslissingscriteria). Er kan evenwel geen indeling worden gegeven voor chemische stoffen waarvan niet is voorspeld dat zij ernstig oogletsel veroorzaken of die niet zijn ingedeeld met de ICE-testmethode (zie punt 11).

Bron en ouderdom van de kippenogen

In het verleden werden voor dit onderzoek steeds ogen verzameld van kippen uit de slachterij die geslacht werden voor de menselijke consumptie waardoor er geen nood was aan proefdieren. Enkel ogen van gezonde dieren die geschikt zijn voor de menselijke voedselketen worden gebruikt.

Hoewel een gecontroleerde studie voor de beoordeling van de ideale leeftijd van de kip nog niet werd gevoerd, was de leeftijd en het gewicht van de in deze testmethode gebruikte kippen in het verleden dat van piepkuikens van oudsher geslacht in een pluimveeslachterij (d.w.z. ongeveer 7 weken oud, 1,5 tot 2,5 kg).

Verzameling en vervoer van ogen naar het laboratorium

Na verdoving van de kippen, meestal met een elektrische schok, en incisie in de nek voor bloeding, dient de kop onmiddellijk verwijderd te worden. Er dient een plaatselijke bron van kippen, niet ver van het laboratorium te worden gezocht zodat de koppen snel genoeg van de slachterij naar het laboratorium kunnen worden vervoerd om bederf en/of bacteriële besmetting zoveel mogelijk te beperken. Om de naleving van de acceptatiecriteria van de test te verzekeren dient het tijdsinterval tussen de verzameling van de koppen en het moment waarop de ogen in de superfusiekamer worden geplaatst nadat zij zijn weggenomen, tot een minimum te worden beperkt (gewoonlijk maximaal twee uur). Alle in het onderzoek gebruikte ogen dienen van dezelfde groep op een bepaalde dag verzamelde ogen te zijn.

Aangezien de ogen in het laboratorium ontleed worden, worden de koppen intact en op omgevingstemperatuur van de slachterij (gewoonlijk tussen 18 °C en 25 °C) vervoerd in plastic dozen, bevochtigd met in isotoon zout gedrenkte doeken.

Selectiecriteria en aantal ogen gebruikt in de ICE

Ogen die een hoge referentie-fluoresceïneverkleuring (d.w.z. > 0,5) of corneale troebelheidsscore (d.w.z. > 0,5) vertonen, worden na verwijdering verworpen.

Elke behandelingsgroep en tegelijkertijd gemeten positieve controle bestaat uit ten minste drie ogen. De negatieve controlegroep of de oplosmiddelcontrole (indien een ander oplosmiddel dan zout gebruikt wordt) bestaat uit ten minste één oog.

Wanneer vaste materialen het resultaat “GHS Geen categorie” opleveren, is een tweede cyclus met drie ogen aanbevolen om het negatieve resultaat te bevestigen of te verwerpen.

PROCEDURE

Voorbereiding van de ogen

De oogleden worden zorgvuldig verwijderd zodat geen schade wordt berokkend aan de cornea. De corneale integriteit kan eenvoudig worden beoordeeld met een druppel van 2 % (g/v) natriumfluoresceïne die gedurende enkele seconden wordt aangebracht op het hoornvliesoppervlak en daarna uitgewassen met een isotone zoutoplossing. Met fluoresceïne behandelde ogen worden daarna onderzocht met een spleetlampmicroscoop om er zeker van te zijn dat de cornea niet beschadigd is (d.w.z. fluoresceïne-retentie en corneale troebelheidsscore ≤ 0.5).

Indien het oog onbeschadigd is, wordt het voorzichtig verder verwijderd uit de schedel zonder de cornea te beschadigen. De oogbal wordt van de oogrand getrokken door het derde ooglid stevig vast te houden met een chirurgische tang terwijl de oogspier afgesneden wordt met een kromme schaar met botte punten. Het is belangrijk schade aan de cornea door buitensporige druk (d.w.z. misvorming door samendrukking) te voorkomen.

Als het oog van de oogrand verwijderd is, zou een zichtbaar gedeelte van de oogzenuw nog aangehecht moeten zijn. Zodra het oog van de oogrand verwijderd is, wordt het op een absorberend verband gelegd en worden het derde ooglid en ander bindweefsel weggesneden.

Het verwijderde oog wordt op een klem van roestvrij staal geplaatst met de cornea in verticale positie. De klem wordt dan overgebracht naar een kamer van het superfusieapparaat (18). De klemmen dienen zo in het superfusieapparaat te worden geplaatst dat de volledige cornea met de isotone zoutoplossing wordt bedropen (3-4 druppels per minuut of 0,1 tot 0,15 ml/min). In de kamers van het superfusieapparaat moet een temperatuur van 32 ± 1,5 °C worden gehandhaafd. Bijlage 3 bevat een diagram van een typisch superfusieapparaat met oogklemmen, dat verkrijgbaar is in de handel of zelf kan worden gemaakt. Het apparaat kan worden aangepast aan de behoeften van elk individueel laboratorium (bv. om een ander aantal ogen te houden).

Nadat ze in het superfusieapparaat geplaatst zijn, worden de ogen nogmaals onderzocht met een spleetlampmicroscoop om te controleren dat er zich tijdens de dissectieprocedure geen schade heeft voorgedaan. Met behulp van de dieptemeter van de spleetlampmicroscoop wordt meteen ook de corneale dikte gemeten ter hoogte van de corneale apex. Ogen met een fluoresceïne-retentiescore van > 0,5; (ii) corneale troebelheid > 0,5; elk bijkomend teken van schade, dienen te worden vervangen. Individuele ogen die niet werden verwijderd op basis van de voorgaande criteria dienen te worden verwijderd indien de corneale dikte met meer dan 10 % afwijkt van de gemiddelde waarde van alle ogen. Gebruikers dienen zich te realiseren dat spleetlampmicroscopen verschillende resultaten voor corneale dikte kunnen opleveren naargelang van de instelling van de breedte van de spleet. De breedte van de spleet dient te worden ingesteld op 0,095 mm.

Zodra alle ogen onderzocht en goedgekeurd zijn, worden de ogen gedurende ongeveer 45 tot 60 minuten geïncubeerd om ze vóór de dosering te equilibreren met het testsysteem. Na de equilibreerperiode wordt een nulreferentiemeting opgetekend voor de corneale dikte en troebelheid die zal dienen als referentie (d.w.z. tijd = 0). De fluoresceïnescore die bepaald wordt bij de ontleding wordt gebruikt als referentiemeting voor dat eindpunt.

Aanbrenging van de teststof

Onmiddellijk na de nulreferentiemetingen wordt het oog (in de houder) verwijderd uit het superfusieapparaat, in horizontale positie geplaatst, en wordt de teststof aangebracht op de cornea.

Vloeibare teststoffen worden gewoonlijk onverdund getest, maar kunnen worden verdund indien dit nodig blijkt te zijn (bv. als onderdeel van de onderzoeksopzet). Het aanbevolen oplosmiddel voor verdunde teststoffen is fysiologische zoutoplossing. Andere oplosmiddelen mogen echter ook worden gebruikt in gecontroleerde omstandigheden maar indien aan een ander oplosmiddel dan fysiologische zoutoplossing de voorkeur wordt gegeven, dient dit te worden gemotiveerd.

Vloeibare teststoffen worden zodanig aangebracht op de cornea dat het gehele oppervlak van de cornea gelijk bedekt is met de teststof; het standaardvolume is 0,03 ml.

Indien mogelijk, dienen de vaste stoffen zo fijn mogelijk gemalen te worden in een vijzel of een vergelijkbaar maalinstrument. Het poeder wordt zodanig op de cornea aangebracht dat het hele oppervlak gelijk bedekt is met de teststof; de standaardhoeveelheid is 0,03 g.

De teststof (vloeibaar of vast) wordt gedurende 10 seconden toegediend en dan weggespoeld met isotone zoutoplossing (ongeveer 20 ml) op omgevingstemperatuur. Het oog (in de houder) wordt daarna terug in het superfusieapparaat geplaatst in de oorspronkelijke rechtopstaande positie. Indien nodig kunnen de cornea na de toediening gedurende 10 seconden en op latere tijdstippen (bv. wanneer er residuen van de teststof op de cornea worden aangetroffen) bijkomend worden uitgewassen. Over het algemeen is de hoeveelheid zoutoplossing die extra wordt gebruikt voor het uitwassen, niet van doorslaggevend belang, maar de vaststelling dat chemische stoffen aan de cornea blijven kleven is wel belangrijk.

Controlestoffen

In elk experiment moeten gelijktijdig gemeten negatieve controles of controles met oplosmiddel/medium en positieve controles worden opgenomen.

Bij het testen van vloeistoffen aan 100 % of vaste stoffen wordt fysiologische zoutoplossing gebruikt als tegelijkertijd gemeten negatieve controle in de ICE-testmethode om niet-specifieke veranderingen in het testsysteem op te sporen en om te garanderen dat de onderzoeksomstandigheden niet ongewenst leiden tot een irriterende respons.

Bij het testen van verdunde vloeistoffen wordt een tegelijkertijd gemeten controlegroep van oplosmiddelen/media opgenomen in de testmethode om niet-specifieke veranderingen in het testsysteem op te sporen en om te garanderen dat de onderzoeksomstandigheden niet ongewenst leiden tot een irriterende respons. Zoals gesteld in punt 31, kunnen enkel oplosmiddelen/media worden gebruikt waarvan geweten is dat ze geen nadelig effect op het testsysteem hebben.

Een bekende voor de ogen irriterende stof wordt in elk experiment opgenomen als gelijktijdige positieve controle om na te gaan of de juiste respons wordt opgewekt. Aangezien het ICE-onderzoek in deze testmethode wordt gebruikt om corrosieve en hevig irriterende stoffen te identificeren, is het best dat de positieve controle gebeurt met een referentiestof die een hevige respons opwekt in deze testmethode. Om te verzekeren dat de variabiliteit in de positieve-controlerespons doorheen de tijd kan worden beoordeeld, mag de grootte van de hevig irriterende respons echter niet buitensporig zijn. Voor de positieve controle dienen voldoende in-vitrogegevens te worden gegenereerd zodat een statistisch gedefinieerde aanvaardbare reeks voor de positieve controle kan worden berekend. Indien voor een bepaalde positieve controle geen gepaste historische ICE-testmethodegegevens beschikbaar zijn, dan is het mogelijk dat onderzoek dient te worden verricht om deze gegevens te verkrijgen.

Voorbeelden van positieve controles voor vloeibare teststoffen zijn 10 % azijnzuur of 5 % benzalkoniumchloride. Voorbeelden van positieve controles voor vaste teststoffen zijn natriumhydroxide of imidazool.

IJkstoffen zijn nuttig voor de beoordeling van potentiële oogirritatie bij onbekende chemische stoffen uit een specifieke chemische klasse of productklasse of voor de beoordeling van potentiële relatieve irritatie van een voor het oog irriterende stof binnen een reeks van irritatieresponsen.

Gemeten eindpunten

Behandelde cornea's worden beoordeeld vóór behandeling en op 30, 75, 120, 180 en 240 minuten (± 5 minuten) na het uitwassen na behandeling. Deze punten in de tijd leveren een geschikt aantal metingen op over een behandelingsperiode van vier uur en laten toch voldoende tijd tussen twee metingen voor de vereiste waarnemingen voor alle ogen.

De eindpuntbeoordelingen zijn corneale troebelheid, zwelling, fluoresceïne-retentie en morfologische effecten (bv. kuilvorming of loskomen van de epitheellaag). Alle eindpunten, met uitzondering van de fluoresceïne-retentie (die enkel wordt bepaald vóór de behandeling en 30 minuten na blootstelling aan de teststof) worden bepaald op elk van de bovenvermelde tijdstippen.

Het nemen van foto's wordt aanbevolen als documentatie van corneale troebelheid, fluoresceïne-retentie, morfologische effecten en, indien uitgevoerd, histopathologie.

Na het laatste onderzoek, na vier uur, worden gebruikers aangespoord om de ogen te bewaren in het gepaste fixeermiddel (d.w.z. neutrale gebufferde formaldehyde) voor eventueel histopathologisch onderzoek (zie punt 14 en referentie (8) voor meer informatie).

Corneale zwelling wordt bepaald aan de hand van de diktemetingen van de cornea met een optische pachymeter op een spleetlampmicroscoop. Zij wordt uitgedrukt als percentage en wordt berekend vanuit de corneale diktemetingen volgens de volgende formule:

Het gemiddelde percentage van corneale zwelling voor alle testogen wordt berekend voor alle waarnemingstijdstippen. Op basis van de hoogste gemiddelde score voor corneale zwelling, zoals die op elk tijdstip is waargenomen, wordt dan een algemene categoriescore toegekend aan elke teststof (zie punt 51).

De corneale troebelheid wordt beoordeeld aan de hand van het gebied van de cornea waar de troebelheid het dichtst is, zoals te zien in tabel 1. De gemiddelde waarde van de corneale troebelheid voor alle testogen wordt berekend voor alle waarnemingstijdstippen. Op basis van de hoogste gemiddelde score voor corneale troebelheid, zoals die op elk tijdstip is waargenomen, wordt dan een algemene categoriescore toegekend aan elke teststof (zie punt 51).

Tabel 1

Corneale troebelheidsscores

De mate van fluoresceïne-retentie wordt enkel beoordeeld op het tijdstip van de 30e minuut, zoals te zien in tabel 2. De gemiddelde fluoresceïne-retentiewaarde voor alle testogen wordt vervolgens berekend voor het tijdstip van de 30e minuut en wordt gebruikt voor de algemene categoriescore die aan elke teststof wordt gegeven (zie punt 51).

Tabel 2

Fluoresceïne-retentiescores

Morfologische effecten zijn bijvoorbeeld “kuilvorming” van de corneale epitheelcellen, “loskomen” van de epitheellaag, “ongelijkmatig worden” van het corneale oppervlak en “kleven” van de teststof aan de cornea. Deze bevindingen kunnen in hevigheid variëren en kunnen eveneens gelijktijdig voorkomen. De indeling van deze bevindingen is subjectief naargelang de interpretatie van de onderzoeker.

GEGEVENS EN RAPPORTAGE

Evaluatie van de gegevens

Resultaten van corneale troebelheid, zwelling en fluoresceïne-retentie dienen afzonderlijk te worden beoordeeld om een ICE-klasse te genereren voor elk eindpunt. De ICE-klassen voor elk eindpunt worden daarna gecombineerd om een irritatieklasse voor elke teststof te genereren.

Beslissingscriteria

Na beoordeling van elk eindpunt kunnen ICE-klassen worden toegekend op basis van een vooraf vastgestelde reeks. Interpretatie van corneale zwelling (tabel 3), troebelheid (tabel 4) en fluoresceïne-retentie (tabel 5) aan de hand van vier ICE-klassen gebeurt volgens onderstaande schalen. Scores voor corneale zwelling zoals te zien in tabel 3 zijn enkel van toepassing indien de dikte gemeten wordt met een spleetlampmicroscoop (bijvoorbeeld Haag-Streit BP900) met een dieptemeetapparaat nr. 1 en spleetbreedte ingesteld op 9 gelijk aan 0,095 mm. Gebruikers dienen zich te realiseren dat spleetlampmicroscopen verschillende resultaten voor corneale dikte kunnen opleveren naargelang van de instelling van de breedte van de spleet.

Tabel 3

ICE-indelingscriteria voor corneale zwelling

Tabel 4

ICE-indelingscriteria voor troebelheid

Tabel 5

ICE-indelingscriteria voor gemiddelde fluoresceïne-retentie

De in-vitroclassificatie voor een teststof wordt beoordeeld door de GHS-classificatie te nemen die overeenkomt met de combinatie van de categorieën die werden verkregen voor corneale zwelling, corneale troebelheid en fluoresceïne-retentie zoals beschreven in tabel 6.

Tabel 6

Totale in-vitroclassificaties

Acceptatiecriteria van het onderzoek

Een test wordt aanvaardbaar geacht als de gelijktijdige negatieve controles of controles met medium/oplosmiddel en de gelijktijdige positieve controles respectievelijk zijn geïdentificeerd als GHS niet ingedeeld en GHS categorie 1.

Testverslag

Het testverslag dient de volgende informatie te bevatten, indien relevant voor het voeren van het onderzoek: