EUR-Lex Access to European Union law

1.

Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 105 (1995) van de OESO (TG 105). Deze testmethode is een herziene versie van de oorspronkelijke TG 105, die in 1981 is vastgesteld. Er zijn geen inhoudelijke verschillen tussen de huidige versie en die uit 1981. De wijzigingen betreffen voornamelijk de vorm. De herziening is uitgevoerd op basis van EU-testmethode „Oplosbaarheid in water” (1).

2.

De oplosbaarheid in water van een stof kan aanzienlijk worden beïnvloed door de aanwezigheid van verontreinigingen. Deze testmethode betreft de bepaling van de oplosbaarheid in water van niet-vluchtige, chemisch zuivere stoffen die stabiel zijn in water. Alvorens de oplosbaarheid in water te bepalen, is het nuttig om van tevoren te beschikken over gegevens inzake de te onderzoeken stof, zoals de structuurformule, de dampspanning, de dissociatieconstante en de hydrolyse (als functie van de pH).

3.

In deze testmethode worden twee methoden beschreven: de kolomelutiemethode en de methode met de kolf, die respectievelijk van toepassing zijn op stoffen waarvan de oplosbaarheid minder of meer bedraagt dan 10–2 g/l. Tevens wordt een eenvoudige inleidende test beschreven. Daarmee kan worden bepaald wat bij benadering de juiste hoeveelheid van het monster is om in de uiteindelijke test te gebruiken, alsmede hoeveel tijd er nodig is om de verzadigingswaarde te bereiken.

4.

De oplosbaarheid van een stof in water is de massaconcentratie van de stof in een verzadigde oplossing in water bij een gegeven temperatuur.

5.

De oplosbaarheid in water wordt uitgedrukt als de massa van opgeloste stof per volume van de oplossing. De SI-eenheid is kg/m3 (g/l kan ook worden gebruikt).

6.

Het is niet nodig om bij het onderzoeken van een stof referentiestoffen te gebruiken.

7.

De test wordt bij voorkeur uitgevoerd bij 20 ± 0,5 °C. De gekozen temperatuur moet in alle betrokken delen van de apparatuur constant worden gehouden.

8.

In een maatcilinder van 10 ml, voorzien van een glazen stop, worden stapsgewijs toenemende volumes water op kamertemperatuur toegevoegd aan ongeveer 0,1 g monster (vaste stoffen moeten worden fijngemaakt). Nadat een hoeveelheid water is toegevoegd, wordt het mengsel telkens gedurende 10 minuten geschud en vervolgens visueel onderzocht op eventuele onopgeloste delen van het monster. Als het monster of delen ervan onopgelost zijn nadat nog 10 ml water is toegevoegd, wordt het experiment herhaald in een maatcilinder van 100 ml. De benaderde waarde van de oplosbaarheid is hieronder in tabel 1 vermeld onder de hoeveelheid water waarin het monster geheel wordt opgelost. Bij een lagere waarde van de oplosbaarheid kan het lang duren om een teststof op te lossen en moet minimaal 24 uur in acht worden genomen. Als de teststof na 24 uur nog steeds niet is opgelost, moet langer (maximaal 96 uur) worden gewacht of moet worden geprobeerd de stof verder te verdunnen om te bepalen of de kolomelutiemehode dan wel de methode met de kolf moet worden gebruikt.

Tabel 1

9.

Deze methode is gebaseerd op de elutie van de te onderzoeken stof met water uit een microkolom welke is gevuld met een inert dragermateriaal dat van tevoren is gedekt met een overmaat aan de te onderzoeken stof (2). De oplosbaarheid in water is gelijk aan de massaconcentratie van het eluaat wanneer deze een plateau bereikt als functie van de tijd

10.

De apparatuur bestaat uit een microkolom (figuur 1) die op constante temperatuur wordt gehouden. Deze wordt aangesloten op een recirculatiepomp (figuur 2) of op een voorraadfles (figuur 3). De microkolom bevat een inerte drager die op zijn plaats wordt gehouden door een kleine prop glaswol, waarmee ook deeltjes worden weggefilterd. Bruikbare materialen voor de drager zijn bijvoorbeeld glasparels, diatomeeënaarde of andere inerte materialen.

11.

De microkolom in figuur 1 is geschikt voor de opstelling met recirculatiepomp. Zij is aan de bovenzijde voorzien van een hoofdruimte voor vijf kolomvolumina (die aan het begin van het experiment worden afgevoerd) en voor het volume van vijf monsters (die tijdens het experiment worden genomen om te worden geanalyseerd). Eventueel kunnen de afmetingen worden verminderd indien tijdens het experiment water aan het systeem kan worden toegevoegd ter vervanging van de eerste vijf kolomvolumina welke met verontreinigingen worden afgevoerd. De kolom is door middel van slangen, gemaakt van een inert materiaal, verbonden met de circulatiepomp, die een opbrengst van ongeveer 25 ml/h moet kunnen leveren. Als recirculatiepomp kan bijvoorbeeld een peristaltische pomp of een membraanpomp worden gebruikt. Er moet op worden toegezien dat geen verontreiniging en/of adsorptie plaatsvindt met het materiaal van de slangen.

12.

In figuur 3 is een schema van een opstelling met een voorraadfles afgebeeld. In deze opstelling is de microkolom voorzien van een eenwegkraan. De kolom en de voorraadfles zijn verbonden door middel van een glazen slijpstuk en slangen, gemaakt van een inert materiaal. Het debiet door de voorraadfles moet ongeveer 25 ml/h bedragen.

Figuur 1

Afmetingen in mm

Figuur 2

Figuur 3

13.

Ongeveer 600 mg dragermateriaal wordt overgebracht in een rondbodemkolf van 50 ml. Een geschikte hoeveelheid van de teststof wordt opgelost in een vluchtig en analytisch zuiver oplosmiddel en de juiste hoeveelheid van deze oplossing wordt bij het dragermateriaal gevoegd. Het oplosmiddel wordt, bijvoorbeeld met behulp van een roterende verdamper, volledig verdampt. Bij onvolledige verwijdering van het oplosmiddel kan het dragermateriaal, ten gevolge van verdelingseffecten aan het oppervlak, tijdens de elutiefase niet worden verzadigd met water. Het beladen dragermateriaal wordt gedurende twee uur bevochtigd in ongeveer 5 ml water en de suspensie wordt in de microkolom gebracht. Als alternatief kan men ook het droge, beladen dragermateriaal direct in de met water gevulde microkolom brengen, en daarna twee uur wachten totdat een evenwichtstoestand is ontstaan.

14.

Het laden van het dragermateriaal kan aanleiding geven tot problemen en daarmee tot onjuiste resultaten, bijvoorbeeld als de teststof wordt afgezet als olie. Deze problemen moeten worden onderzocht en de bijzonderheden moeten worden gerapporteerd.

15.

De stroming door de kolom wordt op gang gebracht. Een debiet van ongeveer 25 ml/h (dit komt overeen met ongeveer 10 kolomvolumina/uur voor de beschreven kolom) wordt aanbevolen. Ten minste de eerste vijf kolomvolumina worden afgevoerd om wateroplosbare verontreinigingen te verwijderen. De apparatuur blijft in werking totdat een evenwichtstoestand is bereikt; hiervoor geldt dat de concentraties in vijf opeenvolgende monsters niet meer dan ± 30 % mogen verschillen op aselecte wijze. Tussen de tijdstippen, waarop deze monsters worden genomen, moeten ten minste tien kolomvolumina passeren. Afhankelijk van de toegepaste analysemethode kan het de voorkeur genieten een concentratie/tijdcurve op te stellen om aan te tonen dat het evenwicht is bereikt.

16.

Er wordt een aantal opeenvolgende monsters van het eluaat genomen voor analyse volgens de gekozen methode. In het middengebied van het eluaat, wanneer de concentraties constant zijn binnen ± 30 % in ten minste vijf opeenvolgende fracties, worden de fracties gebruikt om de oplosbaarheid te bepalen.

17.

Als eluens wordt bij voorkeur dubbel gedestilleerd water gebruikt. Gedeïoniseerd water met een soortelijke weerstand van meer dan 10 megohm/cm en een totaal gehalte aan organische koolstof van minder dan 0,01 % kan ook worden gebruikt.

18.

Bij beide werkwijzen wordt een tweede reeks metingen verricht waarbij het debiet de helft is van de aanvankelijke waarde. Als de resultaten van beide series metingen overeenstemmen, worden de testresultaten geaccepteerd. Als de gemeten oplosbaarheid bij het laagste debiet hoger blijkt, dan moet het halveren van het debiet worden voortgezet, totdat twee opeenvolgende series metingen dezelfde oplosbaarheid geven.

19.

Bij beide werkwijzen moeten de fracties aan de hand van het Tyndall-effect worden gecontroleerd op aanwezigheid van deeltjes in colloïdale toestand. De aanwezigheid van deeltjes maakt de test ongeldig, zodat de test moet worden herhaald nadat de filterwerking van de kolom is verbeterd.

20.

De pH van elk monster moet worden gemeten, bij voorkeur met behulp van speciaal indicatorpapier.

21.

De teststof (vaste stoffen moeten worden fijngemaakt) wordt opgelost in water bij een temperatuur die iets hoger is dan de testtemperatuur. Zodra verzadiging is bereikt, wordt het mengsel afgekoeld en op de testtemperatuur gehouden. Als alternatief, en op voorwaarde dat men er, via geschikte monsternamen, zeker van is dat het verzadigingsevenwicht is bereikt, kan de meting rechtstreeks bij de testtemperatuur worden uitgevoerd. Vervolgens wordt de massaconcentratie van de teststof in de waterige oplossing, welke geen onopgeloste deeltjes mag bevatten, bepaald aan de hand van een geschikte analysemethode (3).

22.

Het volgende materiaal is nodig:

23.

Aan de hand van de inleidende test wordt bepaald hoeveel van de teststof nodig is om de gewenste hoeveelheid water te verzadigen. In drie van een glazen stop voorziene glazen vaten (bijvoorbeeld centrifugebuizen, kolven) wordt telkens ongeveer vijfmaal die hoeveelheid materiaal afgewogen. De op grond van de analysemethode en het oplosbaarheidsbereik vastgestelde hoeveelheid water wordt in elk vat gegoten. De vaten worden goed afgesloten en vervolgens bij 30 °C geschud. Hiervoor moet een schud- of roermachine worden gebruikt waarmee bij constante temperatuur kan worden gewerkt, bijvoorbeeld een magneetroerder in een waterbak met thermostaatregeling. Na één dag wordt 24 uur gewacht totdat in één van de vaten onder af en toe roeren bij de testtemperatuur een evenwichtstoestand is ontstaan. Vervolgens wordt de inhoud van het vat gecentrifugeerd bij de testtemperatuur, waarna de concentratie van de teststof in de heldere waterige oplossing volgens een geschikte analysemethode wordt bepaald. De beide andere kolven ondergaan dezelfde behandeling nadat respectievelijk twee en drie dagen bij 30 °C is gewacht totdat een evenwichtstoestand is ontstaan. Als de gemeten concentraties in ten minste de twee laatstgenoemde vaten onderling niet meer dan 15 % verschillen, worden de testresultaten geaccepteerd. Als de resultaten van de vaten 1, 2 en 3 toenemende waarden geven, moet de hele test worden herhaald, waarbij langer wordt gewacht tot een evenwichtstoestand is ontstaan.

24.

De test kan ook worden uitgevoerd zonder voorverwarming bij 30 °C. Om de snelheid te kunnen schatten waarmee het verzadigingsevenwicht zich instelt, worden monsters genomen totdat blijkt dat verder roeren geen invloed meer heeft op de gemeten concentraties.

25.

De pH van elk monster moet worden gemeten, bij voorkeur met behulp van speciaal indicatorpapier.

26.

Bij voorkeur wordt een methode toegepast waarmee verschillende stoffen kunnen worden onderscheiden, aangezien kleine hoeveelheden opgeloste verontreinigingen kunnen leiden tot grote fouten in de gemeten oplosbaarheid. Voorbeelden van zulke methoden zijn: gas- of vloeistofchromatografie, titratie, fotometrie, voltametrie.

27.

Voor elke serie metingen moeten het gemiddelde en de standaardafwijking worden berekend van ten minste vijf opeenvolgende monsters, die op het verzadigingsniveau zijn genomen. De gemiddelde waarden uit twee tests met verschillend debiet mogen onderling niet meer dan 30 % verschillen.

28.

Het gemiddelde van de aparte resultaten voor de drie kolven, die onderling niet meer dan 15 % mogen verschillen, wordt berekend.

29.

In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

30.

In het verslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

(1)

Richtlijn 92/69/EEG van de Commissie van 31 juli 1992 houdende zeventiende aanpassing aan de vooruitgang van de techniek van Richtlijn 67/548/EEG van de Raad betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke stoffen (PB L 383 van 29.12.1992, blz. 113).

(2)

NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method.

(3)

NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method.”.

1.

Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 123 (2006) van de OESO (TG 123). De langzaam-roerenmethode („slow-stirring”-methode) heeft accurate waarden opgeleverd voor de 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt (POW) tot een log POW van 8,2 (1). Het is dan ook een geschikte experimentele benadering voor de directe bepaling van de POW van zeer hydrofobe stoffen.

2.

Andere methoden voor de bepaling van de 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt (POW) zijn de „schudfles”-methode (2) en de bepaling van de POW aan de hand van het retentiegedrag bij omgekeerde-fase-HPLC (3). De „schudfles”-methode is gevoelig voor artefacten als gevolg van de overgang van microdruppeltjes octanol naar de waterfase. Hoe hoger de POW-waarde, hoe meer de aanwezigheid van deze druppeltjes in de waterfase leidt tot overschatting van de teststofconcentratie in het water. Daarom is het gebruik van deze methode beperkt tot stoffen met log POW < 4. De tweede methode berust op betrouwbare gegevens van rechtstreeks bepaalde POW-waarden voor de kalibratie van het verband tussen het HPLC-retentiegedrag en de gemeten POW-waarden. Er was een voorlopige OESO-testrichtlijn beschikbaar voor de bepaling van 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënten van ioniseerbare stoffen (4), maar deze wordt niet langer gebruikt.

3.

Deze testmethode is ontwikkeld in Nederland. De nauwkeurigheid van de hier beschreven methoden is gevalideerd en geoptimaliseerd in een ringtest met medewerking van vijftien laboratoria (5).

4.

Voor inerte organische stoffen zijn zeer significante verbanden gevonden tussen hun 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt (POW) en hun bioaccumulatie in vissen. Bovendien is een verband aangetoond tussen de POW en de toxiciteit voor vissen en de sorptie van chemicaliën aan vaste stoffen zoals bodems en sedimenten. Referentie (6) biedt een uitvoerig overzicht van deze verbanden.

5.

Er is een grote verscheidenheid aan verbanden vastgesteld tussen de 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt en andere stofeigenschappen die van belang zijn voor milieutoxicologie en milieuchemie. Daardoor is de 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt uitgegroeid tot een centrale parameter bij het beoordelen van het milieurisico van chemicaliën, alsmede bij het voorspellen van de levensloop van chemicaliën in het milieu.

6.

De langzaam-roerenmethode wordt verondersteld de vorming van microdruppeltjes uit druppeltjes 1-octanol in de waterfase te beperken. Hierdoor wordt overschatting van de concentratie in het water als gevolg van teststofmoleculen in dergelijke druppeltjes vermeden. De langzaam-roerenmethode is dan ook bij uitstek geschikt voor de bepaling van de POW voor stoffen met een verwachte log POW-waarde van 5 of hoger, waarvoor de schudflesmethode (2) geneigd is foutieve resultaten te geven.

7.

De verdelingscoëfficiënt van een stof tussen water en een lipofiel oplosmiddel (1-octanol) is een maat voor de evenwichtsverdeling van de stof tussen de twee fasen. De verdelingscoëfficiënt tussen water en 1-octanol (POW) wordt gedefinieerd als de verhouding tussen de evenwichtsconcentraties van de teststof in met water verzadigde 1-octanol (CO) en met 1-octanol verzadigd water (CW).

Aangezien het om een verhouding van concentraties gaat, is de POW dimensieloos. Meestal wordt de 10-logaritme van POW gegeven (log POW). Vanwege de temperatuurafhankelijkheid van de POW moet bij gerapporteerde gegevens de meettemperatuur worden vermeld.

8.

Om de verdelingscoëfficiënt vast te stellen worden water, 1-octanol en de teststof bij constante temperatuur met elkaar in evenwicht gebracht, waarna de concentraties van de teststof in de beide fasen worden bepaald.

9.

De problemen bij de schudflesmethode, in verband met de vorming van microdruppeltjes tijdens het experiment, kunnen met de hier voorgestelde langzaam-roerenmethode worden verminderd. In het langzaam-roerenexperiment worden water, 1-octanol en de teststof in een thermostatisch geregelde geroerde reactor gebracht. Het roeren versnelt de uitwisseling tussen de fasen. De turbulentie als gevolg van het roeren blijft beperkt, waardoor de uitwisseling tussen 1-octanol en water wordt bevorderd zonder dat daarbij microdruppeltjes worden gevormd.

10.

Omdat de aanwezigheid van andere stoffen dan de teststof van invloed zou kunnen zijn op de activiteitscoëfficiënt van de teststof, moet deze als zuivere stof worden onderzocht. Voor de 1-octanol/water-verdelingstest moet de hoogste in de handel verkrijgbare zuiverheid worden gebruikt.

11.

Deze methode is van toepassing op zuivere stoffen die niet dissociëren of verbindingen vormen en die geen significante grensvlakactiviteit vertonen. Zij is toepasbaar voor het bepalen van de verdelingscoëfficiënt tussen 1-octanol en water van dergelijke stoffen en van mengsels. Indien de methode voor mengsels wordt gebruikt, zijn de vastgestelde verdelingscoëfficiënten tussen 1-octanol en water voorwaardelijk en afhankelijk van de chemische samenstelling van het onderzochte mengsel en de elektrolytsamenstelling van de gebruikte waterfase. Mits aanvullende stappen worden genomen, is de methode ook toepasbaar voor verbindingen die dissociëren of verbindingen vormen (punt 12).

12.

Wegens het voorkomen van meervoudige evenwichtstoestanden in water en 1-octanol bij de 1-octanol/water-verdeling van dissociërende stoffen als organische zuren en fenolen, organische basen en organometaalverbindingen, is de verdelingscoëfficiënt een voorwaardelijke constante die sterk afhangt van de elektrolytsamenstelling (7)(8). Bij het bepalen van de 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt moeten de pH en de elektrolytsamenstelling in het experiment dan ook worden gecontroleerd en gerapporteerd. De waardering van dergelijke verdelingscoëfficiënten vereist een deskundig oordeel. Op grond van de dissociatieconstanten moeten geschikte pH-waarden worden geselecteerd, zodat voor elke ionisatietoestand een verdelingscoëfficiënt wordt bepaald. Voor het onderzoeken van organometaalverbindingen zijn buffers nodig die geen complex vormen (8). Rekening houdend met bestaande kennis over het gedrag in water (complexconstanten, dissociatieconstanten), moeten de testomstandigheden zodanig worden gekozen dat een schatting kan worden gemaakt van de speciatie van de teststof in de waterfase. Ten behoeve van een gelijke ionsterkte in alle experimenten moet een achtergrondelektrolyt worden gebruikt.

13.

Bij het uitvoeren van de test op stoffen met een lage oplosbaarheid in water of een hoge POW kunnen problemen optreden doordat de concentraties in water zo laag kunnen worden dat het moeilijk wordt deze nog nauwkeurig te bepalen. Deze testmethode biedt aanwijzingen om met dit probleem om te gaan.

14.

De zuiverheid van de chemische reagentia moet ten minste pro analysi zijn. Aanbevolen wordt om ongemerkte teststoffen te gebruiken met bekende chemische samenstelling en bij voorkeur een zuiverheid van 99 %, dan wel met radioactieve koolstof gemerkte teststoffen met bekende chemische samenstelling en radiochemische zuiverheid. Bij merkstoffen met een korte halfwaardetijd moet voor het radioactief verval worden gecorrigeerd. Bij radioactief gemerkte teststoffen moet een analytische methode worden toegepast die specifiek is voor de verbinding, opdat de gemeten radioactiviteit rechtstreeks verband houdt met de teststof.

15.

Een schatting van log POW kan worden verkregen met behulp van speciaal hiervoor in de handel verkrijgbare software of aan de hand van de verhouding van de oplosbaarheidswaarden in beide oplosmiddelen.

16.

Alvorens met een langzaam-roerenexperiment een POW-waarde te bepalen moet de volgende informatie over een teststof beschikbaar zijn:

17.

Een standaard-laboratoriumuitrusting is vereist, in het bijzonder:

18.

Het reactievat moet zijn vervaardigd van inert materiaal, opdat de adsorptie aan het oppervlak van het reactievat verwaarloosbaar is.

19.

De bepaling van de POW moet worden uitgevoerd met 1-octanol van de hoogste zuiverheid die in de handel verkrijgbaar is (ten minste + 99 %). Aanbevolen wordt de 1-octanol te zuiveren door extractie met zuur, base en water en vervolgens te drogen. Bovendien kan de 1-octanol worden gezuiverd door middel van destillatie. Bij de bereiding van de standaardoplossingen van de teststof moet gezuiverde 1-octanol worden gebruikt. Het water dat voor de POW-bepaling wordt gebruikt, moet zijn gedistilleerd in apparatuur van glas of kwarts, of verkregen uit een zuiveringssysteem. Ook kan HPLC-water worden gebruikt. Voor gedestilleerd water is filtratie door een 0,22 μm-filter vereist, en moeten blanco’s in het experiment worden opgenomen om na te gaan dat de geconcentreerde extracten geen onzuiverheden bevatten die kunnen interfereren met de teststof. Bij gebruik van een glasvezelfilter moet dit vooraf worden schoongemaakt door het ten minste drie uur bij 400 °C te verhitten.

20.

Voorafgaand aan het experiment worden de beide oplosmiddelen met elkaar verzadigd door ze in een voldoende groot reactievat met elkaar in evenwicht te brengen. Hiertoe wordt het tweefasensysteem gedurende twee dagen geroerd.

21.

Een geschikte teststofconcentratie wordt gekozen en opgelost in 1-octanol (verzadigd met water). De 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt moet worden bepaald in verdunde oplossingen in 1-octanol en water. Daarom mag de teststofconcentratie niet hoger zijn dan 70 % van de oplosbaarheid van de stof, met een maximumconcentratie van 0,1 M in elk van beide fasen (1). De voor het experiment gebruikte 1-octanoloplossingen moeten vrij zijn van gesuspendeerde vaste teststofdeeltjes.

22.

De geschikte hoeveelheid teststof wordt opgelost in 1-octanol (verzadigd met water). Als de geschatte waarde voor log POW hoger is dan 5, moet men goed opletten dat de voor het experiment gebruikte 1-octanoloplossingen geen gesuspendeerde vaste teststofdeeltjes bevatten. Daartoe moet bij een geschatte waarde van log POW > 5 de volgende werkwijze worden gevolgd:

23.

Voor de bepaling van de teststofconcentratie moet een gevalideerde analysemethode worden gebruikt. De onderzoekers moeten aantonen dat de concentraties in de met water verzadigde 1-octanolfase en in de met 1-octanol verzadigde waterfase tijdens het experiment boven de bepaalbaarheidsgrens liggen van de gebruikte analysemethode. In gevallen waarin extractiemethoden nodig zijn, moeten voorafgaand aan het experiment de recovery’s van de teststof uit de waterfase en uit de 1-octanolfase worden vastgesteld. Het analysesignaal moet worden gecorrigeerd voor blanco’s en er moet voor worden gezorgd dat geen carry-over van analyt van het ene monster naar het andere kan optreden.

24.

Voorafgaand aan de analyse zijn waarschijnlijk extractie van de waterfase met een organisch oplosmiddel en preconcentratie van het extract noodzakelijk. Om dezelfde reden is het noodzakelijk eventuele blancoconcentraties te verlagen. Daartoe moeten oplosmiddelen van hoge zuiverheid worden gebruikt, bij voorkeur oplosmiddelen voor restanalyse. Bovendien kan het voor het vermijden van kruisverontreiniging bevorderlijk zijn om te werken met vooraf zorgvuldig gereinigd glaswerk(bv. door te wassen met een oplosmiddel of tot hoge temperatuur te verhitten).

25.

Een schatting van log POW kan worden verkregen met een schattingsprogramma of op basis van het oordeel van een deskundige. Indien de waarde hoger is dan 6 moeten blancocorrecties en analytcarry-over nauwlettend worden gemonitord. Evenzo is het bij een geschatte log POW > 6 geboden een surrogaatstandaard te gebruiken om te corrigeren voor de recovery. In de handel is een aantal softwareprogramma’s beschikbaar voor het schatten van log POW  (1), bv. Clog P(16), KOWWIN (17), ProLogP (18) en ACD log P (19). Beschrijvingen van de schattingaanpak zijn te vinden in de referenties (20-22).

26.

De bepaalbaarheidsgrenzen voor de teststofconcentratie in 1-octanol en water worden vastgesteld met behulp van beproefde methoden. Als vuistregel geldt dat de bepaalbaarheidsgrens van de methode kan worden bepaald als zijnde de concentratie in water of 1-octanol die een signaal-ruisverhouding geeft van tien. Er moet een geschikte extractie- en preconcentratiemethode worden gekozen en analytische recovery’s moeten eveneens worden gespecificeerd. Een geschikte preconcentratiefactor wordt gekozen om bij analytische bepaling een signaal van de vereiste sterkte te verkrijgen.

27.

Op basis van de parameters van de analysemethode en de verwachte concentraties wordt bepaald van welke orde van grootte de monsteromvang moet zijn voor een nauwkeurige bepaling van de stofconcentratie. Het gebruik van watermonsters die te klein zijn om voldoende analysesignaal te verkrijgen, moet worden vermeden. Het gebruik van buitensporig grote watermonsters moet eveneens worden vermeden, aangezien er anders te weinig water over is voor het minimaal vereiste aantal analysen (n = 5). In aanhangsel 1 wordt het minimale monstervolume aangegeven als functie van het volume van het reactievat, de detectiegrens van de teststof en de oplosbaarheid van de teststof.

28.

De kwantitatieve bepaling van de teststoffen geschiedt door de kalibratiecurven van de respectieve verbinding te vergelijken. De concentraties van de geanalyseerde monsters moeten vergezeld gaan van de concentraties van de standaarden.

29.

Voor teststoffen met een geschatte log POW > 6 moet voorafgaand aan de extractie een surrogaatstandaard aan het watermonster worden gekoppeld om de tijdens extractie en preconcentratie van de watermonsters optredende verliezen te registeren. Voor een nauwkeurige recoverycorrectie moeten de eigenschappen van de surrogaten vrijwel of geheel overeenkomen met die van de teststof. Bij voorkeur worden voor dit doel stabiele, isotopisch gemerkte (bijvoorbeeld gedeutereerde of 13C-gemerkte) analogen van de betreffende stoffen gebruikt. Indien het gebruik van gemerkte stabiele isotopen (bijvoorbeeld 2H of 13C) niet mogelijk is, moet op basis van betrouwbare gegevens in de literatuur worden aangetoond dat de fysisch-chemische eigenschappen van het surrogaat nagenoeg overeenkomen met die van de teststof. Bij vloeistof-vloeistofextractie van de waterfase kunnen zich emulsies vormen. Dit kan worden beperkt door zout toe te voegen en de emulsie gedurende de nacht te laten bezinken. De voor de extractie en de preconcentratie van de monsters gebruikte methoden dienen te worden vermeld.

30.

Monsters die uit de 1-octanolfase zijn onttrokken, kunnen zo nodig voorafgaand aan de analyse worden verdund met een geschikt oplosmiddel. Bovendien wordt het gebruik van surrogaatstandaarden aanbevolen voor stoffen waarvoor recoveryexperimenten een grote mate van variatie hebben aangetoond in de recoveryexperimenten (een relatieve standaarddeviatie > 10 %).

31.

De details van de analytische methode dienen te worden vermeld, waaronder de extractiemethode, de preconcentratie- en verdunningsfactoren, de instrumentparameters, de kalibratieprocedure, het kalibratiebereik, de analytische recovery van de teststof uit water, de toevoeging van surrogaatstandaarden voor recoverycorrectie, blancowaarden, detectiegrenzen en bepaalbaarheidsgrenzen.

32.

Bij het kiezen van de water- en 1-octanolvolumes moet rekening worden gehouden met de bepaalbaarheidsgrenzen in 1-octanol en water, de preconcentratiefactoren die zijn toegepast op de watermonsters, de monstervolumes in 1-octanol en water, en de verwachte concentraties. Om experimentele redenen moet het volume 1-octanol in het langzaam-roerensysteem zodanig worden gekozen dat de 1-octanollaag dik genoeg is (> 0,5 cm) om een monster te kunnen nemen uit de 1-octanolfase zonder deze te verstoren.

33.

Typische faseverhoudingen die worden gebruikt bij bepalingen van verbindingen met een log POW van 4,5 en hoger zijn 20 tot 50 ml 1-octanol en 950 tot 980 ml water in een 1 litervat.

34.

Tijdens de test wordt het reactievat thermostatisch geregeld om de temperatuur tot op 1 °C constant te houden. De bepaling dient te worden uitgevoerd bij 25 °C.

35.

De proefopstelling moet worden beschermd tegen daglicht, hetzij door het experiment in een donkere ruimte uit te voeren, hetzij door het reactievat met aluminiumfolie te bedekken.

36.

Het experiment moet worden uitgevoerd in een (zo veel mogelijk) stofvrije omgeving.

37.

Het 1-octanol-watersysteem wordt geroerd tot zich een evenwicht heeft ingesteld. In een pilotexperiment wordt de equilibratieperiode bepaald door een langzaam-roerenexperiment uit te voeren en op gezette tijden water- en 1-octanolmonsters te nemen. De monsters moeten worden genomen met een tussentijd van ten minste vijf uur.

38.

Elke POW-bepaling moet worden uitgevoerd met ten minste drie onafhankelijke langzaam-roerenexperimenten.

39.

Aangenomen wordt dat zich een evenwicht heeft ingesteld wanneer een regressie van de 1-octanol/water-concentratieverhouding tegen de tijd over een periode van vier meetpunten een helling oplevert die niet significant afwijkt van nul bij een p-waarde van 0,05. De equilibratietijd is minimaal één dag voordat met de monsterneming kan worden begonnen. Als vuistregel geldt dat de monsterneming van stoffen met een geschatte log POW < 5 op de dagen twee en drie kan plaatsvinden. Bij meer hydrofobe verbindingen kan het zijn dat de equilibratieperiode moet worden verlengd. Voor een verbinding met log POW = 8,23 (decachloorbifenyl) waren 144 uur voldoende voor het instellen van een evenwicht. Of zich een evenwicht heeft ingesteld, wordt nagegaan door herhaaldelijk een monster te nemen uit hetzelfde reactievat.

40.

Bij het opstarten van het experiment wordt het reactievat gevuld met 1-octanol verzadigd water. Vervolgens wordt gewacht totdat de thermostatisch ingestelde temperatuur is bereikt.

41.

De gewenste hoeveelheid teststof (opgelost in het vereiste volume met water verzadigde 1-octanol) wordt voorzichtig toegevoegd in het reactievat. Dit is een cruciale stap in het experiment, daar turbulente menging van de twee fasen vermeden moet worden. Daartoe kan de 1-octanolfase langzaam worden gepipetteerd tegen de wand van het proefvat, vlak boven het wateroppervlak. Het zal dan langs de glaswand stromen en een film vormen boven op de waterfase. Het rechtstreeks schenken van 1-octanol in het vat moet te allen tijde worden vermeden; er mogen geen 1-octanoldruppels rechtstreeks in het water vallen.

42.

Nadat met roeren is begonnen, wordt de roersnelheid langzaam opgevoerd. Als de roermotoren niet op de vereiste manier kunnen worden ingesteld, moet worden overwogen een transformator te gebruiken. De roersnelheid moet zodanig worden ingesteld dat op het raakvlak van het water en de 1-octanol een vortex van 0,5 tot maximaal 2,5 cm diepte wordt gevormd. De roersnelheid moet worden verlaagd als de vortexdiepte van 2,5 cm wordt overschreden, aangezien anders microdruppeltjes kunnen worden gevormd uit druppeltjes 1-octanol in de waterfase, die leiden tot een overschatting van de teststofconcentratie in het water. De maximale roersnelheid van 2,5 cm vortexdiepte wordt aanbevolen op basis van de bevindingen uit het als ringtest uitgevoerde validatieonderzoek (5). Het is een compromis tussen een snelle evenwichtsinstelling en beperking van de vorming van microdruppeltjes 1-octanol.

43.

Voordat een monster wordt genomen, moet de roerder worden uitgezet en moeten de vloeistoffen tot stilstand komen. Nadat het monster is genomen, wordt de roerder weer langzaam aangezet en wordt de roersnelheid weer geleidelijk opgevoerd, zoals hierboven beschreven.

44.

Monsters uit de waterfase worden genomen via een kraan in de bodem van het reactievat. Het dode volume aan water dat zich in de kranen bevindt (in het in aanhangsel 2 beschreven vat ongeveer 5 ml) moet altijd worden weggegooid. Het water in de kranen wordt namelijk niet geroerd en is dan ook niet in evenwicht met de bulk. Noteer het volume van de watermonsters en zorg dat rekening wordt gehouden met de hoeveelheid teststof in het weggegooide water wanneer een massabalans wordt opgesteld. Verlies door verdamping moet zo veel mogelijk worden beperkt door het water rustig in de scheitrechter te laten lopen, zodat de water-1-octanollaag niet wordt verstoord.

45.

1-octanolmonsters worden verkregen door afname van een klein aliquot (ca. 100 μl) uit de 1-octanollaag met een 100 microliterspuit van glas en metaal. Pas op dat het grensvlak niet wordt verstoord. Het volume van het vloeistofmonster wordt opgeschreven. Een klein aliquot is voldoende, daar het 1-octanolmonster nog wordt verdund.

46.

Om onnodige overbrengingsstappen van het monster te vermijden moet het monstervolume gravimetrisch worden bepaald. Bij watermonsters kan dit worden gedaan door het watermonster in een scheitrechter op te vangen die al de vereiste hoeveelheid oplosmiddel bevat.

47.

Volgens deze testmethode wordt de POW bepaald door drie langzaam-roerenexperimenten uit te voeren (drie proefnemingen) met de te onderzoeken verbinding, onder identieke omstandigheden. De regressie om aan te tonen dat evenwicht is bereikt, moet zijn gebaseerd op de resultaten van ten minste vier bepalingen van CO/CW op opeenvolgende tijdstippen. Op die manier kan de variantie worden berekend als maat voor de onzekerheid van de gemiddelde waarde die bij elke proefneming wordt verkregen.

48.

De POW kan worden gekarakteriseerd door de variantie in de gegevens die in elke proefneming zijn verkregen. Deze informatie wordt gebruikt om de POW te berekenen als gewogen gemiddelde van de resultaten van de individuele proefnemingen. Daartoe wordt de inverse variantie van de resultaten van de proefnemingen als gewicht gebruikt. Op die manier zullen gegevens met een grote spreiding (uitgedrukt in de variantie), en dus een lagere betrouwbaarheid, minder invloed hebben op de uitkomst dan gegevens met een lage variantie.

49.

Op soortgelijke wijze wordt de gewogen standaarddeviatie berekend. Dit is een maat voor de herhaalbaarheid van de POW-meting. Een lage waarde voor de gewogen standaarddeviatie geeft aan dat de POW-bepaling binnen hetzelfde laboratorium een hoge herhaalbaarheid had. De formele statische behandeling van de gegevens wordt hieronder geschetst.

50.

Voor iedere monstertijd wordt de logaritme berekend van de verhouding van de teststofconcentratie in 1-octanol en water (log (CO/Cw)). Het bereiken van chemisch evenwicht wordt aangetoond door deze verhouding uit te zetten tegen de tijd. Als deze curve een plateau laat zien op basis van ten minste vier opeenvolgende tijdpunten toont dit aan dat een evenwicht is bereikt, en dat de verbinding daadwerkelijk in de 1-octanol is opgelost. Zo niet, dan moet de test worden voortgezet totdat vier opeenvolgende tijdpunten een helling opleveren die niet significant afwijkt van 0 bij een p-waarde van 0,05, hetgeen aangeeft dat log Co/Cw niet langer afhangt van de tijd.

51.

De waarde van log POW van de proefneming wordt berekend als het gewogen gemiddelde van log Co/Cw voor het deel van de curve van log Co/Cw tegen de tijd waarvoor evenwicht is aangetoond. Het gewogen gemiddelde wordt berekend door de gegevens gewicht toe te kennen op basis van de inverse variantie, zodat de invloed van de gegevens op de einduitkomst omgekeerd evenredig is aan de onzekerheid van de gegevens.

52.

De gemiddelde waarde van log POW van de verschillende proefnemingen wordt berekend als het gemiddelde van de uitkomsten van de individuele proefnemingen, gewogen naar hun respectieve varianties.

De berekening gaat als volgt:

waarbij

Voor wi wordt de reciproque waarde van de variantie van log POW,i gebruikt ().

53.

De fout in het gemiddelde van log POW, wordt geschat als de herhaalbaarheid van de log Co/Cw die is bepaald in de evenwichtsfase in de verschillende proefnemingen, en deze wordt uitgedrukt als de gewogen standaarddeviatie van log POW,Av (σlog Pow,Av), die op haar beurt een maat is voor de fout in log POW,Av. De gewogen standaarddeviatie kan als volgt worden berekend uit de gewogen variantie (varlog Pow,Av):

Het symbool n staat voor het aantal proefnemingen.

54.

In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

(1)

De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the „slow-stirring” method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512.

(2)

Hoofdstuk A.8 van deze bijlage, Verdelingscoëfficiënt.

(3)

Hoofdstuk A.8 van deze bijlage, Verdelingscoëfficiënt.

(4)

OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.

(5)

Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.

(6)

Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.

(7)

Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.

(8)

Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596-2602.

(9)

OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paris.

(10)

Hoofdstuk A.6 van deze bijlage, Oplosbaarheid in water.

(11)

Hoofdstuk C.7 van deze bijlage, Afbraak — Niet-biologische afbraak: hydrolyse in afhankelijkheid van de pH.

(12)

Hoofdstuk C.4 — Delen II tot en met VII (methoden A tot en met F) van deze bijlage, Bepaling van de „gemakkelijke” biologische afbreekbaarheid.

(13)

Hoofdstuk A.4 van deze bijlage, Dampspanning.

(14)

Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623-626.

(15)

Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 tot en met 2-52.

(16)

Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA.

(17)

Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.

(18)

Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.

(19)

ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001.

(20)

Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, DC.

(21)

Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479-488.

(22)

Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386-390.

1.

Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 403 (2009) van de OESO (1). Testrichtlijn 403 (TG 403), de oorspronkelijke testrichtlijn voor acute inhalatie, werd in 1981 vastgesteld. Deze herziene testmethode B.2 (die gelijkwaardig is aan de herziene versie van TG 403) is ontworpen om de flexibiliteit te vergroten, het gebruik van dieren terug te dringen en in regelgevingsbehoeften te voorzien. De herziene testmethode omvat twee soorten onderzoek: een traditioneel LC50-protocol en een concentratie × tijd-protocol (c × t-protocol). Deze testmethode heeft als belangrijkste kenmerken dat zij het mogelijk maakt om een verband tussen concentratie en respons vast te stellen dat loopt van een niet-dodelijke tot een dodelijke afloop, teneinde een mediaan letale concentratie (LC50), niet-dodelijke drempelconcentratie (bv. LC01), en helling af te leiden, en om mogelijke geslachtsgebonden gevoeligheid aan te tonen. Het c × t-protocol moet worden gebruikt wanneer specifieke behoeften op het gebied van regelgeving of wetenschap het nodig maken gedurende meerdere perioden van verschillende duur dierproeven uit te voeren, bijvoorbeeld met het oog op het opstellen van rampenbestrijdingsplannen (bv. om waarden voor de richtniveaus voor acute blootstelling (Acute Exposure Guideline Levels, AEGL’s), richtsnoeren voor rampenbestrijdingsplannen (Emergency Response Planning Guidelines (ERPG’s), of drempelniveaus voor acute blootstelling (Acute Exposure Threshold Levels, AETL’s) af te leiden) of ruimtelijkeordeningsplannen.

2.

Aanwijzingen voor de uitvoering en interpretatie van onderzoek volgens deze testmethode zijn opgenomen in de leidraad betreffende tests op acute inhalatietoxiciteit (GD 39 (2)).

3.

De in de context van deze testmethode gebruikte definities zijn opgenomen in het laatste deel van dit hoofdstuk en in GD 39 (2).

4.

Deze testmethode maakt het mogelijk teststoffen te karakteriseren, er een kwantitatieve risicobeoordeling voor uit te voeren, en ze te rangschikken en in te delen overeenkomstig Verordening (EG) nr. 1272/2008 (3). GD 39 (2) bevat een leidraad voor de keuze van de geschikte testmethode voor acute toxiciteitstests. Wanneer alleen informatie over indeling en etikettering nodig is, wordt over het algemeen hoofdstuk B.52 van deze bijlage (4) aanbevolen (zie GD 39 (2)). Deze testmethode B.2 is niet specifiek bedoeld voor het testen van speciale materialen, zoals slecht oplosbare isometrische materialen of vezelmaterialen of gefabriceerde nanomaterialen.

5.

Alvorens te overwegen deze testmethode toe te passen, moet het testlaboratorium alle beschikbare informatie over de teststof, met inbegrip van bestaande studies (bv. hoofdstuk B.52 van deze bijlage (4)) waarvan de gegevens een argument vormen om geen aanvullende tests uit te voeren, in aanmerking nemen teneinde het gebruik van dieren tot een minimum te beperken. Voor de keuze van de geschiktste soorten, stam, geslacht, wijze van blootstelling en testconcentraties kan onder meer gebruik worden gemaakt van informatie over de identiteit, chemische structuur en fysisch-chemische eigenschappen van de teststof; de resultaten van eventuele in vitro of in vivo uitgevoerde toxiciteitstests; de voorgenomen toepassingen en de potentiële blootstelling van de mens; en de beschikbare (Q)SAR-gegevens en toxicologische gegevens over chemische stoffen met een verwante structuur (zie GD 39 (2)).

6.

Het testen van bijtende en/of irriterende teststoffen bij concentraties die naar verwachting hevige pijn en/of angst zullen veroorzaken, moeten zo veel mogelijk worden vermeden. Het bijtende/irriterende potentieel moet op basis van het oordeel van deskundigen worden geëvalueerd, met behulp van bijvoorbeeld ervaring bij mens en dier (bv. op grond van onderzoek met herhaalde toediening, uitgevoerd bij niet-bijtende/niet-irriterende concentraties), bestaande in-vitrogegevens (bv. op grond van de hoofdstukken B.40 (5) en B.40 bis (6) van deze bijlage of van OESO TG 435 (7)), pH-waarden, informatie over soortgelijke stoffen of andere relevante gegevens, teneinde uit te zoeken of van verdere tests kan worden afgezien. Bij specifieke regelgevingsbehoeften (bv. voor het opstellen van rampenplannen) kan deze testmethode worden gebruikt voor het blootstellen van dieren aan deze materialen, aangezien zij de onderzoeksleider of hoofdonderzoeker de controle geeft over de keuze van de doelconcentraties. De doelconcentraties mogen echter geen ernstige irriterende/bijtende effecten veroorzaken, maar moeten wel toereikend zijn om de concentratie/responscurve uit te breiden tot niveaus die stroken met de wetenschappelijke en regelgevingsdoelstellingen van de test. Deze concentraties moeten per geval worden gekozen en de keuze voor een bepaalde concentratie moet worden gemotiveerd (zie GD 39 (2)).

7.

Deze herziene testmethode B.2 is ontworpen om voldoende informatie te kunnen verzamelen over de acute toxiciteit van een teststof om deze in te kunnen delen, en om voor kwantitatieve risicobeoordelingen benodigde gegevens over de sterfte (bv. LC50, LC01 en helling) voor één of beide geslachten te verkrijgen. Deze testmethode omvat twee methoden. De eerste methode is een traditioneel protocol waarin groepen dieren gedurende een vaststaande periode, doorgaans vier uur, aan een limietconcentratie (limiettest) of een stapsgewijze reeks concentraties worden blootgesteld. Voor specifieke regelgevingsdoeleinden kan een andere blootstellingsduur vereist zijn. De tweede methode is een (c × t)-protocol waarin groepen dieren worden blootgesteld aan één concentratie (limietconcentratie) of een reeks van verschillende concentraties gedurende perioden van verschillende duur.

8.

Stervende dieren of dieren die duidelijk pijn hebben of tekenen van hevige en voortdurende angst vertonen, worden op humane wijze gedood en worden bij de interpretatie van het testresultaat op dezelfde manier behandeld als dieren die tijdens de test gestorven zijn. OESO-leidraad nr. 19 inzake humane eindpunten (8) bevat criteria om te bepalen of stervende of hevig lijdende dieren moeten worden gedood en richtsnoeren om voorspelbare of ophanden zijnde sterfte te herkennen.

9.

Er worden gezonde jonge volwassen dieren van gangbare laboratoriumstammen gebruikt. Er wordt de voorkeur gegeven aan ratten; het gebruik van andere soorten moet worden gemotiveerd.

10.

De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn. Op de dag van blootstelling moeten de jonge volwassen dieren acht tot twaalf weken oud zijn en een lichaamsgewicht hebben dat niet meer dan 20 % afwijkt van het gemiddelde gewicht voor elk geslacht van eerder blootgestelde dieren van dezelfde leeftijd. De dieren worden willekeurig gekozen en gemerkt om elk dier afzonderlijk te kunnen identificeren. De dieren blijven voordat de test begint minimaal vijf dagen in hun kooi om in het laboratorium te acclimatiseren. Vlak voor de test acclimatiseren de dieren ook enige tijd in het testapparaat, aangezien hierdoor de stress als gevolg van de nieuwe omgeving zal afnemen.

11.

De temperatuur van de ruimte waar de proefdieren verblijven, moet 22 ± 3 °C zijn. De relatieve vochtigheid wordt idealiter tussen 30 en 70 % gehouden, maar wanneer water als medium wordt gebruikt, zal dit niet altijd mogelijk zijn. Voor en na de blootstelling worden de dieren over het algemeen groepsgewijs in kooien ondergebracht, waarbij zij naar geslacht en concentratie worden gescheiden; het aantal dieren per kooi mag echter niet zo groot zijn dat een duidelijke observatie van elk dier wordt gestoord en moet zodanig worden gekozen dat er zo min mogelijk dieren verloren gaan als gevolg van kannibalisme en gevechten. Wanneer de dieren uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan acclimatisatie voor de fixeerbuizen noodzakelijk zijn. De fixeerbuizen mogen geen onnodige lichamelijke, thermische of immobilisatiestress voor de dieren opleveren. De immobilisatie kan van invloed zijn op fysiologische eindpunten zoals de lichaamstemperatuur (hyperthermie) en/of het ademminuutvolume. Als er generieke gegevens beschikbaar zijn waaruit blijkt dat geen significante veranderingen als gevolg van de immobilisatie optreden, is geen voorafgaande gewenning aan de fixeerbuizen noodzakelijk. Dieren die met hun hele lijf aan een aerosol worden blootgesteld, worden tijdens de blootstelling individueel gehuisvest om te voorkomen dat zij het testaerosol filteren door de vacht van hun kooigenoten. Er kan gebruik worden gemaakt van gebruikelijk en gecertificeerd laboratoriumvoeder, behalve tijdens de blootstelling, met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater uit de waterleiding. Er wordt kunstlicht gebruikt met een cyclus van 12 uur licht/12 uur donker.

12.

Bij de keuze van de inhalatiekamer wordt rekening gehouden met de aard van de teststof en het doel van de test. Blootstelling via de neus alleen heeft de voorkeur (hieronder vallen blootstelling via de kop alleen, blootstelling via de neus alleen en blootstelling via de snuit alleen). Blootstelling via de neus alleen heeft over het algemeen de voorkeur voor studies van vloeibare of vaste aerosolen en voor dampen die kunnen condenseren tot aerosolen. Speciale doelstellingen van de studie kunnen beter worden verwezenlijkt door blootstelling van het hele lijf, maar dit moet in het studieverslag worden gemotiveerd. Om bij gebruik van een kamer voor het hele lijf te zorgen voor een stabiele atmosfeer, mag het totale volume van de testdieren niet meer dan 5 % van het volume van de kamer innemen. De technische principes voor blootstelling via de neus alleen en blootstelling van het hele lijf, alsook de specifieke voor- en nadelen ervan, zijn uiteengezet in GD 39 (2).

13.

Voor de blootstelling via de neus alleen mag bij ratten elke tijdsduur worden gekozen, tot een maximum van zes uur. Bij muizen dient de blootstelling via de neus alleen in het algemeen niet langer dan vier uur te duren. Als er onderzoek met een langere tijdsduur nodig is, moet dit worden gemotiveerd (zie GD 39 (2)). Dieren die in een kamer voor het hele lijf aan aerosolen worden blootgesteld, worden afzonderlijk gehuisvest om ingestie van de teststof door het verzorgen van kooigenoten te voorkomen. Tijdens de blootstellingsperiode krijgen de dieren geen voeder. Tijdens een blootstelling van het hele lijf kan de dieren water worden gegeven.

14.

De dieren worden aan de teststof blootgesteld in de vorm van gas, damp, aerosol of een mengsel daarvan. De te testen fysische toestand hangt af van de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof, de gekozen concentratie en/of de meest waarschijnlijke fysische vorm waarin de teststof bij hantering en gebruik aanwezig is. Hygroscopische en chemisch reactieve teststoffen moeten worden getest in drogeluchtomstandigheden. Er dient op te worden gelet dat er geen explosieve concentraties optreden.

15.

Voor alle aerosolen en voor dampen die tot aerosolen kunnen condenseren, wordt de deeltjesgrootte bepaald. Om blootstelling van alle relevante delen van de ademhalingswegen mogelijk te maken worden aerosolen met een massamediaan van de aerodynamische diameter (MMAD) tussen 1 en 4 μm en een geometrische standaardafwijking (σg) tussen 1,5 en 3,0 aanbevolen (2)(9)(10). Hoewel redelijkerwijs moet worden getracht deze normwaarden te halen, wordt het oordeel van een deskundige gegeven als dit niet mogelijk blijkt. Zo kunnen de deeltjes van metaaldampen kleiner zijn dan deze norm, terwijl geladen deeltjes, vezels en hygroscopische materialen (die in de vochtige omgeving van de ademhalingswegen opzwellen) de norm kunnen overschrijden.

16.

Er kan een medium worden gebruikt om een passende concentratie en deeltjesgrootte van de teststof in de atmosfeer te verkrijgen. Als algemene regel wordt de voorkeur gegeven aan water. Deeltjesmateriaal kan aan mechanische processen worden onderworpen om de gewenste deeltjesgrootteverdeling te verkrijgen, waarbij er echter op moet worden gelet dat de teststof niet wordt ontbonden of gewijzigd. Als de samenstelling van de teststof mogelijk is gewijzigd door mechanische processen (bv. als er bij overvloedig malen door wrijving extreme temperaturen zijn ontstaan), wordt de samenstelling analytisch gecontroleerd. Er dient zorgvuldig op te worden gelet dat de teststof niet wordt verontreinigd. Niet-broze korrelige materialen die met opzet zo zijn samengesteld dat zij niet-inhaleerbaar zijn, hoeven niet te worden getest. Aan de hand van een slijtageproef moet worden aangetoond dat bij de hantering van het korrelige materiaal geen inhaleerbare deeltjes ontstaan. Als bij een slijtageproef inhaleerbare stoffen ontstaan, wordt een test op inhalatietoxiciteit verricht.

17.

Er is geen parallelle negatieve controlegroep (lucht) noodzakelijk. Wanneer voor het verkrijgen van de testatmosfeer een ander medium dan water wordt gebruikt, moet alleen een controlegroep voor dat medium worden gebruikt wanneer er geen historische gegevens over de inhalatietoxiciteit beschikbaar zijn. Indien een toxiciteitsstudie van een in een medium bereide teststof uitwijst dat er geen toxiciteit optreedt, volgt hieruit dat het medium bij de geteste concentratie niet toxisch is; in dat geval is er geen mediumcontrole noodzakelijk.

18.

Tijdens elke blootstelling wordt de luchtdoorstroming in de kamer zorgvuldig geregeld, voortdurend gecontroleerd en ten minste elk uur geregistreerd. De controle van de concentratie (of stabiliteit) van de testatmosfeer is een integrale meting van alle dynamische parameters waarbij indirect alle relevante dynamische parameters voor het verkrijgen van de atmosfeer kunnen worden geregeld. Wanneer kamers voor blootstelling via de neus alleen worden gebruikt, moet er in het bijzonder op worden gelet dat de uitgeademde lucht niet opnieuw wordt ingeademd indien de luchtdoorstroming in het blootstellingssysteem ontoereikend is om een dynamische luchtdoorstroming van de teststofatmosfeer te verkrijgen. Er zijn voorgeschreven methoden die kunnen worden toegepast om aan te tonen dat de uitgeademde lucht bij de gekozen operationele omstandigheden niet opnieuw wordt ingeademd (2)(11). Het zuurstofgehalte moet ten minste 19 % bedragen en het kooldioxidegehalte niet meer dan 1 %. Als er redenen zijn om aan te nemen dat deze normwaarden niet kunnen worden gehaald, moet de zuurstof- en kooldioxideconcentratie worden gemeten.

19.

De temperatuur in de kamer moet op 22 ± 3 °C worden gehouden. Bij blootstelling via de neus alleen en bij blootstelling van het hele lijf wordt de relatieve vochtigheid in het ademhalingsgebied van de dieren gecontroleerd en bij een blootstellingsduur tot vier uur ten minste drie keer en bij een kortere blootstelling ieder uur geregistreerd. De relatieve vochtigheid wordt idealiter tussen 30 en 70 % gehouden, al zal dit niet altijd haalbaar (bv. wanneer mengsels op waterbasis worden getest) of meetbaar zijn vanwege interferentie tussen de teststof en de testmethode.

20.

Waar mogelijk wordt de nominale concentratie in de blootstellingskamer berekend en geregistreerd. De nominale concentratie is de massa van de gegenereerde teststof gedeeld door het totale luchtvolume dat door het kamersysteem wordt geleid. De nominale concentratie wordt niet gebruikt om de blootstelling van de dieren te karakteriseren, maar een vergelijking tussen de nominale concentratie en de feitelijke concentratie vormt een aanwijzing voor het rendement van het testsysteem en kan bijgevolg worden gebruikt om problemen bij het genereren te ontdekken.

21.

De feitelijke concentratie is de concentratie van de teststof in het ademhalingsgebied van de dieren in een inhalatiekamer. De feitelijke concentraties kunnen worden verkregen door toepassing van specifieke methoden (bv. rechtstreekse bemonstering of op adsorptie of een chemische reactie gebaseerde methoden, gevolgd door analytische karakterisering) of niet-specifieke methoden, zoals gravimetrische filteranalyse. Gravimetrische analysen zijn alleen aanvaardbaar voor aerosolen van poeders met één component of aerosolen van vloeistoffen met een geringe vluchtigheid en moeten worden ondersteund met passende specifieke karakteriseringen van de teststof voorafgaand aan de studie. De concentratie van aerosolen van poeders met meerdere componenten kan ook door middel van gravimetrische analyse worden bepaald. In dat geval zijn echter analytische gegevens vereist die aantonen dat de samenstelling van het materiaal in de lucht vergelijkbaar is met die van het uitgangsmateriaal. Als deze informatie niet beschikbaar is, kan het nodig zijn in de loop van de studie op gezette tijden een nieuwe analyse van de teststof (idealiter in de toestand in de lucht) uit te voeren. Voor geaerosoliseerde stoffen die kunnen verdampen of sublimeren, moet worden aangetoond dat met de gekozen methoden alle fasen zijn verzameld. In het studieverslag worden de doelconcentratie, de nominale concentratie en de feitelijke concentratie vermeld, maar in statistische analysen voor de berekening van de letale concentratiewaarden wordt uitsluitend gebruikgemaakt van de feitelijke concentraties.

22.

Er wordt zo mogelijk één partij van de teststof gebruikt en het testmonster wordt bewaard onder omstandigheden waarbij de zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit behouden blijven. Voor aanvang van de studie worden de teststof, met inbegrip van de zuiverheid, en indien technisch mogelijk de identiteit en de hoeveelheden van vastgestelde verontreinigingen en onzuiverheden gekarakteriseerd. Dit kan onder meer met de volgende gegevens worden aangetoond: retentietijd en relatief piekoppervlak, moleculair gewicht op basis van massaspectroscopie of gaschromatografie, of andere schattingen. Hoewel het testlaboratorium niet verantwoordelijk is voor de identiteit van het testmonster, kan het raadzaam zijn dat het testlaboratorium de karakterisering van de opdrachtgever ten minste in beperkte mate bevestigt (bv. kleur, fysische aard enz.).

23.

De blootstellingsatmosfeer wordt zo constant mogelijk gehouden en, afhankelijk van de analysemethode, voortdurend en/of met tussenpozen gecontroleerd. Wanneer met tussenpozen wordt bemonsterd, wordt in een studie van vier uur ten minste twee keer een monster van de kameratmosfeer genomen. Als dit vanwege de beperkte luchtdoorstroming of lage concentraties niet mogelijk is, kan één monster gedurende de volledige blootstellingsperiode worden verzameld. Indien significante fluctuaties tussen monsters optreden, worden bij de volgende geteste concentraties vier monsters per blootstelling genomen. Het verschil tussen individuele monsters van de kamerconcentratie en de gemiddelde concentratie mag bij gassen en dampen niet meer dan ± 10 % en bij vloeibare of vaste aerosolen niet meer dan ± 20 % bedragen. De equilibratietijd van de kamer (t95) wordt berekend en geregistreerd. De blootstellingsduur omvat de tijd waarin de teststof wordt gegenereerd en houdt rekening met de tijd die nodig is om t95 te bereiken. In GD 39 (2) zijn richtsnoeren voor het schatten van t95 opgenomen.

24.

Voor zeer complexe mengsels bestaande uit gassen/dampen en aerosolen (bv. verbrandingsatmosferen en teststoffen die zijn ontleend aan doelgerichte eindproducten of apparaten), kan elke fase zich in een inhalatiekamer verschillend gedragen, zodat van elke fase (gas/damp en aerosol) ten minste één indicatorstof (analyt) moet worden gekozen, normaliter de voornaamste werkzame stof in het mengsel. Wanneer de teststof een mengsel is, wordt de analytische concentratie vermeld voor het mengsel, en niet slechts voor de werkzame stof of de component (analyt). Aanvullende informatie over feitelijke concentraties is opgenomen in GD 39 (2).

25.

De deeltjesgrootteverdeling van aerosolen wordt tijdens elke blootstelling van vier uur ten minste twee keer bepaald met behulp van een cascade-impactor of een alternatief instrument, zoals een aerodynamische deeltjesgroottemeter. Indien kan worden aangetoond dat de met een cascade-impactor of een alternatief instrument verkregen resultaten gelijkwaardig zijn, mag het alternatieve instrument gedurende de hele studie worden gebruikt. Parallel aan het primaire instrument wordt een tweede instrument, zoals een gravimetrisch filter of een impinger/gas bubbler gebruikt om de doeltreffendheid van de verzameling met het primaire instrument te bevestigen. De door middel van deeltjesgrootteanalyse en filteranalyse verkregen massaconcentraties moeten in redelijke mate overeenkomen (zie GD 39 (2)). Indien in een vroeg stadium van de studie de gelijkwaardigheid kan worden aangetoond, zijn verdere bevestigende metingen niet nodig. Met het oog op het dierenwelzijn moeten maatregelen worden genomen om zo veel mogelijk te voorkomen dat niet-overtuigende gegevens worden verkregen waardoor herhaling van de blootstelling noodzakelijk is. Voor dampen wordt de deeltjesgrootte bepaald indien de mogelijkheid bestaat dat de dampen condenseren waardoor aerosolvorming optreedt of indien in een dampatmosfeer deeltjes worden gedetecteerd waarbij gemengde fasen kunnen optreden (zie punt 15).

26.

Hieronder worden twee soorten onderzoek beschreven: het traditionele protocol en het c × t-protocol. Beide protocollen kunnen een verkennende test, een hoofdonderzoek, en/of een limiettest (traditioneel protocol) of tests bij een limietconcentratie (c × t) omvatten. Indien bekend is dat een van beide geslachten een grotere gevoeligheid heeft, kan de onderzoeksleider ervoor kiezen dit onderzoek alleen voor het gevoeligste geslacht uit te voeren. Als andere knaagdiersoorten dan ratten uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan de maximale blootstellingsduur worden aangepast om soortspecifieke symptomen van angst te minimaliseren. Alvorens met het onderzoek te beginnen moeten alle beschikbare gegevens worden bekeken om het gebruik van dieren tot een minimum te beperken. Zo kunnen gegevens die zijn verkregen op grond van hoofdstuk B.52 van deze bijlage (4) een verkennende test wellicht overbodig maken, en wellicht ook aantonen of het ene geslacht gevoeliger is dan het andere (zie GD 39 (2)).

27.

Bij een traditioneel onderzoek, worden groepen dieren aan een teststof blootgesteld gedurende een vaste periode (doorgaans vier uur) in een kamer voor blootstelling via de neus alleen of voor blootstelling van het hele lijf. Dieren worden blootgesteld aan hetzij een limietconcentratie (limiettest), of stapsgewijs aan ten minste drie concentraties (hoofdonderzoek). Het hoofdonderzoek kan worden voorafgegaan door een verkennende test, tenzij er al enige informatie over de teststof beschikbaar is, bijvoorbeeld uit een eerder uitgevoerd onderzoek volgens hoofdstuk B.52 (zie GD 39 (2)).

28.

Een verkennende test wordt gebruikt om de werkzaamheid van de teststof te schatten en geslachtsafhankelijke verschillen in gevoeligheid aan te tonen, en ter ondersteuning bij de keuze van de blootstellingsconcentratieniveaus voor het hoofdonderzoek of de limiettest. Bij de keuze van concentratieniveaus voor de verkennende test moet alle beschikbare informatie worden gebruikt, met inbegrip van de beschikbare (Q)SAR-gegevens en gegevens over soortgelijke chemische stoffen. Bij elke concentratie mogen ten hoogste drie mannetjes en drie vrouwtjes worden blootgesteld (om geslachtsafhankelijke verschillen vast te stellen kunnen drie dieren per geslacht nodig zijn). Een verkennende test kan betrekking hebben op één concentratie, maar indien nodig kunnen meerdere concentraties worden getest. In een verkennende test mogen niet zo veel dieren en concentraties worden getest dat deze test eerder op een hoofdonderzoek lijkt. Een eerder uitgevoerd onderzoek op grond van hoofdstuk B.52 (4) kan worden gebruikt in plaats van een verkennende test (zie GD 39 (2)).

29.

Een limiettest wordt toegepast indien bekend is of verwacht wordt dat de teststof praktisch niet-toxisch is, d.w.z. dat een toxische reactie alleen optreedt boven de in de regelgeving bepaalde limietconcentratie. Bij een limiettest wordt één groep van drie mannetjes en drie vrouwtjes blootgesteld aan de teststof in een limietconcentratie. Informatie over de toxiciteit van de teststof kan afkomstig zijn van kennis omtrent vergelijkbare geteste stoffen, waarbij rekening wordt gehouden met de identiteit en het percentage van de bestanddelen waarvan bekend is dat zij in toxicologisch opzicht relevant zijn. Wanneer er weinig of geen informatie over de toxiciteit van het testmateriaal is of wordt verwacht dat de teststof toxisch is, moet het hoofdonderzoek worden uitgevoerd.

30.

De keuze van de limietconcentraties hangt gewoonlijk af van wettelijke voorschriften. Indien Verordening (EG) nr. 1272/2008 wordt toegepast, bedragen de limietconcentraties voor gassen, dampen en aerosolen respectievelijk 20 000 ppm, 20 mg/l en 5 mg/l (of de maximaal haalbare concentratie) (3). Het kan vanuit technisch oogpunt ingewikkeld zijn limietconcentraties van sommige teststoffen te bereiken, vooral als dampen en aerosolen. Wanneer aerosolen worden getest, is het primaire doel een in te ademen deeltjesgrootte te verkrijgen (MMAD van 1-4 μm). Voor de meeste teststoffen is dit mogelijk bij een concentratie van 2 mg/l. Aerosolen mogen alleen bij een hogere concentratie dan 2 mg/l worden getest indien een in te ademen deeltjesgrootte kan worden verkregen (zie GD 39 (2)). In Verordening (EG) nr. 1272/2008 worden tests boven een limietconcentratie met het oog op het dierenwelzijn afgeraden. De limietconcentratie moet alleen worden overwogen wanneer het zeer waarschijnlijk is dat de resultaten van een dergelijke test rechtstreeks van belang zijn om de gezondheid van mensen te beschermen (3), en dit moet in het studieverslag worden gemotiveerd. Als de teststof kan ontploffen, moet worden vermeden dat zich omstandigheden voordoen waarin een explosie kan optreden. Om onnodig gebruik van dieren te voorkomen wordt de limiettest van tevoren een keer zonder dieren uitgevoerd om te waarborgen dat de kameromstandigheden voor een limiettest kunnen worden bereikt.

31.

Indien bij de limietconcentratie wordt geconstateerd dat er dieren gestorven of stervende zijn, kunnen de resultaten van de limiettest dienen als een verkennende test voor verdere tests bij andere concentraties (zie hoofdonderzoek). Indien de fysische of chemische eigenschappen van een teststof het onmogelijk maken een limietconcentratie te bereiken, moet bij de maximaal haalbare concentratie worden getest. Indien minder dan 50 % sterfte optreedt bij de maximaal haalbare concentratie, zijn geen verdere tests nodig. Als de limietconcentratie niet kon worden bereikt, moet dit in het studieverslag worden toegelicht en met ondersteunende gegevens worden gestaafd. Indien bij de maximaal haalbare concentratie van een damp geen toxiciteit optreedt, kan het nodig zijn de teststof in de vorm van een vloeibare aerosol te gebruiken.

32.

Een hoofdonderzoek wordt meestal uitgevoerd met vijf mannetjes en vijf vrouwtjes (of vijf dieren van het gevoeligste geslacht, indien dit bekend is) per concentratieniveau, en bij ten minste drie concentratieniveaus. Er moeten voldoende concentratieniveaus worden gebruikt om een robuuste statistische analyse mogelijk te maken. De tijdsduur tussen de blootstelling van de verschillende groepen wordt bepaald door de aanvang, de duur en de ernst van de toxiciteitsverschijnselen. De blootstelling van dieren bij het volgende concentratieniveau wordt uitgesteld totdat een redelijk vertrouwen bestaat dat de eerder geteste dieren zullen overleven. Dit stelt de onderzoeksleider in staat de doelconcentratie voor de volgende blootstellingsgroep aan te passen. Aangezien dit vanwege de afhankelijkheid van geavanceerde technologieën wellicht niet altijd praktisch is bij inhalatieonderzoek, moet de blootstelling van dieren bij het volgende concentratieniveau worden gebaseerd op eerdere ervaringen en wetenschappelijke afwegingen. Voor het testen van mengsels moet GD 39 (2) worden geraadpleegd.

33.

Als alternatief voor het traditionele protocol kan een stapsgewijs c × t-onderzoek worden overwogen voor de beoordeling van de inhalatietoxiciteit (12)(13)(14). Bij deze aanpak kunnen de dieren bij verschillende concentratieniveaus en gedurende meerdere perioden van verschillende duur aan een teststof worden blootgesteld. Alle tests worden uitgevoerd in een kamer voor blootstelling via de neus alleen (kamers voor het hele lijf zijn voor dit protocol niet geschikt). Aanhangsel 1 bevat een stroomdiagram van dit protocol. Een simulatieanalyse heeft uitgewezen dat zowel met het traditionele protocol als met het c × t-protocol robuuste LC50-waarden kunnen worden verkregen, maar dat het c × t-protocol doorgaans beter geschikt is voor het verkrijgen van robuuste LC01- en LC10-waarden (15).

34.

Een simulatieanalyse heeft aangetoond dat het voor het testen bij vier concentraties en gedurende vijf blootstellingsperioden van verschillende duur in het kader van een hoofdonderzoek doorgaans volstaat om per c × t-interval twee dieren (één van elk geslacht als beide geslachten worden gebruikt, of twee van het gevoeligste geslacht) te gebruiken. Onder bepaalde omstandigheden kan de onderzoeksleider ervoor kiezen twee ratten per geslacht per c × t-interval te gebruiken (15). Door twee dieren per geslacht per concentratie en tijdstip te gebruiken kan de bias en de variabiliteit van de schattingen worden verkleind, het percentage succesvolle schattingen worden verhoogd, en het dekkingspercentage van het betrouwbaarheidsinterval worden verbeterd. Als er echter geen voldoende passende fitting met de gegevens mogelijk is om een schatting te kunnen maken (indien een dier per geslacht of twee dieren van het gevoeligste geslacht worden gebruikt), kan wellicht ook een vijfde blootstellingsconcentratie volstaan. Nadere richtsnoeren voor het bij een c × t-onderzoek te gebruiken aantal dieren en concentraties zijn opgenomen in GD 39 (2).

35.

Een verkennende test wordt gebruikt om de werkzaamheid van de teststof te schatten, en ter ondersteuning bij de keuze van de blootstellingsconcentratieniveaus voor het hoofdonderzoek. Een verkennende test met ten hoogste drie dieren per geslacht per concentratie (zie aanhangsel III van GD 39 (2) voor nadere bijzonderheden) kan nodig zijn om een geschikte aanvangsconcentratie voor het hoofdonderzoek te kunnen kiezen en het aantal gebruikte dieren te kunnen minimaliseren. Soms is het nodig om drie dieren per geslacht te gebruiken om geslachtsafhankelijke verschillen vast te stellen. Deze dieren moeten gedurende één periode, doorgaans met een duur van 240 minuten, worden blootgesteld. Om te beoordelen of het mogelijk is geschikte testatmosferen tot stand te brengen, moeten voorafgaande tests zonder dieren worden uitgevoerd. Een verkennende test is doorgaans niet nodig als er gegevens over de sterfte beschikbaar zijn uit een onderzoek volgens hoofdstuk B.52 (4). Bij het kiezen van de aanvankelijke doelconcentratie in een onderzoek volgens hoofdstuk B.2 moet de onderzoeksleider rekening houden met de sterftepatronen die zijn waargenomen in al het beschikbare onderzoek volgens hoofdstuk B.52 (4), voor beide geslachten en voor alle geteste concentraties (zie GD 39 (2)).

36.

De beginconcentratie (blootstellingssessie I) (aanhangsel 1) is ofwel een limietconcentratie, ofwel een door de onderzoeksleider op basis van de verkennende test gekozen concentratie. Groepen van 1 dier per geslacht worden aan deze concentratie blootgesteld gedurende perioden van verschillende duur (bv. 15, 30, 60, 120, of 240 minuten), hetgeen betekent dat er in totaal 10 dieren worden gebruikt (dit wordt „blootstellingssessie I” genoemd) (aanhangsel 1).

37.

De keuze van de limietconcentraties hangt gewoonlijk af van wettelijke voorschriften. Indien Verordening (EG) nr. 1272/2008 wordt toegepast, bedragen de limietconcentraties voor gassen, dampen en aerosolen respectievelijk 20 000 ppm, 20 mg/l en 5 mg/l (of de maximaal haalbare concentratie) (3). Het kan vanuit technisch oogpunt ingewikkeld zijn limietconcentraties van sommige teststoffen te bereiken, vooral als dampen en aerosolen. Wanneer aerosolen worden getest, is het doel een in te ademen deeltjesgrootte te verkrijgen (d.w.z. een MMAD van 1-4 μm) bij een limietconcentratie van 2 mg/l. Dat is met de meeste teststoffen mogelijk. Aerosolen mogen alleen bij een hogere concentratie dan 2 mg/l worden getest indien een in te ademen deeltjesgrootte kan worden verkregen (zie GD 39 (2)). In Verordening (EG) nr. 1272/2008 worden tests boven een limietconcentratie met het oog op het dierenwelzijn afgeraden. Tests boven de limietconcentratie moeten alleen worden overwogen wanneer het zeer waarschijnlijk is dat de resultaten van dergelijke tests rechtstreeks van belang zijn om de gezondheid van mensen te beschermen (3), en dit moet in het studieverslag worden gemotiveerd. Als de teststof kan ontploffen, moet worden vermeden dat zich omstandigheden voordoen waarin een explosie kan optreden. Om onnodig gebruik van dieren te voorkomen wordt de test bij de beginconcentratie van tevoren een keer zonder dieren uitgevoerd om te waarborgen dat de kameromstandigheden voor deze concentratie kunnen worden bereikt.

38.

Indien bij de beginconcentratie wordt geconstateerd dat er dieren gestorven of stervende zijn, kunnen de resultaten bij deze concentratie als uitgangspunt dienen voor verdere tests bij andere concentraties (zie hoofdonderzoek). Indien de fysische of chemische eigenschappen van een teststof het onmogelijk maken een limietconcentratie te bereiken, moet bij de maximaal haalbare concentratie worden getest. Indien minder dan 50 % sterfte optreedt bij de maximaal haalbare concentratie, zijn geen verdere tests nodig. Als de limietconcentratie niet kon worden bereikt, moet dit in het studieverslag worden toegelicht en met ondersteunende gegevens worden gestaafd. Indien bij de maximaal haalbare concentratie van een damp geen toxiciteit optreedt, kan het nodig zijn de teststof in de vorm van een vloeibare aerosol te gebruiken.

39.

De beginconcentratie (blootstellingssessie I) (aanhangsel 1) die tijdens het hoofdonderzoek wordt getest, is ofwel een limietconcentratie, ofwel een door de onderzoeksleider op basis van de verkennende test gekozen concentratie. Indien tijdens of na blootstellingssessie I sterfte is geconstateerd, wordt de minimale blootstelling (c × t) die tot sterfte leidt als leidraad genomen voor het vaststellen van de concentratie en blootstellingsperioden voor blootstellingszitting II. Elke volgende blootstellingsessie hangt af van de sessie die eraan voorafgaat (zie aanhangsel 1).

40.

Voor veel teststoffen zullen de resultaten die worden verkregen bij de beginconcentratie, plus drie extra blootstellingssessies met een kleinere tijdraster (d.w.z. de geometrische afstand tussen de blootstellingsperioden, zoals aangegeven door de factor tussen opeenvolgende perioden, doorgaans √2), toereikend zijn om de c × t-sterfteverhouding vast te stellen (15), maar het gebruik van een vijfde blootstellingsconcentratie kan van enig nut zijn (zie aanhangsel 1 en GD 39 (2)). Voor de mathematische behandeling van de resultaten voor het c × t-protocol, zie aanhangsel 1.

41.

De dieren worden tijdens de blootstellingsperiode veelvuldig klinisch geobserveerd. Na de blootstelling worden op dezelfde dag nog ten minste twee klinische observaties verricht, of meer als de respons van de dieren op de behandeling daartoe aanleiding geeft, en vervolgens gedurende veertien dagen ten minste één keer per dag. De duur van de observatieperiode staat niet vast, maar wordt bepaald op grond van de aard en het aanvangstijdstip van klinische symptomen en de duur van de herstelperiode. Het is belangrijk op welk tijdstip de toxiciteitsverschijnselen verschijnen en verdwijnen, vooral als er een neiging is tot vertraagde toxiciteitsverschijnselen. Alle observaties worden systematisch geregistreerd en van elk dier wordt een apart overzicht bijgehouden. Dieren die stervend worden aangetroffen en dieren die hevige pijn hebben en/of blijvende tekenen van hevige angst vertonen, worden met het oog op het dierenwelzijn op humane wijze gedood. Wanneer onderzoek wordt gedaan naar klinische toxiciteitsverschijnselen, moet erop worden gelet dat een aanvankelijk slecht uiterlijk aspect en voorbijgaande veranderingen in de ademhaling als gevolg van de blootstellingsprocedure, niet worden aangezien voor aan de teststof gerelateerde toxiciteit die het nodig zou maken de dieren voortijdig te doden. Er moet rekening worden gehouden met de beginselen en criteria in de leidraad voor humane eindpunten (GD 19) (7). Wanneer dieren om redenen van dierenwelzijn worden gedood of dood worden aangetroffen, wordt zo nauwkeurig mogelijk geregistreerd op welk tijdstip ze zijn gestorven.

42.

Bij externe observaties van de dieren in de kooien wordt gekeken naar veranderingen in de huid en de vacht, de ogen en de slijmvliezen, de ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het autonome en centrale zenuwstelsel, de somatomotorische activiteit en gedragspatronen. Waar mogelijk moet een onderscheid worden gemaakt tussen lokale en systemische effecten. Er moet worden gelet op de observatie van tremors, convulsies, speekselafscheiding, diarree, lethargie, slaap en coma. Een meting van de rectale temperatuur kan ondersteunende gegevens opleveren voor met de behandeling of opsluiting verband houdende reflectoire bradypneu of hypo-/hyperthermie.

43.

Het gewicht van elk dier wordt tijdens de acclimatiseringsperiode één keer geregistreerd, op dag 0 (de dag van blootstelling) voorafgaand aan de blootstelling en ten minste op de dagen 1, 3 en 7 (en vervolgens iedere week), alsook op het moment waarop het dier sterft of wordt geëuthanaseerd als dit na dag 1 is. Het lichaamsgewicht is erkend als een kritische indicator van toxiciteit en dieren die een blijvende gewichtsafname van ≥ 20 % vertonen ten opzichte van de voor de studie geregistreerde waarde, moeten zorgvuldig worden gevolgd. Aan het einde van de periode na de blootstelling worden de dieren die nog leven, gewogen en op humane wijze gedood.

44.

Op alle proefdieren, met inbegrip van de dieren die tijdens de test sterven of met het oog op het dierenwelzijn worden geëuthanaseerd en uit het onderzoek worden genomen, wordt macroscopische obductie uitgevoerd. Als het niet mogelijk is onmiddellijk nadat een dood dier is aangetroffen een obductie te verrichten, wordt het dier gekoeld (niet bevroren) bij temperaturen die laag genoeg zijn om de autolyse tot een minimum te beperken. De obductie wordt zo spoedig mogelijk verricht, normaliter binnen één of twee dagen. Alle met het blote oog waarneembare pathologische veranderingen worden voor elk dier geregistreerd, met bijzondere aandacht voor veranderingen in de luchtwegen.

45.

Om de interpretatieve waarde van de studie te vergroten kan worden overwogen aanvullend onderzoek te verrichten dat vooraf in de opzet is opgenomen, zoals bepaling van het longgewicht van overlevende ratten en/of microscopisch onderzoek van de luchtwegen om aanwijzingen voor irritatie te vinden. Ook kunnen de organen worden onderzocht die tekenen van macroscopische pathologische veranderingen vertonen bij dieren die na 24 uur of langer nog leven, alsmede organen waarvan bekend is of verwacht wordt dat zij zijn aangetast. Microscopisch onderzoek van de volledige luchtwegen kan nuttige informatie opleveren voor teststoffen die met water reageren, zoals zuren en hygroscopische teststoffen.

46.

Voor elk dier worden de gegevens over het lichaamsgewicht en de obductiebevindingen vermeld. Daarnaast worden de gegevens van de klinische observatie in tabelvorm samengevat met voor alle testgroepen vermelding van het gebruikte aantal dieren, het aantal dieren dat specifieke toxiciteitsverschijnselen vertoonde, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of om redenen van dierenwelzijn is gedood, het tijdstip waarop elk dier is gestorven, een beschrijving van de toxische effecten met het verloop en de omkeerbaarheid en de obductiebevindingen.

47.

In het testverslag wordt indien van toepassing de volgende informatie opgenomen:

(1)

OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/testguidelines

(2)

OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/testguidelines

(3)

Verordening (EG) nr. 1272/2008 van het Europees Parlement en de Raad van 16 december 2008 betreffende de indeling, etikettering en verpakking van stoffen en mengsels tot wijziging en intrekking van de Richtlijnen 67/548/EEG en 1999/45/EG en tot wijziging van Verordening (EG) nr. 1907/2006 (PB L 353 van 31.12.2008, blz. 1).

(4)

Hoofdstuk B.52 van deze bijlage, Acute inhalatietoxiciteit: methode ter bepaling van de acute-toxiciteitsklasse.

(5)

Hoofdstuk B.40 van deze bijlage, In-vitrohuidcorrosie: test op basis van de transcutane elektrische weerstand (TEW).

(6)

Hoofdstuk B.40 bis van deze bijlage, In-vitrohuidcorrosie: test met humaan huidmodel.

(7)

OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/testguidelines

(8)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/testguidelines

(9)

SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.

(10)

Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.

(11)

Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167.

(12)

Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.

(13)

Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.

(14)

Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71.

(15)

OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/testguidelines

(16)

Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York.

1.

Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 407 (2008) van de OESO (TG 407). De oorspronkelijke testrichtlijn TG 407 werd in 1981 vastgesteld. In 1995 werd een herziene versie vastgesteld, met als doel aanvullende informatie te verkrijgen met behulp van de in het onderzoek gebruikte dieren, met name over neurotoxiciteit en immunotoxiciteit.

2.

In 1998 is de OESO een actie gestart om bestaande testrichtlijnen te herzien en nieuwe testrichtlijnen te ontwikkelen voor het screenen en testen op potentiële hormoonontregelaars (8), en heeft zij daaraan een hoge prioriteit toegekend. Een onderdeel van deze actie was het bijwerken van de bestaande OESO-richtlijn voor „toxiciteitsonderzoek (oraal) op knaagdieren bij herhaalde toediening (28 dagen)” (TG 407) door er geschikte parameters in op te nemen om de endocriene werking van teststoffen vast te kunnen stellen. Deze procedure ging gepaard met een uitgebreid internationaal programma voor het testen van de relevantie en praktische uitvoerbaarheid van de aanvullende parameters, de mate waarin met deze parameters de (anti)oestrogene, (anti)androgene, en (anti)thyreoïde werking van stoffen kan worden vastgesteld, de intra- en interlaboratoriumreproduceerbaarheid en de interferentie tussen de nieuwe parameters en die welke in de vroegere TG 407 waren voorgeschreven. De vele gegevens die daarbij zijn verkregen, zijn bijeengebracht en in detail geëvalueerd in een uitgebreid OESO-verslag (9). Deze bijgewerkte testmethode B.7 (gelijkwaardig met TG 407) is het resultaat van de ervaringen en resultaten van het internationale testprogramma. Met deze testmethode kunnen bepaalde met het endocrien systeem samenhangende effecten in de context van andere toxicologische effecten worden geplaatst.

3.

Bij de bepaling en evaluatie van de toxische eigenschappen van een chemische stof moet aan de hand van acute-toxiciteitstests eerst informatie over de toxiciteit worden verkregen. Daarna kan de orale toxiciteit door middel van herhaalde toediening worden bepaald. Deze testmethode heeft tot doel de effecten van toxiciteit op een zeer grote verscheidenheid aan potentiële doelwitten te onderzoeken. Zij levert informatie op over de mogelijke gevaren voor de gezondheid die kunnen voortvloeien uit herhaalde blootstelling gedurende een relatief beperkte periode, met inbegrip van effecten op het zenuwstelsel, het immuunsysteem en het endocrien systeem. Met betrekking tot deze specifieke eindpunten moet zij de identificatie mogelijk maken van potentieel neurotoxische stoffen, die in dit opzicht nader verdienen te worden onderzochtt, en stoffen die de fysiologie van de schildklier verstoren. Ook kan zij gegevens opleveren over stoffen die van invloed zijn op de mannelijke en/of vrouwelijke voortplantingsorganen van jonge volwassen dieren en een indicatie geven van de immunologische effecten.

4.

De resultaten van deze testmethode B.7 moeten worden gebruikt voor de identificatie van de gevaren en het beoordelen van risico’s. De resultaten die worden verkregen met de parameters die met het endocriene systeem te maken hebben, moeten worden gezien in samenhang met het conceptueel kader van de OESO voor het testen en beoordelen van hormoonontregelende stoffen (11). De methode omvat het basale toxiciteitsonderzoek bij herhaalde toediening dat kan worden gebruikt voor stoffen waarvoor een onderzoek van 90 dagen niet gerechtvaardigd is (bv. als het productievolume binnen bepaalde grenzen blijft), of ter voorbereiding op een langetermijnsonderzoek. De blootstellingstijd bedraagt 28 dagen.

5.

Het internationale programma voor de validering van geschikte parameters om de mogelijke endocriene werking van een teststof vast te stellen, heeft aangetoond dat de kwaliteit van de met behulp van deze testmethode B.7 verkregen gegevens sterk zal afhangen van de ervaring waarover het testlaboratorium beschikt. Het gaat daarbij met name om de histopathologische bepaling van cyclische veranderingen in de vrouwelijke voortplantingsorganen en de bepaling van het gewicht van de kleine hormoonafhankelijke organen die moeilijk te ontleden zijn. Er zijn richtsnoeren ontwikkeld voor histopathologisch onderzoek (19). Deze zijn beschikbaar op de openbare website van de OESO over de testrichtsnoeren. Zij zijn bedoeld om de pathologen te helpen bij hun onderzoek en om de gevoeligheid van de bepalingen te helpen vergroten. Van diverse parameters werd vastgesteld dat zij als indicator kunnen dienen van met het endocrien systeem samenhangende toxiciteit; deze zijn in de testmethode opgenomen. Parameters waarvoor onvoldoende gegevens beschikbaar waren om het nut ervan te kunnen vaststellen of waarvan tijdens het valideringsprogramma slechts in geringe mate kon worden aangetoond dat zij zouden kunnen helpen bij de opsporing van hormoonontregelaars, worden voorgesteld als facultatieve eindpunten (zie aanhangsel 2).

6.

Op grond van de tijdens het valideringsproces verkregen gegevens moet worden benadrukt dat deze bepaling onvoldoende gevoelig is om alle stoffen met (anti)androgene of (anti)oestrogene werking te kunnen identificeren (9). De testmethode wordt niet uitgevoerd in het levensstadium dat het gevoeligst is voor hormoonontregeling. Met de testmethode zijn tijdens het valideringsproces desondanks stoffen geïdentificeerd die de schildklierfunctie in sterke of lichte mate beïnvloeden, alsmede sterk of matig endocrien werkzame stoffen die via de oestrogeen- of androgeenreceptoren werken, maar in de meeste gevallen konden endocrien werkzame stoffen die de oestrogeen- of androgeenreceptoren in lichte mate beïnvloeden niet worden geïdentificeerd. Daarom kan de methode niet als screeningtest voor endocriene activiteit worden omschreven.

7.

Het ontbreken van effecten die verband houden met deze werkingswijzen kan derhalve niet als bewijs worden beschouwd voor het ontbreken van effecten op het endocrien systeem. Wat de met het endocrien systeem samenhangende effecten betreft, moet de karakterisering van stoffen derhalve niet worden gebaseerd op de resultaten van deze testmethode alleen, maar moeten deze resultaten gebruikt worden in een benadering met meervoudige bewijsvoering („weight of evidence”-benadering), waarin alle bestaande gegevens over een stof worden benut om de mogelijke endocriene werking ervan te karakteriseren. Voor de besluitvorming over regelgeving inzake endocriene werking (karakterisering van stoffen) moet daarom een brede benadering worden gevolgd, die niet slechts leunt op de resultaten van de toepassing van deze testmethode.

8.

Erkend wordt dat alle procedures waarbij dieren worden gebruikt, aan de plaatselijke normen voor de verzorging van dieren moeten voldoen; bij de beschrijvingen van de verzorging en behandeling hieronder gaat het om minimale prestatienormen, die door de lokale regelgeving worden vervangen indien deze strikter is. De OESO heeft nadere richtsnoeren voor de humane behandeling van dieren opgesteld (14).

9.

De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1.

10.

De teststof wordt gedurende een periode van 28 dagen dagelijks oraal toegediend aan verscheidene groepen proefdieren, in geleidelijk stijgende doses. Er wordt één dosis per groep gebruikt. Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks zorgvuldig geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven of worden geëuthanaseerd, wordt obductie verricht. Dieren die aan het eind van het onderzoek nog in leven zijn, worden geëuthanaseerd en ook hierop wordt obductie verricht. Een onderzoek van 28 dagen levert informatie op over de effecten van herhaalde orale blootstelling en kan erop wijzen dat verdere langetermijnonderzoeken nodig zijn. Ook kan het informatie opleveren over de te kiezen concentraties voor langetermijnonderzoek. Met de met behulp van deze testmethode verkregen gegevens kan de toxiciteit van de teststof worden gekarakteriseerd, een indicatie van de dosis-responsverhouding worden gegeven en het niveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld (No-Observed Adverse Effect Level, NOAEL) worden bepaald.

11.

De voorkeur wordt gegeven aan ratten, hoewel andere knaagdiersoorten kunnen worden gebruikt. Indien de in deze testmethode B.7 gespecificeerde parameters worden onderzocht bij een andere knaagdiersoort moet dit uitvoerig worden gemotiveerd. Hoewel het vanuit biologisch oogpunt aannemelijk is dat andere soorten op vergelijkbare wijze op toxische stoffen reageren als de rat, kan het gebruik van kleinere soorten leiden tot een hogere variabiliteit als gevolg van technische moeilijkheden bij het ontleden van kleinere organen. In het internationale valideringsprogramma voor de detectie van hormoonontregelaars zijn alleen ratten gebruikt. Er worden gezonde jonge volwassen dieren van gangbare laboratoriumstammen gebruikt. De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn. De toediening moet zo snel mogelijk na het spenen beginnen maar in ieder geval voordat de dieren negen weken oud zijn. Per geslacht mag bij het begin van het onderzoek het gewicht van de dieren die worden gebruikt, niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken. Als een herhaalde orale toediening wordt uitgevoerd als inleiding op een studie van langere duur, moeten de dieren in beide studies bij voorkeur tot dezelfde stam behoren en dezelfde oorsprong hebben.

12.

Alle procedures moeten in overeenstemming zijn met de plaatselijke normen voor de verzorging van proefdieren. De temperatuur in de proefdierruimte moet 22 °C (± 3 °C) zijn. Hoewel de relatieve vochtigheid minimaal 30 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte) dient te zijn, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met een fotoperiode van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende mengbaarheid met de teststof te zorgen, wanneer de stof in het voer wordt toegediend. De dieren moeten in kleine groepen van hetzelfde geslacht worden gehuisvest; dieren kunnen individueel worden gehuisvest als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is. Indien de dieren in groepen in kooien worden ondergebracht, mogen per kooi niet meer dan vijf dieren worden gehuisvest.

13.

Het voeder moet regelmatig op verontreinigingen worden onderzocht. Een monster van het voedsel moet worden bewaard totdat het verslag is afgerond.

14.

Gezonde jonge volwassen dieren worden willekeurig ingedeeld in de behandelde en controlegroepen. De kooien worden zodanig opgesteld dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooien tot een minimum worden beperkt. De dieren krijgen een unieke identificatie en blijven voordat de behandeling begint minimaal vijf dagen in hun kooi om in het laboratorium te acclimatiseren.

15.

De teststof kan via een maagsonde, met de voeding of met het drinkwater worden toegediend. De wijze van de orale toediening hangt af van het doel van het onderzoek en van de fysische/chemische/toxicokinetische eigenschappen van de teststof.

16.

Indien nodig wordt de teststof opgelost of gesuspendeerd in een geschikt medium. Aanbevolen wordt eerst te bezien of het mogelijk is een waterige oplossing/suspensie te gebruiken, als dit niet kan een oplossing/suspensie in olie (bv. maïsolie) te overwegen en daarna eventueel een ander medium. Van niet-waterige media moeten de toxische eigenschappen bekend zijn. De stabiliteit van de teststof in het medium moet worden bepaald.

17.

Op ieder dosisniveau moeten ten minste tien dieren (vijf mannetjes en vijf vrouwtjes) worden gebruikt. Indien het de bedoeling is tussentijds dieren te euthanaseren, moet het aantal worden verhoogd met het aantal dieren dat volgens plan voor de voltooiing van de studie zal worden geëuthanaseerd. Er moet worden overwogen een aanvullende satellietgroep van tien dieren (vijf per geslacht) op te nemen in de controlegroep en de groep met het hoogste dosisniveau, voor observatie van reversibiliteit, persistentie of vertraagd tot uiting komen van toxische effecten gedurende ten minste 14 dagen na de behandeling.

18.

In het algemeen moeten er ten minste drie testgroepen en één controlegroep worden gebruikt, maar als er op grond van de beoordeling van andere gegevens bij toediening van 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag geen effecten worden verwacht, kan er een limiettest worden uitgevoerd. Als er geen bruikbare gegevens beschikbaar zijn, kan een bereikbepalingonderzoek worden uitgevoerd (bij dieren van dezelfde stam en dezelfde herkomst) om de orde van grootte van de te gebruiken doses te helpen bepalen. Afgezien van de toediening van de teststof worden de dieren in de controlegroep op identieke wijze behandeld als de dieren in de testgroepen. Indien bij de toediening van de teststof van een medium gebruik wordt gemaakt, dient dit aan de controlegroep in het hoogste gebruikte volume toegediend te worden.

19.

De dosisniveaus moeten worden gekozen in het licht van de bestaande gegevens over toxiciteit en (toxico)kinetica van de teststof en verwante stoffen. Het hoogste dosisniveau moet zo worden gekozen dat toxische effecten optreden, maar geen sterfte of ernstig lijden. Daarna moet een dalende reeks dosisniveaus worden gekozen teneinde een eventuele doseringsgerelateerde respons en het laagste dosisniveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld (No-Observed Adverse Effect Level, NOAEL) aan te tonen. Intervallen van een factor twee of vier zijn vaak optimaal om de dalende dosisniveaus vast te stellen en het is vaak beter een vierde testgroep toe te voegen dan zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor tien) tussen de doseringen te gebruiken.

20.

Bij algemene toxiciteit (bv. verminderd lichaamsgewicht, effecten op lever, hart, longen of nieren enz.) of andere veranderingen die mogelijk geen toxische reacties zijn (bv. verminderde voedselinname, leververgroting), moeten de waargenomen effecten op immunologische, neurologische of endocriene eindpunten met de nodige omzichtigheid worden geïnterpreteerd.

21.

Als volgens de hier beschreven procedures een test wordt uitgevoerd met één dosisniveau van ten minste 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag — of, in het geval van toediening via het voer of het drinkwater, het equivalente percentage in het voer of het drinkwater (berekend overeenkomstig het lichaamsgewicht) — en er geen waarneembare toxische effecten optreden, en deze ook niet kunnen worden verwacht op grond van gegevens betreffende chemische stoffen met verwante structuur, is het niet noodzakelijk een volledige test met drie dosisniveaus te doen. De limiettest is van toepassing, behalve wanneer vanwege de verwachte blootstelling van de mens een hoger dosisniveau nodig wordt geacht.

22.

De dieren krijgen gedurende een periode van 28 dagen, zeven dagen per week, een dosis van de teststof toegediend. Indien de teststof via een maagsonde aan het dier wordt toegediend, moet dit in één enkele dosis gebeuren met gebruikmaking van een maagbuisje of een geschikte intubatiecanule. Het maximale vloeistofvolume dat in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het dier. Het volume mag niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht, behalve wanneer het om een waterige oplossing gaat: in dat geval mag 2 ml/100 g lichaamsgewicht worden gebruikt. Behalve bij irriterende of bijtende stoffen, die normaal gesproken bij hogere concentraties hevigere effecten hebben, moeten volumeverschillen tot een minimum worden beperkt door de concentratie aan te passen, zodat er op alle dosisniveaus hetzelfde volume wordt toegediend.

23.

Wanneer stoffen met de voeding of het drinkwater worden toegediend, moet erop worden toegezien dat de hoeveelheden van de teststof niet interfereren met de normale voedings- of waterbalans. Wanneer de teststof in het voer wordt toegediend, kan een constante concentratie in het voer (in ppm) of een constante dosis in verhouding tot het lichaamsgewicht van de dieren worden gebruikt; de gekozen methode moet worden gespecificeerd. Wanneer een stof met een sonde wordt toegediend, moet de dosis elke dag op een vergelijkbaar tijdstip worden toegediend en indien nodig worden aangepast om een constante dosis in verhouding tot het lichaamsgewicht van het dier te houden. Wanneer een onderzoek met herhaalde toediening als voorbereiding op een langdurig onderzoek wordt gebruikt, moet bij beide onderzoeken een vergelijkbare voeding worden gebruikt.

24.

De dieren moeten 28 dagen worden geobserveerd. Dieren uit een satellietgroep die bestemd is voor vervolgwaarnemingen moeten ten minste 14 dagen zonder behandeling worden geobserveerd om de persistentie van de toxische effecten c.q. het herstel alsmede het eventuele optreden van vertraagde toxiciteit te kunnen waarnemen.

25.

Algemene klinische waarnemingen moeten ten minste eenmaal per dag plaatsvinden, bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip en met in achtneming van de piekperiode van de te verwachten effecten na toediening. De gezondheidstoestand van de dieren moet worden geregistreerd. De dieren moeten ten minste tweemaal per dag worden geobserveerd op ziekteverschijnselen en sterfte.

26.

Alle dieren worden eenmaal voor de eerste blootstelling nauwkeurig klinisch onderzocht (om intra-individuele vergelijking mogelijk te maken) en vervolgens ten minste eenmaal per week. Dit onderzoek moet buiten de kooi op een vaste onderzoekplaats en bij voorkeur steeds op hetzelfde moment van de dag worden uitgevoerd. De gegevens moeten zorgvuldig worden opgetekend, bij voorkeur met behulp van scoringssystemen die door het testlaboratorium expliciet zijn gedefinieerd. Er moet zo veel mogelijk worden gezorgd dat variaties in de testomstandigheden minimaal zijn en dat de waarnemers niet weten welke behandeling een gegeven dier heeft ondergaan. Tekenen waarop moet worden gelet, zijn onder meer (maar niet alleen): veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van af- en uitscheiding, en onwillekeurige reacties zoals traanvorming, rechtopstaan van het haar, verandering van de pupilgrootte of een ongewoon ademhalingspatroon. Ook verandering in gang, houding en reactiviteit op vastpakken, alsmede de aanwezigheid van klonische of tonische bewegingen, stereotiep gedrag (bijvoorbeeld overmatige lichaamsverzorging, herhaaldelijk ronddraaien) of bizar gedrag (bijvoorbeeld zelfverminking, achteruitlopen) moeten worden opgetekend (2).

27.

Gedurende de vierde week van de blootstelling moet de sensorische reactiviteit op stimuli van verschillende aard (2) (bv. auditief, visueel of proprioceptief) (3)(4)(5) worden bepaald en moet een bepaling van de grijpkracht (6) en de motorische activiteit (7) plaatsvinden. Meer informatie over de procedures die kunnen worden gevolgd, is te vinden in de desbetreffende literatuur. Er kunnen evenwel ook andere dan de genoemde procedures worden toegepast.

28.

Als de studie wordt verricht bij wijze van inleidend onderzoek voor daaropvolgend subchronisch onderzoek van 90 dagen, kunnen functionele observaties in de vierde week achterwege worden gelaten. In dat geval moeten de functionele observaties in het bedoelde vervolgonderzoek plaatsvinden. Daar staat echter tegenover dat de beschikbaarheid van gegevens betreffende functionele observaties uit het onderzoek met herhaalde toediening, de keuze van de dosisniveaus voor het daaropvolgende subchronische onderzoek ten goede kan komen.

29.

Bij wijze van uitzondering kunnen functionele waarnemingen ook achterwege worden gelaten bij groepen die anders tekenen van toxiciteit vertonen in een mate die aanzienlijk zou interfereren met de uitvoering van de functionele test.

30.

Tijdens de necropsie kan de oestruscyclus van alle vrouwtjes worden vastgesteld (facultatief) door vaginale uitstrijkjes te nemen. Deze observaties leveren informatie op over de fase van de oestruscyclus op het moment waarop de dieren zijn gedood, en kunnen van pas komen bij de histologische evaluatie van oestrogeengevoelige weefsels (zie de richtsnoeren voor histopathologie (19)).

31.

Alle dieren moeten ten minste eenmaal per week worden gewogen. Ook het voedselverbruik moet ten minste wekelijks worden gemeten. Indien de teststof met het drinkwater wordt toegediend, moet ook het waterverbruik ten minste wekelijks worden gemeten.

32.

Aan het eind van de testperiode moeten de volgende onderzoeken worden verricht: bepaling van hematocriet en hemoglobinegehalte, telling van de erytrocyten, totale en gedifferentieerde telling van de leukocyten, telling van de bloedplaatjes en meting van de stollingstijd en het stollingsvermogen. Indien de teststof of de vermeende metabolieten ervan oxiderende eigenschappen hebben, of hiervan een vermoeden bestaat, moeten andere bepalingen worden uitgevoerd, zoals van de methemoglobineconcentratie en de Heinz-lichaampjes.

33.

De bloedmonsters moeten worden genomen net vóór of tijdens het euthanaseren van de dieren; er moet worden genoteerd uit welk lichaamsdeel. De monsters moeten onder de juiste omstandigheden worden bewaard. Gedurende de nacht voordat zij geëuthanaseerd worden, mogen dieren geen voedsel krijgen (7).

34.

Om belangrijke toxische effecten op de weefsels en met name op de nieren en de lever te onderzoeken moet klinisch-biochemisch onderzoek worden verricht op bloedmonsters van alle dieren, met uitzondering van de dieren die stervend zijn aangetroffen en/of zijn geëuthanaseerd vóór het beëindigen van het onderzoek. Deze monsters moeten juist vóór het euthanaseren of als onderdeel van de procedure hiervoor worden genomen. Onderzoek van plasma of serum moet omvatten: natrium, kalium, glucose, totaal cholesterol, ureum, creatinine, totaal proteïne en albumine, ten minste twee enzymen die een indicatie geven van hepatocellulaire effecten (zoals alanineaminotransferase, aspartaataminotransferase, alkalische fosfatase, gamma-glutamyltranspeptidase en glutamaatdehydrogenase), en galzuren. Bepaling van andere enzymen (van hepatische of andere oorsprong) en bilirubine kan onder bepaalde omstandigheden nuttige informatie geven.

35.

Als optie kunnen tijdens de laatste week van het onderzoek de volgende urineonderzoeken worden verricht, waarbij op regelmatige tijdstippen urinemonsters moeten worden genomen: uitzien, volume, osmolaliteit of soortelijk gewicht, pH, eiwit, glucose en bloed/bloedcellen.

36.

Bovendien moet worden overwogen plasma- of serummarkers van algemene weefselbeschadiging te onderzoeken. Andere onderzoeken die moeten worden uitgevoerd als van de teststof bekend is, of vermoed wordt, dat zij de desbetreffende metabolische profielen beïnvloedt, zijn: calcium, fosfaat, triglyceriden, specifieke hormonen, en cholesterinase. Deze moeten voor chemische stoffen in bepaalde klassen of per geval geïdentificeerd worden.

37.

Hoewel bij de internationale evaluatie van de endocriene eindpunten geen duidelijke voordelen van de bepaling van schildklierhormonen (T3, T4) en TSH konden worden aangetoond, kan het nuttig zijn monsters van serum of plasma te bewaren voor het meten van T3, T4 en TSH (facultatief) als er aanwijzingen zijn voor een effect op de hypofyse-schildklieras. Deze monsters kunnen worden ingevroren bij – 20 °C voor opslag. De volgende factoren kunnen van invloed zijn op de variabiliteit en de absolute concentraties van de hormoonbepalingen:

Histopathologisch onderzoek maakt een betrouwbaardere definitieve identificatie van stoffen met thyreoïde werking mogelijk dan bepaling van de hormoonniveaus.

38.

Plasmamonsters die specifiek voor hormoonbepaling zijn bedoeld, moeten telkens op hetzelfde moment van de dag worden genomen. Het verdient aanbeveling speciale aandacht te schenken aan bepalingen van T3-, T4- en TSH-niveaus die het gevolg zijn van histopathologische veranderingen van de schildklier. De verschillende in de handel verkrijgbare „assay kits” kunnen verschillende numerieke waarden opleveren bij de analyse van hormoonconcentraties. Als gevolg daarvan kunnen wellicht geen prestatiecriteria op basis van uniforme historische gegevens worden gegeven. In plaats daarvan moeten de laboratoria zich inspannen om de variatiecoëfficiënten voor T3 en T4 lager dan 25, en voor TSH lager dan 35, te houden. Alle concentraties worden geregistreerd in ng/ml.

39.

In het geval van ontoereikende basisgegevens uit het verleden moet worden overwogen de hematologische en klinisch-biochemische variabelen te bepalen, bij voorkeur bij een groep dieren die niet in de testgroepen zijn opgenomen, of anders voordat met de toediening wordt begonnen.

40.

Bij alle dieren in de studie moet een volledige macroscopische obductie worden uitgevoerd, waaronder een zorgvuldig onderzoek van het huidoppervlak, alle lichaamsopeningen alsmede de schedelholte, de borstholte en de buikholte, en de inhoud daarvan. Lever, nieren, bijnieren, testes, epididymides, prostaat + zaadblaasjes met coagulans afscheidende klieren als geheel, thymus, milt, hersenen en hart van alle dieren (afgezien van de dieren die stervend zijn aangetroffen en/of zijn geëuthanaseerd vóór het beëindigen van het onderzoek) moeten zo nodig ontdaan worden van aanhechtend weefsel, en ze moeten zo spoedig mogelijk na de sectie nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. Het prostaatcomplex moet voorzichtig worden ontdaan van aanhechtend weefsel om te voorkomen dat de met vloeistof gevulde zaadblaasjes lek raken. Als alternatief kunnen zaadblaasjes en prostaat na de fixatie worden ontdaan van aanhechtend weefsel en gewogen.

41.

Daarnaast kunnen facultatief twee andere weefsels worden gewogen, zo snel mogelijk na de sectie om uitdroging te voorkomen: gepaarde ovaria (nat gewicht) en uterus, inclusief cervix (richtsnoeren voor het verwijderen en prepareren van baarmoederweefsel voor gewichtsmeting zijn opgenomen in OESO TG 440 (18)).

42.

Het gewicht van de schildklier (facultatief) kan na de fixatie worden bepaald. Aanhechtend weefsel moet zeer voorzichtig en pas na fixatie worden verwijderd, om beschadiging van de weefsels te voorkomen. Weefselbeschadigingen kunnen de histopathologische analyse negatief beïnvloeden.

43.

De volgende weefsels moeten in een fixeermiddel worden bewaard dat zowel voor het type weefsel als voor het beoogde latere histopathologische onderzoek (zie punt 47) geschikt is: elk macroscopisch waarneembaar letsel, hersenen (representatieve delen waaronder cerebrum, cerebellum en pons), ruggenmerg, oog, maag, dunne en dikke darm (inclusief Peyerse platen), lever, nieren, bijnieren, milt, hart, thymus, schildklier, luchtpijp en longen (conserveren door opblazen met een fixatief en dan onderdompelen), geslachtsklieren (testes en ovaria), secundaire geslachtsorganen (uterus en cervix, epididymides, prostaat + zaadblaasjes met coagulans uitscheidende klieren), vagina, urineblaas, lymfeklieren [naast de meest proximale afvoerende lymfeklier moet ook een andere lymfeklier worden uitgenomen, afhankelijk van de ervaringen van het laboratorium (15)), perifere zenuwen (nervus ischiadicus of nervus tibialis), bij voorkeur dicht bij de spier, skeletspier en bot, met beenmerg (een coupe, of in plaats daarvan een direct op een objectglaasje aangebracht stukje beenmergaspiraat). Aanbevolen wordt de testes te fixeren door middel van onderdompeling in Bouin-oplossing of gemodificeerde Davidson-oplossing (16)(17). De tunica albuginea moet voorzichtig en ondiep met een naald worden ingeprikt op de beide polen van het orgaan, zodat het fixatief snel kan binnendringen. Uit de klinische en andere bevindingen kan de noodzaak blijken verder weefsel te onderzoeken. Ook organen waarvan op basis van de bekende eigenschappen van de teststof wordt verondersteld dat ze kunnen worden aangetast, moeten worden bewaard.

44.

De volgende weefsels kunnen nuttige aanwijzingen geven voor met het endocrien systeem samenhangende effecten: geslachtsklieren (ovaria en testes), secundaire geslachtsorganen (uterus inclusief cervix, epididymides, zaadblaasjes met coagulans afscheidende klieren, dorsolaterale en ventrale prostaat), vagina, hypofyse, mannelijke borstklier, schildklier en bijnier. Er bestaat onvoldoende documentatie over veranderingen in de mannelijke borstklieren, maar deze parameter zou kan erg gevoelig kunnen zijn voor stoffen met oestrogene werking. De observatie van niet in de lijst van punt 43 opgenomen organen/weefsels is facultatief (zie aanhangsel 2).

45.

In de richtsnoeren voor histopathologisch onderzoek (19) zijn nadere gegevens opgenomen over de sectie, de fixatie, het snijden van coupes en de histopathologie van endocriene weefsels.

46.

In het kader van het internationale testprogramma zijn enkele aanwijzingen gevonden dat subtiele endocriene effecten van stoffen die de homeostase van geslachtshormonen in beperkte mate kunnen beïnvloeden, kunnen worden herkend aan verstoring van de synchronisatie van de oestruscyclus in verschillende weefsels, en niet zozeer door uitgesproken histopathologische veranderingen in de vrouwelijke geslachtsorganen. Hoewel dergelijke effecten niet eenduidig konden worden aangetoond, wordt aanbevolen rekening te houden met aanwijzingen voor mogelijke asynchronie van de oestruscyclus bij het interpreteren van de histopathologie van de ovaria (folliculaire, thecale en granulosacellen), uterus, cervix en vagina. Indien de door middel van vaginale uitstrijkjes vastgestelde fase van de cyclus wordt beoordeeld, kan deze ook in de vergelijking worden betrokken.

47.

Bij alle dieren in de groep behandeld met het hoogste dosisniveau en bij de dieren in de controlegroep moet een volledig histopathologisch onderzoek worden verricht op de bewaarde organen en weefsels. Organen en weefsels die blijken te zijn beschadigd door de teststof op het hoogste dosisniveau, moeten in alle groepen met een lagere dosering worden onderzocht.

48.

Elk macroscopisch waarneembaar letsel moet worden onderzocht.

49.

Bij het histopathologisch onderzoek van de dieren in de satellietgroepen moet speciaal worden gelet op die organen en weefsels waarin effecten blijken te zijn opgetreden bij de andere behandelde groepen.

50.

Voor elk dier worden apart gegevens verstrekt. Bovendien moeten alle gegevens worden samengevat in tabellen die voor iedere testgroep laten zien: het aantal dieren aan het begin van het onderzoek, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of om redenen van dierenwelzijn is geëuthanaseerd en het tijdstip waarop de dood bij de individuele dieren is ingetreden, het aantal dieren dat toxiciteitsverschijnselen vertoont, een beschrijving van de waargenomen toxische effecten, met inbegrip van de aanvang, de duur en de ernst van eventuele toxische effecten, het aantal dieren met letsel, het type letsel en de ernst ervan, en het percentage dieren waarbij ieder type letsel voorkomt.

51.

Waar mogelijk moeten getalsmatige resultaten met behulp van een geschikte en algemeen erkende statistische methode worden geëvalueerd. Het gebruik van meerdere t-tests moet worden voorkomen door vergelijking van het effect over een dosisbereik. De statistische methoden moeten gedurende de opzet van het onderzoek worden gekozen.

52.

Voor de kwaliteitscontrole wordt voorgesteld historische controlegegevens te verzamelen en variatiecoëfficiënten te berekenen voor numerieke gegevens, met name voor de parameters die verband houden met het opsporen van hormoonontregelaars. Deze gegevens kunnen voor vergelijkingsdoeleinden worden gebruikt wanneer daadwerkelijk uitgevoerd onderzoek wordt geëvalueerd.

53.

In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

(1)

OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity.

(2)

IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.

(3)

Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.

(4)

Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704.

(5)

Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.

(6)

Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.

(7)

Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.

(8)

OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.

(9)

OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.

(10)

OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.

(11)

OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html

(12)

OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.

(13)

OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.

(14)

OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.

(15)

Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404-407.

(16)

Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85.

(17)

Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.

(18)

OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals N 440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties.

(19)

OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.

1.

Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 412 (2009) van de OESO. Testrichtlijn 412 (TG 412), de oorspronkelijke testrichtlijn voor subacute inhalatie, werd in 1981 vastgesteld (1). Deze testmethode B.8 (die gelijkwaardig is aan de herziene versie van TG 412) is bijgewerkt om haar in overeenstemming te brengen met de stand van de wetenschap en om te voldoen aan de huidige en toekomstige regelgevingsbehoeften.

2.

Met deze methode kunnen nadelige effecten na herhaalde dagelijkse blootstelling aan een teststof door inhalatie gedurende 28 dagen worden gekarakteriseerd. De gegevens uit het onderzoek van 28 dagen naar subacute inhalatietoxiciteit kunnen worden gebruikt voor kwantitatieve risicobeoordelingen (indien niet gevolgd door een onderzoek van 90 dagen naar subchronische inhalatietoxiciteit (hoofdstuk B.29 van deze bijlage)). De gegevens kunnen ook informatie opleveren over de te kiezen concentraties voor langetermijnonderzoek, zoals het onderzoek van 90 dagen naar subchronische inhalatietoxiciteit. Deze testmethode is niet specifiek bedoeld voor het testen van nanomaterialen. De in de context van deze testmethode gebruikte definities zijn opgenomen in het laatste deel van dit hoofdstuk en in leidraad GD 39 (2).

3.

Het testlaboratorium moet alle beschikbare informatie over de teststof in overweging nemen voordat het onderzoek wordt uitgevoerd. Dit komt de kwaliteit van het onderzoek ten goede en zorgt ervoor dat het gebruik van dieren tot een minimum wordt beperkt. Voor de keuze van geschikte testconcentraties kan onder meer gebruik worden gemaakt van informatie over de identiteit, chemische structuur en fysisch-chemische eigenschappen van de teststof; de resultaten van eventuele in vitro of in vivo uitgevoerde toxiciteitstests; de voorgenomen toepassing(en) en de potentiële blootstelling van de mens; de beschikbare (Q)SAR-gegevens en toxicologische gegevens over chemische stoffen met een verwante structuur; en aan tests op acute inhalatietoxiciteit ontleende gegevens. In het geval van verwachte of in de loop van het onderzoek waargenomen neurotoxiciteit, kan de onderzoeksleider ervoor kiezen om geschikte evaluaties op te nemen, zoals een „functional observational battery” (FOB) en meting van de motorische activiteit. Hoewel de timing van de blootstellingen ten opzichte van specifiek onderzoek een kritieke factor kan vormen, mogen deze nieuwe activiteiten niet interfereren met de basisopzet van het onderzoek.

4.

Verdunningen van bijtende of irriterende teststoffen kunnen worden getest bij concentraties die de gewenste mate van toxiciteit opleveren (zie GD 39 (2)). Bij blootstelling van dieren aan deze materialen, moeten de doelconcentraties laag genoeg zijn om geen hevige pijn en angst te veroorzaken, maar wel toereikend zijn om de concentratie/responscurve uit te breiden tot niveaus die stroken met de wetenschappelijke en regelgevingsdoelstellingen van de test. Deze concentraties moeten per geval worden gekozen, bij voorkeur op basis van een adequaat opgezet bereikbepalingonderzoek dat informatie oplevert over het kritische eindpunt, eventuele irritatiedrempelwaarden en het moment van optreden (zie de punten 11 tot en met 13). De keuze voor een bepaalde concentratie moet worden gemotiveerd.

5.

Stervende dieren of dieren die duidelijk pijn hebben of tekenen van hevige en voortdurende angst vertonen, moeten op humane wijze worden gedood. Stervende dieren worden op dezelfde wijze beschouwd als dieren die tijdens de test sterven. De OESO-leidraad inzake humane eindpunten (3) bevat criteria om te bepalen of stervende of hevig lijdende dieren moeten worden gedood en richtsnoeren om voorspelbare of ophanden zijnde sterfte te herkennen.

6.

Er worden gezonde jonge volwassen knaagdieren van gangbare laboratoriumstammen gebruikt. Er wordt de voorkeur gegeven aan ratten. Als een andere soort wordt gebruikt, moet dit worden gemotiveerd.

7.

De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn. Op de dag waarop zij willekeurig worden ingedeeld, moeten de jonge volwassen dieren zeven tot negen weken oud zijn en een lichaamsgewicht hebben dat niet meer dan 20 % afwijkt van het gemiddelde gewicht voor elk geslacht. De dieren worden willekeurig gekozen, gemerkt om elk dier afzonderlijk te kunnen identificeren en vóór het begin van de test gedurende minimaal vijf dagen in hun kooi gehouden om ze aan de omstandigheden in het laboratorium te laten wennen.

8.

De dieren moeten individueel worden onderscheiden, indien mogelijk met behulp van onderhuidse transponders, om de waarnemingen te vergemakkelijken en verwarring te voorkomen. De temperatuur van de ruimte waar de proefdieren verblijven, moet 22 ± 3 °C zijn. De relatieve vochtigheid wordt idealiter tussen 30 en 70 % gehouden, maar wanneer water als medium wordt gebruikt, zal dit niet altijd mogelijk zijn. Voor en na de blootstelling worden de dieren over het algemeen groepsgewijs in kooien ondergebracht, waarbij zij naar geslacht en concentratie worden gescheiden; het aantal dieren per kooi mag echter niet zo groot zijn dat een duidelijke observatie van elk dier wordt gestoord en moet zodanig worden gekozen dat er zo min mogelijk dieren verloren gaan als gevolg van kannibalisme en gevechten. Wanneer de dieren uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan acclimatisatie voor de fixeerbuizen noodzakelijk zijn. De fixeerbuizen mogen geen onnodige lichamelijke, thermische of immobilisatiestress voor de dieren opleveren. De immobilisatie kan van invloed zijn op fysiologische eindpunten zoals de lichaamstemperatuur (hyperthermie) en/of het ademminuutvolume. Als er generieke gegevens beschikbaar zijn waaruit blijkt dat geen significante veranderingen als gevolg van de immobilisatie optreden, is geen voorafgaande gewenning aan de fixeerbuizen noodzakelijk. Dieren die met hun hele lijf aan een aerosol worden blootgesteld, worden tijdens de blootstelling individueel gehuisvest om te voorkomen dat zij het testaerosol filteren door de vacht van hun kooigenoten. Er kan gebruik worden gemaakt van gebruikelijk en gecertificeerd laboratoriumvoeder, behalve tijdens de blootstelling, met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater uit de waterleiding. Er wordt kunstlicht gebruikt met een cyclus van 12 uur licht/12 uur donker.

9.

Bij de keuze van de inhalatiekamer wordt rekening gehouden met de aard van de teststof en het doel van de test. Blootstelling via de neus alleen heeft de voorkeur (hieronder vallen blootstelling via de kop alleen, blootstelling via de neus alleen en blootstelling via de snuit alleen). Blootstelling via de neus alleen heeft over het algemeen de voorkeur voor studies van vloeibare of vaste aerosolen en voor dampen die kunnen condenseren tot aerosolen. Speciale doelstellingen van de studie kunnen beter worden verwezenlijkt door blootstelling van het hele lijf, maar dit moet in het studieverslag worden gemotiveerd. Om bij gebruik van een kamer voor het hele lijf te zorgen voor een stabiele atmosfeer, mag het totale „volume” van de testdieren niet meer dan 5 % van het volume van de kamer innemen. De technische principes voor blootstelling via de neus alleen en blootstelling van het hele lijf, alsook de specifieke voor- en nadelen ervan, zijn uiteengezet in GD 39 (2).

10.

Anders dan bij acuut onderzoek zijn er bij onderzoek van 28 dagen naar subacute inhalatietoxiciteit geen vastgestelde limietconcentraties. Bij het vaststellen van de maximale geteste concentratie moet rekening worden gehouden met: 1) de maximaal haalbare concentratie, 2) het niveau waaraan mensen in het ongunstigste geval zouden worden blootgesteld („worst case”), 3) de noodzaak een toereikende zuurstoftoevoer in stand te houden, en/of 4) overwegingen met het oog op dierenwelzijn. Indien geen op reële gegevens gebaseerde grenswaarden beschikbaar zijn, kunnen de limietwaarden voor acute-toxiciteitsonderzoek van Verordening (EG) nr. 1272/2008 (13) worden gebruikt (d.w.z. tot een maximale concentratie van 5 mg/l voor aerosolen, 20 mg/l voor dampen en 20 000 ppm voor gassen); zie GD 39 (2). Als het nodig is deze limietwaarden te overschrijden voor het testen van gassen of zeer vluchtige teststoffen (bv. koelmiddelen), moet dit worden gemotiveerd. De limietconcentratie moet tot onmiskenbare toxiciteit leiden zonder onnodige stress bij de dieren te veroorzaken of hun levensduur te beïnvloeden (3).

11.

Alvorens te beginnen met het hoofdonderzoek, kan het nodig zijn een bereikbepalingonderzoek uit te voeren. Een bereikbepalingonderzoek is uitgebreider dan een verkennende test, omdat het zicht niet beperkt tot de keuze van de concentratie. De tijdens een bereikbepalingonderzoek opgedane kennis kan ervoor helpen zorgen dat het hoofdonderzoek succesvol verloopt. Een bereikbepalingonderzoek kan bijvoorbeeld technische informatie opleveren met betrekking tot analysemethoden, deeltjesgroottebepaling, het herkennen van toxische mechanismen, klinisch-pathologische en histopathologische gegevens, en schattingen van mogelijke NOAEL- en MTC-concentraties in het hoofdonderzoek. De onderzoeksleider kan ervoor kiezen het bereikbepalingonderzoek te gebruiken om de drempelwaarde voor irritatie van de luchtwegen (bv. door middel van histopathologisch onderzoek van de luchtwegen, het testen van de longfunctie, of bronchoalveolaire lavage), de hoogste concentratie die zonder onnodige stress door de dieren wordt verdragen en de parameters waarmee de toxiciteit van een teststof het best kan worden gekarakteriseerd, te bepalen.

12.

Een bereikbepalingonderzoek kan één of meer concentratieniveaus omvatten. Bij elk concentratieniveau worden ten hoogste drie mannetjes en drie vrouwtjes blootgesteld. Een bereikbepalingonderzoek duurt ten minste vijf dagen en doorgaans niet langer dan veertien dagen. In het testverslag moet de keuze van de concentraties voor het hoofdonderzoek worden gemotiveerd. Het hoofdonderzoek heeft tot doel een verband tussen concentratie en respons aan te tonen op basis van wat naar verwachting het gevoeligste eindpunt zal zijn. De lage concentratie is bij voorkeur de concentratie waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld („no-observed adverse effect”), de hoge concentratie moet tot onmiskenbare toxiciteit leiden zonder onnodige stress bij de dieren te veroorzaken of hun levensduur te beïnvloeden (3).

13.

Bij het kiezen van de concentratieniveaus voor het bereikbepalingonderzoek moet met alle beschikbare informatie rekening worden gehouden, met inbegrip van structuur-activiteitrelaties en gegevens over vergelijkbare stoffen (zie punt 3). Een bereikbepalingonderzoek kan de vanuit mechanistisch oogpunt als meest gevoelig beschouwde eindpunten bevestigen of weerleggen, bv. cholinesteraseremming door organofosfaten, vorming van methemoglobine door voor erytrocyten toxische stoffen, schildklierhormonen (T3, T4) voor thyreotoxische stoffen, eiwit, LDH, of neutrofielen in bronchoalveolaire lavage voor onschadelijke, slecht oplosbare deeltjes of longirritatie veroorzakende aerosolen.

14.

Het hoofdonderzoek naar subacute toxiciteit omvat doorgaans drie concentratieniveaus en, waar nodig, parallelle negatieve controles (luchtcontroles) en/of mediumcontroles (zie punt 17). Voor de keuze van geschikte blootstellingsniveaus moet gebruik worden gemaakt van alle beschikbare gegevens, met inbegrip van de resultaten van onderzoek naar systemische toxiciteit, metabolisme en kinetiek (er moet speciaal op worden gelet dat hoge concentratieniveaus waardoor kinetische processen worden verzadigd, worden vermeden). Elke testgroep bestaat uit ten minste tien knaagdieren (vijf mannetjes en vijf vrouwtjes) die over een periode van vier weken gedurende vijf dagen per week telkens zes uur per dag aan de teststof worden blootgesteld (de totale duur van het onderzoek is 28 dagen). De dieren mogen ook zeven dagen per week worden blootgesteld (bv. bij het testen van geneesmiddelen die worden geïnhaleerd). Indien bekend is dat een van beide geslachten gevoeliger is voor een bepaalde teststof, kunnen beide geslachten bij verschillende concentratieniveaus worden blootgesteld om het verband tussen concentratie en respons nauwkeuriger te kunnen bepalen, zoals beschreven in punt 15. Als andere knaagdiersoorten dan ratten uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan de maximale blootstellingsduur worden aangepast om soortspecifieke symptomen van angst te minimaliseren. Indien een blootstellingsduur van minder dan 6 uur/dag wordt gebruikt, of er onderzoek naar blootstelling van het hele lijf met een lange tijdsduur (bv. 22 uur/dag) moet worden verricht, moet dit worden gemotiveerd (zie GD 39 (2)). Tijdens de blootstellingsperiode krijgen de dieren geen voeder, tenzij de blootstelling langer duurt dan 6 uur. Tijdens een blootstelling van het hele lijf kan de dieren water worden gegeven.

15.

De gekozen doelconcentraties moeten het mogelijk maken de doelorganen te identificeren en een duidelijk verband tussen concentratie en respons aan te tonen:

16.

Een satellietonderzoek (reversibiliteitsonderzoek) kan worden gebruikt voor observatie van reversibiliteit, persistentie of vertraagd tot uiting komen van toxiciteit gedurende een geschikte periode van ten minste 14 dagen na de behandeling. Satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen) bestaan uit vijf mannetjes en vijf vrouwtjes die gelijktijdig met de proefdieren in het hoofdonderzoek worden blootgesteld. Satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen) moeten bij het hoogste concentratieniveau aan de teststof worden blootgesteld en waar nodig moeten er parallelle luchtcontroles en/of mediumcontroles zijn (zie punt 17).

17.

De dieren voor de parallelle negatieve controle (luchtcontrole) worden op identieke wijze behandeld als de dieren in de testgroepen, behalve dat zij worden blootgesteld aan gefilterde lucht in plaats van aan de teststof. Wanneer voor het verkrijgen van de testatmosfeer water of een andere stof wordt gebruikt, moet in plaats van een negatieve controlegroep (luchtcontrolegroep) een mediumcontrolegroep in het onderzoek worden opgenomen. Waar mogelijk moet water worden gebruikt als het medium. Wanneer water wordt gebruikt als het medium moeten de controledieren worden blootgesteld aan lucht met dezelfde relatieve luchtvochtigheid als voor de blootgestelde groepen wordt gebruikt. De keuze van een geschikt medium vindt plaats op basis van een correct uitgevoerde voorstudie of van historische gegevens. Als de toxiciteit van een medium niet goed bekend is, kan de onderzoeksleider ervoor kiezen zowel een negatieve controle (luchcontrole) als een mediumcontrole te gebruiken, maar dit wordt sterk afgeraden. Indien uit historische gegevens blijkt dat een medium niet toxisch is, is een negatieve controlegroep (luchtcontrolegroep) niet nodig, en wordt alleen een mediumcontrole gebruikt. Indien een voorstudie van een in een medium bereide teststof uitwijst dat er geen toxiciteit optreedt, volgt hieruit dat het medium bij de geteste concentratie niet toxisch is en dat deze mediumcontrole moet worden gebruikt.

18.

De dieren worden aan de teststof blootgesteld in de vorm van gas, damp, aerosol of een mengsel daarvan. De te testen fysische toestand hangt af van de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof, de gekozen concentratie en/of de meest waarschijnlijke fysische vorm waarin de teststof bij hantering en gebruik aanwezig is. Hygroscopische en chemisch reactieve teststoffen moeten worden getest in drogeluchtomstandigheden. Er dient op te worden gelet dat er geen explosieve concentraties optreden. Deeltjesmateriaal kan aan mechanische processen worden onderworpen om een kleinere deeltjesgrootte te verkrijgen. Nadere richtsnoeren zijn opgenomen in GD 39 (2).

19.

Voor alle aerosolen en voor dampen die tot aerosolen kunnen condenseren, wordt de deeltjesgrootte bepaald. Om blootstelling van alle relevante delen van de ademhalingswegen mogelijk te maken, worden aerosolen met een massamediaan van de aerodynamische diameter (MMAD) tussen 1 en 3 μm en een geometrische standaardafwijking (σg) tussen 1,5 en 3,0 aanbevolen (4). Hoewel redelijkerwijs moet worden getracht deze normwaarden te halen, wordt het oordeel van een deskundige gegeven als dit niet mogelijk blijkt. Metaaldampdeeltjes kunnen bijvoorbeeld kleiner zijn dan deze normwaarde, en geladen deeltjes en vezels juist groter.

20.

In het ideale geval wordt de teststof zonder medium getest. Indien het noodzakelijk is een medium te gebruiken om een geschikte deeltjesgrootte en concentratie van de teststof te verkrijgen, wordt de voorkeur gegeven aan water. Wanneer een teststof wordt opgelost in een medium, moet de stabiliteit ervan worden aangetoond.

21.

Tijdens elke blootstelling wordt de luchtdoorstroming in de blootstellingskamer zorgvuldig geregeld, voortdurend gecontroleerd en ten minste elk uur geregistreerd. De realtimecontrole van de concentratie (of stabiliteit in de tijd) van de testatmosfeer is een integrale meting van alle dynamische parameters waarbij indirect alle relevante dynamische parameters voor het verkrijgen van de atmosfeer kunnen worden geregeld. Indien de concentratie realtime wordt gecontroleerd, kan de frequentie waarmee de luchtdoorstroming wordt gemeten, worden teruggebracht tot één meting per blootstelling per dag. Wanneer kamers voor blootstelling via de neus alleen worden gebruikt, moet er in het bijzonder op worden gelet dat de uitgeademde lucht niet opnieuw wordt ingeademd. Het zuurstofgehalte moet ten minste 19 % bedragen en het kooldioxidegehalte niet meer dan 1 %. Als er redenen zijn om aan te nemen dat deze normwaarde niet kan worden gehaald, moet de zuurstof- en kooldioxideconcentratie worden gemeten. Wanneer uit de metingen op de eerste blootstellingsdag blijkt dat de waarden voor deze gassen op het juiste niveau liggen, zijn geen verdere metingen nodig.

22.

De temperatuur in de kamer moet op 22 ± 3 °C worden gehouden. Voor zover mogelijk wordt, zowel bij blootstelling via de neus alleen als bij blootstelling van het hele lijf, tijdens elke blootstelling de relatieve vochtigheid in het ademhalingsgebied van de dieren doorlopend gecontroleerd en ten minste elk uur geregistreerd. De relatieve vochtigheid wordt bij voorkeur tussen 30 en 70 % gehouden, al zal dit niet altijd haalbaar (bv. wanneer mengsels op waterbasis worden getest) of meetbaar zijn vanwege interferentie tussen de teststof en de testmethode.

23.

Waar mogelijk wordt de nominale concentratie in de blootstellingskamer berekend en geregistreerd. De nominale concentratie is de massa van de gegenereerde teststof gedeeld door het totale luchtvolume dat door het inhalatiekamersysteem wordt geleid. De nominale concentratie wordt niet gebruikt om de blootstelling van de dieren te karakteriseren, maar een vergelijking tussen de nominale concentratie en de feitelijke concentratie vormt een aanwijzing voor het rendement van het testsysteem en kan bijgevolg worden gebruikt om problemen bij het genereren te ontdekken.

24.

De feitelijke concentratie is de concentratie van de teststof zoals bemonsterd in het ademhalingsgebied van de dieren in een inhalatiekamer. De feitelijke concentraties kunnen worden verkregen door toepassing van specifieke methoden (bv. rechtstreekse bemonstering of op adsorptie of een chemische reactie gebaseerde methoden, gevolgd door analytische karakterisering) of niet-specifieke methoden, zoals gravimetrische filteranalyse. Gravimetrische analysen zijn alleen aanvaardbaar voor aerosolen van poeders met één component of aerosolen van vloeistoffen met een geringe vluchtigheid en moeten worden ondersteund met passende specifieke karakteriseringen van de teststof voorafgaand aan de studie. De concentratie van aerosolen van poeders met meerdere componenten kan ook door middel van gravimetrische analyse worden bepaald. In dat geval zijn echter analytische gegevens vereist die aantonen dat de samenstelling van het materiaal in de lucht vergelijkbaar is met die van het uitgangsmateriaal. Als deze informatie niet beschikbaar is, kan het nodig zijn in de loop van de studie op gezette tijden een nieuwe analyse van de teststof (idealiter in de toestand in de lucht) uit te voeren. Voor geaerosoliseerde stoffen die kunnen verdampen of sublimeren, moet worden aangetoond dat met de gekozen methoden alle fasen zijn verzameld.

25.

Er wordt zo mogelijk één partij van de teststof gebruikt gedurende het onderzoek, en het testmonster wordt bewaard onder omstandigheden waarbij de zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit behouden blijven. Voor aanvang van de studie worden de teststof, met inbegrip van de zuiverheid, en indien technisch mogelijk de identiteit en de hoeveelheden van vastgestelde verontreinigingen en onzuiverheden gekarakteriseerd. Dit kan onder meer met de volgende gegevens worden aangetoond: retentietijd en relatief piekoppervlak, moleculair gewicht op basis van massaspectroscopie of gaschromatografie, of andere schattingen. Hoewel het testlaboratorium niet verantwoordelijk is voor de identiteit van het testmonster, kan het raadzaam zijn dat het testlaboratorium de karakterisering van de opdrachtgever ten minste in beperkte mate bevestigt (bv. kleur, fysische aard enz.).

26.

De blootstellingsatmosfeer wordt zo constant mogelijk gehouden. Een voorziening voor realtimecontrole, zoals een aerosol-fotometer voor aerosolen, of een totaal-koolwaterstofanalysator voor dampen, kunnen worden gebruikt om de stabiliteit van de blootstellingsvoorwaarden aan te tonen. De feitelijke concentratie in de kamer moet gedurende elke blootstellingsdag voor elk blootstellingsniveau ten minste 3 keer worden gemeten. Als dit vanwege de beperkte luchtdoorstroming of lage concentraties niet mogelijk is, is één monster per blootstellingsperiode aanvaardbaar. In het ideale geval wordt dit monster in dat geval gedurende de volledige blootstellingsperiode verzameld. Het verschil tussen individuele monsters van de kamerconcentratie en de gemiddelde kamerconcentratie mag bij gassen en dampen niet meer dan ± 10 % en bij vloeibare of vaste aerosolen niet meer dan ± 20 % bedragen. De equilibratietijd van de kamer (t95) wordt berekend en gerapporteerd. De blootstellingsduur omvat de tijd waarin de teststof wordt gegenereerd. Hierbij wordt rekening gehouden met de equilibratietijd van de kamer (t95) en de vervaltijd. In GD 39 (2) zijn richtsnoeren voor het schatten van t95 opgenomen.

27.

Voor zeer complexe mengsels bestaande uit dampen/gassen en aerosolen (bv. verbrandingsatmosferen en teststoffen die zijn ontleend aan doelgerichte eindproducten of apparaten), kan elke fase zich in een inhalatiekamer verschillend gedragen. Daarom moet van elke fase (damp/gas en aerosol) ten minste één indicatorstof (analyt) worden gekozen, normaliter de voornaamste werkzame stof in het mengsel. Wanneer de teststof een mengsel is, wordt de analytische concentratie vermeld voor het totale mengsel, en niet slechts voor het werkzame bestanddeel of de indicatorstof (analyt). Aanvullende informatie over feitelijke concentraties is opgenomen in GD 39 (2).

28.

De deeltjesgrootteverdeling van aerosolen wordt voor ieder concentratieniveau ten minste wekelijks bepaald met behulp van een cascade-impactor of een alternatief instrument, zoals een aerodynamische deeltjesgroottemeter. Indien kan worden aangetoond dat de met een cascade-impactor en het alternatieve instrument verkregen resultaten gelijkwaardig zijn, mag het alternatieve instrument gedurende de hele studie worden gebruikt.

29.

Parallel aan het primaire instrument wordt een tweede instrument, zoals een gravimetrisch filter of een impinger/gas bubbler gebruikt om de doeltreffendheid van de verzameling met het primaire instrument te bevestigen. De door middel van deeltjesgrootteanalyse en filteranalyse verkregen massaconcentraties moeten in redelijke mate overeenkomen (zie GD 39 (2)). Indien in een vroeg stadium van de studie de gelijkwaardigheid bij alle geteste concentraties kan worden aangetoond, zijn verdere bevestigende metingen niet nodig. Met het oog op het dierenwelzijn moeten maatregelen worden genomen om zo veel mogelijk te voorkomen dat niet-overtuigende gegevens worden verkregen waardoor herhaling van het onderzoek noodzakelijk is.

30.

Voor dampen wordt de deeltjesgrootte bepaald indien de mogelijkheid bestaat dat de dampen condenseren waardoor aerosolvorming optreedt of indien in een dampatmosfeer deeltjes worden gedetecteerd waarbij gemengde fasen kunnen optreden.

31.

De dieren worden voor, tijdens en na de blootstellingsperiode klinisch geobserveerd. Afhankelijk van de reactie van de dieren tijdens de blootstelling kunnen frequentere observaties nodig zijn. Indien het observeren van de dieren wordt belemmerd door het gebruik van fixeerbuizen, slecht verlichte kamers voor het hele lijf, of ondoorzichtige atmosferen, moeten de dieren zorgvuldig worden geobserveerd na afloop van de blootstelling. Door de volgende dag vóór de blootstelling te observeren kan eventuele reversibiliteit of verergering van toxische effecten worden beoordeeld.

32.

Alle observaties worden geregistreerd en van elk dier wordt een apart overzicht bijgehouden. Wanneer dieren om redenen van dierenwelzijn worden gedood of dood worden aangetroffen, wordt zo nauwkeurig mogelijk geregistreerd op welk tijdstip ze zijn gestorven.

33.

Bij externe observaties van de dieren in de kooien wordt gekeken naar veranderingen in de huid en de vacht, de ogen en de slijmvliezen, de ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het zenuwstelsel, de somatomotorische activiteit en gedragspatronen. Er moet worden gelet op de observatie van tremors, convulsies, speekselafscheiding, diarree, lethargie, slaap en coma. Een meting van de rectale temperatuur kan ondersteunende gegevens opleveren voor met de behandeling of opsluiting verband houdende reflectoire bradypneu of hypo-/hyperthermie. In het onderzoeksprotocol kunnen aanvullende beoordelingen worden opgenomen, zoals kinetiek, biomonitoring, longfunctie, retentie van slecht oplosbare stoffen die zich in longweefsel ophopen, en gedragsveranderingen.

34.

Het gewicht van elk dier wordt kort voor de eerste blootstelling geregistreerd, op dag 0 en vervolgens twee keer per week (bijvoorbeeld op vrijdag en maandag, om het herstel gedurende een weekend zonder blootstelling aan te tonen, of volgens een tijdsinterval om de systemische toxiciteit te kunnen beoordelen), alsook op het moment waarop het dier sterft of wordt geëuthanaseerd. Indien er gedurende de eerste twee weken geen effecten optreden, kan het lichaamsgewicht van de dieren gedurende het vervolg van de studie wekelijks worden gemeten. Indien satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen) worden gebruikt, moeten de dieren in deze groepen ook gedurende de hele herstelperiode wekelijks worden gewogen. Bij de beëindiging van het onderzoek moeten alle dieren kort voordat zij worden gedood, worden gewogen om een onvertekende berekening van de verhouding tussen orgaangewichten en lichaamsgewicht mogelijk te maken.

35.

Het voedselverbruik wordt wekelijks gemeten. Het waterverbruik kan ook worden gemeten.

36.

Voor alle dieren, met inbegrip van de dieren in de controlegroepen en satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen), worden klinisch-pathologische beoordelingen uitgevoerd wanneer zij worden gedood. Het tijdsinterval tussen het einde van de blootstelling en de aftapping van het bloed moet worden geregistreerd, met name wanneer het desbetreffende eindpunt snel naar de uitgangswaarde terugkeert. Voor parameters met een korte plasmahalfwaardetijd (bv. COHb, CHE, en MetHb) is het wenselijk om na het einde van de blootstelling monsters te nemen.

37.

Tabel 1 bevat een lijst van de klinisch-pathologische parameters die doorgaans voor elk toxicologisch onderzoek vereist zijn. Urineonderzoek hoeft niet routinematig te worden uitgevoerd, maar kan worden verricht wanneer dit op grond van de verwachte of waargenomen toxiciteit nuttig wordt geacht. De onderzoeksleider kan ervoor kiezen aanvullende parameters te beoordelen om de toxiciteit van een teststof beter te kunnen karakteriseren (bijv. cholinesterase, lipiden, hormonen, zuur/base-evenwicht, methemoglobine of Heinz-lichaampjes, creatinekinase, verhouding myeloïde/erytroïde cellen, troponines, arteriële bloedgassen, lactaatdehydrogenase, sorbitoldehydrogenase, glutamaatdehydrogenase, en gamma- glutamyltranspeptidase).

Tabel 1

Klinisch-pathologische standaardparameters

38.

Wanneer er aanwijzingen zijn dat afzetting en retentie primair in de onderste luchtwegen (d.w.z. de alveolen) plaatsvindt, kan bronchoalveolaire lavage de aangewezen techniek zijn voor kwantitatieve analyse van op hypothesen gebaseerde dosis-effectparameters, waarbij de nadruk ligt op alveolitis, longontsteking en fosfolipidose. Op deze manier kunnen veranderingen in de dosis-responsverhouding en het verloop in de tijd van alveolair letsel adequaat worden onderzocht. De bronchoalveolaire lavagevloeistof kan worden geanalyseerd met betrekking tot de totale en gedifferentieerde tellingen van de leukocyten, totaal eiwit, en lactaatdehydrogenase. Ook parameters die wijzen op lysosomale beschadigingen, fosfolipidose, fibrose en door irritatie of allergie veroorzaakte ontstekingen, kunnen worden overwogen; het kan hierbij onder meer gaan om de bepaling van pro-inflammatoire cytokinen/chemokinen. Bronchoalveolaire lavagemetingen vormen doorgaans een aanvulling op de resultaten van histopathologisch onderzoek, maar kunnen deze niet vervangen. In GD 39 (2) zijn richtsnoeren voor het uitvoeren van longlavage opgenomen.

39.

Op alle proefdieren, met inbegrip van de dieren die tijdens de test sterven of met het oog op het dierenwelzijn uit het onderzoek worden genomen, wordt macroscopische obductie uitgevoerd, indien mogelijk na volledig uitbloeden. Voor ieder dier moet worden geregistreerd hoeveel tijd er is verstreken tussen het einde van hun laatste blootstelling en het moment waarop zij zijn gedood. Als het niet mogelijk is onmiddellijk nadat een dood dier is aangetroffen een obductie te verrichten, wordt het dier gekoeld (niet bevroren) bij een temperatuur die laag genoeg is om de autolyse tot een minimum te beperken. De obductie wordt zo spoedig mogelijk verricht, normaliter binnen één of twee dagen. Alle met het blote oog waarneembare pathologische veranderingen worden voor elk dier geregistreerd, met bijzondere aandacht voor veranderingen in de luchtwegen.

40.

Tabel 2 bevat een lijst van de organen en weefsels die tijdens de macroscopische obductie in een geschikt medium moeten worden bewaard voor histopathologisch onderzoek. Het is aan de onderzoeksleider om te beoordelen of de organen en weefsels tussen [vierkante haken] en alle andere organen en weefsels worden bewaard. De vet weergegeven organen moeten zo spoedig mogelijk na de sectie worden ontdaan van aanhechtend weefsel en nat worden gewogen om uitdroging te voorkomen. De schildklier en epididymides moeten alleen worden gewogen indien dit nodig is, omdat bij het ontdoen van aanhechtend weefsel artefacten kunnen ontstaan die het histopathologische onderzoek kunnen belemmeren. Weefsels en organen moeten worden gefixeerd in 10 % gebufferde formaldehyde of een ander geschikt fixeermiddel zodra de obductie is verricht, en ten minste 24 tot 48 uur vóór het ontdoen van aanhangend weefsel, afhankelijk van het gebruikte fixeermiddel.

Tabel 2

Tijdens de macroscopische obductie bewaarde organen en weefsels

Bijnieren

Beenmerg (en/of vers aspiraat)

Hersenen (inclusief delen van cerebrum, cerebellum en medulla/pons)

[Ogen (netvlies, oogzenuw) en oogleden]

Hart

Nieren

Larynx (3 niveaus, 1 niveau moet de steel van de epiglottis bevatten)

Lever

Long (alle lobben op één niveau, inclusief de hoofdbronchiën)

Lymfeklieren van de longhilus, met name bij slecht oplosbare teststoffen in deeltjesvorm. Voor grondiger onderzoek en/of studies met een immunologische focus kunnen aanvullende lymfeklieren worden overwogen, bv. uit de mediastinale, cervicale/submandibulaire en/of auriculaire streek.

Weefsels van de nasofarynx (ten minste 4 niveaus; 1 niveau moet het nasofaryngaal kanaal en het nasofarynx-geassocieerd lymfatisch weefsel (nasal associated lymphoid tissue, NALT) omvatten.

Slokdarm

[Reukkolf]

Ovaria

Zaadblaasjes

Ruggenmerg (cervicaal, middenthoracaal en lumbaal)

Milt

Maag

Testes

Thymus

Schildklier

Luchtpijp (ten minste 2 niveaus, inclusief 1 lengtecoupe door de carina en 1 dwarscoupe)

[Urineblaas]

Uterus

Elk macroscopisch waarneembaar letsel

41.

De longen worden in hun geheel verwijderd, gewogen en ingedruppeld met een geschikt fixeermiddel bij 20-30 cm waterdruk om ervoor te zorgen dat de longstructuur intact blijft (5). De coupes worden voor alle lobben op één niveau, inclusief de hoofdbronchiën, gemaakt, maar als longlavage wordt uitgevoerd, worden van de niet gespoelde lob op drie niveaus coupes gemaakt (geen seriële coupes).

42.

Ten minste 4 niveaus van de weefsels van de nasofarynx worden onderzocht, waarvan er één het nasofaryngaal kanaal moet omvatten (5)(6)(7)(8)(9), om adequaat onderzoek mogelijk te maken van het plaveiselcelepitheel, overgangsepitheel (respiratoir zonder trilharen), ademhalingsepitheel (respiratoir met trilharen) en reukepitheel, alsmede het drainerend lymfatisch weefsel (NALT; (10)(11)). Er worden drie niveaus van de larynx onderzocht; een van deze niveaus moet de steel van de epiglottis omvatten (12). Er worden ten minste twee niveaus van de luchtpijp onderzocht, inclusief één lengtecoupe door de carina van de splitsing van de extrapulmonale bronchiën, en één dwarscoupe.

43.

Alle in tabel 2 genoemde organen en weefsels wordt histopathologisch onderzocht bij de controle- en hogeconcentratiegroepen, en bij alle dieren die tijdens het onderzoek sterven of worden gedood. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de luchtwegen, doelorganen, en macroscopisch waarneembaar letsel. De organen en weefsels die in de hogeconcentratiegroep letsel vertonen, worden bij alle groepen onderzocht. De onderzoeksleider kan ervoor kiezen bij meer groepen histopathologisch onderzoek te verrichten, om een duidelijk verband tussen concentratie en respons aan te tonen. Indien van een satellietgroep (reversibiliteitsgroep) gebruik wordt gemaakt, dan wordt histopathologisch onderzoek verricht op alle weefsels en organen waar bij de behandelde groepen effecten blijken te zijn opgetreden. Indien er bij de hogeblootstellingsgroep buitensporig veel vroegtijdige sterfte of andere problemen optreden die afbreuk doen aan de significantie van de gegevens, wordt de groep die bij de op één na hoogste concentratie is blootgesteld, histopathologisch onderzocht. Getracht moet worden om de macroscopische waarnemingen te correleren aan microscopische bevindingen.

44.

Voor elk dier apart worden gegevens over lichaamsgewicht, voedselverbruik, klinische pathologie, orgaangewichten en histopathologie vermeld. Daarnaast worden de gegevens van de klinische observatie in tabelvorm samengevat met voor alle testgroepen vermelding van het gebruikte aantal dieren, het aantal dieren dat specifieke toxiciteitsverschijnselen vertoonde, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of om redenen van dierenwelzijn is gedood, het tijdstip waarop elk dier is gestorven, een beschrijving van de toxische effecten met het verloop en de omkeerbaarheid en de obductiebevindingen. Alle resultaten, zowel numerieke als incidenteel, moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden geëvalueerd. Iedere algemeen aanvaarde statistische methode mag worden gebruikt; de statistische methoden worden bij de opzet van het onderzoek gekozen.

45.

In het testverslag wordt indien van toepassing de volgende informatie opgenomen: