BIJLAGE I

(Artikel 1)

LIJST VAN REFERENTIEMETHODEN

Index Min. = minimum, Max. = maximum, Bijlage = bijlage bij de geciteerde verordening, VDS = vetvrije droge stof, PG = peroxidegetal, V = voorkomen, S = smaak, C = consistentie, TKG = totaal kiemgetal, Therm = kiemgetal thermofielen, LS = lidstaat, IDF = Internationale Zuivelbond, ISO = Internationale Organisatie voor normalisatie, IUPAC = International Union of Pure and Applied Chemistry, ADPI = American Dairy Products Institute, GMS = gecondenseerde volle melk met suiker, GMR = geëvaporeerde melk of room.

DEEL A

Verordening van de Commissie	Product	Parameter	Grenswaarde (1)	Referentiemethode	Opmerking
Verordening (EG) nr. 2771/1999 — Openbare opslag	Ongezouten boter	Vet	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Water	Max. 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		VDS	Max. 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Vrije vetzuren	1,2 mmol/100 g vet	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		PG (max.)	0,3 meq. zuurstof/1 000 g vet	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Opmerking 1
		Colibacteriën	Niet detecteerbaar in 1 g	Bijlage X	Opmerking 3
		Niet van melk afkomstig vet	Niet detecteerbaar door triglyceride-analyse	Bijlage XX
		Sterol-verklikstoffen	Niet detecteerbaar, β-sitosterol ≤ 40 mg/kg	Bijlage VIII
		Andere verklikstoffen:
		— vanilline	Niet detecteerbaar	Bijlage VI
		— ethylester van caroteenzuur	≤ 6 mg/kg	Bijlage VII
		— triglyceriden van n-heptaanzuur	Niet detecteerbaar	Bijlage V
		Sensorische kenmerken	Ten minste 4 van de 5 punten voor V, S en C	Bijlage IV
		Waterdispersie	Ten minste 4 punten	ISO 7586:1985 — IDF 112A:1989
Verordening (EG) nr. 2771/1999 — Particuliere opslag	Ongezouten boter	Vet	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Water	Max. 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		VDS	Max. 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
Verordening (EG) nr. 2771/1999 — Particuliere opslag	Gezouten boter	Vet	Min. 80 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Water	Max. 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		VDS (exclusief zout)	Max. 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Zout	Max. 2 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
Verordening (EG) nr. 1898/2005, hoofdstuk II	Ongezouten boter	Vet	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Niet van melk afkomstig vet		Bijlage XX
		Water	Max. 16 % m/m	ISO 3727-1 2001|IDF 80-1:2001
		VDS	Max. 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Verklikstoffen:
		— sterolen	Zie bijlage VIII	Bijlage VIII
		— vanilline	Zie bijlage VI	Bijlage VI
		— ethylester van caroteenzuur	Zie bijlage VII	Bijlage VII
		— triglyceriden van n-heptaanzuur	Zie bijlage V	Bijlage V
Verordening (EG) nr. 1898/2005, hoofdstuk II	Gezouten boter	Vet	Min. 80 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Niet van melk afkomstig vet		Bijlage XX
		Water	Max. 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		VDS (exclusief zout)	Max. 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Zout	Max. 2 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
		Verklikstoffen:
		— sterolen	Zie bijlage VIII	Bijlage VIII
		— vanilline	Zie bijlage VI	Bijlage VI
		— ethylester van caroteenzuur	Zie bijlage VII	Bijlage VII
		— triglyceriden van n-heptaanzuur	Zie bijlage V	Bijlage V
Verordening (EG) nr. 1898/2005, hoofdstuk II	Boterconcentraat	Vet	Min. 99,8 % m/m	IDF 24:1964
		Water en VDS	Max. 0,2 % m/m	ISO 5536:2002|IDF 23:2002 (vocht) IDF 24:1964 (VDS)
		Vrije vetzuren	1,2 mmol/100 g vet	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		PG (max.)	0,5 meq. zuurstof/1 000 g vet	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Opmerking 1
		Niet van melk afkomstig vet	Niet aanwezig	Bijlage XX
		Smaak	Vers
		Geur	Geen vreemde geuren
		Overige	Geen neutraliserende stoffen, antioxidanten of conserveermiddelen
		Verklikstoffen:
		— sterolen	Zie bijlage VIII	Bijlage VIII
		— vanilline	Zie bijlage VI	Bijlage VI
		— ethylester van caroteenzuur	Zie bijlage VII	Bijlage VII
		— triglyceriden van n-heptaanzuur	Zie bijlage V	Bijlage V
Verordening (EG) nr. 1898/2005, hoofdstuk II	Room	Vet	Min. 35 % m/m	ISO 2450:1999|IDF 16 C:1987
		Niet van melk afkomstig vet		Bijlage XX
		Verklikstoffen:
		— sterolen	Zie bijlage VIII		Opmerking 2
		— vanilline	Zie bijlage VI	Bijlage VI
		— ethylester van caroteenzuur	Zie bijlage VII		Opmerking 2
		— triglyceriden van n-heptaanzuur	Zie bijlage V	Bijlage V
Verordening (EG) nr. 1898/2005, hoofdstuk III	Boterconcentraat	Vet	Min. 96 % m/m		Opmerking 2
		Niet van melk afkomstig vet		Bijlage XX
		VDS	Max. 2 % m/m		Opmerking 2
		Verklikstoffen:
		— stigmasterol (95 % m/m)	15 g/100 kg boterconcentraat	Bijlage VIII
		— stigmasterol (85 % m/m)	17 g/100 kg boterconcentraat	Bijlage VIII
		— triglyceriden van n-heptaanzuur	10,34 kg/t boterconcentraat	Bijlage V
		— ethylester van boterzuur en stigmasterol		— ethylester van boterzuur — stigmasterol: bijlage VIII	Opmerking 2
		— ethylester van boterzuur en triglyceriden van n-heptaanzuur		— ethylester van boterzuur — triglyceriden van n-heptaanzuur: bijlage V	Opmerking 2
		lecithine (E 322)	Max. 0,5 % m/m		Opmerking 2
		NaC1	Max. 0,75 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
		Vrije vetzuren	1,2 mmol/100 g vet	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		PG (max.)	Max. 0,5 meq. zuurstof/1 000 g vet	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Opmerking 1
		Smaak	Vers
		Geur	Geen vreemde geuren
		Overige	Geen neutraliserende stoffen, antioxidanten of conserveermiddelen
Verordening (EG) nr. 1898/2005, hoofdstuk IV	Ongezouten boter	Vet	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Water	Max. 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		VDS	Max. 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
Verordening (EG) nr. 1898/2005, hoofdstuk IV	Gezouten boter	Vet	Min. 80 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Water	Max. 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		VDS (exclusief zout)	Max. 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Zout	Max. 2 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
Artikel 9 en titel II van Verordening (EG) nr. 1255/1999	Kaas van schapen- en/of geitenmelk	Koemelk	< 1 % m/m	Bijlage IX
Verordening (EEG) nr. 2921/90	Bijlage I — Zuurcaseïne	Water	Max. 12,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Vet	Max. 1,75 % m/m	ISO 5543:2004|IDF127:2004
		Vrije vetzuren	Max. 0,30 ml 0,1 N NaOH-oplossing/g	ISO 5547:1978|IDF 91:1979
Verordening (EEG) nr. 2921/90	Bijlage I — Lebcaseïne	Water	Max. 12,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Vet	Max. 1,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		As	Min. 7,50 % m/m	ISO 5545:1978|IDF 90:1979
Verordening (EEG) nr. 2921/90	Bijlage I — Caseïnaat	Water	Max. 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Melkeiwitten	Min. 88,00 % m/m	ISO 5549:1978|IDF 92:1979
		Vet en as	Max. 6,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Vaste as		ISO 5544:1978|IDF 89:1979
		As		ISO 5545:1978|IDF 90:1979
Verordening (EEG) nr. 2921/90	Bijlage II — Zuurcaseïne	Water	Max. 10,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Vet	Max. 1,50 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Vrije vetzuren	Max. 0,20 ml 0,1 N NaOH-oplossing/g	ISO 5547:1978|IDF 91:1979
		TKG (max.)	30 000/ g	ISO 4833:2003	Opmerking 3
		Colibacteriën	Geen in 0,1 g	Bijlage X	Opmerking 3
		Therm. (max.)	5 000/ g	ISO 4833:2003	Opmerkingen 3 en 4
Verordening (EEG) nr. 2921/90	Bijlage II — Lebcaseïne	Water	Max. 8,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Vet	Max. 1,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		As	Min. 7,50 % m/m	ISO 5545:1978|IDF 90:1979
		TKG (max.)	30 000/ g	ISO 4833:2003	Opmerking 3
		Colibacteriën	Geen in 0,1 g	Bijlage X	Opmerking 3
		Therm. (max.)	5 000/ g	ISO 4833:2003	Opmerkingen 3 en 4
Verordening (EEG) nr. 2921/90	Bijlage II — Caseïnaat	Water	Max. 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Melkeiwitten	Min. 88,00 % m/m	ISO 5549:1978|IDF 92:1979
		Vet en as	Max. 6,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004 ISO 5544:1978|IDF 89:1979 of ISO 5545:1978|IDF 90:1979
		TKG (max.)	30 000/ g	ISO 4833:2003	Opmerking 3
		Colibacteriën	Geen in 0,1 g	Bijlage X	Opmerking 3
		Therm. (max.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Opmerkingen 3 en 4
Verordening (EEG) nr. 2921/90	Bijlage III — Caseïnaat	Water	Max. 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Melkeiwitten	Min. 85,00 % m/m	ISO 5549:1978|IDF 92:1979
		Vet	Max. 1,50 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Lactose	Max. 1,00 % m/m	ISO 5548:2004|IDF 106:2004
		As	Max. 6,50 % m/m	ISO 5544:1978|IDF 89:1979 of ISO 5545:1978|IDF 90:1979
		TKG (max.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Opmerking 3
		Colibacteriën	Geen in 0,1 g	Bijlage X	Opmerking 3
		Therm. (max.)	5 000/ g	ISO 4833:2003	Opmerkingen 3 en 4
Verordening (EG) nr. 2799/1999	Mengvoeders en mageremelkpoeder (MMP) (voor diervoeding)	Water (zurekarnemelkpoeder)	Max. 5 % m/m	Bijlage XIX
		Eiwit	Min. 31,4 % m/m van de vetvrije droge stof	ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001
		Water (MMP)	Max. 5 % m/m	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Vet (MMP)	Max. 11 % m/m	ISO 1736:2000|IDF 9C:1987
		Lebwei (MMP)	Geen	Bijlage XIII	Opmerking 6
		Zetmeel (MMP)	Geen	Bijlage XVII
		Water (mengsels)	Max. 5 % m/m van de vetvrije stof	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Vet (mengsels)		Richtlijn 84/4/EEG van de Commissie (PB L 15 van 18.1.1984, blz. 29)
		Lebwei (mengsels)	Geen	Bijlage XIII
		MMP-gehalte (eindproduct)	Min. 50 % m/m	Bijlage XVI
		Vet (eindproduct)	Min. 2,5 % m/m of 5 % m/m	Richtlijn 84/4/EEG van de Commissie (PB L 15 van 18.1.1984, blz. 29)	Opmerking 7
		Zetmeel (eindproduct)	Min. 2 % m/m	Bijlage XVII	Opmerking 8
		Koper (eindproduct)	25 ppm	Richtlijn 78/633/EEG van de Commissie (PB L 206 van 26.7.1987, blz. 43)
Verordening (EG) nr. 214/2001	MMP (spray)	Vet	Max. 1,0 % m/m	ISO 1736:2000|IDF 9C:1987
		Eiwit	Min. 31,4 % (2)m/m van de vetvrije droge stof	ISO 8968-1/2:2001|IDF 20-1/2:2001
		Water	Max. 3,5 % m/m	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Zuurgraad	Max. 19,5 ml 0,1 N NaOH, 10 g vetvrije droge stof	ISO 6091:1980|IDF 86:1981
		Lactaten	Max. 150 mg/100 g vetvrije droge stof	ISO 8069:2005|IDF 69:2005
		Fosfatase	Negatief	ISO 11816-1:2006|IDF 155-1:2006
		Onoplosbaarheid	Max. 0,5 ml bij 24 °C	ISO 8156:2005|IDF 129:2005
		Verbrande deeltjes	Filterschijf A of B (15,0 mg)	ADPI (1990)
		TKG	40 000/ g	ISO 4833:2003	Opmerking 3
		Colibacteriën	Negatief/ 0,1 g	Bijlage X	Opmerking 3
		Karnemelk	Negatief	Bijlage XIV
		Lebwei	Negatief	Bijlage XII
		Zure wei	Negatief		Opmerking 2
		Antibiotica		Bijlage XV

DEEL B

De in deel B opgenomen referentiemethoden kunnen worden gebruikt voor de analyse van producten die onder een van de in kolom 1 vermelde verordeningen vallen.

Verordening van de Commissie	Product	GN-code	Parameter	Grenswaarde	Referentiemethode	Opmerking
Verordening (EEG) nr. 2658/87 Verordening (EG) nr. 2535/2001 Verordening (EG) nr. 1282/2006	Melk en room, niet ingedikt, zonder toegevoegde suiker of andere zoetstoffen	0401	Vet (≤ 6 % m/m)	De grenswaarden zijn vermeld in de omschrijving van de GN-code voor het betrokken product en eventueel in deel 9 van bijlage I (restitutienomenclatuur) van Verordening (EEG) nr. 3846/87 van de Commissie (PB L 366 van 24.12.1987, blz. 1) of in Verordening (EG) nr. 2535/2001 (PB L 341 van 22.12.2001, blz. 29).	ISO 1211:2001|IDF 1D:1996
			Vet (> 6 % m/m)		ISO 2450:1999|IDF 16C:1987
	Melk en room, ingedikt of met toegevoegde suiker of andere zoetstoffen	0402	Vet (vloeibare vorm)		ISO 1737:1999|IDF 13C:1987
			Vet (vaste vorm)		ISO 1736:2000|IDF 9C:1987
			Eiwit		ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001
			Sucrose (normaal gehalte)		ISO 2911:2004| IDF 35:2004
			Sucrose (laag gehalte)			Opmerking 2
			Droge stof (GMS)		ISO 6734:1989|IDF 15B:1991
			Droge stof (GMR)		ISO 6731:1989|IDF 21B:1987
			Water (melkpoeder)		ISO 5537:2004|IDF 26:2004
			Water (roompoeder)		Bijlage XVIII
	Karnemelk, gefermenteerde of aangezuurde melk en room, al dan niet ingedikt, met toegevoegde suiker of andere zoetstoffen	0403	Vet		ISO 1211:2001|IDF 1D:1996 ISO 1736:2000|IDF 9C:1987 ISO 2450:1999|IDF 16 C:1987 ISO 7208:1999|IDF 22B:1987 ISO 8262-3:2005|IDF 124-3:2005
			Eiwit		ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001
			Sucrose (normaal gehalte)		ISO 2911:2004|IDF 35:2004
			Sucrose (laag gehalte)			Opmerking 2
			Water (zurekarnemelkpoeder)		Bijlage XIX
			Water (zoetekarnemelkpoeder)		ISO 5537:2004|IDF26:2004
			Droge stof (andere producten)		Door de bevoegde autoriteit goedgekeurde methoden
	Wei, al dan niet ingedikt of met toegevoegde suiker of andere zoetstoffen; producten die uit natuurlijke melkbestanddelen bestaan	0404	Vet		ISO 1736:2000|IDF 9C:1987 ISO 2450:1999|IDF 16C:1987 ISO 7208:1999|IDF 22B:1987
			Eiwit		ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001
			Sucrose (normaal gehalte)		ISO 2911:2004|IDF 35:2004
			Sucrose (laag gehalte)			Opmerking 2
		0404 90	Eiwit		ISO 8968 1/2 2001|IDF 20-1/2:2001
			Water		IDF 21B:1987
			Droge stof		ISO 6734:1989|IDF 15B:1991
			(Ingedikte producten)		ISO 6731:1989|IDF 21B:1987
	Boter en andere melkvetten; zuivelpasta's	0405	Vet (als ≤ 85 % m/m)		ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Boter	Water		ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
			VDS		ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
			NaCl		ISO 15648:2004|IDF 179:2004
			Vet (als > 99 % m/m)		IDF 24:1964
	Butteroil		Water (als vet < 99 % m/m)		ISO 5536:2002|IDF 23:2002
	Kaas en wrongel	0406	Vet		ISO 1735:2004|IDF 5:2004
			Droge stof		ISO 5534:2004|IDF 4:2004
			Droge stof (Ricotta)		ISO 2920:2004|IDF 58:2004
			NaCl		ISO 5943:2006|IDF 88:2006
			Lactose		ISO 5765-1/2:2002|IDF 79-1/2:2002
Verordening (EEG) nr. 2658/87	Mengvoeders	2309	Lactose		Bijlage XI

Opmerkingen bij de lijst van EU-referentiemethoden:

Opmerking 1: Isolatie melkvet zoals beschreven in ISO 1740:1991 (donker bewaren).

Opmerking 2: Er is geen referentiemethode vastgesteld. De methoden worden door de bevoegde autoriteit goedgekeurd.

Opmerking 3: Monstervoorbehandeling volgens ISO 8261:2001|IDF 122:2001.

Opmerking 4: Incubatie gedurende 48 uur bij een temperatuur van 55 °C; let op dat uitdroging van het kweekmedium wordt voorkomen.

Opmerking 5: % VDS m/m = % droge stof m/m — % vet m/m.

Opmerking 6: Richtlijn 84/4/EEG van de Commissie.

Opmerking 7: Verordening (EG) nr. 2799/1999 van de Commissie (PB L 340 van 31.12.1999, blz. 3-27).

Opmerking 8: Richtlijn 78/633/EEG van de Commissie.

---

(1)  Unbeschadet der Anforderungen der jeweiligen Verordnung.

(2)  Per 1 september 2009 is het minimale eiwitgehalte 34 %.

BIJLAGE II

(Artikel 3)

BEOORDELING OF EEN PARTIJ AAN DE WETTELIJKE GRENSWAARDE VOLDOET

1.   PRINCIPE

Wanneer in de desbetreffende wetgeving gedetailleerde monsternemingsprocedures worden vermeld, worden deze procedures gevolgd. In alle andere gevallen wordt een monster gebruikt dat bestaat uit ten minste drie componenten die aselect worden genomen uit de partij die moet worden gecontroleerd. Er kan een samengesteld monster worden bereid. Het verkregen resultaat wordt met de wettelijke grenswaarden vergeleken door berekening van een 95 %-betrouwbaarheidsinterval als 2 x standaarddeviatie, waarbij als standaarddeviatie wordt gebruikt: 1) als de methode via internationale samenwerking is gevalideerd, de waarden voor σr en σR; 2) bij een interne validering, de berekende interne reproduceerbaarheid. Dit betrouwbaarheidsinterval wordt vervolgens gelijkgesteld aan de meetonzekerheid van het resultaat.

2.   DE METHODE IS VIA INTERNATIONALE SAMENWERKING GEVALIDEERD

In dit geval zijn de standaarddeviatie van de herhaalbaarheid σr en de standaarddeviatie van de reproduceerbaarheid σR bepaald en kan het laboratorium aantonen of de prestatiekenmerken van de gevalideerde methode worden gehaald.

Berekening het rekenkundig gemiddelde van de n herhaalde metingen.

Bereken de totale onzekerheid (k = 2) van als:

Als het eindresultaat x van de meting wordt berekend met een vergelijking van de vorm x = y 1 + y 2, x = y 1 – y 2, x = y 1 · y 2 of x = y 1 / y 2, moeten de gebruikelijke procedures voor de combinatie van standaarddeviaties in dergelijke gevallen worden gevolgd.

De partij wordt geacht niet aan de bovenste wettelijke grenswaarde UL te voldoen als:

;

in alle andere gevallen wordt de partij geacht wel aan UL te voldoen.

De partij wordt geacht niet aan de onderste wettelijke grenswaarde LL te voldoen als:

;

in alle andere gevallen wordt de partij geacht wel aan LL te voldoen.

3.   INTERNE VALIDERING MET BEREKENING VAN DE STANDAARDDEVIATIE VAN DE INTERNE REPRODUCEERBAARHEID

Wanneer methoden worden gebruikt die niet in deze verordening worden vermeld en er geen maat voor de precisie is bepaald, moet een interne validering worden uitgevoerd. In de vergelijkingen voor de berekening van de totale onzekerheid U moeten de standaarddeviatie van de interne herhaalbaarheid sir en de standaarddeviatie van de interne reproduceerbaarheid siR worden gebruikt in plaats van respectievelijk σr en σR.

De beslisregels zijn dezelfde als in geval 1). Als de partij echter wordt geacht niet aan de wettelijke grenswaarde te voldoen, moeten de metingen worden herhaald met de in deze verordening vermelde methode en de beslisprocedure van geval 1).

BIJLAGE III

(Artikel 4)

EVALUATIE VAN DE BEOORDELAARS EN DE BETROUWBAARHEID VAN DE RESULTATEN BIJ SENSORISCHE ANALYSES

De volgende procedures zijn van toepassing als methoden van puntentoekenning worden gebruikt (IDF-norm 99C:1997).

A)   BEPALING VAN DE „HERHAALBAARHEIDSINDEX”

Over een periode van 12 maanden moet een beoordelaar minstens tien monsters als blinde duplo's analyseren. Dit zal meestal tijdens verscheidene sessies gebeuren. De resultaten voor de afzonderlijke productkenmerken worden met de volgende vergelijking geëvalueerd:

Hierbij is:

wI	:	herhaalbaarheidsindex
xi1	:	score voor de eerste evaluatie van monster xi
xi2	:	score voor de tweede evaluatie van monster xi
n	:	aantal monsters

De te evalueren monsters moeten representatief zijn voor een grote kwaliteitsspreiding. Daarbij mag wI niet hoger zijn dan 1,5 (op een schaal met vijf punten).

B)   BEPALING VAN DE „DEVIATIE-INDEX”

Deze index dient te worden gebruikt om na te gaan of een beoordelaar dezelfde schaal voor de evaluatie van de kwaliteit gebruikt als een ervaren groep beoordelaars. De door de beoordelaar verkregen scores worden met het gemiddelde van de door de groep beoordelaars verkregen scores vergeleken.

De resultaten worden met de volgende vergelijking geëvalueerd:

Hierbij is:

xi1; xi2	:	zie onder A)
;	:	Gemiddelde score van de groep beoordelaars voor respectievelijk de eerste en de tweede evaluatie van monster xi
n	:	aantal monsters (minstens tien per 12 maanden)

De te evalueren monsters moeten representatief zijn voor een grote kwaliteitsspreiding. Daarbij mag D1 niet hoger zijn dan 1,5 (op een schaal met vijf punten).

De lidstaten moeten eventuele problemen die zij bij de toepassing van deze procedure ondervinden, melden.

Wanneer een bepaalde beoordelaar de grenswaarde van 1,5 voor de deviatie-index of de herhaalbaarheidsindex blijkt te overschrijden, moeten de deskundigen van de officiële instantie een of meer aselecte „herhalingstoetsen” uitvoeren bij monsters die door hen in de weken daarna worden geclassificeerd, of een of meer „begeleide” toetsen met deze beoordelaar uitvoeren. Er is intensief toezicht nodig om te kunnen beslissen of de diensten van deze beoordelaar verder zullen worden gebruikt. De resultaten dienen te worden gedocumenteerd en als bewijs van de follow-up te worden bewaard.

C)   VERGELIJKING VAN DE IN VERSCHILLENDE REGIO'S VAN EEN LIDSTAAT EN IN VERSCHILLENDE LIDSTATEN VERKREGEN RESULTATEN

Indien van toepassing, moet minstens eenmaal per jaar een toets worden georganiseerd om de resultaten van beoordelaars uit verschillende regio's te vergelijken. Als er significante verschillen worden geconstateerd, moeten de nodige maatregelen worden genomen om de oorzaken daarvan te achterhalen en tot vergelijkbare resultaten te komen.

De lidstaten mogen toetsen organiseren om de resultaten van hun eigen beoordelaars en de beoordelaars van naburige lidstaten te vergelijken. Bij significante verschillen moet er een diepgaand onderzoek worden ingesteld teneinde tot vergelijkbare resultaten te komen.

De lidstaten moeten de resultaten van deze vergelijkingen aan de Commissie meedelen.

BIJLAGE IV

(Artikel 4)

SENSORISCHE EVALUATIE VAN BOTER

1.   DOEL

Het doel van deze procedure voor de sensorische evaluatie van boter is een uniforme methode vast te stellen die in alle lidstaten van toepassing is.

Zie voor meer bijzonderheden de huidige versie van de internationale IDF-norm voor melk en zuivelproducten: IDF 99 — delen 1,2 en 3 over sensorische evaluatie.

2.   DEFINITIES

Sensorische evaluatie (beoordeling): een onderzoek van de eigenschappen van een product met behulp van de zintuigen.

Panel: een groep geselecteerde beoordelaars die tijdens de beoordeling, zonder onderling contact en zonder elkaar te beïnvloeden, hun werk doen.

Beoordelaar: iemand die wordt gekozen op grond van zijn of haar vermogen om een sensorisch onderzoek uit te voeren. Een dergelijke beoordelaar kan een beperkte ervaring hebben.

Deskundige beoordelaar: iemand met een hoge mate van sensorische gevoeligheid en ervaring met sensorische methoden, die consistente en betrouwbare sensorische beoordelingen van uiteenlopende producten kan uitvoeren. Een dergelijke beoordelaar zal een goed sensorisch lange termijngeheugen hebben.

Toekennen van punten: een sensorische evaluatie door een panel met gebruikmaking van een cijferschaal. Er moet een nomenclatuur voor de afwijkingen worden gehanteerd.

Classificatie: een indeling in een kwaliteitsklasse op grond van de toegekende punten.

Controledocumenten: documenten die worden gebruikt om de individuele punten per eigenschap en de uiteindelijke classificatie van het product te noteren. (Dit document kan ook worden gebruikt om de chemische samenstelling te registreren.)

3.   ONDERZOEKRUIMTE

Zie voor meer bijzonderheden ISO 8589 en ISO/DIS 22935-2 | IDF 99-2, punt 7.

Er moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen om ervoor te zorgen dat de beoordelaars in de onderzoekruimte niet door uitwendige factoren worden beïnvloed.

De onderzoekruimte moet vrij van vreemde geuren en gemakkelijk schoon te houden zijn. De muren moeten licht van kleur en niet reflecterend zijn.

De onderzoekruimte en verlichting ervan moeten zodanig zijn dat ze de eigenschappen van de te beoordelen producten niet beïnvloeden.

De temperatuur van de ruimte moet zodanig kunnen worden geregeld dat de temperatuur van de boter constant blijft. Tijdens de classificatie moet de temperatuur van de boter 12 °C (±2 °C) zijn.

4.   SELECTIE VAN DE BEOORDELAARS

Een beoordelaar moet vertrouwd zijn met boterproducten en de vaardigheden hebben om een sensorische evaluatie uit te voeren. Zijn/haar vaardigheid moet periodiek (minstens eens per jaar) door de bevoegde autoriteit worden gecontroleerd.

4.1.   ISO/DIS 22935-1 | IDF 99-1, punt 4 (rekrutering) en punt 5.1, dienen te worden geraadpleegd voor bijzonderheden over algemene eisen en screeningstoetsen die kunnen worden gebruikt alvorens een nieuwe beoordelaar officieel werkzaam is.

Het is van cruciaal belang dat er continue opleiding is en er moeten periodiek algemene bijeenkomsten worden gehouden. Zie ISO 8586-1 voor informatie over de opleiding van panels.

4.2.   De aanvankelijke opleiding omvat:

—	algemene theorie en praktisch belang van sensorische evaluatie,

—	methoden, schalen en beschrijving van sensorische indrukken,

—	waarneming en herkenning van sensorische eigenschappen en specifieke sensorische termen,

—	achtergrondopleiding over de fabricage van boter,

—	gevalideerde referenties en monsters om de beoordelaar te helpen bij het herkennen van specifieke smaken en de smaakintensiteit in het product.

5.   EISEN VOOR HET PANEL

Het aantal beoordelaars in het panel moet oneven zijn; het minimale aantal is drie. De meeste beoordelaars moeten werknemers van de bevoegde autoriteit zijn of bevoegde personen die niet in dienst zijn bij de zuivelindustrie.

De leider van het panel is verantwoordelijk voor de hele procedure en kan aan het panel deelnemen.

Om te zorgen dat de panelleden een optimale prestatie leveren, moet vóór de evaluatie met een aantal factoren rekening worden gehouden:

—	de panelleden mogen niet aan een ziekte lijden die hun prestaties nadelig kan beïnvloeden; indien dit wel het geval is, moet de beoordelaar in het panel door een ander worden vervangen;

—	de panelleden moeten op tijd komen om aan de evaluatie te kunnen deelnemen en ervoor zorgen dat zij voldoende tijd hebben om de evaluatie uit te voeren;

—	de panelleden mogen geen sterk geurende stoffen als parfum, aftershave of deodorant gebruiken, mogen geen sterk aromatische (bijv. sterk gekruide) voeding eten enz.;

—	de panelleden mogen een half uur vóór de evaluatie niet roken, eten of iets anders dan water drinken.

6.   PRESTATIES

Alle beoordelaars dienen geregeld aan en als voor sensorische evaluatie deel te nemen om hun vaardigheden op peil te houden. De frequentie is afhankelijk van de hoeveelheid boter en de omzet en moet minimaal één panel per maand zijn.

Ook ervaren beoordelaars moeten elk jaar aan een aantal panels deelnemen, zo mogelijk ten minste één keer per kwartaal.

7.   MONSTERNEMING EN VOORBEHANDELING VAN HET MONSTER

Om mogelijke vooroordelen te voorkomen is het van cruciaal belang dat de identiteit van de monsters tijdens de beoordeling geheim blijft. De monsters dienen te worden gecodeerd.

Dit moet vóór de evaluatie worden georganiseerd. Er moeten eisen worden gesteld aan de temperatuur van de boter tijdens het vervoer naar de onderzoekruimte (6 °C ± 2 °C).

Wanneer de sensorische evaluatie in een koelhuis wordt uitgevoerd, wordt het monster met een boterboor genomen. Als de sensorische evaluatie op een andere plaats dan het koelhuis wordt uitgevoerd, moet een monster van minstens 500 g worden genomen. Tijdens de evaluatie moet de boter een temperatuur hebben van 12 °C (±2 °C). (NB: in ISO/DIS 22935-2 | IDF 99-2 is de evaluatietemperatuur van boter 14 °C ± 2 °C). Grote afwijkingen moeten tot elke prijs worden vermeden.

8.   BEOORDELING VAN DE WAARDE PER EIGENSCHAP

8.1.   Bij de sensorische evaluatie moeten de volgende drie eigenschappen worden beoordeeld: voorkomen, consistentie en smaak.

Voorkomen betreft de volgende kenmerken: kleur, zichtbare zuiverheid, ontbreken van fysische verontreiniging, ontbreken van schimmelgroei en uniformiteit van de waterdispersie. De waterdispersie wordt onderzocht volgens IDF-norm 112A/1989.

Consistentie betreft de volgende kenmerken: samenhang („body”), textuur en vastheid. De smeerbaarheid kan met fysische methoden worden gemeten als een lidstaat dit wenst om aan de eisen van de consument te voldoen. De Commissie kan besluiten de methoden hiervoor in de toekomst te harmoniseren.

Body is de term die verwijst naar de cohesie van het product zoals het wordt geconsumeerd. Deze wordt normaal gesproken geassocieerd met vastheid en smeerbaarheid en moet in het hele product uniform zijn. Deze eigenschap hangt nauw samen met de textuur en is het vermogen van het product om zijn eigen gewicht te kunnen dragen. De weerstand bij snijden is een indicatie en meting is mogelijk langs mechanische weg en via het mondgevoel en het vingergevoel.

Smaak is het kenmerk dat in de mond wordt waargenomen, voornamelijk door de smaakpapillen van de tong.

Geur is het kenmerk dat door de neus en de reukzin wordt waargenomen.

Bij een significante afwijking van de aanbevolen temperatuur is een betrouwbare evaluatie van de consistentie en de smaak onmogelijk. De temperatuur is van het grootste belang.

De classificatie van boter moet worden uitgesteld als de temperatuur buiten het aanbevolen interval ligt.

8.2.   Elke eigenschap moet apart sensorisch worden geëvalueerd. De punten moeten volgens tabel 1 worden toegekend.

8.3.   Het kan wenselijk zijn dat de beoordelaars, voordat ze aan de beoordeling beginnen, gezamenlijk punten toekennen aan voorkomen, consistentie en smaak van een of meer referentiemonsters teneinde tot uniformiteit te komen.

8.4.   De punten voor goedkeuring van de boter worden als volgt toegekend:

Zie punt 7: Nomenclatuur en beschrijving van de criteria voor punten bij de toekenning.

	Maximaal	Vereist
Voorkomen	5	4
Consistentie	5	4
Smaak/geur	5	4

—	Als de vereiste punten niet worden gehaald, moet een omschrijving van de afwijking worden gegeven.

—	De door iedere beoordelaar per eigenschap toegekende punten moeten in het controledocument worden genoteerd.

—	Het product wordt op grond van een meerderheidsbesluit goed- of afgekeurd.

—	Gevallen waarin verschillen tussen de afzonderlijke punten per eigenschap groter zijn dan 1 punt, mogen niet vaak voorkomen (hoogstens eens per 20 monsters). Als dat wel zo is, dient de panelleider de vaardigheid van het panel te controleren.

9.   TOEZICHT

Een panelleider, die een officiële werknemer van de bevoegde autoriteit moet zijn en lid van het panel mag zijn, is verantwoordelijk voor de hele gang van zaken. Hij of zij moet de individuele punten per eigenschap in het controledocument noteren en vastleggen of het product goed- of afgekeurd is.

10.   NOMENCLATUUR

Zie tabel 2.

11.   REFERENTIES

FIL-IDF 99C:1997 Sensory evaluation of dairy products by scoring — Reference method

ISO/DIS 22935 | IDF 99 Internationale norm voor melk en zuivelproducten — Sensorische analyse — Delen 1-3

ISO 8586-1: Sensorische analyse — Algemene leidraad voor de selectie, training en inspectie van beoordelaars — Deel 1

ISO 8589 Sensorische analyse — Algemene leidraad voor het ontwerp van onderzoekruimtes

FIL-IDF 112A:1989 Butter- Determination of water dispersion value

Tabel 1

Puntenwaardering voor boter

Voorkomen			Consistentie			Smaak + geur
Punten	Nr (1).	Opmerkingen	Punten (kwaliteitsklasse)	Nr (1).	Opmerkingen	Punten (kwaliteitsklasse)	Nr (1).	Opmerkingen
5		Zeer goed ideaal type hoogste kwaliteit (volledig droog)	5		Zeer goed ideaal type hoogste kwaliteit (goed smeerbaar)	5		Zeer goed ideaal type hoogste kwaliteit (absoluut zuivere fijnste smaak)
4		Goed  (2) geen duidelijke afwijkingen	4	17 18	Goed  (2) hard zacht	4		Goed  (2) geen duidelijke afwijkingen
3	1 2 3 4 5 6 7 8	Redelijk (geringe afwijkingen) nat (vrij vocht) niet uniform, twee kleuren streperig gevlekt, gemarmerd vlekkerig olieafscheiding te sterk gekleurd slap, open textuur	3	14 15 16 17 18	Redelijk (geringe afwijkingen) kort, brokkelig, kruimelig deegachtig, vettig kleverig hard zacht	3	21 22 25 27 33 34 35	Redelijk (geringe afwijkingen) onzuiver vreemde smaak zuur kooksmaak, branderig voersmaak ruw, bitter te zout
2	1 3 4 5 6 10 11 12	Slecht (duidelijke afwijkingen) nat (vrij vocht) streperig gevlekt, gemarmerd vlekkerig olieafscheiding vreemde stoffen beschimmeld onopgelost zout	2	14 15 16 17 18	Slecht (duidelijke afwijkingen) kort, brokkelig, kruimelig deegachtig, vettig kleverig hard zacht	2	21 22 23 25 32 33 34 35 36 38	Slecht (duidelijke afwijkingen) onzuiver vreemde smaak muf zuur oxidatiesmaak, metaalsmaak voersmaak ruw, bitter te zout goor, bedorven chemische smaak
1	1 3 4 5 6 7 9 10 11 12	Zeer slecht (grote afwijkingen) nat (vrij vocht) streperig gevlekt, gemarmerd vlekkerig olieafscheiding te sterk gekleurd korrelig vreemde stoffen beschimmeld onopgelost zout	1	14 15 16 17 18	Zeer slecht (grote afwijkingen) kort, brokkelig, kruimelig deegachtig, vettig kleverig hard zacht	1	22 24 25 26 28 29 30 31 32 34 35 36 37 38	Zeer slecht (grote afwijkingen) vreemde smaak kazig, kaasgeur zuur gistachtig schimmelsmaak ranzig olieachtig, visachtig talkachtig oxidatiesmaak, metaalsmaak ruw, bitter te zout goor, bedorven moutachtig chemische smaak

Tabel 2

Tabel van boterafwijkingen

I. Voorkomen

1. nat (vrij vocht)

2. niet uniform, twee kleuren

3. streperig

4. gevlekt, gemarmerd

5. vlekkerig

6. olieafscheiding

7. te sterk gekleurd

8. slap (open textuur)

9. korrelig

10. vreemde stoffen

11. beschimmeld

12. onopgelost zout

II. Consistentie

14. kort, brokkelig, kruimelig

15. deegachtig, vettig

16. kleverig

17. hard

18. zacht

III. Smaak en geur

20. smaakloos

21. onzuiver (3)

22. vreemde smaak

23. muf

24. kazig, kaasgeur

25. zuur

26. gistachtig

27. a) kooksmaak

b) branderig

28. schimmelsmaak

29. ranzig

30. olieachtig, visachtig

31. talkachtig

32. a) oxidatiesmaak

b) metaalsmaak

33. voersmaak

34. ruw, bitter

35. te zout

36. goor, bedorven

37. moutachtig

38. chemische smaak

---

(1)  Zie tabel 2.

(2)  De onder „goed” vermelde afwijkingen zijn slechts zeer geringe afwijkingen van het ideale type.

(3)  Deze aanduiding moet zo weinig mogelijk worden gebruikt en alleen wanneer de afwijking niet nauwkeuriger kan worden beschreven.

BIJLAGE V

(Artikel 5)

BEPALING VAN HET GEHALTE AAN N-HEPTAANZUUR-TRIGLYCERIDE VAN BOTER, BUTTEROIL EN ROOM DOOR GASCHROMATOGRAFISCHE ANALYSE VAN TRIGLYCERIDEN

1.   TOEPASSINGSGEBIED

Dit is een methode voor de bepaling van het gehalte aan n-heptaanzuur-triglyceride van butteroil, boter en room.

2.   TERMINOLOGIE EN DEFINITIE

Gehalte aan n-heptaanzuur: het gehalte aan het triglyceride van n-heptaanzuur, zoals bepaald volgens deze methode.

NB: Het gehalte aan n-heptaanzuur wordt voor butteroil en boter uitgedrukt in kg per ton product en voor room in kg per ton melkvet.

3.   PRINCIPE

Melkvet wordt overeenkomstig ISO 14156|IDF 172:2001 uit de verschillende producten geëxtraheerd. Het gehalte aan n-heptaanzuur-triglyceride in het geëxtraheerde vet wordt met behulp van capillaire gaschromatografie (GC) kwantitatief bepaald. Het resultaat voor het monster wordt aan de hand van capronzuur-triglyceride als interne standaard beoordeeld.

NB: Ook tributyrine blijkt een geschikte interne standaard te zijn.

4.   REAGENTIA

Gebruik alleen reagentia waarvan vaststaat dat ze van analysekwaliteit zijn.

4.1.   n-Hexaan.

4.2.   Standaard capronzuur-triglyceride, ten minste 99 % zuiver.

4.3.   Standaard n-heptaanzuur-triglyceride, ten minste 99 % zuiver.

4.4.   Watervrij natriumsulfaat (Na2SO4).

5.   APPARATUUR

Gangbare laboratoriumapparatuur en met name:

5.1.   Analytische balans, tot op 1 mg nauwkeurig.

5.2.   Maatkolven, 10 ml en 20 ml.

5.3.   Centrifugebuizen, 30 ml.

5.4.   Rotatieverdamper.

5.5.   Droogstoof die op een temperatuur van 50 °C ± 5 °C kan worden gehouden.

5.6.   Filtreerpapier, normale porositeit, diameter ongeveer 15 cm.

Apparatuur voor gaschromatografie.

5.7.1.   Gaschromatograaf met een split/splitless of on-column injector en een vlamionisatiedetector (FID).

GC-kolom met een stationaire fase die met succes voor de scheiding van triglyceriden is gebruikt (100 % dimethylpolysiloxaan of 5 % fenyl- met 95 % methylpolysiloxaan). Kies de stationaire fase, de lengte van de kolom (tussen 4 m en 15 m), de inwendige diameter (tussen 0,22 mm en 0,50 mm) en de laagdikte (0,12 μm of meer) met inachtneming van de ervaringen van het laboratorium en het gebruikte injectiesysteem. In elk geval moet de gekozen kolom zorgen voor een volledige scheiding tussen de oplosmiddelpiek en capronzuur-triglyceride en een basislijnresolutie tussen de pieken van capronzuur- en n-heptaanzuur-triglyceride. Bijvoorbeeld onderstaande omstandigheden kunnen worden gebruikt.

5.7.2.1.   Voorbeeld van de omstandigheden die bij een split-injector kunnen worden gebruikt:

—	Draaggas: helium

—	Kolomdruk (top): 100 kPa

—	Kolom: kwartsglas, lengte 12 m, inwendige diameter 0,5 mm, laagdikte 0,1 μm

—	Stationaire fase: 100 % dimethylpolysiloxaan of 5 % fenyl- en 95 % dimethylpolysiloxaan (bijv. HT5)

—	Kolomtemperatuur: aanvankelijke temperatuur 130 °C gedurende 1 min, met 20 °C/min opgevoerd tot 260 °C en vervolgens met 30 °C/min opgevoerd tot 360 °C; gedurende 10 min op 360 °C houden

—	Detectortemperatuur: 370 °C

—	Injectortemperatuur: 350 °C

—	Splitverhouding 1:30

—	Geïnjecteerde hoeveelheid monster: 1 μl

5.7.2.2.   Voorbeeld van de omstandigheden die bij een on-column injector kunnen worden gebruikt:

—	Draaggas: waterstof (constant debiet)

—	Kolomdruk (top): 89 kPa

—	Kolom: kwartsglas, lengte 4 m, inwendige diameter 0,32 mm, laagdikte 0,25 μm

—	Stationaire fase: 5 % fenyl- en 95 % dimethylpolysiloxaan

—	Kolomtemperatuur: aanvankelijke temperatuur 60 °C gedurende 2 min, met 35 °C/min opgevoerd tot 340 °C; gedurende 5 min op deze temperatuur houden

—	Detectortemperatuur: 350 °C

—	Geïnjecteerde hoeveelheid monster: 1 μl

5.8.   Injectiespuit, 5 μl.

6.   MONSTERNEMING

Het is belangrijk dat het laboratorium een monster ontvangt dat echt representatief is en niet tijdens het vervoer of de opslag is beschadigd of gewijzigd.

De monsterneming is niet in de in deze bijlage gespecificeerde methode opgenomen. Zie voor een aanbevolen monsternemingsmethode de norm IDF 50C:1995 of ISO 707-1997 — Melk en zuivelproducten — Leidraad voor monsterneming.

7.   PROCEDURE

7.1.   Voorbehandeling van het monster en de analysehoeveelheid

Zie ISO 14156 | IDF 172:2001.

7.1.1.   Butteroil, Boter

7.1.1.1.   Smelt 50-100 g monster in de droogstoof (5.5).

7.1.1.2.   Weeg 0,5-1,0 g watervrij natriumsulfaat (4.4) af in een vouwfilter.

7.1.1.3.   Filtreer het vet over het filter met watervrij natriumsulfaat en vang het filtraat op in een in de droogstoof (5.5) geplaatst bekerglas. Let op dat er bij het overschenken van de gesmolten boter op het filter geen serum wordt overgebracht.

7.1.2.   Room

7.1.2.1.   Breng het monster op een temperatuur van 20 °C ± 2 °C.

7.1.2.2.   Meng of roer het monster grondig.

7.1.2.3.   Verdun een zodanige hoeveelheid monster dat een analysehoeveelheid van 100 ml wordt verkregen met ongeveer 4 % m/m vet.

7.1.2.4.   Volg de procedure voor rauwe melk en gehomogeniseerde melk (zie ISO 14156 | IDF 172:2001, §8.3) om het vet uit de room te extraheren.

7.1.2.5.   Weeg in een maatkolf van 10 ml (5.2) tot op 1 mg nauwkeurig 1 g geëxtraheerd vet af. Voeg 1 ml van oplossing 7.2.2 toe. Vul met n-hexaan (4.1) aan tot 10 ml en meng.

7.1.2.6.   Breng 1 ml van oplossing 7.1.1.2 in een maatkolf van 10 ml (5.2) en verdun met n-hexaan (4.1) aan tot 10 ml.

7.2.   Bereiding van de kalibratiestandaards

7.2.1.   Los 100 mg n-heptaanzuur-triglyceride (4.3) op in 10 ml n-hexaan (4.1).

7.2.2.   Los 100 mg capronzuur-triglyceride (4.2) op in 10 ml n-hexaan (4.1).

7.2.3.   Breng 1 ml van oplossing 7.2.2 in een maatkolf van 10 ml (5.2). Vul met n-hexaan (4.1) aan tot 10 ml.

7.2.4.   Breng 1 ml van oplossing 7.2.1 en 1 ml van oplossing 7.2.2 in een maatkolf van 10 ml (5.2). Vul met n-hexaan (4.1) aan tot 10 ml.

7.2.5.   Breng 1 ml van oplossing 7.2.4 in een maatkolf van 10 ml (5.2). Vul met n-hexaan (4.1) aan tot 10 ml.

7.3.   Chromatografische bepaling

7.3.1.   Injecteer twee maal 1 μl van standaardoplossing 7.2.5.

7.3.2.   Injecteer 1 μl van elke monsteroplossing.

NB: Als een on-column injector wordt gebruikt, moeten zowel de standaard- als de monsteroplossingen verder worden verdund.

7.3.3.   Herhaal 7.3.1 om de drie monsters, zodat de monsters worden gegroepeerd tussen duplo-standaardinjecties. De resultaten worden gebaseerd op het rekenkundig gemiddelde van de responsfactoren uit de standaard-chromatogrammen.

8.   BEREKENING VAN DE RESULTATEN

Integreer bij elk chromatogram het piekoppervlak voor de triglyceriden van n-heptaanzuur en capronzuur.

Volg deze instructies voor elke groep, d.w.z. voor elke verzameling gegroepeerde monsters. De vlak daarvoor tweemaal geïnjecteerde standaard is STD1 en de vlak daarna tweemaal geïnjecteerde standaard is STD2.

8.1.   Kalibratie

8.1.1.   Bereken de responsfactor voor elke duplo van STD1, Rf1(a) en Rf1(b)

Rf1(a) of Rf1(b) = (Piekoppervlak voor capronzuur-triglyceride/Piekoppervlak voor n-heptaanzuur-triglyceride) × 100

Bereken het rekenkundig gemiddelde van de responsfactor Rf1:

Rf1 = (Rf1(a) + Rf1(b)) / 2

8.1.2.   Bereken evenzo het rekenkundig gemiddelde van de responsfactor STD2 en Rf2

8.1.3.   Bereken het rekenkundig gemiddelde van de responsfactor Rf

Rf = (Rf1 + Rf2) /2

8.2.   Monsters

Bereken voor elk monster-chromatogram tussen STD1 en STD2 het n-heptaanzuurgehalte C (kg/t):

C = (Piekoppervlak voor n-heptaanzuur-triglyceride × Rf × 100)/(Piekoppervlak voor capronzuur-triglyceride × Wt × 1 000)

Hierbij is:

—	Wt = Gewicht van het afgewogen vet (g);

—	100 = verdunningsvolume voor het monster;

—	1 000 = omrekeningsfactor (van μg/g naar kg/ton).

Houd bij botermonsters rekening met het vetgehalte van de boter en bereken een gecorrigeerde concentratie Cboter (kg/ton boter)

Cboter = Cvet × F

Hierbij is F het vetgehalte van de boter.

9.   PRECISIE

Zie punt 12 voor de details over de methode voor de precisieberekening bij een ringonderzoek met boter volgens ISO 5725-1 en ISO 5725-2.

De waarden voor de herhaalbaarheids- en reproduceerbaarheidsgrens zijn voor het 95 %-betrouwbaarheidsniveau en mogen niet op andere dan de vermelde concentratiebereiken en matrices worden toegepast.

9.1.   Herhaalbaarheid

Het absolute verschil tussen twee aparte testresultaten die binnen korte tijd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur in hetzelfde laboratorium met dezelfde methode en identiek testmateriaal worden verkregen, mag in niet meer dan 5 % van de gevallen groter zijn dan 0,35 kg/t.

9.2.   Reproduceerbaarheid

Het absolute verschil tussen twee aparte testresultaten die door verschillende personen met verschillende apparatuur in verschillende laboratoria met dezelfde methode en identiek testmateriaal worden verkregen, mag in niet meer dan 5 % van de gevallen groter zijn dan 0,66 kg/t.

10.   TOLERANTIEGRENZEN: ONDERGRENZEN (ONVOLDOENDE HOEVEELHEDEN)

10.1.   Er moeten drie monsters van het product met de verklikstof worden genomen om te controleren of de toevoeging van de verklikstof correct is gebeurd.

10.2.   Boter en boterconcentraat

10.2.1.   De toe te voegen hoeveelheid bedraagt 11 kg ten minste 95 % zuiver n-heptaanzuur-triglyceride per ton boter, d.w.z. 10,45 kg/t.

10.2.2.   De resultaten voor de drie monsters die bij de analyse van het product worden verkregen, worden gebruikt om te controleren of de verklikstof in de juiste hoeveelheid en voldoende homogeen is toegevoegd en het laagste van deze resultaten wordt met de volgende grenswaarden vergeleken:

—	9,51 kg/t (95 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid 95 % zuiver n-heptaanzuur-triglyceride, één bepaling);

—	6,89 kg/t (70 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid 95 % zuiver n-heptaanzuur-triglyceride, één bepaling);

—	De concentratie van de verklikstof in het monster met het laagste resultaat wordt in combinatie met interpolatie tussen 9,51 kg/t en 6,89 kg/t gebruikt.

10.3.   Room

10.3.1.   De toe te voegen hoeveelheid bedraagt 10 kg ten minste 95 % zuiver n-heptaanzuur-triglyceride per ton melkvet, d.w.z. 9,50 kg/t melkvet met verklikstof

10.3.2.   De resultaten voor de drie monsters die bij de analyse van het product worden verkregen, worden gebruikt om te controleren of de verklikstof in de juiste hoeveelheid en voldoende homogeen is toegevoegd en het laagste van deze resultaten wordt met de volgende grenswaarden vergeleken:

—	8,60 kg/t (95 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid 95 % zuiver n-heptaanzuur-triglyceride, één bepaling);

—	6,23 kg/t (70 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid 95 % zuiver n-heptaanzuur-triglyceride, één bepaling).

—	De concentratie van de verklikstof in het monster met het laagste resultaat wordt in combinatie met interpolatie tussen 8,60 kg/t en 6,23 kg/t gebruikt.

11.   TOLERANTIEGRENZEN: BOVENGRENZEN (HOEVEELHEDEN DIE MEER DAN 20 % TE GROOT ZIJN)

11.1.   Er moeten drie monsters van het product met de verklikstof worden genomen om te controleren of de toevoeging van de verklikstof correct is gebeurd.

11.2.   Boter en boterconcentraat

11.2.1.   De resultaten voor de drie monsters die bij de analyse van het product worden verkregen, worden gebruikt om te controleren of de verklikstof in de juiste hoeveelheid en voldoende homogeen is toegevoegd en het gemiddelde van deze resultaten wordt met de volgende grenswaarde vergeleken:

—	De bovengrens is 12,96 kg/t.

11.3.   Room

11.3.1.   De resultaten voor de drie monsters die bij de analyse van het product worden verkregen, worden gebruikt om te controleren of de verklikstof in de juiste hoeveelheid en voldoende homogeen is toegevoegd en het gemiddelde van deze resultaten wordt met de volgende grenswaarde vergeleken:

—	De bovengrens is 11,82 kg/t.

12.   AANVULLENDE INFORMATIE: STATISTISCHE ANALYSE VAN DE RESULTATEN VAN DE BEPALING VAN TRIHEPTANOAAT IN BOTERVET MET BEHULP VAN TRIGLYCERIDE-ANALYSE

Er zijn vier ringonderzoeken uitgevoerd voor de bepaling van het triheptanoaatgehalte van boter met verklikstof.

Aan het eerste ringonderzoek hebben negen laboratoria deelgenomen en er zijn geen specificaties vermeld over de gebruikte analysemethoden.

Aan het tweede ringonderzoek hebben tien laboratoria deelgenomen en daarbij zijn vier verschillende methoden gebruikt:

—	Kwantitatieve bepaling van methylheptanoaat met behulp van n-nonaan of methylnonanoaat als interne standaard;

—	Kwantitatieve bepaling van triheptanoaat met behulp van tricaproaat als interne standaard;

—	Kwantitatieve bepaling van methylheptanoaat met behulp van een kalibratiemonster/mengsel;

—	Kwantitatieve bepaling van methylheptanoaat met behulp van een kalibratiemengsel.

Bij de analyse van methylvetzuren (FAME) werden bovendien twee verschillende methyleringsprocedures gebruikt (De Francesco en Christopherson & Glass).

Gelet op de verkregen resultaten werden voor de uitvoering van het derde ringonderzoek twee methoden gekozen:

—	Kwantitatieve bepaling van methylheptanoaat met behulp van n-nonaan of methylnonanoaat als interne standaard;

—	Kwantitatieve bepaling van triheptanoaat met behulp van tricaproaat als interne standaard.

Uit de resultaten van de zeven laboratoria blijkt dat de FAME-methode een hogere variabiliteit oplevert en daarom werd besloten alleen de bepaling van triheptanoaat als triglyceride te gebruiken volgens de methode voor de kwantitatieve bepaling van triheptanoaat met behulp van tricaproaat als interne standaard. Daarnaast moet de triglyceride-analyse met behulp van een capillaire kolom worden uitgevoerd.

Bij het vierde ringonderzoek werden vier monsters (A, B, C en D) door negen laboratoria geanalyseerd (zie de tabellen 1 en 2).

Twee laboratoria (DE en EU) hebben de monsters met behulp van de FAME-methode geanalyseerd.

Vanwege het beperkte aantal laboratoria is de statistische berekening zowel bij het volledige gegevenspakket (figuren 1 en 2) mèt de FAME-resultaten als bij de gegevens van de TG-analyse uitgevoerd.

Tests op uitbijters:

—	monster A: bij de Dixon-, Cochran- en Grubbs-toets op niveaus 1 en 5 % bleek één laboratorium uitbijter te zijn.

—	monster B: bij de Grubbs-toets op niveau 5 % bleek één laboratorium uitbijter te zijn.

—	monster C: bij de Dixon- en Grubbs-toets op niveaus 1 en 5 % bleek één laboratorium uitbijter te zijn.

—	monster D: bij de Dixon- en Grubbs-toets op niveaus 1 en 5 % bleek één laboratorium uitbijter te zijn.

De uitbijter is niet in de berekening meegenomen.

Vermeldenswaardig is dat de resultaten van de FAME-methode met de gebruikte toetsen nooit als uitbijter werden aangemerkt.

Precisieparameters

De tabellen 1 en 2 bevatten de resultaten van alle laboratoria en de precisieparameters, berekend met een aanvaardbaar aantal (8) laboratoria maar helaas niet afkomstig van dezelfde analysemethode.

De tabellen 3 en 4 bevatten de resultaten van uitsluitend de TG-methode en de bijbehorende precisieparameters. Deze parameters zijn alleen aanvaardbaar als het geringe aantal laboratoria (6) aanvaardbaar is.

De figuren 2 en 3 tonen de trend van Sr en SR, berekend met de vier monsters van bovengenoemde twee gegevensverzamelingen.

Tabel 5 bevat de Sr- en SR-waarden met de bijbehorende gecombineerde waarden en de totale r- en R-parameters.

Ten slotte is het kritieke verschil bij het 95 %-waarschijnlijkheidsniveau (KrD95) berekend.

Tabel 1:

Statistische resultaten van de methoden TG + FAME*

Monster A		R1	R2	Gem.	Aantal laboratoria na eliminatie uitbijters	8
RENNES	FR1	11,0	11,1	11,1	Aantal uitbijters	1
RIKILT	NL	11,2	11,2	11,2	Uitbijters	DК
ZPLA	DE*	11,6	11,8	11,7	Gemiddelde waarde	11,3
ADAS	GB	11,4	11,2	11,3	Werkelijke waarde	11,0
CNEVA	FR2	11,4	11,4	11,4	Standaarddeviatie herhaalbaarheid (Sr)	0,09
LODI	IT	11,1	11,3	11,2	Relatieve sd herhaalbaarheid (RSDr%)	0,80
EELA	FI	11,3	11,2	11,3	Herhaalbaarheid r (95 %)	0,26
ISPRA	EU*	11,0	11,0	11,0	Relatieve herhaalbaarheid r %	2,24
D.V.F.A.	DK	13,3	11,8	12,6	Standaarddeviatie reproduceerbaarheid (SR)	0,23
					Relatieve sd reproduceerbaarheid (RSDR%)	2,04
					Reproduceerbaarheid R (95 %)	0,84
					Relatieve reproduceerbaarheid R %	5,71
Monster B		R1	R2	Gem.	Aantal laboratoria na eliminatie uitbijters	8
RENNES	FR1	12,7	12,8	12,8	Aantal uitbijters	1
RIKILT	NL	13,5	13,3	13,4	Uitbijters	DK
ZPLA	DE*	14,0	13,8	13,9	Gemiddelde waarde	13,4
ADAS	GB	13,4	13,5	13,5	Werkelijke waarde	13,5
CNEVA	FR2	13,3	13,4	13,4	Standaarddeviatie herhaalbaarheid (Sr)	0,14
LODI	IT	13,9	13,5	13,7	Relatieve sd herhaalbaarheid (RSDr%)	1,04
EELA	FI	13,4	13,2	13,3	Herhaalbaarheid r (95 %)	0,40
ISPRA	EU*	13,2	13,3	13,3	Relatieve herhaalbaarheid r %	2,91
D.V.F.A.	DK	14,1	14,8	14,5	Standaarddeviatie reproduceerbaarheid (SR)	0,35
					Relatieve sd reproduceerbaarheid (RSDR%)	2,61
					Reproduceerbaarheid R (95 %)	0,99
					Relatieve reproduceerbaarheid R %	7,31

Tabel 2:

Statistische resultaten van de methoden TG + FAME*

Monster C		R1	R2	Gem.	Aantal laboratoria na eliminatie uitbijters	8
RENNES	FR1	8,9	9,2	9,1	Aantal uitbijters	1
RIKILT	NL	9,2	9,3	9,3	Uitbijters	DK
ZPLA	DE*	9,2	9,4	9,3	Gemiddelde waarde	9,3
ADAS	GB	9,5	9,3	9,4	Werkelijke waarde	9,3
CNEVA	FR2	9,4	9,4	9,4	Standaarddeviatie herhaalbaarheid (Sr)	0,14
LODI	IT	9,2	9,5	9,4	Relatieve sd herhaalbaarheid (RSDr%)	1,50
EELA	FI	9,4	9,6	9,5	Herhaalbaarheid r (95 %)	0,40
ISPRA	EU*	9,4	9,3	9,4	Relatieve herhaalbaarheid r %	4,20
D.V.F.A.	DK	10,7	10,9	10,8	Standaarddeviatie reproduceerbaarheid (SR)	0,17
					Relatieve sd reproduceerbaarheid (RSDR%)	1,82
					Reproduceerbaarheid R (95 %)	0,47
					Relatieve reproduceerbaarheid R %	5,10
Monster D		R1	R2	Gem.	Aantal laboratoria na eliminatie uitbijters	8
RENNES	FR1	1,6	1,6	1,6	Aantal uitbijters	1
RIKILT	NL	2,1	2,1	2,1	Uitbijters	DK
ZPLA	DE*	2,3	2,3	2,3	Gemiddelde waarde	2,1
ADAS	GB	2,1	2,2	2,2	Werkelijke waarde	2,1
CNEVA	FR2	2,1	2,1	2,1	Standaarddeviatie herhaalbaarheid (Sr)	0,08
LODI	IT	2,2	1,9	2,1	Relatieve sd herhaalbaarheid (RSDr%)	3,81
EELA	FI	2,3	2,3	2,3	Herhaalbaarheid r (95 %)	0,22
ISPRA	EU*	2,3	2,3	2,3	Relatieve herhaalbaarheid r %	10,67
D.V.F.A.	DK	3,4	2,9	3,2	Standaarddeviatie reproduceerbaarheid (SR)	0,24
					Relatieve sd reproduceerbaarheid (RSDR%)	11,43
					Reproduceerbaarheid R (95 %)	0,67
					Relatieve reproduceerbaarheid R %	32,00

Tabel 3:

Statistische resultaten van de methoden TG + FAME*

Monster A		R1	R2	Gem.	Aantal laboratoria na eliminatie uitbijters	6
RENNES	FR1	11,0	11,1	11,1	Aantal uitbijters	1
RIKILT	NL	11,2	11,2	11,2	Uitbijters	DК
ADAS	GB	11,4	11,2	11,3	Gemiddelde waarde	11,2
CNEVA	FR2	11,4	11,4	11,4	Werkelijke waarde	11,0
LODI	IT	11,1	11,3	11,2	Standaarddeviatie herhaalbaarheid (Sr)	0,09
EELA	FI	11,3	11,2	11,3	Relatieve sd herhaalbaarheid (RSDr%)	0,80
D.V.F.A.	DK	13,3	11,8	12,6	Herhaalbaarheid r (95 %)	0,25
					Relatieve herhaalbaarheid r %	2,24
					Standaarddeviatie reproduceerbaarheid (SR)	0,13
					Relatieve sd reproduceerbaarheid (RSDR%)	1,16
					Reproduceerbaarheid R (95 %)	0,36
					Relatieve reproduceerbaarheid R %	3,25
Monster B		R1	R2	Gem.	Aantal laboratoria na eliminatie uitbijters	6
RENNES	FR1	12,7	12,8	12,8	Aantal uitbijters	1
RIKILT	NL	13,5	13,3	13,4	Uitbijters	DК
ADAS	GB	13,4	13,5	13,5	Gemiddelde waarde	13,3
CNEVA	FR2	13,3	13,4	13,4	Werkelijke waarde	13,5
LODI	IT	13,9	13,5	13,7	Standaarddeviatie herhaalbaarheid (Sr)	0,15
EELA	FI	13,4	13,2	13,3	Relatieve sd herhaalbaarheid (RSDr%)	1,13
D.V.F.A.	DK	14,1	14,8	14,5	Herhaalbaarheid r (95 %)	0,42
					Relatieve herhaalbaarheid r %	3,16
					Standaarddeviatie reproduceerbaarheid (SR)	0,33
					Relatieve sd reproduceerbaarheid (RSDR%)	2,48
					Reproduceerbaarheid R (95 %)	0,93
					Relatieve reproduceerbaarheid R %	6,94

Tabel 4:

Statistische resultaten van de TG-methode

Monster C		R1	R2	Gem.	Aantal laboratoria na eliminatie uitbijters	6
RENNES	FR1	8,9	9,2	9,1	Aantal uitbijters	1
RIKILT	NL	9,2	9,3	9,3	Uitbijters	DК
ADAS	GB	9,5	9,3	9,4	Gemiddelde waarde	9,3
CNEVA	FR2	9,4	9,4	9,4	Werkelijke waarde	9,3
LODI	IT	9,2	9,5	9,4	Standaarddeviatie herhaalbaarheid (Sr)	0,15
EELA	FI	9,4	9,6	9,5	Relatieve sd herhaalbaarheid (RSDr%)	1,61
D.V.F.A.	DK	10,7	10,9	10,8	Herhaalbaarheid r (95 %)	0,42
					Relatieve herhaalbaarheid r %	4,51
					Standaarddeviatie reproduceerbaarheid (SR)	0,19
					Relatieve sd reproduceerbaarheid (RSDR%)	2,04
					Reproduceerbaarheid R (95 %)	0,53
					Relatieve reproduceerbaarheid R %	5,71
Monster D		R1	R2	Gem.	Aantal laboratoria na eliminatie uitbijters	6
RENNES	FR1	1,6	1,6	1,6	Aantal uitbijters	1
RIKILT	NL	2,1	2,1	2,1	Uitbijters	DК
					Gemiddelde waarde	2,1
ADAS	GB	2,1	2,2	2,2	Werkelijke waarde	2,1
CNEVA	FR2	2,1	2,1	2,1	Standaarddeviatie herhaalbaarheid (Sr)	0,09
LODI	IT	2,2	1,9	2,1	Relatieve sd herhaalbaarheid (RSDr%)	4,29
EELA	FI	2,3	2,3	2,3	Herhaalbaarheid r (95 %)	0,26
D.V.F.A.	DK	3,4	2,9	3,2	Relatieve herhaalbaarheid r %	12,01
					Standaarddeviatie reproduceerbaarheid (SR)	0,25
					Relatieve sd reproduceerbaarheid (RSDR%)	11,90
					Reproduceerbaarheid R (95 %)	0,69
					Relatieve reproduceerbaarheid R %	33,32

Tabel 5

Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid (met FAME*)

	Aantal labs	Uitbijters	Herhaalbaarheid Sr (95 %)	Reproduceerbaarheid SR (95 %)
Monster A	8	1	0,09	0,23
Monster Β	8	1	0,14	0,35
Monster C	8	1	0,14	0,17
Monster D	8	1	0,08	0,24
Gecombineerde waarde			0,116	0,256
			R	R
Gecombineerde waarde * 2,8			0,324	0,716
KrD95 = 0,40 Voor triheptanoaat vermelde minimale zuiverheid = 95 % Voor triheptanoaat in botervet vermelde minimale grenswaarde = 11 kg/t Rekening houdend met het kritieke verschil bij het 95 %-waarschijnlijkheidsniveau mag het gemiddelde van de twee resultaten niet lager zijn dan:   bij toevoeging van 95 % zuiver triheptanoaat: 10,05 kg/t.

Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid (zonder FAME*)

	Aantal labs	Uitbijters	Herhaalbaarheid Sr (95 %)	Reproduceerbaarheid SR (95 %)
Monster A	6	1	0,09	0,13
Monster Β	6	1	0,15	0,33
Monster C	6	1	0,15	0,19
Monster D	6	1	0,09	0,25
Gecombineerde waarde			0,124	0,237
			r	R
Gecombineerde waarde * 2,8			0,347	0,663
KrD95 = 0,36 Voor triheptanoaat vermelde minimale zuiverheid = 95 % Voor triheptanoaat in botervet vermelde minimale grenswaarde = 11 kg/t Rekening houdend met het kritieke verschil bij het 95 %-waarschijnlijkheidsniveau mag het gemiddelde van de twee resultaten niet lager zijn dan:   bij toevoeging van 95 % zuiver triheptanoaat: 10,09 kg/t

Figuur 1 (1)

Experimentele resultaten: monster A

Experimentele resultaten: monster B

Experimentele resultaten: monster C

Experimentele resultaten: monster D

Figuur 2

Standaarddeviatie herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid bij verschillende niveau's (TG + FAME)

Figuur 3

Standaarddeviatie herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid bij verschillende niveau's (TG)

Figuur 4

Voorbeeld met een on-column injector

---

(1)  = FAME-methode

BIJLAGE VI

(Artikel 5)

BEPALING VAN HET VANILLINEGEHALTE VAN BOTERCONCENTRAAT, BOTER OF ROOM MET BEHULP VAN HOGEDRUKVLOEISTOFCHROMATOGRAFIE (HPLC)

1.   DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED

In deze methode wordt een werkwijze beschreven voor de kwantitatieve bepaling van vanilline in boterconcentraat, boter of room.

2.   PRINCIPE

Een bekende hoeveelheid monster wordt met een mengsel van isopropanol/ethanol/acetonitril (1:1:2) geëxtraheerd. Het grootste gedeelte van het vet wordt neergeslagen door af te koelen tot een temperatuur tussen –15 en –20 °C en vervolgens te centrifugeren.

Na verdunnen met water wordt het vanillinegehalte met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) bepaald.

3.   APPARATUUR

Gangbare laboratoriumapparatuur en met name:

3.1.   Diepvriezer met een temperatuurbereik van –15 °C tot –20 °C.

3.2.   Wegwerpinjectiespuiten, 2 ml.

3.3.   Membraanmicrofilters met een poriegrootte van 0,45 μm en bestand tegen een oplossing met 5 % extractievloeistof (4.4).

3.4.   Vloeistofchromatografiesysteem, bestaande uit een pomp (stroomsnelheid 1,0 ml/min), een injector (20 μl injectie, automatisch of manueel), een UV-detector (ingesteld op 306 nm, 0,01 Å volle schaaluitslag), een recorder of integrator en een kolomthermostaat, ingesteld op 25 °C.

3.5.   Analysekolom (250 mm × 4,6 mm ID), gepakt met LiChrospher RP 18 (Merck, 5 μm) of gelijkwaardig.

3.6.   Voorkolom (ongeveer 20 mm × 3 mm ID), droog gepakt met LiChrospher RP 18 (5-10 μm) of gelijkwaardig.

3.7.   Centrifuge, 2 000 rpm.

4.   REAGENTIA

Alle gebruikte reagentia moeten van analysekwaliteit zijn.

4.1.   Isopropanol

4.2.   Ethanol 96 % (v/v)

4.3.   Acetonitril

4.4.   Extractievloeistof

Meng isopropanol (4.1), ethanol (4.2) en acetonitril (4.3) in de verhouding 1:1:2 (v/v).

Vanilline (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde) ≥ 98 %

4.5.1.   Stamoplossing vanilline (= 500 μg/ml)

Weeg tot op 0,1 mg nauwkeurig ongeveer 50 mg (CM mg) vanilline (4.5) af in een maatkolf van 100 ml; voeg 25 ml extractievloeistof (4.4) toe en vul aan met water.

4.5.2.   Standaardoplossing vanilline (= 10 μg/ml)

Pipetteer 5 ml van de stamoplossing vanilline (4.5.1) in een maatkolf van 250 ml en vul aan met water.

4.5.3.   Methanol, HPLC-kwaliteit

4.5.4.   IJsazijn

4.5.5.   Water, HPLC-kwaliteit

4.5.6.   Mobiele fase HPLC

Meng 300 ml methanol (4.5.3), ongeveer 500 ml water (4.5.5) en 20 ml ijsazijn (4.5.4) in een maatkolf van 1 000 ml en vul aan met water (4.5.5). Filtreer over een filter van 0,45 μm (3.3).

5.   PROCEDURE

5.1.   Voorbehandeling van het monster

5.1.1.   Boter

Verwarm het monster totdat dit begint te smelten. Vermijd plaatselijke oververhitting bij ongeveer 30 °C. De boter mag hoe dan ook niet in twee fasen scheiden. Homogeniseer het monster, wanneer het zacht genoeg is, door het te schudden. Roer de boter 15 s voordat er een testmonster wordt genomen. Weeg tot op 1 mg nauwkeurig ongeveer 5 g (SM g) boter af in een maatkolf van 100 ml.

5.1.2.   Boterconcentraat

Plaats vlak voor de monsterneming de verpakking met boterconcentraat in een oven van 40-50 °C totdat het product volledig is gesmolten. Meng het monster door zwenken of roeren, maar voorkom dat luchtbellen ontstaan doordat te hard wordt geroerd. Weeg tot op 1 mg nauwkeurig ongeveer 4 g (SM g) boterconcentraat af in een maatkolf van 100 ml.

5.1.3.   Room

Verwarm het monster in een waterbad of droogstoof bij een temperatuur van 35-40 °C. Verdeel het vet homogeen door zwenken en, indien nodig, door roeren. Koel het monster snel af tot 20 ± 2 °C. Het monster moet er homogeen uitzien, anders moet de werkwijze worden herhaald. Weeg tot op 1 mg nauwkeurig ongeveer 10 g (SM g) room af in een maatkolf van 100 ml.

5.2.   Bereiding van de testoplossing

Voeg ongeveer 75 ml extractievloeistof (4.4) toe aan het testmonster (5.1.1, 5.1.2 of 5.1.3), roer of schud krachtig gedurende ongeveer 15 minuten en vul aan met extractievloeistof (4.4). Breng ongeveer 10 ml van dit extract over in een reageerbuis, die afgesloten wordt met een stop. Plaats de reageerbuis ongeveer 30 minuten in de diepvriezer (3.1). Centrifugeer het koude extract gedurende 5 minuten bij ongeveer 2 000 rpm en decanteer onmiddellijk. Laat de gedecanteerde oplossing op kamertemperatuur komen. Pipetteer 5 ml van de gedecanteerde oplossing in een maatkolf van 100 ml en vul aan met water. Filtreer een hoeveelheid met een injectiespuit (3.2) door een membraanmicrofilter (3.3). Het filtraat is gereed voor de bepaling met behulp van HPLC.

5.3.   Kalibratie

Pipetteer 5 ml van de standaardoplossing vanilline (4.5.2) in een maatkolf van 100 ml. Voeg 5 ml extractievloeistof (4.4) toe en vul met water aan tot de maatstreep. Deze oplossing bevat 0,5 μg vanilline/ml.

5.4.   Bepaling met behulp van HPLC

Laat het chromatografiesysteem ongeveer 30 minuten stabiliseren. Injecteer de standaardoplossing (5.3). Herhaal dit totdat het verschil in piekoppervlakte of piekhoogte tussen twee opeenvolgende injecties kleiner is dan 2 %. Onder de beschreven omstandigheden bedraagt de retentietijd van vanilline ongeveer 9 minuten. Analyseer de standaardoplossing (5.3) in duplo door injectie van 20 μl. Injecteer 20 μl van de testoplossingen (5.2). Bepaal het oppervlak of de hoogte van de vanillinepiek. Herhaal de duplobepaling van de standaardoplossing (5.3) na tien injecties van de testoplossingen (5.2).

6.   BEREKENING VAN DE RESULTATEN

Bereken het gemiddelde oppervlak (of de gemiddelde hoogte) (AC) van de vanillinepieken die horen bij de duplo-injecties van de standaardoplossingen vóór en na iedere reeks testoplossingen (vier piekoppervlakken of piekhoogtes in totaal).

Bereken de responsfactor (R):

Hierbij is CM de massa vanilline in mg (4.5.1).

Het gehalte (mg/kg) aan vanilline (C) van het testmonster is:

Hierbij is:

AS	=	het oppervlak of de hoogte van de vanillinepiek van het testmonster
SM	=	de massa van het testmonster in g (5.1.1, 5.1.2 of 5.1.3)

NB: Bij analyse van vanilline in room moet de concentratie van de verklikstof worden uitgedrukt in mg verklikstof/kg melkvet. Hiertoe wordt C vermenigvuldigd met 100/f, waarbij f het vetgehalte van de room in procent m/m is.

20	=	de verdunningsfactor van de standaard en het testmonster
0,96	=	de correctiefactor voor het vetgehalte van de eerste verdunning van het testmonster

NB: In plaats van het piekoppervlak kan de piekhoogte worden gebruikt (zie punt 8.3).

7.   NAUWKEURIGHEID VAN DE METHODE

7.1.   Herhaalbaarheid (r)

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die binnen een zo kort mogelijke tijd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op identiek testmateriaal zijn uitgevoerd, mag niet groter zijn dan 16 mg/kg.

7.2.   Reproduceerbaarheid (R)

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die door verschillende personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur op identiek testmateriaal zijn uitgevoerd, mag niet groter zijn dan 27 mg/kg.

8.   TOLERANTIEGRENZEN

8.1.   Voor de controle op een homogene verdeling van de verklikstof moeten drie monsters van het product worden genomen.

Uit vanille of synthetische vanilline vervaardigde verklikstof

8.2.1.   De toe te voegen hoeveelheid voor 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde is 250 g per ton boterconcentraat of boter. Voor room is de toe te voegen hoeveelheid 250 g per ton melkvet.

8.2.2.   De resultaten voor de drie monsters die bij de analyse van het product worden verkregen, worden gebruikt om te controleren of de verklikstof in de juiste hoeveelheid en voldoende homogeen is toegevoegd en het laagste van deze resultaten wordt met de volgende grenswaarden vergeleken:

—	220,8 mg/kg (95 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid);

—	158,3 mg/kg (70 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid).

De concentratie van de verklikstof in het monster met het laagste resultaat wordt in combinatie met interpolatie tussen 220,8 mg/kg en 158,3 mg/kg gebruikt.

Uitsluitend uit vanillepeulen of integrale extracten daarvan vervaardigde verklikstof:

8.3.1.   De toe te voegen hoeveelheid voor 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde is 100 g per ton boterconcentraat of boter. Voor room is de toe te voegen hoeveelheid 100 g per ton melkvet.

8.3.2.   De resultaten voor de drie monsters die bij de analyse van het product worden verkregen, worden gebruikt om te controleren of de verklikstof in de juiste hoeveelheid en voldoende homogeen is toegevoegd en het laagste van deze resultaten wordt met de volgende grenswaarden vergeleken:

—	78,3 mg/kg (95 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid);

—	53,3 mg/kg (70 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid).

De concentratie van de verklikstof in het monster met het laagste resultaat wordt in combinatie met interpolatie tussen 78,3 mg/kg en 53,3 mg/kg gebruikt.

9.   OPMERKINGEN

9.1.   De recovery van toegevoegd vanilline bij een gehalte van 250 mg/kg butteroil varieert van 97,0 tot 103,8 %. Het gemiddelde gehalte dat gevonden werd, bedroeg 99,9 % met een standaarddeviatie van 2,7 %.

9.2.   De standaardoplossing bevat 5 % extractievloeistof ter compensatie van de piekverbreding als gevolg van de aanwezigheid van 5 % extractievloeistof in de testoplossing. Hierdoor is kwantificering met behulp van de piekhoogte mogelijk.

9.3.   De analyse is gebaseerd op een lineaire kalibratiecurve door de oorsprong.

9.4.   Met behulp van geschikte verdunningen van de standaardoplossing (4.5.2) moet de lineariteit de eerste keer dat de analyse wordt uitgevoerd en vervolgens met regelmatige tussenpozen en na veranderingen in of herstel van de HPLC-apparatuur worden gecontroleerd. Vanilline kan door enzymen in ongepasteuriseerde room of producten daarvan worden afgebroken tot vanillinezuur, divanilline en andere verbindingen.

BIJLAGE VII

(Artikel 5)

BEPALING VAN DE ETHYLESTER VAN BETA-APO-8'-CAROTEENZUUR IN BOTERCONCENTRAAT EN BOTER MET BEHULP VAN SPECTROMETRIE

1.   DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED

In deze methode wordt een werkwijze beschreven voor de kwantitatieve bepaling van de ethylester van beta-apo-8'-caroteenzuur (apocaroteenzuurester) in boterconcentraat en boter. Onder apocaroteenzuurester wordt verstaan de totale hoeveelheid van alle stoffen in een extract van monsters, verkregen op de in de methode beschreven wijze, die bij 440 nm licht absorberen.

2.   PRINCIPE

Het botervet wordt opgelost in petroleumether en vervolgens wordt de absorptie bij 440 nm gemeten. Het gehalte aan apocaroteenzuurester wordt met behulp van een externe standaard bepaald.

3.   APPARATUUR

3.1.   Meetpipetten, 0,25, 0,50, 0,75 en 1,0 ml.

3.2.   Spectrofotometer, geschikt voor meting bij 440 nm (en 447-449 nm) en voorzien van cuvetten met een optische weglengte van 1 cm.

3.3.   Maatkolven, 20 ml en 100 ml.

3.4.   Analytische balans met een gevoeligheid van 0,1 mg, tot op 1 mg nauwkeurig en tot op 0,1 mg afleesbaar.

3.5.   Oven, 45 °C ± 1 °C.

3.6.   Asvrije filters, snel filtrerend.

4.   REAGENTIA

Alle reagentia moeten van analysekwaliteit zijn.

Suspensie van apocaroteenzuurester (ongeveer 20 %).

4.1.1.   Bepaal het gehalte van deze suspensie als volgt:

Verwarm de suspensie tot 45-50 °C en homogeniseer in de ongeopende oorspronkelijke verpakking. Weeg nauwkeurig ongeveer 400 mg af in een maatkolf (100 ml), los op in 20 ml chloroform (4.4) en vul met cyclohexaan (4.5) aan tot de maatstreep. Verdun 5 ml van deze oplossing met cyclohexaan tot 100 ml (oplossing A). Verdun 5 ml van oplossing A met cyclohexaan tot 100 ml. Meet de absorptie bij 447-449 nm (meet het maximum met cyclohexaan als blanco in cuvetten met een optische weglengte van 1 cm).

Gehalte aan apocaroteenzuurester P (%) = (Absmax × 40 000)/(Msusp × 2 550) of werk uit: (Absmax / 2 550) × (100/5) × (100/5) × (100/Msusp)

Absmax	=	absorptie van de meetoplossing bij het maximum
Msusp	=	massa van de suspensie (g)
2 550	=	referentie-absorptie (1 %, 1 cm)
P	=	zuiverheid (gehalte) van de suspensie (%)

NB: Een suspensie van apocaroteenzuurester is gevoelig voor lucht, warmte en licht. Een ongeopende oorspronkelijke verpakking (luchtdicht onder stikstof) kan op een koele plaats gedurende ongeveer twaalf maanden worden bewaard. Na opening moet de inhoud binnen korte tijd worden gebruikt.

4.1.2.   Standaardoplossing apocaroteenzuurester, ongeveer 0,2 mg/ml

Weeg tot op 1 mg nauwkeurig ongeveer 0,100 g suspensie apocaroteenzuurester (4.1.1) af (W), los dit op in petroleumether (4.2), breng de oplossing kwantitatief over in een maatkolf van 100 ml en vul met petroleumether aan tot de maatstreep.

Deze oplossing bevat (W × P)/10 mg apocaroteenzuurester/ml.

NB: De oplossing moet op een koele donkere plaats worden bewaard. Na een maand is de oplossing niet meer bruikbaar.

4.2.   Petroleumether (40-60 °C).

4.3.   Natriumsulfaat (watervrije korrels), vooraf gedurende twee uur gedroogd bij 102 °C.

4.4.   Chloroform.

4.5.   Cyclohexaan.

5.   PROCEDURE

5.1.   Bereiding van het testmonster

5.1.1.   Boterconcentraat

Smelt het monster in een oven bij ongeveer 45 °C.

5.1.2.   Boter

Smelt het monster in een oven bij ongeveer 45 °C en filtreer een representatieve hoeveelheid in een omgeving zonder sterk natuurlijk of kunstlicht bij 45 °C over een filter dat ongeveer 10 g watervrij natriumsulfaat (4.3) bevat. Vang een geschikte hoeveelheid botervet op.

5.2.   Bepaling

Weeg tot op 1 mg nauwkeurig ongeveer 1 g boterconcentraat (of geëxtraheerd botervet (5.1.2)) af (M). Breng met behulp van petroleumether (4.2) kwantitatief over in een maatkolf van 20 ml (V), vul aan tot de maatstreep en meng goed.

Breng een hoeveelheid over in een cuvet van 1 cm en meet de absorptie bij 440 nm met petroleumether als blanco. Lees de concentratie van apocaroteenzuurester in de oplossing af uit de kalibratiecurve (C μg/ml).

5.3.   Kalibratie

Pipetteer 0, 0,25, 0,5, 0,75 en 1,0 ml standaardoplossing apocaroteenzuurester (4.1.2) in vijf maatkolven van 100 ml. Vul met petroleumether (4.2) aan tot de maatstreep en meng.

De concentraties van de oplossingen liggen tussen 0 en ongeveer 2 μg/ml en worden nauwkeurig berekend aan de hand van de concentratie van de standaardoplossing (4.1.2): (W × P)/10 mg/ml. Meet de absorptie bij 440 nm met petroleumether (4.2) als blanco.

Zet de absorptie op de y-as uit tegen de concentratie apocaroteenzuurester op de x-as. Bereken de vergelijking van de kalibratiecurve.

6.   BEREKENING VAN DE RESULTATEN

6.1.   Het gehalte aan apocaroteenzuurester, uitgedrukt als mg/kg product, is:

Voor boterconcentraat: (C × V)/M

Voor boter: 0,82 (C ×V)/M

Hierbij is:

C	=	het gehalte aan apocaroteenzuurester in μg/ml, afgelezen uit de kalibratiecurve (5.3)
V	=	volume (ml) van de testoplossing (5.2)
M	=	de massa (g) van het testmonster (5.2)
0,82	=	een correctiefactor voor het gehalte van boter aan botervet.

7.   NAUWKEURIGHEID VAN DE METHODE

7.1.   Herhaalbaarheid

7.1.1.   Analyse van boter

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die binnen een zo kort mogelijke tijd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op identiek testmateriaal zijn uitgevoerd, mag niet groter zijn dan 1,4 mg/kg.

7.1.2.   Analyse van boterconcentraat

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die binnen een zo kort mogelijke tijd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op identiek testmateriaal zijn uitgevoerd, mag niet groter zijn dan 1,6 mg/kg.

7.2.   Reproduceerbaarheid

7.2.1.   Analyse van boter

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die door verschillende personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur op identiek testmateriaal zijn uitgevoerd, mag niet groter zijn dan 4,7 mg/kg.

7.3.   2. Analyse van boterconcentraat

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die door verschillende personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur op identiek testmateriaal zijn uitgevoerd, mag niet groter zijn dan 5,3 mg/kg.

7.4.   Herkomst van de precisiegegevens

De precisiegegevens zijn afkomstig van een experiment dat in 1995 in elf laboratoria is uitgevoerd met twaalf monsters met verklikstoffen (zes blinde duplo's) voor boter en twaalf monsters met verklikstoffen (zes blinde duplo's) voor boterconcentraat.

8.   TOLERANTIEGRENZEN

8.1.   Er moeten drie monsters van het product met de verklikstof worden genomen om te controleren of de toevoeging van de verklikstof correct is gebeurd.

8.2.   Boter

8.2.1.   De toe te voegen hoeveelheid voor boter is, rekening houdend met de achtergrondabsorptie, 22 mg/kg.

8.2.2.   De resultaten voor de drie monsters die bij de analyse van het product worden verkregen, worden gebruikt om te controleren of de verklikstof in de juiste hoeveelheid en voldoende homogeen is toegevoegd en het laagste van deze resultaten wordt met de volgende grenswaarden vergeleken:

—	17,7 mg/kg (95 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid);

—	12,2 mg/kg (70 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid).

De concentratie van de verklikstof in het monster met het laagste resultaat wordt in combinatie met interpolatie tussen 17,7 mg/kg en 12,2 mg/kg gebruikt.

8.3.   Boterconcentraat

8.3.1.   De toe te voegen hoeveelheid voor boterconcentraat is, rekening houdend met de achtergrondabsorptie, 24 mg/kg.

De resultaten voor de drie monsters die bij de analyse van het product worden verkregen, worden gebruikt om te controleren of de verklikstof in de juiste hoeveelheid en voldoende homogeen is toegevoegd en het laagste van deze resultaten wordt met de volgende grenswaarden vergeleken:

—	19,2 mg/kg (95 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid);

—	13,2 mg/kg (70 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid).

De concentratie van de verklikstof in het monster met het laagste resultaat wordt in combinatie met interpolatie tussen 19,2 mg/kg en 13,2 mg/kg gebruikt.

BIJLAGE VIII

(Artikel 5)

BEPALING VAN SITOSTEROL OF STIGMASTEROL IN BOTER OF BOTERCONCENTRAAT MET BEHULP VAN CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE

1.   DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED

In deze methode wordt een werkwijze beschreven voor de kwantitatieve bepaling van sitosterol of stigmasterol in boter en boterconcentraat. Onder sitosterol wordt verstaan de totale hoeveelheid β-sitosterol en 22-dihydro-β-sitosterol; overige sitosterolen gelden als te verwaarlozen.

2.   PRINCIPE

De boter of het boterconcentraat wordt met een ethanolische kaliumhydroxideoplossing verzeept, waarna het onverzeepbaar residu met diethylether wordt geëxtraheerd.

De sterolen worden in trimethylsilylethers omgezet en met behulp van capillaire gaschromatografie kwantitatief bepaald, waarbij betulinol als interne standaard wordt gebruikt.

3.   APPARATUUR

3.1.   Verzepingskolf, 150 ml, voorzien van een refluxkoeler met slijpstukken.

3.2.   Scheitrechters, 500 ml.

3.3.   Kolven, 250 ml.

3.4.   Tegendrukscheitrechters, 250 ml, of soortgelijke apparatuur voor het opvangen van gebruikte diethylether.

3.5.   Glazen kolom, 350 mm × 20 mm, met een filterplaat van gesinterd glas.

3.6.   Waterbad of verwarmingsmantel.

3.7.   Reactieflesjes, 2 ml.

Gaschromatograaf, geschikt voor het werken met een capillaire kolom, voorzien van een splitsysteem en bestaande uit:

3.8.1.   een oven met thermostaat waarmee de kolommen met een nauwkeurigheid van ±1 °C op de gewenste temperatuur kunnen worden gehouden;

3.8.2.   een verdampingseenheid met regelbare temperatuur;

3.8.3.   een vlamionisatiedetector met versterker/verzwakker;

3.8.4.   een integrator/recorder, geschikt voor gebruik met de versterker/verzwakker (3.8.3).

3.9.   Een kwartsglas capillaire kolom, volledig gecoat met BP1 of equivalent (of een andere kolom met ten minste dezelfde resolutie) met een uniforme dikte van 0,25 μm; met deze kolom moet resolutie van de trimethylsilylderivaten van lanosterol en sitosterol mogelijk zijn. Hiervoor kan een kolom met een lengte van 12 m en een inwendige diameter van 0,2 mm worden gebruikt.

3.10.   Chromatografische injectiespuit met geharde naald, 1 μl.

4.   REAGENTIA

Alle reagentia dienen van analysekwaliteit te zijn. Het gebruikte water dient gedestilleerd water of water van ten minste gelijkwaardige zuiverheid te zijn.

4.1.   Ethanol, minimaal 95 % zuiver.

4.2.   Kaliumhydroxide, 60 %-oplossing. Los 600 g kaliumhydroxide (minimaal 85 %) op in water en vul met water aan tot 1 liter.

Betulinol, minimaal 99 % zuiver.

Oplossingen van betulinol in diethylether (4.4):

4.3.1.1.   De concentratie van de betulinoloplossing voor de bepaling van sitosterol moet 1,0 mg/ml zijn;

4.3.1.2.   De concentratie van de betulinoloplossing voor de bepaling van stigmasterol moet 0,4 mg/ml zijn.

4.4.   Diethylether, analysekwaliteit (peroxide- en restvrij).

4.5.   Natriumsulfaat (watervrije korrels), vooraf gedurende twee uur gedroogd bij 102 °C.

4.6.   Silyleringsreagens, b.v. TRI-SIL (verkrijgbaar bij Pierce Chemical Co, cat.nr. 49001) of gelijkwaardig. (Waarschuwing: TRI-SIL is ontvlambaar, toxisch, bijtend en mogelijkerwijs carcinogeen. Het laboratoriumpersoneel moet op de hoogte zijn van de veiligheidsvoorschriften voor TRI-SIL en de nodige voorzorgsmaatregelen nemen.)

4.7.   Lanosterol.

Sitosterol, bekende zuiverheid (P) minimaal 90 %.

NB 1: De zuiverheid van het voor de kalibratie gebruikte standaardmateriaal moet volgens de normalisatiemethode worden bepaald. Aangenomen wordt dat alle in het monster aanwezige sterolen in het chromatogram voorkomen, dat het totale piekoppervlak overeenkomt met 100 % van de sterol-bestanddelen en dat de detector voor alle sterolen dezelfde respons geeft. Er moet worden nagegaan of het systeem op het betrokken concentratiebereik lineair is.

4.8.1.   Sitosterol-standaardoplossing: bereid een oplossing die tot op 0,001 mg/ml nauwkeurig ongeveer 0,5 mg/ml (W1) sitosterol (4.8) in diethylether (4.4) bevat.

Stigmasterol, bekende zuiverheid (P) minimaal 90 %.

4.9.1.   Stigmasterol-standaardoplossing: bereid een oplossing die tot op 0,001 mg/ml nauwkeurig ongeveer 0,2 mg/ml (W1) stigmasterol (4.9) in diethylether (4.4) bevat.

4.10.   Mengsel voor controle van de resolutie: bereid een oplossing die 0,05 mg/ml lanosterol (4.7) en 0,5 mg/ml sitosterol (4.8) in diethylether (4.4) bevat.

5.   PROCEDURE

5.1.   Bereiding van de standaardoplossingen voor chromatografie

De interne standaardoplossing (4.3.1.) moet op hetzelfde moment aan zowel de desbetreffende standaardoplossing met sterolen als aan het verzeepte monster (5.2.2.) worden toegevoegd.

5.1.1.   Standaardoplossing sitosterol voor chromatografie: breng 1 ml van de sitosterol- standaardoplossing (4.8.1) in elk van twee reactieflesjes (3.7) en damp de diethylether af met een stikstofstroom. Voeg 1 ml interne standaardoplossing (4.3.1.1) toe en damp de diethylether af met een stikstofstroom.

5.1.2.   Standaardoplossing stigmasterol voor chromatografie: breng 1 ml van de stigmasterol- standaardoplossing (4.9.1) in elk van de twee reactieflesjes (3.7) en damp de diethylether af met een stikstofstroom. Voeg 1 ml interne standaardoplossing (4.3.1.2) toe en damp de diethylether af met een stikstofstroom.

5.2.   Bereiding van het onverzeepbaar residu

5.2.1.   Laat het botermonster smelten bij een temperatuur van ten hoogste 35 °C en meng het monster zorgvuldig door het te roeren.

Weeg tot op 1 mg nauwkeurig ongeveer 1 g boter (W2) of boterconcentraat (W2) af in een kolf van 150 ml (3.1). Voeg 50 ml ethanol (4.1) en 10 ml kaliumhydroxideoplossing (4.2) toe. Bevestig de refluxkoeler, verwarm gedurende 30 minuten tot ongeveer 75 °C. Verwijder de koeler en laat de kolf afkoelen tot kamertemperatuur.

5.2.2.   Voeg 1,0 ml interne standaardoplossing toe (4.3.1.1 als sitosterol wordt bepaald of 4.3.1.2 als stigmasterol wordt bepaald). Meng zorgvuldig en breng de inhoud van de kolf kwantitatief over in een scheitrechter van 500 ml (3.2), waarna de kolf achtereenvolgens wordt gewassen met 50 ml water en 250 ml diethylether (4.4). Schud de scheitrechter krachtig gedurende 2 minuten en wacht tot de fasen gescheiden zijn. Laat de waterige onderlaag weglopen en was de etherlaag door viermaal te schudden met 100 ml water.

NB 2: Om emulsievorming te voorkomen moet het wassen met water de eerste twee maal voorzichtig gebeuren (tienmaal omkeren). De derde maal kan gedurende 30 seconden krachtig worden geschud. Indien er een emulsie ontstaat, kan deze worden afgebroken door 5-10 ml ethanol toe te voegen. Indien ethanol wordt toegevoegd, moet er nog eens twee maal krachtig met water worden gewassen.

5.2.3.   Laat de heldere zeepvrije etherlaag door een glazen kolom (3.5) met 30 g watervrij natriumsulfaat (4.5) lopen. Vang de ether op in een kolf van 250 ml (3.3). Voeg een kooksteentje toe en damp de oplossing vrijwel droog op een waterbad of met een verwarmingsmantel. Zorg er daarbij voor dat het verdampte oplosmiddel wordt opgevangen.

NB 3: Als de vloeistof bij een te hoge temperatuur volledig wordt drooggedampt, is het mogelijk dat er ook sterolen verloren gaan.

5.3.   Bereiding van de trimethylsilylethers

5.3.1.   Breng de in de kolf resterende etheroplossing met 2 ml diethylether over in een reactieflesje van 2 ml (3.7) en damp de ether af met een stikstofstroom. Was de kolf tweemaal als volgt: breng 2 ml diethylether in de kolf, breng deze over naar het reactieflesje en damp de ether af met stikstof.

5.3.2.   Silyleer het monster door 1 ml TRI-SIL (4.6) toe te voegen. Sluit het flesje af en schud krachtig om de sterolen op te lossen. Verwarm, als de sterolen niet volledig oplossen, tot 65-70 °C. Laat de oplossing gedurende ten minste 5 minuten staan alvorens deze in de gaschromatograaf te injecteren. Silyleer de standaardoplossing en het mengsel om de resolutie te controleren (4.10) op dezelfde manier als de monsters.

NB 4: Het silyleren moet in een watervrij milieu gebeuren. Wanneer betulinol onvolledig is gesilyleerd, verschijnt er vlak bij de betulinol-piek een tweede piek.

Het silyleringsproces wordt gestoord door de aanwezigheid van ethanol in de oplossing, die een gevolg kan zijn van onvoldoende wassen na de extractie. Indien dit probleem aanhoudt, kan na de extractie nog een vijfde maal worden gewassen, waarbij gedurende 30 seconden krachtig wordt geschud.

5.4.   Gaschromatografie

5.4.1.   Keuze van de werkomstandigheden:

Volg voor de instelling van de gaschromatograaf de instructies van de fabrikant.

Voor de werkomstandigheden gelden de volgende richtlijnen:

—	kolomtemperatuur: 265 °C

—	injectortemperatuur: 265 °C

—	detectortemperatuur: 300 °C

—	stroomsnelheid draaggas: 0,6 ml/minuut

—	waterstofdruk: 84 kPa

—	luchtdruk: 155 kPa

—

splitverhouding: 10:1 tot 50:1; de splitverhouding moet volgens de instructies van de fabrikant worden geoptimaliseerd en vervolgens moet worden gecontroleerd of de respons van de detector op het betrokken concentratiebereik lineair is. NB 5: Het is vooral belangrijk dat de liner van de injector regelmatig wordt schoongemaakt.

—	geïnjecteerde hoeveelheid: 1 μl TMSE-oplossing.

Laat het systeem equilibreren en begin niet met de analyse voordat de respons voldoende stabiel is.

Stel deze omstandigheden afhankelijk van de kenmerken van de kolom en de gaschromatograaf zodanig in dat er chromatogrammen worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen:

—	de resolutie tussen de sitosterol-piek en de lanosterol-piek moet afdoende zijn. Bij een gesilyleerd mengsel voor controle op de resolutie (4.10) moet een soortgelijk chromatogram worden verkregen als in figuur 1 is weergegeven;

—	voor onderstaande sterolen moet ongeveer de daarbij vermelde relatieve retentietijd worden verkregen: — cholesterol: 1,0 — stigmasterol: 1,3 — sitosterol: 1,5 — betulinol: 2,5

—	de retentietijd voor betulinol moet ongeveer 24 minuten zijn.

5.4.2.   Analyse

Injecteer 1 μl gesilyleerde standaardoplossing (stigmasterol of sitosterol) en stel de kalibratieparameters van de integrator in.

Injecteer nog eens 1 μl gesilyleerde standaardoplossing om de responsfactor in vergelijking met betulinol te bepalen.

Injecteer 1 μl gesilyleerde monsteroplossing en meet de piekoppervlakken. Voor en na elke chromatografische reeks moet er standaardoplossing worden geïnjecteerd.

Een leidraad is dat vóór en na elke reeks van 6 injecties met monsteroplossing standaardoplossing moet worden geïnjecteerd.

NB 6: Bij de integratie van de stigmasterol-piek moet ook het oppervlak van eventuele staarten, zoals aangegeven bij de punten 1, 2 en 3 in figuur 2b, worden meegerekend.

Wanneer de totale hoeveelheid sitosterol wordt bepaald, moet bij de integratie van de sitosterol-piek ook het oppervlak van de piek van 22-dihydro-β-sitosterol (stigmastanol), dat vlak na sitosterol elueert (zie figuur 3b), worden meegerekend.

6.   BEREKENING VAN DE RESULTATEN

6.1.   Bepaal het oppervlak van de sterol-pieken en de betulinol-pieken van beide standaardoplossingen voor en na een reeks en bereken R1:

R1 = (gemiddeld oppervlak van de sterol-piek in de standaard)/(gemiddeld oppervlak van de betulinol-piek in de standaard)

Bepaal het oppervlak van de sterol-piek (stigmasterol en sitosterol) en de betulinolpiek in de monsteroplossing en bereken R2:

R2 = (oppervlak van de sterol-piek in het monster)/(oppervlak van de betulinol-piek in het monster)

W1	=	hoeveelheid sterol (mg) in 1 ml standaardoplossing (4.8.1 of 4.9.1);
W2	=	gewicht van het monster (g) (5.2.1);
P	=	zuiverheid van de standaard-sterol (4.8 of 4.9).

Sterolgehalte van het monster (mg/kg) = ((R 2)/(R 1)) × ((W 1)/(W 2)) × P × 10.

7.   NAUWKEURIGHEID VAN DE METHODE

7.1.   Boter

7.1.1.   Herhaalbaarheid

7.1.1.1.   Stigmasterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die binnen een zo kort mogelijke tijd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op identiek testmateriaal zijn uitgevoerd, mag niet groter zijn dan 19,3 mg/kg.

7.1.1.2.   Sitosterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die binnen een zo kort mogelijke tijd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op identiek testmateriaal zijn uitgevoerd, mag niet groter zijn dan 23,0 mg/kg.

7.1.2.   Reproduceerbaarheid

7.1.2.1.   Stigmasterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die door verschillende personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur op identiek testmateriaal zijn uitgevoerd, mag niet groter zijn dan 31,9 mg/kg.

7.1.2.2.   Sitosterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die door verschillende personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur op identiek testmateriaal zijn uitgevoerd, mag niet groter zijn dan 8,7 % van het gemiddelde van de bepalingen.

7.1.3.   Herkomst van de precisiegegevens

De precisiegegevens zijn afkomstig van een experiment dat in 1992 in acht laboratoria is uitgevoerd met zes monsters (drie blinde duplo's) voor stigmasterol en zes monsters (drie blinde duplo's) voor sitosterol.

7.2.   Boterconcentraat

7.2.1.   Herhaalbaarheid

7.2.1.1.   Stigmasterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die binnen een zo kort mogelijke tijd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op identiek testmateriaal zijn uitgevoerd, mag niet groter zijn dan 10,2 mg/kg.

7.2.1.2.   Sitosterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die binnen een zo kort mogelijke tijd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op identiek testmateriaal zijn uitgevoerd, mag niet groter zijn dan 3,6 % van het gemiddelde van de bepalingen.

7.2.2.   Reproduceerbaarheid

7.2.2.1.   Stigmasterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die door verschillende personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur op identiek testmateriaal zijn uitgevoerd, mag niet groter zijn dan 25,3 mg/kg.

7.2.2.2.   Sitosterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die door verschillende personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur op identiek testmateriaal zijn uitgevoerd, mag niet groter zijn dan 8,9 % van het gemiddelde van de bepalingen.

7.2.3.   Herkomst van de precisiegegevens

De precisiegegevens zijn afkomstig van een experiment dat in 1991 in negen laboratoria is uitgevoerd met zes monsters (drie blinde duplo's) voor stigmasterol en zes monsters (drie blinde duplo's) voor sitosterol.

8.   TOLERANTIEGRENZEN

8.1.   Er moeten drie monsters van het product met de verklikstof worden genomen om te controleren of de toevoeging van de verklikstof correct is gebeurd.

8.2.   Boter

8.2.1.   Stigmasterol

8.2.1.1.   De toe te voegen hoeveelheid stigmasterol bedraagt 150 g ten minste 95 % zuiver stigmasterol per ton boter, d.w.z. 142,5 mg/kg, of 170 g ten minste 85 % zuiver stigmasterol per ton boter, d.w.z. 144,5 mg/kg.

8.2.1.2.   De resultaten voor de drie monsters die bij de analyse van het product worden verkregen, worden gebruikt om te controleren of de verklikstof in de juiste hoeveelheid en voldoende homogeen is toegevoegd en het laagste van deze resultaten wordt met de volgende grenswaarden vergeleken:

—	115,8 mg/kg (95 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid voor 95 % zuiver stigmasterol);

—	117,7 mg/kg (95 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid voor 85 % zuiver stigmasterol);

—	80,1 mg/kg (70 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid voor 95 % zuiver stigmasterol);

—	81,5 mg/kg (70 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid voor 85 % zuiver stigmasterol).

De concentratie van de verklikstof in het monster met het laagste resultaat wordt in combinatie met interpolatie tussen respectievelijk 115,8 mg/kg en 80,1 mg/kg of 117,7 mg/kg en 81,5 mg/kg gebruikt.

8.2.2.   Sitosterol

8.2.2.1.   De toe te voegen hoeveelheid sitosterol bedraagt 600 g ten minste 90 % zuiver sitosterol per ton boter, d.w.z. 540 mg/kg.

8.2.2.2.   De resultaten voor de drie monsters die bij de analyse van het product worden verkregen, worden gebruikt om te controleren of de verklikstof in de juiste hoeveelheid en voldoende homogeen is toegevoegd en het laagste van deze resultaten wordt met de volgende grenswaarden vergeleken:

—	482,6 mg/kg (95 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid voor 90 % zuiver sitosterol);

—	347,6 mg/kg (70 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid voor 90 % zuiver sitosterol).

De concentratie van de verklikstof in het monster met het laagste resultaat wordt in combinatie met interpolatie tussen 482,6 mg/kg en 347,6 mg/kg gebruikt.

8.3.   Boterconcentraat

8.3.1.   Stigmasterol

8.3.1.1.   De toe te voegen hoeveelheid stigmasterol bedraagt 150 g ten minste 95 % zuiver stigmasterol per ton boterconcentraat, d.w.z. 142,5 mg/kg, of 170 g ten minste 85 % zuiver stigmasterol per ton boterconcentraat, d.w.z. 144,5 mg/kg.

8.3.1.2.   De resultaten voor de drie monsters die bij de analyse van het product worden verkregen, worden gebruikt om te controleren of de verklikstof in de juiste hoeveelheid en voldoende homogeen is toegevoegd en het laagste van deze resultaten wordt met de volgende grenswaarden vergeleken:

—	118,5 mg/kg (95 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid voor 95 % zuiver stigmasterol);

—	120,4 mg/kg (95 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid voor 85 % zuiver stigmasterol);

—	82,9 mg/kg (70 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid voor 95 % zuiver stigmasterol);

—	84,3 mg/kg (70 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid voor 85 % zuiver stigmasterol).

De concentratie van de verklikstof in het monster met het laagste resultaat wordt in combinatie met interpolatie tussen respectievelijk 118,5 mg/kg en 82,9 mg/kg of 120,4 mg/kg en 84,3 mg/kg gebruikt.

8.3.2.   Sitosterol

8.3.2.1.   De toe te voegen hoeveelheid sitosterol bedraagt 600 g ten minste 90 % zuiver sitosterol per ton boterconcentraat, d.w.z. 540 mg/kg.

8.3.2.2.   De resultaten voor de drie monsters die bij de analyse van het product worden verkregen, worden gebruikt om te controleren of de verklikstof in de juiste hoeveelheid en voldoende homogeen is toegevoegd en het laagste van deze resultaten wordt met de volgende grenswaarden vergeleken:

—	480,9 mg/kg (95 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid voor 90 % zuiver sitosterol);

—	345,9 mg/kg (70 % van de minimaal toe te voegen hoeveelheid voor 90 % zuiver sitosterol).

De concentratie van de verklikstof in het monster met het laagste resultaat wordt in combinatie met interpolatie tussen 480,9 mg/kg en 345,9 mg/kg gebruikt.

Figuur 1

Chromatogram van het mengsel voor controle van de resolutie

Volledige resolutie, waarbij de recorderpen na de piek van lanosterol op de basislijn terugkomt alvorens de piek voor sitosterol begint, verdient de voorkeur, maar onvolledige resolutie is aanvaardbaar.

Figuur 2a	Figuur 2b
Stigmasterol-standard	Botermonster, gedenatureerd met stigmasterol
NB: Bij integratie van de piek voor stigmasterol moeten ook eventuele staarten, zoals aangegewen bij de punten 1, 2 en 3, worden meegerekend.

Figuur 3a	Figuur 3b
β-sitosterol-standard	Botermonster, gedenatureerd met β-sitosterol
NB: β-sitosterol bevat vaak een verontreiniging (stigmastanol) die onmiddellijk na β-sitosterol elueert. Wanneer de totale hoeveelheid β-sitosterol wordt bepaald, moeten de oppervlakken van deze twee pieken bij elkaar worden opgeteld.