“B.53.   STUDJU DWAR IN-NEWROTOSSIĊITÀ TAL-IŻVILUPP

INTRODUZZJONI

1.   Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-Linja Gwida dwar it-Testijiet (TG) tal-OECD Nru 426 (2007). F'Ġunju 1995 f'Kopenħagen, Grupp ta' Ħidma tal-OECD dwar it-Tossiċità Riproduttiva u tal-Iżvilupp tħaddet dwar il-ħtieġa li jiġu aġġornati l-linji gwida eżistenti tal-OECD dwar it-testijiet għat-tossiċità riproduttiva u tal-iżvilupp, u l-iżvilupp ta' linji gwida ġodda għall-punti aħħarin li għadhom mhumiex koperti (1). Il-grupp ta' ħidma rrakkomanda li l-linja gwida dwar it-testijiet għan-newrotossiċità tal-iżvilupp għandhom jinkitbu fuq il-bażi ta' linja gwida tal-EPA tal-Istati Uniti, li minn dak iż-żmien 'l hawn ġiet riveduta (2). F'Ġunju 1996, saret it-tieni laqgħa ta' konsultazzjoni f'Kopenħagen biex is-Segretarjat jiġi pprovdut bi gwida fuq ir-riżultat ta' linja gwida ġdida dwar it-testijiet dwar in-newrotossiċità tal-iżvilupp, inklużi l-elementi ewlenin, eż., dettalji dwar l-għażla tal-ispeċi ta' annimal, il-perjodu ta' dożaġġ, il-perjodu ta' ttestjar, il-punti aħħarin li għandhom jiġu vvalutati, u l-kriterji għall-evalwazzjoni tar-riżultati. Fl-1998 ġiet ippubblikata linja gwida tal-Istati Uniti dwar valutazzjoni tar-riskju ta' newrotossiċità (3). F'Ottubru 2000 l-ewwel saret Laqgħa ta' Konsultazzjoni tal-Esperti tal-OECD u mbagħad wara sar Workshop tal-Istitut tax-Xjenza tar-Riskji tal-ILSI u fl-2005 saret laqgħa ta' konsultazzjoni tal-esperti f'Tokjo. Dawn il-laqgħat saru biex jiġu diskussi l-kwistjonijiet xjentifiċi u tekniċi relatati mal-linja gwida kurrenti dwar it-testijiet u r-rakkomandazzjonijiet mil-laqgħat (4)(5)(6)(7) ġew ikkunsidrati fl-iżvilupp ta' dan il-metodu ta' ttestjar. Iktar informazzjoni dwar il-kondotta, l-interpretazzjoni u t-terminoloġija użata għal dan il-metodu ta' ttestjar tista' tinkiseb mid-Dokumenti ta' Gwida tal-OECD Nru 43 dwar l-‘Ittestjar u l-Valutazzjoni tat-Tossiċità Riproduttiva’ (8) u Nru 20 dwar l-‘Ittestjar tan-Newrotossiċità’(9).

KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI

2.   Hemm numru ta' sustanzi kimiċi li huma magħrufin li jipproduċu effetti newrotossiċi tal-iżvilupp fil-bniedem u speċi oħrajn (10)(11)(12)(13). Id-determinazzjoni tal-potenzjal għan-newrotossiċità tal-iżvilupp jaf tkun meħtieġa biex jiġu vvalutati u evalwati l-karatteristiċi tossiċi ta' sustanza kimika. L-istudji dwar in-newrotossiċità tal-iżvilupp huma mfasslin sabiex jipprovdu dejta, inklużi karatterizzazzjonijiet tar-rispons għad-doża, dwar l-effetti funzjonali u morfoloġiċi potenzjali fuq is-sistema nervuża fi żvilupp tal-ulied li jistgħu jfeġġu minn esponiment fl-utru u kmieni fil-ħajja.

3.   Studju dwar in-newrotossiċità tal-iżvilupp jista' jsir bħala studju separat, inkorporat fi studju dwar it-tossiċità riproduttiva u/jew dwar in-newrotissiċità fl-adulti (eż.,, il-metodi ta' ttestjar B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)), jew jiżdied ma' studji dwar it-tossiċità tal-iżvilupp qabel it-twelid (eż., il-metodu ta' ttestjar B.31 (17)). Meta l-istudju dwar in-newrotossiċità tal-iżvilupp ikun inkorporat fi ħdan jew ikun marbut ma' studju ieħor, importanti li tinżamm l-integrità taż-żewġ tipi ta' studju. L-ittestjar kollu għandu jikkonforma mal-leġiżlazzjoni applikabbli jew il-linji gwida tal-gvern u istituzzjonali għall-użu ta' annimali tal-laboratorju fir-riċerka (eż., 18).

4.   Il-laboratorju tat-testijiet għandu jqis l-informazzjoni kollha għad-dispożizzjoni dwar is-sustanza kimika tat-test qabel ma jagħmel l-istudju. It-tali informazzjoni ser tinkludi l-identità u l-istruttura tas-sustanza kimika; il-proprjetajiet fiżikokimiċi tagħha; ir-riżultati ta' kwalunkwe test ieħor in vitro jew in vivo dwar it-tossiċità fuq is-sustanza kimika; dejta tossikoloġika dwar sustanzi kimiċi strutturalment relatati; u l-użu/i antiċipat(i) tas-sustanza kimika. Din l-informazzjoni hija neċessarja biex dawk kollha kkonċernati jkunu ssodisfati li t-test huwa rilevanti għall-protezzjoni tas-saħħa tal-bniedem, u ser tgħin fl-għażla ta' doża ta' bidu xierqa.

IL-PRINĊIPJU TAT-TEST

5.   Is-sustanza kimika tat-test tingħata lill-annimali matul it-tqala u t-treddigħ. L-ommijiet jiġu ttestjati biex jiġu vvalutati l-effetti f'nisa tqal u li qed ireddgħu u dan jista' jipprovdi wkoll informazzjoni komparattiva (ommijiet versus ulied). L-ulied jingħażlu b'mod aleatorju minn fost il-boton għal evalwazzjoni tan-newrotossiċità. L-evalwazzjoni tikkonsisti f'osservazzjonijiet biex jiġu identifikati anormalitajiet grossi fis-sistema newroloġika jew fl-imġiba, inkluża l-valutazzjoni tal-iżvilupp fiżiku, l-ontoġenija tal-imġiba, l-attività motorja, il-funzjoni motorja u sensorjali, u t-tagħlim u l-memorja; u l-evalwazzjoni tal-piżijiet tal-moħħ u n-newropatoloġija matul l-iżvilupp ta' wara t-twelid u l-fażi adulta.

6.   Meta l-metodu ta' ttestjar jitwettaq bħala studju separat, jistgħu jintużaw annimali disponibbli addizzjonali f'kull grupp għal proċeduri speċifiċi relatati man-newromġiba, in-newropatoloġija, in-newrokimika jew l-elettrofiżjoloġija li jitstgħu jżidu mad-dejta miksuba mill-analiżijiet rakkomandati minn dan il-metodu ta' ttestjar (16)(19)(20)(21). Il-proċeduri supplimentari jistgħu jkunu partikolarment utli meta osservazzjoni empirika, effetti antiċipati, jew mekkaniżmu/modalità ta' azzjoni jindikaw tip speċifiku ta' newrotossiċità. Dawn il-proċeduri supplimentali jistgħu jintużaw fl-ommijiet kif ukoll fil-frieħ. Barra minn hekk, proċeduri ex vivo jew in vitro jistgħu jintużaw ukoll, diment li dawn il-proċeduri ma jibdlux l-integrità tal-proċeduri in vivo.

TĦEJJIJIET GĦAT-TEST

L-għażla tal-ispeċi tal-annimali

7.   L-ispeċi ppreferuta għat-test hija l-far; jistgħu jintużaw speċijiet oħrajn meta jkunu xierqa. Madankollu, il-jiem ta' tqala u ta' wara t-twelid speċifikati f'dan il-metodu ta' ttestjar huma speċifiċi għal razez użati spiss ta' firien, u għandhom jingħażlu jiem komparabbli jekk tintuża speċi differenti jew razza mhux tas-soltu. L-użu ta' speċijiet oħrajn għandu jkun iġġustifikat fuq il-bażi ta' dejta tossikoloġika, farmakokinetika, u/jew oħra. Il-ġustifikazzjoni għandha tinkludi d-disponibilità ta' valutazzjonijiet tan-newromġiba u n-newropatoloġija ta' wara t-twelid speċifiċi għall-ispeċijiet. Jekk kien hemm test preċedenti li qajjem tħassib, għandhom jiġu kkunsidrati l-ispeċi/ir-razza li qajmu tħassib. Minħabba l-attributi ta' prestazzjoni li jvarjaw ta' razez ta' firien differenti, għandu jkun hemm evidenza li r-razza magħżula sabiex tintuża għandha fekondità u risponsività adegwati. L-affidabilità u s-sensittività ta' speċijiet oħrajn biex tiġi identifikata newrotossiċità tal-iżvilupp għandhom jiġu dokumentati.

Kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija u tal-għalf

8.   It-temperatura fil-kamra tal-annimali tal-esperimenti għandha tkun 22 ± 3 °C. Filwaqt li l-umdità relattiva għandha tkun tal-inqas 30 % u idealment ma taqbiżx is-70 % minbarra matul it-tindif tal-kamra, il-mira għandha tkun 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, b'sekwenza ta' 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Huwa possibbli wkoll li jinqeleb iċ-ċiklu tad-dawl qabel it-tgħammir u għad-durata tal-istudju, sabiex isiru valutazzjonijiet tal-punti aħħarin funzjonali u tal-imġiba matul il-perjodu mudlam (taħt dawl aħmar), jiġifieri fil-ħin li matulu normalment l-annimali jkunu attivi (22). Kwalunkwe bidla fiċ-ċiklu tad-dawl-dlam għandha tinkludi ħin adegwat biex dan iċ-ċiklu jindera ħalli l-annimali jkunu jistgħu jadattaw għaċ-ċiklu l-ġdid. Għall-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta' ilma tajjeb għax-xorb. It-tip ta' ikel u ilma għandu jiġi rrapportat u t-tnejn li huma għandhom jiġu analizzati għal kontaminanti.

9.   L-annimali jistgħu jitqiegħdu f'post waħedhom jew f'gaġġa fi gruppi żgħar tal-istess sess. Il-proċeduri ta' tgħammir għandhom jitwettqu f'gaġeġ adattati għall-iskop. Wara evidenza ta' kopulazzjoni jew mhux iktar minn 15-il jum ta' tqala, l-annimali mgħammrin għandhom jitqiegħdu f'gaġeġ separati f'gaġeġ tal-ħlas jew tal-maternità. Il-gaġeġ għandhom jiġu rranġati b'tali mod li jkunu minimizzati l-effetti possibbli minħabba l-pożizzjoni tal-gaġġa. L-annimali nisa mgħammrin għandhom jingħataw materjal tat-tibjit xieraq u definit meta jkunu waslu biex iwelldu. Huwa magħruf b'mod ġenerali li tqandil mhux kif suppost jew stress matul it-tqala jista' jirriżulta f'riżultati avversi, inkluż korriment jew żvilupp alterat tal-fetu u wara t-twelid. Bħala protezzjoni kontra telf ta' feti minħabba fatturi li mhumiex relatati mal-kura, l-annimali għandhom jitqandlu bir-reqqa matul it-tqala, u għandu jiġi evitat stress minn fatturi esterni bħal storbju żejjed fuq barra.

Tħejjija tal-annimali

10.   Għandhom jintużaw annimali b'saħħithom, li draw il-kundizzjonijiet tal-laboratorju u li ma kinux soġġetti għal proċeduri sperimentali fl-imgħoddi, sakemm l-istudju ma jkunx inkorporat fi studju ieħor (ara l-paragrafu 3). L-annimali tat-test għandhom jiġu karatterizati għall-ispeċi, ir-razza, is-sors, is-sess, il-piż u l-età. Kull annimal għandu jkun assenjat u jiġi mmarkat b'numru uniku ta' identifikazzjoni. Sa fejn dan ikun prattikabbli, l-annimali tal-gruppi kollha tat-test għandhom ikunu tal-istess piż u età u fi ħdan il-medda normali tal-ispeċi u r-razza studjata. F'kull livell ta' doża għandhom jintużaw annimali nisa żgħażagħ li qatt ma welldu. Aħwa ma għandhomx jitgħammru, u għandha tinxteħet attenzjoni biex dan jiġi żgurat. Il-Jum tat-Tqala (GD) 0 huwa l-jum li fih ikunu osservati l-plakka vaġinali u/jew l-isperma. Għandu jingħata ħin adegwat ta' akklimatizzazzjoni (eż., 2-3 ijiem) meta jinxtraw annimali tqal minn fornitur. L-annimali tqal għandhom jiġu assenjati b'mod ħieles minn preġudizzji fil-gruppi ta' kontroll u kura, u sa fejn dan ikun possibbli, għandhom jitqassmu ndaqs bejn il-gruppi (eż., proċedura aleatorja stratifikata hija rakkomandata biex tkun ipprovduta distribuzzjoni ndaqs fost il-gruppi kollha, bħal dik ibbażata fuq il-piż tal-ġisem). L-annimali nisa inseminati mill-istess raġel għandhom jitqassmu ndaqs bejn il-gruppi.

PROĊEDURA

In-numru u s-sess tal-annimali

11.   Kull grupp tat-test u ta' kontroll għandu jkun fih numru suffiċjenti ta' annimali nisa tqal li jridu jkunu esposti għas-sustanza kimika tat-test biex jiġi żgurat li jiġi prodott numru suffiċjenti ta' ulied għal evalwazzjoni tan-newrotossiċità. Huwa rakkomandat totali ta' 20 boton f'kull livell ta' doża. Disinji tad-dożaġġ tal-grupp 'staggered' u tar-replikati huma awtorizzati jekk jintlaħqu n-numri totali ta' boton f'kull grupp, u jekk jintużaw mudelli statistiċi xierqa biex jagħtu kont għar-replikati.

12.   Dakinhar tal-jum wara t-twelid (PND) 4 jew qabel (il-jum tal-ħlas huwa PND 0), id-daqs ta' kull boton għandu jkun aġġustat billi jiġu eliminati l-frieħ żejda permezz ta' għażla aleatorja biex jinħareġ daqs tal-boton uniformi għall-frieħ kollha (23). Id-daqs tal-boton ma għandux jaqbeż id-daqs medju tal-boton għar-razza ta' rodituri użata (8-12). Il-boton għandu jkollhom, kemm jista' jkun, numri ndaqs ta' frieħ irġiel u nisa. L-eliminazzjoni selettiva tal-frieħ, eż.,, fuq il-bażi tal-piż tal-ġisem, mhijiex xierqa. Wara l-istandardizzazzjoni tal-boton (qtil għat-tnaqqis) u qabel iktar testijiet tal-punti aħħarin funzjonali, il-frieħ individwali li huma skedati għal testijiet ta' qabel il-ftim jew wara l-ftim għandhom jiġu identifikati b'mod uniku, billi jintuża kwalunkwe metodu umanitarju xieraq għall-identifikazzjoni tal-frieħ (eż., 24).

L-assenjament ta' annimali għal testijiet funzjonali u tal-imġiba, piżijiet tal-moħħ, u evalwazzjonijiet newropatoloġiċi

13.   Il-metodu ta' ttestjar jippermetti li jittieħdu diversi approċċi fir-rigward tal-assenjament tal-annimali esposti in utero u permezz ta' treddigħ għal testijiet funzjonali u tal-imġiba, maturità sesswali, determinazzjoni tal-piż tal-moħħ, u evalwazzjoni newropatoloġika (25). Jistgħu jiżdiedu wkoll testijiet oħrajn tal-funzjoni tan-newromġiba (eż., l-imġiba soċjali), in-newrokimika jew in-newropatoloġija fuq bażi ta' każ b'każ, diment li ma tkunx kompromessal-integrità tat-testijiet oriġinali meħtieġa.

14.   Il-frieħ jingħażlu minn kull grupp ta' doża u jiġu assenjati għal valutazzjonijiet tal-punti aħħarin fil-PND 4 jew wara. L-għażla tal-frieħ għandha ssir b'tali mod li ż-żewġ sessi minn kull boton f'kull grupp ta' doża jkunu rappreżentati ndaqs fit-testijiet kollha kemm jista' jkun. Għall-ittestjar tal-attività motorja, l-istess par ta' frieħ irġiel u nisa għandhom jiġu ttestjati fl-etajiet kollha ta' qabel il-ftim (ara l-paragrafu 35). Għat-testijiet kollha l-oħrajn, l-istess pari ta' annimali rġiel u nisa jew oħrajn separati jistgħu jiġu assenjati f'testijiet tal-imġiba differenti. Frieħ differenti jistgħu jkunu jeħtieġu li jiġu assenjati għal testijiet ta' frieħ li għadhom kif infatmu versus adult tal-funzjoni konjittiva sabiex jiġi evitat it-tfixkil tal-effetti tal-età u t-taħriġ minn qabel f'dawk il-kejliet (26)(27). Fil-ftim (PND 21), il-frieħ li ma jingħażlux għall-ittestjar jistgħu jinqatlu b'mod dinjituż. Kwalunkwe alterazzjoni fl-assenjamenti tal-frieħ għandha tiġi rrapportata. L-unità ta' kejl statistika għandha tkun il-boton (jew l-omm) u mhux il-grupp.

15.   Hemm modi differenti ta' kif frieħ jiġu assenjati għal-eżamijiet, testijiet konjittivi, eżamijiet patoloġiċi ta' qabel u wara l-ftim, eċċ., (ara l-Figura 1 għad-disinn ġenerali u l-Appendiċi 1 għal eżempji ta' assenjament). In-numri minimi rakkomandati ta' annimali f'kull grupp ta' doża għal eżamijiet ta' qabel u wara l-ftim huma kif ġejjin:

Osservazzjonijiet kliniċi u piż tal-ġisem	L-annimali
Osservazzjonijiet kliniċi dettaljati	20/sess (1/sess/boton)
Piż tal-moħħ (wara l-fissazzjoni) PND 11-22	10/sess (1/boton)
Piż tal-moħħ (mhux fissat) ~ PND 70	10/sess (1/boton)
Newropatoloġija (fissazzjoni b'immersjoni jew b'perfusjoni) PND 11-22	10/sess (1/boton)
Newropatoloġija (fissazzjoni b'perfusjoni) PND ~70	10/sess (1/boton)
Maturità sesswali	20/sess (1/sess/boton)
Fażijiet oħrajn fl-iżvilupp (fakultattiva)	L-annimali kollha
Ontoġenija tal-imġiba	20/sess (1/sess/boton)
Attività motorja	20/sess (1/sess/boton)
Funzjoni motorja u sensorja	20/sess (1/sess/boton)
Tagħlim u memorja	10/sess (1) (1/boton)

Dożaġġ

16.   Għandhom jintużaw tal-inqas tliet livelli ta' dożi u kontroll konkurrenti. Il-livelli ta' doża għandhom ikunu distanti biżżejjed biex tinħoloq gradazzjoni tal-effetti tossiċi. Sakemm ma jkunx limitat mill-għamla fiżikokimika jew il-proprjetajiet bijoloġiċi tas-sustanza kimika, l-ogħla livell ta' doża għandu jingħażel bl-għan li jikkaġuna xi tossiċità materna (eż.,, sinjali kliniċi, tnaqqis fiż-żieda fil-piż tal-ġisem (mhux iktar minn 10 %) u/jew evidenza ta' tossiċità li tillimita d-doża f'organu fil-mira). Id-doża għolja tista' tkun limitata għal 1 000 mg/kg/jum tal-piż tal-ġisem, b'xi eċċezzjonijiet. Pereżempju, l-esponiment mistenni tal-bniedem tista' tindika l-bżonn li jintuża livell ogħla ta' doża. Inkella għandhom isiru studji pilota jew studji preliminari ta' sejbien tal-medda biex jiġi determinat l-ogħla dożaġġ li għandu jipproduċi grad minimu ta' tossiċità materna. Jekk intwera li s-sustanza kimika tat-test hija tossika għall-iżvilupp fi studju standard tat-tossiċità tal-iżvilupp jew fi studju pilota, l-ogħla livell tad-doża għandu jkun id-doża massima li ma tikkaġunax tossiċità eċċessiva fl-ulied, jew mewt jew malformazzjonijiet in utero jew neonatali, biżżejjed biex tkun prekluża evalwazzjoni sinifikanti ta' newrotossiċità. L-inqas livell ta' doża għandu jkollu l-għan li ma jipproduċi ebda evidenza ta' tossiċità materna jew tal-iżvilupp, inkluża newrotossiċità. Għandha tingħażel sekwenza dixxendenti ta' livelli ta' doża bilgħan li jintwera kwalunkwe rispons relatat mad-doża u Livell ta' Effett Avvers Mhux Osservat (NOAEL), jew dożi qrib il-limitu ta' identifikazzjoni li jippermettu li tiġi determinata doża ta' riferiment. Intervalli maqsuma fi tnejn sa erbgħa spiss ikunu ottimali sabiex jiġu stabbiliti l-livelli ta' doża dixxendenti, u ż-żieda tar-raba' grupp ta' doża spiss ikun ippreferut iktar mill-użu ta' intervalli kbar ħafna (eż., iktar minn fattur ta' 10) bejn id-dożaġġi.

17.   Il-livelli ta' doża għandhom jingħażlu filwaqt li tittieħed f'kunsiderazzjoni d-dejta eżistenti kollha dwar it-tossiċità kif ukoll l-informazzjoni addizzjonali dwar il-metaboliżmu u t-tossikokinetika tas-sustanza kimika tat-test jew materjali relatati. Din l-informazzjoni tista' tgħin ukoll biex turi l-adegwatezza tal-iskeda tad-dożaġġ. Id-dożaġġ dirett tal-frieħ għandu jitqies fuq il-bażi tal-esponiment u l-informazzjoni farmakokinetika (28)(29). Għandhom jittieħdu f'kunsiderazzjoni bir-reqqa l-benefiċċji u l-iżvantaġġi qabel ma jsiru studji tad-dożaġġ dirett (30).

18.   Il-grupp ta' kontroll konkurrenti għandu jkun grupp ta' kontroll b'kura finta jew grupp ta' kontroll b'veikolu jekk jintuża veikolu fl-għoti tas-sustanza kimika. Normalment l-annimali għandhom jingħataw l-istess volum ta' sustanzi kimiċi jew veikolu tat-test fuq bażi ta' piż tal-ġisem. Jekk jintuża veikolu jew addittiv ieħor biex jiġi faċilitat id-dożaġġ, għandhom jittieħdu f'kunsiderazzjoni l-karatteristiċi li ġejjin: l-effetti fuq l-assorbiment, id-distribuzzjoni, il-metaboliżmu jew iż-żamma tas-susanza kimika tat-test; effetti fuq il-proprjetajiet kimiċi tas-sustanza kimika tat-test li jistgħu jibdlu l-karatteristiċi tossiċi tagħha; u l-effetti fuq il-konsum ta' ikel jew ilma jew l-istatus nutrizzjonali tal-annimali. Il-veikolu ma għandux jikkaġuna effetti li jistgħu jfixklu l-interpretazzjoni tal-istudju u la għandu jkun tossiku għan-newromġiba u lanqas ma għandu jkollu effetti fuq ir-riproduzzjoni jew l-iżvilupp. Għal veikoli ġodda, għandu jkun inkluż grupp ta' kontroll b'kura finta minbarra grupp ta' kontroll bil-veikolu. L-annimali fil-grupp(i) ta' kontroll għandhom jiġu ttrattati bl-istess mod bħall-annimali tal-grupp tat-test.

L-għoti ta' dożi

19.   Is-sustanza kimika jew il-veikolu tat-test għandhom jingħataw bl-iktar rotta rilevanti għall-esponiment potenzjali tal-bniedem, u fuq il-bażi ta' informazzjoni disponibbli dwar il-metaboliżmu u d-distribuzzjoni fl-annimali tat-test. Is-soltu, ir-rotta tal-amministrazzjoni tkun orali (eż.,gavage, djetetika, permezz ta' ilma tax-xorb), iżda jistgħu jintużaw rotot oħrajn (eż., dermali, teħid man-nifs) skont il-karatteristiċi u r-rotot ta' esponiment antiċipati jew magħrufin għall-bniedem (gwida ulterjuri hija pprovduta fid-Dokument ta' Gwida 43(8)). Għandha tkun ipprovduta ġustifikazzjoni għar-rotta tal-amministrazzjoni magħżula. Is-sustanza kimika tat-test għandha tingħata kuljum bejn wieħed u ieħor fl-istess ħin tal-ġurnata.

20.   Normalment, id-doża mogħtija lil kull annimal għandha tkun ibbażata fuq l-iktar determinazzjoni riċenti tal-piż tal-ġisem individwali. Madankollu, meta d-dożi jiġu aġġustati matul l-aħħar terz tat-tqala, dan għandu jsir bir-reqqa. Jekk tiġi osservata tossiċità eċċessiva fl-ommijiet ikkurati, dawk l-annimali għandhom jinqatlu b'mod dinjituż.

21.   Bħala minimu, is-sustanza kimika jew il-veikolu tat-test għandhom jingħataw kuljum lil annimali nisa mgħammrin mill-ħin tal-impjant (GD 6) sat-treddigħ (PND 21), sabiex il-ħrief ikunu esposti għas-sustanza kimika tat-test matul l-iżvilupp newroloġiku ta' qabel u wara t-twelid. L-età li fiha jibda d-dożaġġ, u d-durata u l-frekwenza tad-dożaġġ, jistgħu jiġu aġġustati jekk l-evidenza tappoġġja disinn sperimentali iktar rilevanti għal esponimenti tal-bniedem. Id-durati tad-dożaġġ għandhom ikunu aġġustati għal speċijiet oħrajn biex jiġi żgurat esponiment matul il-perjodi bikrin kollha tal-iżvilupp tal-moħħ (jiġifieri ekwivalenti għal tkabbir tal-moħħ tal-bniedem ta' qabel it-twelid u kmiem wara t-twelid). Id-dożaġġ jista' jibda mill-bidu tat-tqala (GD 0) għad li għandu jittieħed f'kunsiderazzjoni l-potenzjal li s-sustanza kimika tat-test tikkaġuna telf ta' qabel l-impjant. Amministrazzjoni li tibda f'GD 6 tevita dan ir-riskju, iżda l-istadji ta' żvilupp bejn GD 0 u 6 ma jkunux ikkurati. Meta laboratorju jixtri annimali mgħammrin biż-żmien, ikun imprattiku li d-dożaġġ jinbeda minn GD 0, u b'hekk GD 6 ikun jum ta' bidu tajjeb. Il-laboratorju tat-test għandu jfassal l-iskeda tad-dożaġġ skont l-informazzjoni rilevanti dwar l-effetti tas-sustanza kimika tat-test, l-esperjenza fl-imgħoddi, u kunsiderazzjonijiet loġistiċi; dan jista' jinkludi estensjoni tad-dożaġġ wara l-ftim. Id-dożaġġ ma għandux iseħħ dakinhar tal-ħlas f'dawk l-annimali li ma jkunux għadhom welldu l-ulied tagħhom kompletament. B'mod ġenerali, huwa supponut li l-esponiment tal-frieħ ser isseħħ permezz tal-ħalib matern; madankollu, dożaġġ dirett tal-frieħ għandu jiġi kkunsidrat f'dawk il-każijiet fejn hemm nuqqas ta' evidenza ta' esponiment issuktat għall-ulied. L-evidenza tal-esponiment kontinwu tista' tinkiseb minn eż.,, informazzjoni farmakokinetika, tossiċità tal-ulied jew bidliet fil-bijoswieq (28).

OSSERVAZZJONIJIET

Osservazzjonijiet tal-ommijiet

22.   L-ommijiet kollha għandhom jiġu osservati bir-reqqa tal-inqas darba kuljum fir-rigward tal-kundizzjoni tas-saħħa tagħhom, inkluża l-morbidità u l-mortalità.

23.   Matul il-perjodi tal-kura u l-osservazzjoni, b'mod perjodiku għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi iktar dettaljati (tal-inqas darbtejn matul il-perjodu tad-dożaġġ fit-tqala u darbtejn matul il-perjodu ta' dożaġġ fit-treddigħ) billi tal-inqas jintużaw għaxar ommijiet għal kull livell ta' doża. L-annimali għandhom ikunu osservati barra l-gaġġa oriġinali minn tekniċi mħarrġin li ma jafux bil-kura tal-annimali, billi jintużaw proċeduri standardizzati ħalli jiġi minimizzat l-istress tal-annimali u l-preġudizzju tal-osservaturi, u tiġi massimizzata l-affidabilità bejn l-osservaturi. Meta dan ikun possibbli, huwa rakkomandat li l-osservazzjonijiet fi studju partikolari jsiru mill-istess tekniku.

24.   Il-preżenza tas-sinjali osservati għandha tiġi rreġistrata. Kull meta dan ikun possibbli, anki l-kobor tas-sinjali osservati għandu jiġi rreġistrat. L-osservazzjonijiet kliniċi għandhom jinkludu, iżda ma għandhomx ikunu limitati għal, bidliet fil-ġilda, il-pil, l-għajnejn, il-membrani mukużi, l-okkorrenza ta' tnixxijiet, u l-attività awtonomika (eż., dmugħ, piloerezzjoni, daqs tal-ħabba, xejra respiratorja mhux tas-soltu u/jew teħid tan-nifs bil-ħalq, u kwalunkwe sinjal mhux tas-soltu ta' urina jew rawt).

25.   Kwalunkwe rispons mhux tas-soltu fir-rigward ta' pożizzjoni tal-ġisem, livell ta' attività (eż., esplorazzjoni mnaqqsa jew miżjuda taż-żona standard) u koordinazzjoni tal-moviment għandhom jiġu osservati. Bidliet fil-mixja, (eż., imferċħa, atassja), qagħda (eż., ħotba) u r-reattività għat-tqandil, it-tqegħid jew stimuli ambjentali oħrajn, kif ukoll il-preżenza ta' movimenti kloniċi jew toniċi, konvulżjonijiet, rogħda, sterjotipi (eż.,mixmut wisq, ċaqliq tar-ras mhux tas-soltu, tidwir ripetittiv), imġiba mhux tas-soltu (eż., gdim jew lagħaq eċċessiv, awtomutilazzjoni, mixi lura, tleħħin), jew aggressjoni għandhom jiġu rreġistrati.

26.   Sinjali ta' tossiċità għandhom jiġu rreġistrati, inkluż il-jum tal-bidu, il-ħin tal-ġurnata, il-grad, u d-durata.

27.   L-annimali għandhom jiġu ppeżati fil-ħin tad-dożaġġ tal-inqas darba fil-ġimgħa matul l-istudju, darkinkhar jew qrib il-jum tal-ħlas, u fil-PND 21 (ftim). Għall-istudji ta' gavage, l-ommijiet għandhom jintiżnu tal-inqas darbtejn fil-ġimgħa. Id-dożi għandhom ikunu aġġustati fil-ħin ta' kull determinazzjoni tal-piż tal-ġisem, kif xieraq. Il-konsum tal-ikel għandu jitkejjel kull ġimgħa tal-inqas matul it-tqala u t-treddigħ. Il-konsum tal-ilma għandu jitkejjel tal-inqas darba fil-ġimgħa jekk l-esponiment ikun permezz tal-provvista tal-ilma.

L-osservazzjonijiet fuq ulied

28.   L-ulied kollha għandhom jiġu osservati bir-reqqa tal-inqas darba kuljum għal sinjali ta' tossiċità u għall-morbilità u l-mortalità.

29.   Matul il-perjodi tal-kura u l-osservazzjoni, għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi iktar dettaljati tal-ulied. L-ulied (tal-inqas ferħ/sess/boton wieħed) għandhom ikunu osservati minn tekniċi mħarrġin li ma jafux bil-kura tal-annimali, billi jużaw proċeduri standardizzati biex jiġi minimizzat il-preġudizzju u tiġi massimizzata l-affidabilità bejn l-osservaturi. Meta dan ikun possibbli, huwa rakkomandat li l-osservazzjonijiet isiru mill-istess tekniku. Bħala minimu, il-punti aħħarin deskritti fil-paragrafi 24 u 25 għandhom jiġu ssorveljati kif xieraq għall-istadju tal-iżvilupp taħt osservazzjonijiet.

30.   Is-sinjali kollha ta' tossiċità fl-ulied għandhom ikunu rreġistrati, inkluż il-jum tal-bidu, il-ħin tal-ġurnata, il-grad u d-durata.

Fażijiet fiżiċi u tal-iżvilupp

31.   Bidliet fil-fażijiet ta' żvilupp ta' qabel il-ftim (eż., ftuħ tal-pinna, ftuħ tal-għajnejn, spuntar tal-inċiż) huma ferm korrelatati mal-piż tal-ġisem (30)(31). Il-piż tal-ġisem jista' jkun l-aħjar indikatur ta' żvilupp fiżiku. Għaldaqstant, il-kejl tal-fażijiet ta' żvilupp huwa rakkomandat biss meta jkun hemm evidenza minn qabel ta' dawn il-punti aħħarin ser jipprovdu informazzjoni addizzjonali. Il-puntwalità għall-valutazzjoni ta' dawn il-parametri hija indikata fit-Tabella 1. Skont l-effetti antiċipati, u r-riżultati tal-kejliet inizjali, jista' jkun rakkomandabbli li jiżdiedu punti tal-ħin addizzjonali jew li l-kejliet isiru fi stadji oħrajn tal-iżvilupp.

32.   Huwa rakkomandat li tintuża l-età ta' wara l-att sesswali minflok l-età ta' wara t-twelid meta jiġi vvalutat l-iżvilupp fiżiku (33). Jekk il-frieħ jiġu ttestjati dakinhar tal-ftim, huwa rakkomandat li dan l-ittestjar isir qabel il-ftim propju biex jiġi evitat effett ta' konfużjoni mill-istress marbut mal-ftim. Barra minn hekk, kwalunkwe ttestjar ta' wara l-ftim tal-frieħ ma għandux iseħħ matul il-jumejn ta' wara l-ftim.

Tabella 1

Il-puntwalità tal-valutazzjoni tal-fażijiet fiżiċi u tal-iżvilupp, u punti aħħarin funzjonali/tal-imġiba  (2)

Perjodi tal-Età Punti Aħħarin	Qabel il-ftim (3)	Adolexxenza (3)	Żgħażagħ (3)
Fażijiet fiżiċi u tal-iżvilupp
Piż tal-Ġisem u Osservazzjonijiet Kliniċi	fil-ġimgħa (4)	tal-inqas kull ġimgħatejn	tal-inqas kull ġimgħatejn
Piż tal-moħħ	PND 22 (5)		fit-terminazzjoni
Newropatoloġija	PND 22 (5)		fit-terminazzjoni
Maturità sesswali	—	kif xieraq	—
Fażijiet oħrajn tal-iżvilupp (6)	kif xieraq	—	—
Punti aħħarin funzjonali/tal-imġiba
Ontoġenija tal-imġiba	Tal-inqas żewġ kejliet
Attività motorja (inkluża d-drawwa)	1–3 darbiet (7)	—	darba
Funzjoni motorja u sensorjali	—	darba	darba
Tagħlim u memorja	—	darba	darba

33.   Il-ħrief ħajjin għandhom jingħaddu u jitqassmu skont is-sess eż., permezz ta' spezzjoni viżwali jew kejl tad-distanza anoġenitali (34)(35), u kull ferħ fi ħdan boton għandu jintiżen b'mod individwali fit-twelid jew ftit wara, tal-inqas darba fil-ġimgħa matul it-treddigħ, u tal-inqas darba kull ġimgħatejn wara. Meta tiġi evalwata l-maturità sesswali, l-età u l-piż tal-ġisem tal-annimal meta sseħħ patenza vaġinali (36) jew separazzjoni preputjali (37) għandhom jiġu ddeterminati għal tal-inqas annimal raġel wieħed u annimal mara wieħed għal kull boton.

Ontoġenija tal-imġiba

34.   L-ontoġenija tal-imġibiet magħżulin għandha titkejjel f'tal-inqas ferħ/sess/boton wieħed matul il-perjodu tal-età xieraq, bl-istess frieħ li jintużaw fil-jiem kollha tat-test għall-imġibiet kollha vvalutati. Il-jiem tal-kejl għandhom jitqassmu b'mod regolari tul dak il-perjodu biex tiġi definita l-bidla normali jew dik relatata mal-kura fl-ontoġenija ta' dik l-imġiba (38). Dawn li ġejjin huma xi eżempji ta' mġibiet li tista' tiġi vvalutata l-ontoġenija tagħhom: rifless sabiex l-annimal iqum fuq saqajh, ġeotassi negattiva u attività motorja (38)(39)(40).

L-attività motorja

35.   L-attività motorja għandha tiġi ssorveljata (41)(42)(43)(44)(45) matul il-perjodi ta' età ta' qabel il-ftim u tal-adultezza. Għall-ittestjar fil-ħin tal-ftim, ara l-paragrafu 32. Is-sessjoni tat-test għandha tkun twila biżżejjed biex tintwera drawwa bejn is-sessjonijiet għal kontrolli mhux ikkurati. L-użu tal-attività motorja biex tiġi vvalutata l-ontoġenija tal-imġiba huwa ferm rakkomandat. Jekk jintuża bħala test tal-ontoġenija tal-imġiba, f'dak il-każ l-ittestjar għandu juża l-istess annimali għas-sessjonijiet kollha tat-test ta' qabel il-ftim. L-ittestjar għandu jkun spiss biżżejjed biex tiġi vvalutata l-ontoġenija tad-drawwa fi ħdan is-sessjoni (44). Dan jista' jkun jeħtieġ tliet perjodi ta' żmien jew iktar qabel, u inkluż, il-jum tal-ftim (eż., PND 13, 17, 21). L-ittestjar tal-istess annimali, jew sħab tal-boton, għandu jseħħ f'età adulta qrib tmiem l-istudju (eż., PND 60-70). L-ittestjar f'jiem addizzjonali jista' jsir kif ikun hemm bżonn. L-attività motorja għandha tiġi ssorveljata permezz ta' apparat awtomatizzat li jrireġistra l-attività li għandu jkun kapaċi jidentifika kemm żidiet kif ukoll tnaqqisijiet fl-attività (jiġifieri attività bażi kif imkejla mill-istrument ma għandhiex tkun baxxa wisq tant li tipprekludi l-identifikazzjoni ta' tnaqqsijiet, u lanqas għolja wisq tant li tipprekludi l-qbid ta' żidiet fl-attività). Kull strument għandu jiġi ttestjat permezz ta' proċeduri standard biex tkun żgurata, kemm jista' jkun, l-affidabilità tal-operazzjoni bejn apparati u fost il-jiem. Kemm jista' jkun, il-gruppi tal-kura għandhom jiġu bbilanċjati bejn l-istrumenti. Kull annimal għandu jiġi ttestjat b'mod individwali. Il-gruppi tal-kura għandhom ikunu kontrobilanċjati bejn ħinijiet tat-test biex tiġi evitata konfużjoni permezz tar-ritmi ċirkadjani tal-attività. Għandhom isiru sforzi biex jiġi żgurat li l-varjazzjonijiet fil-kundizzjonijiet tat-test huma minimi u mhumiex sistematikament relatati mal-kura. Fost il-varjabbli li jistgħu jaffettwaw afna miżuri tal-imġiba, inkluża l-attività motorja, hemm il-livell tal-ħoss, id-daqs u l-forma tal-gaġġa tat-test, it-temperatura, l-umdità relattiva, il-kundizzjonijiet tad-dawl, l-irwejjaħ, l-użu tal-gaġġa oriġinali jew gaġġa tat-test ġdida u distrazzjonijiet ambjentali.

Il-funzjoni motorja u sensorjali

36.   Il-funzjoni motorja u sensorjali għandha tiġi analizzata f'dettall tal-inqas darba għall-perjodu adoloxxenti u darba matul il-perjodu taż-żgħożija (eż., PND 60-70). Għall-ittestjar fi żmien il-ftim, ara l-paragrafu 32. Għandu jsir ittestjar suffiċjenti biex jiġi żgurat kampjunar kwantitattiv adegwat tal-modalitajiet sensorjali (eż., somatosensorjali, vestibulari) u l-funzjonijiet motorji (eż.,saħħa, koordinazzjoni). Ftit eżempji ta' testijiet għall-funzjoni motorja u sensorjali huma rispons għal forza (46), rifless biex l-annimal iqum fuq saqajh (47)(48), drawwa ta' qatgħa awditorja (40)(49)(50)(51)(52)(53)(54), u potenzjali evokati (55).

Testijiet tat-tagħlim u tal-memorja

37.   Għandu jsir test tat-tagħlim u l-memorja assoċjattivi wara l-ftim (eż.,, 25 ± 2 jum) u għal żgħażagħ (PND 60 u iktar). Għall-ittestjar fi żmien il-ftim, ara l-paragrafu 32. L-istess test(ijiet) jew oħrajn separati jistgħu jintużaw f'dawn iż-żewġ stadji tal-iżvilupp. Jista' jkun hemm xi flessibilità fl-għażla tat-test(ijiet) għat-tagħlim u l-memorja f'firien li jkunu għadhom kif infatmu u adulti. Madankollu, it-test(ijiet) għandhom jitfasslu b'tali mod li jissodisfaw żewġ kriterji. L-ewwel nett, it-tagħlim għandu jiġi vvalutat jew bħala bidla fuq bosta provi jew sessjonijiet ripetuti ta' tagħlim, jew, f'testijiet li jinvolvu prova waħda, b'referenza għal kundizzjoni li tivverifika hemmx effetti mhux assoċjattivi tal-esperjenza ta' taħriġ. It-tieni, it-test(ijiet) għandu jinkludi xi kejl tal-memorja (tat-terminu qasir jew fit-tul) minbarra t-tagħim oriġinali (kisba), iżda dan il-kejl tal-memorja ma jistax ikun irrapportat fin-nuqqas ta' miżura ta' kisba miksuba mill-istess test. Jekk it-test(ijiet) tat-tagħlim u l-memorja juri/u effett tas-sustanza kimika tat-test, jistgħu jiġu kkunsidrati testijiet addizzjonali biex jiġu evitati interpretazzjonijiet alternattivi bbażati fuq alterazzjonijiet fil-kapaċitajiet sensorjali, motivazzjonali u/jew motorji. Minbarra dawn iż-żewġ kriterji ta' hawn fuq, huwa rakkomandat li t-test tat-tagħlim u l-memorja jingħażel fuq il-bażi tas-sensittività murija tiegħu għall-klassi tas-sustanza kimika investigata, jekk it-tali informazzjoni tkun disponibbli fit-tagħrif. Fin-nuqqas ta' din l-informazzjoni, eżempji ta' testijiet li jistgħu jsiru biex jiġu ssodisfati -kriterji ta' hawn fuq jinkludu: evitar passiv (43)(56)(57), tlaqqigħ ittardjat mal-pożizzjoni għall-far adult (58) u għall-far tarbija (59), il-kundizzjonament olfattiv (43)(60), il-labirint fl-ilma ta' Morris (61)(62)(63), il-labirint ta' Biel jew Cincinnati (64)(65), il-labirint b'fetħiet radjali (66), il-labirint T (43), u l-kisba u ż-żamma ta' mġiba kkontrollata minn skeda (26)(67)(68). Hemm testijiet addizzjonali deskritti fit-tagħrif dwar firien li jkunu għadhom kif infatmu (26)(27) u firien adulti (19)(20).

Awtopsja

38.   L-annimali materni jistgħu jiġu ewtanizzati wara l-ftim tal-ulied.

39.   L-evalwazzjoni newropatoloġika tal-ulied ser issir billi jintużaw tessuti minn annimali maqtulin b'mod dinjituż fil-PND 22 jew f'punt ta' żmien qabel bejn PND 11 u PND 22, kif ukoll fi tmiem l-istudju. Għal ulied maqtulin sal-PND 22, għandhom jiġu evalwati t-tessuti tal-moħħ; għal annimali maqtulin fit-tmiem, għandhom jiġu evalwati kemm it-tessuti tas-sistema nervuża ċentrali (CNS) kif ukoll it-tessuti tas-sistema nervuża periferali (PNS). L-annimali maqtulin fil-PND 22 jew qabel jistgħu jiġu fissati jew permezz ta' immersjoni jew perfużjoni. L-annimali maqtulin fi tmiem l-istudju għandhom jiġu fissati permezz ta' perfużjoni. L-aspetti kollha tat-tħejjija tal-kampjuni ta' tessut, mill-perfużjoni tal-annimali sad-dissezzjoni tal-kampjuni tat-tessuti, l-ipproċessar tat-tessuti, u t-tilwin tas-slides għadhom iħaddmu disinn kontrobilanċjat b'tali mod li kull lott ikun fih kampjuni rappreżentattivi minn kull grupp ta' doża. Tista' tinstab gwida addizzjonali dwar in-newropatoloġija fid-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru. 20(9), ara wkoll (103).

L-ipproċessar ta' kampjuni tat-tessuti

40.   Għandha tittieħed nota tal-anormalitajiet grossi kollha li jidhru fi żmien in-nekropsija. Il-kampjuni tat-tessut meħudin għandhom jirrappreżentaw ir-reġjuni l-kbar kollha tas-sistema nervuża. Il-kampjuni tat-tessut għandhom jinżammu b'mod fissattiv xieraq u jiġu pproċessati skont protokolli standardizzati ppubblikati dwar l-istoloġija (69)(70)(71)(103). L-impjantazzjoni tal-paraffina hija aċċettabbli għal tessuti tas-CNS u l-PNS, iżda l-użu ta' ożmju wara l-fissazzjoni, flimkien ma' impjantazzjoni tal-eposside, jista' jkun xieraq meta jkun hemm bżonn ta' grad ogħla ta' riżoluzzjoni (eż.,għal nervi periferali meta tkun suspettata newropatija periferali u/jew anaiżi morfometrika tan-nervi periferali). It-tessut tal-moħħ miġbur għal analiżi morfometrika għandu jiġi impjantat fil-midjums xierqa fil-livelli tad-doża kollha fl-istess ħin sabiex jiġu evitati oġġetti li jiċkienu li jistgħu jkunu assoċjati ma' ħażna mtawla f'fissattiv (6).

Eżami newropatoloġiku

41.   L-iskopijiet tal-eżami kwalitattiv huma:

(i)	li jidentifika reġjuni fis-sistema nervuża li jesibixxu evidenza ta' alterazzjonijiet newropatoloġiċi;

(ii)	li jidentifika tipi ta' alterazzjonijiet newropatoloġiċi li jirriżultaw minn esponiment għas-sustanza kimika tat-test; u

(iii)

li jiddetermina l-medda tas-severità tal-alterazzjonijiet newropatoloġiċi.

It-taqsimiet istoloġiċi rappreżentattivi mill-kampjuni tat-tessut għandhom jiġu eżaminati bil-mikroskopju minn patoloġista mħarreġ kif xieraq għal evidenza ta' alterazzjonijiet newropatoloġiċi. L-alterazzjonijiet newropatoloġiċi kollha għandhom jiġu assenjati grad suġġettiv li jindika s-severità. Tilwin b'ematossilina u eosina jista' jkun biżżejjed biex jiġu evalwati taqsimiet tal-moħħ minn annimali maqtulin b'mod dinjituż fil-PND 22, jew qabel. Madankollu, tilwin tal-mjelin (eż.,, luxol fast blue/cresyl violet) u tilwin lewn il-fidda (eż., tilwin ta' Bielschowsky jew Bodians) huma rakkomandati għat-taqsimiet tat-tessuti tas-CNS u l-PNS minn annimali maqtulin fi tmiem l-istudju. Soġġetti għall-ġudizzju professjonali tal-patoloġista u t-tip ta' alterazzjonijiet osservati, tilwin ieħor jista' jitqies xieraq biex jiġu identifikati u kkaratterizzati tipi partikolari ta' alterazzjonijiet (eż., proteina aċidika fibrillari glijali (GFAP) jew istokimika tal-lektina biex jiġu vvalutati alterazzjonijiet glijali u mikroglijali (72), fluoro-jade biex tiġi identifikata nekrożi (73)(74), jew tilwin tal-fidda speċifiku għad-deġenerazzjoni newrali (75)).

42.   Għandha ssir evalwazzjoni morfometrika (kwantitattiva) peress li din id-dejta tista' tgħin fl-identifikazzjoni ta' effett relatat mal-kura u hija utli fl-interpretazzjoni tad-differenzi relatati mal-kura fil-piż tal-moħħ jew il-morfoloġija (76)(77). It-tessut nervuż għandu jiġi kampjunat u jitħejja biex tkun tista' ssir evalwazzjoni morfometrika. L-evalwazzjonijiet morfometriċi jistgħu jinkludu eż., kejliet lineari jew areali ta' reġjuni speċifiċi tal-moħħ (78). Kejliet lineari jew areali jeħtieġu l-użu ta' taqsimiet omologi magħżulin bir-reqqa fuq il-bażi ta' punti referenzjarji mikroskopiċi affidabbli (6). Tista' tintuża l-istereoloġija biex jiġu identifikati effetti relatati mal-kura fuq parametri bħall-volum jew in-numru ta' ċelloli għal reġjuni newroanatomiċi speċifiċi (79)(80)(81)(82)(83)(84).

43.   L-imħuħ għandhom jiġu eżaminati għal kwalunkwe evidenza ta' alterazzjonijiet newropatoloġiċi relatati mal-kura u għandhom jittieħdu kampjuni adegwati mir-reġjuni ewlenin kollha tal-moħħ (eż., il-basal olfattivi, il-kortiċi ċerebrali, l-ippokampu, il-gangliji tal-bażi, it-talamu, l-ipotalamu, il-meżenċefalu (tektum, tegmentum, u pendunkuli ċerebrali), il-pont, il-medulla tawwalija, iċ-ċervellett) biex jiġi żgurat eżami dettaljat. Importanti li t-taqsimiet għall-annimali kollha jittieħdu fl-istess pjan. F'adulti maqtulin b'mod dinjituż fi tmiem l-istudju, għandhom jittieħdu kampjuni mit-taqsimiet rappreżentattivi tas-sinsla tad-dahar u l-PNS. Iż-żoni eżaminati għandhom jinkludu l-għajn bin-nerv ottiku u r-retina, is-sinsla tad-dahar fin-nefħiet ċervikali u lombari, il-fibri tal-għeruq dorsali u ventrali, in-nerv xjatiku prossimali, in-nerv tat-tibja prossimali (fl-irkoppa), u l-għeruq tal-muskolu tal-pexxul tan-nerv tat-tibja. It-taqsimiet tas-sinsla tad-dahar u tan-nerv periferali għandhom jinkludu kemm it-taqsimiet djagonali jew trasversali kif ukoll lonġitudinali.

44.   L-evalwazzjoni newropatoloġika għandha tinkludi eżami għal indikazzjonijiet ta' ħsara tal-iżvilupp fis-sistema nervaża (6)(85)(86)(87)(88)(89), minbarra l-alterazzjonijiet ċellolari (eż., vakwolazzjoni newronali, deġenrazzjoni, nekrożi) u bidliet fit-tessut (eż., glijożi, infiltrazzjoni lewkoċitika, formazzjoni ċistika). F'dan ir-rigward, importanti li l-effetti relatati mal-kura jiġu distinti minn avvenimenti normali tal-iżvilupp li jkunu magħrufin li jseħħu fi stadju tal-iżvilupp li jikkorrispondi għall-ħin tas-sagrifiċċju (90). L-eżempji ta' alterazzjonijiet sinifikanti li jindikaw ħsara tal-iżvilupp jinkludu, iżda mhumiex limitati għal:

—	alterazzjonijiet fid-daqs jew il-forma gross tal-basal olfattivi, iċ-ċerebru jew iċ-ċervellett,

—

alterazzjonijiet fid-daqs relattiv tal-bosta reġjuni tal-moħħ, inklużi tnaqqisijiet jew żidiet fid-daqs tar-reġjuni li jirriżultaw mit-telf jew il-persistenza ta' popolazzjonijiet normalment temporanji ta' ċelloli jew projezzjonijiet assonali (eż., saff ġerminali estern jew ċervellett, corpus callosum),

—

alterazzjonijiet fil-proliferazzjoni, il-migrazzjoni, u d-differenzazzjoni, kif indikat miż-żoni ta' apoptożi jew nekrożi eċċessiva, għoqiedi jew popolazzjonijiet mifruxin ta' newroni ektopiċi, diżorjentati jew malformati jew alterazzjonijiet fid-daqs releattiv tal-bosta saffi ta' strutturi kortikali,

—	alterazzjonijiet fil-mudelli ta' mjelinazzjoni, inkluż tnaqqis ġenerali fid-daqs jew tilwin alterat ta' strutturi mjelinati,

—	evidenza ta' idroċefalu, b'mod partikolari tkabbir tal-ventrikli, stenożi tal-akwedott ċerebrali u tidjiq tal-emisferi ċerebrali.

Analiżi tar-relazzjoni bejn id-doża u r-rispons tal-alterazzjonijiet newropatoloġiċi

45.   Hija rakkomandata l-proċedura bbażata fuq passi li ġejja għall-analiżijiet newropatoloġiċi kwalitattivi u kwantitattivi. L-ewwel nett, it-taqsimiet mill-grupp ta' doża għolja huma mqabblin ma' dawk tal-grupp ta' kontroll. Jekk ma tinstab ebda evidenza ta' alterazzjonijiet newropatoloġiċi fl-annimali tal-grupp ta' doża għolja, ma jkun hemm bżonn ta' ebda analiżi ulterjuri. Jekk tinsab evidenza ta' alterazzjonijiet newropatoloġiċi fil-grupp ta' doża għolja, jiġu eżaminati l-annimali mill-gruppi ta' doża intermedja u baxxa. Jekk il-grupp ta' doża għolja jintemm minħabba mewt jew tossiċità oħra ta' konfużjoni, il-gruppi ta' doża għolja u intermedja għandhom jiġu analizzati għal alterazzjonijiet newropatoloġiċi. Jekk ikun hemm xi indikazzjoni ta' newrotossoċità fil-gruppi ta' doża baxxa, għandha ssir analiżi newropatoloġika f'dawk il-gruppi. Jekk tinstab xi alterazzjoni newropatoloġika relatata mal-kura fl-eżami kwalitattiv jew kwantitattiv, għandha tiġi ddeterminata d-dipendenza fuq id-doża tal-inċidenza, il-frekwenza u l-grad ta' severità tal-leżjonijiet jew tal-alterazzjonijiet morfometriċi, fuq il-bażi ta' evalwazzjoni tal-annimali kollha mill-gruppi ta' doża kollha. f'din l-evalwazzjoni għandhom ikunu inklużi r-reġjuni tal-moħħ li jesibixxu xi evidenza ta' alterazzjoni newropatoloġika għandhom ikunu inklużi. Ir-reġjuni kollha tal-moħħ li jesibixxu xi evidenza ta' alterazzjoni newropatoloġika għandhom Għal kull tip ta' leżjoni, għandhom jiġu deskritti l-karatteristiċi użati biex jiġi definit kull grad ta' severità, billi jiġu indikati l-karatteristiċi użati għad-differenzazzjoni ta' kull grad. Il-frekwenza ta' kull tip ta' leżjoni u l-grad ta' severità tagħha għandhom jiġu rreġistrati u għandha ssir analiżi statistika biex tiġi evalwata l-għamla ta' relazzjoni bejn id-doża u r-rispons. Huwa rakkomandat li jintużaw slides kodifikati (91).

DEJTA U RAPPORTAR

Dejta

46.   Id-dejta għandha tiġi rrapportata b'mod individwali u tinġabar fil-qosor f'forma tabulari, li għal kull grupp tat-test turi t-tipi ta' bidla u n-numru ta' ommijiet, l-ulied skont is-sess, u l-boton li juru kull tip ta' bidla. Jekk ikun sar esponiment dirett tal-frieħ wara t-twelid, għandhom jiġu rrapportati r-rotta, id-durata u l-perjodu ta' esponiment.

Evalwazzjoni u interpretazzjoni tar-riżultati

47.   Studju dwar in-newrotossiċità tal-iżvilupp ser jipprovdi informazzjoni dwar l-effetti ta' esponiment ripetut għal sustanza kimika matul żvilupp in utero u kmieni wara t-twelid. Peress li jinxteħet enfasi kemm fuq punti aħħarin tat-tossiċità ġenerali kif ukoll tan-newrotossiċità tal-iżvilupp, ir-riżultati tal-istudju ser jippermettu li ssir distinzjoni bejn effetti tan-newrożvilupp li jseħħu fin-nuqqas ta' tossiċità materna, u dawk li jkunu espressi biss f'livelli li huma tossiċi wkoll għall-annimal matern. Minħabba l-interrelazzjonijiet kumplessi bejn id-disinn tal-istudji, l-analiżi statistika, u l-importanza bijoloġika tad-dejta, interpretazzjoni adegwata tad-dejta dwar in-newrotossiċità tal-iżvilupp ser tinvolvi ġudizzju tal-esperti (107)(109). L-interpretazzjoni tar-riżultati tat-test għandha tuża approċċ ta' piż tal-evidenza (20)(92)(93)(94). Għandhom jiġu diskussi l-mudelli tas-sejbiet tal-imġiba jew morfoloġiċi, jekk ikunu preżenti, kif ukoll evidenza tar-rispons għad-doża. Dejta mill-istudji kollha rilevanti għall-evalwazzjoni tan-newrotossiċità tal-iżvilupp, inklużi studji jew rapporti ta' każijiet epidemjoloġiċi tal-bniedem, u studji sperimentali fuq annimali (eż., dejta tossikokinetika, informazzjoni struttura-attività, dejta minn studji oħrajn dwar it-tossiċità) għandha tkun inkluża f'din il-karatterizzazzjoni. Dan jinkludi r-relazzjoni bejn id-dożi tas-sustanza kimika tat-test u l-preżenza jew in-nuqqas, l-inċidenza, u d-daqs ta' kwalunkwe effett newrotissiku għal kull sess (20)(95).

48.   L-evalwazzjoni tad-dejta għandha tinkludi taħdita kemm fuq l-importanza bijoloġika kif ukoll dik statistika. L-analiżi statistika għandha titqies bħala għodda li tiggwida minflok tiddetermina l-interpretazzjoni tad-dejta. In-nuqqas ta' importanza statistika ma għandux ikun l-unika bażi għall-konklużjoni ta' nuqqas ta' effett relatat mal-kura, u lanqas mal-importanza statistika ma għandha tkun l-unika ġustifikazzjoni għall-konklużjoni ta' effett relatat mal-kura. Bħala protezzjoni kontra sejbiet negattivi foloz u d-diffikultajiet inerenti fil-‘prova ta' negattiv’, għandha tiġi diskussa dejta kontroll storiku u pożittiv disponibbli, speċjalment meta ma jkun hemm l-ebda effett relatat mal-kura (102)(106). Il-probabilità ta' pożittivi foloz għandha tiġi diskussa fid-dawl tal-evalwazzjoni statistika sħiħa tad-dejta (96). L-evalwazzjoni għandha tinkludi r-relazzjoni, jekk ikun hemm waħda, bejn alterazzjonijiet newropatoloġiċi u tal-imġiba osservati.

49.   Ir-riżultati kollha għandhom jiġu analizzati billi jintużaw mudelli statistiċi xierqa għad-disinn sperimentali (108). L-għażla ta' analiżi parametrika jew nonparametrika għandha tkun iġġustifikata billi jiġu kkunsidrati fatturi bħall-għamla tad-dejta (trasformata jew le) u d-distribuzzjoni tagħha, kif ukoll ir-robustezza relattiva tal-analiżi statistika magħżula. L-iskop u d-disinn tal-istudju għandhom jiggwida l-għażla tal-analiżijiet statistċi biex jiġu minimizzati żbalji tat-Tip I (pożittiv falz) u tat-Tip II (negattiv falz)(96)(97)(104)(105). L-istudji tal-iżvilupp li jużaw speċi li jwelldu ħafna frieħ u li fihom jiġu ttestjati diversi ħrief għal kull boton għandhom jinkludu l-boton fil-mudell statistiku bħala protezzjoni kontra rati ta' żball tat-Tip I imkabbrin (98)(99)(100)(101). L-unità statistika tal-kejl għandha tkun il-boton u mhux il-ferħ. L-esperimenti għandhom jitfasslu b'tali mod li l-aħwa tal-boton ma jitqisux osservazzjonijiet indipendenti. Kwalunkwe punt aħħari mkejjel b'mod ripetut fl-istess suġġett għandu jiġi analizzat billi jintużaw mudelli statistiċi li jieħdu f'kunsiderazzjoni n-nuqqas ta' dipendenza ta' dawk il-kejliet.

Rapport tat-test

50.   Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Sustanza kimika tat-test:

—	in-natura fiżika u, fejn rilevanti, il-proprjetajiet fiżjokimiċi,

—	dejta ta' identifikazzjoni, inkluż is-sors,

—	il-purità tal-preparazzjoni, u impuritajiet magħrufin u/jew antiċipati.

Veikolu (jekk xieraq):

—	ġustifikazzjoni tal-għażla tal-veikolu, jekk mhuwiex ilma jew soluzzjoni salmastra fiżjoloġika.

Annimali tat-test:

—	l-ispeċi u r-razza użati, u ġustifikazzjoni jekk ma jintużax far,

—	il-fornitur tal-annimali tat-test,

—	in-numru, l-età fil-bidu, u s-sess tal-annimali,

—	is-sors, il-kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija, id-dieta, l-ilma, eċċ.,

—	il-piżijiet individwali tal-annimali fil-bidu tat-test.

Kundizzjonijiet tat-test:

—	il-ħsieb wara l-għażla tal-livell ta' doża,

—	il-ħsieb wara r-rotta tad-dożaġġ u l-perjodu ta' żmien,

—	l-ispeċifikazzjonijiet tad-dożi mogħtijin, inklużi d-dettalji tal-veikolu, il-volum u l-forma fiżika tal-materjal mogħti,

—	dettalji dwar il-formulazzjoni tas-sustanza kimika tat-test/il-preparazzjoni tad-dieta, il-konċentrazzjoni, l-istabilità u l-omoġenità miksubin tal-preparazzjoni,

—	il-metodu użat għall-identifikazzjoni unika tal-ommijiet u l-ulied,

—	deskrizzjoni dettaljata tal-proċedura/i aleatorja/i użata/i biex l-ommijiet jiġu assenjati għal gruppi tal-kura, biex jingħażlu l-frieħ għall-għażla, u biex il-frieħ jiġu assenjati għal gruppi tat-test,

—	dettalji tal-għoti tas-sustanza kimika tat-test,

—	konverżjoni minn konċentrazzjoni tad-dieta/ilma tax-xorb jew tas-sustanza kimika tat-test li tittieħed man-nifs (ppm) għad-doża propja (mg/kg piż tal-ġisem/jum), jekk applikabbli,

—	il-kundizzjonijiet ambjentali,

—	dettalji tal-kwalità tal-ikel u l-ilma (eż., tat-tapp, distillat);

—	id-dati ta' meta beda u spiċċa l-istudju.

Osservazzjonijiet u proċeduri tat-test:

—	deskrizzjoni dettaljata tal-proċeduri użati biex l-osservazzjonijiet u l-proċeduri jiġu standardizzati kif ukoll definizzjonijiet operazzjonali għall-punteġġ tal-osservazzjonijiet;

—	lista tal-proċeduri kollha tat-test użati, u ġustifikazzjoni għall-użu tagħhom;

—	dettalji tal-proċeduri tal-imġiba/funzjonali, patoloġiċi, newrokimiċi jew elettrofiżjoloġiċi użati, inklużi informazzjoni u dettalji dwar strumenti awtomatizzati;

—	proċeduri għall-kalibraġġ u l-iżgurar tal-ekwivalenza tal-istrumenti u l-ibbilanċjar tal-gruppi tal-kura fil-proċeduri tal-ittestjar;

—	ġustifikazzjoni qasira li tispjega kwalunkwe deċiżjoni li tinvolvi ġudizzju professjonali.

Riżultati (individwali u sommarju, inklużi l-medja u l-varjanza meta jkunu xierqa):

—	in-numru ta' annimali fil-bidu tal-istudju u n-numru fi tmiem l-istudju,

—	in-numru ta' annimali u boton użati għal kull metodu tat-test,

—	in-numru ta' identifikazzjoni ta' kull annimal u l-boton li ġie minnu,

—	id-daqs tal-boton u l-piż medju fil-bidu skont is-sess,

—	dejta dwar il-piż tal-ġisem u dwar il-bidla fil-piż tal-ġisem, inkluż il-piż tal-ġisem terminali għall-ommijiet u l-ulied,

—	dejta dwar il-konsum ta' ikel, u dejta dwar il-konsum ta' ilma jekk xierqa (eż., jekk is-sustanza kimika tat-test tingħata permezz tal-ilma),

—	dejta dwar ir-rispons tossiku skont is-sess u l-livell ta' doża, inklużi sinjali tat-tossiċità jew il-mortalità, inklużi l-ħin u l-kawża tal-mewt, jekk xieraq,

—	in-natura, is-severità, id-durata, il-jum tal-bidu, il-ħin tal-ġurnata, u l-kors sussegwenti tal-osservazzjonijiet kliniċi dettaljati,

—	il-punteġġ f'kull fażi tal-iżvilupp (il-piż, il-maturità sesswali u l-ontoġenija tal-imġiba) f'kull ħin ta' osservazzjoni,

—	deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet kollha tal-imġiba, funzjonali, newropatoloġiċi, newrokimiċi, elettrofiżjoloġiċi skont is-sess, inklużi kemm żidiet kif ukoll tnaqqisiet minn kontrolli,

—	sejbiet dwar in-nekropsija,

—	piżijiet tal-ġisem,

—	kwalunkwe dijanjosi msawra minn sinjali newroloġiċi u leżjonijiet, inklużi mard jew kundizzjonijiet li jseħħu b'mod naturali,

—	stampi ta' sejbiet eżemplari,

—	stampi b'enerġija baxxa biex tiġi vvalutata l-omoloġija tas-sezzjonijiet użati għall-morfometrija,

—	dejta dwar l-assorbiment u l-metaboliżmu, inkluża dejta komplimentari minn studju tossikokinetiku separat, jekk disponibbli,

—	it-trattament statistiku tar-riżultati, inklużi mudelli statistiċi użati biex tiġi analizzata d-dejta, u r-riżultati, irrilevanti jekk kinux sinifikanti jew le,

—	lista tal-persunal tal-istudju, inkluż it-taħriġ professjonali.

Diskussjoni tar-riżultati:

—	informazzjoni dwar ir-rispons għad-doża, skont is-sess u l-grupp,

—	relazzjoni ta' kwalunkwe effett tossiku ieħor ma' konklużjoni dwar il-potenzjal newrotissiku tas-sustanza kimika tat-test, skont is-sess u l-grupp,

—	l-impatt ta' kwalunkwe informazzjoni tossikokinetika fuq il-konklużjonijiet,

—	is-similaritajiet tal-effetti ta' kwalunkwe newrotossiku magħruf,

—	dejta li ssostni l-affidabilità u s-sensittività tal-metodu tat-test (jiġifieri dejta ta' kontroll storiku u pożittiv),

—	ir-relazzjonijiet, jekk jeżistu, bejn l-effetti newropatoloġiċi u funzjonali,

—	l-NOAEL jew id-doża ta' riferiment għal ommijiet u ulied, skont is-sess u l-grupp.

Konklużjonijiet:

—	diskussjoni dwar l-interpretazzjoni ġenerali tad-dejta bbażata fuq ir-riżultati, inkluża konklużjoni dwar jekk is-sustanza kimika tat-test ikkaġunatx newrotossiċità tal-iżvilupp u l-NOAEL.

TAGĦRIF

(1)

OECD (1995). Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on Reproduction and Developmental Toxicity. Kopenħagen, id-Danimarka, 13-14 ta' Ġunju 1995.

(2)

US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Disponibbli fuq: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].

(3)

US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Disponibbli fuq: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].

(4)

Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79-91.

(5)

Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111.

(6)

Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109:93-100.

(7)

OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., Stati Uniti, 23-25 ta' Ottubru 2000.

(8)

OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Pariġi. Lulju 2008. Disponibbli fuq: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].

(9)

OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Pariġi, Settembru 2003. Disponibbli fuq: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html].

(10)

Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.

(11)

Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000) Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.

(12)

Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188-197.

(13)

Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998) Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.

(14)

Il-Kapitolu B.34 ta' dan l-Anness, Studju dwar it-tossiċità riproduttiva ta' ġenerazzjoni waħda.

(15)

Il-Kapitolu B.35 ta' dan l-Anness, Studju dwar it-tossiċità riproduttiva ta' żewġ ġenerazzjonijiet.

(16)

Il-Kapitolu B.43 ta' dan l-Anness, Studju dwar in-Newrotossiċità fir-Rodituri.

(17)

Il-Kapitolu B.31 ta' dan l-Anness, Studju dwar it-tossiċità tal-iżvilupp qabel it-twelid.

(18)

Id-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta' Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintużaw għal skopijiet xjentifiċi. ĠU L 276, 20.10.2010, p. 33.

(19)

WHO (1986) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals, (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, Stati Uniti. Disponibbli fuq: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].

(20)

WHO (2001) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Ġinevra. Disponibbli fuq: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].

(21)

Chang, L.W., Slikker, W. (1995) Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.

(22)

De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19:499-509.

(23)

Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2-6.

(24)

Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27:110-112.

(25)

Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118-136.

(26)

Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979) Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

(27)

Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987) Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.

(28)

Zoetis, T., Walls, I. (2003) Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.

(29)

Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87-94.

(30)

Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4.

(31)

ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5 A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use.

(32)

Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433-439.

(33)

Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449-457.

(34)

Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383-390.

(35)

Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350-365.

(36)

Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579-586.

(37)

Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298-303.

(38)

Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489-95.

(39)

Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896-920.

(40)

Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, pp. 67-100.

(41)

Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53-66.

(42)

Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, New York, pp. 37-82.

(43)

Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117-129.

(44)

Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247-260.

(45)

Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599-609.

(46)

Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405-411.

(47)

Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Physiol. Behav., 64:661-669.

(48)

Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589-591.

(49)

Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In: Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, pp. 287-351

(50)

Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107-128.

(51)

Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. In Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, pp. 181-211.

(52)

Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8:199-211.

(53)

Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25-30.

(54)

Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437–445.

(55)

Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. In: Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. pp. 125-145.

(56)

Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321-332.

(57)

Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247-296.

(58)

Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237-244.

(59)

Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98-105.

(60)

Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465-479.

(61)

Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47-60.

(62)

Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29-69.

(63)

D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60-90.

(64)

Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235-241.

(65)

Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387-399.

(66)

Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327-332.

(67)

Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342-352.

(68)

Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338–341.

(69)

Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 122-131.

(70)

Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994) Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington, DC, pp. 84-107.

(71)

Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002) Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, Londra.

(72)

Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291-304.

(73)

Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123-130.

(74)

Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53:365-372.

(75)

De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545-561.

(76)

De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745-755.

(77)

De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417-432.

(78)

Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129–135.

(79)

Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.

(80)

Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305-310.

(81)

Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262-268.

(82)

Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26:707-710.

(83)

West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51-61.

(84)

Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130: 813–831.

(85)

Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113-121.

(86)

Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294-298.

(87)

Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. In: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, pp. 3-41.

(88)

Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283:70-74.

(89)

Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056–1060.

(90)

Friede, R. L. (1989) Developmental Neuropathology. Second edition. Springer-Verlag, Berlin.

(91)

House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127-133.

(92)

Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401-405.

(93)

US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644 A.

(94)

US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274-56322.

(95)

Danish Environmental Protection Agency (1995) Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.

(96)

Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5:113-126.

(97)

Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21-27.

(98)

Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329-335.

(99)

Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12:165-172.

(100)

Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221-228.

(101)

Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587-90.

(102)

Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345-352.

(103)

Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A 'best practices' approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing — for today. Toxicol. Pathol. 34:296-313.

(104)

Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205-210.

(105)

Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295-301.

(106)

Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266-287.

(107)

Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288-325.

(108)

Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326-348.

(109)

Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349-381.

Figura 1

Skema ġenerali ta' ttestjar għat-testijiet funzjonali/tal-imġiba, evalwazzjoni tan-newropatoloġija, u l-piżijiet tal-moħħ. Din id-dijagramma hija bbażata fuq id-deskrizzjoni fil-paragrafi 13-15 (PND = jum ta' wara t-twelid). L-eżempji tal-assenjament tal-annimali jingħataw fl-Appendiċi 1

B.54.   BIJOASSAĠĠ UTEROTROFIKU F'RODITURI: TEST TA' TGĦARBIL TA' TERMINU QASIR GĦAL PROPRJETAJIET ESTROĠENIĊI

INTRODUZZJONI

1.   Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għall-Linja Gwida tat-Test (TG) tal-OECD Nru 440 (2007). L-OECD nediet attività ta' profil għoli fl-1998 sabiex jiġu riveduti l-linji gwida eżistenti u jiġu żviluppati linji gwida ġodda għat-tgħarbil u l-ittestjar ta' sustanzi potenzjali li jfixklu s-sistema endokrinali (1). Element minnhom tal-attività kien li tiżviluppa linja gwida tat-test għal Bijoassaġġ Uterotrofiku ta' rodituri. Imbagħad, il-Bijoassaġġ Uterotrofiku tar-rodituri għaddha minn programm estensiv ta' validazzjoni inkluża l-kompilazzjoni ta' dokument ta' sfond dettaljat (2)(3) u t-twettiq ta' studji estensivi fi ħdan u bejn laboratorji biex jintwerew ir-relevanza u r-riproduċibbiltà tal-bijoassaġġ b'estroġen ta' referenza potenti, agonisti riċetturi dgħajfin tal-estroġen, antagnist riċettur qawwi tal-estroġen, u sustanza kimika ta' referenza negattiva (4)(5)(6)(7)(8)(9). Dan il-metodu ta' ttestjar B.54 huwa r-riżultat tal-esperjenza miksuba matul il-programm tat-test ta' validazzjoni u r-riżultati miksubin fih b'agonisti estroġeniċi.

2.   Il-Bijoassaġġ Uterotrofiku huwa test ta' tgħarbil b'terminu qasir li oriġina fis-snin tletin (27)(28) u ġie standardizzat għall-ewwel darba għat-tgħarbil minn kumitat tal-esperti fl-1962 (32)(35). Huwa msejjes fuq iż-żieda fil-piż uterin jew ir-rispons uterotrofiku (għal analiżi, ara 29). Jevalwa l-ħila ta' sustanza kimika sabiex tniedi attivitajiet bijoloġiċi konsistenti ma' agonisti jew antagonisti ta' estroġeni naturali (eż. 17ß-estradjol), madankollu, l-użu tagħha għall-identifikazzjoni ta' antagonist huwa ferm inqas komuni għall-agonisti. L-utru jirrispondi għal estroġeni b'żewġ modi. Rispons inizjali huwa żieda fil-piż minħabba imbibizzjoni ta' ilma. Dan ir-rispons huwa segwit minn żieda fil-piż minħabba tkabbir fit-tessut (30). Ir-risponsi tal-utri f'firien u ġrieden huma komparabbli b'mod kwalitattiv.

3.   Dan il-bijoassaġġ iservi bħala assaġġ in vivo u l-applikazzjoni tiegħu għandha titqies fil-kuntest tal-‘Qafas Kunċettwali tal-OECD għall-Ittestjar u l-Valutazzjoni tas-Sustanzi li Jfixklu s-Sistema Endokrinali’ (Appendiċi 2). F'dan il-Qafas Kunċettwali, il-Bijoassaġġ Uterotrofiku jinsab fil-Livell 3 bħala assaġġ in vivo li jipprovdi dejta dwar mekkaniżmu endokrinali uniku, jiġifieri l-estroġeniċità.

4.   Il-Bijoassaġġ Uterotrofiku huwa maħsub sabiex ikun inkluż f'sensiela ta' testijiet in vitro u in vivo biex jiġu identifikati sustanzi kimiċi b'potenzjal li jinteraġixxu mas-sistema endokrinali, li finalment iwasslu għal valutazzjonijiet tar-riskju għas-saħħa tal-bniedem jew l-ambjent. Il-programm ta' validazzjoni tal-OECD uża kemm agonisti b'saħħithom kif ukoll dgħajfin biex jevalwa l-prestazzjoni tal-assaġġ fl-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi estroġeniċi (4)(5)(6)(7)(8). B'hekk, is-sensittività tal-proċedura tat-test għal agonisti tal-estroġen intweriet sew flimkien ma' riproduċibilità tajba intra u interlaboratorja.

5.   Fir-rigward tal-kimiċi negattivi, fil-programm ta' valutazzjoni kienet inkluża biss sustanza kimika ‘negattiva’ ta' referenza waħda li diġà kienet irrapportata negattiva minn assaġġ uterotrofiku kif ukoll tqabbad mar-riċettur in vitro u assaġġi ta' riċetturi, iżda ġiet evalwata dejta oħra dwar it-testijiet, mhux relatata mal-programm ta' validazzjoni tal-OECD, li kompliet issostni l-ispeċifiċità tal-Bijoassaġġ Uterotrofiku għat-tgħarbil ta' agonisti tal-estroġen (16).

KUNSIDERAZZJONIJIET U LIMITAZZJONIJIET INIZJALI

6.   Agonisti u antagonisti tal-estroġen jaġixxu bħala ligandi għal riċetturi tal-estroġen α and β u jistgħu jattivaw jew jinibixxu, rispettivament, l-azzjoni transkrizzjonali tar-riċetturi. Dan jista' jkollu l-potenzjal li jwassal għal perikli tas-saħħa avversa, inklużi effetti fuq ir-riproduzzjoni u l-iżvilupp. Għaldaqstant, hemm il-bżonn li sustanza kimika tiġi vvalutata u evalwata bħala agonista jew antagonista possibbli tal-estroġen. Filwaqt li informattiva, l-affinità ta' ligand għal riċettur tal-estroġen jew attivazzjoni transkrizzjonali ta' ġeni rapportaturi in vitro hija waħda mill-bosta determinanti ta' periklu possibbli. Determinanti oħrajn jistgħu jinkludu attivazzjoni u diżattivazzjoni metabolika malli jidħlu fil-ġisem, distribuzzjoni f'tessuti fil-mira, u tneħħija mill-ġisem, xi ħaġa li tal-inqas tiddependi b'mod parzjali fuq ir-rotta tal-amministrazzjoni u s-sustanza kimika li tkun qed tiġi ttestjata. Dan iwassal għall-bżonn li titgħarbel l-attività possibbli ta' sustanza kimika in vivo f'kundizzjonijiet rilevanti, sakemm il-karatteristiċi dwar is-sustanza kimika rigward l-Assorbiment — id-Distribuzzjoni — il-Metaboliżmu — l-Eliminazzjoni (ADME) ma jkunux diġà pprovdew l-informazzjoni xierqa. It-tessuti tal-utri jirrispondu bi tkabbir mgħaġġel u qawwi għall-istimolu mill-estroġeni, b'mod partikolari f'rodituri tal-laboratorju, li għandhom ċiklu estruż li jdum madwar 4 ijiem. Speċi ta' rodituri, b'mod partikolari l-firien, spiss jintużaw fi studji dwar it-tossiċità għal karatterizzazzjoni tal-periki. Għaldaqstant, l-utru tar-rodituri huwa organu mira xieraq għat-tgħarbil in vivo ta' agonisti u antagonisti tal-estroġen.

7.   Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat fuq dawk il-protokolli mħaddmin fl-istudju ta' validazzjoni tal-OECD li ntwera li huwa affidabbli u ripetibbli fi studji intra u interlaboratorji (5)(7). Bħalissa, hemm żewġ metodi disponibbli, jiġifieri l-metodu tal-annimal mara adulta b'ovarettomija (metodu ovx-adult) u l-metodu tal-annimal mara immatura mingħajr ovarettomija (metodu immatur). Fil-programm tat-test ta' validazzjoni tal-OECD intwera li ż-żewġ metodi għandhom sensittività u riproduċibbiltà paragunabbli. Madankollu, l-immatur, peress li għandu assi ipotalamiku-pitwitarju-gonadali (HPG) intatt, huwa kemxejn inqas speċifiku iżda jkopri ambitu usa' ta' investigazzjoni mill-annimal ovarettomjat għaliex kapaċi jwieġeb għal sustanzi kimiċi li jinteraġixxu mal-assi HPG minflok ir-riċettur tal-estroġen biss. L-assi HGP tal-far huwa funzjonali fl-età ta' madwar 15-il jum. Qabel din, il-pubertà ma tistax titħaffef b'kuri bħal GnRH. Malli l-annimali nisa jibdew jilħqu l-pubertà, qabel il-ftuħ vaġinali, l-annimali nisa ser ikollhom ċikli silenzjużi li ma jirriżultawx fi ftuħ vaġinali jew ovulazzjoni, iżda hemm xi bidliet ormonali. Jekk sustanza kimika tistimola l-assi HPD b'mod dirett jew indirett, jirriżultaw pubertà prekoċi, ovluzzjoni bikrija u ftuħ vaġinali mħaffef. Mhux biss is-sustanzi kimiċi li jaġixxu fuq l-assi HPG jagħmlu dan iżda ċerti dieti b'livelli ogħla ta' enerġija metabolizzabbli minn oħrajn ser jistimolaw it-tkabbir u jħaffu l-ftuħ vaġinali bla ma jkunu estroġeniċi. It-tali sustanzi kimiċi ma jinduċux rispons uterotrofiku f'annimali adulti OVX peress li l-assi HPG tagħhom ma jaħdimx.

8.   Għal raġunijiet ta' benessri tal-annimali, għandha tingħata preferenza lill-metodu billi jintużaw firien immaturi, billi tiġi evitata kura ta' qabel il-kirurġija tal-annimali u jiġi evitat nuqqas ta' użu possibbli ta' dawk l-annimali li jindikaw kwalunkwe evidenza ta' dħul fil-fażi estruża (ara l-paragrafu 30).

9.   Ir-rispons uterotrofiku mhuwiex kompletament ta' oriġini estroġenika, jiġifieri sustanzi kimiċi li mhumiex agonisti jew antagonisti ta' estroġeni jistgħu jipprovdu rispons ukoll. Pereżempju, dożi relattivament għoljin ta' proġesteron, testosteron, jew diversi proġestini sintetiċi kollha jistgħu jwasslu għal rispons stimolattiv (30). Kwalunkwe rispons jista' jkun analizzat b'mod istoloġiku għal keratinizzazzjoni u kornifikazzjoni tal-vaġina (30). Tkun xi tkun l-oriġini possibbli tar-rispons, riżultat pożittiv ta' Bijoassaġġ Uterotrofiku normalment għandu jniedi azzjonijiet għal iktar kjarifika. Evidenza addizzjonali tal-estroġeniċità tista' tiġi minn assaġġi in vitro, bħall-assaġġi li jaqbdu mal-ER u assaġġi ta' attivazzjoni transkrizzjonali, jew minn assaġġi in vivo oħrajn bħall-assaġġ tal-pubertà tal-annimali nisa.

10.   Peress li l-Bijoassaġġ Uterotrofiku jservi bħala assaġġ tat-tgħarbil in vivo, l-approċċ ta' validazzjoni meħud qeda kemm kunsiderazzjonijiet relatati mal-benessri tal-annimali kif ukoll strateġija ta' ttestjar b'saffi. Għal dan l-għan, sar sforz biex jiġu vvalidti b'mod rigoruż ir-riproduċibilità u s-sensittività għall-estroġeniċità — it-tħassib ewlieni għal ħafna susanzi kimiċi-, filwaqt li ftit li xejn sar sforz fir-rigward tal-komponent tal-antiestroġeniċità tal-assaġġ. Huwa biss antiestroġen wieħed b'attività b'saħħitha li ġie ttestjat peress li n-numru ta' sustanzi kimiċi bi profil antiestroġeniku ċar (mhux oskurat minn xi attività estroġenika) huwa ferm limitat. B'hekk, dan il-metodu ta' ttestjar huwa ddedikat għall-protokoll estroġeniku, filwaqt li l-protokoll li jiddeskrivi l-modalità antagonista tal-assaġġ huwa inkluż f'Dokument ta' Gwida (37). Ir-riproduċibilità u s-sensittività tal-assaġġ għas-sustanzi kimiċi b'attività purament antiestroġenika ser ikunu definiti b'mod iktar ċar iktar 'il quddiem, wara li l-proċedura tat-test tkun daħlet fir-rutina tal-użu għal ċertu żmien u jkunu ġew identifikati iktar sustanzi kimiċi b'din il-modalità ta' azzjoni.

11.   Huwa rikonoxxut li l-proċeduri kollha bbażati fuq annimali ser jikkonformaw mal-istandards lokali tal-indukrar tal-annimali; id-deskrizzjonijiet tal-indukrar u l-kura stabbiliti hawn taħt huma standards minimi tal-prestazzjoni, u ser ikunu sostitwiti minn regolamenti lokali bħad-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta' Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintużaw għal skopijiet xjentifiċi (38). Gwida ulterjuri dwar it-trattament umanitarju tal-annimali tingħata mill-OECD (25).

12.   Bħal bl-assaġġ kollha li jużaw annimali ħajjin, importanti li jkun żgurat li d-dejta hija verament neċessarja qabel ma jinbeda l-assaġġ. Pereżempju, żewġ kundizzjonijiet li fihom tista' tkun meħtieġa d-dejta huma:

—	potenzjal għoli ta' esponiment (Livell 1 tal-Qafas Kunċettwali, Appendiċi 2) jew indikazzjonijiet għal estroġeniċità (Livell 2) biex jiġi investigat jekk it-tali effetti jistgħux iseħħu in vivo,

—	effetti li jindikaw estroġeniċità f'testijiet in vivo tal-Livell 4 jew 5 biex ikun sostanzjat li l-effetti kienu relatati ma' mekkaniżmu estroġeniku li ma jistax jintwera permezz ta' test in vitro.

13.   Id-definizzjonijiet użati f'dan il-metodu ta' ttestjar jingħataw fl-Appendiċi 1.

IL-PRINĊIPJU TAT-TEST

14.   Il-Bijoassaġġ Uterotrofiku jiddependi għas-sensittività tiegħu fuq sistema ta' ttestjar tal-annimali li fiha l-assi ipotalamiku-pitwitarju-ovarju mhuwiex funzjonali, xi ħaġa li twassal għal livelli endoġeni baxxi ta' estroġen li jiċċirkola. Dan ser jiżgura piż uterin bażi baxx u medda massima ta' rispons għal estroġeni amministrati. Żewġ stati sensittivi tal-estroġen fir-roditur mara jissodisfaw dan ir-rekwiżit:

(i)	annimali nisa immaturi wara l-ftim u qabel il-pubertà, u

(ii)	annimali nisa żgħażagħ wara ovarettomija b'ħin adegwat sabiex it-tessuti tal-utri jagħmlu rigress.

15.   Is-sustanza kimika tat-test tingħata kuljum permezz ta' gavage orali jew tilqima taħt il-ġilda. Dożi tas-sustanza kimika tat-test gradwati jingħataw lil minimu ta' żewġ gruppi tal-kura (ara l-paragrafu 33 għal gwida) ta' annimali sperimentali billi jintuża livell wieħed ta' doża għal kull grupp u perjodu ta' għoti ta' tliet ijiem konsekuttivi għal metodu immatur u perjodu ta' għoti minimu ta' tliet ijiem konsekuttivi għall-metodu adulti ovx. L-annimali huma nekropsjati madwar 24 siegħa wara l-aħħar doża. Għal agonisti tal-estroġen, il-piż uterin medju tal-gruppi ta' annimali kkurati fir-rigward tal-grupp veikolu huwa vvalutat għal żieda statistikament importanti. Żieda statistikament importanti fil-piż uterin medju ta' grupp tat-test tindika rispons pożittiv f'dan il-bijoassaġġ.

DESKRIZZJONI TAL-METODU

Għażla tal-ispeċi ta' annimali

16.   Jistgħu jintużaw razez ta' rodituri tal-laboratorju użati spiss. Bħala eżempju, matul il-validazzjoni intużaw ir-razez Sprague-Dawley u Wistar ta' firien. Razez b'utri magħrufin jew suspettati li huma inqas risponsivi ma għandhomx jintużaw. Il-laboratorju għandu juri s-sensittività tar-razza użata kif deskritta fil-paragrafi 26 u 27.

17.   Il-far u l-ġurdien intużaw spiss fil-Bijoassaġġ Uterotrofiku sa mis-snin tletin. L-istudji ta' validazzjoni tal-OECD saru biss b'firien fuq il-bażi ta' fehim li ż-żewġ speċi huma mistennija jkunu ekwivalenti u għalhekk, speċi waħda tkun biżżejjed għall-validazzjoni madwar id-dinja sabiex jiġu ffrankati riżorsi u annimali. Il-far huwa l-ispeċi tal-għażla f'ħafna mill-istudji dwar it-tossiċità riproduttiva u tal-iżvilupp. Peress li teżisti database storika vasta għal firien u, għalhekk, sabiex jitwessa' l-ambitu tal-metodu ta' ttestjar tal-Bijoassaġġ Utertrofiku f'rodituri għall-użu ta' ġrieden bħala speċi tat-test, sar studju limitat ta' validazzjoni ta' segwitu fil-ġrieden (16). Ingħażel approċċ komparattiv b'numru limitat ta' sustanzi kimiċi tat-test, laboratorji li jieħdu sehem u mingħajr ittestjar ta' kampjun kodifikat sabiex jinżamm l-iskop oriġinali biex jiġu ffrankati riżorsi u annimali. Dan l-istudju komparattiv ta' validazzjoni juri għall-Bijoassaġġ Uterotrofiku fi ġrieden ovarjettomizzati żgħażagħ li, b'mod kwalitattiv u kwantitattiv, id-dejta miksuba f'firien u ġrieden jikkorrispondi sew għal xulxin. Meta r-riżultat tal-Bijoassaġġ Uterotrofiku jista' jkun preliminari għal studju fit-tul, dan jippermetti sabiex fiż-żewġ studji jintużaw annimali mill-istess razza u sors. L-approċċ komparattiv kien limitat għall-ġrieden OVX u r-rapport ma jipprovdix dejta robusta stabbilita biex jiġi vvalidat il-mudell immatur, u b'hekk il-mudell immatur għall-ġrieden mhuwiex ikkunsidrat taħt il-kamp ta' applikazzjoni tal-metodu ta' ttestjar kurrenti.

18.   B'hekk, f'xi każijiet, jistgħu jintużaw ġrieden minflok firien. Għandha tingħata ġustifikazzjoni għal din l-ispeċi, fuq il-bażi ta' kriterji tossikoloġiċi, farmakokinetiċi u/jew oħrajn. Jista' jkun hemm bżonn ta' modifiki tal-protokoll għall-ġrieden. Pereżempju, il-konsum ta' ikel tal-ġrieden fuq bażi tal-piż tal-ġisem huwa ogħla minn dak tal-firien u, għaldaqstant, il-kontenut ta' fitoestroġen fl-ikel għandu jkun inqas għall-ġrieden milli għall-firien (9)(20)(22).

Kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija u tal-għalf

19.   Il-proċeduri kollha għandhom jikkonformaw ma' standards lokali ta' indukrar tal-annimali tal-laboratorju. Dawn id-deskrizzjonijiet tal-indukrar u l-kura huma standards minimi u ser ikunu sostitwiti minn regolamenti lokali bħad-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta' Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintużaw għal skopijiet xjentifiċi (38). It-temperatura fil-kamra tal-annimali sperimentali għandha tkun ta' 22 °C (b'medda ta' madwar ± 3 °C). L-umdità relattiva għandha tkun tal-inqas 30 % u idealment ma għandhiex taqbeż massimu ta' 70 %, minbarra matul it-tindif tal-kamra. Il-mira għandha tkun umdità relattiva ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali. Is-sekwenza tad-dawl ta' kuljum għandha tkun ta' 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam.

20.   Id-dieta tal-laboratorju u l-ilma tax-xorb għandhom ikunu pprovduti ad libitum. L-annimali żgħażagħ jistgħu jitrabbew f'post b'mod individwali jew jitqiegħdu f'gaġġa fi gruppi li jaslu sa tliet annimali. Minħabba l-età żgħira tal-annimali immaturi, huwa rakkomandat li jitrabbew fi grupp soċjali.

21.   Il-livelli għoljin ta' fitoestroġeni f'dieti tal-laboratorju huma magħrufin li jżidu l-piżijiet uterini fir-rodituri sa grad għolji biżżejjed li jxekkel il-Bijoassaġġ Uterotrofiku (13)(14)(15). Livelli għoljin ta' fitoestroġeni u ta' enerġija metabolizzabbli f'dieti tal-laboratorju jistgħu jirriżultaw f'pubertà bikrija wkoll, jekk jintużaw annimali immaturi. Il-preżenza ta' fitoestroġeni tirriżulta primarjament mill-inklużjoni ta' prodotti tas-sojja u tal-alfalfa fid-dieti tal-laboratorju u ntwera li konċentrazzjonijiet ta' fitoestroġeni jvarjaw minn lott għal ieħor ta' dieti standard tal-laboratorju (23). Il-piż tal-ġisem huwa varjabbli importanti, peress li l-kwantità ta' ikel ikkonsmat huwa relatat mal-piż tal-ġisem. Għalhekk, id-doża propja ta' fitoestroġen ikkonsmata mill-istess dieta tista' tvarja bejn speċi u skont l-età (9). Għal firien nisa immaturi, il-konsum tal-ikel fuq bażi ta' piż tal-ġisem jista' jkun bejn wieħed u ieħor id-doppju dak ta' firien adulti żgħażagħ b'ovarettomija. Għal ġrieden żgħażagħ, il-konsum tal-ikel fuq bażi tal-piż tal-ġisem jista' jkun bejn wieħed u ieħor erba' darbiet dak ta' firien żgħażagħ nisa b'ovarettomija.

22.   Madankollu, ir-riżultati tal-Bijoassaġġ Uterotrofiku (9)(17)(18)(19) juru li kwantitajiet limitati ta' fitoestroġeni djetetiċi huma aċċettabbli u ma jnaqqsux is-sensittività tal-bijoassaġġ. Bħala gwida, livelli djetetiċi ta' fitoestroġeni ma għandhomx jaqbżu it-350 μg tal-ekwivalenti ta' genistein/gramma tad-dieta tal-laboratorju għal firien nisa immaturi Sprague Dawley u Wistar (6)(9). Dawn id-dieti għandhom ikunu xierqa wkoll meta jiġu ttestjati f'firien żgħażagħ b'ovarettomija għaliex il-konsum tal-ikel fuq bażi ta' piż tal-ġisem huwa inqas f'żgħażagħ meta mqabbel ma' annimali immaturi. Jekk ser jintużaw ġrieden adulti b'ovarettomija jew firien iktar sensittivi għal fitoestroġeni, għandu jiġi kkunsidrat tnaqqis proporzjonat fil-livelli tal-fitoestroġen fid-dieta (20). Barra minn hekk, id-differenzi f'enerġija metabolika disponibbli minn dieti differenti jistgħu jwasslu għal qabżiet fiż-żmien għall-bidu tal-pubertà (21)(22).

23.   Qabel l-istudju, hemm bżonn li ssir għażla bir-reqqa ta' dieta mingħajr livell għoli ta' fitoestroġeni (għal gwida ara (6)(9)) jew enerġija metabolizzabbli, li tista' tfixkel ir-riżultati (15)(17)(19)(22)(36). L-iżgurar tal-prestazzjoni xierqa tas-sistema tat-test użata mil-laboratorju kif speċifikat fil-paragrafi 26 u 27 huwa kontroll importanti fuq dawn iż-żewġ fatturi. Bħala salvagwardja konsistenti ma' prattika tajba tal-laboratorju (GLP) għandu jsir kampjunar rappreżentattiv ta' kull lott ta' dieta mogħtija matul l-istudju għal analiżi possibbli ta' kontenut fitoestroġenu (eż. fil-każ ta' piż ta' kontroll uterin għoli relatat ma' kontrolli storiċi jew rispons inadegwat għall-estroġen ta' referenza, 17 alfa etinil estradjol). L-alikwoti għandhom jiġu analizzati bħala parti mill-istudju jew jiġu ffriżati f'– 20 oC jew b'tali mod li jipprevjenu milli l-kampjun jiddekomponi qabel l-analiżi.

24.   Ċerti materjali tas-sodod jista' jkun fihom sustanzi kimiċi estroġeniċi jew antiestroġeniċi li jseħħu b'mod naturali (eż. iċ-ċifċiegħa tal-qamħirrun hija magħrufa li taffettwa ċ-ċikliċità tal-firien u tidher li hija antiestroġenika). Il-materjal tas-sodda magħżul għandu jkun fih livell minimu ta' fitoestroġeni.

Preparazzjoni tal-annimali

25.   Annimali sperimentali mingħajr evidenza ta' xi marda jew anormalità fiżika jingħażlu b'mod aleatorju fil-gruppi ta' kontroll u tal-kura. Il-gaġeġ għandhom jiġu rranġati b'tali mod li jkunu minimizzati l-effetti possibbli dovuti għat-tqegħid tal-gaġġa. L-annimali għandhom jiġu identifikati b'mod uniku. Idealment, annimali immaturi għandhom jitqiegħdu f'gaġġa ma' ommijiet jew ommijiet adottivi sal-ftim matul l-akklimatizzazzjoni. Il-perjodu ta' akklimatizzazzjoni qabel il-bidu tal-istudju għandu jkun ta' madwar 5 ijiem għal annimali żgħażagħ u għall-annimali immaturi ma' ommijiet jew ommijiet adottivi. Jekk l-annimali immaturi jinkisbu bħala annimali li għadhom kif infatmu mingħajr ommijiet, jista' jkun hemm bżonn ta' durata iqsar tal-perjodu ta' akklimatizzazzjoni peress li d-dożaġġ għandu jibda eżatt wara l-ftim (ara l-paragrafu 29).

PROĊEDURA

Verifika tal-Profiċjenza tal-Laboratorju

26.   Jistgħu jintużaw żewġ għażliet differenti biex tiġi verifikata l-profiċjenza tal-laboratorju:

—

Verifika perjodika, li tiddependi fuq studju bażi inizjali ta' kontroll pożittiv (ara l-paragrafu 27). Tal-inqas kull 6 xhur u kull darba li jkun hemm bidla li tista' tinfluwenza l-prestazzjoni tal-assaġġ (eż. formulazzjoni ġdida tad-dieta, bidla fil-persunal li jagħmel dissezzjonijiet, bidla fir-razza jew il-fornituri tal-annimali, eċċ), ir-risponsitività tas-sistema tat-test (mudell tal-annimal) għandha tiġi verifikata billi tintuża doża xierqa (fuq il-bażi tal-istudju bażi ta' kontroll pożittiv deskritt fil-paragrafu 27) ta' estroġen ta' referenza: 17α-etinil estradjol (Nru tas-CAS 57-63-6) (EE),

—	L-użu ta' kontrolli konkurrenti, billi jiġi inkluż grupp mogħti doża xierqa ta' estroġen ta' referenza f'kull assaġġ.

Jekk is-sistema ma tweġibx kif mistenni, il-kundizzjonijiet sperimentali għandhom jiġu eżaminati u modifikati kif xieraq. Huwa rakkomandat li d-doża ta' estroġen ta' referenza tintuża f'wieħed mill-approċċi tkun ta' madwar ED70 sa 80.

27.   Studju Bażi ta' Kontroll Pożittiv — Qabel ma laboratorju jwettaq studju b'dan il-metodu ta' ttestjar għall-ewwel darba, il-profiċjenza tal-laboratorju għandha tintwera billi tiġi ttestjata r-risponsività tal-mudell tal-annimal, billi jiġi stabbilit ir-rispons tad-doża ta' estroġen ta' referenza: 17α-etinil estradjol (Nru tas-CAS 57-63-6) (EE) b'minimu ta' erba' dożi. Ir-rispons tal-piż uterin ser jitqabbel ma' dejta storika stabbilita (ara r-referenza (5)). Jekk dan l-istudju bażi ta' kontroll pożittiv ma jrendix ir-riżultati antiċipati, il-kundizzjonijiet sperimentali għandhom jiġu eżaminati u modifikati.

In-numru u l-kundizzjoni tal-annimali

28.   Kull grupp ikkurat u ta' kontroll għandu jkun fih tal-inqas 6 annimali (kemm għall-protokoll tal-metodu immatur kif ukoll dak tal-adulti ovx).

L-età tal-annimali immaturi

29.   Għall-Bijoassaġġ Uterotrofiku b'annimali immaturi, irid ikun speċifikat il-jum tat-twelid. Id-dożaġġ għandu jibda kmieni biżżejjed sabiex jiġi żgurat li, fi tmiem l-għoti tas-sustanza kimika tat-test, tkun għadha ma seħħitx iż-żieda fiżjoloġika tal-estroġeni endoġenużi assoċjata mal-pubertà. Min-naħa l-oħra, hemm evidenza li annimali żgħar ħafna jistgħu jkunu inqas sensittivi. Għad-definizzjoni tal-età ottimali, kull laboratorju għandu jieħu f'kunsiderazzjoni d-dejta ta' sfond tiegħu stess fuq il-maturità.

Bħala gwida ġenerali, id-dożaġġ fil-firien jista' jibda minnufih wara l-ftim bikri fil-jum 18 ta' wara t-twelid (bil-jum tat-twelid li jkun il-jum 0 ta' wara t-twelid). Idealment, id-dożaġġ fil-firien għandu jitlesta fil-jum 21 ta' wara t-twelid iżda dejjem qabel il-jum 25 ta' wara twelid għax, wara din l-età, l-assi ipotalamiku-pitwitarju-ovarju jsir funzjonali u l-livelli ta' estroġen endoġenu jistgħu jibdew jiżdiedu b'żieda konkomitanti fil-medji tal-piż uterin bażi u żieda fid-devjazzjonijiet standard tal-grupp (2)(3)(10)(11)(12).

Proċedura għal ovarettomija

30.   Għall-far u l-ġurdien mara b'ovarettomija (gruppi ta' trattament u kontroll), l-ovarettomija għandha ssir fl-età ta' bejn 6 u 8 ġimgħat. Għall-firien, għandhom ikunu għaddew tal-inqas 14-il jum bejn l-ovarettomija u l-ewwel jum ta' għoti sabiex l-utri jkun jista' jagħmel rigress għal linja bażi stabbli minima. Għall-ġrieden, għandhom jgħaddu tal-inqas 7 ijiem bejn l-ovarettomija u l-ewwel jum ta' għoti. Peress li ammonti żgħar ta' tessut tal-ovarji huma biżżejjed biex jiġu prodotti livelli ċirkolanti sinifikanti ta' estroġeni (3), l-annimali għandhom jiġu ttestjati qabel l-użu billi jiġu osservati ċelloli epiteljali kampjunati bit-tajjar mill-vaġina f'tal-inqas ħamest ijiem konsekuttivi (eż., il-jiem 10-14 wara l-ovarettomija għall-firien). Jekk l-annimali jindikaw xi evidenza ta' dħul fil-perjodu estruż, l-annimali ma għandhomx jintużaw. Barra minn hekk, fin-nekropsija, il-kampjuni tal-ovarji għandhom jiġu eżaminati għal xi evidenza tal-preżenza tat-tessut tal-ovarji. Jekk iva, l-annimal ma għandux jintuża fil-kalkoli (3).

31.   Il-proċedura tal-ovarettomija tibda bl-annimal fir-rikombenza ventrali wara li l-annimal jiġi anestetizzat kif xieraq. Il-qasma li tiftaħ il-ħajt tal-addome dorsolaterali għandha tkun ta' madwar 1 cm u parallela fil-punt nofsani bejn il-limitu inferjuri kostali u l-qoxra iljaka, u ftit millimetri laterali mill-marġni laterali tal-muskolu lombari. L-ovarju għandu jinqala' fejn jiltaqgħu l-kanal salovarju u l-korp uterin. Wara l-konferma li ma jkun hemm ebda fsad qawwi, il-ħajt tal-addome għandu jingħalaq bil-ħjata u l-ġilda għandha tingħalaq permezz ta' autoclips jew ħjata xierqa. Il-punti tal-lega jintwerew b'mod skematiku fil-Figura 1. Għandha tintuża analġeżija xierqa ta' wara l-operazzjoni kif rakkomandat minn veterinarju b'esperjenza fl-indukrar ta' rodituri.

Piż tal-ġisem

32.   Fil-metodu tal-adulti ovx, il-piż tal-ġisem u l-piż uterin mhumiex korrelatati għaliex il-piż uterin huwa affettwat minn ormoni bħal estroġeni iżda mhux mill-fatturi ta' tkabbir li jirregolaw id-daqs tal-ġisem. Min-naħa l-oħra, il-piż tal-ġisem huwa relatat mal-piż uterin fil-mudell immatur, waqt li jkun qed jimmatura (34). B'hekk, fil-bidu tal-istudju, il-varjazzjoni fil-piż tal-annimali użati, fil-mudell immatur, għandha tkun minima u ma taqbiżx ± 20 % tal-piż medju. Dan ifisser li d-daqs tal-boton għandu jkun standardizzat minn min jgħammar, biex jiġi żgurat li l-ulied ta' annimali minn ommijiet differenti ser jitgħalfu bejn wieħed u ieħor l-istess. L-annimali għandhom jiġu assenjati fi gruppi (kemm kontroll kif ukoll kura) permezz ta' distribuzzjoni tal-piż aleatorja, sabiex il-piż medju tal-ġisem ta' kull grupp ma jkunx statistikament differenti minn kwalunkwe grupp ieħor. Għandha tingħata kunsiderazzjoni biex jiġi evitat l-assenjament ta' sħab boton fl-istess grupp tal-kura sa fejn dan ikun prattikabbli bla ma jiżdied in-numru ta' boton li għandhom jintużaw għall-investigazzjoni.

Dożaġġ

33.   Sabiex jiġi stabbilit jekk sustanza kimika tat-test jistax ikollha azzjoni estroġenika in vivo, żewġ gruppi ta' doża u kontroll normalment ikunu biżżejjed u għalhekk, dan il-metodu huwa ppreferut għal raġunijiet marbuta mal-benessri tal-annimali. Jekk l-iskop huwa li jew tinkiseb kurva ta' rispons għad-doża jew li ssir estrapolazzjoni għal dożi inqas, hemm bżonn ta' tal-inqas 3 gruppi ta' doża. Jekk ikun hemm bżonn ta' informazzjoni minbarra l-identifikazzjoni ta' attività estroġenika (bħal stima tal-potenza), għandha tiġi kkunsidrata skeda differenti tad-dożaġġ. Ħlief għall-kura bis-sustanza kimika tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom jitqandlu bl-istess mod bħas-suġġetti tal-grupp tat-test. Jekk jintuża veikolu fl-għoti tas-sustanza kimika tat-test, il-grupp ta' kontroll għandu jirċievi l-istess ammont ta' veikolu użat mal-gruppi kkurati (jew l-ogħla volum użat mal-gruppi tat-test jekk ikun differenti bejn il-gruppi).

34.   F'dan il-każ, l-għan tal-Bijoassaġġ Uterotrofiku huwa li jingħażlu dożi li jiżguraw sopravvivenza tal-annimali u li huma mingħajr tossiċità sinifikanti jew diffikultà għall-annimali wara tliet ijiem konsekuttivi ta' għoti tas-sustanza kimika sa doża massima ta' 1 000 mg/kg/jum. Il-livelli kollha ta' doża għandhom jiġu proposti u jingħażlu filwaqt li tittieħed f'kunsiderazzjoni kwalunkwe dejta (tossiko) kinetika u dwar it-tossiċità eżistenti disponibbli għas-sustanza kimika tat-test jew materjali relatati. L-ogħla livell ta' doża għandu l-ewwel nett jieħu f'kunsiderazzjoni l-informazzjoni dwar l-LD50 u/jew it-tossiċità akuta sabiex jiġu evitati mewt, tbatija severa jew diffikultà fl-annimali (24)(25)(26). L-ogħla doża għandha tirrappreżenta d-doża massima tollerata (MTD); studju li jsir f'livell tad-doża li kkaġuna rispons uterotrofiku pożittiv tkun aċċettata wkoll. Għat-tgħarbil, intervalli kbar (eż. unitajiet ta' nofs log li jikkorrispondu għal progressjoni tad-doża ta' 3,2 jew anki sa unitajiet ta' log waħda) bejn dożaġġi ġeneralment huma aċċettabbli. Jekk ma jkun hemm ebda dejta xierqa disponibbli, jista' jitwettaq studju ta' sejbien tal-medda biex jgħin fid-determinazzjoni tad-dożi li għandhom jintużaw.

35.   Inkella, jekk il-potenza estroġenika ta' agonist tista' tiġi stmata permezz ta' dejta in vitro (jew in silico), din tista' tiġi kkunsidrata għall-għażla tad-doża. Pereżempju, l-ammont tas-sustanza kimika tat-test li tipproduċi risponsi uterotrofiċi ekwivalenti għall-agonist ta' referenza (etinil estradjol) huwa stmat mill-potenzi in vitro relattivi tiegħu għal etinil estradjol. L-ogħla doża tat-test tingħata permezz ta' moltiplikazzjoni ta' din id-doża ekwivalenti b'fattur xieraq, eż. 10 jew 100.

Kunsiderazzjonijiet għas-sejbien tal-medda

36.   Jekk ikun hemm bżonn, jista' jsir studju preliminari ta' sejbien tal-medda bi ftit annimali. F'dan ir-rigward, id-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 19 (25) jista' jintuża biex jiġu definiti s-sinjali kliniċi li jindikaw tossiċità jew diffikultà tal-annimali. Jekk fattibbli fi ħdan dan l-istudju ta' sejbien tal-medda wara tliet ijiem ta' għoti, l-utri jistgħu jinqatgħu u jintiżnu madwar 24 wara l-aħħar doża. Imbagħad din id-dejta tkun tista' tintuża biex tassisti fid-disinn tal-istudju ewlieni (agħżel dożi massimi u inferjuri aċċettabbli u rrakkomanda n-numru ta' gruppi tad-doża).

L-għoti ta' dożi

37.   Is-sustanza kimika tat-test tingħata permezz ta' gavage orali jew tilqima taħt il-ġilda. Iridu jitqiesu kunsiderazzjonijiet dwar il-benessri tal-annimali kif ukoll aspetti tossikoloġiċi bħar-relevanza għar-rotta ta' esponiment tal-bniedem għas-sustanza kimika (eż. gavage orali biex tiġi simulata inġestjoni, tilqima taħt il-ġilda biex jiġi simulat teħid man-nifs jew adsorbiment dermali), il-proprjetajiet fiżiċi/kimiċi tal-materjal tat-test u speċjalment informazzjoni tossikoloġika eżistenti u dejta dwar il-metaboliżmu u l-kinetika (eż. il-bżonn li jiġi evitat metaboliżmu first pass, effiċjenza aħjar b'rotta partikolari) meta tingħażel ir-rotta tal-amministrazzjoni.

38.   Huwa rakkomandat li, fejn ikun possibbli, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' soluzzjoni/sospensjoni milwiema. Iżda peress li ħafna mil-liganti tal-oestroġenu jew il-prekursuri metaboliċi tagħhom għandhom it-tendenza li jkunu odrofobiċi, l-iktar approċċ komuni huwa li tintuża soluzzjoni/sospensjoni fiż-żejt (eż. żejt tal-qamħirrun, tal-karawett, tal-ġunġlien jew taż-żebbuġa). Madankollu, dawn iż-żjut għandhom kontenut kaloriku u ta' xaħam differenti, u b'hekk il-veikolu jista' jaffettwa l-konsum ta' enerġija metabolizzabbli (ME) totali, u b'hekk potenzjalment jibdel il-punti aħħarin imkejlin bħall-piż uterin, speċjalment fil-metodu immatur (33). B'hekk, qabel l-istudju, kwalunkwe veikolu li għandu jintuża għandu jiġi ttestjat fl-isfond tal-kontrolli bla veikoli. Is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jinħallu f'ammont minimu ta' 95 % etanol jew solventi xierqa oħrajn u dilwiti għall-konċentrazzjonijiet tal-ħidma finali fil-veikolu tat-test. Il-karatteristiċi tossiċi tas-solvent iridu jkunu magħrufin, u għandhom jiġu ttestjati fi grupp ta' kontroll separat bis-solventi biss. Jekk is-sustanza kimika tat-test titqies stabbli, tista' tintuża azzjoni mekkanika ġentili vigoruża u tat-tisħin biex tassisti fil-ħall tas-sustanza kimika tat-test. Għandha tiġi ddeterminata l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fil-veikolu. Jekk is-sustanza kimika tat-test tkun stabbli għad-durata tal-istudju, jista' jitħejja alikwot tal-bidu tas-sustanza kimika, u d-dilwizzjonijiet tad-dożaġġ speċifikati jitħejjew kuljum.

39.   Il-puntwalità tad-dożaġġ ser tiddependi mill-mudell użat (irreferi għall-paragrafu 29 għall-mudell immatur u għall-paragrafu 30 għall-mudell adulti ovx). Il-firien nisa immaturi jingħataw doża bis-sustanza kimika tat-test kuljum għal tliet ijiem konsekuttivi. Hija rakkomandata wkoll kura ta' tliet ijiem għal firien nisa b'ovarettomija iżda esponimenti itwal huma aċċettabbli u jistgħu jtejbu l-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi attivi dgħajfin. Fil-ġrieden nisa b'ovarettomija, durata tal-applikazzjoni ta' 3 ijiem għandha tkun biżżejjed mingħajr vantaġġ importanti permezz ta' estensjoni li tasal sa sebat ijiem għal agonisti b'saħħithom tal-estroġen, madankollu, din ir-relazzjoni ma ntwerietx għal estroġeni dgħajfin fl-istudju ta' validazzjoni (16) u b'hekk id-dożaġġ għandu jkun estiż sa sebat ijiem konsekuttivi fi ġrieden adulti ovx. Id-doża għandha tingħata bosta drabi kuljum. Għandhom ikunu aġġustati kif ikun hemm bżonn biex jinżamm livell kostanti tad-doża f'termini ta' piż tal-ġisem tal-annimal (eż., mg tas-sustanza kimika tat-test għal kull kg ta' piż tal-ġisem kuljum). Rigward il-volum tat-test, il-varjabbiltà tiegħu, fuq bażi ta' piż tal-ġisem, għandha tiġi minimizzata billi tiġi aġġustata l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni ta' dożaġġ biex jiġi żgurat volum kostanti fuq bażi ta' piż tal-ġisem fil-livelli kollha tad-doża u għal kwalunkwe rotta tal-amministrazzjoni.

40.   Meta s-sustanza kimika tat-test tingħata b'gavage, dan għandu jsir b'doża waħda ta' kuljum lill-annimali billi jintuża tubu tal-istonku jew cannula xierqa ta' intubazzjoni. Il-volum massimu ta' likwidu li jista' jingħata f'darba jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. Għandhom jiġu segwiti l-linji gwida lokali dwar l-indukrar tal-annimali, iżda l-volum ma għandux jaqbeż il-5 ml/kg piż tal-ġisem, ħlief fil-każ ta' soluzzjonijiet milwiema fejn jista' jintuża 10 ml/kg piż tal-ġisem.

41.   Meta s-sustanza kimika tat-test tingħata permezz ta' tilqima taħt il-ġilda, dan għandu jsir b'doża waħda ta' kuljum. Id-dożi għandhom jingħataw fir-reġjuni dososkapulari jew lombari permezz ta' labra sterili (eż. wisgħa ta' 23 jew 25) u siringa tuberkulina. It-tqaxxir tas-sit tat-tilqima huwa fakultattiv. Għandhom jiġu rreġistrati kwalunkwe telf, tnixxija fis-sit tat-tilqima jew dożaġġ inkomplut. Il-volum totali injettat f'kull far f'ġurnata ma għandux jaqbeż il-5 ml/kg piż tal-ġisem, maqsum f'2 sti tat-tilqima, ħlief fil-każ ta' soluzzjoni milwiema fejn jista' jintuża 10 ml/kg piż tal-ġisem.

Osservazzjonijiet

Osservazzjonijiet ġenerali u kliniċi

42.   Għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi ġenerali tal-inqas darba kuljum u b'mod iktar spiss meta jkunu osservati sinjali ta' tossiċità. Idealment, l-osservazzjonijiet għandhom isiru fl-istess ħin(ijiet) ta' kull ġurnata u filwaqt li jitqies il-perjodu tal-ogħla effetti antiċipati wara d-dożaġġ. L-annimali kollha għandhom jiġu osservati għall-mortalità, il-morbidità u sinjali kliniċi ġenerali bħal bidlet fl-imġiba, il-ġilda, il-pil, l-għajnejn, il-membrani mukużi, l-okkorrenza ta' tnixxijiet u eskrezzjonijiet u l-attività awtonomika (eż. dmugħ, piloerezzjoni, daqs tal-ħabba, mudell respiratorju mhux tas-soltu).

Piż tal-ġisem u konsum ta' ikel

43.   L-annimali kollha għandhom jintiżnu għall-eqreb 0,1 g, billi jibdew ftit qabel il-bidu tal-kura, jiġifieri meta l-annimali jiġu allokati fi gruppi. Bħala kejl fakultattiv, l-ammont ta' ikel ikkonsmat matul il-perjodu tal-kura jista' jitkejjel għal kull gaġġa billi jintiżnu dawk li jitgħalfu. Ir-riżultati tal-konsum ta' ikel għandhom jingħataw fi grammi għal kull far kuljum.

Dissezzjoni u kejl tal-piż tal-utru

44.   Erbgħa u għoxrin siegħa wara l-aħħar kura, il-firien ser jinqatlu b'mod dinjituż. Idealment, l-ordni ta' nekropsija ser tkun aleatorja fost gruppi biex tiġi evitata progressjoni direttament 'il fuq jew 'l isfel ta' gruppi ta' doża li tista' taffettwa d-dejta b'mod li jkun diffiċli jinqabad. L-għan tal-bijoassaġġ huwa li jitkejjel kemm il-piż tal-utru mxarrab kif ukoll dak niexef. Il-piż imxarrab jinkludu l-utru u l-kontenuti tal-fluwidu luminali. Il-piż niexef huwa mkejjel wara li jitbattlu u jitneħħew il-kontenuti luminali tal-utru.

45.   Qabel id-dissezzjoni, il-vaġina tiġi eżaminata għal-istatus tal-ftuħ fl-annimali immaturi. Il-proċedura ta' dissezzjoni tibda billi jinfetaħ il-ħajt tal-addome li jibda fis-simfiżi pubika. Imbagħad, il-qarn tal-utru u l-ovarji, jekk ikunu preżenti, jinqalgħu mill-ħajt tal-addome dorsali. L-appart tal-urina u l-uretri jitneħħew min-naħa ventrali u laterali tal-utru u l-vaġina. Adeżjoni fibruża bejn ir-rektum u l-vaġina tinqala' sakemm ikun jista' jiġi identifikat fejn jiltaqgħu l-orifiċju vaġinali u l-ġilda perineali. L-utru u l-vaġina jinqalgħu mill-ġisem billi ssir inċiżjoni fil-ħajt vaġinali ftit 'il fuq mill-għaqda bejn il-ġilda perineali kif muri fil-Figura 2. L-utru għandu jinqala' mill-ħajt tal-ġisem permezz ta' qatgħa ġentili tal-meżenterija uterina fil-punt tat-tqabbid tagħha fit-tul sħiħ tal-lat dorsolaterali ta' kull qarn uterin. Ladarba jitneħħa mill-ġisem, it-tqandil tal-uterin għandu jkun rapidu biżżejjed biex tiġi evitata desikkazzjoni tat-tessuti. It-telf ta' piż minħabba desikkazzjoni jsir iktar importanti b'tessuti żgħar bħall-utru (23). Jekk l-ovarji jkunu preżenti, l-ovarji jitneħħew fil-kanal salovarju biex jiġi evitat telf ta' fluwidu luminali mill-qarn uterin. Jekk l-annimal tkun saritlu ovarettomija, il-qtajja' għandhom jiġu eżaminati għall-preżenza ta' xi tessut tal-ovarji. Xaħam u tessut konnettiv żejda għandhom jinqatgħu. Il-vaġina titneħħa mill-utru ftit taħt iċ-ċerviċi sabiex iċ-ċerviċi jibqa' mal-korp uterin kif muri fil-Figura 2.

46.   Kull utru għandu jiġi ttrasferit f'kontenitur immarkat b'mod uniku u li jintiżen (eż. petri-dish jew plastic weight boat) filwaqt li jitkompla l-indukrar biex tiġi evitata desikkazzjoni qabel jintiżen (eż. karta xuga ftit imxarrba b'salmastru tista' titqiegħed fil-kontenitur). L-utru bi fluwidu luminali ser jintiżen sal-eqreb 0,1 mg (piż tal-utru mxarrab).

47.   Imbagħad kull utru jiġi pproċessat b'mod individwali biex jitneħħa l-fluwidu luminali. Iż-żewġ qrun tal-utru ser jittaqqbu jew jinqatgħu b'mod lonġitudinali. L-utru jitqiegħed fuq karta xuga ftit imxarrba (eż. Whatman Nru 3) u tintmesaħ ftit b'biċċa oħra ta' karta xuga ftit imxarrba biex il-fluwidu luminali jitneħħa għal kollox. L-utru mingħajr il-kontenuti luminali ser jintiżen sal-eqreb 0,1 mg (piż tal-utru niexef).

48.   Il-piż tal-utru fit-tmiem jista' jintuża biex jiġi żgurat li ma nqabżitx l-età xierqa fil-far intatt immatur, madankollu, id-dejta storika tar-razza tal-far użata mil-laboratorju hija deċiżiva f'dan ir-rigward (ara l-paragrafu 56 għal interpretazzjoni tar-riżultati).

Investigazzjonijiet fakultattivi

49.   Wara li jintiżen, l-utru jista' jiġi ffissat f'formalin b'bafer newtrali ta' 10 % biex jiġi eżaminat b'mod istopatoloġiku wara tilwim b'Ematossilina u Osina (HE). Il-vaġina tista' tiġi studjata kif xieraq (ara l-paragrafu 9). Barra minn hekk, il-kejl morfometriku tal-epitelju endometrijali jista' jsir għal tqabbil kwantitattiv.

DEJTA U RAPPORTAR

Dejta

50.   Id-dejta tal-istudju għandha tinkludi:

—	in-numru ta' annimali fil-bidu tal-assaġġ,

—	in-numru u l-identità tal-annimali misjubin mejtin matul l-assaġġ jew maqtulin għal raġunijiet umanitarji u d-data u l-ħin ta' kwalunkwe mewta jew qatla b'mod dinjituż,

—	in-numru u l-identità tal-annimali li juru sinjali ta' tossiċità, u deskrizzjoni tas-sinjali tat-tossiċità osservata, inkluż il-ħin tal-bidu, id-durata, is-severità ta' kwalunkwe effett tossiku, u

—	in-numru u l-identità tal-annimali li juru kwalunkwe leżjoni u deskrizzjoni tat-tip ta' leżjonijiet.

51.   Dejta individwali dwar l-annimali għandha tiġi rreġistrata għall-piżijiet tal-ġisem, il-piż uterin imxarrab, u l-piż uterin niexef. Għandha tintuża analiżi statistika one-tailed għall-agonisti biex jiġi ddeterminat jekk l-għoti ta' sustanza kimika tat-test irriżultatx f'żieda statistikament importanti (p < 0,05) fil-piż uterin. Analiżijiet statistiċi xierqa għandha ssir biex isiru testijiet għal bidliet relatati mal-kura fil-piż uterin niexef u mxarrab. Pereżempju, id-dejta tista' tiġi evalwata permezz ta' analiżi tal-approċċ ta' kovarjanza (ANCOVA) bil-piż tal-ġisem fin-nekropsija bħall-kovarjabbli. Tista' ssir trasformazzjoni logaritmika li tistabbilizza l-varjanza fuq id-dejta uterina qabel ma ssir l-analiżi tad-dejta. It-testijiet Dunnett u Hsu huma xierqa biex isir tqabbil ta' pari ta' kull grupp mogħti doża ma' kontrolli veikolu u biex jiġu kkalkolati l-intervalli ta' kunfidenza. Jistgħu jintużaw plots residwi studentizzati biex jinqabdu punti ta' osservazzjoni distanti possibbli għall-valutazzjoni tal-omoġenità tal-varjanzi. Dawn il-proċeduri ġew applikati fil-programm ta' validazzjoni tal-OECD bl-użu tal-PROC GLM fis-Sistema ta' Analiżi Statistika (l-Istitut SAS, Cary, NC), verżjoni 8 (6)(7).

52.   Rapport finali għandu jinkludi:

Faċilità ta' ttestjar:

—	Il-persunal responsabbli u r-responsabilitajiet tal-istudju tiegħu,

—	Dejta mit-Test Bażi ta' Kontroll Pożittiv u dejta perjodika ta' kontroll pożittiv (ara l-paragrafi 26 u 27),

Sustanza kimika tat-test:

—	Il-karatterizzazzjoni tas-sustanzi kimiċi tat-test,

—	L-għamla fiżika u, fejn rilevanti, il-proprjetajiet fiżjokimiċi,

—	Il-metodu u l-frekwenza tal-preparazzjoni tad-dilwizzjonijiet,

—	Kwalunkwe dejta ġġenerata fuq l-istabbiltà,

—	Kwalunkwe analiżi tas-soluzzjonijiet ta' dożaġġ,

Veikolu:

—	Il-karatterizzazzjoni tal-veikolu tat-test (għamla, fornitur u lott),

—	Ġustifikazzjoni tal-għażla tal-veikolu (jekk mhux ilma),

Annimali tat-test:

—	L-ispeċi u r-razza u ġustifikazzjoni tal-għażla tagħhom,

—	Il-fornitur u l-faċilità speċifika tal-fornitur,

—	L-età mal-provvista bid-data tat-twelid,

—	Jekk l-annimali huma immaturi, jekk ġewx forniti mal-omm jew omm adottiva u d-data tal-ftim,

—	Dettalji dwar il-proċedura ta' akklimatizzazzjoni tal-annimali,

—	In-numru ta' annimali għal kull gaġġa,

—	Dettalji u l-metodu ta' identifikazzjoni tal-annimal individwali u tal-grupp,

Kundizzjonijiet tal-Assaġġ:

—	Dettalji dwar il-proċess tal-każwalizzazzjoni (jiġifieri l-metodu użat),

—	Ir-raġuni għall-għażla tad-doża,

—	Dettalji dwar il-fomulazzjoni tas-sustanza kimika tat-test, il-konċentrazzjonijiet, l-istabbiltà u l-omoġenità tagħha,

—	Dettalji tal-għoti tas-sustanza kimika tat-test u r-raġuni għall-għażla tar-rotta ta' esponiment,

—	Id-dieta (isem, tip, fornitur, kontenut, u, jekk ikunu magħrufin, il-livelli tal-fitoestroġen),

—	Is-sors ta' ilma (eż., ilma tal-vit jew ilma ffiltrat) u l-provvista tal-ilma (b'tubi minn kontenitur kbir, fi fliexken, eċċ.),

—	Il-bejta (l-isem, it-tip, il-fornitur, il-kontenut),

—	Reġistru tal-kundizzjonijiet tal-gaġġa, l-intervall tad-dawl, it-temperatura u l-umdità fil-kamra, it-tindif tal-kamra,

—	Deskrizzjoni dettaljata tan-nekropsija u tal-proċeduri ta' wżin tal-utri

—	Deskrizzjoni tal-proċeduri statistiċi,

Riżultati

Għal annimali individwali:

—	Il-piżijiet tal-ġisem individwali kollha ta' kuljum (mill-allokazzjoni fi gruppi san-nekropsija) (sal-eqreb 0,1 g),

—	L-età ta' kull annimal (fil-jiem li jibdew mill-jum tat-twelid bħala l-jum 0) meta jibda l-għoti tas-sustanza kimika tat-test,

—	Id-data u l-ħin ta' kull għoti ta' doża,

—	Il-volum u d-dożaġġ ikkalkolati mogħtijin u l-osservazzjonijiet ta' kwalunkwe telf ta' dożaġġ matul jew wara l-għoti,

—	Reġistru ta' kuljum tal-qagħda tal-annimal, inklużi sintomi u osservazzjonijiet rilevanti,

—	Il-kawża tal-mewt issuspettata (jekk tinsab matul studju fi stat moribond jew mejjet),

—	Id-data u l-ħin tal-qti b'mod dinjituż b'intervall tal-ħin għall-aħħar dożaġġ,

—	Il-piż uterin imxarrab (sal-eqreb 0,1 mg) u kwalunkwe osservazzjoni ta' telf ta' fluwidu luminali matul id-dissezzjjoni u l-preparazzjoni biex jintiżen,

—	Piż uterin niexef (sal-eqreb 0,1 mg),

Għal kull grupp ta' annimali:

—	Il-piżijiet medji tal-ġisem ta' kuljum (sal-eqreb 0,1 g) u devjazzjonijiet standard (minn allokazzjoni fi gruppi permezz ta' nekropsija),

—	Medji tal-piżijiet uterini mxarrbin u nixfin (sal-eqreb 0,1 mg) u devjazzjonijiet standard,

—	Jekk jitkejjel, il-konsum ta' ikel ta' kuljum (ikkalkolat bħala grammi ta' ikel ikkonsmat għal kull annimal),

—	Ir-riżultati tal-analiżijiet statistiċi li jqabblu kemm piżijiet uterini mxarrbin kif ukoll nixfin ta' gruppi kkurati fir-rigward tal-istess kejliet fil-gruppi ta' kontroll veikoli,

—	Ir-riżultati tal-analiżi statistika li tqabbel il-piż sħiħ tal-ġisem u ż-żieda fil-piż tal-ġisem tal-gruppi kkurati relatati mal-istess kejliet fil-gruppi ta' kontroll veikoli.

53.   Sommarju tal-fatti importanti ta' gwida tal-metodu ta' ttestjar

	Firien	Ġrieden
Annimali
Razza	Razza ta' rodituri tal-laboratorju użata spiss
Numru ta' annimali	Tal-inqas 6 annimali għal kull grupp ta' doża
Numru ta' gruppi	Tal-inqas 2 gruppi tat-test (ara l-paragrafu 33 għal gwida) u grupp ta' kontroll negattiv Għal gwida dwar gruppi ta' kontroll pożittiv, ara l-paragrafi 26 u 27
Kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija u tal-għalf
To fil-kamra tal-annimali	22°C ± 3°C
Umdità relativa	50-60 % u mhux inqas minn 30 % jew iktar minn 70 %
Sekwenza tad-dawl ta' kuljum	12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam
Dieta u ilma tajjeb għax-xorb	Ad libitum
Post tat-trobbija	B'mod individwali jew fi gruppi sa tliet annimali (trobbija fi grupp soċjali hija rakkomandata għal annimali immaturi)
Dieta u bejta	Livell baxx ta' fitoestroġeni rakkomandati fid-dieta u l-bejta
Protokoll
Metodu	Metodu immatur mingħajr ovarjettomija (dak preferut). Metodu ta' firien nisa adulti b'ovarettomija	Metodu ta' ġrieden nisa adulti b'ovarettomija
L-età tad-dożaġġ għal annimali immaturi	Mhux qabel PND 18. Id-dożaġġ għandu jsir qabel PND 25	Mhux rilevanti fil-kamp ta' applikazzjoni tal-metodu ta' ttestjar attwali.
Età tal-ovarettomija	Età ta' bejn 6 u 8 ġimgħat.
Età tad-dożaġġ għal annimali b'ovarettomija	Għandhom ikunu għaddew tal-inqas 14-il jum bejn l-ovarettomija u l-1 jum ta' għoti.	Għandhom ikunu għaddew tal-inqas 7 ijiem bejn l-ovarettomija u l-1 jum ta' għoti.
Piż tal-ġisem	Il-varjazzjoni fil-piż tal-ġisem għandha tkun minima u ma taqbiżx ± 20 % tal-piż medju.
Dożaġġ
Rotta tal-amministrazzjoni	Gavage orali jew tilqima taħt il-ġilda
Frekwenza tal-għoti	Doża waħda kuljum
Ammont ta' volum għal gavage u tilqima	≤ 5 ml/kg piż tal-ġisem (jew sa 10 ml/kg piż tal-ġisem f'każ ta' soluzzjonijiet milwiema) (f'2 siti ta' tilqim għar-rotta taħt il-ġilda)
Durata tal-għoti	3 ijiem konsekuttivi għall-mudell immatur Tal-inqas 3 ijiem konsekuttivi għall-mudell OVX	7 ijiem konsekuttivi għall-mudell OVX
Ħin tan-nekropsija	Madwar 24 siegħa wara l-aħħar doża
Riżultati
Rispons pożittiv	Żieda statistikament sinifikanti tal-piż medju tal-utru (imxarrab u/jew niexef)
Estroġen ta' referenza	17α-etinil estradjol

GWIDA GĦALL-INTERPRETAZZJONI U L-AĊĊETTAZZJONI TAR-RIŻULTATI

54.   B'mod ġenerali, test għall-estroġeniċità għandu jitqies pożittiv jekk ikun hemm żieda statistikament importanti fil-piż tal-utru (p< 0,05) tal-inqas fil-livell għoli tad-doża meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll b'solvent. Riżultat pożittiv huwa appoġġjat iktar mill-wiri ta' relazzjoni bijoloġikament plawżibbli bejn id-doża u d-daqs tar-rispons, filwaqt li jitfakkar li attivitajiet estroġeniċi u antiestroġeniċi tas-sustanza kimika li jidħlu f'xulxin jistgħu jaffettwaw il-forma tal-kurva bejn id-doża u r-rispons.

55.   Għandha tingħata attenzjoni sabiex ma tinqabiżx id-doża massima tollerata ħalli tkun tista' ssir interpretazzjoni valida tad-dejta. Tnaqqis fil-piż tal-ġisem, sinjali kliniċi u sejbiet oħrajn għandhom jiġu vvalutati fid-dettall f'dan ir-rigward.

56.   Kunsiderazzjoni importanti għall-aċċettazzjoni tad-dejta mill-Bijoassaġġ Uterotrofiku hija l-piżijiet tal-utru tal-grupp ta' kontroll veikolu. Valuri ta' kontroll għoljin jitsgħu jikkompromettu r-risponsitività tal-bijoassaġġ u l-ħila li jiġu identifikati agonisti tal-estroġen ferm dgħajfin. Analiżijiet tat-tagħrif u d-dejta ġġenerata matul il-validazzjoni tal-Bijoassaġġ Uterotrofiku jissuġġerixxu li waqtiet ta' medji ta' kontroll għoljin iseħħu b'mod spontanju, b'mod partikolari f'annimali immaturi (2)(3)(6)(9). Peress li l-piż tal-utru ta' firien immaturi jiddependi fuq bosta varjabbli bħar-razza u l-piż tal-ġisem, ma jista' jingħata ebda limitu superjuri definittiv għall-piż tal-utru. Bħala gwida, jekk il-piżijiet tal-utru niexef f'firien ta' kontroll immaturi jkunu ta' bejn 40 u 45 mg, ir-riżultati għandhom jitqiesu bħala suspettużi u piżijiet tal-utri ta' iktar minn 45 mg jistgħu jwasslu sabiex it-test jerġa' jsir. Madankollu, dan irid jitqies fuq bażi ta' każ b'każ (3)(6)(8). Meta jsiru testijiet f'firien adulti, ovarettomija inkompluta ser tħalli tessut tal-ovarji li jista' jipproduċi estroġenu endoġenu u jittardja r-rigressjoni tal-piż tal-utru.

57.   Piżijiet tal-utru niexef tal-kontroll veikolu li huma inqas minn 0,09 % tal-piż tal-ġiesm għal firien nisa immaturi u inqas minn 0,04 % għal firien nisa żgħażagħ b'ovarettomija jidhru li jrendu riżultati aċċettabbli (ara t-Tabella 31 (2)). Jekk il-piżijiet tal-utru tal-kontroll ikunu ikbar minn dawn in-numru, għandhom jiġu skrutinizzati bosta fatturi inklużi l-età tal-annimali, ovarettomija xierqa, fitoestroġeni djetetiċi, u l-bqija, u riżultat ta' assaġġ negattiv (ebda indikazzjoni ta' attività estroġenika) għandu jintuża bir-reqqa.

58.   Dejta storika għall-gruppi ta' kontroll veikolu għandha tinżamm fil-laboratorju. Dejta storika għal risponsi għal estroġeni ta' referenza pożittivi, bħal 17α-etinil estradjol, għandha tinżamm fil-laboratorju wkoll. Il-laboratorji jistgħu jittestjaw ukoll ir-rispons għal agonisti tal-estroġen dgħajfin li jkunu magħrufni. Din id-dejta kollha tista' titqabbel mad-dejta disponibbli (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) biex jiġi żgurat li l-metodi tal-laboratorju jrendu biżżejjed sensittività.

59.   Il-piżijiet tal-utru niexef urew inqas varjabbiltà matul l-istudju ta' validazzjoni tal-OECD meta mqabblin mal-piżijiet tal-utru mxarrab (6)(7). Madankollu, rispons importanti f'xi kejl jindika li s-sustanza kimika tat-test hija pożittiva għal attività estroġenika.

60.   Ir-rispons uterotrofiku mhuwiex kompletament ta' oriġini estroġenika, madankollu, riżultat pożittiv tal-Bijoassaġġ Uterotrofiku għandu ġeneralment jiġi interpretat bħala evidenza għal potenzjal estroġeniku in vivo, u normalment għandu jniedi azzjonijiet għal klassifikazzjoni ulterjuri (ara l-paragrafu 9 u l-‘OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals’, Anness 2).

Figura 1

Dijagramma skematika turi t-tħennija kirurġika tal-ovarji

Il-proċedura tibda billi jinfetaħ il-ħajt tal-addome dorsolaterali fil-punt tan-nofs bejn il-limitu inferjuri kostali u l-qoxra iljaka, u ftit millimetri laterali għall-marġni laterali tal-muskolu lombari. Fi ħdan il-kavità tal-addome, għandhom jiġu identifikati l-ovarji. Fuq pjan asettiku, imbagħad l-ovarji jitneħħew fiżikament mill-kavità tal-addome, titqiegħed ligatura bejn l-ovarju u l-utru biex jiġi kkontrollat il-fsad, u l-ovarju jinqala' permezz ta' inċiżjoni fuq il-ligatura fl-għaqda tal-kanal salovarju u kull qarn tal-utru. Wara l-konferma li ebda fsad importanti ma għadu jippersisti, il-ħajt tal-addome għandu jingħalaq b'sutura, u tingħalaq il-ġilda, eż., b'autoclips jew sutura. L-annimali għandhom jitħallew jirkupraw u l-piż tal-utru għandu jitħalla jagħmel rigress għal tal-inqas 14-il jum wara l-użu.

Figura 2

It-tneħħija u l-preparazzjoni tat-tessuti tal-utru għall-kejl tal-piż

Il-proċedura tibda billi jinfetaħ il-ħajt tal-addome fis-simfiżi pubika. Imbagħad, kull ovarju, jekk ikun preżenti, u l-qarn tal-utru jitneħħew mill-ħajt tal-addome dorsali. L-apparat tal-urina u l-uretri jitneħħew mil-lat ventrali u laterali tal-utru u l-vaġina. L-adeżjoni fibruża bejn ir-rektum u l-vaġina jinqalgħu sakemm l-għaqda tal-orifiċju vaġinali u l-ġilda perineali jkunu jistgħu jiġu identifikati. L-utru u l-vaġina jinqalgħu mill-ġisem permezz ta' inċiżjoni tal-ħajt vaġinali ftit 'il fuq mill-għaqda bejn il-ġilda perineali kif muri fil-figura. L-utru għandu jinqala' mill-ħajt tal-ġisem billi ssir qatgħa ħafifa tal-meżenterija uterina fil-punt ma' fejn taqbad matul it-tul sħiħ tal-aspett dorsolaterali ta' kull qarn uterin. Wara t-tneħħija mill-ġisem, ix-xaħam żejjed u t-tessut konnettiv jinqata'. Jekk ikunu preżenti l-ovarji, l-ovarji jitneħħew fil-kanal salovarju biex jiġi evitat telf ta' fluwidu luminali mill-qarn uterin. Jekk l-annimal tkun saritlu ovarettomija, il-qtajja' għandhom jiġu eżaminati għal-preżenza ta' xi tessut tal-ovarji. Il-vaġina titneħħa mill-utru eżatt taħt iċ-ċerviċi sabiex iċ-ċerviċi jibqa' mal-korp uterin kif muri fil-figura. Imbagħad l-utru jista' jintiżen.

NOTI GĦALL-QAFAS

Nota 1:

Dħul fil-livelli kollha u ħruġ fil-livelli kollha huma possibbli u jiddependu fuq l-għamla tal-ħtiġijiet eżistenti ta' informazzjoni għal skopijiet ta' valutazzjoni tal-periklu u r-riskju

Nota 2:

Fil-livell 5, l-ekotossikoloġija għandha tinkludi punti aħħarin li jindikaw mekkaniżmi ta' effetti avversi, u l-ħsara potenzjali għall-popolazzjoni

Nota 3:

Meta mudell multimodali jkopri diversi mill-assaġġi tal-punt aħħari uniku, dak il-mudell jieħu post l-użu ta' dawk l-assaġġi tal-punt aħħari uniku

Nota 4:

Il-valutazzjoni ta' kull sustanza kimika għandha tkun imsejsa fuq bażi ta' każ b'każ, filwaqt li tittieħed f'kunsiderazzjoni l-informazzjoni kollha għad-dispożizzjoni, filwaqt li tibqa' mfakkra l-funzjoni tal-livelli tal-qafas.

Nota 5:

Il-qafas ma għandux jitqies li jinkludi kollox bħalissa. Fil-livelli 3, 4 u 5 jinkludi assaġġi li jew huma disponibbli jew inkella li għalihom qed issir validazzjoni. Fir-rigward ta' dawn tal-aħħar, dawn huma inklużi b'mod provviżorju. Ladarba jiġu żviluppati u vvalidati, dawn ser jiżdiedu b'mod formali mal-qafas.

Nota 6:

Il-livell 5 ma għandux jitqies li jinkludi testijiet definittivi biss. It-testijiet inklużi f'dak il-livell jitqiesu li jikkontribwixxu għall-valutazzjoni ġenerali tal-perikli u r-riskji.

TAGĦRIF

(1)

OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10-11 ta' Marzu 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.

(2)

OECD (2003). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic Bioassay. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003)1.

(3)

Owens JW, Ashby J. (2002). Critical Review and Evaluation of the Uterotrophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists and Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic Protocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445-520.

(4)

OECD (2006). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation of the Rodent Uterotrophic Assay — Phase 1. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 65. ENV/JM/MONO(2006)33.

(5)

Kanno, J, Onyon L, Haseman J, Fenner-Crisp P, Ashby J, Owens W. (2001). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to screen compounds for in vivo estrogenic responses: Phase 1. Environ Health Perspect. 109:785-94.

(6)

OECD (2006). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic Bioassay: Phase 2 — Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/MONO(2006)34.

(7)

Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dose Response Studies. Environ. Health Persp.111:1530-1549

(8)

Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp.111:1550-1558.

(9)

Owens W, Ashby J, Odum J, Onyon L. (2003). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dietary phytoestrogen analyses. Environ. Health Persp. 111:1559-1567.

(10)

Ogasawara Y, Okamoto S, Kitamura Y, Matsumoto K. (1983). Proliferative pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of [I125]iododeoxyuridine. Endocrinology 113:582-587.

(11)

Branham WS, Sheehan DM, Zehr DR, Ridlon E, Nelson CJ. (1985). The postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17β-estradiol. Endocrinology 117:2229-2237.

(12)

Schlumpf M, Berger L, Cotton B, Conscience-Egli M, Durrer S, Fleischmann I, Haller V, Maerkel K, Lichtensteiger W. (2001). Estrogen active UV screens. SÖFW-J. 127:10–15.

(13)

Zarrow MX, Lazo-Wasem EA, Shoger RL. (1953). Estrogenic activity in a commercial animal ration. Science 118:650–651.

(14)

Drane HM, Patterson DSP, Roberts BA, Saba N. (1975). The chance discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd. Cosmet. Toxicol. 13:425–427.

(15)

Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on in vivo responses to exogenously administered estrogens. Environ. Health Perspec.106:369–373.

(16)

OECD (2007). Additional data supporting the Test Guideline on the Uterotrophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 67.

(17)

Degen GH, Janning P, Diel P, Bolt HM. (2002). Estrogenic isoflavones in rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145–157.

(18)

Wade MG, Lee A, McMahon A, Cooke G, Curran I. (2003). The influence of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. Food Chem. Toxicol. 41:1517-1525.

(19)

Yamasaki K, Sawaki M, Noda S, Wada T, Hara T, Takatsuki M. (2002). Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given different phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the immature rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613–620.

(20)

Thigpen JE, Haseman JK, Saunders HE, Setchell KDR, Grant MF, Forsythe D. (2003). Dietary phytoestrogens accelerate the time of vaginal opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477–485.

(21)

Ashby J, Tinwell H, Odum J, Kimber I, Brooks AN, Pate I, Boyle CC. (2000). Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent sexual development. J. Appl. Toxicol.20:343–347.

(22)

Thigpen JE, Lockear J, Haseman J, Saunders HE, Caviness G, Grant MF, Forsythe DB. (2002). Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 26:381–393.

(23)

Thigpen JE, Li L-A, Richter CB, Lebetkin EH, Jameson CW. (1987). The mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci.37:596–601.

(24)

OECD (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD Guideline for the testing of chemicals No 425.

(25)

OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.

(26)

OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4.

(27)

Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935). The estimation of oestrin and of male hormone in oily solution. J. Physiol. 85: 320–333.

(28)

Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936). The nature of the estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 19: 33–41.

(29)

Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996). Survey and assessment of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34: 288–305.

(30)

Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973). The effects of various steroid on the vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284–291.

(31)

OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development — Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Pariġi.

(32)

Dorfman R.I. (1962). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, Academic Press.

(33)

Thigpen J. E. et al. (2004). Selecting the appropriate rodent diet for endocrine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401–416.

(34)

Gray L.E. and Ostby J. (1998). Effects of pesticides and toxic substances on behavioral and morphological reproductive development: endocrine versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (1–2): 159–184.

(35)

Booth AN, Bickoff EM u Kohler GO. (1960). Estrogen-like activity in vegetable oils and mill by-products. Science 131:1807–1808.

(36)

Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004). Evaluation of estrogenic activity in diets for experimental animals using in vitro assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410–1414.

(37)

OECD (2007). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay Procedure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment. No. 71.

(38)

Id-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta' Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintużaw għal skopijiet xjentifiċi (ĠU L 276, 20.10.2010, p. 33).

B.55.   BIJOASSAĠĠ HERSHBERGER F'FIRIEN: ASSAĠĠ TA' TGĦARBIL TA' TERMINU QASIR GĦAL PROPRJETAJIET (ANTI)ANDROĠENIĊI

INTRODUZZJONI

1.   Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-Linja Gwida tat-Test (TG) tal-OECD Nru 441 (2009). L-OECD nediet attività ta' prijorità għolja fl-1998 biex tirrevedi l-linji gwida eżistenti u tiżviluppa linji gwida ġodda għat-tgħarbil u l-ittestjar ta' interferenti endokrinali potenzjali (1). Element minnhom tal-attività kien li tiżviluppa linja gwida tat-test għall-Bijoassaġġ Hershberger tal-firien. Wara għexieren ta' snin ta' użu mill-industrija farmaċewtika, dan l-assaġġ ġie standardizzat għall-ewwel darba minn kumitat uffiċjali tal-esperti fl-1962 bħala għodda tat-tgħarbil għal sustanzi kimiċi androġeniċi (2). Fl-2001-2007, il-Bijoassaġġ Hershberger tal-firien sarlu programm ta' validazzjoni estensiv inkluża l-ġenerazzjoni ta' Dokument ta' Reviżjoni ta' Sfond (23), kompilazzjoni ta' dokument tal-metodi dettaljati (3), l-iżvilupp ta' gwida dwar id-dissezzjoni (21) u t-twettiq ta' studji intra u interlaboratorji estensivi biex jintwerew l-affidabilità u r-riproduċibilità tal-bijoassaġġ. Dawn l-istudji ta' validazzjoni saru b'androġen ta' referenza qawwi (testosteron propjonat (TP)), żewġ androġeni sintetiċi qawwijin (trenbolon aċetat u metil testosteron), farmaċewtiku antiandroġeniku qawwi (flutamid), inibitur qawwi tas-sinteżi (finasterid) tal-androġen naturali (diidrotestosteron-DHT), bosta pestiċidi antiandroġeniċi dgħajfin (linuron, vinklożolina, proċimidon, p,p' DDE), inibitur qawwi ta' 5α ridottasi (finasterid) u żewġ sustanzi kimiċi negattivi magħrufin (dinitrofenol u nonilfenol) (4)(5)(6)(7)(8). Dan il-metodu ta' ttestjar huwa r-riżultat tal-esperjenza storika twila bil-bijoassaġġ u l-esperjenza miksuba matul il-programm tat-test ta' validazzjoni u r-riżultati miksubin bih.

2.   Il-Bijoassaġġ Hershberger huwa test ta' tgħarbil in vivo ta' terminu qasir li juża tessuti aċċessorji tal-apparat riproduttiv tal-irġiel. L-assaġġ oriġina fis-snin tletin u ġie modifikat fis-snin erbgħin biex jinkludi muskoli risponsivi għall-androġen fl-apparat riproduttiv tal-irġiel (2) (9-15). Fis-snin sittin, ġew evalwati iktar minn 700 androġen possibbli billi ntużat verżjoni standardizzata tal-protokoll (2)(14), u l-użu tal-assaġġ kemm għal androġeni kif ukoll għal antiandroġeni tqies li huwa metodu standard fis-snin sittin (2)(15). Il-bijoassaġġ kurrenti huwa bbażat fuq il-bidliet fil-piż ta' ħames tessuti li jiddependi fuq l-androġen fil-far raġel peripubertali msewwi. Jevalwa l-ħila ta' sustanza kimika li tniedi attivitajiet bijoloġiċi konsistenti mal-agonisti androġeni, antagonisti jew inibituri ta' 5α-ridottasi. Il-ħames tessuti fil-mira li jiddependu fuq l-androġen inklużi f'dan il-metodu ta' ttestjar huma l-prostata ventrali (VP), in-nuffata seminali (SV) (kif ukoll fluwidi u glandoli koagulanti), il-muskolu reffiegħ ani-bulbokavernosu (LABC), il-glandoli ta' Cowper flimkien (COW) u r-ras tal-pene (GP). Fil-far raġel peripubertali msewwi, dawn il-ħames tessuti kollha kemm huma jwieġbu għal androġeni b'żieda fil-piż assolut. Meta dawn l-istess tessuti jiġu stimolati biex jiżdiedu fil-piż permezz tal-għoti ta' androġen ta' referenza qawwi, dawn il-ħames tessuti kollha jwieġbu għall-antiandroġeni bi tnaqqis fil-piż assolut. Il-mudell primarju għall-bijoassaġġ Hershberger kien ir-raġel peripubertali msewwi b'kirurġija, li ġie validat fil-Fażijiet 1, 2 u 3 tal-programm ta' validazzjoni ta' Hershberger.

3.   Il-Bijoassaġġ Hershberger iservi bħala assaġġ mekkanistiku ta' tgħarbil in vivo għal agonisti tal-androġen, antagonisti tal-androġen u inibituri ta' 5α-ridottasi u l-applikazzjoni tiegħu għandha titqies fil-kuuntest tal-‘Qafas Kunċettwali tal-OECD għall-Ittestjar u l-Valutazzjoni tas-Sustanzi li Jfixklu s-Sistema Endokrinali’ (Appendiċi 2). F'dan il-Qafas Kunċettwali, il-Bijoassaġġ Hershberger jinsab fil-Livell 3 bħala assaġġ in vivo li jipprovdi dejta dwar mekkaniżmu endokrinali wieħed, jiġifieri (anti)androġeniċità. Huwa maħsub sabiex ikun inkluż f'serje ta' testijiet in vitro u in vivo biex jiġu identifikati sustanzi kimiċi b'potenzjal li jinteraġixxu mas-sistema endokrinali, li finalment iwasslu għal valutazzjonijiet tal-periklu u r-riskju għas-saħħa tal-bniedem jew l-ambjent.

4.   Minħabba tħassib relatat mal-benessri tal-annimali fil-proċedura ta' tiswija, intuża r-raġel intatt stimolat (mhux imsewwi) li jkun għadu kif infatam bħala mudell alternattiv għall-Bijoassaġġ Hershberger biex jiġi evitat il-pass tat-tiswija. Il-metodu tat-test tar-raġel stimolat li jkun għadu kif infatam ġie validat (24); madankollu, fl-istudji ta' validazzjoni, il-verżjoni tar-raġel li jkun għadu kif infatam tal-Bijoassaġġ Hershberger ma dehritx li kapaċi tidentifika effetti b'mod konsistenti fuq piżijiet tal-organi li jiddependu fuq androġen minn antiandroġeni dgħajfin bid-dożi ttestjati. Għalhekk, ma kienx inkluż f'dan il-metodu ta' ttestjar. Madankollu, peress li l-użu tiegħu jista' jipprovdi mhux biss benefiċċji għall-benessri tal-annimali iżda jista' jipprovdi wkoll informazzjoni dwar modi oħrajn ta' azzjoni, huwa disponibbli fid-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 115(25).

KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET

5.   L-agonisti u l-antagonisti tal-androġen jaġixxu bħala lega għar-riċettur tal-androġen u jistgħu jattivaw jew jinibixxu, rispettivament, it-traskrizzjoni tal-ġeni kkontrollata mir-riċettur. Barra minn hekk, ċerti sustanzi kimiċi jinibixxu l-konverżjoni ta' testosteron għall-androġenu naturali iktar qawwi diidrotestosteron f'xi tessuti tal-androġen fil-mira (inibituri ta' 5α-ridottasi). It-tali sustanzi kimiċi għandhom il-potenzjal li jwasslu għal perikli avversi għas-saħħa, inklużi effetti fuq ir-riproduzzjoni u l-iżvilupp. Għalhekk, hemm bżonn regolatorju biex sustanza kimika tiġi vvalutata u evalwata malajr bħala agonist jew antagonist possibbli tal-androġen jew inibitur ta' 5α-ridottasi. Filwaqt li informattiva, l-affinità tal-lega għal riċettur tal-androġen kif imkejla permezz tar-rabta tar-riċettur jew l-attivazzjoni transkrizzjonali tal-ġeni rapportaturi in vitro mhijiex l-uniku determinant ta' periklu possibbli. Determinanti oħrajn jinkludu attivazzjoni u diżattivazzjoni metaboliċi malli jidħlu fil-ġisem, distribuzzjoni kimika biex jimmiraw għal tessuti, u tneħħija mill-ġisem. Dan iwassal għall-bżonn li titgħarbel l-attività possibbli ta' sustanza kimika in vivo f'kundizzjonijiet u esponiment rilevanti. L-evalwazzjoni in vivo hija inqas kritika jekk ikunu magħrufin il-karatteristiċi tas-sustanza kimika rigward Assorbiment –Distribuzzjoni — Metaboliżmu — Eliminazzjoni (ADME). Tessuti li jiddependu fuq androġen iwieġbu bi tkabbir rapidu u qawwi għall-istimolu minn androġeni, b'mod partikolari f'firien irġiel peripubertali msewwijin. Speċi rodituri, b'mod partikolari l-far, jintużaw spiss ukoll fl-istudji dwar it-tossiċità għall-karatterizzazzjoni tal-perikli. B'hekk, il-verżjoni l-assaġġ, li tuża l-far peripubertali msewwi u l-ħames tessuti fil-mira f'dan l-assaġġ, hija xierqa għat-tgħarbil in vivo ta' agonisti u antagonisti tal-androġen u inibituri ta' 5α-ridottasi.

6.   Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat fuq dawk il-protokolli mħaddmin fl-istudju ta' validazzjoni tal-OECD li ntwera li huma affidabbli u riproduċibbli fi studji intra u interlaboratorji (4)(5)(6)(7)(8). Kemm il-proċeduri androġeni kif ukoll dawk antiandroġeni huma ppreżentati f'dan il-metodu ta' ttestjar.

7.   Għad li kien hemm xi varjazzjoni fid-doża tat-TP użata biex jiġu identifikati antiandroġeni fil-programm tal-OECD ta' validazzjoni tal-Bijoassaġġ mil-laboratorji differenti (0,2 versus 0,4 mg/kg/d, tilqima taħt il-ġilda), ftit li xejn kien hemm differenza bejn dawn iż-żewġ varjazzjonijiet fil-protokoll fil-ħila biex jaqbdu attività antiandroġenika dgħajfa jew qawwija. Madankollu, huwa ċar li d-doża tat-TP ma għandhiex tkun għolja wisq tant li timblokka l-effetti ta' antagonisti dgħajfin tar-riċettur tal-androġenu (AR) jew baxxa wisq tant li t-tessuti androġeniċi juru rispons tat-tkabbir batut anki mingħajr il-koamministrazzjoni tal-antiandroġen.

8.   Ir-rispons tat-tkabbir tat-tessuti individwali li jiddependu fuq l-androġen mhuwiex ta' oriġini kompletament androġenika, jiġifieri sustanzi kimiċi minbarra agonisti androġeni li jibdlu l-piż ta' ċerti tessuti. Madankollu, ir-rispons għat-tkabbir ta' bosta tessuti fl-istess ħin isostni mekkaniżmu iktar speċifiku għall-androġen. Pereżempju, dożi għoljin ta' estroġeni qawwijin jistgħu jżidu l-piż tal-infafet seminali; madankollu, it-tessuti l-oħrajn li jiddependu fuq l-androġen fl-assaġġ ma jwiġbux b'mod simili. Is-sustanzi kimiċi antiandroġeniċi jistgħu jaġixxu jew bħala antagonitsi tar-riċetturi androġeni jew inibituri ta' 5α-ridottasi. L-inibituri ta' 5α-ridottasi għandhom effett varjabbli, għaliex il-konverżjoni għal diidrotestosteron iktar qawwi tvarja skont it-tessut. L-antiandroġeni li jinibixxu 5α — ridottasi, bħal finasterid, għandhom effetti li jinħassu iktar fil-prostata ventrali minn tessuti oħrajn meta mqabblin ma' antagonist AR qawwi, bħal flutamid. Din id-differenza fir-rispons tat-tessut tista' tintuża biex tinħareġ differenza bejn modi ta' azzjoni medjati b'AR u dawk medjati b'5α — ridottasi. Barra minn hekk, ir-riċettur tal-androġen huwa relatat fil-livell tal-evoluzzjoni ma' dak ta' ormoni tal-isterojdi oħrajn, u xi ormoni oħrajn, meta jingħata b'livelli ta' dożaġġ għoljin suprafiżjoloġiċi, jista' jwaħħal u jantagonizza l-effetti tat-TP li jippromwovu t-tkabbir (13). Barra minn hekk, huwa plawżibbli wkoll li metaboliżmu msaħħaħ tal-isterojdi u t-tnaqqis konsegwenti tat-testosteron tas-serum jistgħu jnaqqsu t-tkabbir tat-tessuti li jiddependu fuq l-androġen. Għalhekk, kwalunkwe eżitu pożittiv fil-Bijoassaġġ Hershberger normalment għandu jiġi evalwat billi jintuża approċċ ta' piż tal-evidenza, inklużi assaġġi in vitro, bħall-assaġġi vinkolanti tal-AR u tar-riċetturi tal-estroġen (ER) u l-assaġġi ta' attivazzjoni transkrizzjonali korrispondenti, jew minn assaġġi in vivo oħrajn li jeżaminaw tessuti simili tal-androġen fil-mira bħall-assaġġ pubertali tal-irġiel, l-assaġġ tal-irġiel adulti intatti ta' 15-il jum, jew studji ta' doża ripetuta ta' 28 jum jew 90 jum.

9.   L-esperjenza tindika li androġeni ksenobijotiċi huma iktar rari minn antiandroġeni ksenobijotiċi. Allura huwa mistenni li l-bijoassaġġ Hershberger ser jintuża spiss għat-tgħarbil ta' antiandroġeni. Madankollu, il-proċedura għall-ittestjar għal androġeni xorta waħda tista' tkun rakkomandata għal sustanzi kimiċi sterojdali jew simili għall-isterojdi jew għal sustanzi kimiċi li għalihom indikazzjoni tal-effetti androġeniċi possibbli nġiebet minn metodi li jinsabu fil-Livell 1 jew 2 tal-qafas kunċettwali (Appendiċi 2). B'mod simili, effetti avversi assoċjati ma' profili (anti)androġeniċi jistgħu jkunu osservati fl-assaġġi tal-Livell 5, li jwasslu għall-bżonn li jiġi vvalutat jekk sustanza kimika toperax permezz ta' mod ta' azzjoni endokrinali.

10.   Huwa rikonoxxut li l-proċeduri kollha bbażati fuq l-annimali għandhom ikunu konformi mal-istandards lokali tal-indukrar tal-annimali; id-deskrizzjonijiet tal-indukrar u l-kura stabbiliti hawn taħt huma standards minimi tal-prestazzjoni, u ser jiġu sostiwtiti minn regolamenti lokali bħad-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta' Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintużaw għal skopijiet xjentifiċi (26). Iktar gwida dwar it-trattament umanitarju tal-annimali tingħata mill-OECD (17).

11.   Bħal fi kwalunkwe bijoassaġġ li juża annimali sperimentali, għandha tingħata kunsiderazzjoni attenta għall-ħtieġa li jitwettaq dan l-istudju. Bażikament, jista' jkun hemm żewġ raġunijiet għal deċiżjoni bħal din:

—	potenzjal ta' esponiment għoli (Livell 1 tal-Qafas Kunċettwali) jew indikazzjonijiet għal (anti)androġeniċità f'assaġġi in vitro (Livell 2) li jappoġġjaw investigazzjonijiet dwar jekk it-tali effetti jistgħux iseħħu in vivo,

—	effetti konsistenti ma' (anti)androġeniċità f'testijiet in vivo tal-Livell 4 jew 5 li jsostnu investigazzjonijiet tal-mod ta' azzjoni speċifiku, eż., biex jiġi determinat jekk l-effetti kinux dovuti għal mekkaniżmu (anti)androġeniku.

12.   Id-definizzjonijiet użati f'dan il-metodu ta' ttestjar jingħataw fl-Appendiċi 1.

IL-PRINĊIPJU TAT-TEST

13.   Il-Bijoassaġġ Hershberger jikseb is-sensittività tiegħu billi juża rġiel bi produzzjoni minima ta' androġen endoġenu. Dan jinkiseb permezz tal-użu ta' rġiel imsewwijin diment li jingħata biżżejjed żmien wara t-tiswija biex jiġu mmirati tessuti għar-rigress lejn piż bażi minimu u uniformi. B'hekk, meta jsir tgħarbil tal-attività androġenika potenzjali, hemm livelli endoġenużi baxxi ta' androġeni ċirkolanti, l-assi ipotalamiku — pitwitarju — gonadi ma jibqax kapaċi jikkumpensa permezz ta' mekkaniżmi ta' tagħlif, il-ħila tat-tessuti biex iwieġbu tkun massimizzata, u l-varjabbiltà tal-piż tat-tessut tal-bidu tiġi minimizzata. Meta jsir tgħarbil ta' attività antiandroġenika potenzjali, tista' tinkiseb żieda iktar konsistenti fil-piż tat-tessut meta t-tessuti jkunu stimolati permezz ta' androġen ta' referenza. B'hekk, il-Bijoassaġġ Hershberger jeħtieġ biss 6 annimali għal kull grupp tad-doża filwaqt li assi oħrajn bi rġiel pubertali jew adulti intatti jissuġġerixxu li jintużaw 15-il raġel f'kull grupp ta' doża.

14.   It-tiswija ta' firien irġiel peripubertali għandha ssir b'mod xieraq billi jintużaw anastetiċi u teknika asettika approvati. L-analġeżiċi għandhom jingħataw fl-ewwel ftit jiem wara l-kirurġija biex tiġi eliminata skumdità ta' wara l-kirurġija. It-tiswija ssaħħaħ il-preċiżjoni tal-assaġġ biex jinqabdu androġeni u antiandroġeni batuti billi telimina mekkaniżmi kompensatorji endokrinali ta' rispons preżenti fl-annimal intatt li jistgħu jtaffu l-effetti tal-androġeni u l-antiandroġeni mogħtijin u billi tiġi eliminata l-varjabbiltà kbira bejn l-individwi f'livelli tat-testosteron tas-serum. B'hekk, it-tiswija tnaqqas in-numri ta' annimali meħtieġa li jitgħarblu għal dawn l-attivitajiet endokrinali.

15.   Meta jsir tgħarbil għal attività androġenika potenzjali, is-sustanza kimika tat-test tingħata kuljum permezz ta' gavage orali jew tilqima taħt il-ġilda (sc) għal perjodu ta' għaxart ijiem konsekuttivi. Is-sustanzi kimiċi tat-test jingħataw lil tal-inqas żewġ gruppi tal-kura ta' annimali sperimentali li jużaw livell wieħed ta' doża għal kull grupp. L-annimali huma nekropsjati madwar 24 siegħa wara l-aħħar doża. Żieda statistikament sinifikanti f'żewġ piżijiet ta' organi fil-mira jew iktar tal-gruppi tas-sustanzi kimiċi tat-test imqabblin mal-grupp ta' kontroll veikolu tindika li s-sustanza kimika tat-test hija pożittiva għal attività androġenika potenzjali (Ara l-paragrafu 60). L-androġeni, bħal trenbolon, li ma jistax ikun 5α — ridott għandhom effetti li jinħassu iktar fuq l-LABC u l-GP meta mqabblin mat-TP, iżda t-tessuti kollha għandhom juru tkabbir miżjud.

16.   Meta jsir tgħarbil għal attività antiandroġenika potenzjali, is-sustanza kimika tat-test tingħata kuljum permezz ta' gavage orali jew tilqima taħt il-ġilda għal perjodu ta' għaxart ijiem konsekuttivi flimkien ma' dożi kuljum tat-TP (0,2 jew 0,4 mg/kg/jum) permezz ta' tilqima sc. Kien determinat fil-programm ta' validazzjoni li 0,2 jew 0,4 mg/kg/jum ta' TP jistgħu jintużaw peress li t-tnejn kienu effettivi fil-qbid ta' antiandroġeni u, għalhekk, doża waħda biss għandha tingħażel sabiex tintuża fl-assaġġ. Dożi approvati tas-sustanza kimika tat-test jingħataw lil tal-inqas tliet gruppi tal-kura mill-annimali sperimentali billi jintuża livell ta' doża wieħed għal kull grupp. L-annimali jiġu nekropsjati madwar 24 siegħa wara l-aħħar doża. Tnaqqis statistikament sinifikanti f'żewġ piżijiet ta' organi fil-mira jew iktar tas-sustanza kimika tat-test flimkien mal-gruppi tat-TP imqabblin mal-grupp ta' kontroll b'TP biss jindika li s-sustanza kimika tat-test hija pożittiva għal attività antiandroġenika potenzjali (Ara l-paragrafu 61).

DESKRIZZJONI TAL-METODU

Għażla tal-ispeċi u r-razza

17.   Il-far intuża spiss fil-Bijoassaġġ Hershberger sa mis-snin tletin. Għad li huwa bijoloġikament plawżibbli li kemm il-far kif ukoll il-ġurdien juru risponsi simili, fuq il-bażi ta' 70 sena esperjenza bil-mudell tal-far, il-far huwa l-ispeċi tal-għażla għall-Bijoassaġġ Hershberger. Barra minn hekk, peress li d-dejta tal-Bijoassaġġ Hershberger tista' tkun preliminari għal studju pluriġenerazzjonali fit-tul, dan jippermetti sabiex annimali mill-istess speċi, razza u sors jintużaw fiż-żewġ studji.

18.   Dan il-protokoll jippermetti sabiex il-laboratorji jagħżlu r-razza ta' far li għandha tintuża fl-assaġġ li ġeneralment għandha tkun dik użata storikament mil-laboratorju li jieħu sehem. Jistgħu jintużaw ir-razez ta' firien tal-laboratorju użati spiss; madankollu, razez li jimmaturaw ferm wara li jgħalqu t-42 jum ma għandhomx jintużaw peress li tiswija ta' dawn l-irġiel meta jkollhom 42 jum tista' tipprekludi l-kejl tal-piżijiet tar-ras tal-pene, li jista' jsir biss wara li l-prepuzju jiġi separat mill-korp tal-pene. B'hekk, razez li ġejjin mill-far Fisher 344 ma għandhomx jintużaw, ħlief f'każijiet rari. Il-far Fisher 344 għandu durati differenti tal-fażijiet tal-iżvilupp sesswali meta mqabbel ma' razez oħrajn użati iktar spiss bħar-razez Sprague Dawley jew Wistar (16). Jekk tintuża din ir-razza, il-laboratorju għandu jsewwihom f'età ftit ikbar u għandu jkun kapaċi juri s-sensittività tar-razza użata. Ir-raġuni għall-għażla tar-razza tal-far għandha tiġi ddikjarata b'mod ċar mil-laboratorju. Meta l-assaġġ tat-tgħarbil jista' jkun preliminari għal studju orali b'doża ripetuta, studju dwar ir-riproduzzjoni u l-iżvilupp, jew studju fit-tul, idealment intużaw annimali mill-istess razza u sors fl-istudji kollha.

Kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija u tal-għalf

19.   Il-proċeduri kollha għandhom jikkonformaw mal-istandards lokali kollha dwar l-indukrar tal-annimali tal-laboratorju. Dawn id-deskrizzjonijiet ta' indukrar u kura huma standards minimi u ser jiġu sostitwiti minn regolamenti lokali iktar strinġenti, bħad-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta' Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintużaw għal skopijiet xjentifiċi (26). It-temperatura fil-kamra tal-annimali sperimentali għandha tkun 22 °C (b'medda ta' madwar ± 3 °C). L-umdità relattiva għandha tkun tal-inqas 30 % u idealment ma għandhiex taqbeż massimu ta' 70 %, minbarra matul it-tindif tal-kamra. Il-mira għandha tkun umdità relattiva ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali. Is-sekwenza tad-dawl ta' kuljum għandha tkun ta' 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam.

20.   It-trobbija f'post fi grupp hija ppreferuta iktar minn iżolament minħabba l-età żgħira tal-annimali u l-fatt li l-firien huma annimali soċjali. It-trobbija fi grupp ta' żewġ jew tliet annimali f'kull gaġġa tevita ffullar u stress assoċjat li jistgħu jinterferixxu mal-kontroll ormonali tal-iżvilupp tat-tessut aċċessorju tas-sess. Il-gaġeġ għandhom jitnaddfu sew biex jinteħħew kontaminanti possibbli u jiġu rranġati b'tali mod li jiġu minimizzati l-effetti possibbli dovuti għall-pożizzjoni tal-gaġġa. Il-gaġeġ ta' daqs xieraq (~2 000 ċentimetru kwadru) ser jevitaw iffullar.

21.   Kull annimal għandu jkun identifikat b'mod individwali (eż., marka jew tikketta mal-widna) billi jintuża metodu umanitarju. Il-metodu ta' identifikazzjoni għandu jiġi rreġistrat.

22.   Id-dieta tal-laboratorju u l-ilma tajjeb għax-xorb għandhom jiġu pprovduti ad libitum. Il-laboratorju li jagħmlu l-Bijoassaġġ Hershberger għandhom jużaw id-dieta tal-laboratorju li normalment jużaw fil-ħidma tagħhom ta' ttestjar ta' sustanzi kimiċi. Fl-istudji ta' validazzjoni tal-Bijoassaġġ, ma ġew osservati ebda effett jew varjabbiltà li kienu attribwibbli għad-dieta. Id-dieta użata ser tiġi rreġistrata u għandu jinżamm kampjun tad-dieta tal-laboratorju għal analiżi possibbli fil-ġejjieni.

Il-kriterji ta' prestazzjoni għal piżijiet ta' organi li jiddependi fuq androġen

23.   Matul l-istudju ta' validazzjoni, ma kien hemm ebda evidenza li tnaqqis fil-piż tal-ġisem affettwa żidiet jew tnaqqisijiet fit-tkabbir tal-piżijiet tat-tessut għal tessuti fil-mira (jiġifieri, li għandhom jintiżnu f'dan l-istudju).

24.   Fost ir-razez differenti ta' firien użati b'suċċess fil-programm ta' validazzjoni, il-piżijiet ta' organi li jiddependi fuq androġen huma ikbar fir-razez itqal ta' firien meta mqabblin ma' razez eħfef. Għalhekk, il-kriterji ta' prestazzjoni tal-Bijoassaġġ Hershberger ma jinkludux piżijiet tal-organi assoluti mistennija għal kontrolli pożittivi u negattivi.

25.   Peress li l-Koeffiċjent tal-Varjazzjoni (CV) għal tessut għandu relazzjoni inversa mas-saħħa statistika, il-kriterji ta' prestazzjoni tal-Bijassaġġ Hershberger huma bbażati fuq valuri massimi tas-CV għal kull tessut (Tabella 1). Is-CVs jittieħdu mill-istudji ta' validazzjoni tal-OECD. Fil-każ ta' riżultati negattivi, il-laboratorji għandhom jeżaminaw is-CVs mill-grupp ta' kontroll u l-grupp ta' kura b'doża għolja biex jiddeterminaw jekk inqabżux il-kriterji ta' prestazzjoni massimi tas-CV.

26.   L-istudju għandu jkun ripetut meta: 1) tlieta jew iktar mill-għaxar CVs individwali possibbli fil-gruppi ta' kontroll u ta' kura b'doża għolja jaqbżu l-massimi magħżulin għal studji ta' agonisti u antagonisti fit-Tabella 1 u 2) tal-inqas żewġ tessuti fil-mira kienu marġinalment insinifikanti, jiġifieri, valuri ta' ρ bejn 0,05 u 0,10.

Tabella 1

CVs massimi awtorizzabbli Determinati għat-Tessuti Aċċessorji tas-Sess fil-Mira għall-mudell imsewwi fl-Istudji ta' Validazzjoni tal-OECD  (1)

Tessut	Effetti antiandroġeniċi	Effetti androġeniċi
Infafet seminali	40 %	40 %
Prostata ventrali	40 %	45 %
LABC	20 %	30 %
Glandoli ta' Cowper	35 %	55 %
Ras tal-pene	17 %	22 %

PROĊEDURA

Konformità regolatorja u verifika tal-laboratorju

27.   Għall-kuntrarju tal-assaġġ Utertrofiku (Kapitolu B.54 ta' dan l-Anness), wiri tal-konformità tal-laboratorju qabel it-tnedija tal-istudju mhijiex neċessarja għall-assaġġ Hershberger għaliex kontrolli pożittivi (Testosteron Propjonat u Flutamid) u negattivi fl-istess ħin isiru bħala parti integrali tal-assaġġ.

In-numru u l-kundizzjoni tal-annimali

28.   Kull grupp ikkurat u tal-kontroll għandu jinkludi minimu ta' 6 annimali. Dan japplika kemm għall-protokoll androġeniku kif ukoll antiandroġeniku.

Tiswija

29.   Għandu jkun hemm perjodu inizjali ta' akklimatizzazzjoni ta' bosta jiem wara r-riċevuta tal-annimali biex jiġi żgurat li l-annimali huma b'saħħithom u jikbru sew. Peress li annimali msewwijin qabel ma jgħalqu 42 jum jew il-jum ta' wara t-twelid (pnd) 42 jistgħu ma jurux separazzjoni prepuzjali, l-annimali għandhom jissewwew fil-pnd 42 jew wara, u mhux qabel. L-annimali jissewwew taħt anesteżija billi ssir inċiżjoni fl-iskrotu u jitneħħew iż-żewġ testikoli u l-epididimidi b'ligatura tal-vini tad-demm u l-passaġġi seminali. Wara l-konfrma li ma jkun qed hemm l-ebda fsad, l-iskrotu għandu jingħalaq b'sutura jew autoclips. L-annimali għandhom jiġu kkurati b'analġeżiċi għall-ewwel ftit jiem wara l-kirurġija biex tittaffa kwalunkwe skumdità ta' wara l-kirurġija. Jekk l-annimali msewwijin jinxtraw minn fornitur tal-annimali, l-età tal-annimali u l-istadju tal-maturità sesswali għandhom ikunu żgurati mill-fornituri.

Akklimatizzazzjoni wara t-tiswija

30.   L-annimali għandhom ikomplu bl-akklimatizzazzjoni fil-kundizzjonijiet tal-laboratorju biex tkun tista' ssir ir-rigressjoni fil-piżijiet tat-tessut fil-mira għal tal-inqas 7 ijiem wara t-tiswija. L-annimali għandhom ikunu osservati kuljum, u kwalunkwe annimal b'evidenza ta' marda jew anormalitajiet fiżiċi għandu jitneħħa. B'hekk, il-kura permezz ta' bidu tad-dożaġġ (fl-istudju) tista' tibda mindu jgħalqu pnd 49 jum, iżda mhux wara l-pnd 60. L-età meta ssir in-nekropsija ma għandhiex tkun iktar mill-pnd 70. Din il-flessibilità tippermetti sabiex laboratorju jiskeda l-ħidma sperimentali b'mod effiċjenti.

Piż tal-ġisem u gruppi aleatorji

31.   Id-differenzi fil-piżijiet tal-ġisem individwali huma sors ta' varjabbiltà fil-piżijiet tat-tessut kemm fi ħdan kif ukoll fost gruppi ta' annimali. Iż-żieda fil-vjarbabiltà tal-piż tat-tessut tirriżulta f'koeffiċjent tal-varjazzjoni (CV) miżjud u tnaqqas is-saħħa statistika tal-assaġġ (kultant imsejħa s-sensitività tal-assaġġ). Għalhekk, varjazzjonijiet fil-piż tal-ġisem għandhom ikunu kkontrollati kemm b'mod sperimentali kif ukoll statistiku.

32.   Il-kontroll sperimentali jinvolvi l-produzzjoni ta' varjazzjonijiet żgħar fil-piż tal-ġisem fi ħdan u fost il-gruppi ta' studju. L-ewwel nett, annimali żgħar jew kbar wisq għandhom jiġu evitati u ma jitqegħdux fil-grupp tal-istudju. Mal-bidu tal-istudju, il-varjazzjoni tal-piż tal-annimali ma għandhiex taqbeż ± 20 % tal-piż medju (eż. 175 g ± 35 g għal firien peripubertali msewwijin). It-tieni, l-annimali għandhom ikunu assenjati fi gruppi (kemm ta' kontroll kif ukoll tal-kura) permezz ta' distribuzzjoni tal-piż b'mod aleatorju, sabiex il-piż medju tal-ġisem ta' kull grupp ma jkunx statistikament differenti minn xi grupp ieħor. Il-proċedura blokk ta' tqassim aleatorju użata għandha tiġi rreġistrata.

33.   Peress li t-tossiċità tista' tnaqqas il-piż tal-ġisem tal-gruppi kkurati fir-rigward tal-grupp ta' kontroll, il-piż tal-ġisem fl-ewwel jum tal-għoti tas-sustanza kimika tat-test jista' jintuża bħala kovarjant statistiku, mhux il-piż tal-ġisem fin-nekropsija.

Dożaġġ

34.   Sabiex jiġi stabbilit jekk sustanza kimika tat-test jistax ikollha azzjoni androġenika in vivo, żewġ gruppi ta' doża tas-sustanza kimika tat-test flimkien ma' kontrolli pożittivi u veikoli (negattivi) (Ara l-paragrafu 43) normalment ikunu biżżejjed, u għalhekk, dan id-disinn huwa ppreferut għal raġunijiet ta' benessri tal-annimali. Jekk l-iskop ikun li jew tinkiseb kurva ta' rispons għad-doża jew li ssir estrapolazzjoni għal dożi inferjuri, tal-inqas ikun hemm bżonn ta' 3 gruppi ta' doża. Jekk ikun hemm bżonn ta' informazzjoni minbarra identifikazzjoni tal-attività androġenika (bħal stima tal-potenza), għandha tiġi kkunsidrata skeda differenti tad-dożaġġ. Biex isiru testijiet għal antiandroġeni, is-sustanza kimika tat-test tingħata flimkien ma' agonist tal-androġen ta' referenza. Għandhom jintużaw tal-inqas 3 gruppi ta' ttestjar b'dożi differenti tas-sustanza kimika tat-test u kontroll pożittiv u negattiv (Ara l-paragrafu 44). Ħlief għat-trattament bis-sustanza kimika tat-test, l-annimali fil-grupp ta' kontroll għandhom jitqandlu bl-istess mod bħas-suġġetti tal-grupp tat-test. Jekk jintuża veikolu fl-għoti tas-sustanza kimika tat-test, il-grupp ta' kontroll għandu jirċievi l-veikolu fl-ogħla volum użat bil-gruppi tat-test.

35.   Il-livelli kollha ta' doża għandhom ikunu proposti u jingħażlu filwaqt li tittieħed f'kunsiderazzjoni kwalunkwe dejta (tossiko)kinetika u dwar it-tossiċità eżistenti u għad-dispożizzjoni għas-sustanza kimika tat-test jew materjali relatati. L-ewwel nett, l-ogħla livell ta' doża għandu jieħu f'kunsiderazzjoni l-LD50 u/jew informazzjoni dwar it-tossiċità akuta sabiex jiġu evitati mewt, tbatija severa jew diffikultà fl-annimali (17)(18)(19)(20) u, it-tieni, jieħu f'kunsiderazzjoni l-informazzjoni disponibbli dwar id-dożi użati fi studji sottokroniċi u kroniċi. B'mod ġenerali, l-ogħla doża ma għandhiex tikkaġuna tnaqqis fil-piż finali tal-ġisem tal-annimali iktar minn 10 % tal-piż ta' kontroll. L-ogħla doża għandha tkun jew 1) l-ogħla doża li tiżgura sopravvivenza tal-annimali u li hija mingħajr tossiċità jew diffikultà importanti għall-annimali wara 10 ijiem konsekuttivvi ta' għoti sa doża massima ta' 1 000 mg/kg/jum (Ara l-paragrafu 36) jew 2) doża li tinduċi effetti (anti)androġeniċi, skont liema tkun l-inqas. Għat-tgħarbil, intervalli kbar, eż. unitajiet ta' nofs log (li jikkorrispondu għal progressjoni tad-doża ta' 3,2) jew anki unitajiet ta' log waħda, bejn dożaġġi ġeneralment huma aċċettabbli. Jekk ma hemm ebda dejta xierqa disponibbli, jista' jsir studju ta' sejbien tal-medda (Ara l-paragrafu 37) biex jgħin fid-determinazzjoni tad-dożi li għandhom jintużaw.

Livell tad-doża ta' limitu

36.   Jekk test fid-doża ta' limitu ta' 1 000 mg/kg piż tal-ġisem/jum u doża inqas li juża l-proċeduri deskritti għal dan l-istudju jonqos milli jipproduċi bidla statistikament sinifikanti fil-piżijiet tal-organi riproduttivi, f'dak il-każ, livelli addizzjonali ta' dożi jistgħu jitqiesu mhux neċessarji. Id-doża ta' limitu tapplika ħlief meta dejta dwar esponiment tal-bniedem tindika l-bżonn li jintuża livell ta' doża ogħla.

Kunsiderazzjonijiet għas-sejba tal-medda

37.   Jekk ikun hemm bżonn, jista' jsir studju preliminari ta' sejbien tal-medda bi ftit annimali sabiex jingħażlu gruppi ta' doża xierqa [billi jintużaw metodi għall-ittestjar tat-tossiċità akuta (Kapitoli B.1 bis, B.1 tris ta' dan l-Anness (27), TG tal-OECD Nru 425 (19))]. L-għan fil-każ tal-Bijoassaġġ Hershberger huwa li jagħżel dożi li jiżguraw sopravvivenza tal-annimali u li huma ħielsa minn tossiċità jew diffikultà importanti għall-annimali wara għaxart ijiem konsekuttivi ta' għoti tas-sustanza kimika sa doża limitu ta' 1 000 mg/kg/jum kif stipulat fil-paragrafi 35 u 36. F'dan ir-rigward jista' jintuża Dokument Gwida tal-OECD (17) li jiddefinixxi sinjali kliniċi li jindikaw tossiċità jew diffikultà fl-annimali. Jekk fattibbli fi ħdan dan l-istudju ta' sejbien tal-medda wara għaxart ijiem ta' għoti, it-tessuti fil-mira jistgħu jinqatgħu u jintiżnu madwar 24 siegħa wara li tingħata l-aħħar doża. Imbagħad din id-dejta tkun tista' tintuża biex tgħin fl-għażla tad-dożi fl-istudju ewlieni.

Sustazi kimiċi ta' referenza u veikolu

38.   L-agonist tal-androġen ta' referenza għandu jkun Testosteron Propjonat (TP), Nru tas-CAS 57-82-5. Id-dożaġġ ta' referenza tat-TP jista' jkun jew 0,2 mg/kg-bw/jum jew inkella 0,4 mg/kg-bw/jum. L-antagonist tal-androġen ta' referenza għandu jkun Flutamid (FT), Nru tas-CAS 1311-84-7. Id-dożaġġ ta' referenza tal-FT għandu jkun ta' 3 mg/kg-bw/jum, u l-FT għandu jingħata flimkien mad-dożaġġ ta' referenza tat-TP.

39.   Huwa rakkomandat li, kull fejn ikun possibbli, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' soluzzjoni milwiema/sospensjoni. Madankollu, peress li ħafna ligandi tal-androġeni jew il-prekursuri metaboliċi tagħhom għandhom it-tendenza li jkunu idrofobiċi, l-iktar approċċ komuni huwa li tintuża soluzzjoni/sospensjoni fiż-żejt (eż. żejt tal-qamħirrun, tal-karawett, tal-ġunġlien jew taż-żebbuġ). Is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jinħallu f'ammont minimu ta' 95 % etanol jew solventi xierqa oħrajn u jiġu dilwiti f'konċentrazzjonijiet ta' użu finali fil-veikolu tat-test. Il-karatteristiċi tossiċi tas-solvent għandhom ikunu magħrufin, u għandhom ikunu ttestjati fi grupp ta' kontroll separat b'solvent biss. Jekk is-sustanza kimika tat-test titqies stabbli, tista' tintuża azzjoni mekkanika ħafifa ta' tisħin u b'saħħitha biex tgħin ħalli tinħall is-sustanza kimika tat-test. Għandha tiġi determinata l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fil-veikolu. Jekk is-sustanza kimika tat-test hija stabbli għad-durata tal-istudju, ikun jista' jitħejja alikwot tal-bidu tas-sustanza kimika tat-test, u d-dilwizzjonijiet speċifikati tad-dożaġġ ippreparati ta' kuljum b'attenzjoni biex jiġu evitati kontaminazzjoni u ħela tal-kampjuni.

L-għoti tad-dożi

40.   It-TP għandu jingħata permezz ta' tilqima taħt il-ġilda, u l-FT permezz ta' gavage orali.

41.   Is-sustanza kimika tat-test tingħata permezz ta' gavage orali jew tilqima taħt il-ġilda. Kunsiderazzjonijiet dwar il-benessri tal-annimali u l-proprjetajiet fiżiċi/kimiċi tas-sustanza kimika tat-test iridu jitqiesu meta tingħażel ir-rotta tal-amministrazzjoni. Barra minn hekk, għandhom jittieħdu f'kunsiderazzjoni aspetti tossikoloġiċi bħar-relevanza għar-rotta ta' esponiment tal-bniedem għas-sustanza kimika (eż. gavage orali biex tiġi simulata inġestjoni, tilqima taħt il-ġilda biex jiġi simulat teħid man-nifs jew adsorbiment dermali) u informazzjoni tossikoloġika eżistenti u dejta dwar il-metaboliżmu u l-kinetika (eż. il-bżonn li jiġi evitat metaboliżmu first pass, effiċjenza aħjar b'rotta partikolari) qabel ma jinbeda ttestjar estensiv fit-tul, jekk jinkisbu riżultati pożittivi permezz tat-tilqima.

42.   L-annimali għandhom jingħataw doża bl-istess mod u sekwenza ta' ħin għal għaxart ijiem konsekuttivi b'intervalli ta' madwar 24 siegħa. Il-livell ta'dożaġġ għandu jiġi aġġustat kuljum fuq il-bażi tal-kejl konkurrenti ta' kuljum tal-piż tal-ġisem. Il-volum tad-doża u l-ħin li tingħata għandu jiġi rreġistrat f'kull jum ta' esponiment. Għandha tingħata attenzjoni sabiex ma tinqabiżx id-doża massima deskritta fil-paragrafu 35 biex tkun tista' ssir interpretazzjoni valida tad-dejta. Tnaqqis fil-piż tal-ġisem, sinjali kliniċi u sejbiet oħrajn għandhom jiġu vvalutati f'dettall f'dan ir-rigward. Għal gavage orali, għandhom jintużaw tubu tal-istonku jew cannula xierqa ta' intubazzjoni. Il-volum massimu ta' likwidu li jista' jingħata f'darba jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. Għandhom ikunu segwiti l-linji gwida lokali dwar l-indukrar tal-annimali, iżda l-volum ma għandux jaqbeż il-5 ml/kg piż tal-ġisem, ħlief fil-każ ta' soluzzjonijiet milwiema fejn jista' jintuża 10 ml/kg piż tal-ġisem. Għal tilqimiet taħt il-ġilda, id-dożi għandhom jingħataw fir-reġjuni dorsoskapulari u/jew lombari permezz ta' labra sterili (eż. ħxuna ta' 23 jew 25) u siringa tuberkulina. It-tqaxxir tas-sit tat-tilqima huwa fakultattiv. Għandhom jiġu rreġistrati kwalunkwe telf, tnixxija fis-sit tat-tilqima jew dożaġġ inkomplut. Il-volum totali injettat lil kull far kuljum ma għandux jaqbeż iż-0,5 ml/kg piż tal-ġisem.

Proċeduri speċifiċi għal agonisti tal-androġen

43.   Għat-test għal agonisti tal-androġen, il-veikolu huwa l-kontroll negattiv, u l-grupp ikkurat b'TP huwa l-kontroll pożittiv. L-attività bijoloġika konsistenti ma' agonisti tal-androġen hija ttestjata bl-għoti ta' sustanza kimika tat-test lil gruppi tal-kura bid-dożi magħżulin għal 10 ijiem konsekuttivi. Il-piżijiet tal-ħames tessuti aċċessorji tas-sess mill-gruppi tas-sustanza kimika tat-test jitqabblu mal-grupp veikolu għal żidiet statistikament importanti fil-piż.

Proċeduri speċifiċi għal antagonisti tal-androġen u inibituri ta' 5α-ridottasi

44.   Għat-test għal antagonisti tal-androġe u inibituri ta' 5α-ridottasi, il-grupp ikkurat b'TP huwa l-kontroll negattiv, u l-grupp koamministrat bid-dożi ta' referenza tat-TP u l-FT huwa l-kontroll pożittiv. L-attività bijoloġika konsistenti ma' antagonisti tal-androġen u inibituri ta' 5α-ridottasi hija ttestjata billi tingħata doża ta' referenza ta' TP u bl-għoti tas-sustanza kimika tat-test għal 10 ijiem konsekuttivi. Il-piżijiet tal-ħames tessuti aċċessorji tas-sess mit-TP flimkien mal-gruppi tas-sustanza kimika tat-test jitqabblu mal-grupp ta' referenza b'TP biss għal tnaqqisijiet statistikament sinifikanti fil-piżijiet.

OSSERVAZZJONIJIET

Osservazzjonijiet kliniċi

45.   Osservazzjonijiet kliniċi ġenerali għandhom isiru tal-inqas darba kuljum u b'mod iktar spiss meta jkunu osservati sinjali ta' tossiċità. Idealment, l-osservazzjonijiet għandhom isiru fl-istess ħin(ijiet) kuljum u filwaqt li jiġi kkunsidrat il-perjodu tal-ogħla effetti antiċipati wara d-dożaġġ. L-annimali kollha għandhom jiġu osservati għall-mortalità, il-morbidità u sinjali kliniċi ġenerali bħal bidlet fl-imġiba, il-ġilda, il-pil, l-għajnejn, il-membrani mukużi, l-okkorrenza ta' tnixxijiet u eskrezzjonijiet u l-attività awtonomika (eż. dmugħ, piloerezzjoni, daqs tal-ħabba, mudell respiratorju mhux tas-soltu).

46.   Kwalunkwe annimal li jinstab mejjet għandu jitneħħa u jiġi dispost mingħajr analiżi ulterjuri tad-dejta. Kwalunkwe mortalità tal-annimali qabel in-nekropsija għandha tkun inkluża fir-reġistru tal-istudju ma' kwalunkwe raġuni apparenti għall-mortalità. Kwalunkwe annimal moribond għandu jinqatel b'mod dinjituż. Kwalunkwe annimal moribond li mbagħad jiġi ewtanizzat għandu jkun inkluż fir-reġistru tal-istudju bir-raġunijiet apparenti għall-morbidità.

Piż tal-ġisem u konsum ta' ikel

47.   L-annimali kollha għandhom jintiżnu kuljum sal-eqreb 0,1 g, b'bidu eżatt qabel ma tinbeda l-kura, jiġifieri meta -annimali jitqassmi fi gruppi. Bħala kejl fakultattiv, l-ammont ta' ikel ikkonsmat matul il-perjodu tal-kura jista' jitkejjel skont kull gaġġa billi jintiżnu dawk li jitgħalfu. Ir-riżultati tal-konsum tal-ikel għandhom jingħataw fi grammi għal kull far kull jum.

Dissezzjoni u kejl tal-piżijiet tat-tessuti u tal-organi

48.   Madwar 24 siegħa wara l-aħħar għoti tas-sustanza kimika tat-test, il-firien għandhom jiġu ewtanizzati u żvinati skont il-proċeduri normali tal-kondotta fil-laboratorju, u għandha ssir in-nekropsija. Il-metodu ta' qtil dinjituż għandu jiġi rreġistrat fir-rapport tal-laboratorju.

49.   Idealment, l-ordni ta' nekropsija għandha tkun aleatorja fost il-gruppi biex tiġi evitata progressjoni direttament 'il fuq jew 'l isfel ta' gruppi ta' doża li tista' taffettwa d-dejta. Kwalunkwe sejba fin-nekropsija, jiġifieri bidliet patoloġiċi/leżjonijiet viżibbli għandha titniżżel u tiġi rreġistrata.

50.   Il-ħames tessuti li jiddependu fuq l-androġen (VP, SV, LABC, COW, GP) għandhom jintiżnu. Dawn it-tessuti għandhom jinqatgħu, jitraqqmu bi preċiżjoni mit-tessut u x-xaħam imqabbad żejjed, u għandhom jiġu determinati l-piżijiet friski (mhux fissati) tagħhom. Kull tessut għandu jitqandel b'attenzjoni partikolari biex jiġi evitat it-telf ta' fluwidi u biex tiġi evitata desikkazzjoni, li tista' tintroduċi żbalji importanti u varjabbiltà billi jitnaqqsu l-piżijiet irreġistrati. Ħafna mit-tessuti jistgħu jkunu żgħar ħafna jew diffiċli wisq biex issirilhom dissezzjoni, u dan ser jintroduċi varjabbiltà. Għalhekk, importanti li l-persuni li jagħmlu d-dissezzjoni tat-tessuti aċċessorji tas-sess ikunu midħla tal-proċeduri standard ta' dissezzjoni għal dawn it-tessuti. Manwal tal-proċedura standard tal-operazzjoni (SOP) għad-dissezzjoni huwa disponibbli mill-OECD (21). Taħriġ attent skont il-gwida dwar l-SOP ser inaqqas sors potenzjali ta' varjazzjoni fl-istudju. Idealment, l-istess prosettur għandu jkun responsabbli għad-dissezzjoni ta' tessut partikolari biex jiġu eliminati differenzi bejn individwi fl-ipproċessar tat-tessuti. Jekk dan ma jkunx possibbli, in-nekropsija għandha titfassal b'tali mod li kull prosettur jagħmel dissezzjoni ta' tessut partikolari mill-gruppi tal-kura kollha u mhux għal individwu wieħed li jagħmel dissezzjoni tat-tessuti kollha minn grupp ta' kontroll, filwaqt li ħaddieħor ikun responsabbli għall-grupp ikkurat. Kull tessut aċċessorju tas-sess għandu jintiżen mingħajr tnixxif sal-eqreb 0,1 mg, u l-piżijiet iridu jiġu rreġistrati għal kull annimali.

51.   Ħafna mit-tessuti jistgħu jkunu żgħar ħafna jew diffiċli wisq biex issir dissezzjoni tagħhom, u dan ser jintroduċi varjabbiltà. Ħidma fl-imgħoddi indikat medda ta' koeffiċjent tal-varjazzjonijiet (CVs) li donnu jvarja fuq il-bażi tal-profiċjenza tal-laboratorju. Fi ftit każijiet, fi ħdan laboratorju partikolari ġew osservati differenzi kbar fil-piżijiet assoluti tat-tessuti bħall-VP u s-COWS.

52.   Il-kejl ta' fwied, kilwa f'par u adrenali f'par huwa fakultattiv. Mill-ġdid, it-tessuti għandu jitneħħilhom kwalunkwe fascia u xaħam imqabbad magħhom. Il-fwied għandu jintiżen u jiġi rreġistrat sal-eqreb 0,1 g u l-kliewi f'par u l-adrenali f'par għandhom jintiżnu u jiġu rreġistrati sal-eqreb 0,1 mg. Il-fwied, il-kilwa u l-adrenali mhumiex influwenzati minn androġeni biss; jipprovdu wkoll ħjiliet utli ta' tossiċità sistemika.

53.   Il-kejl tal-ormon luteinizzanti tas-serum (LH), l-orom li jistimola l-follikoli (FSH) u t-testosteron (T) huwa fakultattiv. Il-livelli tas-serum T huma utli biex jiġi determinat jekk is-sustanza kimika tat-test tinduċix metaboliżmu tal-fwied ta' testosteron, li jbaxxi l-livelli tas-serum. Mingħajr id-dejta T, effett bħal dan jista' jidher li ġej minn mekkaniżmu antiandroġeniku. Il-livelli tal-LH jipprovdu informazzjoni dwar il-ħila ta' antiandroġenu sabiex mhux biss jonqsu l-piżijiet tal-organi, iżda anki sabiex tiġi affettwata l-funzjoni ipotalamika-pitwitarja, li fi studji fit-tul tista' tinduċi tumuri fit-testikoli. L-FSH huwa ormon importanti għall-ispermatoġenesi. Is-serum T4 u T3 huma kejl fakultattiv ukoll li jipprovdi informazzjoni supplimentari utli dwar il-ħila li tiġi interrotta omeostażi tal-orom tat-tirojde. Jekk ser isiru l-kejliet tal-oromon, il-firien għandhom jiġu anestetizzati qabel in-nekropsija u għandu jittieħed id-demm permezz ta' titqiba kardijaka, u l-metodu tal-anesteżija għandu jingħażel b'attenzjoni sabiex ma jaffettwax il-kejl tal-ormon. Il-metodu tat-tħejjija tas-serum, is-sors tar-radjuimmunoassaġġ jew kits oħrajn ta' kejl, il-proċeduri analitiċi, u r-riżultati għandhom jiġu rreġistrati. Il-livelli tal-LH għandhom jiġu rrapportati bħala ng għal kull ml serum, u l-livell ta' T għandu jiġi rrapportat ukoll bħala ng għal kull ml serum.

54.   Id-dissezzjoni tat-tessuti hija deskritta kif ġej bi gwida dettaljata ta' dissezzjoni b'ritratti ppubblikati bħala materjali supplementari bħala parti mill-programm ta' validazzjoni (21). Hemm ukoll vidjo ta' dissezzjoni għad-dispożizzjoni mill-paġna fuq il-web tal-Korea Food and Drug Administration (22).

—	Bil-wiċċ ventrali tal-annimal iħares 'il fuq, ara jekk il-prepuzju tal-pene isseparax mir-ras tal-pene. Jekk iva, imbagħad daħħal lura l-prepuzju u neħħi r-ras tal-pene, iżen (sal-eqreb 0,1 mg), u rreġistra l-piż,

—

Iftaħ il-ġilda u l-ħajt tal-addome, biex tesponi l-vixxri. Jekk l-organi fakultattivi jintiżnu, neħħi u iżen il-fwied sal-eqreb 0,1 g, neħħi l-istonku u l-intestini u iżen il-kliewi f'par u l-adrenali f'par sal-eqreb 0,1 mg. Din id-dissezzjoni tesponi l-apparat tal-urina u tibda d-dissezzjoni tat-tessuti aċċessorji fil-mira tar-raġel,

—

Biex tagħmel dissezzjoni tal-VP, issepara l-apparat tal-urina mis-saff tal-muskolu ventrali billi taqta' t-tessut konnettiv tul il-linja tan-nofs. Ċaqlaq l-apparat tal-urina lura lejn in-nuffati seminali (SV), biex tikxef il-lobi tax-xellug u tal-lemin tal-prostata ventrali (miksija b'saff xaħam). Bil-mod iġbed ix-xaħam mil-lobi tal-lemin u tax-xellug tal-VP. Bir-reqqa ċaqlaq il-lobu tal-lemin tal-VP mill-uretra u agħmel dissezzjoni tal-lobu mill-uretra. Filwatq li tibqa' żżomm il-lobu tal-lemin tal-VP, bil-mod ċaqlaq il-lobu tax-xellug tal-VP mill-uretra u mbagħad agħmel dissezzjoni; iżen sal-eqreb 0,1 mg u rreġistra l-piż,

—

Biex tagħmel dissezzjoni tal-SVCG, ċaqlaq l-apparat tal-urina lejn id-denb, biex tesponi l-vas deferens u l-lobi tal-lemin u tax-xellug tan-nuffati seminali flimkien mal-glandoli koagulanti (SVCG). Evita tnixxija ta' fluwidu billi ssodd b'emostata fil-bażi tal-SVCGs, fejn il-vas deferens jingħaqad mal-uretra. Bil-mod agħmel dissezzjoni tal-SVCGs, bl-emostata f'postha neħħi x-xaħam u l-adnexa, qiegħed f'użin tat-tara, neħħi l-emostata, u iżen sal-eqreb 0,1 mg u rreġistra l-piż,

—

Biex tagħmel dissezzjoni tal-muskoli reffiegħa bulbokavernosi ani plus (LABC), il-muskoli u l-bażi tal-pene jiġu esposti. Il-muskoli LA jiksu l-kolon, filwaqt li l-muskoli anterjuri tal-LA u l-BC jaqbdu mal-basal tal-pene. Il-ġilda u l-adnexa mir-reġjuni perianali li jestendi mill-bażi tal-pene sat-tarf anterjuri tal-anus jitneħħew. Il-muskoli tal-BC jiġu dissezzjonati b'mod gradwali mill-basla u t-tessuti tal-pene. Il-kolon tinqata' fi tnejn u, l-LABC sħaħ jistgħu jiġu dissezzjonati u jitneħħew. L-LABC għandu jitneħħilhom ix-xaħam u l-adnexa, jintiżnu sal-eqreb 0,1 mg, u jiġi rreġistrat il-piż tagħhom,

—

Wara li jitneħħew l-LABC, il-glandoli ttondjati ta' Cowper jew bulboretrali (COW) isiru viżibbli fil-bażi ta', u ftit dorsali għal, basal tal-pene. Hemm bżonn li ssir dissezzjoni bir-reqqa biex jiġi evitat milli tintlaqat il-kapsula rqiqa ħalli tiġi evitata tnixxija ta' fluwidi. Iżen is-COW f'par sal-eqreb 0,1 mg, u rreġistra l-piż,

—	Barra minn hekk, jekk jintilef fluwidu minn xi glandola matul in-nekropsija u d-dissezzjoni, dan għandu jiġi rreġistrat.

55.   Jekk l-evalwazzjoni ta' kull sustanza kimika tkun teħtieġ nekropsija ta' iktar annimali minn dak li huwa raġonevoli għal jum wieħed, il-bidu tal-istudju jista' jkun imxekkel għal jumejn konsekuttivi, u dan jirriżulta fix-xekkil tan-nekropsija u l-ħidma relatata għal jumejn. Jekk ikun hemm xekkil bħal dan, għandhom jintużaw nofs l-annimali għal kull grupp tal-kura kull jum.

56.   Għandha ssir dispożizzjoni b'mod xieraq tal-karkassi wara n-nekropsija.

RAPPORTAR

Dejta

57.   Id-dejta għandha tiġi rrapportata b'mod individwali (jiġifieri l-piż tal-ġisem, il-piżijiet tat-tessut aċċessorju tas-sesss, kejliet fakultattivi u risponsi u osservazzjonijiet oħrajn) u għal kull grupp ta' annimali (medji u devjazzjonijiet standard ta' kull kejl meħud). Id-dejta għandha tinġabar fil-qosor f'forma ta' tabella. Id-dejta għandha turi n-numru ta' annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta' annimali misjubin mejtin matul it-test jew misjubin li qed juru sinjali ta' tossiċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta' tossiċità osservati, inklużi l-ħin tal-bidu, id-durata u s-severità.

58.   Rapport finali għandu jinkludi:

Faċilità tal-ittestjar

—	Isem il-faċilità, il-post,

—	Id-direttur tal-istudju u persunal ieħor u r-responsabilitajiet ta' studju tiegħu,

—	Id-dati li fihom beda u ntemm l-istudju, jiġifieri l-ewwel jum tal-għoti tas-sustanza kimika tat-test u l-aħħar jum ta' nekropsija, rispettivament.

Sustanza kimika tat-test

—	Is-sors, in-numru tal-lott, l-identità, il-purità, l-indirizz sħiħ tal-fornitur u l-karatterizzazzjoni tas-sustanza/i kimika/kimiċi,

—	L-għamla fiżika u, fejn rilevanti, il-proprjetajiet fiżjokimiċi,

—	Il-kundizzjonijiet ta' ħżin u l-metodu u l-frekwenza tal-preparazzjoni tad-dilwizzjoni,

—	Kwalunkwe dejta ġġenerata fuq l-istabbiltà,

—	Kwalunkwe analiżi tas-soluzzjonijiet/sospensjonijiet tad-dożaġġ.

Veikolu

—	Il-karatterizzazzjoni tal-veikolu (identità, fornitur u Nru tal-lott),

—	Ġustifikazzjoni tal-għażla tal-veikolu (jekk mhuwiex ilma).

Annimali tat-test u proċeduri ta' trobbija tal-annimali

—	L-ispeċi/ir-razza użata u r-raġuni għall-għażla,

—	Is-sors jew il-fornitur tal-annimali, inkluż l-indirizz sħiħ,

—	In-numru u l-età tal-annimali forniti,

—	Il-kundizzjonijiet fil-post tat-trobbija (temperatura, dawl, u l-bqija),

—	Id-dieta (isem, tip, fornitur, numru tal-lott, kontenut u, jekk magħrufin, il-livelli ta' fitoestroġeni),

—	Il-bejta (isem, tip, fornitur, kontenut),

—	Il-kundizzjonijiet fil-gaġeġ u n-numru ta' annimali f'kull gaġġa.

Kundizzjonijiet tal-Assaġġ

—	L-età tat-tiswija u d-durata tal-akklimatizzazzjoni wara t-tiswija,

—	Il-piżijiet individwali tal-annimali fil-bidu tal-istudju (sal-eqreb 0,1 g),

—	Il-proċess ta' tqassim aleatorju u rekord tal-assenjament għal veikolu, referenza, gruppi tas-sustanza kimika tat-test, u gaġeġ,

—	Devjazzjoni medja u standard tal-piżijiet tal-ġisem għal kull grupp għal kull jum li jintiżnu fih tul l-istudju kollu,

—	Ir-raġuni għall-għażla tad-doża,

—	Ir-rotta tal-amministrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test u r-raġuni għall-għażla tar-rotta ta' esponiment,

—	Jekk assaġġ għall-antiandroġeniċità, it-trattament bit-TP (doża u volum),

—	It-trattament bis-sustanza kimika tat-test (doża u volum),

—	Il-ħin tad-dożaġġ,

—	Il-proċeduri tan-nekropsija, inklużi mezzi ta' żvinar u kwalunkwe anesteżija,

—	Jekk isiru analiżijiet tas-serum, għandhom jiġu pprovduti dettalji dwar il-metodu. Pereżempju, jekk tintuża l-RIA, għandhom jiġu rrapportati l-proċedura tal-RIA, is-sors tal-kits tal-RIA, id-dati ta' skadenza tal-kits, il-proċedura għall-għadd tax-xintillar, u l-istandardizzazzjoni.

Riżultati

—	L-osservazzjonijiet ta' kuljum għal kull annimal matul id-dożaġġ, inklużi:

—	Il-piżijiet tal-ġisem (sal-eqreb 0.1 g),

—	Is-sinjali kliniċi (jekk ikun hemm),

—	Kwalunkwe kejl jew noti ta' konsum tal-ikel.

—	L-osservazzjonijiet fin-nekropsija għal kull annimal, inklużi:

—	Id-data tan-nekropsija,

—	Il-grupp tal-kura tal-annimali,

—	L-ID tal-annimali,

—	Il-prosettur,

—	Il-ħin tal-ġurnata li fih isiru n-nekropsija u d-dissezzjoni,

—	L-età tal-annimali,

—	Il-piż tal-ġisem finali fin-nekropsija, filwaqt li jiġu osservati kwalunkwe żieda jew tnaqqis statistikament sinifikanti,

—	L-ordni tal-iżvinar u d-dissezzjoni tal-annimali fin-nekropsija,

—	Il-piżijiet tal-ħames tessuti fil-mira li jiddependu fuq l-androġen:

—	Il-prostata ventrali (sal-eqreb 0,1 mg),

—	In-nuffati seminali flimkien mal-glandoli koagulanti, inkluż fluwidu (f'pari, sal-eqreb 0,1 mg),

—	Il-kumpless tal-muskolu reffiegħ bulbokavernosu ani plus (sal-eqreb 0.1 mg),

—	Il-glandoli ta' Cowper (piż frisk — f'pari, sal-eqreb 0,1 mg),

—	Ir-ras tal-pene (piż frisk sal-eqreb 0,1 mg);

—	Il-piżijiet tat-tessuti fakultattivi, jekk isiru:

—	Il-fwied (sal-eqreb 0,1 g),

—	Il-kilwa (f'pari, sal-eqreb 0,1 mg),

—	Adrenali (f'pari, sal-eqreb 0,1 mg);

—	Rimarki u kummenti ġenerali,

—	Analiżijiet tal-ormoni tas-serum, jekk isiru. — Serum LH (fakultattiv — ng għal kull ml serum), u — Serum T (fakultattiv — ng għal kull ml serum);

—	Rimarki u kummenti ġenerali.

Sommarju tad-dejta

Id-dejta għandha tinġabar f'sommarju f'forma ta' tabella li jkun fiha d-daqs tal-kampjun għal kull grupp, il-medja tal-valur, u l-iżball standard tad-devjazzjoni medja jew standard. It-tabelli għandhom jinkludu piżijiet tal-ġisem fin-nekropsija, il-bidliet fil-piż tal-ġisem mill-bidu tad-dożaġġ san-nekropsija, il-piżijiet tat-tessuti aċċessorji tas-sess fil-mira, u kwalunkwe piż fakultattiv ta' organi.

Diskussjoni tar-riżultati

Analiżi tar-riżultati

59.   Il-piżijiet tal-ġisem u l-organi fin-nekropsija għandhom jiġu analizzati b'mod statistiku għal karatteristiċi bħall-omoġenità tal-varjanza bi trasformazzjonijiet xierqa tad-dejta kif ikun hemm bżonn. Il-gruppi tal-kura għandhom jitqabblu ma' grupp ta' kontroll billi jintużaw tekniki bħal ANOVA segwiti minn tqabbil bejn pari (eż. it-test ‘one tailed’ ta' Dunnett) u l-kriterju għad-differenza statistika, pereżempju, p ≤ 0,05. Dawk il-gruppi li jiksbu importanza statistika għandhom jiġu identifikati. Madankollu, piżijiet ta' ‘organi relattivi’ għandhom jiġu evitati minħabba s-suppożizzjonijiet statistiċi invalidi li jinsabu fil-qalba ta' din il-manipulazzjoni tad-dejta.

60.   Għall-agoniżmu tal-androġen, il-kontroll għandu jkun il-grupp tat-test b'veikolu biss. Il-karatteristiċi tal-mod ta' azzjoni ta' sustanza kimika tat-test jistgħu jwasslu għal risponsi relattivi differenti bejn it-tessuti, pereżempju trenbolon, li ma jistgħux ikunu 5 alfa-ridotti, għandu effetti li jinħassu iktar fuq l-LABC u l-GP meta mqabbel mat-TP. Żieda statistikament importanti (p≤ 0,05) fi kwalunkwe tnejn jew iktar mill-ħames piżijiet tat-tessuti fil-mira li jiddependu fuq androġen (VP, LABC, GP, CG u SVCG) għandha titqies riżultat ta' agonist tal-androġen pożittiv, u t-tessuti kollha fil-mira għandhom juru xi graad ta' tkabbir miżjud. Evalwazzjoni kombinata tar-risponsi tat-tessuti tal-organi sesswali aċċessorji kollha (ASO) tista' tinkiseb billi ssir analiżi xierqa tad-dejta plurivarjata. Din tista' ttejjeb l-analiżi, speċjalment f'każijiet fejn tessut wieħed biss jagħti rispons statistikament importanti.

61.   Għall-antagoniżmu tal-androġen, il-kontroll għandu jkun il-grupp tat-test tal-androġen ta' referenza (testosteron propjonat biss). Il-karatteristiċi tal-mod ta' azzjoni ta' sustanza kimika tat-test jistgħu jwasslu għal risponsi relattivi differenti bejn it-tessuti, pereżempju inibituri ta' 5 alfa α-ridottasi, bħal finasterid, għandhom effetti li jinħassu iktar fuq il-prostata ventrali milli tessuti oħrajn meta mqabblin ma' antagonisti qawwijin tal-AR, bħal flutamid. Tnaqqis statistikament importanti (p ≤ 0,05) fi kwalunkwe tnejn jew iktar mill-ħames piżijiet tat-tessuti fil-mira li jiddependu fuq l-androġen (VP, LABC, GP, CG u SVCG) relatat mat-trattament bit-TP waħdu għandu jitqies bħala riżultat tal-antagonist tal-androġen pożittiv u t-tessuti kollha fil-mira għandhom juru xi grad ta' tkabbir imnaqqas. L-evalwazzjoni kombinata tar-risponsi kollha tat-tessut għall-ASO jistgħu jiġu arkivjati billi tintuża analiżi xierqa tad-dejta plurivarjata. Din tista' ttejjeb l-analiżi, speċjalment f'każijiet fejn tessut wieħed biss jagħti rispons statistikament importanti.

62.   Id-dejta għandha tinġabar fil-qosor f'forma ta' tabella li jkun fiha l-medja, l-iżball standard tal-medja (devjazzjoni standard tkun aċċettabbli wkoll) u d-daqs tal-kampjun għal kull grupp. It-tabelli ta' dejta individwali għandhom ikunu inklużi wkoll. Il-valuri individwali, il-medja, il-valuri ta' SE (SD) u CV għad-dejta tal-kontroll għandhom jiġu eżaminati biex jiġi determinat jekk jilħqux kriterji aċċettabbli għal konsistenza ma' valuri storiċi mistennijin. CVs li jaqbżu l-valuri tas-CV elenkati fit-Tabella 1 (ara l-paragrafi 25 u 26) għal kull piż tal-organu għandhom jiddeterminaw jekk hemmx żbalji fir-reġistrazzjoni jew it-tidħil tad-dejta jew jekk il-laboratorju għadux laħaq livell eċċezzjonali ta' dissezzjoni preċiża tat-tessuti li jiddependu fuq l-androġen u jekk hemmx bżonn ta' iktar taħriġ/prattika. Ġeneralment, CVs (id-devjazzjoni standard maqsuma bil-piż medju tal-organi) huma riproduċibbli minn laboratorju għal ieħor u minn studju għal ieħor. Id-dejta ppreżentata għandha tinkludi tal-inqas: il-piżijiet tal-prostata ventrali, in-nuffata seminali, il-muskolu reffiegħ bulbukavernosu ani plus, il-glandoli ta' Cowper, ir-ras tal-pene, il-fwied u l-ġisem u l-bidla fil-piż tal-ġisem mill-bidu tad-dożaġġ san-nekropsija. Id-dejta tista' tiġi ppreżentata wkoll wara aġġusatment tal-kovarjanza għall-piż tal-ġisem, iżda din ma għandhiex tieħu post preżentazzjoni tad-dejta mhux aġġustata. Barra minn hekk, jekk fl-ebda wieħed mill-gruppi ma sseħħ separazzjoni prepuzjali (PPS), l-inċidenza tal-PPS għandha tiġi rreġistrata u titqabbel b'mod statistiku mal-grupp tal-kontroll permezz tat-test Fisher Exact.

63.   Fil-verifika tad-dejta mdaħħla fil-kompjuter mal-iskedi tad-dejta oriġinali għall-preċiżjoni, il-valuri tal-piż tal-organi li mhumiex bijoloġikament plawżibbli jew li jvarjaw b'iktar minn tliet devjazzjonijiet standard mill-medji tal-grupp tat-trattament għandhom jiġu skrutinizzati bir-reqqa u jaf ikollhom bżonn jitwarrbu, peress li aktarx ikunu żbalji fir-reġistrazzjoni.

64.   It-tqabbil tar-riżultati tal-istudju mal-valuri tas-CV tal-OECD (fit-Tabella 1) spiss ikun pass importanti fl-interpretazzjoni dwar il-validità tar-riżultati tal-istudju. Id-dejta storika għall-gruppi tal-kontroll tal-veikolu għandha tinżamm fil-laboratorju. Id-dejta storika għar-risponsi għal sustanzi kimiċi ta' referenza pożittivi, bħal TP u FT, għandha tinżamm fil-laboratorju wkoll. Il-laboratorju jistgħu jittestjaw b'mod perjodiku wkoll ir-rispons għal agonisti u antagonisti dgħajfin magħrufin tal-androġen u jżommu din id-dejta. Din id-dejta tista' titqabbel mad-dejta disponibbli tal-OECD biex jiġi żgurat li l-metodi tal-laboratorju jrendu preċiżjoni u saħħa statistiċi suffiċjenti.

NOTI GĦALL-QAFAS

Nota 1:

Dħul fil-livelli kollha u ħruġ fil-livelli kollha huma possibbli u jiddependu fuq l-għamla tal-ħtiġijiet eżistenti ta' informazzjoni għal skopijiet ta' valutazzjoni tal-periklu u r-riskju.

Nota 2:

Fil-livell 5, l-ekotossikoloġija għandha tinkludi punti aħħarin li jindikaw mekkaniżmi ta' effetti avversi, u l-ħsara potenzjali għall-popolazzjoni.

Nota 3:

Meta mudell multimodali jkopri diversi mill-assaġġi tal-punt aħħari uniku, dak il-mudell jieħu post l-użu ta' dawk l-assaġġi tal-punt aħħari uniku.

Nota 4:

Il-valutazzjoni ta' kull sustanza kimika għandha tkun imsejsa fuq bażi ta' każ b'każ, filwaqt li tittieħed f'kunsiderazzjoni l-informazzjoni kollha għad-dispożizzjoni, filwaqt li tibqa' mfakkra l-funzjoni tal-livelli tal-qafas.

Nota 5:

Il-qafas ma għandux jitqies li jinkludi kollox bħalissa. Fil-livelli 3, 4 u 5 jinkludi assaġġi li jew huma disponibbli jew inkella li għalihom qed issir validazzjoni. Fir-rigward ta' dawn tal-aħħar, dawn huma inklużi b'mod provviżorju. Ladarba jiġu żviluppati u vvalidati, dawn ser jiżdiedu b'mod formali mal-qafas.

Nota 6:

Il-livell 5 ma għandux jitqies li jinkludi testijiet definittivi biss. It-testijiet inklużi f'dak il-livell jitqiesu li jikkontribwixxu għall-valutazzjoni ġenerali tal-perikli u r-riskji.

TAGĦRIF

(1)

OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10-11 ta' Marzu 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.

(2)

Dorfman RI (1962). Standard methods adopted by official organization. Academic Press, NY.

(3)

Gray LE Jr, Furr J and Ostby JS (2005). Hershberger assay to investigate the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and antiandrogenic activity in castrate-immature male rats. In: Current Protocols in Toxicology 16.9.1-16.9.15. J Wiley and Sons Inc.

(4)

OECD (2006). Final OECD report of the initial work towards the validation of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testosterone propionate and anti-androgenic effects of flutamide. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment No 62. ENV/JM/MONO(2006)30.

(5)

OECD (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and a 5α-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple Laboratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment No 86. ENV/JM/MONO(2008)3.

(6)

OECD (2007). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment No 73. ENV/JM/MONO(2007)20.

(7)

Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006). The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269.

(8)

Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob E (2007). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671-8.

(9)

Korenchevsky V (1932). The assay of testicular hormone preparations. Biochem J26:413-422.

(10)

Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932). The response of castrated male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem J26:1306-1314.

(11)

Eisenberg E, Gordan GS (1950). The levator ani muscle of the rat as an index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp Therap 99:38-44.

(12)

Eisenberg E, Gordan GS, Elliott HW (1949). Testosterone and tissue respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity. Endocrinology 45:113-119.

(13)

Hershberger L, Shipley E, Meyer R (1953). Myotrophic activity of 19-nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani muscle method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175-180.

(14)

Hilgar AG, Vollmer EP (1964). Endocrine bioassay data: Androgenic and myogenic. Washington DC: United States Public Health Service.

(15)

Dorfman RI (1969). Androgens and anabolic agents. In: Methods in Hormone Research, volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York:Academic Press, 151-220.

(16)

Massaro EJ (2002). Handbook of Neurotoxicology, volume I. New York: Humana Press, p. 38.

(17)

OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.

(18)

OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development — Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Pariġi.

(19)

OECD (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD Guideline for the testing of chemicals No 425.

(20)

OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4.

(21)

Supplemental materials for Owens et al. (2006). The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269. Ara, t-taqsima II, Il-gwida dwar id-dissezzjoni pprovduta lil-laboratorji: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf

(22)

Korea Food and Drug Administration. Gwida b'referenza viżwali dwar il-proċedura ta' assaġġ Hershberger, inkluż filmat ta' dissezzjoni. http://rndmoa.kfda.go.kr/endocrine/reference/education_fr.html

(23)

OECD (2008). Background Review Document on the Rodent Hershberger Bioassay. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17.

(24)

OECD (2008). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling Male Rat Version of the Hershberger Bioassay.

(25)

OECD (2009). Guidance Document on the Weanling Hershberger Bioassay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic properties. Series on Testing and Assessment, Number 115.

(26)

Id-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta' Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintużaw għal skopijiet xjentifiċi (ĠU L 276, 20.10.2010, p. 33).

(27)

Il-kapitoli li ġejjin ta' dan l-Anness:   B.1 bis, Tossiċità orali akuta — proċedura b'doża fissa   B.1 tris, Tossiċità orali akuta — metodu tal-klassi tossika akuta

B.56   STUDJU ESTIŻ TAT-TOSSIĊITÀ RIPRODUTTIVA TA' ĠENERAZZJONI WAĦDA

INTRODUZZJONI

1.   Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-Linja Gwida tat-Testijiet (TG) tal-OECD Nru 443 (2012). Huwa bbażat fuq il-proposta tal-Kumitat Tekniku tal- International Life Science Institute (ILSI)-Health and Environmental Sciences Institute (HESI), Agricultural Chemical Safety Assessment (ACSA) għal studju estiż dwar ir-riproduttività ta' ġenerazzjoni waħda fl-istadju tal-ħajja F1 kif ippubblikata f'Cooper et al., 2006 (1). Sar ħafna titjib u kien hemm ħafna kjarifiki fit-tifsila tal-istudju sabiex tiġi pprovduta flessibilità u sabiex tiġi enfasizzata l-importanza tal-bidu b'għarfien eżistenti, filwaqt li jintużaw osservazzjonijiet tul il-ħajja biex jiġi ggwidat u jitfassal l-ittestjar. Dan il-metodu ta' ttestjar jipprovdi deskrizzjoni dettaljata tal-kondotta operazzjonali ta' Studju Estiż tat-Tossiċità Riproduttiva ta' Ġenerazzjoni Waħda. Il-metodu ta' ttestjar jiddeskrivi tliet koorti ta' annimali F1:

Koorta 1:: valutazzjoni tal-punti aħħarin tar-riproduzzjoni/l-iżvilupp; din il-koorta tista' tiġi estiża biex tinkludi ġenerazzjoni F2,

Koorta 2:: valutazzjoni tal-impatt potenzjali tal-esponiment kimiku fuq is-sistema nervuża li tkun fil-proċess ta' żvilupp,

Koorta 3:: valutazzjoni tal-impatt potenzjali tal-esponiment kimiku fuq is-sistema immuni li tkun fil-proċess ta' żvilupp.

2.   Deċiżonijiet dwar jekk tiġix ivvalutata t-tieni ġenerazzjoni u biex titneħħa koorta tan-newrotossiċità tal-iżvilupp u/jew koorta tal-immunotossiċità tal-iżvilupp għandhom jirriflettu għarfien eżistenti għas-sustanza kimika li tkun qed tiġi evalwata, kif ukoll il-bżonnijiet tal-bosta awtoritajiet regolatorji. L-iskop tal-metodu ta' ttestjar huwa li jipprovdi dettalji dwar kif jista' jsir l-istudju u li jindirizza kif għandha tiġi evalwata kull koorta.

3.   Il-proċedura għad-deċiżjoni dwar l-iskattar intern għall-produzzjoni tat-tieni ġenerazzjoni hija deskritta fid-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 117 (39) għal dawk l-awtoritajiet regolatorji li jużaw skattaturi interni.

KUNSIDERAZZJONIJIET U GĦANIJIET INIZJALI

4.   L-għan ewlieni tal-Istudju Estiż tat-Tossiċità Riproduttiva ta' Ġenerazzjoni Waħda huwa li jevalwa l-istadji tal-ħajja speċifiċi mhux koperti minn tipi oħrajn ta' studji tat-tossiċità u jittestja għal effetti li jistgħu jseħħu minħabba esponiment kimiku qabel u wara t-twelid. Għal punti aħħarin riproduttivi, huwa previst li, bħala l-ewwel pass u meta tkun disponibbli, tintuża informazzjoni minn studji b'doża ripetuta (inklużi studji ta' tgħarbil dwar it-tossiċità riproduttiva, eż., TG tal-OECD Nru 422 (32)), jew assaġġi ta' tgħarbil ta' interferenti endokrinali fuq terminu qasir, (eż., Assaġġ uterotrofiku — metodu ta' ttestjar B.54 (36); u l-assaġġ Hershberger — metodu ta' ttestjar B.55 (37)) biex jinqabdu effetti fuq organi riproduttivi għall-irġiel u n-nisa. Dan jista' jinkludi spermatoġenesi (istopatoloġija testikolari) għall-irġiel u ċikli estrużi, għadd tal-follikoli/maturità tal-ooċiti u integrità tal-ovarji (istopatoloġija) għan-nisa. Imbagħad, l-Istudju Estiż tat-Tossiċità Riproduttiva ta' Ġenerazzjoni Waħda jservi bħala test għal punti aħħarin riproduttivi li jeħtieġu l-interazzjoni ta' rġiel ma' nisa, nisa ma' conceptus, u nisa ma' ulied u l-ġenerazzjoni F1 generation sa wara l-maturità sesswali (ara d-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 151 li jsostni dan il-metodu ta' ttestjar (40)).

5.   Il-metodu ta' ttestjar huwa mfassal sabiex jipprovdi evalwazzjoni tal-effetti ta' qabel u wara t-twelid tas-sustanzi kimiċi fuq l-iżvilupp kif ukoll evalwazzjoni dettaljata tat-tossiċità sistemika f'nisa tqal u li qed ireddgħu u wlied żgħar u adulti. Analiżi dettaljata tal-punti aħħarin ewlenin tal-iżvilupp, bħall-vijabbiltà tal-wild, is-saħħa ta' dawk li għadhom kif jitwieldu, l-istatus tal-iżvilupp fit-twelid, u l-iżvilupp fiżiku u funzjonali sal-adultezza, hija mistennija tidentifika organi speċifiċi fil-mira fl-ulied. Barra minn hekk, l-istudju ser jipprovdi u/jew jikkonferma informazzjoni dwar l-effetti ta' sustanza kimika tat-test fuq l-integrità u l-prestazzjoni tas-sistemi riproduttivi ta' rġiel u nisa adulti. B'mod speċifiku, iżda mhux biss, jiġu kkunsidrati l-parametri li ġejjin: il-funzjoni gonadali, iċ-ċiklu estruż, il-maturità tal-isperma epdidimali, l-imġiba tat-tgħammir, it-twelid, it-tqala, il-ħlas, u t-treddigħ. Barra minn hekk, l-informazzjoni miksuba mill-valutazzjonijiet tan-newrotossiċità tal-iżvilupp u tal-immunotossiċità tal-iżvilupp ser tikkaratterizza l-effetti potenzjali f'dawk is-sistemi. Id-dejta miksuba minn dawn it-testijiet għandha tippermetti li ssir id-determinazzjoni tal-Livelli ta' Effett Avvers Mhux Osservat (NOAELs), l-Inqas Livelli ta' Effett Avvers Osservat (LOAELs) u/jew dożi ta' riferiment għall-bosta punti aħħarin u/jew tintuża biex tikkaratterizza l-effetti misjubin fi studji preċedenti b'doża ripetuta u/jew isservi ta' gwida għat-testijiet sussegwenti.

6.   Fil-Figura 1 hemm ippreżentata tpinġija skematika tal-protokoll. Is-sustanza kimika tat-test tingħata kontinwament f'dożi gradwati lil bosta gruppi ta' rġiel u nisa sesswalment maturi. Din il-ġenerazzjoni parentali (P) hija dożata għal perjodu definit qabel it-tgħammir (magħżul fuq il-bażi tal-informazzjoni disponibbli tas-sustanza kimika tat-test; iżda għal tal-inqas ġimgħatejn) u perjodu ta' tgħammir ta' ġimgħatejn. Irġiel P ikomplu jiġu kkurati tal-inqas sal-ftim tal-F1. Għandhom jiġu kkurati għal tal-inqas 10 ġimgħat. Jistgħu jiġu kkurati iktar jekk ikun hemm bżonn li jiġu ċċarati l-effetti fuq ir-riproduzzjoni. Il-kura tan-nisa P tkompli matul it-tqala u t-treddigħ sat-terminazzjoni wara l-ftim tal-boton tagħhom (jiġifieri 8-10 ġimgħat ta' kura). L-ulied F1 jirċievu iktar kura bis-sustanza kimika tat-test mill-ftim sal-adultezza. Jekk tiġi vvalutata t-tieni ġenerazzjoni (ara d-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 117 (39)), l-ulied F1 ser jinżammu bil-kura sal-ftim tal-F2, jew sa tmiem l-istudju.

7.   Osservazzjonijiet kliniċi u eżamijiet patoloġiċi jsiru fuq l-annimali kollha għal sinjali ta' tossiċità, b'enfasi speċjali fuq l-integrità u l-prestazzjoni tas-sistemi riproduttivi ta' rġiel u nisa u s-saħħa, it-tkabbir, l-iżvilupp u l-funzjoni tal-ulied. Fil-ftim, l-ulied magħżulin jiġu assenjati f'sottogruppi speċifiċi (koorti 1-3, ara l-paragrafi 33 u 34 u l-Figura 1) għal iktar investigazzjonijiet, inklużi l-maturità sesswali, l-integrità u l-funzjoni tal-organu riproduttiv, il-punti aħħarin newroloġiċi u tal-imġiba, u l-funzjonijiet immuni.

8.   Fit-twettiq tal-istudju, għandhom jiġu segwiti l-prinċipji ta' gwida u l-kunsiderazzjonijiet spjegati fid-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 19 dwar ir-rikonoxximent, il-valutazzjoni, u l-użu ta' sinjali kliniċi bħala punti aħħarin umanitarji għal annimali sperimentali użati fl-evalwazzjonijiet tas-sikurezza (34).

9.   Meta jkun hemm disponibbli numru suffiċjenti ta' studji biex ikun żgurat l-impatt ta' din it-tifsila l-ġdida tal-istudju, il-metodu ta' ttestjar ser jiġi analizzat u jekk ikun hemm bżonn rivedut fid-dawl tal-esperjenzi miksubin.

Figura 1

Skema tal-Istudju Estiż tat-Tossiċità Riproduttiva ta' Ġenerazzjoni Waħda

DESKRIZZJONIJIET TAL-METODU/PREPARAZZJONIJIET GĦAT-TEST

Annimali

Għażla tal-ispeċi u r-razza tal-annimali

10.   L-għażla tal-ispeċi għat-test tat-tossiċità riproduttiva għandha tiġi kkunsidrata bir-reqqa fid-dawl tal-informazzjoni kollha għad-dispożizzjoni. Madankollu, minħabba d-dejta ta' sfond estensiva u l-komparabbiltà għat-testijiet tat-tossiċità ġenerali, normalment il-far ikun l-ispeċi preferuta, u l-kriterji u r-rakkomandazzjonijiet mogħtijin f'dan il-metodu ta' ttestjar jirreferu għal din l-ispeċi. Jekk jintużaw speċi oħrajn, għandha tingħata ġustifikazzjoni u ser ikun hemm bżonn li jsiru l-modifiki xierqa. Ma għandhomx jintużaw razez b'fekondità baxxa jew inċidenza għolja magħrufa sew ta' difetti spontanji fl-iżvilupp.

L-età, il-piż tal-ġisem u l-kriterji ta' inklużjoni

11.   Għandhom jintużaw annimali parentali b'saħħithom li ma kinux soġġetti għal proċeduri sperimentali fl-imgħoddi. Kemm l-irġiel kif ukoll in-nisa għandhom ikunu studjati u n-nisa għandhom ikunu qatt ma welldu u mhux tqal. L-annimali P għandhom ikunu laħqu l-maturità sesswali, ta' piż simili (dawk tal-istess sess) fil-bidu tad-dożaġġ, età simili (madwar 90 jum) fit-tgħammir, u jirrappreżentaw l-ispeċi u r-razza fl-istudju. L-annimali għandhom jiġu akklimatizzati għal tal-inqas 5 ijiem wara li jaslu. L-annimali jitqassmu b'mod aleatorju fil-gruppi ta' kontroll u kura, b'tali mod li jirriżutla f'valuri medji komparabbli tal-piż tal-ġisem bejn il-gruppi (jiġifieri ± 20 % tal-medja).

Kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija u tal-għalf

12.   It-temperatura fil-kamra tal-annimali tal-esperiment għandha tkun ta' 22 °C (± 3 °C). L-umdità relattiva għandha tkun bejn 30-70 %, b'medda ideali ta' 50–60 %. Id-dawl artifiċjali għandu jitfassal għal 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista illimitata ta' ilma tajjeb għax-xorb. Għandha tingħata attenzjoni bir-reqqa għall-kontenut ta' fitoestroġen tad-dieta, peress li livell għoli ta' fitoestroġen fid-dieta jista' jaffettwa xi punti aħħarin tar-riproduzzjoni. Huma rakkomandati dieti standaradizzati b'formula miftuħa li fihom tnaqqsu s-sustanzi kimiċi estroġeniċi (2)(30). L-għażla tad-dieta tista' tkun influwenzata mill-bżonn li tiġi żgurata taħlita xierqa ta' sustanza kimika tat-test meta tingħata b'dan il-metodu. Il-kontenut, l-omoġenità u l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fid-dieti għandhom jiġu verifikati. L-għalf u l-ilma tajjeb għax-xorb għandhom jiġu analizzati b'mod regolari għal kontaminanti. Il-kampjuni ta' kull lott tad-dieta użata matul l-istudju għandhom jinżammu f'kundizzjonijiet xierqa (eż., iffriżati f'– 20 °C), sakemm jiġi finalizzat ir-rapport, f'każ li r-riżultati jeħtieġu iktar analiżi tal-ingredjenti tad-dieta.

13.   L-annimali għandhom jitqiegħdu f'gaġeġ fi gruppi żgħar tal-istess sess u grupp tal-kura. Jistgħu jitqiegħdu f'gaġġa b'mod individwali biex jiġu evitati korrimenti possibbli (eż., irġiel wara l-perjodu ta' tgħammir). Il-proċeduri ta' tgħammir għandhom isiru f'gaġeġ xierqa. Wara evidenza ta' kopulazzjoni, in-nisa li huma supponuti tqal jitqiegħdu f'gaġeġ separati għall-ħlas jew il-maternità fejn ikunu pprovduti b'materjali xierqa u definiti tat-tibjit. Il-boton jitqiegħdu ma' ommhom sal-ftim. Annimali F1 għandhom jitqiegħdu fi gruppi żgħar tal-istess sess u grupp tal-kura mill-ftim sat-tmiem. Jekk dan ikun xjentifikament ġustifikat, l-annimali jistgħu jitqiegħdu f'gaġġa b'mod individawli. Il-livell ta' fitoestroġeni li jinsab fil-materjal tat-tibjit magħżul għandu jkun minimu =.

Numru u identifikazzjoni tal-annimali

14.   Is-soltu, kull test u grupp ta' kontroll għandu jkun fih numru suffiċjenti ta' pari tat-tgħammir biex tal-inqas ikun hemm 20 mara tqila f'kull grupp tad-doża. L-għan huwa li jiġu prodotti biżżejjed nisa tqal ħalli tkun żgurata evalwazzjoni valida tal-potenzjal tas-sustanza kimika sabiex taffettwa l-fertilità, it-tqala u l-imġiba materna tal-ġenerazzjoni P u t-tkabbir u l-iżvilupp tal-ulied F1, mit-twelid sal-maturità. Nuqqas ta' kisba tan-numru mixtieq ta' annimali tqal mhux bilfors jinvalida l-istudju u għandu jiġi evalwat fuq bażi ta' każ b'każ, filwaqt li tiġi kkunsidrata relazzjoni kawżali possibbli mas-sustanza kimika tat-test.

15.   Kull annimal P jiġi assenjat numru uniku ta' identifikazzjoni qabel jibda d-dożaġġ. Jekk id-dejta storika tal-laboratorju tissuġġerixxi li sehem importanti ta' nisa jistgħu ma jurux ċikli estrużi regolari (4 jew 5 ijiem), huwa rakkomandat li ssir valutazzjoni taċ-ċikli estrużi qabel tibda l-kura. Inkella, id-daqs tal-grupp jista' jiżdied biex jiġi żgurat li tal-inqas 20 mara f'kull grupp ikollha ċikli estrużi regolari (4 jew 5 ijiem) fil-bidu tal-kura. L-ulied F1 kollha jiġu identifikati b'mod uniku meta jiġu eżaminati għall-ewwel darba dawk li jkunu għadhom kif twieldu fil-jum ta' wara t-twelid (PND) 0 jew 1. Ir-reġistrazzjonijiet li jindikaw il-boton ta' oriġini għandhom jinżammu għall-annimali F1, u F2 kollha fejn applikabbli, matul l-istudju kollu.

Is-sustanza kimika tat-test

L-informazzjoni disponibbli dwar is-sustanza kimika tat-test

16.   L-analiżi tal-informazzjoni eżistenti hija importanti għal deċiżjonijiet dwar ir-rotta tal-amministrazzjoni, l-għażla tal-veikolu, l-għażla tal-ispeċi tal-annimali, l-għażla tad-dożaġġi u l-modifiki potenzjali tal-iskeda tad-dożaġġ. Għaldaqstant, l-informazzjoni kollha li hemm għad-dispożizzjoni dwar is-sustanza kimika tat-test, jiġifieri proprjetajiet fiżikokimiċi, tossikokinetiċi (inkluż metaboliżmu speċifiku għall-ispeċi), tossikodinamiċi, relazzjonijiet bejn l-istruttura u l-attività (SARs), proċessi metaboliċi in vitro, riżultati ta' studji preċedenti dwar it-tossiċità u informazzjoni rilevanti dwar analogi strutturali għandhom jittieħdu f'kunsiderazzjoni fl-ippjanar tal-Istudju Estiż tat-Tossiċità Riproduttiva ta' Ġenerazzjoni Waħda. Informazzjoni preliminari dwar l-assorbiment, id-distribuzzjoni, il-metaboliżmu u l-eliminazzjoni (ADME) u l-bijoakkumulazzjoni tista' tinkiseb mill-istruttura kimika, id-dejta fiżikokimika, il-firxa ta' proteina tal-plażma li tgħaqqad jew studji tossikokinetiċi (TK), filwaqt li r-riżultati minn studji tat-tossiċità jagħtu informazzjoni addizzjonali, eż., dwar in-NOAEL, il-metaboliżmu jew l-induzzjoni tal-metaboliżmu.

Kunsiderazzjoni tad-dejta tossikokinetika

17.   Għad li mhijiex meħtieġa, dejta dwar it-TK minn studji li saru fl-imgħotti ta' sejbien tal-medda tad-doża jew oħrajn huma ferm utli fl-ippjanar tat-tifsila tal-istudju, l-għażla tal-livelli tad-doża u l-interpretazzjoni tar-riżultati. Hija partikolarment utli dejta li: 1) tivverifika l-esponiment ta' feti u frieħ li qed jiżviluppaw għas-sustanza kimika tat-test (jew metaboliti rilevanti), 2) tipprovdi stima tad-dożimentrija interna, u 3) tevalwa għal saturazzjoni potenzjali li tiddependi fuq id-doża tal-proċessi kinetiċi. Dejta addizzjonali dwar it-TK, bħal profili tal-metaboliti, korsijiet tal-ħin ta' konċentrazzjoni, eċċ. għandha tiġi kkunsidrata wkoll jekk tkun disponibbli. Dejta supplimentari dwar it-TK tista' tinġabar ukoll matul l-istudju ewlieni, diment li ma xxekkilx il-ġbir u l-interpretazzjoni tal-punti aħħarin ewlenin tal-istudju.

Bħala gwida ġenerali, is-sett ta' dejta li ġej dwar it-TK ikun utli fl-ippjanar tal-Istudju Estiż tat-Tossiċità Riproduttiva ta' Ġenerazzjoni Waħda:

—	Tqala tard (eż., Jum tat-Tqala 20) — demm matern u demm tal-fetu,

—	Nofs it-treddigħ (PND 10) — demm matern, demm tal-ferħ u/jew ħalib,

—	Ftit wara l-ftim (eż., PND 28) — kampjuni tad-demm tal-annimal li nfatam.

Għandu jkun hemm flessibbiltà fid-determinazzjoni tal-analiti speċifiċi (eż. sustanza kimika u/jew metaboliti tal-ġenitur) u l-iskema tal-kampjunar. Pereżempju, in-numru u l-puntwalità tal-ġbir tal-kampjun f'jum partikolari tal-kampjunar ser ikunu jiddependu fuq ir-rotta ta' esponiment u l-għarfien minn qabel dwar il-proprjetajiet tat-TK f'annimali mhux tqal. Għal studji djetetiċi, il-kampjunar f'ħin konsistenti wieħed f'kull wieħed minn dawn il-jiem huwa biżżejjed, filwaqt li d-dożaġġ b'gavage jista' jkun jeħtieġ ħinijiet traddizzjonali ta' kampjunar biex tinkiseb stima aħjar tal-medda ta' dożi interni. Madankollu, m'hemmx bżonn li jiġi ġġenerat perjodu ta' żmien b'konċentrazzjoni sħiħa f'xi wieħed mill-jiem tal-kampjun. Jekk ikun hemm bżonn, id-demm jista' jinġabar skont is-sess fi ħdan il-boton għal analiżijiet tal-fetu u tal-annimali li għadhom kif twieldu.

Rotta tal-amministrazzjoni

18.   L-għażla tar-rotta għandha tieħu f'kunsiderazzjoni l-iktar rotta/rotot rilevanti għall-esponiment tal-bniedem. Għad li l-protokoll huwa mfassal għall-għoti tas-sustanza kimika tat-test permzz tad-dieta, jista' jiġi modifikat biex din tingħata b'rotot oħrajn (ilma tajjeb għax-xorb, gavage, teħid man-nifs, dermali), skont il-karatteristiċi tas-sustanza kimika u l-informazzjoni meħtieġa.

Għażla tal-veikolu

19.   Meta jkun hemm bżonn, is-sustanza kimika tat-test tinħall jew tiġi sospiża f'veikolu xieraq. Huwa rakkomandat li, meta dan ikun possibbli, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' soluzzjoni/sospensjoni milwiema, segwit minn kunsiderazzjoni ta' soluzzjoni/sospensjoni fiż-żejt (eż., żejt tal-qamħirrun). Għal veikolu li mhumiex ilma, għandhom ikunu magħrufin il-karatteristiċi tossiċi tal-veikolu. L-użu ta' veikoli b'tossiċità intrinsika potenzjali għandu jiġi evitat (eż., aċetun, DMSO). Għandha tiġi ddeterminata l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fil-veikolu. Għandhom jittieħdu f'kunsiderazzjoni l-karatteristiċi li ġejjin jekk jintuża veikolu jew addittiv ieħor biex jitħaffef id-dożaġġ: effetti fuq l-assorbiment, id-distribuzzjoni, il-metaboliżmu jew iż-żamma tas-sustanza kimika tat-test; effetti fuq il-proprjetajiet kimiċi tas-sustanza kimika tat-test li jistgħu jibdlu l-karatteristiċi tossiċi tagħha; u effetti fuq il-konsum ta' ilma jew ikel jew l-istatus nutrizzjonali tal-annimali.

Għażla tad-doża

20.   Normalment, l-istudju għandu jinkludi tal-inqas tliet livelli tad-doża u kontroll konkurrenti. Meta jingħażlu livelli xierqa tad-doża, l-investigatur għandu jqis l-informazzjoni kollha għad-dispożizzjoni, inkluża informazzjoni dwar id-dożaġġ minn studji li saru qabel, dejta dwar it-TK minn annimali tqal jew mhux tqal, kemm iseħħ trasferiment fit-treddigħ, u stimi tal-esponiment tal-bniedem. Jekk hemm dejta dwar it-TK disponibbli li tindika saturazzjoni li tiddependi fuq id-doża tal-proċessi tat-TK, għandha tingħata attenzjoni sabiex jiġu evitati livelli tad-doża għoljin li jesibixxu b'mod ċar saturazzjoni, diment li ovvjament l-esponimenti tal-bniedem ikunu mistennijin ikunu f'livell ferm inqas mill-punt ta' saturazzjoni. F'dawn il-każijiet, l-ogħla livell tad-doża għandu jkun il-punt ta' inflezzjoni, jew ftit ogħla minnu, għat-tranżizzjoni lejn imġiba mhux lineari tat-TK.

21.   Fin-nuqqas ta' dejta rilevanti dwar it-TK, il-livelli tad-doża għandhom ikunu bbażati fuq effetti tossiċi, sakemm ma jkunux limtiati mill-għamla fiżika/kimika tas-sustanza kimika tat-test. Jekk il-livelli tad-doża jkunu bbażati fuq it-tossiċità, l-ogħla doża għandha tingħażel bl-għan li tikkaġuna xi tossiċità sistemika, iżda mhux mewt jew tbatija severa tal-annimali.

22.   Għandha tingħażel sekwenza dixxendenti tal-livelli tad-doża sabiex jintwera kwalunkwe effett relatat mad-doża u sabiex jiġu stabbiliti NOAELs jew dożi qrib il-limitu ta' identifikazzjoni li jippermetti sabiex tiġi derivata doża ta' riferiment għall-iktar punt(i) aħħari(n) sensittiv(i). Biex jiġi evitat spazju kbir bejn id-dożż tal-NOAELs u l-LOAELs, spiss intervalli d-doppju jew erba' darbiet ta' xulxin ikunu ottimali. Iż-żieda tar-raba' grupp tat-test spiss ikun ippreferut milli jintuża intervall kbir ħafna (eż., fattur ta' iktar minn 10) bejn id-dożi.

23.   Ħlief għall-kura bis-sustanza kimika tat-test, l-annimali fil-grupp ta' kontroll jiġu ttrattati bl-istess mod bħas-suġġetti tal-grupp tat-test. Dan il-grupp ma għandux jingħata kura jew kura finta jew grupp ta' kontroll b'veikolu jekk jintuża veikolu fl-għoti tas-sustanza kimika tat-test. Jekk jintuża veikolu, il-grupp ta' kontroll għandu jirċievi l-veikolu fl-ogħla volum użat.

Test tal-limitu

24.   Jekk ma hemm ebda evidenza ta' tossiċità b'doża ta' tal-inqas 1 000 mg/kg piż tal-ġisem/jum fi studji b'doża ripetuta, jew jekk ma tkunx mistennija tossiċità fuq il-bażi ta' dejta minn sustanzi kimiċi relatati fil-livell strutturali u/jew metaboliku, li jindikaw similarità fil-proprjetajiet metaboliċi in vivo/in vitro, jista' ma jkunx hemm bżonn ta' studju li juża bosta livelli ta' doża. F'dawn il-każijiet, l-Istudju Estiż tat-Tossiċità Riproduttiva ta' Ġenerazzjoni Waħda jista' jsir billi jintuża grupp ta' kontroll u doża waħda ta' tal-inqas 1 000 mg/kg piż tal-ġisem/jum. Madankollu, jekk tinsab evidenza għal tossiċità riproduttiva jew tal-iżvilupp f'din id-doża ta' limitu, ser ikun hemm bżonn ta' studji b'livelli inqas tad-doża biex jiġi identifikat NOAEL. Dawn il-kunsiderazzjonijiet tat-test ta' limitu japplikaw biss meta l-esponiment tal-bniedem ma jkunx jindika l-bżonn ta' livell ta' doża ogħla.

PROĊEDURI

Esponiment tal-ulied

25.   L-esponiment djetetiku huwa l-metodu ppreferut tal-għoti. Jekk isiru studji b'gavage, ta' min jinnota li l-frieħ normalment jirċievu s-sustanza kimika tat-test b'mod indirett mill-ħalib biss, sakemm jibda d-dożaġġ dirett tagħhom fil-ftim. Fi studji dwar id-dieta jew l-ilma tajjeb għax-xorb, il-frieħ jirċievu wkoll is-sustanza kimika tat-test direttament meta jibdew jieklu waħedhom matul l-aħħar ġimgħa tal-perjodu tat-treddigħ Għandhom jiġu kkunsidrati modifiki fit-tifsila tal-istudju meta l-eskrezzjoni tas-sustanza kimika tat-test fil-ħalib tkun batuta u meta jkun hemm nuqqas ta' evidenza għal esponiment kontinwu tal-ulied. F'dawn il-każijiet, għandu jiġi kkunsidrat dożaġġ dirett tal-frieħ matul il-perjodu tat-treddigħ fuq il-bażi tal-informazzjoni disponibbli dwar it-TK, it-tossitiċtà tal-ulied jew bidliet fil-bijomarkaturi (3)(4). Għandhom jingħataw kunsiderazzjoni attenta l-benefiċċji u l-iżvantaġġi qabel ma jsiru studji tad-dożaġġ dirett fuq frieħ li għadhom fil-fażi tat-treddigħ (5).

Skeda tad-dożaġġ u għoti tad-dożi

26.   Jista' jkun hemm disponibbli ċerta informazzjoni dwar iċ-ċikli estrużi, l-istopatoloġija tal-apparat riproduttiv tal-irġiel u n-nisa u analiżi tal-isperma epididimali/testikolari minn studji li saru fl-imgħoddi dwar it-tossiċità b'doża ripetuta ta' durata adegwata. Għalhekk, id-durata tal-kura qabel it-tgħammir fl-Istudju Estiż tat-Tossiċità Riproduttiva ta' Ġenerazzjoni Waħda hija mfassla sabiex tidentifika l-effetti fuq bidliet funzjonali li jistgħu jinterferixxu mal-imġiba tat-tgħammir u l-fertilizzazzjoni. Il-kura ta' qabel it-tgħammir għandha tkun twila biżżejjed biex jinkisbu kundizzjonijiet ta' esponiment bi stat kostanti fl-irġiel u n-nisa P. F'ħafna mill-każijiet, kura ta' qabel it-tgħammir ta' ġimgħatejn għaż-żewġ sessi titqies li hija adegwata. Għan-nisa, din tkopri 3-4 ċikli estrużi sħaħ u għandha tkun biżżejjed biex taqbad kwalunkwe effett avvers fuq iċ-ċikliċità. Għall-irġiel, din hija ekwivalenti għaż-żmien meħtieġ għal tranżitu epididimali tal-ispermatożoa li qed timmatura u għandha tippermetti li jiġu identifikati l-effetti posttestikolari fuq l-isperma (matul l-aħħar stadji tal-ispermjazzjoni u l-maturità tal-isperma epididimali) fit-tgħammir. Fil-ħin tat-terminazzjoni, meta jkunu skedati istopatoloġija testikolari u epididimali u analiżi tal-parametri tal-isperma, l-irġiel P u F1 ser ikunu ġew esposti għal tal-inqas proċess spermatoġeniku wieħed sħiħ ((6)(7)(8)(9) u d-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 151(40)).

27.   Ix-xenarji ta' esponiment ta' qabel it-tgħammir għall-irġiel jistgħu jiġu adattati jekk fl-istudju preċedenti jkunu ġew oidentifikati b'mod ċar tossiċità testikolari (indeboliment tal-ispermatoġenesi) jew effetti fuq l-integrità u l-funzjoni tal-isperma. B'mod simili, għan-nisa, l-effetti magħrufin tas-sustanza kimika tat-test fuq iċ-ċiklu estruż u b'hekk anki r-riċettività sesswali, jistgħu jiġġustifikaw xenarji ta' esponiment ta' qabel it-tgħammir differenti. F'każijiet speċjali, jista' jkun aċċettabbli li kura tan-nisa P tinbeda biss wara li jkun inkiseb kampjun pożittiv għall-isperma (ara d-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 151(40)).

28.   Ladarba jiġi stabbilit il-perjodu ta' dożaġġ ta' qabel it-tgħammir, l-annimali għandhom jirċievu s-sustanza kimika tat-test kontinwament fuq bażi ta' 7 ijiem/ġimgħa san-nekropsija. L-annimali kollha għandhom jingħataw id-doża bl-istess metodu. Id-dożaġġ għandu jkompli matul il-perjodu ta' tgħammir ta' ġimgħatejn u, għan-nisa P, matul it-tqala u t-treddigħ sal-jum tat-terminazzjoni tal-annimal miftum. L-irġiel għandhom jiġu kkurati bl-istess mod sat-terminazzjoni fiż-żmien meta l-annimali F1 jinfatmu. Għan-nekropsija, għandha tingħata prijorità lil nisa li għandhom jiġu nekropsjati fuq numru ikbar ta' jiem, skont il-faċilitajiet tal-laboratorju. Sakemm ma jkunx diġà nbeda matul il-perjodu tat-treddigħ, dożaġġ dirett tal-irġiel u n-nisa F1 magħżulin għandu jinbeda fil-ftim u jkompli san-nekropsija skedata, skont l-assenjament tal-koorti.

29.   Għal sustanzi kimiċi mogħtijin permezz tad-dieta jew ilma tajjeb għax-xorb, importanti li jiġi żgurat li l-kwantitajiet tas-sustanza kimika tat-test involuti ma jxekklux in-nutrizzjoni jew il-bilanċ tal-ilma normali. Meta s-sustanza kimika tat-test tingħata fid-dieta, jistgħu jitħaddmu jew konċentrazzjoni djetetika kostanti (ppm) jew livell ta' doża kostanti f'termini tal-piż tal-ġisem tal-annimal; l-għażla li ssir għandha tiġi speċifikata.

30.   Meta s-sustanza kimika tat-test tingħata b'gavage, il-volum ta' likwidu mogħti f'darba normalment ma għandux jaqbeż il-1 ml/100 g piż tal-ġisem (0,4 ml/100 g piż tal-ġisem huwa l-massimu għaż-żejt, eż., żejt tal-qamħirrun). Ħlief għal sustanzi kimiċi irritanti jew korrożivi, li normalment juru effetti aggravat f'konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandha tiġi minimizzata billi tiġi aġġustata l-konċentrazzjoni biex jiġi żgurat volum kostanti fil-livelli kollha tad-doża. Il-kura għandha tingħata f'ħinijiet simili ta' kull ġurnata. Normalment id-doża lil kull annimal għandha tkun ibbażata fuq l-iktar determinazzjoni riċenti tal-piż tal-ġisem individwali u tiġi aġġustata tal-inqas kull ġimgħa fl-irġiel adulti u n-nisa adulti mhux tqal, u kull jumejn f'nisa tqal u annimali F1 meta tingħata qabel il-ftim u matul il-ġimgħatejn ta' wara l-ftim. Jekk id-dejta dwar it-TK tindika trasferiment baxx tal-plaċenta tas-sustanza kimika tat-test, id-doża b'gavage matul l-aħħar ġimgħa tat-tqala jista' jkollha bżonn tiġi aġġustata biex jiġi evitat għoti ta' doża tossika wisq lill-omm. In-nisa ma għandhomx jiġu kkurati b'gavage, jew xi rotta oħra tal-kura meta l-animal ikun jeħtieġ li jitqandel, dakinhar tal-ħlas; omissjoni tal-għoti tas-sustanza kimika tat-test dakinhar hija ppreferuta milli tfixkil tal-proċess tat-twelid.

Tgħammir

31.   Kull mara P għandha titqgħed ma' raġel waħdu magħżul b'mod aleatorju u mhux relatat mill-istess grupp tad-dożaġġ (tlaqqigħ 1:1) sakemm tiġi osservata evidenza ta' kopulazzjoni jew wara li jgħaddu ġimgħatejn. Jekk ma jkunx hemm biżżejjed irġiel, pereżempju minħabba mewt ta' rġiel qabel it-tlaqqigħ, ir-raġel/l-irġiel li diġà tgħammru jistgħu jitlaqqgħu (1:1) mat-tieni mara/nisa b'tali mod li n-nisa kollha jkunu tlaqqgħu ma' raġel. Il-jum 0 tat-tqala huwa definit bħala l-jum li fih tiġi kkonfermata evidenza ta' tgħammir (jinstabu l-plakka vaġinali jew sperma). L-annimali għandhom jiġu separati malajr kemm jista' jkun wara li tiġi osservata evidenza ta' kopulazzjoni. Jekk ma jkunx seħħ tgħammir wara ġimgħatejn, l-annimali għandhom jiġu separati mingħajr ebda opportunità oħra ta' tgħammir. Il-pari li jitgħammru għandhom ikunu identifikati b'mod ċar fid-dejta.

Daqs tal-boton

32.   Fil-jum 4 wara t-twelid, id-daqs ta' kull boton jista' jiġi aġġustat billi jiġu eliminati l-frieħ żejda permezz ta' għażla aleatorja b'tali mod li jirriżultaw, kemm jista' jkun, ħamest irġiel u ħames nisa għal kull boton. L-eliminazzjoni selettiva tal-frieħ, eż., fuq il-bażi tal-piż tal-ġisem, mhijiex xierqa. Mull meta n-numru ta' frieħ irġiel jew nisa jipprevjeni milli jkun hemm ħamsa minn kull sess għal kull boton, huwa aċċettabbli li jsir aġġustament parzjali (pereżempju, sitt irġiel u erba' nisa).

L-għażla tal-frieħ għall-istudji ta' wara l-ftim (ara l-Figura 1)

33.   Fil-ftim (madwar PND 21), jingħażlu frieħ mill-boton kollha għad-dispożizzjoni sa 20 għal kull doża u grupp ta' kontroll biex isiru iktar eżamijiet u dawn jinżammu sal-maturità sesswali (sakemm ma jkunx hemm bżonn li jsiru testijiet qabel). Il-frieħ jingħażlu b'mod aleatorju, bl-eċċezzjoni li annimali mhux żviluppati (dawk b'piż tal-ġisem f'livell iktar minn żewġ devjazzjonijiet standard inqas mill-piż medju tal-frieħ tal-boton rispettiv) ma għandhomx ikunu inklużi, peress li huwa improbabbli li ser ikunu jirrappreżentaw il-grupp tal-kura.

Fil-PND 21, il-frieħ F1 magħżulin jiġu assenjati b'mod aleatorju f'waħda mit-tliet koorti tal-annimali, kif ġej:

Koorta 1 (1 A u 1B) == Ittestjar tat-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp,

Koorta 2 (2 A u 2B) == Ittestjar tan-newrotossiċità tal-iżvilupp,

Koorta 3 == Ittestjar tan-immunotossiċità tal-iżvilupp.

Koorta 1 A:: Raġel wieħed u mara/boton/grupp 1 (20/sess/grupp): għażla ta' prijorità għall-valutazzjoni primarja tal-effetti fuq is-sistemi riproduttivi u tat-tossiċità ġenerali.

Koorta 1B:: Raġel wieħed u mara/boton/grupp 1 (20/sess/grupp): għażla ta' prijorità għal valutazzjoni ta' segwitu tal-prestazzjoni riproduttiva permezz ta' tgħammir ta' annimali F1, meta jiġu vvalutati (ara d-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 117(39)), u għall-kisba ta' dejta addizzjonali dwar l-istopatoloġija f'każijiet ta' tossikanti riproduttivi jew endokrinali suspettati, jew meta r-riżulati mill-koorta 1 A jfixklu.

Koorta 2 A:: Total ta' 20 ferħ għal kull grupp (10 irġiel u 10 nisa għal kull grupp; raġel wieħed jew mara waħda għal kull boton) assenjati għal ittestjar tan-newromġiba segwit minn valutazzjoni tan-newroistopatoloġija bħala adulti.

Koorta 2B:: Total ta' 20 ferħ għal kull grupp (10 irġiel u 10 nisa għal kull grupp; raġel wieħed jew mara waħda għal kull boton) assenjati għal valutazzjoni tan-newroistopatoloġija fil-ftim (PND 21 jew PND 22). Jekk ma jkunx hemm biżżejjed annimali, għandha tingħata preferenza l-assenjazzjoni tal-annimali fil-Koorta 2 A.

Koorta 3:: Total ta' 20 ferħ għal kull grupp (10 irġiel u 10 nisa għal kull grupp; wieħed/waħda għal kull boton, fejn possibbli). Jista' jkun hemm bżonn ta' frieħ addizzjonali mill-grupp tal-kontroll biex jaġixxu bħala annimali tal-kontroll pożittiv fl-assaġġ tar-rispons tal-antikorpi dipendenti fuq iċ-ċellola T (TDAR) fil-PND 56 ± 3.

34.   Jekk ma jkunx hemm biżżejjed frieħ f'boton biex iservu l-koorti kollha, il-koorta 1 tieħu preċedenza, peress li tista' tkun estiża ħalli tipproduċi ġenerazzjoni F2. Jistgħu jiġu assenjati frieħ addizzjonali fi kwalunkwe waħda mill-koorti f'każ ta' tħassib speċifiku, eż., jekk sustanza kimika tkun suspettata li hija newrotossikant jew tossikant riproduttiv. Dawn il-frieħ jistgħu jintużaw għal eżamijiet f'punti ta' żmien differenti jew għall-evalwazzjoni ta' punti aħħarin supplementari. Il-frieħ li ma jiġux assenjati f'koorti ser jiġu sottomessi għall-bijokimika klinika (paragrafu 55) u nekropsija grossa (paragrafu 68).

It-tieni tgħammir tal-annimali P

35.   Normalment it-tieni tgħammir ma jkunx rakkomandat għall-annimali P, peress li jekk iseħħ tintilef informazzjoni importanti fuq in-numru ta' siti ta' impjant (u b'hekk dejta ta' telf wara l-impjant u perinatali, indikaturi ta' potenzjal teratoġeniku possibbli) għall-ewwel boton. Il-bżonn li jiġi verifikat jew evidenzjat effett f'nisa esposti jiġi ssodisfat aħjar billi l-istudju jiġi estiż ħalli jinkludi tgħammir tal-ġenerazzjoni F1. Madankollu, it-tieni tgħammir tal-irġiel P ma' nisa mhux ikkurati dejjem huwa possibbiltà ħalli sejbiet ekwivoċi jiġu ċċarati jew għall-karatterizzazzjoni ulterjuri tal-effetti fuq il-fertilità osservati fl-ewwel tgħammir.

OSSERVAZZJONIJIET FIL-ĦAJJA

Osservazzjonijiet kliniċi

36.   Għall-annimali P u dawk F1 magħżulin, issir osservazzjoni klinika ġenerali darba kull jum. Fil-każ ta' dożaġġ b'gavage, it-twaqqit tal-osservazzjonijiet kliniċi għandu jkun qabel u wara d-dożaġġ (għal sinjali possibbli ta' tossiċità assoċjata mal-quċċata tal-konċentrazzjoni tal-plażma). Bidliet pertinenti fl-imġiba, sinjali ta' ħlas diffiċli jew imtawwal u s-sinjali kollha ta' tossiċità huma rreġistrati. Darbtejn kuljum, u fi tmiem il-ġimgħa darba kuljum, l-annimali kollha jiġu osservati għal tossiċità severa, morbidità u mortalità.

37.   Barra minn hekk, isir eżami iktar dettaljat tal-annimali P u F1 kollha (wara l-ftim) fuq bażi ta' kull ġimgħa u għal konvenjenza dan jista' jsir meta l-annimal jintiżen, b'tali mod li jitnaqqas l-istess marbut mat-tqandil. L-osservazzjonijiet għandhom isiru bir-reqqa u jiġu rreġistrati billi jintużaw sistemi ta' punteġġ li ġew definti mil-laboratorju ta' ttestjar. Għandom isiru sforzi biex jiġi żgurat li varjazzjonijiet fil-kundizzjonijiet tat-test huma minimi. Is-sinjali osservati għandhom jinkludu, iżda mhumiex limitati għal, bidliet fil-ġilda, il-pil, l-għajnejn, il-membrani mukużi, l-okkorrenza ta' tnixxijiet u eskrezzjonijiet u attività awtonomika (eż., dmugħ, piloerezzjoni, daqs tal-ħabba, xejra respiratorja mhux tas-soltu). Bidliet fil-mixja, il-pożizzjoni, ir-rispons għat-tqandil, kif ukoll il-preżenza ta' movimenti kloniċi jew toniċi, sterotipija (eż., traqqim eċċessiv, dawran ripetittiv) jew imġiba stramba (eż., awtomutilazzjoni, mixi lura) għandhom jiġu rreġistrati wkoll.

Piż tal-ġisem u konsum ta' ikel/ilma

38.   L-annimali P jintiżnu fl-ewwel jum tad-dożaġġ u tal-inqas kull ġimgħa minn hemm 'il quddiem. Barra minn hekk, nisa P jintiżnu matul it-treddigħ fl-istess jiem bħall-użin tal-frieħ fil-boton tagħhom (ara l-paragrafu 44). L-annimali F1 kollha jintiżnu għalihom fil-ftim (PND 21) u tal-inqas darba fil-ġimgħa minn hemm 'il quddiem. Il-piż tal-ġisem jiġi rreġistrat ukoll dakinhar li jilħqu l-pubertà (isseħħ is-separazzjoni prepuzjali jew il-patenza vaġinali). L-annimali kollha jintiżnu fis-sagrifiċċju.

39.   Matul l-istudju, il-konsum ta' ikel u ilma (fil-każ ta' għoti tas-sustanza kimika tat-test fl-ilma tajjeb għax-xorb) huma rreġistrati tal-inqas darba fil-ġimgħa fl-istess jiem bħala piżijiet tal-ġisem tal-annimal (ħlief matul il-koabitazzjoni). Il-konsum ta' ikel ta' kull gaġġa ta' annimali F1 huwa rreġistrat kull ġimgħa b'bidu mill-għażla f'koorta rispettiva.

Ċikli estrużi

40.   Informazzjoni preliminari dwar l-effetti relatati mas-sustanza kimika tat-test fuq iċ-ċiklu estruż jaf diġà tkun disponibbli minn studji preċedenti dwar it-tossiċità b'doża ripetuta, u tista' tintuża fit-tfassil ta' protokoll speċifiku għas-sustanza kimika tat-test għall-Istudju Estiż tat-Tossiċità Riproduttiva ta' Ġenerazzjoni Waħda. Normalment, il-valutazzjoni taċ-ċikliċità estruża (permezz ta' ċitoloġija vaġinali) ser tibda fil-bidu tal-perjodu tal-kura sal-konferma ta' tgħammir jew fi tmiem il-perjodu ta' tgħammir ta' ġimgħatejn. Jekk in-nisa tgħarblu għal ċikli estrużi normali qabel il-kura, ikun utli li jkomplu jittieħdu kampjuni hekk kif tinbeda l-kura, iżda jekk ikun hemm tħassib dwar effetti mhux speċifiċi fil-bidu tal-kura (bħal tnaqqis inizjali ċar fil-konsum ta' ikel), f'dak il-każ l-annimali jistgħu jitħallew jadattaw għall-kura sa ġimgaħtejn qabel il-bidu tal-perjodu ta' kampjunar ta' ġimgħatejn li jwassal għat-tgħammir. Jekk il-perjodu ta' kura tan-nisa jiġi estiż b'dan il-mod (jiġifieri kura ta' qabel it-tgħammir għal 4 ġimgħat), f'dak il-każ għandhom jittieħdu f'kunsiderazzjoni x-xiri ta' annimali iżgħar u l-estensjoni tal-perjodu tal-kura fuq l-irġiel qabel it-tlaqqigħ. Meta jinkisbu ċelloli vaġinali/ċervikali, għandha tingħata attenzjoni sabiex tiġi evitata disturbanza tal-mukoża u mbagħad, l-induzzjoni tal-psewdotqala (10)(11).

41.   Il-kampjuni meħudin mill-vaġina għandhom jiġu eżaminati kuljum għan-nisa F1 kollha fil-koorta 1 A, wara l-bidu tal-patenza vaġinali, sakemm jiġi rreġistrat l-ewwel kampjun keratinizzat, sabiex jiġi ddeterminat l-intervall taż-żmien bejn iż-żewġ avvenimenti. Iċ-ċikli estrużi għan-nisa F1 kollha fil-koorta 1 A għandu jiġi ssorveljat ukoll għal perjodu ta' ġimgħatejn, b'bidu minn madwar il-PND 75. Barra minn hekk, jekk ikun hemm bżonn li jsir tgħammir tal-ġenerazzjoni F1, iċ-ċitoloġija vaġinali fil-koorta 1B ser tkun segwita minn żmien it-tlaqqigħ sakemm tinstab evidenza ta' tgħammir.

Tgħammir u tqala

42.   Minbarra l-punti aħħarin standard (eż., piż tal-ġisem, konsum ta' ikel, osservazzjonijiet kliniċi inklużi verifiki tal-mortalità/morbidità), jiġu rreġistrati d-dati tat-tgħammir, id-data ta' inseminazzjoni u d-data tal-ħlas u jiġu kkalkolati l-intervall ta' qabel l-att sesswali (tlaqqigħ sal-inseminazzjoni) u d-durata tat-tqala (inseminazzjoni sal-ħlas). In-nisa P għandhom jiġu eżaminati bir-reqqa fi żmien il-ħlas mistenni għal kwalunkwe sinjal ta' distoċja. Kwalunkwe anormalità fl-imġiba tat-tibjit jew il-prestazzjoni tat-treddigħ għandha tiġi rreġistrata.

43.   Il-jum li fih iseħħ il-ħlas huwa l-jum tat-treddigħ 0 (LD 0) għall-omm u l-jum ta' wara t-twelid 0 (PND 0) għall-wild. Inkella, it-tqabbil kollha jista' jkun imsejjes fuq żmien ta' wara l-att sesswali biex tiġi eliminata konfużjoni ta' dejta tal-iżvilupp ta' wara t-twelid, minħabba differenzi fid-durata tat-tqala; madankollu, it-twaqqit relatat mal-ħlas għandu jiġi rreġistrat ukoll. Dan huwa speċjalment importanti meta s-sustanza kimika tat-test teżerċita influwenza fuq id-durata tat-tqala.

Parametri tal-ulied

44.   Kull boton għandu jiġi eżaminat malajr kemm jista' jkun wara l-ħlas (PND 0 jew 1) biex jiġu stabbiliti n-numru u s-sess tal-frieħ, ulied imwielda mejtin, ulied imwielda ħajjin, u l-preżenza ta' anomaliji grossi (anormalitajiet estrenament viżibbli, inklużi palat maqsum; emorraġiji taħt il-ġilda; kulur jew tonalità mhux tas-soltu tal-ġilda; preżenza tal-kurdun; nuqqas ta' ħalib fl-istonku; preżenza ta' tnixxijiet nixfin). Barra minn hekk, l-ewwel eżami kliniku tan-neonati għandu jinkludi valutazzjoni kwalitattiva tat-temperatura tal-ġisem, l-istat tal-attività u r-reazzjoni għat-tqandil. Il-frieħ misjubin mejtin fil-PND 0 jew fi żmien iktar tard għandhom jiġu eżaminati għal difetti u kawżi tal-mewt possibbli. Il-frieħ ħajjin jingħaddu u jintiżnu b'mod individwali fil-PND 0 jew PND 1, u b'mod regolari wara, eż., tal-inqas fil-PND 4, 7, 14, u 21. Eżamijiet kliniċi, kif applikabbli għall-età tal-annimali, għandhom jiġu ripetuti meta jintiżnu l-ulied, jew iktar spiss jekk isiru sejbiet speċifiċi għall-każ fit-twelid. Is-sinjali osservati jistgħu jinkludu, iżda ma jistgħux ikunu limitati għal, anormalitajiet esterni, bidliet fil-ġilda, il-piż, l-għajnejn, il-membrani mukużi, l-okkorrenza ta' tnixxijiet u eskrezzjonijiet u attività awtomatika. Bidliet fil-mixja, il-pożizzjoni, ir-rispons għat-tqandil, kif ukoll il-preżenza ta' movimenti kloniċi jew toniċi, sterjotipija jew imġiba stramba, għandhom jiġu rreġistrati wkoll.

45.   Id-distanza anoġenitali (AGD) ta' kull ferħ għandha titkejjel tal-inqas darba mill-PND 0 sal-PND 4. Il-piż tal-ġisem tal-frieħ għandu jinġabar dakinhar li titkejjel l-AGD u l-AGD għandha tiġi normalizzata għal kejl tad-daqs tal-ferħ, idealment l-għerq kwadrat tal-piż tal-ġisem (12). Il-preżenza ta' bżieżel/areoli fi frieħ irġiel għandhom jiġu verifikati fil-PND 12 jew 13.

46.   L-annimali F1 kollha magħżulin huma evalwati kuljum għal separazzjoni balano-prepuzjali jew patenza vaġinali għall-irġiel/nisa rispettivament b'bidu qabel il-jum mistenni għall-kisba ta' dawn il-punti aħħarin biex jinstab jekk maturità sesswali sseħħx kmieni. Għandha tittieħed nota ta' kwalunkwe anormalità tal-organi ġenitali, bħal ħajta vaġinali persistenti, ipospadija jew pene maqsum. Il-maturità sesswali tal-annimali F1 titqabbel mal-iżvilupp fiżiku billi jiġu determinati l-età u l-piż tal-ġisem fis-separazzjoni balano-prepuzjali jew il-ftuħ vaġinali għall-irġiel/nisa rispettivament (13).

Valutazzjoni tan-newrotossiċità potenzjali tal-iżvilupp (koorti 2 A u 2B)

47.   Għaxar annimali rġiel u 10 nisa tal-koorta 2 A u 10 annimali rġiel u 10 nisa tal-koorta 2B, minn kull grupp tal-kura (għal kull koorta: raġel 1 jew mara 1 għal kull boton; kull boton rappreżentat minn tal-inqas ferħ 1; għażla aleatorja) għandhom jintużaw għall-valutazzjonijiet tan-newrotossiċità. L-annimali tal-koorta 2 A għandhom ikunu soġġetti għal valutazzjonijiet tal-qatgħa awditorja, il-batterija osservazzjonali funzjonali, l-attività motorja (ara l-paragrafi 48-50), u n-newropatoloġija (ara l-paragrafi 74-75). Għandhom isiru sforzi biex jiġi żgurat li varjazzjonijiet fil-kundizzjonijiet kollha tat-test huma minimi u mhumiex sistematikament relatati mal-kura. Fost il-varjabbli li jitsgħu jaffettwaw l-imġiba huma l-livell tal-ħoss (eż. storbju intermittenti), it-temperatura, l-umdità, id-dawl, l-irwejjaħ, il-ħin tal-ġurnata, u distrazzjonijiet ambjentali. Ir-riżultati tal-assaġġi tan-newrotossiċità għandhom jiġu interpretati fir-rigward tal-meded storiċi xierqa ta' referenza tal-kontroll. L-annimali tal-koorta 2B għandhom jintużaw għall-valutazzjoni tan-newropatoloġija fil-PND 21 jew PND 22 (ara l-paragrafi 74-75).

48.   Fil-PND 24 (± 1 jum) għandu jsir test ta' qatgħa awditorja billi jintużaw annimali fil-koorta 2 A. Il-jum tat-test għandu jkun kontrobilanċjat bejn il-gruppi tal-kura u ta' kontroll. Kull sessjoni tikkonsisti f'50 prova. Fit-twettiq tat-test tal-qatgħa awditorja, għandha tiġi determinata l-amplitudni medja tar-rispons f'kull blokka ta' 10 provi (5 blokok ta' 10 provi), bil-kundizzjonijiet tat-test ottimizzati ħalli tiġi prodotta drawwa bejn is-sessjonijiet. Dawn il-proċeduri għandhom ikunu konsistenti mal-metodu ta' ttestjar B.53 (35).

49.   Fi żmien xieraq bejn il-PND 63 u l-PND 75, l-annimali tal-koorta 2 A jiġu soġġetti għal batterija osservazzjonali funzjonali u test awtomatizzat tal-attività motorja. Dawn il-proċeduri għandhom ikunu konsistenti mal-metodi ta' ttestjar B.43 (33) u B.53 (35). Il-batterija osservazzjonali funzjonali tinkludi deskrizzjoni deskrizzjoni dettaljata tad-dehra, l-imġiba u l-integrità funzjonali tas-suġġett. Din hija vvalutata permezz ta' osservazzjonijiet fil-gaġġa ta' oriġini, wara t-teħid f'arena standard għal osservazzjoni (fil-miftuħ) fejn l-annimal jiċċaqlaq b'libertà, u permezz ta' testijiet manipolattivi. It-testijiet għandhom jimxu mill-inqas sal-iktar interattivi. Lista ta' miżuri hija ppreżentata fl-Appendiċi 1. L-annimali kollha għandhom jiġu osservati bir-reqqa minn osservaturi mħarrġin li mhumiex konxji bl-istatus tal-kura tal-annimali, billi jintużaw proċeduri standardizzati ħalli tiġi minimizzata l-varjabbiltà tal-osservaturi. Fejn possibbli, huwa rakkomandat li l-istess osservatur jevalwa l-annimali f'test partikolari. Jekk dan mhuwiex possibbli, hemm bżonn li tintwera l-affidabbiltà ta' bejn l-ossevaturi. Għal kull parametru fil-batterija tal-ittestjar tal-imġiba, għandhom jintużaw gradi espliċiti definiti b'mod operazzjonali u kriterji tal-punteġġ. Jekk possibbli, għandhom jiġu żviluppati miżuri kwantitattivi oġġettivi għal punti aħħarin osservazzjonali, li jinvolvu klassifikazzjoni soġġettiva. Għal attività motorja, kull annimali jiġi ttestjat b'mod individwali. Is-sessjoni tat-test għandha tkun twila biżżejjed biex tintwera drawwa bejn is-sessjonijiet għall-kontrolli. L-attività motorja għandha tiġi ssorveljata permezz ta' apparat awtomatizzat ta' reġistrazzjoni tal-attività li għandu jkun kapaċi jidentifika kemm żidiet kif ukoll tnaqqisijiet fl-attività (jiġifieri l-attività bażi kif imkejla mill-apparat ma għandhiex tkun baxxa wisq tant li tipprekludi l-identifikazzjoni ta' tnaqqisiet, u lanqas għolja wisq tant li tipprekludi l-identifikazzjoni ta' żidiet fl-attivit). Kull apparat għandu jkun ittestjat permezz ta' proċeduri standard ħalli tiġi żgurata, kemm jista' jkun, l-affidabbiltà tal-operazzjoni bejn l-apparati u bejn il-jiem differenti. Kemm jista' jkun, il-gruppi tal-kura għandhom ikunu bbilanċjati bejn l-apparati. Il-gruppi tal-kura għandhom ikunu kontrobilanċjati bejn il-ħinijiet tat-test ħalli tiġi evitata konfużjoni minħabba ritmi ċirkadjani ta' attività.

50.   Jekk l-informazzjoni eżistenti tindika l-bżonn li jsir ittestjar funzjonali ieħor (eż., sensorjali, soċjali, konjittiv), dawn għandhom jiġu integrati bla ma jikkompromettu l-integrità tal-evalwazzjonijiet l-oħrajn li saru fl-istudju. Jekk dan l-ittestjar isir fl-istess annimali kif użat għall-ittestjar tal-qatgħa awditorja standard, il-batterija osservazzjonali funzjonali u l-attività motorja, għandhom jiġu skedati testijiet differenti ħalli jiġi minimizzat ir-riskju ta' xekkil tal-integrità ta' dawn it-testijiet. Proċeduri supplementari jistgħu jkunu partikolarment utli meta osservazzjoni empirika, effetti antiċipati, jew il-mekkanistika/il-mod ta' azzjoni jindikaw tip sieċifiku ta' newrotossiċità.

Valutazzjoni tal-immunotossiċità potenzjali tal-iżvilupp (koorta 3)

51.   Fil-PND 56 (± 3 ijiem), 10 annimali rġiel u 10 nisa tal-koorta 3 minn kull grupp tal-kura (raġel 1 u mara 1 għal kull boton; il-boton kollha rappreżentati minn tal-inqas ferħ wieħed; magħżulin b'mod aleatorju) għandhom jintużaw f'assaġġ tar-rispons tal-antikorpi b'dipendenza fuq iċ-ċellola T, jiġifieri r-rispons primarju tal-antikorpi IgM għal antiġen li jiddependi fuq iċ-ċellola T, bħal Ċelloli Ħomor tad-Demm tan-Nagħaġ (SRBC) jew Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), konsistenti ma' proċeduri kurrenti ta' ttestjar tal-immunotossitià (14)(15). Ir-rispons jista' jiġi evalwat permezz ta' għadd taċ-ċelloli speċifiċi li jifformaw plakka (PF) fil-milsa jew billi jiġi determinat it-titru tal-antikorp IgM speċifiku għal SRBC jew KLH fis-serum minn ELISA, fl-ogħla livell tar-rispons. Ir-risponsi tipikament jilħqu l-ogħla livell erba' (rispons tal-PFC) jew ħamest (ELISA) ijiem wara l-immunizzazzjoni ġol-vina. Jekk ir-rispons primarju tal-antikorpi jiġi assaġġat permezz tal-għadd ta' ċelloli li jifformaw plakka, huwa permessibbli li jiġu evalwati sottogruppi ta' annimali f'jiem separati, diment li: l-immunizzazzjoni u s-sagrifiċċju tas-sottogruppi jsiru f'ċertu żmien b'tali mod li l-PFCs jingħaddu fl-ogħla livelli tar-rispons; li s-sottogruppi jkun fihom numru ndaqs ulied irġiel u nisa mill-gruppi kollha tad-doża, inklużi kontrolli; u li s-sottogruppi huma evalwati f'bejn wieħed u ieħor l-istess età ta' wara t-twelid. L-esponiment għas-sustanza kimika tat-test ikompli sal-jum ta' qabel il-ġbir tal-milsa għar-rispons tal-PFC jew is-serum għall-assaġġ tal-ELISA.

Valutazzjoni ta' segwitu tat-tossiċità riproduttiva potenzjali (koorta 1B)

52.   L-annimali tal-koorta 1B jistgħu jinżammu fil-kura wara l-PND 90 u jitgħammru wkoll sabiex tinkiseb ġenerazzjoni F2 jekk ikun hemm bżonn. L-irġiel u n-nisa tal-istess grupp tad-doża għandhom ikunu koabitati (biex jiġi evitat tlaqqigħ ta' aħwa) għal massimu ta' ġimgħatejn, li jibdew mill-PND 90 jew wara, iżda mhux wara mill-PND 120. Il-proċeduri għandhom ikunu simili għal dawk għall-annimali P. Madankollu, fuq il-bażi ta' piż tal-evidenza, jista' jkun biżżejjed li l-boton jiġu terminati fil-PND 4 minflok ma jkunu segwiti sal-ftim jew iktar.

OSSERVAZZJONIJIET TERMINALI

Bijokimika klinika/Ematoloġija

53.   L-effetti sistemiċi għandhom jiġu ssorveljati fl-annimali P. Il-kampjuni tad-demm wara sawm minn siti definit jittieħdu minn għaxart irġiel u nisa P magħżulin b'mod aleatorju għal kull grupp tad-doża fit-terminazzjoni, jinħażnu f'kundizzjonijiet xierqa u jiġu soġġetti għal ematoloġija parzjali jew fuq skala sħiħa, bijokimika klinika, assaġġ tat-T4 u t-TSH jew eżamijiet oħrajn issuġġeriti mill-profil tal-effetti magħruf tas-sustanza kimika tat-test (ara d-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 151(40)). Il-parametri ematoloġiċi li ġejjin għandhom jiġu eżaminati: ematokrit, konċentrazzjoni ta' emoglobina, għadd tal-eritroċita, għadd totali u differenzjali tal-lewkoċita, għadd tal-pjastrini u ħin/potenzjal ta' għoqiedi tad-demm. Investigazzjonijiet ta' plażma jew serum għandhom jinkludu: glukożju, kolesterol totali, urea, kreatinina, proteina totali, albumina u tal-inqas żewġ enżini li jindikaw effetti epatoċellolari (bħal alanina aminotrasferasi, aspartati aminotrasferasi, alkalina fosfatasi, gamma glutamil transpeptidasi u sorbitol deidroġenasi). Il-kejliet ta' enżimi u aċidi biljari addizzjonali jistgħu jipprovdu informazzjoni utli f'ċerti ċirkustanzi. Barra minn hekk, jista' jittieħed demm mill-annimali kollha u dan għandu jinħażen għal analiżi possibbli iktar tard biex jgħin ħalli jiġu ċċarati effetti ekwivokali jew sabiex tiġi ġġenerata dejta dwar l-esponiment intern. Jekk ma jkunx se jsir it-tieni tgħammir tal-annimali P, il-kampjuni tad-demm jittieħdu eżatt qabel il-proċedura fis-sagrifiċċju skedat, jew bħala parti minnha. F'każ li l-annimali jinżammu, il-kampjuni tad-demm għadhom jinġabru ftit jiem qabel ma l-annimali jitgħammru għat-tieni darba. Sakemm id-dejta eżistenti minn studji b'doża ripetuta ma jindikawx li l-parametru mhuwiex affettwat mis-sustanza kimika tat-test, għandha ssir urinaliżi qabel it-terminazzjoni u għandhom jiġu evalwati l-parametri li ġejin: id-dehra, il-volum, l-ożmolalità jew il-gravità speċifika, il-pH, il-proteina, il-glukożju, id-demm u ċ-ċelloli tad-demm, il-fdalijiet taċ-ċelloli. L-urina tista' tinġabar ukoll biex tiġi ssorveljata l-eskrezzjoni tas-sustanza kimika tat-test u/jew il-metabolita/i.

54.   L-effetti sistemiċi għandhom jiġu ssorveljati wkoll fl-annimali F1. Kampjuni tad-demm wara sawm minn sit definit jittieħdu minn għaxart irġiel u nisa magħżulin b'mod aleatorju mill-koorta 1 A għal kull doża tal-grupp fit-terminazzjoni, jinħażnu fil-kundizzjonijiet xierqa u jiġu soġġetti għal bijokimika klinika standard, inkluża l-valutazzjoni tal-livelli tas-serum għal ormoni tat-tirojde (T4 u TSH), ematoloġija (għadd totali u differenzjali tal-lewkoċite flimkien mal-eritroċite) u valutazzjonijiet tal-urinaliżi.

55.   Il-frieħ żejda fil-PND 4 huma soġġetti għal nekropsija grossa u tingħata kunsiderazzjoni għall-kejl tal-konċentrazzjonijiet tas-serum fl-ormon tat-tirojde (T4). Jekk ikun hemm bżonn, id-demm ta' dawk li jkunu għadhom kif twieldu (PND 4) jista' jinġabar skont il-boton għal analiżijiet bijokimiċi/tal-ormon tat-tirojde. Id-demm jinġabar ukoll għal analiżi tat-T4 u t-TSH mill-frieħ li għadhom kif infatmu soġġetti għal nekropsija grossa fil-PND 22 (frieħ F1 mhux magħżulin għal koorti).

Parametri tal-isperma

56.   Il-parametri tal-isperma għandhom jitkejlu fl-irġiel kollha tal-ġenerazzjoni P sakemm ma jkunx hemm dejta eżistenti x'turi li l-parametri tal-isperma mhumiex affettwati fi studju ta' 90 jum. Eżami tal-parametri tal-isperma għandu jsir fl-irġiel kollha tal-koorta 1 A.

57.   Fit-terminazzjoni, il-piżijiet tat-testikoli u tal-epididimi jiġu rreġistrati għall-irġiel P u F1 (koorta 1 A) kollha. Tal-inqas testikola waħda u epididima waħda jinżammu għal eżami istopatoloġiku. L-epididima li jfidal tintuża għal enumerazzjoni tar-riżervi tal-isperma tal-epididima cauda (16)(17). Barra minn hekk, l-isperma mill-epididima auda (jew vas deferens) tinġabar billi jintużaw il-metodi li jnaqqsu l-ħsara għall-evalwazzjoni tal-motilità u l-morfoloġija tal-isperma (18).

58.   Il-motilità tal-isperma tista' jew tiġi evalwata minnufih wara s-sagrifiċċju jew inkella tiġi rreġistrata għal analiżi iktar tard. Il-perċentwal ta' sperma motili b'mod progressiv jista' jiġi determinat jew b'mod soġġettiv jew oġġettiv permezz ta' analiżi taċ-ċaqliq assistita bil-kompjuter (19)(20)(21)(22)(23)(24). Għall-evalwazzjoni tal-morfoloġija tal-isperma, kampjun tal-isperma epididimali (jew vas deferens) għandu jiġi eżaminat bħala preparazzjonijiet fissi jew imxaarrbin (25) u tal-inqas 200 spermatożoa għal kull kampjun għandhom jiġu klassifikti jew bħala normali (kemm ir-ras u l-biċċa tan-nofs/id-denb jidhru normali) jew inkella anormali. Eżempji ta' anormalitajiet morfoloġiċi tal-isperma jinkludu fużjoni, irjus iżolati, u rjus u/jew dnub sfigurati (26). Irjus tal-isperma sfigurati jew kbar jistgħu jindikaw difetti fl-ispermjazzjoni.

59.   Jekk il-kampjuni tal-isperma jkunu ffriżati, il-kampjuni fissati u l-immaġnijet għall-analiżi tal-motilità tal-isperma jiġu rreġistrati fil-ħin tan-nekropsija (27), analiżi sussegwenti tista' tkun ristretta għal irġiel tal-kontroll u dawk ta' doża għolja. Madankollu, jekk jiġu ossrevati effetti relatati mal-kura, il-gruppi ta' doża inqas ikollhom jiġu evalwati wkoll.

Nekropsija grossa

60.   Fi żmien it-terminazzjoni jew il-mewt prematura, l-annimali P u F1 kollha jiġu nekropsjati u eżaminati b'mod mikroskopiku għal kwalunkwe anomalità strutturali jew bidla patoloġika. Għandha tingħata attenzjoni partikolari għal-organi tas-sistema riproduttiva. Il-ħrief li jinqatlu b'mod dinjituż f'kundizzjoni moribonda u l-ħrief mejtin għandhom jiġu rreġistrati u, meta jkunu għadhom sħaħ, jiġu eżaminati għal difetti possibbli u/jew kawża tal-mewt u jinżammu.

61.   Għal nisa P u F1 adulti, kampjun vaġinali jiġi eżaminat dakinhar tan-nekropsija biex jiġi determinat l-istadju taċ-ċiklu estruż u tkun tista' ssir korrelazzjoni mal-istopatoloġija fl-organi riproduttivi. L-utri tan-nisa P kollha (u n-nisa F1, jekk applikabbli) jiġu eżaminati għall-preżenza u n-numru ta' siti tal-impjant, b'tali mod li ma jxekkilx l-evalwazzjoni istopatoloġika.

Piż tal-organi u preservazzjoni tat-tessuti — annimali adulti P u F1

62.   Fil-ħin tat-terminazzjoni, il-piżijiet tal-ġisem u l-piżijiet imxarrbin tal-organi elenkati hawn taħt mill-annimali P kollha u l-adulti F1 kollha, minn koorti rilevanti (kif spjegat hawn taħt), huma determinati malajr kemm jista' jkun wara d-dissezzjoni sabiex jiġi evitat milli jinxfu. Imbagħad, dawn l-organi għandhom jiġu ppreservati fil-kundizzjonijiet xierqa. Sakemm ma jkunx speċifikat mod ieħor, l-organi f'pari jistgħu jintiżnu b'mod individwali jew flimkien, b'mod konsistenti mal-prattika tipika tal-laboratorju li jagħmel ix-xogħol.

—	Utru (b'kanali salovarji u ċerviċi), ovarji,

—	Testikoli, epididimidi (total u cauda għall-kampuni użati għall-għadd tal-isperma),

—

Prostata (il-partijiet dorsolaterali u ventrali f'daqqa). Għandha tingħata attenzjoni meta jinqatal-kumpless tal-prostata biex jiġi evitat titqib tan-nuffati seminali mimlijin fluwidu. Fil-każ ta' effett relatat mal-kura fuq il-piż totali tal-prostata, is-segmenti dorsolaterali u ventrali għandhom jiġu dissezzjonati bir-reqqa wara l-fissazzjoni, u għandhom jintiżnu b'mod separat,

—	Nuffati seminali bi glandoli koagulanti u l-fluwidi tagħhom (bħala unità waħda),

—	Moħħ, fwied, kliewi, qalb, milsa, il-glandoli tat-timu, pitwitarja, tat-tirojde (wara l-fissazzjoni), adrenali u l-organi jew it-tessuti fil-mira magħrufin.

63.   Minbarra l-organi elenkati hawn fuq, kampjuni ta' nerv periferali, muskolu, sinsla tad-dahar, għajn flimkien man-nerv ottiku, apparat gastrointestinali, apparat tal-urina, pulmun, trakea (bit-tirojde u l-paratirojde mqabbdin), mudullun tal-għadam, vas deferens (irġiel), glandola tal-ħalib (irġiel u nisa) u vaġina għandhom jiġu ppreservati f'kundizzjonijiet xierqa.

64.   L-organi kollha tal-annimali tal-koorta 1 A ser jintiżnu u ser jiġu ppreservati għal istopatoloġija.

65.   Għall-investigazzjoni ta' effetti immunotossiċi kkaġunati qabel u wara t-twelid, 10 annimali rġiel u 10 nisa mill-koorta 1 A minn kull grupp tal-kura (raġel wieħed jew mara waħda għal kull boton; il-boton kollha rappreżentati minn tal-inqas ferħ 1; għażla aleatorja) ser ikunu soġġetti għal dan li ġej fit-terminazzjoni:

—	ser jintiżnu n-nodi tal-limfa assoċjati ma' u distanti mir-rotta ta' esponiment (minbarra l-piż tal-glandoli adrenali, it-timu u l-milsa, li diġà sar fl-annimali kollha tal-koorta 1 A),

—	analiżi tal-limfoċite splenika tas-sottopopolazzjoni (limfoċiti T, limfoċiti B ta' CD4+ u CD8+ u ċelloli qattiela naturali) billi jintuża nofs il-milsa, bin-nofs l-ieħor tal-milsa jinżamm għal evalwazzjoni istopatoloġika.

Analiżi tas-sottopopolazzjoni tal-limfoċite splenika f'annimali mhux immunizzati (koorta 1 A) ser tiddetermina jekk l-esponiment huwiex relatat ma' bidla fid-distribuzzjoni immunoloġika fi stat kostanti ta' limfoċiti ‘li jgħinu’ (CD4+) jew ċitotossiċi (CD8+) li ġejjin mit-timu jew ċelloli qattiela naturali (NK) (risponsi rapidi għal ċelloli neoplastiċi u patoġeni).

66.   Għall-annimali tal-koorta 1B, għandhom jintiżnu l-organi li ġejjin u jiġu pproċessati għall-istadju tal-blokk it-tessuti korrispondenti li ġejjin:

—	Vaġina (mingħajr ma tintiżen),

—	Utru biċ-ċerviċi,

—

Ovarji,

—	Testikoli (tal-inqas waħda),

—	Epididimidi,

—	Nuffati seminali u glandoli koagulanti,

—

Prostata,

—	Pitwitarja,

—	Organi fil-mira identifikati.

L-istopatoloġija fil-koorta 1B issir jekk ir-riżultati mill-koorta 1 A joħolqu ekwivoku jew f'każijiet ta' tossikanti riproduttivi jew endokrinali ssuspettati.

67.   Il-koorti 2 A u 2B: Ittestjar tan-newrotossiċità tal-iżvilupp (PND 21 jew PND 22 u ulied adulti). L-annimali tal-koorta 2 A huma terminati wara ttestjar tal-imġiba, bil-piż tal-moħħ irreġistrat u newroistopatoloġija sħiħa għal skopijiet ta' valutazzjoni tan-newrotossiċità. L-annimali tal-koorta 2B huma terminati fil-PND 21 jew PND 22, bil-piż tal-moħħ irreġistrat u eżami mikroskopiku tal-moħħ għal finijiet tal-valutazzjoni tan-newrotossiċità. Il-fissazzjoni tal-perfużjoni hija meħtieġa għall-annimali tal-koorta 2 A u fakultattiva għal annimali tal-koorta 2B, kif stipulat fil-metodu ta' ttestar B.53 (35).

Piż tal-organi u preservazzjoni tat-tessuti — Annimali F1 miftumin

68.   Il-frieħ mhux magħżulin għal koorti, inklużi frieħ żgħar wisq, huma terminati wara l-ftim, fil-PND 22, sakemm ir-riżultati ma jindikawx il-bżonn ta' iktar investigazzjonijiet matul il-ħajja. Il-frieħ terminati huma soġġetti għal nekropsija grossa inkluża valutazzjoni tal-organi riproduttivi, kif deskritti fil-paragrafi 62 u 63. Għal massimu ta' 10 frieħ għal kull sess għal kull grupp, minn kemm jista' jkun boton, il-moħħ, il-milsa, u t-timu għandhom jintiżnu u jinżammu f'kundizzjonijiet xierqa. Barra minn hekk, it-tessuti mammarji għal dawn il-frieħ irġiel u nisa jistgħu jiġu ppreservati għal analiżijiet mikroskopiċi ulterjuri (2) (ara d-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 151 (40)). L-anomalitajiet grossi u t-tessuti fil-mira għandhom jinżammu għal eżami istoloġiku possibbli.

Istopatoloġija — annimali P

69.   Istopatoloġija sħiħa tal-organi elenkati fil-paragrafi 62 u 63 issir għall-annimali P kollha tad-doża għolja u ta' kontroll. L-organi li juru bidliet relatati mal-kura għandhom jiġu eżaminati fl-annimali kollha fil-gruppi ta' doża inqas sabiex jgħinu fid-determinazzjoni ta' NOAEL. Barra minn hekk, l-organi riproduttivi tal-annimali kollha ssuspettati b'fertilità mnaqqsa, eż., dawk li naqsu milli jitgħammru, iwelldu, inisslu, jew iwelldu wlied b'saħħithom, jew li għalihom ġew affettwati ċ-ċikliċità estrużi jew in-numru, il-motilità, jew il-morfoloġija tal-isperma u l-leżjonijiet gross kollha għandhom ikunu soġġetti għal evalwazzjoni istopatoloġika.

Istopatoloġija — Annimali F1

Annimali tal-koorta 1

70.   Issir istopatoloġija sħiħa tal-organi elenkati fil-paragrafi 62 u 63 għall-annimali adulti kollha ta' doża għolja u tal-kontroll mill-koorta 1 A. Il-boton kollha għandhom ikunu rappreżentanti minn tal-inqas ferħ 1 għal kull sess. L-organi u t-tessuti li juru bidliet relatati mal-kura u l-leżjonijiet gross kollha għandhom ikunu eżaminati fl-annimali kollha fil-gruppi ta' doża inqas biex jgħinu fid-determinazzjoni ta' NOAEL. Għall-evalwazzjoni ta' effetti kkaġunati qabel u wara t-twelid fuq organi limfojdi, għandha tiġi evalwata wkoll l-istopatoloġija ta' 10 annimali rġiel u 10 nisa mill-koorta 1 A fuq in-nodi tal-limfa u l-mudullun tal-għadam miġburin wara l-evalwazzjoni istopatoloġika tat-timu, il-milsa, u l-glandoli adrenali li diġà saret fl-annimali 1 A kollha.

71.   Tessuti riproduttivi u endokrinali mill-annimali kollha tal-koorta 1B, ipproċessati għall-istadju tal-blokk kif spjegat fil-paragrafu 66, għandhom jiġu eżaminati għal istopatoloġija f'każijiet ta' tossikanti riproduttivi jew endokrinali ssuspettati. Il-koorta 1B għandu jsirilha wkoll eżami istoloġiku jekk ir-riżultati mill-koorta 1 A joħolqu ekwivoku.

72.   L-ovarji ta' nisa adulti għandu jkun fihom follikoli primordjali u li qed jikbru, kif ukoll corpora lutea; għalhekk, eżami istopatoloġiku għandu jkollu l-għan li jidentifika evalwazzjoni kwantitattiva tal-follikoli primordjali u oħrjan żgħar li qed jikbru, kif ukoll corpora lutea, f'nisa F1; in-numru ta' annimali, l-għażla tas-sezzjoni tal-ovarji, u d-daqs tal-kampjun tas-sezzjoni għandhom ikunu statistikament xierqa għall-proċedura ta' evalwazzjoni użata. L-enumerazzjoni follikolari tista' ssir għall-ewwel fuq annimali tal-kontroll u ta' doża għolja, u fil-każ ta' effett avvers f'dawn tal-aħħar, għandhom jiġu eżaminati dożi inqas. L-eżami għandu jinkludi enumerazzjoni tan-numru ta' follikoli primordjali, li jista' jingħaqad ma' follikoli żgħar li qed jikbru, għat-tqabbil ta' ovarji kkurati u tal-kontroll (ara d-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 151 (40)). Il-valutazzjoni tal-corpora lutea għandha ssir b'mod parallel mal-ittestjar taċ-ċikliċità estruża sabiex l-istadju taċ-ċiklu jkun jista' jittieħed f'kunsiderazzjoni fil-valutazzjoni. Il-kanal salovarju, l-utru u l-vaġina jiġu eżaminati għal żvilupp xieraq tipiku tal-organi.

73.   Eżamijiet dettaljati tal-itsopatoloġija testikolari jsiru fuq l-irġiel F1 sabiex jiġu identifikati effetti relatati mal-kuar fuq id-differenzazzjoni u l-iżvilupp tat-testikoli u fuq l-ispermatoġenesi (38). Meta jkun possibbli, għandhom jiġu eżaminati sezzjonijiet tax-xibka testikolari. Caput, corpus, u cauda tal-epididimi u l-vas deferens jiġu eżaminati għal żvilupp xieraq tipiku tal-organi, kif ukoll għall-parametri meħtieġa għall-irġiel P.

Annimali tal-koorta 2

74.   Issir newroistopatoloġija għall-annimali kollha ta' doża għolja u tal-kontroll tal-koorta 2 A għal kull sess wara li jitlesta l-ittestjar tan-newromġiba (wara PND 75, iżda mhux wara PND 90). L-istopatoloġija tal-moħħ issir għall-annimali kollha ta' doża għolja u tal-kontroll tal-koorta 2B għal kull sess fil-PND 21 jew PND 22. L-organi jew it-tessuti li juru bidliet relatati mal-kura għandhom jiġu eżaminati wkoll għall-annimali fil-gruppi ta' doża inqas biex titħaffef id-determinazzjoni ta' NOAEL. Għall-annimali tal-koorta 2 A u 2B, jiġu eżaminati bosta sezzjonijiet mill-moħħ biex ikun jista' jsir eżami tal-basal olfattivi, il-kortiċi ċerebrali, l-ippokampu, il-gangliji tal-bażi, it-talamu, l-ipotalamu, il-meżenċefalu (tekum, tegmentum, u pendunkuli ċerebrali), iz-zokk enċefaliku u ċ-ċervellett. Għall-koorta 2 A biss, jiġu eżaminati l-għajnejn (ir-retina u n-nerv ottiku) u kampjuni ta' nerv periferiku, muskolu u sinsla tad-dahar. Il-proċeduri newroistoloġiċi kollha għandhom ikun konsistenti mal-metodu ta' ttestjar B.53 (35).

75.   Għandhom isiru evalwazzjonijiet morfometriċi (kwantitattivi) fuq żoni rappreżentattivi tal-moħħ (sezzjonijiet omologi magħżulin bir-reqqa fuq il-bażi ta' punti mikroskopiċi ta' riferiment affidabbli) u jistgħu jinkludu kejliet lineari u/jew areali ta' reġjuni speċifiċi tal-moħħ. Għandhom jittieħdu tal-inqas tliet sezzjonijiet konsekuttivi f'kull punt ta' riferiment (livell) sabiex tingħażel l-iktar sezzjoni omologa u rappreżentattiva għaż-żona speċifika tal-moħħ li ser tiġi evalwata. In-newropatoloġist għandu jeżerċita ġudizzju xieraq dwar jekk it-taqsimiet imħejjin għall-kejl humiex omologi ma' oħrajn fis-sett tal-kampjun u għaldaqstant, xierqa għal inklużjoni, peress li l-kejliet lineari b'mod partikolari jistgħu jinbidlu fuq distanza relattivament qasira (28). Ma għandhomx jintużaw sezzjonijiet mhux omologi. Filwaqt li l-għan huwa li jittieħed kampjun tal-annimali kollha riżervati għal dan l-għan (10/sess/livell tad-doża), numri inqas xorta jistgħu jkunu adegwati. Madankollu, kampjuni minn inqas minn 6 annimali/sess/livell tad-doża ġeneralment ma jitqisux biżżejjed għall-finijiet ta' dan il-metodu ta' ttestjar. L-istereoloġija tista' tintuża biex tidentifika effetti relatati mal-kura fuq parametri bħall-volum jew in-numru ta' ċelloli għar-reġjuni newroanatomiċi speċifiċi. L-aspetti kollha tat-tħejjija tal-kampjuni tat-tessuti, mill-fissazzjoni tat-tessuti, sad-dissezzjoni tal-kampjuni tat-tessuti, l-ipproċessar tat-tessuti, u t-tilwin tas-slides, għandhom iħaddmu disinn kontrobilanċjat, b'tali mod li kull lott ikun fih kampjuni rappreżentattivi minn kull grupp tad-doża. Meta jkunu ser jintużaw analiżijiet morfometriċi jew stereoloġiċi, it-tessut tal-moħħ għandu jitqiegħed fil-midjums xierqa fil-livelli tad-doża kollha fl-istess ħin sabiex jiġu evitati tiċkin tal-oġġetti assoċjat ma' ħżin prolungat f'fissattiv.

RAPPORTAR

Dejta

76.   Id-dejta tiġi rrapportata b'mod individwali u tinġabar fil-qosor f'forma ta' tabelli. Fejn xieraq, għal kull grupp tat-test u kull ġenerazzjoni, għandhom jiġu rrapportati dawn i ġejjin: in-numru ta' annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta' annimali misjubin mejtin matul it-test jew inqatlu għal raġunijiet umanitarji, il-ħin ta' kwalunkwe mewta jew qtil umanitarju, in-numru ta' annimali fertili, in-numru ta' nisa tqal, in-numru ta' nisa li qed iwelldu boton, u n-numru ta' annimali li qed juru sinjali ta' tossiċità. Għandha tiġi rrapportata wkoll deskrizzjoni tat-tossiċità, inklużi l-ħin tal-bidu, id-durata u s-severità.

77.   Ir-riżultati numeriċi għandhom jiġu rrapportati permezz ta' metodu statistiku xieraq u aċċettat. Il-metodi statistiċi għandhom jingħażlu bħala parti mid-disinn tal-istudju u għandhom jindirizzaw kif xieraq dejta mhux normali (eż., dejta tal-għadd), dejta ċċensurata (eż., ħin ta' osservazzjoni limitat), nuqqas ta' indipendenza (eż., effetti tal-boton u miżuri ripetuti) u varjanzi mhux indaqs. Mudelli mħalltin lineari ġeneralizzati u mudelli ta' rispons għad-doża jkopru klassi wiesgħa ta' għodod analitiċi li jistgħu jkunu xierqa għad-dejta ġġenerata f'dan il-metodu ta' ttestjar. Ir-rapport għandu jinkludi biżżejjed informazzjoni dwar il-metodu ta' analiżi u l-programm tal-kompjuter użat, sabiex statitsiku/reviżur indipendenti jkun jista' jevalwa/jerġa' jevalwa l-analiżi.

Evalwazzjoni tar-riżultati

78.   Is-sejbiet għandhom jiġu evalwati f'termini tal-effetti osservati, inklużi sejbiet mikroskopiċi u fin-nekropsija. L-evalwazzjoni tinkludi r-relazzjoni, jew in-nuqqas tagħha, bejn id-doża u l-preżenza, l-inċidenza u s-severità tal-anormalitajiet, inklużi leżjonijiet grossi. Għandhom jiġu vvalutati wkoll l-organi fil-mira, il-fertilità, l-anormalitajiet kliniċi, il-prestazzjoni riproduttiva u tal-boton, il-bidliet fil-piż tal-ġisem, il-mortalità u kwalunkwe effett tossiku u tal-iżvilupp ieħor. Għandha tingħata attenzjoni speċjali lil bidliet speċifiċi għas-sess. Il-proprjetajiet fiżikokimiċi tas-sustanza kimika tat-test, u meta disponibbli, dejta dwar it-TK, inklużi t-trasferiment plaċentali u l-eskrezzjoni tal-ħalib, għandhom jiġu kkunsidrati wkoll meta jiġu evalwati r-riżultati tat-test.

Rapport tat-test

79.   Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja miksuba f'dan l-istudju minn annimali P, F1 u annimali F2 (fejn rilevanti):

Sustanza kimika tat-test:

—	L-informazzjoni rilevanti disponibbli kollha dwar il-proprjetajiet kimiċi, tossikokinetiċi u tissikodinamiċi tas-sustanza kimika tat-test,

—	Id-dejta ta' identifikazzjoni,

—	Il-purità.

Veikolu (jekk xieraq):

—	Il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-veikolu jekk mhuwiex ilma.

Annimali tat-test:

—	L-ispeċi/ir-razza użati,

—	In-numru, l-età u s-sess tal-annimali,

—	Is-sors, il-kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija, id-dieta, il-materjali tat-tibjit, eċċ.,

—	Il-piżijiet individwali tal-annimali fil-bidu tat-test,

—	Dejta dwar il-kampjun vaġinali għal nisa P qabel tinbeda l-kura (jekk id-dejta tinġabar f'dak iż-żmien),

—	Rekords dwar it-tlaqqigħ tal-ġenerazzjoni P li jindikaw is-sieħeb u s-sieħba li tgħammru u s-suċċess tat-tgħammir,

—	Rekords dwar il-boton ta' oriġini għall-annimali adulti tal-ġenerazzjoni F1.

Kundizzjonijiet tat-test:

—	Ġustifikazzjoni għall-għażla tal-livell tad-doża,

—	Dettalji tal-formulazzjoni tas-sustanza kimika tat-test/preparazzjoni tad-dieta, il-konċentrazzjonijiet miksubin,

—	L-istabbiltà u l-omoġenità tal-preparazzjoni fil-veikolu jew it-trasportatur (eż., dieta, ilma tajjeb għax-xorb), fid-demm u/jew il-ħalib bil-kundizzjonijiet ta' użu u ħżin bejn l-użi,

—	Dettalji tal-għoti tas-sustanza kimika tat-test,

—	Konverżjoni minn konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test (ppm) f'ilma tajjeb għax-xorb/dieta għad-doża miksuba (mg/kg piż tal-ġisem/jum), jekk applikabbli,

—	Dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u l-ilma (inkluża l-kompożizzjoni tad-dieta, jekk disponibbli),

—	Deskrizzjoni dettaljata tal-proċeduri ta' każwalizzazzjoni biex jingħażlu frieħ għas-separazzjoni u biex jiġu assenjati frieħ għall-gruppi tat-test,

—	Il-kundizzjonijiet ambjentali,

—	Il-lista tal-persunal tal-istudju, inkluż it-taħriġ professjonali.

Riżultati (sommarju u dejta individwali skont is-sess u d-doża):

—

Konsum ta' ikel, konsum ta' ilma jekk disponibbli, effiċjenza tal-ikel (żieda fil-piż tal-ġisem għal kull gramma ikel ikkonsmat, ħlief għall-perjodu ta' koabitazzjoni u matul it-treddigħ), u konsum tas-sustanza kimika tat-test (għal għoti permezz ta' dieta/ilma tajjeb għax-xorb) għall-annimali P u F1,

—	Dejta dwar l-assorbiment (jekk disponibbli),

—	Dejta dwar il-piż tal-ġisem għall-annimali P,

—	Dejta dwar il-piż tal-ġisem għall-annimali F1 magħżulin wara l-ftim,

—	Il-ħin tal-mewt matul l-istudju jew jekk l-annimali baqgħux ħajjin wara t-terminazzjoni,

—	L-għamla, is-severità u d-durata tal-osservazzjonijiet kliniċi (jekk humiex riversibbli jew le),

—	Dejta dwar l-ematoloġija, l-urinaliżi u l-kimika klinika inklużi TSH u T4,

—	Analiżi fenotipika taċ-ċelloli tal-milsa (ċelloli T, B, NK),

—	Ċelloli tal-mudullun tal-għadam,

—	Dejta dwar ir-rispons tossiku,

—	In-numru ta' nisa P u F1 b'ċiklu estruż normali jew anormali u d-durata taċ-ċiklu,

—	Żmien sat-tgħammir (intervall qabel l-att sesswali, in-numru ta' jiem bejn it-tlaqqigħ u t-tgħammir),

—	Effetti tossiċi jew oħrajn fuq ir-riproduzzjoni, inklużi numri u perċentwali ta' annimali li rnexxew fit-tgħammir, it-tqala, il-ħlas u t-treddigħ, ta' rġiel li kkaġunaw it-tqala, ta' nisa b'sinjali ta' distoċja/ħlas prolungat jew diffiċli,

—	Id-durata tat-tqala u, jekk disponibbli, tal-ħlas,

—	In-numri ta' impjanti, id-daqs tal-boton u l-perċentwal ta' frieħ irġiel,

—	In-numru u l-perċentwal ta' telf ta' wara l-impjant, annimali mwielda ħajjin u annimali mwielda mejtin,

—	Dejta dwar il-piż tal-boton u l-piż tal-frieħ (irġiel, nisa u f'daqqa), in-numru ta' annimali li baqgħu żgħar jekk determinat,

—	In-numru ta' frieħ b'anormalitajiet ferm viżibbli,

—	Effetti tossiċi jew oħrajn fuq l-ulied, it-tkabbir wara t-twelid, il-vijabbiltà, eċċ.,

—	Dejta dwar punti ta' riferiment fiżiċi fi frieħ u dejta oħra dwar l-iżvilupp wara t-twelid,

—	Dejta dwar il-maturità sesswali ta' annimali F1,

—	Dejta dwar osservazzjonijiet funzjonali fi frieħ u adulti, skont kif appilkabbli,

—	Il-piż tal-ġisem fis-sagrifiċċju u dejta dwar il-piż tal-organi relattiv u assolut għal annimali P u annimali adulti F1,

—	Is-sejbiet fin-nekropsija,

—	Deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet istopatoloġiċi kollha,

—	In-numru totali ta' sperma epididimali cauda, il-perċentwal ta' sperma progressivament motili, il-perċentwal ta' sperma morfoloġikament normali, u l-perċentwal ta' sperma b'kull anormalità identifikata għal irġiel P u F1,

—	In-numri u l-istadji tal-maturità tal-follikoli li jinsabu fl-ovarji tan-nisa P u F1, fejn applikabbli,

—	Enumerazzjoni tal-corpora lutea fl-ovarji tan-nisa F1,

—	Trattament statistiku tar-riżultati, fejn xieraq.

Parametri tal-koorta 2:

—	Deskrizzjoni dettaljata tal-proċeduri użati biex jiġu standardizzati osservazzjonijiet u proċeduri kif ukoll definizzjonijiet operazzjonali għall-għoti ta' punteġġ għall-osservazzjonijiet,

—	Lista tal-proċeduri kollha tat-test użati, u ġustifikazzjoni għall-użu tagħhom,

—	Dettalji tal-proċeduri tal-imġiba/funzjonali, newropatoloġiċi u morfometriċi użati, inkluża informazzjoni u dettalji dwar apparati awtomatizzati,

—	Proċeduri għall-kalibraġġ u l-iżgurar tal-ekwivalenza tal-apparati u l-ibbilanċjar tal-gruppi tal-kura fil-proċeduri ta' ttestjar,

—	Ġustifikazzjoni qasira li tispjega kwalunkwe deċiżjoni li tinvolvi ġudizzju professjonali,

—	Deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet kollha dwar l-imġiba/funzjonali, newropatoloġiċi u morfometriċi skont is-sess u l-grupp tad-doża, inklużi kemm żidiet kif ukoll tnaqqisiet mill-kontrolli,

—	Il-piż tal-moħħ,

—	Kwalunkwe dijanjosi li ġejja minn sinjali newroloġiċi u leżjonijiet, inkluż mard jew kundizzjonijiet li jseħħu b'mod naturali,

—	Stampi ta' sejbiet eżemplari,

—	Stampi b'enerġija baxxa biex tiġi vvalutata l-omoloġija tas-sezzjonijiet użati għall-morfometrija,

—	Trattament statistiku tar-riżultati, inklużi l-mudelli statistiċi użati biex tiġi analizzata d-dejta, r-riżultati, indipendentement minn jekk kinux sinifikanti jew le,

—	Ir-relazzjoni ta' kwalunkwe effett tossiku ieħor ma' konklużjoni dwar il-potenzjal newrotossiku tas-sustanza kimika tat-test, skont is-sess u l-grupp tad-doża,

—	L-impatt ta' kwalunkwe informazzjoni tossikokinetika fuq il-konklużjonijiet,

—	Dejta li ssostni l-affidabbiltà u s-sensittività tal-metodu ta' ttestjar (jiġifieri dejta tal-kontroll pożittiv u storiku),

—	Ir-relazzjonijiet, jekk jeżistu, bejn l-effetti newropatoloġiċi u funzjonali,

—	L-NOAEL jew id-doża ta' riferiment għal ommijiet u wlied, skont is-sess u l-grupp tad-doża,

—	Diskussjoni tal-interpretazzjoni ġenerali tad-dejta fuq il-bażi tar-riżultati, inkluża konklużjoni dwar jekk is-sustanza kimika kkaġunatx newrotossiċità tal-iżvilupp u l-NOAEL.

Parametri tal-koorta 3:

—	Titri tal-antikorp IgM tas-serum (sensitizzazzjoni għal SRBC jew KLH), jew unitajiet PFC IgM tal-milsa (sensitizzazzjoni għal SRBC);

—	It-twettiq tal-metodu TDAR għandu jkun ikkonfermat bħala parti mill-proċess ta' ottimizzazzjoni mil-laboratorju li jħejji l-assaġġ għall-ewwel darba, u b'mod perjodiku (eż. kull sena) mil-laboratorji kollha;

—	Diskussjoni tal-interpretazzjoni ġenerali tad-dejta fuq il-bażi tar-riżultati, inkluża konklużjoni dwar jekk is-sustanza kimika kkaġunatx immunotossiċità tal-iżvilupp u l-NOAEL;

Diskussjoni tar-riżultati

Konklużjonijiet, inklużi l-valuri tal-NOAEL għal effetti fuq il-ġenituri u l-ulied

Għandha tiġi pprovduta wkoll l-informazzjoni kollha mhux miksuba matul l-istudju, iżda li hija utli għall-interpretazzjoni tar-riżultati (eż., similaritajiet tal-effetti għal kwalunkwe newrotossikant magħruf).

Interpretazzjoni tar-Riżultati

80.   Studju Estiż tat-Tossiċità Riproduttiva ta' Ġenerazzjoni Waħda ser jipprovdi informazzjoni dwar l-effetti ta' esponiment ripetut għal sustanza kimika matul il-fażijiet kollha taċ-ċiklu riproduttiv, kif ikun hemm bżonn. B'mod partikolari, l-istudju jipprovdi informazzjoni dwar is-sistema riproduttiva, u dwar l-iżvilupp, it-tkabbir, is-sopravvivenza u l-punti aħħarin funzjonali tal-ulied sal-PND 90.

81.   L-interpretazzjoni tar-riżultati tal-istudju għandhom jieħdu f'kunsiderazzjoni l-informazzjoni kollha għad-dispożizzjoni dwar is-sustanza kimika, inklużi proprjetajiet fiżikokimiċi, tat-TK u tossikodinamiċi, l-informazzjoni rilevanti disponibbli dwar analogi strutturali, u riżultati ta' studji dwar it-tossiċità li saru qabel bis-sustanza kimika tat-test (eż., tossiċità akuta, tossiċità wara applikazzjoni ripetuta, studji mekkanistiċi u studji li jivvalutaw jekk hemmx differenzi kwalitattivi u kwantitattivi sostanzjali bejn l-ispeċi fi proprjetajiet metaboliċi in vivo/in vitro). Ir-riżultati tan-nekropsija grossa u tal-piż tal-organi għandhom jiġu vvalutati fil-kuntest ma' osservazzjonijiet li jsiru fi studji oħrajn b'doża ripetuta, meta dan ikun fattibbli. It-tnaqqisiet fit-tkabbir tal-ulied jistgħu jitqiesu f'relazzjoni ma' influwenza tas-sustanza kimika tat-test fuq il-kompożizzjoni tal-ħalib (29).

Koorta 2 (Newrotossiċità tal-iżvilupp)

82.   Ir-riżultati tan-newromġiba u n-newropatoloġija għandhom jiġu interpretati fil-kuntest tas-sejbiet kollha, billi jintuża approċċ tal-piż tal-evidenza b'ġudizzju espert. Għandhom jiġu diskussi l-mudelli tas-sejbiet tal-imġiba jew morfoloġiċi, jekk ikunu preżenti, kif ukoll evidenza tar-rispons għad-doża. L-evalwazzjoni tan-newrotossiċità tal-iżvilupp, inklużi studji epidemjoloġiċi tal-bniedem jew rapporti tal-każ, u studji sperimentali ta' annimali (eż. dejta tossikokinetika, informazzjoni dwar l-istruttura-attività, dejta minn studji oħrajn tat-tossiċità) għandha tkun inkluża f'din il-karatterizzazzjoni. Evalwazzjoni tad-dejta għandha tinkludi diskussjoni kemm tal-importanza bijoloġika kif ukoll statistika. L-evalwazzjoni għandha tinkludi r-relazzjoni, jekk ikun hemm waħda, bejn l-alterazzjonijiet newropatoloġiċi u tal-imġiba osservati. Għal gwida dwar l-interpretazzjoni tar-riżultati tan-newrotossiċità tal-iżvilupp, irreferi għall-metodu ta' ttestjar B.53 (35) u Tyl et al., 2008 (31).

Koorta 3 (Immunotossiċità tal-iżvilupp)

83.   Trażżin jew tisħiħ tal-funzjoni immuni kif ivvalutata bit-TDAR (rispons tal-antikorpi li jiddependu fuq iċ-ċelloli T), għandhom jiġu evalwati fil-kuntest tal-osservazzjonijiet kollha li jkunu saru. Is-sinifikanza tal-eżitu tat-TDAR tista' tkun sostnuta b'effetti oħrajn fuq indikaturi relatati immunoloġikament (eż., ċellolarità tal-mudullun tal-għadam, il-piż u l-ispatoloġija tat-tessuti limfojdi, id-distribuzzjoni tas-sottosett tal-limfoċite). L-effetti stabbiliti bit-TDAR jistgħu jkunu inqas sinifikanti f'każ ta' tossiċitajiet oħrajn osservati f'konċentrazzjonijiet iżgħar ta' esponiment.

84.   Id-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 43 għandu jiġi kkonsultat għal għajnuna fl-interpetazzjoni tar-riżultati dwar ir-riproduzzjoni u n-newrotossiċità (26).

TAGĦRIF

(1)

Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers and K.E. Whitby (2006), ‘A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment’, Critical Reviews in Toxicology, 36, 69-98.

(2)

Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe (1999), ‘Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula Laboratory Animal Diets’, Lab. Anim. Sci., 49, 530- 536.

(3)

Zoetis, T. and I. Walls (2003), Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, Washington, DC.

(4)

Moser, V.C., I. Walls and T. Zoetis (2005), ‘Direct Dosing of Preweaning Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI Expert Working Group’, International Journal of Toxicology, 24, 87-94.

(5)

Conolly, R.B., B.D. Beck, and J.I. Goodman (1999), ‘Stimulating Research to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment’, Toxicological Sciences, 49, 1-4.

(6)

Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995), ‘Detection of Effects on Male Reproduction — a Literature Survey’, Journal of the American College of Toxicologists, 14, 293-327.

(7)

Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003), ‘Some Aspects Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility’, Regulatory Toxicology and Pharmacology, 37, 356-369.

(8)

Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. Mayahara and Y. Ohno (2000). ‘Collaborative work to evaluate toxicity on male reproductive organs by repeated dose studies in rats — overview of the studies’, Journal of Toxicological Sciences, 25, 1-21.

(9)

Creasy, D.M. (2003), ‘Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Toxicologic Pathology’, Birth Defects Research, Part B, 68, 408-415.

(10)

Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper (2007), ‘The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies’, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97.

(11)

Sadleir, R.M.F.S. (1979), ‘Cycles and Seasons’, in C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York.

(12)

Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. Reynolds (1999), ‘Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights’, Reproductive Toxicology, 13: 383-390.

(13)

Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi and R.I. Weiner (1977), ‘Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat’, Biological Reproduction, 17, 298-303.

(14)

Ladics, G.S. (2007), ‘Use of SRBC Antibody Responses for Immunotoxicity Testing’, Methods, 41, 9-19.

(15)

Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. Herzyk (2004), ‘Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemocyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation’, Toxicology, 197, 23-35.

(16)

Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989), ‘A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat’, Fundamental and Applied Toxicology, 12, 92-108.

(17)

Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978), ‘Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats’, Journal of Reproduction and Fertility,54, 103-107.

(18)

Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991), ‘The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat’. Reproductive Toxicology,5, 39-44.

(19)

Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996), ‘Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report’, Reproductive Toxicology, 10, 237- 244.

(20)

Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992), ‘Methods for Assessing Rat Sperm Motility’, Reproductive Toxicology, 6, 267-273.

(21)

Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992), ‘Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration’, Journal of Andrology, 13, 409-421.

(22)

Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991), ‘Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations’, Reproductive Toxicology, 5, 449-458.

(23)

Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993), ‘Kompjuter-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer’, Methods in Toxicology, Part A, Academic, Orlando, Florida. pp. 319-333.

(24)

Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989), ‘The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations’, Journal of Andrology, 10, 401-415.

(25)

Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992), ‘Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants’, Reproductive Toxicology, 6, 491-505.

(26)

OECD (2008), Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment, Series on Testing and Assessment, No. 43, ENV/JM/MONO(2008)16, OECD, Pariġi.

(27)

Working, P.K., M. Hurtt (1987), ‘Computerized Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility’, Journal of Andrology, 8, 330-337.

(28)

Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee (2006), ‘A 'Best Practices' Approach to Neuropathologic Assessment in Developmental Neurotoxicity Testing — for Today’, Toxicological Pathology, 34, 296-313.

(29)

Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de Duffard, and R. Duffard (2006), ‘Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of their Major Components’, Food Chemicals Toxicology, 44, 8-16.

(30)

Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. Caviness, G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007), ‘Variations in Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats’, Environmental health perspectives, 115(12), 1717-1726.

(31)

Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. Sobotka (2008), ‘Identification and Interpretation of Developmental Neurotoxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental Endpoints’, Neurotoxicology and Teratology, 30: 349-381.

(32)

OECD (1996), Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Reproduction/Developmental Toxicity Screening Test, Linja Gwida tal-OECD għall-Ittestjar ta' Sustanzi Kimiċi, Nru 422, OECD, Pariġi.

(33)

Il-Kapitolu B.43 ta' dan l-Anness, Studju tan-Newrotossiċità fir-Rodituri

(34)

OECD (2000), Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations, Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariġi.

(35)

Il-Kapitolu B.53 ta' dan l-Anness, Studju tan-Newrotossiċità tal-Iżvilupp

(36)

Il-Kapitolu B.54 ta' dan l-Anness, Bijoassaġġ Uterotrofiku fir-Rodituri: Test ta' Tgħarbil fuq terminu qasir għal Proprjetajiet Estroġeniċi

(37)

Il-Kapitolu B.55 ta' dan l-Anness, Il-Bijoassaġġ Hershberger fil-Firien: Assaġġ ta' Tgħarbil fuq Terminu Qasir għal Proprjietajiet (Anti)Androġeniċi

(38)

OECD (2009), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 106, OECD, Pariġi.

(39)

OECD (2011), Guidance Document on the Current Implementation of Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Kanada, Series on Testing and Assessment, No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OECD, Pariġi.

(40)

OECD (2013), Guidance Document supporting TG 443: Extended One Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Assessment, No. 151, OECD, Pariġi.

B.57.   H295R ASSAĠĠ TAL-ISTEROJDOĠENESI

INTRODUZZJONI

1.   Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-Linja Gwida dwar it-Testijiet (TG) tal-OECD Nru 456 (2011). Fl-1998, l-OECD nediet attività ta' prijorità għolja biex tirrevedi linji gwida dwar it-testijiet eżistenti, u tiżviluppa ġodda, għat-tgħarbil u l-ittestjar ta' sustanzi kimiċi interferenti endokrinali potenzjali. Il-Qafas Kunċenttwali tal-2002 tal-OECD għall-Ittestjar u l-Valutazzjoni tas-Sustanzi Kimiċi Interferenti Endokrinali jinvolvi ħames livelli, b'kull livell li jikkorrispondi għal livell differenti ta' kumplessità bijoloġika (1). L-Assaġġ tal-Isterojdoġenesi in vitro H295R (H295R) deskritt f'dan il-metodu ta' ttestjar juża linja ta' ċelloli adrenokarċinoma tal-bniedem (ċelloli NCI-H295R) u jikkostitwixxi ‘assaġġ in vitro tat-2 livell, li jipprovdi dejta mekkanistika’, li għandu jintuża għal finijiet ta' tgħarbil u prijoritizzazzjoni. L-iżvilupp u l-istandardizzazzjoni tal-assaġġ bħala tgħarbil għal effetti kimiċi fuq sterojdoġenesi, speċifikament il-produzzjoni ta' 17β-estradjol (E2) u testosteron (T), twettqu fi proċess b'bosta stadji. L-assaġġ H295R ġie ottimizzat u vvalidat (2)(3)(4)(5).

2.   L-għan tal-Assaġġ tal-Isterojdoġenesi H295R huwa li jidentifika sustanzi kimiċi li jaffettwaw il-produzzjoni ta' E2 u T. L-assaġġ H295R huwa maħsub sabiex jidentifika ksenobijotiċi li bħala s-sit(i) fil-mira tagħhom għandhom il-komponenti endoġeni li jinvolvu l-mogħdija bijokimika intraċellolari li tibda bis-sekwenza ta' reazzjonijiet mill-kolesterol sal-produzzjoni ta' E2 u/jew T. L-assaġġ H295R mhuwiex maħsub sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li jaffettwaw l-isterojdoġenesi minħabba effetti fuq l-assi ipotalamiku-pitwitarju-gonadali (HPG). L-għan tal-assaġġ huwa li jipprovdi tweġiba IVA/LE fir-rigward tal-potenzjal ta' sustanza kimika li tikkaġuna jew tinibixxi l-produzzjoni ta' T u E2; madankollu, jistgħu jinkisbu riżultati kwantitattivi f'ċerti każijiet (ara l-paragrafi 53 u 54). Ir-riżultati tal-assaġġ jingħataw bħala bidliet relattivi fil-produzzjoni tal-ormini meta mqabbla mal-kontrolli ta' solventi (SCs). L-assaġġ ma għandux l-għan li jipprovdi informazzjoni mekkanistika speċifika dwar l-interazzjoni tas-sustanza kimika tat-test mas-sistema endokrinali. Saret riċerka billi ntużat il-linja ta' ċelloli ħalli jiġu identifikati effetti fuq enżimi speċifiċi u ormoni intermedjati bħall-proġesteron (2).

3.   Id-definizzjonijiet u t-taqsiriet użati f'dan il-metodu ta' ttestjar huma deskritti fl-Appendiċi. Protokoll dettaljat inklużi struzzjonijiet dwar kif tipprepara soluzzjonijiet, tikkultiva ċelloli u twettaq diversi aspetti tat-test huwa disponibbli bħala Appendiċi I-III tad-dokument tal-OECD ‘Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production’ (4).

KUNSIDERAZZJONIJIET U LIMITAZZJONIJIET INIZJALI

4.   Ħames enżimi differenti li jikkaġunaw sitt reazzjonijiet differenti huma involuti f'bijosinteżi tal-ormon tal-isterojdi tas-sess. Il-konverżjoni enżimatika tal-kolesterol għal pregnenolon miċ-ċitokromu P450 (CYP) enżima kolsterol monossiġenasi li jaqtal-katina laterali (CYP11 A) jikkostitwixxi l-pass inizjali f'serje ta' reazzjonijiet bijokimiċi li jwasslu għal sinteżi tal-prodotti finali tal-isterojdi. Skont l-ordni taż-żewġ reazzjonijiet ta' wara, il-mogħdija sterojdoġenika tinqasam f'żewġ mogħdijiet, il-mogħdija idrossisterojdi Δ5 u l-mogħdija ketosterojdi Δ4, li jiltaqgħu fil-produzzjoni tal-androstenedjon (Figura 1).

5.   Androstenedjon huwa konvertit f'testosteron (T) minn 17β-idrossisterojd deidroġenasi (17β-HSD). It-testosteron huwa kemm prodott intermedjat kif ukoll ormon tal-prodott finali. Fir-raġel, T jista' jiġi konvertit f'diidrotestosteron (DHT) permezz ta' 5α-ridottasi, li tinsab fil-membrani ċellolari, envelopp nukleari, u retikulu endoplażmiku tat-tessuti fil-mira ta' azzjoni androġenika bħall-prostata u n-nuffati seminali. DHT huwa notevolment iktar qawwi bħala androġen milli T u jitqies li huwa ormon tal-prodott finali wkoll. L-assaġġ H295R ma jkejjilx id-DHT (ara l-paragrafu 10).

6.   L-enżima fil-mogħdija sterojdoġenika li tikkonverti sustanzi kimiċi androġeniċi f'sustanzi kimiċi estroġeniċi hija aromatażi (CYP19). CYP19 tibdel T f'17β-estradjol (E2) u androstenedjon f'estron. E2 u T jitqiesu ormoni tal-prodott finali tal-mogħdija sterojdoġenika.

7.   L-ispeċifiċità tal-attività tal-ljasi ta' CYP17 tvarja għas-sottostrati intermedjati bejn l-ispeċi. Fil-bniedem, l-enżina tiffavorixxi sottostrati tal-mogħdija idrossisterojdi Δ5 (pregnenolon), filwaqt li sottostrati fil-mogħdija ketosterojdi Δ6 (proġesteron) huma ffavoriti fil-far (19). Dawn id-differenzi fl-attività tal-ljasi ta' CYP17 jistgħu jispjegaw uħud mid-differenzi li jiddependu fuq l-ispeċi bħala rispons għal sustanzi kimiċi li jibdlu l-isterojdoġenesi in vivo (6). Intwera li ċ-ċelloli H295 jirriflettu l-iktar mill-qrib l-espressjoni tal-enżima adrenali u l-mudell ta' produzzjoni tal-isterojdi ta' bniedem adult (20), iżda huma magħrufin li jesprimu enżimi kemm għall-mogħdija idrossisterojdi Δ5 kif ukoll dik ketosterojdi Δ6 għas-sinteżi tal-androġen (7)(11)(13)(15).

Figura 1

Mogħdija sterojdoġenika f'ċelloli H295R

Nota:

L-enżimi huma fil-korsiv, l-ormoni huma skurati u l-vleġeġ jindikaw id-direzzjoni tas-sinteżi. L-isfond griż jindika mogħdijiet/prodotti kortikosterojdi. Il-mogħdijiet/prodotti sterojdi tas-sess għandhom ċirku madwarhom. CYP = ċitokroma P450; HSD = idrossisterojdi deidroġenasi; DHEA = deidroepjandrosteron.

8.   Il-linja ta' ċelloli adreno-karċinoma H295R tal-bniedem hija mudell in vitro utli għall-investigazzjoni tal-effetti fuq sinteżi tal-ormon sterojde (2)(7)(8)(9)(10). Il-linja ta' ċelloli H295R tesprimi ġeni li jikkodifikaw għall-enżimi ewlenin kollha għall-isterojdoġenesi osservata iktar 'il fuq (11)(15) (Figura 1). Din hija proprjetà unika għaliex l-espressjoni in vivo ta' dawn il-ġeni hija speċifika għat-tessut u l-istadju tal-iżvilupp b'tipikament ebda tessut waħdu jew stadju tal-iżvilupp waħdu li jesprimi l-ġeni kollha involuti fl-isterojdoġenesi (2). Iċ-ċelloli H295R għandhom karatteristiċi fiżjoloġiċi ta' ċelloli adrenali ta' fetu tal-bniedem żonalment mhux differenzjati (11). Iċ-ċelloli jirrappreżentaw sistema in vitro unika peress li għandhom il-ħila li jiproduċu l-ormoni sterojdi kollha fil-kortiċi adrenali adult u l-gonadi, biex b'hekk ikun jista' jsir ittestjar għal effetti kemm fuq sinteżi kortikosterojdi kif ukoll fuq il-produzzjoni tal-ormoni tal-isterojdi tas-sess bħal androġeni u estroġeni, għad li l-assaġġ kien validat biss biex jidentifika bidliet fit-T u E2. Il-bidliet irreġistrati mis-sistema tat-test fil-forma ta' bidla fil-produzzjoni ta' T u E2 jistgħu jkunu ir-riżultat ta' firxa ta' interazzjonijiet differenti tas-sustanzi kimiċi tat-test b'funzjonijiet sterojdoġeniċi li huma espressi miċ-ċelloli H295R. Dawn jinkludu l-modulazzjoni tal-espressjoni, sinteżi jew funzjoni ta' enżimi involuti fil-produzzjoni, it-trasformazzjoni, jew l-eliminazzjoni ta' ormoni ta' sterojdi (12)(13)(14). L-inibizzjoni tal-produzzjoni ta' ormoni tista' tkun dovuta għal tagħqid kompetittiv dirett ma' enżema fil-mogħdija, impatt fuq kofatturi bħall-NADPH (Nikotinamid Adenin Dinukleotid Fosfat) u cAMP (Adenożina Monofosfat ċiklika), u/jew żieda fil-metaboliżmu tal-isterojdi jew it-trażżin tal-espressjoni tal-ġeni ta' ċerti enżimi fil-mogħdija tal-isterojdoġenesi. Filwaqt li l-inibizzjoni tista' tkun funzjoni kemm ta' proċessi diretti kif ukoll indetti involuti fil-produzzjoni ta' ormoni, normalment l-induzzjoni tkun ta' għamla indiretta, bħal permezz tal-effett fuq kofatturi bħall-NADPH u s-cAMP (bħal fil-każ ta' forskolin), tnaqqis fil-metaboliżmu tal-isterojdi (13), u/jew sopraregolamentazzjoni tal-espressjoni tal-ġeni sterojdoġeniċi.

9.   L-assaġġ H295R għandu bosta vantaġġi:

—	Jippermetti li jiġu identifikat kemm żidiet kif ukoll tnaqqisijiet fil-produzzjoni ta' T kif ukoll E2,

—

Jippermetti li ssir valutazzjoni diretta tal-impatt potenzjali ta' sustanza kimika fuq il-vijabbiltà/iċ-ċitotossiċità taċ-ċelloli. Din hija karatteristika importanti peress li b'hekk tkun tista' ssir diskriminazzjoni bejn l-effetti li huma dovuti għal ċitotossiċità minn dawk dovuti għall-interazzjoni diretta tas-sustanzi kimiċi mal-mogħdijiet sterojdoġeniċi, li mhijiex possibbli f'sistemi ta' espjanti tat-tessut li jikkonsisti f'diversi tipi ta' ċelloli b'sensittivitajiet u funzjonalitajiet varji,

—	Ma jeħtieġx l-użu ta' annimali,

—	Il-linja ta' ċelloli ta' H295R hija disponibbli b'mod kummerċjali.

10.   Il-limitazzjonijiet ewlenin tal-assaġġ huma kif ġej:

—	Il-kapaċità metabolika tiegħu mhijiex magħrufa iżda aktarx kemxejn limitata; b'hekk, sustanzi kimiċi li jeħtieġu jkunu metabolikament attivi aktarx li mhux ser jinstabu f'dan l-assaġġ.

—	Peress li ġej mit-tessut adrenali, H295R fih l-enżimi li kapaċi jipproduċu l-glukokortikojdi u l-mineralkortikojdi kif ukoll l-ormoni tas-sess; għalhekk, l-effetti fuq il-produzzjoni ta' glukokortikojdi u mineralkortikojdi jistgħu jinfluwenzaw il-livelli ta' T u E2 osservati fl-assaġġ,

—	Ma jkejjilx DHT u, għalhekk, ma jkunx mistenni jsib sustanzi kimiċi li jinibixxu 5α-ridottasi, f'liema każ jista' jintuża l-assaġġ Hershberger (16),

—	L-assaġġ H295R mhuwiex ser jidentifika sustanzi kimiċi li jinterferixxu mal-isterojdoġenesi billi jaffettwaw l-assi ipotalamiku-pitwitarju-gonadali (HPG) peress li dan jista' jkun studjat biss f'annimali sħaħ.

IL-PRINĊIPJU TAT-TEST

11.   L-iskop tal-assaġġ huwa l-identifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi li jaffettwaw il-produzzjoni ta' T u E2. T huwa wkoll intermedju fil-mogħdija għall-produzzjoni ta' E2. L-assaġġ jista' jidentifika sustanzi kimiċi li tipikament jinibixxu jew jinduċu l-enżimi tal-mogħdija tal-isterojdoġenesi.

12.   Normalment l-assaġġ isir f'kundizzjonijiet standard tal-koltura taċ-ċelloli fi platti tal-koltura b'24 toqba. Inkella, jistgħu jintużaw daqsijiet oħrajn tal-platti għat-twettiq tal-assaġġ; madankollu, kundizzjonijiet taż-żriegħ u sperimentali għandhom jiġu aġġustati kif xieraq biex tinżamm aderenza mal-kriterji tal-prestazzjoni.

13.   Wara perjodu ta' akklimatizzazzjoni ta' 24 siegħa fi platti b'bosta toqob, iċ-ċelloli jiġu esposti għal 48 siegħa għal seba' konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test f'tal-inqas tripilikat. Solvent u inibitur u induttur magħruf tal-produzzjoni tal-ormoni jintużaw b'konċentrazzjoni fissa bħala kontrolli negattivi u pożittivi. Fi tmiem il-perjodu ta' esponiment, il-midjum jitneħħa minn kull toqba. Il-varjabbiltà taċ-ċelloli f'kull toqba tiġi analizzata eżatt wara t-tneħħija tal-midjum. Il-konċentrazzjonijiet tal-ormoni fil-midjum jistgħu jitkejlu permezz ta' firxa ta' metodi inklużi kits ta' kejl tal-ormoni kummerċjalment disponibbli u/jew tekniki strumentali bħal spettrometrjia tal-massa tal-kromatografija likwida (LC-MS). Id-dejta tingħata bħala bidla fid-daqs relatata mal-kontroll tas-solvent u l-Inqas Konċentrazzjoni b'Effett Osservata (LOEC). Jekk l-assaġġ ikun negattiv, l-ogħla konċenetrazzjoni ttestjata tiġi rrapportata bħala l-Konċentrazzjoni bl-Ebda Effett Osservat (NOEC). Konklużjonijiet dwar il-ħila ta' sustanza kimika biex taffettwa l-isterojdoġenesi għandhom ikunu bbażati fuq tal-inqas żewġ testijiet indipendenti. L-ewwel test jista' jaħdem bħala test ta' sejbien tal-medda b'aġġustament sussegwenti tal-konċentrazzjonijiet għat-testijiet 2 u 3, jekk applikabbli, jekk jinstabu problemi relatati mas-solubilità jew iċ-ċitotossiċità jew jekk l-attività tas-sustanza kimika tkun tidher li waslet fi tmiem il-medda tal-konċentrazzjonijiet ittestjati.

PROĊEDURA TAL-KOLTURA

Linja Ċellolari

14.   Iċ-ċelloli NCI-H295R huma kummerċjalment disponibbli mill-American Type Culture Collections (ATCC) wara li jiġi ffirmat Material Transfer Agreement (MTA) (3).

Introduzzjoni

15.   Minħabba bidliet fil-kapaċità ta' produzzjoni ta' E2 taċ-ċelloli b'età/mogħdija li jikbru (2), iċ-ċelloli għandhom ikunu kolturati wara protokoll speċifiku qabel jintużaw u għandha tittieħed nota tan-numru ta' mogħdijiet mindu ċ-ċelloli tneħħew mill-friża kif ukoll in-numru tal-mogħdjia li fiha ġew iffriżati ċ-ċelloli u tqiegħdu f'ħażna tan-nitroġenu likwidu. L-ewwel numru jindika n-numru tal-mogħdija propja taċ-ċellola u t-tieni numru jiddeskrivi n-numru tal-mogħdija li fiha ċ-ċelloli ġew iffriżati u tqiegħdu għall-ħżin. Pereżempju, ċelloli li kienu ffriżati wara l-ħames moħdija u tneħħew mill-friża u mbagħad inqasmu tliet darbiet (4 mogħdijiet jekk iċ-ċelloli maħlul frisk jingħaddu bħala l-1 mogħdija) wara li ġew ikkolturati mill-ġdid jitniżżlu bħala l-mogħdija 4.5. Eżempju ta' skema ta' enumerar hija rappreżentata fl-Appendiċi I tar-rapport ta' validazzjoni (4).

16.   Midjum tal-ħażna jintuża bħala l-bażi għall-midjums supplimentati u tal-iffriżar. Il-midjum supplimentat huwa komponent neċessarju għall-koltura taċ-ċelloli. Il-midjum tal-iffriżar huwa mfassal b'mod speċifiku biex ikun jista' jsir iffriżar ħieles minn impatti taċ-ċelloli għal ħżin fit-tul. Qabel l-użu, Nu-serum (jew serum komparabbli bi proprjetajiet indaqs li ntwera li jipproduċi dejta li tissodisfa l-prestazzjoni tat-test u r-rekwiżiti ta' Kontroll tal-Kwalità (QC)), li huwa kostitwent ta' midjums supplimentati, għandu jiġi analizzat għal konċentrazzjonijiet ta' sfond ta' T u E2. Il-preparazzjoni ta' dawn is-soluzzjonijiet hija deskritta fl-Appendiċi II tar-rapport ta' validazzjoni (4).

17.   Wara l-bidu tal-koltura ta' ċellola H295R minn lott oriġinali tal-ATCC, iċ-ċelloli għandhom jitkabbru għal ħames mogħdijiet (jiġifieri ċ-ċelloli jinqasmu 4 darbiet). Imbagħad, iċ-ċelloli tal-ħames mogħdija jiġu ffriżati f'nitroġenu likwidu għall-ħżin. Qabel l-iffriżar taċ-ċelloli, fi platt tal-QC isir kampjun taċ-ċelloli tar-raba' mogħdija preċedenti (Ara l-paragrafu 36 u 37) biex jiġi verifikat jekk il-produzzjoni bażi tal-ormoni u r-rispons għal sustanzi kimiċi tal-kontroll pżittiv jissodisfawx il-kriterji ta' kontroll tal-kwalità tal-assaġġ kif definiti fit-Tabella 5.

18.   Iċ-ċelloli H295R iridu jiġu kkolturati, iffriżati u jinħażnu f'nitroġenu likwidu biex jiġi żgurat li dejjemm ikun hemm ċelloli tal-mogħdija/età xierqa disponibbli għal koltura u użu. In-numru massimu ta' mogħdijiet wara li jittieħed lott ġdid (4) jew iffriżat (5) ta' ċelloli f'koltura li huwa aċċettabbli għall-użu fl-assaġġ H295R ma għandux jaqbeż l-10. Pereżempju, il-mogħdijiet aċċettabbli għall-kolturi ta' ċelloli minn lott iffriżat fil-mogħdija 5 ikun minn 4.5 sa 10.5. Għal ċelloli li jinbdew minn dawn il-lottijiet iffriżati, għandha tiġi segwita l-proċedura deskritta fil-paragrafu 19. Dawn iċ-ċelloli għandhom jiġu kkolturati għa tal-inqas erba' (4) mogħdijiet addizzjonali (mogħdija 4.5) qabel ma jintużaw fl-ittestjar.

Ċelloli tal-Bidu mill-Ħażna Ffriżata

19.   Il-proċedura għall-bidu taċ-ċelloli minn ħażna ffriżata għandha tintuża meta lott ġdid ta' ċelloli jitneħħa mill-ħżin f'nitroġenu likwidu għall-fini ta' koltura u ttestjar. Id-dettalji għal din il-proċedura huma stabbiliti fl-Appendiċi III tar-rapport ta' validazzjoni (4). Iċ-ċelloli jitneħħew minn ħażna f'nitroġenu likwidu, jinħallu malajr, jitqiegħdu f'midjum supplimentat f'tubu ċentrifugu f'temperatura ambjentali, jerġgħu jiġu sospiżi f'midjum supplimentat, u jiġu ttrasferiti fi flask tal-koltura. Il-midjum għandu jinbidel l-għada. Iċ-ċelloli H295R huma kolativati f'inkubatur f'37 °C b'5 % CO2 f'atmosfera tal-arja u l-midjum jinbidel 2-3 darbiet fil-ġimgħa. Meta ċ-ċelloli jkunu madwar 85-90 % konfluwenti, għandhom jinqasmu. Il-qsim taċ-ċelloli huwa neċessarju biex jiġu żgurati s-saħħa u t-tkabbir taċ-ċelloli u sabiex jinżammu ċelloli għat-twettiq ta' bijoassaġġi. Iċ-ċelloli jitlaħalħu tliet darbiet b'salmastru b'bafer tal-fosfat (PBS, bla Ca2+ Mg2+.) u jitneħħew mill-flask tal-koltura billi tiżdied enżima xierqa ta' qlugħ, eż., tripsina, f'PBS (bla Ca2+ Mg2+). Eżatt wara li ċ-ċelloli jinqalgħu mill-flask tal-koltura, l-azzjoni tal-enżima għandha titwaqqaf billi jiżdied il-midjum supplimentat bi proporzjon ta' 3X il-volum użat għat-trattament bl-enżima. Iċ-ċelloli jitqiegħdu f'tubu ċentrifugu, jiġu ċentrifugati f'temperatura ambjentali, is-supernatant jitneħħa u l-pellet ta' ċelloli jerġa' jiġi sospiż f'midjum supplimentat. L-ammont xieraq ta' soluzzjoni taċ-ċellola jitqiegħed fil-flask il-ġdid tal-koltura. L-ammont ta' soluzzjoni taċ-ċellola għandu jiġi aġġustat sabiex iċ-ċelloli jkunu konfluwenti fi żmien 5-7 ijiem. Il-proporzjon sottokultivat rakkomandat huwa 1:3 sa 1:4. Il-platt għandu jiġi mmarkat bir-reqqa. Iċ-ċelloli issa lseti biex jintużaw fl-assaġġ u ċ-ċelloli żejda għandhom jiġu ffriżati f'nitroġenu likwidu kif spjegat fil-paragrafu 20.

Iffriżar ta' Ċelloli H295R (preparazzjoni ta' ċelloli għal ħżin f'nitroġenu likwidu)

20.   Biex jiġu ppreparati ċelloli H295R għall-iffriżar, il-proċedura deskritta hawn fuq għall-qsim taċ-ċelloli għandha tiġi segwita sal-istadju ta' sospensjoni mill-ġdid tal-pellet taċ-ċelloli f'qiegħ it-tubu ċentrifugu. Hawnhekk, il-pellet taċ-ċelloli jerġa' jiġi sospiż f'midjum ta' ffriżar. Is-soluzzjoni tiġi ttrasferita f'kunjett krijoġeniku, immarkata kif xieraq, u ffriżata f'– 80 °C għal 24 siegħa u wara l-kunjett krijoġeniku jiġi ttrasferit f'nitroġenu likwidu għall-ħżin. Id-dettalji għal din il-proċedura huma stabbiliti fl-Appendiċi III tar-rapport ta' validazzjoni (4).

Tqegħid fil-Platti u Preinkubazzjoni ta' Ċelloli għall-Ittestjar

21.   In-numru ta' platti b'24 toqba, ippreparati kif spjegat fil-paragrafu 19, li ser ikunu meħtieġa skont in-numru ta' sustanzi kimiċi li għandom jiġu ttestjati u l-konfluwenza taċ-ċelloli fil-platti tal-koltura. Bħala regola ġenrrali, flask wieħed tal-koltura (75 cm2) b'ċelloli konfluwenti ta' 80-90 % ser iforni biżżejjed ċelloli għal platt wieħed sa 1,5 (b'24 toqba) b'densità fil-mira ta' 200 000 sa 300 000 ċellola għal kull ml tal-midjum, u dan jirriżulta f'konfluwenza ta' madwar 50-60 % fit-toqob wara 24 siegħa (Figura 2). Tipikament, din hija d-densità ottimali taċ-ċelloli għall-produzzjoni ta' ormoni fl-assaġġ. F'densitajiet ogħla, il-mudelli ta' produzzjoni ta' T kif ukoll E2 jinbidlu. Qabel ma jsir l-assaġġ għall-ewwel darba, huwa rakkomandat li jiġu ttestjati densitajiet ta' żriegħ differenti ta' bejn 200 000 u 300 000 ċellola għal kull ml, u li d-densità li tirriżulta f'konfluwenza ta' 50-60 % fit-toqba wara 24 siegħa tingħażel għal iktar esperimenti.

Figura 2

Fotomikrografija ta' ċelloli H295R b'densità ta' żriegħ ta' 50 % fi platt tal-koltura b'24 toqba meħuda fit-tarf (A) u ċ-ċentru (B) ta' toqba

22.   Il-midjum jiġi pipettat mill-flask tal-kultura, u ċ-ċelloli jitlaħalħu 3 darbiet b'PBS sterili (bla Ca2+Mg2+). Tiżdied soluzzjoni ta' enżima (f'PBS) biex taqla' ċ-ċelloli mill-flask tal-koltura. Wara żmien xieraq għall-qlugħ taċ-ċelloli, l-azzjoni tal-enżima għandha titwaqqaf biż-żieda ta' midjum supplimentat bi proprozjon ta' 3X il-volum użat għat-trattament bl-enżima. Iċ-ċelloli jitqiegħdu f'tubu ċentrifugu, ċentrifugati f'temperatura ambjentali, is-supernatant jitneħħa, u l-pellet taċ-ċelloli jerġa' jiġi sospiż f'midjum supplimentat. Id-densità taċ-ċelloli tiġi kkalkolata billi jintużaw, eż., emoċitometru jew kalkolatur taċ-ċelloli. Is-soluzzjoni taċ-ċelloli għandha tiġi dilwita sad-densità mixtieqa tat-tqegħid fil-platt u titħawwad sew biex tiġi żgurata densità omoġena taċ-ċelloli. Iċ-ċelloli għandhom jitqiegħdu fi platt b'1 ml tas-soluzzjoni ta' ċelloli/toqba u l-platti u t-toqob immarkati. Il-platti li fihom isir żriegħ jiġu inkubati f'37 °C f'5 % CO2 f'atmosfera tal-ajru għal 24 siegħa biex iċ-ċelloli jkunu jistgħu jaqbdu mat-toqob.

REKWIŻITI TA' KONTROLL TAL-KWALITÀ

23.   Huwa kruċjali li l-volumi eżatti tas-soluzzjonijiet u l-kampjuni jitwasslu fit-toqob matul id-dożaġġ għaliex dawn il-volumi jiddeterminaw il-konċentrazzjonijiet użati fil-kalkoli tar-riżultati tal-assaġġ.

24.   Qabel il-bidu tal-koltura taċ-ċelloli u kwalunkwe ttestjar sussegwenti, kull laboratorju għandu juri s-sensittività tas-sistema ta' kejl tal-ormoni tagħha (paragrafi 29-31).

25.   Jekk ser jintużaw assaġġi ta' kejl tal-ormoni bbażati fuq antikorpi, is-sustanzi kimiċi li ser jiġu ttestjati għandhom jiġu analizzati għall-potenzjal tagħhom li jinterferixxu mas-ssitema ta' kejl użata biex jiġu kwantifikati T u E2 kif spjegat fil-paragrafu 32 qabel jinbeda l-ittestjar.

26.   DMSO huwa s-solvent rakkomandat għall-assaġġ. Jekk jintuża solvent alternattiv, għandhom jiġu determinati dawn li ġejjin:

—	Is-solubilità tas-sustanza kimika tat-test, il-forskolin u l-prokloraz fis-solvent, u

—	Iċ-ċitotossitià bħala funzjoni tal-konċentrazzjoni tas-solvent.

Huwa rakkomandat li l-konċentrazzjoni massima awtorizzabbli tas-solvent ma għandhiex taqbeż 10 × dilwizzjoni tal-inqas konċentrazzjoni ċitotossika tas-solvent.

27.   Qabel ma jagħmel it-testijiet għall-ewwel darba, il-laboratorju għandu jagħmel esperiment kwalifikattiv li juri li l-laboratorju kapaċi jżomm u jilħaq il-kundizzjonijiet xierqa meħtieġa tal-koltura taċ-ċelloli u tal-esperimenti għall-ittestjar tas-sustanza kimika kif spjegat fil-paragrafi 33-35.

28.   Meta jinbeda l-ittestjar għal lott ġdid, għandu jsir platt tal-kontroll qabel ma jintuża lott ġdid ta' ċelloli ħalli tiġi evalwata l-prestazzjoni taċ-ċelloli kif deskritt fil-paragrafi 36 u 37.

Prestazzjoni tas-Sistema ta' Kejl tal-Ormoni

Sensittivià, reqqa, preċiżjoni tal-metodu u l-kontroreattività tiegħu ma' matriċi kampjun

29.   Kull laboratorju jista' juża sistema ta' kejl tal-ormoni tal-għażla tiegħu għall-analiżi tal-produzzjoni ta' T u E2 minn ċelloli H295R diment li tissodisfa l-kriterji ta' prestazzjoni, inkluż il-imitu ta' Kwantifikazzjoni (LOQ). Nominalment, dawn huma 100 pg/ml għal T u 10 pg/ml għal E2, li huma bbażati fuq il-livelli ormonali bażi fl-istudji ta' validazzjoni. Madankollu, livelli ogħla jew inqas jistgħu jkunu xierqa skont il-livelli tal-ormoni bażi miksubin fil-laboratorju inkarigat. Qabel ma jsiru l-platti tal-QC u t-testijiet, il-laboratorju għandu juri li l-assaġġ tal-ormon li ser jintuża jista' jkejjel konċentrazzjonijiet tal-ormoni f'midjum supplimentat b'reqqa u preċiżjoni suffiċjenti sabiex jissodisfa l-kriterji tal-QC speċifikati fit-Tabelli 1 u 5 billi jiġi analizzat midjum supplimentat miżjud b'kontroll intern tal-ormoni. Ma' kull midjum supplimentat għandhom jiżdiedu tal-inqas tliet konċentrazzjonijiet ta' kull ormon (eż., 100, 500 u 2 500 pg/ml T; 10, 50 u 250 pg/ml E2; jew l-inqas konċentrazzjonijiet possibbli fuq il-bażi tal-limiti ta' identifikazzjoni tas-sistema ta' kejl tal-ormoni magħżulin jistgħu jintużaw għall-inqas konċentrazzjonijiet miżjudin għal T u E2) u jiġu analizzati. Konċentrazzjonijiet tal-ormoni mkejlin ta' kampjuni mhux estrattati għandhom ikunu fi ħdan konċentrazzjonijiet nominali ta' 30 %, u l-varjazzjoni ta' bejn il-kejliet replikati tal-istess kampjun ma għandhiex taqbeż il-25 % (ara wkoll it-Tabella 8 għal kriterji addizzjonali tal-QC). Jekk dawn il-kriterji tal-QC jiġu ssodisfati, huwa supponut li l-assaġġ magħżul tal-kejl tal-ormoni huwa eżatt u preċiż biżżejjed u ma jidħolx f'kontroreazzjoni ma' komponenti fil-midjum (matriċi kampjun) b'tali mod li tkun mistennija influwenza importanti fuq l-eżitu tal-assaġġ. F'dan il-każ, ma jkun hemm bżonn li ssir ebda estrazzjoni ta' kampjuni qabel il-kejl tal-ormoni.

30.   F'każ li l-kriterji tal-QC fit-tabelli 1 u 8 ma jkunux issodisfati, jista' jkun li qed iseħħ effett matriċi sinifikanti, u għandu jsir esperiment b'midjum miżjud estratt. Eżempju ta' proċedura ta' estrazzjoni huwa deskritt fl-Appendiċi II tar-rapport ta' validazzjoni (4). Il-kejliet tal-konċentrazzjonijiet ta' ormini fil-kampjuni estrattati għandhom isiru tliet darbiet (6). Jekk jista' jintwera li wara l-estrazzjoni l-komponenti tal-midjum ma jinterferixxux mal-metodu ta' identifikazzjoni tal-orom kif definit mill-kriterji tal-QC, l-esperimenti kollha li jsiru wara għandhom isiru billi jintużaw kampjuni estrattati. Jekk il-kriterji tal-QC ma jkunux jistgħu jiġu ssodisfati wara l-estrazzjoni, is-sistema ta' kejl tal-ormoni użata mhijeix xierqa għall-fini tal-Assaġġ tal-Isterojdoġenesi H295R, u għandu jintuża metodu alternattiva ta' identifikazzjoni tal-ormoni.

Kurva standard

31.   Il-konċentrazzjonijiet tal-ormoni tal-kontrolli tas-solvent (SC) għandhom ikunu jaqgħu fi ħdan is-sehem lineari tal-kurva standard. Idealment, il-valuri tal-SC għandhom ikunu jaqgħu ħdejn in-nofs tas-sehem lineari biex jiġi żgurat li l-induzzjoni u l-inibizzjoni tas-sinteżi tal-ormoni jistgħu jitkejlu. Id-dilwizzjonijiet tal-midjum (jew estratti) li għandhom jitkejlu jridu jingħażlu kif xieraq. Ir-reazzjoni lineari trid tiġi determinata permezz ta' approċċ statistiku.

Test tal-interferenza kimika

32.   Jekk ser jintużaw assaġġi bbażati fuq antikorpi bħal Assaġġi Immunosorbenti Marbutin mal-Enżimi (ELISAs) u Assaġġi Radjuimmuni (RIAs) biex jitkelju l-ormoni, kull sustanza kimika għandha tiġi ttestjata għal interferenza potenzjali mas-sistema ta' kejl tal-ormoni li ser tintuża qabel jinbeda l-ittestjar propju tas-sustanzi kimiċi (Appendiċi III tar-rapport ta' validazzjoni (4)) għaliex uħud mill-karatteristiċi jistgħu jinterferixxu ma' dawn it-testijiet (17). Jekk isseħħ interferenza li hija ≥ 20 % tal-produzzjoni tal-ormoni bażi għal T u/jew E2 kif determinat mill-analiżi tal-ormoni, it-Test ta' Interferenza tal-Assaġġ tal-Ormoni mas-Sustanza Kimika (kif deskritt fl-Appendiċi III tar-rapport ta' validazzjoni (4) taqsima 5.0) għandu jsir fuq id-dilwizzjonijiet kollha tas-soluzzjonijiet tal-ħażna tas-sustanza kimika tat-test ħalli jiġi identifikat id-doża limitu li biha sseħħ interferenza sinifikanti (≥ 20 %). Jekk l-interferenza hija inqas minn 30 %, ir-riżultati jistgħu jiġu kkoreġuti għall-interferenza. Jekk l-interferenza taqbeż it-30 %, id-dejta tkun invalida u għandha titwarrab id-dejta f'dawn il-konċentrazzjonijiet. Jekk isseħħ interferenza sinifikanti ta' sustanza kimika tat-test ma' sistema ta' kejl tal-ormoni f'iktar minn konċentrazzjoni mhux ċitotossika waħda, għandha tintuża sistema differenti ta' kejl tal-ormoni. Sabiex tiġi evitata interferenza minn sustanzi kimiċi kontaminanti, huwa rakkomandat li l-ormoni jiġu estrattati mill-midjum permezz ta' solvent xieraq, il-metodi possibbli jistgħu jinkisbu mir-rapport ta' validazzjoni (4).

Tabella 1

Kriterji ta' prestazzjoni tas-sistemi ta' kejl tal-ormoni

Parametru	Kriterju
Sensittività tal-Metodu ta' Kejl	Limitu tal-Kwantifikazzjoni (LOQ) T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (12)
Effiċjenza tal-Estrazzjoni tal-Ormoni (biss meta jkun hemm bżonn estrazzjoni)	Ir-rati medji ta' rkupru (fuq il-bażi ta' miżuri trippli) għall-ammonti miżjudin tal-ormon ma għandhomx imorru oltre 30 % mill-ammont li żdied.
Interferenza Kimika (sistemi bbażati fuq l-antikorpi biss)	Ma għandha sseħħ ebda kontroreattività sostanzjali (≥ 30 % tal-produzzjoni tal-ormon bażi tal-ormon rappreżentattiv) ma' kwalunkwe wieħed mill-ormoni prodotti miċ-ċelloli (13)  (14)

Test tal-Profiċjenza tal-Laboratorju

33.   Qabel ma jiġu ttestjati sustanzi kimiċi mhux magħrufin, laboratorju għandu juri li kapaċi jikseb u jżomm kundizzjonijiet xierqa għall-koltura taċ-ċelloli u t-testijiet meħtieġa għat-twettiq b'suċċess tal-assaġġ billi jagħmel test tal-profiċjenza tal-laboratorju. Peress li t-twettiq ta' assaġġ huwa marbut direttament mal-persunal tal-laboratorju li jwettaq l-assaġġ, dawn il-proċeduri għandhom jiġu parzjalment ripetuti jekk isseħħ bidla fil-persunal tal-laboratorju.

34.   Dan it-test tal-profiċjenza ser isir fl-istess kundizzjonijiet elenkati fil-paragrafi 38 sa 40 billi ċ-ċelloli jiġu esposti għal 7 konċentrazzjonijiet li jiżdiedu ta' indutturi u inibituri qawwijin, moderati u dgħajfin kif ukoll sustanza kimika negattiva (ara t-Tabella 2). B'mod speċifiku, is-sustanzi kimiku li għandhom jiġu ttestjati jinkludu l-induttur b'saħħtu forskolin (Nru tas-CAS 66575-29-9); l-inibitur b'saħħtu prokloraz (Nru tas-CAS 67747-09-5); l-induttur moderat atrażina (Nru tas-CAS 1912-24-9); l-inibitur moderat aminoglutetimid (Nru tas-CAS 125-84-8); l-induttur dgħajjef (produzzjoni ta' E2) u inibitur dgħajjef (produzzjoni ta' T) bisfenol A (Nru tas-CAS 80-05-7); u l-gonadotropina korjonika umana tas-sustanza kimika negattiva (HCG) (Nru tas-CAS 9002-61-3) kif muri fit-Tabella 2. Isiru platti separati għas-sustanzi kimiċi kollha billi jintuża l-format kif muri fit-Tabella 6. Platt tal-QC minnhom (Tabella 4, paragrafi 36-37) għandu jkun inkluż fit-test ta' kuljum għas-sustanzi kimiċi tal-profiċjenza.

Tabella 2:

Sustanzi kimiċi tal-profiċjenza u konċentrazzjonijiet ta' esponiment

Sustanza kimika tal-profiċjenza	Konċentrazzjonijiet tat-Test [μM]
Prokloraz	0 (15), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10
Forskolin	0 (15), 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30
Atrażina	0 (15), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100
Aminoglutetimid	0 (15), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100
Bisfenol A	0 (15), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100
HCG	0 (15), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100

L-esponiment ta' H295R għal sustanzi kimiċi tal-profiċjenza għandha ssir fi platti b'24 toqba matul it-test tal-profiċjenza tal-laboratorju. Id-dożaġġ huwa f'μM għad-dożi kollha tas-sustanza kimika tat-test. Id-dożi għandhom jingħataw f'DMSO b'0,1 % v/v għal kull toqba. Il-konċentrazzjonijiet kollha tat-test għandhom jiġu ttestjati f'toqob trippli (Tabella 6). Platti separati jiġu ttestjati għal kull sustanza kimika. Platt tal-QC minnhom huwa inkluż ma' kull test ta' kuljum.

35.   L-analiżi tal-vijabbiltà taċ-ċellola u tal-ormon għandha ssir kif stipulat fil-paragrafi 42 sa 46. Il-valur limitu (l-inqas konċentrazzjoni b'effett osservata, LOEC) u d-deċiżjoni ta' klassifikazzjoni għandhom jiġu rrapportati u jitqabblu mal-valuri fit-Tabella 3. Id-dejta titqies aċċettabbli jekk tissodisfa l-LOEC u l-klassifikazzjoni tad-deċiżjoni fit-Tabella 3.

Tabella 3:

Valuri limitu (LOECs) u klassifikazzjonijiet tad-deċiżjoni għas-Sustanzi Kimiċi tal-Profiċjenza

	Nru tas-CAS	LOEC [μM]		Klassifikazzjoni tad-Deċiżjoni
		T	E2	T	E2
Prokloraz	67747-09-5	≤ 0,1	≤ 1,0	+ (16) (Inibizzjoni)	+ (Inibizzjoni)
Forskolin	66575-29-9	≤ 10	≤ 0,1	+ (Induzzjoni)	+ (Induzzjoni)
Atrażina	1912-24-9	≤ 100	≤ 10	+ (Induzzjoni)	+ (Induzzjoni)
Aminoglutetimid	125-84-8	≤ 100	≤ 100	+ (Inibizzjoni)	+ (Inibizzjoni)
Bisfenol A	80-05-7	≤ 10	≤ 10	+ (Inibizzjoni)	+ (Induzzjoni)
HCG	9002-61-3	n/a	n/a	Negattiva	Negattiva

Platti tal-Kontroll tal-Kwalità

36.   Il-platt tal-kontroll tal-kwalità (QC) jintuża biex tiġi verifikata l-prestazzjoni taċ-ċelloli H295R f'kundizzjonijiet standard tal-koltura, u biex tiġi stabbilita database storika għal konċentrazzjonijiet ta' ormoni f'kontrolli solventi, kontrolli pożittivi u negattivi, kif ukoll kejliet oħrajn tal-QC maż-żmien.

—	Il-prestazzjoni taċ-ċelloli H295R għandha tiġi vvalutata billi jintuża platt tal-QC għal kull lott ġdid mill-ATCC jew wara li tintuża ħażna ffriżata qabel ta' ċelloli għall-ewwel darba sakemm ma jkunx sar test tal-profiċjenza tal-laboratorju (paragrafi 32-34) b'dak il-lott ta' ċelloli,

—	Platt tal-QC jipprovdi valutazzjoni sħiħa tal-kundizzjonijiet tal-assaġġ (eż., il-vijabbiltà taċ-ċelloli, il-kontrolli tas-solvent, il-kontrolli negattivi u pożittivi, kif ukoll il-varjabbiltà intra u interassaġġi) meta jiġu ttestjati s-sustanzi kimiċi u għandu jkun parti minn kull test.

37.   It-test tal-QC isir fi platt b'24 toqba u jsegwi l-istess proċeduri ta' inkubazzjoni, dożaġġ, vijabbiltà/ċitotossiċità taċ-ċelloli, estrazzjoni tal-ormon u analiżi tal-ormon deskritti fil-paragrafi 38 sa 46 għall-ittestjar ta' sustanzi kimiċi. Il-platt tal-QC fih vojta, kontrolli tas-solvent, u żewġ konċentrazzjonijiet ta' induttur magħruf (forskolin, 1, 10 μM) u inibitur (prokloraz, 0,1, 1 μM) tas-sinteżi ta' E2 u T. Barra minn hekk, MeOH jintuża f'toqob magħżulin bħala kontroll pożittiv għall-assaġġ tal-vijabbiltà/ċitotossiċità. Deskrizzjoni dettajlata tat-tifsila tal-platt hija pprovdta fit-Tabella 4. Il-kriterji li għandhom jiġu ssodisfati fil-platt tal-QC huma elenkati fit-Tabella 5. Il-produzzjoni minima tal-ormon bażi għal T u E2 għandha tiġi ssodisfata kemm fil-kontroll tas-solvent kif ukoll fit-toqob vojta.

Tabella 4

Tifsira tal-platt tal-kontroll tal-kwalità għall-ittestjar tal-prestazzjoni ta' ċelloli H295R mhux esposti u ċelloli esposti għal inibituri magħrufin (PRO = prokloraz) u stimulaturi (FOR = forskolin) tal-produzzjoni ta' E2 u T. Wara li jintemm l-esperiment ta' esponiment u jitneħħa l-midjum, ser tiżdied soluzzjoni ta' metanol ta' 70 % mat-toqob kollha ta' MeOH biex isservi ta' kontroll pożittiv għaċ-ċitotossiċità (ara l-assaġġ taċ-ċitotossiċità fl-Appendiċi III tar-rapport ta' validazzjoni (4))

	1	2	3	4	5	6
A	Vojta (17)	Vojta (17)	Vojta (17)	Vojta (17) (+ MeOH) (18)	Vojta (17) (+ MeOH) (18)	Vojta (17) (+ MeOH) (18)
B	DMSO (19) 1 μl	DMSO (19) 1 μl	DMSO (19) 1 μl	DMSO (19) 1 μl (+ MeOH) (18)	DMSO (19) 1 μl (+ MeOH) (18)	DMSO (19) 1 μl (+ MeOH) (18)
C	FOR 1 μM	FOR 1 μM	FOR 1 μM	PRO 0,1 μM	PRO 0,1 μM	PRO 0,1 μM
D	FOR 10 μM	FOR 10 μM	FOR 10 μM	PRO 1 μM	PRO 1 μM	PRO 1 μM

Tabella 5

Kriterji tal-prestazzjoni għall-Platt tal-Kontroll tal-Kwalità

	T	E2
Produzzjoni bażi ta' ormon fil-kontroll solvent (SC)	≥ 5 darbiet l-LOQ	≥ 2,5 darbiet l-LOQ
Induzzjoni (10 μM forskolin)	≥ 1,5 darbiet l-SC	≥ 7,5 darbiet l-SC
Inibizzjoni (1μM prokloraz)	≤ 0,5 darbiet l-SC	≤ 0,5 darbiet l-SC

PROĊEDURA TA' ESPONIMENT GĦAL SUSTANZA KIMIKA

38.   Iċ-ċelloli preinkubati jitneħħew mill-inkubatur (paragrafu 21) u jiġu kkontrollati taħt mikroskopju biex jiġi żgurat li huma f'kundizzjoni tajba (kemm qabdu, il-morfoloġija) qabel id-dożaġġ.

39.   Iċ-ċelloli jitqiegħdu f'kabina tal-bijosikurezza u l-midjum supplimentat jitneħħa u jinbidel ma' midjum supplimentat ġdid (1 ml/toqba). DMSO huwa s-solvent ippreferut għal dan il-metodu ta' ttestjar. Madankollu, jekk hemm raġunijiet sabiex jintużaw solventi oħrajn, għandha tiġi deskritta r-raġuni xjentifika. Iċ-ċelloli huma esposti għas-sustanza kimika ta' ttestjar b'żieda ta' 1 μl tas-soluzzjoni tal-ħażna xierqa fid-DMSO (ara l-Appendiċi II tar-rapport ta' validazzjoni (4)) għal kull 1 ml midjum supplimentat (volum tat-toqba). Dan jirriżulta f'konċentrazzjoni finali ta' 0,1 % DMSO fit-toqob. Biex jiġi żgurat taħlit adegwat, ġeneralment huwa ppreferut li s-soluzzjoni tal-ħażna xierqa tas-sustanza kimika tat-test fid-DMSO titħallat ma' midjum supplimentat biex tinkiseb il-konċentrazzjoni finali mixtieqa għal kull doża, u t-taħlita tiżdied ma' kull toqba eżatt wara t-tneħħija tal-midjum il-qadim. Jekk tintuża din l-għażla, il-konċentrazzjoni tad-DMSO (0,1 %) għandha tibqa' konsistenti bejn it-toqob kollha. It-toqob li fihom l-ikbar żewġ konċentrazzjonijiet jiġu vvalutati viżwalment għal formazzjoni ta' preċipitati jew dardir bħala indikazzjoni ta' solubilità inkompluta tas-sustanza kimika tat-test billi jintuża sterjomikroskopju. Jekk jiġu osservati dawn il-kundizzjonijiet (dardir, formazzjoni ta' preċipitati), it-toqob li fihom l-inqas konċentrazzjonijiet li jmiss jiġu eżaminati wkoll (u l-bqija) u l-konċentrazzjonijiet li ma ddaħħlux kompletament fis-soluzzjoni għandhom jiġu esklużi minn evalwazzjoni u analiżi ulterjuri. Il-platt jittieħed lura fl-inkubatur f'37 °C f'5 % CO2 f'atmosfera tal-arja għal 48 siegħa. It-tifsila tal-platt tas-sustanza kimika tat-test tintwera fit-Tabella 6. Il-ħażniet 1 -7 juru tfassil b'dożijiet li jiżdiedu tas-sustanza kimika tat-test.

Tabella 6

Skematika tad-dożaġġ għall-esponiment ta' ċelloli H295R biex jiġu ttestjati sustanzi kimiċi fi platt b'24 toqba

	1	2	3	4	5	6
A	DMSO	DMSO	DMSO	Ħażna 4	Ħażna 4	Ħażna 4
B	Ħażna 1	Ħażna 1	Ħażna 1	Ħażna 5	Ħażna 5	Ħażna 5
C	Ħażna 2	Ħażna 2	Ħażna 2	Ħażna 6	Ħażna 6	Ħażna 6
D	Ħażna 3	Ħażna 3	Ħażna 3	Ħażna 7	Ħażna 7	Ħażna 7

40.   Wara 48 siegħa, il-platti ta' esponiment jitneħħew mill-inkubatur u kull toqba tiġi kkontrollata taħt il-mikroskopju għall-kundizzjoni taċ-ċelloli (kemm qabdu, il-morfoloġija, il-grad ta' konfluwenza) u sinjali ta' ċitotossiċità. Il-midjum minn kull toqba jinqasam f'żewġ ammonti ndaqs (madwar 490 μl kull wieħed) u jiġi ttrasferit f'żewġ kunjetti separati mmarkati kif xieraq (jiġifieri alikwota waħda biex jiġi pprovdut kampjun ta' riżerva għal kull toqba). Biex jiġi evitat milli jinxfu ċ-ċelloli, il-midjum jitneħħa ringiela, ringiela jew kolonna, kolonna u jiġi sostitwit ma' midjum għall-assaġġ tal-vijabbiltà/ċitotossiċità taċ-ċelloli. Jekk il-vijabbiltà/ċitotossiċità taċ-ċelloli ma titkejjilx mill-ewwel, jiżdied 200 μl PBS b'Ca2+ u Mg2+ f'kull toqba. Il-midjums jiġu ffriżati f'– 80 °C sa ma jsir iktar ipproċessar biex jiġu analizzati l-konċentrazzjonijiet tal-ormoni (ara l-paragrafi 44-46). Filwaqt li T u E2 f'midjum miżmum f'– 80 °C huma ġeneralment stabbli għal tal-inqas 3 xhur, l-istabbiltà tal-ormoni matul il-ħżin għandha tiġi dokumentata fi ħdan kull laboratorju.

41.   Eżatt wara li jitneħħa l-midjum, jiġu determinati l-vijabblità/ċitotossiċità taċ-ċelloli għal kull platt ta' esponiment.

Determinazzjoni tal-Vijabbiltà taċ-Ċelloli

42.   Assaġġ tal-vijabbiltà/ċitotossiċità taċ-ċelloli tal-għażla tista' tintuża biex jiġi determinat l-impatt potenzjali tas-sustanza kimika tat-test fuq il-vijabbiltà taċ-ċelloli. L-assaġġ għandu jkun jista' jipprovdi kejl veru tal-perċentwal ta' ċelloli vijabbil preżenti f'toqba, jew għandu jintwera li dan huwa direttament paragunabbli (funzjoni lineari ta') mal-Assaġġ Live/Dead® (ara l-Appendiċi III tar-rapport ta' validazzjoni (4)). Assaġġ alternattiv li ntwera li jaħdem daqstantieħor huwa t-test MTT [3-(4,5-dimetiltjażol-2-yl)-2,5-difenil tetrażolju bromur] (18). Il-valutazzjoni tal-vijabbiltà taċ-ċelloli bl-użu tal-metodi ta' hawn fuq hija kejl relattiv li mhux bilfors juri relazzjonijiet lineari man-numru assolut ta' ċelloli f'toqba. Għalhekk, l-analist għandu jagħmel valutazzjoni viżwali parallela soġġettiva ta' kull toqba, u għandhom jittieħdu ritratti diġitali tal-SCs u tal-ikbar żewġ konċentrazzjonijiet mhux tossiċi li mbagħad jiġu arkivjati biex tkun tista' ssir valutazzjoni iktar tard tad-densità vera taċ-ċelloli jekk ikun hemm bżonn. Jekk spezzjoni viżwali jew kif muri mill-assaġġ tal-vijabbiltà/ċitotossiċità jidher li hemm żieda fin-numru ta' ċelloli, iż-żieda apparenti trid tiġi verifikata. Jekk tiġi verifikata żieda fin-numri ta' ċelloli, din għandha tiġi ddikjarata fir-rapport tat-test. Il-vijabbiltà taċ-ċelloli ser tingħata b'mod relattiv għar-rispons medju fl-SCs, li jitqies li huwa ċelloli vijabbli 100 %, u hija kkalkolata kif xieraq għall-assaġġ tal-vijabbiltà/ċitotossiċità taċ-ċeloli li jintuża. Għall-assaġġ tal-MTT, tista' tintuża l-formula li ġejja:

% ċelloli vijabbli = (rispons fit-toqba – rispons medju f'toqob mogħtija MeOH [= 100 % mejtin]) ÷ (rispons medju f'toqob SC – rispons medju f'toqob mogħtija MeOH [= 100 % mejtin])

43.   Toqob b'varjabbiltà inqas minn 80 %, relatati mal-vijabbiltà medja fl-SCs (= 100 % vijabbiltà), ma għandhomx ikunu inklużi fl-analiżi tad-dejta finali. L-inibizzjoni tal-isterojdoġenesi li sseħħ fil-preżenza ta' kważi 20 % ċitotossiċità għandha tiġi evalwata bir-reqqa biex jiġi żgurat li ċ-ċitotossiċità mhijiex il-kawża għall-inibizzjoni.

Analiżi tal-Ormoni

44.   Kull laboratorju jista' juża sistema ta' kejl tal-ormoni tal-għażla tiegħu għall-analiżi ta' T u E2. Jistgħu jintużaw alikwoti ta' riżerva ta' midjum minn kull grupp tal-kura biex jitħejjew dilwizzjonijiet ħalli l-konċentrazzjoni tiġi fi ħdan il-parti lineari tal-kurva standard. Kif osservat fil-paragrafu 29, kull laboratorju għandu juri l-konformità tas-sistema ta' kejl tal-ormoni tiegħu (eż., ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) mal-kriterji tal-QC billi janalizza midjum supplimentat miżjud b'kontroll tal-ormon intern qabel ma jwettaq testijiet tal-QC jew ittestjar ta' sustanzi kimiċi. Sabiex jiġi żgurat li l-komponenti tas-sistema tat-test ma jxekklux il-kejl tal-ormoni, l-ormoni jista' jkollhom bżonn jiġu estrattati mill-midjums qabel ma jitkejlu (ara l-paragrafu 30 għall-kundizzjonijiet li fihom ikun hemm jew ma jkunx hemm bżonn estrazzjoni). Huwa rakkomandat li ssir estrazzjoni wara l-proċeduri fl-Appendiċi III tar-rapport ta' validazzjoni (4).

45.   Jekk qed tintuża kitt kummerċjali tat-testijiet biex titkejjel il-produzzjoni tal-ormoni, l-analiżi tal-ormoni għandha ssir kif speċifikat fil-manwali pprovduti mill-manifattur tal-kitt tat-testijiet. Ħafna mill-manifatturi għandhom proċedura unika li biha jsiru l-analiżijiet tal-ormoni. Id-dilwizzjonijiet tal-kampjuni jridu jiġu aġġustati b'tali mod li l-konċentrazzjonijiet mistennija tal-ormoni għall-kontrolli tas-solvent jaqgħu fi ħdan iċ-ċentru tal-medda lineari tal-kurva standard tal-assaġġ individwali (Appendiċi III tar-rapport ta' validazzjoni (4)). Valuri li jaqgħu barra s-sehem lineari tal-kurva standard għandhom jiġu rrifjutati.

46.   Il-konċentrazzjonijiet tal-ormoni finali huma kkalkolati kif ġej:

Eżempju:

Estratti:	450 μl midjum
Rikostitwiti f':	250 μl bafer tal-assaġġ
Dilwizzjoni fl-Assaġġ:	1:10 (biex il-kampjuni jiġi fi ħdan il-medda lineari tal-kurva standard)
Konċentrazzjoni ta' Ormoni fl-Assaġġ:	150 pg/ml (diġà aġġustata għall-konċentrazzjoni għal kull ml tal-kampjun fl-assaġġ)
Irkupru:	89 %
Konċentrazzjoni tal-ormoni finali =	(Konċentrazzjoni tal-ormoni (għal kull ml) ÷ irkupru) (fattur ta' dilwizzjoni)
Konċentrazzjoni tal-ormoni finali =	(150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 10 = 936,3 pg/ml

Għażla tal-konċentrazzjonijiet tat-test

47.   Għandhom isiru tal-inqas żewġ testijiet indipendenti tal-assaġġ. Sakemm informazzjoni preċedenti dwar il-limitu ta' solubilità jew iċ-ċitotossiċità ma tipprovdix bażi għall-għażla tal-konċentrazzjonijiet tat-test, huwa rakkomandat li l-konċentrazzjonijiet tat-test għall-ewwel test ikollhom intervalli ta' log10 b'10-3 M li tkun il-konċentrazzjoni massima. Jekk is-sustanza kimika hija solubbli, u mhux ċitotossika fl-ebda mill-konċentrazzjonijiet ittestjati, u l-ewwel test ikun negattiv għall-konċentrazzjonijiet kollha, mela dan irid jiġi kkonfermat f'test wieħed jew iktar billi jintużaw l-istess kundizzjonijiet bħal dawk fl-ewwel test li sar (Tabella 7). Jekk ir-riżultati tal-ewwel test huma ekwivoċi (jiġifieri l-bidla ta' drabi hija statistikament sinifikanti mill-SC f'konċentrazzjoni waħda biss) jew pożittivi (jiġifieri l-bidla ta' drabi f'żewġ konċentrazzjonijiet maġenb jew iktar hija statistikament sinifikanti), it-test għandu jiġi ripetut kif indikat fit-Tabella 7 billi jiġu rfinati l-konċentrazzjonijiet tat-test magħżulin. Il-konċentrazzjonijiet tat-test fit-tieni u t-tielet test (jekk applikabbli) għandhom jiġu aġġustati fuq il-bażi tar-riżultati tal-konċentrazzjonijiet parentesi li ġew ittestjati inizjalment li kkaġunaw effeett billi ntuża intervall ta' konċentrazzjoni ta' 1/2-log (eż., jekk it-test oriġinali ta' 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1 000 μM irriżulta f'induzzjonijiet b'1 u 10 μM, il-konċentrazzjonijiet ittestjati fit-tieni test għandhom ikunu 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μM), sakemm ma jkunx hemm bżonn li jintużaw konċentrazzjonijiet inqas biex jinkiesb LOEC. Fl-aħħar każ, tal-inqas ħames konċentrazzjonijiet taħt l-inqas konċentrazzjoni ttestjata fl-ewwel test għandhom jintużaw fit-tieni test billi tintuża skala ta' 1/2-log. Jekk it-tieni test ma jikkonfermax l-ewwel test (jiġifieri l-importanza statistika ma sseħħx fil-konċentrazzjoni li qabel ittestjat pożittiva, inkrement tal-konċentrazzjoni ta' ± 1), għandu jsir it-tielet esperiment billi jintużaw il-kundizzjonijiet oriġinali ta' ttestjar. Riżultati ekwivoċi fl-ewwel test jitqiesu negattivi jekk l-effett osservat ma jkunx jista' jiġi kkonfermat fl-ebda wieħed miż-żewġ testijiet ta' wara. Riżultati ekwivoċi jitiqesu risponsi (effett) pożittivi meta r-rispons ikun jista' jiġi kkonfermat f'tal-inqast testieħor fi ħdan inkrement tal-konċentrazzjoni ta' ± 1 (ara t-taqsima 55 għall-Proċedura ta' Interpretazzjoni tad-Dejta).

Tabella 7

Matriċi tad-deċiżjonijiet għal xenarji ta' eżitu possibbli

Test 1	Test 2		Test 3		Deċiżjoni
Xenarju	Deċiżjoni	Xenarju	Deċiżjoni	Xenarju	Pożittiva	Negattiva
Negattiv	Konferma (20)	Negattiv	Waqfa			X
Negattiv	Konferma (20)	Pożittiv	Irfinar (21)	Negattiv		X
Ekwivoku (22)	Irfinar (21)	Negattiv	Konferma (20)	Negattiv		X
Ekwivoku (22)	Irfinar (21)	Negattiv	Konferma (20)	Pożittiv	X
Ekwivoku (22)	Irfinar (21)	Pożittiv			X
Pożittiv	Irfinar (21)	Negattiv	Konferma (20)	Pożittiv	X
Negattiv	Konferma (20)	Pożittiv	Irfinar (21)	Pożittiv	X
Pożittiv	Irfinar (21)	Pożittiv	Waqfa		X

Kontroll tal-Kwalità tal-Platt tat-Test

48.   Minbarra l-ilħuq tal-kriterji għall-platt tal-QC, għandhom jiġu ssodisfati kriterji oħrajn tal-kwalità li jappartjenu għal varjazzjoni aċċettabbli bejn toqob replikati, esperimenti replikati, linearità u sensittività tas-sistemi ta' kejl tal-ormoni, varjabbiltà bejn kejliet replikati tal-ormini tal-istess kampjun, u rkupru tal-perċentwal ta' żidiet mal-ormoni wara estrazzjoni tal-midjum (jekk applikabbli; ara l-Paragrafu 30 rigward ir-rekwiżiti ta' estrazzjoni) u dawn huma pprovduti fit-Tabella 8. Id-dejta għandha tkun taqa' fi ħdan il-meded aċċettabbli definiti għal kull parametri li għandu jitqies għal evalwazzjoni ulterjuri. Jekk dawn il-kriterji ma jkunux issodisfati, l-ispreadsheet għandha tinnota li l-kriterji tal-QC ma ġewx issodisfati għall-kampjun inkwistjoni, u li l-kampjun għandu jerġa' jerġa' jiġi analizzat jew jitneħħa mis-sett tad-dejta.

Tabella 8

Meded u/jew varjazzjoni aċċettabbli (%) għall-parametri tal-platt tat-test tal-assaġġ ta' H295R

(LOQ: Limitu ta' Kwantifikazzjoni tas-sistema ta' mmaniġġjar tal-ormoni. CV: Koeffiċjent tal-varjazzjoni; SC: Kontroll tas-Solvent; DPM: Diżintegrazzjonijiet fil-minuta)

	Tqabbil Bejn	T	E2
Produzzjoni tal-ormoni bażi f'SCs	Darbiet ikbar mil-LOQ	≥ 5 darbiet iktar	≥ 2,5 darbiet iktar
Esperimenti tal-Esponiment — Fi ħdan is-CV tal-Platt għal SCs (Toqob Replikati)	Konċentrazzjonijiet Assoluti	≤ 30 %	≤ 30 %
Esperimenti tal-Esponiment — Bejn CV tal-Platt għal SCs (Esperimenti Replikati)	Bidla fi Drabi Ikbar	≤ 30 %	≤ 30 %
Sistema ta' Kejl tal-Ormoni — Sensittività	Tnaqqis fi drabi identifikabbli relatat mal-SC	≥ 5 darbiet inqas	≥ 2,5 darbiet inqas
Sistema ta' Kejl tal-Ormoni — CV tal-Kejl Replikat għal SCs (23)	Konċentrazzjonijiet Assoluti	≤ 25 %	≤ 25 %
Estrazzjoni tal-Midjum — Irkupru tal-Istandard Intern 3H (Jekk Applikabbli)	DPM	≥ 65 % Nominali

ANALIŻI U RAPPORTAR TAD-DEJTA

Analiżi tad-Dejta

49.   Biex jiġu evalwati ż-żieda/it-tnaqqis relatati fi produzzjoni tal-ormoni kumikament alterata, ir-riżultati għandhom jiġu normalizzati għall-valur medju tal-SC ta' kull platt tat-test, u r-riżultati espressi bħala bidliet relatati mal-SC f'kull platt tat-test. Id-dejta kollha għandha tiġi espressa bħala devjazzjoni standard (SD) medja ta' ± 1.

50.   Dejta dwar l-ormoni mit-toqob fejn iċ-ċitotossiċità kienet inqas minn 20 % biss għandha tkun inkluża fl-analiżi tad-dejta. Il-bidliet relatati għandhom jiġu kkalkolati kif ġej:

Bidla Relattiva = (Konċentrazzjoni ta' ormoni f'kull toqba) ÷ (Konċentrazzjoni medja tal-ormoni fit-toqob kollha ta' kontroll tas-solvent).

51.   Jekk permezz ta' spezzjoni viżwali tat-toqba jew kif muri mill-assaġġ tal-vijabbiltà/ċitotossiċità deskritti fil-paragrafu 42 jidher li hemm żieda fin-numru ta' ċelloli, iż-żieda apparenti trid tiġi verifikata. Jekk tiġi verifikata żieda fin-numri taċ-ċelloli, din għandha tiġi ddikjarata fir-rapport tat-test.

52.   Qabel ma jsiru analiżijiet statistiċi, għandhom jiġu evalwati s-suppożizzjonijiet tan-normalità u l-omoġenità tal-varjanza. In-normalità għandha tiġi evalwata billi jintużaw plots standard tal-probabilità jew metodu statistiku xieraq ieħor (eż., test ta' Shapiro-Wilk). Jekk normalment ma ssirx distribuzzjoni tad-dejta (bidliet fi drabi), għandu jsir tentattiv ta' trasformazzjoni tad-dejta biex tkun approssimata distribuzzjoni normali. Jekk normalment issir distribuzzjoni jew tiġi approssimata distribuzzjoni normali tad-dejta, id-differenzi bejn il-gruppi ta' konċentrazzjoni tas-sustanza kimika u l-SCs għandhom jiġu analizzati billi jintuża test parametriku (eż., it-Test ta' Dunnett) bil-konċentrazzjoni li hija l-varjabbli indipendenti, u r-rispons (bidla fi drabi) il-varjabbli dipendenti. Jekk normalment id-dejta ma tiġix distribwita, għandu jintuża test xieraq mhux parametriku (eż., it-test ta' Kruskal Wallis, it-test Steel's Many-one rank). Id-differenzi jitqiesu sinifikanti f'p ≤ 0,05. L-evalwazzjonijiet statistiċi jsiru fuq il-bażi tal-valuri medji għal kull toqba li jirrappreżentaw punti ta' dejta replikati indipendenti. Huwa antiċipat li minħabba l-intervall kbir tad-dożi fl-ewwel test (skala log10) f'ħafna każijiet mhuwiex ser ikun possibbli li jiġu deskritti relazzjonijiet ċari bejn il-konċentrazzjoni u r-rispons fejn l-ikbar żewġ dożi ser ikunu fis-sehem lineari tal-kurva sigmojde. Għaldaqstant, għall-ewwel test jew kwalunkwe sett ta' dejta ieħor fejn isseħħ din il-kundizzjoni (eż., fejn ma tkun tista' tiġi stmata ebda effikaċja massima), ser jiġu applikati statistiki varjabbli fissi tat-tip I kif deskritti iktar 'il fuq.

53.   Jekk ikun hemm iktar minn żewġ punti ta' dejta fis-sehem lineari tal-kurva u meta jkunu jistgħu jiġu kkalkolati l-effikaċji massimi — kif inhu antiċipat għal uħud mit-tieni testijiet li jsiru billi jintuża intervall semi-log ta' konċentrazzjonijiet ta' esponiment — għandu jintuża mudell ta' rigressjoni probit, logit jew ieħor xieraq biex jiġu kkalkolati l-konċentrazzjonijiet effettivi (eż., EC50 u EC20).

54.   Għandhom jiġu pprovduti riżultati kemm f'format grafiku (graffs bil-kolonni li jirrappreżentaw l-SD medja +/- 1) u f'tabella (LOEC/NOEC, direzzjoni tal-effett, u l-qawwa tar-rispons massimu li hija parti mis-sehem doża-rispons tad-dejta) (ara l-Figura 3 għal eżempju). Valutazzjoni tad-dejta titqies valida biss jekk tkun ġiet ibbażata fuq tal-inqas żewġ testijiet li jkunu saru b'mod indipendenti. Esperiment jew test jitqies importanti jekk ikun sar f'data differenti billi jintuża sett ġdid ta' soluzzjonijiet u kontrolli. Il-medda ta' konċentrazzjoni użata fit-testijiet 2 u 3 (jekk ikun hemm bżonnhom) tista' titfassal fuq il-bażi tar-riżultati tat-test 1 biex tiġi definita aħjar il-medda doża-rispons li fiha l-LOEC (ara l-paragrafu 47).

Figura 3

Eżempju tal-preżentazzjoni u l-evalwazzjoni tad-dejta miksuba matul it-twettiq tal-Assaġġ ta' H295R f'format grafiku u tabulari.

(L-asteriski jindikaw differenzi statistikament sinifikanti mill-kontroll tas-solvent (p< 0,05). (LOEC: L-inqas konċentrazzjoni effettiva osservata; Bidla Mass: Saħħa massima tar-rispons osservat fi kwalunkwe konċentrazzjoni relatata mar-rispons medju tal-SC (= 1))

Sustanza Kimika	LOEC	Bidla Mass
Forskolin	0,01	0,15-il darba
Letrożol	0,001	29 darba

Proċedura ta' Interpretazzjoni tad-Dejta

55.   Sustanza kimika tat-test tiġi ġġudikata pożittiva jekk l-induzzjoni bi drabi tkun statistikament differenti (p ≤ 0,05) mill-kontroll tas-solvent f'żewġ konċentrazzjonijiet maġenb xulxin f'tal-inqas żewġ testijiet indipendenti (Tabella 7). Sustanza kimika tat-test tiġi ġġudikata negattiva wara żewġ testijiet negattivi indipendenti, jew fi tliet testijiet, li jinvolvu żewġ testijiet negattivi u test ekwivoku jew pożittiv. Jekk id-dejta ġġenerata fi tliet esperimenti indipendenti ma tissodisfax il-kriterji ta' deċiżjoni elenkati fit-Tabella 7, ir-riżultati tal-esperiment ma jkunux interpretabbli. Ir-riżultati f'konċentrazzjonijiet li jaqbżu l-limitu tas-solubilità jew f'konċentrazzjonijiet ċitotossiċi ma għandhomx ikunu inklużi fl-interpretazzjoni tar-riżultati.

Rapport tat-Test

56.   Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Faċilità ta' ttestjar

—	Isem il-faċilità u l-post,

—	Id-direttur tal-istudju u persunal ieħor u r-responsabilitajiet ta' studju tiegħu,

—	Id-dati li fihom beda u ntemm l-istudju.

Sustanza kimika tat-test, reaġenti u kontrolli

—	L-identità (isem/Nru tas-CAS kif xieraq), is-sors, in-numru tal-lott, il-purità, il-fornitur, u l-karatterizzazzjoni tas-sustanza kimika tat-test, ir-reaġenti u l-kontrolli,

—	L-għamla fiżika u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tas-sustanza kimika tat-test,

—	Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-metodu tal-frekwenza tat-tħejjija tas-sustanzi kimiċi tat-test, ir-reaġenti u l-kontrolli,

—	L-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test.

Ċelloli

—	Is-sors u t-tip ta' ċelloli,

—	In-numru ta' mogħdijiet taċ-ċelloli (identifikatur tal-mogħdijiet taċ-ċelloli) taċ-ċelloli użati fit-test,

—	Deskrizzjoni tal-proċeduri għall-manutenzjoni tal-kolturi taċ-ċelloli.

Rekwiżiti ta' qabel l-ittestjar (jekk applikabbli)

—	Deskrizzjoni u riżultati tat-test ta' interferenza tal-assaġġ tal-ormoni mas-sustanza kimiċi,

—	Deskrizzjoni u riżultati tal-kejliet tal-effiċjenza tal-estrazzjoni tal-ormoni,

—	Il-kurvi standard u ta' kalibrazzjoni għall-assaġġi analitiċi li għandom ikunu inklużi,

—	Il-limiti ta' identifikazzjoni għall-assaġġi analitiċi magħżulin,

Kundizzjonijiet tat-test

—	Il-kompożizzjoni tal-midjums,

—	Il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test,

—	Id-densità taċ-ċelloli (konċentrazzjonijiet stmati jew imkejlin taċ-ċelloli wara 24 u 48 siegħa),

—	Is-solubilità tas-sustanza kimika tat-test (limitu tas-solubilità, jekk determinat),

—	Il-ħin u l-kundizzjonijiet ta' inkubazzjoni.

Riżultati tat-test

—	Dejta mhux ipproċessata għal kull toqba għal kontrolli u sustanzi kimiċi tat-test--kull kejl replikat fil-forma ta' dejta oriġinali pprovduta mill-istrument użat biex titkejjel il-produzzjoni tal-ormoni (eż., OD, unitajiet tal-fluworexxenza, DPM, eċċ.),

—	Il-validazzjoni tan-normalità jew l-ispjegazzjoni tat-trasformazzjoni tad-dejta;

—	Ir-risponsi medji +/- 1 SD għal kull toqba mkejla,

—	Dejta dwar iċ-ċitotossiċità (konċentrazzjonijiet tat-test li kkaġunaw ċitotossiċità),

—	Konferma li ġew issodisfati r-rekwiżiti tal-QC,

—	Il-bidla relattiva mqabla mal-kontroll tas-solventi kkoreġut għaċ-ċitotossiċità,

—	Graff bil-kolonni li juri relattiv (bidla ta' drabi) f'kul konċentrazzjoni, SD u sinifikanza statistika kif spjegat fil-paragrafu 49-54.

Interpretazzjoni tad-dejta

—	Applikazzjoni tal-proċedura ta' interpretazzjoni tad-dejta għar-riżultati u diskussjoni tas-sejbiet,

Diskussjoni

—	Hemm xi indikazzjoni mill-istudju dwar il-possibilità li d-dejta dwar T/E2 tista' tkun influwenzata minn effetti indiretti fuq il-mogħdijiet glukokortikojdi u mineralikortikojdi?

Konklużjonijiet

TAGĦRIF

(1)

OECD (2002), OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals, fl-Appendiċi 2 għall-Kapitolu B.54 ta' dan l-Anness.

(2)

Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, R. and Giesy, J.P. (2006), Human adrenocarcinoma (H295R) cells for rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone production, Toxicol. Appl. Pharmacol., 217, 114-124.

(3)

Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, J. P. (2007), The OECD validation program of the H295R steroidgenesis assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies. Env. Sci. Pollut. Res., 14, 23 — 30.

(4)

OECD (2010), Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production, OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/MONO(2010)31, Pariġi. Disponibbli fuq [http://www.oecd.org/document/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1,00.html]

(5)

OECD (2010), Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for Steroidogenesis, OECD Series of Testing and Assessment No. 133, ENV/JM/MONO(2010)32, Pariġi. Disponibbli fuq: [http://www.oecd.org/document/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1,00.html]

(6)

Battelle (2005), Detailed Review Paper on Steroidogenesis, Disponibbli fuq: [http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_final_3_29_05.pdf]

(7)

Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004), Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroidogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR, Toxicol. Sci., 81, 78-89.

(8)

Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. (2002), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells, Toxicol. Appl. Pharmacol., 182, 44-54.

(9)

Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. (2010), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model development for metyrapone, Environ. Health Perspect., 118: 265-272.

(10)

Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell line, Environ. Sci. Poll. Res., 17:1137-1148.

(11)

Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990), Establishment and characterization of a human adrenocortical carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid biosynthesis, Cancer Res., 50, 5488-5496.

(12)

He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010), Ozonation attenuates the steroidogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in the H295R cell line, Chemosphere, 80:578-584.

(13)

Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. and Giesy, J.P. (2005), Quantitative RT-PCR methods for evaluating toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line, Environ. Sci. Technol., 39:2777-2785.

(14)

Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 and T production using the H295R cell line, Environ. Sci. Pol. Res., 17:1137-1148.

(15)

Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids, J. Clin. Endocrinol. Metab., 77, 731-737.

(16)

Il-Kapitolu B.55 ta' dan l-Anness: Bijoassaġġ Hershberger f'Firien: Assaġġ ta' Tgħarbil ta' Terminu Qasir għal Proprjetajiet (Anti)Androġeniċi.

(17)

Shapiro, R., and Page, L.B. (1976), Interference by 2,3-dimercapto-1-propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay, J. Lab. Clin. Med., 2, 222-231.

(18)

Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods., 65, 55-63.

(19)

Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). Biochemical differences between rat and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs of these two species, Biochemistry. 38:1598-1606.

(20)

Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006), Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 26:484-492.

B.58.   ASSAĠĠI TAL-MUTAZZJONI TAL-ĠENI SOMATIĊI U TAĊ-ĊELLOLI TAL-ĠERMI TA' RODITURI TRANSĠENIĊI

INTRODUZZJONI

1.   Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-Linja Gwida tal-OECD dwar it-Testijiet (TG) Nru 488 (2013). Il-metodi ta' ttestjar tal-UE huma disponibbi għal firxa wiesgħa ta' assaġġi tal-mutazzjoni in vitro li kapaċi jidentifikaw mutazzjonijiet fil-kromożomi u/jew fil-ġeni. Hemm metodi ta' ttestjar għal punti aħħarin in vivo (jiġifieri aberrazzjonijiet tal-kromożomi u sinteżi mhux skedata tad-DNA); madankollu, dawn ma jkejlux il-mutazzjonijiet tal-ġeni. Assaġġi tal-mutazzjoni ta' Rodituri Transġeniċi (TGR) jissodisfaw il-bżonn ta' testijiet in vivo prattiċi u disponibbli b'mod komuni għal mutazzjonijiet ta' ġeni.

2.   L-assaġġi tal-mutazzjoni ta' TGR ġew analizzati b'mod estensiv (24)(33). Jużaw firien u ġrieden transġeniċi li fihom bosta kopji ta' vetturi plażmidi integrati b'mod kromożomali jew phage shuttle. It-transġeni fihom ġeni rapportaturi għall-identifikazzjoni ta' bosta tipi ta' mutazzjonijiet ikkaġunati in vivo mis-sustanzi kimiċi tat-test.

3.   Mutazzjonijiet li jfeġġu f'roditur jingħataw punteġġ billi jiġi rkuprat it-transġene u jiġi analizzat il-fenotip tal-ġene rapportatur f'ospitant batterjali defiċjenti għall-ġene rapportatur. L-assaġġi tal-mutazzjoni tal-ġeni ta' TGR ikejlu mutazzjonijiet ikkaġunati f'ġeni ġenetikament newtrali rkuprati minn prattikament kwalunkwe tessut tar-roditur. Għalhekk, dawn l-assaġġi jgħelbu ħafna mil-limitazzjonijiet eżistenti assoċjati mal-istudju ta' mutazzjoni tal-ġeni in vivo f'ġeni endoġeni (eż. tessuti limitati xierqa għal analiżi, għażla negattiva/pożittiva kontra mutazzjonijiet).

4.   Il-piż tal-evidenza jissuġġerixxi li t-transġeni jwieġbu għall-mutaġeni b'mod simili għal ġeni endoġeni, speċjalment fir-rigward tal-identifikazzjoni ta' sostituzzjonijiet ta' pari bażi, mutazzjonijiet fil-bidla tal-qafas, u tħassiriet u tidħiliet żgħar(24).

5.   Il-Workshops Internazzjonali dwar l-Ittestjar tal-Ġenotossiċità (IWGT) approvaw l-inklużjoni tal-assaġġi tal-mutazzjoni tal-ġeni ta' TGR għall-identifikazzjoni in vivo ta' mutazzjonijiet fil-ġeni, u rrakkomandaw protokoll għall-implimentazzjoni tagħhom (15)(29). Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat fuq dawn ir-rakkomandazzjonijiet. Analiżi ulterjuri li ssostni l-użu ta' dan il-protokoll tista' tinkiseb f'(16).

6.   Huwa anċipat li fil-ġejjieni jista' jkun possibbli li assaġġ tal-mutazzjoni tal-ġeni ta' TGR jingħaqad ma' studju tat-tossiċità tad-doża ripetuta (Kapitolu B.7 ta' dan l-Anness). Madankollu, hemm bżonn ta' dejta biex jiġi żgurat li s-sensittività tal-assaġġi tal-mutazzjoni tal-ġeni ta' TGR mhijiex affettwata mill-perjodu iqsar ta' żmien ta' jum bejn tmiem il-perjodu ta' għoti u l-ħin tal-kampjunar, kif użat fl-istudju tat-tossikoloġija b'doża ripetuta, imqabbel mat-3 ijiem użati fl-assaġġi tal-mutazzjoni tal-ġeni ta' TGR. Hemm bżonn dejta wkoll biex tindika li l-prestazzjoni tal-assaġġ b'doża ripetuta mhijiex affettwata b'mod avvers billi ntużat razza ta' rodituri transġeniċi minflok razez ta' rodituri tradizzjonali. Meta din id-dejta tkun disponibbli, dan il-metodu ta' ttestjar ser jiġi aġġornat.

7.   Id-definizzjonijiet tat-termini ewlenin huma stabbiliti fl-Appendiċi.

KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI

8.   L-assaġġi tal-mutazzjoni tal-ġeni ta' TGR li għalihom hemm disponibbli biżżejjed dejta biex issostni l-użu tagħhom f'dan il-metodu ta' ttestjar huma: ġurdien batterjofago lacZ (Muta™Mouse); ġurdien plażmidu lacZ; ġurdien u far gpt delta (gpt u Spi– ); ġurdien u far lacI (Big Blue®), kif isiru f'kundizzjonijiet standard. Barra minn hekk, l-assaġġ ta' għażla pożittiva cII jista' jintuża għall-evalwazzjoni ta' mutazzjonijiet fil-mudelli Big Blue® u Muta™Mouse. Normalment, il-mutaġenesi fil-mudelli ta' TGR tiġi vvalutata bħala frekwenza tal-mutanti; madankollu, jekk ikun hemm bżonn, analiżi molekolari tal-mutazzjonijiet tista' tipprovdi iktar informazzjoni (ara l-paragrafu 24).

9.   Dawn it-testijiet ta' mutazzjoni tal-ġeni in vivo fuq rodituri huma speċjalment rilevanti għall-valutazzjoni tal-periklu mutaġeniku peress li r-risponsi tal-assaġġi huma dipendenti fuq metaboliżmu in vivo, farmakokinetika, proċessi ta' tiswija tad-DNA, u sinteżi tat-transleżjoni tad-DNA, għad li dawn jistgħu jvarjaw bejn l-ispeċi, bejn it-tessuti u bejn it-tipi ta' ħsara fid-DNA. Assaġġ in vivo għal mutazzjonijiet tal-ġeni huwa utli għal investigazzjoni ulterjuri ta' effett mutaġeniku identifikat minn sistema in vitro, u bħala segwitu għar-riżultati tat-testijiet billi jintużaw punti aħħarin in vivo oħrajn (24). Minbarra li hija assoċjata b'mod kawżali mal-induzzjoni tal-kanċer, il-mutazzjoni tal-ġeni hija punt aħħari rilevanti għat-tbassir ta' mard mhux kanċeruż ibbażat fuq mutazzjoni f'tessuti somatiċi (12)(13) kif ukoll mard trasmess permezz tal-linja ġerminali.

10.   Jekk hemm evidenza li s-sustanza kimika tat-test, jew metabolita rilevanti, ma hi ser tilħaq ebda tessut ta' interess, ma jkunx xieraq li jsir assaġġ tal-mutazzjoni tal-ġeni ta' TGR.

IL-PRINĊIPJU TAT-TEST

11.   Fl-assaġġi deskritti fil-paragrafu 8, il-ġene fil-mira huwa ta' oriġini batterjali jew batterjofaga, u l-mezz ta' rkupru mid-DNA ġenomika tar-rodituri huwa permezz ta' inkorproazzjoni tat-transġene f'vettur batterjofagu λ jew vettur shuttle plażmid. Il-proċedura tinvolvi l-estrazzjoni tad-DNA ġenomiku mit-tessut ta' interess tar-rodituri, l-ipproċessar in vitro tad-DNA ġenomiku (jiġifieri l-imballaġġ ta' vetturi λ, jew il-ligazzjoni u l-elettroporazzjoni ta' plażmidi għall-irkupru tal-vettur shuttle), u l-identifikazzjoni sussegwenti ta' mutazzjonijiet f'ospitanti batterjali f'kundizzjonijiet xierqa. L-assaġġi jħaddmu transġeni newtrali li malajr jistgħu jiġu rkuprati minn ħafna mit-tessuti.

12.   L-esperiment bażiku tal-mutazzjoni tal-ġeni ta' TGR jinvolvi kura tar-roditur b'sustanza kimika fuq perjodu ta' żmien. Is-sustanzi kimiċi jistgħu jingħtaw permezz ta' kwalunkwe rotta xierqa, inkluża impjantazzjoni (eż. ittestjar ta' apparat mediku). Il-perjodu totali li matulu annimali jingħata d-doża jissejjaħ il-perjodu tal-għoti. L-għoti normalment ikun segwit minn perjodu ta' żmien, qabel is-sagrifiċċju, li matulu s-sustanza kimika ma tingħatax u li matulu l-leżjonijiet tad-DNA mhux imsewwijin jiġu fissati f'mutazzjonijiet stabbli. Fit-tagħrif, dan il-perjodu ssejjaħ b'modi oħrajn bħala l-ħin ta' manifestazzjoni, il-ħin ta' fissazzjoni jew il-ħin ta' espressjoni; tmiem dan il-perjodu huwa ħin il-kampjunar (15)(29). Wara li l-annimal jiġi sagrifikat, id-DNA ġenomiku jiġi iżolat mit-tessut(i) ta' interess u jiġi purifikat.

13.   Id-dejta għal tessut wieħed għal kull annimal minn imballaġġi/ligazzjonijiet diversi normalment tiġi aggregata, u l-frekwenza tal-mutanti ġeneralment tiġi evalwata billi jintużaw total ta' bejn 105 u 107 unità li jifformaw plakka jew kolonja. Meta jintużaw metodi tal-għażla pożittiva, l-unitajiet totali li jifformaw plakka jiġu determinat b'sett separat ta' platti mhux selettivi.

14.   Il-metodi tal-għażla pożittiva ġew żviluppati biex titħaffef l-identifikazzjoni tal-mutazzjonijiet kemm fil-ġene gpt [ġurdien u far gpt delta, fenotip gpt – (20)(22)(28)] kif ukoll il-ġene lacZ [Muta™Mouse jew ġurdien plażmidu lacZ (3)(10)(11)(30)]; filwaqt li l-mutazzjonijiet tal-ġeni lacI f'annimali Big Blue® jiġu identifikati permezz ta' metodu mhux selettiv li jidentifika mutanti permezz tal-ġenerazzjoni ta' plakek ikkuluriti (koħol). Il-metodoloġija tal-għażla pożittiva hija fis-seħħ ukoll sabiex tidentifika mutazzjonijiet tal-punt li jfeġġu fil-ġene cII tal-vettur shuttle batterjofago λ [ġurdien jew far Big Blue®, u Muta™Mouse (17)] u mutazzjonijiet imħassrin fil-ġeni λ red u gam [għażla ta' Spi — fil-ġurdien u l-far gpt delta (21)(22)(28)]. Il-frekwenza tal-mutanti tiġi kkalkolata billi jinqasam in-numru ta' plakek/plażmidi li fihom mutazzjonijiet fit-transġene bin-numru totali ta' plakek/plażmidi rkuprati mill-istess kampjun ta' DNA. Fl-istudji ta' mutazzjoni tal-ġeni tad-DNA, il-frekwenza tal-mutanti hija l-parametru rrapportat. Barra minn hekk, frekwenza tal-mutazzjoni tista' tiġi ddeterminata bħala l-frazzjon taċ-ċelloli li jġorru mutazzjonijiet indipendenti; dan il-kalkolu jeħtieġ korrezzjoni għal espansjoni klonika permezz ta' sekwenzjar tal-mutanti rkuprati(24).

15.   Il-mutazzjonijiet punteġġati fl-assaġġi tal-mutazzjoni tal-punt lacI, lacZ, cII u gpt jikkonsistu primarjament f'mutazzjonijiet tas-sostituzzjoni tal-pari bażi, mutazzjonijiet ta' bidla fil-qafas u tidħiliet/tħassiriet żgħar. Is-sehem relattiv ta' dawn it-tipi ta' mutazzjoni fost mutazzjonijiet spontanji huwa simili għal dak li deher fil-ġene endoġenu Hprt. Tħassiriet kbar jinqabdu biss bl-għażla Spi— u l-assaġġi plażmidi lacZ (24). Il-mutazzjonijiet ta' interess huma mutazzjonijiet in vivo li jfeġġu fil-ġurdien jew fil-far. Mutazzjonijiet in vivo u ex vivo, li jistgħu jfeġġu matul l-irkupru, ir-replikazzjoni jew it-tiswija tal-fago/plażmidi huma relattivament rari, u f'xi sistemi jistgħu jkunu identifikati b'mod speċifiku, jew esklużi mis-sistema tal-għażla pożittiva/tal-ospitant batterjali.

DESKRIZZJONI TAL-METODU

Preparazzjonijiet

Għażla tal-ispeċi ta' annimali

16.   Bħalissa hemm disponibbli firxa ta' mudelli ta' identifikazzjoni tal-mutazzjoni tal-ġeni ta' ġrieden transġeniċi, u dawn is-sistemi ntużaw b'mod iktar mifrux minn mudelli ta' firien transġeniċi. Jekk jidher ċar li l-far huwa mudell iktar xieraq mill-ġurdien (eż. meta ssir investigazzjoni tal-mekkaniżmu ta' karċinoġenesi għal tumur li jidher biss f'firien, biex issir korrelazzjoni ma' studju dwar it-tossiċità fil-firien, jew jekk ikun magħruf li l-metaboliżmu tal-far huwa jirrappreżenta aħjar il-metaboliżmu tal-bniedem), għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' mudelli tal-far transġeniku.

Kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija u tal-għalf

17.   Idealment, it-temperatura fil-kamra tal-annimali tal-esperimenti għandha tkun ta' 22 °C (± 3 °C). Għad li l-umdità relattiva għandha tkun tal-inqas 30 % u idealment ma taqbiżx is-70 % ħlief matul it-tindif tal-kamra, l-għan għandu jkun li tinżamm umdità relattiva ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, u b'sekwenza ta' kuljum ta' 12-il siegħa dawl, segwiti minn 12-il siegħa dlam. Għall-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista illimitata ta' ilma tajjeb għax-xorb. L-għażla tad-dieta tista' tkun influwenzata mill-bżonn li tiġi żgurata taħlita xierqa ta' sustanza kimika tat-test meta tingħata minn din ir-rotta. L-annimali għandhom jitrabbew fi gruppi żgħar (mhux iktar minn ħamsa) tal-istess sess jekk ma tkun mistennija ebda mġiba aggressiva. L-annimali jistgħu jitrabbew waħedhom jekk dan ikun xjentifikament iġġustifikat.

Preparazzjoni tal-annimali

18.   Annimali żgħażagħ b'saħħithom li laħqu l-maturità sesswali (għalqu 8-12-il ġimgħa fil-bidu tal-kura) jiġu assenjati b'mod aleatorju fil-gruppi ta' kontroll u tal-kura. L-annimali jiġu identifikati b'mod uniku. L-annimali jiġu akklimatizzati għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju għal tal-inqas ħamest ijiem. Il-gaġeġ għandhom jiġu rranġati b'tali mod li l-effetti possibbli dovuti għat-tqegħid tal-gaġġa jiġu minimizzati. Fil-bidu tal-istudju, il-varjazzjoni fil-piż tal-annimali għandha tkun minima u ma taqbiżx ± 20 % tal-piż medju ta' kull sess.

Preparazzjoni tad-dożi

19.   Is-sustanzi kimiċi solidi tat-test għandhom jinħallu jew jiġu sospiżi f'solventi jew veikoli xierqa jew jitħalltu f'dieta jew ilma tajjeb għax-xorb qabel id-dożaġġ tal-annimali. Is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test jistgħu jiġu dożati direttament jew jiġu dilwiti qabel id-dożaġġ. Għal esponimenti bit-teħid man-nifs, is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw bħala gass, fwar jew aerosol solidu/likwidu, skont il-proprjetajiet fiżjokimiċi tagħhom. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet friski tas-sustanza kimika tat-test sakemm id-dejta dwar l-istabbiltà maturix l-aċċettabbiltà tal-ħżin.

Kundizzjonijiet tat-test

Solvent/veikolu

20.   Is-solvent/il-veikolu ma għandhomx jipproduċu effetti tossiċi fil-volumi tad-doża użati, u ma għandhomx ikunu ssuspettati b'reazzjoni kimika mas-sustanza kimika tat-test. Jekk jintużaw solventi/veikoli oħrajn li mhumiex magħrufin sew, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun sostnuta permezz ta' dejta ta' referenza li tindika l-kompatibbiltà tagħhom. Huwa rakkomandat li, fejn jista' jkun, l-ewwel jiġi kkkunsidrat l-użu ta' solvent/veikolu milwiem.

Kontrolli Pożittivi

21.   Normalment għandhom jintużaw annimali konkurrenti bil-kontroll pożittiv. Madankollu, għal laboratorji li wrew kompetenza (ara l-paragrafu 23) u li użaw dawn l-assaġġi spiss, DNA minn annimali preċedenti kkurati bil-kontroll pożittiv jista' jkun inkluż ma' kull studju bħala konferma tas-suċċess tal-metodu. It-tali DNA mill-esperimenti fl-imgħoddi għandu jinkiseb mill-istess speċi u tessuti ta' interess, u jinħażen kif xieraq (ara l-paragrafu 36). Meta jintużaw kontrolli pożittivi konkurrenti, m'hemmx bżonn li jingħataw mill-istess rotta bħas-sustanza kimika tat-test; madankollu, il-kontrolli pożittivi għandhom ikunu magħrufin li jinduċu mutazzjonijiet f'tessut wieħed jew iktar ta' interess għas-sustanza kimika tat-test. Id-dożi tas-sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv għandhom jingħażlu sabiex jipproduċu effetti dgħajfin jew moderati li b'mod kritiku jivvalutaw il-prestazzjoni u s-sensittività tal-assaġġ. Fit-Tabella 1 hemm inklużi eżempji ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv u uħud mit-tessuti fil-mira tagħhom.

Tabella 1

Eżempji ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv u uħud mit-tessuti fil-mira tagħhom

Sustanza kimika tal-kontroll pożittiv u Nru tas-CAS	Isem EINECS u Nru tal-EINECS	Karatteristiċi	Tessut fil-Mira tal-Mutazzjoni
			Far	Ġurdien
N-Ethyl-N-nitrosourea [Nru tas-CAS 759-73-9]	N-Ethyl-N-nitrosourea [212-072-2]	Mutaġen li jaġixxi dirett	Fwied, pulmin	Mudullun tal-għadam, kolon, epitelju koloniku, intestin, fwied, pulmun, milsa, kilwa, ċelloli granulosi tal-ovarji, ċelloli ġerminali tal-irġiel
Etil carbamate (uretan) [CAS no. 51-79-6]	Uretan [200-123-1]	Mutaġen, jeħtieġ metaboliżmu iżda jipproduċi biss effetti dgħajfin		Mudullun tal-għadam, prestonku, intestin żgħir, fwied, pulmun, milsa
2,4-Djaminotoluen [Nru tas-CAS 95-80-7]	4-Metil-m-fenilenedjamin [202-453-1]	Mutaġen, jeħtieġ metaboliżmu, pożittiv ukoll fl-assaġġ Spi-	Fwied	Fwied
Benżo[a]piren [Nru tas-CAS 50-32-8]	Benżo[def]krisen [200-028-5]	Mutaġen, jeħtieġ metaboliżmu	Fwied, omenta,	Mudullun tal-għadam, sider, kolon, prestonku, stonku glandolari, qalb, fwied, pulmun, ċelloli ġerminali tal-irġiel

Kontrolli negattivi

22.   Il-kontrolli negattivi, ikkurati b'solvent jew veikolu waħdu, u nkella kkurati bl-istess mod bħall-gruppi tal-kura, għandhom ikunu inklużi għal kull ħin tal-kampjunar. Fin-nuqqas ta' dejta tal-kontroll storika jew ippubblikata li turi li ma kien indott ebda effett ta' tħassir jew mutaġeniku mis-solvent/veikolu magħżul, il-kontrolli mhux ikkurati għandhom ikunu inklużi wkoll għal kull ħin tal-kampjunar sabiex tiġi stabbilita aċċettabbiltà tal-kontroll tal-veikolu.

Verifika tal-profiċjenza tal-laboratorju

23.   Il-kompetenza f'dawn l-assaġġi għandha tiġi stabbilita billi tintwera l-ħila ta' riproduzzjoni tar-riżultati mistennija minn dejta ppubblikata (24) għal: 1) frekwenzi tal-mutanti b'sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv (inklużi risponsi dgħajfin) bħal dawk elenkati fit-Tabella 1, nonmutaġeni, u kontrolli tal-veikolu; u 2) irkupru tat-transġene minn DNA ġenomiku (eż. effiċjenza fl-imballaġġ).

Sekwenzjar tal-mutanti

24.   Għal applikazzjonijiet regolatorji, is-sekwenzjar tad-DNA tal-mutanti mhuwiex meħtieġ, b'mod partikolari meta jinkiseb riżultat ċar pożittiv jew negattiv. Madankollu, id-dejta tas-sekwejzjar tista' tkun utli meta tkun osservata varjazzjoni għolja bejn l-individwi. F'dawn il-każijiet, is-sekwenzjar jista' jintuża biex jitwarrbu l-possibilitajiet ta' jackpots jew avvenimenti klonali billi jiġi identifikat is-sehem ta' mutanti uniċi minn tessut partikolari. Sekwenzjar għal madwar 10 minuti għal kull tessut għal kull annimal għandu jkun biżżejjed għad-determinazzjoni sempliċi ta' jekk il-mutanti klonali jikkontribwixxux għall-frekwenza tal-mutanti; is-sekwenzjar ta' ammont li jasal sa 25 mutant jista' jkun meħtieġ biex tiġi korretta b'mod matematiku l-frekwenza tal-mutanti għall-klonalità. Is-sekwenzjar tal-mutanti jista' jiġi kkunsidrat ukoll meta jinstabu żidiet żgħar fil-frekwenza tal-mutanti (jiġifieri kemm jinqabżu l-valuri tal-kontroll mhux ikkurat). Differenzi fl-ispettru tal-mutanti bejn il-kolonji tal-muatnti minn annimali kkurati u mhux ikkurati jistgħu jsostnu effett mutaġeniku (29). Barra minn hekk, l-ispettri ta' mutazzjoni jistgħu jkunu utli għall-iżvilupp ta' ipoteżijiet mekkanistiċi. Meta s-sekwenzjar ikun ser jiġi inkluż bħala parti mill-protokoll tal-istudju, għandha tingħata attenzjoni speċjali fit-tfassil tat-tali studji, b'mod partikolari fir-rigward tan-numru ta' mutanti sekwenzjati għal kull kampjun, biex tinkiseb biżżejjed saħħa skont il-mudell statistiku użat (ara l-paragrafu 43).

PROĊEDURA

In-Numru u s-Sess tal-Annimali

25.   In-numru ta' annimali għal kull grupp għandu jkun determinat minn qabel biex ikun biżżejjed ħalli jipprovdi s-saħħa statistika meħtieġa biex tal-inqas jiġi identifikat irdoppjar fil-frekwenza tal-mutanti. Id-daqsijiet tal-grupp ser ikunu jikkonsistu f'minimu ta' ħames annimali; madankollu, jekk is-saħħa statistika ma tkunx biżżejjed, in-numru ta' annimali għandu jiżdied kif meħtieġ. Normalment għandhom jintużaw annimali rġiel. Jista' jkun hemm każijiet li fihom l-ittestjar ta' nisa biss ikun iġġustifikat; pereżempju, meta jiġu ttestjati mediċini speċifiċi għal nisa bnedmin, jew meta jiġi investigat il-metaboliżmu speċifiku għan-nisa. Jekk ikun hemm biżżejjed differenzi bejn is-sessi f'termini ta' tossiċità jew metaboliżmu, f'dak il-każ ikun hemm bżonn kemm ta' rġiel kif ukoll ta' nisa.

Il-Perjodu tal-Għoti

26.   Fuq il-bażi tal-osservazzjonijiet li l-mutazzjonijiet jakkumulaw ma' kull kura, hemm bżonn ta' skeda b'dożaġġ ripetut, b'kuri ta' kuljum għal perjodu ta' 28 jum. Ġeneralment dan jitqies li huwa aċċettabbli kemm għall-produzzjoni ta' akkumulazzjoni suffiċjenti ta' mutazzjonijiet minn mutaġeni dgħajfin, kif ukoll għall-għoti ta' żmien adegwat għall-esponiment sabiex jiġu identifikati mutazzjonijiet f'organi bi proliferazzjoni baxxa. Skedi alternattivi tal-kura jistgħu jkunu xierqa għal ċerti evalwazzjonijiet, u dawn l-iskedi tad-dożaġġ alternattivi għandhom ikunu ġġustifikati xjentifikament fil-protokoll. Il-kuri ma għandhomx ikunu iqsar miż-żmien meħtieġ għall-induzzjoni sħiħa tal-enżimi metabolizzanti rilevanti kollha, u kuri iqsar jistgħu jkunu jeħtieġu l-użu ta' bosta żminijiet tal-kampjunar li jkunu xierqa għal organi b'rati differenti ta' proliferazzjoni. Xorta waħda dejjem għandha tintuża l-informazzjoni kollha disponibbli (eż. dwar it-tossiċità ġenerali jew il-metaboliżmu u l-farmakokinetika) meta jiġi ġġustifikat protokoll, speċjalment meta jkun hemm devjazzjoni mir-rakkomandazzjonijiet standard ta' hawn fuq. Filwaqt li jistgħu jżidu s-sensittività, durati tal-kura itwal minn 8 ġimgħat għandhom jiġu spjegati b'mod ċar u ġġustifikati, peress li żminijiet itwal tal-kura jistgħu jipproduċu żieda apparenti fil-frekwenza tal-mutanti permezz ta' espansjoni klonali (29).

Livelli tad-Doża

27.   Il-livelli tad-doża għandhom ikunu bbażati fuq ir-riżultati ta' studju ta' sejbien tal-medda tad-doża li jkejjel it-tossiċità ġenerali li ngħatat mill-istess rotta ta' esponiment, jew fuq ir-riżultati ta' studji preżistenti dwar it-tossiċità sottoakuta. Jistgħu jintużaw annimali mhux transġeniċi tal-istess razza ta' rodituri għad-determinazzjoni tal-meded tad-doża. Fit-test ewlieni, sabiex tinkiseb informazzjoni dwar ir-rispons għad-doża, studju sħiħ għandu jinkludi grupp tal-kontroll negattiv (ara l-paragrafu 22) u tal-inqas tliet livelli tad-doża b'intervalli xierqa, ħlief meta tkun intużat id-doża limitu (ara l-paragrafu 28). L-ogħla doża għandha tkun id-Doża Massima Tollerata (MTD). L-MTD hija definita bħala d-doża li tipproduċi sinjali ta' tossiċità b'tali mod li livelli ogħla tad-doża, fuq il-bażi tal-istess skeda tad-dożaġġ, jipproduċu letalità. Is-sustanzi kimiċi b'attivitajiet bijoloġiċi speċifiċi f'dożi mhux tossiċi baxxi (bħal ormoni u mitoġeni), u sustanzi kimiċi li jesibixxu saturazzjoni ta' proprjetajiet tossikokinetiċi jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta' tfassil tad-dożi u għandhom jiġu evalwati fuq bażi ta' każ b'każ. Il-livelli tad-doża użati għandhom ikopru medda mill-massimu sa tossiċità baxxa jew ineżistenti.

Test tal-limitu

28.   Jekk esperimenti dwar is-sejbien tal-medda tad-doża, jew dejta eżistenti minn razez ta' rodituri relatati, jindikaw li skeda tal-kura ta' tal-inqas id-doża limitu (ara iktar 'l isfel) ma tipproduċi ebda effetti tossiċi osservabbli, u jekk ma tkunx mistennija ġenotossiċità fuq il-bażi ta' dejta minn sustanzi kliniċi strutturalment relatati, f'dak il-każ jista' ma jitqiesx li hemm bżonn ta' studju sħiħ billi jintużaw tliet livelli tad-doża. Għal perjodu tal-għoti ta' 28 jum (jiġifieri 28 kura ta' kuljum), id-doża limitu hija ta' 1 000 mg/kg piż tal-ġisem/jum. Għal perjodi tal-għoti ta' 14-il jum jew inqas, id-doża limitu hija ta' 2 000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum (l-iskedi tad-dożaġġ li jvarjaw minn 28 kura ta' kuljum għandhom jiġu ġġustifikati b'mod xjentifiku fil-protokoll; ara l-paragrafu 26).

L-Għoti tad-Dożi

29.   Normalment, is-sustanza kimika tat-test tingħata b'gavage billi jintuża tubu fl-istonku jew kannula xierqa ta' intubazzjoni. B'mod ġenerali, meta jitfassal assaġġ għandha tiġi kkunsidrata r-rotta antiċipata tal-esponiment tal-bniedem. Għalhekk, rotot oħrajn ta' esponiment (bħal ilma tajjeb għax-xorb, taħt il-ġilda, ġol-vina, topikali, teħid man-nifs, intratrakeali, mad-dieta, jew impjant) jistgħu jkunu aċċettabbli meta jkunu jistgħu jiġu ġġustifikati. Tilqima intraperitoneali mhijiex rakkomandata peress li mhijiex rotta fiżjoloġikament rilevanti ta' esponiment tal-bniedem. Il-volum massimu ta' likwidu li jista' jingħata b'gavage jew tilqima f'darba waħda jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. Il-volum ma għandux jaqbeż iż-2 ml/100 g piż tal-ġisem. L-użu ta' volumi ogħla minn dan għandu jiġi ġġustifikat. Ħlief għal sustanzi kimiċi irritanti jew korrużivi, li normalment juru effetti mgħarrqin f'konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandha tiġi minimizzata billi tiġi aġġustata l-konċentrazzjoni ħalli jiġi żgurat volum kostanti fil-livelli kollha tad-doża.

Żmien tal-Kampjunar

Ċelloli Somatiċi

30.   Iż-żmien tal-kampjunar huwa varjabbli kritiku għaliex huwa ddeterminat mill-perjodu meħtieġ sabiex il-mutazzjonijiet jiġu fissi. Dan il-perjodu huwa speċifiku għat-tessut u jidher li huwa relatat mal-ħin tad-dawran tal-popolazzjoni taċ-ċelloli, bil-mudullun tal-għadam u l-intestin li għandhom ripsons rapidu u l-fwied ferm inqas. Kompromess xieraq għall-kejl ta' frekwenzi mutanti kemm f'tessuti bi proliferazzjoni rapida kif ukoll dawk bi proliferazzjoni iktar bil-mod huwa kuri kuljum għal 28 jum konsekuttiv (kif indikat fil-paragrafu 26) u kampjunar tliet ijiem wara l-aħħar kura; għad li l-frekwenza massima tal-mutanti tista' ma tfeġġx f'tessuti bi proliferazzjoni bil-mod f'dawn il-kundizzjonijiet. Jekk it-tessuti bi proliferazzjoni bil-mod ikunu ta' importanza partikolari, f'dak il-każ żmien tal-kampjunar iktar tard ta' 28 jum wara l-perjodu tal-għoti ta' 28 jum jista' jkun iktar adattat (16)(29). F'xi każijiet, iż-żmien tal-kampjunar iktar tard jieħu post iż-żmien ta' kampjunar ta' 3 ijiem, u jkun jeħtieġ ġustifikazzjoni xjentifika.

Ċelloli ġerminali

31.   L-assaġġi ta' TGR huma adattati għall-istudju tal-induzzjoni tal-mutazzjoni tal-ġeni f'ċelloli ġerminali fl-irġiel (7)(8)(27), li fihom it-twaqqit u l-kinetika tal-ispermatoġenesi ġew definiti sew (27). In-numri inferjuri ta' ova disponibbli għal analiżi, anki wara superovulazzjoni, u l-fatt li ma hemm ebda sinteżi tad-DNA fl-ooċite, jipprekludu d-determinazzjoni tal-mutazzjoni f'ċelloli ġerminali tan-nisa bl-użu ta' assaġġi transġeniċi (31).

32.   Iż-żminijiet tal-kampjunar għaċ-ċelloli ġerminali tal-irġiel għandhom jingħażlu b'tali mod li jittieħed kampjun tal-medda tat-tipi ta' ċelloli esposti fi ħdan l-iżvilupp taċ-ċelloli ġerminali, u b'hekk l-istadju fil-mira fil-kampjunar ikun ġie espost biżżejjed. Iż-żmien għall-progressjoni taċ-ċelloli ġerminali li qed jiżviluppaw minn ċelloli staminali spermatogonjali sa sperma matura li tilħaq il-vas deferens/epididimi cauda huwa ta' ~49 jum għall-ġrieden (36) u ~70 jum għall-firien (34)(35). Wara esponiment għal 28 jum b'perjodu ta' kampjunar sussegwenti ta' tliet ijiem, l-isperma akkumulata miġbura mill-vas deferens/epididimi cauda (7)(8) ser tirrappreżenta popolazzjoni ta' ċelloli esposti matul madwar il-fażi aħħarija tal-ispermatoġenesi, li tinkludi l-perjodu mejotiku u postmejotiku, iżda mhux il-perjodu spermatogonjali jew taċ-ċelloli staminali. Sabiex jittieħed kampjun adegwat taċ-ċelloli fil-vas deferens/epididimi cauda li kienu ċelloli staminali spermatogonjali matul il-perjodu tal-esponiment, hemm bżonn ta' żmien addizzjonali tal-kampjunar ta' tal-inqas 7 ġimgħat (ġrieden) jew 10 ġimgħat (firien) wara li tintemm il-kura.

33.   Ċelloli estrużi minn tubuli seminiferużi wara skeda ta' 28 + 3 ijiem jinvolvu popolazzjoni mħallta arrikkita għall-istadji kollha taċ-ċelloli ġerminali fil-fażi tal-iżvilupp (7)(8). Il-kampjunar ta' dawn iċ-ċelloli għall-identifikazzjoni tal-mutazzjoni tal-ġeni ma jipprovdix valutazzjoni preċiża tal-istadji li fihom jiġu indotti l-mutazzjonijiet taċ-ċelloli ġerminali daqs kemm tista' tinkiseb mill-kampjunar tal-ispermatożoa mill-vas deferens/epididimi cauda (peress li hemm medda ta' tipi ta' ċelloli ġerminali kampjunati mit-tubuli, u ser ikun hemm xi ċelloli somatiċi li jikkontaminaw din il-popolazzjoni ta' ċelloli). Madankollu, il-kampjunar ta' ċelloli minn tubuli seminiferużi minbarra l-ispermatożoa mill-vas deferens/epididimi cauda wara skeda ta' kampjunar ta' 28 + 3 jum biss jipprovdi ċerta kopertura taċ-ċelloli esposti tul il-maġġoranza tal-fażijiet tal-iżvilupp taċ-ċelloli ġerminali, u jista' jkun utli għall-identifikazzjoni ta' xi mutaġeni taċ-ċelloli ġerminali.

Osservazzjonijiet

34.   Għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi ġenerali tal-inqas darba kuljum, idealment fl-istess ħin(ijiet) kuljum u jiġi kkunsidrat il-perjodu bl-ogħla livell ta' effetti antiċipati wara d-dożaġġ. Il-kundizzjoni tas-saħħa tal-annimali għandha tiġi rreġistrata. Tal-inqas darbtejn kuljum, l-annimali kollha għandhom ikunu osservati għal morbidità u mortalità. L-annimali kollha għandhom jintiżnu tal-inqas darba fil-ġimgħa, u fis-sagrifiċċju. Il-kejliet tal-konsum tal-ikel għandu jsir tal-inqs darba kull ġimgħa. Jekk is-sustanza tat-test tingħata permezz tal-ilma tajjeb għax-xorb, il-konsum tal-ilma għandu jitkejjel f'kull bidla tal-ilma u tal-inqas darba fil-ġimgħa. L-annimali li jesibixxu indikaturi mhux letali ta' tossiċità eċċessiva għandhom jiġu ewtanizzati qabel jintemm il-perjodu ta' ttestjar (23).

Ġbir tat-Tessuti

35.   Ir-raġuni għall-ġbir tat-tessuti għandha tkun definita biċ-ċar. Peress li mhuwiex possibbli li tiġi studjata l-induzzjoni tal-mutazzjoni fi prattikament l-ebda studju, l-għażla tat-tessuti li għandhom jinġabru għandha tkun imsejsa fuq ir-raġuni għat-twettiq tal-istudju u kwalunkwe dejta eżistenti dwar mutaġeniċità, karċinoġeniċità jew tossiċità għas-sustanza kimika investigata. Fatturi importanti li għandhom jiġu kkunsidrati għandhom jinkludu r-rotta tal-amministrazzjoni (fuq il-bażi tar-rotta/rotot probabbli ta' esponiment għall-bniedem), id-distribuzzjoni mbassra tat-tessuti, u l-mekkaniżmu ta' azzjoni possibbli. Fin-nuqqas ta' kwalunkwe informazzjoni ta' sfnod, għandhom jinġabru bosta tessuti somatiċi li jistgħu jkunu ta' interess. Dawn għandhom jirrappreżentaw tessuti bi proliferazzjoni rapida, bi proliferazzjoni bil-mod, u tas-sit ta' kuntatt. Barra minn hekk, għandhom jinġabru u jinħażnu spermatożoa mill-vas deferens/epididimi cauda u ċelloli ġerminali fil-fażi tal-iżvilupp mit-tubuli seminiferużi (kif deskritti fil-paragrafi 32 u 33) fil-każ li fil-ġejjieni jkun hemm bżonn ta' analiżi tal-mutaġeniċità taċ-ċelloli ġerminali. Għandhom jinkisbu l-piżijiet tal-organi, u għall-organi l-kbar, għandha tinġabar l-istess żona mill-annimali kollha.

Il-Ħżin tat-Tessuti u d-DNA

36.   It-tessuti (jew omoġenati tat-tessuti) għandhom jinħażnu f'– 70 °C jew inqas u jintużaw għall-iżolament tad-DNA fi żmien 5 snin. DNA iżolat, maħżun imkessaħ f'4 °C f'bafer xieraq, għandu jintuża b'mod ottimali għall-analiżi tal-mutazzjoni fi żmien sena.

Għażla tat-Tessuti għal Analiżi tal-Mutanti

37.   L-għażla tat-tessuti għandha tkun ibbażata fuq kunsiderazzjonijiet bħal: 1) ir-rotta tal-amministrazzjoni jew is-sit tal-ewwel kuntatt (eż. l-istonku glandolari jekk l-għoti jsir b'mod orali, il-fwied jekk l-għoti jsir bit-teħid man-nifs, jew il-ġilda jekk intużat applikazzjoni topikali); u 2) parametri farmakokinetiċi osservati fi studji dwar it-tossiċità ġenerali, li jindikaw dispożizzjoni żamma jew akkumulazzjoni ta' tessut, jew l-organi fil-mira għat-tossiċità. Jekk l-istudji jsiru bħala segwitu għal studji dwar il-karċinoġeniċità, għandhom jiġu kkunsidrati t-tessuti fil-mira għall-karċinoġeniċità. L-għażla tat-tessuti għal analiżi għandha timmassimizza l-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi li huma mutaġeni in vitro li jaġixxu b'mod dirett, metabolizzati malajr, ferm reattivi jew ftit li xejn assorbiti, jew dawk li għalihom it-tessut fil-mira huwa determinat mir-rotta tal-amministrazzjoni (6).

38.   Fin-nuqqas ta' informazzjoni ta' sfond u filwaqt li jittieħed f'kunsiderazzjoni s-sit ta' kuntatt dovut għar-rotta tal-amministrazzjoni, il-fwied u tal-inqas tessut wieħed b'diviżjoni rapida (eż. stonku glandolari, mudullun tal-għadam) għandhom jiġu evalwati għal mutaġeniċità. F'ħafna każijiet, ir-rekwiżiti ta' hawn fuq jistgħu jinkisbu mill-analiżi ta' żewġ tessuti magħżulin bir-reqqa, iżda f'xi każijiet, ikun hemm bżonn tlieta jew iktar. Jekk hemm raġunijiet għal tħassib speċifiku dwar l-effetti taċ-ċelloli ġerminali, inklużi risponsi pożittivi f'ċelloli somatiċi, it-tessuti taċ-ċelloli ġerminali għandhom jiġu evalwati għal mutazzjonijiet.

Metodi tal-Kejl

39.   Metodi standard tal-laboratorju jew ippubblikati għall-identifikazzjoni ta' mutanti huma disponibbli għall-mudelli transġeniċi rakkomandati: batterjofago lambda u plażmidi lacZ (30); ġrieden lacI (2)(18); ġrieden gpt delta (22); firien gpt delta (28); cII (17). Il-modifiki għandhom jiġu ġġustifikati u dokumenti kif xieraq. Id-dejta minn imballaġġi multipli tista' tiġi aggregata u tintuża biex jintlaħaq numru adegwat ta' plakek jew kolonji. Madankollu, il-bżonn ta' numru ikbar ta' reazzjonijiet tal-imballaġġ biex jintlaħaq in-numru xieraq ta' plakek jista' jkun indikazzjoni ta' kwalità batuta tad-DNA. F'dawn il-każijiet, id-dejta għandha tiġi kkunsidrata bir-reqqa għaliex tista' ma tkunx affidabbli. In-numru totali ottimali ta' plakek jew kolonji għal kull kampjun tad-DNA huwa rregolat mill-probabilità statistika ta' identifikazzjoni ta' biżżejjed numri ta' mutanti bi frekwenza partikolari ta' mutanti spontanji. B'mod ġenerali, hemm bżonn ta' minimu ta' 125 000 sa 300 000 plakka jekk il-frekwenza ta' mutanti spontanji tkun fl-ordni ta' 3 × 10-5 (15). Għall-assaġġ lacI Big Blue®, huwa importanti li jintwera li l-medda sħiħa ta' fenotipi tal-kulur tal-mutanti tista' tiġi identifikata permezz tal-inklużjoni ta' kontrolli tal-kulur xierqa konkurrenti ma' kull platt. It-tessuti u l-kampjuni riżultanti (oġġetti) għandhom jiġu pproċessati u analizzati billi jintuża disinn blokk, li fihom l-oġġetti mill-grupp tal-kontroll tal-veikolu/tas-solvent, il-grupp tal-kontroll pożittiv (jekk jintuża) jew id-DNA tal-kontroll pożittiv (fejn xieraq), u l-gruppi kollha tal-kura huma pproċessati flimkien.

DEJTA U RAPPORTAR

Trattament tar-Riżultati

40.   Dejta dwar l-annimali individwali għandha tiġi ppreżentata f'forma ta' tabelli. L-unità sperimentli hija l-annimal. Ir-rapport għandu jinkludi n-numru totali ta' unitajiet li jifformaw plakka (pfu) jew unitajiet li jifformaw kolonja (cfu), in-numru ta' mutanti, u l-frekwenza tal-mutanti għal kull tessut minn kull annimal. Jekk hemm bosta reazzjonijiet tal-imballaġġ/salvataġġ, għandu jiġi rrapportat in-numru ta' reazzjonijiet għal kull kampjun tad-DNA. Filwaqt li d-dejta għal kull reazzjoni individwali għandha tinżamm, il-pfu jew is-cfu biss iridu jiġu rrapportati. Għandha tiġi rrapportata d-dejta dwar it-tossiċità u s-sinjali kliniċi skont il-paragrafu 34. Kwalunkwe riżultat ta' sekwenzjar għandu jiġi ppreżentat għal kull mutant analizzat, u għandhom jintwerew il-kalkoli tal-frekwenza tal-mutazzjoni li rriżultaw għal kull annimal u tessut.

Evalwazzjoni Statistika u Interpretazzjoni tar-Riżultati

41.   Hemm diversi kriterji għad-determinazzjoni ta' riżultat pożittiv, bħal żieda relatata mad-doża fil-frekwenza tal-mutanti, jew żieda ċara fil-frekwenza tal-mutanti fi grupp ta' doża wieħed meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll tas-solvent/veikolu. Tal-inqas tliet gruppi tad-doża kkurati għandhom jiġu analizzati sabiex tiġi pprovduta biżżejjed dejta għal analiżi tar-rispons għad-doża. Filwaqt li r-relevanza bijoloġika tar-riżultati għandha tkun il-kunsiderazzjoni primarja, jistgħu jintużaw metodi statistiċi xierqa bħala għajnuna fl-evalwazzjoni tar-riżultati tat-test (4)(14)(15)(25)(26). It-testijiet statistiċi użati għandhom jikkunsidraw l-annimal bħala l-unità sperimentali.

42.   Sustanza kimika tat-test li għaliha r-riżultati ma jissodisfawx il-kriterji ta' hawn fuq fi kwalunkwe tessut titqies mhux mutaġenika f'dan l-assaġġ. Għal relevanza bijoloġika ta' riżultat negattiv, l-esponiment għat-tessut għandu jiġi kkonfermat.

43.   Għal analiżijiet tas-sekwenzjar tad-DNA, hemm disponibbli għadd ta' approċċi statistiċi biex jassistu fl-interpretazzjoni tar-riżultati (1)(5)(9)(19).

44.   Kunsiderazzjoni ta' jekk il-valuri osservati humiex fi ħdan jew barra l-medda ta' kontroll storiku tista' tipprovdi gwida meta tiġi evalwata s-sinifikanza bijoloġika tar-rispons (32).

Rapport tat-test

45.   Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Sustanza kimika tat-test:

—	id-dejta ta' identifikazzjoni u n-nru tas-CAS, jekk ikunu magħrufin,

—	is-sors, in-numru tal-lott jekk disponibbli,

—	l-għamla fiżika u l-purità,

—	il-proprjetajiet fiżjokimiċi rilevanti għat-twettiq tal-istudju,

—	l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test, jekk magħrufa.

Solvent/veikolu:

—	il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-veikolu,

—	is-solubilità u l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent/veikolu, jekk magħruf,

—	il-preparazzjoni tal-formulazzjonijiet djetetiċi, tal-ilma tajjeb għax-xorb jew tat-teħid man-nifs,

—	id-determinazzjonijiet analitiċi dwar il-formulazzjonijiet (eż., l-istabbiltà, l-omoġenità, il-konċentrazzjonijiet nominali).

Annimali tat-test:

—	l-ispeċi/ir-razza użata u ġustifikazzjoni għall-għażla,

—	in-numru, l-età u s-sess tal-annimali,

—	is-sors, il-kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija, id-dieta, eċċ.,

—	il-piż individwali tal-annimali fil-bidu tat-test, inklużi l-medda tal-piż tal-ġisem, id-devjazzjoni medja u standard għal kull grupp.

Kundizzjonijiet tat-test:

—	dejta tal-kontroll pożittiv u negattiv (veikolu/solvent),

—	dejta mill-istudju ta' sejbien tal-medda,

—	ir-raġuni għall-għażla tal-livell tad-doża,

—	dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test,

—	dettalji dwar l-għoti tas-sustanza kimika tat-test,

—	ir-raġuni għar-rotta tal-amministrazzjoni,

—	metodi għall-kejl tat-tossiċità tal-annimali, inklużi, fejn disponibbli, l-analiżijiet istopatoloġiċi jew ematoloġiċi u l-frekwenza li biha saru l-osservazzjonijiet u ttieħdu l-piżijiet tal-ġisem tal-annimali,

—	metodi għall-verifika li s-sustanza kimika tat-test laħqet it-tessut fil-mira, jew ċirkolazzjoni ġenerali, jekk inkisbu riżultati negattivi,

—	id-doża propja (mg/kg piż tal-ġisem/jum) ikkalkolata mill-konċentrazzjoni u l-konsum tas-sustanza kimika tat-test fid-dieta/ilma tajjeb għax-xorb (ppm), jekk applikabbli,

—	dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u l-ilma,

—	deskrizzjoni dettaljata tal-iskedi tal-kura u l-kampjunar u ġustifikazzjonijiet għall-għażliet,

—	il-metodu tal-ewtanażja,

—	il-proċeduri għall-iżolament u l-preservazzjoni tat-tessuti,

—	il-metodi għall-iżolament tad-DNA ġenomiku tar-rodituri, b'salvataġġ tat-transġene minn DNA ġenomiku, u t-trasferiment ta' DNA transġeniku għal ospitant batterjali,

—	is-sors u n-numri tal-lott taċ-ċelloli, il-kitts u r-reaġenti kollha (fejn applikabbli),

—	il-metodi għall-enumerar tal-mutanti,

—	il-metodi għall-analiżi molekolari tal-mutanti u l-użu fil-korrezzjoni għall-klonalità u/jew il-kalkolu tal-frekwenzi tal-mutazzjoni, jekk applikabbli.

Riżultati:

—	il-kundizzjoni tal-annimali qabel u matul il-perjodu tat-test, inklużi sinjali tat-tossiċità,

—	il-piżijiet tal-ġisem u l-organi fis-sagrifiċċju,

—	għal kull tessut/annimal, in-numru ta' mutanti, in-numru ta' plakek jew kolonji evalwati, il-frekwenza tal-mutanti,

—	għal kull grupp ta' tessuti/annimali, in-numru ta' reazzjonijiet tal-imballaġġ għal kull kampjun tad-DNA, in-numru totali ta' mutanti, il-frekwenza medja tal-mutanti, id-devjazzjoni standard,

—	ir-relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn possibbli,

—	għal kull tessut/annimal, in-numru ta' mutanti indipendenti u l-frekwenza medja tal-mutazzjoni, fejn saret analiżi molekolari tal-mutazzjonijiet,

—	dejta ta' kontroll negattiv konkurrenti u storiku b'meded, medji u devjazzjonijiet standard,

—	dejta ta' kontroll pożittiv konkurrenti (jew kontroll pożittiv tad-DNA mhux konkurrenti),

—	determinazzjonijiet analitiċi, jekk disponibbli (eż. konċentrazzjonijiet tad-DNA użati fl-imballaġġ, dejta dwar is-sekwenzjar tad-DNA),

—	l-analiżijiet statistiċi u l-metodi applikati.

Diskussjoni tar-riżultati

Konklużjoni

TAGĦRIF

(1)

Adams, W.T. and T.R. Skopek (1987), ‘Statistical Test for the Comparison of Samples from Mutational Spectra’, J. Mol. Biol., 194: 391-396.

(2)

Bielas, J.H. (2002), ‘A more Efficient Big Blue® Protocol Improves Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measurement’, Mutation Res., 518: 107–112.

(3)

Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen and J. Vijg (1995), ‘Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying in vivo Mutations’Nature, 377(6550): 657–659

(4)

Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1995), ‘Statistical Design and Analysis of Mutation Studies in Transgenic Mice’, Environ. Mol. Mutagen, 25(3): 246–255.

(5)

Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1996), ‘Mutational Spectra in Transgenic Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency’, Environ. Mol. Mutagen, 28: 405–413.

(6)

Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio and V. Thybaud (1999), ‘Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing in vivo for the Detection of Site-of-contact Mutagens’, Mutagenesis, 14(1): 141–151.

(7)

Douglas, G.R., J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen and L.M. Soper(1995), ‘Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethylnitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of lacZ Transgenic Mice’, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7485-7489.

(8)

Douglas, G.R., J.D. Gingerich, L.M. Soper and J. Jiao (1997), ‘Toward an Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells’, Mutation Res., 388(2-3): 197-212.

(9)

Dunson, D.B. and K.R. Tindall (2000), ‘Bayesian Analysis of Mutational Spectra’, Genetics, 156: 1411–1418.

(10)

Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. Lohman, D.L. Knook and J. Vijg(1989), ‘Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations in vivo’, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(20): 7971–7975.

(11)

Gossen, J.A. and J. Vijg (1993), ‘A Selective System for lacZ-Phage using a Galactose-sensitive E. coli Host’, Biotechniques, 14(3): 326, 330.

(12)

Erikson, R.P. (2003), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other than Cancer’, Mutation Res., 543: 125-136.

(13)

Erikson, R.P. (2010), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other than Cancer: an Update’, Mutation Res., 705: 96-106.

(14)

Fung, K.Y., G.R. Douglas and D. Krewski (1998), ‘Statistical Analysis of lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays’, Mutagenesis, 13(3): 249–255.

(15)

Heddle, J.A., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. Douglas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000), ‘In vivo Transgenic Mutation Assays’, Environ. Mol. Mutagen., 35: 253-259.

(16)

Heddle, J.A., H.-J. Martus and G.R. Douglas (2003), ‘Treatment and Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays’, Environ. Mol. Mutagen., 41: 1-6.

(17)

Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya and S. Garges (1996), ‘Analysis of Genetic Instability during Mammary Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for in vivo Mutations in a Bacteriophage λ Transgene Target’, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(17): 9073–9078.

(18)

Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge and J.M. Short (1990), ‘The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Mutagenicity Testing’, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212–218.

(19)

Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott and P.A. Burns (2008), ‘Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra using Multivariate Data Analysis’, Carcinogenesis, 29(4): 772-778.

(20)

Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni (1996), ‘A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi — and 6-thioguanine Selections’, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465–470.

(21)

Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999), ‘Spi — Selection: an Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice’, Environ. Mol. Mutagen., 34(1): 9–15.

(22)

Nohmi, T., T. Suzuki and K.I. Masumura (2000), ‘Recent Advances in the Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays’, Mutation Res., 455(1–2): 191–215.

(23)

OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, No19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariġi.

(24)

OECD (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, No 103, ENV/JM/MONO(2009)7, OECD, Pariġi.

(25)

Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, R.W. Tennant and K.R. Tindall (1995), ‘Study Design and Sample Sizes for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay’, Environ. Mol. Mutagen., 25(3): 231–245.

(26)

Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, ... G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft and N.J. Gorelick (1997), ‘Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Study’, Mutation. Res., 388(2–3): 249–289.

(27)

Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas and C.L. Yauk (2006), ‘Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays’, Mutation. Res., 598: 164-193.

(28)

Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. Kawamura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010), ‘Integration of in vivo Genotoxicity and Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Structural Isomers’, Toxicol. Sci., 114(1): 71-78.

(29)

Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003), ‘In vivo Transgenic Mutation Assays’, Mutation Res., 540: 141-151.

(30)

Vijg, J. and G.R. Douglas (1996), ‘Bacteriophage λ and Plasmid lacZ Transgenic Mice for studying Mutations in vivo’ in: G. Pfeifer (ed.), Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II, Plenum Press, New York, NY, Stati Uniti, pp. 391–410.

(31)

Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster and G.R. Douglas (2005), ‘A lacZ Transgenic Mouse Assay for the Detection of Mutations in Follicular Granulosa Cells’, Mutation Res., 578(1-2): 117-123.

(32)

Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud (2011), ‘Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data’, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007.

(33)

OECD (2011), Retrospective Performance Assessment of OECD Test Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, No 145, ENV/JM/MONO(2011)20, OECD, Pariġi.

(34)

Clermont, Y. (1972), ‘Kinetics of spermatogenesis in mammals seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal’. Physiol. Rev. 52: 198-236.

(35)

Robaire, B., Hinton, B.T., and Oregbin-Crist, M.-C. (2006), ‘The Epididymis’, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., Richards, J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, Elsevier, il-Pajjiżi l-Baxxi, pp. 1071-1148.

(36)

Russell, L.B. (2004), ‘Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse’, Genetica, 122: 25–36.

”