32001D0183

Id-Deċiżjoni tal-Kummissjoni

tat-22 ta’ Frar 2001

li tistabbilixxi l-pjanijiet dwar kampjunar u l-metodi djanjostiċi għall-iskoperta u l-konfermazzjoni ta’ xi mard tal-ħut u li tħassar id-Deċiżjoni 92/532/KEE

(notifikata taħt dokument numru C(2001) 426)

(Test b’ rilevanza għaż-ŻEE)

(2001/183/KE)

IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ,

Filwaqt li kunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi il-Komunità Ewropea,

Filwaqt li kunsidrat id-Direttiva tal-Kunsill 91/67/KEE tat-28 ta’ Jannar 1991 dwar il-kundizzjonijiet dwar saħħa ta’ l-annimali li jirregolaw it-tqegħid fuq is-suq ta’ annimali u prodotti akkwakulturi [1], kif l-aħħar emendata bid-Direttiva 98/45/KE [2], u partikolarment l-Artikolu 15 tagħha,

Billi:

(1) Il-pjanijiet dwar kampjunar u l-metodi djanjostiċi għall-iskoperta u l-konferma ta’ xi mard tal-ħut ġew stabbiliti fid-Deċiżjoni tal-Kummissjoni 92/532/KEE [3], kif emendata bid-Deċiżjoni tal-Kummissjoni 96/240/KE [4].

(2) Minn żmien l-adozzjoni tad-Deċiżjoni 92/532/KEE, saru żviluppi ġodda prattiċi u xjentifiċi, u ġiet emendata d-Direttiva 91/67/KEE. Dan jeħtieġ li l-pjanijiet dwar kampjunar u l-metodi djanjostiċi jiġu aġġornati.

(3) Tali aġġornar tirrelata għall-eżaminazzjoni u l-identifikazzjoni ta’ viruses li jikkawżaw settiċemja virali emorraġika (SVE) u nekrożi ematopejċi infettużi (NEI) u tibdiliet skond l-aħħar emendi tad-Direttiva 91/67/KEE.

(4) Il-laboratorju Komunitarji referenti għall-mard tal-ħut stabbilit bid-Direttiva tal-Kunsill 93/53/KEE [5], ġie kkonsultat.

(5) Il-pjanijiet dwar kampjunar u l-metodi djanjostiċi għall-iskoperta u l-konferma ta’ xi mard tal-ħut introdotti bid-Deċiżjoni 92/532/KEE għandhom jitħassru għall-iskopijiet tal-kjarezza

(6) Il-miżuri provduti f’ din id-Deċiżjoni huma skond l-opinjoni tal-Kumitat Veterinarju Permanenti,

ADOTTAT DIN ID-DEĊIŻJONI:

Artikolu 1

Il-pjanijiet dwar kampjunar u l-metodi djanjostiċi għall-iskoperta u l-konferma ta’ settiċemja virali emorraġika (SVE) u nekrożi ematopejċi infettużi (NEI) huma stabbiliti fl-Anness.

Artikolu 2

Din id-Deċiżjoni tħassar id-Deċiżjoni 92/532/KEE.

Artikolu 3

Din id-Deċiżjoni hija indirizzata lill-Istati Membri.

Magħmula f’ Brussel, fit-22 ta’ Frar 2001.

Għall-Kummissjoni

David Byrne

Membru tal-Kummissjoni

[1] ĠU L 46, tad-19.2.1991, p. 1.

[2] ĠU L 189, tat-3.7.1998, p. 12.

[3] ĠU L 337, tal-21.11.1992, p. 18.

[4] ĠU L 79, tad-29.3.1996, p. 19.

[5] ĠU L 175, tad-19.7.1993, p. 23.

--------------------------------------------------

L-ANNESS

IL-PJANIJIET DWAR KAMPJUNAR U L-METODI DJANJOSTIĊI GĦALL-ISKOPERTA U L-KONFERMA TA’ SETTIĊEMJA VIRALI EMORRAĠIKA (SVE) U NEKROŻI EMATOPEJĊI INFETTUŻI (NEI)

L-INTRODUZZJONI

Dan l-Anness

(a) jipprovdi għal gwidi u ħtiġiet minimi dwar pjanijiet dwar kampjunar u l-metodi djanjostiċi għall-iskoperta u l-konferma tal-preżenza ta’ settiċemja virali emorraġika (SVE) u nekrożi ematopejċi infettużi (NEI);

(b) jintegra d-dispożizzjonijiet ta’ l-Annessi B u C tad-Direttiva 91/67/KEE għall-approvazzjoni ta’ u l-mantenuzzjoni ta’ l-istat ta’ żoni u rziezet f’ żoni mhux approvati;

(ċ) iwaqqaf dispożizzjonijiet li jimmiraw lejn djanjosi tajba ta’ SVE u NEI u lejn l-għarfien uffiċjali ta’ l-istat ta’ żoni u ta’ rziezet fiż-żoni mhux approvati skond l-Artikoli 5 u 6 tad-Direttiva 91/67/KEE;

(d) huwa dirett lejn kemm l-awtoritajiet responsabbli għall-kontroll ta’ SVE u NEI u l-ħaddiema fil-laboratorju li jwettqu t-testijiet rigward lejn il-mard. Għalhekk, jitqiegħed l-enfasi fuq il-proċeduri tal-kampjunar, il-prinċipji u l-applikazzjonijiet ta’ testijiet tal-laboratorji u l-istima tar-riżultati tagħhom, kif ukoll dwar tekniċi dettaljati tal-laboratorju. Iżda fejn xieraq il-laboratjorji jistgħu japplikaw modifiki għat-testijiet deskritti f’ dan l-Anness jew jużaw testijiet differenti, sa fejn tista’ tintwera l-istess sensitivita’ u speċifiċita’.

L-I Parti tinkludi pjanijiet dwar kampjunar u l-metodi djanjostiċi għas-sorveljanza ta’ SVE u NEI sabiex jiġi akkwistat u mantnut stat ta’ żona jew razzett f’ żona mhux approvata.

It-II Parti tiddeskrivi l-proċeduri djanjostiċi għall-konferma ta’ SVE u NEI fil-każ ta’ suspett.

It-III Parti twaqqaf il-kriterji u l-gwidi għal program uffiċjali għall-spezzjonijiet sanitarji, dokumentazzjoni ta’ liberta’ minn SVE u/jew NEI storika.

Ir-IV Parti tagħti rakkmandazzjonijiet dwar il-proċeduri għat-titrazzjoni tal-virus ta’ SVE u NEI biex tiġi verifikata s-suxxettibilita’ tal-kulturi taċ-ċelloli għall-infezzjoni.

Akronimi u taqsiriet huma elenkati fil-V Parti.

I PARTI Il-Pjanijiet dwar kampjunar u l-metodi djanjostiċi għas-sorveljanza ta’ SVE u NEI sabiex jiġi akkwistat u mantnut l-istat approvat ta’ żona jew razzett f’ żona mhux approvata

I. L-Spezzjonijiet u l-kampjunar

1. Dispożizzjonijiet ġenerali dwar spezzjonijiet sanitarji kliniċi, ġbir u għażla ta’ kampjuni għas-sorveljanza ta’ żoni jew irziezet f’ żoni mhux approvati sabiex jiġi akkwistat u mantnut l-istat approvat għal SVE u NEI.

L-spezzjonijiet sanitarji kliniċi u l-kampjunar taċ-ċelloli tal-ħut u/jew fluwidu ovarjan li għandhom jitwettqu f’ żoni jew f’ irziezet li huma f’ żoni mhux approvati sabiex jiġi akkwistat jew mantnut l-istat approvat għal SVE u/jew NEi skond l-Annessi B u C tad-Direttiva 91/67/KEE huma mqassra f’ Tabelli 1A, 1B u 1C. Aktar dettalji jinsabu fil-Partijiet 1.1.2 sa 1.1.4. Tabelli 1A u 1B m’ għandhomx jgħoddu għal irziezet ġodda u rziezet li jibdew l-attivitajiet tagħhom mill-ġdid bil-ħut, bajd jew gamete minn żona approvata jew razzett approvat f’ żona mhux approvata, sakemm jikkonformaw mar-ħtiġiet stabbiliti fid-Direttiva 91/67/KEE, l-Anness C, Parti I.A.6(a) jew I.A.6(b) jew II.A.3(a) jew II.A.3 (b).

L-spezzjonijiet sanitarji kliniċi għandhom jitwettqu matul it-terminu minn Ottubru sa Ġunju jew kull meta t-temperatura ta’ l-ilma huwa inqas minn 14 °C. Meta l-irziezet li għandhom jiġu ispezzjonati darbtejn fis-sena, l-intervalli bejn l-spezzjonijet għandhom ikunu għall-inqas ta’ erba’ xhur. L-unitajiet ta’ produzzjoni kollha (vaski, tankijiet, gaġġeġ, eċċ) għandhom jiġu ispezzjonati għall-preżenza ta’ ħut mejtin, jew li ma jġibux ruħhom b’ mod mhux normali. Għandha tingħata attenzjoni partikolari għal post għall-ħruġ ta’ l-ilma fejn il-ħut ġeneralment jakkumulaw mal-kurrent ta’ l-ilma.

Il-ħut li għandhom jiġu kkampjunatu għandhom jingħażlu kif ġej.

- Jekk mhux preżenti t-troti, ħut biss ta’ din l-ispeċie għandhom jingħażlu għall-kampjunar. Jekk mhux preżenti t-troti, l-kampjun għandu jittieħed minn ħut tal-ispeċie kollha preżenti kulmeta l-ispeċie huma suxxettibbli għal SVE u/jew NEI (kif elenkati fl-Anness A tad-Direttiva 91/67/KEE). L-ispeċie għandhom rappreżentati proporzjonalment fil-kampjun.Jekk aktar minn għajn wieħed jiġi utiliżżat għall-produzzjoni tal-ħut, ħut li jirrappreżenta l-għejun kollha ta’ l-ilma għandhom jiġu inkluż għall-kampjunar.

- Jekk huma preżenti ħut dgħajfa, li ma jġibux ruħhom b’mod normali jew mejtin friski (mhux dekomponuti), għandhom jingħażlu primarjament dawn il-ħut.

- Jekk mhux preżenti dawn il-ħut, il-ħut magħżul għandu jinkludi ħut li jidher normali u b’ saħħtu miġbur b’ tali mod li kull parti tar-razzett kif ukoll il-klassijiet tas-snin kollha huma rappreżentati b’ mod proporzjonat f’ dan il-kampjun.

2. Dispożizzjonijiet speċifiċi, inkluż il-ġbir tal-kampjuni, għas-sorveljanza ta’ żoni jew irziezet f’ żoni mhux approvati sabiex jiġi akkwistat jew mantnut stat approvat għall-SVE u/jew NEI

1. Żona jew razzett f’ żona mhux approvata li titqiegħed taħt is-sorveljanza tas-servizzi uffiċjali tista’ takkwista stat approvat għall-SVE u/jew NEI soġġett jew għal:

(a) Mudell "A" - programm ta’ sorveljanza ta’ sentejn

Wara għall-inqas sentejn ta’ nuqqas ta’ sinjali kliniċi jew oħrajn ta’ SVE u/jew NEI, l-irziezet kollha fiż-żona jew kwalunkwe razzett f’ żona mhux approvata li għandhom jiġu approvati għandhom jiġu ispezzjonati sanitarjament darbtejn fis-sena għal sentejn. Matul dawn is-sentejn ta’ kontroll, li jippreċedu l-akkwistar ta’ stat approvat, in-nuqqas ta’ sinjali kliniċi jew oħrajn ta’ SVE jew NEI għandhom ikunu tkomplew u l-kampjuni għandhom jinġabru għall-eżaminazzjoni skond it-Tabella IA. Oltre, il-kampjuni għandhom jingħażlu, jiġu preparati u eżaminati kif deskritt fil-Partijiet I.I sa I.IV u l-eżaminazzjonijiet laboratorji għandhom ikunu pproduċew riżultati negativi għal SVE u/jew NEI; jew

(b) Mudell "B" - program ta’ sorveljanza ta’ sentejn b’ daqs ta’ kampjun imnaqqas

Wara program uffiċjali ta’ spezzjonijiet sanitarji li jiddokumenta l-liberta’ storika minn SVE u/jew NEI għall-inqas għal erba’ snin, l-irziezet kollha fiż-żona jew kwalunkwe razzett f’ żona mhux approvata li għandhom jiġu approvati għandhom jiġu ispezzjonati sanitarjament darbtejn fis-sena għal sentejn. Matul dawn is-sentenj ta’ kontroll, li jippreċedu l-akkwistar ta’ stat approvat, in-nuqqas ta’ sinjali kliniċi jew oħrajn ta’ SVE jew NEI għandhom ikunu tkomplew u l-kampjuni għandhom jinġabru għall-eżaminazzjoni skond it-Tabella 1B. Oltre, il-kampjuni għandhom jingħażlu, jiġu preparati u eżaminati kif deskritt fil-Partijiet I.I sa I.IV u l-eżaminazzjonijiet laboratorji għandhom ikunu pproduċew riżultati negativi għal SVE u/jew NEI. Sabiex programm ta’ spezzjonijiet sanitarji jingħaraf mis-servizzi uffiċjali għad-dokumentazzjoni dwar libera’ rigward SVE u/jew NEI, għandu jilħaq il-kriterji u l-gwidi stabbiliti fit-III Parti.

2. Dispożizzjonijiet speċjali għall-approvazzjoni ta’ l-irziezet ġodda u rziezet li jibdew l-attivitajiet tagħhom mill-ġdid bil-ħut, bajd jew gamete minn żona approvata jew razzett approvat f’ żona mhix approvata

Irziezet ġodda u rziezet li jibdew l-attivitajiet tagħhom mill-ġdid bil-ħut, bajd jew gamete minn żona approvata jew razzett approvat f’ żona mhux approvata jistgħu jakkwistaw stat skond ir-ħtiġiet stabbiliti fid-Direttiva 91/67/EEC, l-Anness C, I.A.6a/b or II.A.3.a/b. Għalhekk id-dispożizzjonijiet dwar kampjunar fil-Mudelli A u B fuq (Partijiet 1.1.2.1.a u 1.1.21b) m’ għandhomx jgħoddu għal tali rziezet.

3. Programm ta’ sorveljanza għall-mantenuzzjoni ta’ stat approvat għal SVE u/jew NEI Sabiex jinżamm l-istat ta’ żona jew razzett f’ żona mhux approvata għall-SVE

u/jew NEI, għandhom isiru spezzjonijiet u kampjunar għall-eżaminazzjoni skond it-Tabella 1C. Il-kampjuni għandhom jintgħażlu, jiġu ppreparati u eżaminati kif deskritt fil-Partijiet I.I sa I.IV u l-eżaminazzjonijiet laboratorji għandhom ikunu negative dwar l-aġenti ta’ SVE u/jew NEI.

3. Preparament u bgħit tal-kampjuni mill-ħut

Qabel il-bgħit jew trasferiment lil-laboratorju il-biċċiet ta’ organi li ser jiġu eżaminati għandhom jitneħħew mill-ħut b’għodda ta’ dissezzjoni sterili u jiġu trasferiti għal tubi tal-plastik sterili li fihom meżż ta’ transport, i.e., meżż ta’ kultura taċ-ċelloli b’ 10 % serum tal-għoġla u antibjotiċi. Il-kombinazzjoni ta’ 200 fil-peniċillina, 200mg strettomiċina u 200 mg kanamiċina għal kull millilitru (m1) jista’ jiġi rakkmandat, iżda jistgħu jintużaw ukoll antibjotiċi oħrajn ta’ effikaċja pprovata. Il-materjal taċ-ċelloli li għandu jiġi eżaminat huwa l-milsa, l-kliewi ta’ wara, u oltre, jew il-qalb jew l-enċefalon. F’xi każijiet, għandu jiġi eżaminat il-fluwidu ovarjan (Tabelli IA sa C)

Il-fluwidu ovarjan jew il-biċċiet ta’ organi minn massimu ta’ 10 ħutiet (Tabelli 1A sa C) jista’ jinġabar f’ tubu wieħed sterili li fih għall-inqas 4ml meżż ta’ transport u jirrappreżenta kampjun wieħed tal-grupp. Iċ-ċellola f’ kull kampjun għandha tiżen minimu ta’ 0,5 gramma (g).

It-tubi għandhom jitqiegħdu f’ kontenituri insulati (bħal kaxxi tal-polistirena bil-ħitan ħoxnin) flimkien ma’ biżżejjed silġ jew blokkijiet tal-friża biex jiġi aċċertat it-tkessiħ tal-kampjun matul it-trasportazzjoni lejn il-laboratjoru. L-iffriżar għandu jiġi evitat. It-temperatura ta’ kampjun matul it-tranżitu m’ għandha qatt teċċedi 10 °C u s-silġ għad irid ikun preżenti fil-kaxxa tat-trasport ma’ l-irċevuta jew waħda jew aktar mill-blokkijiet għad trid tkun parzjalment jew totalment iffriżata.

L-eżaminazzjoni viroloġika għandha tinbeda mill-aktar fis possibbli u mhux aktar tard minn 48 siegħa wara l-kollezzjoni tal-kampjuni. F’ każijiet eċċezzjonali [1] l-eżaminazzjoni viroloġika tista’ tinbeda mhux aktar tard minn 72 siegħa wara l-ġbir tal-materjal, sakemm il-materjal li għandu jiġi eżaminat huwa mħares mill-mezz tat-trasport u il-ħtiġiet tat-temperatura matul it-trasportazzjoni jistgħu jintlaħqu (Parti 1.1.3, paragrafu 3).

Jista’ jintbagħat ħut sħiħ lil-laboratorju jekk il-ħtiġiet tat-temperatura matul it-trasportazzjoni jistgħu jintlaħqu. Ħut sħiħ jista’ jitgeżwer f’ karta b’ kapaċita’ assorbenti u fl-aħħar jintbagħat f’ basket tal-plastik, imkessaħ kif imsemmi. Il-ħut ħaj jista’ jintbagħat ukoll.

L-imballaġġ u t-tabellar kollu għandu jsir skond ir-regolamenti preżenti tat-trasport nazzjonali u internazzjonali kif xieraq.

4. Ġbir ta’ materjal djanjostiku supplementari

Skond il-ftehim mal-laboratorju djanjostiku involut, jistgħu jinġabru ċelloli oħrajn tal-ħut ukoll u jiġu preparati għal eżaminazzjonijiet supplementari.

II. 11. Il-Preparament ta’ kampjuni għal eżaminazzjoni viroloġika

1. L-Iffriżar f’ każijiet eċċezzjonali

Fejn iqumu diffikultajiet prattiċi (eż., kundizzjonijiet ta’ temp ħażin, jiem li ma jinħadmux, problemi bil-laboratorju, eċċ.) li jrendu impossibbli l-inokulazzjoni taċ-ċelloli f’ 48 siegħa wara l-ġbir tal-kampjuni taċ-ċelloli huwa aċċettabbli li l-eżempji taċ-ċelloli jiġu ffriżati f’ meżż ta’ kultura taċ-ċelloli f’ temperatura ta’ - 20 °C jew inqas u li ssir eżaminazzjoni viroloġika f’ 14-il jum. Iċ-ċelloli, pero’, għandhom jiġu friżati u mdewba biss darba qabel l-eżaminazzjoni. Għandhom jinżammu reġistri bid-dettalji dwar ir-raġuni għal kull iffriżar ta’ kampjuni taċ-ċelloli (bħal maltemp, il-linji taċ-ċelloli mietu, eċċ)

2. L-Omoġenizzazzjoni ta’ l-organi

Fil-laboratorju iċ-ċelloli fit-tubi għandhom jiġu omoġenizzati kompletament (jew b’ stomacher, blender jew mortar u pestle b’ ramel sterili) u wara jiġu sospiżi fil-meżż tat-trasport oriġinali.

Jekk kampjun ikkonsista f’ħuta sħiħa ta’ inqas minn 4 cm, dawn għandhom jiġu kkapuljati b’ imqass sterili jew scalpel wara t-tneħħija tal-ġisem wara l-fetħa taż-żaqq. Jekk kampjun ikkonsista f’ħuta sħiħa ta’ bejn 4cm u 6cm, il-vixxri inklużi l-kliewi għandhom jinġabru. Jekk kampjun ikkonsista f’ħuta sħiħa ta’ aktar minn 6cm, għandhom jinġabru eżempji ta’ ċelloli kif deskritt fil-Parti 1.1.3. L-eżempji taċ-ċelloli għandom jiġu kapuljati b’ imqass sterili jew scalpel u jiġu omoġenizzati kif deskritt fuq u jiġu sospiżi fil-meżż tat-trasport.

Proporzjon finali bejn materjal taċ-ċelloli u trasport għandu jiġi aġġustat fil-laboratorju għal 1:10.

3. Iċ-Ċentrifugazzjoni ta’ omoġenat

L-omoġenat huwa ċentrifugat f’ ċentrifuga mkessħa ta’ 2 °C sa 5 °C f’ 2000 sa 4000 x g għal 15-il minuta u jinġabar is-supernatant u jiġi ttratat jew għal erba’ sigħat f’ 15 °C jew mal-lejl f’4 °C bl-antibjotiċi, eż., gentamiċina 1 mg/ml jista’ jkun utli f’ dan l-istadju.

Jekk il-bgħit tal-kampjun ikun sar f’ meżż ta’ trasport (i.e. b’ esponiment għall-antibjotiċi) it-trattament tas-supernatant bl-antibjotiċi jista’ jitħalla barra.

It-trattament bl-antibjotiċi jimmira li jikkontrolla l-kontaminazzjoni batterjali fil-kampjuni u jrendi l-filtrazzjoni mill-filtri għamla ta’ membrane mhux neċessarji.

Jekk is-supernatant miġbur jinħażen f’ temperature ta’ -80 °C f’ 48 siegħa wara l-kampjunar jista’ jerġa’ jintuża darba biss għal eżaminazzjoni viroloġika.(’) F’ każijiet eċċezzjonali, eż fejn il-ħut jinġabar f’ żoni remoti ħafna bla ebda possibilita’ ta’ posta kuljum.

Fejn ikun hemm diffikultajiet prattiċi (eż, ma jaħdimx l-inkubatur, problemi bil-kulturi taċ-ċelloli eċċ) li jrendu impossibbli l-inokulazzjoni taċ-ċelloli f’ 48 siegħa wara l-ġbir tal-kampjuni taċ-ċelloli,huwa aċċettabbli li l-eżempji taċ-ċelloli jiġu ffriżati f’ meżż ta’ kultura taċ-ċelloli f’ temperatura ta’ - 80 °C jew

inqas li ssir eżaminazzjoni viroloġika f’ 14-il jum/Qabel l-inokulazzjoni taċ-ċelloli is-supernatant jitħallat ma’ partijiet indaqs ta’ grupp imħallat b’ mod xieraq ta’ antisera mas-serotipi indieni tal-virus NPI u jiġi inkuvbat b’ dan għal minimu ta’ siegħa f’ temperature ta’15 °C jew massimu ta’ 18-il siegħa f’ temperature ta’ 4 °C. It-titru tal-antiserum għandu jkun għall-inqas 1/2000 f’ test ta’ newtralizzazzjoni tal-plakka ta’ 50 %.

It-trattament ta’ l-inokuli kollha bl-antiserum għall-virus NPI (virus li f’xi partijiet ta’ l-Ewropa jokkorri fil-50 % tal-kampjunu tal-ħut) jimmira li jipprevjeni ECP minħabba l-virus NPI milli jiżviluppa fil-kulturi taċ-ċelel inokulati kollha. Dan inaqqas id-dewmien ta’ l-eżaminazzjonijiet viroloġiċi kif ukoll in-numru ta’ każijiet li fihom l-okkorrenza ta’ ECP ikollha titqies bħala potenzjalment indikativa ta’ SVEV jew NĦIV.

Meta l-kampjuni jiġu minn unitajiet ta’ produzzjoni meqjusa liberi minn NPI, it-trattament ta’ l-inokuli bl-antiserum għall-virus NPI jista’ jitħalla barra.

III. L-Eżaminazzjoni viroloġika

1. Il-Kulturi taċ-ċelloli u meżżi

BF-2 jew RTG-2 u ċelloli jew EPC jew FHM jitkabbru sa 20 % għal 30 °C f’ meżż xieraq, eż, Eagle’s MEM (jew modifiki tiegħu b’ supplement ta’ 10 % serum fetali bovina u antibjotiċi f’ konċentrazzjonijiet standard.

Meta ċ-ċelloli jiġu kkoltivati fi fliexken magħluqa, huwa rakkmandat li l-meżż jitnaddaf bil-bikarbonat. Il-meżż użat għall-koltivazzjoni taċ-ċelloli f’ unitajiet miftuħa jista’ jintnaddaf b’Tris-HC1 (23 mM) u Na-bicarbonate (6 mM). Il-pH għandu jkun 7,6 ± 0,2.

Il-kulturi taċ-ċelloli li għandhom jintużaw għall-inokulazzjoni b’materja taċ-ċelloli għandhom ikunu żgħażagħ (4 sa 48 siegħa) u jikbru attivament (mhux konfluwenti) meta jiġu innokulati.

2. L-IInnokulazzjoni tal-kulturi taċ-ċelloli

Sospenzjoni ta’ l-organi ttrattata bl-antibjotiċi tiġi innokulata fil-kulturi taċ-ċelloli f’ żewġ taħlitiet, i.e., l-ewwel taħlita u oltre, taħlita tagħha ta’ 1:10, li tirriżulta f’ taħlitiet finali ta’ materjal taċ-ċelloli f’ meżż ta’ kultura taċ-ċelloli ta’ 1:100 u 1:1000 rispettivament, (sabiex tiġi prevenuta interferenza omologa). Għall-inqas żewġ linji taċ-ċelloli għandhom jiġu innokulati. (Ara Parti I. 111.1) Il-proporzjoni bejn id-daqs ta’ l-inoculum u l-volum tal-meżż tal-kultura taċ-ċelloli għandha tkun madwar 1:10.

Għal kull taħlita u kull linja ta’ ċelloli, minimu ta’ xi 2 cm2 arja taċ-ċelloli, li tikkorrispondi għal kontenitur f’ tavla waħda b’ 24 kontenitur tal-kultura taċ-ċelloli. L-użu ta’ tavli tal-kultura taċ-ċelloli hija rakkmandata, iżda unitajiet oħrajn b’ arja simili jew akbar biex jikbru huma aċċettabbli wkoll.

3. L-Inkubazzjoni ta’ kulturi taċ-ċelloli

Kulturi taċ-ċelloli innokulati jiġu inkubati f’ temperature ta’ 15 °C għal 7 sa 10 jiem. Jekk il-kulur tal-meżż tal-kultura taċ-ċelloli jinbidel minn aħmar għal isfar, li jindikat aċidifikazzjoni, għandu jsir aġġustament tal-pH b’ taħlita ta’ bikarbonat sterili jew sustanzi ekwivalenti sabiex tiġi aċċertata s-suxxettibilita’ taċ-ċelloli għall-infezzjoni virali.

Għall-inqas kull sitt xhur jew jekk hija suspettata suxxettibilita’ taċ-ċelloli mnaqqsa, titrazzjoni ta’ stokkijiet iffriżati ta’ SVEV u NĦIV isseħħ sabiex tiġi vverifikata s-suxxettibilita’ tal-kulturi taċ-ċelloli għall-infezzjoni. Proċedura ta’ rakkmandazzjoni hija ppreżentata fil-Parti IV.

4. Il-Mikroskopija

Kulturi taċ-ċelloli inokulati għandhom jiġu ispezzjonati regolarment (għall-inqas tliet darbiet fil-ġimgħa) għall-okkorrenza ta’ ECP bi tkabbir ta’ 40 sa 150 darba. Jekk tiġi osservata ECP ovvja, il-proċeduri ta’ identifikazzjoni tal-virus skond il-Parti I.IV għandhom jinbdew minnufih.

5. Is-Subkultivazzjoni

Jekk ma żviluppat l-ebda ECP wara l-inkubazzjoni primarja għal 7 sa 10 ijiem issir subkultivazzjoni għal kulturi taċ-ċelloli friski bl-użu ta’ arja taċ-ċelloli simili għal dik tal-kultura primarja.

Aliquots ta’ meżż (supernatant) mill-kulturi/kontenituri kollha li jikkonsistu fil-kultura primarja jinġabru skond il-linja ta’ ċelloli 7 sa 10 ijiem wara l-inokulazzjoni. Il-ġabriet imbagħad jiġu inokulati f’ kulturi taċ-ċelloli omoġeni mhux imħallta u mħallta 1:10 (li jirriżultaw f’ soluzzjonijiet finali ta’ 1:10 u 1:100 rispettivament, tas-supernatant) kif deskritt fil-Parti 1.1112. Alternativament, aliquots ta’ 10 % kultura taċ-ċelloli friska li jikkonsistwixxu l-kultura primarja huwa inokulat direttament f’ kontenitur b’ kultura taċ-ċelloli friska (subkultivazzjoni minn kontenitur għall-ieħor). L-inokulazzjoni tista’ tiġi preċeduta mill-preinkubazzjoni tat-taħlitiet bl-antiserum għall- virus NPI f’ taħlita xieraq kif deskritt fil-Parti 1.11.3.

Il-kulturi innokulati huma mbagħad inkubati għal 7 sa 10 ijiem f’ 15 °C b’ osservazzjoni bħal fil-Parti 1 111.4.

Jekk isseħħ ECP tossika fl-ewwel tlitt ijiem ta’ inkubazzjoni, is-subkultivazzjoni tista’ ssir f’ dak l-stadju iżda ċ-ċelloli għandhom imbagħad jiġu inkubati għal sebat ijiem u jerġgħu jiġu subkultivati b’ inkubazzjoni ta’ sebat ijiem oħra. Meta tiżviluppa ECP tossika wara tlitt ijiem, iċ-ċelloli jistgħu jitgħaddew darba u jiġu innokulati biex jiġi akkwistat it-total ta’ 14-il jum mill-innokulazzjoni primarja. M’ għandu jkun hemm l-ebda evidenza ta’ tossiċita’ fl-aħħar sebat ijiem ta’ inkubazzjoni.

Jekk isseħħ kontaminazzjoni batterjali minkejja t-trattament bl-antibjotiċi, is-subkultivazzjoni għandhat tiġi preċeduta minn ċentrifugazzjoni ta’ 2000 sa 1000 x g għal 15 sa 30 min f’ 2 to 5 °C, u/jew filtrazzjoni tas-supernatant minn filtru ta’ 0,45 wm (membrane li ftit jorbot proteini). Oltre dan, il-proċeduri ta’ subkultivazzjoni huma l-istess bħal għal ECP tossika.

IV. L-Identifikazzjoni tal-virus

1. It-Testijiet għall-identifikazzjoni tal-virus

Jekk ġiet osservata evidenza ta’ ECP f’ kultura taċ-ċelloli, jinġabar meżż (supernatant) u jiġi eżaminat b’ waħda jew aktar minn dawn it-tekniċi: newtralizzazzjoni, IF, ELISA. Jekk it-testijiet ma permettewx identifikazzjoni definittiva tal-virus f’ temp ta’ ġimgħa, is-supernatant għandu jintbagħat lil laboratorju nazzjonali ta’ referenza jew għal laboratorju ta’referenza tal-UE għal mard tal-ħut identifikazzjoni immedjata.

2. In-Newtralizzazzjoni

Neħħi ċ-ċelloli mis-supernatant miġbur biċ-ċentrifugazzjoni (2000 sa 4000 x g) jew filtrazzjoni tal-membrane (0,45 wm) b’ membrane li ftit jorbot proteini u ħallat lis-supernatant 1:100 u 1:10 000 f’ meżż ta’ kultura taċ-ċelloli.

Aliquots taż-żewġ taħlitiet ta’ supernatant jitħalltu u jiġu inkubati għal 60 minuta f’ temperatura ta’ 15 °C b’ partijiet indaqs tar-reaġenti segwenti separatament:

- serum li fih antikorpi speċifiċi għal gruppi kontra SVEV f’ taħlita 1:50 (vol:vol) [2]

- serum li fih antikorpi speċifiċi għal gruppi kontra NĦIV f’ taħlita 1:50 (vol:vol) [3]

- ġabriet ta’ antisera kontra s-serotipi indiġeni ta’ IPNV f’ taħlita 1:50 (vol:vol) [4]

- meżż waħdu (kontroll pożittiv)

Minn kull taħlita ta’ supernatant-serum tal-virus għall inqas żewġ kulturi taċ-ċelloli jiġu innokulati b’ 5- pl kull wieħed u mbagħad jiġu inkubati f temperature ta’ 15 °C. Jiġi verifikat l-iżvilupp ta’ ECP kif deskritt fil-Parti 1 111.4.

Xi strains ta’ SVEV ma jirreaġixxux f’ testijiet ta’ newtralizzazzjoni. Tali iżolati għandhom jiġu identifikati b’ IF jew ELISA.

Testijiet ta’ newtralizzazzjoni oħrajn b’ effikaċja ppruvata jistgħu jintużaw alternattivament.

3. L-IF

Biex jiġi identifikat kull iżolat tal-virus, għall-inqas tmien ħġiġiet jew ekwivalent jinżergħu b’ ċelloli ta’ densita’ li twassal għal madwar 60 % sa 90 % konfluwenza wara 24 siegħa ta’ koltivazzjoni. Ċelloli EPC huma rakkmandati għal dan l-iskop minħabba l-aderenza qawwija tagħhom ma’ uċuħ tal-ħġieġ iżda linji oħrajn ta’ ċelloli bħal BF-2, RTG-2 jew FHM jistgħu jintużaw ukoll.

Meta ċ-ċelloli ssedimentaw mal-wiċċ tal-ħġieġ (xi siegħa wara ż-żriegħ) jew meta l-kulturi inkubaw għal sa 24 siegħa, il-virus li għandu jiġi identifikat jiġi inokulat. Jiġu inkokulati erba; kulturi f’ proporzjon ta’ volum għal volum ta’ 1:10, u erba’ kulturi f’ proporzjon ta’ 1:1000. Dawn imbagħad jiġu inkubati f’ temperatura ta’ 15 °C għal 20 sa 30 siegħa.

Wara l-inkubazzjoni, il-kulturi jitlaħalħu darbtejn f’ Eagle’s MEM bla serum, iffissat f’ aċeton 80 % kiesaħ silġ u mbagħad imtebba’ permezz ta’ TAFI ta’ żewġ saffi. L-ewwel saff reaġent jikkonsisti f’ antikorpi poliklonali jew monoklonali ta’ kwalita’ riferenti. It-tieni saff reaġenti huwa antiserum konjugat b’ Florokrom ma’ l-immunoglobulin użat fl-ewwel saff. Għal kull wieħed mill-antisera ttestjat għall-inqas kultura waħda b’ inokulazzjoni b’ doża qawwija u oħra b’ inokulazzjoni b’ doża baxxa għandhom jittebbgħu.Għandhom jiġu inklużi fit-test kontrolli tajbin negative jew pożittivi. Florokromi bħal FIX jew TRITC huma rakkmandati.

Għamel il-kultura mtebba’ b’ salina gliċerola. Eżamina taħt dawl ultravjola inċidenti (UV). Uża lentijiet 10 x jew 12 x u lentijiet ta’ x 25 u x 40 oġġettivi b’ aperture numeriċi > 0,7 u > 1,3, rispettivament.

Din it-teknika IF tingħata bħala eżempju. Xi tekniċi oħrajn IF (rigward kulturi taċ-ċelloli, fissazzjoni u antikorpi ta’ kwalita’ riferenti ta; effikaċja ppruvata jistgħu jintużaw alternativament.(’) Jew kif speċifikat mil-laboratorju referent rigward il-possibbli ċitotossiċità ta’ l-antisera.

4. L-ELISA

Kontenituri f’ platti mikrotitri huma miksija mal-lejl b’ taħlitiet rakkmandat ta’ immunoglobulin purifikat ishma żgħar ta’ antikorpi ta’ kwalita’ ta’referenza.

Wara tlaħliħ tal- kontenituri b’ buffer PBS-Tween-20, il-virus li għandu jiġi identifikat jiżdied mal-kontenituri f’ stadji ta’ taħlit ta’ tnejn jew erbgħa u permess li jirreaġixxi mal-antikorp li jiksi għal 60 minuta f’ temperatura ta’ 37 °C. Wara tlaħliħ b’ buffer PBS-Tween-20, l-antikorpi biotinilati ta’ speċifiċita’ li tikkorrespondi għal dik ta’ l-antikorpi li jiksu jiżdiedu u jiġu permessi li jirreaġixxu għal 60 minuta f’ temperatura ta’ 20 °C. Wara tlaħliħa oħra bħal fuq, streptavidin konjugata b’ HRP jiżdied u jiġi permess li jirraġixxi għal siegħa f’ temperature ta’ 20 °C. Wara l-aħħar tlaħliħa, tiġi viżwalizzata enzyme imwaħħla bl-użu ta’ substrati xierqa ta’ ELISA (OPD jew oħrajn).

Il-verżjoni ta’ ELISA msemmija fuq ibbażat fuq biotina-avidina jingħata bħala eżempju. Jistgħu jintużaw verżjonijiet oħrajn ta’ ELISA b’ effikaċja pruvata minflok.

TABELLA 1A

Skema ta' spezzjoni u kampjunar għal żoni u għal irziezet f' żoni mhux approvati għat-terminu ta' kontroll ta' sentejn li jippreċedi l-akkwist ta' stat approvat għal SVE u NEI

(skond id-Direttiva 91/67/KEE, l-Annessi B u C u d-dispożizzjonijiet fl-I Parti ta' dan l-Anness)

Massimu ta' ħut f' kull vaska: 10

[5] [6] [7] [8]

| Numru ta' ispezzjonijiet kliniċi fis-sena | Numru ta' eżaminazzjonijiet laboratorji fis-sena | [5]Eżaminazzjoni laboratorja għall-preżenza ta' virus |

Numru ta' ħut li qed jikber (Materjal ta' organi) | Numru ta' ħut żgħir (Fluwidu ovarjan) |

Żoni u rziezet kontinentali

(a)Irziezet bil-ħut żgħir | 2 | 2 | 120 (l-ewwel spezzjoni) [6] 150 (it-tieni spezzjoni) | 30 (l-ewwel spezzjoni) [7] 0 (it-tieni spezzjoni) |

(b)Irziezet bil-ħut żgħir biss | 2 | 1 | 0 | 150 (l-ewwel u t-tieni spezzjonijiet) [7] |

(ċ)Irziezet bla ħut żgħir | 2 | 2 | 150 (l-ewwel u t-tieni spezzjonijiet) | 0 |

Żoni u rziezet kostali

(a)Irziezet bil-ħut żgħir | 2 | 2 | 120 (l-ewwel spezzjoni) 150 (it-tieni spezzjoni) | 30 (l-ewwel spezzjoni) [7] 0 (it-tieni spezzjoni) |

(b)Irziezet salmonidi bil-ħut żgħir | 2 | 2 | 30 (l-ewwel u t-tieni spezzjonijiet) [8] | 0 |

(ċ)Irziezet mhux salmonidi bil-ħut żgħir | 2 | 2 | 150 (l-ewwel u t-tieni spezzjonijiet) | 0 |

TABELLA I.B

Skema ta' spezzjoni u kampjunar għal żoni u għal irziezet f'żoni mhux approvati għat-terminu ta' kontroll ta' sentejn li jippreċedi l-akkwist ta' stat approvat għal SVE u NEI f' żoni u rziezet f' żoni mhux approvati bi storja uffiċjalment magħrufa iddokumentata ta' libertà minn dan il-mard

(skond id-Direttiva 91/67/KEE, l-Annessi B u C u d-dispożizzjonijiet fl-I u t-III Partijiet ta' dan l-Anness)

Numru massimu ta' ħut f' kull vaska: 10

[9] [10] [11]

| Numru ta' ispezzjonijiet kliniċi fis-sena | Numru ta' eżaminazzjonijiet laboratorji fis-sena | Eżaminazzjoni laboratorja għall-preżenza ta' virus |

Numru ta' ħut li qed jikber (Materjal ta' organi) | Numru ta' ħut żgħir (Fluwidu ovarjan) |

Żoni u rziezet kontinentali

(a)Irziezet bil-ħut żgħir | 2 | 2 | 0 (l-ewwel spezzjoni) [5] 30 (it-tieni spezzjoni) | 30 (l-ewwel spezzjoni) [6] 0 (it-tieni spezzjoni) |

(b)reine Brutanlagen | 2 | 1 | 0 | 30 (l-ewwel jew it-tieni spezzjoni [6] |

(ċ)Irziezet bla ħut żgħir | 2 | 2 | 30 (l-ewwel u t-tieni spezzjonijiet) | 0 |

Żoni u rziezet kostali

(a)Irziezet bil-ħut żgħir | 2 | 2 | 0 (l-ewwel spezzjoni) 30 (it-tieni spezzjoni) | 30 (l-ewwel spezzjoni) [6] 0 (it-tieni spezzjoni) |

(b)Irziezet salmonidi bil-ħut żgħir | 2 | 2 | 30 (l-ewwel u t-tieni spezzjonijiet) [7] | 0 |

(ċ)Irziezet mhux salmonidi bil-ħut żgħir | 2 | 2 | 30 (l-ewwel u t-tieni spezzjonijiet) | 0 |

TABELLA 1C

Skema ta' ispezzjoni u kampjunar għal żoni u għal irziezet f'żoni mhux sabiex jinżamm l-istat approvat għal SVE u NEI

(skond id-Direttiva 91/67/KEE, l-Annessi B u C u d-dispożizzjonijiet fl-I Parti ta' dan l-Anness)

umru massimu ta' ħut f' kull vaska: 10

[12] [13] [14]

| Numru ta' ispezzjonijiet kliniċi fis-sena | [5]Numru ta' ħut fil-grupp tal-kampjun għall-eżaminazzjoni laboratorja |

Numru ta' ħut li qed jikber (Materjal ta' organi) | Numru ta' ħut żgħir (Fluwidu ovarjan) |

Żoni u rziezet kontinentali

(a)Irziezet bil-ħut żgħir | 2 | 20 (l-ewwel jew it-tieni spezzjoni) I | 10 (l-ewwel jew it-tieni spezzjoni) [6] |

(b)Irziezet bil-ħut żgħir biss | 2 | 0 | 30 (l-ewwel jew it-tieni spezzjoni) [6] |

ċ)Irziezet bla ħut żgħir | 2 | 30 | 0 |

Żoni u rziezet kostali

(a)Irziezet bil-ħut żgħir | 2 | 20 (l-ewwel jew it-tieni spezzjoni) | 10 (l-ewwel jew it-tieni spezzjoni) [6] |

(b)Irziezet bla ħut żgħir | 1 | 30 [7] | 0 |

IT-II PARTI Proċeduri djanjostjiċi għall-konferma ta’ SVE u NEI f’ ġrajjiet suspettati

Għandha ssir teknika waħda jew aktar minn dawn għad-djanjosi ta’ SVE u NEI:

- A. iżolazzoni tal-virus konvenzjonali b’ identifikazzjoni seroloġika sussegwenti tal-virus

- B. iżolazzoni tal-virus b’ identifikazzjoni seroloġika simultanja,

- C. tekniċi djanjostiċi oħrajn (TAFI, ELISA).

Il-konferma ta’ l-ewwel każ ta’ SVE u/jew NEI f’ irziezet f’ żoni approvati m’ għandhiex tkun ibbażata fuq il-metodu C waħda. Għandu jintuża wkoll jew il-metodu A jew il-metodu B.

Il-materjal maħsub għal eżaminazzjoni viroloġika jista’ f’ xi każijiet jeħtieġ li jiġi akkumpanjat minn materjal supplementari għal eżaminazzjoni batterjoloġika, parasitoloġika, ħistoloġika jew oħrajn biex tiġi permessa djanjosi differenzjali.

A. Iżolazzoni tal-virus konvenzjonali b’ identifikazzjoni seroloġika sussegwenti tal-virus

I.1. 1.1. Għażla tal-kampjuni

Ta’ l-inqas 10 ħut li juru sinjali tipiċi tal-virus SVE jew NEI iridu jingħażlu għal eżami

I.2. 1.2. Preparament u bgħit tal-kampjuni mill-ħut

Kif stabbilit fil-Parti 1.1.3

I.3. 1.3. Ġbir ta’ materjal djanjostiku supplementari

Kif stabbilit fil-Parti 1.1.4

II. 11. Preparament ta’ kampjuni għall-eżaminazzjoni viroloġika

Kif stabbilit fil-Parti 1.11

III. Eżaminazzjoni viroloġika

Kif stabbilit fil-Parti 1 111

IV. Identifikazzjoni tal-virus

Kif stabbilit fil-Parti LIV

B. Iżolazzoni tal-virus b’identifikazzjoni seroloġika simultanja

I.1. Għażla tal-kampjuni

Kif stabbilit fil-Parti II.A.I.1

I.2. 1.2. Preparament u bgħit tal-kampjuni mill-ħut

Kif stabbilit fil-Parti 1.1.3

I.3. 1.3. Ġbir ta’ materjal djanjostiku supplementari

Kif stabbilit fil-Parti 1.1.4

II.1. 11.1. Omoġenizzazzjoni ta’ l-organi

Kif stabbilit fil-Parti 1.11.2

II.2. 11.2. Ċentrifugazzjoni ta’ l-omoġenat

L-omoġenat huwa ċentrifugat f’ ċentrifuga mkessħa għal 2 °C sa 5 °C għal 2000 sa 4000 x g għal 15-il minuta u jinġabar is-supernatant u jiġi trattat għal erba’ sigħat f’ temperatura ta’ 15 °C bl-antibjotiċi, eż ġentamiċina f’ 1 mg/ml, jew iffiltrata mill-membrane (0,45 wm) minn membrane li ftit jorbot proteini.

II.3. 11.3. Trattament tas-supernatant b’ antisera djanjostiċi

Is-sospensjoni ta’ organi trattat bl-antibjotiċi jew iffiltrat mill-membrane jitħallat 1:10 u 1:1000 f’ meżż ta’ kultura taċ-ċelloli u jitħalltu aliquots u jiġu inkubati għal 60 minuta f’ temperatura ta’ 15 °C b’ partijiet indaqs tar-reaġenti elenkati fil-Parti LIV.2.

III.1. 111.1. Kulturi taċ-ċelloli u mezzi

Kif stabbilit fil-Parti 1 111.1

III.2. 111.2. Innokulazzjoni tal-kulturi taċ-ċelloli

Minn kull taħlita tas-serum tal-virus (ippreparata kif stabbilit fil-Parti II.B.11.3) jiġu inokulati għall-inqas żewġ kulturi taċ-ċelloli b’ 50 ul kull wieħed.

III.3. 111.3. Inkubazzjoni tal-kulturi taċ-ċelloli

Kif stabbilit fil-Parti 1 111.1

III.4. 111.4. Mikroskopija

Il-kulturi taċ-ċelloli inokulati huma spezzjonati kuljum għall-okkorrenza ta’ ECP bi tkabbir ta’ 40 sa 150 darba. Jekk ECP tiġi prevenuta minn wieħed mill-antisera użati, il-virus jista’ jitqies li ġie identifikat f’ dan is-sens.

Jekk ma tiġix prevenuta ECP b’ xi antisera, għandhom isiru proċeduri ta’ identifikazzjoni tal-virus skond il-Parti I.IV.

III.5. 111.5. Subkultivazzjoni

Jekk ma seħħet l-ebda ECP wara 7 sa 10 ijiem għandha ssir subkultivazzjoni minn kulturi inokulati bis-supernatant u bil-meżż (Parti II.B.11.3) skond il-Parti 1 111.5.

C. Tekniċi djanjostiċi oħrajn

Is-supernatant ippreparat kif deskritt fil-Parti 1.11.2 jista’ jiġi sottomess għal TAFI jew ELISA skond il-PArti LIV.3 jew il-Parti LIVA rispettivament. Dawn it-tekniċi rapidi għandhom jiġu supplimentati b’ eżaminazzjoni viroloġika jew skond A jew skond B fi żmien 48 siegġa mill-kampjunar, jekk:

(a) ikun hemm riżultat negattiv; jew

(b) ikun hemm riżultat pożittiv b’ materjal li jirrappreżenta l-ewwel każ ta; NEI jew SVE f’ żona approvata.

Il-materjal taċ-ċelloli jista’ jiġi soġġettat għal tekniċi djanjostiċi oħrajn bħal RT-PCR, IF fuq taqsimiet iffriżati, immunoħistokimika fuq materjal taċ-ċelloli iffissat bil-formalina. Dawn it-tekniċi għandhom dejjem jiġu akkumpanjati minn inokulazzjoni ta’ materjal taċ-ċelloli mhux iffissata fuq kulturi taċ-ċelloli.

III PARTI Storja dokumentata ta’ liberta’ minn SVE u/jew NEI f’żoni jew irziezet li huma f’żoni mhux approvati

Gwidi u kriterji għal programm uffiċjali ta’ spezzjoni sanitarja

1. Programm uffiċjali ta’ spezzjoni sanitarja tista’ tiġi inizzata biss jew:

- wara progamm ta’ eradikazzjoni uffiċjalment magħruf għal SVEV u/jew NĦIV inkluż it-tneħħija tal-ħut kollha fil-razzett, tindif, diżinfettar, u fallowing qabel stukkjar mill-ġdid bil-ħut minn irziezet approvati, jew

- fuq irziezet bl-ebda storja ta’ infezzjoni minn SVEV jew NĦIV.

2. Il-programm ta’ spezzjonijiet sanitarji għandu jkun ibbażat kemm fuq spezzjonijiet kliniċi kif ukoll eżaminazzjonijiet laboratorji.

3. Il-programm għandu jinkludi żewġ spezzjonijiet kliniċi annwali skond il-gwidi li jinsabu fl-I Parti.

4. Għall-inqas waħda mill-spezzjonijiet imwettqa kull sena, għandhom jinġabru 30 kampjun taċ-ċelloli tal-ħut u/jew fluwidu ovarjan minn kull razzett. Il-kampjuni għandhom jintgħażlu, jiġu ppreparati u soġġettati għal eżaminazzjoni laboratorja skond il-Partijiet I, II u IV.

5. Il-programm ta’ spezzjonijiet sanitarji għandu jsir għall-inqas għal erba’ snin fl-irziezet kolha fiż-żona jew fir-razzett (f’ żona mhux approvata) li għandhom jiġu approvati.

6. Għall-għarfien uffiċjali tal-programm, m’għandu jsir jew jinkixef l-ebda każ ta’ SVE jew NEI (l-ebda infezzjoni klinika jew iżolament tal-virus).

IV PARTI Il-Proċedura għat-titrazzjoni biex tiġi verifikata s-suxxettibilita’ tal-kulturi taċ-ċelloli għall-infezzjoni

Il-proċeduri rakkmandati għat-titrazzjoni msemmija fil-Parti 1 111.3 jingħataw isfel.

Għandhom jintużaw għall-inqas żewġ iżolati ta’ SVEV u iżolat wieħed ta’ NĦIV. L-iżolati għandhom jirrappreżentaw l-akbar grupp ta’ viruses fl-UE, eż, għal SVEV iżolat wieħed patoġeniku mit-troti fl-ilma frisk u iżolat wieħed marin patoġeniku għal rombu u għal NĦIV, strain wieħed patoġeniku tat-troti mill-Ewropa. Għandhom jintużaw iżolati definiti sew mill-Istati Membri. Iżolati referenti huma disponibbli mil-laboratorji ta’ riferenza tal-UE għall-mard tal-ħut.

Gruppi ta’ virus f’ numri baxxi ta’ kulturi taċ-ċelloli huma propagate fi fliexken tal-kulturi taċ-ċelloli fuq ċelloli BF-2 jew RTG-2 għal SVEV u fuq ċelloli EPC jew FHM għal NĦIV. Għandu jintuża meżż ta’ kultura taċ-ċelloli b’ għall-inqas 10 % serum. Uża MOI baxx għall-inokulazzjoni (< 1).

F’ ECP totali, il-virus jiġi maħsud b’ ċentrifugazzjoni tas-supernatant tal-kultura taċ-ċelloli ta’ 2000 x g għal 15-il minuta, sterilizzat bil-filtri minn filtru tal-membrane 0,45 wm u distribwit f’ kriotubi tabellati. Il-virus jinżamm f’ temperatura ta’ - 80 °C.

Ġimgħa wara l-iffriżar, tliet fliexken replikati b’ kull virus jiddewbu taħt ilma kiesaħ u jiġu titrati fuq il-linji rispettivi taċ-ċelloli tagħhom. Għall-inqas kull sitt xhur, jew jekk huwa suspettat li s-suxxetibilita’ ta’ linja taċ-ċelloli naqset, kull iżolat tal-virus jiġi mdewweb jew titrat.

Proċeduri ta’ titrazzjoni għandhom jiġu deskritti fid-dettal u l-istess proċeduri jiġu segwiti kull darba.

Titrazzjoni b’ taħlita fit-tarf għandu jinkludi għall-inqas sitt repliki f’ kull pass ta’ taħlit. It-titri jiġu mqabbla ma’ titri akkwistati qabel. Jekk it-titri ta’ kwalunkwe mit-tliet iżolati tal-virus taqa’ b’ fattur ta’ żewġ logs jew aktar, imqabbel mat-titru inizzjali, il-linja ta’ ċelloli m’ għadx irid jintuża għal skopijiet ta’ sorveljanza.

Jekk jinżammu linji differenti taċ-ċelloli fil-laboratorju kull linja għandha tiġi eżaminata separatament.

Għandhom jinżammu reġistri għall-inqas għal 10 snin

V PARTI L-Akronimi u t-taqsiriet

BF-2 Bluegill fry -2 (cell line)

ECP Effett Ċitopatiku

LRK Laboratorju ta’ riferenza Komunitarju tal-mard tal-ħut

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

EPC Epithelioma papulosum cyprini (linja taċ-ċelloli)

FHM Fathead minnow (linja taċ-ċelloli)

FITC Fluorescein isothiocyanate

Aċtu Sulfoniku Hepes N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethane

HRP Perosidatt tal-Horseradish

IF Immunoflorexxenza

TAFI Test ta’ antikorpi florexxenti indirett

NĦIV Nekrożi ħematopejka infettuża (virus)

NPI Nekrożi Pankreatika Infettuża (virus)

MEM Mezz essenzjali minimu

MOI Multipliċita’ ta’ infezzjoni (proporzjon ta’ partikli tal-virus infettuż miżjuda ma’ numru magħruf ta’ ċelloli f’ kultura)

OPD Ortho phenylene diamine

PBS Phosphate buffered saline

RTG-2 Testikoli tat-troti (linja taċ-ċelloli)

RT-PCR Reversed transcriptase polymerase chain reaction

Tris-HC1 Tris (hydroxymethyl) aminomethane - HC1

TRITC Tetramethyl-rhodamine-isothiocyanate

SVE(V) Settiċimja virali emorraġika (virus)

[1] F' kaæijiet eċċezzjonali, eæ fejn il-ħut jinġabar f' æoni remoti ħafna bla ebda possibilita' ta' posta kuljum.

[2] Jew kif speċifikat mil-laboratorju referent rigward il-possibbli ċitotossiċità ta' l-antisera.

[3] Jew kif speċifikat mil-laboratorju referent rigward il-possibbli ċitotossiċità ta' l-antisera.

[4] Jew kif speċifikat mil-laboratorju referent rigward il-possibbli ċitotossiċità ta' l-antisera.

[5] Alternattivament, jista' jintuża kampjun b' daqs imnaqqas kif elenkat fit-Tabella I.B jekk il-ħtiġiet deskritti fit-test tal-Partijiet 11.1, 1.1.2.1.b u III jintlaħqu.

[6] Spezzjonijiet kliniċi

[7] F' ċirkostanzi eċċezzjonali, jekk huwa impossibbli li jiġi akkwistat fluwidu ovarjan, l-organi jistgħu jiġu kkampjunati minflok.

[8] Il-kampjuni għandhom jinġabru mhux qabel tliet ġimgħat wara t-trasferiment tal-ħut minn ilma frisk għal ilma mielaħ.

[9] Ispezzjonijiet kliniċi.

[10] F' ċirkostanzi eċċezzjonali, jekk huwa impossibbli li jiġi akkwistat fluwidu ovarjan, l-organi jistgħu jiġu kkampjunati minflok.

[11] Il-kampjuni għandhom jinġabru mhux qabel tliet ġimgħat wara t-trasferiment tal-ħut minn ilma frisk għal ilma mielaħ.

[12] F' żoni approvati l-kapmjuni iridu jinġabru b' rotazzjoni f' 50 % ta' l-irziezet tal-ħut kull sena. Fi rziezet approvati f' żoni mhux approvati il-kampjuni jridu jinġabru kull sena.

[13] F' ċirkostanzi eċċezzjonali, jekk huwa impossibbli li jiġi akkwistat fluwidu ovarjan, l-organi jistgħu jiġu akkampjunati minflok.

[14] l-kampjuni għandhom jinġabru mhux qabel tliet ġimgħat wara t-trasferiment tal-ħut minn ilma frisk għal ilma mielaħ.

--------------------------------------------------