1.

ESAO ķīmisko vielu testēšanas vadlīnijas un uz tām pamatotās ES testēšanas metodes tiek regulāri pārskatītas, ņemot vērā tehnikas attīstību, regulatīvo prasību izmaiņas un dzīvnieku labturības apsvērumus. Sākotnējā, jau apstiprinātā testēšanas metode (TM) ādas sensibilizācijas noteikšanai pelēm ir lokālo limfmezglu noteikšanas metode (LLNA; ESAO 429. testēšanas vadlīnijas; šā pielikuma B.42. nodaļa) (1). Ir publicēti LLNA validācijas un ar to saistītā darba pārskati (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Atjauninātās LLNA pamatā ir praktiskās pieredzes un zinātnisko datu izvērtējums (12). Šī ir otrā no divām TM, kas izstrādājamas, lai novērtētu ķīmiskām vielām vai to maisījumiem piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu (dzīvniekiem). Pirmajā TM (ESAO 406. testēšanas vadlīnijas; šā pielikuma B.6. nodaļa) izmanto testēšanu ar jūrascūciņām, proti, maksimizācijas testu jūrascūciņām un Bīlera testu (13). Salīdzinot ar B.6 un EASO 406. testēšanas vadlīnijām (13), LLNA ir pārāka dzīvnieku labturības ziņā. Šī atjauninātā LLNA TM ietver veiktspējas standartus (PS) (1. papildinājums), kurus var izmantot, lai novērtētu tādu jaunu un/vai pārveidotu testēšanas metožu validācijas statusu, kuras ir funkcionalitātes vai noteikšanas mehānisma ziņā līdzīgas LLNA, saskaņā ar ESAO Vadlīniju dokumentā Nr. 34 izklāstītajiem principiem (14).

2.

LLNA pēta ādas sensibilizācijas indukcijas fāzi un sniedz kvantitatīvus datus, kas piemēroti atbildes reakcijas uz devu novērtēšanai. Turklāt jānorāda, ka vieglas/vidējas iedarbības sensibilizatori, kas ir ieteikti kā piemērotas pozitīvās kontroles vielas (PC) jūrascūciņu testa metodēm (B.6; EASO 406. testēšanas vadlīnijas) (13), ir piemēroti arī lietošanai ar LLNA (6) (8) (15). Kā viena no iespējamām pieejām šajā TM aprakstīta reducētā LLNA (rLLNA), kura ļauj maksimāli par 40 % samazināt izmantoto dzīvnieku skaitu (16) (17) (18). rLLNA var izmantot, ja ir regulatīva vajadzība apstiprināt negatīvu ādas sensibilizācijas potenciāla prognozi un ar nosacījumu, ka tiek ievērotas visas pārējās šajā TM aprakstītās LLNA protokola specifikācijas. Negatīvai ādas sensibilizācijas potenciāla prognozei būtu jābalstās uz visu pieejamo informāciju, kā aprakstīts 4. punktā. Lai varētu piemērot rLLNA pieeju, vajadzīgs skaidrs pamatojums un zinātniski argumenti. Ja pretēji gaidītajam ar rLLNA tiek iegūts pozitīvs vai neskaidrs rezultāts, var būt jāturpina testēšana, lai interpretētu vai precizētu minēto rezultātu. rLLNA nebūtu izmantojama ādu sensibilizējošu testējamo vielu bīstamības noteikšanai gadījumos, kad jānovērtē reakcija uz devu, piemēram, nosakot apakškategorijas atbilstīgi Regulai (EK) Nr. 1272/2008 par vielu un maisījumu klasificēšanu, marķēšanu un iepakošanu un ANO Globāli harmonizētajai ķīmisko vielu klasifikācijas un marķēšanas sistēmai.

3.

Definīcijas skatīt 2. papildinājumā.

4.

LLNA ir viena no alternatīvām, kuras var izmantot ķīmisko vielu – potenciālu ādas sensibilizatoru noteikšanā. Tas nenozīmē, ka visos gadījumos LLNA būtu jālieto jūrascūciņu testa vietā (B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (13), bet gan to, ka šī noteikšana ir minētajam testam līdzvērtīga un to var izmantot kā alternatīvu, kuras pozitīvajam vai negatīvajam rezultātam vairs nav vajadzīgs papildu apstiprinājums. Pirms uzsākt pētījumus, testēšanas laboratorijai jāņem vērā visa par testējamo vielu pieejamā informācija. Pie šādas informācijas pieder tās identifikācija un ķīmiskā struktūra, fizikāli ķīmiskās īpašības, citu in vitro vai in vivo veikto toksicitātes testu rezultāti un toksikoloģiskie dati par struktūras ziņā saistītām vielām. Šī informācija jāizvērtē, lai noteiktu LLNA piemērotību konkrētajai vielai (ņemot vērā atsevišķu veidu vielu nesaderību ar LLNA; skatīt 5. punktu) un lai izraudzītos pareizu testējamās vielas devu.

5.

LLNA ir in vivo metode un kā tāda paredz dzīvnieku izmantošanu alerģiskās kontakta sensibilizējošās aktivitātes novērtējumā. Tomēr šim mērķim vajadzīgo dzīvnieku skaits var būt mazāks nekā parasti. Turklāt LLNA piedāvā būtiski uzlabot veidu, kādā dzīvnieki tiek izmantoti alerģiskās kontakta sensibilizācijas testēšanā (mazāk sāpju un ciešanu). LLNA pamatojas uz to imunoloģisko gadījumu izskatīšanu, kurus ķīmiskās vielas stimulē sensibilizācijas indukcijas fāzē. Atšķirībā no testiem ar jūrascūciņām (B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (13) ar LLNA nav jānoskaidro provocētās–inducētās ādas hipersensibilizācijas reakcijas. Turklāt LLNA nav jāizmanto palīgviela, kā tas ir jūrascūciņu maksimizācijas testā (13). Tādā veidā LLNA mazina dzīvnieku sāpes un ciešanas. Neraugoties uz LLNA priekšrocībām salīdzinājumā ar B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijām, ir jāatzīst, ka ir daži ierobežojumi, kas var radīt nepieciešamību izmantot B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijas (13) (piemēram, ar LLNA noteikti šķietami negatīvi dažiem metāliem, šķietami pozitīvi dažiem ādas kairinātājiem [tādiem kā atsevišķas surfaktantu tipa ķīmiskās vielas] (19) (20), vai testējamās vielas šķīdība). Turklāt vajadzība pēc jūrascūciņu testiem (B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (21) var saglabāties attiecībā uz ķīmisko vielu klasēm vai vielām, kuru sastāvā ir funkcionālās grupas, par kurām ir pierādīts, ka tās darbojas kā potenciāli sajaucējfaktori (13). Bez tam, pamatojoties uz ierobežoto validācijas datubāzi, kas sastāvēja pārsvarā no pesticīdu preparātiem, attiecībā uz šāda tipa testējamām vielām (22) drīzāk LLNA, nevis jūrascūciņu tests dos pozitīvu rezultātu. Tomēr, testējot preparātus, varētu līdztekus testēt arī salīdzināšanas vielas (līdzīgas vielas, kuru reakcija ir zināma), lai pierādītu, ka LLNA darbojas pienācīgi (skatīt 16. punktu). Izņemot šādus minētos ierobežojumus, LLNA jāvar izmantot jebkuras vielas testēšanai, ja vien testējamai vielai nav tādu īpašību, kas varētu ietekmēt LLNA precizitāti.

6.

LLNA pamatprincips ir tāds, ka sensibilizatori inducē limfocītu savairošanos limfmezglos, kuri drenē testējamās vielas saņemšanas vietu. Šī savairošanās ir proporcionāla devai un alergēna iedarbīgumam un ir vienkāršs paņēmiens, lai iegūtu kvantitatīvu sensitivitātes mērījumu. Savairošanās pakāpi nosaka, vidējo savairošanos katrā testējamās vielas grupā salīdzinot ar vidējo savairošanos kontroles grupā, kas saņēmusi tikai nesēju (VC). Nosaka attiecību starp vidējo progresiju grupās, kas saņēmušas pētāmo vielu, un progresiju VC grupā; tas ir stimulācijas indekss (SI). Lai testējamo vielu pamatoti klasificētu kā potenciālu ādas sensibilizatoru, SI vērtībai jābūt ≥ 3. Šeit aprakstīto procedūru pamatā ir in vivo veikta radioaktīvā iezīmēšana šūnu savairošanās izmērīšanai aurikulārajos limfmezglos. Tomēr šūnu savairošanās vērtēšanai var izmantot citus beigu punktus ar nosacījumu, ka pilnībā tiek ievēroti PS (1. papildinājums).

7.

Šim testam izvēlētā suga ir peles. Izmanto jaunas, pieaugušas CBA/Ca vai CBA/J līnijas sievišķā dzimuma peles, kas nav dzemdējušas un nav grūsnas. Pētījuma sākumā dzīvniekiem jābūt 8–12 nedēļu veciem, dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām un ne lielākām par 20 % no vidējās masas. Citas līnijas un vīrišķā dzimuma dzīvniekus var izmantot, ja ir iegūts pietiekami daudz datu, lai parādītu, ka LLNA atbildes reakcijā nav nozīmīgu atšķirību, kas specifiskas līnijai un/vai dzimumam.

8.

Ja nav zinātniska pamatojuma, kāpēc peles būtu turamas katra atsevišķi, peles izmitina grupā (23). Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, jābūt 22 ± 3 °C temperatūrai. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50-60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam atbilstoši secībai 12 stundas gaišas, 12 stundas tumšas. Barošanai var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens daudzumu.

9.

Dzīvniekus izvēlas pēc nejaušības principa, marķē individuālai identificēšanai (bet nekādā veidā nemarķē ausis) un tur būros vismaz piecas dienas pirms testa sākuma, lai tos aklimatizētu laboratorijas apstākļos. Pirms apstrādes uzsākšanas visus dzīvniekus apskata, lai pārliecinātos, ka tiem nav novērojami ādas bojājumi.

10.

Cietas ķīmiskās vielas pirms peļu ausu apstrādes izšķīdina vai suspendē, izmantojot šķīdinātājus vai nesējus, un vajadzības gadījumā atšķaida. Šķidras ķīmiskās vielas var izmantot gan atšķaidītas, gan neatšķaidītas. Nešķīstošas ķīmiskās vielas (kādas parasti izmanto medicīnas iekārtās) pirms peļu ausu apstrādes ekstrahē piemērotā šķīdinātājā, lai visas ekstrahējamās sastāvdaļas būtu pieejamas testēšanai. Ja dati par testējamo vielu stabilitāti liecina, ka tās uzglabāt nevar, katru dienu sagatavo svaigas testējamās vielas.

11.

Metodes veiktspējas pienācīgumu parāda ar pozitīvās kontroles vielu (PC) palīdzību, kas ar adekvātu un reproducējamu sensibilitāti reaģē kā sensibilizējošas testēšanas vielas, kuru reakcijas intensitāte ir sīki aprakstīta. Ieteicams paredzēt vienlaicīgu PC, jo tādā veidā var pierādīt laboratorijas spēju atkārtoti un sekmīgi īstenot noteikšanu, kā arī novērtēt iekšlaboratorijas un starplaboratoriju reproducējamību un rezultātu salīdzināmību. Pirms LLNA ieteicams lietotājiem konsultēties ar atbildīgajām iestādēm, jo dažas regulatīvās iestādes pieprasa PC izmantošanu katrā individuālā pētījumā. Attiecīgi labāk ir ikreiz izmantot vienlaicīgu PC, jo tas ļauj neveikt papildu testēšanu ar dzīvniekiem, lai izpildītu prasības, kuras var izrietēt no PC periodiskas izmantošanas (skatīt 12. punktu). PC jādod pozitīva LLNA atbildes reakcija tādā iedarbības līmenī, kurā ir sagaidāms stimulācijas indekss (SI) > 3, salīdzinot ar negatīvās kontroles vielu (NC) grupu. PC deva jāizvēlas tā, lai neizraisītu pārmērīgu ādas kairinājumu vai sistēmisku toksicitāti un lai indukcija būtu atkārtojama, taču ne pārmērīga (tā ir pārmērīga, piemēram, ja SI > 20). Ieteicamākās PC ir 25 % heksilkanēļskābes aldehīds (CAS Nr. 101-86-0) ar acetonu/olīveļļu (4:1 tilp./tilp.) un 5 % merkaptobenzotiazols (CAS No. 149-30-4) ar N,N-dimetilformamīdu (skatīt 1 papildinājuma 1. tabulu). Var būt apstākļi, kad ar pienācīgu pamatojumu var izmantot citas PC, kas atbilst iepriekš minētajiem kritērijiem.

12.

Lai gan vienlaicīgas PC grupas izmantošana ir ieteicama, var būt situācijas, kad laboratorijās, kurās LLNA veic regulāri (t. i., vismaz reizi mēnesī) un kurās tāpēc ir vēsturiska PC datubāze, kas pierāda laboratorijas spēju ar PC iegūt reproducējamus un pareizus rezultātus, adekvātāka var izrādīties periodiska PC izmantošana (t. i., vismaz reizi 6 mēnešos). LLNA metodes adekvātu pārzināšanu var sekmīgi pierādīt, ar PC iegūstot konsekventus pozitīvus rezultātus vismaz 10 neatkarīgās testēšanas reizēs, kuras veiktas samērīgā laika periodā (t. i., ne ilgāk kā gada laikā).

13.

Vienlaicīga PC grupa noteikti jāiekļauj, kad LLNA notiek procedurālas izmaiņas (piemēram, augsti kvalificēta personāla nomaiņa, testēšanas metodes materiālu un/vai reaģentu nomaiņa, cits izmēģinājumu dzīvnieku piegādātājs), un šādas izmaiņas pienācīgi jādokumentē laboratorijas pārskatos. Jānovērtē šādu izmaiņu ietekme uz iepriekš izveidotās vēsturiskās datubāzes adekvātumu un tas, vai vajag veidot jaunu vēsturisku datubāzi, lai dokumentētu ar PC iegūtu rezultātu konsekvenci.

14.

Pētniekiem jāapzinās, ka lēmums par periodisku, nevis vienlaicīgu PC izmantošanu ietekmēs to, kādā mērā par adekvātiem un pieņemamiem varēs uzskatīt negatīvos pētījumu rezultātus, kas bez vienlaicīgas PC iegūti periodiskās PC izmantošanas starplaikos. Piemēram, ja ar periodisko PC pētījumu iegūst šķietami negatīvu rezultātu, var apšaubīt negatīvu testējamās vielas rezultātu, kas iegūts iepriekšējā pieņemamā periodiskā PC pētījuma un nepieņemamā periodiskā PC pētījuma starplaikā. Tāpēc rūpīgi jāizvērtē, vai izmantot vienlaicīgu vai periodisku PC. Tāpat jāizvērtē, kādas ir iespējas vienlaicīgās PC grupā izmantot mazāk dzīvnieku, ja to var zinātniski pamatot un ja laboratorija ar saviem specifiskajiem vēsturiskajiem datiem var pierādīt, ka ir iespējams izmantot mazāk peļu (12).

15.

Kaut arī PC jātestē nesējā, par kuru ir zināms, ka tas izrāda viendabīgu atbildes reakciju (piemēram, acetons/olīveļļa; 4:1 tilp./tilp.), var būt dažas reglamentējošas situācijas, kurās būs nepieciešama arī testēšana nestandarta nesējā (klīniski/ķīmiski piederīgs sastāvs) (24). Ja vienlaicīgo PC testē ar citu nesēju nekā testējamo vielu, vienlaicīgās PC vajadzībām jāparedz atsevišķs VC.

16.

Ja vērtē testējamās vielas, kas pieder konkrētai ķīmisko vielu klasei vai kas dod noteikta diapazona reakciju, var izmantot salīdzināšanas vielas, kuras noder, lai parādītu, ka testēšanas metode darbojas un pienācīgi nosaka šā tipa testējamām vielām piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu. Pienācīgām salīdzināšanas vielām ir jāpiemīt šādām īpašībām:

17.

Uz devas grupu ar vismaz trim testējamās vielas koncentrācijām izmanto vismaz četrus dzīvniekus un vienlaicīgas NC grupu, kas saņem tikai testējamās vielas nesēju, un PC grupu (vienlaicīgu vai nesenu atkarībā no laboratorijas prakses un saistībā ar 11.–15. punktu). Jāapsver iespēja testēt vairākas PC devas, īpaši tad, ja PC testēšana ir periodiska. Izņemot apstrādi ar testējamo vielu, ar kontroles grupu dzīvniekiem rīkojas tieši tāpat kā ar apstrādāto grupu dzīvniekiem.

18.

Devu un nesēja izvēlei jāpamatojas uz atsaucē (3) un (5) sniegtajiem ieteikumiem. Secīgas devas parasti izraugās no atbilstošas koncentrāciju rindas, kā 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, u. c. Koncentrāciju rindas izvēlei jābūt ar adekvātu zinātnisku pamatojumu. Jāizvērtē visa esošā toksikoloģiskā (piemēram, akūta toksicitāte un dermālais kairinājums) un struktūras un fizikālķīmiskā informācija par attiecīgo testējamo vielu (un/vai par struktūras ziņā saistītām vielām), ja tāda ir, un trīs secīgās koncentrācijas jāizraugās tā, lai augstākā no tām izraisītu stiprāko iedarbību, kura vēl nerada sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu (3) (25). Ja šādas informācijas nav, sākumā var būt jāveic priekšskrīninga tests (skatīt 21.–24. punktu).

19.

Nesējs nedrīkst pārmainīt vai maskēt testēšanas rezultātus, un tas jāizraugās tāds, lai šķīdība būtu iespējami lielāka, tā ļaujot iegūt augstāko reāli sasniedzamo koncentrāciju un iegūstot šķīdumu/suspensiju, kas būtu derīga testējamās vielas pielietošanai. Ieteicamie nesēji ir acetons/olīveļļa (4:1 tilp./tilp.), N,N-dimetilformamīds, metiletilketons, propilēnglikols un dimetilsulfoksīds (19), bet var izmantot arī citus, ja tam ir pietiekams zinātniskais pamatojums. Dažos gadījumos papildu kontrolei jāizmanto klīniski atbilstošs šķīdinātājs vai tirdzniecības preparāts, kura sastāvā testējamo vielu tirgo. Īpaši jārūpējas, lai nodrošinātu to, ka hidrofīlas testējamās vielas ir iekļautas nesēja sistēmā, kas mitrina ādu un tūlīt nenotek, un jāizmanto pienācīgi šķīdinātāji (piemēram, 1 % Pluronic® L92). Tādēļ ir jāizvairās no nesējiem, kas satur vienīgi ūdeni.

20.

Izpētot no individuālām pelēm iegūtus limfmezglus, var novērtēt dzīvnieku savstarpējās atšķirības un iegūt testējamās vielas grupas un VC grupas mērījumu statistisku salīdzinājumu (skatīt 35. punktu). Turklāt PC grupas peļu skaita iespējamā samazinājuma izvērtējumam jēga ir tad, ja dati ir par individuāliem dzīvniekiem (12). Dažas regulatīvās iestādes prasa, lai dati būtu par individuāliem dzīvniekiem. Citas turpretim par pieņemamiem var uzskatīt arī datus par apstrādes dzīvnieku grupām, un šādā situācijā lietotājiem ir izvēle starp individuālu un grupas datu vākšanu.

21.

Ja nav informācijas, lai noteiktu augstāko testējamo devu (skatīt 18. punktu), jāveic priekšskrīninga tests, lai definētu ar LLNA testējamo atbilstošo devas līmeni. Priekšskrīninga testa mērķis ir būt par orientieri ar LLNA testējamā maksimālā devas līmeņa izvēlē, ja nav informācijas par koncentrāciju, kādā testējamā viela izraisa sistēmisku toksicitāti (skatīt 24. punktu) un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu (skatīt 23. punktu). Maksimālajam testējamās vielas devas līmenim vajadzētu būt 100 % (šķidrumiem) un augstākajai iespējamajai koncentrācijai (cietām vielām un suspensijām).

22.

Priekšskrīninga testa apstākļi ir identiski pamata LLNA apstākļiem, izņemot to, ka nevērtē progresiju limfmezglos un ka devas grupā var izmantot mazāku skaitu dzīvnieku. Ieteicamais skaits ir viens vai divi dzīvnieki katrā devas grupā. Visām pelēm ik dienas pārbauda to, vai apstrādes vietā nav klīnisku pazīmju, kas liecinātu par sistēmisku toksicitāti vai lokālu kairinājumu. Pirms testa un tā beigās (6. diena) reģistrē dzīvnieku ķermeņa masu. Katrai peles apskata abas ausis, un iespējamo apsārtumu novērtē pēc 1. tabulas punktu skalas (25). Auss biezumu mēra ar piemērotu mērierīci (piemēram, digitālo mikrometru vai “Peacock” tipa biezuma mērierīci) 1. dienā (pirms devas), 3. dienā (aptuveni 48 stundas pēc pirmās devas) un 6. dienā. Turklāt 6. dienā auss biezumu var mērīt ar auss caursišanas paņēmienu pēc tam, kad dzīvnieki ir humāni nonāvēti. Lokālu ādas kairinājumu uzskata par pārmērīgu tad, ja jebkurā mērījumu dienā apsārtuma novērtējums pēc punktu skalas ir ≥ 3 un/vai auss biezums ir palielinājies par ≥ 25 % (26) (27). Lielākā deva, kas izmantojama LLNA pamata testā, ir otrā zemākā deva priekšskrīninga koncentrāciju rindā (skatīt 18. punktu), kas neizraisa sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu.

1.   tabula

Apsārtuma (eritēmas) skala

23.

Papildus auss biezuma 25 % pieaugumam (26) (27) kairinātāju identificēšanai LLNA izmanto arī statistiski nozīmīgus auss biezuma pieauguma rādītājus apstrādātajām pelēm salīdzinājumā ar kontroles grupas pelēm (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Tomēr, lai gan statistiski nozīmīgs pieaugums var arī nesasniegt 25 % robežu, šādu pieaugumu neuzskata par pārmērīga kairinājuma izpausmi (30) (32) (33) (34).

24.

Turpmāk uzskaitītie klīniskie novērojumi, ja tie ir novērtējuma neatņemama daļa, var liecināt par sistēmisku toksicitāti (35) (36), un tāpēc var parādīt, kāds būs LLNA pamata testā izmantojamais maksimālais devas līmenis: nervu sistēmas darbības traucējumi (piemēram, piloarekcija, ataksija, drebuļi un krampji); uzvedības traucējumi (piemēram, agresivitāte, ar personīgo higiēnu saistītās uzvedības maiņa, jūtams aktivitātes samazinājums vai pieaugums); neraksturīga elpošana (piemēram, elpas vilcienu biežuma un intensitātes maiņa, kā apgrūtināta vai spazmatiska elpošana, trokšņi plaušās) un pārmaiņas barības un ūdens uzņemšanā. Turklāt novērtējumā jāņem vērā letarģijas pazīmes un/vai reakcijas samazināšanās un visas klīniskās pazīmes, kas liecina par vairāk nekā mirklīgām sāpēm un ciešanām, vai ķermeņa masas samazinājums par vairāk nekā 5 % laikā no 1. dienas līdz 6. dienai, kā arī mirstības rādītāji. Mirstoši dzīvnieki vai dzīvnieki, kuriem acīmredzami sāp vai kuri smagi un ilgstoši cieš, ir humāni jānonāvē (37).

25.

Eksperimenta grafiks ir šāds:

—   1. diena: Individuāli nosaka un reģistrē katra dzīvnieka masu, izdara un reģistrē klīniskos novērojumus. Katras auss aizmugures virsmu apstrādā ar 25 μl atšķaidījuma, kurš satur attiecīgo testējamo vielu, tikai nesēju vai PC (vienlaicīgu vai nesenu atkarībā no laboratorijas prakses un saistībā ar 11.–15. punktu).

—   2. un 3. diena: Atkārto 1. dienā veikto apstrādi.

—   4. un 5. diena: Apstrāde nenotiek.

—   6. diena: Reģistrē katra dzīvnieka masu. Visām testa un kontroles pelēm astes vēnā injicē 250 μl sterila fosfāta bufera fizioloģiskā šķīduma (PBS), kas satur 20 μCi (7,4 × 105 Bq) tritiāta (3H)-metiltimidīna. Alternatīvi visām pelēm astes vēnā injicē 250 μl sterila PBS, kas satur 2 μCi (7.4 × 104 Bq) 125I–joddeoksiuridīna un 10–5Μ fluordeoksiuridīna. Pēc piecām stundām (5 h) visus dzīvniekus humāni nonāvē. Pelēm izgriež aurikulāros limfmezglus un ievieto PBS katram dzīvniekam atsevišķi (individuālo dzīvnieku pieeja); alternatīvi izgriež visus aurikulāros limfmezglus un ievieto PBS katrai eksperimenta grupai kopā (apstrādes grupas pieeja). Sīkus datus un diagrammas par limfmezglu identificēšanu un izgriešanu skatīt atsaucēs (12). Eksperimenta protokolā var iekļaut papildu parametrus, kas raksturo turpmāku ādas lokālo reakciju pamata pētījuma laikā, piemēram, auss apsārtuma novērtējumu pēc punktu skalas vai auss biezuma mērījumus (nosaka ar mērierīci vai ar auss caursišanas paņēmienu autopsijā).

26.

No abās pusēs izgrieztām limfmezglu šūnām (LNC) iegūtu atsevišķu šūnu suspensiju no atsevišķiem dzīvniekiem vai no apstrādes grupas pagatavo, šūnas saudzīgi mehāniski sadalot caur nerūsējošā tērauda sietu ar 200 μm acu izmēru vai izmantojot citu paņēmienu, kas ir derīgs atsevišķu šūnu suspensiju ieguvei. LNC divreiz mazgā lielā daudzumā PBS, un DNS izgulsnē ar 5 % trihloretiķskābi (TCA) 4 °C temperatūrā 18 stundu laikā (3). Plāksnītes vai nu vēlreiz suspendē 1 ml TCA un pārnes scintilācijas stobriņos, kas satur 10 ml 3H skaitīšanas scintilācijas šķidruma, vai tieši pārnes gamma skaitīšanas caurulītēs 125I skaitīšanai.

27.

3H-metiltimidīna inkorporēšanos mēra ar β-scintilāciju skaitīšanu kā sadalīšanās skaitu minūtē (DPM). 125I-joddeoksiuridīna inkorporēšanos mēra ar 125I skaitīšanu un arī izsaka kā DPM. Atkarībā no izmantotās pieejas inkorporēšanos izsaka kā DPM katrai pelei (individuālā pieeja) vai DPM apstrādes grupai (apstrādes grupas pieeja).

28.

Atsevišķos gadījumos, ja ir regulatīva vajadzība apstiprināt negatīvu ādas sensibilizācijas potenciāla prognozi un ar nosacījumu, ka tiek ievērotas visas pārējās šajā TM aprakstītās LLNA protokola specifikācijas, var izmantot fakultatīvu, rLLNA protokolu (16) (17) (18), kuram vajadzīgs mazāk izmēģinājuma dzīvnieku. Lai varētu piemērot rLLNA pieeju, vajadzīgs skaidrs pamatojums un zinātniski argumenti. Ja iegūtais rezultāts ir pozitīvs vai neskaidrs, var būt jāturpina testēšana, lai interpretētu vai precizētu minēto rezultātu.

29.

Devas grupu skaita samazinājums ir vienīgā atšķirība starp LLNA un rLLNA testēšanas metožu protokoliem, un tāpēc ar rLLNA neiegūst datus par devas un atbildes reakcijas mijiedarbību. Tātad rLLNA neizmanto gadījumos, kad minētā informācija ir vajadzīga. Tāpat kā daudzdevu LLNA gadījumā, testējamās vielas koncentrācijai, kuru vērtē ar rLLNA, jābūt augstākajai koncentrācijai, kura vēl nerada acīmredzamu sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu pelēm (skatīt 18. punktu).

30.

Ikviena pele vismaz reizi dienā ir rūpīgi jānovēro attiecībā uz vietēju kairinājumu apstrādes vietā vai sistēmiskas toksicitātes klīniskajām pazīmēm. Visus novērojumus sistemātiski reģistrē, par katru peli izdarot individuālu ierakstu. Novērošanas plānā jāiekļauj kritēriji, kas ļauj tūlīt identificēt peles, kurām ir sistēmiskas toksicitātes, pārmērīga lokāla ādas kairinājuma vai ādas korozijas pazīmes, lai tām veiktu eitanāziju (37).

31.

Kā norādīts 25. punktā, individuālu dzīvnieku ķermeņa masa ir jānosaka testa sākumā un pirms plānotās humānās nonāvēšanas.

32.

Katras apstrādes grupas rezultātu izsaka ar SI. Ja izmanto individuālo pieeju, SI iegūst, DPM vidējo lielumu katrai pelei katrā testējamās vielas grupā un PC grupā dalot ar DPM vidējo lielumu katrai pelei šķīdinātāja/VC grupā. Tā VC grupās vidējais SI ir 1. Ja izmanto apstrādes grupas pieeju, SI iegūst, dalot katras apstrādes grupas apvienoto radioaktīvo inkorporāciju ar apvienotās VC grupas inkorporāciju; rezultāts ir vidējais SI.

33.

Lēmumu pieņemšanas procesā rezultātu uzskata par pozitīvu, ja SI ≥ 3. Tomēr, nosakot, vai neitrālam tuvu rezultātu varētu uzskatīt par pozitīvu, var ņemt vērā arī devas un atbildes reakcijas stiprumu un šķīdinātāja/nesēja un PC reakcijas statistisko nozīmīgumu un konsekvenci (4) (5) (6).

34.

Ja nepieciešams paskaidrot iegūtos rezultātus, jāņem vērā testējamās vielas dažādās īpašības, tostarp tas, vai tā strukturāli līdzinās jau zināmiem ādas sensibilizatoriem, vai tā izraisa pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu pelēm un kāda veida atbildes reakcija uz devu ir novērota. Šie un citi apsvērumi sīkāk iztirzāti citur (7).

35.

Radioaktivitātes datu vākšana par individuālām pelēm pavērs iespējas statistiskai analīzei par devas un atbildes reakcijas mijiedarbības esību un tās pakāpi šajos datos. Jebkurš statistisks novērtējums var ietvert devas un atbildes reakcijas mijiedarbības novērtējumu, kā arī pienācīgi koriģētus testējamo grupu salīdzinājumus (piemēram, devu pāri grupā un šīs grupas salīdzinājums ar vienlaicīgu VC grupu). Statistiskā analīze var ietvert, piemēram, lineāro regresiju jeb Viljama [William’s] testu, ar ko analizē devas un atbildes reakcijas mijiedarbību tendences, un Daneta [Dunnett] testu, lai salīdzinātu devu pārus. Izvēloties attiecīgu statistiskās analīzes metodi, pētniekam jāapzinās iespējamās mainīgo lielumu nevienādības un citas ar to saistītās problēmas, kuru dēļ var būt nepieciešama datu pārveidošana vai neparametriskā statistiskā analīze. Visādā ziņā iespējams, ka pētniekam SI būs jāaprēķina un statistiskā analīze jāveic gan ar, gan bez dažiem punktveida datiem (respektīvi, neņemot vērā galējības jeb rupjas kļūdas).

36.

Dati jāapkopo tabulā. Individuālu dzīvnieku apstrādes gadījumā jānorāda indivīdu DPM vērtības, grupas vidējā DPM vērtība uz dzīvnieku, attiecīgais kļūdas apzīmējums (piem., SD, SEM) un vidējais SI katrai devas grupai salīdzinājumā ar kontroles VC grupu. Dzīvnieku grupas apstrādes gadījumā jānorāda vidējais DPM un vidējais SI katrai devas grupai salīdzinājumā ar kontroles VC grupu.

37.

Testēšanas pārskatā jābūt iekļautai šādai informācijai:

1)

OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 429, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

2)

Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary, Food Chem. Toxicol., 30, 165-169.

3)

Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications, Toxicol., 93, 13-31.

4)

Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise, J. Toxicol. Environ. Health, 53, 563-79.

5)

Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation, Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002.

6)

Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 34, 985-997.

7)

Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 36, 327-33.

8)

Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins, Toxicol., 146, 49-59.

9)

Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 258-273.

10)

Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34, 274-286.

11)

Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 249-257.

12)

ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]

13)

OECD (1992), Skin Sensitisation. OECD Guideline for Testing of Chemicals No 406, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

14)

OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

15)

Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde, J. Appl. Toxicol., 18, 281-284.

16)

Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal requirements? Contact Dermatitis, 54, 181-185.

17)

ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay (rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre for the Validation of Alternative Methods, April 2007. Available at: [http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf]

18)

ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]

19)

ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]

20)

Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.

21)

Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96.

22)

ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]

23)

ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.

24)

McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71-89.

25)

OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 404, Paris, France. Available at: http://www.oecd.org/document/40/0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

26)

Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances, Toxicologist, 96, 235.

27)

ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]

28)

Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206.

29)

Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions, Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94.

30)

Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals, Toxicol. Meth., 8, 245-256.

31)

Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods, Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506.

32)

Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68.

33)

Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728.

34)

Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract, Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028.

35)

OECD (1987), Acute Dermal Toxicity, OECD Guideline for Testing of Chemicals No 402, Paris, France. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

36)

ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Available at: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm]

37)

OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

1.

Ādas kairinājums ir atgriezeniska audu bojājuma veidošanās ādā ne ilgāk kā 4 stundas pēc testējamās vielas aplicēšanas [saskaņā ar Apvienoto Nāciju Organizācijas (ANO) vielu klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizēto sistēmu (GHS) un Eiropas Parlamenta un Padomes 2008. gada 16. decembra Regulu (EK) Nr. 1272/2008 par vielu un maisījumu klasificēšanu, marķēšanu un iepakošanu (1) (3)]. Šajā testēšanas metodē (TM) aprakstīta in vitro noteikšanas procedūra, kuru var izmantot kairinošu ķīmisku vielu (substanču un maisījumu) bīstamības identificēšanai saskaņā ar 2. kategoriju ANO GHS un ES CLP regulā (1) (2) (3). ES un citos reģionos, kas nav pieņēmuši fakultatīvo ANO GHS 3. kategoriju (vājš kairinātājs), šo TM var izmantot arī neklasificētu ķīmisko vielu identificēšanai, t. i., ANO GHS un ES CLP“neklasificētām” vielām (1) (3). Šo TM var izmantot kā atsevišķu aizstājējtestu, lai noteiktu ādas kairināmību ar ķīmiskām vielām in vivo ādas kairināmības testēšanā ar pakāpeniskas testēšanas stratēģiju (4; šā pielikuma B.4. nodaļa).

2.

Ādas kairinājuma novērtēšanai parasti veic laboratorijas izmēģinājumus ar dzīvniekiem [ESAO 404. testēšanas vadlīnijas; šā pielikuma B.4. nodaļa] (4). Ņemot vērā dzīvnieku labturības apsvērumus, 2004. gadā pārskatīja B.4. metodi, ar ko nosaka ādas kairinājumu/kodīgu jeb korozīvu iedarbību uz ādu pēc pakāpeniskas testēšanas stratēģijas, izmantojot validētas in vitro vai ex vivo metodes un tādā veidā neradot dzīvniekiem sāpes un ciešanas. Trīs validētas in vitro testēšanas metodes ir pieņemtas kā ESAO 430., 431. un 435. testēšanas vadlīnijas (5) (6) (7) un divas no tām kā šā pielikuma B.40. un B.40.a nodaļas, kas izmantojamas korozīvās iedarbības noteikšanai ar pakāpeniskas testēšanas stratēģiju, kā paredz B.4 un ESAO 404. testēšanas vadlīnijas (4).

3.

Šī TM ir par cilvēka veselības beigu punktam atbilstošo ādas kairinājumu. Šajā TM izmanto cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļus (RhE) (kuriem par šūnu avotu izmanto nepārveidotus cilvēka epidermas keratinocītus, ādai reprezentatīvu audu un citoloģisko arhitektūru), kuru bioķīmiskās un fizioloģiskās īpašības kopumā ir ļoti līdzīgas cilvēka ādas virsējās daļas, t. i., epidermas, īpašībām. Šajā TM ietverti arī veiktspējas standarti (PS) (2. papildinājums), kas ļauj novērtēt līdzīgas un modificētas RhE tipa metodes, kuras izstrādājusi EC-ECVAM (8) saskaņā ar ESAO vadlīniju dokumentu Nr. 34 (9).

4.

Eksistē trīs validētas metodes, kuras līdzinās šai TM. Prevalidēšanas, optimizēšanas un validēšanas pētījumi jau pabeigti in vitro metodei (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20), kurā izmanto RhE modeli; komerciāli tā pieejama ar nosaukumu EpiSkinTM (validēta references metode – VRM). Divas pārējās komerciāli pieejamās in vitro ādas kairinājuma RhE metodes, validējot ar PS (21), uzrāda VRM līdzīgus rezultātus; tās ir EpiDermTM SIT (EPI-200) un SkinEthicTM RhE metode (22).

5.

Pirms tādu ierosinātu līdzīgu vai modificētu in vitro RhE metožu, kas nav VRM, EpiDermTM SIT (EPI-200) vai SkinEthicTM RhE metode, izmantošanas regulatīviem mērķiem ir jānosaka šādu metožu ticamība, piemērotība (pareizība) un ierosinātā izmantojuma limiti, tādējādi nodrošinot, ka attiecīgo metodi var uzskatīt par līdzīgu VRM atbilstīgi PS prasībām, kas noteiktas šajā TM (2. papildinājums). Pirms līdzīgas vai modificētas in vitro RhE metodes izstrādes un validēšanas un iesniegšanas regulatīvai apstiprināšanai (23) turklāt ieteicams iepazīties ar ESAO paskaidrojošo pamatdokumentu par in vitro ādas kairinājuma testēšanu.

6.

Definīcijas skatīt 1. papildinājumā.

7.

Saskaņā ar validācijas pētījumu (16) šīs TM iespējas ir ierobežotas tādā ziņā, ka ar šo metodi nevar ķīmiskās vielas klasificēt kā fakultatīvās ANO GHS 3. kategorijas vielas (vāji kairinātāji) (1). Ja metodi izmanto kā daļēju aizstājējtestu, var būt jāveic turpmāka in vivo testēšana, lai pilnībā aprakstītu vielas spēju izraisīt ādas kairinājumu (4; šā pielikuma B.4. nodaļa). Ir atzīts, ka cilvēka ādas izmantošanai jāatbilst nacionālām un starptautiskām ētiskajām normām un nosacījumiem.

8.

Ar šo TM in vitro tiek analizēts ādas kairinātāja komponents pakāpeniskās testēšanas stratēģijā B.4 (ESAO 404. testēšanas vadlīnijas) par ādas koroziju/kairinājumu (4). Lai arī ar šo TM nevar iegūt adekvātus datus par ādas koroziju, jāatzīmē, ka B.40.a (ESAO 431. testēšanas vadlīnijas) par ādas koroziju pamatojas uz tādu pašu RhE testēšanas sistēmu, bet izmanto citu protokolu (B.40.a nodaļa). Šīs metodes pamatā ir RhE modeļi, kuros izmanto cilvēka keratinocītus un kuri tādējādi in vitro pārstāv attiecīgās sugas mērķorgānu. Tā turklāt tiešā veidā aptver iekaisuma kaskādes/mehānisma sākotnējo posmu norisēs (šūnu bojājumi un audu bojājumi, kuru rezultāts ir lokalizēta trauma), kuras notiek, kairinājumam rodoties in vivo. Ar šo TM saistītajā validēšanas procesā ir testēts plašs ķīmisko vielu spektrs, un validācijas pētījuma empīriskā datubāze aptver kopumā 58 ķīmiskas vielas (16)(18)(23). Metode ir derīga cietām vielām, šķidrumiem, puscietām vielām un vaskiem. Šķidrumi var būt ūdens vai neūdens šķīdumu veidā; cietas vielas var būt gan ūdenī šķīstošas, gan nešķīstošas. Ja nepieciešams, cietās vielas pirms aplicēšanas jāsamaļ pulverī; nekāda cita iepriekšēja apstrāde paraugam nav vajadzīga. Validācijas pētījumā vēl nav novērtētas gāzes un aerosoli (24). Kaut arī jādomā, ka vispār ir iespējams tos testēt ar RhE tehnoloģiju, ar pašreizējo TM gāzes un aerosolus testēt nevar. Jāatzīmē arī tas, ka ķīmiskās vielas, kurām ir spilgta krāsa, var ietekmēt šūnu dzīvotspējas mērījumus, un tas jālabo ar pielāgotu kontroli (skatīt 24.–26. punktu).

9.

Vienai atsevišķai testēšanas reizei ar trim audu atkārtojumiem jābūt pietiekamai gadījumos, kad testējamās ķīmiskās vielas klasifikācija ir nepārprotama. Tomēr neskaidros gadījumos, kā nesakritīgi mērījumu rezultāti atkārtojumos un/vai vidējā procentuālā dzīvotspēja 50 ± 5 %, jāapsver vajadzība pēc otrās vai pat pēc trešās testēšanas reizes, ja nesakrīt abu pirmo divu testēšanas reižu rezultāti.

10.

Testējamo ķīmisko vielu topikāli aplicē uz trīsdimensiju RhE modeļa, kuru veido nepārveidoti cilvēka epidermas keratinocīti, kultivēti tā, lai veidotos labi diferencētas daudzslāņu cilvēka epidermas modelis. Tam ir bazālais, spinālais un granulārais slānis, daudzslāņu stratum corneum ar lamelāriem lipīdu starpšūnu slāņiem, kuru uzbūve ir reprezentatīva galvenajām lipīdu klasēm in vivo.

11.

Ķīmisku vielu izraisīts ādas kairinājums, kas izpaužas kā apsārtums un pietūkums, ir notikumu kaskādes rezultāts, kuras sākums ir iespiešanās stratum corneum un bojājumi zem tā esošajos keratinocītu slāņos. Mirstošās keratinocītu šūnas izdala mediatorus, kas sāk iekaisuma kaskādes norises, kuras ietekmē dermis esošās šūnas, jo sevišķi stromālās un endoteliālās šūnas. Novēroto apsārtumu un pietūkumu izraisa endoteliālo šūnu dilatācija un pieaugošā caurlaidība (24). RhE izmantojošās metodes mēra notikumu kaskādes sākuma norises.

12.

Šūnu dzīvotspēju RhE modeļos mēra pēc vitālās krāsvielas MTT [3 (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijbromīds, tiazolilzilais; CAS Nr. 298-93-1)] konversijas ar enzīmu par zilas krāsas formazāna sāli, kura daudzumu audu ekstraktā nosaka kvantitatīvi (25). Kairinošas ķīmiskās vielas tiek klasificētas pēc šūnu dzīvotspējas samazināšanās zemāk par kādu noteiktu iepriekš pieņemtu robežvērtību (t. i., ≤ 50 %, ANO GHS/ES CLP 2. kat. kairinošās vielas). Atkarībā no regulatīvās sistēmas, kurā izmanto šīs TM rezultātus, ķīmiskās vielas, ar kurām šūnu dzīvotspēja ir augstāka par noteikto robežvērtību, var uzskatīt par kairinājumu neizraisošām (t. i., > 50 %, neklasificētas vielas).

13.

Pirms sākt plaši izmantot kādu no trijām ar šo TM saistītajām validētajām testēšanas metodēm, tehniskās prasmes uzskatāmai parādīšanai laboratorijām jāizmanto desmit references vielas, kas norādītas 1. tabulā. Attiecībā uz līdzīgām metodēm, kas izstrādātas saskaņā ar šo TM, vai uz kādas no triju validēto metožu modifikācijām, pirms sākt attiecīgās metodes izmantošanu regulatīvās testēšanas vajadzībām, jābūt izpildītām šai TM noteikto veiktspējas standartu (PS) prasībām, kas aprakstītas 2. papildinājumā.

14.

Ieteicams, lai prasmes demonstrēšanas ietvaros lietotājs pēc audu saņemšanas verificētu šo audu barjeras funkcijas, kā precizējis RhE modeļa ražotājs. Īpaši svarīgi tas ir tad, ja audu sūtījums veicis tālu ceļu vai aizņēmis ilgu laiku. Kad metode ir sekmīgi apgūta un tās izmantošanas prasme uzskatāmi parādīta, šādu verifikāciju vairs nav nepieciešams veikt katru reizi. Tomēr, ja metodi izmanto parastajā praksē, ir ieteicams turpināt regulāri novērtēt šīs barjeras funkcijas.

1.   tabula

References vielas  (8)

15.

Turpmāk aprakstīti ādas kairinājuma noteikšanai izmantojamās RhE metodes komponenti un procedūras. Jārekonstruē RhE modelis, kuru sagatavo laboratorijā vai iegūst no komerciāliem avotiem. Par EpiSkinTM, EpiDermTM SIT (EPI-200) un SkinEthicTM RhE ir pieejamas standartoperāciju procedūras (SOP) (26)(27)(28). Testēšana jāveic, ievērojot turpmāk aprakstītos noteikumus.

16.

Epitēlija rekonstruēšanai jāizmanto nepārveidoti cilvēka keratinocīti. Zem funkcionāla stratum corneum jābūt vairākiem dzīvotspējīgu epitēlija šūnu slāņiem (bazālajam slānim, stratum spinosum, stratum granulosum). Stratum corneum jābūt daudzslāņu, ar raksturīgo lipīdu profilu, kas izveido funkcionālo barjeru, kura novērš citotoksisko marķieru, piemēram, nātrija dodecilsulfāta (SDS) vai Triton X-100, ātru penetrāciju. Barjeras funkcija jānovērtē, nosakot koncentrāciju, pie kuras ķīmiskais marķieris pēc noteikta ekspozīcijas laika samazina audu dzīvotspēju par 50 % (IC50), vai nosakot ekspozīcijas laiku, pēc kura noteiktas fiksētas koncentrācijas ķīmiskā marķiera iedarbībā audu dzīvotspēja samazinās par 50 % (ET50). RhE modeļa aizturēšanas īpašībām jānovērš ap stratum corneum esošā materiāla pāreja dzīvotspējīgos audos, kuras dēļ var tikt nepareizi modelēta faktiskā iedarbība uz ādu. RhE modelis nedrīkst būt kontaminēts ar baktērijām, vīrusiem, mikoplazmu un sēnītēm.

17.

Metode dzīvotspējas noteikšanai ir MTT metode (25). RhE modeļa lietotājiem jānodrošina, ka visas izmantotās RhE modeļa partijas atbilst negatīvās kontroles (NC) vajadzībām definētajiem kritērijiem. Ekstrakcijas šķīduma optiskajam blīvumam (OD) jābūt pietiekami zemam, t. i., OD< 0,1. Pieņemamības diapazonu (augšējā un apakšējā robeža) negatīvās kontroles OD vērtībām (resp., ādas kairinājuma testēšanas metodes apstākļus) nosaka RhE modeļa izstrādātājs/piegādātājs; pieņemamības diapazons trijām validētajām metodēm ir norādīts 2. tabulā. Jādokumentē ar NC apstrādāto audu stabilitāte kultūrā (jābūt ar salīdzināmiem dzīvotspējas rādītājiem) visas testa ekspozīcijas laikā.

2.   tabula

Pieņemamības diapazons negatīvās kontroles OD vērtībām

18.

Stratum corneum un tā lipīdu sastāvam jābūt tādam, lai aizturētu citotoksisku ķīmisko marķieru, piemēram, SDS vai Triton X-100, ātru penetrāciju, ko nosaka pēc IC50 vai ET50 (3. tabula).

19.

Jāveic RhE modeļa histoloģiski izmeklējumi, lai demonstrētu modeļa līdzību cilvēka epidermas struktūrai (ieskaitot daudzslāņu stratum corneum).

20.

Ar pozitīvās kontroles (PC) ķīmisko vielu un negatīvo kontroli (NC) iegūtajiem testēšanas metodes rezultātiem uzskatāmi jāparāda to reproducējamība laikā.

21.

RhE modeļa izstrādātājam/piegādātājam jānodrošina un uzskatāmi jāparāda, ka visas izmantotās RhE modeļa partijas atbilst definētajiem produkcijas pieņemamības kritērijiem, kuru vidū piemērotākie ir dzīvotspēja (17. punkts), barjeras funkcija (18. punkts) un morfoloģija (19. punkts). Šie dati jādara pieejami metodes lietotājiem, lai tie šo informāciju iekļautu testēšanas pārskatā. RhE modeļa izstrādātājam/piegādātājam (vai pašiem testētājiem gadījumos, kad izmanto pašizgatavotus modeļus) jānosaka IC50 vai ET50 vērtību pieņemamības intervāls (augšējā un apakšējā robeža). Kairinātāja klasifikācijas prognozēšanai ir derīgi tikai ar prasībām atbilstošiem audu modeļiem noteiktie rezultāti. Kā piemērs 3. tabulā norādīti trijām validētajām metodēm noteiktie pieņemamības intervāli.

3.   tabula

Partiju QC pieņemamības intervāli

22.

Katrai testējamai ķīmiskajai vielai un kontroles vielai katrā testēšanas reizē vajadzīgi vismaz trīs atkārtojumi. Testējamās ķīmiskās vielas, kas ir šķidras vai cietas vielas, uz epidermas virsmas vienmērīgā slānī jāaplicē pietiekamā daudzumā, t. i., minimāli 25 μl/cm2 vai 25 mg/cm2, raugoties, lai netiktu testēta nefiksēta deva. Testējot cietas vielas, lai nodrošinātu iespējami labāku testējamās vielas un epidermas virsmas kontaktu, pirms to aplicēšanas epidermas virsma jāsamitrina ar dejonizētu vai destilētu ūdeni. Ja iespējams, cietas vielas jātestē smalka pulvera veidā. Ekspozīcijas perioda beigās testējamā ķīmiskā viela no epidermas virsmas rūpīgi jānoskalo ar piemērotu buferšķīdumu vai 0,9 % NaCl. Atkarībā no lietotā RhE modeļa (validēti ir trīs modeļi) ekspozīcijas laiks var būt no 15 līdz 60 minūtēm, bet inkubēšanas temperatūra no 20 līdz 37 °C. Ekspozīcijas periodus un temperatūras optimizē katrai RhE metodei atsevišķi, un tie kļūst par konkrētajai metodei raksturīgajām iezīmēm; metodes sīkāk skatīt standartoperāciju procedūrās (SOP) (26) (27) (28).

23.

Katrā testēšanas reizē jāizmanto paralēlas NC un PC, lai uzskatāmi parādītu, ka šūnu dzīvotspēja (ar NC), barjeras funkcija un audu jutība (ar PC) ir iepriekš noteiktajā vērtību pieņemamības intervālā. Ieteicamā PC ir nātrija dodecilsulfāta 5 % šķīdums ūdenī. Ieteicamās NC ķīmiskās vielas ir ūdens vai fizioloģiskais šķīdums ar fosfātbuferi (PBS).

24.

Testēšanas procedūras svarīgākais elements ir ievērot, ka dzīvotspējas mērījumus nedrīkst veikt tūlīt pēc testējamo vielu ekspozīcijas un ka noskalotajiem audiem jaunā barotnē ir vajadzīgs pietiekami ilgs pēcekspozīcijas inkubēšanas laiks. Šajā laikā izzūd vājas citotoksiskas iedarbības pazīmes un parādās nepārprotamas citotoksiskas iedarbības izpausmes. Testa optimizācijas posms (11) (12) (13) (14) (15) parādīja, ka optimāls ir 42 stundu ilgs pēcekspozīcijas inkubēšanas laiks.

25.

Šūnu dzīvotspējas mērīšanai ar šo TM izmantojamā validētā kvantitatīvā metode ir MTT noteikšana. Tā ir audu trīsdimensiju modelim piemērota metode. Audu paraugu uz 3 stundām pārnes atbilstošas koncentrācijas (piemēram, 0,3-1 mg/ml) MTT šķīdumā. Pēc tam veic nogulsnētā zilas krāsas formazāna produkta ekstrakciju ar šķīdinātāju (piemēram, izopropanolu vai paskābinātu izopropanolu) un nosaka formazāna koncentrāciju, mērot optisko blīvumu pie viļņa garuma 570 nm ± 30 nm.

26.

Testējamās ķīmiskās vielas optiskās īpašības vai ķīmiskās reakcijas ar MTT var traucēt noteikšanu, un tāpēc dzīvotspēja var būt noteikta nepareizi (jo testējamā ķīmiskā viela var gan kavēt, gan veicināt krāsas veidošanos vai atkrāsošanos). Tas var notikt gadījumos, kad testējamo ķīmisko vielu pilnībā nenoskalo no audiem vai tad, ja tā iespiežas epidermā. Ja testējamā ķīmiskā viela tieši iedarbojas uz vitālo krāsvielu MTT (MTT reducētājs), tai ir krāsa vai krāsa izveidojas ekspozīcijas laikā, testējamo ķīmisko vielu radīto dzīvotspējas mērījumu traucējumu noteikšanai un korekcijām jāizmanto papildu kontroles. SOP par trijām validētajām metodēm ir pieejams sīks apraksts par to, kā koriģēt tiešo MTT redukciju un traucējumus, ko rada vielas, kam ir krāsa (26) (27) (28).

27.

Katrai metodei, kurā izmanto testēšanai derīgas RhE modeļu partijas (sk. 21. punktu) ar NC vielu apstrādātajiem audiem noteiktajām optiskā blīvuma vērtībām jāraksturo šo audu kvalitāte visos nosūtīšanas un saņemšanas cikla posmos un visos protokola procesos. Optiskā blīvuma kontrolvērtības nedrīkst būt zemākas par vēsturiski noteiktajām robežvērtībām. Arī datiem par audiem, kas apstrādāti ar PC vielu, t. i., nātrija dodecilsulfāta (SDS) 5 % šķīdumu ūdenī, jāraksturo audiem saglabājusies spēja reaģēt uz ķīmisko kairināju TM apstākļos (26) (27) (28). Jānosaka attiecīgi kritēriji par audu testēšanas atkārtojumos noteikto rezultātu pieļaujamo mainību (piemēram, ja par šādu kritēriju izmanto standartnovirzi (SD), tai jāiekļaujas vienpusējā 95 % pielaides intervālā, kas aprēķināts pēc vēsturiskiem datiem; VRM SD < 18 %).

28.

Katrai testējamajai ķīmiskajai vielai iegūtās optiskā blīvuma vērtības var izmantot dzīvotspējīgo šūnu daļas aprēķināšanai salīdzinājumā ar NC, kuru pieņem par 100 %. Precīzi jānosaka un jādokumentē šūnu dzīvotspējas robežvērtība, pēc kuras identificē un atšķir testējamās kairinošās ķīmiskās vielas no šādi neklasificētajām ķīmiskajām vielām, kā arī testēšanas rezultātu izvērtēšanai izmantotās statistiskās procedūras, un uzskatāmi jāparāda to piemērotība. Kairināmības prognozēšanas robežvērtības ir šādas:

29.

Par katru noteikšanas reizi, arī par atkārtotiem eksperimentiem, ja tos veic, tabulas veidā apkopo visus datus par visiem testējamo audu atkārtojumiem (piemēram, optiskā blīvuma vērtības, datus par testējamās vielas ietekmi uz šūnu dzīvotspēju un tās klasifikācijas datus). Par katru noteikšanas reizi jānorāda rezultāta vidējā vērtība ± standartnovirze. Par katru testējamo vielu jādokumentē novērotā iedarbība ar MTT reaģentu un testējamo ķīmisko vielu, kurai ir krāsa.

30.

Testēšanas pārskatā jābūt iekļautai šādai informācijai:

1)

UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York and Geneva. Available at: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]

2)

EC-ECVAM (2009), Statement on the “Performance under UN GHS of three in vitro assays for skin irritation testing and the adaptation of the Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards”, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 9 April 2009. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

3)

Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No 1907/2006. OV L 353, 31.12.2008., 1. lpp.

4)

OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 404, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

5)

OECD (2004), In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 430, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

6)

OECD (2004), In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 431, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

7)

OECD (2006), In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

8)

EC-ECVAM (2009), Performance Standards for in vitro skin irritation test methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

9)

OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

10)

Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, Results and evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57-93.

11)

Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in Vitro 16, 765–770.

12)

Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests, ALTEX 21, 107–114.

13)

Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests – An assessment of the performance of the optimised test, ATLA 33, 351-367.

14)

Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. (2005), The in vitro acute skin irritation of chemicals: optimisation of the EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process, ATLA 33, 329-349.

15)

Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irritation Task Force report 2, ATLA 30, 109-129.

16)

Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test, ATLA 35, 559-601.

17)

Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1-α. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

18)

Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 603-619.

19)

Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007), In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy - Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 351-358.

20)

EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of in vitro tests for skin irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 April 2007. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

21)

EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation testing. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

22)

EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of in vitro tests for skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC29), 5 November 2008. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

23)

OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test Guideline on in vitro skin irritation testing. OECD Series on Testing and Assessment, No. 137, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/document/24/0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1_1_1,00.html]

24)

Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004), In vitro skin irritation: fact and future. State of the art review of mechanisms and models, Toxicol. in Vitro 18, 231-243.

25)

Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods 65, 55-63.

26)

EpiSkinTM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation Validation Study: Validation of the EpiSkinTM test method 15 min - 42 hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

27)

EpiDermTM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for: In vitro EpiDermTM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corporation’s reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

28)

SkinEthicTM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irritation test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

29)

Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, pp 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc Graw-Hill, New York.

30)

Commission Directive 2001/59/EC of 6 August 2001 adapting to technical progress for the 28th time Council Directive 67/548/EEC on the approximation of laws, regulations and administrative provisions relating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances, OV L 225, 21.8.2001., 1. lpp.

31)

Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Contact Dermatitis 51, 1-4.

32)

Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irritation and photo-irritation patch test data with cellular in vitro assays and animal in vivo data, ALTEX, 14, 359-365.

33)

Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch test data with in vitro skin irritation assays and animal data, Contact Dermatitis, 62, 109-116.

1.

In vitro mikrokodolu (MNvit) noteikšana ir genotoksicitātes tests mikrokodolu (MN) noteikšanai starpfāzu šūnu citoplazmā. Mikrokodoli var būt no acentriskiem hromosomu fragmentiem (t. i., tādiem, kuriem nav centromēra) vai no veselām hromosomām, kuras šūnu dalīšanās anafāzē nespēj atvirzīties uz šūnas poliem. Noteikšanā reģistrē klastogēno un aneigēno ķīmisko vielu (substanču un maisījumu) (1) (2) aktivitāti šūnās, kurās testējamās vielas iedarbības laikā vai pēc tās ir notikusi šūnu dalīšanās. Šī testēšanas metode (TM) ļauj izmantot testēšanas protokolu ar aktīna polimerizācijas inhibitoru citotalazīnu B (cytoB) vai bez tā. CytoB pievienošana pirms mērķmitozes ļauj identificēt un selektīvi analizēt mikrokodolu sastopamību šūnās, kurās noslēdzies viens mitozes cikls (jo šādās šūnās ir divi kodoli) (3) (4). Turklāt, ja ir pierādījumi tam, ka analizējamā šūnu populācijā ir notikusi mitoze, šī TM ļauj izmantot testēšanas protokolus, kuri neparedz citokinēzes bloķēšanu.

2.

Papildus MNvit noteikšanas izmantojumam mikrokodolus inducējošu ķīmisku vielu (substanču un maisījumu) identificēšanai ir vēl citi noderīgi paņēmieni, kā iegūt informāciju par hromosomu bojājumu mehānismiem un mikrokodolu veidošanos, piemēram, citokinēzes bloķēšana, kinetohoru imūnķīmiskā iezīmēšana vai hibridizēšana ar centromēru/telomēru zondēm (fluorescenta in situ hibridizēšana, FISH) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Iezīmēšanas un hibridizēšanas procedūras var izmantot, ja pastiprinās mikrokodolu veidošanās un pētnieks vēlas noskaidrot, vai šā pastiprinājuma izraisītāja iedaba ir klastogēna un/vai aneigēna.

3.

Mikrokodoli reprezentē meitasšūnām nodotos bojājumus, bet metafāzes šūnās uzskaitītās hromosomu aberācijas tālāk nodotas netiek. Tā kā mikrokodolu novērtējums interfāzes šūnās var būt relatīvi objektīvs, laboratorijas personāla vienīgais uzdevums ir noteikt, vai šūnās ir notikusi dalīšanās un cik daudz ir šūnu, kas satur mikrokodolu. Rezultātā uzskaiti preparātos iespējams paveikt relatīvi ātri, un analīzi var automatizēt. Tāpēc ir praktiski iespējams vienā apstrādes reizē uzskaitīt tūkstošiem, nevis simtiem šūnu un tādā veidā palielināt noteikšanas nozīmību. Visbeidzot, tā kā mikrokodoli var izveidoties no salīpošām hromosomām, ar šo metodi potenciāli var detektēt aneiploīdiju ierosinošos aģentus, kurus ir sarežģīti pētīt ar parastajiem hromosomu aberācijas testiem (piemēram, ESAO 473. testēšanas vadlīnijas; šā pielikuma B.10. nodaļa) (17). Tomēr ar MNvit noteikšanu, ja neizmanto tādus īpašus paņēmienus kā 2. punktā aprakstītais FISH, nav iespējams diferencēt poliploīdiju un klastogenitāti inducējošas ķīmiskas vielas.

4.

MNvit noteikšana ir in vitro metode, kurā parasti izmanto cilvēka vai grauzēju šūnu kultūras. Tā dod visaptverošu pamatu hromosomu bojājumu potenciāla izpētei in vitro, jo ļauj detektēt gan aneigēnus, gan klastogēnus.

5.

MNvit noteikšana ir noturīga un efektīva dažādu tipu šūnās, ar cytoB vai bez tā. Bagātīgs datu klāsts apstiprina MNvit noteikšanas derīgumu dažādās grauzēju šūnu līnijās (CHO, V79, CHL/IU un L5178Y) un cilvēka limfocītos (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Īpaši jāatzīmē starptautiskie validācijas pētījumi, kuru norisi koordinējusi Francijas Genotoksikoloģijas biedrība [Société Française de Toxicologie Génétique] (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22), un Starptautiskā Genotoksikoloģijas darbsemināra materiāli (4) (16). Veicot retrospektīvu validācijas pētījumu, pieejamos datus turklāt pēc zinātnisko pierādījumu nozīmīguma principa atkārtoti izvērtējis Eiropas Komisijas izveidotais Eiropas Alternatīvo metožu validēšanas centrs (ECVAM), un ECVAM zinātniskā padomdevēja komiteja (ESAC) šo testēšanas metodi ir akceptējusi kā zinātniski derīgu (32) (33) (34). Aprakstīta arī cilvēka TK6 limfoblastoīdo šūnu līnijas (35) HepG2 šūnu (36) (37) un Sīrijas kāmja embrija primāro šūnu (38) izmantošana, taču par tām nav bijis validācijas pētījumu.

6.

Definīcijas skatīt 1. papildinājumā.

7.

In vitro testos parasti jāizmanto metaboliskajai aktivācijai eksogēns avots, izņemot ja šūnas attiecībā uz testējamām vielām ir metaboliski kompetentas. Eksogēnā metaboliskās aktivācijas sistēma nav pilnībā identiska in vivo apstākļiem. Jāpievērš uzmanība tam, lai novērstu apstākļus, kuros iegūst šķietami pozitīvus rezultātus, kas neliecina par testējamai vielai piemītošu mutagenitāti, bet kuru cēlonis ir vērā ņemamas izmaiņas pH vai osmozē vai paaugstināta citotoksicitāte (39) (40) (41). Ja testējamā viela tās pievienošanas laikā izmaina barotnes pH, tas jākoriģē, ieteicams, ar buferšķīdumu, ko pievieno izejas standartšķīdumam, lai pH visos tilpumos, koncentrācijās un barotnēs būtu vienāds.

8.

Mikrokodolu indukcijas analīzē izšķiroša nozīme ir tam, lai apstrādātajās un neapstrādātajās kultūrās būtu notikusi mitoze. Mikrokodolu uzskaitei labākais laiks ir tad, kad testējamās vielas pievienošanas laikā vai pēc tam šūnās ir noslēgusies viena mitoze.

9.

Uz cilvēka vai zīdītāju izcelsmes šūnu kultūrām iedarbojas ar testējamo vielu, izmantojot eksogēnu metaboliskās aktivācijas avotu un arī bez tā, izņemot ja lieto šūnas ar adekvātu metabolisko kapacitāti. Visos testos izmanto vienlaicīgas šķīdinātāja/nesēja kontroles (VC) un pozitīvās kontroles (PC) ķīmiskās vielas.

10.

Uz šūnām iedarbojas ar testējamo vielu, un iedarbības laikā vai pēc tās šūnas kultivē pietiekami ilgu laiku, lai hromosomu vai vārpstiņas bojājumi izraisītu mikrokodolu veidošanos starpfāzu šūnās. Lai inducētu aneiploīdiju, parasti mitozei jānotiek testējamās vielas klātbūtnē. Savāktās un iekrāsotās starpfāzu šūnas analizē, lai tajās noteiktu mikrokodolu esību. Ideālā gadījumā mikrokodoli jāuzskaita tikai tajās šūnās, kurās mitoze noslēgusies testējamās vielas iedarbības laikā vai pēciedarbības periodā, ja tāds ir. Ar citokinēzes bloķētāju apstrādātās kultūrās uzskaita tikai divkodolu šūnas. Ja citokinēzes bloķētājs nav lietots, ir svarīgi parādīt, ka analizētajās šūnās, visticamāk, ir notikusi šūnu dalīšanās testējamās vielas iedarbības laikā vai pēc tās. Attiecībā uz visiem protokoliem ir svarīgi parādīt, ka šūnu savairošanās ir notikusi gan kontroles, gan apstrādātajā kultūrā; kultūrās, kurās uzskaita mikrokodolus (vai paralēlajās kultūrās), jānovērtē testējamās vielas inducētās citotoksicitātes vai citostāzes pakāpe.

11.

Var izmantot kultivētus primāros cilvēka perifēro asinsvadu limfocītus (5) (19) (42) (43) un vairākas grauzēju šūnu līnijas, piemēram, CHO, V79, CHL/IU, un L5178Y šūnas (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Ja izmanto citas šūnu līnijas un tipus, tas jāpamato ar uzskatāmi parādītu veiktspēju, kā aprakstīts iedaļā par pieņemamības kritērijiem. Mikrokodolu sastopamības biežums ietekmēs testa jutību, un tāpēc ieteicams izmantot šūnu tipus ar zemiem, stabiliem mikrokodolu veidošanās biežuma rādītājiem.

12.

Cilvēka perifēro asinsvadu limfocīti jāiegūst no jauniem cilvēkiem (aptuveni 18–35 gadus veciem), kas ir veselīgi, nesmēķētāji un nav nesen bijuši saskarē ar genotoksisku ķīmisku vielu vai starojumu. Ja izmanto šūnas no vairāk nekā viena donora, jānorāda donoru skaits. Mikrokodolu sastopamības biežums palielinās līdz ar vecumu, un šī tendence ir izteiktāka sievietēm nekā vīriešiem (44); tas jāņem vērā, izvēloties grupējamās donoru šūnas.

13.

Kultūru uzturēšanai lieto piemērotas barotnes un ievēro atbilstošus kultivēšanas apstākļus (trauki kultūrām, CO2 koncentrācija, temperatūra un mitrums). Stabilām šūnu līnijām un celmiem regulāri jāpārbauda modālo hromosomu skaita stabilitāte un mikoplazmas neesība, un tos nedrīkst izmantot, ja konstatē mikoplazmu vai ja modālo hromosomu skaits ir mainījies. Jāzina, kāds ir normālais šūnas cikla laiks kultivēšanas apstākļos, ko izmanto testēšanas laboratorijā. Ja izmanto citokinēzes bloķēšanas paņēmienu, citokinēzes inhibitora koncentrācija jāoptimizē konkrētajam šūnu tipam un jāizraugās tāda, par kuru zināms, ka uzskaites vajadzībām tā dod labu divkodolu šūnu iznākumu.

14.

Stabilas šūnu līnijas un celmi: šūnas pavairo no pamatkultūrām, izsēj barotnē tādā blīvumā, lai kultūras nesaplūstu monoslānī un lai suspensiju kultūras nesasniegtu pārmērīgu blīvumu pirms šūnu savākšanas, un inkubē 37 °C temperatūrā.

15.

Limfocīti: pilnu asins sastāvu, kas apstrādāts ar antikoagulantu (piemēram, heparīnu), vai tikai limfocītus kultivē, klātesot mitogēnam, piemēram, fitohemaglutinīnam (PHA), un tad uz to iedarbojas ar testējamo vielu un ar cytoB.

16.

Ja izmanto šūnas ar nepietiekamu endogēno metabolisko kapacitāti, jālieto eksogēnas metabolizējošās sistēmas. Plašāk izmantojamā aktivācijas sistēma ir ar kofaktoru papildināta pēcmitohondriskā frakcija (S9), ko pagatavo no grauzēju aknām, kas apstrādātas ar enzīmstimulējošām vielām, piemēram, Aroclor 1254 (45) (46) vai fenobarbitona un β-naftoflavona maisījumu (46) (47) (48) (49). Pēdējā minētā kombinācija nav pretrunā ar Stokholmas Konvenciju par noturīgiem organiskajiem piesārņotājiem (50) un Regulu (EK) Nr. 850/2004 par noturīgiem organiskajiem piesārņotājiem (66) un jauktas funkcijas oksidāžu inducēšanā izrādījusies tikpat efektīva kā Aroclor 1254 (46) (47) (48) (49). S9 frakciju parasti izmanto koncentrācijā 1–10 % (tilp./tilp.) galīgajā testa barotnē. Metaboliskās aktivācijas sistēmas stāvoklis var būt atkarīgs no testējamo ķīmisko vielu klases, un dažos gadījumos var būt lietderīgi izmantot vairāk nekā vienu S9 koncentrāciju.

17.

Ar gēnu inženierijas metodēm iegūtas šūnu līnijas, kas izteic specifiskos cilvēka vai grauzēju enzīmus, var atbrīvot no vajadzības pēc eksogēnas metaboliskās aktivācijas sistēmas, un tās var izmantot kā testa šūnas. Šādos gadījumos izmantojamo šūnu līniju izvēlei jābūt zinātniski pamatotai, piemēram, ar jauktas funkcijas oksidāžu atbilstību testējamās vielas metabolismam (51) un ar to reaģētspēju uz zināmiem klastogēniem un aneigēniem (skatīt daļu par pieņemamības kritērijiem). Jāatzīst, ka testējamo vielu nedrīkst metabolizēt ar izteiktām jauktas funkcijas oksidāzēm; šajā gadījumā negatīvs rezultāts neliecina, ka testējamā viela nespēj inducēt mikrokodolus.

18.

Cietas ķīmiskās vielas jāizšķīdina atbilstošos šķīdinātājos vai nesējos un, ja vajadzīgs, pirms šūnu apstrādes jāatšķaida. Šķidras ķīmiskās vielas var tieši pievienot testēšanas sistēmā un/vai pirms šūnu apstrādes atšķaidīt. Gāzes vai gaistošas vielas jātestē ar attiecīgām standarta protokolu modifikācijām, piemēram, apstrādi veicot hermētiski noslēgtā traukā (52) (53). Ja dati par testējamo vielu preparātu stabilitāti liecina, ka tos uzglabāt nevar, izmanto svaigi pagatavotus preparātus.

19.

Šķīdinātājs vai nesējs nedrīkst reaģēt ar testējamo vielu vai nebūt saderīgs ar šūnu dzīvotspēju vai ar S9 aktivitātes uzturēšanu izmantotajās koncentrācijās. Ja nelieto labi zināmu šķīdinātāju/nesēju (piemēram, ūdeni, šūnu kultūras barotni, dimetilsulfoksīdu), lietojums jāpamato ar datiem par tā saderību ar testējamo vielu un to, ka izmantotais šķīdinātājs/nesējs nav genotoksisks. Vienmēr, kad tas iespējams, vispirms ieteicams izmantot ūdeni saturošus šķīdinātājus vai nesējus.

20.

Viens no svarīgākajiem apsvērumiem MNvit metodes veiktspējas nodrošināšanā ir tāds, ka uzskaitītajām šūnām apstrādes laikā vai pēcapstrādes inkubēšanas laikā (ja tāds ir) ir jābūt pabeigušām mitozi. CytoB ir aģents, ko ļoti plaši izmanto kā citokinēzes bloķētāju, jo tas inhibē aktīna veidošanos un tādējādi neļauj meitasšūnām atdalīties pēc mitozes; rezultātā rodas divkodolu šūnas (5) (54), (55). Mikrokodolu uzskaiti tāpēc var veikt tikai tajās šūnās, kurās apstrādes laikā vai pēc tās ir beigusies mitoze. Vienlaikus var izmērīt testējamās vielas ietekmi uz šūnu savairošanās kinētiku. CytoB ieteicams izmantot kā citokinēzes bloķētāju cilvēka limfocītos, jo šūnu cikla ilgumi dažādās kultūrās un dažādiem donoriem atšķirsies un ne visi limfocīti reaģē uz PHA. Šūnu līniju testēšanā, lai noteiktu, vai uzskaites šūnas ir sadalījušās, izmanto citas metodes; tās ir apskatītas turpmāk (skatīt 26. punktu).

21.

Laboratorijai jānosaka atbilstoša cytoB koncentrācija katram šūnu tipam, lai sasniegtu optimālu divkodolu šūnu sastopamību šķīdinātāja/nesēja kontroles kultūrās. Atbilstošas koncentrācijas cytoB parasti ir starp 3 un 6 μg/ml.

22.

Nosakot augstāko testējamās vielas koncentrāciju, kas jātestē, neizvēlas koncentrācijas, kas spēj radīt šķietami pozitīvas atbildes reakcijas, piemēram, tādas koncentrācijas, kas izraisa pārmērīgu citotoksicitāti, nogulsnes barotnē vai manāmi izmaina pH vai osmozi (39) (40) (41).

23.

Mēra šūnu savairošanos, lai nodrošinātu, ka apstrādātajās šūnās testēšanas laikā ir beigusies mitoze un ka apstrāde tiek veikta attiecīgā citotoksicitātes līmenī (skatīt 29. punktu). Citotoksicitāti ar metabolisma aktivāciju un bez tās nosaka šūnās, kam vajadzīga metaboliskā aktivācija, izmantojot šūnu skaita relatīvo pieaugumu (RICC) vai populācijas relatīvo divkāršošanos (RPD) (formulas skatīt 2. papildinājumā), ja vien neizmanto cytoB. Ja izmanto cytoB, citotoksicitāti var noteikt, izmantojot replicēšanās indeksu (RI) (formulas skatīt 2. papildinājumā).

24.

Kultūru apstrāde ar cytoB un vienkodola, divkodolu un daudzkodolu šūnu relatīvā sastopamības biežuma noteikšana kultūrā ir laba metode, kā kvantitatīvi izteikt ietekmi uz šūnu savairošanos un apstrādes citotoksisko vai citostatisko darbību (5), un nodrošina, ka uzskaitītas tiek tikai šūnas, kas apstrādes laikā vai pēc tās ir dalījušās.

25.

Pētījumos ar cytoB citostāzi/citotoksicitāti var kvantitatīvi izteikt ar savairošanās indeksu pēc citokinēzes blokādes (CBPI) (5) (26) (56) vai tās var iegūt no RI, kas raksturo vismaz 500 šūnas vienā kultūrā (formulas skatīt 2. papildinājumā). Ja cytoB izmanto, lai novērtētu šūnu savairošanās pakāpi, CBPI vai RI jānosaka vismaz 500 šūnām vienā kultūrā. Šos mērījumus, cita starpā, var izmantot, lai noteiktu citotoksicitāti, salīdzinot vērtības apstrādātajās un kontroles kultūrās. Noderīgu informāciju var dot citu citotoksicitātes marķieru (piemēram, šūnu saplūšanas, šūnu skaita, apoptozes, nekrozes, metafāzes uzskaites) novērtēšana.

26.

Pētījumos bez cytoB ir uzskatāmi jāparāda, ka kultūrā uzskaitītās šūnas ir beigušas dalīties apstrādes laikā vai pēc apstrādes ar testējamo vielu, citādi var iegūt šķietami negatīvu rezultātu. Metodes, kas izmantotas, lai nodrošinātu, ka uzskaitītas tiek dalīšanos beigušās šūnas, paredz iekļaut un pēc tam detektēt bromdeoksiuridīnu (BRDU), lai identificētu replicējušās šūnas (57), klonu veidošanos, kad šūnas no pastāvīgās šūnu līnijas apstrādā un uzskaita in situ uz mikroskopa priekšmetstikliņa (savairošanās indekss (PI)) (25) (26) (27) (28), vai arī populācijas relatīvās divkāršošanās (RPD) vai šūnu skaita relatīvā pieauguma (RICC) noteikšanu vai citas pārbaudītas metodes (16) (56) (58) (59) (formulas skatīt 2. papildinājumā). Noderīgu informāciju var dot citu citotoksicitātes vai citostāzes marķieru (piemēram, šūnu saplūšanas, šūnu skaita, apoptozes, nekrozes, metafāzes uzskaites) novērtēšana.

27.

Jāizvērtē vismaz trīs analizējamas testējamās koncentrācijas. Lai to panāktu, var būt nepieciešams veikt eksperimentu, izmantojot lielāku skaitu savstarpēji tuvu esošu koncentrāciju un analizēt mikrokodolu veidošanos tādās koncentrācijās, kas nodrošina piemērotu citotoksicitāšu diapazonu. Alternatīva stratēģija ir veikt iepriekšēju citotoksicitātes testēšanu, lai galīgajā testā vajadzētu pētīt mazāku skaitu koncentrāciju.

28.

Augstākajai koncentrācijai jārada 55 ± 5 % citotoksicitāte. Augstākās koncentrācijās kā sekundāra citotoksicitātes ietekme var rasties hromosomu bojājumi (60). Ja konstatē citotoksicitāti, izraudzītajām testējamām koncentrācijām jābūt diapazonā no koncentrācijas, kas rada 55 ± 5 % citotoksicitāti, līdz koncentrācijai, kas rada nelielu citotoksicitāti vai to nerada nemaz.

29.

Ja citotoksiskums vai nogulsnes nav novērotas, augstākajai testējamai koncentrācijai jāatbilst 0,01 M, 5 mg/ml vai 5 μl/ml atkarībā no tā, kura ir mazākā. Analīzei atlasītajām koncentrācijām parasti jāatšķiras par ne vairāk kā 10 vienībām. Testējamām vielām, kam koncentrācijas–atbildes reakcijas līknes ir stāvas, var būt jātestē savstarpēji mazāk atšķirīgas koncentrācijas, lai uzskaiti varētu veikt arī kultūrās ar vidēju un zemu toksicitātes diapazonu.

30.

Ja ierobežojošais faktors ir šķīdība, maksimālā koncentrācija (ja to neierobežo citotoksicitāte) ir zemākā koncentrācija, kurā kultūrās ir saredzamas minimālas nogulsnes, ar nosacījumu, ka tas netraucē uzskaitei. Nogulsnes jāvērtē ar tādām metodēm kā gaismas mikroskopija un kultivēšanas gaitā neizzūdošu vai (līdz apstrādes beigām) parādošos nogulšņu konstatēšana.

31.

Katrā eksperimentā jāiekļauj vienlaicīgas pozitīvās un šķīdinātāja/nesēja kontroles, ar metabolisma aktivāciju vai bez tās.

32.

PC ir vajadzīga, lai pierādītu izmantoto šūnu spēju un testa protokola derīgumu klastogēnu un aneigēnu identificēšanai un apliecinātu S9 preparāta metabolisko kapacitāti. Ar PC būtu jāizmanto zināmi mikrokodolu veidošanās inducētāji tādās koncentrācijās, kurās sagaidāms neliels, bet reproducējams palielinājums salīdzinājumā ar fona līmeni, un tiek uzskatāmi parādīta testēšanas sistēmas jutība. PC vielu koncentrācijas izvēlas tā, lai to iedarbība būtu skaidri redzama, tomēr lai kodēto priekšmetstikliņu identitāti to nolasītājs nevarētu konstatēt uzreiz.

33.

Lai uzskatāmi parādītu testēšanas sistēmas metabolisko kompetenci un spēju detektēt klastogēnus, jāizmanto klastogēns, kuram vajadzīga metabolisma aktivācija (piemēram, ciklofosfamīds vai benz[a]pirēns). Ja tas ir pamatoti, var lietot citas PC. Dažas PC, kam vajadzīga metabolisma aktivācija, noteiktos apstrādes apstākļos vai noteiktās šūnu līnijās var būt aktīvas bez eksogēnas metabolisma aktivācijas, un tāpēc izraudzītajā šūnu līnijā un izraudzītajās koncentrācijās jātestē vajadzība pēc metaboliskās aktivācijas un S9 preparāta aktivitāte.

34.

Patlaban nav zināms neviens aneigēns, kam vajadzīga metaboliska aktivācija, lai tas kļūtu genotoksiski aktīvs (16). Aneigēnās aktivitātes jomā patlaban pieņemtās PC ir, piemēram, kolhicīns un vinblastīns. Var izmantot citas ķīmiskas vielas, ja tās inducē mikrokodolu veidošanos vienīgi vai galvenokārt aneigēnas aktivitātes rezultātā. Lai novērstu vajadzību pēc divām PC (klastogenicitātei un aneigenicitātei) bez metaboliskās aktivācijas, aneigenicitātes kontroli var izmantot par PC bez S9 un klastogenicitātes kontroli var lietot, lai testētu izmantotās metabolisma aktivācijas sistēmas piemērotību. Klastogenicitātes un aneigenicitātes PC jāizmanto šūnās, kurām nav vajadzīga S9. Ieteicamās PC norādītas 3. papildinājumā.

35.

Ja ir pieejamas piemērotas ķīmiskās vielas, var apsvērt ar ķīmiskās vielas klasi saistītas PC izmantošanu. Visām izmantotajām PC jābūt piemērotām attiecīgajam šūnu tipam un aktivācijas apstākļiem.

36.

Visās šūnu savākšanas reizēs jāparedz šķīdinātāja/nesēja kontroles izmantošana. Turklāt jāizmanto arī neapstrādāta NC (bez šķīdinātāja/nesēja), ja vien nav publicētu vai laboratorijā pieejamu vēsturisko kontroles datu, kas uzskatāmi parāda, ka izraudzītajam šķīdinātājam šādā koncentrācijā nav genotoksiskas vai citas kaitīgas iedarbības.

37.

Lai palielinātu varbūtību, ka aneigēns vai klastogēns tiek detektēts brīdī, kad tas ir aktīvs kādā konkrētā šūnas cikla posmā, ir svarīgi ar testējamo vielu apstrādāt pietiekamu skaitu šūnu visos to šūnas cikla posmos. Tādēļ šūnu līniju un primāro šūnu kultūru apstrādes kārtība var nedaudz atšķirties no limfocītu apstrādes, kam vajadzīga mitogēnā stimulācija, lai sāktos šūnas cikls; tas apskatīts 41.–43. punktā (16).

38.

Teorētiski apsvērumi, kā arī publicētie dati (18), rāda, ka lielākā daļa aneigēnu un klastogēnu tiks detektēti īsā 3–6 stundu apstrādes periodā ar S9 vai bez tā, un turpinājumā sekos testējamās vielas noņemšana un augšanas periods 1,5–2,0 šūnas ciklu garumā (6). Šūnu paraugus ņem pēc laika perioda, kas atbilst aptuveni 1,5–2,0 parastajiem (t. i., neapstrādātu šūnu) šūnas cikliem, apstrādes sākumā vai beigās (skatīt 1. tabulu). Paraugu ņemšanas vai atveseļošanās laiku var pagarināt, ja ir zināms vai domājams, ka testējamā viela ietekmē šūnas cikla ilgumu (piemēram, ja testē nukleozīdu analogus).

39.

Ņemot vērā S9 preparātu potenciālo citotoksicitāti kultivētās zīdītāju šūnās, apstrādi ar paildzinātu iedarbību 1,5–2,0 normālos šūnas ciklos veic tikai bez S9. Paildzinātā apstrādē ir iespējas šūnu apstrādi ar testējamo vielu veikt cytoB klātbūtnē vai bez tās. Šīs iespējas attiecas uz situācijām, kurās var būt bažas par iespējamo mijiedarbību starp testējamo vielu un cytoB.

40.

Ierosinātā šūnu apstrādes kārtība ir parādīta 1. tabulā. Šo vispārīgo apstrādes kārtību var modificēt atkarībā no testējamās vielas stabilitātes vai reaģētspējas vai no konkrētām izmantoto šūnu augšanas īpatnībām. Visos variantos apstrādei jāsākas un jābeidzas, kad šūnu augšana ir eksponenciāla. Apstrādes kārtība sīkāk izklāstīta 41.–47. punktā.

1.   tabula

Šūnu apstrādes un savākšanas laiks MNvit noteikšanā

41.

Limfocītiem visefektīvākā pieeja ir sākt testējamās vielas iedarbību 44–48 stundas pēc stimulēšanas ar PHA, kad cikla sinhronizācija būs zudusi (5). Sākotnējā noteikšanā šūnas 3–6 stundas apstrādā ar testējamo vielu S9 klātbūtnē vai bez tās. Apstrādes barotni aizvāc un aizstāj ar svaigu barotni, kas satur cytoB, un pēc 1,5–2,0 normāliem šūnas cikliem šūnas savāc.

42.

Ja abās sākotnējās noteikšanās ar īslaicīgu (3–6 stundu) apstrādi rezultāts ir negatīvs vai neskaidrs, nākamo apstrādi veic ar ilgstošāku iedarbību bez S9. Pieejami divi vienlīdz pieņemami apstrādes varianti. Tomēr iespējams, A variants ir labāks stimulētiem limfocītiem, jo eksponenciālā augšana 96 stundas pēc stimulēšanas sākuma var mazināties. Turklāt B variantā līdz galīgajam paraugu ņemšanas laikam šūnu kultūras nebūtu saplūdušas.

43.

Primārās šūnas un šūnu līnijas jāapstrādā līdzīgi kā limfocītus, izņemot to, ka nav nepieciešams tos 44–48 stundas stimulēt ar PHA. Uz šūnām, kas nav limfocīti, iedarbojas tā, ka pētījuma beigās šūnas joprojām atrodas logaritmiskajā augšanas posmā.

44.

Šūnas 3–6 stundas apstrādā S9 klātbūtnē vai bez tās. Apstrādes barotni aizvāc un aizstāj ar svaigu barotni, un pēc 1,5–2,0 normāliem šūnas cikliem šūnas savāc.

45.

Ja abās sākotnējās noteikšanās ar īslaicīgu (3–6 stundu) apstrādi rezultāts ir negatīvs vai neskaidrs, nākamo apstrādi veic ar ilgstošāku iedarbību. Pieejami divi vienlīdz pieņemami apstrādes varianti.

46.

Monoslāņa kultūrās 3–6 stundu apstrādes beigās vēl var būt mitotiskās šūnas (identificējamas kā apaļas un tādas, kas atdalās no virsmas). Tā kā mitotiskās šūnas viegli atdalās, tās var tikt aizvāktas kopā ar testējamo vielu saturošo barotni. Šīs šūnas jāsavāc, kad kultūras mazgā, un jāievieto atpakaļ kultūrā, lai šūnu savākšanas laikā nebūtu mitotiski dalošos šūnu un mikrokodolu zuduma.

47.

Dublikātu kultūras jāizmanto katrai testējamās vielas koncentrācijai un nesēja/šķīdinātāja un NC kultūrām. Ja dublikātu kultūru variācija ir minimāla, ko pierāda ar vēsturiskiem laboratorijas datiem, ir pieņemami izmantot tikai vienu kultūru. Ja izmanto tikai vienu kultūru, ieteicams analizēt lielāku koncentrāciju skaitu.

48.

Šūnas no katras kultūras savāc un apstrādā atsevišķi. Šūnu preparātu sagatavošana var ietvert hipotonisku apstrādi, bet tā nav nepieciešama, ja atbilstošu šūnu izklājumu panāk citā veidā. Var izmantot dažādus priekšmetstikliņu sagatavošanas paņēmienus, ja vien uzskaites vajadzībām tiek iegūti augstas kvalitātes šūnu preparāti. Šūnu citoplazma jāsaglabā, lai detektētu mikrokodolus un (ar citokinēzes bloķēšanas metodi) ticami identificētu divkodolu šūnas.

49.

Priekšmetstikliņus iekrāsot var ar dažādām metodēm, piemēram, Giemsa vai luminiscences DNS specifiskām krāsvielām (59). Lietojot DNS specifisku krāsvielu (piemēram, akridīnoranžo (61) vai Hoechst 33258 ar pironīnu-Y (62)), iespējams izvairīties no daļas artefaktu, kas saistīti ar DNS nespecifisku krāsvielu izmantošanu. Antikinetohoru antivielas, FISH ar pancentromēriskām DNS zondēm vai in situ iezīmēšanu ar pancentromēriem specifiskām gruntskrāsām, kā arī atbilstošu DNS iekrāsošanu, var izmantot, lai identificētu mikrokodolu saturu (hromosomas/hromosomu fragmentus), ja vajadzīga informācija par to veidošanās mehāniku (15) (16). Citas metodes un diferenciāciju starp klastogēniem un aneigēniem var izmantot tad, ja pagātnē tā ir izrādījusies efektīva.

50.

Visus priekšmetstikliņus, tostarp šķīdinātāja/nesēja un kontroles priekšmetstikliņus, pirms mikroskopiskās analīzes kodē. Alternatīvi, kodētus paraugus var analizēt, izmantojot validētas, automatizētas plūsmas citometriskā vai attēlu analīzes sistēmā.

51.

Ar cytoB apstrādātās kultūrās mikrokodolu sastopamība jāanalizē vismaz 2 000 divkodolu šūnām vienā koncentrācijā (vismaz 1 000 divkodolu šūnās vienā kultūrā; divas kultūras vienā koncentrācijā). Ja izmanto tikai vienu kultūru, tajā jāuzskaita vismaz 2 000 divkodolu šūnu no katras koncentrācijas. Ja katrā koncentrācijā uzskaitei ir pieejamas ievērojami mazāk nekā 1 000 divkodolu šūnu katrā kultūrā vai 2 000 divkodolu šūnu, ja izmanto tikai vienu kultūru, un ja nav detektējams ievērojams mikrokodolu skaita pieaugums, testēšana jāatkārto ar lielāku daudzumu šūnu vai ar mazāk toksiskām koncentrācijām atkarībā no tā, kas ir piemērotāk. Jāraugās, lai neuzskaitītu divkodolu šūnas ar neregulāru formu vai tādas, kuru abi kodoli ir ļoti nevienādi; tāpat nevajag sajaukt divkodolu šūnas un nevienmērīgā izklājumā esošas daudzkodolu šūnas. Šūnās, kas satur vairāk nekā divus galvenos kodolus, mikrokodoli nav jāanalizē, jo šajās šūnās mikrokodolu vidējā izplatība var būt augstāka (63), (64). Vienkodola šūnu uzskaite ir pieņemama tad, ja ir pierādīts, ka testējamā vielas maina cytoB aktivitāti.

52.

Ar cytoB neapstrādātās šūnu līnijās mikrokodoli jāuzskaita vismaz 2 000 šūnām vienā koncentrācijā (vismaz 1 000 šūnu vienā kultūrā; divas kultūras vienā koncentrācijā). Ja izmanto tikai vienu kultūru katrai koncentrācijai, no šīs kultūras jāuzskaita vismaz 2 000 šūnu.

53.

Ja lieto cytoB, jānosaka CBPI vai RI, lai novērtētu šūnu savairošanos (skatīt 2. papildinājumu), izmantojot vismaz 500 šūnas katrā kultūrā. Ja apstrādi veic bez cytoB, ir būtiski sniegt uzskaitīto šūnu savairošanās pierādījumus, kā aprakstīts 24.–27. punktā.

54.

Laboratorijai, kas ierosina izmantot MNvit noteikšanu, kas aprakstīta šajā TM, jāpierāda tās spēja ticami un pareizi detektēt ķīmiskās vielas ar zināmu aneigēnu un klastogēnu aktivitāti, ar metabolisko aktivāciju un bez tās, kā arī detektēt zināmas, negatīvi reaģējošas ķīmiskās vielas, izmantojot references vielas, kas uzskaitītas 3. papildinājumā. Kā pierādījumu savai spējai pareizi veikt šo TM laboratorijai jāsniedz pierādījumi par to, ka šūnās, kurās uzskaita mikrokodolu veidošanos, ir beigusies viena kodolu dalīšanās, ja testēšanu veic bez cytoB.

55.

Ieteicamās references vielas ir ķīmiskās vielas, kas uzskaitītas 3. papildinājumā. Šo sarakstu var papildināt un tajā iekļautās ķīmiskās vielas aizstāt ar citām, ja šo ķīmisko vielu aktivitāte ir zināma un ja mikrokodolus tās inducē ar vienādiem darbības mehānismiem, un ja ir pierādīts, ka tās ir piemērotas ķīmiskajām vielām, kuras tiks testētas, izmantojot MNvit procedūru. Pamatojums var būt validācijas pētījums, kurš aptver daudzas un dažādas vai arī tikai dažas vielas, kas izvēlētas, ņemot vērā testējamās vielas ķīmisko klasi vai bojājumu rašanās mehānismu, kuru pēta.

56.

Šķīdinātāja/nesēja kontrolei un neapstrādātām kultūrām būtu jāuzrāda reproducējami zema un stabila mikrokodolu sastopamība (parasti 5–25 mikrokodoli uz 1 000 šūnām visiem šūnu tipiem, kas minēti 11. punktā). Citiem šūnu tipiem var būt dažādi reakciju diapazoni, kas jānosaka, kad tos validē izmantošanai MNvit noteikšanā. Vēsturiskos kontroles diapazonus veido no datiem par negatīvo kontroli, šķīdinātāju un PC. Šīs vērtības jāizmanto, lemjot par to, vai eksperimentā izmantot vienlaicīgu NC/PC.

57.

Ja noteikšanas vajadzībām ierosinātas sīkas izmaiņas testēšanas protokolā (piemēram, automatizēta, nevis manuāla uzskaite; jauns šūnu tips), šo izmaiņu efektivitāte jāpierāda, pirms modificēto protokolu var uzskatīt par pieņemamu izmantošanai. Efektivitātes pierādīšana ietver demonstrēšanu, ka ir iespējams detektēt hromosomu pārrāvumu un papildinājumu vai zaudējumu galvenos mehānismus un ka var iegūt atbilstošu pozitīvu un negatīvu rezultātu attiecībā uz atsevišķās vielas klasi vai daudzām dažādām vielām, kuras paredzēts testēt.

58.

Ja izmanto citokinēzes bloķēšanas paņēmienu, mikrokodolu indukcijas novērtēšanai izmanto tikai divkodolu šūnas ar mikrokodoliem (neatkarīgi no mikrokodolu skaita šūnā). Atsevišķi uzskaitot šūnas ar vienu, diviem vai vairākiem mikrokodoliem, var iegūt noderīgu informāciju, bet tā nav obligāta.

59.

Jānosaka vienlaicīgie citotoksiskuma un/vai citostāzes pasākumi visām apstrādātajām kultūrām un šķīdinātāja/nesēja kontroles kultūrām (58). Jāaprēķina CBPI vai RI visām apstrādātajām un kontroles kultūrām, to izsakot kā šūnas cikla kavēšanās mērījumus gadījumā, ja izmanto citokinēzes bloķēšanas paņēmienu. Ja nav cytoB, izmanto RPD vai RICC, vai PI (skatīt 2. papildinājumu).

60.

Norāda datus par atsevišķām kultūrām. Turklāt visus datus apkopo tabulas veidā.

61.

Ķīmiskās vielas var inducēt mikrokodolu veidošanos MNvit tāpēc, ka tās inducē hromosomu pārrāvumu, hromosomu zaudējumu vai abus kopā. Var veikt papildu analīzi ar antikinetohoru antivielām vai centromēriem specifiskām in situ zondēm vai izmantot citas metodes, lai noteiktu, vai mikrokodolu inducēšanas mehānisms ir saistīts ar klastogēnu un/vai ar aneigēnu aktivitāti.

62.

Nav prasības veikt verifikāciju, papildus testējot izteikti pozitīvu vai negatīvu reakciju. Neskaidri rezultāti jāprecizē, analizējot vēl 1 000 šūnu no visām kultūrām, lai saglabātu aklā nolasījuma principu. Ja šī pieeja nedod rezultātu, testēšanu turpina. Turpmākajā testēšanā jāapsver pētījuma parametru modifikācija pēc vajadzības plašākā vai šaurākā diapazonā. Pētījuma parametri, kurus varētu modificēt, ir testējamo koncentrāciju atšķirības, apstrādes un šūnu savākšanas laiks un/vai metabolisma aktivācijas apstākļi.

63.

Ir vairāki pozitīva rezultāta kritēriji, kā, piemēram, mikrokodolus saturošo šūnu skaita pieaugums atkarībā no koncentrācijas vai statistiski nozīmīgs pieaugums. Vispirms rezultātus izvērtē no bioloģiskā skatpunkta. Apsverot, vai novērotās vērtības ir vēsturiskā kontroles diapazona robežās vai ārpus tām, var iegūt pieturas punktus, lai novērtētu reakcijas bioloģisko nozīmīgumu. Kā palīglīdzekli izmēģinājumu rezultātu novērtēšanai var izmantot piemērotas statistikas metodes (65). Tomēr statistiskās testēšanas rezultāti jānovērtē attiecībā uz devas un reakcijas mijiedarbību. Jāņem vērā arī reproducējamība un vēsturiskie dati.

64.

Lai gan lielākajā daļā eksperimentu iegūst nepārprotami pozitīvus vai negatīvus rezultātus, tomēr dažkārt pēc iegūtajiem datiem nevar skaidri spriest par testējamās vielas aktivitāti. Šīs neviennozīmīgās vai apšaubāmās reakcijas var rasties neatkarīgi no tā, cik reizes eksperimentu atkārto.

65.

Pozitīvs MNvit noteikšanas rezultāts liecina, ka testējamās vielas inducē hromosomu pārrāvumu vai hromosomu zaudējumu kultivētās zīdītāju šūnās. Negatīvs rezultāts liecina, ka konkrētajos testēšanas apstākļos testējamā viela nerada hromosomu pārrāvumu un/vai papildinājumu vai zaudējumu kultivētās zīdītāju šūnās.

66.

Testēšanas pārskatā jāiekļauj vismaz šāda informācija, ja tā attiecas uz konkrēto noteikšanu.

1)

Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res., 392, 1-4.

2)

Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project, Mutation Res., 287, 3-15.

3)

Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay, Cytobios., 43, 233-246.

4)

Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group, Environ. Mol. Mutagen., 35, 167-172.

5)

Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay, Nature Protocols, 2(5), 1084-1104.

6)

Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation, Mutation Res., 161, 193-198.

7)

Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody, Environ. Mol. Mutagen., 13, 34-43.

8)

Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes, Mutation Res., 234, 9-20.

9)

Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, 6, 297-302.

10)

Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes, Mutagenesis, 8, 329-334.

11)

Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe, Mutation Res., 319, 205-213.

12)

Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization, Mutagenesis, 8, 519-525.

13)

Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes, Mutation Res., 322, 9-20.

14)

Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy, Mutation Res., 372, 233-245.

15)

Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes, Mutation Res., 372, 211-219.

16)

Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res., 540, 153-163.

17)

OECD (1997), In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Test Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [www.oecd.org/env/testguidelines]

18)

Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study, Mutation Res., 607, 13-36.

19)

Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes, Mutation Res., 607, 37-60.

20)

Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells, Mutation Res., 607, 61-87.

21)

Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells, Mutation Res., 607, 88-124.

22)

Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells, Mutation Res., 607, 125-152.

23)

Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience, Mutation Res., 392, 187-208.

24)

Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience, Mutation Res., 392, 45-59.

25)

Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and Madle, S. (1998), Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Res., 410, 81-116.

26)

Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different test approaches, Mutation Res. 439, 183-190.

27)

Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. (1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity, Mutation Res. 445, 55-71.

28)

von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000), In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells - results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances, Mutation Res., 468, 137-163.

29)

Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 517, 123-134.

30)

Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and Sofuni, T. (1999), Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU), Mutagenesis, 14, 569-580.

31)

Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test, Mutation Res., 607, 1-152.

32)

ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25th meeting, 16-17 November, 2006, Available at: [http://ecvam.jrc.it/index.htm]

33)

ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, Available at: [http://ecvam.jrc.it/index.htm]

34)

Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT), Mutagenesis, 23, 271-283.

35)

Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test, Mutation Res., 347, 105-115.

36)

Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells, Mutagenesis, 17, 257-260.

37)

Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge, Toxicol., 198, 315-328.

38)

Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals, Mutation Res., 392, 61-70.

39)

Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, 147-205.

40)

Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells, Mutation Res., 268, 297-305.

41)

Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886.

42)

Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymphocytes, Mutation Res., 147, 29-36.

43)

Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method, Mutation Res., 392, 11-18.

44)

Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei, Environ. Mol. Mutagen. 37, 31-45.

45)

Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutation Res., 113, 173-215.

46)

Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65.

47)

Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, 7, 175-177.

48)

Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, 85. – 88. lpp.

49)

Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.

50)

UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Available at: [http://www.pops.int/]

51)

Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells, Mutagenesis, 11, 247-274.

52)

Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R.R., Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, 91. – 103. lpp.

53)

Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay, Environ. Mutagenesis 5, 795-801.

54)

Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations, Mutation Res., 285, 35-44.

55)

Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 521, 103-112.

56)

Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to “Report from the in vitro micronucleus assay working group”, Mutation Res., 564, 97-100.

57)

Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear assay in lymphocytes, Mutation Res., 139, 61-65.

58)

Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Res., 655, 1-3.

59)

Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. (1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 341, 169-184.

60)

Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environ. Molec. Mutagenesis 35, 191-201.

61)

Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, 241-247.

62)

MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, 269-275.

63)

Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Res., 120, 241-247.

64)

Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 534, 65-75.

65)

Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003), In vitro micronucleus test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, 463.–467. lpp.

66)

Regulation (EC) No 850/2004 of the European Parliament and of the Council of 29 April 2004 on persistent organic pollutants and amending Directive 79/117/EEC, OV L 229, 30.4.2004., 5. lpp.

1.

ESAO ķīmisko vielu testēšanas vadlīnijas un ES testēšanas metodes tiek regulāri pārskatītas, ņemot vērā tehnikas attīstību, regulatīvo prasību izmaiņas un dzīvnieku labturības apsvērumus. Ir pārskatīta B.42 – pirmā no testēšanas metodēm (TM) ādas sensibilizācijas noteikšanai pelēm jeb lokālo limfmezglu noteikšanas metode (LLNA; ESAO 429. testēšanas vadlīnijas) (1). Ir publicēti LLNA validācijas un ar to saistītā darba pārskati (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Lai mērītu limfocītu savairošanos, LLNA izmanto radioizotopisko timidīnu vai jodīnu, un tāpēc šīs metodes pielietošana ir ierobežota gadījumos, kad radioaktīvo komponentu iegāde, izmantošana vai apglabāšana ir problemātiska. LLNA:DA (izstrādātājs: Daicel Chemical Industies Ltd.) ir modificēta LLNA, kurā nav radioaktīvo komponentu un ar kuru kvantitatīvi nosaka adenozīntrifosfāta (ATP) saturu, par limfocītu savairošanās indikatoru izmantojot bioluminiscenci. LLNA:DA testēšanas metode ir validēta, to ir pārskatījusi starptautiska salīdzinošās izvērtēšanas komisija un ir rekomendējusi šo metodi kā tādu, kas ar dažiem ierobežojumiem uzskatāma par noderīgu ādu sensibilizējošu un nesensibilizējošu ķīmisku vielu identificēšanai (10) (11) (12) (13). Šī TM ir izstrādāta, lai novērtētu ķīmiskām vielām vai to maisījumiem piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu (dzīvniekiem). Šā pielikuma B.6. nodaļā un ESAO 406. testēšanas vadlīnijās aprakstītā metode izmanto testēšanu ar jūrascūciņām, proti, maksimizācijas testu jūrascūciņām un Bīlera testu (14). LLNA (šā pielikuma B.42. nodaļa; ESAO 429. testēšanas vadlīnijas) un abas šīs metodes modifikācijas, kurās nav radioaktīvo komponentu, proti, LLNA:DA (šā pielikuma B.50. nodaļa; ESAO 442.a testēšanas vadlīnijas) un LLNA:BrdU-ELISA (šā pielikuma B.51. nodaļa; ESAO 442.b testēšanas vadlīnijas), visas ir pārākas par testēšanas metodēm ar jūrascūciņām, kas aprakstītas B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijās (14), dzīvnieku skaita samazinājuma un labāka izmantojuma ziņā.

2.

Līdzīgi kā LLNA, ar LLNA:DA pēta ādas sensibilizācijas indukcijas fāzi un sniedz kvantitatīvus datus, kas piemēroti atbildes reakcijas uz devu novērtēšanai. Turklāt iespēja noteikt ādas sensibilizatorus, neizmantojot radioaktīvus DNS marķierus, atbrīvo no vajadzības risināt arodapstarošanas un radioaktīvo atkritumu apglabāšanas jautājumus. Tas savukārt ļauj ādas sensibilizatoru noteikšanai biežāk izmantot peles un turpināt samazināt jūrascūciņu izmantošanu ādas sensibilizācijas potenciāla testēšanā (t. i., B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (14).

3.

Definīcijas skatīt 1. papildinājumā.

4.

LLNA:DA metode ir modificēta LLNA, kura paredzēta ķīmisko vielu – potenciālu ādas sensibilizatoru identificēšanai un kurai ir zināmi ierobežojumi. Tas nenozīmē, ka visos gadījumos LLNA:DA būtu jālieto LLNA vai jūrascūciņu testa vietā (B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (14), bet gan to, ka šī noteikšana ir minētajam testam līdzvērtīga un to var izmantot kā alternatīvu, kuras pozitīvajam vai negatīvajam rezultātam vairs nav vajadzīgs papildu apstiprinājums (10) (11). Pirms uzsākt pētījumus, testēšanas laboratorijai jāņem vērā visa par testējamo vielu pieejamā informācija. Pie šādas informācijas pieder testējamās vielas identifikācija un ķīmiskā struktūra, fizikāli ķīmiskās īpašības, citu in vitro vai in vivo veikto toksicitātes testu rezultāti un toksikoloģiskie dati par struktūras ziņā saistītām vielām. Šī informācija jāizvērtē, lai noteiktu LLNA:DA piemērotību konkrētajai testējamai vielai (ņemot vērā atsevišķu veidu vielu nesaderību ar LLNA:DA; skatīt 5. punktu) un lai izraudzītos pareizu testējamās vielas devu.

5.

LLNA:DA ir in vivo metode un kā tāda paredz dzīvnieku izmantošanu alerģiskās kontakta sensibilizējošās aktivitātes novērtējumā. Tomēr salīdzinājumā ar testēšanas metodēm, kurās izmanto jūrascūciņas (B.6; ESAO 406. testēšanas metode), tajā iespējams izmantot mazāku skaitu dzīvnieku (14). LLNA:DA turklāt piedāvā būtisku uzlabojumu (mazāk sāpju un ciešanu) dzīvnieku izmantojumā alerģiskās kontakta sensibilizējošās testēšanas vajadzībām, jo (atšķirībā no B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijām) LLNA:DA nav jānoskaidro provocētās–inducētās ādas hipersensibilizācijas reakcijas. Neraugoties uz LLNA:DA priekšrocībām salīdzinājumā ar B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijām (14), šai metodei ir daži ierobežojumi, kuru dēļ tomēr jāizmanto B.6 vai ESAO 406. testēšanas vadlīniju metode (piemēram, dažu metālu testēšanā, šķietami pozitīva rezultāta konstatēšanas gadījumā dažiem ādas sensibilizatoriem [kā, piemēram, atsevišķām surfaktantu tipa vielām] (6) (1; šā pielikuma B.42. nodaļa) vai testējamās vielas šķīdības labad). Turklāt vajadzība pēc jūrascūciņu testiem (B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijas (14)) var saglabāties attiecībā uz ķīmisko vielu klasēm vai vielām, kuru sastāvā ir funkcionālās grupas, par kurām ir pierādīts, ka tās darbojas kā potenciāli sajaucējfaktori (16). Ierobežojumus, kuri konstatēti LLNA gadījumā (1; šā pielikuma B.42. nodaļa) ieteicams attiecināt arī uz LLNA:DA (10). Turklāt LLNA:DA var nebūt piemērotākā metode tādu vielu testēšanai, kas ietekmē ATP koncentrācijas (piemēram, vielas, kam ir ATP inhibējoša iedarbība) vai kas ietekmē starpšūnu ATP mērījumu precizitāti (piemēram, ATP degradējošu enzīmu klātbūtne, ārpusšūnu ATP klātbūtne limfmezglā). Izņemot šādus minētos ierobežojumus, LLNA:DA jāvar izmantot jebkuras vielas testēšanai, ja vien testējamai vielai nav tādu īpašību, kas varētu ietekmēt LLNA:DA precizitāti. Ja stimulācijas indeksa (SI) vērtība ir robežās no 1,8 līdz 2,5, jāapsver neitrālam tuva pozitīva rezultāta iespējamība (skatīt 31.–32. punktu). Šā apgalvojuma pamatā ir validēšanas datubāze, kuru veido 44 vielas ar SI ≥ 1,8 (skatīt 6. punktu); LLNA:DA pareizi identificēja visus 32 LLNA sensibilizatorus, bet kļūdaini identificēja trīs no 12 LLNA nesensibilizējošajām vielām, kuru SI vērtības bija robežās no 1,8 līdz 2,5 (t. i., pozitīvs neitrālam tuvs rezultāts) (10). Tomēr, tā kā SI vērtību noteikšanai un testēšanas metodes prognozēšanas spējas aprēķināšanai tika izmantota viena un tā pati datu kopa, minētie rezultāti var būt pārāk augsts reālās prognozēšanas spējas novērtējums.

6.

LLNA:DA pamatprincips ir tāds, ka sensibilizatori inducē limfocītu savairošanos limfmezglos, kuri drenē testējamās vielas saņemšanas vietu. Šī savairošanās ir proporcionāla devai un alergēna iedarbīgumam un ir vienkāršs paņēmiens, lai iegūtu kvantitatīvu sensitivitātes mērījumu. Savairošanās pakāpi nosaka, vidējo savairošanos katrā testējamās vielas grupā salīdzinot ar vidējo savairošanos kontroles grupā, kas saņēmusi tikai nesēju (VC). Nosaka attiecību starp vidējo progresiju grupās, kas saņēmušas pētāmo vielu, un progresiju VC grupā; tas ir stimulācijas indekss (SI). Lai testējamo vielu pamatoti turpinātu vērtēt kā potenciālu ādas sensibilizatoru, SI vērtībai jābūt ≥ 1,8. Šeit aprakstītās procedūras pamatā ir adenozīntrifosfāta (ATP) satura mērīšana ar bioluminiscenci (zināms, ka tas korelē ar dzīvo šūnu skaitu) (17), lai indicētu vairojošos šūnu skaita pieaugumu aurikulārajos limfmezglos (18) (19). Biolumuniscences metodē izmanto luciferāzi (enzīms), lai katalizētu gaismas rašanos no ATP un luciferīna šādā reakcijā:

ATP + Luciferīns + O 2 Oksiluciferīns + AMP + PPi + CO 2 + Gaisma

Emitētās gaismas intensitāte ir lineārā sakarībā ar ATP koncentrāciju, un to mēra ar luminometru. Luciferīna–luciferāzes noteikšana ir jutīga metode ATP kvantitatīvai noteikšanai, kam ir plašs lietojumu spektrs (20).

7.

Šim testam izvēlētā suga ir peles. LLNA:DA validēšanas pētījumi ir veikti vienīgi ar CBA/J līnijas dzīvniekiem, un tāpēc to uzskata par ieteicamo līniju (12) (13). Izmanto jaunas, pieaugušas sievišķā dzimuma peles, kas nav dzemdējušas un nav grūsnas. Pētījuma sākumā dzīvniekiem jābūt 8–12 nedēļu veciem, dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām un ne lielākām par 20 % no vidējās masas. Citas līnijas un vīrišķā dzimuma dzīvniekus var izmantot, ja ir iegūts pietiekami daudz datu, lai parādītu, ka LLNA:DA atbildes reakcijā nav nozīmīgu atšķirību, kas specifiskas līnijai un/vai dzimumam.

8.

Ja nav zinātniska pamatojuma, kāpēc peles būtu turamas katra atsevišķi, peles izmitina grupā (21). Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, jābūt 22 ± 3 °C temperatūrai. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50–60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam atbilstoši secībai 12 stundas gaišas, 12 stundas tumšas. Barošanai var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens daudzumu.

9.

Dzīvniekus izvēlas pēc nejaušības principa, marķē individuālai identificēšanai (bet nekādā veidā nemarķē ausis) un tur būros vismaz piecas dienas pirms testa sākuma, lai tos aklimatizētu laboratorijas apstākļos. Pirms apstrādes uzsākšanas visus dzīvniekus apskata, lai pārliecinātos, ka tiem nav novērojami ādas bojājumi.

10.

Cietas ķīmiskās vielas pirms peļu ausu apstrādes izšķīdina vai suspendē, izmantojot šķīdinātājus vai nesējus, un vajadzības gadījumā atšķaida. Šķidras ķīmiskās vielas var izmantot gan atšķaidītas, gan neatšķaidītas. Nešķīstošas ķīmiskās vielas (kādas parasti izmanto medicīnas iekārtās) pirms peļu ausu apstrādes ekstrahē piemērotā šķīdinātājā, lai visas ekstrahējamās sastāvdaļas būtu pieejamas testēšanai. Ja dati par testējamo vielu stabilitāti liecina, ka tās uzglabāt nevar, katru dienu sagatavo svaigas testējamās vielas.

11.

Metodes veiktspējas pienācīgumu parāda ar pozitīvās kontroles vielu (PC) palīdzību, kuras ar adekvātu un reproducējamu sensibilitāti reaģē uz sensibilizējošām testēšanas vielām un kuru reakcijas intensitāte ir sīki aprakstīta. Ieteicams paredzēt vienlaicīgu PC, jo tādā veidā var pierādīt laboratorijas spēju atkārtoti un sekmīgi īstenot noteikšanu, kā arī novērtēt iekšlaboratorijas un starplaboratoriju reproducējamību un rezultātu salīdzināmību. Pirms LLNA:DA ieteicams lietotājiem konsultēties ar atbildīgajām iestādēm, jo dažas regulatīvās iestādes pieprasa PC izmantošanu katrā individuālā pētījumā. Attiecīgi labāk ir ikreiz izmantot vienlaicīgu PC, jo tas ļauj neveikt papildu testēšanu ar dzīvniekiem, lai izpildītu prasības, kuras var izrietēt no PC neregulāras izmantošanas (skatīt 12. punktu). PC jādod pozitīva LLNA:DA atbildes reakcija tādā iedarbības līmenī, kurā ir sagaidāms stimulācijas indekss (SI) ≥ 1,8, salīdzinot ar negatīvās kontroles vielu (NC) grupu. PC deva jāizvēlas tā, lai neizraisītu pārmērīgu ādas kairinājumu vai sistēmisku toksicitāti un lai indukcija būtu atkārtojama, taču ne pārmērīga (piemēram, SI > 10 uzskata par pārmērīgu). Ieteicamākās PC ir 25 % heksilkanēļskābes aldehīds (Chemical Abstracts Service [CAS] Nr. 101-86-0) un 25 % eigenols (CAS Nr. 97-53-0) ar acetonu/olīveļļu (4:1 tilp./tilp.). Var būt apstākļi, kad ar pienācīgu pamatojumu var izmantot citas PC, kas atbilst iepriekš minētajiem kritērijiem.

12.

Lai gan vienlaicīgas PC grupas izmantošana ir ieteicama, var būt situācijas, kad laboratorijās, kurās LLNA:DA veic regulāri (t. i., vismaz reizi mēnesī) un kurās tāpēc ir vēsturiska PC datubāze, kas pierāda laboratorijas spēju ar PC iegūt reproducējamus un pareizus rezultātus, piemērotāka var izrādīties periodiska PC izmantošana (t. i., vismaz reizi 6 mēnešos). LLNA:DA metodes adekvātu pārzināšanu var sekmīgi pierādīt, ar PC iegūstot konsekventus pozitīvus rezultātus vismaz 10 neatkarīgās testēšanas reizēs, kuras veiktas samērīgā laika periodā (t. i., ne ilgāk kā gada laikā).

13.

Vienlaicīga PC grupa noteikti jāiekļauj, kad LLNA:DA notiek procedurālas izmaiņas (piemēram, augsti kvalificēta personāla nomaiņa, testēšanas metodes materiālu un/vai reaģentu nomaiņa, cits izmēģinājumu dzīvnieku piegādātājs), un šādas izmaiņas pienācīgi jādokumentē laboratorijas pārskatos. Jānovērtē šādu izmaiņu ietekme uz iepriekš izveidotās vēsturiskās datubāzes adekvātumu un tas, vai vajag veidot jaunu vēsturisku datubāzi, lai dokumentētu ar PC iegūtu rezultātu konsekvenci.

14.

Pētniekiem jāapzinās, ka lēmums par periodisku, nevis vienlaicīgu PC izmantošanu ietekmēs to, kādā mērā par adekvātiem un pieņemamiem varēs uzskatīt negatīvos pētījumu rezultātus, kas bez vienlaicīgas PC iegūti periodiskās PC izmantošanas starplaikos. Piemēram, ja ar periodisko PC pētījumu iegūst šķietami negatīvu rezultātu, var apšaubīt negatīvu testējamās vielas rezultātu, kas iegūts iepriekšējā pieņemamā periodiskā PC pētījuma un nepieņemamā periodiskā PC pētījuma starplaikā. Tāpēc rūpīgi jāizvērtē, vai izmantot vienlaicīgu vai periodisku PC. Tāpat jāizvērtē, kādas ir iespējas vienlaicīgās PC grupā izmantot mazāk dzīvnieku, ja to var zinātniski pamatot un ja laboratorija ar saviem specifiskajiem vēsturiskajiem datiem var pierādīt, ka ir iespējams izmantot mazāk peļu (22).

15.

Kaut arī PC jātestē nesējā, par kuru ir zināms, ka tas izrāda viendabīgu atbildes reakciju (piemēram, acetons/olīveļļa; 4:1 tilp./tilp.), var būt dažas reglamentējošas situācijas, kurās būs nepieciešama arī testēšana nestandarta nesējā (klīniski/ķīmiski piederīgs sastāvs) (23). Ja vienlaicīgo PC testē ar citu nesēju nekā testējamo vielu, vienlaicīgās PC vajadzībām jāparedz atsevišķs VC.

16.

Ja vērtē vielas, kas pieder konkrētai ķīmisko vielu klasei vai kas dod noteikta diapazona reakciju, var izmantot salīdzināšanas vielas, kuras noder, lai parādītu, ka testēšanas metode darbojas un pienācīgi nosaka šā tipa vielām piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu. Pienācīgām salīdzināšanas vielām ir jāpiemīt šādām īpašībām:

17.

Uz devas grupu ar vismaz trim testējamās vielas koncentrācijām izmanto vismaz četrus dzīvniekus un vienlaicīgas NC grupu, kas saņem tikai testējamās vielas nesēju, un PC grupu (vienlaicīgu vai nesenu atkarībā no laboratorijas prakses un saistībā ar 11.–15. punktu). Jāapsver iespēja testēt vairākas PC devas, īpaši tad, ja PC testēšana ir periodiska. Izņemot apstrādi ar testējamo vielu, ar kontroles grupu dzīvniekiem rīkojas tieši tāpat kā ar apstrādāto grupu dzīvniekiem.

18.

Devu un nesēja izvēlei jāpamatojas uz atsaucē (2) un (24) sniegtajiem ieteikumiem. Secīgas devas parasti izraugās no atbilstošas koncentrāciju rindas, kā 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, u. c. Koncentrāciju rindas izvēlei jābūt ar adekvātu zinātnisku pamatojumu. Jāizvērtē visa esošā toksikoloģiskā (piemēram, akūta toksicitāte un dermālais kairinājums) un struktūras un fizikālķīmiskā informācija par attiecīgo testējamo vielu (un/vai par struktūras ziņā saistītām vielām), ja tāda ir, un trīs secīgās koncentrācijas jāizraugās tā, lai augstākā no tām izraisītu stiprāko iedarbību, kura vēl nerada sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu (24) (25). Ja šādas informācijas nav, sākumā var būt jāveic priekšskrīninga tests (skatīt 21.–24. punktu).

19.

Nesējs nedrīkst pārmainīt vai maskēt testēšanas rezultātus, un tas jāizraugās tāds, lai šķīdība būtu iespējami lielāka, tā ļaujot iegūt augstāko reāli sasniedzamo koncentrāciju un iegūstot šķīdumu/suspensiju, kas būtu derīga testējamās vielas pielietošanai. Ieteicamie nesēji ir acetons/olīveļļa (4:1 tilp./tilp.), N,N-dimetilformamīds, metiletilketons, propilēnglikols un dimetilsulfoksīds (6), bet var izmantot arī citus, ja tam ir pietiekams zinātniskais pamatojums. Dažos gadījumos papildu kontrolei jāizmanto klīniski atbilstošs šķīdinātājs vai tirdzniecības preparāts, kura sastāvā testējamo vielu tirgo. Īpaši jārūpējas, lai nodrošinātu to, ka hidrofīlas vielas ir iekļautas nesēja sistēmā, kas mitrina ādu un tūlīt nenotek, un jāizmanto pienācīgi šķīdinātāji (piemēram, 1 % Pluronic® L92). Tādēļ ir jāizvairās no nesējiem, kas satur vienīgi ūdeni.

20.

Izpētot no individuālām pelēm iegūtus limfmezglus, var novērtēt dzīvnieku savstarpējās atšķirības un iegūt testējamās vielas grupas un VC grupas mērījumu statistisku salīdzinājumu (skatīt 33. punktu). Turklāt PC grupas peļu skaita iespējamā samazinājuma izvērtējumam jēga ir vienīgi tad, ja dati ir par individuāliem dzīvniekiem (22). Dažas regulatīvās iestādes prasa, lai dati būtu par individuāliem dzīvniekiem. Regulāra datu vākšana par individuāliem dzīvniekiem dod priekšrocības dzīvnieku labturības ziņā, jo ļauj izvairīties no atkārtotas testēšanas gadījumā, ja vielas testēšanas rezultātus sākotnēji apkopo vienā veidā (piemēram, par apstrādes grupu), bet regulatīvās iestādes vēlāk izvirza citas prasības (piemēram, pieprasa datus par individuāliem dzīvniekiem).

21.

Ja nav informācijas, lai noteiktu augstāko testējamo devu (skatīt 18. punktu), jāveic priekšskrīninga tests, lai definētu ar LLNA:DA testējamo atbilstošo devas līmeni. Priekšskrīninga testa mērķis ir būt par orientieri ar LLNA:DA testējamā maksimālā devas līmeņa izvēlē, ja nav informācijas par koncentrāciju, kādā testējamā viela izraisa sistēmisku toksicitāti (skatīt 24. punktu) un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu (skatīt 23. punktu). Maksimālajam testējamās vielas devas līmenim vajadzētu būt 100 % (šķidrumiem) un augstākajai iespējamajai koncentrācijai (cietām vielām un suspensijām).

22.

Priekšskrīninga testa apstākļi ir identiski pamata LLNA:DA apstākļiem, izņemot to, ka nevērtē progresiju limfmezglos un ka devas grupā var izmantot mazāku skaitu dzīvnieku. Ieteicamais skaits ir viens vai divi dzīvnieki katrā devas grupā. Visām pelēm ik dienas pārbauda to, vai apstrādes vietā nav klīnisku pazīmju, kas liecinātu par sistēmisku toksicitāti vai lokālu kairinājumu. Pirms testa un tā beigās (8. diena) reģistrē dzīvnieku ķermeņa masu. Katrai peles apskata abas ausis, un iespējamo apsārtumu novērtē pēc 1. tabulas punktu skalas (25). Auss biezumu mēra ar piemērotu mērierīci (piemēram, digitālo mikrometru vai “Peacock” tipa biezuma mērierīci) 1. dienā (pirms devas), 3. dienā (aptuveni 48 stundas pēc pirmās devas), 7. dienā (24 stundas pirms testēšanas beigām) un 8. dienā. Turklāt 8. dienā auss biezumu var mērīt ar auss caursišanas paņēmienu pēc tam, kad dzīvnieki ir humāni nonāvēti. Lokālu kairinājumu uzskata par pārmērīgu tad, ja jebkurā mērījumu dienā apsārtuma novērtējums pēc punktu skalas ir ≥ 3 un/vai auss biezums ≥ 25 % (26) (27). Lielākā deva, kas izmantojama LLNA:DA pamata testā, ir otrā zemākā deva priekšskrīninga koncentrāciju rindā (skatīt 18. punktu), kas neizraisa sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu.

1.   tabula

Apsārtuma (eritēmas) skala

23.

Papildus auss biezuma 25 % pieaugumam (26) (27) kairinātāju identificēšanai LLNA izmanto arī statistiski nozīmīgus auss biezuma pieauguma rādītājus apstrādātajām pelēm salīdzinājumā ar kontroles grupas pelēm (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Tomēr, lai gan statistiski nozīmīgs pieaugums var arī nesasniegt 25 % robežu, šādu pieaugumu neuzskata par pārmērīga kairinājuma izpausmi (30) (31) (32) (33) (34).

24.

Turpmāk uzskaitītie klīniskie novērojumi, ja tie ir novērtējuma neatņemama daļa, var liecināt par sistēmisku toksicitāti (35), un tāpēc var parādīt, kāds būs LLNA:DA pamata testā izmantojamais maksimālais devas līmenis: nervu sistēmas darbības traucējumi (piemēram, piloarekcija, ataksija, drebuļi un krampji); uzvedības traucējumi (piemēram, agresivitāte, ar personīgo higiēnu saistītās uzvedības maiņa, jūtams aktivitātes samazinājums vai pieaugums); neraksturīga elpošana (piemēram, elpas vilcienu biežuma un intensitātes maiņa, kā apgrūtināta vai spazmatiska elpošana, trokšņi plaušās) un pārmaiņas barības un ūdens uzņemšanā. Turklāt novērtējumā jāņem vērā letarģijas pazīmes un/vai reakcijas samazināšanās un visas klīniskās pazīmes, kas liecina par vairāk nekā mirklīgām sāpēm un ciešanām, vai ķermeņa masas samazinājums par vairāk nekā 5 % laikā no 1. dienas līdz 8. dienai, kā arī mirstības rādītāji. Mirstoši dzīvnieki vai dzīvnieki, kuri uzrāda stipru sāpju un ciešanu pazīmes, ir humāni jānonāvē (36).

25.

Eksperimenta grafiks ir šāds:

—   1. diena: individuāli nosaka un reģistrē katra dzīvnieka masu, reģistrē klīniskos novērojumus. Izmantojot SLS šķīdumā iemērktu otiņu un katras auss aizmugures virsmu noklājot četros līdz piecos triepienos, uzliek 1 % nātrija laurilsulfāta (SLS) šķīdumu ūdenī. Stundu pēc apstrādes ar SLS katras auss aizmugures virsmu apstrādā ar 25 μl atšķaidījuma, kurš satur attiecīgo testējamo vielu, tikai nesēju vai PC (vienlaicīgu vai nesenu atkarībā no laboratorijas prakses un saistībā ar 11.–15. punktu).

—   2., 3. un 7. diena: atkārto priekšapstrādi ar 1 % SLS šķīdumu ūdenī un testējamās vielas uzlikšanu kā 1. dienā.

—   4., 5. un 6. diena: apstrāde nenotiek.

—   8. diena: reģistrē katra dzīvnieka masu un klīniskos novērojumus. Aptuveni 24 līdz 30 stundas pēc tam, kad 7. dienā sākta vielas uzlikšana, dzīvniekus humāni nonāvē. No katras auss izgriež aurikulāros limfmezglus, kurus katrai pelei atsevišķi apstrādā fizioloģiskajā šķīdumā ar fosfātbuferi (PBS). Sīkus datus un diagrammas par limfmezglu identificēšanu un izgriešanu skatīt atsaucēs (22). Eksperimenta protokolā var iekļaut papildu parametrus, kas raksturo turpmāku ādas lokālo reakciju pamata pētījuma laikā, piemēram, auss apsārtuma novērtējumu pēc punktu skalas vai auss biezuma mērījumus (nosaka ar mērierīci vai ar auss caursišanas paņēmienu autopsijā).

26.

No katrai pelei abās pusēs izgrieztām limfmezglu šūnām (LNC) sagatavo atsevišķu šūnu suspensiju; to dara, limfmezglus novietojot starp diviem priekšmetstikliņiem un viegli uzspiežot, lai tie pārplīstu. Kad audi vienmērīgi un plānā kārtā izlīdzinājušies, priekšmetstikliņus atdala vienu no otra. Uz abiem priekšmetstikliņiem esošos audus suspendē ar PBS, priekšmetstikliņu slīpā leņķī turot virs Petri trauciņa un skalojot ar PBS, un vienlaikus ar šūnu skrāpi tīrot priekšmetstikliņu no audiem. Tā kā NC dzīvnieku limfmezgli ir mazi, tie jāapstrādā ar sevišķu rūpību, lai novērstu SI vērtību izkropļojumus. Abu priekšmetstikliņu noskalošanai jāizmanto kopā 1 mL PBS. Petri trauciņā atrodošos LNC suspensiju homogenizē, nedaudz apmaisot ar šūnu skrāpi. Ar mikropipeti savāc 20 μL LNC suspensijas alikvotas, neskarot ar aci saredzamo membrānu, un pagatavo tās maisījumu ar 1,98 mL PBS, rezultātā iegūstot 2 mL paraugu. Pēc šīs pašas procedūras sagatavo otru 2 mL paraugu; tādā veidā no katra dzīvnieka iegūst divus paraugus.

27.

ATP satura pieaugumu limfmezglos mēra ar luciferīna/luciferāzes metodi, izmantojot ATP mērīšanas komplektu, kas mēra bioluminiscenci, to izsakot relatīvās luminiscences vienībās (RLU). Noteikšanas laikam, kas aizrit no dzīvnieka nonāvēšanas brīža līdz ATP satura izmērīšanai, katra individuāla dzīvnieka gadījumā jābūt iespējami vienādākam un jāiekļaujas apmēram 30 minūtēs, jo uzskata, ka ATP saturs pēc dzīvnieka nonāvēšanas pakāpeniski samazinās (12). Tāpēc procedūru virkne, no aurikulāro limfmezglu izgriešanas līdz ATP izmērīšanai, jāpabeidz 20 minūtēs, ievērojot iepriekš noteiktu grafiku, kas visiem dzīvniekiem ir vienāds. ATP luminiscence jāmēra katrā 2 mL paraugā, tādā veidā no katra dzīvnieka iegūstot divus ATP mērījumu rezultātus. Turpmāko aprēķinu vajadzībām nosaka un izmanto vidējo ATP luminiscences rādītāju (skatīt 30. punktu).

28.

Ikviena pele vismaz reizi dienā ir rūpīgi jānovēro attiecībā uz vietēju kairinājumu apstrādes vietā vai sistēmiskas toksicitātes klīniskajām pazīmēm. Visus novērojumus sistemātiski reģistrē, par katru peli izdarot individuālu ierakstu. Novērošanas plānā jāiekļauj kritēriji, kas ļauj tūlīt identificēt peles, kurām ir sistēmiskas toksicitātes, pārmērīga lokāla ādas kairinājuma vai ādas korozijas pazīmes, lai tām veiktu eitanāziju (36).

29.

Kā norādīts 25. punktā, individuālu dzīvnieku ķermeņa masa ir jānosaka testa sākumā un pirms plānotās humānās nonāvēšanas.

30.

Katras apstrādes grupas rezultātu izsaka ar vidējo SI. SI iegūst, vidējo RLU vērtību katrai pelei katrā testējamās vielas grupā un PC grupā dalot ar vidējo RLU vērtību katrai pelei šķīdinātāja/VC grupā. Tā VC grupās vidējais SI ir 1.

31.

Lēmumu pieņemšanas procesā rezultātu uzskata par pozitīvu, ja SI ≥ 1,8 (10). Tomēr, nosakot, vai neitrālam tuvu rezultātu (t. i., ar SI vērtību robežās no 1,8 līdz 2,5) varētu uzskatīt par pozitīvu, var ņemt vērā arī devas un atbildes reakcijas stiprumu un šķīdinātāja/nesēja un PC reakcijas statistisko nozīmīgumu un konsekvenci (2) (3) (37).

32.

Attiecībā uz neitrālam tuvu pozitīvu rezultātu ar SI vērtību robežās no 1,8 līdz 2,5, pirms apstiprināt, ka šis rezultāts ir pozitīvs, lietotāji var izvērtēt tādu papildu informāciju kā devas un atbildes reakcijas mijiedarbība, sistēmiskas toksicitātes vai pārmērīga kairinājuma pazīmes un, attiecīgā gadījumā, statistiskais nozīmīgums apvienojumā ar SI vērtībām (10). Jāņem vērā arī testējamās vielas dažādās īpašības, tostarp tas, vai tā strukturāli līdzinās jau zināmiem ādas sensibilizatoriem, vai tā izraisa pārmērīgu ādas kairinājumu pelēm un kāda veida atbildes reakcija uz devu ir novērota. Šie un citi apsvērumi sīkāk iztirzāti citur (4).

33.

Datu vākšana par individuālām pelēm pavērs iespējas statistiskai analīzei par devas un atbildes reakcijas mijiedarbības esību un tās pakāpi šajos datos. Jebkurš statistisks novērtējums var ietvert devas un atbildes reakcijas mijiedarbības novērtējumu, kā arī pienācīgi koriģētus testējamo grupu salīdzinājumus (piemēram, devu pāri grupā un šīs grupas salīdzinājums ar vienlaicīgu šķīdinātāja/kontroles grupu). Statistiskā analīze var ietvert, piemēram, lineāro regresiju jeb Viljamsa [William’s] testu, ar ko analizē devas un atbildes reakcijas mijiedarbību tendences, un Daneta [Dunnett] testu, lai salīdzinātu devu pārus. Izvēloties attiecīgu statistiskās analīzes metodi, pētniekam jāapzinās iespējamās mainīgo lielumu nevienādības un citas ar to saistītās problēmas, kuru dēļ var būt nepieciešama datu pārveidošana vai neparametriskā statistiskā analīze. Visādā ziņā iespējams, ka pētniekam SI būs jāaprēķina un statistiskā analīze jāveic gan ar, gan bez dažiem punktveida datiem (respektīvi, neņemot vērā galējības jeb rupjas kļūdas).

34.

Dati jāapkopo tabulā, uzrādot indivīdu RLU vērtības, grupas vidējo RLU vērtību uz dzīvnieku, attiecīgo kļūdas apzīmējumu (piem., SD, SEM) un vidējo SI katrai devas grupai salīdzinājumā ar vienlaicīgo šķīdinātāja/kontroles grupu.

35.

Testēšanas pārskatā jābūt iekļautai šādai informācijai:

1)

OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

2)

Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem, Toxicol., 34, 999-1002.

3)

Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem, Toxicol., 34, 985-997.

4)

Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-333.

5)

Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, 49-59.

6)

ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]

7)

Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 258-273.

8)

Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 274-286.

9)

Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process.Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 249-257.

10)

ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No. 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm]

11)

ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf].

12)

Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Characterization and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint.J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 1-10.

13)

Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node assay based on adenosine triphosphate measurement. J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 11-26.

14)

OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

15)

Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.

16)

Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96.

17)