“B.53.   ONTOĢENĒZES NEIROTOKSICITĀTES PĒTĪJUMS

IEVADS

1.   Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (TG) 426 (2007. gads). Kopenhāgenā 1995. gada jūnijā ESAO Reproduktīvās un ontoģenēzes toksicitātes darbgrupa apsprieda vajadzību atjaunināt esošos ESAO testēšanas norādījumus reproduktīvās un ontoģenēzes toksicitātes jomā un izstrādāt jaunus norādījumus attiecībā uz beigupunktiem, kas vēl nav aprakstīti (1). Darbgrupa ieteica, ka ontoģenēzes neirotoksicitātes testēšanas norādījumi ir jāsagatavo atbilstoši ASV EPA norādījumiem, kuri pēc minētā datuma ir pārskatīti (2). 1996. gada jūnijā Kopenhāgenā notika otrā konsultatīvā sanāksme ar mērķi informēt sekretariātu par jauno ontoģenēzes neirotoksicitātes testēšanas norādījumu izklāstu, aptverot galvenos aspektus, piemēram, norādījumus par dzīvnieku sugu izvēli, devas došanas periodu, testēšanas periodu, novērtējamos beigupunktus un rezultātu novērtēšanas kritērijus. ASV neirotoksicitātes riska novērtēšanas norādījumi tika publicēti 1998. gadā (3). 2000. gada oktobrī vienlaicīgi notika ESAO ekspertu konsultatīvā sanāksme un ILSI Riska zinātnes institūta seminārs, un 2005. gadā Tokijā notika ekspertu konsultatīvā sanāksme. Minēto sanāksmju mērķis bija pārrunāt zinātniskos un tehniskos jautājumus saistībā ar pašreizējiem testēšanas norādījumiem, un sanāksmēs sniegtie ieteikumi (4)(5)(6)(7) tika ņemti vērā, izstrādājot šo testēšanas metodi. Papildu informācija par šīs testēšanas metodes izmantošanu, iegūto rezultātu interpretāciju un terminoloģiju ir pieejama ESAO Norādījumu dokumentā Nr. 43 “Reproduktīvās toksicitātes testēšana un novērtējums” (8) un Norādījumu dokumentā Nr. 20 “Neirotoksicitātes testēšana” (9).

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI

2.   Vairākas ķīmiskās vielas cilvēkiem un citām sugām rada ontoģenēzes neirotoksicitātes risku (10)(11)(12)(13). Lai pārbaudītu un novērtētu ķīmiskās vielas toksiskās īpašības, var būt nepieciešams noteikt potenciālo ontoģenēzes neirotoksicitāti. Ontoģenēzes neirotoksicitātes pētījumus izstrādā tā, lai varētu iegūt datus, tostarp devas un atbildes reakcijas raksturojumu, par tādu iespējamu funkcionālu un morfoloģisku ietekmi uz pēcnācēja nervu sistēmu attīstības procesā, kuras iemesls var būt ekspozīcija in utero un dzīves sākumā.

3.   Ontoģenēzes neirotoksicitātes pētījumu var veikt kā reproduktīvās toksicitātes un/vai pieaugušu dzīvnieku neirotoksicitātes pētījumā ietilpstošu pētījumu (piemēram, B.34. (14), B.35. (15), B.43. (16) testēšanas metode) vai to pievienot prenatālās ontoģenēzes toksicitātes pētījumam (piemēram, B.31. (17) testēšanas metode). Ja ontoģenēzes neirotoksicitātes pētījumu iekļauj citā pētījumā vai tādam pētījumam pievieno, ir ļoti svarīgi saglabāt abu pētījumu integritāti. Visiem testiem jābūt saskaņā ar piemērojamiem tiesību aktiem vai valdības un iestāžu norādījumiem par laboratorijas dzīvnieku izmantošanu pētījumos (piemēram, 18).

4.   Pirms pētījuma sākšanas testēšanas laboratorijai ir jāizskata visa pieejamā informācija par testējamo ķīmisko vielu. Šādā informācijā ietilpst ķīmiskās vielas identitāte un struktūra, fizikālķīmiskās īpašības, citu to in vitro vai in vivo toksicitātes testu rezultāti, kur attiecīgā viela izmantota, toksikoloģiskie dati par strukturāli līdzīgām ķīmiskajām vielām un vielas paredzamais(-ie) lietošanas veids(-i). Šī informācija ir vajadzīga, lai nodrošinātu, ka tests atbilst nolūkam aizsargāt cilvēku veselību un ka tiek pareizi izraudzīta sākotnējā deva.

TESTA PRINCIPS

5.   Testējamo ķīmisko vielu ievada grūsniem dzīvniekiem un dzīvniekiem laktācijas periodā. Mātītes testē, lai novērtētu iedarbību uz grūsnām un barojošām mātītēm, un minētie pētījumi var arī sniegt salīdzinošu informāciju (par mātītēm un pēcnācējiem). Pēcnācējus, kuriem veic neirotoksicitātes novērtējumu, no metiena izvēlas nejaušināti. Pētījumā izdara novērojumus, lai noteiktu būtiskus neiroloģiskus un uzvedības traucējumus, arī lai novērtētu fizisko attīstību, uzvedības ontoģenēzi, motorisko aktivitāti, motoriskās un sensoriskās funkcijas un mācīšanos un atmiņu, kā arī smadzeņu svaru un neiropatoloģiju postnatālās attīstības periodā un pieaugušam dzīvniekam.

6.   Ja testēšanas metodi izmanto kā atsevišķu pētījumu, papildu pieejamos dzīvniekus katrā grupā var izmantot noteiktām neiroizturēšanās, neiropatoloģiskām, neiroķīmiskām vai elektrofizioloģiskām procedūrām, kuras dod iespēju papildināt šai testēšanas metodē ieteicamajos standartizmeklējumos iegūtos datus (16)(19)(20)(21). Minētās papildu procedūras var īpaši noderēt, ja empīriskie novērojumi, gaidāmā iedarbība vai mehānismi/darbības veidi norāda uz noteikta veida neirotoksicitāti. Minētās papildu procedūras var izmantot gan mātītēm, gan mazuļiem. Turklāt var izmantot arī ex vivo vai in vitro procedūras, ja vien tās neietekmē in vivo procedūru integritāti.

SAGATAVOŠANĀS TESTAM

Dzīvnieku sugu izvēle

7.   Testā ieteicamā suga ir žurka, bet vajadzības gadījumā var izmantot citas sugas. Tomēr jāņem vērā, ka šīs testēšanas metodes norādes attiecībā uz grūsnību un pēcdzemdību periodu atbilst parasti izmantotajām žurku līnijām, un ja izmanto citas sugas vai netipiskas dzīvnieku līnijas, jāizvēlas salīdzināmi periodi. Izmantojot citas sugas dzīvniekus, izvēle ir jāpamato ar toksikoloģijas, farmakokinētikas un/vai citiem datiem. Pamatojumā jānorāda, vai ir pieejams konkrētajai sugai raksturīgās pēcdzemdību neiroizturēšanās un neiropatoloģijas novērtējums. Ja iepriekš veiktos testos radušās bažas, jāapsver, vai neizmantot sugu/līniju, ar kuru radušās bažas. Dažādu sugu žurkām atbildes reakcija ir atšķirīga, un tāpēc ir jābūt pierādījumiem, ka izvēlētās līnijas vaislība un jutība ir atbilstīga. Ir jādokumentē citu sugu datu ticamība un jutība attiecībā uz ontoģenēzes neirotoksicitātes noteikšanu.

Turēšanas un barošanas nosacījumi

8.   Temperatūrai eksperimenta dzīvnieku turēšanas telpā jābūt 22 ± 3 °C. Lai gan relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un, izņemot telpu uzkopšanas laiku, vēlams, ne vairāk kā 70 %, jācenšas nodrošināt mitrumu 50–60 % robežās. Dzīvniekus 12 stundas diennaktī tur mākslīgā apgaismojumā, bet 12 stundas tumsā. Apgaismojuma ciklu var mainīt arī pirms pārošanās un uz visu pētījuma laiku, lai novērtētu funkcionālos un uzvedības beigupunktus laikā, kad telpās ir tumšs (sarkanajā apgaismojumā), t. i., laikā, kad dzīvnieki parasti ir aktīvi (22). Ja tiek mainīts gaismas un tumsas cikls, ir jānodrošina attiecīgs aklimatizācijas periods, lai dzīvnieki varētu pielāgoties jaunajam ciklam. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu piekļuvi dzeramajam ūdenim. Ir jāreģistrē barības un ūdens veids un ir jāpārbauda, vai tie nav piesārņoti.

9.   Dzīvniekus būros var turēt atsevišķi vai nelielās viendzimuma grupās. Pārošanas procedūras jāveic attiecīgajam nolūkam piemērotos būros. Pārotos dzīvniekus pēc kopulācijas vai ne vēlāk kā no grūtniecības 15. dienas tur atsevišķi dzemdību vai maternitātes būros. Būrus izvieto tā, lai iespējami mazinātu būru novietojuma varbūtējo ietekmi. Tuvojoties dzemdībām, sapārotajām mātītēm ir jānodrošina piemēroti un iepriekš noteikti materiāli migas veidošanai. Ir labi zināms, ka grūsnības laikā nepiemērota apiešanās vai stress var radīt negatīvas sekas, izraisīt augļa zaudēšanu un augļa un postnatālās attīstības izmaiņas. Lai izvairītos no augļa zaudēšanas, ko izraisa ar vielas ievadīšanu nesaistīti faktori, ar grūsniem dzīvniekiem ir jārīkojas uzmanīgi un ir jāizvairās no ārējo faktoru radīta stresa, piemēram, no pārmērīga ārpuses trokšņa.

Dzīvnieku sagatavošana

10.   Pētījumā ir jāizmanto veseli dzīvnieki, kuri ir aklimatizējušies laboratorijas apstākļos un kuriem eksperimentālas procedūras iepriekš nav veiktas, izņemot gadījumus, kur pētījums ietilpst citā pētījumā (skatīt 3. punktu). Testa dzīvniekiem ir jānorāda suga, līnija, izcelsme, dzimums, svars un vecums. Visus dzīvnieku marķē ar individuālu identifikācijas numuru. Visās testa grupās, cik vien tas praktiski iespējams, dzīvnieku svaram un vecumam jābūt vienādam, pētāmās sugas un līnijas standarta diapazonā. Visiem devas līmeņiem jāizmanto pieaugušas mātītes, kas nav dzemdējušas. Brāļus un māsas nedrīkst pārot, un jāraugās, lai to nepieļautu. Grūsnības 0. diena ir diena, kad novērots maksts embols un/vai sperma. Iegādājoties grūsnus dzīvniekus, tiem ir jānodrošina pietiekams aklimatizācijas periods (piemēram, 2–3 dienas). Sapārotās mātītes nejaušināti jāsadala kontroles un vielas ievadīšanas grupā, un dzīvnieki grupās ir jāsadala iespējami vienmērīgi (piemēram, grupās ieteicams ar stratificētas nejaušināšanas procedūru nodrošināt vienmērīgu sadalījumu pēc svara vai citos aspektos). Pa grupām vienmērīgi jāsadala ir arī mātītes, ko apsēklojis viens un tas pats tēviņš.

PROCEDŪRA

Dzīvnieku skaits un dzimums

11.   Testējamās ķīmiskās vielas ievadīšanai paredzēto grūsno mātīšu skaitam katrā testa un kontroles grupā jābūt pietiekamam, lai nodrošinātu, ka tiek iegūts pietiekams skaits pēcnācēju neirotoksicitātes izvērtēšanai. Katrā devu līmenī ieteicams izmantot 20 metienus. Ja metienu kopskaits uz grupu ir nodrošināts un ja replicēto devu izmantošanu atspoguļo, izmantojot piemērotu statistisku modeli, drīkst izmantot replicētu devu ievadīšanas modeļus un modeļus, kuros atšķiras devu ievadīšanas sākumpunkts.

12.   Pēc piedzimšanas 4. dienā vai pirms tam (piedzimšanas diena ir 0. diena pēc piedzimšanas), mazuļu skaits katrā metienā jākoriģē, liekos mazuļus nejaušināti likvidējot, lai nodrošinātu vienādu metienu lielumu (23). Metienu lielums nedrīkst pārsniegt izmantotās grauzēju līnijas metiena vidējo lielumu (8–12). Metienā ir jāatstāj iespējami vienāds skaits vīriešu un sieviešu dzimuma mazuļu. Selektīva mazuļu likvidēšana, piemēram, balstoties uz ķermeņa svaru, nav pieļaujama. Pēc metiena standartizēšanas (lieko likvidēšanas) un pirms funkcionālo beigupunktu turpmākas testēšanas katram atsevišķam mazulim, ko paredzēts izmantot testēšanai pirms vai pēc atšķiršanas no mātes, piešķir unikālu identifikāciju, izmantojot jebkādu mazuļiem piemērotu, humānu identifikācijas metodi (piemēram, (24)).

Dzīvnieku grupēšana funkcionālajiem un uzvedības testiem, smadzeņu svara noteikšanai un neiropatoloģiskai izvērtēšanai

13.   Šī testēšanas metode paredz iespēju izmantot dažādas pieejas, kā in utero un laktācijas periodā eksponētus dzīvniekus grupēt izmantošanai funkcionālos un uzvedības testos, dzimumbrieduma testos, smadzeņu svara noteikšanai un neiropatoloģiskai izvērtēšanai (25). Atsevišķi var iekļaut citus neiroizturēšanās funkciju (piemēram, sociālās uzvedības), neiroķīmijas vai neiropatoloģijas testus, ja tas neapdraud pamata testu integritāti.

14.   Beigupunktu novērtēšanai mazuļus no katras grupas, kas saņem vienādu devu, izraugās un sadala 4. dienā pēc piedzimšanas vai vēlāk. Mazuļus atlasa tā, lai visos testos no katra vienas devas grupas metiena pēc iespējas būtu pārstāvēti abi dzimumi. Motoriskās aktivitātes testos visos vecuma posmos pirms atšķiršanas no mātes testē vienu un to pašu vīrišķā un sievišķā dzimuma mazuļu pāri (skatīt 35. punktu). Dažādos citos uzvedības testēšanas testos var izmantot vienu un to pašu tēviņa un mātītes pāri vai citus pārus. Lai kognitīvo funkciju mērījumos izvairītos no ietekmes, kas saistīta ar vecumu un iepriekšēju apmācību (26) (27), no mātes atšķirto mazuļu un pieaugušo dzīvnieku kognitīvo funkciju testu rezultātu salīdzināšanai var būt nepieciešams ņemt atšķirīgus mazuļus. Mazuļus atšķirot no mātes (21. dienā pēc piedzimšanas), tos, kurus neizraugās testēšanai, var humāni nonāvēt. Visas mazuļu sadalījuma izmaiņas ir jāreģistrē. Statistiskajai mērvienībai ir jābūt metienam (vai mātītei), nevis mazulim.

15.   Ir dažādi veidi, kā mazuļus iedalīt pārbaudēm pirms un pēc atšķiršanas no mātes, kognitīvajiem testiem, patoloģiju pārbaudēm utt. (skatīt 1. attēlu, kur sniegta vispārīga shēma, un 1. papildinājumu, kur norādīti iedalījuma piemēri). Ieteicamais minimālais dzīvnieku skaits pārbaudēm pirms un pēc atšķiršanas no mātes katrā devas grupā ir šāds:

Klīniskie novērojumi un ķermeņa svars	Visi dzīvnieki
Detalizēti klīniskie novērojumi	20 no katra dzimuma (1 no katra dzimuma uz metienu)
Smadzeņu svars (pēc fiksācijas) 11.–22. dienā pēc piedzimšanas	10 no k. dzimuma (1 no metiena)
Smadzeņu svars (bez fiksācijas), apmēram 70. dienā pēc piedzimšanas	10 no k. dzimuma (1 no metiena)
Neiropatoloģija (iegremdēšana vai fiksācija ar perfūziju), 11.–22. dienā pēc piedzimšanas	10 no k. dzimuma (1 no metiena)
Neiropatoloģija (fiksācija ar perfūziju) apmēram 70. dienā pēc piedzimšanas	10 no k. dzimuma (1 no metiena)
Dzimumbriedums	20 no k. dzimuma (1 no k. dzimuma uz metienu)
Citi attīstības parametri (pēc izvēles)	Visi dzīvnieki
Uzvedības ontoģenēze	20 no k. dzimuma (1 no k. dzimuma uz metienu)
Motoriskā aktivitāte	20 no k. dzimuma (1 no k. dzimuma uz metienu)
Motoriskās un sensoriskās funkcijas	20 no k. dzimuma (1 no k. dzimuma uz metienu)
Mācīšanās un atmiņa	10 no k. dzimuma (1) (1 no metiena)

Dozēšana

16.   Izmanto vismaz trīs devu līmeņus un vienlaicīgas kontroles grupu. Devu līmeņu intervālam jābūt tādam, lai būtu vērojama toksiskās iedarbības gradācija. Ja vien augstāko devas līmeni neierobežo ķīmiskās vielas fizikālķīmiskās vai bioloģiskās īpašības, šis līmenis jāizvēlas ar mērķi izraisīt maternālo toksicitāti (piemēram, klīniski simptomi, samazināts ķermeņa svara pieaugums (ne vairāk kā 10 %) un/vai pazīmes, ka mērķorgānu toksicitāti ietekmē devas līmenis). Augstākā deva var būt līdz 1 000 mg uz kg ķermeņa svara dienā, izņemot atsevišķus gadījumus. Piemēram, sagaidāmā cilvēku ekspozīcija var norādīt uz to, ka jāizmanto augstāka deva. Lai noteiktu augstāko devas līmeni, kas jāizmanto un kam būtu jārada minimāls maternālās toksicitātes līmenis, var arī veikt izmēģinājuma pētījumus vai iepriekšējus devu līmeņa noteikšanas pētījumus. Ja tas, ka testējamā ķīmiskā viela ietekmē attīstību, konstatēts ontoģenēzes toksicitātes standartpētījumā vai izmēģinājuma pētījumā, augstākais devas līmenis ir maksimālā deva, kas neradīs pārmērīgu pēcnācēja toksicitāti vai bojāeju in utero vai neonatālajā periodā un ar ko pietiek, lai pamatoti izvērtētu toksicitāti. Zemākajam devas līmenim būtu jābūt tādam, lai nerastos maternālās vai ontoģenēzes toksicitātes, tostarp neirotoksicitātes, pazīmes. Devu līmeņi jāizraugās to samazinājuma virzienā tā, lai parādītos jebkāda ar devu saistīta atbildes reakcija un lai zemākais devas līmenis būtu nenovērojamas nelabvēlīgas ietekmes līmenis (NOAEL), vai jāizraugās noteikšanas robežai tuvas devas, kas varētu palīdzēt noteikt etalondevu. Devu līmeņu noteikšanai to samazinājuma virzienā optimums bieži vien ir divkārši līdz četrkārši intervāli, un bieži vien ir ieteicamāk pievienot ceturto devu grupu, nevis izmantot ļoti plašu devu intervālu (piemēram, vairāk nekā 10 reizes).

17.   Devu līmeņi ir jāizvēlas, ņemot vērā visus esošos toksicitātes datus, kā arī papildu informāciju par testējamās ķīmiskās vielas vai ar to saistītu materiālu metabolismu un toksikokinētiku. Minētā informācija var arī palīdzēt parādīt devu došanas režīma piemērotību. Vai devas mazuļiem nedot tieši, ir jāapsver, balstoties uz ekspozīciju un farmakokinētisko informāciju (28)(29). Pirms veikt pētījumus ar tiešu devu došanu, ir rūpīgi jāizvērtē priekšrocības un trūkumi (30).

18.   Vienlaicīgas kontroles grupai jāsaņem placebo vai nesējviela, ja pēdējo testējamās ķīmiskās vielas ievadīšanai izmanto. Visiem dzīvniekiem parasti jādod vienāds testējamās ķīmiskās vielas vai nesējvielas tilpums attiecībā pret ķermeņa svaru. Ja devu došanā izmanto nesējvielu vai citu piedevu, jāņem vērā šādas īpašības – ietekme uz testējamās ķīmiskās vielas uzsūkšanos, izplatīšanos, metabolismu vai aizturi; tāda ietekme uz testējamās ķīmiskās vielas ķīmiskajām īpašībām, kas var mainīt tās toksiskās īpašības; un ietekme uz barības un ūdens patēriņu vai dzīvnieku barojuma stāvokli. Nesējvielas ietekme nedrīkst traucēt pētījuma interpretāciju, tai nedrīkst piemist neiroizturēšanās toksicitāte un tā nedrīkst ietekmēt reprodukciju vai attīstību. Jaunām nesējvielām papildus nesējvielas kontroles grupai jāizmanto placebo saņēmēja kontroles grupa. Ar kontroles grupas(-u) dzīvniekiem jārīkojas tāpat kā ar testa grupas dzīvniekiem.

Devu ievadīšana

19.   Jāizraugās tāds testējamās ķīmiskās vielas vai nesējvielas ievadīšanas ceļš, kas visvairāk atbilst cilvēka ekspozīcijas gadījumam, un jābalstās uz pieejamo informāciju par tās metabolismu un izplatīšanos testa dzīvnieku organismā. Testējamo ķīmisko vielu parasti ievada orāli (piemēram, ar mākslīgo barošanu vai ar uzturu vai dzeramo ūdeni), bet, ņemot vērā vielas īpašības un tās paredzamo vai zināmo iedarbību uz cilvēkiem, var izmantot arī citus veidus (piemēram, caur ādu vai ar inhalāciju) (papildu norādījumi ir sniegti Norādījumu dokumentā Nr. 43(8)). Izraudzītais ievadīšanas ceļš ir jāpamato. Testējamā ķīmiskā viela katru dienu ir jāievada aptuveni vienā laikā.

20.   Katram dzīvniekam ievadīto devu parasti izvēlas atkarībā no pēdējā noteiktā individuālā ķermeņa svara. Tomēr grūsnības pēdējā trešdaļā deva jānosaka piesardzīgi. Ja vielu saņēmušajām mātītēm ir novērojama pārmērīga toksicitāte, tādi dzīvnieki ir humāni jānonāvē.

21.   Testējamo ķīmisko vielu vai nesējvielu sapārotajām mātītēm ievada vismaz katru dienu, sākot ar implantācijas brīdi (grūsnības 6. dienā), visu laktācijas periodu (21. diena pēc piedzimšanas), lai mazuļus testējamai ķīmiskai vielai eksponētu prenatālās un postnatālās neiroloģiskās attīstības periodā. Ja pierādījumi liecina, ka kāds (cits) eksperimenta plāns cilvēka ekspozīcijas gadījumam ir vairāk piemērots, devas ievadīšanas sākuma vecumu, kā arī tās ievadīšanas ilgumu un biežumu var koriģēt. Devas ievadīšanas ilgumu citām sugām pielāgo tā, lai nodrošinātu ekspozīciju visos smadzeņu attīstības sākumposmos (piemēram, periodos, kas līdzvērtīgi cilvēka smadzeņu attīstībai prenatālajā periodā un postnatālā perioda sākumā). Devu var sākt ievadīt, grūsnībai sākoties (tās 0. dienā), bet jāņem vērā, ka testējamā ķīmiskā viela var izraisīt (augļa) bojāeju pirms implantācijas. Ja devu ievada, sākot ar grūsnības 6. dienu, minētais risks nepastāv, bet tādā gadījumā attīstības stadijās no grūsnības 0. dienas līdz 6. dienai deva nebūtu ievadīta. Ja laboratorija iegādājas sapārotus dzīvniekus, grūsnības 0. dienā devu ievadīt sākt nav iespējams, un tādā gadījumā devu var sākt ievadīt grūsnības 6. dienā. Testēšanas laboratorijai devu došanas režīms ir jānosaka, ņemot vērā attiecīgo informāciju par testējamās ķīmiskās vielas ietekmi, iepriekšēju pieredzi un loģistikas apsvērumus; var būt gadījumi, kur devu turpina ievadīt arī pēc atšķiršanas no mātes. Atnešanās dienā dzīvniekiem, kam dzemdību process vēl nav beidzies, devu ievadīt nedrīkst. Kopumā tiek pieņemts, ka mazuļi testējamo ķīmisko vielu saņem ar mātes pienu, tomēr, ja trūkst pierādījumu tam, ka pēcnācējs joprojām ir eksponēts ķīmiskajai vielai, ir jāizvērtē iespēja mazuļiem pārbaudāmo vielu ievadīt tieši. Pierādījumu tam, ka testējamā ķīmiskā viela joprojām iedarbojas, var sniegt, piemēram, farmakokinētiskā informācija, pēcnācēja toksicitāte vai biomarķieru izmaiņas (28).

NOVĒROJUMI

Mātīšu novērošana

22.   Visas mātītes vismaz reizi dienā ir rūpīgi jānovēro attiecībā uz to veselības stāvokli, tostarp saslimstību un mirstību.

23.   Vielas ievadīšanas un novērošanas periodā periodiski jāveic detalizētāki klīniskie novērojumi (vismaz divas reizes attiecībā uz devu ievadīšanu grūsnības laikā un divas reizes attiecībā uz devu ievadīšanu laktācijas periodā), katrā devas līmenī izmantojot vismaz desmit mātītes. Dzīvnieki ir jānovēro ārpus turēšanas būra, un tas jādara par vielas ievadīšanu neinformētiem apmācītiem tehniskajiem darbiniekiem, dzīvnieku stresa un novērotāja neobjektivitātes mazināšanai un atsevišķo novērotāju iegūto rezultātu ticamības paaugstināšanai izmantojot standartprocedūras. Ja iespējams, ieteicams, ka attiecīgā pētījuma ietvaros novērojumus veic viens un tas pats tehniskais darbinieks.

24.   Novērotās pazīmes ir jāreģistrē. Kad vien tas īstenojams, ir jāreģistrē arī novēroto pazīmju izpausmes stiprums. Klīniskajos novērojumos jāiekļauj (bet ne tikai) pārmaiņas ādā, apmatojumā, acīs, gļotādās, sekrēcijas un veģetatīvā aktivitāte (piemēram, asarošana, piloerekcija, acs zīlītes diametrs, neraksturīga elpošana un/vai elpošana caur muti un neparastas urinācijas vai defekācijas pazīmes).

25.   Jāatzīmē arī neparastas atbildes reakcijas, kas izpaužas ķermeņa stāvoklī, aktivitātes līmenī (piemēram, samazināta vai pastiprināta standartiežogojuma pētīšana) un kustību koordinācijā. Jāreģistrē pārmaiņas gaitā (piemēram, gāzelēšanās, ataksija), stājā (piemēram, sakumpusi mugura) un atbildes reakcijās uz manipulācijām, novietošanu vai citiem vides stimuliem, kā arī klonisko vai tonisko kustību esamība, krampji, drebēšana, stereotipiska (piemēram, pārmērīga apmatojuma laizīšana, neparastas galvas kustības, atkārtota riņķošana) vai savāda izturēšanās (piemēram, košana vai pārmērīga laizīšana, pašsakropļošanās, staigāšana atpakaļvirzienā, skaņu izdošana) vai agresivitāte.

26.   Toksicitātes pazīmes ir jāreģistrē, norādot arī to sākšanās dienu, laiku, smagumu un ilgumu.

27.   Dzīvnieki ir jānosver vielas ievadīšanas reizē vismaz reizi nedēļā visu pētījuma laiku, dzemdību dienā vai neilgi pirms tās, kā arī 21. pēcdzemdību dienā (atšķiršanas brīdī). Pētījumos ar mākslīgo barošanu mātītes ir jāsver vismaz divas reizes nedēļā. Deva ir attiecīgi jāpielāgo, katru reizi nosakot ķermeņa svaru. Grūsnības un laktācijas periodā barības patēriņu mēra vismaz reizi nedēļā. Ja testējamo ķīmisko vielu ievada ar dzeramo ūdeni, vismaz reizi nedēļā ir jāmēra ūdens patēriņš.

Pēcnācēju novērošana

28.   Visi pēcnācēji vismaz reizi dienā ir rūpīgi jānovēro un jāreģistrē toksicitātes, saslimstības un mirstības pazīmes.

29.   Vielas ievadīšanas un novērošanas laikā jāizdara detalizētāki pēcnācēju klīniskie novērojumi. Pēcnācēji (vismaz viens mazulis no katra dzimuma metienā) ir jānovēro par vielas ievadīšanu neinformētiem apmācītiem tehniskajiem darbiniekiem, dzīvnieku stresa un novērotāja neobjektivitātes mazināšanai un atsevišķo novērotāju iegūto rezultātu ticamības paaugstināšanai izmantojot standartprocedūras. Ja iespējams, ieteicams, ka novērojumus veic viens un tas pats tehniskais darbinieks. Ir jāuzrauga vismaz 24. un 25. punktā minētie beigupunkti, ņemot vērā attīstības stadiju, kas tiek novērota.

30.   Visas pēcnācēja toksicitātes pazīmes ir jāreģistrē, norādot arī to sākšanās dienu, laiku, smagumu un ilgumu.

Fiziskie parametri un attīstības parametri

31.   Pārmaiņas attīstības parametros (piemēram, auss gliemežnīcas atvēršanās, acu atvēršanās, priekšzobu parādīšanās) pirms atšķiršanas no mātes cieši korelē ar ķermeņa svaru (30)(31). Ķermeņa svars var būt vislabākais fiziskās attīstības rādītājs. Tāpēc attīstības parametrus ieteicams mērīt tikai tad, ja jau ir pierādījumi, ka no šiem beigupunktiem varēs gūt papildu informāciju. Minēto parametru novērtēšanas laiks ir norādīts 1. tabulā. Atkarībā no gaidāmās ietekmes un sākotnējo mērījumu rezultātiem var būt ieteicams noteikt papildu laikus vai veikt mērījumus citās attīstības stadijās.

32.   Novērtējot fizisko attīstību, ieteicams ņemt vērā pēcdzimumakta vecumu, nevis postnatālo vecumu (33). Ja mazuļus pārbauda dienā, kad tos atšķir no mātes, pārbaudi ieteicams veikt pirms faktiskās atšķiršanas, lai izvairītos no nelabvēlīgās ietekmes, ko rada stress sakarā ar mazuļa atšķiršanu no mātes. Turklāt pārbaudes pēc atšķiršanas no mātes mazulim nedrīkst veikt divās pirmajās pēcatšķiršanas dienās.

1. tabula

Fiziskās un attīstības atšķirību novērtējuma grafiks un funkcionālie/uzvedības beigupunkti  (2)

Vecuma periodi Beigupunkti	Pirms atšķiršanas (3)	Pusaugu dzīvnieki (3)	Jauni pieaugušie (3)
Fiziskie parametri un attīstības parametri
Ķermeņa svars un klīniskie novērojumi	reizi nedēļā (4)	vismaz reizi divās nedēļās	vismaz reizi divās nedēļās
Smadzeņu svars	22. dienā pēc piedzimšanas (5)		beigās
Neiropatoloģija	22. dienā pēc piedzimšanas (5)		beigās
Dzimumbriedums	—	pēc vajadzības	—
Citi attīstības parametri (6)	pēc vajadzības	—	—
Funkcionālie/uzvedības beigupunkti
Uzvedības ontoģenēze	vismaz divi mērījumi
Motoriskā aktivitāte (tostarp pieraduma veidošanās)	1–3 reizes (7)	—	vienu reizi
Motoriskās un sensoriskās funkcijas	—	vienu reizi	vienu reizi
Mācīšanās un atmiņa	—	vienu reizi	vienu reizi

33.   Dzīvie mazuļi ir jāsaskaita un jāsadala pēc dzimuma, piemēram, veicot vizuālu pārbaudi vai izmērot anogenitālo atstatumu (34)(35), un katrs metiena mazulis ir atsevišķi jānosver iespējami drīz pēc dzimšanas, laktācijas periodā – vismaz reizi nedēļā un vismaz reizi divās nedēļās pēc laktācijas perioda. Vērtējot dzimumbriedumu, no katra metiena vismaz vienam tēviņam un vienai mātītei ir jānosaka dzīvnieka vecums un ķermeņa svars tad, kad notiek maksts atvēršanās (36) vai preputiālā atdalīšanās (37).

Uzvedības ontoģenēze

34.   Izraudzītu uzvedības modeļu ontoģenēze attiecīgā vecumā jāmēra vismaz vienam mazulim no katra dzimuma metienā, un visās testēšanas dienās visu uzvedības modeļu novērtēšanā izmanto vienus un tos pašus mazuļus. Lai noteiktu normālu attiecīgā uzvedības modeļa ontoģenēzi vai ar vielas ievadīšanu saistītas ontoģenēzes izmaiņas, mērījumu dienas attiecīgajā periodā ir jāsadala vienmērīgi (38). Turpmāk tekstā ir minēti daži uzvedības modeļi, kuru ontoģenēze varētu būt jānovērtē: iztaisnošanas reflekss, negatīvā ģeotakse un motoriskā aktivitāte (38)(39)(40).

Motoriskā aktivitāte

35.   Motoriskā aktivitāte ir jāmonitorē (41)(42)(43)(44)(45), pirms mazulis tiek atšķirts no mātes un pieauguša dzīvnieka dzīves posmā. Kā veikt pārbaudi, kad mazulis ir atšķirts no mātes, sk. 32. punktā. Testēšanas seansam ir jābūt pietiekami ilgam, lai vielu nesaņēmušiem kontroldzīvniekiem tā laikā izveidotos pieradums. Motorisko aktivitāti ļoti ieteicams izmantot, lai novērtētu uzvedības ontoģenēzi. Visās uzvedības ontoģenēzes testēšanas sesijās pirms mazuļa atšķiršanas no mātes ir jāizmanto vieni un tie paši dzīvnieki. Testēšana ir jāveic pietiekami bieži, lai ontoģenēzes aspektā varētu novērtētu pieraduma veidošanos sesijas laikā (44). Šajā nolūkā var būt jāizmanto trīs vai vairāk periodi pirms atšķiršanas no mātes un atšķiršanas dienā (piemēram, 13., 17. un 21. dienā pēc piedzimšanas). Tie paši vai tā paša metiena dzīvnieki arī ir jātestē pieauguša dzīvnieka dzīves posmā tuvu pētījuma beigām (piemēram, 60.–70. diena pēc piedzimšanas). Pēc nepieciešamības testēšanu veic papildu dienās. Motoriskā aktivitāte jāmonitorē ar automātisku aktivitātes reģistrēšanas iekārtu, kurai jāspēj konstatēt gan aktivitātes pieaugumu, gan samazināšanos (t. i., saskaņā ar ierīces mērījumiem pamataktivitātes līmenis nedrīkst būt tik zems, lai nevarētu noteikt aktivitātes samazināšanos, vai tik augsts, lai nevarētu noteikt aktivitātes paaugstināšanos). Katra ierīce ir jātestē, izmantojot standartprocedūras, lai iespēju robežās nodrošinātu, ka visā darbības laikā ierīču kopums darbojas uzticami. Iespēju robežās vielas ievadīšanas grupas attiecībā uz ierīcēm jāsadala vienmērīgi. Katrs dzīvnieks ir jāpārbauda atsevišķi. Vielas ievadīšanas grupās jānodrošina arī testēšanas laiku līdzsvars, lai nelabvēlīgu ietekmi neradītu aktivitātes diennakts ritmi. Ir jācenšas nodrošināt, lai izmaiņas testa apstākļos būtu minimālas un nebūtu sistemātiski saistītas ar vielas ievadīšanu. Starp mainīgajiem lielumiem, kas var ietekmēt daudzus uzvedības mērījumus, tostarp motorisko aktivitāti, ir trokšņa līmenis, testēšanas būra izmērs un forma, temperatūra, relatīvais mitrums, apgaismojums, aromāts, dzīvnieka turēšanas būra vai jauna testēšanas būra izmantošana un apkārtējās vides ietekme.

Motoriskās un sensoriskās funkcijas

36.   Motoriskās un sensoriskās funkcijas ir detalizēti jāpārbauda vismaz vienu reizi pusaudzībā un vienu reizi jauna pieaugušā dzīvnieka dzīves posmā (piemēram, 60.–70. dienā pēc piedzimšanas). Kā veikt pārbaudi, kad mazulis ir atšķirts no mātes, sk. 32. punktā. Ir jāveic pietiekamas pārbaudes, lai nodrošinātu pietiekami daudz sensorisko modalitāšu (piemēram, somatosensorika, vestibulārs) un motorisko funkciju (piemēram, spēks, koordinācija) paraugu. Daži motorisko un sensorisko funkciju testu piemēri ir atliecējmuskuļa reflekss (46), iztaisnošanās reflekss (47)(48), pierašana pie dzirdes kairinātājiem (40)(49)(50)(51)(52)(53)(54) un impulsa testi (55).

Mācīšanās un atmiņas testi

37.   Asociatīvās mācīšanās un atmiņas tests ir jāveic pēc dzīvnieka atšķiršanas no mātes (piemēram, 25. dienā (± 2 dienas)) un jauniem pieaugušiem dzīvniekiem (60. dienā pēc piedzimšanas vai vēlāk). Kā veikt pārbaudi, kad mazulis ir atšķirts no mātes, sk. 32. punktā. Minētajos divos attīstības posmos var izmantot vienu(-s) un to(-s) pašu(-us) vai atsevišķu(-us) testu(-us). Iespējamas nelielas atkāpes, izvēloties mācīšanās un atmiņas testu(-us) žurkām, kas atšķirtas no mātes, un pieaugušām žurkām. Tomēr testiem ir jābūt izstrādātiem tā, lai tie atbilstu diviem kritērijiem. Pirmkārt, mācīšanās ir jānovērtē kā izmaiņas, kas vairākos atkārtotas mācīšanās mēģinājumos vai sesijās vērojamas savstarpējā salīdzinājumā, vai – attiecībā uz testiem ar vienu mēģinājumu – salīdzinājumā ar etalonstāvokli, kas kontrolē mācīšanās pieredzes neasociatīvo ietekmi. Otrkārt, papildus standarta mācīšanai (iemaņu apgūšana) testā(-os) ir jāiekļauj daži atmiņas (īstermiņa vai ilgtermiņa) novērtēšanas pasākumi, bet šādu atmiņas novērtēšanu pārskatā var iekļaut tikai tad, ja tajā pašā testā ir iegūts mērījums attiecībā uz iemaņu apgūšanu. Ja mācīšanās un atmiņas testa(-u) rezultāti liecina par testējamās ķīmiskās vielas ietekmi, jāapsver, vai neveikt papildu testus, lai izslēgtu citu interpretāciju, kuras pamatā ir sensoriskas izmaiņas, motivācijas un/vai kustībspējas izmaiņas. Papildus minētajiem diviem kritērijiem, ja informācijas avotos attiecīga informācija ir pieejama, mācīšanās un atmiņas testu ieteicams izraudzīties, ņemot vērā pierādītu jutību pret ķīmiskajām vielām, kas pieder pie testējamās vielas klases. Ja minētā informācija nav pieejama, lai nodrošinātu atbilstību minētajiem kritērijiem, var sagatavot, piemēram, šādus testus: pasīvā izvairīšanās (43)(56)(57), kavēta pielāgošanās stāvoklim pieaugušām žurkām (58) un žurku mazuļiem (59), ožas kondicionēšana (43)(60), Morris ūdens labirints (61)(62)(63), Bīla vai Cincinati labirints (64)(65), radiāllabirints (66), T veida labirints (43) un ar grafiku kontrolētas uzvedības apguve un saglabāšana (26)(67)(68). Citi testi ir aprakstīti literatūras avotos par žurkām, kas atšķirtas no mātes (26)(27), un pieaugušām žurkām (19)(20).

Autopsija

38.   Mātesdzīvniekus pēc pēcnācēja atšķiršanas var humāni nonāvēt.

39.   Pēcnācējus neiropatoloģiski izvērtē, izmantojot to dzīvnieku audus, kas humāni nonāvēti 22. dienā pēc piedzimšanas vai agrāk, laikā no 11. dienas līdz 22. dienai pēc piedzimšanas, kā arī pētījuma beigās. Attiecībā uz pēcnācējiem, ko nonāvē 22. dienā pēc piedzimšanas, jānovērtē smadzeņu audi, bet attiecībā uz dzīvniekiem, kurus nonāvē pētījuma beigās – centrālās nervu sistēmas (CNS) audi un perifērās nervu sistēmas (PNS) audi. Dzīvniekiem, kas nonāvēti 22. dienā pēc piedzimšanas vai agrāk, fiksāciju var veikt, vai nu iegremdējot šķīdumā vai veicot perfūziju. Dzīvniekiem, kas nonāvēti pētījuma beigās, jāveic fiksācija ar perfūziju. Audu paraugu sagatavošana visos aspektos, sākot ar dzīvnieku perfūziju un beidzot ar audu paraugu secēšanu, audu apstrādi un priekšmetstikliņu krāsošanu, ir jāplāno līdzsvaroti, lai katrā partijā būtu reprezentatīvi paraugi no katras devu grupas. Papildu norādījumi par neiropatoloģiju ir pieejami ESAO Norādījumu dokumentā Nr. 20 (9), sk. arī (103).

Audu paraugu apstrāde

40.   Ir jāreģistrē visas autopsijā konstatētās būtiskās anomālijas. Paņemtajiem audu paraugiem ir jābūt no visiem galvenajiem nervu sistēmas reģioniem. Audu paraugi ir jāsaglabā piemērotā fiksācijas šķīdumā un jāapstrādā saskaņā ar standartizētiem publicētiem histoloģijas protokoliem (69)(70)(71)(103). Iegremdēšana parafīnā ir pieļaujama CNS un PNS audiem, bet, ja ir vajadzīga labāka izšķirtspēja, papildus iegremdēšanai epoksīdsveķos pēc fiksācijas var būt lietderīgi izmantot osmiju (piemēram, perifērajiem nerviem, ja ir aizdomas par perifēro neiropātiju, un/vai veicot perifēro nervu morfometrisko analīzi). Morfometriskās analīzes nolūkā iegūtie smadzeņu audi jāiegremdē piemērotā līdzeklī visiem devu līmeņiem vienlaicīgi, lai nerastos sarukuma artefakti, kas var būt saistīts ar pārāk ilgu uzglabāšanu fiksācijas šķīdumā (6).

Neiropatoloģiskā izmeklēšana

41.   Kvantitatīvās izmeklēšanas mērķi ir šādi:

i)	noteikt nervu sistēmas rajonus, kur novērotas neiropatoloģiskas izmaiņas;

ii)	noteikt, kāda veida neiropatoloģiskās izmaiņas izriet no testējamās ķīmiskās vielas iedarbības; un

iii)	noteikt neiropatoloģisko izmaiņu smaguma pakāpi.

Reprezentatīvas histoloģiskas audu paraugu daļas attiecīgi apmācītam patologam ir mikroskopiski jāizmeklē attiecībā uz neiropatoloģisku izmaiņu liecībām. Visas neiropatoloģiskās izmaiņas ir subjektīvi jāiedala pēc smaguma pakāpes. Lai novērtētu smadzeņu daļas dzīvniekiem, kas humāni nonāvēti 22. dienā pēc piedzimšanas vai agrāk, var pietikt ar hematoksilīna un eozīna krāsvielu. Tomēr CNS un PNS audu daļām, kas iegūtas no dzīvniekiem, kuri ir nonāvēti pētījuma beigās, ieteicams izmantot mielīnu (piemēram, luxol fast zilais/cresyl violetais) un sudraba krāsvielu (piemēram, Bielschowsky vai Bodians krāsvielu). Ievērojot profesionāla patologa spriedumu un ņemot vērā novērotās izmaiņas, var uzskatīt, ka noteikta veida izmaiņu noteikšanai un raksturošanai ir lietderīgi izmantot citas krāsvielas, (piemēram, nervu audu šķiedru skābes proteīnu (GFAP) vai lecitīna histoķīmiju, lai novērtētu nervu audu un mikroskopisko nervu audu izmaiņas (72), fluoronefrītu, lai atklātu nekrozi (73)(74), vai sudraba krāsvielu, kas speciāli paredzēta nervu deģenerācijas konstatēšanai (75)).

42.   Ir jāizdara morfometrisks (kvantitatīvs) izvērtējums, jo šādi dati var palīdzēt noteikt ar vielas ievadīšanu saistītu ietekmi, un tiem ir būtiska nozīme, interpretējot ar vielas ievadīšanu saistītas smadzeņu svara vai morfoloģijas atšķirības (76)(77). Nervu audu paraugi ir jāņem un jāsagatavo tā, lai varētu veikt morfometrisku izvērtējumu. Morfometriskais izvērtējums var aptvert, piemēram, noteiktu smadzeņu daļu lineāru vai reģionālu mērījumu (78). Lai varētu veikt lineāru vai reģionālu mērījumu, ir jāizmanto homologas daļas, kas rūpīgi izraudzītas pēc drošām mikroskopiskām atšķirībām (6). Lai noteiktu ar vielas ievadīšanu saistītu ietekmi uz tādiem parametriem kā daudzums vai šūnu skaits noteiktos neiroanatomiskos reģionos, var izmantot stereoloģiju (79)(80)(81)(82)(83)(84).

43.   Smadzenēs jāmeklē jebkādas liecības par neiropatoloģiskām izmaiņām, kas saistītas ar vielas ievadīšanu, un no visām galvenajām smadzeņu daļām (piemēram, ožas sīpols, smadzeņu pusložu garoza, hipokamps, bazālie gangliji, talāms, hipotalāms, vidussmadzenes (jumts, tegmentum un smadzeņu kājiņas), tilts, garenās smadzenes, smadzenītes) ir jāpaņem pietiekami paraugi, lai būtu iespējams veikt rūpīgu pārbaudi. Ir svarīgi visiem dzīvniekiem smadzeņu daļas ņemt vienā līmenī. Pieaugušiem dzīvniekiem, kas humāni nonāvēti pētījuma beigās, ir jāņem paraugi no attiecīgajām muguras smadzeņu un PNS daļām. Izmeklējamo vietu skaitā jāiekļauj acs ar acs nervu un tīkleni, muguras smadzenes pie kakla un muguras paresninājumiem, dorsālo un ventrālo saknīšu šķiedras, proksimālais sēžas nervs, proksimālais tibiālais nervs (pie ceļa) un tibiālā nerva apakšstilba muskuļa zari. Muguras smadzeņu un perifēro nervu griezumiem nepieciešams gan šķērsgriezums, gan garengriezums.

44.   Neiropatoloģiskajā izvērtējumā jāiekļauj arī nervu sistēmas attīstības traucējumu pazīmju pārbaude (6)(85)(86)(87)(88)(89), kā arī šūnu izmaiņas (piemēram, neironu vakuolizācija, deģenerācija, nekroze) un audu izmaiņas (piemēram, glioze, leikocītu infiltrācija, cistu veidošanās). Šajā sakarā ar vielas ievadīšanu saistītu ietekmi ir svarīgi nošķirt no normālas attīstības gadījumiem, kādi iespējami tajā attīstības stadijā, kādā dzīvnieks bijis nonāvēšanas brīdī (90). Būtisku izmaiņu piemēri, kas liecina par attīstības traucējumiem, ir (ne tikai) šādi:

—	ožas sīpolu, smadzeņu vai smadzenīšu kopējā izmēra vai veida izmaiņas,

—	dažādu smadzeņu daļu relatīvā izmēra izmaiņas, tostarp smadzeņu daļu izmēra palielināšanās vai samazināšanās, kas saistīta ar parasti pārejošu šūnu vai aksonu projekciju populāciju (piemēram, smadzenīšu ārējais ģeneratīvais slānis, lielais smadzeņu saiklis) zaudēšanu vai noturīgumu,

—	savairošanās, migrācijas un diferenciācijas izmaiņas, uz ko norāda reģioni, kur konstatēta pārmērīga apoptoze vai nekroze, ektopisku, dezorientētu vai izkropļotu neironu klasteri vai izkliedētas populācijas vai smadzeņu garozas struktūru dažādu līmeņu relatīvā izmēra izmaiņas,

—	mielinizācijas modeļu izmaiņas, tostarp kopējā izmēra samazināšanās vai mieliniēto struktūru iekrāsošanas izmaiņas,

—	hidrocefālijas pazīmes, jo īpaši ventrikulu palielināšanās, smadzeņu kanāla stenoze un smadzeņu garozas biezuma samazināšanās.

Devas un atbildes reakcijas sakarības analīze attiecībā uz neiropatoloģiskajām pārmaiņām

45.   Kvalitatīvu un kvantitatīvu neiropatoloģisku izmeklēšanu ieteicams izdarīt saskaņā ar turpmāk tekstā aprakstīto pakāpenisko procedūru. Vispirms griezumus no augstākās devas grupas salīdzina ar kontroles grupas griezumiem. Ja augstākās devas grupas dzīvniekiem neiropatoloģiskas izmaiņas netiek konstatētas, turpmāki izmeklējumi nav jāveic. Ja augstākās devas grupas dzīvniekiem konstatē neiropatoloģiskas izmaiņas, ir jāizmeklē vidēji lielās un mazās devas grupas dzīvnieki. Ja nāves vai citādu nevēlamu toksicitātes izpausmju dēļ augstākās devas grupa tiek likvidēta, izmeklējumi neiropatoloģisku izmaiņu noteikšanai ir jāveic augstākās un vidēji lielās devas grupās. Ja neirotoksicitātes pazīmes dzīvniekiem ir konstatētas mazāko devu grupās, neiropatoloģiskie izmeklējumi ir jāveic attiecīgajām grupām. Ja kvalitatīvas vai kvantitatīvas izmeklēšanas rezultātā tiek konstatētas kādas ar vielas ievadīšanu saistītas neiropatoloģiskas izmaiņas, izvērtējot visus dzīvniekus no visām devu grupām, ir jānosaka, kāda ir šo izmaiņu sastopamības un audu bojājumu vai morfometrisko izmaiņu biežuma un smaguma atkarība no devas. Šai izvērtēšanai jāaptver visas smadzeņu daļas, kurās konstatētas jebkādas neiropatoloģiskas izmaiņas. Attiecībā uz katru bojājuma veidu ir jāapraksta smaguma pakāpes noteikšanai izmantotās īpašības, arī īpatnības, kas izmantotas katras pakāpes diferencēšanai. Katra bojājuma veida biežums un smaguma pakāpe ir jādokumentē, un ir jāveic statistiskā analīze, lai novērtētu sakarību starp devu un atbildes reakciju. Ieteicams izmantot kodētus priekšmetstikliņus (91).

DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

Dati

46.   Par datiem veido atsevišķu pārskatu un tos apkopo tabulā, par katru testa grupu norādot izmaiņu veidu un to mātīšu, katra dzimuma pēcnācēju un metienu skaitu, kam attiecīgā izmaiņa konstatēta. Ja pēcnācēji pēc piedzimšanas tiek eksponēti tieši, ir jāreģistrē ekspozīcijas ceļš, ilgums un periods.

Rezultātu izvērtēšana un interpretācija

47.   Ontoģenēzes neirotoksicitātes pētījums sniedz informāciju par to, kāda ietekme ir atkārtotai eksponētībai ķīmiskajai vielai in utero un postnatālās attīstības sākumā. Tā kā tiek uzsvērti gan vispārīgās toksicitātes, gan ontoģenēzes neirotoksicitātes beigupunkti, pētījuma rezultāti dod iespēju tādu ietekmi uz neiroloģisko attīstību, kura sastopama bez vispārīgas maternālas toksicitātes, atšķirt no tādas ietekmes uz attīstību, kura izpaužas tikai pie līmeņiem, kas ir toksiski arī mātesdzīvniekam. Tā kā starp pētījuma plānu, statistisko analīzi un datu bioloģisko nozīmīgumu pastāv sarežģīta mijiedarbība, pienācīgai ontoģenēzes neirotoksicitātes datu interpretācijai ir nepieciešams ekspertu viedoklis (107)(109). Interpretējot testa rezultātus, ir jāizmanto zinātnisko datu nozīmīguma pieeja (20)(92)(93)(94). Ir jāizvērtē arī (sastopamie) uzvedības un morfoloģisko konstatējumu modeļi, kā arī liecības par sakarību starp devu un atbildes reakciju. Šajā raksturojumā ir jāiekļauj visu ontoģenēzes neirotoksicitātes novērtēšanā būtisko pētījumu dati, arī dati, kas iegūti epidemioloģiskos pētījumos vai atsevišķos gadījumos ar cilvēkiem un eksperimentālos pētījumos ar dzīvniekiem (piemēram, toksikokinētiskie dati, dati par struktūru un aktivitāti un dati no citiem toksicitātes pētījumiem). Tas attiecas arī uz sakarību starp testējamās ķīmiskās vielas devām un neirotoksisko iedarbību uz katru dzimumu vai tās neesamību, sastopamību un pakāpi (20)(95).

48.   Izvērtējot datus, ir jākomentē to bioloģiskais un statistiskais nozīmīgums. Statistiskā analīze ir jāuzskata par rīku, kas vada, nevis nosaka rezultātu interpretāciju. Statistiskā nozīmīguma trūkums nedrīkst būt vienīgais pamatojums tam, lai secinātu, ka ar vielas ievadīšanu saistītas ietekmes nav, un statistiskais nozīmīgums nedrīkst būt vienīgais pamatojums secinājumam, ka pastāv ar vielas ievadīšanu saistīta ietekme. Lai izvairītos no iespējamiem maldīgi negatīviem konstatējumiem un no tipiskajām negatīva rezultāta pierādīšanas grūtībām, ir jāaplūko pieejamie pozitīvās un vēsturiskās kontroles dati, jo īpaši tad, ja ar vielas ievadīšanu saistītas ietekmes nav (102) (106). Maldīgi pozitīvu rezultātu varbūtība ir jāizskata, ņemot vērā datu kopējo statistisko novērtējumu (96). Izvērtējumā jānorāda sakarība starp konstatētajām neiropatoloģiskajām un uzvedības izmaiņām, ja tāda pastāv.

49.   Visi rezultāti ir jāanalizē, izmantojot statistiskus modeļus, kas atbilst eksperimenta plānam (108). Parametriskās vai neparametriskās analīzes izvēle ir jāpamato, ņemot vērā tādus faktorus kā datu veids (transformētie vai netransformētie) un to sadalījums, kā arī izraudzītās statistiskās analīzes metodes relatīvais noturīgums. Statistiskās analīzes metode jāizvēlas, ņemot vērā pētījuma nolūku un plānu, lai mazinātu I tipa (maldīgi pozitīvs) un II tipa (maldīgi negatīvs) kļūdas (96)(97)(104)(105). Attīstības pētījumos, kuros izmanto tādas šķirnes, kurām vienā metienā ir vairāki pēcnācēji un tie tiek testēti, metiens ir jāiekļauj statistikas modelī, lai ierobežotu I tipa kļūdu skaita pieaugumu (98)(99)(100)(101). Statistiskajai mērvienībai ir jābūt metienam, nevis mazulim. Eksperimenti ir jāveido tā, lai viena metiena atsevišķie dzīvnieki nebūtu atsevišķu novērojumu objekti. Visi beigupunkti, kurus atkārtoti mēra vienam un tam pašam subjektam, ir jāanalizē ar tādiem statistiskiem modeļiem, kuros būtu ņemts vērā, ka minētie mērījumi nav neatkarīgi.

Testēšanas pārskats

50.   Testēšanas pārskatā jāietver vismaz turpmāk minētā informācija.

Testējamā ķīmiskā viela:

—	fizikālās īpašības un attiecīgā gadījumā fizikālķīmiskās īpašības,

—	identifikācijas dati, tostarp avots,

—	preparāta tīrība un zināmie un/vai paredzamie piemaisījumi.

Nesējviela (attiecīgā gadījumā):

—	nesējvielas izvēles pamatojums, ja nesējviela nav ūdens vai fizioloģiskais šķīdums.

Testa dzīvnieki:

—	izmantotā suga un līnija un pamatojums, ja testējamā suga nav žurka,

—	testa dzīvnieku piegādātājs,

—	dzīvnieku skaits, vecums pētījuma sākumā un dzimums,

—	izcelsme, turēšanas apstākļi, barība, ūdens u. c.,

—	katra dzīvnieka svars testa sākumā.

Testēšanas apstākļi:

—	devu izvēles pamatojums,

—	devas ievadīšanas ceļa un laika pamatojums,

—	ievadīto devu specifikācija, iekļaujot sīkus datus par ievadītā materiāla nesējvielu, tilpumu un fizikālo formu,

—	sīka informācija par testējamās ķīmiskās vielas maisījuma/barības preparāta sagatavošanu, sasniegto preparāta koncentrāciju, stabilitāti un homogenitāti,

—	mātīšu un pēcnācēju unikālai identifikācijai izmantotā metode,

—	sīks apraksts par kārtību, kā veic nejaušināto izlasi, lai sadalītu mātītes vielas ievadīšanas grupās, izlasītu liekos mazuļus likvidēšanai un tos iedalītu testa grupās,

—	sīka informācija par testējamās ķīmiskās vielas ievadīšanu,

—	testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas (milj. daļas) barībā/dzeramajā ūdenī vai ieelpotajā gaisā pārrēķins faktiskajā devā (mg uz kg no ķermeņa svara dienā)(attiecīgā gadījumā),

—	telpas apstākļi,

—	sīka informācija par barības un ūdens kvalitāti (piemēram, ūdensvada ūdens vai destilēts ūdens),

—	pētījuma sākuma un beigu datums.

Novērojumu un testa procedūras:

—	sīks apraksts par procedūrām, ko izmanto, lai standartizētu novērojumus un procedūras, kā arī vērtēšanas novērojumos izmantotās darba definīcijas,

—	visu izmantoto testa procedūru saraksts un to izmantošanas pamatojums,

—	sīki uzvedības/funkcionālo, patoloģisko, neiroķīmisko vai elektrofizioloģisko procedūru dati, arī informācija un sīkas ziņas par automātiskajām ierīcēm,

—	testēšanas procedūrās izmantotās kalibrēšanas, ierīču ekvivalences nodrošināšanas un vielas ievadīšanas grupu līdzsvarošanas procedūras,

—	īss pamatojums visiem lēmumiem, kas saistīti ar profesionālu spriedumu.

Rezultāti (atsevišķi un kopējie, attiecīgā gadījumā arī vidējā vērtība un dispersija):

—	dzīvnieku skaits pētījuma sākumā un beigās,

—	to dzīvnieku un metienu skaits, ko izmanto katrai testēšanas metodei,

—	katra dzīvnieka identifikācijas numurs un metiens, pie kura pieder attiecīgais dzīvnieks,

—	metiena lielums un vidējais svars dzimšanas brīdī, pēc dzimuma,

—	ķermeņa svars un ķermeņa svara izmaiņu dati, tostarp mātīšu un pēcnācēju ķermeņa svars pēc nonāvēšanas,

—	barības patēriņa dati un attiecīgā gadījumā ūdens patēriņa dati (piemēram, ja testējamo ķīmisko vielu ievada ar ūdeni),

—	dati par toksisko atbildes reakciju pa dzimumiem un devu līmeņiem, arī toksicitātes pazīmes vai mirstība, tostarp attiecīgā gadījumā nāves iestāšanās brīdis un cēlonis,

—	detalizētos klīniskos novērojumos konstatētas ietekmes veids, smagums un ilgums, sākšanās diena, laiks un tālākā attīstība,

—	visu attīstības parametru (svars, dzimumbriedums un uzvedības ontoģenēze) rādītāji katrā novērošanas reizē,

—	sīks apraksts par visiem uzvedības, funkcionāliem, neiropatoloģiskiem, neiroķīmiskiem un elektrofizioloģiskiem konstatējumiem pa dzimumiem, arī palielinājums un samazinājums salīdzinājumā ar kontroldzīvniekiem,

—	autopsijas atrades,

—	smadzeņu svars,

—	diagnozes, kas secinātas no neiroloģiskām pazīmēm un bojājumiem, arī dabiski sastopamas slimības vai stāvokļi,

—	atražu paraugu attēli,

—	mazjaudas attēli, ar kuriem var novērtēt morfometrijai izmantoto daļu homoloģiju,

—	dati par uzsūkšanos un metabolismu, arī papildu dati no atsevišķa toksikokinētikas pētījuma, ja tādi ir,

—	rezultātu statistiskā apstrāde, arī datu analīzē izmantotie statistiskie modeļi, un rezultāti neatkarīgi no to būtiskuma,

—	pētījumā iesaistīto personu saraksts, arī profesionālā sagatavotība.

Rezultātu izvērtējums:

—	informācija par atbildes reakciju uz devu pa dzimumiem un grupām,

—	jebkādas citas toksiskas ietekmes sakarība ar secinājumu par testējamās ķīmiskās vielas neirotoksisko potenciālu pa dzimumiem un grupām,

—	jebkādas ar toksikokinētiku saistītas informācijas ietekme uz secinājumiem,

—	līdzība ar zināmu neirotoksisku vielu ietekmi,

—	dati, kas apliecina testēšanas metodes ticamību un jutību (t. i., pozitīvās kontroles dati un vēsturiskie kontroldati),

—	vai pastāv korelācija starp neiropatoloģisko un funkcionālo ietekmi,

—	NOAEL vai etalondeva mātītēm un pēcnācējiem pa dzimumiem un grupām.

Secinājumi:

—	datu vispārējās interpretācijas izvērtēšana, balstoties uz rezultātiem, arī secinājums par to, vai testējamā ķīmiskā viela izraisījusi ontoģenēzes neirotoksicitāti un kāds bijis NOAEL.

LITERATŪRA

(1)

OECD (1995). Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on Reproduction and Developmental Toxicity. Copenhagen, Denmark, 13-14 June 1995.

(2)

US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Available: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].

(3)

US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Available: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].

(4)

Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79-91.

(5)

Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111.

(6)

Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109:93-100.

(7)

OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23-25 October 2000.

(8)

OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Paris. July 2008 Available: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].

(9)

OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, September 2003. Available: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html].

(10)

Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.

(11)

Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000) Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.

(12)

Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188-197.

(13)

Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998) Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1 st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.

(14)

Šā pielikuma B.34. nodaļa “Toksicitātes ietekme uz vienas paaudzes reproduktīvo funkciju”.

(15)

Šā pielikuma B.35. nodaļa “Divu paaudžu reproduktīvās toksicitātes pētījums”.

(16)

Šā pielikuma B.43. nodaļa “Žurku neirotoksicitātes pētījums”.

(17)

Šā pielikuma B.31. nodaļa “Prenatālās ontoģenēzes toksicitātes pētījums”.

(18)

Eiropas Parlamenta un Padomes 2010. gada 22. septembra Direktīva 2010/63/ES par zinātniskiem mērķiem izmantojamo dzīvnieku aizsardzību. OV L 276, 20.10.2010., 33. lpp.

(19)

WHO (1986) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals, (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Available: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].

(20)

WHO (2001) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Geneva. Available: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].

(21)

Chang, L.W., Slikker, W. (1995) Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1 st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.

(22)

De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19:499-509.

(23)

Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2-6.

(24)

Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27:110-112.

(25)

Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118-136.

(26)

Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979) Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

(27)

Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987) Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.

(28)

Zoetis, T., Walls, I. (2003) Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.

(29)

Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87-94.

(30)

Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4.

(31)

ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use.

(32)

Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433-439.

(33)

Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449-457.

(34)

Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383-390.

(35)

Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350-365.

(36)

Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579-586.

(37)

Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298-303.

(38)

Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489-95.

(39)

Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896-920.

(40)

Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, 67. – 100. lpp.

(41)

Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53-66.

(42)

Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, New York, 37. – 82. lpp.

(43)

Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117-129.

(44)

Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247-260.

(45)

Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599-609.

(46)

Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405-411.

(47)

Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Physiol. Behav., 64:661-669.

(48)

Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589-591.

(49)

Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In: Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, 287. – 351. lpp.

(50)

Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107-128.

(51)

Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. In Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, 181. – 211. lpp.

(52)

Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8:199-211.

(53)

Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25-30.

(54)

Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437–445.

(55)

Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. In: Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. 125. – 145. lpp.

(56)

Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321-332.

(57)

Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247-296.

(58)

Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237-244.

(59)

Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98-105.

(60)

Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465-479.

(61)

Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47-60.

(62)

Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29-69.

(63)

D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60-90.

(64)

Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235-241.

(65)

Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387-399.

(66)

Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327-332.

(67)

Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342-352.

(68)

Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338–341.

(69)

Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 122-131.

(70)

Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994) Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington, DC, 84. – 107. lpp.

(71)

Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002) Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, London.

(72)

Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291-304.

(73)

Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123-130.

(74)

Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53:365-372.

(75)

De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545-561.

(76)

De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745-755.

(77)

De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417-432.

(78)

Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129–135.

(79)

Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.

(80)

Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305-310.

(81)

Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262-268.

(82)

Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26:707-710.

(83)

West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51-61.

(84)

Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130: 813–831.

(85)

Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113-121.

(86)

Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294-298.

(87)

Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. In: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, 3. – 41. lpp.

(88)

Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283:70-74.

(89)

Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056–1060.

(90)

Friede, R. L. (1989) Developmental Neuropathology. Second edition. Springer-Verlag, Berlin.

(91)

House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127-133.

(92)

Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401-405.

(93)

US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644A.

(94)

US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274-56322.

(95)

Danish Environmental Protection Agency (1995) Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.

(96)

Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5:113-126.

(97)

Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21-27.

(98)

Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329-335.

(99)

Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12:165-172.

(100)

Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221-228.

(101)

Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587-90.

(102)

Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345-352.

(103)

Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A “best practices” approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing – for today. Toxicol. Pathol. 34:296-313.

(104)

Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205-210.

(105)

Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295-301.

(106)

Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266-287.

(107)

Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288-325.

(108)

Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326-348.

(109)

Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349-381.

1. attēls

Vispārīga testēšanas shēma, ko izmanto funkcionālajiem/uzvedības testiem, neiropatoloģiskajai izvērtēšanai un smadzeņu svara noteikšanai. Šī diagramma ir saskaņā ar 13.–15. punkta aprakstu (PND = diena pēc piedzimšanas). 1. papildinājumā ir minēti dzīvnieku iedalījuma piemēri.

B.54.   UTEROTROPAIS BIOTESTS AR GRAUZĒJIEM: ESTROGĒNO ĪPAŠĪBU ĪSĀ SKRĪNINGA TESTS

IEVADS

1.   Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (TG) 440 (2007. gads). ESAO 1998. gadā sāka augsti prioritāru darbību, lai par iespējami endokrīnās sistēmas darbības traucējumus izraisošu vielu skrīningu un pārbaudēm pārskatītu esošos norādījumus un izveidotu jaunus (1). Viens no apakšpasākumiem bija izveidot testēšanas norādījumus “Uterotropajam biotestam ar grauzējiem”. “Uterotropajam biotestam ar grauzējiem” veica vērienīgu validācijas programmu, arī sagatavoja detalizētu pamatinformāciju (2)(3) un īstenoja vērienīgus laboratoriju un starplaboratoriju pētījumus, lai pierādītu biotesta piemērotību un reproducējamību ar spēcīgu estrogēnu standartvielu, vājiem estrogēna receptoru agonistiem, spēcīgu estrogēna receptoru antagonistu un negatīvu ķīmisko standartvielu (4)(5)(6)(7)(8)(9). Šī testēšanas metode B.54 ir radīta, izmantojot testēšanas programmā gūto pieredzi un šīs programmas rezultātus, kas gūti ar estrogēnu agonistiem.

2.   Uterotropais biotests ir īss skrīninga tests, kas tika izstrādāts 20. gs. 30. gados (27)(28) un ko ekspertu komiteja pirmo reizi standartizēja skrīningam 1962. gadā (32)(35). Tās pamatā ir dzemdes svara pieaugums vai uterotropa atbildes reakcija (recenziju sk. 29. punktā). Ar to novērtē ķīmiskās vielas spēju izraisīt dabiskā estrogēna agonistiem vai antagonistiem (piemēram, 17 ß estradiols) pielīdzināmu bioloģisko aktivitāti, tomēr antagonistu noteikšanai to izmanto daudz retāk nekā agonistu noteikšanai. Dzemde uz estrogēnu reaģē divos veidos. Sākotnējā reakcija ir tās svara pieaugums, kas saistīts ar ūdens uzsūkšanos. Pēc tam svara pieaugums ir saistīts ar audu augšanu (30). Žurku un peļu dzemdes reakcijas ir kvalitatīvi salīdzināmas.

3.   Biotestu izmanto kā in vivo skrīninga testu, un tas būtu jāskata kopā ar “ESAO konceptuālo pamatdokumentu: endokrīnās sistēmas darbības traucējumus izraisošu vielu testēšana un novērtēšana” (2. papildinājums). Minētajā konceptuālajā regulējumā uterotropais biotests ir iekļauts 3. līmenī kā in vivo tests, kas sniedz informāciju par vienu atsevišķu endokrīnās sistēmas mehānismu, t. i., estrogenitāti.

4.   Uterotropo biotestu ir paredzēts iekļaut in vitro un in vivo testu sērijā, kuros identificē ķīmiskās vielas, kas var ietekmēt endokrīnās sistēmas darbību, un ar kuru palīdzību var novērtēt riskus cilvēku veselībai un videi. Lai novērtētu testa veiktspēju estrogēnisku ķīmisko vielu identificēšanā, ESAO validācijas programmā tika izmantoti gan stipri, gan vāji estrogēnu agonisti (4)(5)(6)(7)(8). Šādi tika labi pierādīta testa procedūras jutība attiecībā uz estrogēnu agonistiem, kā arī laboratorijas un starplaboratoriju pētījumu reproducējamība.

5.   Attiecībā uz negatīvām ķīmiskām vielām validācijas programmā iekļāva tikai vienu “negatīvu” ķīmisko standartvielu, kura uterotropā biotestā, kā arī in vitro receptoru saistīšanās testā un receptoru testā jau atzīta par negatīvu, bet ir izvērtēti ar ESAO validācijas programmu nesaistīti papildu testa dati, ar kuriem papildus pamatots uterotropā biotesta specifiskums estrogēnu agonistu skrīningā (16).

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI

6.   Estrogēnu agonisti un antagonisti darbojas kā estrogēna α un β receptoru ligandi, un tie var attiecīgi aktivizēt vai nomākt receptoru transkripciju. Tas var radīt veselības apdraudējumus, tostarp negatīvi ietekmēt reprodukciju un attīstību. Tāpēc ir nepieciešams ķīmiskas vielas ātri novērtēt un izvērtēt kā iespējamus estrogēna agonistus vai antagonistus. Kāda liganda afinitātei ar kādu estrogēna receptoru vai tam, ka in vitro aktivizējas ziņotājgēnu transkripcija, ir informatīva nozīme, tomēr tas ir tikai viens no faktoriem, kas nosaka iespējamu bīstamību. Bīstamību var noteikt arī, piemēram, metaboliska aktivēšanās un dezaktivēšanās, vielai iekļūstot ķermenī, tās izplatīšanās mērķaudos un izdalīšanās no organisma, – tas vismaz daļēji atkarīgs no ievadīšanas ceļa un testējamās ķīmiskās vielas. Tas nozīmē, ka testējamās ķīmiskās vielas iespējamā darbība piemērotos apstākļos ir jāpārbauda in vivo, izņemot gadījumus, kad ķīmiskās vielas īpašības attiecībā uz uzsūkšanos – izplatīšanos – metabolismu – izdalīšanos attiecīgu informāciju jau nodrošina. Dzemdes audi ātri un spēcīgi aug, ja tos stimulē ar estrogēnu, jo īpaši laboratoriju grauzējiem, kuru estrālais cikls ir apmēram 4 dienas. Grauzēju sugas, jo īpaši žurkas, bieži izmanto arī toksicitātes pētījumos bīstamības raksturošanai. Tāpēc grauzēju dzemde ir atbilstošs mērķorgāns estrogēna agonistu un antagonistu in vivo skrīningam.

7.   Šīs testēšanas metodes pamatā ir ESAO validācijas pētījumā izmantotie protokoli, par kuriem laboratoriju un starplaboratoriju pētījumos apstiprināts, ka tie ir uzticami un atkārtojami (5)(7). Pašlaik ir pieejamas divas metodes, proti, metode, kurā izmanto pieaugušas mātītes, kam ir izoperētas olnīcas, un metode, kurā izmanto nenobriedušus dzīvniekus, kam olnīcas nav izoperētas. ESAO validācijas testa programma apliecināja, ka abu minēto metožu jutība un reproducējamība ir salīdzināma. Metode ar nenobriedušiem dzīvniekiem gan ir nespecifiskāka sakarā ar to, ka šādiem dzīvniekiem nedarbojas hipotalāma, hipofīzes un gonādu ass, bet salīdzinājumā ar metodi, kurā izmanto pieaugušas mātītes, kurām ir izoperētas olnīcas, tai ir lielāks pētījuma tvērums, jo ar šo metodi var konstatēt ķīmiskas vielas, kas iedarbojas uz hipotalāma, hipofīzes un gonādu asi, nevis tikai uz estrogēna receptoru. Žurkas hipotalāma, hipofīzes un gonādu ass darbojas apmēram no 15 dienu vecuma. Pirms tam pubertāti, piemēram, ar GnRH, paātrināt nevar. Mātītēm, kas gandrīz sasniegušas pubertātes vecumu, pirms maksts atvēršanās ir vairāki klusie periodi, kuru rezultātā nenotiek maksts atvēršanās vai ovulācija, bet notiek hormonu svārstības. Ja ķīmiskā viela tieši vai netieši stimulē hipotalāma, hipofīzes un gonādu asi, tas var izraisīt agrīnu pubertātes iestāšanos, agrīnu ovulāciju un paātrinātu maksts atvēršanos. Augšanu stimulē un maksts atvēršanos paātrina ne vien ķīmiskas vielas, kas iedarbojas uz hipotalāma, hipofīzes un gonādu asi, bet arī tāda barība, kas gan nav estrogēniska, taču ir ar augstāku metabolizējamas enerģijas līmeni. Minētās ķīmiskās vielas neizraisīs uterotropo atbildes reakciju mātītēm, kurām ir izoperētas olnīcas, jo šo dzīvnieku hipotalāma, hipofīzes un gonādu ass nedarbojas.

8.   Dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ priekšroka jādod metodei, kurā izmanto nenobriedušas žurkas, lai dzīvniekiem pirms tam netiktu veiktas operācijas un lai mazinātu dzīvnieku neizmantojamību, piemēram, attiecībā uz dzīvniekiem, kam ir estrālā cikla sākšanās pazīmes (sk. 30. punktu).

9.   Uterotropās atbildes reakcijas cilme nav tikai estrogēniska, proti, reakciju var izraisīt arī ķīmiskās vielas, kas nav estrogēnu agonisti vai antagonisti. Piemēram, relatīvi liela progesterona, testosterona vai dažādu sintētisko progestīnu deva arī var radīt stimulētu atbildes reakciju (30). Ja konstatēta atbildes reakcija, var veikt histoloģiskus izmeklējumus attiecībā uz maksts keratinizāciju un pārragošanos (30). Neatkarīgi no atbildes reakcijas iespējamā cēloņa, uterotropajā biotestā gūstot pozitīvu rezultātu, parasti jārīkojas, lai iegūtu precīzāku informāciju. Papildu liecības par estrogenitāti var iegūt in vitro testēšanā, piemēram, estrogēna receptora saistīšanās testos un transkripcijas aktivizēšanās testos, vai citos in vivo testos, piemēram, mātīšu pubertātes testā.

10.   Tā kā uterotropo biotestu izmanto par in vivo skrīninga testu, izraudzītajā validācijas pieejā ir gan ņemti vērā dzīvnieku labturības apsvērumi, gan izmantota diferencētas testēšanas stratēģiju. Šajā sakarā centieni bija vērsti uz to, lai stingri apstiprinātu reproducējamību un jutību attiecībā uz estrogenitāti – kas ir galvenā problēma daudzu ķīmisko vielu gadījumā, –, bet maz tika darīts attiecībā uz testa daļu, kas skar antiestrogenitāti. Tā kā vielu ar izteikti antiestrogēniskām īpašībām (ko neaizēno kaut kāda estrogēniska darbība) ir ļoti maz, testēšanā tika izmantots tikai viena izteikti antiestrogēniska viela. Tāpēc šajā testēšanas metodē ir aplūkots estrogenitātes protokols, bet protokols, kurā ir aprakstīts antagonista tests, ir iekļauts Norādījumu dokumentā (37). Izteikti antiestrogēniskas darbības ķīmiskajām vielām paredzētā testa reproducējamību un jutību skaidrāk definēs vēlāk, kad testa procedūra jau kādu laiku būs izmantota un kad būs identificēts vairāk ķīmisko vielu ar šādu iedarbības veidu.

11.   Ir atzīts, ka visām procedūrām, kas saistītas ar dzīvniekiem, ir jāatbilst vietējiem dzīvnieku labturības standartiem; turpmāk tekstā minētie labturības un apiešanās nosacījumi ir minimālie standarti, un lielāks spēks ir vietējam regulējumam, piemēram, Eiropas Parlamenta un Padomes 2010. gada 22. septembra Direktīvai 2010/63/ES par zinātniskiem mērķiem izmantojamo dzīvnieku aizsardzību (38). ESAO ir izdevusi arī citus noteikumus par humānu izturēšanos pret dzīvniekiem (25).

12.   Tāpat kā visos testos, kur izmanto dzīvus dzīvniekus, ir ļoti svarīgi pirms testa sākuma pārliecināties, ka attiecīgie dati ir tiešām vajadzīgi. Piemēram, divi gadījumi, kur minētie dati var būt vajadzīgi, ir šādi:

—	augsta ekspozīcijas iespējamība (konceptuālā regulējuma 1. līmenis, 2. papildinājums) vai estrogenitātes pazīmes (2. līmenis), – lai noskaidrotu, vai šāda ietekme ir iespējama in vivo,

—	ietekme, kas liecina par estrogenitāti 4. vai 5. līmeņa in vivo testos, – lai pamatotu, ka attiecīgā ietekme ir saistīta ar estrogenitātes mehānismu, ko nevar noskaidrot in vitro testā.

13.   Šajā testēšanas metodē minētās definīcijas ir minētas 1. papildinājumā.

TESTA PRINCIPS

14.   Uterotropā biotesta jutība tiek nodrošināta dzīvnieku testēšanas sistēmā, kurā nedarbojas hipotalāma, hipofīzes un gonādu ass, un attiecīgi ir zems endogēnais cirkulējošā estrogēna līmenis. Tādā gadījumā ir zems dzemdes svara izejlielums un reakcija uz estrogēna ievadīšanu notiek maksimālā diapazonā. Grauzēju mātītēm minētajām prasībām atbilst divi estrogēnjutīgi stāvokļi:

i)	nenobriedušas mātītes pēc atšķiršanas un pirms pubertātes, un

ii)	jaunas pieaugušās mātītes, kurām izoperētas olnīcas un nodrošināts pietiekams laiks, lai varētu samazināties dzemdes audu apjoms.

15.   Testējamo ķīmisko vielu ievada katru dienu ar mākslīgo barošanu vai zemādas injekciju. Testējamo ķīmisko vielu pakāpeniskās devās saņem ne mazāk kā divas eksperimenta dzīvnieku grupas (norādījumus sk. 33. punktā), katrai grupai izmantojot vienu devas līmeni un ievadot vielu trīs dienas pēc kārtas, ja izvēlēta metode, kurā izmanto nenobriedušus dzīvniekus, un ievadot vielu vismaz trīs dienas pēc kārtas, ja izvēlēta metode, kurā izmanto pieaugušas mātītes, kam izoperētas olnīcas. Dzīvniekiem izdara autopsiju apmēram 24 stundas pēc pēdējās devas ievadīšanas. Estrogēna agonistu gadījumā novērtē vidējo dzemdes svaru grupās, kurās dzīvnieki saņem testējamo ķīmisko vielu, salīdzinājumā ar nesējvielas grupu, lai konstatētu, vai vērojams statistiski nozīmīgs pieaugums. Testa grupas dzīvnieku vidējā dzemdes svara statistiski nozīmīgs pieaugums liecina par pozitīvu atbildes reakciju šajā biotestā.

METODES APRAKSTS

Dzīvnieku sugas izraudzīšanās

16.   Var izmantot parastās laboratorijas grauzēju līnijas. Piemēram, validācijas procesā tika izmantotas Sprague un Dawley un Wistar līnijas žurkas. Neizmanto līnijas, par kurām ir zināms vai par kurām ir aizdomas, ka to dzemde mazāk reaģē uz testējamo ķīmisko vielu. Laboratorijai ir jāpierāda izmantotās līnijas jutība, kā norādīts 26. un 27. punktā.

17.   Žurkas un peles uterotropajā biotestā izmanto kopš 20. gs 30. gadiem. ESAO validācijas pētījumi tika veikti tikai ar žurkām, pieņemot, ka ir sagaidāms, ka abas sugas būs līdzvērtīgas, un tāpēc metodes validācijai pasaulē jāpietiek ar vienu sugu, lai taupītu resursus un aizsargātu dzīvniekus. Parasti reproduktīvās un ontoģenēzes toksicitātes pētījumos izmanto žurkas. Tā kā par pelēm ir ievērojama vēsturisko datu bāze, lai uterotropā biotesta metodes tvērumu attiecībā uz grauzējiem paplašinātu un par testa sugu izmantotu arī peles, ar tām ierobežotā apjomā tika veikts validācijas pēcpētījums (16). Saskaņā ar sākotnējo nolūku taupīt resursus un aizsargāt dzīvniekus ir izraudzīta pieeja, kura balstās uz vielu salīdzināmību, kurā testējamās ķīmiskās vielas un iesaistītās laboratorijas izmanto ierobežotā skaitā un arī nepārbauda kodētus paraugus. Šis validācijas pētījums, kurā izmanto vielu salīdzināmības pieeju, attiecībā uz uterotropo biotestu ar jaunām pieaugušām pelēm, kurām ir izoperētas olnīcas, apliecina, ka iegūtie kvalitatīvie un kvantitatīvie dati par žurkām un pelēm ir līdzīgi. Ja uterotropā biotesta rezultātus izmanto kā ilgtermiņa pētījuma priekšpētījumu, abos pētījumos var izmantot vienas līnijas un izcelsmes dzīvniekus. Vielu salīdzināmības pieeja tika izmantota tikai ar pelēm, kurām ir izoperētas olnīcas, un ziņojums nenodrošina tādu uzticamu datu kopumu, ar kuriem būtu iespējams validēt metodi, kurā izmanto nenobriedušus dzīvniekus, un tāpēc metode, kur izmanto nenobriedušas peles, nav šīs testēšanas metodes tvērumā.

18.   Tātad dažos gadījumos žurku vietā var izmantot peles. Ir jāpamato attiecīgās sugas izmantošana, ņemot vērā toksikoloģiskos, farmakokinētiskos un/vai citus kritērijus. Izmantojot peles, var būt jāmaina protokols. Piemēram, peles proporcionāli ķermeņa svaram patērē vairāk barības nekā žurkas, un tāpēc peļu barībā fitoestrogēnu saturam ir jābūt mazākam nekā žurku barībā (9)(20)(22).

Turēšanas un barošanas apstākļi

19.   Visām procedūrām ir jāatbilst vietējiem laboratorijas dzīvnieku labturības standartiem. Minētie labturības un apiešanās nosacījumi ir minimālie standarti, un lielāks spēks ir vietējiem noteikumiem, piemēram, Eiropas Parlamenta un Padomes 2010. gada 22. septembra Direktīvai 2010/63/ES par zinātniskiem mērķiem izmantojamo dzīvnieku aizsardzību (38). Eksperimenta dzīvnieku telpas temperatūrai jābūt 22 °C (ar nobīdi ± 3 °C). Gaisa relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un, ieteicams, ne vairāk kā 70 %, izņemot uzkopšanas laiku. Vēlamais gaisa relatīvais mitrums ir 50–60 %. Telpās ir jābūt mākslīgajam apgaismojumam. Dzīvniekus 12 stundas diennaktī tur apgaismojumā, bet 12 stundas tumsā.

20.   Laboratorijas dzīvnieku barību un dzeramo ūdeni dzīvnieki saņem ad libitum. Jaunus pieaugušos dzīvniekus var turēt atsevišķi vai būros grupās līdz trīs dzīvniekiem katrā būrī. Tā kā nenobriedušie dzīvnieki ir jauni, ieteicams tos turēt, veidojot sociālās grupas.

21.   Ir zināms, ka augsts fitoestrogēnu līmenis laboratorijas dzīvnieku barībā veicina dzemdes svara pieaugumu tādā apmērā, kas ir pietiekams, lai interferētu ar uterotropo biotestu (13)(14)(15). Augsts fitoestrogēnu un metabolizējamās enerģijas līmenis laboratorijas dzīvnieku barībā var izraisīt arī agrīnu pubertātes iestāšanos nenobriedušiem dzīvniekiem. Fitoestrogēnu klātbūtni galvenokārt veicina sojas un sējas lucernas izstrādājumu iekļaušana laboratorijas dzīvnieku barībā, un fitoestrogēna koncentrācija dažādās laboratorijas dzīvnieku barības partijās ir atšķirīga (23). Ķermeņa svars ir svarīgs mainīgais, jo patērētās barības daudzums ir saistīts ar ķermeņa svaru. Tāpēc ar vienu un to pašu barību faktiskais patērētais fitoestrogēna daudzums dažādām sugām un dažādiem vecumiem var atšķirties (9). Nenobriedušas žurku mātītes attiecībā pret ķermeņa svaru var patērēt apmēram divreiz vairāk barības nekā jaunas pieaugušas žurku mātītes, kurām ir izoperētas olnīcas. Jaunas pieaugušas peles attiecībā pret ķermeņa svaru var patērēt apmēram četras reizes vairāk barības nekā jaunas pieaugušas žurku mātītes, kurām ir izoperētas olnīcas.

22.   Tomēr uterotropā biotesta rezultāti (9)(17)(18)(19) liecina, ka ierobežotā daudzumā fitoestrogēni barībā ir pieņemami, un tas nemazina biotesta jutību. Var vadīties no tā, ka nenobriedušām Sprague un Dawley un Wistar sugas žurku mātītēm fitoestrogēnu līmenis barībā nedrīkst pārsniegt 350 μg genisteīna aizstājēju uz gramu laboratorijas dzīvnieku barības (6)(9). Šāda barība būtu piemērota, arī testējot jaunas pieaugušas žurkas, kam ir izoperētas olnīcas, jo jaunas pieaugušas žurkas attiecībā pret ķermeņa svaru patērē mazāk barības nekā nenobriedušas žurkas. Ja izmanto pieaugušas peles, kurām ir izoperētas olnīcas, vai žurkas, kuras ir jutīgākas pret fitoestrogēnu, fitoestrogēna daudzums barībā ir attiecīgi jāsamazina (20). Turklāt atšķirīgs metaboliskās enerģijas līmenis barībā var izraisīt pubertātes sākuma laika nobīdi (21)(22).

23.   Pirms pētījuma sākšanas ir rūpīgi jāizvēlas barība, lai fitoestrogēna (norādījumus sk. (6)(9)) vai metabolizējamās enerģijas līmenis nebūtu pārāk augsts, jo tas var nelabvēlīgi ietekmēt pētījuma rezultātus (15)(17)(19)(22)(36). Abu minēto faktoru pārbaudei ir svarīga nozīme laboratorijas izmantotās testa sistēmas pareizas darbības nodrošināšanā, kā norādīts 26. un 27. punktā. Drošības apsvērumu dēļ, ievērojot labas laboratorijas prakses noteikumus, ir jāsagatavo katras pētījuma laikā izmantotās barības partijas reprezentatīvi paraugi, lai būtu iespējams noteikt fitoestrogēnu līmeni (piemēram, gadījumā, ja salīdzinājumā ar vēsturiskiem kontroldatiem ir vērojams liels dzemdes kontrolsvars, vai ja izpaužas nepietiekama atbildes reakcija uz estrogēna standartvielu, 17 α etinilestradiolu). Alikvotas ir jāanalizē pētījumā vai jāsasaldē –20 °C temperatūrā vai tā, lai paraugs nesāktu sadalīties pirms analīzes.

24.   Daži guļvietas materiāli var saturēt dabiskas estrogēniskas vai antiestrogēniskas ķīmiskās vielas (piemēram, kukurūzas vālīte ietekmē ciklu žurkām un uzskatāms, ka tai piemīt antiestrogēniskas īpašības). Ir jāizvēlas guļvietas materiāls, kas satur iespējami maz fitoestrogēnu.

Dzīvnieku sagatavošana

25.   Eksperimenta dzīvniekus, kuriem neizpaužas slimības vai fiziskās kroplības, nejaušināti sadala kontroles un vielas ievadīšanas grupās. Būrus izvieto tā, lai iespējami samazinātu būru novietojuma varbūtējo iedarbību. Katram dzīvniekam ir jāpiešķir atsevišķa identifikācija. Aklimatizācijas periodā līdz atšķiršanai ieteicams nenobriedušus dzīvniekus turēt būros kopā ar māti vai to māti, kuras aprūpē ir nodoti dzīvnieku mazuļi. Jauniem pieaugušiem dzīvniekiem un nenobriedušiem dzīvniekiem, kurus piegādā ar māti vai māti, kuras aprūpē ir nodots mazulis, aklimatizācijas periodam pirms pētījuma sākuma ir jābūt apmēram 5 dienām. Ja nenobriedušus dzīvniekus saņem jau atšķirtus no mātes, nepieciešamais aklimatizācijas periods var būt īsāks, jo testējamās ķīmiskās vielas ievadīšana ir jāsāk uzreiz pēc atšķiršanas (sk. 29. punktu).

PROCEDŪRA

Laboratorijas kvalifikācijas verificēšana

26.   Laboratorijas kvalifikāciju var pārbaudīt ar divām pieejām:

—

periodiskās verifikācijās, kurās izmanto sākotnēju pozitīvās kontroles izejdatu pētījumu (sk. 27. punktu). Vismaz ik pēc 6 mēnešiem un katru reizi, kad notiek izmaiņas, kas var ietekmēt testa rezultātus (piemēram, jauns barības preparāts, izmaiņas to darbinieku sastāvā, kas veic sekcijas, tiek izmantoti citas līnijas dzīvnieki vai cits piegādātājs utt.), testa sistēmas (dzīvnieku modeļa) reaģētspēju pārbauda, izmantojot attiecīgu devu estrogēna standartvielas (pamatojoties uz pozitīvās kontroles izejdatu pētījumu, kas aprakstīts 27. punktā), resp., 17α-etinilestradiola (CAS Nr. 57-63-6) (EE),

—	vienlaicīgās kontrolēs, katrā testēšanā iekļaujot grupu, kurai ievada attiecīgu estrogēna standartvielas devu.

Ja sistēma reaģē nepareizi, ir jāpārbauda un attiecīgi jāmaina eksperimenta apstākļi. Ieteicamā estrogēna standartvielas deva, ko izmanto abās pieejās, ir apmēram ED 70–80.

27.   Pozitīvās kontroles izejdatu pētījums – pirms laboratorija pirmo reizi veic pētījumu, izmantojot šo testēšanas metodi, laboratorijas kvalifikācija ir jāpārbauda dzīvnieku modeļa reaģētspējas testēšanā, nosakot atbildes reakciju uz estrogēna standartvielas devu – ne mazāk kā četrām devām 17α-etinilestradiola (CAS Nr. 57-63-6) (EE). Ietekmi uz dzemdes svaru salīdzina ar vēsturiskiem datiem (sk. literatūras sarakstu (5)). Ja pozitīvās kontroles izejdatu pētījumā negūst vēlamos rezultātus, ir jāpārbauda un jāmaina eksperimenta apstākļi.

Dzīvnieku skaits un stāvoklis

28.   Katrā devu saņemšanas un kontroles grupā jābūt vismaz 6 dzīvniekiem (gan metodei, kurā izmanto nenobriedušus dzīvniekus, gan metodei, kurā izmanto pieaugušus dzīvniekus, kam ir izoperētas olnīcas).

Nenobriedušu dzīvnieku vecums

29.   Uterotropā biotestā izmantojot nenobriedušus dzīvniekus, ir jānorāda dzīvnieku dzimšanas datums. Devu ievadīšana ir jāsāk pietiekami agri, nodrošinot, lai pēc testējamās ķīmiskās vielas ievadīšanas vēl nebūtu konstatējams ar pubertāti saistīts endogēnā estrogēna fizioloģiskais pieaugums. No otras puses, ir liecības, ka ļoti jauni dzīvnieki var būt mazāk jutīgi. Lai noteiktu vislabāko vecumu, katrai laboratorijai būtu jāņem vērā savi pamatdati par nobriešanu.

Parasti žurkām devu var sākt ievadīt uzreiz pēc agrīnas atšķiršanas 18. dienā pēc piedzimšanas (piedzimšanas diena ir 0. diena pēc piedzimšanas). Ieteicams beigt žurkām ievadīt devu 21. dienā pēc piedzimšanas, bet noteikti pirms 25. dienas pēc piedzimšanas, jo šajā vecumā sāk darboties hipotalāma, hipofīzes un gonādu ass un var sākt paaugstināties endogēnais estrogēna līmenis, un tas izraisa dzemdes svara vidējā izejlieluma un grupas standartnovirzes pieaugumu (2)(3)(10)(11)(12).

Olnīcu izoperēšanas procedūra

30.   Žurku un peļu mātītēm, kurām izoperē olnīcas (kontroles grupas un vielas saņemšanas grupas), to dara 6–8 nedēļu vecumā. Minimālais laiks no olnīcu izoperēšanas brīža līdz pirmajai devas ievadīšanas dienai žurkām ir 14 dienas, lai dzemdes audi varētu samazināties līdz minimālam stabilam izejlielumam. Pelēm minimālais laiks no olnīcu izoperēšanas brīža līdz pirmajai devas ievadīšanas dienai ir 7 dienas. Pietiek ar nelielu daudzumu olnīcas audu, lai radītu ievērojamu estrogēnu cirkulācijas līmeni (3), tāpēc pirms izmantošanas dzīvnieki ir jāpārbauda, vismaz piecas dienas pēc kārtas (piemēram, žurkām 10.–14. dienā pēc olnīcu izoperēšanas) pārbaudot maksts uztriepē iegūtas epitēlija šūnas. Ja konstatē estrālā cikla sākšanās pazīmes, dzīvniekus izmantot nedrīkst. Turklāt izgriezto olnīcu vietas ir jāpārbauda autopsijā, lai pārliecinātos, ka nav palikušas olnīcas audu daļas. Ja olnīcas audu daļas ir palikušas, attiecīgo dzīvnieku aprēķinos neizmanto (3).

31.   Olnīcu izoperēšanas procedūras sākumā dzīvnieku, kuram ir ievadīta vajadzīgā anestēzijas deva, nogulda uz vēdera. Iegriezumam, ar kuru atver dorsāli laterālo vēdera sienu, jābūt apmēram 1 cm garam un jāatrodas vidū starp paribi un gūžas kaulu, un dažus milimetrus uz sāniem no jostas muskuļa sānu malas. Olnīcu izņem no vēdera dobuma un novieto sterilā vietā. Olnīcu izgriež olvada un dzemdes savienojuma vietā. Pārliecinās, ka nav lielas asiņošanas, aizšuj vēdera dobumu un ādu savelk ar skavām vai piemērotu ķirurģisko diegu. Savienojuma vietas shematiski ir attēlotas 1. attēlā. Ir jāizmanto atbilstošs pēcoperācijas pretsāpju līdzeklis, ko iesaka grauzēju aprūpes jomā specializējies veterinārārsts.

Ķermeņa svars

32.   Metodē, kurā izmanto pieaugušus dzīvniekus, kam izoperētas olnīcas, ķermeņa svars nekorelē ar dzemdes svaru, jo pēdējo ietekmē hormoni, piemēram, estrogēni, nevis augšanas faktori, kas regulē ķermeņa apmērus. Lietojot metodi, kurā izmanto nenobriedušus dzīvniekus, gluži pretēji, nobriešanas laikā ķermeņa svars ir saistīts ar dzemdes svaru (34). Tāpēc, lietojot metodi, kurā izmanto nenobriedušus dzīvniekus, pētījuma sākumā dzīvnieku svara atšķirībām jābūt minimālām un tās nedrīkstētu pārsniegt ± 20 % no vidējā svara. Tas nozīmē, ka audzētājam ir jāstandartizē metiena lielums, lai nodrošinātu, ka pēcnācēji, kas piedzimuši dažādām mātītēm, saņem apmēram vienādu barību. Dzīvnieki ir jāiedala grupās (kontroles un vielas ievadīšanas grupā) tos nejaušināti sadalot pēc svara, lai katras grupas vidējais ķermeņa svars statistiski neatšķirtos no otras grupas. Jāraugās, lai viena metiena dzīvniekus neiedalītu vienā un tajā pašā vielas ievadīšanas grupā, ja tas ir praktiski iespējams, nepalielinot izmantošanai pētījumā paredzēto metienu skaitu.

Dozējums

33.   Lai noteiktu, vai testējamajai ķīmiskajai vielai var būt estrogēniska iedarbība in vivo, parasti pietiek ar divām vielas ievadīšanas grupām un kontroles grupu, un tāpēc dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ vēlams izmantot šādu modeli. Ja mērķis ir iegūt devas un atbildes reakcijas sakarības līkni vai datus ekstrapolēt uz mazākām devām, ir vajadzīgas vismaz 3 devu grupas. Ja ir vajadzīga ne tikai informācija par estrogēniskas darbības klātbūtni, bet arī papildu informācija (piemēram, par stiprumu), jāapsver, vai neizmantot citu devu došanas režīmu. Ar kontroles dzīvniekiem jārīkojas tāpat kā ar testa grupu dzīvniekiem, tie tikai nesaņem testējamo ķīmisko vielu. Ja testējamo ķīmisko vielu ievada kopā ar nesējvielu, kontroles grupas dzīvnieki saņem tādu pašu nesējvielas daudzumu, ko izmanto vielas ievadīšanas grupai (vai, ja grupu rādītāji atšķiras, testa grupu dzīvniekiem izmantoto maksimālo tilpumu).

34.   Uterotropā biotesta gadījumā mērķis ir izraudzīties tādas devas, lai dzīvnieki izdzīvotu un lai, dzīvniekiem tās ievadot trīs dienas pēc kārtas ar maksimālo devu 1 000 mg uz kg dienā, tiem nerastos vērā ņemama toksicitāte vai diskomforts. Devu līmeņi jāierosina un jāizraugās, ņemot vērā par testējamo ķīmisko vielu vai par radniecīgiem materiāliem pieejamos toksicitātes un (toksiko-)kinētikas datus. Izvēloties augstāku devas līmeni, pirmām kārtām jāņem vērā LD 50 un/vai informācija par akūto toksicitāti, lai neizraisītu dzīvnieku nāvi, smagas ciešanas vai diskomfortu (24)(25)(26). Augstākajai devai ir jābūt maksimālajai panesamajai devai; ir pieņemams arī pētījums par devas līmeni, kurā izraisīta pozitīva uterotropa atbildes reakcija. Skrīninga gadījumā parasti izmanto lielus devu intervālus (piemēram, puslogaritmiskas vienības, kas atbilst devas progresijai 3,2, vai līdz pat viens log vienības). Ja piemēroti dati nav pieejami, lai noteiktu izmantojamās devas, var veikt diapazona noteikšanas pētījumu.

35.   Ja agonista estrogēnisko stiprumu var noteikt, izmantojot in vitro (vai in silico) datus, arī tos var ņemt vērā, izraugoties devu. Piemēram, testējamās ķīmiskās vielas tilpumu, kas radīs agonista standartvielai (etinilestradiolam) līdzvērtīgu uterotropu atbildes reakciju, nosaka pēc tā in vitro noteiktā relatīvā stipruma attiecībā pret etinilestradiolu. Augstāko testa devu iegūst, minēto līdzvērtīgo devu attiecīgi reizinot, piemēram, ar 10 vai 100.

Apsvērumi par diapazona noteikšanu

36.   Vajadzības gadījumā ar nedaudziem dzīvniekiem var veikt diapazona noteikšanas priekšpētījumu. Šajā sakarā var izmantot ESAO Norādījumu dokumentu Nr. 19 (25), kur noteiktas klīniskās pazīmes, kas liecina par dzīvnieku toksicitāti vai diskomfortu. Ja minētajā diapazona noteikšanas pētījumā pēc tam, kad deva ir ievadīta trīs dienas, tas iespējams, apmēram 24 stundas pēc pēdējās devas ievadīšanas dzīvniekiem var izgriezt un nosvērt dzemdi. Iegūtos datus pēc tam var izmantot galvenā pētījuma plānam (izvēlēties pieņemamu maksimālo un minimālo devu un noteikt ieteicamo devu grupu skaitu).

Devu ievadīšana

37.   Testējamo ķīmisko vielu ievada, izmantojot mākslīgo barošanu vai zemādas injekciju. Izvēloties devas ievadīšanas ceļu, ir jāņem vērā dzīvnieku labturības apsvērumi un tādi toksikoloģiskie aspekti kā iespējamā cilvēka ekspozīcija (piemēram, ar mākslīgo barošanu modelē testējamās vielas nonākšanu barības vadā, ar zemādas injekciju modelē testējamās vielas ieelpošanu vai adsorbciju no ādas), testējamā materiāla fizikālķīmiskās īpašības un jo īpaši esošā toksikoloģiskā informācija un dati par metabolismu un kinētiku (piemēram, konkrēts ceļš dod iespēju izvairīties no priekšlaicīga metabolisma, nodrošina labāku efektivitāti).

38.   Ja vien iespējams, ieteicams lietošanai izraudzīties šķīdumu/suspensiju uz ūdens bāzes. Bet tā kā lielākā daļa estrogēna ligandu vai to metabolisko priekšteču ir hidrofobi, parasti izmanto eļļas (piemēram, kukurūzas, zemesriekstu vai sezama eļļas vai olīveļļas) šķīdumu/suspensiju. Tomēr minēto eļļu kaloriju un tauku saturs ir atšķirīgs, un tāpēc nesējviela var ietekmēt kopējo uzņemtās metabolizējamās enerģijas daudzumu, kas var mainīt mērīšanas beigupunktu, piemēram, dzemdes svaru, jo īpaši, lietojot metodi, kurā izmanto nenobriedušus dzīvniekus (33). Tāpēc pirms pētījuma visas nesējvielas, ko paredzēts izmantot, ir jāpārbauda, izmantojot kontroles bez nesējvielām. Testējamo ķīmisko vielu var izšķīdināt minimālā daudzumā 95 % etanola šķīduma vai cita atbilstoša šķīdinātāja un līdz galīgajai darba koncentrācijai atšķaidīt testa nesējvielā. Ir jāzina šķīdinātāja toksiskās īpašības, un tām jābūt testētām atsevišķā kontroles grupā, kurai izmanto tikai šķīdinātāju. Ja testējamā ķīmiskā viela ir stabila, tās šķīdināšanā var izmantot vieglu sildīšanu un spēcīgu mehānisku iedarbību. Ir jānosaka testējamās ķīmiskās vielas stabilitāte nesējvielā. Ja visu pētījuma laiku testējamā ķīmiskā viela ir stabila, var sagatavot vienu ķīmiskās vielas sākuma alikvotu un katru dienu sagatavot devas atšķaidījumus pēc specifikācijām.

39.   Devas ievadīšanas laiks ir atkarīgs no izmantotā modeļa (informāciju par nenobriedušu dzīvnieku modeli sk. 29. punktā un dzīvnieku, kam ir izoperētas olnīcas, modeli sk. 30. punktā). Nenobriedušām žurku mātītēm testējamās ķīmiskās vielas devu ievada katru dienu trīs dienas pēc kārtas. Vielu ievadīt trīs dienas pēc kārtas ir ieteicams arī žurku mātītēm, kurām ir izoperētas olnīcas, bet var izmantot arī ilgāku ekspozīciju, kas var palīdzēt vieglāk noteikt ķīmiskās vielas ar vāju aktivitāti. Peļu mātītēm, kurām ir izoperētas olnīcas, attiecībā uz spēcīgiem estrogēna agonistiem ir jāpietiek devu ievadīt 3 dienas, un devas ievadīšanas laika pagarināšana līdz septiņām dienām nedos būtiskas priekšrocības, tomēr minētais kopsakars attiecībā uz vājiem estrogēniem validācijas pētījumā (16) nav novērots, un tāpēc pelēm, kurām ir izoperētas olnīcas, devu došana jāpaildzina līdz 7 dienām pēc kārtas.Deva katru dienu jāievada vienā laikā. Deva pēc vajadzības jākoriģē, lai saglabātu nemainīgu devas līmeni attiecībā pret dzīvnieka ķermeņa svaru (piemēram, testējamās ķīmiskās vielas mg uz kg ķermeņa svara dienā). Iedarbība, ko rada testiem lietotā tilpuma mainība attiecībā pret ķermeņa svaru, ir jāsamazina līdz minimumam, ievadāmā šķīduma koncentrāciju koriģējot tā, lai pie visām devām attiecībā pret ķermeņa svaru un neatkarīgi no devas ievadīšanas ceļa tilpums būtu vienāds.

40.   Ja testējamo ķīmisko vielu dzīvniekiem ievada ar mākslīgo barošanu, tas jādara ar kuņģa zondi vai piemērotu intubācijas cauruli vienā devā reizi dienā. Maksimālais šķidruma daudzums, ko vienā reizē var ievadīt, ir atkarīgs no testa dzīvnieka lieluma. Ir jāievēro vietējie dzīvnieku aprūpes noteikumi, taču tilpums nedrīkst pārsniegt 5 ml uz kg ķermeņa svara, izņemot ūdens šķīdumus, ko var ievadīt 10 ml uz kg ķermeņa svara.

41.   Ja testējamo ķīmisko vielu ievada ar zemādas injekciju, viela jāievada vienā devā reizi dienā. Devu ievada mugurā, plecu vai jostasvietas zonā, izmantojot sterilu adatu (piemēram, 23. vai 25. izmērs) un turbekulīna šļirci. Injekcijas vietu var nenoskūt. Vielas zudumi, noplūdes injekcijas vietā vai nepilnīga devas ievadīšana ir jāreģistrē. Kopējais tilpums, ko injicē žurkai dienā, nedrīkst pārsniegt 5 ml uz kg ķermeņa svara, izmantojot 2 injicēšanas vietas, izņemot gadījumus, kur ievada ūdens šķīdumus, ko var ievadīt 10 ml uz kg no ķermeņa svara.

Novērojumi

Vispārīgie un klīniskie novērojumi

42.   Vispārīgi klīniskie novērojumi jāizdara vismaz reizi dienā un, ja konstatē toksicitātes pazīmes, tad biežāk. Novērojumi katru dienu jāizdara vienā laikā, ņemot vērā paredzamās ietekmes maksimuma laiku pēc devu došanas. Visi dzīvnieki jānovēro attiecībā uz mirstību, saslimstību un vispārīgām klīniskām pazīmēm, piemēram, uzvedības, ādas, apmatojuma, acu un gļotādas, kā arī veģetatīvās aktivitātes pārmaiņām (piemēram, asarošana, piloerekcija, acs zīlītes diametra pārmaiņas un neraksturīga elpošana) un sekrēcijas un izdalījumu klātbūtni.

Ķermeņa svars un barības patēriņš

43.   Visi dzīvnieki jāsver katru dienu līdz tuvākajai 0,1 g vienībai, sākot ar brīdi tieši pirms pirmās devas ievadīšanas, t. i., kad dzīvnieki ir sadalīti grupās. Par izvēles mērījumu var izmantot arī barības patēriņu devu došanas laikā uz vienu būri, nosverot barības traukus. Barības patēriņa mērījumu rezultātus izsaka gramos uz vienu žurku dienā.

Secēšana un dzemdes svara noteikšana

44.   Divdesmit četras stundas pēc devas pēdējās ievadīšanas reizes žurkas humāni nonāvē. Ideālā gadījumā autopsija jāizdara pa grupām nejaušinātā kārtībā, lai secība nebūtu vienā vai otrā virzienā pa devu grupām, un tādējādi nebūtu nedaudz ietekmēti dati. Biotesta mērķis ir noteikt dzemdes natīvo svaru un saussvaru. Natīvajā svarā ietilpst dzemdes un lūmena šķidruma svars. Dzemdes saussvaru nosaka tad, kad no dzemdes ir izspiests un izvadīts lūmena šķidrums.

45.   Pirms secēšanas nenobriedušiem dzīvniekiem pārbauda maksti, lai noskaidrotu, vai tā ir atvērusies. Secēšanas procedūras sākumā atgriež vēdera dobumu, sākot ar kaunuma kaula simfīzes centru. Pēc tam no vēdera dobuma aizmugurējās sienas atdala dzemdes ragu un olnīcas, ja tādas ir. No dzemdes un maksts priekšpuses un sānu puses atdala urīnpūsli un urīnvadus. Saistaudu savienojumu starp anālo atveri un maksti atgriež līdz vietai, kur redzams maksts atveres savienojums ar starpenes ādu. Dzemdi un maksti no ķermeņa atdala, griežot maksts sieniņu tieši virs starpenes ādas savienojuma vietas, kā parādīts 2. attēlā. Dzemdi no vēdera dobuma izgriež, uzmanīgi pārgriežot dzemdes apzarni tā piestiprināšanās vietā pa abu dzemdes ragu aizmugurējo daļu visā garumā. Kad dzemde izņemta no vēdera dobuma, ir jārīkojas ātri, lai audi neizžūtu. Svara zudumam izžūšanas dēļ jāpievērš lielāka uzmanība neliela apjoma audu, piemēram, dzemdes gadījumā (23). Ja dzīvniekam ir olnīcas, tās izgriež pie olvadiem tā, lai no dzemdes raga neiztek lūmena šķidrums. Ja dzīvniekam olnīcas ir izoperētas, izgriezuma vietas pārbauda, lai noteiktu, vai nav palikušas olnīcas audu daļas. Nogriež liekos taukus un saistaudus. Maksti no dzemdes atdala tieši zem dzemdes kakla tā, lai dzemdes kakls paliktu dzemdē, kā parādīts 2. attēlā.

46.   Katru dzemdi ievieto atsevišķi marķētā un nosvērtā tvertnē (piemēram, Petri platē vai plastmasas mērtraukā), rūpīgi raugoties, lai tā pirms svēršanas neizžūtu (piemēram, tvertnē var ieklāt filtrpapīru, kas mazliet samitrināts fizioloģiskajā šķīdumā). Dzemdi ar lūmena šķidrumu nosver līdz tuvākajai 0,1 g vienībai (dzemdes natīvais svars).

47.   Pēc tam katru dzemdi apstrādā atsevišķi, lai izvadītu lūmena šķidrumu. Abus dzemdes ragus pārdur vai gareniski pārgriež. Dzemdi noliek uz mazliet samitrināta filtrpapīra (piemēram, Vatmaņa papīrs Nr. 3) un ar otru mazliet samitrinātu filtrpapīru viegli uzspiež, lai izvadītu atlikušo lūmena šķidrumu. Dzemdi, kurai ir izvadīts lūmena šķidrums, nosver līdz tuvākajai 0,1 g vienībai (dzemdes saussvars).

48.   Pētījuma beigās konstatēto dzemdes svaru var izmantot, lai pārliecinātos, ka nenobriedušajām žurkām nav pārsniegts attiecīgais vecums, tomēr šajā sakarā svarīgāki ir vēsturiskie dati par laboratorijā izmantoto žurku līniju. (par rezultātu interpretāciju sk. 56. punktu).

Neobligātie izmeklējumi

49.   Pēc nosvēršanas dzemdi var ielikt fiksācijas šķīdumā (10 % neitrālā buferētā formalīnā), lai varētu veikt histopatoloģisko izmeklēšanu pēc iekrāsošanas ar hematoksilīnu un eozīnu. Attiecīgi var izmeklēt maksti (sk. 9. punktu). Turklāt kvantitatīvai salīdzināšanai var izmantot endometriskā epitēlija morfometrisku mērīšanu.

DATI UN ZIŅOJUMU SAGATAVOŠANA

Dati

50.   Pētījuma rezultātos ietilpst:

—	dzīvnieku skaits testa sākumā,

—	to dzīvnieku skaits un identitāte, kas testēšanas laikā ir nobeigušies vai humānu apsvērumu dēļ nonāvēti, un katras nobeigšanās vai humānās nonāvēšanas datums un laiks,

—	to dzīvnieku skaits un identitāte, kam novērotas toksicitātes pazīmes, novēroto toksicitātes pazīmju apraksts, ieskaitot toksiskās ietekmes sākuma laiku, ilgumu un smagumu, un

—	to dzīvnieku skaits un identitāte, kam novēroti audu bojājumi, un bojājumu veida apraksts.

51.   Par atsevišķiem dzīvniekiem atspoguļotie dati ir ķermeņa svars, dzemdes natīvais svars un dzemdes saussvars. Vienpusēju statistisko analīzi attiecībā uz agonistiem izmanto, lai noteiktu, vai testējamās ķīmiskās vielas ievadīšana veicinājusi statistiski nozīmīgu (p < 0,05) dzemdes svara pieaugumu. Attiecīga statistiskā analīze ir jāveic, lai pārbaudītu ar vielas ievadīšanu saistītas dzemdes saussvara un dzemdes natīvā svara izmaiņas. Piemēram, datus var novērtēt ar kovariācijas analīzes (ANCOVA) pieeju, par vienu no mainīgajiem izmantojot ķermeņa svaru autopsijas laikā. Pirms analizēt datus par dzemdēm, ar tiem var veikt dispersiju izlīdzinošu logaritmisko transformāciju. Lai salīdzinātu devu grupu un nesējvielas kontroles grupu pārus un lai aprēķinātu ticamības intervālus, piemēroti ir Doneta un Hsu testi. Lai noteiktu iespējamos “izlēcējus” un novērtētu dispersiju homogenitāti, var izmantot stjūdentizētus atlikumu grafikus. Minētās procedūras tika izmantotas ESAO validācijas programmā, statistiskās analīzes sistēmas (SAS Institute, Cary, NC) 8. versijā izmantojot PROC GLM (6)(7).

52.   Galīgajā ziņojumā iekļauj šādu informāciju:

Testēšanas iekārta:

—	atbildīgie darbinieki un viņu pienākumi pētījumā,

—	pozitīvās kontroles izejdatu testa dati un regulāri pozitīvās kontroles dati (sk. 26. un 27. punktu).

Testējamā ķīmiskā viela:

—	testējamās ķīmiskās vielas īpašības,

—	fizikālās īpašības un attiecīgā gadījumā fizikālķīmiskās īpašības,

—	atšķaidījumu pagatavošanas veids un biežums,

—	visi apkopotie dati par stabilitāti,

—	visi ievadāmā šķīduma analīzes rezultāti.

Nesējviela:

—	testējamās nesējvielas īpašības (veids, piegādātājs un partijas numurs),

—	nesējvielas izvēles pamatojums (ja nesējviela nav ūdens).

Testa dzīvnieki:

—	izmantotā suga un līnija un izvēles pamatojums,

—	piegādātājs un konkrētā piegādātājiestāde,

—	vecums piegādes brīdī un dzimšanas datums,

—	ja piegādāti nenobrieduši dzīvnieki, norādīt vai tie piegādāti ar māti vai to māti, kuras aprūpē ir nodoti dzīvnieku mazuļi, un atšķiršanas datums,

—	dati par dzīvnieku aklimatizācijas procedūru,

—	dzīvnieku skaits vienā būrī,

—	atsevišķu dzīvnieku un to grupu identifikācijas veids un paņēmiens.

Testēšanas apstākļi:

—	nejaušināšanas procesa apraksts (t. i., izmantotā metode),

—	izraudzīto devu pamatojums,

—	sīkas ziņas par testējamās ķīmiskās vielas preparāta sagatavošanu, iegūtā koncentrācija, stabilitāte un homogenitāte,

—	sīkas ziņas par testējamās ķīmiskās vielas ievadīšanu un ekspozīcijas veida izvēles pamatojums,

—	barība (nosaukums, veids, piegādātājs, sastāvs un fitoestrogēnu līmenis, ja zināms),

—	ūdens izcelsme (piemēram, krāna ūdens vai filtrēts ūdens) un piegādes veids (pa caurulēm no lielākas tvertnes, pudelēs utt.),

—	guļvietas (nosaukums, veids, piegādātājs, sastāvs),

—	apraksts par apstākļiem būros, apgaismojuma intervāli, telpu temperatūra, relatīvais mitrums un to uzkopšana,

—	autopsijas un dzemdes svēršanas procedūru sīks apraksts,

—	statistisko procedūru apraksts.

Rezultāti

Par katru dzīvnieku:

—	katru dienu katra dzīvnieka svars (sākot ar brīdi, kad tie iedalīti grupās, un beidzot ar autopsiju) (līdz tuvākajai 0,1 g vienībai),

—	katra dzīvnieka vecums (dienās, sākot ar dzimšanas dienu – 0. dienu pēc piedzimšanas), kad sāk ievadīt testējamo ķīmisko vielu,

—	katras devas ievadīšanas datums un laiks,

—	aprēķinātais ievadītās devas tilpums un deva un novērojumi par devas zudumiem vielas ievadīšanas brīdī vai pēc devas ievadīšanas,

—	katru dienu reģistrēts dzīvnieka statuss, arī simptomi un novērojumi,

—	iespējamais nāves cēlonis (ja pētījuma laikā konstatēts pirmsnāves stāvoklis vai nāve),

—	humānās nonāvēšanas datums un laiks un laiks no pēdējās devas ievadīšanas brīža līdz nonāvēšanas brīdim,

—	dzemdes natīvais svars (līdz tuvākajai 0,1 mg vienībai) un novērotais lūmena šķidruma zudums secēšanas laikā un sagatavojot dzemdi svēršanai,

—	dzemdes saussvars (līdz tuvākajai 0,1 mg vienībai).

Visām dzīvnieku grupām:

—	vidējais ķermeņa svars katru dienu (līdz tuvākajai 0,1 g vienībai) un standartnovirzes (no brīža, kad dzīvnieki sadalīti grupās, līdz autopsijai),

—	vidējais dzemdes natīvais svars un vidējais dzemdes saussvars (līdz tuvākajai 0,1 mg vienībai) un standartnovirzes,

—	barības patēriņš dienā, ja to mēra (aprēķina patērētās barības gramos uz vienu dzīvnieku),

—	statistiskās analīzes rezultāti par devu grupu dzīvnieku dzemdes natīvā svara un saussvara salīdzinājumu ar attiecīgajiem nesējvielas kontroles grupas mērījumiem,

—	statistiskās analīzes rezultāti par devu grupu dzīvnieku kopējā ķermeņa svara un ķermeņa svara pieauguma salīdzinājumu ar attiecīgajiem mērījumiem nesējvielas kontroles grupā.

53.   Svarīgu norādījumu apkopojums attiecībā uz testēšanas metodi

	Žurkas	Peles
Dzīvnieki
Līnija	Parasti izmantotā laboratorijas grauzēju līnija
Dzīvnieku skaits	Vismaz 6 dzīvnieki vienā devas grupā
Grupu skaits	Vismaz 2 testa grupas (norādījumus sk. 33. punktā) un negatīvās kontroles grupa Norādījumi par pozitīvās kontroles grupām ir sniegti 26. un 27. punktā
Turēšanas un barošanas apstākļi
Temperatūra dzīvnieku turēšanas telpā	22 °C ± 3 °C
Relatīvais mitrums	50–60 % un ne mazāk kā 30 % vai ne vairāk kā 70 %
Apgaismojuma intervāli	12 stundas apgaismojumā un 12 stundas tumsā
Barība un dzeramais ūdens	Ad libitum
Turēšanas apstākļi	Atsevišķi vai grupās līdz trīs dzīvniekiem (nenobriedušus dzīvniekus ieteicams turēt, veidojot sociālās grupas)
Uzturs un guļvietas	Ieteicams, lai uzturā un guļvietās būtu zems fitoestrogēna līmenis
Protokols
Metode	Metode, kurā izmanto nenobriedušus dzīvniekus, kam nav izoperētas olnīcas (ieteicamā metode) Metode, kurā izmanto pieaugušas mātītes, kam izoperētas olnīcas	Metode, kurā izmanto pieaugušas mātītes, kam izoperētas olnīcas
Vecums devu došanas brīdī nenobriedušiem dzīvniekiem	Ne agrāk kā 18. dienā pēc dzimšanas. Devu došana jābeidz līdz 25. dienai pēc dzimšanas	Šai testēšanas metodē neizmanto
Vecums, kad izoperē olnīcas	6–8 nedēļu vecumā
Vecums devu došanas brīdī dzīvniekiem, kuriem izoperētas olnīcas	Intervālam starp olnīcu izoperēšanu un devu došanas 1. dienu ir jābūt vismaz 14 dienām	Intervālam starp olnīcu izoperēšanu un devu došanas 1. dienu ir jābūt vismaz 7 dienām
Ķermeņa svars	Ķermeņa svara svārstībām ir jābūt minimālām, un tās nedrīkst pārsniegt ± 20 % no vidējā svara
Devu ievadīšana
Ievadīšanas ceļš	Ar mākslīgo barošanu vai zemādas injekciju
Devas ievadīšanas biežums	Viena deva dienā
Ar mākslīgo barošanu vai zemādas injekciju ievadītās devas tilpums	≤ 5 ml uz kg no ķermeņa svara (vai līdz 10 ml uz kg no ķermeņa svara gadījumos, kad ievada ūdens šķīdumu) (2 injekcijas vietās zemādas injekcijas gadījumā)
Devas ievadīšanas periods	Metodei, kurā izmanto nenobriedušus dzīvniekus, 3 dienas pēc kārtas Metodei, kurā izmanto pieaugušus dzīvniekus, kam izoperētas olnīcas, vismaz 3 dienas pēc kārtas	Metodei, kurā izmanto pieaugušus dzīvniekus, kam izoperētas olnīcas, 7 dienas pēc kārtas
Autopsijas laiks	Apmēram 24 stundas pēc pēdējās devas ievadīšanas
Rezultāti
Pozitīva atbildes reakcija	Vidējā dzemdes (natīvais svars un/vai saussvars) svara statistiski nozīmīgs pieaugums
Estrogēna standartviela	17α etinilestradiols

NORĀDĪJUMI PAR REZULTĀTU INTERPRETĀCIJU UN PIEŅEMAMĪBU

54.   Parasti tiek uzskatīts, ka estrogenitātes tests ir pozitīvs, ja salīdzinājumā ar grupu, kurai izmanto šķīdinātāju, vismaz augstajā devu līmenī ir konstatēts dzemdes svara statistiski nozīmīgs pieaugums (p < 0,05). Pozitīvus rezultātus pamato, pierādot bioloģiski ticamu sakarību starp devu un atbildes reakcijas stiprumu, ņemot vērā to, ka līkni, kas raksturo atbildes reakciju uz devu, var ietekmēt testējamās ķīmiskās vielas estrogēniskās un antiestrogēniskās darbības pārklāšanās.

55.   Jāraugās nepārsniegt maksimālo panesamo devu, lai datus varētu statistiski interpretēt. Šajā gadījumā ir uzmanīgi jānovērtē ķermeņa svara samazināšanās, klīniskās pazīmes un citi konstatējumi.

56.   Lai uterotropā biotesta dati būtu pieņemami, ir svarīgi novērtēt dzemdes svaru nesējvielas kontroles grupas dzīvniekiem. Augstas kontrolvērtības var negatīvi ietekmēt biotesta reaģētspēju un spēju noteikt ļoti vājus estrogēnu agonistus. Literatūras avoti un dati, kas iegūti uterotropā biotesta validācijas procesā, liecina, ka ir iespējami spontāni augsta vidējā vērtība kontrolgrupās, jo īpaši nenobriedušiem dzīvniekiem (2)(3)(6)(9). Tā kā nenobriedušām žurkām dzemdes svaru ietekmē vairāki mainīgie, piemēram, līnija vai ķermeņa svars, dzemdes svara precīza maksimālā robežvērtība nav nosakāma. Orientējoši rezultātus var uzskatīt par aizdomīgiem, ja dzemdes saussvars nenobriedušu žurku kontroles grupā ir no 40 līdz 45 mg, un, ja dzemdes svars pārsniedz 45 mg, tests jāatkārto. Tomēr katrs gadījums jāizvērtē atsevišķi (3)(6)(8). Testējot pieaugušas žurkas, kurām olnīcas nav pilnīgi izoperētas, palikušajos olnīcas audos var producēties endogēns estrogēns un kavēt dzemdes svara samazināšanos.

57.   Lai rezultāti būtu pieņemami, nesējvielas kontroles grupas žurku dzemdes saussvaram nenobriedušām žurku mātītēm ir jābūt mazākam nekā 0,09 % no ķermeņa svara, bet jaunām pieaugušām žurku mātītēm, kurām ir izoperētas olnīcas, – mazākam nekā 0,04 % no ķermeņa svara [sk. 31. tabulu (2)]. Ja dzemdes svars kontroldzīvniekiem ir lielāks, ir jāizskata vairāki faktori, arī, kāds bijis dzīvnieku vecums, vai olnīcas izoperētas pareizi, kāds bijis fitoestrogēnu daudzums barībā, un citi faktori, un negatīvi testēšanas rezultāti (estrogēniska darbība nav konstatēta) ir jāizmanto piesardzīgi.

58.   Agrāk iegūti nesējvielas kontroles grupas dati ir jāsaglabā laboratorijā. Laboratorijā ir jāsaglabā arī agrāk iegūti dati par reakciju uz pozitīvām estrogēna standartvielām, piemēram, 17α-etinilestradiolu. Laboratorijās var testēt arī reakciju uz zināmiem vājiem estrogēnu agonistiem. Visus minētos datus var salīdzināt ar pieejamajiem datiem (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8), lai garantētu, ka laboratorijas metodes nodrošina pietiekamu jutību.

59.   ESAO validācijas pētījumā dzemdes saussvara mainība bija mazāka nekā dzemdes natīvā svara mainība (6)(7). Tomēr būtiska atbildes reakcija jebkurā no šiem parametriem liecinātu, ka attiecībā uz testējamo ķīmisko vielu ir konstatēta estrogēniska aktivitāte.

60.   Uterotropu atbildes reakciju neizraisa tikai estrogēni, tomēr uterotropajā biotestā gūts pozitīvs rezultāts kopumā jāinterpretē kā in vivo liecība par iespējamu estrogenitāti, un tādā gadījumā parasti ir jārīkojas, lai jautājumu precizētu (sk. 9. punktu un “ESAO konceptuālo pamatdokumentu: endokrīnās sistēmas darbības traucējumus izraisošu vielu testēšana un novērtēšana”, 2. papildinājums).

1. attēls

Shematiska diagramma, kurā attēlots, kā izoperēt olnīcas.

Procedūras sākumā izdara iegriezumu vēderā starp paribi un gūžas kaulu, un dažus milimetrus uz sāniem no jostas muskuļa sānu malas. Vēdera dobumā atrod olnīcas. Sterilā operācijas laukā olnīcas izņem no vēdera dobuma, starp olnīcu un dzemdi ievieto ligatūru, lai kontrolētu asiņošanu, un, izdarot iegriezumu virs ligatūras, olvada un katra dzemdes raga savienojuma vietā, izņem olnīcas. Pārliecinoties, ka nav vērojama liela asiņošana, vēdera dobumu aizšuj un ādu savelk, piemēram, ar skavām vai ķirurģiskiem diegiem. Pirms dzīvnieku izmantošanas vismaz 14 dienas ir jāļauj dzīvniekiem atkopties un dzemdes svaram atjaunoties.

2. attēls

Dzemdes audu izgriešana un sagatavošana svēršanai.

Procedūras sākumā atgriež vēdera dobumu, sākot ar kaunuma kaula simfīzes centru. Pēc tam no vēdera dobuma aizmugurējās sienas atdala dzemdes ragus un olnīcas, ja tādas ir. No dzemdes un maksts priekšpuses un sānu puses atdala urīnpūsli un urīnvadus. Saistaudu savienojumu starp anālo atveri un maksti atgriež līdz vietai, kur redzams maksts atveres savienojums ar starpenes ādu. Dzemdi un maksti no ķermeņa atdala, griežot maksts sieniņu tieši virs starpenes ādas savienojuma vietas, kā parādīts attēlā. Dzemdi no vēdera dobuma atdala, uzmanīgi pārgriežot dzemdes apzarni tā piestiprināšanās vietā pa abu dzemdes ragu aizmugurējo daļu visā garumā. Kad dzemde no ķermeņa izņemta, nogriež liekos taukus un saistaudus. Ja dzīvniekam ir olnīcas, tās izgriež pie olvadiem tā, lai no dzemdes raga neiztek lūmena šķidrums. Ja dzīvniekam olnīcas ir izoperētas, izgriezuma vietas pārbauda, lai noteiktu, vai nav palikušas olnīcas audu daļas. Maksti no dzemdes atdala tieši zem dzemdes kakla tā, lai dzemdes kakls paliktu dzemdē, kā parādīts attēlā. Pēc tam dzemdi var nosvērt.

PIEZĪMES PAR REGULĒJUMU

1. piezīme.

Pievienošanās un aiziešana ir iespējama visos līmeņos, un tā ir atkarīga tikai no tā, kāda esošā informācija ir vajadzīga bīstamības un riska noteikšanai.

2. piezīme.

5. līmenī ekotoksikoloģijā jāiekļauj beigupunkti, kas norāda uz negatīvās ietekmes mehānismiem, un iespējamo kaitējumu populācijai.

3. piezīme.

Ja multimodāls modelis aptver vairākus testus, kas pastāv arī atsevišķi viena beigupunkta analīzei, minētos atsevišķa beigupunkta analīzes testus aizstāj ar šādu modeli.

4. piezīme.

Katra ķīmiskā viela katrā gadījumā jānovērtē atsevišķi, ņemot vērā visu pieejamo informāciju un regulējuma līmeņu funkcijas.

5. piezīme.

Šis regulējums pašlaik ir nepilnīgs. 3., 4. un 5. līmenī ir minētas analīzes, kas ir pieejamas vai kuras ir paredzēts apstiprināt tuvākajā laikā. Analīzes, kuras ir paredzēts apstiprināt, tiek iekļautas provizoriski. Tiklīdz tās būs pabeigtas un apstiprinātas, tās tiks oficiāli iekļautas šajā regulējumā.

6. piezīme.

5. līmenis neattiecas tikai uz galīgajiem testiem. Minētajā līmenī iekļautie testi papildina vispārīgo bīstamības un riska novērtējumu.

LITERATŪRA

(1)

OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.

(2)

OECD (2003). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic Bioassay. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003)1.

(3)

Owens JW, Ashby J. (2002). Critical Review and Evaluation of the Uterotrophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists and Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic Protocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445-520.

(4)

OECD (2006). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation of the Rodent Uterotrophic Assay – Phase 1. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 65. ENV/JM/MONO(2006)33.

(5)

Kanno, J, Onyon L, Haseman J, Fenner-Crisp P, Ashby J, Owens W. (2001). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to screen compounds for in vivo estrogenic responses: Phase 1. Environ Health Perspect. 109:785-94.

(6)

OECD (2006). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic Bioassay: Phase 2 – Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/MONO(2006)34.

(7)

Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Dose Response Studies. Environ. Health Persp.111:1530-1549

(8)

Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp.111:1550-1558.

(9)

Owens W, Ashby J, Odum J, Onyon L. (2003). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Dietary phytoestrogen analyses. Environ. Health Persp. 111:1559-1567.

(10)

Ogasawara Y, Okamoto S, Kitamura Y, Matsumoto K. (1983). Proliferative pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of [I125]iododeoxyuridine. Endocrinology 113:582-587.

(11)

Branham WS, Sheehan DM, Zehr DR, Ridlon E, Nelson CJ. (1985). The postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17β-estradiol. Endocrinology 117:2229-2237.

(12)

Schlumpf M, Berger L, Cotton B, Conscience-Egli M, Durrer S, Fleischmann I, Haller V, Maerkel K, Lichtensteiger W. (2001). Estrogen active UV screens. SÖFW-J. 127:10-15.

(13)

Zarrow MX, Lazo-Wasem EA, Shoger RL. (1953). Estrogenic activity in a commercial animal ration. Science118:650-651.

(14)

Drane HM, Patterson DSP, Roberts BA, Saba N. (1975). The chance discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd. Cosmet. Toxicol. 13:425-427.

(15)

Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on in vivo responses to exogenously administered estrogens. Environ. Health Perspec. 106:369-373.

(16)

OECD (2007). Additional data supporting the Test Guideline on the Uterotrophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 67.

(17)

Degen GH, Janning P, Diel P, Bolt HM. (2002). Estrogenic isoflavones in rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145-157.

(18)

Wade MG, Lee A, McMahon A, Cooke G, Curran I. (2003). The influence of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. Food Chem. Toxicol. 41:1517-1525.

(19)

Yamasaki K, Sawaki M, Noda S, Wada T, Hara T, Takatsuki M. (2002). Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given different phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the immature rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613-620.

(20)

Thigpen JE, Haseman JK, Saunders HE, Setchell KDR, Grant MF, Forsythe D. (2003). Dietary phytoestrogens accelerate the time of vaginal opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477-485.

(21)

Ashby J, Tinwell H, Odum J, Kimber I, Brooks AN, Pate I, Boyle CC. (2000). Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent sexual development. J. Appl. Toxicol. 20:343-347.

(22)

Thigpen JE, Lockear J, Haseman J, Saunders HE, Caviness G, Grant MF, Forsythe DB. (2002). Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 26:381-393.

(23)

Thigpen JE, Li L-A, Richter CB, Lebetkin EH, Jameson CW. (1987). The mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci.37:596-601.

(24)

OECD (2008). Acute oral toxicity – up-and-down procedure. OECD Guideline for the testing of chemicals No 425.

(25)

OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.

(26)

OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4.

(27)

Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935). The estimation of oestrin and of male hormone in oily solution. J. Physiol. 85: 320 – 333.

(28)

Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936). The nature of the estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 19: 33 – 41.

(29)

Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996). Survey and assessment of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34: 288 – 305.

(30)

Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973). The effects of various steroid on the vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284 – 291.

(31)

OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development – Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Paris.

(32)

Dorfman R.I. (1962). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, Academic Press.

(33)

Thigpen J. E. et al. (2004). Selecting the appropriate rodent diet for endocrine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401-416.

(34)

Gray L.E. and Ostby J. (1998). Effects of pesticides and toxic substances on behavioral and morphological reproductive development: endocrine versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (1-2): 159-184.

(35)

Booth AN, Bickoff EM and Kohler GO. (1960). Estrogen-like activity in vegetable oils and mill by-products. Science 131:1807-1808.

(36)

Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004). Evaluation of estrogenic activity in diets for experimental animals using in vitro assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410-1414.

(37)

OECD (2007). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay Procedure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment. No. 71.

(38)

Eiropas Parlamenta un Padomes 2010. gada 22. septembra Direktīva 2010/63/ES par zinātniskiem mērķiem izmantojamo dzīvnieku aizsardzību (OV L 276, 20.10.2010., 33. lpp.).

B.55.   HERŠBERGERA BIOTESTS AR žURKĀM: (ANTI)ANDROGĒNO ĪPAŠĪBU ĪSĀ SKRĪNINGA TESTS

IEVADS

1.   Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (TG) 441 (2009. gads). Lai pārskatītu esošos un izveidotu jaunus noteikumus attiecībā uz iespējamo endokrīnās sistēmas darbības traucējumu skrīningu un testēšanu, 1998. gadā ESAO sāka augstas prioritātes rīcību (1). Viens no šīs rīcības mērķiem bija izveidot testēšanas norādījumus Heršbergera biotestam ar žurkām. Farmācijas nozare šo testēšanas metodi izmantoja vairākus gadu desmitus, un 1962. gadā oficiāla ekspertu komiteja to pirmo reizi standartizēja kā skrīninga rīku androgēnu ķīmisko vielu noteikšanai (2). No 2001. līdz 2007. gadam Heršbergera biotestam ar žurkām tika veikta plaša validācijas programma un tika sagatavots papildinformācijas pārskata dokuments (23), sīki izstrādāts metožu apkopojums (3), izstrādāti secēšanas norādījumi (21) un norādījumi, kā veikt laboratorijas un starplaboratoriju pētījumus, lai nodrošinātu ticamu un piemērotu biotestēšanu. Minēto validāciju veica ar spēcīgu androgēnu standartvielu (testosterona propionātu (TP)), diviem spēcīgiem sintētiskiem androgēniem (trenbolona acetātu un metiltestosteronu), spēcīgu antiandrogēnu farmaceitisko preparātu (flutamīdu), spēcīgu dabiskā androgēna (dihidrotestosterona-DHT) sintēzes (finasterīda) inhibitoru, dažiem vājiem antiandrogēniem pesticīdiem (linuronu, vinklozolīnu, procimidonu, p,p'DDE), spēcīgu 5α reduktāzes inhibitoru(finasterīdu) un divām zināmām negatīvām ķīmiskām vielām (dinitrofenoluun nonilfenolu) (4) (5) (6) (7) (8). Šī testēšanas metode tika izveidota, ņemot vērā daudzu gadu biotestēšanas pieredzi un pieredzi, kas iegūta testa programmas laikā un izmantojot šīs programmas rezultātus.

2.   Heršbergera biotests ir in vivo īsā skrīninga tests, kurā izmanto tēviņu reproduktīvā trakta akcesoros audus. Šis tests tika izveidots 1930. gados un labots 1940. gados, kad tajā iekļāva tēviņu reproduktīvā trakta muskuļus, kas reaģē uz androgēniem (2) (9-15). 1960. gados, izmantojot protokola standartizētu versiju (2) (14), tika novērtēti vairāk nekā 700 iespējamo androgēnu, un 1960. gados minētā testa izmantošana androgenitātes un antiandrogenitātes noteikšanai tika uzskatīta par standarta metodi (2) (15). Šā biotesta pamatā ir pubertātes sākumposmā kastrētiem žurku tēviņiem vērojamas svara izmaiņas piecos audu veidos, uz kuriem iedarbojas androgēns. Šajā testā novērtē ķīmiskas vielas spēju izraisīt bioloģisko aktivitāti, kas savienojama ar dabiskā androgēna agonistiem, antagonistiem vai 5α reduktāzes inhibitoru. Pieci testā izmantotie audu veidi, uz kuriem iedarbojas androgēns, ir vēdera prostata (VP), sēklas pūslīši (SV) (ar koagulācijas dziedzeriem un to šķidrumiem), tūpļa cēlājmuskulisun priekštelpas sīpola un briedumķermeņa (LABC) muskulis, Kupera dziedzeris un dzimumlocekļa galviņa (GP). Kastrētiem žurku tēviņiem pubertātes sākumposmā androgēna ietekmē minēto piecu audu absolūtais svars pieaug. Stimulējot minētos audus, lai palielinātu svaru, ievadot spēcīgu androgēnu standartvielu, minētie pieci audi reaģē uz antiandrogēnu, un to absolūtais svars samazinās. Sākumā Heršbergera biotestā izmantoja ķirurģiski kastrētus tēviņus pubertātes sākumposmā, un tas tika apstiprināts Heršbergera validācijas programmas 1., 2. un 3. fāzē.

3.   Heršbergera biotestu izmanto kā mehānisku in vivo skrīninga testu androgēniem agonistiem, androgēniem antagonistiem un 5α reduktāzes inhibitoriem, un tas būtu jāskata saistībā ar “ESAO konceptuālo pamatdokumentu: endokrīnās sistēmas darbības traucējumus izraisošu vielu testēšana un novērtēšana” (2. papildinājums). Minētajā konceptuālajā pamatdokumentā Heršbergera biotests ir iekļauts 3. līmenī kā in vivo tests, kas sniedz informāciju par atsevišķu endokrīnās sistēmas mehānismu, t. i., (anti)estrogenitāti. Heršbergera biotestu ir paredzēts iekļaut in vitro un in vivo testu sērijā, lai identificētu ķīmiskas vielas, kas var ietekmēt endokrīnās sistēmas darbību, un tas vajadzīgs, lai veiktu bīstamības un riska novērtējumu attiecībā uz cilvēku veselību vai vidi.

4.   Pamatojoties ar dzīvnieku labturības apsvērumiem attiecībā uz kastrācijas procedūru, metode ar neskartiem (nekastrētiem), stimulētiem, atšķirtiem tēviņiem tika izmantota kā alternatīva Heršbergera biotestam, lai tie nebūtu jākastrē. Testēšanas metode, kurā izmanto stimulēto atšķiršanu, tika apstiprināta (24), tomēr validācijas pētījumos Heršbergera biotestā atšķiršanai nevarēja vienmēr noteikt, kā to orgānu svaru, uz kuriem iedarbojas androgēns, ietekmē vāji antiandrogēni testētajās devās. Tāpēc tā netika iekļauta šajā testēšanas metodē. Tomēr, tā kā tās izmantošana var būt ne tikai saistīta ar dzīvnieku labturību, bet var arī sniegt informāciju par citiem rīcības veidiem, tā ir aprakstīta ESAO Norādījumu dokumentā Nr. 115 (25).

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI

5.   Androgēna agonisti un antagonisti darbojas kā androgēna receptoru ligandi, un tie var attiecīgi aktivizēt vai nomākt gēnu transkripciju, ko kontrolē receptors. Turklāt dažas ķīmiskas vielas kavē testosterona pārvēršanos spēcīgākā dabiskajā androgēna dihidrotestosteronā dažos androgēnos mērķaudos (5α reduktāzes inhibitori). Minētās ķīmiskās vielas var radīt negatīvu veselības apdraudējumu, tostarp attiecībā uz reprodukciju un attīstību. Tāpēc ir vajadzīgs regulējums, lai varētu ātri izskatīt un novērtēt ķīmisko vielu kā iespējamo androgēna agonistu vai antagonistu vai 5α reduktāzes inhibitoru. Androgēna receptora liganda afinitāte, ko mēra ar receptora saistvielām, vai ziņotājgēnu transkripcijas aktivizēšanās in vitro sniedz datus, tomēr tas nav vienīgais veids, kā noteikt iespējamo apdraudējumu. Citi veidi ir, piemēram, metaboliska aktivēšanās un dezaktivēšanās, vielai iekļūstot ķermenī, ķīmiskās vielas izplatīšanās mērķaudos un izdalīšanās no organisma. Tas nozīmē, ka ir jāpārbauda ķīmiskās vielas iespējamā aktivitāte in vivo noteiktos apstākļos un ekspozīcijā. In vivo novērtējums nav tik kritisks, ja ir zināmas ķīmiskās vielas īpašības attiecībā uz uzsūkšanos – izplatīšanos – metabolismu – izdalīšanos. Ja audus, uz kuriem iedarbojas androgēns, stimulē ar androgēniem, jo īpaši kastrētiem žurku tēviņiem pirmspubertātes vecumā, tie ātri un stabili aug. Grauzēju sugas, jo īpaši žurkas, arī bieži izmanto toksicitātes pētījumos bīstamības raksturošanai. Tāpēc testēšanas veids, kurā izmanto kastrētas žurkas pirmspubertātes vecumā un piecus mērķaudus šajā testēšanā, ir atbilstošs in vivo androgēna agonistu un antagonistu un 5α reduktāzes inhibitoru skrīningam.

6.   Šīs testēšanas metodes pamatā ir ESAO validācijas pētījumā izmantotie protokoli, kas apliecināja, ka laboratorijas un starplaboratoriju pētījumu rezultāti ir ticami un atkārtojami (4)(5)(6)(7)(8). Šajā testēšanas metodē izmanto androgēnas un antiandrogēnas procedūras.

7.   Lai gan ESAO Heršbergera biotesta validācijas programmā, kur piedalījās dažādas laboratorijas, lai atklātu antiandrogēnu, tika izmantotas nedaudz atšķirīgas TP devas (0,2 un 0,4 mg uz kg dienā, zemādas injekcija), šie divi protokolu varianti maz atšķīrās attiecībā uz spēju noteikt vāju vai spēcīgu antiandrogēnu aktivitāti. Tomēr ir skaidrs, ka TP deva nedrīkst būt pārāk augsta, lai nekavētu vāja androgēna receptora (AR) ietekmi, vai pārāk zema, lai nebūtu tā, ka androgēnie audi aug lēni pat tad, ja nav ievadīts antiandrogēns.

8.   Atsevišķu androgēnatkarīgu audu augšanu neietekmē tikai androgēns, t. i., noteiktu audu svaru var ietekmēt ķīmiskās vielas, kas nav androgēna agonisti. Tomēr vairākos audos augšanas atbildes reakciju vienlaikus ietekmē vairāk androgēnam specifisks mehānisms. Piemēram, spēcīga estrogēna augstas devas ietekmē var pieaugt sēklas pūslīšu svars, tomēr citi androgēnatkarīgie audi testā reaģē citādi. Antiandrogēniskas ķīmiskās vielas var darboties kā androgēna receptoru antagonisti vai 5α reduktāzes inhibitori. 5α reduktāzes inhibitori var iedarboties dažādi, jo dažādos audos atšķirīgi notiek pārveidošanās par spēcīgāko dihidrotestosteronu. Antiandrogēni, kas nomāc 5α reduktāzi, piemēram, finasterīds, salīdzinājumā ar spēcīgu AR antagonistu, piemēram, flutamīdu, vairāk ietekmē vēdera prostatu nekā citus audus. Audu atšķirīgo reakciju var izmantot, lai AR izraisīto atbildes reakciju atšķirtu no 5α reduktāzes izraisītās reakcijas. Turklāt androgēna receptors ir evolucionāri saistīts ar citu steroīdhormonu receptoru, un daži citi hormoni, tos ievadot lielās devās, kas pārsniedz fizioloģisko devu, var saistīt TP un kavēt tā ietekmi uz augšanu (13). Turklāt iespējams, ka pastiprināts steroīdu metabolisms un ar to saistīta seruma testosterona samazināšanās var kavēt androgēnatkarīgo audu augšanu. Tāpēc Heršbergera biotesta pozitīvie rezultāti vienmēr ir jānovērtē, izmantojot zinātnisko datu nozīmīguma pieeju, tostarp in vitro testus, piemēram, AR un estrogēna receptoru (ER) saistīšanas testus un atbilstošās transkripcijas aktivēšanas testus, vai izmantojot citus in vivo testus, kuros pārbauda līdzīgus androgēna mērķaudus, piemēram, tēviņu pubertātes tests, 15 dienu tests ar neskartiem pieaugušiem tēviņiem vai 28 dienu vai 90 dienu atkārtotas devas pētījumi.

9.   Pieredze liecina, ka ksenobiotiski androgēni ir sastopami retāk nekā ksenobiotiski antiandrogēni. Attiecīgi sagaidāms, ka Heršbergera biotestu izmantos galvenokārt antiandrogēnu skrīningam. Tomēr androgenitātes testēšanas procedūru var izmantot steroīdiem vai steroīdiem līdzīgām ķīmiskām vielām vai ķīmiskām vielām, kurām iespējamā androgēnu ietekme tika noteikta, izmantojot konceptuālā pamatdokumenta 1. vai 2. līmenī minētās metodes (2. papildinājums). Turklāt ar (anti)androgēniskām īpašībām saistītu negatīvu ietekmi var novērot 5. līmeņa testos, un tādā gadījumā var būt jānosaka tas, vai ķīmiskās vielas ietekme ir endokrīniska.

10.   Ir atzīts, ka visām procedūrām, kas saistītas ar dzīvniekiem, ir jāatbilst vietējiem dzīvnieku labturības standartiem; turpmāk tekstā minētie labturības un testu nosacījumi ir minimālie standarti, un tos aizstāj ar vietējiem noteikumiem, piemēram, Eiropas Parlamenta un Padomes 2010. gada 22. septembra Direktīvu 2010/63/ES par zinātniskiem mērķiem izmantojamo dzīvnieku aizsardzību (26). ESAO ir izdevusi arī citus norādījumus par humānu izturēšanos pret dzīvniekiem (17).

11.   Kā jebkurā biotestā ar eksperimenta dzīvniekiem ir rūpīgi jāizvērtē vajadzība veikt attiecīgo pētījumu. Parasti tam var būt divi iemesli:

—	liela ekspozīcijas iespējamība (konceptuālā pamatdokumenta 1. līmenis) vai (anti)androgenitātes pazīmes in vitro testēšanā (2. līmenis) – lai noskaidrotu, vai šāda ietekme ir iespējama in vivo,

—	ietekme atbilst (anti)androgēnitātei in vivo testu 4. vai 5. līmenī, pamatojot konkrētā iedarbības veida izmeklēšanu, piemēram, lai noteiktu, vai ietekme ir saistīta ar (anti)androgēnisku mehānismu.

12.   Šajā testēšanas metodē minētās definīcijas ir minētas 1. papildinājumā.

TESTA PRINCIPS

13.   Heršbergera biotesta jutību nodrošina, izmantojot tēviņus, kuriem vāji veidojas endogēnais androgēns. Šajā nolūkā izmanto kastrētus tēviņus, nodrošinot attiecīgu laiku pēc kastrācijas, lai mērķaudi saruktu līdz minimumam, un izmanto arī kopīgu svara izejlielumu. Tādā gadījumā, pārbaudot iespējamo androgēno aktivitāti, endogēnais cirkulācijas androgēna līmenis ir zems, hipotalāma, hipofīzes un gonādas ass ir veidota tā, lai nevarētu kompensēt ar atbildes reakcijas mehānismiem, audu atbildes reakcijas spēja ir maksimāli palielināta un sākotnējā audu svara mainīgums ir minimāls. Iespējamās antiandrogēniskās darbības skrīningā var nodrošināt stabilāku audu svara pieaugumu, audus stimulējot ar androgēna standartvielu. Tas nozīmē, ka Heršbergera biotestam ir vajadzīgi tikai 6 dzīvnieki vienā devas grupā, bet citos testos, kur izmanto neskartus pieaugušus tēviņus vai tēviņus pubertātes vecumā, ir jāizmanto 15 tēviņi vienā devas grupā.

14.   Žurku tēviņi pubertātes sākumposmā ir atbilstīgi jākastrē, izmantojot apstiprinātu anestēzijas un sterilizācijas metodi. Sāpju mazināšanas līdzekli ievada pirmās dažas dienas pēc operācijas, lai pēc tās mazinātu diskomfortu. Kastrācija uzlabo testa precizitāti vāju androgēnu un antiandrogēnu noteikšanā, likvidējot kompensējošos endokrīnos atbildes reakcijas mehānismus, kas piemīt neskartiem dzīvniekiem un var mazināt ievadīto androgēnu un antiandrogēnu ietekmi, un ierobežojot lielo seruma testosterona līmeņa mainību, kas vērojama atsevišķiem indivīdiem. Tādējādi kastrācija samazina to dzīvnieku skaitu, kas jāpārbauda, lai novērtētu endokrīno aktivitāti.

15.   Iespējamās androgēniskās darbības skrīningā testējamo ķīmisko vielu ievada katru dienu ar mākslīgo barošanu vai zemādas injekciju desmit dienas pēc kārtas. Testējamās ķīmiskās vielas ievada ne mazāk kā divām eksperimenta dzīvnieku grupām, kurām ievada vielu, vienai grupai izmantojot vienu devas līmeni. Dzīvniekiem izdara autopsiju apmēram 24 stundas pēc pēdējās devas ievadīšanas. Ja, salīdzinot ar nesējvielas kontroles grupu, pārbaudāmās vielas grupās ir konstatēts divu vai vairāku mērķorgānu svara statistiski nozīmīgs pieaugums, tad uzskatāms, ka rezultāts attiecībā uz testējamās ķīmiskās vielas androgēno darbību ir pozitīvs (sk. 60. punktu). Androgēni, piemēram, trenbolons, uz ko neiedarbojas 5α reduktāze, vairāk ietekmē LABC muskuli un dzimumlocekļa galviņu (GP), nekā TP, tomēr būtu jāpieaug visu audu svaram.

16.   Pārbaudot iespējamo antiandrogēnisko darbību, testējamo ķīmisko vielu ievada katru dienu ar mākslīgo barošanu vai zemādas injekciju desmit dienas pēc kārtas, TP dienas devu (0,2 vai 0,4 mg uz kg dienā) ievadot ar injekciju. Validācijas programmā tika noteikts, ka TP var izmantot 0,2 vai 0,4 mg uz kg dienā, jo abas minētās devas var izmantot antiandrogēnu noteikšanai, un tāpēc testēšanā ir jāizmanto tikai viena no minētajām devām. Testējamās ķīmiskās vielas pakāpeniskas devas ievada ne mazāk kā trīs eksperimenta dzīvnieku grupām, vienai grupai izmantojot vienu devas līmeni. Dzīvniekiem izdara autopsiju apmēram 24 stundas pēc pēdējās devas ievadīšanas. Ja testējamās ķīmiskās vielas grupās un TP grupās salīdzinājumā ar TP kontroles grupu ir konstatēts divu vai vairāku mērķorgānu svara statistiski nozīmīgs samazinājums, tad rezultāts attiecībā uz testējamās ķīmiskās vielas iespējamo antiandrogēnisko darbību ir pozitīvs (sk. 61. punktu).

METODES APRAKSTS

Dzīvnieku sugas un līnijas izvēle

17.   Heršbergera biotestā žurkas izmanto kopš 20. gs. 30. gadiem. Lai gan bioloģiski ticams, ka atbildes reakcija žurkām un pelēm būtu līdzīga, ņemot vērā 70 gadu pieredzi testos ar žurkām, tieši tās parasti izmanto Heršbergera biotestā. Turklāt Heršbergera biotesta datus var izmantot kā sākotnējos datus ilgtermiņa pētījumam, kas aptver vairākas paaudzes, tādējādi abos pētījumos var izmantot vienas sugas, līnijas un izcelsmes dzīvniekus.

18.   Izmantojot šo protokolu, laboratorijas var izvēlēties, kuru žurku līniju izmantot testēšanā, un parasti izvēlas to, kuru iesaistītā laboratorija izmanto vēsturiski. Var izmantot parastās laboratorijas žurku līnijas, tomēr nav ieteicams izmantot tādu līniju žurkas, kas nobriest ievērojami vēlāk nekā 42 dienas pēc dzimšanas, jo minēto žurku tēviņu kastrēšana 42 dienu vecumā var kavēt dzimumlocekļa galviņas svara mērīšanu, ko var darīt tikai tad, kad ir atdalījusies dzimumlocekļa priekšāda. Tas nozīmē, ka nav vēlams izmantot žurku līnijas, kas iegūtas no Fisher 344 žurkām, izņemot retus gadījumus. Līnijas Fisher 344 žurku reproduktīvās sistēmas orgānu attīstības laiks atšķiras no citām biežāk izmantotām žurku līnijām, piemēram, Sprague Dawley vai Wistar (16). Ja jāizmanto minētā žurku līnija, laboratorijā žurkas jākastrē mazliet vecākas un jāvar pierādīt izmantotās līnijas jutību. Laboratorijai ir skaidri jāpamato žurku līnijas izvēle. Ja skrīninga testu veic pirms vairākkārtējās devas perorāla pētījuma, pētījuma par reprodukciju un attīstību vai ilgtermiņa pētījuma, ieteicams visos pētījumos izmantot vienas līnijas un izcelsmes dzīvniekus.

Turēšanas un barošanas apstākļi

19.   Visām procedūrām ir jāatbilst visiem vietējiem laboratorijas dzīvnieku labturības standartiem. Šeit sniegtie labturības un testu nosacījumi ir minimālie standarti, un lielāks spēks ir stingrākiem vietējiem noteikumiem, piemēram, Eiropas Parlamenta un Padomes 2010. gada 22. septembra Direktīvai 2010/63/ES par zinātniskiem mērķiem izmantojamo dzīvnieku aizsardzību (26). Eksperimenta dzīvnieku telpas temperatūrai jābūt 22 °C (ar nobīdi ± 3 °C). Relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un, ieteicams, ne vairāk kā 70 %, izņemot uzkopšanas laiku. Vēlamais relatīvais mitrums ir 50–60 %. Telpās ir jābūt mākslīgajam apgaismojumam. Dzīvniekus 12 stundas diennaktī tur apgaismojumā, bet 12 stundas tumsā.

20.   Vēlams dzīvniekus turēt grupās, nevis atsevišķi, jo dzīvnieki ir jauni, un žurkas ir sociāli dzīvnieki. Ja būrī ir divi vai trīs dzīvnieki, tad būris nav pārpildīts un netiek radīts stress, kas var ietekmēt dzimumorgānu sistēmas akcesoro audu attīstības hormonālo kontroli. Būrus rūpīgi iztīra, lai likvidētu iespējamus kontaminētājus, un tos izvieto tā, lai iespējami samazinātu būru novietojuma varbūtējo iedarbību. Jāizmanto pienācīga izmēra būri (apmēram 2 000 kvadrātcentimetri), lai tie nebūtu pārpildīti.

21.   Visi dzīvnieki ir humānā viedā atsevišķi jāidentificē (piemēram, marķējums uz auss vai krotālija). Identifikācijas veidu dokumentē.

22.   Laboratorijas dzīvnieku barību un dzeramo ūdeni dzīvnieki saņem ad libitum. Laboratorijām, kas izmanto Heršbergera biotestu, ir jāizmanto laboratorijas dzīvnieku barība, ko parasti izmanto ķīmiskās vielas testēšanā. Biotesta validācijas pētījumos netika konstatēta ar barību saistīta ietekme vai mainība. Izmantoto barību dokumentē un laboratorijas dzīvnieku barības paraugu saglabā, lai turpmāk vajadzības gadījumā to varētu analizēt.

Veiktspējas kritēriji attiecībā uz androgēnatkarīgu orgānu svaru

23.   Validācijas pētījumā netika konstatēts, ka ķermeņa svara samazinājums ietekmē mērķaudu (t. i., šajā pētījumā sveramo audu) svara pieaugumu vai samazinājumu.

24.   Salīdzinot dažādas žurku līnijas, kas veiksmīgi izmantotas validācijas programmā, androgēnatkarīgie orgāni ir lielāki smagākām žurku līnijām nekā vieglākām līnijām. Tāpēc Heršbergera biotesta norises kritērijos nav norādīts absolūtais paredzamais orgānu svars pozitīvās un negatīvās kontroles dzīvniekiem.

25.   Tā kā audiem variācijas koeficients (CV) ir apgriezti proporcionālā sakarībā ar statistisko jaudu, Heršbergera biotesta veiktspējas kritēriju pamatā ir variācijas koeficienta maksimālās vērtības katriem audiem (1. tabula). Variācijas koeficientu nosaka ESAO validācijas pētījumos. Negatīva rezultāta gadījumā laboratorijām ir jāpārbauda variācijas koeficients kontroles grupā un augstākās devas grupā, lai noteiktu, vai ir pārsniegti maksimālā variācijas koeficienta veiktspējas kritēriji.

26.   Pētījumu atkārto šādos gadījumos: 1) trīs vai vairāk no desmit iespējamiem atsevišķiem variācijas koeficientiem kontroles grupā un augstākās devas grupā pārsniedz maksimālo daudzumu, kas noteikts pētījumiem ar agonistiem un antagonistiem, kā norādīts 1. tabulā, un 2) vismaz divi mērķaudi ir gandrīz nenozīmīgi, t. i., ρ vērtības no 0,05 līdz 0,10.

1. tabula

Maksimālie pieļaujamie variācijas koeficienti, kas noteikti dzimumorgānu sistēmas akcesorajiem mērķaudiem, ESAO validācijas pētījumos lietojot modeli, kurā izmanto kastrētus dzīvniekus  (12)

Audi	Antiandrogēniska ietekme	Androgēniska ietekme
Sēklas pūslīši	40 %	40 %
Vēdera prostata	40 %	45 %
LABC	20 %	30 %
Kupera dziedzeri	35 %	55 %
Dzimumlocekļa galviņa	17 %	22 %

PROCEDŪRA

Atbilstība regulējumam un laboratorijas verifikācija

27.   Atšķirībā no uterotropās testēšanas (šā pielikuma B.54. nodaļa), pirms Heršbergeratesta veikšanas nav jāapliecina laboratorijas kompetence, jo vienlaicīgās pozitīvās (testosterona propionāts un flutamīds) un negatīvās kontroles ir testa neatņemama daļa.

Dzīvnieku skaits un stāvoklis

28.   Katrā apstrādes un kontroles grupā jābūt ne mazāk kā 6 dzīvniekiem. Tas attiecas uz androgēnu un antiandrogēnu protokoliem.

Kastrācija

29.   Lai dzīvnieki būtu veseli un augtu, pēc to saņemšanas ir jānodrošina dažas dienas ilgs aklimatizācijas periods. Tā kā dzīvniekiem, kas ir kastrēti agrāk nekā 42 dienu vecumā jeb 42. dienā pēc piedzimšanas, var nebūt preputiālās atdalīšanās, dzīvnieki ir jākastrē 42. dienā pēc piedzimšanas vai vēlāk, nevis agrāk. Dzīvniekus kastrē, izmantojot anestēziju, izdarot iegriezumu sēklinieku maisiņā un izņemot abus sēkliniekus un sēklinieku piedēkļus, asinsvadus un sēklas vadus liģējot. Pārliecinoties, ka nav asiņošanas, sēklinieku maisiņu aizšuj vai brūcei uzliek skavas. Pirmās dažas dienas pēc operācijas, lai mazinātu diskomfortu, dzīvniekiem ievada pretsāpju līdzekli. Ja no dzīvnieku piegādātāja iegādājas kastrētus dzīvniekus, piegādātājam ir jānorāda dzīvnieku vecums un dzimumbrieduma stadija.

Aklimatizācija pēc kastrācijas

30.   Dzīvniekiem pēc kastrācijas ir jānodrošina vismaz 7 dienu ilgs aklimatizācijas periods laboratorijā, lai mērķaudu svars saruktu. Dzīvnieki katru dienu ir jānovēro, un ir jālikvidē dzīvnieki, kam ir redzamas slimības vai fiziskās kroplības. Tas nozīmē, ka (pētījuma) devu var sākt dot, sākot ar 49. dienu pēc piedzimšanas, bet ne vēlāk kā 60. dienā pēc piedzimšanas. Autopsiju drīkst veikt ne vēlāk kā 70. dienā pēc piedzimšanas. Laika ierobežojumi ir tik elastīgi, lai laboratorija varētu efektīvi plānot eksperimentus.

Ķermeņa svars un grupu nejaušināšana

31.   Audu svara mainību dzīvniekiem vienā grupā un dažādās grupās ietekmē individuālā ķermeņa svara atšķirības. Palielinoties audu svara mainībai, palielinās variācijas koeficients un samazinās testēšanas statistiskā jauda (tā dēvētais testu jutīgums). Tāpēc ķermeņa svara izmaiņas ir jākontrolē gan eksperimentā, gan ar statistikas metodēm.

32.   Kontrole eksperimentā nozīmē tikai nelielas ķermeņa svara izmaiņas vienā pētījuma grupā un dažādās grupās. Pārāk mazus vai pārāk lielus dzīvniekus neizmanto un neiekļauj pētījuma grupā. Uzsākot pētījumu, izmantoto dzīvnieku ķermeņa svaram mainībai jābūt ± 20 % no vidējā svara (piemēram, 175 g ± 35 g kastrētām žurkām pubertātes sākumposmā). Dzīvnieki ir jāiedala grupās (kontroles un vielas ievadīšanas grupā) tās pēc svara sadalot nejaušināti, lai katras grupas vidējais ķermeņa svars statistiski neatšķirtos no otras grupas. Jādokumentē izmantotā blokotas nejaušināšanas procedūra.

33.   Tā kā toksicitāte var samazināt izmēģinājumu grupu dzīvnieku ķermeņa svaru attiecībā pret kontroles grupu, par statistisko kovariācijas vērtību var izmantot ķermeņa svaru pirmajā testējamās ķīmiskās vielas ievadīšanas dienā, nevis ķermeņa svaru autopsijas brīdī.

Dozējums

34.   Lai noteiktu, vai testējamajai ķīmiskajai vielai var būt androgēniska iedarbība in vivo, parasti pietiek ar divām vielas ievadīšanas un kontroles grupām un pozitīvo un nesējvielas (negatīvo) kontroles grupu (sk. 3. punktu), un tāpēc dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ šo modeli izmanto visbiežāk. Ja mērķis ir iegūt līkni, kas raksturo atbildes reakciju uz devu vai veikt ekstrapolāciju uz mazākām devām, ir vajadzīgas vismaz 3 devu grupas. Ja ir vajadzīga papildu informācija, nevis tikai par to, vai ir androgēniska darbība (piemēram, noteikt stiprumu), ir jāizmanto cits devu došanas režīms. Testējot antiandrogēnus, testējamo ķīmisko vielu ievada kopā ar androgēna agonista standartvielu. Ir jāizmanto vismaz 3 testa grupas ar dažādu testējamās ķīmiskās vielas devu un pozitīvās un negatīvās kontroles grupa (sk. 44. punktu). Ar kontroles dzīvniekiem jārīkojas tāpat kā ar testa grupu dzīvniekiem, tie tikai nesaņem testējamo ķīmisko vielu. Ja testējamo ķīmisko vielu ievada ar nesējvielu, kontroles grupa saņem maksimālo nesējvielas tilpumu, ko izmanto testa grupām.

35.   Devu līmeņi jāierosina un jāizvēlas, ņemot vērā esošos toksicitātes un (toksisko-)kinētikas datus, kas ir pieejami par testējamo ķīmisko vielu vai par radniecīgiem materiāliem. Izvēloties augstāku devas līmeni, vispirms ir jāņem vērā LD50 un/vai informācija par pārbaudāmās vielas akūto toksicitāti, lai neizraisītu dzīvnieku nāvi, smagas ciešanas vai diskomfortu (17)(18)(19)(20), un ir jāņem vērā pieejamā informācija par devām, ko izmanto subhroniskos un hroniskos pētījumos. Parasti augstākā deva nedrīkst izraisīt dzīvnieku galīgā ķermeņa svara samazinājumu vairāk nekā par 10 % no kontrolsvara. Atkarībā no tā, kura no turpmāk minētajām devām ir zemāka, augstākā deva ir: 1) augstākā deva, pie kuras dzīvnieki izdzīvo un kura tiem nerada ievērojamu toksicitāti vai diskomfortu, to 10 dienas pēc kārtas ievadot līdz maksimālajai devai 1 000 mg uz kg dienā (sk. 36. punktu) vai 2) deva, kas izraisa (anti)androgēnisku ietekmi. Skrīninga gadījumā parasti izmanto lielus devu intervālus, piemēram, intervāla vienības puse log (devas progresijā 3,2), vai pat viens log. Ja piemēroti dati nav pieejami, izmantojamo devu noteikšanai var izdarīt diapazona atrašanas pētījumu (37. punkts).

Robeždeva

36.   Ja testā pie robeždevas, kas ir 1 000 mg uz kg no ķermeņa svara dienā, un mazākās devas, izmantojot šā pētījuma procedūras, nav izraisītas statistiski nozīmīgas reproduktīvo orgānu izmaiņas, nevajag ievadīt augstāku devu. Robeždevu izmanto, izņemot gadījumus, kur dati par cilvēku ekspozīciju liecina, ka ir jāizmanto augstāks devas līmenis.

Apsvērumi par diapazona noteikšanu

37.   Vajadzības gadījumā pirms tam dažiem dzīvniekiem var veikt diapazona noteikšanas priekšpētījumu, lai pareizi izraudzītos devu grupas [izmantojot akūtā toksiskuma noteikšanas metodes (šā pielikuma B.1.a un B.1.b sadaļa (27), ESAO Testēšanas norādījumi 425 (TG) (19))]. Heršbergera biotesta gadījumā mērķis ir izraudzīties tādas devas, lai dzīvnieki izdzīvotu un lai tiem nerastos ievērojama toksicitāte vai diskomforts, desmit dienas pēc kārtas ievadot ķīmisko vielu līdz robeždevai 1 000 mg/kg dienā, kā noteikts 35. un 36. punktā. Šajā saistībā var izmantot ESAO Norādījumu dokumentu (17), kurā noteiktas klīniskās pazīmes, kas liecina par dzīvnieku toksicitāti vai diskomfortu. Ja iespējams, minētajā diapazona noteikšanas pētījumā pēc tam, kad pārbaudāmā viela ir ievadīta desmit dienas, mērķaudus var izgriezt un nosvērt apmēram 24 stundas pēc pēdējās devas ievadīšanas. Pēc tam datus var izmantot, lai izraudzītos devas galvenajā pētījumā.

Ķīmiskās standartvielas un nesējviela

38.   Androgēna agonista standartviela ir testosterona propionāts (TP), CAS Nr. 57-82-5. TP standartvielas deva ir 0,2 mg uz kg no dzīvnieka svara dienā vai 0,4 mg uz kg no dzīvnieka svara dienā. Androgēna antagonista standartviela ir flutamīds (FT), CAS Nr. 1311-84-7. FT standartvielas deva ir 3 mg uz kg no dzīvnieka svara dienā, un FT ievada kopā ar TP standartvielas devu.

39.   Ja vien iespējams, ieteicams lietošanai izraudzīties šķīdumu/suspensiju uz ūdens bāzes. Bet tā kā daudzi androgēna ligandi vai to metaboliskie priekšteči ir hidrofobi, parasti izmanto eļļas (piemēram, kukurūzas, zemesriekstu vai sezama eļļas vai olīveļļas) šķīdumu/suspensiju. Testējamo ķīmisko vielu var izšķīdināt minimālā daudzumā 95 % etanola šķīduma vai cita atbilstoša šķīdinātāja un līdz galīgajai darba koncentrācijai atšķaidīt testa nesējvielā. Ir jāzina šķīdinātāja toksiskās īpašības, un tām jābūt testētām atsevišķā kontroles grupā, kurai izmanto tikai šķīdinātāju. Ja testējamā ķīmiskā viela ir stabila, tās šķīdināšanā var izmantot vieglu sildīšanu un spēcīgu mehānisku iedarbību. Ir jānosaka testējamās ķīmiskās vielas stabilitāte nesējvielā. Ja visu pētījuma laiku testējamā ķīmiskā viela ir stabila, var sagatavot vienu testējamās ķīmiskās vielas sākuma alikvotu un katru dienu sagatavot devas atšķaidījumus pēc specifikācijām, rīkojoties piesardzīgi, lai paraugus nekontaminētu un nesabojātu.

Devu ievadīšana

40.   TP ievada ar zemādas injekciju, un FT ievada ar mākslīgo barošanu.

41.   Testējamo ķīmisko vielu ievada, izmantojot mākslīgo barošanu vai zemādas injekciju. Izvēloties devas ievadīšanas ceļu, ir jāņem vērā dzīvnieku labturības apsvērumi un testējamās ķīmiskās vielas fizikālķīmiskās īpašības. Pirms sākt vērienīgu ilgtermiņa testēšanu gadījumā, ja ar injekciju iegūti pozitīvi rezultāti, ir jāņem vērā tādi toksikoloģiskie aspekti kā iespējamais cilvēka ekspozīcijas ceļš (piemēram, ar mākslīgo barošanu modelē vielas nonākšanu barības vadā, ar zemādas injekciju modelē ieelpošanu vai adsorbciju no ādas) un esošā toksikoloģiskā informācija un dati par metabolismu un kinētiku (piemēram, konkrēts ceļš dod iespēju izvairīties no priekšlaicīga metabolisma, nodrošina labāku efektivitāti).

42.   Dzīvniekiem devu ievada vienā veidā un ar vienādu laika intervālu desmit dienas pēc kārtas ik pēc apmēram 24 stundām. Devas līmeni katru dienu koriģē, ņemot vērā ķermeņa svaru, ko mēra katru dienu. Katru dienu dokumentē devas tilpumu un ekspozīcijas laiku. Jāraugās, lai nepārsniegtu maksimālo devu, kā noteikts 35. punktā, lai datus varētu statistiski interpretēt. Šajā ziņā ir rūpīgi jānovērtē ķermeņa svars, klīniskās pazīmes un citi konstatējumi. Ievadot vielu ar mākslīgo barošanu, izmanto kuņģa zondi vai piemērotu intubācijas kanulu. Maksimālais šķidruma daudzums, ko vienā reizē var ievadīt, ir atkarīgs no testa dzīvnieka lieluma. Ir jāievēro vietējie noteikumi dzīvnieku labturības jomā, taču tilpums nedrīkst pārsniegt 5 ml uz kg no ķermeņa svara, izņemot ūdens šķīdumus, ko var ievadīt 10 ml uz kg no ķermeņa svara. Attiecībā uz zemādas injekcijām devu ievada muguras, plecu vai jostasvietas zonā, izmantojot sterilu adatu (piemēram, 23. vai 25. izmērs) un turbekulīna šļirci. Injekcijas vietu var nenoskūt. Vielas zudumi, noplūdes injekcijas vietā vai nepilnīga devas ievadīšana ir jāreģistrē. Kopējais tilpums, ko injicē žurkai dienā, nedrīkst pārsniegt 0,5 ml uz kg ķermeņa svara.

Speciālās procedūras attiecībā uz androgēna agonistiem

43.   Ja pārbauda androgēna agonistus, nesējviela ir negatīvā kontrole, un grupa, kurai ievada TP, ir pozitīvā kontrole. Bioloģisko darbību, kas atbilst androgēna agonistiem, pārbauda, ievadot testējamās ķīmiskās vielas izraudzīto devu grupas dzīvniekiem 10 dienas pēc kārtas. Salīdzina piecu dzimumorgānu sistēmas akcesoro mērķaudu svaru testējamās ķīmiskās vielas grupām un nesējvielas grupai, lai konstatētu, vai vērojams statistiski nozīmīgs svara pieaugums.

Speciālās procedūras attiecībā uz androgēna antagonistiem un 5α reduktāzes inhibitoriem

44.   Ja testē androgēna antagonistus un 5α reduktāzes inhibitorus, grupa, kurai ievada TP, ir negatīvā kontrole, un grupa, kurai ievada arī TP un FT standartvielas devu, ir pozitīvā kontrole. Bioloģisko darbību, kas atbilst androgēna antagonistiem un 5α reduktāzes inhibitoriem, pārbauda, ievadot TP standartvielas devu un ievadot testējamo ķīmisko vielu 10 dienas pēc kārtas. Salīdzina piecu dzimumorgānu sistēmas akcesoro mērķaudu svaru grupām, kurām ievada TP un testējamo ķīmisko vielu, un grupai, kurai ievada tikai TP standartvielu, lai konstatētu, vai vērojams statistiski nozīmīgs svara samazinājums.

NOVĒROJUMI

Klīniskie novērojumi

45.   Vispārīgi klīniskie novērojumi ir jāveic vismaz reizi dienā un biežāk, ja ir konstatētas toksicitātes pazīmes. Novērojumi katru dienu jāizdara vienā un tai pašā laikā, ņemot vērā paredzamās ietekmes maksimuma laiku pēc devu došanas. Visi dzīvnieki jānovēro attiecībā uz mirstību, saslimstību un vispārīgām klīniskām pazīmēm, piemēram, izmaiņām uzvedībā, ādā, apmatojumā, acīs, gļotādā, attiecībā uz sekrēciju un izdalījumiem un veģetatīvo aktivitāti (piemēram, asarošanu, piloerekciju, acs zīlītes diametru un neraksturīgu elpošanu).

46.   Visus dzīvniekus, kas testēšanas laikā ir nobeigušies, izņem un likvidē, neveicot datu analīzi. Visi dzīvnieki, kas nobeigušies pirms autopsijas, ir jāiekļauj pētījuma dokumentējumos, norādot acīmredzamo nobeigšanās iemeslu. Visi mirstošie dzīvnieki ir humāni jānonāvē. Visi mirstoši un pēc tam humāni nonāvēti dzīvnieki ir jāiekļauj pētījuma ziņojumā, norādot acīmredzamo saslimstības iemeslu.

Ķermeņa svars un barības patēriņš

47.   Visi dzīvnieki jāsver katru dienu līdz tuvākajai 0,1 g vienībai, sākot ar brīdi tieši pirms pirmās devas ievadīšanas, t. i., kad dzīvnieki ir iedalīti grupās. Par izvēles mērījumu var izmantot arī barības patēriņu devu došanas laikā uz vienu būri, nosverot barības traukus. Barības patēriņa mērījumu rezultātus izsaka gramos uz vienu žurku dienā.

Secēšana un audu un orgānu svara noteikšana

48.   Apmēram 24 stundas pēc testējamās ķīmiskās vielas pēdējās ievadīšanas reizes žurkas humāni nonāvē un nolaiž asinis saskaņā ar standartprocedūru, kas ir spēkā attiecīgajā laboratorijā, un veic autopsiju. Humānās nonāvēšanas veids ir jādokumentē laboratorijas pārskatā.

49.   Ideālā gadījumā autopsija jāizdara pa grupām nejaušinātā kārtībā, lai secība nebūtu vienā vai otrā virzienā pa devu grupām, un tādējādi nebūtu nedaudz ietekmēti dati. Visi autopsijas rezultāti, t. i., patoloģiskas izmaiņas/skaidri redzami bojājumi, ir jāpieraksta un jānorāda pārskatā.

50.   Ir jānosver pieci androgēnatkarīgie audi (VP, SV, LABC, Kupera dziedzeris, GP). Minētos audus izgriež, tiem uzmanīgi nogriež liekos audus un taukus, un nosaka to jauno svaru (bez fiksācijas). Ar visiem audiem darbojas ļoti uzmanīgi, lai neiztecētu šķidrums un lai tie neizžūtu, kas var radīt ievērojamu kļūdu un mainību mazāka reģistrētā svara dēļ. Daži audi var būt ļoti mazi vai tos var būt grūti secēt, un tas var palielināt mainību. Tāpēc ir svarīgi, lai personas, kas veic dzimumorgānu sistēmas akcesoro mērķaudu secēšanu, pārzinātu attiecīgo audu secēšanas standartprocedūru. Standartoperāciju procedūru (SOP) rokasgrāmata, kurā aprakstīts, kā veikt secēšanu, ir pieejama ESAO (21). Precīzi ievērojot SOP norādījumus, pētījumā mazināsies variāciju iespēja. Ideālā gadījumā par attiecīgā veida audu secēšanu jābūt atbildīgam vienam prozektoram, lai audu apstrādes procesā nerastos individuālas atšķirības. Ja tas nav iespējams, autopsija jāplāno tā, lai katrs prozektors secētu viena veida audus visām devu grupām, nevis viens prozektors secētu visu veidu audus kontroles grupai, bet kāds cits – devu grupām. Visiem dzimumorgānu sistēmas akcesorajiem mērķaudiem nosaka natīvo svaru līdz tuvākajai 0,1 mg vienībai un to dokumentē.

51.   Daži audi var būt ļoti mazi vai tos var būt grūti secēt, un tas rada mainību. Pieredze liecina par variācijas koeficientu diapazonu, kas atšķiras atkarā no laboratorijas lietpratības. Dažreiz konkrētā laboratorijā var būt konstatētas dažu audu, piemēram, VP un Kupera dziedzera, absolūtā svara būtiskas atšķirības.

52.   Aknu, nieru un virsnieru svars ir neobligāti mērījumi. Arī šiem audiem ir jānogriež liekās fascijas un liekie tauki. Aknas nosver un svaru dokumentē līdz tuvākajai 0,1 g vienībai, un nieres un virsnieres nosver un svaru dokumentē līdz tuvākajai 0,1 mg vienībai. Uz aknām, nierēm un virsnierēm ne tikai iedarbojas androgēns, bet tās arī sniedz noderīgus sistēmiskās toksicitātes rādītājus.

53.   Seruma luteinizējošo hormonu (LH), folikulu stimulējošo hormonu (FSH) un testosteronu (T) mēra pēc izvēles. Seruma T līmeni ir svarīgi noteikt, ja testējamā ķīmiskā viela inducē testosterona metabolizēšanos aknās un samazina tā līmeni serumā. Ja T līmeni nenosaka, var izskatīties, ka tas notiek antiandrogēniska mehānisma ietekmē. Nosakot LH līmeni, var iegūt informāciju par antiandrogēna spēju ne tikai samazināt orgānu svaru, bet arī ietekmēt hipotalāma un hipofīzes funkcijas, kas ilgtermiņa pētījumā var radīt sēklinieku audzēju. FSH ir svarīgs spermatoģenēzes hormons. Seruma T4 un T3 mērījums arī ir neobligāti mērījumi, kas var sniegt noderīgu papildinformāciju par spēju traucēt vairogdziedzera hormona homeostāzi. Ja ir jāveic hormona mērījumi, pirms autopsijas žurkas iemidzina ar anestēziju, un, veicot sirds punktēšanu, nolaiž asinis, rūpīgi izvēloties anestēzijas veidu, lai tas neietekmētu hormona mērījumus. Jādokumentē seruma sagatavošanas veids, radioimunoloģiskā testa avots vai citi mērījumu komplekti, analīžu procedūras un rezultāti. LH līmeni dokumentē kā ng uz vienu mililitru seruma, un T arī izsaka ng uz vienu mililitru seruma.

54.   Audu secēšana ir aprakstīta turpmāk tekstā, sniedzot sīki izstrādātus secēšanas norādījumus ar fotogrāfijām, kas publicētas kā validācijas programmas papildu materiāls (21). Korejas Pārtikas un zāļu pārvaldes tīmekļa vietnē ir arī pieejams secēšanas video (22).

—	Dzīvniekam atrodoties guļus ar vēderu uz augšu, pārliecinās, vai dzimumlocekļa priekšāda ir atdalījusies no tā galviņas. Ja priekšāda ir atdalījusies, to atvelk un nogriež dzimumlocekļa galviņu, pēc tam to nosver (līdz tuvākajai 0,1 mg vienībai), un tās svaru reģistrē.

—

Atver vēdera ādu un sienu, lai var redzēt iekšējos orgānus. Ja ir paredzēts svērt orgānus, par kuriem mērījumi nav obligāti, aknas izgriež un nosver līdz tuvākajai 0,1 g vienībai, izgriež kuņģi un zarnas, izgriež un nieres un virsnieres un tās nosver līdz tuvākajai 0,1 g vienībai. Šādi secējot, kļūst redzams pūslis un var sākt tēviņu dzimumorgānu sistēmas akcesoro mērķaudu secēšanu.

—

Lai secētu VP, pūsli atdala no vēdera muskuļu slāņa, pa viduslīniju pārgriežot saistaudus. Uz priekšu virzienā uz sēklas pūslīšiem izņem urīnpūsli, atsedzot vēdera prostatas kreiso un labo puslodi (tās sedz tauku slānis). Uzmanīgi noņem taukus no vēdera prostatas labās un kreisās puslodes. Vēdera prostatas labo puslodi uzmanīgi atdala no urīnizvadkanāla un no tā nogriež. Joprojām pieturot vēdera prostatas labo puslodi, no urīnizvadkanāla uzmanīgi atdala vēdera prostatas kreiso puslodi un nogriež to no urīnizvadkanāla; nosver līdz tuvākajai 0,1 mg vienībai un svaru reģistrē.

—

Lai secētu SVCG, urīnpūsli izņem kaudāli, lai varētu redzēt sēklvadu, sēklas pūslīšu labo un kreiso puslodi un koagulācijas dziedzerus (SVCG). Lai šķidrums nenoplūstu, knaibles saspiež pie SVCG pamatnes, kur sēklvads savienojas ar urīnizvadkanālu. Uzmanīgi secē SVCG, kamēr knaibles ir saspiestas, nogriež taukus un liekos audus, ieliek SVCG svaru traukā, noņem knaibles un nosver līdz tuvākajai 0,1 mg vienībai, un svaru reģistrē.

—

Lai secētu LABC muskuļus, atklāj muskuļus un dzimumlocekļa pamatni. Tūpļa cēlājmuskulis (LA) ir aptinies ap lokzarnu, bet iekšējais tūpļa cēlājmuskulis un priekštelpas sīpola un briedumķermeņa muskulis (BC) ir savienoti ar dzimumlocekļa sēkliniekiem. Nogriež ādu un liekos audus, kas atrodas perianālajā daļā no dzimumlocekļa pamatnes līdz anālās atveres priekšējai daļai. BC muskuļus pakāpeniski nogriež no dzimumlocekļa sēkliniekiem un audiem. Lokzarnu pārgriež un tad var izgriezt un izņemt visu LABC. LABC nogriež taukus un liekos audus, nosver līdz tuvākajai 0,1 mg vienībai un svaru reģistrē.

—

Kad LABC ir izgriezti, pie dzimumlocekļa sēkliniekiem un mazliet uz aizmuguri ir redzami apaļie Kupera dziedzeri jeb urīnizvadkanāla sīpoliņa dziedzeri. Jāgriež uzmanīgi, lai netrāpītu plānajai kapsulai un lai neiztecētu šķidrums. Nosver Kupera dziedzerus līdz tuvākajai 0,1 mg vienībai, un svaru reģistrē.

—	Ja autopsijas vai secēšanas laikā no dziedzera iztek šķidrums, tas jāreģistrē.

55.   Ja ķīmiskās vielas izvērtēšanai secēšana ir jāveic vairāk dzīvniekiem, nekā vienā dienā, praktiski iespējams, pētījumu var sākt pakāpeniski divās secīgās dienās, un tādā gadījumā iespējama pakāpeniska autopsija un attiecīgie darbi divās dienās. Ja izmanto šādu pakāpeniskumu, vienā dienā izmanto pusi dzīvnieku no katras vielas ievadīšanas grupas.

56.   Pēc autopsijas dzīvnieku ķermeņus atbilstoši likvidē.

REZULTĀTI

Dati

57.   Datus pārskatā iekļauj par katru dzīvnieku (t. i., ķermeņa svars, dzimumorgānu sistēmas akcesoro audu svars, citi mērījumi un citas atbildes reakcijas un novērojumi) un par katru dzīvnieku grupu (visu veikto mērījumu vidējais rādītājs un standartnovirzes). Datus apkopo tabulā. Ir jānorāda dzīvnieku skaits testa sākumā, to dzīvnieku skaits, kas testa laikā ir nobeigušies, vai dzīvnieku skaits, kam novērotas toksicitātes pazīmes, un novēroto toksicitātes pazīmju apraksts, ieskaitot toksiskās ietekmes sākuma laiku, ilgumu un smagumu.

58.   Galīgajā pārskatā iekļauj šādu informāciju:

Testēšanas iekārta:

—	iekārtas nosaukums, atrašanās vieta,

—	pētījuma vadītājs un citi darbinieki un viņu pienākumi pētījumā,

—	pētījuma sākuma un beigu datums, t. i., attiecīgi testējamās ķīmiskās vielas ievadīšanas pirmā diena un autopsijas pēdējā diena.

Testējamā ķīmiskā viela:

—	avots, partijas/sērijas numurs, identitāte, tīrības pakāpe, testējamās(-o) ķīmiskās(-o) vielas(-u) piegādātāja pilna adrese un raksturojums,

—	fizikālās īpašības un attiecīgā gadījumā fizikālķīmiskās īpašības,

—	glabāšanas apstākļi un šķīdumu pagatavošanas veids un biežums,

—	jebkādi apkopotie dati par stabilitāti,

—	ievadāmā šķīduma/suspensijas analīze.

Nesējviela:

—	nesējvielas īpašības (identitāte, piegādātājs un partijas numurs),

—	nesējvielas izvēles pamatojums (ja nesējviela nav ūdens).

Testa dzīvnieki un dzīvnieku audzēšanas procedūras:

—	izmantotā suga/līnija un izvēles pamatojums,

—	dzīvnieku izcelsme vai piegādātājs, norādot pilnas adreses,

—	piegādāto dzīvnieku skaits un vecums,

—	turēšanas apstākļi (temperatūra, apgaismojums un citi parametri),

—	barība (nosaukums, veids, piegādātājs, partijas numurs, sastāvs un fitoestrogēna līmenis, ja zināms),

—	guļvietas (nosaukums, veids, piegādātājs, sastāvs),

—	būrī turēšanas apstākļi un dzīvnieku skaits vienā būrī.

Testa apstākļi:

—	dzīvnieka vecums kastrācijas brīdī un aklimatizācijas ilgums pēc kastrācijas,

—	katra dzīvnieka svars pētījuma sākumā (līdz tuvākajai 0,1 g vienībai),

—	nejaušināšanas process un dokumentēts iedalījums pa nesējvielas, standartvielas un testējamās ķīmiskās vielas grupām un būriem,

—	vidējais ķermeņa svars un standartnovirze katrā grupā katrā svēršanas dienā visu pētījuma laiku,

—	izraudzīto devu pamatojums,

—	testējamās ķīmiskās vielas ievadīšanas ceļš un ekspozīcijas ceļa izvēles pamatojums,

—	antiandrogenitātes pētījuma gadījumā TP ekspozīcija (deva un tilpums),

—	testējamās ķīmiskās vielas došana (deva un tilpums),

—	devas došanas laiks,

—	autopsijas procedūras, tostarp asiņu nolaišanas un anestēzijas veids,

—	ja veic seruma analīzi, ir jānorāda izmantotās metodes sīks izklāsts. Piemēram, izmantojot RIA, ir jāreģistrē RIA procedūra, RIA komplekta izcelsme, komplekta derīguma termiņš, scintilāciju skaitīšanas procedūra un standartizācija.

Rezultāti:

—	novērojumi attiecībā uz katru dzīvnieku katru dienu devas došanas laikā, tostarp:

—	ķermeņa svars (līdz tuvākajai 0,1 g vienībai),

—	klīniskās pazīmes (ja tādas ir),

—	jebkādi mērījumi vai piezīmes par barības patēriņu.

—	novērojumi attiecībā uz katra dzīvnieka autopsiju, arī:

—	autopsijas datums,

—	eksperimenta grupa,

—	dzīvnieka identifikācijas numurs,

—	prozektors,

—	autopsijas un secēšanas diennakts laiks,

—	dzīvnieka vecums,

—	galīgais ķermeņa svars autopsijas brīdī, reģistrējot jebkādu nozīmīgu pieaugumu vai samazinājumu,

—	asiņu nolaišanas un secēšanas secība autopsijas laikā,

—	to piecu mērķaudu svars, uz kuriem iedarbojas androgēns:

—	vēdera prostata (līdz tuvākajai 0,1 mg vienībai),

—	sēklas pūslīši un koagulācijas dziedzeri, tostarp šķidrums (pāros, līdz tuvākajai 0,1 mg vienībai),

—	LABC muskuļu komplekss (līdz tuvākajai 0,1 mg vienībai),

—	Kupera dziedzeri (svars bez fiksācijas – pāros, līdz tuvākajai 0,1 mg vienībai),

—	dzimumlocekļa galviņa (svars bez fiksācijas līdz tuvākajai 0,1 mg vienībai).

—	citu audu svars neobligātajos mērījumos:

—	aknas (līdz tuvākajai 0,1 mg vienībai),

—	nieres (pāros, līdz tuvākajai 0,1 mg vienībai),

—	virsnieres (pāros, līdz tuvākajai 0,1 mg vienībai),

—	vispārīgas piezīmes un komentāri,

—	seruma hormonu analīze, ja tāda veikta: — seruma LH (pēc izvēles – ng uz ml seruma), un — seruma T (pēc izvēles – ng uz ml seruma),

—	vispārējas piezīmes un komentāri.

Datu apkopojums

Datus apkopo tabulā, norādot katras grupas parauga izlases lielumu, vidējo vērtību un vidējās vērtības standarta kļūdu jeb standartnovirzi. Tabulā jānorāda ķermeņa svars autopsijas brīdī, ķermeņa svara izmaiņas no devu došanas pirmās dienas līdz autopsijai, dzimumorgānu sistēmas akcesoro mērķaudu svars un pēc izvēles – citu orgānu svars.

Rezultātu apspriešana

Rezultātu analīze

59.   Ķermeņa un orgānu svars autopsijas brīdī statistiski jāanalizē, lai noteiktu tādas īpašības kā dispersijas homogenitāte, vajadzības gadījumā norādot attiecīgas datu transformācijas. Vielas ievadīšanas grupas ir jāsalīdzina ar kontroles grupu, izmantojot tādas metodes kā ANOVA, un salīdzinot pārus (piemēram, Duneta vienpusējais tests), un statistisko atšķirību kritērijus, piemēram, p ≤ 0,05. Jāidentificē grupas, kurās ir konstatēts statistiskais nozīmīgums. Tomēr “orgānu relatīvais svars” nav jānorāda, jo šā datu apkopošanas veida pamatā ir nepareizi statistiski pieņēmumi.

60.   Testējot androgēna agonismu, par kontroli jāizmanto testa grupa, kurai dod tikai nesējvielu. Testējamās ķīmiskās vielas iedarbības veida īpašības audos var izraisīt dažādas relatīvās atbildes reakcijas, piemēram, trenbolons, uz kuru neiedarbojas 5α reduktāze, vairāk ietekmē LABC un GP, nekā TP. Ja attiecībā uz diviem vai vairāk no pieciem testā izmantotajiem audu veidiem (VP, LABC, GP, CG un SVCG) vērojams statistiski nozīmīgs svara pieaugums (p ≤ 0,05), uzskatāms, ka rezultāts attiecībā uz androgēna agonistu ir pozitīvs, turklāt zināms svara pieaugums ir jānovēro visos mērķaudos. Visu dzimumorgānu sistēmas akcesoro audu atbildes reakciju kopīgu izvērtējumu var sagatavot, izmantojot atbilstošu daudzveidīgu datu analīzi. Tas varētu uzlabot analīzes rezultātus, jo īpaši gadījumā, ja tikai vienam audu veidam ir novērota statistiski nozīmīga atbildes reakcija.

61.   Testējot androgēna antagonismu, par kontroli jāizmanto androgēna standartvielas (tikai testosterona propionāts) testa grupa. Testējamās ķīmiskās vielas iedarbības veida īpašības audos var izraisīt dažādas relatīvās atbildes reakcijas, piemēram, salīdzinājumā ar spēcīgiem AR antagonistiem, piem., flutamīdu, 5α reduktāzes inhibitori (piem., finasterīds) vairāk ietekmē vēdera prostatu, nekā citus audus. Ja attiecībā uz diviem vai vairāk no pieciem testā izmantotajiem audu veidiem (VP, LABC, GP, CG un SVCG) vērojams statistiski nozīmīgs svara samazinājums (p ≤ 0,05), kas korelē ar TP došanu, jau uzskatāms, ka rezultāts attiecībā uz androgēna antagonistu ir pozitīvs, turklāt zināms svara pieauguma samazinājums ir jānovēro visos mērķaudos. Visu dzimumorgānu sistēmas akcesoro audu atbildes reakciju kopīgu izvērtējumu var sagatavot, izmantojot atbilstošu daudzveidīgu datu analīzi. Tas varētu uzlabot analīzes rezultātus, jo īpaši gadījumā, ja tikai vienam audu veidam ir novērota statistiski nozīmīga atbildes reakcija.

62.   Datus apkopo tabulā, norādot vidējo vērtību, vidējās vērtības standartkļūdu (vai standartnovirzi) un katras grupas parauga izlases lielumu. Jāiekļauj arī individuālo datu tabulas. Kontroldatu individuālās vērtības, vidējo vērtību, SE (SD) un variācijas koeficienta vērtību pārbauda, lai noteiktu, vai tie atbilst noteiktiem kritērijiem attiecībā uz atbilstību paredzamajām vēsturiskajām vērtībām. Ja variācijas koeficients pārsniedz 1. tabulā katra orgāna svaram sniegtās variācijas koeficienta vērtības (sk. 25. un 26. punktu), tas var liecināt par kļūdām datu dokumentēšanā vai pierakstīšanā vai laboratorijas neprecizitātēm androgēnatkarīgu audu secēšanā, un ir nepieciešama turpmāka apmācība/prakse. Parasti variācijas koeficienti (standartnovirze, ko dala ar orgānu vidējo svaru) dažādās laboratorijās un dažādos pētījumos ir reproducējami. Apkopojot datus, ir jāiekļauj vismaz dati par: vēdera prostatu, sēklas pūslīšiem, tūpļa cēlājmuskuliun briedumķermeņa muskuli, Kupera dziedzeriem, dzimumlocekļa galviņu, aknām, ķermeņa svaru un ķermeņa svara izmaiņām no devu došanas pirmās dienas līdz autopsijai. Datus var apkopot arī pēc tam, kad ķermeņa svars ir koriģēts attiecībā uz kovariāciju, bet ir jāiesniedz arī nekoriģētie dati. Turklāt, ja nevienā grupā nav konstatēta preputiālā atdalīšanās, tad preputiālās atdalīšanās biežumu dokumentē un statistiski salīdzina ar kontroles grupu (ar Fisher Exact testu).

63.   Verificējot datorā reģistrēto datu precizitāti salīdzinājumā ar oriģinālajām datu lapām, orgānu svara vērtības, kas nav bioloģiski ticamas vai kas par vairāk nekā trīs standartnovirzes vērtībām atšķiras no attiecīgās eksperimenta grupas vidējā radītāja, ir rūpīgi jāpārbauda un iespējams, ka tie dokumentēšanas kļūdas dēļ ir jāatmet.

64.   Pētījuma rezultātu salīdzināšana ar ESAO variācijas koeficienta vērtībām (sk. 1. tabulu) parasti ir svarīgs solis pētījuma rezultātu derīguma interpretēšanā. Laboratorijā jāsaglabā agrāk iegūti dati par nesējvielas kontroles grupu. Laboratorijā ir jāsaglabā arī iepriekšēji dati par atbildes reakciju uz pozitīvu ķīmisko standartvielu, piemēram, TP un FT. Laboratorijā var regulāri testēt arī ietekmi uz zināmiem vājiem androgēnu agonistiem un antagonistiem un minētos datus saglabāt. Minētos datus var salīdzināt ar pieejamajiem ESAO datiem, lai nodrošinātu, ka laboratorijas metodes nodrošina pietiekamu statistisko precizitāti un nozīmību.

PIEZĪMES PAR REGULĒJUMU

1. piezīme.

Pievienošanās un aiziešana ir iespējama visos līmeņos, un tā ir atkarīga tikai no tā, kāda esošā informācija ir vajadzīga bīstamības un riska noteikšanai.

2. piezīme.

5. līmenī ekotoksikoloģijā jāiekļauj beigupunkti, kas norāda uz negatīvās ietekmes mehānismiem, un iespējamo kaitējumu populācijai.

3. piezīme.

Ja multimodāls modelis aptver vairākus testus, kas pastāv arī atsevišķi viena beigupunkta analīzei, minētos atsevišķa beigupunkta analīzes testus aizstāj ar šādu modeli.

4. piezīme.

Katra ķīmiskā viela katrā gadījumā jānovērtē atsevišķi, ņemot vērā visu pieejamo informāciju un regulējuma līmeņu funkcijas.

5. piezīme.

Šis regulējums pašlaik ir nepilnīgs. 3., 4. un 5. līmenī ir minētas analīzes, kas ir pieejamas vai kuras ir paredzēts apstiprināt tuvākajā laikā. Analīzes, kuras ir paredzēts apstiprināt, tiek iekļautas provizoriski. Tiklīdz tās būs pabeigtas un apstiprinātas, tās tiks oficiāli iekļautas šajā regulējumā.

6. piezīme.

5. līmenis neattiecas tikai uz galīgiem testiem. Minētajā līmenī iekļautie testi papildina vispārējo bīstamības un riska novērtējumu.

LITERATŪRA

(1)

OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.

(2)

Dorfman RI (1962). Standard methods adopted by official organization. Academic Press, NY.

(3)

Gray LE Jr, Furr J and Ostby JS (2005). Hershberger assay to investigate the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and antiandrogenic activity in castrate-immature male rats. Sk.: Current Protocols in Toxicology 16.9.1-16.9.15. J Wiley and Sons Inc.

(4)

OECD (2006). Final OECD report of the initial work towards the validation of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testosterone propionate and anti-androgenic effects of flutamide. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment No 62. ENV/JM/MONO(2006)30.

(5)

OECD (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and a 5α-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple Laboratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment No 86. ENV/JM/MONO(2008)3.

(6)

OECD (2007). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment No 73. ENV/JM/MONO(2007)20.

(7)

Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006). The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269.

(8)

Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob E (2007). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671-8.

(9)

Korenchevsky V (1932). The assay of testicular hormone preparations. Biochem J26:413-422.

(10)

Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932). The response of castrated male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem J26:1306-1314.

(11)

Eisenberg E, Gordan GS (1950). The levator ani muscle of the rat as an index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp Therap 99:38-44.

(12)

Eisenberg E, Gordan GS, Elliott HW (1949). Testosterone and tissue respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity. Endocrinology 45:113-119.

(13)

Hershberger L, Shipley E, Meyer R (1953). Myotrophic activity of 19-nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani muscle method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175-180.

(14)

Hilgar AG, Vollmer EP (1964). Endocrine bioassay data: Androgenic and myogenic. Washington DC: United States Public Health Service.

(15)

Dorfman RI (1969). Androgens and anabolic agents. In: Methods in Hormone Research, volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York:Academic Press, 151-220.

(16)

Massaro EJ (2002). Handbook of Neurotoxicology, volume I. New York: Humana Press, p 38.

(17)

OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.

(18)

OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development – Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Paris.

(19)

OECD (2008). Acute oral toxicity – up-and-down procedure. OECD Guideline for the testing of chemicals No 425.

(20)

OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4.

(21)

Supplemental materials for Owens et al. (2006). The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269. See, section II, The dissection guidance provided to the laboratories: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf.

(22)

Korea Food and Drug Administration. Visual reference guide on Hershberger assay procedure, including a dissection video. http://rndmoa.kfda.go.kr/endocrine/reference/education_fr.html.

(23)

OECD (2008). Background Review Document on the Rodent Hershberger Bioassay. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17.

(24)

OECD (2008). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling Male Rat Version of the Hershberger Bioassay.

(25)

OECD (2009). Guidance Document on the Weanling Hershberger Bioassay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic properties. Series on Testing and Assessment, Number 115.

(26)

Eiropas Parlamenta un Padomes 2010. gada 22. septembra Direktīva 2010/63/ES par zinātniskiem mērķiem izmantojamo dzīvnieku aizsardzību. OV L 276, 20.10.2010., 33. lpp.

(27)

Šā pielikuma nodaļas:   B.1.a. nodaļa “Akūts perorāls toksiskums – fiksētās devas metode”   B.1.b. nodaļa “Akūts perorāls toksiskums – akūta toksiskuma klases metode”

B.56.   PAPLAŠINĀTAIS VIENAS PAAUDZES REPRODUKTĪVĀS TOKSICITĀTES PĒTĪJUMS

IEVADS

1.   Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (TG) 443 (2012. gads). Tās pamatā ir Starptautiskā dabaszinātņu institūta (ILSI), Veselības un vides zinātnes institūta (HESI), Lauksaimniecības ķīmiskās drošības novērtēšanas (ACSA) tehniskās komitejas priekšlikums par F1 dzīves cikla paplašināto vienas paaudzes reproduktīvās sistēmas pētījumu, kas publicēts Cooper et al., 2006 (1). Ir veikti vairāki pētījuma plāna uzlabojumi un skaidrojumi, lai nodrošinātu elastīgumu un uzsvērtu nozīmi, kāda ir esošo zināšanu izmantošanai sākumposmā, vienlaicīgi papildinot tās ar novērojumiem dzīves laikā, lai vadītu un pielāgotu testēšanu. Šī testēšanas metode sniedz sīki izstrādātu aprakstu par paplašinātā vienas paaudzes reproduktīvās toksicitātes pētījuma darbības vadību. Testēšanas metodē ir aprakstītas F1 dzīvnieku trīs kohortas:

1. kohorta: tiek novērtēti reproduktīvie/attīstības beigupunkti; šo kohortu drīkst paplašināt, lai iekļautu F2 paaudzi,

2. kohorta: tiek novērtēta ķīmisko vielu iedarbības iespējamā ietekme uz nervu sistēmu attīstības stadijā,

3. kohorta: tiek novērtēta ķīmisko vielu iedarbības iespējamā ietekme uz imūnsistēmu attīstības stadijā.

2.   Lēmumi par to, vai novērtēt otro paaudzi un izlaist ontoģenēzes neirotoksicitātes kohortu un/vai ontoģenēzes imūntoksicitātes kohortu, jābalsta uz esošajām zināšanām par vērtējamo ķīmisko vielu, kā arī dažādu regulatīvo iestāžu vajadzībām. Testēšanas metodes mērķis ir sniegt informāciju par to, kā pētījumu var vadīt, un noteikt, kā ir jāizvērtē katra kohorta.

3.   Procedūra, saskaņā ar kuru ierosina lēmumu par otro paaudzi, aprakstīta ESAO Norādījumu dokumentā Nr. 117 (39) tām regulatīvajām iestādēm, kuras šos lēmumus izmanto.

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN MĒRĶI

4.   Paplašinātā vienas paaudzes reproduktīvās toksicitātes pētījuma galvenais mērķis ir izvērtēt konkrētus dzīves ciklus, kuri nav ietverti citu veidu toksicitātes pētījumos, un testēt ietekmi, kas var rasties, pakļaujot prenatālai un postnatālai ķīmiskās vielas iedarbībai. Attiecībā uz reproduktīviem beigupunktiem paredzēts, ka, pirmkārt un ja ir pieejama, tiek izmantota informācija, kas gūta atkārtotas devas pētījumos (tostarp reproduktīvās toksicitātes skrīninga pētījumos, piemēram, ESAO TG 422 (32)) vai endokrīnās sistēmas traucējumu īsā skrīninga testos (piemēram, uterotrofiskajā testā, B.54. testēšanas metode (36) un Heršbergera testā, B.55. testēšanas metode (37)), lai noteiktu ietekmi uz vīrišķajiem un sievišķajiem reproduktīvajiem orgāniem. Tā varētu aptvert spermatoģenēzi (sēklinieku histopatoloģija) tēviņiem un estrālos ciklus, folikulu skaitu/olšūnas nobriešanu un olnīcu integritāti (histopatoloģija) mātītēm. Paplašināto vienas paaudzes reproduktīvās toksicitātes pētījumu izmanto kā reproduktīvo beigupunktu testu, kura laikā jānotiek mijiedarbībai starp tēviņu un mātīti, mātīti un apaugļošanas produktu un mātīti un pēcnācējiem un F1 paaudzi līdz dzimumbriedumam (sk. ESAO Norādījumu dokumentu Nr. 151, kurā šī testēšanas metode pamatota (40)).

5.   Testēšanas metode ir izstrādāta, lai gūtu izvērtējumu par ķīmisko vielu ietekmi uz prenatālo un postnatālo attīstību, kā arī grūsnu un barojošu māšu un jaunu un pieaugušu pēcnācēju sistēmiskās toksicitātes pilnīgu novērtējumu. Gaidāms, ka sīki izmeklējumi par galvenajiem attīstības beigupunktiem, piemēram, pēcnācēju dzīvotspēju, jaundzimušo veselību, attīstības stāvokli atnešanās brīdī, fizisko un funkcionālo attīstību līdz pieaugušam vecumam, palīdzēs noteikt konkrētus pēcnācēju mērķorgānus. Turklāt pētījums sniegs un/vai apstiprinās informāciju par testējamās ķīmiskās vielas ietekmi uz pieaugušas vīrišķās un sievišķās reproduktīvās sistēmas integritāti un darbību. Papildus citiem īpaši tiek aplūkoti šādi parametri: gonādu funkcija, estrālais cikls, spermas nobriešana sēklinieku piedēkļos, uzvedība pārošanās laikā, apaugļošanās, grūtniecība, atnešanās un laktācija. Turklāt informācija, kas iegūta no ontoģenēzes neirotoksicitātes un ontoģenēzes imūntoksicitātes novērtējumiem, raksturos iespējamo ietekmi uz minētajām sistēmām. Šajos testos iegūtie dati ir jāizmanto, lai noteiktu nenovērojamās nelabvēlīgas ietekmes līmeņus (NOAEL), zemākos novērojamās nelabvēlīgās ietekmes līmeņus (LOAEL) un/vai etalondevas attiecībā uz dažādiem beigupunktiem un/vai lai raksturotu iepriekšējos atkārtotas devas pētījumos konstatēto ietekmi, un/vai tie ir jāizmanto kā rokasgrāmata turpmākajā testēšanā.

6.   1. attēlā parādīts shematisks protokola attēlojums. Testējamā ķīmiskā viela pakāpeniskās devās tiek pastāvīgi ievadīta vairākām dzimumbriedumu sasniegušu tēviņu un mātīšu grupām. Šī vecākpaaudze (P) saņem devu noteiktā pirmspārošanas periodā (ko izvēlas, pamatojoties uz pieejamo informāciju par testējamo ķīmisko vielu, bet tas ir vismaz divas nedēļas) un divu nedēļu ilga pārošanas perioda laikā. P tēviņiem viela tiek turpmāk ievadīta vismaz līdz F1 atšķiršanai. Tas jādara vismaz 10 nedēļas. Vielu var ievadīt arī ilgāk, ja ir jānoskaidro ietekme uz reproduktīvajām spējām. Vielas ievadīšana P mātītēm tiek turpināta grūtniecības un laktācijas periodā līdz likvidēšanai pēc atšķiršanas no metieniem (t. i., 8–10 devu došanas nedēļas). F1 pēcnācējiem testējamo ķīmisko vielu joprojām ievada pēc atšķiršanas, līdz dzīvnieki ir pieauguši. Ja tiek novērtēta otrā paaudze (sk. ESAO Norādījumu dokumentu Nr. 117 (39)), F1 pēcnācējiem turpinās ievadīt vielu līdz F2 atšķiršanai vai līdz pētījuma beigām.

7.   Klīniskie novērojumi un patoloģiju izmeklējumi tiek veikti visiem dzīvniekiem attiecībā uz toksicitātes pazīmēm, īpašu uzsvaru liekot uz vīrišķās un sievišķās reproduktīvās sistēmas integritāti un darbību, kā arī pēcnācēju veselību, augšanu, attīstību un funkcijām. Atšķiršanas brīdī izraudzītie pēcnācēji tiek iedalīti noteiktās apakšgrupās (1.–3. kohorta, sk. 33. un 34. punktu un 1. attēlu), lai veiktu turpmāku izpēti, tostarp lai pētītu dzimumbriedumu, reproduktīvo orgānu integritāti un darbību, neiroloģiskos un uzvedības beigupunktus un imūnfunkcijas.

8.   Veicot pētījumu, ir jāievēro galvenie principi un apsvērumi, kas noteikti ESAO Norādījumu dokumentā Nr. 19 par klīnisko pazīmju atpazīšanu, novērtēšanu un izmantošanu par humānajiem beigupunktiem eksperimenta dzīvniekiem, kurus izmanto drošības novērtējumā (34).

9.   Kad būs pieejams pietiekams pētījumu daudzums, lai varētu pārliecināties par šā jaunā pētījuma plāna ietekmi, testēšanas metode tiks pārskatīta, un vajadzības gadījumā to pārstrādās, ņemot vērā gūto pieredzi.

1. attēls

Paplašināta vienas paaudzes reproduktīvās toksicitātes pētījuma shēma

METODES APRAKSTS/APRAKSTS PAR SAGATAVOŠANOS TESTAM

Dzīvnieki

Dzīvnieku sugas un līnijas izvēle

10.   Sugas izvēle reproduktīvās toksicitātes testēšanai ir rūpīgi jāapsver, balstoties uz pieejamo informāciju. Tomēr, ņemot vērā pamatdatus un vispārīgās toksicitātes testu salīdzināmību, parasti priekšroka tiek dota žurkām, un šajā testēšanas metodē minētie kritēriji un ieteikumi attiecas uz šo sugu. Ja tiek izmantotas citas sugas, ir jāsniedz pamatojums un būs jāveic attiecīgi grozījumi protokolā. Nedrīkst izmantot līnijas ar zemu auglību vai bieži sastopamiem spontāniem attīstības defektiem.

Vecums, ķermeņa svars un iekļaušanas kritēriji

11.   Ir jāizmanto veseli vecākdzīvnieki, kuriem iepriekš nav veiktas eksperimentālas procedūras. Ir jāpēta gan tēviņi, gan mātītes un jāizvēlas mātītes, kas nav dzemdējušas un nav grūsnas. P dzīvniekiem ir jābūt sasniegušiem dzimumbriedumu, ar vienādu svaru (dzimuma ietvaros) devu došanas sākumā, vienādā vecumā (aptuveni 90 dienas) pārošanas laikā un tiem jābūt reprezentatīviem pētāmajai sugai un līnijai. Pēc ierašanās dzīvniekiem vismaz 5 dienas ir jāaklimatizējas. Dzīvnieki tiek nejaušināti iedalīti kontroles un vielas ievadīšanas grupās tādā veidā, lai vidējās ķermeņa svara vērtības starp grupām būtu salīdzināmas (t. i., ± 20 % no vidējās vērtības).

Turēšanas un barošanas nosacījumi

12.   Temperatūrai eksperimentālo dzīvnieku turēšanas telpā jābūt 22 °C (± 3 °). Relatīvajam mitrumam jābūt 30–70 % robežās ar ideālo diapazonu 50–60 % robežās. Dzīvniekus 12 stundas diennaktī tur mākslīgā apgaismojumā, bet 12 stundas tumsā. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu piekļuvi dzeramajam ūdenim. Ir jāpievērš uzmanība barības fitoestrogēna saturam, jo augsts fitoestrogēna līmenis barībā varētu ietekmēt dažus reproduktīvos beigupunktus. Tiek ieteikta standarta, parasta barība, kurā estrogēnu ķīmisko vielu līmenis ir samazināts (2) (30). Barības izvēli var ietekmēt vajadzība nodrošināt piemērotu testējamās ķīmiskās vielas piejaukumu, ievadot to saskaņā ar šo metodi. Ir jāverificē testējamās ķīmiskās vielas saturs, homogenitāte un stabilitāte barībā. Barība un dzeramais ūdens ir regulāri jāanalizē attiecībā uz piesārņojumu. Pētījumā izmantotās barības katras partijas paraugi ir jāglabā atbilstošos apstākļos (piemēram, sasaldēta –20 °C temperatūrā) līdz pārskata pabeigšanai gadījumā, ja rezultāti nosaka, ka jāanalizē barības sastāvdaļas.

13.   Dzīvnieki ir jātur būros mazās viendzimuma grupās, kas pieder vienai un tai pašai vielas ievadīšanas grupai. Tos drīkst turēt atsevišķi, lai izvairītos no iespējamiem ievainojumiem (piemēram, tēviņus pēc pārošanas perioda). Pārošanas procedūras ir jāveic piemērotos būros. Pēc kopulācijas mātītes, kuras uzskata par grūsnām, tiek turētas atsevišķi atnešanās vai maternitātes būros, kuros tiek nodrošināts piemērots un noteikts migas veidošanas materiāls. Metieni līdz atšķiršanai tiek turēti ar mātēm. F1 dzīvnieki ir jātur mazās grupās viena dzimuma un vielas ievadīšanas grupas ietvaros no atšķiršanas līdz izmēģinājuma beigām. Ja tam ir zinātnisks pamatojums, dzīvniekus var turēt atsevišķi. Fitoestrogēnu līmenim izraudzītajā migas veidošanas materiālā ir jābūt minimālam.

Dzīvnieku skaits un identifikācija

14.   Parasti katrā testa un kontroles grupā jābūt pietiekamam daudzumam pārošanai paredzētu pāru, lai iegūtu 20 grūsnas mātītes katrā devas grupā. Mērķis ir nodrošināt pietiekamu daudzumu grūsnu mātīšu, lai varētu ticami izvērtēt ķīmiskās vielas ietekmes potenciālu attiecībā uz P paaudzes dzīvnieku auglību, grūsnību un mātišķo dzīvnieku uzvedību, kā arī uz F1 pēcnācēju augšanu un attīstību no aizmešanās līdz nobriešanai. Nespēja iegūt pietiekamu skaitu grūsnu dzīvnieku obligāti nepadara pētījumu par nederīgu, un tas ir jāvērtē katrā gadījumā atsevišķi, ņemot vērā iespējamo cēloņsakarību ar testējamo ķīmisko vielu.

15.   Katram P dzīvniekam tiek piešķirts unikāls identifikācijas numurs, pirms tam sāk devu došanu. Ja laboratorijas vēsturiskajos datos norādīts, ka lielai daļai mātīšu nav regulāra (4 vai 5 dienas) estrālā cikla, pirms vielas ievadīšanas sākuma iesaka veikt estrālā cikla novērtējumu. Kā alternatīvu piedāvā grupas palielināšanu, lai nodrošinātu, ka vielas ievadīšanas sākumā vismaz 20 mātītēm katrā grupā ir regulārs (4 vai 5 dienas) estrālais cikls. Visiem F1 pēcnācējiem piešķir unikālas identifikācijas zīmes brīdī, kad jaundzimušos pirmo reizi izmeklē 0. vai 1. dienā pēc piedzimšanas. Visā pētījuma periodā reģistrācija, kas norāda izcelsmes metienu, ir jāizdara par visiem atlasītajiem F1 dzīvniekiem un vajadzības gadījumā F2 dzīvniekiem.

Testējamā ķīmiskā viela

Pieejamā informācija par testējamo ķīmisko vielu

16.   Liela nozīme ir esošās informācijas pārskatam, lai pieņemtu svarīgus lēmumus par ievadīšanas ceļu, nesējvielas izvēli, dzīvnieku sugu atlasi, devu atlasi un iespējamām izmaiņām devu došanas grafikā. Tāpēc, plānojot paplašināto vienas paaudzes reproduktīvās toksicitātes pētījumu, ir jāņem vērā visa pieejamā informācija par testējamo ķīmisko vielu, t. i., fizikālķīmiskās īpašības, toksikokinētiskie dati (tostarp sugai raksturīgais metabolisms), toksikodinamiskās īpatnības, sakarība starp struktūru un aktivitāti (SAR), in vitro metoboliskie procesi, iepriekšējo toksicitātes pētījumu rezultāti un attiecīgā informācija par strukturālajiem analogiem. Sākotnējo informāciju par uzsūkšanos, izplatīšanos, metabolismu un izdalīšanos (ADME) un bioloģisko uzkrāšanos var iegūt no ķīmiskās struktūras, fizikālajiem un ķīmiskajiem datiem, spējas saistīt plazmas olbaltumvielu vai toksikokinētisko datu (TK) pētījumiem, vienlaicīgi toksicitātes pētījumu rezultāti dod papildu informāciju, piemēram, par NOAEL, metabolismu vai metabolisko aktivāciju.

Toksikokinētisko datu izskatīšana

17.   Lai gan TK dati, kas iegūti iepriekš veiktu devu diapazona noteikšanas vai citu pētījumu rezultātā, nav obligāti jāizmanto, tie ir ārkārtīgi noderīgi, veidojot pētījuma plānu, izvēloties devas un interpretējot rezultātus. Īpaši lietderīgi ir dati, ar kuriem: 1) pārbauda testējamās ķīmiskās vielas (vai citu metabolītu) iedarbību uz augli un mazuli attīstības stadijā; 2) sniedz iekšēji uzņemto devu aplēsi un 3) novērtē kinētisko procesu no devas atkarīgo iespējamo piesātinājumu. Ja tie ir pieejami, jāizskata arī papildu TK dati, piemēram, metabolītu profili, koncentrācijas un laika līknes. Var savākt arī papildu TK datus pamatpētījuma laikā, ja tas netraucē vākt un interpretēt pamatpētījuma beigupunktus.

Vispārīgi, lai plānotu paplašināto vienas paaudzes reproduktīvās toksicitātes pētījumu, būru noderīgi šādi TK dati:

—	vēla grūsnība (piemēram, 20. grūsnības diena) – mātītes asinis un augļa asinis,

—	laktācijas vidusposms (10. diena pēc piedzimšanas) – mātītes asinis, mazuļa asinis un/vai piens,

—	pēcatšķiršanas agrīnais posms (piemēram, 28. diena pēc piedzimšanas) – atšķirtā mazuļa asins paraugs.

Īpašu analītu (piemēram, sākotnējā ķīmiskā viela un/vai metabolīti) un paraugu ņemšanas shēma ir jānosaka, izmantojot elastīgu pieeju. Piemēram, attiecīgā paraugu ņemšanas dienā savācamo paraugu skaits un vākšanas laiks būs atkarīgs no iedarbības veida un iepriekšējām zināšanām par TK īpatnībām, kas novērotas mātītēm, kuras nav grūsnas. Attiecībā uz pētījumiem ar barību paraugu ņemšana vienā konkrētā laikā katru dienu ir pietiekama, bet mākslīgas barošanas gadījumā devu došanai var būt nepieciešami papildu paraugu ņemšanas laiki, lai iegūtu labāku aplēsi par iekšēji uzņemto devu diapazonu. Tomēr nevienā no paraugu ņemšanas dienām nav jāveido pilnīga koncentrācijas un laika līkne. Vajadzības gadījumā asinis var apkopot pa dzimumiem metienos, lai veiktu augļa un jaundzimušo analīzi.

Ievadīšanas ceļš

18.   Izvēloties ievadīšanas ceļu, jāņem vērā tas (tie) ceļš(-i), kas ir visvairāk saistīts(-i) ar cilvēka ekspozīciju. Lai gan protokols ir izstrādāts, lai testējamo ķīmisko vielu ievadītu ar barību, to var mainīt uz citu ievadīšanas ceļu (dzeramais ūdens, mākslīga barošana, ieelpošana, caur ādu) atkarībā no ķīmiskās vielas īpašībām un prasītās informācijas.

Nesējvielas izvēle

19.   Vajadzības gadījumā testējamā ķīmiskā viela tiek izšķīdināta vai suspendēta piemērotā nesējvielā. Ja vien iespējams, ieteicams lietošanai izraudzīties šķīdumu/suspensiju uz ūdens bāzes, kā otro variantu izskatot šķīdumu/suspensiju uz eļļas bāzes (piemēram, kukurūzas eļļa). Attiecībā uz citām nesējvielām, kas nav ūdens, ir jāzina to toksiskās īpašības. Nevajag izvēlēties iespējami toksiskas nesējvielas (piemēram, acetons, DMSO). Ir jānosaka testējamās ķīmiskās vielas stabilitāte nesējvielā. Ja nesējviela vai cita piedeva tiek izmantota, lai būtu vieglāk iedot devu, ir jāapsver šādas īpašības: ietekme uz uzsūkšanos, izplatīšanos, metabolismu vai testējamās ķīmiskās vielas aizturi; ietekme uz testējamās ķīmiskās vielas ķīmiskajām īpašībām, kuras var mainīt tās toksiskās īpašības; un ietekme uz barības un ūdens patēriņu vai dzīvnieku barojumu.

Devas izvēle

20.   Parasti pētījumā jāietver vismaz trīs dažādi devu līmeņi un to vienlaicīga kontrole. Izvēloties piemērotus devas līmeņus, pētītājam jāņem vērā visa pieejamā informācija, tostarp informācija par devu došanu iepriekšējos pētījumos, TK dati par dzīvniekiem, kuri ir vai nav grūsni, laktācijas ceļā nodotais vielas daudzums un skaitliskais novērtējums par cilvēka ekspozīciju. Ja ir pieejami TK dati, kas liecina, ka TK procesos vērojams no devas atkarīgs piesātinājums, ir jācenšas izvairīties no lielām devām, kuras nepārprotami liecina par piesātinājumu, ja gaidāms, ka cilvēka ekspozīcija būs ievērojami zemāka par piesātinājuma punktu. Šādos gadījumos augstākās devas līmenis atrodas vai nu liekuma punktā pārejā uz TK īpašību nelinearitāti, vai nedaudz virs minētā punkta.

21.   Ja nav attiecīgu TK datu, deva ir jāizvēlas, pamatojoties uz toksisko ietekmi, ja to neierobežo testējamās ķīmiskās vielas fizikālķīmiskās īpašības. Ja devas līmeņus izraugās, balstoties uz toksicitāti, visaugstākā deva ir jāizvēlas, lai izraisītu nevis dzīvnieka nāvi vai smagas ciešanas, bet sistēmisku toksicitāti.

22.   Devu līmeņi to samazinājuma virzienā jāizraugās, lai parādītu ar devu saistīto ietekmi, noteiktu NOAEL vai izraudzītos noteikšanas robežai tuvas devas, kas varētu palīdzēt noteikt etalondevu visjutīgākajam(-iem) beigupunktam(-iem). Lai izvairītos no lieliem devu intervāliem starp NOAEL un LOAEL, visbiežāk par optimālu uzskata divkāršu vai četrkāršu intervālu. Bieži vien ir ieteicamāk pievienot ceturto devu grupu, nevis izmantot ļoti plašu devu intervālu (piemēram, vairāk nekā 10 reizes).

23.   Ar kontroles grupas(-u) dzīvniekiem jārīkojas tāpat kā ar testa grupas dzīvniekiem, atšķiras tikai testējamās ķīmiskās vielas ievadīšana. Šai grupai nav jābūt saņēmušai vielu vai jābūt placebo saņēmējai, vai nesējvielas kontroles grupai, ja testējamās ķīmiskās vielas ievadīšanai izmanto nesējvielu. Ja tiek izmantota nesējviela, kontroles grupai jāsaņem lielākais izmantotais nesējvielas tilpums.

Pieļaujamā daudzuma tests

24.   Ja atkārtotas devas pētījumi nav liecinājuši par toksicitāti ar devas līmeni vismaz 1 000 mg uz kg ķermeņa svara dienā vai ja, pamatojoties uz tādiem datiem par strukturāli un/vai metaboliski saistītām ķīmiskām vielām, kas liecina par līdzīgām in vivo/in vitro metaboliskām īpatnībām, toksicitāte nebūtu gaidāma, iespējams, nav vajadzīgs pētījums ar vairākiem devu līmeņiem. Šādos gadījumos paplašināto vienas paaudzes reproduktīvās toksicitātes pētījumu varētu veikt, izmantojot kontroles grupu un vienu devu vismaz 1 000 mg uz kg ķermeņa svara dienā. Tomēr, ja ar šādu robeždevu tiek konstatētas reproduktīvās vai ontoģenēzes toksicitātes liecības, jāveic turpmāki pētījumi ar mazākām devām, lai konstatētu NOAEL. Šos apsvērumus par pieļaujamā daudzuma testu izmanto tikai tad, ja cilvēka ekspozīcija neliecina, ka deva jāpalielina.

PROCEDŪRAS

Iedarbība uz pēcnācējiem

25.   Vēlamais paņēmiens ir ievadīšana uz barību. Attiecībā uz mākslīgas barošanas pētījumiem ir jāņem vērā, ka parasti līdz atšķiršanas brīdim, kad mazuļiem sāks dot devu tieši, tie saņems testējamo ķīmisko vielu tikai netieši, ar pienu. Barības vai dzeramā ūdens pētījumos mazuļi papildus saņems testējamo ķīmisko vielu tieši, kad tie laktācijas perioda pēdējā nedēļā sāks ēst paši. Ja testējamās ķīmiskās vielas izdalīšanās pienā ir neliela un ja trūkst pierādījumu par nepārtrauktu mazuļu eksponēšanu, jāapsver, vai pētījuma plānā neizdarīt izmaiņas. Šajos gadījumos, pamatojoties uz pieejamo TK informāciju, pēcnācēju toksicitāti vai biomarķieru izmaiņām, ir jāapsver tieša devas došana mazuļiem laktācijas periodā (3)(4). Pirms uzsākt pētījumus ar tiešu devu došanu zīdāmiem mazuļiem, ir rūpīgi jāapsver to priekšrocības un trūkumi (5).

Devu došanas grafiks un devu ievadīšana

26.   Iespējams, ka ir pieejama informācija par estrāliem cikliem, vīrišķās un sievišķās reproduktīvās sistēmas histopatoloģiju un sēklinieku/sēklinieku piedēkļu spermas analīzi, kas iegūta iepriekšējo pietiekami ilgu atkārtotas devas toksicitātes pētījumu laikā. Paplašinātā vienas paaudzes reproduktīvās toksicitātes pētījumā vielas ievadīšanas ilgumam pirms pārošanas jābūt tādam, lai varētu noteikt ietekmi uz funkcionālām izmaiņām, kuras var kavēt pārošanās uzvedību un apaugļošanos. Vielas ievadīšanai pirms pārošanas jābūt pietiekami ilgai, lai sasniegtu ilgstošas ekspozīcijas apstākļus P tēviņiem un mātītēm. Vairumā gadījumu par pietiekamu uzskata divu nedēļu ilgu vielas ievadīšanu abiem dzimumiem pirms pārošanas. Attiecībā uz mātītēm tas ietver 3–4 pilnus estrālos ciklus, un ar to jāpietiek, lai noteiktu jebkādu nelabvēlīgu ietekmi uz cikliskumu. Attiecībā uz tēviņiem tas līdzinās laikam, kas vajadzīgs, lai nobrieduši spermotozoīdi izietu no sēklinieku piedēkļiem, un šajā laikā jāvar konstatēt sēkliniekos radušos ietekmi uz spermu (spermas veidošanās un spermas nobriešanas spermas piedēkļos pēdējos posmos) pārošanas laikā. Pētījuma beigās, kad ir paredzēta sēklinieku un sēklinieku piedēkļu histopatoloģija un spermas parametru analīze, P un F1 tēviņi būs eksponēti vismaz vienu pilnu spermatoģenēzes ciklu (6) (7) (8) (9), sk. ESAO Norādījumu dokumentu Nr. 151 (40).

27.   Pirmspārošanas ekspozīcijas scenārijus tēviņiem var koriģēt, ja sēklinieku toksicitāte (spermatoģenēzes pasliktināšanās) vai ietekme uz spermas integritāti un darbību ir skaidri konstatēta iepriekšējos pētījumos. Līdzīgi dažādus pirmspārošanas ekspozīcijas scenārijus var pamatot attiecībā uz mātītēm, kur zināma testējamās ķīmiskās vielas ietekme uz estrālo ciklu un tādējādi uz to seksuālo atbildes reakciju. Īpašos gadījumos ir pieņemams, ka vielas ievadīšanu P mātītēm uzsākt tikai pēc tam, kad saņemta uztriepe ar pozitīvu reakciju uz spermu (sk. ESAO Norādījumu dokumentu Nr. 151 (40)).

28.   Kad ir noteikts pirmspārošanas devu došanas periods, dzīvniekiem testējamā ķīmiskā viela jāsaņem nepārtraukti 7 dienas nedēļā līdz autopsijai. Visiem dzīvniekiem devas jādod ar vienu un to pašu paņēmienu. Devu došana jāturpina 2 nedēļu ilgā pārošanas perioda laikā un attiecībā uz P mātītēm visā grūsnības un laktācijas periodā līdz to likvidēšanai pēc atšķiršanas. Tēviņiem viela jādod tādā pašā veidā līdz to likvidēšanai laikā, kad F1 dzīvnieki tiek atšķirti. Autopsiju pirmajām veic mātītēm, kurām autopsija ir jāveic vienā un tajā pašā laktācijas dienā vai tuvu tai. Tēviņu autopsiju var veikt vairākas dienas atkarībā no laboratorijas iespējām. Ja vien tieša devas došana nav sākta jau laktācijas periodā, izraudzītajiem F1 tēviņiem un mātītēm tā jāsāk atšķiršanas brīdī un atkarībā no iedalījuma kohortā jāturpina līdz paredzētajai autopsijai,.

29.   Attiecībā uz ķīmiskajām vielām, kas ievadītas ar barību vai dzeramo ūdeni, ir svarīgi pārliecināties, ka testējamās ķīmiskās vielas daudzums netraucē normālu barības uzņemšanu vai un ūdens līdzsvaru. Ja testējamā ķīmiskā viela tiek ievadīta ar barību, var izmantot vai nu nemainīgu tās koncentrāciju barībā (milj. daļas), vai nemainīgu devas līmeni attiecībā pret dzīvnieka ķermeņa svaru; izvēlētais risinājums ir jānorāda.

30.   Ja testējamo ķīmisko vielu ievada ar mākslīgo barošanu, ievadītā šķidruma tilpums vienā reizē nedrīkst pārsniegt 1 ml uz 100 g ķermeņa svara (maksimālais eļļas daudzums, piemēram, kukurūzas eļļas gadījumā, ir 0,4 ml uz 100 g ķermeņa svara). Izņemot kairinošas vai kodīgas ķīmiskas vielas, kam augstākā koncentrācijā parasti ir saasināta iedarbība, testa tilpuma izmaiņas ir jāsamazina līdz minimumam, pielāgojot koncentrāciju, lai nodrošinātu nemainīgu tilpumu visos devu līmeņos. Viela katru dienu jāievada vienā un tajā pašā laikā. Parasti deva katram dzīvniekam ir jānosaka, pamatojoties uz pēdējo individuāli noteikto ķermeņa svaru, un jākoriģē vismaz reizi nedēļā pieaugušiem tēviņiem un pieaugušām mātītēm, kas nav grūsnas, un reizi divās dienās grūsnām mātītēm un F1 dzīvniekiem, kam devu ievada pirms atšķiršanas un divu nedēļu laikā pēc atšķiršanas. Ja TK datos norādīts, ka testējamā ķīmiskā viela slikti izkļūst cauri placentai, mākslīgās barošanas devu pēdējā grūtniecības nedēļā drīkst koriģēt tā, lai novērstu pārmērīgi toksiskas devas ievadīšanu mātītei. Atnešanās dienā mātītēm viela nav jāievada ne ar mākslīgo barošanu, ne jebkādā citā ceļā, kas saistīts ar dzīvnieka aiztikšanu; šajā dienā ieteicams drīzāk neievadīt testējamo ķīmisko vielu, nevis traucēt atnešanos.

Pārošana

31.   Katra P mātīte jānovieto kopā ar vienu nejaušināti izraudzītu neradniecisku tēviņu no tās pašas devas grupas (1:1 pārošana), līdz tiek konstatēts kopulācijas fakts vai pagājušas divas nedēļas. Ja tēviņu nepietiek, piemēram, pirms pārošanas tie gājuši bojā, drīkst pārot (1:1) jau pārotu(-us) tēviņu(-us) ar otru mātīti, tādējādi sapārojot visas mātītes. Grūtniecību sāk skaitīt no dienas, kurā ir apstiprinājies pārošanas fakts (konstatēts maksts embols vai sperma). Dzīvnieki ir jānošķir iespējami ātri pēc kopulācijas fakta konstatēšanas. Ja pēc divām nedēļām pārošanās nav notikusi, dzīvnieki ir jānošķir, un turpmāk tos pārot nedrīkst. Datos skaidri jānorāda sapārotie pāri.

Metiena lielums

32.   Ceturtajā dienā pēc atnešanās mazuļu skaitu katrā metienā var samazināt, ja iespējams, tajā nejaušināti atstājot piecus vīrišķos un piecus sievišķos mazuļus. Mazuļu skaita samazināšana izlases veidā, piemēram, pamatojoties uz ķermeņa svaru, nav jāveic. Ja metiena vīrišķo un sievišķo mazuļu skaita dēļ nav iespējams atstāt piecus katra dzimuma pārstāvjus, ir pieņemama daļēja koriģēšana (piemēram, seši vīrišķie un četri sievišķie mazuļi).

Mazuļu izlasīšana pēcatšķiršanas pētījumiem (sk. 1. attēlu)

33.   Atšķiršanas brīdī (aptuveni 21. dienā pēc piedzimšanas) no visiem pieejamajiem metieniem katrā devas un kontroles grupā tiek izlasīti ne vairāk kā 20 mazuļi, kuriem veic turpmākus izmeklējumus līdz dzimumbrieduma sasniegšanai (ja vien testēšana nav jāveic agrāk). Mazuļus izlasa nejaušināti, neiekļaujot nīkuļus (dzīvniekus, kuru ķermeņa svars ir par vairāk nekā divām standartnovirzēm mazāks nekā vidējais attiecīgā metiena mazuļu svars), jo vielas ievadīšanas grupai tie nav pietiekami reprezentatīvi.

Atlasītos F1 mazuļus 21. dienā pēc piedzimšanas pēc nejaušas izvēles principa iedala vienā no trīs dzīvnieku kohortām:

1. kohorta (1A un 1B)= reproduktīvās/ontoģenēzes toksicitātes testēšana,

2. kohorta (2A un 2B)= ontoģenēzes neirotoksicitātes testēšana,

3. kohorta= ontoģenēzes imūntoksicitātes testēšana.

1A kohorta: viens tēviņš un viena mātīte/metiens/grupa (20/dzimums/grupa): prioritāra izlase primāram ietekmes uz reproduktīvo sistēmu un vispārējas toksicitātes novērtējumam.

1B kohorta: viens tēviņš un viena mātīte/metiens/grupa (20/dzimums/grupa): prioritāra izlase reproduktīvās sistēmas darbības turpmākam novērtējumam, pārojot un novērtējot F1 dzīvniekus (sk. ESAO Testēšanas norādījumus 117 (39)), un papildu histopatoloģijas datu ieguvei gadījumos, kad ir aizdomas par reproduktīvai vai endokrīnai sistēmai toksiskām vielām vai ja 1A kohortas rezultāti ir pārprotami.

2A kohorta: kopā 20 mazuļi katrā grupā (10 tēviņi un 10 mātītes katrā grupā; 1 tēviņš vai 1 mātīte no katra metiena) tiek iedalīti, lai testētu iedarbību uz centrālo nervu sistēmu, pēc tam veicot pieaugušu dzīvnieku neirohistopatoloģijas novērtējumu.

2B kohorta: kopā 20 mazuļi katrā grupā (10 tēviņi un 10 mātītes katrā grupā; 1 tēviņš vai 1 mātīte no katra metiena) tiek iedalīti, lai veiktu neirohistopatoloģijas novērtējumu atšķiršanas brīdī (21. vai 22. diena pēc piedzimšanas). Ja dzīvnieku skaits nav pietiekams, priekšroka ir jādod dzīvnieku iedalīšanai 2A kohortā.

3. kohorta: kopā 20 mazuļi katrā grupā (10 tēviņi un 10 mātītes katrā grupā; iespēju robežās viens no katra metiena). Iespējams, ka kontroles grupas mazuļus būs nepieciešams izmantot par pozitīvās kontroles dzīvniekiem no T šūnas atkarīgas antivielas reakcijas testā (TDAR) 56. dienā pēc piedzimšanas (± 3 dienas).

34.   Ja metienā nav pietiekami daudz mazuļu, lai tos iedalītu visās kohortās, priekšroka tiek dota 1. kohortai, jo to var paplašināt, lai veidotu F2 paaudzi. Papildu mazuļus drīkst iedalīt jebkurā kohortā tādā gadījumā, ja pastāv konkrētas bažas, piemēram, aizdomas, ka ķīmiskā viela ir neirotoksiska, imūntoksiska vai reproduktīvai sistēmai toksiska viela. Šos mazuļus drīkst izmantot izmeklējumos dažādos laika punktos vai izvērtēšanai papildu beigupunktos. Mazuļi, kas nav iedalīti kohortās, tiks nodoti klīniskai bioķīmijai (55. punkts) un autopsijai (68. punkts).

P dzīvnieku otrā pārošana

35.   Parasti neiesaka veikt P dzīvnieku otro pārošanu, jo tādējādi tiek zaudēta vērtīga informācija par implantācijas vietu skaitu (un arī pēcimplantācijas un perinatālo zaudējumu dati, iespējamas teratogenitātes rādītāji) par pirmo metienu. Paplašinot pētījumu un ietverot tajā F1 paaudzes pārošanu, tiktu labāk apmierināta vajadzība pārbaudīt vai izskaidrot ietekmi uz devas saņēmējām mātītēm. Tomēr vienmēr ir iespējams veikt P tēviņu otro pārošanu ar mātītēm, kurām nav dota viela, lai noskaidrotu pārprotamos konstatējumus vai papildinātu pirmās pārošanas laikā izstrādāto raksturojumu par ietekmi uz auglību.

NOVĒROJUMI DZĪVES LAIKĀ

Klīniskie novērojumi

36.   Attiecībā uz P un atlasītiem F1 dzīvniekiem vispārīgus klīniskus novērojumus veic reizi dienā. Ja devas dod ar mākslīgo barošanu, klīniskie novērojumi jāveic pirms un pēc devas došanas (lai novērotu iespējamās ar maksimālo koncentrāciju plazmā saistītās toksicitātes pazīmes). Tiek reģistrētas attiecīgas uzvedības izmaiņas, smagas vai ieilgušas atnešanās pazīmes un visas toksicitātes pazīmes. Divas reizes dienā, nedēļas nogalē vienu reizi dienā visi dzīvnieki tiek izmeklēti, lai konstatētu smagu toksicitāti, saslimstību un mirstību.

37.   Turklāt reizi nedēļā tiek veikti sīkāki P un F1 dzīvnieku izmeklējumi (pēc atšķiršanas), un to var ērti izdarīt, kad dzīvnieks tiek svērts, tādējādi mazinot iejaukšanās radīto stresu. Novērojumi ir rūpīgi jāveic un jāreģistrē, izmantojot punktu sistēmu, kuru ir noteikusi testēšanas laboratorija. Ir jācenšas nodrošināt minimālas testēšanas apstākļu pārmaiņas. Norādītajām pazīmēm jāietver (bet ne tikai) izmaiņas ādā, apmatojumā, acīs, gļotādās, kā arī sekrēcija un izdalījumi un veģetatīvā aktivitāte (piemēram, asarošana, piloerekcija, acs zīlītes diametrs, neraksturīga elpošana). Ir jāreģistrē izmaiņas gaitā, stājā, reakcijā uz aprūpi, kā arī klonisko vai tonisko kustību esamība, izmaiņas stereotipos (piemēram, pārmērīga kopšanās, atkārtota griešanās) vai dīvaina izturēšanās (piemēram, pašsakropļošanās, staigāšana atpakaļvirzienā).

Ķermeņa svars un barības/ūdens patēriņš

38.   P dzīvnieki tiek svērti devas došanas pirmajā dienā un pēc tam vismaz reizi nedēļā. Turklāt P mātītes laktācijas periodā tiek svērtas tajās pašās dienās, kad tiek svērti metiena mazuļi (sk. 44. punktu). Visi F1 dzīvnieki tiek svērti individuāli atšķiršanas brīdī (21. dienā pēc piedzimšanas) un pēc tam vismaz reizi nedēļā. Ķermeņa svars tiek reģistrēts arī pubertitātes sasniegšanas dienā (kad notiek preputiālā atdalīšanās vai vagīnas atvēršanās). Visi dzīvnieki tiek svērti pēc nonāvēšanas.

39.   Pētījuma laikā barības un ūdens patēriņš (gadījumā, ja testējamās ķīmiskās vielas deva tiek dota ar dzeramo ūdeni) tiek reģistrēts vismaz reizi nedēļā tajā pašā dienā, kad reģistrē dzīvnieka ķermeņa svaru (izņemot kopā turēšanas laiku). Katra F1 dzīvnieku būra barības patēriņš tiek uzskaitīts reizi nedēļā, sākot no attiecīgās kohortas atlases brīža.

Estrālie cikli

40.   Iespējams, ka ir pieejama sākotnējā informācija par testējamās ķīmiskās vielas ietekmi uz estrālo ciklu, kas iegūta iepriekšējo atkārtotas devas toksicitātes pētījumu laikā, un to var izmantot, izstrādājot ar testējamo ķīmisko vielu saistīto protokolu paplašinātam vienas paaudzes reproduktīvās toksicitātes pētījumam. Parasti estrālā cikliskuma novērtēšana (izmantojot vaginālo citaloģiju) sāksies vielas ievadīšanas perioda sākumā un turpināsies līdz pārošanas fakta apstiprinājumam vai divu nedēļu ilgā pārošanas perioda beigām. Ja mātītēm skrīningā ir konstatēts normāls estrālais cikls pirms vielas ievadīšanas, sākot vielas ievadīšanu, būtu jāturpina ņemt uztriepes, bet, ja rodas bažas par neraksturīgu ietekmi vielas ievadīšanas sākumā (piemēram, izteikts barības patēriņa samazinājums), dzīvniekiem drīkst atļaut pielāgoties vielas saņemšanai līdz pat divām nedēļām, pirms sākt divu nedēļu uztriepju ņemšanas periodu pirms pārošanas. Ja mātītei vielas saņemšanas periods tiek pagarināts minētajā veidā (t. i., līdz četrām nedēļām pirms pārošanas apstrādes), ir jāapsver jaunāku dzīvnieku iegāde un vielas saņemšanas perioda pagarināšana tēviņiem pirms pārošanas. Iegūstot vagīnas/dzemdes kakla šūnas, jācenšas izvairīties no gļotādas bojāšanas un sekojošas pseidogrūsnības ierosināšanas (10) (11).

41.   A1 kohortas F1 mātīšu vaginālās uztriepes ir jāizmeklē katru dienu pēc vagīnas atvēršanās, līdz tiek reģistrēta pirmā uztriepe ar apsēklošanas pazīmēm, lai noteiktu laikposmu starp šiem diviem notikumiem. Visām A1 kohortas F1 mātītēm estrālais cikls ir jāuzrauga divas nedēļas, sākot no aptuveni 75. dienas pēc piedzimšanas. Turklāt, ja rodas vajadzība pārot F1 paaudzi, 1B kohortas vaginālajai citoloģijai sekos no pārošanas brīža, līdz tiks saņemts kopulācijas fakta apstiprinājums.

Pārošana un grūtniecība

42.   Papildus standarta beigupunktiem (piemēram, ķermeņa svars, barības patēriņš, klīniskie novērojumi, tostarp saslimstības/mirstības pārbaudes) tiek reģistrēti pārošanas datumi, apaugļošanas datumi un atnešanās datumi, kā arī tiek aprēķināti postkoitālie intervāli (no pārošanas līdz apaugļošanai) un grūtniecības ilgums (no apaugļošanas līdz atnešanās brīdim). P mātītes ir rūpīgi jāizmeklē gaidāmās atnešanās laikā, lai konstatētu distocijas pazīmes. Ir jāreģistrē jebkuras novirzes, kas vērojamas migas veidošanas vai zīdīšanas laikā.

43.   Laktāciju (0. laktācijas diena) sāk skaitīt no atnešanās dienas attiecībā uz māti un 0. dienu pēc piedzimšanas attiecībā uz mazuli. Kā alternatīvu visus salīdzinājumus piedāvā balstīt uz postkoitālo laiku, lai izslēgtu kļūdas postnatālās attīstības datos dažādu grūtniecības periodu ilguma dēļ; tomēr ir jāreģistrē arī atnešanās laiks. Tas ir ļoti svarīgi, ja testējamā ķīmiskā viela ietekmē grūtniecības ilgumu.

Pēcnācēju parametri

44.   Katrs metiens ir jāizmeklē iespējami drīz pēc atnešanās (0. vai 1. dienā pēc piedzimšanas), lai noteiktu mazuļu skaitu un dzimumu, nedzīvi piedzimušos, dzīvi piedzimušos un makroskopisku anomāliju esamību (redzamas ārējas novirzes, tostarp vilka rīkle, zemādas hemorāģija, ādas krāsas vai tekstūras novirzes, nabassaite, piena trūkums vēderā, izžuvusi sekrēcija). Turklāt pirmo klīnisko izmeklējumu laikā jāveic kvalitatīvs jaundzimušo novērtējums – ķermeņa temperatūra, aktivitātes līmenis un reakcija uz aprūpi. Mazuļi, kas atrasti miruši 0. dienā pēc piedzimšanas vai vēlāk ir jāizmeklē, lai noteiktu iespējamo kaitējumu un nāves iemeslu. Dzīvos mazuļus individuāli saskaita un nosver 0. vai 1. dienā pēc piedzimšanas un pēc tam regulāri, piemēram, vismaz 4., 7., 14. un 21. dienā pēc piedzimšanas. Klīniskie izmeklējumi, ko veic attiecīgā dzīvnieku vecumā, ir jāatkārto, pēcnācējus sverot, vai biežāk, ja atnešanās brīdī ir konstatēti īpaši gadījumi. Norādītās pazīmes varētu būt ārējās novirzes, izmaiņas ādā, apmatojumā, acīs, gļotādās, sekrēcijas un izdalījumu parādīšanās un veģetatīvā aktivitāte, kā arī citas pazīmes. Ir jāreģistrē izmaiņas gaitā, stājā, reakcijā uz aprūpi, kā arī klonisko vai tonisko kustību esamība, izmaiņas stereotipos vai neraksturīga izturēšanās.

45.   Ir vismaz vienu reizi jānomēra katra mazuļa anogenitālais attālums (AGD) laikposmā no 0. līdz 4. dienai pēc piedzimšanas. Mazulis ir jānosver tajā pašā dienā, kad tiek mērīts AGD, un AGD ir jāpielāgo mazuļa izmēram, priekšroku dodot kvadrātsaknei no ķermeņa svara (12). Krūtsgali/areolas vīrišķiem mazuļiem ir jāpārbauda 12. vai 13. dienā pēc piedzimšanas.

46.   Visiem atlasītajiem F1 dzīvniekiem katru dienu tiek novērtēta vagīnas atvēršanās vai balanopreputiālā atdalīšanās attiecīgi mātītēm/tēviņiem, lai konstatētu, vai šie beigupunkti tiek sasniegti pirms plānotās dienas un dzimumbriedums tiek sasniegts agrāk. Būtu jānorāda jebkuras dzimumorgānu novirzes, piemēram, pastāvīgi izdalījumi no vagīnas, hipospādija vai iekaisis penis. F1 dzīvnieku dzimumbriedums tiek salīdzināta ar fizisko attīstību, nosakot vecumu un ķermeņa svaru laikā, kad notiek vagīnas atvēršanās vai balanopreputiālā atdalīšanās attiecīgi mātītēm/tēviņiem.

Potenciālās ontoģenēzes neirotoksicitātes novērtējums (2A un 2B kohorta)

47.   Neirotoksicitātes novērtēšanā būtu jāizmanto 10 vīrišķie un 10 sievišķie 2A kohortas dzīvnieki un 10 vīrišķie un 10 sievišķie 2B kohortas dzīvnieki no katras vielas ievadīšanas grupas (katrai kohortai: 1 tēviņš vai 1 mātīte no katra metiena; visus metienus pārstāv vismaz 1 mazulis; nejaušināta izlase). 2A kohortas dzīvniekiem ir jāveic reakcijas uz dzirdes kairinātājiem, funkcionālo novērojumu sērijas, motoriskās aktivitātes (sk. 48.–50. punktu) un neiropatoloģijas novērtēšana (sk. 74.–75. punktu). Ir jācenšas nodrošināt, ka testēšanas apstākļu pārmaiņas ir minimālas un nav sistemātiski saistītas ar vielas ievadīšanu. Starp mainīgajiem rādītājiem, kas var ietekmēt uzvedību, ir skaņas līmenis (piemēram, saraustīts troksnis), temperatūra, mitrums, apgaismojums, smaržas, dienas laiks un vides kairinātāji. Neirotoksicitātes testu rezultāti ir jāinterpretē atbilstīgi vēsturiskiem kontroles atsauces diapazoniem. 2B kohortas dzīvnieki ir jāizmanto neiropatoloģijas novērtējumam 21. vai 22. dienā pēc piedzimšanas (sk. 74.–75. punktu).

48.   Tests ar dzirdes kairinātājiem ir jāveic 24. dienā pēc piedzimšanas (± 1 diena), izmantojot 2A kohortas dzīvniekus. Testēšanas diena ir savstarpēji jāsaskaņo starp vielas ievadīšanas un kontroles grupām. Katra sesija ietver 50 mēģinājumus. Veicot testu ar dzirdes kairinātājiem, vidējā reakcijas amplitūda uz katru 10 mēģinājumu kopumu (5 kopumi pa 10 mēģinājumiem) ir jānosaka, optimizējot testa nosacījumus tādā veidā, lai radītu pieraduma veidošanos sesijas laikā. Šīm procedūrām ir jāatbilst B.53. testēšanas metodei (35).

49.   Piemērotā laikā starp 63. un 75. dienu pēc piedzimšanas 2A kohortas dzīvnieki tiek novirzīti uz funkcionālo novērojumu sēriju un automātisku motoriskās aktivitātes testu. Šīm procedūrām ir jāatbilst B.43. testēšanas metodei (33) un B.53. testēšanas metodei (35). Funkcionālo novērojumu sērija ietver dzīvnieka ārienes, uzvedības un funkcionālās integritātes pilnu aprakstu. To novērtē, veicot novērojumus dzīvnieka turēšanas būrī, pēc pārvietošanas uz novērojumu standartnožogojumu (atklāta telpa), kur dzīvnieks brīvi kustas, un manipulatīvus testus. Testēšanai jānotiek no mazas savstarpējas mijiedarbības uz pieaugošu. Pasākumu saraksts ir ietverts 1. pielikumā. Visi dzīvnieki rūpīgi jānovēro apmācītiem novērotājiem, kuri nav informēti par dzīvnieku apstrādes statusu, un jāizmanto standartprocedūras, lai samazinātu novērotāju mainību. Iespēju robežās ieteicams, ka dzīvniekus attiecīgā testā novērtē viens un tas pats novērotājs. Ja tas nav iespējams, ir jāsniedz pierādījumi par novērotāju uzticamību. Attiecībā uz katru parametru uzvedības testēšanas sērijā ir jāizmanto skaidri operatīvi noteikti mērogi un punktu piešķiršanas kritēriji. Iespēju robežās jāizstrādā objektīvi kvantitatīvie pasākumi novērojumu beigupunktiem, kuri ietver subjektīvu vērtēšanu. Attiecībā uz kustību aktivitāti katru dzīvnieku testē individuāli. Testa sesijai jābūt pietiekami ilgai, lai kontroldzīvniekiem sesijas laikā veidotos pieradums. Kustību aktivitāte ir jāuzrauga, izmantojot automātisku aktivitātes reģistrēšanas iekārtu, ar kuru jānosaka gan aktivitātes pieaugums, gan samazinājums (t. i., ierīces noteiktā pamataktivitāte nedrīkst būt tik zema, lai padarītu neiespējamu samazinājuma noteikšanu, un tik augsta, lai padarītu neiespējamu aktivitātes pieauguma noteikšanu). Katra ierīce ir jātestē, izmantojot standarta procedūras, lai iespēju robežās nodrošinātu, ka visā darbības laikā ierīču kopums darbojas uzticami. Iespēju robežās vielas ievadīšanas grupas attiecībā uz ierīcēm jāsadala vienmērīgi. Vielas ievadīšanas grupās jānodrošina arī testēšanas laiku līdzsvars, lai nelabvēlīgu ietekmi neradītu aktivitātes diennakts ritmi.

50.   Ja esošā informācija liecina par vajadzību veikt citus (piemēram, sensorās, sociālās, kognitīvās) darbības testus, šie testi ir jāiekļauj, netraucējot citu pētījuma ietvaros veikto novērtējumu integritāti. Ja šo testēšanu veic ar tiem pašiem dzīvniekiem, kurus izmanto standarta testam ar dzirdes kairinātājiem, funkcionālo novērojumu sērijai un motoriskās aktivitātes testēšanai, ir jāparedz dažādi testi, lai samazinātu šo testu integritātes apdraudējumu. Īpaši noderīgas var būt papildu procedūras, ja empīriskie novērojumi, gaidāmā ietekme vai mehāniskais/iedarbības veids liecina par īpaša veida neirotoksicitāti.

Iespējamās ontoģenēzes imūntoksicitātes novērtējums (3. kohorta)

51.   56. dienā pēc piedzimšanas (± 3 dienas) no T šūnas atkarīgas antivielas reakcijas testā, t. i., sākotnējā IgM antivielu reakcija uz antigēnu, kas atkarīgs no T šūnas, piemēram, Sheep Red Blood Cells (SRBC) vai Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), ir jāizmanto 10 vīrišķie un 10 sievišķie 3. kohortas dzīvnieki no katras vielas ievadīšanas grupas (1 tēviņš un 1 mātīte no katra metiena; visus metienus pārstāv vismaz 1 mazulis; atlase izdarīta pēc nejaušas izlases principa) atbilstīgi pašreizējām imūntoksicitātes testēšanas procedūrām (14) (15). Reakciju var novērtēt, saskaitot īpašus plakus veidojošās šūnas (PFC) liesā vai nosakot SRBC vai KLH raksturīgu IgM antivielas titru serumā, izmantojot ELISA, reakcijas maksimālajā punktā. Parasti reakcijas maksimālais punkts tiek sasniegts četras (PFC reakcija) vai piecas (ELISA) dienas pēc intravenozas imunizēšanas. Ja primārā antivielas reakcija tiek testēta, skaitot plakus veidojošās šūnas, dzīvnieku apakšgrupas ir atļauts novērtēt atsevišķās dienās, ja: apakšgrupas imunizēšanas un nonāvēšanas laiku nosaka tādā veidā, ka PFC tiek skaitīts reakcijas maksimālajā punktā; apakšgrupas ietver vienādu vīrišķo un sievišķo pēcnācēju skaitu no visām devas grupām, tostarp kontroles grupām; un apakšgrupas izvērtē aptuveni vienā un tajā pašā postnatālajā vecumā.Testējamās ķīmiskās vielas iedarbība turpināsies līdz dienai pirms liesu savākšanas PFC reakcijai vai seruma savākšanas ELISA testam.

Iespējamās reproduktīvās toksicitātes turpmākais novērtējums (1B kohorta)

52.   1B kohortas dzīvnieki var tikt apstrādāti pēc 90. postnatālās dienas un pavairoti, lai vajadzības gadījumā iegūtu F2 paaudzi. Vienas un tās pašas devas grupas tēviņiem un mātītēm ir jādzīvo kopā (izvairoties no māsu un brāļu pārošanas) ne vairāk kā divas nedēļas, sākot no 90. dienas pēc piedzimšanas vai pēc tam, bet ne vēlāk kā līdz 120. dienai pēc piedzimšanas. Ir jāievēro tās pašas procedūras, kas attiecībā uz P dzīvniekiem. Tomēr, pamatojoties uz pierādījumiem, ir iespējams, ka pietiek ar metiena nonāvēšanu 4. dienā pēc piedzimšanas tā vietā, lai strādātu ar to līdz atšķiršanai vai pēc tam.

NOBEIGUMA NOVĒROJUMI

Klīniskā bioķīmija/hematoloģija

53.   Ir jāuzrauga sistēmiska ietekme uz P dzīvniekiem. Asins paraugi tukšā dūšā no noteiktas vietas tiek ņemti 10 pēc nejaušas izvēles principa atlasītiem P tēviņiem un mātītēm no katras devas grupas izmēģinājuma beigās, uzglabāti atbilstošos apstākļos un tiem tiek veikta pilna apjoma hematoloģija, klīniskā bioķīmija, T4 un TSH testi vai citi izmeklējumi, ko iesaka saskaņā ar testējamās ķīmiskās vielas zināmās ietekmes profilu (sk. ESAO Norādījumu dokumentu Nr. 151 (40)). Jāpārbauda šādi hematoloģiski parametri: hematokrīts, hemoglobīna koncentrācija, eritrocītu skaits, leikocītu skaits un leikocitārā formula, trombocītu skaits un asins recēšanas laiks/spēja. Plazmas vai seruma pētījumiem jāietver: glikoze, kopējais holesterīns, urīnviela, kreatinīns, kopējās olbaltumvielas, albumīns un vismaz divi fermenti, kas norāda uz hepatocelulārajām ietekmēm (piemēram, alanīna aminotransferāze, aspartāta aminotransferāze, alkalīnfosfatāze, gamma glutamiltranspeptidāze un sorbīta dehidrogenāze). Var iekļaut arī papildu fermentu un žultsskābju noteikšanu, kas varētu sniegt noderīgu informāciju pie dažiem nosacījumiem. Turklāt var paņemt asinis no visiem dzīvniekiem un glabāt, lai būtu iespēja veikt analīzes vēlāk un noskaidrot pārprotamu ietekmi vai sagatavot datus par iekšējo ekspozīciju. Ja nav paredzēta otrā P dzīvnieku pārošana, asinsanalīzes ņem tikai pirms plānotās nonāvēšanas procedūras un tās ietvaros. Ja dzīvnieki tiek saglabāti, asinsparaugi ir jāsavāc dažas dienas pirms dzīvnieku otrās pārošanas. Ja vien esošie atkārtotas devas pētījumu dati neliecina, ka testējamā ķīmiskā viela nav ietekmējusi parametru, urīna analīzes ir jāveic pirms izmēģinājuma beigām un jāvērtē šādi parametri: izskats, daudzums, osmolaritāte vai īpatnējais svars, pH, olbaltumvielas, glikoze, asins un asins šūnas, šūnas atliekas. Var savākt urīnu, lai uzraudzītu testējamās ķīmiskās vielas un/vai metabolīta(-u) izvadīšanu.

54.   Ir jāuzrauga sistēmiska ietekme uz F1 dzīvniekiem. Asins paraugi tukšā dūšā no noteiktas vietas tiek ņemti 10 nejaušināti izlasītiem 1A kohortas tēviņiem un mātītēm no katras devas grupas izmēģinājuma beigās, uzglabāti atbilstošos apstākļos, un tiem tiek veikta standarta klīniskā bioķīmija, tostarp seruma līmeņa novērtēšana vairogdziedzera hormoniem (T4 un TSH), hematoloģija (eritrocītu skaits, leikocītu skaits un leikocitārā formula), kā arī urīnanalīzes novērtēšana.

55.   Pārpalikušiem mazuļiem 4. dienā pēc piedzimšanas tiek veikta autopsija un apsvērta 55 izdarīt vairogdziedzera hormonu (T4) seruma koncentrācijas mērījumus. Vajadzības gadījumā jaundzimušo (4. diena pēc piedzimšanas) asinis var savākt pa metieniem bioķīmijas/vairogdziedzera hormonu analīzēm. Asinis tiek vāktas arī T4 un TSH analīzēm no atšķirtajiem mazuļiem, kuriem paredzēts veikt autopsiju 22. dienā pēc piedzimšanas (F1 mazuļi, kas nav atlasīti kohortām).

Spermas parametri

56.   Spermas parametri ir jānosaka visiem P paaudzes tēviņiem, ja vien esošie dati neliecina, ka iedarbība uz spermas parametriem pētījuma 90. dienā nav notikusi. Spermas parametru izmeklējumi jāveic visiem 1A kohortas tēviņiem.

57.   Izmēģinājuma beigās reģistrē visu 1A kohortas P un F1 tēviņu sēklinieku un sēklinieku piedēkļu svaru. Vismaz vienu sēklinieku un sēklinieka piedēkli rezervē histopatoloģijas izmeklējumiem. Pārējos sēklinieku piedēkļus izmanto cauda epididymis spermas rezervju uzskaitīšanai (16) (17). Turklāt tiek izmantotas tādas cauda epididymides (vai vas deferens) spermas savākšanas metodes, kas samazina bojājumus, kuri var apgrūtināt spermas kustīguma un spermas morfoloģijas izvērtēšanu.

58.   Spermas kustīgumu var izvērtēt tūlīt pēc nonāvēšanas vai reģistrēt turpmākai analīzei. Pieaugoši kustīgas spermas procentuālo daudzumu var noteikt subjektīvi vai objektīvi, izmantojot datorizētu kustīguma analīzi (19) (20) (21) (22) (23) (24). Attiecībā uz spermas morfoloģijas izvērtēšanu cauda epididymides (vai vas deferens) spermas paraugi ir jāizmeklē kā fiksēti vai mitri preparāti (25), un vismaz 200 spermatozoīdi katrā paraugā jāklasificē kā normāli (gan galviņa un centrs, gan aste šķiet normāli) vai nenormāli. Spermas morfoloģisko noviržu paraugos jāparādās saplūšanai, izolētām galviņām un kroplīgām galviņām un/vai astēm (26). Kroplīgas vai lielas spermas galviņas var norādīt uz spermas veidošanās defektiem.

59.   Ja spermas paraugi ir sasaldēti, uztriepes fiksētas un spermas kustīguma analīzes attēli reģistrēti pēc autopsijas (27), turpmāko analīzi var veikt tikai kontroles grupas un lielas devas saņemošiem tēviņiem. Tomēr, ja tiek novērota ar apstrādi saistīta ietekme, jāizvērtē arī zemāku devu grupas.

Makroskopiskā autopsija

60.   Nonāvēšanas laikā vai priekšlaicīgas nāves gadījumā veic P un F1 dzīvnieku autopsiju un makroskopiskus izmeklējumus, reģistrējot jebkuras anatomiskas novirzes vai patoloģiskas izmaiņas. Īpaša uzmanība ir jāpievērš reproduktīvās sistēmas orgāniem. Mirstošā stāvoklī humāni nonāvēti mazuļi un mirušie mazuļi ir jāreģistrē un, ja to audus nav skārusi autolīze, jāizmeklē attiecībā uz iespējamiem defektiem un/vai nāves cēloni un jāsaglabā.

61.   P un F1 mātīšu vaginālā uztriepe tiek izmeklēta autopsijas dienā, lai noteiktu estrālā cikla stāvokli un ļautu saistīt to ar reproduktīvo orgānu histopatoloģiju. Visu P mātīšu (un vajadzības gadījumā F1 mātīšu) dzemdes tādā veidā, kas netraucē histopatoloģisko vērtēšanu, tiek izmeklētas, lai noteiktu implantācijas vietu klātbūtni un skaitu.

Orgānu svars un audu saglabāšana – P un F1 pieauguši dzīvnieki

62.   Nonāvēšanas laikā visu P dzīvnieku un F1 pieaugušu dzīvnieku no attiecīgajām kohortām (kā turpmāk norādīts) ķermeņa svars un turpmāk uzskaitīto orgānu mitrais svars tiek noteikts iespējami drīz pēc sekcijas, lai izvairītos no žūšanas. Tad šie orgāni ir jāsaglabā atbilstošos apstākļos. Ja nav norādīts citādi, pāru orgānus var svērt atsevišķi vai kopā, atbilstīgi testēšanas laboratorijas iedibinātai praksei:

—	dzemde (ar olvadiem un dzemdes kaklu), olnīcas,

—	sēklinieki, sēklinieku piedēkļi (kopā un cauda epididymides paraugiem, ko izmanto spermas skaitīšanai),

—	muguras un vēdera prostata. Atbrīvojot no audiem prostatu, ir jāuzmanās, lai nepārspiestu ar šķidrumu pildītos sēklas pūslīšus. Ja devu došana ir ietekmējusi kopējo prostatas svaru, pēc fiksācijas muguras un vēdera daļas rūpīgi jāatdala un jānosver atsevišķi,

—	sēklas pūslīši ar koagulācijas dziedzeriem un to šķidrumiem un prostatu (kā viena vienība),

—	smadzenes, aknas, nieres, sirds, liesa, timuss, hipofīze, vairogdziedzeris (pēc fiksācijas), virsnieru dziedzeris un zināmie mērķa orgāni vai audi.

63.   Papildus iepriekš uzskaitītajiem orgāniem piemērotos apstākļos jāsaglabā paraugi no perifērās nervu sistēmas, muskuļiem, muguras smadzenēm, acs un optiskā nerva, gastrointestinālā trakta, urīnpūšļa, plaušām, trahejas (ar vairogdziedzeri un epitēlijķermenīšiem), kaulu smadzenēm, vas deferens (tēviņiem), piena dziedzera (tēviņiem un mātītēm) un vagīnas.

64.   Visu 1A kohortas dzīvnieku orgāni tiek svērti un saglabāti histopatoloģijai.

65.   Izmēģinājuma beigās prenatāli un postnatāli izraisītas imūntoksicitātes ietekmes izpētei 10 vīrišķiem un 10 sievišķiem 1A kohortas dzīvniekiem no katras vielas ievadīšanas grupas (1 tēviņš un 1 mātīte no katra metiena; visus metienus pārstāv vismaz 1 mazulis; atlase izdarīta pēc nejaušas izvēles principa) tiks veiktas šādas darbības:

—	to limfvadu svēršana, kas saistīti ar ievadīšanas vietu un kas ir attālu no tās (papildus virsnieru dziedzera, timusa un liesas svaram, kas jau mērīts 1A kohortas dzīvniekiem),

—	liesas limfocītu subpopulācijas analīzē (CD4+ un CD8+ T limfocīti, B limfocīti un dabīgās galētājšūnas) izmanto pusi liesas, bet otru pusi saglabā histopatoloģijas izvērtējumam.

Liesas limfocītu subpopulācijas analīzē neimunizētiem dzīvniekiem (1A kohorta) tiks noteikts, vai iedarbība ir saistīta ar pāreju uz “palīga” (CD4+) vai citotoksisku (CD8+) timusā radušos limfocītu vai dabīgu galētājšūnu (NK) (ātra reakcija uz audzēju šūnām un patogēniem) imunoloģiski stacionāra līmeņa izplatīšanos.

66.   Ir jānosver šādi 1B kohortas dzīvnieku orgāni un atbilstoši audi jāapstrādā līdz uzglabāšanas stadijai:

—	vagīna (nenosvērta),

—	dzemde ar dzemdes kaklu,

—

olnīcas,

—	sēklinieki (vismaz viens),

—	sēklinieku piedēkļi,

—	sēklas pūslīši ar koagulācijas dziedzeriem,

—

prostata,

—

hipofīze,

—	noteiktie mērķa orgāni.

1B kohortas dzīvniekiem jāveic histopatoloģija, ja 1A kohortas rezultāti ir pārprotami vai gadījumos, kad ir aizdomas par reproduktīvai vai endokrīnai sistēmai toksiskām vielām.

67.   2A un 2B kohortas: ontoģenēzes neirotoksicitātes testēšana (21. vai 22. diena pēc piedzimšanas un pieauguši pēcnācēji). 2A kohortas dzīvnieki tiek nonāvēti pēc uzvedības testēšanas, reģistrējot smadzeņu svaru un pilnu neirohistopatoloģiju neirotoksicitātes novērtēšanas vajadzībām. 2B kohortas dzīvnieki tiek nonāvēti 21. vai 22. dienā pēc piedzimšanas, reģistrējot smadzeņu svaru un veicot smadzeņu mikroskopiskus izmeklējumus neirotoksiskuma novērtēšanas vajadzībām. 2A kohortas dzīvniekiem un pēc izvēles 2B kohortas dzīvniekiem ir paredzēta perfūzijas fiksācija, kā noteikta B.53. testēšanas metodē (35).

Orgānu svars un audu saglabāšana – F1 atšķirtie mazuļi

68.   Mazuļus, kurus neatlasa kohortām, tostarp nīkuļus, pēc atšķiršanas nonāvē 22. dienā pēc piedzimšanas, ja vien rezultāti neliecina, ka jāveic papildu izpēte dzīves laikā. Nonāvētajiem mazuļiem veic autopsiju, tostarp reproduktīvo orgānu novērtējumu, kā aprakstīts 62. un 63. punktā.Ir jānosver un atbilstošos apstākļos jāsaglabā smadzenes, liesa un timuss no ne vairāk kā 10 mazuļiem no katra dzimuma katrā grupā, no iespējami daudziem metieniem. Turklāt šo vīrišķo un sievišķo mazuļu krūšu audus var saglabāt, lai veiktu turpmākas mikroskopiskas analīzes (13) (sk. ESAO Testēšanas norādījumus 151 (40)). Makroskopiskas novirzes un mērķa audi ir jāsaglabā iespējamiem histoloģiskajiem izmeklējumiem.

Histopatoloģija – P dzīvnieki

69.   Pilna 62. un 63. punktā uzskaitīto orgānu histopatoloģija tiek veikta visiem kontroles grupas un lielas devas saņemošiem P dzīvniekiem. Orgāni, kuros parādās ar apstrādi saistītas izmaiņas, ir jāizmeklē arī visiem dzīvniekiem mazās un vidējās devas grupās, lai palīdzētu NOAEL noteikšanā. Turklāt histopatoloģiskā izvērtēšana ir jāveic visiem dzīvniekiem, par kuriem ir aizdomas attiecībā uz samazinātu auglību, piemēram, tādiem, kas nav pārojušies, apaugļojušies, radījuši pēcnācējus vai dzemdējuši veselus pēcnācējus vai kuriem ir ietekmēts estrālais cikls vai spermas daudzums, kustīgums vai morfoloģija, un attiecībā uz visiem makroskopiskiem bojājumiem.

Histopatoloģija – F1 dzīvnieki

1. kohortas dzīvnieki

70.   Pilna 62. un 63. punktā uzskaitīto orgānu histopatoloģija tiek veikta visiem kontroles grupas un lielas devas saņemošiem 1A kohortas dzīvniekiem. Visi metieni ir jāpārstāv ar vismaz vienu katra dzimuma mazuli. Orgāni un audi, kuros parādās ar apstrādi saistītas izmaiņas, un visi makroskopiskie bojājumi ir jāizmeklē arī visiem dzīvniekiem mazās un vidējās devas grupās, lai palīdzētu NOAEL noteikšanā. Lai izvērtētu prenatāli un postnatāli izraisītu ietekmi uz limfmezgliem, ir jāveic no 10 vīrišķiem un 10 sievišķiem 1A kohortas dzīvniekiem savākto limfvadu un kaulu smadzeņu histopatoloģija pēc tam, kad jau veikta visu 1A dzīvnieku timusa, liesas un virsnieru dziedzera histopatoloģiskā izvērtēšana.

71.   Visu 1B kohortas dzīvnieku reproduktīvās un endokrīnās sistēmas audiem, kas apstrādāti līdz uzglabāšanas stadijai, kā aprakstīts 66. punktā, ir jāveic histopatoloģija tajos gadījumos, kad ir aizdomas par reproduktīvai vai endokrīnai sistēmai toksiskām vielām. 1B kohortai ir jāveic histoloģiski izmeklējumi arī tad, ja 1A kohortas rezultāti ir pārprotami.

72.   Pieaugušu mātīšu olnīcām jāsatur aizmetņu un augošas olšūnas, kā arī corpora lutea; tāpēc histopatoloģisko izmeklējumu mērķis ir veikt F1 mātīšu kvantitatīvu aizmetņu un augošu olšūnu, kā arī corpora lutea izvērtējumu; dzīvnieku skaitam, olnīcu izgriezumu atlasei un autopsijas parauga lielumam jābūt statistiski atbilstošam izmantojamai vērtēšanas procedūrai. Sākumā olšūnu skaitu var noteikt kontroles un lielas devas saņemošiem dzīvniekiem, un tajos gadījumos, ja tiek novērota nelabvēlīga ietekme uz lielas devas saņemošiem dzīvniekiem, tiem nosaka mazākas devas. Izmeklējumos jāietver aizmetņu olšūnu skaita noteikšana, kuru var apvienot ar mazu augošu olšūnu skaitu, lai salīdzinātu ar devu grupas un kontroles grupas olnīcām (sk. ESAO Testēšanas norādījumus 151 (40)). Corpora lutea novērtējums jāveic vienlaicīgi ar estrālā cikliskuma testēšanu, lai novērtējumā varētu ņemt vērā cikla stadiju. Olvadi, dzemde un vagīna tiek izmeklēti, lai konstatētu atbilstošiem orgāniem raksturīgu attīstību.

73.   F1 tēviņiem tiek veikti sīki izstrādāti sēklinieku histopatoloģijas izmeklējumi, lai noteiktu ar apstrādi saistītu ietekmi uz sēklinieku diferenciāciju un attīstību, kā arī uz spermatoģenēzi (38). Ja iespējams, jāizmeklē rete testis izgriezumi. Tiek izmeklēti epididymis caput, epididymis corpus un epididymis cauda un vas deferens, lai konstatētu atbilstošu orgāniem raksturīgu attīstību, kā arī parametrus, kas noteikti P tēviņiem.

2. kohortas dzīvnieki

74.   Visiem 2A kohortas lielas devas saņemošiem un kontroles dzīvniekiem pa dzimumiem tiek veikta neirohistopatoloģija pēc tam, kad ir testēta iedarbība uz centrālo nervu sistēmu (pēc 75. dienas pēc piedzimšanas, bet ne vēlāk kā 90. dienā pēc piedzimšanas). Visiem 2B kohortas lielas devas saņemošiem un kontroles dzīvniekiem pa dzimumiem tiek veikta smadzeņu histopatoloģija 21. vai 22. dienā pēc piedzimšanas. Orgāni vai audi, kuros parādās ar apstrādi saistītas izmaiņas, ir jāizmeklē arī visiem dzīvniekiem mazākas devas grupās, lai palīdzētu NOAEL noteikšanā. Attiecībā uz 2A un 2B kohortas dzīvniekiem tiek pārbaudīti daudzi izgriezumi no smadzenēm, lai ļautu pārbaudīt ožas sīpolus, smadzeņu garozu, hipokampusu, bazālo gangliju, talāmu, hipotalāms, vidussmadzenes (thecum, tegmentum un smadzeņu kājiņas), smadzeņu stumbrs un smadzenītes. Attiecībā uz 2A kohortu tiek izmeklētas tikai acis (tīklene un optiskais nervs) un perifērās nervu sistēmas, muskuļu un muguras smadzeņu paraugi. Visām šīm neirohistoloģijas procedūrām ir jāatbilst B.53. testēšanas metodei (35).

75.   Morfometriski (kvantitatīvi) vērtējumi jāveic tipiskās smadzeņu zonās (rūpīgi atlasot homologus izgriezumus, pamatojoties uz ticamām mikroskopiskām atšķirības iezīmēm), un tie var ietvert īpašu smadzeņu daļu lineārus un/vai areālus mērījumus. Attiecībā uz katru atšķirības iezīmi (līmeni) jāņem vismaz trīs secīgi izgriezumi, lai atlasītu to attiecīgā smadzeņu rajona izgriezumu, kurš ir pietiekami homologs un tipisks, lai vislabāk būtu derīgs vērtēšanai. Neiropatologam jāpieņem atbilstošs spriedums, vai mērījumiem sagatavotie izgriezumi ir homologi ar citiem paraugu komplektā esošajiem izgriezumiem un tāpēc piemēroti iekļaušanai, jo relatīvi neliels attālums var ietekmēt lineāros mērījumus (28).Nedrīkst izmantot nehomologus paraugus.Lai gan mērķis ir paņemt paraugus no visiem šim nolūkam rezervētajiem dzīvniekiem (10/dzimums/devas līmenis), var pietikt arī ar mazāku skaitu.Tomēr paraugi, kas ņemti no mazāk nekā 6 dzīvniekiem/dzimums/devas līmenis, šīs testēšanas metodes vajadzībām netiek uzskatīti par pietiekamiem. Lai noteiktu ar apstrādi saistītu ietekmi uz tādiem parametriem kā īpašu neiroanatomisku rajonu tilpums vai šūnu skaits, drīkst izmantot stereoloģiju. Ir savstarpēji jālīdzsvaro visi audu paraugu sagatavošanas aspekti, sākot no audu fiksācijas un turpinot ar audu paraugu secēšanu, audu apstrādi, novietošanu uz priekšmetstikliņa, lai katrā partijā būtu reprezentatīvs paraugs no katras devas grupas. Ja ir jāizmanto morfometriskas vai stereoloģiskas analīzes, smadzeņu audi no visiem devu līmeņiem vienlaicīgi ir jāuzglabā atbilstošā līdzeklī, lai izvairītos no izžūšanas artefaktiem, kas tiek saistīta ar ilgstošu uzglabāšanu fiksācijas līdzeklī.

ZIŅOŠANA

Dati

76.   Datus var iesniegt gan atsevišķi, gan apkopotus tabulā. Vajadzības gadījumā par katru testa grupu un katru paaudzi ir jāiesniedz šādi dati: dzīvnieku skaits testēšanas sākumā, testēšanas periodā mirušo vai humānu apsvērumu dēļ nonāvēto dzīvnieku skaits, katra nāves vai humānās nonāvēšanas gadījuma laiks, auglīgu dzīvnieku skaits, grūsnu mātīšu skaits, atnesušos mātīšu skaits un dzīvnieku ar toksicitātes pazīmēm skaits. Ir jāiesniedz arī toksicitātes apraksts, tostarp sākums, ilgums un smagums.

77.   Skaitliskie rezultāti ir jāvērtē, izmantojot piemērotu un apstiprinātu statistikas metodi. Statistikas metodes ir jāizvēlas pētījuma plāna ietvaros un atbilstoši jāaplūko nenormāli dati (piemēram, skaitīšanas dati), cenzēti dati (piemēram, ierobežots novērošanas laiks), nepastāvība (piemēram, ietekme uz metienu un atkārtoti pasākumi) un nevienādas mainības. Vispārīgi lineāri jaukti modeļi un devas un atbildes reakcijas modeļi ietver plašu analītisko rīku klasi, kura var būt piemērota saskaņā ar šo testēšanas metodi savāktajiem datiem. Ziņojumā jāietver pietiekama informācija par analīzes metodi un izmantoto datorprogrammu, lai neatkarīgs recenzents/statistiķis var novērtēt/atkārtoti vērtēt analīzi.

Rezultātu vērtējums

78.   Konstatējumi ir jāizvērtē, ņemot vērā novēroto ietekmi, tostarp autopsijas un mikroskopiskus konstatējumus. Vērtējums ietver saistību vai tās trūkumu starp devu un noviržu, tostarp makroskopisku bojājumu, klātbūtni, biežumu un smagumu. Ir jānovērtē arī mērķa orgāni, auglība, klīniskās novirzes, reproduktīvie un metiena rezultāti, ķermeņa svara izmaiņas, mirstība un toksiska un attīstības ietekme. Īpaša uzmanība ir jāpievērš ar dzimumu saistītām izmaiņām. Novērtējot testa rezultātus, ir jāņem vērā testējamās ķīmiskās vielas fizikāli ķīmiskās īpašības un toksikokinētiskie dati, ja tie pieejami, tostarp izkļūšana cauri placentai un nonākšana pienā.

Testēšanas pārskats

79.   Testēšanas pārskatā jāietver šāda informācija, kas iegūta, pētot P, F1 dzīvniekus un F2 dzīvniekus (vajadzības gadījumā).

Testējamā ķīmiskā viela:

—	visa attiecīgā pieejamā informācija par ķīmisko vielu, testējamās ķīmiskās vielas toksikokinētiskās un toksidinamiskās īpašības,

—	identifikācijas dati,

—

tīrība.

Nesējviela (attiecīgā gadījumā):

—	nesējvielas izvēles pamatojums, ja nesējviela nav ūdens.

Testa dzīvnieki:

—	izmantotā suga/līnija,

—	dzīvnieku skaits, vecums un dzimums,

—	izcelsme, turēšanas apstākļi, barība, materiāls migas ierīkošanai utt.,

—	dzīvnieku individuālais svars testēšanas sākumā,

—	P mātīšu vaginālās uztriepes dati pirms apstrādes sākšanas (ja tajā laikā tiek vākti dati),

—	P paaudzes pārošanas dati, kuros norādīti sapārotie tēviņi un mātītes un pārojuma rezultāts,

—	reģistrācija, kas norāda izcelsmes metienu pieaugušiem F1 paaudzes dzīvniekiem.

Testēšanas apstākļi:

—	devu līmeņa izvēles pamatojums,

—	dati par testējamās ķīmiskās vielas preparāta/barības pagatavošanu, sasniegtās koncentrācijas,

—	preparāta stabilitāte un viendabīgums nesējvielā (piemēram, barībā, dzeramajā ūdenī), asinīs un/vai pienā, ņemot vērā izmantošanas un glabāšanas starp izmantošanas reizēm apstākļus,

—	sīki dati par testējamās vielas ievadīšanu,

—	attiecīgajā gadījumā testējamās vielas koncentrācijas (milj. daļas) barībā/dzeramajā ūdenī pārvēršana sasniegtajā devā (mg/kg ķermeņa svara dienā),

—	dati par barības un ūdens kvalitāti (tostarp attiecīgajā gadījumā par barības sastāvu),

—	sīks nejaušas izvēles procedūru apraksts attiecībā uz mazuļu atlasi izbrāķēšanai un atlasi iekļaušanai testa grupās,

—	vides apstākļi,

—	pētījumā nodarbināto darbinieku saraksts, tostarp profesionālā apmācība.

Rezultāti (kopsavilkums un atsevišķi dati pa dzimumiem un devām):

—	barības patēriņš un, ja pieejams, ūdens patēriņš, barības efektivitāte (ķermeņa svara palielinājums uz patērētās barības gramu, izņemot kopā turēšanas periodu un laktācijas periodu) un testējamās ķīmiskās vielas patēriņš (ievadot ar barību/dzeramo ūdeni) P un F1 dzīvniekiem,

—	uzsūkšanās dati (ja pieejami),

—	dati par P dzīvnieku ķermeņa svaru,

—	atlasītu F1 dzīvnieku ķermeņa svars pēc atšķiršanas,

—	nāves laiks pētījuma laikā vai arī informācija, ka dzīvnieki ir izdzīvojuši līdz pētījuma beigām,

—	klīnisko novērojumu veids, smagums un ilgums (atgriezenisks vai neatgriezenisks),

—	hematoloģija, urīnanalīzes un klīniskās ķīmijas dati, tostarp TSH un T4,

—	liesas šūnu (T, B, NK šūnu) fenotipiska analīze,

—	šūnu veidošanās pārmaiņas kaulu smadzenēs,

—	toksiskās atbildes reakcijas dati,

—	P un F1 mātīšu skaits ar normālu vai nenormālu estrālo ciklu un cikla ilgums,

—	laiks līdz pārošanai (prekoitālie intervāli, dienu skaits starp salikšanu pārī un pārošanu),

—

toksiska vai cita ietekme uz reprodukciju, tostarp to dzīvnieku skaits un procentuālā attiecība, kuriem notikusi pārošana, grūtniecība, atnešanās un laktācija, to tēviņu skaits un procentuālā attiecība, kuri izraisījuši grūtniecību, to mātīšu skaits un procentuālā attiecība, kurām novērota distocija/ilgas vai smagas atnešanās pazīmes,

—	grūtniecības un vajadzības gadījumā atnešanās ilgums,

—	implantācijas vietu skaits, metiena lielums un vīrišķo mazuļu procentuālā attiecība,

—	pēcimplantācijas zudumu, nedzīvi piedzimušo, dzīvi piedzimušo skaits un procentuālā attiecība,

—	dati par metiena svaru un mazuļu svaru (tēviņi, mātītes un kopā), nīkuļu skaits, ja tādi ir,

—	mazuļu skaits ar makroskopiskām novirzēm,

—	toksiska vai cita iedarbība uz pēcnācējiem, postnatālo augšanu, dzīvotspēju utt.,

—	dati par mazuļu fiziskajām atšķirībām un citi postnatālās attīstības dati,

—	dati par F1 dzīvnieku dzimumbriedumu,

—	funkcionālo novērojumu dati par mazuļiem un pieaugušajiem,

—	ķermeņa svars nonāvējot un dati par P un pieaugušu F1 dzīvnieku absolūto un relatīvo orgānu svaru,

—	autopsijas konstatējumi,

—	sīks visu histopatoloģijas konstatējumu apraksts,

—	P un F1 tēviņu kopējais cauda epididymal spermas daudzums, pieaugoši kustīgas spermas procentuālais daudzums, morfoloģiski normālas spermas procentuālais daudzums un spermas ar katru identificētu novirzi procentuālais daudzums,

—	P un F1 mātīšu olnīcās konstatēto olšūnu skaits un brieduma pakāpe, vajadzības gadījumā,

—	F1 mātīšu olnīcās konstatēto corpora lutea skaits,

—	vajadzības gadījumā rezultātu statistiskā apstrāde.

2. kohortas parametri:

—	sīks izmantoto procedūru apraksts, lai standartizētu novērojumus un procedūras, kā arī darbības definīcijas, lai piešķirtu punktus novērojumiem,

—	visu izmantoto testēšanas procedūru saraksts un to izmantošanas pamatojums,

—	dati par uzvedības/funkcionālo, neiropatoloģijas un morfometrisko procedūru izmantošanu, tostarp informācija un dati par automātiskām ierīcēm,

—	ierīču kalibrēšanas un precizitātes nodrošināšanas procedūras un vielas ievadīšanas grupu sadale pa testēšanas procedūrām,

—	īss pamatojums, ar ko skaidro visus lēmumus, kuros ietverts profesionāls spriedums,

—	sīks visu uzvedības/funkcionālo, neiropatoloģijas un morfometrisko konstatējumu apraksts pa dzimumiem un devas grupām, tostarp kontroles pieaugumu un samazinājumu,

—	smadzeņu svars,

—	visas diagnozes, kas noteiktas, konstatējot neiroloģiskas pazīmes un bojājumus, tostarp dabīgi radušās slimības vai apstākļus,

—	paraugu konstatējumu attēli,

—	mazjaudas attēli, lai novērtētu morfometrijai izmantoto izgriezumu homoloģiju,

—	rezultātu, tostarp datu analīzē izmantoto statistikas modeļu, kā arī citu nozīmīgu un nenozīmīgu rezultātu statistiska apstrāde,

—	jebkuras citas toksiskas ietekmes saistība ar secinājumu par testējamās ķīmiskās vielas neirotoksisko potenciālu pa dzimumiem un devas grupām,

—	jebkuras toksikokinētiskas informācijas ietekme uz secinājumiem,

—	dati, ar kuriem pamato testēšanas metodes ticamību un jutību (t. i., pozitīvi un vēsturiski kontroles dati),

—	saistība, ja tāda ir, starp neiropatoloģisku un funkcionālu ietekmi,

—	NOAEL vai etalondeva mātītēm un pēcnācējiem pa dzimumiem un devas grupām,

—	vispārējas datu interpretācijas apspriešana, pamatojoties uz rezultātiem, tostarp secinājumu, vai ķīmiskā viela ir vai nav radījusi ontoģenēzes neirotoksicitāti un NOAEL.

3. kohortas parametri:

—	IgM antivielas titru serumā (jutīguma izraisīšana pret SRBC vai KLH) vai liesas IgM PFC vienības (jutīguma izraisīšana pret SRBC),

—	optimizācijas procesa ietvaros TDAR metodes izmantošanas rezultāti ir jāapstiprina gan laboratorijai, kas veic testēšanu pirmo reizi, gan periodiski (piemēram, reizi gadā) visām citām laboratorijām,

—	datu interpretācijas apspriešana, pamatojoties uz rezultātiem, tostarp uz secinājumu, vai ķīmiskā viela ir vai nav radījusi attīstības imūntoksicitāti un NOAEL.

Rezultātu apspriešana

Secinājumi, tostarp NOAEL vērtības attiecībā uz ietekmi uz vecākiem un pēcnācējiem

Ir jāsniedz arī visa tā informācija, kas nav iegūta pētījuma laikā, bet ir noderīga rezultātu (piemēram, jebkuru citu zināmu neirotoksisku vielu līdzīga iedarbība) interpretācijai.

Rezultātu interpretācija

80.   Paplašinātā vienas paaudzes reproduktīvā toksiskuma pētījums sniegs informāciju par ķīmiskās vielas atkārtotas iedarbības ietekmi vajadzības gadījumā visās reproduktīvā cikla fāzēs. Jo īpaši pētījums sniedz informāciju par reproduktīvo sistēmu un par pēcnācēju attīstību, augšanu, izdzīvošanu un funkcionālajiem beigupunktiem līdz pat 90. dienai pēc piedzimšanas.

81.   Pētījuma interpretācijas rezultātos jāņem vērā visa pieejamā informācija par ķīmisko vielu, tostarp fizikāli ķīmiskām, TK un toksikodinamiskām īpatnībām, pieejamā attiecīgā informācija par strukturālajiem analogiem, iepriekš veikto testējamās ķīmiskās vielas toksicitātes pētījumu rezultāti (piemēram, akūts toksiskums, toksiskums pēc atkārtotas piemērošanas, mehānistiski pētījumi un pētījumi, kuros novērtē, vai ir būtiskas kvalitatīvas un kvantitatīvas atšķirības starp sugām in vivo/in vitro metabolisku īpašību ziņā). Autopsijas un orgānu svēršanas rezultāti ir jānovērtē citu atkārtotu devu pētījumos izdarītu novērojumu kontekstā. Pēcnācēju augšanas samazinājums jāaplūko saistībā ar testējamās ķīmiskās vielas ietekmi uz piena struktūru (29).

2. kohorta (ontoģenēzes neirotoksicitāte)

82.   Iedarbības uz centrālo nervu sistēmu un neiropatoloģijas rezultāti ir jāinterpretē visu konstatējumu kontekstā, pamatojoties uz pierādījumiem un ekspertu spriedumiem. Ir jāapspriež uzvedības vai morfoloģisku konstatējumu modeļi, ja tādi ir, kā arī pierādījumi, kas saistīti ar reakciju uz devu. Šajā raksturojumā ir jāietver ontoģenēzes neirotoksicitātes, tostarp cilvēku epidemioloģisku pētījumu vai ziņojumu, kā arī eksperimentālu dzīvnieku pētījumu novērtējums (piemēram, toksikokinētiskie dati, struktūras un darbības informācija, dati no citiem toksiskuma pētījumiem). Datu vērtējumā jāietver gan bioloģiski, gan statistiski svarīgu datu apspriešana. Vērtējumā jāietver saistība, ja tāda ir, starp novēroto neiropatoloģiju un uzvedības izmaiņām. Sīkāku informāciju par ontoģenēzes neirotoksicitātes rezultātu interpretāciju skatīt B.53. testēšanas metodē (35) un Tyl et al., 2008 (31).

3. kohorta (ontoģenēzes imūntoksicitāte)

83.   Imūnās funkcijas apslāpēšana vai pastiprināšana, kas novērtēta, izmantojot TDAR (no T šūnas atkarīgas antivielas reakcijas tests), jāizvērtē visu veikto novērojumu kontekstā. TDAR testa rezultātam ir liela nozīme, jo tas var liecināt par cita veida ietekmi uz rādītājiem, kas saistīti ar imunoloģiju (piemēram, šūnu veidošanās pārmaiņas kaulu smadzenēs, limfaudu svars un histopatoloģija, limfocītu apakškopas izplatīšanās). TDAR testā konstatētā ietekme var būt mazāk nozīmīga, ja citas toksiskuma pazīmes novēro mazākas iedarbības koncentrācijas gadījumā.

84.   ESAO Testēšanas norādījumi 43 jāizmanto kā palīglīdzeklis, interpretējot reproduktīvās sistēmas un neirotoksiskuma izpētes rezultātus (26).

LITERATŪRA

(1)

Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers and K.E. Whitby (2006), “A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment”, Critical Reviews in Toxicology, 36, 69-98.

(2)

Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe (1999), “Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula Laboratory Animal Diets”, Lab. Anim. Sci., 49, 530- 536.

(3)

Zoetis, T. and I. Walls (2003), Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, Washington, DC.

(4)

Moser, V.C., I. Walls and T. Zoetis (2005), “Direct Dosing of Preweaning Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI Expert Working Group”, International Journal of Toxicology, 24, 87-94.

(5)

Conolly, R.B., B.D. Beck, and J.I. Goodman (1999), “Stimulating Research to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment”, Toxicological Sciences, 49, 1-4.

(6)

Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995), “Detection of Effects on Male Reproduction – a Literature Survey”, Journal of the American College of Toxicologists, 14, 293-327.

(7)

Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003), “Some Aspects Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility”, Regulatory Toxicology and Pharmacology, 37, 356-369.

(8)

Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. Mayahara and Y. Ohno (2000). “Collaborative work to evaluate toxicity on male reproductive organs by repeated dose studies in rats – overview of the studies”, Journal of Toxicological Sciences, 25, 1-21.

(9)

Creasy, D.M. (2003), “Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Toxicologic Pathology”, Birth Defects Research, Part B, 68, 408-415.

(10)

Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper (2007), “The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies”, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97.

(11)

Sadleir, R.M.F.S. (1979), “Cycles and Seasons”, in C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York.

(12)

Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. Reynolds (1999), “Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights”, Reproductive Toxicology, 13: 383-390.

(13)

Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi and R.I. Weiner (1977), “Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat”, Biological Reproduction, 17, 298-303.

(14)

Ladics, G.S. (2007), “Use of SRBC Antibody Responses for Immunotoxicity Testing”, Methods, 41, 9-19.

(15)

Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. Herzyk (2004), “Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemocyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation”, Toxicology, 197, 23-35.

(16)

Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989), “A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat”, Fundamental and Applied Toxicology, 12, 92-108.

(17)

Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978), “Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats”, Journal of Reproduction and Fertility, 54, 103-107.

(18)

Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991), “The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat”. Reproductive Toxicology, 5, 39-44.

(19)

Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996), “Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report”, Reproductive Toxicology, 10, 237- 244.

(20)

Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992), “Methods for Assessing Rat Sperm Motility”, Reproductive Toxicology, 6, 267-273.

(21)

Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992), “Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration”, Journal of Andrology, 13, 409-421.

(22)

Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991), “Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations”, Reproductive Toxicology, 5, 449-458.

(23)

Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993), “Computer-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer”, Methods in Toxicology, Part A, Academic, Orlando, Florida. 319. – 333. lpp.

(24)

Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989), “The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations”, Journal of Andrology, 10, 401-415.

(25)

Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992), “Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants”, Reproductive Toxicology, 6, 491-505.

(26)

OECD (2008), Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment, Series on Testing and Assessment, No. 43, ENV/JM/MONO(2008)16,OECD, Paris.

(27)

Working, P.K., M. Hurtt (1987), “Computerized Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility”, Journal of Andrology, 8, 330-337.

(28)

Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee (2006), “A “Best Practices” Approach to Neuropathologic Assessment in Developmental Neurotoxicity Testing – for Today”, Toxicological Pathology, 34, 296-313.

(29)

Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de Duffard, and R. Duffard (2006), “Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of their Major Components”, Food Chemicals Toxicology, 44, 8-16.

(30)

Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. Caviness, G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007), “Variations in Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats”, Environmental health perspectives, 115(12), 1717-1726.

(31)

Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. Sobotka (2008), “Identification and Interpretation of Developmental Neurotoxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental Endpoints”, Neurotoxicology and Teratology, 30: 349-381.

(32)

OECD (1996), Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Reproduction/Developmental Toxicity Screening Test, OECD Guideline for Testing of Chemicals, No. 422, OECD, Paris.

(33)

Šā pielikuma B.43. nodaļa “Žurku neirotoksicitātes pētījums”

(34)

OECD (2000), Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations, Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.

(35)

Šā pielikuma B.53. nodaļa “Ontoģenēzes neirotoksicitātes pētījums”.

(36)

Šā pielikuma B.54. nodaļa “Uterotropais biotests ar grauzējiem: estrogēno īpašību īsā skrīninga tests”.

(37)

Šā pielikuma B.55. nodaļa “Heršbergera biotests ar žurkām: (anti)androgēno īpašību īsā skrīninga tests”.

(38)

OECD (2009), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 106, OECD, Paris.

(39)

OECD (2011), Guidance Document on the Current Implementation of Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada, Series on Testing and Assessment, No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OECD, Paris.

(40)

OECD (2013), Guidance Document supporting TG 443: Extended One Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Assessment, No. 151, OECD, Paris.

B.57.   H295R STEROĪDĢENĒZES TESTS

IEVADS

1.   Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem 456 (TG) (2011. gads). ESAO 1998. gadā uzsāka prioritāru rīcību, lai pārskatītu esošās testēšanas vadlīnijas un izstrādātu jaunas testēšanas vadlīnijas par potenciāli endokrīnās sistēmas traucējumus izraisošu ķīmisko vielu noteikšanu un testēšanu. ESAO 2002. gada dokuments “Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals” aptver piecus līmeņus, no kuriem katrs atbilst citam bioloģiskās sarežģītības līmenim (1). Šajā testēšanas metodē aprakstītajā in vitro H295R steroīdģenēzes testā (H295R) izmanto cilvēka virsnieru karcinomas šūnu līniju (NCI-H295R šūnas), un tā ir 2. līmeņa “in vitro tests, kas sniedz mehānistiskus datus”, kuri izmantojami skrīningam un prioritizēšanai. Šis ir daudzpakāpju procesā izstrādāts un standartizēts skrīninga tests, kurā nosaka ķīmisko vielu ietekmi uz steroīdģenēzi, konkrētāk, uz 17β-estradiola (E2) un testosterona (T) producēšanos. H295R tests ir optimizēts un validēts (2) (3) (4) (5).

2.   H295R steroīdģenēzes testa mērķis ir noteikt ķīmiskas vielas, kas ietekmē E2 un T producēšanos. H295R tests ir paredzēts tam, lai noteiktu ksenobiotiķus, kuri iedarbojas uz endogēnām sastāvdaļām šūnas bioķīmiskajā ceļā, kas aizsākas reakciju sekvencē, kurā no holesterīna rodas E2 un/vai T. Ar H295R testu nav paredzēts noteikt ķīmiskas vielas, kas steroīdģenēzi ietekmē caur hipotalāma-hipofīzes-gonādu (HPG) asi. Testa mērķis ir gūt apstiprinošu vai noliedzošu atbildi (JĀ/NĒ) attiecībā uz ķīmiskās vielas spēju inducēt vai inhibēt T un E2 producēšanos; tomēr dažos gadījumos var gūt kvantitatīvus rezultātus (sk. 53. un 54. punktu). Testa rezultātus izsaka kā hormonu producēšanās relatīvās izmaiņas salīdzinājumā ar šķīdinātāja kontroliedobēm (SC). Testa mērķis nav sniegt konkrētu mehānistisku informāciju par testējamās ķīmiskās vielas mijiedarbību ar endokrīno sistēmu. Pētījums ar šūnu līniju veikts, lai noteiktu iedarbību uz noteiktiem enzīmiem un hormoniem, kas ir starpprodukti, piemēram, progesteronu (2).

3.   Šajā testēšanas metodē izmantotās definīcijas un saīsinājumi ir aprakstīti papildinājumā. Detalizēts protokols ar norādījumiem par to, kā gatavo šķīdumus, kultivē šūnas un dažādos aspektos veic testu, ir pieejams ESAO dokumenta “Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production” I-III papildinājumā (4).

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI

4.   Steroīdo dzimumhormonu sintēzē piedalās pieci dažādi enzīmi, kas katalizē sešas dažādas reakcijas. Citohroma P450 holesterīna sānu ķēdes šķēlējenzīms CYP11A holesterīnu enzimātiskā ceļā pārveido par pregnenolonu, un tas ir pirmais solis bioķīmisku reakciju ķēdē, kurā visbeidzot tiek sintezēti steroīdie galaprodukti. Atkarībā no nākamo divu reakciju secības steroīdģenēzes ceļš sadalās Δ5-hidroksisteroīdceļā un Δ4-ketosteroīdceļā, kas satiekas androstendiona producēšanā (1. att.).

5.   Androstendionu ar 17β-hidroksisteroīda dehidrogenāzes starpniecību (17β-HSD) pārveido par testosteronu (T). Testosterons ir hormons, kas izstrādājas gan kā starpprodukts, gan kā galaprodukts. Androgēniskas darbības mērķaudu – piemēram, prostatas un sēklas pūslīšu – šūnu membrānās, kodolapvalkos un endoplazmatiskajā tīklā tēviņu organisma T ar 5α-reduktāzes starpniecību var pārveidoties par dihidrotestosteronu (DHT). DHT ir daudz spēcīgāks androgēns nekā T, un arī to uzskata par hormonu, kas ir galaprodukts. H295R testā DHT netiek mērīts (sk. 10. punktu).

6.   Steroīdģenēzes ceļa enzīms, ar kura palīdzību androgēniskas ķīmiskās vielas tiek pārveidotas estrogēniskās ķīmiskās vielās, ir aromatāze (CYP19). CYP19 pārveido T par 17β-estradiolu (E2) un androstendionu par estronu. Hormonus E2 un T uzskata par steroīdģenēzes ceļa galaproduktiem.

7.   Dažādu sugu starpsubstrātiem CYP17 liāzes darbības specifiskums ir atšķirīgs. Cilvēka organismā šis enzīms dod priekšroku Δ5-hidroksisteroīdceļa (pregnenolona) substrātiem, savukārt žurkas organismā (19) – Δ4-ketosteroīdceļa (progesterona) substrātiem. Šādas atšķirības CYP17 liāzes darbībā var izskaidrot dažas sugu atšķirības reaģēšanā uz ķīmiskām vielām, kas in vivo maina steroīdģenēzi (6). Ir pierādīts, ka līnijas H295 šūnas ļoti precīzi atspoguļo pieauguša cilvēka virsnieru enzīmu ekspresijas un steroīdu producēšanās modeli (20), taču ir zināms, ka androgēnu sintēzes enzīmu ekspresija tajās notiek gan Δ5-hidroksisteroīdceļā, gan Δ4-ketosteroīdceļā (7) (11) (13) (15).

1. attēls

Steroīdģenēzes ceļš H295R šūnās

Piezīme.

Enzīmi ir norādīti kursīvā, hormoni – treknrakstā, savukārt ar bultām ir norādīts sintēzes virziens. Ar pelēku fonu apzīmēti kortikosteroīdu ceļi/produkti. Steroīdo dzimumhormonu ceļi/produkti ir apvilkti ar apli. CYP = citohroms P450; HSD = hidroksisteroīda hidrogenāze; DHEA = dehidroepiandrosterons.

8.   Cilvēka H295R virsnieru karcinomas šūnu līnija ir izdevīgs in vitro modelis, kurā pētīt ietekmi uz steroīdhormonu sintēzi (2) (7) (8) (9) (10). Šūnu līnijā H295R tiek ekspresēti gēni, kas iepriekš minētajā steroīdģenēzē (11) (15) kodē visus galvenos enzīmus (1. attēls). Tā ir unikāla īpašība, jo šo gēnu ekspresija in vivo ir atkarīga no audu veida un attīstības stadijas, un parasti nenotiek tā, ka kādos audos vai kādā atsevišķā attīstības stadijā tiktu ekspresēti visi steroīdģenēzē iesaistītie gēni (2). H295R šūnas pēc fizioloģiskajām īpašībām ir identiskas zonāli nediferencētām cilvēka augļa virsnieru dziedzera šūnām (11). Šīs šūnas ir unikāla in vitro sistēma, jo spēj producēt visus pieauguša cilvēka virsnieru garozā un gonādās sastopamos steroīdhormonus, tādējādi, lai gan tests ir validēts tikai T un E2 noteikšanai, ar tām iespējams testēt gan to, kā ietekmēta kortikosteroīdu sintēze, gan steroīdo dzimumhormonu, piemēram, androgēnu un estrogēnu, producēšanās. Testēšanas sistēmas konstatētās pārmaiņas, kas izpaužas kā T un E2 producēšanās pārmaiņas, var būt radušās ļoti daudzveidīgā testējamo ķīmisko vielu mijiedarbībā ar H295R šūnām raksturīgajām steroīdģenēzes funkcijām. To vidū ir steroīdhormonu producēšanā, transformācijā vai izvadīšanā iesaistīto enzīmu ekspresijas, sintēzes vai darbības modulācijas (12) (13) (14). Inhibētas hormonu producēšanās iemesli var būt tieša konkurējoša saistīšanās ar kādu no ceļa enzīmiem, ietekme uz tādiem līdzfaktoriem kā NADPH (nikotīnamīdadenīna dinukleotīdfosfāts) un cAMP (cikliskais adenozīnmonofosfāts) un/vai pastiprinājusies steroīdu metabolizēšanās vai nomākta dažu par steroīdģenēzes ceļa enzīmiem atbildīgu gēnu ekspresija. Inhibēšanās var notikt gan tiešos, gan netiešos ar hormonu producēšanos saistītos procesos, savukārt inducēšanās parasti ir netieša, piemēram, to ietekmē tādi līdzfaktori kā NADPH un cAMP (kā tas ir ar forskolīnu), steroīdu metabolizēšanās samazinājums (13) un/vai par steroīdģenēzi atbildīgā gēna ekspresijas pastiprināšanās.

9.   H295R testam ir vairākas priekšrocības:

—	ar to ir iespējams gan attiecībā uz T, gan attiecībā uz E2 konstatēt gan producēšanās pieaugumu, gan samazināšanos,

—

ar to iespējams tieši novērtēt kādas ķīmiskās vielas iespējamo ietekmi uz šūnu dzīvotspēju/citotoksicitāti. Tā ir svarīga īpašība, jo atšķirībā no audu eksplantu sistēmām, ko veido vairāku tipu šūnas ar atšķirīgu jutīgumu un funkcijām, paver iespēju citotoksicitātes sekas nošķirt no sekām, ko izraisījusi ķīmisko vielu tieša mijiedarbība ar steroīdģenēzes ceļiem,

—	tajā nevajag izmantot dzīvniekus,

—	šūnu līnija H295Rir tirdzniecībā pieejama.

10.   Testa galvenie ierobežojumi ir šādi:

—	attiecīgā metaboliskā spēja nav zināma, taču, domājams, ir samērā ierobežota; tāpēc, visdrīzāk, šajā testā netiks pamanītas ķīmiskās vielas, ko aktivizē vielmaiņas process,

—	H295R šūnas ir atvasinātas no virsnieru dziedzera audiem, attiecīgi to enzīmi spēj producēt gan glikokortikoīdus, gan minerālkortikoīdus, gan arī dzimumhormonus; tāpēc testā novērotos T un E2 līmeņus varētu ietekmēt tas, ka ir ietekmēta glikokortikoīdu un minerālkortikoīdu producēšanās,

—	tajā netiek mērīts DHT un tāpēc nav domājams, ka ar to varētu noteikt, vai ķīmiskā viela inhibē 5α-reduktāzi. Minētajā gadījumā var izmantot Heršbergera testu (16),

—	ar H295R testu nevarēs noteikt ķīmiskas vielas, kas steroīdģenēzi ietekmē ar hipotalāma-hipofīzes-gonādu (HPG) ass starpniecību, jo to iespējams pētīt tikai ar dzīviem dzīvniekiem.

TESTA PRINCIPS

11.   Testa mērķis ir noteikt ķīmiskas vielas, kas ietekmē T un E2 producēšanos. T ir arī E2 producēšanās ceļa starpprodukts. Ar šo testu iespējams noteikt ķīmiskās vielas, kas parasti inhibē vai inducē steroīdģenēzes ceļa enzīmus.

12.   Testu parasti veic standarta šūnu kultūras apstākļos ar 24 iedobju platēm. Testam var izmantot cita izmēra plates; tomēr attiecīgi būtu jākoriģē uzsēšanas un eksperimentu nosacījumi, lai nodrošinātu, ka joprojām tiek ievēroti veiktspējas kritēriji.

13.   Pēc 24 stundu aklimatizācijas perioda vairākiedobju platēs vismaz trīskārt replicētus šūnu paraugus 48 stundas eksponē septiņām testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijām. Negatīvajai un pozitīvajai kontrolei noteiktās koncentrācijās izmanto šķīdinātāju, kādu zināmu hormonu producēšanās inhibētāju un tādu pašu inducētāju. Pēc eksponēšanas beigām barotni no visām iedobēm izņem. Tūlīt pēc barotnes izņemšanas analizē katras iedobes šūnu dzīvotspēju. Hormonu koncentrāciju barotnē var mērīt ar dažādām metodēm, arī ar tirdzniecībā pieejamiem hormonu līmeņa mērīšanas komplektiem un/vai aparātmetodēm, piemēram, šķidrumhromatogrāfiju-masspektrometriju (LC-MS). Datus izsaka izmaiņu kārtās attiecībā pret kontroliedobi ar šķīdinātāju un zemākās novērojamās ietekmes koncentrāciju (LOEC). Ja testā iegūts negatīvs rezultāts, augstāko testēto koncentrāciju pārskatā norāda kā nenovērojamās ietekmes koncentrāciju (NOEC). Secinājumiem par ķīmiskas vielas spēju ietekmēt steroīdģenēzi būtu jābalstās uz vismaz divām neatkarīgām testa izpildēm. Pirmo testa izpildi var izmantot par diapazona noteikšanas testu, un attiecīgā gadījumā – ja rodas problēmas ar šķīdību vai citotoksicitāti vai ja šķiet, ka ķīmiskās vielas iedarbība vērojama testēto koncentrāciju diapazona galā, – pēc tam otrajā un trešajā izpildē koncentrācijas koriģē.

ŠŪNU AUDZĒŠANAS PROCEDŪRA

Šūnu līnija

14.   Līnijas NCI-H295R šūnas var komerciāli iegādāties no Amerikas tipveida kultūru kolekcijas (ATCC), parakstot nolīgumu par materiālu nodošanu (MTA) (14).

Ievads

15.   Tā kā, šūnām novecojot/augot to pasāžām (2), to spēja producēt E2 mainās, pirms izmantošanas tās jāaudzē saskaņā ar īpašu protokolu un jānorāda pasāžu skaits kopš šūnu atlaidināšanas, kā arī, pēc cik pasāžām šūnas tikušas sasaldētas un novietotas glabāšanai šķidrajā slāpeklī. Pirmais skaitlis ir faktiskās šūnu pasāžas kārtas skaitlis un otrais – tās pasāžas kārtas skaitlis, kurā šūnas tikušas sasaldētas un novietotas glabāšanā. Piemēram, ja šūnas sasaldē pēc piektās pasāžas un pēc tam koloniju trīs reizes sadala (4 pasāžas, ja svaigi atlaidinātās šūnas uzskata par pirmo pasāžu), tad pēc atkārtotas izaudzēšanas tās marķē ar 4.5. Numerācijas shēmas paraugs sniegts validācijas pārskata I papildinājumā (4).

16.   Par papildināto barotņu un sasaldēšanas barotņu pamatu izmanto barotnes izejmateriālu. Papildinātās barotnes ir nepieciešamas šūnu audzēšanā. Sasaldēšanas barotne ir īpaši izstrādāta tā, lai bez kaitīgām sekām būtu iespējama šūnu sasaldēšana ilgstošai glabāšanai. Pirms izmantošanas jāizanalizē T un E2 fona koncentrācija vienā no papildinātās barotnes sastāvdaļām Nu-serum (vai serumā ar līdzvērtīgām īpašībām, attiecībā uz kuru ir pierādīts, ka ar to var iegūt testēšanas veiktspējas un kvalitātes kontroles prasībām atbilstošus datus). Šo šķīdumu gatavošana ir aprakstīta validācijas pārskata (4) II papildinājumā.

17.   Pēc tam, kad H295R šūnu kultūra ir ieaudzēta no sākotnējās ATCC partijas, šūnas būtu jāaudzē piecas pasāžas (proti, šūnu kopumu sadala četras reizes). Pēc tam piektās pasāžas šūnas sasaldē šķidrā slāpeklī uzglabāšanai. Pirms šūnas sasaldēt, kvalitātes kontroles platē izaudzē iepriekšējās, ceturtās pasāžas, šūnu paraugu (sk. 36. un 37. punktu), lai pārbaudītu, vai hormonu pamatproducēšanās un reaģēšana uz pozitīvās kontroles ķīmiskajām vielām apmierina 5. tabulā definētos testa kvalitātes kontroles kritērijus.

18.   H295R šūnas ir jāaudzē un pēc tam šķidrā slāpeklī jāsasaldē un jāglabā, nodrošinot, ka audzēšanai un lietošanai ir pastāvīgi pieejamas piemērotas pasāžas/vecuma šūnas. Pēc tam, kad jauna (15) vai sasaldēta (16) šūnu partija ievadīta H295R testam piemērotā barotnē, maksimālais pasāžu skaits nedrīkstētu pārsniegt 10. Piemēram, attiecībā uz šūnu kultūrām no piektajā pasāžā sasaldētas partijas pieņemams pasāžu skaits būtu no 4.5. līdz 10.5. pasāžai. Attiecībā uz šūnām, ko sāk audzēt no sasaldētajām partijām, jāievēro 19. punktā aprakstītā procedūra. Pirms šīs šūnas izmantot testā, no tām būtu jāizaudzē vismaz četras (4) papildu pasāžas (4.5. pasāža).

Šūnu audzēšana no sasaldēta izejmateriāla

19.   No glabāšanas šķidrajā slāpeklī izņemot jaunu audzēšanai un testēšanai paredzētu šūnu partiju, jāievēro procedūra, ko izmanto šūnu audzēšanai no sasaldēta izejmateriāla. Šī procedūra ir detalizēti aprakstīta validācijas pārskata (4) III papildinājumā. Šūnas izņem no šķidrā slāpekļa glabātuves, strauji atlaidina, novieto centrifūgas mēģenē ar papildinātu barotni, istabas temperatūrā centrifugē, papildinātā barotnē atkārtoti suspendē un pārvieto uz šūnu kultūru kolbām. Nākamajā dienā barotne jāmaina. H295R līnijas šūnas kultivē inkubatorā 37 °C temperatūrā pie CO2 koncentrācijas gaisā 5 %, un barotni 2–3 reizes nedēļā atjaunina. Kad šūnas ir apmēram par 85–90 % konfluentas, to kopumu ieteicams sadalīt. Šūnu sadalīšana ir nepieciešama, lai nodrošinātu, ka šūnas ir veselīgas un aug, un lai šūnas uzturētu piemērotas bioloģisko testu veikšanai. Šūnas trīs reizes skalo ar fosfātu fizioloģisko buferšķīdumu (PBS bez Ca2+ Mg2+) un atdala no kultūru kolbas sienām, fosfātu fizioloģiskajam šķīdumam (bez Ca2+ Mg2+) pievienojot attiecīgu atdalīšanos veicinošu enzīmu, piem., tripsīnu. Tūlīt pēc tam, kad šūnas atdalījušās no kultūru kolbas sienām, enzīma darbība būtu jāaptur, pievienojot papildinātu barotni, kuras apjoms trīsreiz pārsniedz enzīmu apstrādei izmantoto tilpumu. Šūnas ievieto centrifūgas mēģenē, istabas temperatūrā centrifugē, nolej supernatantu un šūnu nogulas papildinātajā barotnē atkārtoti suspendē. Attiecīgu šūnu šķīduma daudzumu ievieto jaunajā kultūru kolbā. Šūnu šķīduma daudzumu ieteicams koriģēt tā, lai pēc 5–7 dienām šūnas būtu konfluentas. Ieteicamā apakškultūru proporcija ir no 1:3 līdz 1:4. Plate rūpīgi jāmarķē. Tagad šūnas ir gatavas izmantošanai testā, un to pārpalikumu ieteicams sasaldēt šķidrajā slāpeklī, kā aprakstīts 20. punktā.

H295R šūnu sasaldēšana (šūnu sagatavošana glabāšanai šķidrajā slāpeklī)

20.   Lai līnijas H295R šūnas sagatavotu sasaldēšanai, iepriekš aprakstītā šūnu koloniju atdalīšanas procedūra jāievēro līdz solim, kur notiek centrifūgas mēģenes apakšā nogulsnējušos šūnu atkārtota suspendēšana. Tajā brīdī šūnu nogulas atkārtoti suspendē sasaldēšanas barotnē. Šķidrumu pārlej kriogēnajā kivetē, attiecīgi marķē un – 80 °C 24 stundas saldē, kiveti pēc tam novietojot glabāšanai šķidrajā slāpeklī. Šī procedūra ir detalizēti aprakstīta validācijas pārskata (4) III papildinājumā.

Testa šūnu ievietošana platēs un pirmsinkubācijas posms

21.   Cik būs nepieciešams 24 iedobju plašu, kas sagatavotas saskaņā ar 19. punktu, ir atkarīgs no testējamo ķīmisko vielu skaita un no šūnu konfluences kultūru traukos. Parasti no vienas kultūru kolbas (75 cm2), kurā šūnu konfluence ir 80–90 %, var iegūt šūnu daudzumu, ar ko pietiek vienai līdz pusotrai (24 iedobju) platei ar mērķblīvumu 200 000 līdz 300 000 šūnu uz barotnes mililitru – tādā veidā 24 stundu laikā iedobēs iegūstama apmēram 50–60 % konfluence (2. attēls). Tāds šajā testā parasti ir optimālais šūnu blīvums, kādā notiek hormonu producēšanās. Ja šūnu blīvums ir augstāks, gan T, gan E2 producēšanās modeļi mainās. Pirms testu veikt pirmo reizi, ieteicams testēt dažāda blīvuma uzsējumus, no 200 000 līdz 300 000 šūnu uz ml, un tālākiem eksperimentiem jāizraugās blīvums, ar kādu 24 stundu laikā iedobē iegūst 50–60 % konfluenci.

2. attēls

Stāvoklis, kas iegūts pēc 24 stundām no 24 iedobju kultūru platē uzsētām H295R līnijas šūnām ar blīvumu 50 %, mikrofotoattēls pie iedobes malas (A) un centrā (B).

22.   Barotni ar pipeti izņem no kultūru kolbas, un šūnas trīs reizes noskalo ar sterilu PBS (bez Ca2+Mg2+). Lai šūnas atdalītu no kultūru kolbas sienām, tajā pievieno enzīmu šķīdumu (fosfātu fizioloģiskajā buferšķīdumā). Kad šūnu atdalīšanās procesā pagājis pietiekams laiks, enzīma darbība būtu jāaptur, pievienojot papildinātu barotni, kuras apjoms trīsreiz pārsniedz enzīmu apstrādē izmantoto tilpumu. Šūnas ievieto centrifūgas mēģenē, istabas temperatūrā centrifugē, nolej supernatantu un šūnu nogulas papildinātajā barotnē atkārtoti suspendē. Šūnu blīvumu aprēķina, piemēram, ar hemocitometru vai šūnu skaitītāju. Šūnu šķīdums būtu jāatšķaida līdz blīvumam, kas vēlams ievietošanai platē, un rūpīgi jāsamaisa, lai nodrošinātu šūnu blīvuma homogenitāti. Šūnas būtu jāuzsēj, uz iedobi izmantojot 1 ml šūnu šķīduma, un plates un iedobes jānumurē. Plates ar uzsējumu 24 stundas inkubē 37 °C temperatūrā pie CO2 koncentrācijas gaisā 5 %, lai šūnas iedobēs varētu pielipināties.

KVALITĀTES KONTROLES PRASĪBAS

23.   Ir ļoti svarīgi, lai devu ievadīšanas laikā iedobēs nonāktu precīzs šķīdumu un paraugu tilpums, jo no šiem tilpumiem ir atkarīgas testa rezultātu aprēķināšanā izmantotās koncentrācijas.

24.   Pirms sākt ieaudzēt šūnu kultūras un ar tām veikt jebkādus testus, katrai laboratorijai būtu jāpierāda tās izmantotās hormonu līmeņa mērīšanas sistēmas jutība (29.–31. punkts).

25.   Ja paredzēts izmantot uz antivielu metodēm balstītus hormonu līmeņa mērīšanas testus, pirms sākt testēšanu, ir jāanalizē testējamo ķīmisko vielu iespējamā interference ar hormonu līmeņa mērīšanas sistēmu, kas izmantota T un E2 kvantitatīvā noteikšanā, kā minēts 32. punktā.

26.   Testā par šķīdinātāju ieteicams izmantot DMSO (dimetilsulfoksīdu). Ja izmanto alternatīvu šķīdinātāju, jānosaka šādi faktori:

—	testējamās ķīmiskās vielas, forskolīna un prohlorāzes šķīdība šķīdinātājā un

—	citotoksicitāte, to izsakot kā šķīdinātāja koncentrācijas funkciju.

Pieļaujamai maksimālai šķīdinātāja koncentrācijai nav ieteicams pārsniegt šķīdinātāja vismazāk toksiskās koncentrācijas desmitkārtēju atšķaidījumu.

27.   Pirms testēšanu veikt pirmo reizi, laboratorijai, kā aprakstīts 33.–35. punktā, būtu jāveic kvalifikācijas eksperiments, kurā pierāda, ka laboratorija spēj uzturēt un sasniegt attiecīgos ķīmisko vielu testēšanai nepieciešamos šūnu kultivēšanas un eksperimentu apstākļus.

28.   Pirms testēšanā sāk izmantot jaunu partiju, nepieciešama izpilde ar kontroles plati, lai izvērtētu šūnu rādītājus, kā aprakstīts 36. un 37. punktā.

Hormonu līmeņa mērīšanas sistēmas veiktspēja

Metodes jutība, pareizība, precizitāte un šķērsreaktivitāte ar parauga matrici

29.   Katra laboratorija var izvēlēties, kādu hormonu līmeņa mērīšanas sistēmu izmantot, lai analizētu T un E2 producēšanos H295R līnijas šūnās, taču šai metodei jāatbilst veiktspējas kritērijiem, arī kvantitatīvās noteikšanas robežas (LOQ) kritērijam. Nominālvērtības ir 100 pg/ml attiecībā uz T un 10 pg/ml attiecībā uz E2, to pamatā ir validācijas pētījumos novērotie hormonu producēšanās pamatlīmeņi. Tomēr atkarībā no testa veicējas laboratorijas panāktajiem hormonu producēšanās pamatlīmeņiem var būt lietderīgi izmantot augstāku vai zemāku līmeni. Pirms sākt testēt kvalitātes kontroles plati un izpildīt pašu testu, laboratorijai jāpierāda, ka izmantojamā hormonu testā hormonu koncentrācijas mērīšanas pareizība un precizitāte ir pietiekama, lai, analizējot papildinātu barotni, kurai pievienota iekšēja hormona kontroldeva, tiktu apmierināti 1. un 5. tabulā norādītie QC kritēriji. Papildinātajā barotnē katrs hormons būtu jāanalizē, zināmu tā devu pievienojot vismaz trīs koncentrācijās (piem., par zemākajām pievienotās devas koncentrācijām attiecībā uz T var izmantot 100, 500 un 2 500 pg/ml, attiecībā uz E2 – 10, 50 un 250 pg/ml, vai var izmantot tādas zemākās iespējamās koncentrācijas, kas balstās uz izraudzītās hormonu līmeņa mērīšanas noteikšanas robežām). Neekstrahētos paraugos mērītajām hormonu koncentrācijām vajadzētu būt 30 % nominālās koncentrācijas robežās, un viena un tā paša parauga replicēto mērījumu variācija nedrīkstētu pārsniegt 25 % (QC papildkritērijus sk. arī 8. tabulā). Ja šie QC kritēriji ir apmierināti, tiek uzskatīts, ka izraudzītais hormonu līmeņa mērīšanas tests ir pietiekami pareizs, precīzs un ka tajā nav vērojama tāda šķērsreaktivitāte ar barotnes sastāvdaļām (parauga matrici), kas varētu būtiski ietekmēt testa iznākumu. Šajā gadījumā, pirms mērīt hormonu līmeni, paraugi nav jāekstrahē.

30.   Ja 1. un 8. tabulas QC kritēriji nav izpildīti, iespējams, ka būtisku ietekmi rada matrice, un ieteicams veikt eksperimentu ar ekstrahētu barotni, kam pievienota zināma deva. Ekstrakcijas procedūras paraugs sniegts validācijas pārskata (4) II papildinājumā. Ekstrahētajos paraugos hormonu koncentrācija jāmēra trim identiskiem paraugiem (17). Ja iespējams pierādīt, ka pēc ekstrahēšanas, vērtējot pēc QC (kvalitātes kontroles) kritērijiem, barotnes sastāvdaļas neinterferē ar hormonu noteikšanas metodi, visi turpmākie eksperimenti jāveic ar ekstrahētiem paraugiem. Ja pēc ekstrahēšanas atbilstību QC kritērijiem nodrošināt nav iespējams, izmantotā hormonu līmeņa mērīšanas sistēma H295R steroīdģenēzes testa nolūkam nav piemērota un jāizmanto alternatīva hormonu noteikšanas metode.

Standartlīkne

31.   Šķīdinātāja kontroliedobēs (SC) hormonu koncentrācijai jāatbilst standartlīknes lineārajai daļai. Ieteicams, lai SC vērtības būtu tuvu lineārās daļas centram, kas nodrošina iespēju mērīt hormonu sintēzes inducēšanos un inhibēšanos. Attiecīgi jāizraugās līmeņa mērīšanai paredzētie barotnes šķīdumi (vai ekstrakti). Lineārā sakarība ir nosakāma ar piemērotu statistisku pieeju.

Ķīmisko vielu inteferences tests

32.   Ja hormonu līmeņa mērīšanai tiks izmantoti antivielu testi, piemēram, imūnfermentatīvā analīze (ELISA testi) un radioimunoloģiskā metode (RIA testi), pirms sākt ķīmisko vielu faktisko testēšanu, ir jātestē katras ķīmiskās vielas iespējamā interference ar paredzēto hormonu līmeņa mērīšanas sistēmu (validācijas pārskata (4) III papildinājums), jo ķīmisko vielu interference ar šiem testiem ir iespējama (17). Ja hormonu analīzē noteiktā interference ir ≥ 20 % no hormonu T un/vai E2 pamatproducēšanās, ar visām testējamās ķīmiskās vielas šķīdumu koncentrācijām būtu jāizpilda Ķīmisko vielu interferences tests ar hormonu testu (aprakstīts validācijas pārskata (4) 5.0. sadaļas III papildinājumā), lai noteiktu robeždevu, pie kuras rodas būtiska (≥ 20 %) interference. Ja interference nesasniedz 30 %, rezultātus var koriģēt attiecībā uz interferenci. Ja interference pārsniedz 30 %, dati par šīm koncentrācijām nav derīgi un ir jāatmet. Ja būtiska testējamās ķīmiskās vielas interference ar hormonu līmeņa mērīšanas sistēmu ir vērojama vairāk nekā vienā koncentrācijā, pie kuras nav liecību par citotoksicitāti, jāizmanto cita hormonu līmeņa mērīšanas sistēma. Lai izvairītos no interferences ar piesārņojošām ķīmiskām vielām, hormonus no barotnes ieteicams ekstrahēt ar piemērota šķīdinātāja starpniecību, un iespējamās metodes ir norādītas validācijas pārskatā (4).

1. tabula

Hormonu līmeņa mērīšanas sistēmu veiktspējas kritēriji

Parametrs	Kritērijs
Mērīšanas metodes jutība	Kvantitatīvās noteikšanas robeža T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (18)
Hormonu ekstrahēšanas efektivitāte (tikai gadījumos, kur ekstrahēšana nepieciešama)	Vidējais atgūstamības līmenis (pamatojoties uz trīs identisku paraugu mērījumiem) mērījumos ar pievienotu zināmu hormona devu no pievienotā daudzuma nedrīkst atšķirties vairāk kā par 30 %.
Ķīmisko vielu interference testā (tikai sistēmām, kuru pamatā ir antivielu metodes)	Nevajadzētu būt vērojamai būtiskai (≥ 30 % no attiecīgā hormona pamatproducēšanās līmeņa) šķērsreaktivitātei ar jebkādiem šūnu producētajiem hormoniem (19)  (20).

Laboratorijas kvalifikācijas tests

33.   Pirms testēt nezināmas ķīmiskas vielas, laboratorijai ar kvalifikācijas testu jāpierāda, ka tā spēj sasniegt un uzturēt attiecīgus sekmīgai testa izpildei nepieciešamus šūnu kultivēšanas un testēšanas apstākļus. Tā kā jebkura testa veikšana ir tieši saistīta ar laboratorijas personālu, kas testu veic, šīs procedūras daļēji jāatkārto, ja laboratorijas darbinieki mainās.

34.   Kvalifikācijas testu veic ar tādiem pašiem nosacījumiem, kā norādīts 38.–40. punktā, šūnas septiņu koncentrāciju pieauguma secībā eksponējot spēcīgu, mērenu un vāju inducētāju un inhibētāju iedarbībai, kā arī negatīvās kontroles ķīmiskai vielai (sk. 2. tabulu). Konkrētāk, testējamo ķīmisko vielu vidū ir spēcīgais inducētājs forskolīns (CAS Nr. 66575-29-9); spēcīgais inhibētājs prohlorāze (CAS Nr. 67747-09-5); mērenais inducētājs atrazīns (CAS Nr. 1912-24-9); mērenais inhibētājs aminoglutetimīds (CAS Nr. 125-84-8); vājais (E2 producēšanās) inducētājs un vājais (T producēšanās) inhibētājs bisfenols A (CAS Nr. 80-05-7); negatīvās kontroles ķīmiskā viela – cilvēka horioniskais gonadotropīns (HCG) (CAS Nr. 9002-61-3), kā redzams 2. tabulā. Katrai ķīmiskajai vielai ar atsevišķu plati izpilda testus saskaņā ar 6. tabulā sniegto formātu. Katrā kārtējā dienas izpildē, kurā izmanto standartvielas, jāiekļauj viena QC plate (4. tabula, 36.–37. punkts)

2. tabula

Standartvielas un ekspozīcijas koncentrācijas

Standartviela	Testējamās koncentrācijas [μM]
Prohlorāze	0 (21); 0,01; 0,03; 0,1; 0,3; 1; 3; 10
Forskolīns	0 (21); 0,03; 0,1; 0,3; 1; 3; 10; 30
Atrazīns	0 (21); 0,03; 0,1; 1; 3; 10; 30; 100
Aminoglutetimīds	0 (21); 0,03; 0,1; 1; 3; 10; 30; 100
Bisfenols A	0 (21); 0,03; 0,1; 1; 3; 10; 30; 100
HCG	0 (21); 0,03; 0,1; 1; 3; 10; 30; 100

Laboratorijas kvalifikācijas testā H295R līnijas šūnas standartvielām būtu jāeksponē 24 iedobju platēs. Visas testējamo ķīmisko vielu devas izsaka μM. Devas jāievada ar DMSO buferšķīdumu tilpumkoncentrācijā 0,1 % uz iedobi. Katra testējamā koncentrācija būtu jāpārbauda trīs identiskās iedobēs (6. tabula). Katrai ķīmiskajai vielai izmanto atsevišķu plati. Katras dienas izpildē izmanto vienu QC plati.

35.   Jāveic šūnu dzīvotspējas analīze un hormonu analīze, kā paredzēts 42. līdz 46. punktā. Robežvērtība (zemākās novērojamās ietekmes koncentrācija (LOEC)) un lēmums par kvalificēšanu jāatspoguļo pārskatā un jāsalīdzina ar 3. tabulas vērtībām. Datus uzskata par pieņemamiem, ja tie apmierina LOEC un lēmumu kvalificēšanu saskaņā ar 3. tabulu.

3. tabula

Robežvērtības (LOEC) un lēmumu kvalificēšana attiecībā uz standartvielām

	CAS Nr.	LOEC [μM]		Kā kvalificē lēmumu
		T	E2	T	E2
Prohlorāze	67747-09-5	≤ 0,1	≤ 1,0	+ (22) (Inhibēšanās)	+ (Inhibēšanās)
Forskolīns	66575-29-9	≤ 10	≤ 0,1	+ (Inducēšanās)	+ (Inducēšanās)
Atrazīns	1912-24-9	≤ 100	≤ 10	+ (Inducēšanās)	+ (Inducēšanās)
Aminoglutetimīds	125-84-8	≤ 100	≤ 100	+ (Inhibēšanās)	+ (Inhibēšanās)
Bisfenols A	80-05-7	≤ 10	≤ 10	+ (Inhibēšanās)	+ (Inducēšanās)
HCG	9002-61-3	n. p.	n. p.	Negatīvs	Negatīvs

Kvalitātes kontroles plate

36.   Kvalitātes kontroles (QC) plati izmanto, lai verificētu H295R šūnu rādītājus parastajos kultivēšanas apstākļos un lai izveidotu vēsturisku datubāzi ar hormonu koncentrācijām šķīdinātāja kontrolē, pozitīvā kontrolē un negatīvā kontrolē, un laika gaitā arī citiem kvalitātes kontroles pasākumiem.

—	H295R līnijas šūnu rezultāti būtu jānovērtē, katru jaunu ATCC partiju vai iepriekš sasaldētu šūnu izejmateriālu pēc tam, kad tas izmantots pirmo reizi, pārbaudot ar QC plati, ja vien ar attiecīgo šūnu partiju nav izpildīts laboratorijas kvalifikācijas tests (32.–34. punkts).

—	Ķīmisko vielu testēšanā ar kvalitātes kontroles plates palīdzību pilnīgi novērtē testa apstākļus (piem., šūnu dzīvotspēju, šķīdinātāja kontroles, negatīvās un pozitīvās kontroles un mainību šajā testā un salīdzinājumā ar citiem testiem), un kvalitātes kontroles platei jābūt katrā testa izpildē.

37.   Kvalitātes kontroles testu veic 24 iedobju platē, ievērojot tās pašas inkubācijas, devu ievadīšanas, šūnu dzīvotspējas/citotoksicitātes, hormonu ekstrakcijas un hormonu analīzes procedūras, kā aprakstīts 38.–46. punktā attiecībā uz ķīmisko vielu testēšanu. Uz QC plates ir tukši paraugi, šķīdinātāja kontroles un – divās koncentrācijās – kāds zināms E2 un T sintēzes inducētājs (forskolīns, 1, 10 μM) un zināms inhibētājs (prohlorāze, 0,1, 1 μM). Turklāt dažās iedobēs par dzīvotspējas/citotoksicitātes testa pozitīvo kontroli izmanto MeOH. Plates izkārtojuma detalizēts apraksts sniegts 4. tabulā. Kritēriji, kas jāapmierina attiecībā uz kvalitātes kontroles plati, norādīti 5. tabulā. Gan šķīdinātāja kontroliedobē, gan tukšā parauga iedobēs hormoniem T un E2 jāproducējas minimālā pamatapjomā.

4. tabula

Neeksponētu H295R šūnu un zināmiem inhibētājiem (PRO = prohlorāze) un stimulētājiem (FOR = forskolīns) eksponētu šūnu E2 un T producēšanās rādītāju kvalitātes kontroles plates izkārtojums. Pēc ekspozīcijas beigām un barotnes izņemšanas visās MeOH iedobēs pievienos 70 % metanola šķīdumu, to izmantojot par citotoksicitātes pozitīvo kontroli (sk. citotoksicitātes testu validācijas pārskata (4) III papildinājumā).

	1	2	3	4	5	6
A	Tukšs (23)	Tukšs (23)	Tukšs (23)	Tukšs (23) (+ MeOH) (24)	Tukšs (23) (+ MeOH) (24)	Tukšs (23) (+ MeOH) (24)
B	DMSO (25) 1 μl	DMSO (25) 1 μl	DMSO (25) 1 μl	DMSO (25) 1 μl (+ MeOH) (24)	DMSO (25) 1 μl (+ MeOH) (24)	DMSO (25) 1 μl (+ MeOH) (24)
C	FOR 1 μM	FOR 1 μM	FOR 1 μM	PRO 0,1 μM	PRO 0,1 μM	PRO 0,1 μM
D	FOR 10 μM	FOR 10 μM	FOR 10 μM	PRO 1 μM	PRO 1 μM	PRO 1 μM

5. tabula

Veiktspējas kritēriji attiecībā uz kvalitātes kontroles plati

	T	E2
Hormona pamatproducēšanās šķīdinātāja kontroliedobē (SC)	≥ 5 reiz LOQ	≥ 2,5 reiz LOQ
Inducēšanās (10 μM forskolīna)	≥ 1,5 reiz SC	≥ 7,5 reiz SC
Inhibēšanās (1 μM prohlorāzes)	≤ 0,5 reiz SC	≤ 0,5 reiz SC

Eksponēšana ķīmiskajai vielai: procedūra

38.   Priekšinkubētās šūnas izņem no inkubatora (21. punkts) un pārbauda zem mikroskopa, lai pirms devu ievadīšanas pārliecinātos, ka tās ir piemērotā stāvoklī (adhēzija, morfoloģija).

39.   Šūnas ievieto biodrošā skapī, papildināto barotni izņem un aizstāj ar jaunu papildināto barotni (1 ml uz iedobi). Šajā testēšanas metodē par šķīdinātāju ieteicams izmantot DMSO. Ja kādu apsvērumu dēļ izvēlas citu šķīdinātāju, tas zinātniski jāpamato. Šūnas testējamai ķīmiskai vielai eksponē, uz 1 ml papildinātās barotnes (iedobes tilpumu) pievienojot 1 μl attiecīgās vielas koncentrācijas dimetilsulfoksīdā (sk. validācijas pārskata (4) II papildinājumu). Šādi iedobēs iegūst galīgo DMSO šķīduma koncentrāciju 0,1 %. Lai paraugi būtu adekvāti samaisīti, parasti ieteicams attiecīgo testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju dimetilsulfoksīdā samaisīt ar papildināto barotni tā, lai iegūtu katras devas vēlamo galīgo koncentrāciju, un šo maisījumu iedobē ievietot tūlīt pēc līdzšinējās barotnes izņemšanas. Izmantojot šo risinājumu, visās iedobēs jānodrošina nemainīga DMSO šķīduma koncentrācija (0,1 %). Iedobēs, kurās ir divas augstākās koncentrācijas, ar stereomikroskopu vizuāli novērtē, vai neveidojas nogulsnes vai duļķes, kas liecina, ka testējamā viela nav pilnīgi izšķīdināma. Minētajos apstākļos (duļķes, nogulšņu veidošanās) pārbauda arī iedobes ar nākamajām zemākajām koncentrācijām u. tjpr., un šķīdumā pilnīgi neizšķīdušās koncentrācijas no tālākas izvērtēšanas un analīzes izslēdz. Plati uz 48 stundām novieto atpakaļ inkubatorā 37 °C temperatūrā pie CO2 koncentrācijas gaisā 5 %. Testējamo ķīmisko vielu plates izkārtojums sniegts 6. tabulā. “1.–7. koncentrācija” apzīmē testējamās ķīmiskās vielas izvietojumu devu pieauguma secībā.

6. tabula

Devu ievadīšanas shēma H295R šūnu eksponēšanai testējamām ķīmiskajām vielām 24 iedobju platē.

	1	2	3	4	5	6
A	DMSO	DMSO	DMSO	4. koncentrācija	4. koncentrācija	4. koncentrācija
B	1. koncentrācija	1. koncentrācija	1. koncentrācija	5. koncentrācija	5. koncentrācija	5. koncentrācija
C	2. koncentrācija	2. koncentrācija	2. koncentrācija	6. koncentrācija	6. koncentrācija	6. koncentrācija
D	3. koncentrācija	3. koncentrācija	3. koncentrācija	7. koncentrācija	7. koncentrācija	7. koncentrācija

40.   Pēc 48 stundām ekspozīcijas plates no inkubatora izņem un zem mikroskopa katrā iedobē pārbauda šūnu stāvokli (adhēziju, morfoloģiju, konfluenci) un citotoksicitātes pazīmes. Katras iedobes barotni sadala divos vienādos daudzumos (katrā apmēram 490 μl) un ievieto divās atsevišķās attiecīgi marķētās kivetēs (t. i., viena alikvota, kas katrai iedobei ir rezerves paraugs). Lai šūnas neizžūtu, barotni izņem pa vienai rindai vai šķērsrindai un aizstāj ar šūnu dzīvotspējas/citotoksicitātes testa barotni. Ja šūnu dzīvotspēja/citotoksicitāte netiek mērīta tūlīt, katrā iedobē pievieno 200 μl PBS ar Ca2+ un Mg2+. Līdz tālākai apstrādei, kurā analizē hormonu koncentrācijas (sk. 44.–46. punktu), šīs barotnes sasaldē – 80 °C temperatūrā. Lai gan – 80 °C temperatūrā glabātā barotnē T un E2 parasti vismaz trīs mēnešus ir stabili, katrā laboratorijā būtu jādokumentē hormonu stabilitāte glabāšanas laikā.

41.   Tūlīt pēc barotnes izņemšanas katrā eksponētajā platē nosaka šūnu dzīvotspēju/citotoksicitāti.

Šūnu dzīvotspējas noteikšana

42.   Lai noteiktu, kā testējamā ķīmiskā viela, iespējams, ietekmē šūnu dzīvotspēju, var izmantot pašizraudzītu šūnu dzīvotspējas/citotoksicitātes testu. Testam jābūt tādam, lai ar to varētu iegūt iedobes dzīvotspējīgo šūnu procenta patiesu mērījumu, vai arī ir jāpierāda, ka tests ir tieši salīdzināms ar Live/Dead® testu (sk. validācijas pārskata (4) III papildinājumu) (proti, ar Live/Dead® testa lineāru funkciju). Alternatīvs tests, kura līdzvērtīga darbība ir pierādīta, ir MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijbromīda] tests (18). Šūnu dzīvotspējas novērtēšana ar iepriekš minētajām metodēm ir relatīvs mērījums, kurā nav noteikti redzamas lineāras sakarības ar šūnu absolūto skaitu iedobē. Tāpēc analizētājam katra iedobe paralēli būtu subjektīvi jānovērtē vizuāli un digitāli jānofotografē iedobes ar SC un divām augstākajām koncentrācijām, kuras nav citotoksiskas, un attēli jānoglabā arhīvā, lai pēc tam nepieciešamības gadījumā varētu novērtēt faktisko šūnu blīvumu. Ja iedobes vizuāla apskate vai dzīvotspējas/citotoksicitātes tests liecina, ka šūnu skaits varētu būt palielinājies, konstatējums par šādu palielinājumu jāverificē. Ja verifikācija apstiprina šūnu skaita pieaugumu, tas jānorāda testēšanas pārskatā. Šūnu dzīvotspēju izsaka attiecībā pret vidējo atbildes reakciju šķīduma kontroliedobēs, kurās šūnu dzīvotspēju uzskata par 100 %, un to aprēķina atbilstoši izmantotajam šūnu dzīvotspējas/citotoksicitātes testam. MTT testā var izmantot šādu formulu:

dzīvotspējīgo šūnu % = (atbildes reakcija iedobē – vidējā atbildes reakcija ar MeOH apstrādātās [= 100 % šūnu mirušas] iedobēs) ÷ (vidējā SC iedobju reakcija – vidējā reakcija ar MeOH apstrādātās [= 100 % šūnu mirušas] iedobēs).

43.   Galīgajā datu analīzē nedrīkstētu iekļaut iedobes, kurās dzīvotspēja salīdzinājumā ar SC iedobju vidējo dzīvotspēju (= 100 % dzīvotspēja) ir zemāka par 80 %. Steroīdģenēzes inhibēšanās, kas notiek pie gandrīz 20 % citotoksicitātes, būtu rūpīgi jāizvērtē, lai nodrošinātu, ka inhibēšanās cēlonis nav citotoksicitāte.

Hormonu analīze

44.   Hormonu līmeņa mērīšanas sistēmas T un E2 analīzei laboratorijas var izvēlēties. Lai pagatavotu šķīdumus ar standartlīknes lineārajai daļai atbilstošu koncentrāciju, var izmantot katras apstrādātās grupas barotņu liekās alikvotas. Kā norādīts 29. punktā, lai laboratorijas pierādītu savas hormonu noteikšanas sistēmas (piem., ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) atbilstību QC kritērijiem, pirms QC izpildēm vai ķīmisko vielu testēšanas tajās jāizanalizē papildināta barotne, kurai pievienota iekšēja hormona kontroldeva. Lai nodrošinātu, ka ar hormonu līmeņa mērīšanu neinterferē testa sistēmas sastāvdaļas, pirms mērīt līmeni, hormonus var būt nepieciešams ekstrahēt no barotnes (ekstrahēšanas nepieciešamības nosacījumus sk. 30. punktā). Ekstrahēšanu ieteicams veikt saskaņā ar validācijas pārskata (4) III papildinājuma procedūrām.

45.   Ja hormonu producēšanās mērīšanai izmanto tirdzniecībā pieejamu testa komplektu, hormonu analīze jāveic tā, kā specificēts testa komplekta ražotāja rokasgrāmatās. Lielākajai daļai ražotāju ir sava unikāla hormonu analīzes metode. Paraugu atšķaidījums jānoregulē tā, lai šķīdinātāja kontroliedobēm paredzētās hormonu koncentrācijas atrastos konkrētā testa standartlīknes lineārā diapazona centrā (validācijas pārskata (4) III papildinājums). Vērtības ārpus standartlīknes lineārās daļas jāatmet.

46.   Galīgās hormonu koncentrācijas aprēķina šādi:

Piemērs:

Ekstrahēti:	450 μl barotnes
Rekonstituēšana notikusi:	250 mikrolitros testa buferšķīduma
Testā izmantotais atšķaidījums:	1:10 (lai nodrošinātu, ka paraugs atrodas standartlīknes lineārajā diapazonā)
Testā izmantotā hormonu koncentrācija	150 pg/ml (daudzums jau koriģēts attiecībā uz koncentrāciju testējamā parauga mililitrā)
Atgūstamība:	89 %
Galīgā hormonu koncentrācija =	(Hormonu koncentrācija (uz ml) ÷ atgūtais daudzums) (atšķaidījuma koeficients)
Galīgā hormonu koncentrācija =	(150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 10 = 936,3 pg/ml

Testējamo koncentrāciju izvēle

47.   Testam vajadzīgas vismaz divas neatkarīgas izpildes. Ja vien testējamās koncentrācijas neizraugās, balstoties uz iepriekšēju informāciju, piemēram, šķīdības robežām vai citotoksicitāti, pirmajā izpildē testējamām koncentrācijām vajadzētu būt ar intervāliem log10 un maksimālajai koncentrācijai – 10-3 M. Ja ķīmiskā viela ir šķīstoša un nevienā no testētajām koncentrācijām nav novērota tās citotoksicitāte, un ja pirmajā izpildē ar visām koncentrācijām rezultāts bijis negatīvs, tas jāapstiprina ar vēl vienu izpildi, kuras nosacījumi ir tādi paši kā pirmajai (7. tabula). Ja pirmās izpildes rezultāti ir neviennozīmīgi (proti, kārtās izteikta izmaiņa no SC rezultātiem statistiski būtiski atšķiras tikai vienā koncentrācijā) vai pozitīvi (proti, ar divām vai vairāk blakus esošām koncentrācijām ir novērojama statistiski būtiska kārtās izteikta izmaiņa), tests jāatkārto atbilstoši 7. tabulas norādījumiem, precizējot izraudzītās testējamās koncentrācijas. Otrajā un trešajā atkārtojumā (ja tādus veic) testējamās koncentrācijas būtu jākoriģē, balstoties uz rezultātiem, kas pirmajā testēšanas reizē gūti, orientējoties uz koncentrācijām, pie kurām novērojama ietekme, un izmantojot koncentrāciju atstatumu 1/2-log (piem., ja pirmajā izpildē ar vērtībām 0,001; 0,01; 0,1; 1; 10; 100; 1 000 μM bija novērojama inducēšanās pie 1 un 10 μM, nākamajā izpildē jātestē koncentrācijas 0,1; 0,3; 1; 3; 10; 30; 100 μM), ja vien nav jāizmanto zemākas koncentrācijas, lai tiktu sasniegta LOEC. Pēdējā gadījumā otrajā izpildē, izmantojot 1/2 log skalu, jātestē koncentrācija, kas ir vismaz piecas koncentrācijas pakāpes zemāka nekā pirmajā izpildē testētā zemākā koncentrācija. Ja otrā izpilde pirmās izpildes rezultātus neapstiprina (proti, koncentrāciju, ar kuru iepriekšējā reizē rezultāts bijis pozitīvs, testējot pieauguma soļa ± 1 robežās, statistiski būtiski rezultāti netiek gūti), jāveic trešais eksperiments, izmantojot sākotnējos testēšanas nosacījumus. Neviennozīmīgus pirmās izpildes rezultātus par negatīviem uzskata tad, ja divas vēlākās izpildes novēroto ietekmi neapstiprina. Neviennozīmīgus rezultātus par pozitīvu atbildes reakciju (ietekmi) uzskata tad, ja reakciju apstiprina vismaz vēl viena izpilde koncentrācijas pieauguma soļa ± 1 robežās (sk. datu interpretācijas procedūru 55. punktā).

7. tabula

Lemšanas matrice iespējamiem iznākuma scenārijiem

1. izpilde	2. izpilde		3. izpilde		Lēmums
Scenārijs	Lēmums	Scenārijs	Lēmums	Scenārijs	Pozitīvs	Negatīvs
Negatīvs	Apstiprināt (26)	Negatīvs	Apstāties			X
Negatīvs	Apstiprināt (26)	Pozitīvs	Precizēt (27)	Negatīvs		X
Neviennozīmīg (28)	Precizēt (27)	Negatīvs	Apstiprināt (26)	Negatīvs		X
Neviennozīmīgs (28)	Precizēt (27)	Negatīvs	Apstiprināt (26)	Pozitīvs	X
Neviennozīmīgs (28)	Precizēt (27)	Pozitīvs			X
Pozitīvs	Precizēt (27)	Negatīvs	Apstiprināt (26)	Pozitīva	X
Negatīvs	Apstiprināt (26)	Pozitīva	Precizēt (27)	Pozitīvs	X
Pozitīvs	Precizēt (27)	Pozitīvs	Apstāties		X

Testa plates kvalitātes kontrole

48.   Papildus QC plates kritēriju apmierināšanai būtu jāapmierina citi kvalitātes kritēriji, kas saistīti ar to, kāda variācija ir pieņemama attiecībā uz replicētajām iedobēm, replicētajiem eksperimentiem, hormonu līmeņa mērīšanas sistēmu linearitāti un jutību, hormonu līmeņa replicēto mērījumu mainību vienam un tam pašam paraugam un pievienoto zināmo hormonu devu procentuālo atgūstamību pēc barotnes ekstrakcijas (attiecīgā gadījumā; attiecībā uz ekstrakcijas prasībām sk. 30. punktu); minētie kritēriji ir sniegti 8. tabulā. Lai datus varētu ņemt vērā turpmākā izvērtēšanā, tiem jāatrodas katram parametram definētā pieņemamības diapazonā. Ja šie kritēriji nav apmierināti, izklājlapā jānorāda, ka attiecībā uz konkrēto paraugu QC kritēriji nav apmierināti, un paraugs jāanalizē atkārtoti vai no datu kopuma jāatmet.

8. tabula

H295R testa plates parametru pieņemamības diapazoni un/vai variācija (%)

(LOQ – hormonu līmeņa mērīšanas sistēmas kvantitatīvās noteikšanas robeža; CV – variācijas koeficients; SC – šķīdinātāja kontroliedobe; DPM – sabrukumu skaits minūtē)

	Salīdzinājums	T	E2
Hormonu pamatproducēšanās SC	Par cik kārtām pārsniegta LOQ	≥ pieckārt	≥ divarpus kārtas
Ekspozīcijas eksperimenti: SC CV vienā platē (replicētas iedobes)	Absolūtās koncentrācijas	≤ 30 %	≤ 30 %
Ekspozīcijas eksperimenti: SC CV vairākās platēs (replicēti eksperimenti)	Izmaiņas kārtu izteiksmē	≤ 30 %	≤ 30 %
Hormonu līmeņa mērīšanas sistēma –jutība	Konstatējamā samazināšanās kārtu izteiksmē attiecībā pret SC	≥ pieckārt	≥ divarpus kārtas
Hormonu līmeņa mērīšanas sistēma – SC replicēto mērījumu CV  (29)	Absolūtās koncentrācijas	≤ 25 %	≤ 25 %
Barotnes ekstrakcija – iekšējās 3H standartvielas atgūstamība (attiecīgā gadījumā)	DPM	≥ 65 % nomināls

DATU ANALĪZE UN ATSPOGUĻOŠANA TESTĒŠANAS PĀRSKATĀ

Datu analīze

49.   Lai ķīmiski mainītā hormonu producēšanā izvērtētu relatīvo pieaugumu/samazinājumu, rezultāti būtu jānormalizē līdz katras testa plates vidējai SC vērtībai un jāizsaka kā izmaiņas attiecībā pret katras testa plates SC. Visus datus izsaka kā vidējo vērtību ± 1 standartnovirze (SD).

50.   Datu analīzē iekļauj tikai datus par hormoniem no iedobēm, kurās citotoksicitāte bijusi mazāka par 20 %. Relatīvās izmaiņas aprēķina šādi:

Relatīvā izmaiņa = (hormonu koncentrācija katrā iedobē) ÷ (vidējā hormonu koncentrācija visās kontroliedobēs, kurās ir tikai šķīdinātājs).

51.   Ja iedobes vizuāla apskate vai 42. punktā aprakstītais dzīvotspējas/citotokscitātes tests liecina, ka šūnu skaits varētu būt palielinājies, šķietamais palielinājums jāverificē. Ja verifikācija apstiprina šūnu skaita pieaugumu, tas jānorāda testēšanas pārskatā.

52.   Pirms statistisku analīžu veikšanas jāizvērtē pieņēmumi par normalitāti un dispersijas homogenitāti. Normalitāte jāvērtē, izmantojot varbūtību sadalījuma standartgrafikus vai citu attiecīgu statistisku metodi (piem., Šapiro–Vilka testu). Ja datu sadalījums (kārtās izteiktas izmaiņas) nav normālsadalījums, jāmēģina datus transformēt tā, lai tuvinātos normālsadalījumam. Ja datu sadalījums ir normālsadalījums vai tuvu tam, ķīmisko vielu koncentrāciju grupu un SC atšķirības būtu jāanalizē, izmantojot parametrisku testu (piem., Daneta (Dunnett) testu), kurā neatkarīgais mainīgais ir koncentrācija, bet atkarīgais – atbildes reakcija (izmaiņa kārtu izteiksmē). Ja dati nav sadalīti normāli, jāizmanto attiecīgs neparametrisks tests (piem., Kruskala–Vollisa (Kruskal-Wallis) tests vai Stīla (Steel) rangu tests “daudzi pret vienu”). Atšķirības uzskata par būtiskām, ja p ≤ 0,05. Statistiskos izvērtējumos balstās uz katras iedobes vidējām vērtībām, kas atvasinātas no neatkarīgiem replicētiem datu punktiem. Tā kā pirmajā izpildē starp devām ir lieli atstatumi (log10 skala), paredzams, ka daudzos gadījumos divas lielākās devas atradīsies sigmoidālās līknes lineārajā daļā un skaidru sakarību starp koncentrāciju un atbildes reakciju aprakstīt nebūs iespējams. Tāpēc pirmajai izpildei vai jebkādiem citiem datu kopumiem, kur stāvoklis ir tāds pats (piemēram, maksimālo iedarbīgumu nav iespējams skaitliski novērtēt), izmanto I tipa statistiku ar nemainīgu mainīgo, kā aprakstīts iepriekš.

53.   Ja uz līknes lineārās daļas atrodas vairāk nekā divi datu punkti un ja maksimālo iedarbību aprēķināt ir iespējams, kā tas sagaidāms dažās no otrajām izpildēm, kuras veiktas, izmantojot ekspozīcijas koncentrācijas ar atstatumu puse log, iedarbīgās koncentrācijas (piem., EC50 un EC20) būtu jāaprēķina ar probita vai logita analīzi vai ar jebkādu citu piemērotu regresijas modeli.

54.   Rezultāti jāsniedz gan grafiski (joslu diagrammā, kas attēlo vidējo vērtību ± 1 SD), gan tabulā (LOEC/NOEC, iedarbības virziens un maksimālās atbildes reakcijas stiprums – datu daļa, kas attiecas uz devu un atbildes reakciju) (piemēru sk. 3. attēlā). Datu novērtējumu uzskata par derīgu tikai tad, ja to pamatā bijušas vismaz divas neatkarīgas izpildes. Eksperimentu vai izpildi par neatkarīgu uzskata tad, ja tie veikti atšķirīgā dienā ar jaunu šķīdumu un kontrolmateriālu komplektu. Otrajā un trešajā atkārtojumā (ja tādi nepieciešami) izmantotās koncentrācijas var pielāgot, pamatojoties uz pirmās reizes rezultātiem, lai labāk definētu devas un atbildes reakcijas diapazonu, kurā atrodas LOEC (sk. 47. punktu).

3. attēls

Piemērs. H295R testā iegūto datu izklāsts un izvērtējums grafika un tabulas formā

(Ar zvaigznītēm apzīmētas no šķīdinātāja kontroliedobes rezultātiem statistiski būtiskas atšķirības (p< 0,05). LOEC – zemākās novērojamās ietekmes koncentrācija; maksimālā izmaiņa – jebkurā koncentrācijā novērotas maksimālās atbildes reakcijas stiprums attiecībā pret vidējo SC atbildes reakciju (= 1))

Ķīmiskā viela	LOEC	Maksimālā izmaiņa
Forskolīns	0,01	0,15 reizes
Letrozols	0,001	29 reizes

Datu interpretācijas procedūra

55.   Uzskata, ka testējamā viela ir pozitīva, ja vismaz divās neatkarīgās izpildēs ar divām blakus esošām koncentrācijām kārtu indukcija statistiski atšķiras (p ≤ 0,05) no šķīdinātāja kontroliedobes rezultāta (sk. 7. tabulu). Uzskata, ka testējamā ķīmiskā viela ir negatīva, ja ir bijušas divas neatkarīgas negatīvas izpildes vai ja bijušas trīs izpildes, no kurām divas bijušas negatīvas, bet viena – neviennozīmīga vai pozitīva. Ja trīs neatkarīgos eksperimentos gūtie dati 7. tabulā sniegtos lemšanas kritērijus neapmierina, eksperimentu rezultātus interpretēt nav iespējams. Rezultātu interpretācijā nedrīkstētu ņemt vērā rezultātus, kas gūti ar koncentrācijām, kuras pārsniedz šķīdības robežas, vai ar citotoksiskām koncentrācijām.

Testēšanas pārskats

56.   Testēšanas pārskatā jābūt iekļautai šādai informācijai:

Testēšanas komplekss:

—	kompleksa nosaukums un adrese,

—	pētījuma vadītājs, pārējais personāls un tā pienākumi pētījumā,

—	pētījuma sākuma un beigu datums.

Testējamā ķīmiskā viela, reaģenti un kontroles materiāli:

—	testējamās ķīmiskās vielas, reaģentu un kontroles materiālu identitāte (attiecīgi nosaukums/CAS Nr.), avots, sērijas/partijas numurs, tīrība, piegādātājs un raksturojums,

—	testējamās ķīmiskās vielas fizikālais raksturojums un attiecīgās fizikālķīmiskās īpašības,

—	kādi ir glabāšanas apstākļi un ar kādu metodi un cik bieži sagatavotas testējamās ķīmiskās vielas, reaģenti un kontrolmateriāli,

—	testējamās ķīmiskās vielas stabilitāte.

Šūnas:

—	šūnu avots un šūnu veids,

—	testā izmantoto šūnu pasāžu skaits (šūnu pasāžu identifikators),

—	šūnu kultūru uzturēšanas procedūru apraksts.

Pirmstestēšanas prasības (attiecīgā gadījumā):

—	ķīmisko vielu interferences testēšana hormonu testā: apraksts un rezultāti,

—	hormonu ekstrakcijas efektivitātes mērījumu apraksts un rezultāti,

—	visu veicamo analītisko testu standarti un kalibrācijas līknes,

—	izraudzīto analītisko testu noteikšanas robežas.

Testa apstākļi:

—	barotņu sastāvs,

—	testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija,

—	šūnu blīvums (skaitliski novērtētā vai izmērītā šūnu koncentrācija 24 un 48 stundu periodā),

—	testējamās ķīmiskās vielas šķīdība (šķīdības robeža, ja tā noteikta),

—	inkubācijas laiks un nosacījumi.

Testa rezultāti:

—	neapstrādātie dati par katru iedobi attiecībā uz kontrolēm un testējamām ķīmiskām vielām – visi replicētie mērījumi hormonu producēšanās līmeņa mērīšanas instrumenta oriģināldatu formā (piem., OD, fluorescences vienības, DPM u. tml.),

—	normalitātes validācija vai paskaidrojums par datu transformāciju,

—	vidējās atbildes reakcijas ± 1 SD uz katru mērīto iedobi,

—	citotoksicitātes dati (testējamās koncentrācijas, kas radījušas citotoksicitāti),

—	QC prasību izpildes apstiprinājums,

—	attiecībā uz citotoksicitāti koriģēta relatīvā izmaiņa salīdzinājumā ar šķīdinātāja kontrolplati,

—	joslu diagramma, kurā redzamas relatīvās izmaiņas (izmaiņas kārtu izteiksmē) pie katras koncentrācijas, SD un statistiskais nozīmīgums, kā norādīts 49.–54. punktā.

Datu interpretācija:

—	piemērojiet rezultātiem datu interpretācijas procedūru un komentējiet konstatējumus.

Komentāri:

—	vai pētījums kaut kādā mērā vedina domāt, ka T/E2 datus varētu ietekmēt netieša ietekme uz glikokortikoīdu un minerālkortikoīdu ceļiem?

Secinājumi

LITERATŪRA

(1)

OECD (2002), OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals, šā pielikuma B.54. daļas 2. papildinājums

(2)

Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, R. and Giesy, J.P. (2006), Human adrenocarcinoma (H295R) cells for rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone production, Toxicol. Toxic. Appl. Pharmacol., 217, 114-124.

(3)

Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, J. P. (2007), The OECD validation program of the H295R steroidgenesis assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies. Env. Sci. Pollut. Res., 14, 23 – 30.

(4)

OECD (2010), Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production, OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/MONO(2010)31, Paris. Pieejams: [http://www.oecd.org/document/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1,00.html]

(5)

OECD (2010), Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for Steroidogenesis, OECD Series of Testing and Assessment No. 133, ENV/JM/MONO(2010)32, Paris. Pieejams: [http://www.oecd.org/document/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1,00.html]

(6)

Battelle (2005), Detailed Review Paper on Steroidogenesis, pieejams: [http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_final_3_29_05.pdf]

(7)

Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004), Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroidogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR, Toxicol. Sci., 81, 78-89.

(8)

Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. (2002), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells, Toxicol. Toxic. Appl. Pharmacol., 182, 44-54.

(9)

Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. (2010), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model development for metyrapone, Environ. Health Perspect., 118: 265-272.

(10)

Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell line, Environ. Sci. Poll. Res., 17:1137-1148.

(11)

Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990), Establishment and characterization of a human adrenocortical carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid biosynthesis, Cancer Res., 50, 5488-5496.

(12)

He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010), Ozonation attenuates the steroidogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in the H295R cell line, Chemosphere, 80:578-584.

(13)

Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. and Giesy, J.P. (2005), Quantitative RT-PCR methods for evaluating toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line, Environ. Sci. Technol., 39:2777-2785.

(14)

Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 and T production using the H295R cell line, Environ. Sci. Ind. Res., 17:1137-1148.

(15)

Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids, J. Clin. Endocrinol. Metab., 77, 731-737.

(16)

Šā pielikuma B.55. nodaļa: Hershberger Bioassay in Rats: A short-term Screening Assay for (Anti)Androgenic Properties.

(17)

Shapiro, R., and Page, L.B. (1976), Interference by 2,3-dimercapto-1-propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay, J. Lab. Clin. Med., 2, 222-231.

(18)

Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods., 65, 55-63.

(19)

Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). Biochemical differences between rat and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs of these two species, Biochemistry. 38:1598-1606.

(20)

Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006), Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 26:484-492.

B.58.   TRANSGĒNU GRAUZĒJU SOMATISKO ŠŪNU UN DZIMUMŠŪNU GĒNU MUTĀCIJU TESTI

IEVADS

1.   Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (TG) 488 (2013. gads). Ir pieejamas ES testēšanas metodes, ko izmantot plašam klāstam in vitro mutāciju testu, ar kuriem var noteikt hromosomu un/vai gēnu mutācijas. Ir tādas testēšanas metodes, kurās beigupunktus (t. i., hromosomu aberācijas un neplānotu DNS sintēzi) testē in vivo, tomēr ar šīm metodēm nenosaka gēnu mutāciju daudzumu. Transgēnu grauzēju (TGR) mutāciju testi apmierina vajadzību pēc praktiskiem un plaši pieejamiem gēnu mutāciju in vivo testiem.

2.   TGR mutāciju testi ir plaši recenzēti (24) (33). Tajos izmanto transgēnas peles un žurkas, kuru genomā ir hromosomāli integrētas vairākas plazmīdu vai fāgu atspoles vektoru kopijas. Transgēniem ir ziņotājgēni, pēc kuriem iespējams noteikt dažādu veidu mutācijas, kas in vivo inducētas ar testējamām ķīmiskām vielām.

3.   Grauzēju mutāciju skaitu novērtē, atgūstot transgēnu un analizējot ziņotājgēna fenotipu saimniekbaktērijā, kurai šā ziņotājgēna nav. TGR gēnu mutāciju testos skaita mutācijas, kas inducētas ģenētiski neitrālos gēnos, kuri var būt atgūti no burtiski jebkuriem grauzēja audiem. Tāpēc šie testi apiet daudzus ar in vivo gēnu mutāciju pētīšanu endogēnos gēnos saistītus ierobežojumus (piem., analīzei piemērotie audi, pret mutācijām vērsta negatīvā/pozitīvā izlase).

4.   Nozīmīgi pierādījumi liecina, ka transgēni uz mutagēniem reaģē līdzīgi endogēnajiem gēniem, jo īpaši attiecībā uz to, kā konstatē bāzes pāru maiņas, mutācijas ar lasīšanas nobīdi un mazas delēcijas un insercijas (24).

5.   Starptautiskajos genotoksicitātes testēšanas semināros (IWGT) ir izteikts atbalsts tam, ka gēnu mutāciju in vivo noteikšanā izmanto TGR gēnu mutāciju testu, un ir ieteikts protokols tā īstenošanai (15) (29). Minētie ieteikumi ir šīs testēšanas metodes pamatā. Plašāka analīze, kas pamato šā protokola izmantošanu, atrodama (16).

6.   Gaidāms, ka TGR gēnu mutācijas testu turpmāk varēs kombinēt ar atkārtotas devas toksicitātes pētījumu (šā pielikuma B.7. nodaļa). Tomēr nepieciešami tādi dati, lai būtu drošība, ka TGR gēnu mutāciju testu jutību neietekmē tas, ka atkārtotas devas toksicitātes pētījumos periods starp devu ievadīšanas perioda beigām un paraugu ņemšanas laiku ir īsāks – viena diena (TGR gēnu mutāciju testos – trīs dienas). Nepieciešami arī tādi dati, lai būtu drošība, ka atkārtotas devas testa veikšanu negatīvi neietekmē tas, ka ir izraudzīti nevis parastas līnijas grauzēji, bet gan transgēni grauzēji. Kad minētie dati būs pieejami, šī testēšanas metode tiks atjaunināta.

7.   Galveno terminu definīcijas sniegtas papildinājumā.

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI

8.   Pietiekami daudz datu, lai būtu pamatoti tos izmantot šajā testēšanas metodē, ir pieejams par šādiem standartapstākļos veiktiem TGR gēnu mutāciju testiem: lacZ bakteriofāga peles (Muta™Mouse); lacZ plazmīdas peles; gpt delta (gpt un Spi –) peles un žurkas; lacI peles un žurkas (Big Blue®). Turklāt modeļu Big Blue® un Muta™Mouse mutāciju izvērtēšanai var izmantot cII pozitīvās izlases testu. TGR modeļu mutaģenēzi parasti novērtē kā mutantu biežumu; tomēr nepieciešamības gadījumā papildu informāciju var iegūt mutāciju molekulārā analīzē (sk. 24. punktu).

9.   Šie grauzēju gēnu mutāciju in vivo testi ir īpaši piemēroti mutagēnisku apdraudējumu novērtēšanai, jo testos gūtā atbildes reakcija ir atkarīga no in vivo metabolisma, farmakokinētikas, DNS labošanas procesiem un DNS sintēzes uz bojātas matrices, lai gan minētie dažādām sugām, audu un DNS bojājuma veidiem var būt dažādi. Gēnu mutāciju in vivo tests noder, lai turpinātu pētīt in vitro sistēmā konstatētu mutagēnisku iedarbību un lai darbu ar testu rezultātiem turpinātu, izmantojot citus in vivo beigupunktus (24). Gēnu mutācija ne vien ir cēloniski saistīta ar vēža rašanos, bet ir arī būtisks beigupunkts, ar kura palīdzību iespējams prognozēt mutāciju radītas somatisko audu slimības, kas nav vēzis (12) (13), un pa dzimumšūnas līniju nodotas slimības.

10.   Ja ir liecības par to, ka testējamā ķīmiskā viela vai attiecīgs metabolīts interesējošos audos nenonāks, TGR gēnu mutācijas testu veikt nav lietderīgi.

TESTA PRINCIPS

11.   8. punktā aprakstītajos testos mērķgēns sākotnēji ir baktērijas vai bakteriofāga gēns, ko no grauzēju genomiskās DNS atgūst, transgēnu ievietojot λ bakteriofāga vai plazmīdas atspoles vektorā. Procedūra ir tāda, ka genomisko DNS ekstrahē no interesējošiem grauzēja audiem, to in vitro apstrādā (t. i., lai atgūtu atspoles vektoru, iesaiņo λ vektorus vai liģē un elektroporē plazmīdas) un pēc tam piemērotos apstākļos nosaka mutācijas saimniekbaktērijās. Testos tiek izmantoti neitrāli transgēni, kas lielākajā daļā audu veidu ir viegli atgūstami.

12.   TGR gēnu mutāciju pamateksperimentā grauzējam ilgāku laiku dod ķīmisku vielu. Ķīmiskās vielas var ievadīt jebkādā piemērotā ceļā, arī implantēt (piem., medicīnisko ierīču testēšanā). Kopējo periodu, kurā dzīvnieks saņem devas, sauc par devu ievadīšanas periodu. Devu ievadīšanas periodam parasti seko tāds pirmsnonāvēšanas periods, kurā ķīmiskā viela netiek dota un neizlabojušies DNS bojājumi nostiprinās par stabilām mutācijām. Literatūrā šis periods pamīšus dēvēts par izpaušanās laiku, nostiprināšanās laiku vai ekspresijas laiku; šā perioda beigas ir paraugu ņemšanas laiks (15) (29). Kad dzīvnieks nonāvēts, no interesējošiem audiem izolē genomisko DNS un attīra.

13.   No vairākiem iesaiņojumiem/ligācijām iegūtos datus par atsevišķiem katra dzīvnieka audiem apvieno un parasti izvērtē mutantu biežumu, izmantojot 105 līdz 107 plakus veidojošo vienību vai kolonijas veidojošo vienību kopskaitu. Ja izmanto pozitīvās izlases (selektīvas) metodes, plakus veidojošo vienību kopskaitu neselektīvi nosaka ar atsevišķu plašu komplektu, kurā izlasi nepiemēro.

14.   Ir izstrādātas pozitīvās izlases metodes, kas palīdz noteikt mutācijas gan gpt gēnā [gpt delta pelēm un žurkām, gpt – fenotipam (20) (22) (28)], gan lacZ gēnā[pelēm Muta™Mouse vai lacZ plazmīdu pelēm (3) (10) (11) (30)]; savukārt līnijas Big Blue® dzīvniekiem lacI gēna mutācijas nosaka ar neselektīvu metodi, kurā mutanti tiek noteikti pēc krāsainu (zilu) plaku rašanās. Pozitīvās izlases metodes izmanto arī, lai konstatētu punktmutācijas, kas rodas λ bakteriofāga atspoles vektora cII gēnā [līnijas Big Blue® pelēm vai žurkām un līnijas Muta™ Mouse pelēm (17)], un delēcijas mutācijas, kas rodas λ red un gam gēnos [Spi – izlase gpt delta pelēm un žurkām (21) (22) (28)]. Mutantu biežumu aprēķina, to plaku/plazmīdu skaitu, kam transgēnā ir mutācija, dalot ar to plaku/plazmīdu kopējo skaitu, kas atgūts no tā paša DNS parauga. TGR gēnu mutāciju pētījumos pārskatā ietvertais parametrs ir mutantu biežums. Turklāt var noteikt mutāciju biežumu kā to šūnu daļu, kurās ir neatkarīgas mutācijas; šis aprēķins jākoriģē ar klonālo ekspansiju, atgūtos mutantus sekvencējot (24).

15.   lacI, lacZ, cII un gpt gēnu punktmutāciju testos saskaitītās mutācijas galvenokārt ir bāzu pāru maiņas, mutācijas ar nolasīšanas nobīdi un mazas insercijas vai delēcijas. Šo mutāciju veidu relatīvais īpatsvars spontāno mutāciju vidū ir līdzīgs tam, kāds sastopams endogēnajam Hprt gēnam. Lielas delēcijas var konstatēt tikai ar Spi – izlases un lacZ plazmīdu testiem (24). Interesējošās mutācijas ir žurku vai peļu organismā radušās in vivo mutācijas. In vivo un ex vivo mutācijas fāgu/plazmīdu atgūšanas, replicēšanas vai labošanas ceļā rodas samērā reti, un dažās sistēmās tās var īpaši identificēt vai izslēgt, izmantojot saimniekbaktērijas/pozitīvās izlases sistēmu.

METODES APRAKSTS

Sagatavošanās testam

Dzīvnieku sugas izvēle

16.   Patlaban ir pieejami daudzveidīgi transgēnu peļu modeļi gēnu mutāciju noteikšanai, un šīs sistēmas izmanto plašāk nekā transgēnu žurku modeļus. Ja žurka nepārprotami ir labāks modelis nekā pele (piemēram, gadījumos, kur tikai žurkām sastopama audzēja kancerogēniskā mehānisma pētīšanā tiek nodrošināta korelācija ar žurku toksicitātes pētījumu vai kur ir zināms, ka žurkas metabolisms ir līdzīgāks cilvēka metabolismam), jāapsver, vai neizmantot transgēnas žurkas modeli.

Turēšanas un barošanas apstākļi

17.   Temperatūrai testa dzīvnieku turēšanas telpā jābūt 22 °C (± 3 °C). Lai gan relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un, izņemot telpu uzkopšanas laiku, vēlams, ne vairāk par 70 %, jācenšas nodrošināt relatīvo mitrumu 50–60 % robežās. Dzīvniekus 12 stundas diennaktī tur mākslīgā apgaismojumā, bet 12 stundas tumsā. Barošanai var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens piegādi. Uztura izvēli var ietekmēt vajadzība nodrošināt piemērotu testējamās ķīmiskās vielas piejaukšanu, ja vielu ievada ar šādu metodi. Ja nav gaidāma agresīva uzvedība, dzīvnieki būtu jātur nelielās (ne vairāk par pieciem) viendzimuma grupās. Ja tas ir zinātniski pamatoti, dzīvniekus var turēt atsevišķi.

Dzīvnieku sagatavošana

18.   Veselīgus jaunus pieaugušus dzīvniekus, kas sasnieguši dzimumbriedumu (devu došanas sākumā 8–12 nedēļas vecus) nejaušināti iedala kontroles grupās un grupās, kas saņem devas. Katram dzīvniekam atsevišķi piešķir identifikāciju. Dzīvniekus laboratorijas apstākļiem aklimatizē vismaz piecas dienas. Būrus izvieto tā, lai iespējami samazinātu būru novietojuma varbūtējo iedarbību. Pētījuma sākumā dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām un tās nedrīkstētu pārsniegt ± 20 % no vidējās masas, kas noteikta katram dzimumam atsevišķi.

Devu sagatavošana

19.   Pirms dzīvniekiem dot devas, cietas ķīmiskās vielas jāizšķīdina vai jāsuspendē piemērotos šķīdinātājos vai nesējvielās vai jāpievieno uzturam vai dzeramajam ūdenim. Šķidras testējamās ķīmiskās vielas var dot tādas pašas vai pirms došanas atšķaidīt. Atkarībā no testējamās ķīmiskās vielas fizikālķīmiskajām īpašībām dzīvniekus var pakļaut tās inhalatīvai iedarbībai gāzes, tvaiku vai cietu/šķidru daļiņu aerosola veidā. Ja vien dati par testējamo ķīmisko vielu preparātu stabilitāti neliecina, ka tos var uzglabāt, jāizmanto svaigi pagatavoti preparāti.

Testēšanas apstākļi

Šķīdinātājs/nesējviela

20.   Lietotajās devās šķīdinātājs vai nesējviela nedrīkst iedarboties toksiski un tā nedrīkst būt reaģētspējīga ar testa vielu. Izmantojot citus, mazāk izpētītus šķīdinātājus vai nesējvielas, jābūt datiem par to saderību. Kad vien iespējams, pirmām kārtām jāapsver, vai neizmantot šķīdinātājus vai nesējvielas uz ūdens bāzes.

Pozitīvās kontroles paraugi

21.   Parasti vienlaikus jāizmanto pozitīvās kontroles dzīvnieki. Tomēr tādas laboratorijas, kas ir pierādījušas kompetenci (sk. 23. punktu) un šos testus izmanto ikdienā, katrā metodes sekmīguma apstiprināšanas pētījumā var iekļaut tādu dzīvnieku DNS, kam iepriekš dotas pozitīvās kontroles devas. Šāda DNS no iepriekšējiem eksperimentiem jāiegūst no tās pašas sugas un interesējošiem audiem un pienācīgi jāuzglabā (sk. 36. punktu). Ja vienlaikus tiek izmantotas pozitīvās kontroles devas, tās nav nepieciešams ievadīt pa to pašu ceļu kā testējamās ķīmiskās vielas; tomēr par pozitīvās kontroles vielām būtu jāzina, ka tās izraisa mutācijas viena vai vairāku veidu mērķaudos, kas attiecībā uz testējamo ķīmisko vielu ir interesējošie audi. Pozitīvās kontroles ķīmisko vielu devas būtu jāizvēlas tā, lai radītu vāju vai vidēju iedarbību, kas objektīvi atbilst testa veiktspējai un jutībai. Pozitīvās kontroles ķīmisko vielu un dažu to mērķaudu piemēri sniegti 1. tabulā.

1. tabula

Pozitīvās kontroles ķīmisko vielu un dažu to mērķaudu piemēri

Pozitīvās kontroles ķīmiskā viela, tās CAS Nr.	Einecs nosaukums un Einecs numurs	Parametri	Mutācijas mērķaudi
			Žurkām	Pelēm
N-etil-N-nitrozourīnviela [CAS Nr. 759-73-9]	N-etil-N-nitrozourīnviela [212-072-2]	Mutagēns ar tiešu iedarbību	Aknas, plaušas	Kaulu smadzenes, taisnā zarna, taisnās zarnas epitēlijs, zarnas, aknas, plaušas, liesa, niere, olnīcu granulozās šūnas, vīrišķās dzimumšūnas
Etilkarbamāts (uretāns) [CAS Nr. 51-79-6]	Uretāns [200-123-1]	Mutagēns, nepieciešama vielmaiņas vide, rada tikai vāju ietekmi		Kaulu smadzenes, priekškuņģis, tievā zarna, aknas, plaušas, liesa
2,4-diaminotoluols (CAS Nr. 95-80-7)	4-metil-m-fenilēndiamīns [202-453-1]	Mutagēns, nepieciešama vielmaiņas vide, pozitīvs arī Spi - testā	Aknas	Aknas
Benzo[a]pirēns (CAS Nr. 50-32-8)	Benzo[def]krizēns [200-028-5]	Mutagēns, nepieciešama vielmaiņas vide	Aknas, omenta	Kaulu smadzenes, krūtis, taisnā zarna, priekškuņģis, kuņģa dziedzerdaļa, sirds, aknas, plaušas, vīrišķās dzimumšūnas

Negatīvās kontroles paraugi

22.   Katrā paraugu ņemšanas reizē jāparedz negatīvās kontroles paraugi, ko apstrādā tikai ar šķīdinātāju vai nesējvielu, bet pārējās darbības veic tāpat kā ar grupām, kam dotas devas. Ja nav vēsturisku vai publicētu kontroldatu, kas liecinātu, ka izraudzītajam šķīdinātājam/nesējvielai nav slēptas kaitīgas vai mutagēnas iedarbības, katrā paraugu ņemšanas reizē jānodrošina arī kontroles bez devas, lai varētu konstatēt, cik pieņemami ir nesējvielu izmantot par kontrolvielu.

Laboratorijas kvalifikācijas verificēšana

23.   Kompetence šo testu veikšanā būtu jākonstatē, pierādot spēju panākt rezultātus, kādi gaidāmi saskaņā ar publicētiem datiem (24), attiecībā uz: 1) mutantu biežumu, kas vērojams ar pozitīvās kontroles ķīmiskām vielām (vērā ņemot arī vāju atbildes reakciju), piemēram, 1. tabulā norādītām ķīmiskām vielām, ar vielām, kas nav mutagēnas, un ar nesējvielām, kas izmantotas par kontrolvielām; un 2) transgēnu atgūšanu no genomiskās DNS (piem., iesaiņošanas efektivitāti).

Mutantu sekvencēšana

24.   Regulatīviem mērķiem, jo īpaši gadījumos, kur tiek iegūts nepārprotami pozitīvs vai negatīvs rezultāts, mutantu DNS sekvencēšana netiek prasīta. Tomēr sekvencēšanas dati var būt noderīgi, ja indivīdu vidū ir novērojama augsta variācija. Šajos gadījumos sekvencēšanu var izmantot tam, lai konkrētos audos identificētu unikālo mutāciju īpatsvaru, tādējādi izslēdzot iespēju, ka ir radušies “mutāciju laimesti” vai klonēšanas incidenti. Lai vienkārši noteiktu, vai mutantu biežumu veido arī klonālie mutanti, pietiek, ja katram dzīvniekam katra veida audiem sekvencē apmēram 10 mutantus; lai mutantu biežumu attiecībā uz klonalitāti matemātiski koriģētu, var būt nepieciešams sekvencēt pat 25 mutantus. Arī konstatējot gadījumus, kur mutāciju biežums nedaudz palielinājies (piem., tikai nedaudz pārsniedzot vērtības, kas gūtas ar kontrolparaugiem, kuriem devas nav dotas), var apsvērt, vai mutantus nevajadzētu sekvencēt. Mutagēnu ietekmi var veicināt arī mutāciju spektru atšķirības, kas pastāv starp devas saņēmušo un devas nesaņēmušo dzīvnieku mutantu kolonijām (29). Mutāciju spektri var noderēt arī mehānistisku hipotēžu izstrādē. Lai panāktu izmantotajam statistiskajam modelim atbilstošu statistisko jaudu (sk. 43. punktu), pētījumi, kuru protokolā ietilpst sekvencēšana, ir jāplāno īpaši rūpīgi, it sevišķi attiecībā uz sekvencēto mutantu skaitu vienā paraugā.

PROCEDŪRA

Dzīvnieku skaits un dzimums

25.   Grupā būtu iepriekš jānosaka tādai statistiskai jaudai pietiekams dzīvnieku skaits, lai varētu konstatēt, ka mutantu biežums ir vismaz dubultojies. Grupā būs vismaz pieci dzīvnieki, tomēr, ja statistiskā jauda nav pietiekama, dzīvnieku skaits attiecīgi jāpalielina. Parasti izmanto tēviņus. Var būt gadījumi, kur ir pamatoti testēt tikai mātītes; piemēram, ja testē sievietēm paredzētas zāles vai ja pēta sievietēm raksturīgu metabolismu. Ja toksicitātes vai metabolisma ziņā starp dzimumiem ir būtiskas atšķirības, ir nepieciešami gan tēviņi, gan mātītes.

Devu ievadīšanas periods

26.   Pamatojoties uz novērojumiem par to, ka katrā devu došanas reizē mutācijas akumulējas, ir nepieciešams atkārtotu devu režīms: devu došana katru dienu 28 dienu periodā. Kopumā uzskata, ka šajā periodā pietiekami uzkrājas vāju mutagēnu izraisītās mutācijas un ekspozīcija notiek pietiekami ilgi, lai mutācijas varētu konstatēt orgānos, kuros šūnas vairojas lēni. Dažiem izvērtējumiem var būt lietderīgi izmantot alternatīvus devu došanas režīmus, un šādi alternatīvi devu došanas grafiki zinātniski jāpamato protokolā. Devu došana nedrīkst būt īsāka par laiku, kāds nepieciešams, lai pilnībā inducētos visi būtiskie metabolizējošie enzīmi, un īsākā devu došanas laikā var būt nepieciešams izmantot vairākus paraugu ņemšanas laikus, kas piemēroti orgāniem, kuros šūnas vairojas ar atšķirīgu ātrumu. Jebkurā gadījumā protokols jāpamato ar visu pieejamo informāciju (piemēram, par vispārīgo toksicitāti vai metabolismu un farmakokinētiku), jo īpaši tad, ja tajā atkāpjas no iepriekš minētajiem standartieteikumiem. Lai gan devu došanas periods, kas ilgāks par 8 nedēļām, var paaugstināt jutību, tas nepārprotami jāpaskaidro un jāpamato, jo ilgā devu došanas periodā mutantu biežums var šķietami paaugstināties klonālās ekspansijas dēļ (29).

Devu līmeņi

27.   Devu līmeņu noteikšanā būtu jāpamatojas uz tam pašam ekspozīcijas ceļam veiktu devu diapazona noteikšanas pētījumu, kurā noteikta vispārīgā toksicitāte, vai uz līdzšinējo subakūtās toksicitātes pētījumu rezultātiem. Devu diapazonu noteikšanai var izmantot tās pašas grauzēju līnijas netransgēnus dzīvniekus. Lai galvenajā testā iegūtu pilnvērtīgu informāciju par devu un atbildes reakciju, pētījumā jābūt negatīvās kontroles grupai (sk. 22. punktu) un vismaz trim devu līmeņiem ar piemērotiem atstatumiem, izņemot gadījumus, kur ir izmantota robeždeva (sk. 28. punktu). Augstākajai devai jābūt maksimālajai panesamajai devai (MTD). Par MTD nosaka devu, no kuras izraisītajām toksicitātes pazīmēm būtu sagaidāms, ka tādā pašā devu režīmā augstākas devas būs letālas. Šo devu noteikšanas kritēriju izņēmumi var būt ķīmiskās vielas, kurām zemā netoksiskā devā ir specifiska bioloģiska iedarbība (piemēram, hormoni un mitogēni), un ķīmiskas vielas, kurām vērojamas piesātinātas toksikokinētiskās īpašības un kuras tādēļ katrā gadījumā jāizvērtē atsevišķi. Izmantotajām devām jābūt diapazonā no maksimālas toksicitātes līdz maztoksiskām vai netoksiskām devām.

Pieļaujamības tests

28.   Ja devu diapazona noteikšanas eksperimenti vai jau esoši dati par radniecīgām grauzēju līnijām liecina, ka režīmā ar vismaz robeždevas apmēra devām (sk. turpmāk) vērā ņemama toksiskā ietekme netiek novērota, un ja dati par strukturāli radniecīgām ķīmiskām vielām neliek gaidīt genotoksicitāti, var uzskatīt, ka pilnīgs pētījums ar trim devu līmeņiem nav nepieciešams. 28 dienas ilgā devu ievadīšanas periodā (t. i., devu dod reizi dienā 28 dienas) robeždeva ir 1 000 mg uz kilogramu ķermeņa svara dienā. 14 dienu ilgos vai īsākos devu ievadīšanas periodos robeždeva ir 2 000 mg uz kilogramu ķermeņa svara dienā (ja devu došanas grafiks nav 28 dienas reizi dienā, tas zinātniski jāpamato protokolā; sk. 26. punktu).

Devu ievadīšana

29.   Testējamo ķīmisko vielu parasti ievada ar mākslīgo barošanu, izmantojot kuņģa zondi vai piemērotu intubācijas cauruli. Parasti testa plānošanā jāņem vērā, kāds varētu būt cilvēka ekspozīcijas ceļš. Tāpēc pieņemami var būt arī citi ekspozīcijas ceļi (piemēram, uzņemšana ar dzeramo ūdeni, ievadīšana zemādas audos, intravenoza ievadīšana, aplicēšana uz ādas, inhalācija, uzņemšana intratraheāli, ar uzturu vai implantācijas ceļā), ja to iespējams pamatot. Nav ieteicama intraperitoneāla injekcija, jo cilvēkam šāds ekspozīcijas ceļš nav fizioloģiski raksturīgs. Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt mākslīgā barošanā vai ar injekciju, ir atkarīgs no testējamā dzīvnieka lieluma. Tilpums nedrīkst pārsniegt 2 ml uz 100 g ķermeņa svara. Ja izmanto lielāku tilpumu, tas jāpamato. Izņemot kairinošas vai kodīgas ķīmiskās vielas, kuru iedarbība lielākās koncentrācijās parasti ir izteiktāka, ir iespējami jāsamazina testā lietotā tilpuma mainība, koriģējot koncentrāciju tā, lai ar visiem devu līmeņiem tilpums būtu vienāds.

Paraugu ņemšanas laiks

Somatiskās šūnas

30.   Paraugu ņemšanas laiks ir izšķirīgi svarīgs mainīgais, jo tas ir atkarīgs no perioda, kāds nepieciešams, lai mutācijas fiksētos. Atšķirīgiem audiem šis periods atšķiras, un ir konstatēta saistība ar šūnu populācijas nomaiņas laiku, piemēram, kaulu smadzenes un zarnas reaģē ātri, bet aknas – daudz lēnāk. Mutantu biežuma mērīšanā piemērots kompromiss gan audiem, kuros šūnas vairojas strauji, gan lēni, ir 28 secīgas devu došanas reizes katru dienu (kā norādīts 26. punktā) un paraugu ņemšana trīs dienas pēc pēdējās devu došanas reizes. Tomēr minētajos apstākļos audiem, kuru šūnas vairojas lēni, maksimālais mutantu biežums var neizpausties. Ja īpaši svarīga nozīme ir audiem, kuru šūnas vairojas lēni, lietderīgāks paraugu ņemšanas laiks varētu būt 28 dienas pēc 28 dienu ilgā devu ievadīšanas perioda (16) (29). Šis vēlākais paraugu ņemšanas laiks minētajos gadījumos aizstātu paraugu ņemšanu pēc trim dienām, un tas zinātniski jāpamato.

Dzimumšūnas

31.   TGR testi ir labi piemēroti pētījumam par gēnu mutāciju inducēšanu vīrišķās dzimumšūnās (7) (8) (27), attiecībā uz kurām ir labi zināms spermatoģenēzes laiks un kinētika (27). Tā kā pat pēc superovulācijas analīzei ir pieejams maz olšūnu un tā kā olšūnās DNS sintēze nenotiek, mutāciju noteikšanai sievišķās dzimumšūnās transgēnu testi nav izmantojami (31).

32.   Vīrišķo dzimumšūnu paraugu ņemšanas laiki būtu jāizraugās tā, lai eksponētā veida šūnu paraugi tiktu ņemti visā dzimumšūnas attīstības ciklā un lai pietiekami eksponētas būtu šūnas tajā attīstības posmā, uz kuru ir mērķēta paraugu ņemšana. Laiks, kurā dzimumšūnas no spermatogonijiem, respektīvi, cilmes šūnām, pakāpeniski attīstās par nobriedušu spermu, kas nokļūst vas deferens/cauda epididymis, ir apmēram 49 dienas pelēm (36) un 70 dienas žurkām (34) (35). Pēc 28 dienu ekspozīcijas ar tam sekojošu paraugu ņemšanas periodu pēc trim dienām no vas deferens/cauda epididymis savāktā sperma ((7) (8)) pārstāv tādu šūnu populāciju, kas eksponēta apmēram spermatoģenēzes perioda otrajā pusē, kurā ietilpst mejozes periods un pēcmejozes periods, bet ne spermatogoniju vai cilmes šūnu periods. Lai no vas deferens/cauda epididymis paraugam pietiekami ievāktu tādas šūnas, kas ekspozīcijas periodā bijušas spermatozoīdu cilmes šūnas, pēc devu došanas perioda beigām ir nepieciešams noteikt papildu paraugu ņemšanas laiku, minimāli 7 nedēļas (pelēm) vai 10 nedēļas (žurkām).

33.   To šūnu vidū, kas pēc 28 + 3 dienu režīma izspiestas no sēklas kanāliņiem, ir jaukta veida šūnas – bagātīgs dzimumšūnu klāsts, kurā pārstāvēti visi attīstības periodi (7) (8). Gēnu mutāciju noteikšanai paredzētus paraugus ņemot no šīm šūnām, dzimumšūnu mutāciju inducēšanās posmus nevar novērtēt tik precīzi, kā spermatozoīdus ņemot no vas deferens/cauda epididymis (jo no sēklas kanāliņiem var ņemt vairāku veidu dzimumšūnas, un šo šūnu populāciju kontaminēs arī kādas somatiskas šūnas). Tomēr, papildus no vas deferens/cauda epididymis ņemtajiem spermatozoīdiem ņemot šūnu paraugus no sēklas kanāliņiem ar tikai 28 + 3 dienu paraugu ņemšanas režīmu, dažas no iegūtajām šūnām būtu tikušas eksponētas lielākajā daļā dzimumšūnu attīstības fāzu un varētu noderēt dažu dzimumšūnu mutagēnu konstatēšanā.

Novērojumi

34.   Vismaz reizi dienā ir jāizdara vispārīgi klīniski novērojumi, vēlams, vienādos laikos katru dienu, ņemot vērā paredzamās ietekmes maksimuma laiku pēc vielas došanas. Dzīvnieku veselības stāvoklis ir jāprotokolē. Vismaz divreiz dienā visus dzīvniekus novēro attiecībā uz saslimstību un mirstību. Visi dzīvnieki vismaz reizi nedēļā un nonāvēšanas dienā jānosver. Barības patēriņa mērījumi jāizdara vismaz ik nedēļu. Ja testējamo ķīmisko vielu ievada ar dzeramo ūdeni, ūdens patēriņš būtu jāmēra katru reizi, kad ūdens tiek mainīts, un vismaz reizi nedēļā. Dzīvnieki, kam ar neletālām pazīmēm izpaužas pārlieka toksicitāte, pirms testa perioda beigām būtu jāeitanazē (23).

Audu ievākšana

35.   Audu ievākšana ir skaidri jāpamato. Tā kā mutāciju inducēšanos ir iespējams pētīt faktiski jebkuros audos, ievācamie audi būtu jāizraugās, pamatojoties uz to, kāpēc par pētāmo ķīmisko vielu tiek veikts pētījums, un uz jebkādiem esošiem datiem par tās mutagenitāti, kancerogenitāti vai toksicitāti. Svarīgi vērā ņemami faktori ir arī ievadīšanas ceļš (kura pamatā ir varbūtīgais cilvēka ekspozīcijas ceļš vai ceļi), prognozētais sadalījums audos un iespējamais darbības mehānisms. Ja nav nekādas pamatinformācijas, var ievākt vairākus iespējami interesējošus somatiskos audus. Pārstāvētiem vajadzētu būt audiem, kas atjaunojas ātri, audiem, kas atjaunojas lēni, un saskares vietas audiem. Turklāt gadījumam, ja turpmāk būs nepieciešams analizēt dzimumšūnu mutagenitāti, būtu jāievāc un jāuzglabā spermatozoīdi no vas deferens/cauda epididymides un dzimumšūnas no sēklas kanāliņiem (kā aprakstīts 32. un 33. punktā). Jānosaka orgānu svars, un – attiecībā uz lielākiem orgāniem – visiem dzīvniekiem audi jāņem no vienas un tās pašas orgāna zonas.

Audu un DNS glabāšana

36.   Audi (vai audu homogenāti) jāglabā – 70 °C vai zemākā temperatūrā un DNS izolēšanai jāizmanto piecu gadu laikā. Līdz 4 °C atdzesētu piemērotā buferšķīdumā uzglabātu izolētu dezoksiribonukleīnskābi mutāciju analīzei optimāli būtu izmantot viena gada laikā.

Audu izvēle mutantu analīzei

37.   Audu izvēlē jāpamatojas uz tādiem apsvērumiem kā: 1) ievadīšanas ceļš vai pirmās saskares ceļš (piem., orālā ievadīšanā tā ir kuņģa dziedzerdaļa, inhalatīvā ceļā – plauša, vai aplicēšanas ceļā – āda); 2) vispārīgos toksicitātes pētījumos novērotie farmakokinētiskie parametri, kas liecina par vielas sadalījumu, aizturēšanu vai uzkrāšanos audos vai par toksicitātes mērķorgāniem. Ja pētījumi tiek veikti kā kancerogenitātes pētījumu turpinājums, būtu jāņem vērā, kādi ir kancerogenitātes mērķaudi. Analizējamos audus izraugās tā, lai maksimāli būtu iespējams noteikt tādas ķīmiskas vielas, kuras ir tiešas iedarbības in vitro mutagēni, ātri metabolizējas, ir augsti reaģētspējīgas vai slikti absorbējamas, vai tādas ķīmiskas vielas, kuru mērķaudi ir atkarīgi no to ievadīšanas ceļa (6).

38.   Ja pamatinformācijas nav, tad, ņemot vērā arī saskares vietu attiecīgajā ievadīšanas ceļā, ir jānovērtē mutagenitāte aknās un vismaz vienos audos, kuros ātri notiek dalīšanās (piem., kuņģa dziedzerdaļa, kaulu smadzenes). Lielākajā daļā gadījumu augstāk minētās prasības var apmierināt, analizējot divu veidu rūpīgi izraudzītus audus, dažos gadījumos var būt nepieciešami trīs un vairāk veidu audi. Ja ir pamats īpašām bažām par ietekmi uz dzimumšūnām, arī par pozitīvu atbildes reakciju somatiskajās šūnās, jāizvērtē mutācijas dzimumšūnu audos.

Mērīšanas metodes

39.   Ir pieejamas laboratoriskas standartmetodes vai ir publicētas metodes, ar kurām konstatēt mutantus, kas radušies ieteicamajos transgēnu modeļos: lacZ lambda bakteriofāgs un plazmīdas (30); lacI peles (2) (18); gpt delta peles (22); gpt delta žurkas (28); cII (17). Modifikācijas ir jāpamato un pienācīgi jādokumentē. Lai panāktu pietiekamu plaku vai koloniju skaitu, var apkopot datus par vairākiem iesaiņojumiem. Tomēr, ja pienācīgu plaku skaitu var sasniegt tikai ar daudzām iesaiņošanas reakcijām, var būt, ka DNS nav kvalitatīva. Šādos gadījumos dati jāizmanto piesardzīgi, jo tie var būt mazticami. Optimālais plaku vai koloniju kopskaits uz vienu DNS paraugu ir atkarīgs no tā, cik statistiski varbūtīgi ir pie kāda noteikta mutantu spontānas parādīšanās biežuma konstatēt pietiekamu mutantu skaitu. Kopumā, ja mutantu spontānas parādīšanās biežums atrodas kārtā 3 × 10–5 (15), minimālais nepieciešamais plaku skaits ir no 125 000 līdz 300 000. Big Blue® lacI testā ir svarīgi, katrā uzsējumā iestrādājot attiecīgu krāsas kontroli, pierādīt, ka mutantus ir iespējams konstatēt visā krāsu fenotipu diapazonā. Audi un attiecīgie paraugi (vienumi) jāapstrādā un jāanalizē blokos, kā vienu grupu apstrādājot nesējvielas/šķīdinātāja kontroles grupu, pozitīvās kontroles grupu (ja tādu izmanto) vai pozitīvās kontroles DNS grupu (attiecīgā gadījumā) un katru atsevišķo devas saņēmušo grupu.

DATI UN TESTĒŠANAS PĀRSKATS

Rezultātu apstrāde

40.   Datus par katru dzīvnieku apkopo tabulā. Eksperimenta vienība ir viens dzīvnieks. Pārskatā jānorāda plakus veidojošo vienību (PVV) vai kolonijas veidojošo vienību (KVV) kopskaits, mutantu skaits un mutantu biežums attiecībā uz ikvienu audu veidu katram dzīvniekam. Ja ir vērojamas vairākas iesaiņošanas/atgūšanas reakcijas, pārskatā jānorāda reakciju skaits uz vienu DNS paraugu. Lai gan dati jāsaglabā par katru atsevišķu reakciju, pārskatā norāda tikai galīgo PVV vai KVV skaitu. Pārskatā atspoguļo datus par toksicitāti un klīniskajām pazīmēm, kā minēts 34. punktā. Attiecībā uz katru analizēto mutantu jānorāda sekvencēšanas rezultāti un attiecībā uz katru dzīvnieku un katra veida audiem – iznākumā iegūtie mutāciju biežuma aprēķini.

Rezultātu statistisks izvērtējums un interpretācija

41.   Ir vairāki pozitīva rezultāta noteikšanas kritēriji, piemēram, ar devu saistīta mutāciju biežuma paaugstināšanās vai nepārprotama mutāciju biežuma paaugstināšanās kādā atsevišķā devas grupā salīdzinājumā ar šķīdinātāja/nesējvielas kontroles grupu. Lai iegūtu datus, ar ko pietiek devas un atbildes reakcijas analizēšanai, jāanalizē vismaz trīs grupas, kas saņēmušas devas. Lai gan galvenajam apsvērumam vajadzētu būt rezultātu bioloģiskajam nozīmīgumam, par testēšanas rezultātu izvērtēšanas palīglīdzekli var izmantot attiecīgas statistiskas metodes (4) (14) (15) (25) (26). Izmantotajos statistiskajos testos par eksperimenta vienību jāuzskata dzīvnieks.

42.   Ja ar testējamo ķīmisko vielu nevienos audos pēc iepriekš minētajiem kritērijiem nav gūti rezultāti, uzskata, ka šajā testā tās mutagenitāte nav konstatēta. Lai negatīvais rezultāts būtu bioloģiski nozīmīgs, jāapstiprina, ka audu ekspozīcija ir notikusi.

43.   DNS sekvencēšanas analīzes rezultātu interpretēšanā var izmantot vairākas statistiskas pieejas (1) (5) (9) (19).

44.   Apsverot, vai novērotās vērtības ir vēsturiskā kontroles diapazona robežās vai ārpus tām, var iegūt pieturas punktus atbildes reakcijas bioloģiskā nozīmīguma izvērtēšanai (32).

Testēšanas pārskats

45.   Testēšanas pārskatā jābūt iekļautai šādai informācijai:

Testējamā ķīmiskā viela:

—	identifikācijas dati un CAS Nr., ja zināms,

—	avots, sērijas numurs, ja zināms,

—	fizikālās īpašības un tīrības pakāpe,

—	pētījuma veikšanā būtiskas fizikālķīmiskās īpašības,

—	testējamās ķīmiskās vielas stabilitāte, ja tā zināma.

Šķīdinātājs/nesējviela:

—	nesējvielas izvēles pamatojums,

—	testējamās vielas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējvielā, ja tā zināma,

—	uztura, dzeramā ūdens vai inhalāciju preparātu sagatavošana,

—	preparātu analītiska noteikšana (piem., stabilitāte, homogenitāte, nominālās koncentrācijas).

Testa dzīvnieki:

—	izmantotā suga/līnija un izvēles pamatojums,

—	dzīvnieku skaits, vecums un dzimums,

—	izcelsme, turēšanas apstākļi, barība u. c.,

—	katra dzīvnieka svars testa sākumā, katrā grupā norādot ķermeņa svara diapazonu, vidējo lielumu un standartnovirzi.

Testēšanas apstākļi:

—	pozitīvās un negatīvās (nesējviela/šķīdinātājs) kontroles dati,

—	devu diapazona noteikšanas pētījuma dati,

—	devu izvēles pamatojums,

—	detalizēta informācija par testējamo ķīmisko preparātu,

—	sīka informācija par testējamās ķīmiskās vielas ievadīšanu,

—	ievadīšanas ceļa izvēles pamatojums,

—	metodes, ar kādām mēra testējamās vielas toksicitāti dzīvniekiem, ja tādas pieejamas, arī histopatoloģiskas vai hematoloģiskas analīzes un dzīvnieku novērošanas un svēršanas biežums,

—	metodes, ar kurām verificē, ka testējamā ķīmiskā viela ir sasniegusi mērķaudus, vai, ja iegūtie rezultāti ir negatīvi, tās vispārējo apriti,

—	faktiskā deva (mg uz vienu kg ķermeņa svara dienā), kas aprēķināta no testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas (ppm) uzturā/dzeramajā ūdenī un no uzņemtā to daudzuma (attiecīgā gadījumā),

—	sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti,

—	detalizēts apraksts par devu došanas un paraugu ņemšanas grafikiem un veiktās izvēles pamatojums,

—	eitanāzijas paņēmiens,

—	audu izolēšanas un saglabāšanas procedūras,

—	metodes, ar kurām izolē grauzēju genomisko DNS, no genomiskās DNS izgūstot transgēnu un transgēno DNS nododot baktērijai, kas ir saimniekorganisms,

—	visu šūnu, komplektu un reaģentu avots un sērijas numuri (attiecīgā gadījumā),

—	mutantu uzskaitīšanas metodes,

—	metodes, ar kurām izdara mutantu molekulāro analīzi un kuras izmanto koriģēšanai attiecībā uz klonalitāti un/vai mutāciju biežuma aprēķināšanai.

Rezultāti:

—	dzīvnieka stāvoklis pirms testēšanas perioda un tā laikā, arī toksicitātes pazīmes,

—	ķermeņa un orgānu svars nonāvēšanas brīdī,

—	attiecībā uz katra veida audiem no katra dzīvnieka: mutantu skaits, plaku vai koloniju skaitliskais novērtējums, mutantu biežums,

—	attiecībā uz katra veida audiem no katras dzīvnieku grupas: iesaiņošanas reakciju skaits uz vienu DNS paraugu, kopējais mutantu skaits, vidējais mutantu biežums, standartnovirze,

—	ja iespējams, devas un atbildes reakcijas sakarība,

—	attiecībā uz katra veida audiem no katra dzīvnieka, ja ir veikta mutāciju molekulārā analīze: neatkarīgo mutantu skaits un vidējais mutāciju biežums,

—	pašreizējie un vēsturiskie negatīvas kontroles dati, norādot robežas, vidējās vērtības un standartnovirzes,

—	pašreizējie pozitīvas kontroles dati (vai nevienlaicīgas pozitīvās kontroles dati par DNS),

—	analītiskās noteikšanas rezultāti, ja tie pieejami (piem., iesaiņošanā izmantotās DNS koncentrācijas, DNS sekvencēšanas dati),

—	izmantotā statistiskā analīze un metodes.

Komentāri par rezultātiem

Secinājums

LITERATŪRA

(1)

Adams, W.T. and T.R. Skopek (1987), “Statistical Test for the Comparison of Samples from Mutational Spectra”, J. Mol. Biol., 194: 391-396.

(2)

Bielas, J.H. (2002), “A more Efficient Big Blue® Protocol Improves Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measurement”, Mutation Res., 518: 107–112.

(3)

Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen and J. Vijg (1995), “Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying in vivo Mutations”Nature, 377(6550): 657–659

(4)

Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1995), “Statistical Design and Analysis of Mutation Studies in Transgenic Mice”, Environ. Mol. Mutagen, 25(3): 246–255.

(5)

Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1996), “Mutational Spectra in Transgenic Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency”, Environ. Mol. Mutagen, 28: 405–413.

(6)

Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio and V. Thybaud (1999), “Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing in vivo for the Detection of Site-of-contact Mutagens”, Mutagenesis, 14(1): 141–151.

(7)

Douglas, G.R., J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen and L.M. Soper(1995), “Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethylnitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of lacZ Transgenic Mice”, Proc. Natl. Acad. Sci. Sci. USA, 92: 7485-7489.

(8)

Douglas, G.R., J.D. Gingerich, L.M. Soper and J. Jiao (1997), “Toward an Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells”, Mutation Res., 388(2-3): 197-212.

(9)

Dunson, D.B. and K.R. Tindall (2000), “Bayesian Analysis of Mutational Spectra”, Genetics, 156: 1411–1418.

(10)

Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. Lohman, D.L. Knook and J. Vijg(1989), “Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations in vivo”, Proc. Natl. Acad. Sci. Sci. USA, 86(20): 7971–7975.

(11)

Gossen, J.A. and J. Vijg (1993), “A Selective System for lacZ-Phage using a Galactose-sensitive E. coli Host”, Biotechniques, 14(3): 326, 330.

(12)

Erikson, R.P. (2003), “Somatic Gene Mutation and Human Disease other than Cancer”, Mutation Res., 543: 125-136.

(13)

Erikson, R.P. (2010), “Somatic Gene Mutation and Human Disease other than Cancer: an Update”, Mutation Res., 705: 96-106.

(14)

Fung, K.Y., G.R. Douglas and D. Krewski (1998), “Statistical Analysis of lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays”, Mutagenesis, 13(3): 249–255.

(15)

Heddle, J.A., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. Douglas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000), “In vivo Transgenic Mutation Assays”, Environ. Mol. Mutagen., 35: 253-259.

(16)

Heddle, J.A., H.-J. Martus and G.R. Douglas (2003), “Treatment and Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays”, Environ. Mol. Mutagen., 41: 1-6.

(17)

Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya and S. Garges (1996), “Analysis of Genetic Instability during Mammary Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for in vivo Mutations in a Bacteriophage λ Transgene Target”, Proc. Natl. Acad. Sci. Sci. USA, 93(17): 9073–9078.

(18)

Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge and J.M. Short (1990), “The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Mutagenicity Testing”, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212–218.

(19)

Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott and P.A. Burns (2008), “Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra using Multivariate Data Analysis”, Carcinogenesis, 29(4): 772-778.

(20)

Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni (1996), “A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi – and 6-thioguanine Selections”, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465–470.

(21)

Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999), “Spi – Selection: an Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice”, Environ. Mol. Mutagen., 34(1): 9–15.

(22)

Nohmi, T., T. Suzuki and K.I. Masumura (2000), “Recent Advances in the Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays”, Mutation Res., 455(1–2): 191–215.

(23)

OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, N°19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.

(24)

OECD (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, No 103, ENV/JM/MONO(2009)7, OECD, Paris.

(25)

Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, R.W. Tennant and K.R. Tindall (1995), “Study Design and Sample Sizes for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay”, Environ. Mol. Mutagen., 25(3): 231–245.

(26)

Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, … G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft and N.J. Gorelick (1997), “Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Study”, Mutation. Res., 388(2–3): 249–289.

(27)

Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas and C.L. Yauk (2006), “Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays”, Mutation. Res., 598: 164-193.

(28)

Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. Kawamura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010), “Integration of in vivo Genotoxicity and Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Structural Isomers”, Toxicol. Sci., 114(1): 71-78.

(29)

Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003), “In vivo Transgenic Mutation Assays”, Mutation Res., 540: 141-151.

(30)

Vijg, J. and G.R. Douglas (1996), “Bacteriophage λ and Plasmid lacZ Transgenic Mice for studying Mutations in vivo” in: G. Pfeifer (ed.), Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II, Plenum Press, New York, NY, USA, 391. – 410. lpp.

(31)

Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster and G.R. Douglas (2005), “A lacZ Transgenic Mouse Assay for the Detection of Mutations in Follicular Granulosa Cells”, Mutation Res., 578(1-2): 117-123.

(32)

Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud (2011), “Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data”, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007.

(33)

OECD (2011), Retrospective Performance Assessment of OECD Test Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, No 145, ENV/JM/MONO(2011)20, OECD, Paris.

(34)

Clermont, Y. (1972), “Kinetics of spermatogenesis in mammals seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal”. Physiol. Rev. 52: 198-236.

(35)

Robaire, B., Hinton, B.T., and Oregbin-Crist, M.-C. (2006), “The Epididymis”, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., Richards, J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, Elsevier, the Netherlands, 1071.–1148. lpp.

(36)

Russell, L.B. (2004), “Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse”, Genetica, 122: 25–36.

”