EUR-Lex Access to European Union law

1.

Liellopu radzenes duļķošanās un caurlaidības (BCOP) testēšanas metode in vitro ir noteikšanas metode, ko konkrētos apstākļos un ar noteiktiem ierobežojumiem var izmantot, lai vielas un to maisījumus klasificētu kā “nopietnus acu bojājumus vai nopietnu kairinājumu” izraisītājus (1) (2) (3). Šajā testēšanas metodē nopietnu kairinājumu izraisošām uzskata vielas, kas trušiem rada acu bojājumus, kuri neizzūd vismaz 21 dienas laikā pēc iedarbības. Kaut gan netiek uzskatīts, ka ar BCOP var pilnībā aizstāt iedarbības testu uz acīm in vivo ar trušiem, BCOP iesaka izmantot daudzpakāpju testēšanas stratēģijā, lai īpašas lietošanas jomā veiktu normatīvajos aktos reglamentēto klasifikāciju un marķēšanu (4) (5). Testējamās vielas un maisījumus (6) var klasificēt kā nopietnus acu bojājumus vai nopietnu kairinājumu izraisošas, neveicot papildu testēšanu ar trušiem. Ar vielām, kuru testēšanas rezultāts ir negatīvs, jāveic izmēģinājumi izmantojot trušus pēc pakāpeniskas loģiski secīgas testēšanas stratēģijas saskaņā ar ESAO testēšanas norādījumiem OECD Test Guideline 405 (7) (šī pielikuma B. 5. nodaļa).

2.

Šajā testēšanas metodē aprakstītas procedūras, ko izmanto, lai vērtētu testējamās vielas potenciālo nopietnus bojājumus vai nopietnu kairinājumu izraisošo iedarbību uz acīm, ko mēra ar tās spēju izraisīt izolētas liellopu acs radzenes duļķošanos un palielināt tās caurlaidību. Toksisko iedarbību uz radzeni mēra ar šādiem parametriem: (i) gaismas caurlaidības samazināšanās (duļķošanās), (ii) krāsvielas fluoresceīna nātrija sāls caurlaidības palielināšanās (caurlaidība). Radzenes duļķošanās un caurlaidības vērtējumu pēc testējamās vielas iedarbības apvieno, lai noteiktu kairinājuma rādītāju in vitro (IVIS), ko izmanto testējamās vielas radītā kairinājuma pakāpes klasificēšanai.

3.

Pēc BCOP testēšanas metodes ir testētas arī tāda acu kairinājuma izraisošas vielas, kura radītie bojājumi izzūd drīzāk nekā 21 dienas laikā, gan arī vielas, kurām nav kairinājumu izraisošas iedarbības. Tomēr BCOP testēšanas metodes pareizība un rezultātu ticamība šo kategoriju vielām nav formāli novērtēta.

4.

Definīcijas sk. 1. papildinājumā.

5.

Šīs testēšanas metodes pamatā ir Alternatīvo metožu validēšanas starpaģentūru koordinācijas komitejas (ICCVAM) BCOP testēšanas metodes protokols (8), kas tika izstrādāts pēc starptautiska validācijas pētījuma (4)(5)(9), kurā piedalījās Eiropas Alternatīvo metožu validēšanas centrs (ECVAM) un Japānas Alternatīvo metožu validēšanas centrs (JaCVAM). Protokola pamatā ir informācija, kas iegūta no In vitro pētījumu institūta (IIVS) un INVITTOX protokola Nr. 124 (10), kurš atbilst Eiropas Kopienas sponsorētā 1997.-1998. gadā veiktā BCOP testa iepriekšējas validācijas pētījumā izmantotajam protokolam. Abu protokolu pamatā ir BCOP testēšanas metodika, ko pirmoreiz aprakstījuši Gautheron et al. (11).

6.

Šīs testēšanas metodes apzinātie ierobežojumi ir lielais kļūdaini pozitīvo rezultātu procents spirtiem un ketoniem un lielais kļūdaini negatīvo rezultātu procents cietvielām validācijas datubāzē (sk. 44. punktu) (5). Ja no datubāzes izslēdz vielas, kas ietilpst šajās fizikālo un ķīmisko īpašību klasēs, BCOP precizitāte ES, EPA un GHS klasifikācijas sistēmās ievērojami uzlabojas (5). Pamatojoties uz šā testa nolūku (t.i., identificēt tikai nopietnus acu bojājumus / nopietnu kairinājumu izraisošas vielas), kļūdaini negatīvo rezultātu procentam nav būtiskas nozīmes, jo šādas vielas pēc tam tiktu testētas izmēģinājumos ar trušiem vai izmantojot citus pietiekami validētus in vitro testus atkarībā no normatīvajos aktos noteiktajām prasībām, izmantojot secīgas testēšanas stratēģiju un citus attiecīgus datus. Turklāt patlaban esošā validācijas datubāze nedod iespējas pienācīgi novērtēt dažas ķīmisko vielu un produktu klases (piemēram, maisījumus). Taču var mēģināt izmantot šo testēšanas metodi visu veidu testējamajiem materiāliem (tostarp maisījumiem), ja pozitīvs rezultāts var būt pieņemams kā norāde par nopietnus acu bojājumus vai nopietnu kairinājumu izraisošu iedarbību. Taču par spirtiem un ketoniem iegūtie pozitīvie rezultāti jāinterpretē piesardzīgi pārvērtēšanas riska dēļ.

7.

Visās procedūrās ar liellopu acīm un liellopu radzenēm testēšanas iestādēm jāievēro piemērojamie noteikumi un procedūras darbībām ar dzīvnieku izcelsmes materiāliem, pie kuriem pieder arī audi un audu šķidrumi. Bez tam ieteicams ievērot vispārējos piesardzības pasākumus darbam laboratorijā (12).

8.

Lai gan testēšanas metodē tiek ņemti vērā daži iedarbības veidi uz acīm, kas tiek novērtēti truša acs kairinājuma testa metodē un zināmā mērā to smagums, tajā netiek ņemti vērā konjunktīvas un varavīksnenes bojājumi, kas ir šīs metodes ierobežojums. Kaut gan radzenes bojājumu atgriezeniskumu per se nevar novērtēt izmantojot BCOP testa metodi, pamatojoties uz izmēģinājumu rezultātiem ar trušiem, ierosināts neatgriezeniskas un atgriezeniskas iedarbības nošķiršanai izmantot radzenes bojājuma sākotnējā dziļuma novērtējumu (13). Visbeidzot, izmantojot BCOP metodi, nevar novērtēt ar iedarbību uz acīm saistītās sistēmiskās toksicitātes potenciālu.

9.

Patlaban notiek darbs pie precīzāku raksturlielumu izstrādes BCOP metodes izmantošanas iespēju un ierobežojumu noteikšanā kairinājumu izraisošu un kairinājumu neizraisošu vielu identificēšanai (sk. arī 45. punktu). BCOP testēšanas metodes formālai novērtēšanai un iespējamo izmantošanas veidu noteikšanai, tostarp kairinājumu izraisošu un kairinājumu neizraisošu vielu identificēšanai, tās lietotāji tiek aicināti iesniegt validācijas organizācijām paraugus un/vai sniegt datus.

10.

Laboratorijām, kas sāk lietot šo testēšanas metodi, jāizmanto 2. papildinājumā norādītās standartvielas. Laboratorija šīs vielas var izmantot BCOP testēšanas metodes izpildes tehniskās kompetences demonstrēšanai pirms BCOP testēšanas rezultātu datu iesniegšanas izmantošanai normatīvajos aktos reglamentētajai bīstamības klasifikācijai.

11.

BCOP testēšanas metode ir orgāntipisks modelis, kas īslaicīgi nodrošina iespēju saglabāt liellopu acs radzenes normālas fizioloģiskas un bioķīmiskas funkcijas in vitro. Šajā testēšanas metodē testējamās vielas radītos bojājumus novērtē, veicot radzenes duļķošanās un gaismas caurlaidības izmaiņu kvantitatīvus mērījumus attiecīgi ar opacitometru un redzamās gaismas spektrofotometru. Abus mērījumus izmanto IVIS aprēķināšanai, pēc kura nosaka kairinājuma izraisīšanas bīstamības klasifikācijas kategoriju in vitro, ko izmanto testējamās vielas acu kairinājumu izraisīšanas potenciāla in vivo prognozei (sk. sadaļu “Lēmuma pieņemšanas kritēriji”).

12.

BCOP testēšanas metodē tiek izmantotas tikko kautu liellopu acs izolētas radzenes. Radzenes duļķošanos mēra kvantitatīvi kā radzenes gaismas caurlaidību. Radzenes caurlaidību mēra kvantitatīvi kā krāsvielas fluoresceīna nātrija sāls daudzumu, kas iziet cauri visam radzenes slānim un ko nosaka aizmugurējā nodalījuma vidē. Testējamo vielu aplicē uz radzenes epitēlija virsmas, to iepildot radzenes turētāja priekšējā kamerā. 3. papildinājumā dots BCOP metodē izmantojamā radzenes turētāja apraksts un shēma. Radzenes turētāji ir gatavi nopērkami no dažādiem piegādātājiem, tos var izgatavot pašu spēkiem.

13.

Uz kautuvēm nosūtītos liellopus parasti kauj izmantošanai patēriņam cilvēku pārtikā vai citām vajadzībām. Par cilvēkiem paredzētas pārtikai piemērotiem uzskata tikai veselīgus dzīvniekus, ko izmanto arī BCOP testā vajadzīgo radzeņu iegūšanai. Liellopu dzīvsvars atkarībā no šķirnes, vecuma un dzimuma var ievērojami atšķirties, tāpēc netiek noteikts ieteicamais dzīvnieka dzīvsvars kaušanas laikā.

14.

Ja tiek izmantotas dažāda vecuma dzīvnieku acis, to radzeņu izmēri var atšķirties. No liellopiem, kas vecāki par astoņiem gadiem, parasti iegūst radzenes, kuru diametrs horizontāli ir > 30,5 mm un kuru biezums centrā (CCT) ir ≥ 1 100 μm, savukārt no liellopiem, kas ir jaunāki par pieciem gadiem, iegūst radzenes ar diametru horizontāli < 28,5 mm un CCT < 900 μm (14). Šā iemesla dēļ tāpēc parasti neizmanto par 60 mēnešiem vecāku liellopu acis. Parasti neizmanto arī par 12 mēnešiem jaunāku liellopu acis, jo tās vēl attīstās un radzenes biezums un diametrs ir ievērojami mazāki nekā pieaugušu liellopu acīm. Taču jaunlopu (t.i., 6 līdz 12 mēnešus vecu) radzenes ir pieļaujams izmantot, jo tām ir dažas priekšrocības, piemēram, lielāka pieejamība, mazs vecuma diapazons un mazāks darbinieku iespējamas saskares risks ar liellopu sūkļveida encefalopātiju (15). Tā kā būtu lietderīgi sīkāk novērtēt, kā radzenes lielums un biezums ietekmē tās reakciju uz nopietnus acu bojājumus/ nopietnu acu kairinājumu izraisītāju vielu iedarbību, lietotāji tiek rosināti norādīt to dzīvnieku aptuveno vecumu un/vai dzīvsvaru, no kuriem ņemtas testēšanai izmantotās radzenes.

15.

Acis ņem kautuvju darbinieki. Lai pēc iespējas samazinātu acu mehāniskos un cita veida bojājumus, acis izņem iespējami drīz pēc dzīvnieka nonāvēšanas. Lai novērstu kairinājumu iespējami izraisošu vielu iedarbību uz acīm, dzīvnieka galvas skalošanai nedrīkst izmantot detergentus.

16.

Piemērota izmēra konteinerā acis pilnībā iegremdē Henksa šķīdumā (Hanks’ Balanced Salt Solution, HBSS) un nogādā laboratorijā tā, lai pēc iespējas samazinātu to bojāšanos un/vai bakteriālo kontamināciju. Tā kā acis tiek ņemtas kaušanas laikā, tās var būt pakļautas asiņu un citu bioloģisko materiālu, kā arī baktēriju u.c. mikroorganismu iedarbībai. Tāpēc ir svarīgi iespējami samazināt kontaminācijas risku (piemēram, turot konteineru ar acīm uz kūstoša ledus, un Henksa šķīdumam (HBSS), kurā acis atrodas transportēšanas laikā, pievienojot antibiotikas [piemēram, penicilīnu koncentrācijā 100 IU/mL un streptomicīnu koncentrācijā 100 μg/mL]).

17.

Pēc iespējas samazina laiku no acu ņemšanas līdz radzeņu izmantošanai BCOP testā (parasti ņem un izmanto tajā pašā dienā), un uzskatāmi parāda, ka tam nav ietekmes uz testēšanas rezultātiem. Šo rezultātu pamatā ir acu izvēles kritēriji, kā arī atbildes reakcijas pozitīvajā un negatīvajā kontrolē. Visām testēšanā izmantotajām acīm ir jābūt no vienas noteiktā dienā ņemto acu grupas.

18.

Pēc acu nogādāšanas laboratorijā uzmanīgi pārbauda, vai tām nav bojājumu, tostarp pārmērīgas duļķošanās, skrambu vai neovaskularizācijas. Jāizmanto tikai tādu acu radzenes, kam nav šo bojājumu.

19.

Vēlāk testēšanas procesā novērtē arī katras radzenes kvalitāti. Nav derīgas radzenes, kuru duļķošanās rādītājs pēc sākotnējās vienas stundas līdzsvarošanas perioda ir lielāks par septiņām duļķošanās vienībām (PIEZĪME: opacitometrs jākalibrē ar duļķainības kalibratoriem standartiem, kurus izmanto duļķošanās vienību noteikšanai, sk. 3. papildinājumu).

20.

Katrā paraugu grupā (testējamā viela, paralēlas negatīvās un pozitīvās kontroles) jābūt vismaz trīs acīm. BCOP testa negatīvajai kontrolei izmanto trīs radzenes. Tā kā visas radzenes tiek izņemtas no acs ābola un iemontētas radzeņu kamerās, ir iespējami atsevišķu radzeņu duļķošanās un caurlaidības rādītāju artefakti (tostarp negatīvajā kontrolē). Turklāt, veicot IVIS aprēķinus, radzeņu, kam veic negatīvo kontroli, duļķošanās un caurlaidības vērtības tiek izmantotas to radzeņu duļķošanās un caurlaidības vērtību korekcijai, uz kurām iedarbojas ar testējamo vielu un izmanto pozitīvajai kontrolei.

21.

Nebojātas radzenes izpreparē kopā ar 2–3 mm platu cīpslenes daļu, lai atvieglotu turpmākās operācijas un nebojātu radzenes epitēliju un endotēliju. Izolētās radzenes nostiprina šim nolūkam paredzētos radzeņu turētājos, kas sastāv no priekšējā un aizmugurējā nodalījuma, kuri saskaras attiecīgi ar radzenes epitēlija un endotēlija virsmu. Abas kameras (vispirms aizmugurējo kameru) tā, lai neveidotos burbuļi, pilnībā piepilda ar siltu Īgla barotni (Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM). Pēc tam vismaz vienu stundu ierīci iztur pie 32 ± 1 °C, lai stabilizētu tās temperatūru un radzene būtu līdzsvarā ar apkārtējo vidi, iespējami nodrošinot normālu metabolisko aktivitāti (radzenes virsmas temperatūra in vivo ir apmēram 32 °C).

22.

Pēc līdzsvarošanas abās kamerās iepilda svaigu siltu EMEM, un katrai radzenei nolasa sākotnējās duļķošanās rādījumus. Radzenes, kam tiek konstatēti makroskopiski audu bojājumi (piemēram, skrambas, pigmentācija, neovaskularizācija) vai kuru duļķošanās rādītājs ir lielāks par 7 duļķošanās vienībām, nav derīgas. Aprēķina visu to radzeņu vidējo duļķošanos, kam veikta līdzsvarošana. Vismaz trīs radzenes, kuru duļķošanās vērtības ir tuvu visu radzeņu vidējai duļķošanās vērtībai, izmanto negatīvajai (jeb šķīdinātāju) kontrolei. Pārējās radzenes iedala testa un pozitīvās kontroles grupās.

23.

Tā kā ūdens siltumietilpība ir lielāka par gaisa siltumietilpību, ūdens nodrošina stabilākus temperatūras apstākļus inkubācijai. Tāpēc radzenes turētāja un tā satura uzturēšanai 32 ± 1 °C temperatūrā ieteicams izmantot ūdens vannu. Taču var izmantot arī inkubatorus ar gaisu, ja tiek veikti temperatūras stabilitātes uzturēšanai vajadzīgie pasākumi (piemēram, iepriekš sasildot turētājus un barotni).

24.

Izmanto divus dažādus apstrādes protokolus, vienu šķidrumiem un virsmaktīvām vielām (cietvielām vai šķidrumiem), bet otru cietvielām, kas nav virsmaktīvas.

25.

Šķidrumu iedarbību testē neatšķaidot, bet virsmaktīvās vielas testē 10 % (masas) koncentrācijā 0,9 % nātrija hlorīda šķīduma, destilēta ūdens vai cita šķīdinātāja šķīdumā, par kuriem ir iegūtas liecības, ka tiem nav nevēlamas ietekmes uz testēšanas sistēmu. Pusšķidrus, krēmveida un vaskveida materiālus parasti testē šķīdumu veidā. Ja izmanto citu atšķaidīšanas koncentrāciju, tas ir attiecīgi jāpamato. Šķidrumu un virsmaktīvo vielu iedarbībai radzenes pakļauj 10 min. Ja izmanto citu iedarbības laiku, tam jāsniedz pienācīgs zinātnisks pamatojums.

26.

Cietvielas, kas nav virsmaktīvas, parasti testē šķīdumu vai suspensiju veidā 20 % koncentrācijā 0,9 % nātrija hlorīda šķīduma, destilēta ūdens vai cita šķīdinātāja šķīdumā, par kuriem ir iegūtas liecības, ka tiem nav nevēlamas ietekmes uz testēšanas sistēmu. Zināmos apstākļos ar pienācīgu zinātnisku pamatojumu cietvielas var testēt tīrā veidā, izmantojot vaļējās kameras metodi (sk. 29. punktu), tās tieši aplicējot uz radzenes virsmas. Cietvielu iedarbībai radzenes pakļauj četras stundas, taču, tāpat kā šķidrumu un virsmaktīvu vielu gadījumā, ar pienācīgu zinātnisku pamatojumu drīkst izmantot citu iedarbības laiku.

27.

Atkarībā no testējamās vielas fizikālajām un ķīmiskajām īpašībām (piemēram, cietvielas, šķidrumi, viskozi un neviskozi šķidrumi) var izmantot dažādas aplicēšanas metodes. Galvenais ir nodrošināt, lai testējamā viela pienācīgi pārklātu epitēlija virsmu, un skalojot tā tiktu pienācīgi noskalota. Slēgtās kameras metodi parasti izmanto neviskozām vai nedaudz viskozām testējamām vielām, kas ir šķidrumi, bet vaļējās kameras metodi parasti izmanto daļēji viskozām un viskozām testējamajām vielām un cietvielām tīrā veidā.

28.

Izmantojot slēgtās kameras metodi, pietiekamu daudzumu testējamās vielas (750 μL), ar ko var pārklāt radzenes epitēlija virsmu, ievieto priekšējā kamerā pa dozēšanas atverēm kameras augšpusē un atveres pēc tam uz iedarbības laiku noslēdz ar kameras aizbāžņiem. Svarīgi ir nodrošināt, lai katra radzene tiktu pakļauta testējamās vielas iedarbībai uz atbilstošu laiku.

29.

Izmantojot vaļējās kameras metodi, pirms aplicēšanas noņem loga slēggredzenu un priekšējās kameras stikla lodziņu. Kontroles vai testējamo vielu (750 μL vai tādu testējamās vielas daudzumu, ar ko var pilnībā noklāt radzeni) aplicē tieši uz radzenes epitēlija virsmas ar mikropipeti. Ja testējamās vielas dozēšana ar pipeti ir apgrūtināta, to var zem spiediena iepildīt virzuļpipetē, lai atvieglotu dozēšanu. Virzuļpipetes uzgali ievieto šļirces dozēšanas uzgalī, lai materiālu spiediena iedarbības rezultātā varētu iespiest dozēšanas uzgalī. Vienlaikus, pipetes virzulim pārvietojoties augšup, tiek spiests šļirces virzulis. Ja pipetes uzgalī parādās gaisa burbuļi, testējamo materiālu izņem (izspiež) un procesu atkārto, kamēr uzgalis ir pilns un tajā nav gaisa burbuļu. Ja vajadzīgs, var izmantot parastu šļirci (bez adatas), jo ar to var izmērīt precīzu testējamās vielas tilpumu, un vielu ir vieglāk uzklāt radzenes epitēlija virsmai. Pēc aplicēšanas priekšējai kamerai ieliek stikla lodziņu, lai atkal izveidotu noslēgtu sistēmu.

30.

Pēc iedarbības perioda testējamo, negatīvās kontroles vai pozitīvās kontroles vielu izņem no priekšējās kameras un epitēliju vismaz trīs reizes (vai kamēr vairs nav vizuāli novērojamas testējamās vielas paliekas) nomazgā ar EMEM (kas satur fenolsarkano). Barotni, kurā ir fenolsarkanais, izmanto skalošanai, jo fenolsarkanā krāsas izmaiņas var novērot, lai noteiktu skābu vai sārmainu materiālu noskalošanas efektivitāti. Radzenes mazgā vairāk nekā trīs reizes, ja fenolsarkanais nekrāsojas sarkans (ir dzeltenā vai violetā krāsā) vai ja ir redzamas testējamā materiāla atliekas. Kad barotnē vairs nav testējamās vielas, radzenes pēdējo reizi noskalo ar EMEM (bez fenolsarkanā). Pēdējā skalošanas reizē izmanto EMEM (bez fenolsarkanā), lai noskalotu fenolsarkano no priekšējās kameras pirms duļķošanās mērīšanas. Pēc tam priekšējo kameru no jauna piepilda ar svaigu EMEM, kas nesatur fenolsarkano.

31.

Testējot šķidrumus vai virsmaktīvas vielas, pēc skalošanas radzenes inkubē vēl divas stundas 32 ± 1 °C temperatūrā. Zināmos apstākļos var būt noderīgs ilgāks pēciedarbības laiks, kas jāņem vērā konkrētos gadījumos. Ar cietvielām apstrādātas radzenes pēc četru stundu ilgā iedarbības perioda beigām rūpīgi noskalo, bet tām nav vajadzīga papildu inkubācija.

32.

Pēc šķidrumu un virsmaktīvo vielu iedarbības paredzētā inkubācijas perioda beigām un, izņemot virsmaktīvās vielas, pēc četru stundu ilgas cietvielu iedarbības novēro katras radzenes duļķošanos un caurlaidību. Katru radzeni apskata un reģistrē novērojumus (piemēram, audu nolobīšanās, testējamā materiāla atliekas, nevienmērīgas duļķošanās pazīmes). Šie novērojumi var būt svarīgi, jo ar tiem var būt izskaidrojamas opacitometra rādījumu atšķirības.

33.

Katrā eksperimentā iekļauj paralēlas negatīvās vai šķīdinātāja/nesēja kontroles un pozitīvās kontroles.

34.

Testējot vielu, kas ir šķidrums ar 100 % koncentrāciju, BCOP testēšanas metodē iekļauj paralēlu negatīvo kontroli (piemēram, 0,9 % nātrija hlorīda šķīdumu vai destilētu ūdeni), lai varētu konstatēt neraksturīgas testēšanas sistēmas izmaiņas un testējamajiem beigu punktiem noteiktu sākotnējās vērtības. Tādējādi tiek arī nodrošināts, lai testēšanas apstākļu dēļ kā atbildes reakcija nepareizi netiktu konstatēts kairinājums.

35.

Testējot atšķaidītu vielu, kas ir šķidrums, virsmaktīvo vielu vai cietvielu, BCOP testēšanas metodē iekļauj paralēlu šķīdinātāja/nesēja kontroles grupu, lai varētu konstatēt neraksturīgas testēšanas sistēmas izmaiņas un noteiktu mērāmo parametru sākotnējās vērtības. Drīkst izmantot tikai tādu šķīdinātāju/nesēju, par kuru iegūtas liecības, ka tam nav nevēlamas ietekmes uz testēšanas sistēmu.

36.

Katrā eksperimentā kā paralēlu pozitīvo kontroli iekļauj testu ar acu kairinājumu izraisošu vielu, lai pārliecinātos, ka atbildes reakcija ir atbilstoša. Tā kā šajā testēšanas metodē BCOP tests tiek izmantots, lai identificētu acu nopietnus bojājumus vai nopietnu kairinājumu izraisītājas vielas, ideālā gadījumā pozitīvajai kontroles vielai būtu jābūt standartvielai, kas šajā testēšanas metodē izraisa spēcīgu reakciju. Tomēr, lai nodrošinātu iespēju novērtēt pozitīvās kontroles reakcijas mainību laikā, kairinājuma reakcijas intensitāte nedrīkstētu būt pārmērīgi liela.

37.

Pozitīvās kontroles piemēri testējamajām vielām, kas ir šķidrumi, ir dimetilformamīds vai 1 % nātrija hidroksīda šķīdums. Pozitīvās kontroles piemērs testējamajām cietvielām ir 20 % (masas) imidazola šķīdums 0,9 % nātrija hlorīda šķīdumā.

38.

Salīdzināšanas vielas ir lietderīgi izmantot, lai novērtētu noteiktas nezināmu ķīmisko ielu vai produktu kategorijas potenciālu izraisīt acu kairinājumu vai novērtētu acu kairinājumu izraisošas vielas salīdzinošo spēju izraisīt noteiktas intensitātes kairinājuma reakcijas.

39.

Duļķošanos nosaka pēc radzenes gaismas caurlaidības. Radzenes duļķošanos mēra kvantitatīvi ar opacitometru, rezultātā iegūstot duļķošanās vērtības, kas ir nepārtraukti lielumi.

40.

Caurlaidību nosaka pēc krāsvielas fluoresceīna nātrija sāls daudzuma, kas iziet cauri visiem radzenes šūnu slāņiem (t.i., no epitēlija uz radzenes ārējās virsmas līdz endotēlijam uz radzenes iekšējās virsmas). Radzenes turētāja priekšējo kamerā, kas saskaras ar radzenes epitēlija virsmu, iepilda 1 mL fluoresceīna nātrija sāls šķīduma (attiecīgi 4 vai 5 mg/mL, testējot šķidrumus un virsmaktīvās vielas vai cietvielas, kas nav virsmaktīvas), savukārt aizmugurējo kameru, kas saskaras ar radzenes endotēlija virsmu, piepilda ar svaigu EMEM. Pēc tam turētāju horizontālā stāvoklī 90 ± 5 min inkubē 32 ± 1 °C temperatūrā. Izmantojot UV/VIS spektrofotometriju, kvantitatīvi izmēra fluoresceīna nātrija sāls daudzumu, kas nonāk aizmugurējā kamerā. Spektrofotometriskos mērījumus veic pie 490 nm, reģistrē kā optiskā blīvuma (OD490) vai absorbcijas vērtības, ko mēra kā nepārtrauktu lielumu. Fluoresceīna caurlaidības vērtības nosaka, izmantojot OD490 vērtības, izmantojot redzamās gaismas spektrofotometru ar standarta 1 cm optiskā ceļa garumu.

41.

Var izmantot arī 96 iedobju mikrotitrēšanas plati, ja (i) var noteikt fluoresceīna OD490 vērtību noteikšanai izmantotās plates lasītāja lineāro diapazonu un (ii) lai iegūtu OD490 vērtības, kas ekvivalentas standarta 1 cm optiskā ceļa garumam, 96 iedobju platē tiek izmantoti pareiza tilpuma fluoresceīna paraugi (tam vajadzīga pilnībā pilna iedobe [parasti 360 μL]).

42.

Pēc duļķošanās un vidējās caurlaidības (OD490) vērtību korekcijas, ņemot vērā fona duļķošanos un negatīvās kontroles caurlaidības OD490 vērtības, lai katrai testējamo paraugu grupai aprēķinātu in vitro kairinājuma rādītāju (IVIS) katras testējamās paraugu grupas vidējās duļķošanās un caurlaidības OD490 vērtības apvieno, izmantojot šādu empīrisku formulu:

IVIS = vidējā duļķošanās vērtība + (15 × vidējā caurlaidības OD490 vērtība)

Sina et al. (16) norāda, ka šī formula ir iegūta iekšlaboratoriju un starplaboratoriju pētījumos. Datiem, kas, izmantojot 36 savienojumus, iegūti vairāku laboratoriju veiktā pētījumā, tika veikta daudzfaktoru analīze, lai iegūtu vienādojumu, kas vislabāk apraksta in vivo un in vitro datu savstarpējo sakarību. Šo analīzi veica divas atsevišķas zinātnieku grupas, iegūstot gandrīz identiskus vienādojumus.

43.

Duļķošanās un caurlaidības vērtības jānovērtē arī neatkarīgi viena no otras, lai noteiktu, vai testējamā viela izraisījusi nopietnus acu bojājumus vai nopietnu kairinājumu tikai kāda viena testēšanas beigu punkta vai to abu dēļ (sk. sadaļu “Lēmuma pieņemšanas kritēriji”).

44.

Vielu uzskata par nopietnus acu bojājumus vai nopietnu kairinājumu izraisošu, ja tās iedarbības rezultātā izmērītais IVIS ir ≥ 55,1. Kā noteikts 1. punktā, ja testējamā viela netiek identificēta kā nopietnus acu bojājumus vai nopietnu kairinājumu izraisoša, tās klasifikācijai un marķēšanai ir jāveic papildu testēšana. BCOP testēšanas metodes pareizība ir 79 % (113/143) līdz 81 % (119/147), kļūdaini pozitīvo rezultātu daļa ir no 19 % (20/103) līdz 21 % (22/103) un kļūdaini negatīvo rezultātu daļa ir no 16 % (7/43) līdz 25 % (10/40), salīdzinot ar datiem, kas iegūti pēc truša acu testēšanas metodes in vivo, kas klasificēti atbilstīgi EPA (1), ES (2) vai GHS (3) klasifikācijas sistēmai. Ja noteiktu ķīmisko (t.i., spirti, ketoni) vai fizikālo (t.i., cietvielas) īpašību grupas vielas izslēdz no datubāzes, BCOP pareizība ES, EPA un GHS klasifikācijas sistēmā ir no 87 % (72/83) līdz 92 % (78/85), kļūdaini pozitīvo rezultātu daļa ir no 12 % (7/58) līdz 16 % (9/56) un kļūdaini negatīvo rezultātu daļa ir no 0 % (0/27) līdz 12 % (3/26).

45.

Ja testējamo vielu neklasificē kā nopietnus acu bojājumus vai nopietnu kairinājumu izraisošu, kopā ar truša acu testa in vivo vai cita atbilstīgi validēta in vitro testa datiem BCOP dati var būt noderīgi, lai turpmāk novērtētu BCOP testēšanas metodes piemērotību un ierobežojumus acu kairinājumu izraisošu un acu kairinājumu neizraisošu vielu testēšanai (patlaban tiek izstrādāts norādījumu dokuments par in vitro testēšanas metodēm, lai noteiktu toksicitāti acīm).

46.

Testēšanas rezultātu uzskata par pieņemamu, ja pozitīvajā kontrolē tiek iegūta IVIS vērtība, kas divkāršas standartnovirzes robežās sakrīt ar tādas pašreizējo iepriekš iegūto vēsturisko datu vidējo vērtību, kura tiek atjaunināta vismaz reizi trīs mēnešos vai ikreiz, kad veic pieņemamu testu laboratorijās, kurās testēšanu izdara reti (t.i., retāk nekā reizi mēnesī). Negatīvās vai šķīdinātāja/nesēja kontroles rezultātā jāiegūst tādas duļķošanās un caurlaidības vērtības, kas ir mazākas nekā liellopu radzenēm sākotnēji noteiktās fona duļķošanās un caurlaidības augstākās vērtības attiecīgajā negatīvajā vai šķīdinātāja/nesēja kontrolē.

47.

Testēšanas pārskatā jāiekļauj šāda informācija, kas attiecas uz konkrēto noteikšanu:

Testējamās vielas un kontrolvielas

Informācija par sponsoru un testēšanas iestādi

Izmantotās testēšanas metodes un protokola pamatojums

Testēšanas metodes integritāte

Procedūra, ko izmanto, lai nodrošinātu testēšanas metodes integritāti (t.i., pareizību un ticamību) laikā (piemēram, periodiska standartvielu testēšana, iepriekš iegūto vēsturisko negatīvās un pozitīvās kontroles datu izmantošana).

Testa apstiprināšanas kritēriji

Testēšanas apstākļi

Rezultāti

Rezultātu novērtējums

Secinājums

(1)

(2)

Eiropas Parlamenta un Padomes 2008. gada 16. decembra Regula (EK) Nr. 1272/2008 par vielu un maisījumu klasificēšanu, marķēšanu un iepakošanu un ar ko groza un atceļ Direktīvas 67/548/EEK un 1999/45/EK un groza Regulu (EK) Nr. 1907/2006. OV L 353, 31.12.2008., 1. lpp.

(3)

UN (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications, 2007. Pieejams:

[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]

(4)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Pieejams:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm]

(5)

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Centre for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Pieejams:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(6)

Eiropas Parlamenta un Padomes 2006. gada 18. decembra Regula (EK) Nr. 1907/2006, kas attiecas uz ķimikāliju reģistrēšanu, vērtēšanu, licencēšanu un ierobežošanu (REACH), un ar kuru izveido Eiropas Ķimikāliju aģentūru, groza Direktīvu 1999/45/EK un atceļ Padomes Regulu (EEK) Nr. 793/93 un Komisijas Regulu (EK) Nr. 1488/94, kā arī Padomes Direktīvu 76/769/EEK un Komisijas Direktīvu 91/155/EEK, 93/67/EEK, 93/105/EK un 2000/21/EK. OV L 396, 30.12.2006., 1. lpp.

(7)

OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Pieejams:

[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(8)

ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Centre for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Pieejams:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(9)

ICCVAM. (2006). Current Status of In vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Pieejams:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(10)

(11)

(12)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Pieejams:

[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].

(13)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(14)

Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159-2165.

(15)

(16)

Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam Appl Toxicol 26:20-31.

(17)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Pieejams:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

(18)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Pieejams:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

1.

Izolētas vistas acs (ICE) testēšanas metode in vitro ir noteikšanas metode, ko konkrētos apstākļos un ar noteiktiem ierobežojumiem var izmantot, lai vielas un to maisījumus klasificētu kā “nopietnus acu bojājumus vai nopietnu kairinājumu” izraisītājus (1) (2) (3). Šajā testēšanas metodē par nopietnu kairinājumu izraisošām uzskata vielas, kas trušiem rada acu bojājumus, kuri neizzūd vismaz 21 dienas laikā pēc iedarbības. Kaut gan netiek uzskatīts, ka ar ICE var pilnībā aizstāt iedarbības testu uz acīm in vivo ar trušiem, ICE iesaka izmantot daudzpakāpju testēšanas stratēģijā, lai īpašas lietošanas jomā veiktu normatīvajos aktos reglamentēto klasifikāciju un marķēšanu (4) (5). Testējamās vielas (6) var klasificēt kā nopietnus acu bojājumus vai nopietnu kairinājumu izraisošas, neveicot papildu testēšanu ar trušiem. Ar vielām, kuru testēšanas rezultāts ir negatīvs, jāveic izmēģinājumi, izmantojot trušus, pēc pakāpeniskas loģiski secīgas testēšanas stratēģiju saskaņā ar ESAO testēšanas norādījumiem OECD Test Guideline 405 (7) (šī pielikuma B. 5. nodaļa).

2.

Šajā testēšanas metodē aprakstītas procedūras, ko izmanto, lai vērtētu testējamās vielas potenciālo nopietnus bojājumus vai nopietnu kairinājumu izraisošo iedarbību uz acīm, ko mēra ar tās spēju izraisīt toksisku iedarbību uz izolētu vistas aci. Toksisko iedarbību uz radzeni mēra ar šādiem parametriem: (i) kvalitatīvs duļķošanās novērtējums, (ii) kvalitatīvs epitēlija bojājumu novērtējums, pamatojoties uz fluoresceīna aplicēšanu acij (fluoresceīna aizturēšana), (iii) kvantitatīvs biezuma palielināšanās (uzbrieduma) novērtējums un (iv) kvalitatīvs makroskopisko morfoloģisko virsmai radīto bojājumu novērtējums. Radzenes duļķošanās, uzbrieduma un bojājumu novērtējumu pēc testējamās vielas iedarbības novērtē atsevišķi un pēc tam apvieno, lai noteiktu acu kairinājuma klasifikāciju.

3.

Izmantojot ICE testēšanas metodi, ir testētas arī acu kairinājumu izraisošas vielas, kas rada bojājumus, kuri izzūd drīzāk nekā 21 dienā, un vielas, kam nav kairinājumu izraisošas iedarbības. Taču ICE testēšanas metodes pareizība un ticamība šo kategoriju vielām nav formāli novērtēta.

4.

Definīcijas sk. 1. papildinājumā.

5.

Šīs testēšanas metodes pamatā ir Alternatīvo metožu validēšanas starpaģentūru koordinācijas komitejas (ICCVAM) ICE testēšanas metodes protokols (8), kas tika izstrādāts pēc starptautiska validācijas pētījuma (4) (5) (9), kurā piedalījās Eiropas Alternatīvo metožu validēšanas centrs, Japānas Alternatīvo metožu validēšanas centrs un TNO Dzīves kvalitātes nodaļas toksikoloģijas un praktiskās farmakoloģijas departaments (Nīderlande). Protokola pamatā ir informācija, kas iegūta no publicētiem protokoliem, kā arī TNO pašlaik izmantotā protokola (10) (11) (12) (13) (14).

6.

Šīs metodes apzinātie ierobežojumi ir lielais kļūdaini pozitīvo rezultātu procents spirtiem un lielais kļūdaini negatīvo rezultātu procents cietvielām un virsmaktīvām vielām (sk. 47. punktu) (4). Ja no datubāzes izslēdz vielas, kas ietilpst šajās ķīmisko un fizikālo īpašību klasēs, ICE precizitāte ES, EPA un GHS klasifikācijas sistēmās ievērojami uzlabojas (4). Pamatojoties uz šīs testēšanas mērķi (t.i., identificēt tikai nopietnus acu bojājumus / nopietnu kairinājumu izraisošas vielas), kļūdaini negatīvo rezultātu procentam nav būtiskas nozīmes, jo šādas vielas pēc tam tiktu testētas izmēģinājumos ar trušiem vai citus pietiekami validētus in vitro testus, atkarībā no normatīvo aktu prasībām, izmantojot secīgas testēšanas stratēģiju un datu nozīmīguma pieeju. Turklāt, izmantojot līdzšinējo validācijas datubāzi, nevarēja pienācīgi novērtēt dažas ķīmisko vielu vai produktu klases (piemēram, maisījumus). Taču var apsvērt iespējas izmantot šo testēšanas metodi visu veidu testējamajiem materiāliem (tostarp maisījumiem), ja pozitīvs rezultāts var būt pieņemams kā norāde par nopietnus acu bojājumus vai nopietnu kairinājumu izraisošu iedarbību. Taču spirtu testēšanā iegūti pozitīvi rezultāti jāinterpretē piesardzīgi pārvērtēšanas riska dēļ.

7.

Visās procedūrās ar vistu acīm testēšanas iestādēm jāievēro piemērojamie noteikumi un procedūras darbībām ar cilvēku vai dzīvnieku izcelsmes materiāliem, pie kuriem pieder arī audi un audu šķidrumi. Bez tam ieteicams ievērot vispārējos piesardzības pasākumus darbam laboratorijā (15).

8.

Testēšanas metodē netiek ņemti vērā konjunktīvas un varavīksnenes bojājumi, kas ir tās ierobežojums, tomēr tajā tiek ņemti vērā daži iedarbības veidi uz aci, kas tiek novērtēti truša acs kairinājuma testa metodē, un zināmā mērā to smagums. Kaut gan radzenes bojājumu atgriezeniskumu nevar novērtēt, izmantojot ICE testēšanas metodi, pamatojoties uz trušu acu pētījumiem, ir ierosināts, ka, lai nošķirtu neatgriezenisku un atgriezenisku iedarbību, var izmantot radzenes bojājuma sākotnējā dziļuma novērtējumu (16). Visbeidzot, izmantojot ICE testēšanas metodi, nevar novērtēt sistēmiskas toksicitātes potenciālu saistībā ar iedarbību uz acīm.

9.

Patlaban notiek darbs pie precīzāku raksturlielumu izstrādes ICE testēšanas metodes noderīgumam un ierobežojumiem tādu vielu identificēšanai, kas nerada nopietnus acu bojājumus vai nopietnu acu kairinājumu (sk. arī 48. punktu). Lietotāji tiek aicināti iesniegt validācijas organizācijām paraugus un/vai datus, lai tās formāli novērtētu ICE testēšanas metodes turpmākos lietošanas veidus, tostarp nopietna acu kairinājuma izraisošu un acu kairinājumu neizraisošu vielu identificēšanai.

10.

Laboratorijām, kas sāk lietot šo testēšanas metodi, jāizmanto 2. papildinājumā norādītās standartvielas. Laboratorija šīs vielas var izmantot ICE testēšanas metodes izpildes tehniskās kompetences demonstrēšanai pirms ICE testēšanas rezultātu datu iesniegšanas izmantošanai normatīvajos aktos reglamentētajai bīstamības klasifikācijai.

11.

ICE testēšanas metode ir orgāntipisks modelis, kas īslaicīgi nodrošina iespēju saglabāt vistas aci in vitro. Šajā testēšanas metodē testējamās vielas radītos bojājumus novērtē, nosakot radzenes uzbriedumu, duļķošanos un fluoresceīna aizturi. Divi pēdējie parametri tiek novērtēti kvalitatīvi, bet radzenes uzbrieduma noteikšana ir kvantitatīva. Katru novērtējumu pārvērš kvantitatīvā rezultātā, ko izmanto, lai aprēķinātu kopējo kairinājuma rādītāju, vai tam piešķir kvalitatīvu kategoriju, ko izmanto, lai in vitro noteiktu nopietnus acu bojājumus vai nopietnu kairinājumu izraisītāju iedarbības klasifikāciju. Abus rezultātus var izmantot, lai prognozētu testējamās vielas potenciālo in vivo nopietnus acu bojājumus vai nopietnu kairinājumu izraisītāju iedarbību (sk. sadaļu “Lēmuma pieņemšanas kritēriji”).

12.

Parasti šajā testā izmanto acis, kas ņemtas no kautuvē cilvēku patēriņam pārtikai kautām vistām, tāpēc laboratorijas dzīvnieki nav jāizmanto. Izmanto tikai veselīgu dzīvnieku acis, kurus uzskata par piemērotiem cilvēkiem paredzētas pārtikas apritei.

13.

Kaut gan vistu optimālā vecuma novērtēšanai nav veikts īpašs pētījums, šajā testēšanas metodē ierasti izmanto pavasara cāļus, kurus parasti apstrādā putnu kautuvē (t.i., aptuveni 7 nedēļas vecus, 1,5–2,5 kg).

14.

Galvas atdala tūlīt pēc vistu apdullināšanas, parasti ar elektriskās strāvas triecienu, un asiņu nolaišanas pa griezumu kaklā. Jāizvēlas vietējs vistu sagādes avots, kas atrodas iespējami tuvu laboratorijai, lai vistu galvas no kautuves varētu nogādāt laboratorijā, iespējami samazinot to bojāšanos un/vai bakteriālo kontamināciju. Laiks no vistu galvu ņemšanas līdz acu izmantošanai ICE testam ir iespējami jāsamazina (parasti divu stundu laikā), un uzskatāmi jāparāda, ka tam nav nevēlamas ietekmes uz noteikšanas rezultātiem. Šo rezultātu pamatā ir acu izvēles kritēriji, kā arī pozitīvās un negatīvās kontroles reakcijas. Visām testēšanai izmantotajām acīm ir jābūt no vienas noteiktā dienā ņemtu acu grupas.

15.

Tā kā acis laboratorijā tiek preparētas, galvas no kautuves transportē pie apkārtējās vides temperatūras plastmasas kārbās, kurās mitrumu uztur ar sāls izotoniskā šķīdumā samitrinātiem dvieļiem.

16.

Izbrāķē acis, kurām pēc izņemšanas ir augsts fluoresceīna sākotnējais saistīšanas rādītājs (t.i., > 0,5) vai radzenes duļķošanās rādītājs (t.i., > 0,5).

17.

Katrā paraugu grupā un paralēlajā pozitīvajā kontrolē testē vismaz trīs acis. Negatīvās kontroles grupā vai šķīdinātāja kontrolē (ja izmanto šķīdinātāju, izņemot sāls šķīdumu) ir jābūt vismaz vienai acij.

18.

Uzmanīgi noņem plakstiņus, nebojājot radzeni. Radzenes integritāti ātri novērtē, uz dažām sekundēm uzpilinot tās virsmai 2 % (masas) fluoresceīna nātrija sāls šķīdumu, ko pēc tam noskalo ar sāls izotonisko šķīdumu. Pēc tam ar fluoresceīnu apstrādātas acis pārbauda ar spraugas lampas mikroskopu, lai pārliecinātos, vai radzene nav bojāta (t.i., ja fluoresceīna aiztures un radzenes duļķošanās rādītāji ir ≤ 0,5).

19.

Ja acs nav bojāta, to uzmanīgi, nebojājot radzeni, izpreparē galvaskausa. Acs ābolu izvelk no dobuma, stingri pieturot mirkšķināšanas membrānu ar ķirurģiskajām knaiblēm, un acs muskuļus pārgriež ar liektām šķērēm ar noapaļotiem galiem. Svarīgi ir nepieļaut radzenes bojājumus pārmērīga spiediena dēļ (t.i., saspiešanas artefakti).

20.

Kad acs ir izņemta no dobuma, pie tās atstāj redzamu daļu redzes nerva. Pēc izņemšanas no dobuma aci novieto uz absorbējoša paliktņa un nogriež mirkšķināšanas membrānu un citus saistaudus.

21.

Izņemto aci ar radzeni vertikālā stāvoklī iestiprina nerūsējošā tērauda skavā. Skavu pēc tam ievieto mitrināšanas aparāta kamerā (16). Skavas mitrināšanas aparātā ievieto tā, lai izotoniskā sāls šķīduma pilieni mitrinātu visu radzeni. Mitrināšanas aparāta kamerā jāuztur 32 ± 1,5 °C temperatūra. Tipisku mitrināšanas aparāta (ko var iegādāties vai izgatavot) un acu stiprinājuma skavu shēmu sk. 3. papildinājumā. Aparātu var pārveidot atbilstoši konkrētās laboratorijas vajadzībām (piemēram, lai izmantotu atšķirīgu acu skaitu).

22.

Pēc ievietošanas mitrināšanas aparātā acis vēlreiz apskata ar spraugas lampas mikroskopu, lai pārliecinātos, ka preparēšanas procedūrā tās nav bojātas. Izmēra radzenes biezumu radzenes virsotnē, izmantojot spraugas lampas mikroskopa dziļuma mērīšanas ierīci. Nomaina visas acis, (i) kuru fluoresceīna aiztures rezultāts ir > 0,5, (ii) kuru radzenes duļķošanās rādītājs ir > 0,5 vai (iii) kam ir jebkuras citas bojājumu pazīmes. No tām acīm, kas netiek izbrāķētas neviena šī kritērija dēļ, izbrāķē tās, kuru radzenes biezums atšķiras no visu acu radzenes vidējā biezuma rādītāja par vairāk nekā 10 %. Lietotājiem jāņem vērā, ka, izmantojot spraugas lampas mikroskopu, ar dažādu spraugas platumu radzenes biezuma mērījumu rezultāti var būt atšķirīgi. Spraugas platums jāiestata 0,095 mm.

23.

Kad visas acis ir pārbaudītas un atzītas par derīgām, acis apmēram 45 līdz 60 min inkubē, lai pirms aplicēšanas tās līdzsvarotu ar testēšanas sistēmu. Pēc līdzsvarošanas reģistrē radzenes biezuma un duļķošanās nulles sākotnējos mērījumu, ko izmanto kā sākuma punktu (t.i., laiks = 0). Šim testēšanas beigu punktam kā sākotnējās atskaites punktu izmanto fluoresceīna aiztures rādītāju, kas noteikts acs preparēšanas laikā.

24.

Tūlīt pēc nulles sākotnējiem mērījumiem (turētājā ievietotu) aci izņem no mitrināšanas aparāta, novieto horizontāli un uz radzenes aplicē testējamo vielu.

25.

Testējamās vielas, kas ir šķidrumi, parasti testē neatšķaidītas, taču tās var atšķaidīt, ja tas tiek uzskatīts par vajadzīgu (piemēram, plānojot pētījumu). Atšķaidīšanai ieteicams izmantot sāls fizioloģisko šķīdumu. Kontrolētos apstākļos var izmantot arī citus šķīdinātājus, taču, izņemot sāls fizioloģisko šķīdumu, citu šķīdinātāju piemērotība ir uzskatāmi jāparāda.

26.

Testējamās vielas, kas ir šķidrumi, uz radzenes aplicē tā, lai pilnībā visa radzenes virsma tiktu vienmērīgi noklāta ar testējamo vielu; standarta tilpums ir 0,03 mL.

27.

Cietvielas iespējami sīki jāsasmalcina piestā, vai izmantojot līdzvērtīgu smalcināšanas ierīci. Pulveri aplicē uz radzenes tā, lai virsmu vienmērīgi pārklātu ar testējamo vielu; standarta daudzums ir 0,03 g.

28.

Testējamo vielu (šķidruma vai cietvielas veidā) aplicē uz 10 sek un pēc tam noskalo no acs ar istabas temperatūras sāls izotonisko šķīdumu (apmēram 20 mL). Pēc tam aci (ievietotu turētājā) atkal ievieto mitrināšanas aparātā sākotnējā vertikālajā stāvoklī.

29.

Katrā eksperimentā iekļauj paralēlas negatīvās vai šķīdinātāja/nesēja kontroles un pozitīvās kontroles.

30.

Testējot šķidrumus 100 % koncentrācijā vai cietvielas, ICE testēšanas metodē izmanto paralēlu negatīvo kontroli ar sāls fizioloģisko šķīdumu, lai konstatētu neraksturīgas testēšanas sistēmas izmaiņas un nodrošinātu, ka noteikšanas apstākļu dēļ netiek konstatēta kairinājumu izraisoša reakcija.

31.

Testējot atšķaidītus šķīdumus, testēšanas metodē iekļauj paralēlu šķīdinātāja/nesēja kontroles grupu, lai konstatētu neraksturīgas testēšanas sistēmas izmaiņas un nodrošinātu, ka testēšanas apstākļu dēļ kairinājumu izraisoša reakcija netiek konstatēta. Kā noteikts 25. punktā, drīkst izmantot tikai tādu šķīdinātāju/nesēju, par kuru ir liecības, ka tam nav nelabvēlīgas ietekmes uz testēšanas sistēmu.

32.

Katrā eksperimentā kā paralēlu pozitīvo kontroli iekļauj testu ar zināmu acu kairinājumu izraisošu vielu, lai pārliecinātos, ka izraisītā atbildes reakcija ir atbilstoša. Tā kā šajā testēšanas metodē ICE tests tiek izmantots nopietnus acu bojājumus vai nopietnu kairinājumu izraisītāju vielu identificēšanai, pozitīvās kontroles vielai jābūt standartvielai, kas šajā testēšanas metodē izraisa spēcīgu reakciju. Tomēr, lai nodrošinātu iespēju novērtēt pozitīvās kontroles reakcijas mainību laikā, spēcīgās reakcijas intensitāte nedrīkst būt pārmērīgi liela. Pozitīvās kontroles vajadzībām jāiegūst pietiekami daudz in vitro datu, lai varētu aprēķināt statistiski noteiktu pozitīvajai kontrolei pieņemamo vērtību intervālu. Ja pozitīvajai kontrolei nav pieejams pietiekams daudzums iepriekš iegūtu vēsturisko ICE testēšanas metodes datu, iespējams, jāveic pētījumi, lai šo informāciju iegūtu.

33.

Pozitīvās kontroles piemēri testējamajām vielām, kas ir šķidrumi, ir 10 % etiķskābe vai 5 % benzalkonija hlorīds, bet pozitīvās kontroles testējamām cietvielām ir nātrija hidroksīds vai imidazols.

34.

Salīdzināšanas vielas ir lietderīgi izmantot, lai novērtētu nezināmu noteiktas ķīmisko vielu vai produktu kategorijas spēju izraisīt acu kairinājumu, vai arī, lai novērtētu acu kairinājumu izraisošas vielas salīdzinošo spēju izraisīt noteiktas intensitātes atbildes reakciju uz kairinājumu.

35.

Apstrādātās radzenes novērtē pirms aplicēšanas un 30, 75, 120, 180 un 240 min (± 5 min) pēc skalošanas apstrādes beigās. Ar šiem laika intervāliem pietiek, lai četru stundu ilgajā iedarbības periodā veiktu pietiekamu skaitu mērījumu un starp mērījumiem būtu pietiekami ilgs laiks visu vajadzīgo novērojumu veikšanai.

36.

Novērtē šādus parametrus: radzenes duļķošanās, uzbriedums, fluoresceīna aizture un morfoloģiskās izmaiņas (piemēram, epitēlija izdrupšana vai atslābšana). Visus parametrus, izņemot fluoresceīna aizturi (ko nosaka tikai pirms aplicēšanas un 30 min pēc testējamās vielas iedarbības), nosaka katrā no iepriekš minētajiem laika intervāliem.

37.

Radzenes duļķošanās, fluoresceīna aiztures, morfoloģisko izmaiņu un histopatoloģisko izmaiņu, ja tās tiek noteiktas, dokumentēšanai ieteicams izmantot fotogrāfijas.

38.

Pēc pēdējās noteikšanas četru stundu perioda beigās lietotājiem ieteicams saglabāt acis piemērotā fiksatīvā (piemēram, neitrālā buferētā formalīnā) iespējamai histopatoloģiskai izmeklēšanai.

39.

Radzenes uzbriedumu nosaka no radzenes biezuma mērījumiem ar spraugas lampas mikroskopa optisko pahimetru. To izsaka procentos un aprēķina saskaņā ar radzeņu biezuma mērījumiem saskaņā ar šādu formulu:

40.

Visiem novērojumu laika intervāliem aprēķina visu testējamo acu radzeņu vidējo uzbriedumu procentos. Pamatojoties uz augstāko radzeņu uzbrieduma vidējo rādītāju, kas novērots jebkurā laika intervālā, katrai testējamai vielai piešķir kopējo kategorijas rezultātu.

41.

Radzenes duļķošanos aprēķina pēc tās radzenes daļas, kurai noteikts skaitliski lielākais duļķošanās rādītājs. Visām testējamajām acīm visos novērojumu laika intervālos aprēķina radzeņu duļķošanās vidējo rādītāju. Pamatojoties uz jebkurā laika intervālā novērotās radzeņu duļķošanās augstāko vidējo rādītāju, katrai testējamai vielai piešķir kopējo kategorijas rezultātu (1. tabula).

1.   tabula

Radzenes duļķošanās rādītājs

42.

Vidējo fluoresceīna aiztures vērtību visām testējamām acīm aprēķina tikai 30 min novērošanas intervālam un izmanto, lai piešķirtu katrai testējamai vielai kopējo kategorijas rezultātu (2. tabula).

2.   tabula

Fluoresceīna aiztures rādītājs

43.

Morfoloģisko izmaiņu veidi ir radzenes epitēlija šūnu “izdrupšana”, epitēlija “atslābšana”, “nelīdzenumu veidošanās” radzenes virsmā un testējamās vielas “pielipšana” pie radzenes. Šo bojājumu smaguma pakāpe var atšķirties, un vairākas šīs pazīmes var konstatēt vienlaicīgi. Atkarībā no testēšanas veicēja interpretācijas šo bojājumu klasifikācija ir subjektīva.

44.

Radzenes duļķošanās, uzbrieduma un fluoresceīna aiztures rezultāti jānovērtē atsevišķi, lai katram beigu punktam iegūtu ICE klasi. Pēc tam attiecīgās testējamās vielas izraisītā kairinājuma klasifikācijas iegūšanai apvieno visiem beigu punktiem noteiktās ICE klases.

45.

Pēc visu beigu punktu novērtēšanas var piešķirt ICE klases, pamatojoties uz iepriekš noteiktiem rādītāju vērtību intervāliem. Radzenes biezumu (3. tabula), duļķošanos (4. tabula) un fluoresceīna aizturi (5. tabula) atbilstoši četrām ICE klasēm interpretē šādi.

3.   tabula

ICE radzenes biezuma klasifikācijas kritēriji

4.   tabula

ICE klasifikācijas kritēriji duļķošanās novērtēšanai

5.   tabula

ICE klasifikācijas kritēriji fluoresceīna aiztures vidējā rādītāja novērtēšanai

46.

Kopējo testējamās vielas in vitro kairinājuma klasifikācijas kategoriju nosaka atbilstīgi kairinājuma klasifikācijai, kas atbilst radzenes uzbrieduma, radzenes duļķošanās un fluoresceīna aiztures rādītāju kombinācijai, izmantojot 6. tabulā noteikto shēmu.

6.   tabula

Kopējās in vitro kairinājuma klasifikācijas

47.

Kā noteikts 1. punktā, gadījumos, kad testējamā viela netiek identificēta kā nopietnus acu bojājumus vai nopietnu kairinājumu izraisītāja, klasifikācijas un marķēšanas nolūkā ir jāveic papildu testēšana. Nopietnus acu bojājumus vai nopietnu kairinājumu izraisītāju vielu identificēšanas kopējā pareizība pēc ICE testēšanas metodes ir no 83 % (120/144) līdz 87 % (134/154), kļūdaini pozitīvo rezultātu daļa ir no 6 % (7/122) līdz 8 % (9/116) un kļūdaini negatīvo rezultātu daļa ir no 41 % (13/32) līdz 50 % (15/30), salīdzinot ar izmēģinājumu rezultātiem ar trušu acīm in vivo atbilstīgi EPA (1), ES (2) vai GHS (3) klasifikācijas sistēmai. Ja noteiktas ķīmisko (t.i., spirti un virsmaktīvās vielas) un fizikālo īpašību (t.i., cietvielas) grupas vielas izslēdz no datubāzes, ICE pareizība ES, EPA un GHS klasifikācijas sistēmā ir no 91 % (75/82) līdz 92 % (69/75), kļūdaini pozitīvo rezultātu daļa ir no 5 % (4/73) līdz 6 % (4/70) un kļūdaini negatīvo rezultātu daļa ir no 29 % (2/7) līdz 33 % (3/9) (4).

48.

Ja testējamā viela netiek klasificēta kā nopietnus acu bojājumus vai nopietnu kairinājumu izraisītāja, kopā ar in vivo truša acu testa vai cita atbilstīgi validēta in vitro testa datiem ICE dati var būt noderīgi, lai turpmāk novērtētu ICE testēšanas metodes piemērotību un ierobežojumus kā nopietnus acu bojājumus vai nopietnu kairinājumu neizraisošu vielu identificēšanai (tiek izstrādāts norādījumu dokuments par in vitro testēšanas metodēm, lai noteiktu toksicitāti acīm).

49.

Testēšanas rezultātu uzskata par pieņemamu, ja paralēlajā negatīvajā vai nesēja/šķīdinātāja kontrolē un paralēlajā pozitīvajā kontrolē tiek noteikta kairinājuma klasifikācija, kas atbilst attiecīgi kairinājumu izraisošu un nopietnus acu bojājumus vai nopietnu kairinājumu izraisošu vielu klasifikācijai.

50.

Testēšanas pārskatā jāiekļauj šāda informācija, kas attiecas uz konkrēto noteikšanu.

Testējamās vielas un kontrolvielas

Informācija par sponsoru un testēšanas iestādi

Izmantotās testēšanas metodes un protokola pamatojums

Testēšanas metodes integritāte

Procedūra, ko izmanto, lai nodrošinātu testēšanas metodes integritāti (t.i., pareizību un ticamību) laikā (piemēram, periodiska standartvielu testēšana, iepriekš iegūto vēsturisko negatīvo un pozitīvo kontroles datu izmantošana).

Testa apstiprināšanas kritēriji

ja vajadzīgs, pieņemami paralēlo standarta kontroļu diapazoni, pamatojoties uz iepriekš iegūtajiem vēsturiskajiem datiem.

Testēšanas apstākļi

Rezultāti

Rezultātu novērtējums

Secinājums

(1)

(2)

Eiropas Parlamenta un Padomes 2008. gada 16. decembra Regula (EK) Nr. 1272/2008 par vielu un maisījumu klasificēšanu, marķēšanu un iepakošanu un ar ko groza un atceļ Direktīvas 67/548/EEK un 1999/45/EK un groza Regulu (EK) Nr. 1907/2006. OV L 353, 31.12.2008., 1. lpp.

(3)

United nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York and Geneva, 2007. Pieejams:

[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]

(4)

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Pieejams:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(5)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Pieejams:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm]

(6)

Eiropas Parlamenta un Padomes 2006. gada 18. decembra Regula (EK) Nr. 1907/2006, kas attiecas uz ķimikāliju reģistrēšanu, vērtēšanu, licencēšanu un ierobežošanu (REACH), un ar kuru izveido Eiropas Ķimikāliju aģentūru, groza Direktīvu 1999/45/EK un atceļ Padomes Regulu (EEK) Nr. 793/93 un Komisijas Regulu (EK) Nr. 1488/94, kā arī Padomes Direktīvu 76/769/EEK un Komisijas Direktīvu 91/155/EEK, 93/67/EEK, 93/105/EK un 2000/21/EK. OV L 396, 30.12.2006., 1. lpp.

(7)

OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Pieejams:

[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(8)

ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Pieejams:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(9)

ICCVAM. (2006). Current Status of In vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Pieejams:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(10)

Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits. Fd. Chem. Toxicol. 31:69-76.

(11)

INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). Pieejams:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm].

(12)

Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol. In vitro 9:871-929.

(13)

Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials. Food Chem. Toxicol. 34:291-296.

(14)

Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation. Food Chem. Toxicol. 35:23-37.

(15)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Pieejams:

[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].

(16)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(17)

Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The in vitro assessment of severe irritants. Fd. Cosmet.- Toxicol.- 19, 471-480.

(18)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Pieejams:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

(19)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe IrritantsIsolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Pieejams:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]