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Document 32014R0260

Title and reference
Regolamento (UE) n. 260/2014 della Commissione, del 24 gennaio 2014 , recante modifica del regolamento (CE) n. 440/2008 che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l’autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH), al fine di adeguarlo al progresso tecnico Testo rilevante ai fini del SEE

OJ L 81, 19.3.2014, p. 1–253 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2014/260/oj
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Text

19.3.2014   

IT

Gazzetta ufficiale dell'Unione europea

L 81/1


REGOLAMENTO (UE) N. 260/2014 DELLA COMMISSIONE

del 24 gennaio 2014

recante modifica del regolamento (CE) n. 440/2008 che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l’autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH), al fine di adeguarlo al progresso tecnico

(Testo rilevante ai fini del SEE)

LA COMMISSIONE EUROPEA,

visto il trattato sul funzionamento dell’Unione europea,

visto il regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 18 dicembre 2006, concernente la registrazione, la valutazione, l’autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH), che istituisce un’Agenzia europea per le sostanze chimiche, che modifica la direttiva 1999/45/CE e che abroga il regolamento (CEE) n. 793/93 del Consiglio e il regolamento (CE) n. 1488/94 della Commissione, nonché la direttiva 76/769/CEE del Consiglio e le direttive della Commissione 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE (1), in particolare l’articolo 13, paragrafo 3,

considerando quanto segue:

(1)

Il regolamento (CE) n. 440/2008 (2) della Commissione istituisce i metodi di prova per determinare le proprietà fisico-chimiche, la tossicità e l’ecotossicità delle sostanze applicabili ai fini del regolamento (CE) n. 1907/2006.

(2)

È necessario aggiornare il regolamento (CE) n. 440/2008 per includervi in via prioritaria nuovi e aggiornati metodi di prova alternativi adottati di recente dall’OCSE, volti a ridurre il numero di animali usati a scopi di sperimentazione, conformemente alla direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 22 settembre 2010, sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici (3) e alla direttiva 86/609/CEE del Consiglio, del 24 novembre 1986, concernente il ravvicinamento delle disposizioni legislative, regolamentari e amministrative degli Stati membri relative alla protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici (4).

(3)

Questo adeguamento contiene due metodi per la determinazione delle proprietà fisico-chimiche, ivi compreso un adeguamento del metodo dell’idrosolubilità e un nuovo metodo di prova sui coefficienti di ripartizione per le sostanze persistenti, bioaccumulabili e tossiche (PBT), quattro metodi nuovi ed un metodo aggiornato per la determinazione dell’ecotossicità e del destino e del comportamento ambientale; nove metodi per la determinazione della tossicità ed altri effetti sulla salute, tra cui quattro metodi di prova sulla tossicità per inalazione che comprendono l’aggiornamento di tre metodi esistenti e un metodo nuovo per ridurre il numero di animali utilizzati e migliorare la valutazione degli effetti, un aggiornamento del metodo di prova per la tossicità orale a dose ripetuta (28 giorni) al fine di includere dei parametri per la valutazione dell’attività endocrina, un aggiornamento del metodo di prova di tossicocinetica utile per l’impostazione e la comprensione della logica degli studi tossicologici e un aggiornamento dei metodi sulla tossicità cronica e la cancerogenesi e dei metodi combinati tossicità cronica/cancerogenesi.

(4)

È pertanto opportuno modificare di conseguenza il regolamento (CE) n. 440/2008.

(5)

Le misure di cui al presente regolamento sono conformi al parere del comitato istituito dall’articolo 133 del regolamento (CE) n. 1907/2006,

HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:

Articolo 1

L’allegato del regolamento (CE) n. 440/2008 è modificato conformemente all’allegato del presente regolamento.

Articolo 2

Il presente regolamento entra in vigore il terzo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell’Unione europea.

Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.

Fatto a Bruxelles, il 24 gennaio 2014

Per la Commissione

Il presidente

José Manuel BARROSO


(1)  GU L 396 del 30.12.2006, pag. 1.

(2)  GU L 142 del 31.5.2008, pag. 1.

(3)  GU L 276 del 20.10.2010, pag. 33.

(4)  GU L 358 del 18.12.1986, pag. 1.


ALLEGATO

L’allegato del regolamento (CE) n. 440/2008 è così modificato:

1)

il capitolo A.6 è sostituito dal seguente:

«A.6.   IDROSOLUBILITÀ

INTRODUZIONE

1.

Questo metodo di prova equivale alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 105 (1995) Questo metodo di prova è una versione riveduta della linea guida originale n. 105 adottata nel 1981. Non vi sono differenze significative tra l’attuale versione e quella del 1981, in quanto è stato modificato soprattutto il formato. La revisione si basa sul metodo di prova dell’UE “Idrosolubilità” (1).

CONSIDERAZIONI INIZIALI

2.

L’idrosolubilità di una sostanza può essere considerevolmente alterata dalla presenza di impurità. Il presente metodo di prova riguarda la determinazione dell’idrosolubilità di sostanze fondamentalmente pure che sono stabili in acqua e non volatili. Prima di determinare l’idrosolubilità è utile disporre di alcune informazioni preliminari sulla sostanza in esame, come la formula strutturale, la tensione di vapore, la costante di dissociazione e l’idrolisi in funzione del pH.

3.

In questo capitolo sono descritti due metodi: il metodo dell’eluizione su colonna e il metodo del matraccio che riguardano rispettivamente solubilità inferiori e superiori a 10–2 g/l. Viene anche descritta una semplice prova preliminare che consente di determinare approssimativamente la quantità adeguata di campione da utilizzare nella prova finale e il tempo necessario per raggiungere la saturazione.

DEFINIZIONI E UNITÀ

4.

L’idrosolubilità di una sostanza è la concentrazione massica di saturazione della sostanza in acqua ad una determinata temperatura.

5.

L’idrosolubilità è espressa in massa di soluto per volume di soluzione. L’unità SI è kg/m3 (ma si può anche far uso di g/l).

SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO

6.

Per questo metodo non è necessario utilizzare sostanze chimiche di riferimento quando si esamina una sostanza.

DESCRIZIONE DEI METODI

Condizioni sperimentali

7.

La prova deve essere preferibilmente effettuata a 20 ± 0,5 °C, mantenendo costante la temperatura scelta in tutte le parti dell’apparecchiatura.

Prova preliminare

8.

Nell’ambito di una procedura in più fasi successive (stepwise), in un cilindro graduato da 10 ml con tappo di vetro vengono versati volumi crescenti di acqua a temperatura ambiente su circa 0,1 g di campione (le sostanze in esame solide devono essere polverizzate). Dopo ciascuna aggiunta di acqua, la miscela viene agitata per 10 minuti e controllata visivamente per verificare la presenza di particelle non disciolte del campione. Se, dopo l’aggiunta di 10 ml d’acqua, il campione, o parte di esso, resta indisciolto, l’esperimento deve essere proseguito in un cilindro graduato da 100 ml. La solubilità approssimativa è indicata nella tabella 1 in corrispondenza del volume d’acqua necessario per ottenere la dissoluzione completa del campione. Quando la solubilità è bassa, può occorrere più tempo per sciogliere la sostanza in esame e si devono prevedere almeno 24 ore. Se dopo 24 ore la sostanza in esame non è ancora disciolta, occorre aspettare più a lungo (fino a 96 ore) o tentare un’ulteriore diluizione per stabilire se occorre utilizzare il metodo di eluizione su colonna o il metodo del matraccio.

Tabella 1

ml di acqua per 0,1 g di campione

0,1

0,5

1

2

10

100

> 100

solubilità approssimativa in g/l

> 1 000

Da 1 000 a 200

Da 200 a 100

Da 100 a 50

Da 50 a 10

Da 10 a 1

< 1

Metodo dell’eluizione su colonna

Principio

9.

Questo metodo si basa sull’eluizione della sostanza in esame con acqua in una microcolonna caricata con un materiale di supporto inerte, precedentemente rivestito con un eccesso della sostanza stessa (2). L’idrosolubilità è data dalla concentrazione massica dell’eluato quando questo ha raggiunto un plateau in funzione del tempo.

Apparecchiatura

10.

L’apparecchiatura è costituita da una microcolonna (figura 1) mantenuta a temperatura costante, collegata ad una pompa di ricircolo (figura 2) o a un recipiente di livellamento (figura 3). La microcolonna contiene un supporto inerte tenuto fermo da un piccolo tampone di lana di vetro che serve anche per filtrare le particelle. Il materiale di supporto può essere costituito da perline di vetro, farina fossile o altri materiali inerti.

11.

La microcolonna di cui alla figura 1 è adatta alla configurazione con la pompa di ricircolo. È caratterizzata da uno spazio di testa pari ad almeno cinque volte il volume di letto (eliminato all’inizio dell’esperimento) e il volume di cinque campioni (eliminati dall’analisi nel corso dell’esperimento). In alternativa, le dimensioni possono essere ridotte se è possibile aggiungere acqua nel corso dell’esperimento per sostituire i primi cinque volumi di letto, scartati perché contenenti impurità. La colonna è collegata con giunti in materiale inerte alla pompa di ricircolo, che consente una velocità di flusso pari a circa 25 ml/h. La pompa di ricircolo può essere, ad esempio, una pompa peristaltica o a membrana. Occorre fare in modo che non ci sia contaminazione e/o adsorbimento con il materiale del tubo.

12.

La rappresentazione schematica di una configurazione con recipiente di livellamento è riportata nella figura 3. In questa configurazione la microcolonna è munita di un rubinetto ad una via. Il collegamento con il recipiente di livellamento consiste in un giunto di vetro smerigliato e un tubo in materiale inerte. La velocità del flusso proveniente dal recipiente di livellamento deve essere pari a circa 25 ml/h.

Figura 1

Image

Dimensioni in mm

A.

Connessione per giunto di vetro smerigliato

B.

Spazio di testa

C.

Diametro interno 5

D.

Diametro esterno 19

E.

Tampone di lana di vetro

F.

Rubinetto

Figura 2

Image

A.

Equilibrio atmosferico

B.

Flussimetro

C.

Microcolonna

D.

Pompa di circolazione termocontrollata

E.

Pompa di ricircolo

F.

Valvola a due vie per il campionamento

Figura 3

Image

A.

Recipiente di livellamento (per esempio bottiglia da 2,5 litri)

B.

Colonna

C.

Collettore di frazione

D.

Termostato

E.

Tubo in teflon

F.

Giunto in vetro smerigliato

G.

Tubi per l’acqua (tra il termostato e la colonna, diametro interno 8 mm circa)

13.

Circa 600 mg del materiale di supporto sono trasferiti in un matraccio da 50 ml. Una quantità adeguata della sostanza in esame è sciolta in un solvente volatile di purezza analitica e una quantità adeguata di questa soluzione viene aggiunta al materiale di supporto. Il solvente è completamente evaporato, utilizzando ad esempio un evaporatore rotante, perché altrimenti non si ottiene la saturazione dell’acqua del supporto nel corso della fase di eluizione per via della partizione in superficie. Il materiale di supporto così impregnato viene lasciato a bagno per due ore in 5 ml circa di acqua, e quindi la sospensione viene versata nella microcolonna. Altrimenti, si può versare il materiale di supporto impregnato a secco nella microcolonna riempita di acqua lasciando poi il tutto a riposo per due ore per raggiungere l’equilibrio.

14.

Il caricamento del materiale di supporto può causare problemi, dando luogo a risultati erronei, se la sostanza di prova si deposita sotto forma di olio. Occorre valutare questi problemi e riportare i dettagli nella relazione.

Procedura con pompa di ricircolo

15.

Si avvia il flusso attraverso la colonna. Si raccomanda di usare un flusso di approssimativamente 25 ml/h (che corrisponde a 10 volte il volume di letto della colonna descritta per ora). Per eliminare le impurità solubili in acqua, si devono scartare almeno i primi cinque volumi di letto. Successivamente si attiva la pompa fino al raggiungimento dell’equilibrio, che è dimostrato da cinque campioni successivi, le cui concentrazioni non differiscono tra loro più del ± 30 % in una distribuzione casuale. Questi campionamenti devono essere separati l’uno dall’altro da intervalli di tempo corrispondenti almeno al passaggio di un volume corrispondente a dieci volte il volume di letto della colonna. In funzione del metodo analitico utilizzato, può risultare preferibile stabilire una curva concentrazione/tempo per evidenziare che è stato raggiunto l’equilibrio.

Procedura con recipiente di livellamento

16.

Vanno prelevate ed analizzate con il metodo prescelto frazioni di eluato successive. Per determinare la solubilità si utilizzano le frazioni provenienti dalla fase centrale di eluizione, dove le concentrazioni sono costanti (con uno scarto masso di ± 30 %) in almeno cinque frazioni consecutive.

17.

L’eluente più indicato è l’acqua bidistillata, ma si può utilizzare anche acqua deionizzata, caratterizzata da una resistività superiore a 10 megaohm/cm e un tenore totale di carbonio organico inferiore a 0,01 %.

18.

Nell’ambito di entrambe le procedure, l’operazione viene ripetuta una seconda volta dimezzando la velocità di flusso. Se i risultati delle due operazioni concordano, la prova è riuscita. Se la solubilità misurata è superiore con il flusso inferiore, occorre proseguire con il dimezzamento del flusso fino a quando due serie successive non forniscano lo stesso valore di solubilità.

19.

Nell’ambito di entrambe le procedure, occorre esaminare le frazioni per controllare la presenza di materiale colloidale mediante l’esame dell’effetto Tyndall. La presenza di particelle invalida la prova che deve essere ripetuta dopo aver migliorato l’azione filtrante della colonna.

20.

Occorre misurare il pH di ogni campione, preferibilmente utilizzando cartine indicatrici speciali.

Metodo del matraccio

Principio

21.

La sostanza in esame (polverizzata, se solida) è disciolta in acqua a una temperatura leggermente superiore alla temperatura di prova. Quando viene raggiunta la saturazione, la miscela viene raffreddata e mantenuta alla temperatura di prova. In alternativa, la misurazione può essere eseguita direttamente alla temperatura di prova se, mediante un appropriato campionamento, si è sicuri di avere raggiunto l’equilibrio di saturazione. Successivamente, si determina mediante un metodo analitico adeguato la concentrazione massica della sostanza in esame nella soluzione acquosa che non deve contenere particelle indisciolte (3).

Apparecchiatura

22.

Occorre il materiale seguente:

normale strumentazione e vetreria da laboratorio,

un apparecchio per l’agitazione delle soluzioni a temperatura costante controllata,

se necessario per le emulsioni, una centrifuga (preferibilmente termostatata), e

apparecchiatura analitica.

Procedura

23.

Sulla base della prova preliminare viene valutata la quantità di sostanza necessaria per saturare il volume di acqua stabilito. Una quantità di sostanza pari a cinque volte la suddetta quantità viene pesata direttamente in tre recipienti di vetro (per esempio, provette da centrifuga, matracci) provvisti di tappi di vetro. In ciascun recipiente viene aggiunto un volume d’acqua, scelto in funzione del metodo analitico e del “range” di solubilità. I recipienti sono chiusi ermeticamente e poi agitati a 30 °C. Si deve utilizzare un apparecchio di agitazione o di mescolamento che funzioni a temperatura costante, per esempio un agitatore magnetico in un bagnomaria termostatato. Dopo un giorno, uno dei recipienti viene equilibrato per 24 ore alla temperatura di prova, con agitazione saltuaria. Il contenuto del recipiente viene successivamente centrifugato alla temperatura di prova, e viene misurata, con un opportuno metodo analitico, la concentrazione della sostanza in esame nella fase acquosa limpida. Gli altri due matracci vengono trattati in modo analogo dopo un’equilibrazione iniziale a 30 °C per due e tre giorni, rispettivamente. Se le concentrazioni misurate almeno negli ultimi due recipienti non divergono di più del 15 %, la prova è riuscita. Se invece i risultati relativi ai recipienti 1, 2 e 3 evidenziano una tendenza verso valori crescenti, l’intera prova deve essere ripetuta utilizzando tempi di equilibrazione più lunghi.

24.

La prova può essere effettuata anche senza la preincubazione a 30 °C. Per calcolare la velocità con cui si raggiunge l’equilibrio di saturazione, si prelevano dei campioni fino a quando il tempo di agitazione non influisce più sulle concentrazioni.

25.

Occorre misurare il pH di ogni campione, preferibilmente utilizzando cartine indicatrici speciali.

Determinazioni analitiche

26.

Per queste determinazioni è preferibile ricorrere a un metodo analitico specifico per la sostanza in esame, poiché piccole quantità di impurità solubili possono causare grandi errori nella misura della solubilità. Esempi di metodi sono: gascromatografia, cromatografia liquida, titolazione, fotometria e voltammetria.

DATI E RELAZIONE

Dati

Metodo dell’eluizione su colonna

27.

Per ciascuna serie si deve calcolare il valore medio di almeno cinque campioni consecutivi, prelevati in corrispondenza del plateau di saturazione, nonché la deviazione standard. I valori medi ottenuti in due prove con velocità di flusso diverse non devono divergere di oltre il 30 %.

Metodo del matraccio

28.

Occorre calcolare la media dei risultati ottenuti da ognuno dei tre matracci, che tra loro non deve differire di più del 15 %.

Relazione sulla prova

Metodo dell’eluizione su colonna

29.

La relazione deve contenere le seguenti informazioni:

risultati della prova preliminare,

identità chimica e impurità (tappa di purificazione preliminare, se del caso),

concentrazioni, flussi e pH individuali di ciascun campione,

medie e deviazioni standard di almeno cinque campioni dal plateau di saturazione per ciascuna serie,

media di almeno due serie successive,

temperatura dell’acqua durante il processo di saturazione,

metodo di analisi utilizzato,

natura del materiale di supporto,

impregnazione del materiale di supporto,

solvente utilizzato,

indicazione di un’eventuale instabilità chimica della sostanza durante la prova,

tutte le informazioni attinenti all’interpretazione dei risultati, in particolare per quanto riguarda le impurità e lo stato fisico della sostanza in esame.

Metodo del matraccio

30.

La relazione deve contenere le seguenti informazioni:

risultati della prova preliminare,

identità chimica e impurità (tappa di purificazione preliminare, se del caso),

singole determinazioni analitiche e rispettivo valore medio nel caso sia stato determinato più di un valore per ciascun matraccio,

pH di ciascun campione,

media dei valori per vari matracci i cui risultati siano concordanti,

temperatura di prova,

metodo analitico,

indicazione di un’eventuale instabilità chimica della sostanza durante la prova,

tutte le informazioni utili per l’interpretazione dei risultati, in particolare per quanto riguarda le impurità e lo stato fisico della sostanza in esame.

BIBLIOGRAFIA

(1)

Direttiva 92/69/CEE della Commissione, del 31 luglio 1992, recante diciassettesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva 67/548/CEE del Consiglio concernente il ravvicinamento delle disposizioni legislative, regolamentari ed amministrative relative alla classificazione, all’imballaggio e all’etichettatura delle sostanze pericolose (GU L 383 del 29.12.1992, pag. 113).

(2)

NF T 20-045 (AFNOR) (settembre 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method.

(3)

NF T 20-046 (AFNOR) (settembre 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flaskmethod»,

2)

è aggiunto il capitolo A.23:

«A.23.   COEFFICIENTE DI RIPARTIZIONE (1-OTTANOLO/ACQUA): METODO DELL’AGITAZIONE LENTA

INTRODUZIONE

1.

Questo metodo di prova equivale alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 123 (2006). Il metodo dell’agitazione lenta ha permesso di determinare con esattezza valori logaritmici del coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua (POW) fino a 8,2 (1). Costituisce pertanto un approccio sperimentale adeguato per la determinazione diretta del POW di sostanze fortemente idrofobiche.

2.

Tra gli altri metodi per la determinazione del coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua (POW) si annoverano il metodo “dell’agitazione in bottiglia” (shake flask) (2) e la determinazione del POW dal comportamento di ritenzione nell’HPCL (cromatografia liquida ad alta prestazione) a fase inversa (3). Il metodo “dell’agitazione in bottiglia” tende a falsare i risultati a causa del trasferimento di microgoccioline di ottanolo nella fase acquosa. Con l’aumento dei valori del POW, la presenza di queste goccioline nella fase acquosa porta ad una crescente sovrastimazione della concentrazione della sostanza in esame nell’acqua. L’applicazione di questo metodo è pertanto limitata alle sostanze con log POW < 4. Il secondo metodo si basa su valori affidabili di POW determinati direttamente per calibrare la relazione tra il comportamento di ritenzione nell’HPLC e i valori POW misurati. Esisteva un progetto di linea guida OCSE per determinare i coefficienti di ripartizione 1-ottanolo/acqua di sostanze ionizzabili (4) che tuttavia è stato abbandonato.

3.

Il presente metodo di prova è stato messo a punto nei Paesi Bassi. La precisione dei metodi descritti è stata validata e ottimizzata nel corso di uno studio di validazione interlaboratorio (ring test) al quale hanno partecipato 15 laboratori (5).

CONSIDERAZIONI INIZIALI

Significato e utilizzo

4.

Nel caso di sostanze organiche inerti, sono state individuate relazioni molto significative tra i coefficienti di ripartizione 1-ottanolo/acqua (POW) e il bioaccumulo di queste sostanze nei pesci. Inoltre, è stata anche dimostrata una correlazione tra il POW e, da un lato, la tossicità per i pesci e, dall’altro, l’assorbimento di sostanze chimiche nei solidi, come suoli e sedimenti Il riferimento bibliografico (6) contiene un’ampia panoramica di queste relazioni.

5.

È stata accertata l’esistenza di una vasta gamma di relazioni tra il coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua e altre proprietà delle sostanze, di interesse per la chimica e la tossicologia ambientali. Il coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua è pertanto diventato un parametro fondamentale ai fini della valutazione del rischio ambientale delle sostanze chimiche e della previsione del destino di tali sostanze nell’ambiente.

Ambito di applicazione

6.

Si ritiene che il metodo dell’agitazione lenta riduca la formazione di microgoccioline dalle goccioline di 1-ottanolo nella fase acquosa; di conseguenza non si verifica la sovrastimazione della concentrazione in fase acquosa dovuta all’associazione di molecole della sostanza di prova a queste goccioline. Il metodo dell’agitazione lenta si presta in particolare alla determinazione del POW di sostanze con log POW previsto uguale o superiore a 5, per le quali il metodo dell’agitazione in bottiglia (2) tende a fornire risultati erronei.

DEFINIZIONI E UNITÀ

7.

Il coefficiente di ripartizione di una sostanza tra l’acqua e un solvente lipofilo (1-ottanolo) caratterizza la distribuzione in equilibrio della sostanza chimica tra le due fasi. Il coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua (POW) è definito come il rapporto tra la concentrazione in equilibrio della sostanza in esame in 1-ottanolo saturato con acqua (CO) e la concentrazione in equilibrio della sostanza in esame in acqua saturata con 1-ottanolo (CW).

Formula

In quanto rapporto tra due concentrazioni si tratta di un valore adimensionale. Generalmente è espresso con il suo logaritmo decimale (log POW). Visto che il POW dipende dalla temperatura, la relazione sulla prova dovrà precisare la temperatura delle determinazioni.

PRINCIPIO DEL METODO

8.

Al fine di determinare il coefficiente di ripartizione, l’acqua, l’1-ottanolo e la sostanza in esame devono essere portati in equilibrio tra loro a temperatura costante. Si procede successivamente a misurare le concentrazioni della sostanza in esame nelle due fasi.

9.

Il metodo dell’agitazione lenta proposto permette di ridurre le difficoltà sperimentali associate alla formazione di microgoccioline che si verificano nel metodo dell’agitazione in bottiglia. Con il metodo dell’agitazione lenta, l’acqua, l’1-ottanolo e la sostanza in esame si equilibrano in un reattore termostatato sottoposto ad agitazione. Gli scambi tra le fasi sono accelerati dall’agitazione. Quest’ultima produce una leggera turbolenza che favorisce gli scambi tra 1-ottanolo e acqua senza provocare la formazione di microgoccioline (1).

APPLICABILITÀ DELLA PROVA

10.

Dato che la presenza di sostanze diverse dalla sostanza in esame potrebbe influenzare il coefficiente di attività di quest’ultima, essa deve essere testata allo stato puro. Ai fini della determinazione del coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua occorre utilizzare una sostanza che presenti il grado di purezza più elevato disponibile in commercio.

11.

Il presente metodo si applica alle sostanze pure che non si dissociano né si associano e che non manifestano un’attività interfacciale significativa. Può essere utilizzato per determinare il coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua di tali sostanze e delle relative miscele. In quest’ultimo caso, i coefficienti di ripartizione ottenuti variano in funzione della composizione chimica della miscela in esame e della composizione elettrolitica della fase acquosa. Adottando alcune misure supplementari, il metodo può essere applicato anche a sostanze che si dissociano o si associano (paragrafo 12).

12.

A motivo della molteplicità di equilibri dell’acqua e dell’1-ottanolo presenti nella ripartizione 1-ottanolo/acqua delle sostanze dissociabili, come acidi organici e fenoli, basi organiche e composti organometallici, il coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua è una costante fortemente dipendente dalla composizione elettrolitica (7) (8). Ai fini della determinazione di questo coefficiente, è necessario controllare il pH e la composizione elettrolitica, i cui valori devono essere riportati nella relazione sulla prova. La valutazione di questi coefficienti di ripartizione deve essere effettuata da specialisti (“giudizio esperto”). Utilizzando i valori delle costanti di dissociazione, occorre scegliere valori di pH adeguati in modo da stabilire un coefficiente di ripartizione per ciascuno stato di ionizzazione. I composti organometallici devono essere testati usando tamponi non complessanti (8). Alla luce delle conoscenze attuali in materia di chimica in fase acquosa (costanti di complessazione e di dissociazione), le condizioni sperimentali devono essere scelte in modo da poter stimare la speciazione della sostanza in esame in fase acquosa. La forza ionica deve essere identica in tutti gli esperimenti, grazie all’utilizzo di un elettrolita di fondo.

13.

Le sostanze con bassa idrosolubilità o un elevato valore POW possono creare problemi in quanto le loro concentrazioni in acqua sono talmente deboli che diventa difficile determinarle con esattezza. Il presente metodo di prova fornisce indicazioni su come risolvere questo problema.

INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME

14.

Il livello di purezza dei reagenti chimici deve corrispondere almeno al grado analitico. Si raccomanda di utilizzare sostanze non marcate, di composizione chimica nota e di purezza pari almeno al 99 % o sostanze radiomarcate di composizione chimica e purezza radiochimica note. Nel caso di traccianti radioattivi a breve emivita, occorre applicare correzioni a fronte della degradazione. Se la sostanza in esame è radiomarcata, occorre usare un metodo analitico specifico, in modo che la radioattività misurata sia correlata direttamente alla sostanza in esame.

15.

La stima del valore log v può essere ottenuta utilizzando gli appositi software venduti in commercio, o basandosi sul rapporto tra le solubilità in entrambi i solventi.

16.

Prima di applicare il metodo dell’agitazione lenta per la determinazione del POW, occorre disporre delle seguenti informazioni sulla sostanza in esame:

a)

formula strutturale;

b)

metodi analitici adeguati per la determinazione della concentrazione della sostanza in acqua e in 1-ottanolo;

c)

costante o costanti di dissociazione di sostanze ionizzabili (Linea guida OCSE n. 112) (9);

d)

idrosolubilità (10);

e)

idrolisi abiotica (11);

f)

pronta biodegradabilità (12);

g)

tensione di vapore (13).

DESCRIZIONE DEL METODO

Materiale e apparecchiatura

17.

L’esperimento richiede un’apparecchiatura standard di laboratorio, in particolare:

agitatori magnetici e bacchette di agitazione magnetiche rivestite di Teflon per agitare la fase acquosa,

strumenti analitici che permettono di determinare la concentrazione della sostanza in esame alle concentrazioni previste,

un agitatore dotato di rubinetto alla base. In funzione della stima del log POW e del limite di rivelabilità (Limit of Detection — LOD) della sostanza in esame, occorre considerare l’utilizzo di un recipiente di reazione con la medesima geometria ma di volume superiore ad un litro, in modo da ottenere un volume di acqua sufficiente per l’estrazione e l’analisi chimiche. La concentrazione della sostanza in esame nell’estratto acquoso sarà pertanto più elevata, rendendo così più affidabile la determinazione analitica. All’appendice 1 figura una tabella che riporta le stime del volume minimo necessario, il LOD del composto, la stima del valore log POW e l’idrosolubilità del composto. La tabella si basa sulla relazione tra il log POW e il rapporto tra le solubilità in ottanolo e in acqua, secondo Pinsuwan et al. (14):

Formula

dove:

Formula (concentrazione molare),

e sulla relazione presentata da Lyman (15) per la stima dell’idrosolubilità. Le idrosolubilità calcolate con l’equazione riportata nell’appendice 1 sono da considerarsi come una prima stima. Occorre rilevare che l’utilizzatore è libero di determinare l’idrosolubilità mediante qualsiasi altro rapporto che si ritenga rappresenti meglio il rapporto tra idrofobicità e solubilità. Per i composti solidi, ad esempio, si raccomanda di includere il punto di fusione nella previsione della solubilità. Se si utilizza un’equazione modificata, occorre accertarsi che l’equazione per il calcolo della solubilità in ottanolo sia tuttora valida. L’appendice 2 riporta una rappresentazione schematica di un agitatore con rivestimento esterno in vetro, di capacità di circa un litro. Le proporzioni del contenitore rappresentato nell’appendice 2 si sono dimostrate ottimali e devono essere mantenute qualora si utilizzi un apparecchiatura di dimensioni diverse,

è indispensabile disporre di un dispositivo per mantenere costante la temperatura durante l’esperimento di agitazione lenta.

18.

I recipienti devono essere in materiale inerte in modo che l’adsorbimento sulle loro superfici sia trascurabile.

Preparazione delle soluzioni di prova

19.

La determinazione del POW deve essere eseguita utilizzando 1-ottanolo della qualità più pura disponibile in commercio (grado di purezza minima di 99 %). Si raccomanda di purificare la soluzione mediante estrazione acida, basica e con acqua, seguita da essiccazione. L’1-ottanolo può, inoltre, essere purificato per distillazione. Le soluzioni standard delle sostanze in esame devono essere preparate con 1-ottanolo purificato. L’acqua usata per la determinazione del POW deve essere distillata in apparecchi di vetro o quarzo, o trattata con un sistema di purificazione o di qualità HPLC. La filtrazione dell’acqua distillata deve essere eseguita mediante filtro di 0,22 μm; è altresì necessario prevedere delle prove in bianco per assicurarsi che gli estratti concentrati non contengano impurità che possano interferire con la sostanza in esame. Se si usa un filtro in fibra di vetro, occorre pulirlo lasciandolo almeno tre ore in un forno a 400 °C.

20.

Entrambi i solventi devono essere reciprocamente saturati prima dell’esperimento, portandoli all’equilibrio in un recipiente sufficientemente grande. A tal fine occorre sottoporre il sistema a due fasi di agitazione lenta per due giorni.

21.

Selezionare un’adeguata concentrazione della sostanza in esame e scioglierla in 1-ottanolo (saturato con acqua). È necessario determinare il coefficiente di ripartizione in soluzioni diluite in 1-ottanolo e acqua. Pertanto la concentrazione della sostanza di prova non deve superare il 70 % della sua solubilità con una concentrazione massima di 0,1 M in ciascuna fase (1). Le soluzioni di 1-ottanolo utilizzate per l’esperimento devono essere prive della sostanza in esame in sospensione allo stato solido.

22.

Sciogliere la quantità adeguata di sostanza in esame in 1-ottanolo (saturato con acqua). Se la stima del valore logaritmico di POW è superiore a 5, ci si deve assicurare che le soluzioni di 1-ottanolo utilizzate per l’esperimento non contengano la sostanza in esame in sospensione allo stato solido. A tale fine, si esegue la procedura seguente per le sostanze chimiche il cui valore stimato di log POW è > 5:

si scioglie la sostanza in esame in 1-ottanolo (saturato con acqua),

si lascia riposare la soluzione sufficientemente a lungo perché la sostanza solida sospesa si depositi. Durante la decantazione, la concentrazione della sostanza in esame è monitorata,

una volta che le concentrazioni misurate nella soluzione di 1-ottanolo hanno raggiunto un valore stabile, si diluisce la soluzione madre con un volume adeguato di 1-ottanolo,

si misura la concentrazione della soluzione madre diluita. Se la concentrazione misurata è coerente con la diluizione, la soluzione madre diluita può essere utilizzata nell’esperimento ad agitazione lenta.

Estrazione e analisi di campioni

23.

L’analisi della sostanza in esame è effettuata mediante un metodo analitico convalidato. I ricercatori devono dimostrare che, durante la prova, le concentrazioni nella fase di 1-ottanolo saturato con l’acqua e in fase acquosa saturata con 1-ottanolo sono superiori al limite di quantificazione del metodo analitico usato. Occorre stabilire prima dell’esperimento i recuperi analitici mediante analisi della sostanza in esame in fase acquosa e in fase 1-ottanolo, laddove siano necessari metodi di estrazione. Il segnale analitico deve essere corretto per tenere conto delle prove in bianco e si provvederà ad evitare qualsiasi trasferimento dell’analita da un campione all’altro.

24.

Prima dell’analisi, in caso di basse concentrazioni delle sostanze di prova idrofobiche in fase acquosa, sarà probabilmente necessario estrarre la fase acquosa mediante un solvente organico e preconcentrare l’estratto. Per la stessa ragione, è necessario ridurre le concentrazioni delle eventuali prove in bianco. A tale scopo, si devono utilizzare solventi di estrema purezza, preferibilmente solventi utilizzati per l’analisi dei residui. Inoltre, una pulizia accurata (ad esempio lavaggio con solvente o essiccazione a temperatura elevata) degli strumenti in vetro prima dell’esperimento può diminuire il rischio di contaminazione incrociata.

25.

È possibile ottenere una stima del log POW con un apposito programma o ricorrendo al parere di uno specialista. Se il suo valore è superiore a sei, è necessario prestare molta attenzione alle correzioni in funzione dei bianchi e ai trasferimenti dell’analita da un campione all’altro. D’altro canto, se il log POW è superiore a 6, è obbligatorio uno standard surrogato per correggere il tasso di recupero, in modo da ottenere fattori di preconcentrazione elevati. Esistono in commercio diversi programmi software per il calcolo della stima del log POW ad esempio, Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) e ACD log P (19) (1). I riferimenti bibliografici (da 20 a 22) descrivono i vari metodi di stima.

26.

I limiti di quantificazione (limits of quantification — LOQ) della sostanza in esame in 1-ottanolo e in acqua sono stabiliti secondo metodi riconosciuti. Come principio di base, il limite di quantificazione di un metodo corrisponde alla concentrazione in acqua o in 1-ottanolo che produce un rapporto segnale-disturbo pari a dieci. Occorre scegliere metodi di estrazione e di preconcentrazione adeguati e precisare i recuperi analitici. Occorre scegliere un fattore di preconcentrazione adeguato che produca un segnale dell’intensità richiesta nel corso della determinazione analitica.

27.

In funzione dei parametri del metodo analitico e delle concentrazioni previste, si stabilisce il volume approssimativo del campione che permetterà un’accurata determinazione della concentrazione della sostanza. Per ottenere un segnale analitico sufficiente, è opportuno non utilizzare campioni di acqua troppo esigui. D’altro canto, i campioni di acqua non devono neanche essere troppo grandi, poiché il volume di acqua restante rischia di essere insufficiente per il numero minimo di analisi necessario (n = 5). Nell’appendice 1 sono riportati i volumi minimi dei campioni in funzione del volume del recipiente, il limite di quantificazione della sostanza in esame e la sua solubilità.

28.

La quantificazione delle sostanze di prova si effettua per confronto con le curve di calibrazione dei loro composti. Le concentrazioni nei campioni analizzati devono essere comprese tra le concentrazioni degli standard.

29.

Per le sostanze in esame il cui log POW stimato è superiore a sei, occorre aggiungere uno standard surrogato nel campione di acqua prima dell’estrazione per rilevare le perdite che si verificano durante l’estrazione e la preconcentrazione dei campioni di acqua. Affinché la correzione del recupero sia accurata, gli standard surrogati devono avere proprietà molto simili o identiche a quelle della sostanza in esame. A tale scopo, si utilizzano preferibilmente analoghi marcati con isotopi (stabili) della sostanza di prova (perdeuterati o marcati 13C, ad esempio). Se l’utilizzo di analoghi marcati con isotopi stabili (13C o 2H) risulta impossibile, si deve dimostrare, basandosi su dati affidabili tratti da pubblicazioni, che le proprietà fisico-chimiche dello standard surrogato sono molto vicine a quelle della sostanza in esame. Nel corso dell’estrazione liquido-liquido della fase acquosa possono formarsi emulsioni, che possono essere ridotte con l’aggiunta di sale e lasciando decantare l’emulsione tutta la notte. I metodi utilizzati per estrarre e preconcentrare i campioni devono essere riportati nella relazione sulla prova.

30.

Prima di essere analizzati, i campioni prelevati dalla fase 1-ottanolo possono, se necessario, essere diluiti con un adeguato solvente. Inoltre, si raccomanda l’utilizzo di standard surrogati per correggere il tasso di recupero per le sostanze che hanno evidenziato un grado di variazione elevato nel corso delle prove di recupero (deviazione standard relativa > 10 %).

31.

La relazione sulla prova dovrà contenere i dettagli del metodo analitico, e includere: il metodo di estrazione, i fattori di preconcentrazione e di diluizione, i parametri degli strumenti, il processo di calibrazione, l’intervallo di calibrazione, il recupero analitico della sostanza in esame dall’acqua, l’aggiunta di standard surrogati per correggere il tasso di recupero, i valori delle prove in bianco, i limiti di rivelabilità e i limiti di quantificazione.

Esecuzione della prova

Rapporti volumetrici ottimali 1-ottanolo/acqua

32.

La scelta dei volumi di acqua e di 1-ottanolo deve avvenire in funzione degli elementi seguenti: il limite di quantificazione in 1-ottanolo e in acqua, i fattori di preconcentrazione applicati ai campioni di acqua, i volumi di campionamento prelevati in 1-ottanolo e in acqua nonché le concentrazioni previste. Per ragioni sperimentali, il volume di 1-ottanolo nel metodo dell’agitazione lenta deve essere scelto in modo che lo strato di 1-ottanolo sia sufficientemente spesso (> 0,5 cm) da non risultare alterato dopo un campionamento della fase 1-ottanolo.

33.

Per determinare i composti il cui log POW è uguale o superiore a 4,5, il rapporto tra i volumi di ciascuna fase abitualmente utilizzati sono da 20 a 50 ml di 1-ottanolo e da 950 a 980 ml di acqua in un recipiente da un litro.

Condizioni sperimentali

34.

Durante la prova, al recipiente di reazione è applicato un termostato in modo da limitare la variazione di temperatura a meno di 1 °C. La prova deve essere effettuata a 25 °C.

35.

Il sistema sperimentale deve essere protetto dalla luce del giorno, effettuando la prova in una camera oscura o coprendo il recipiente di reazione con un foglio di alluminio.

36.

La prova deve essere effettuata in un ambiente (per quanto possibile) privo di polvere.

37.

Il sistema 1-ottanolo/acqua è agitato fino al raggiungimento dell’equilibrio. Il tempo necessario per raggiungere l’equilibrio è valutato in un esperimento pilota effettuando una prova ad agitazione lenta durante la quale l’acqua e l’1-ottanolo sono sottoposti periodicamente a campionamento. I campionamenti devono avvenire ad intervalli di almeno cinque ore.

38.

La determinazione del POW deve essere effettuata sulla base di almeno tre prove indipendenti di agitazione lenta.

Determinazione del tempo necessario per raggiungere l’equilibrio

39.

Si considera che l’equilibrio sia stato raggiunto quando la regressione del rapporto delle concentrazioni 1-ottanolo/acqua in funzione del tempo (in un arco temporale che comprende quattro punti) si traduce in una pendenza che non si discosta in modo significativo da zero per un livello p uguale a 0,05. Occorre raggiungere l’equilibrio almeno 24 ore prima di poter iniziare il campionamento. In linea di massima, il campionamento delle sostanze il cui log POW stimato è < 5 può essere effettuato nel corso del secondo e terzo giorno. È possibile che il tempo necessario per giungere all’equilibrio sia più lungo per le sostanze maggiormente idrofobiche. Nel caso di una sostanza con log POW = 8,23 (decaclorobifenile), sono state sufficienti 144 ore per raggiungere l’equilibrio. L’equilibrio è valutato mediante una serie di campionamenti effettuati dallo stesso recipiente.

Inizio della prova

40.

All’inizio della prova, riempire il recipiente di reazione con acqua saturata in 1-ottanolo; attendere quindi che il sistema raggiunga la temperatura termostata.

41.

Aggiungere con attenzione al recipiente di reazione la quantità voluta di sostanza in esame (disciolta nel volume richiesto di 1-ottanolo saturato con acqua). Si tratta di un momento critico della prova poiché si deve evitare una miscela turbolenta delle due fasi. A tal fine, la fase 1-ottanolo può essere versata delicatamente con una pipetta sulla parete del contenitore di prova, vicino alla superficie dell’acqua. In tal modo scorrerà lungo la parete formando una pellicola sopra la fase acquosa. Evitare accuratamente di decantare l’1-ottanolo direttamente nella bottiglia; le gocce di 1-ottanolo non devono cadere direttamente nell’acqua.

42.

Una volta iniziata la fase di agitazione, aumentare lentamente la velocità. Qualora non sia possibile regolare adeguatamente i motori dell’agitatore, si consideri il ricorso ad un trasformatore. La velocità di agitazione deve essere regolata in modo da creare un vortice nell’interfaccia acqua/1-ottanolo di profondità massima compresa tra 0,5 e 2,5 cm. Occorre diminuire la velocità di agitazione se la profondità del vortice supera 2,5 cm; altrimenti si possono formare microgoccioline di 1-ottanolo nella fase acquosa che determinano una sovrastimazione della concentrazione della sostanza in esame nell’acqua. Sulla base dei risultati di una prova interlaboratorio di convalida (5), si raccomanda di applicare una velocità massima di agitazione di 2,5 cm. Ciò rappresenta un compromesso che permette di giungere rapidamente all’equilibrio pur limitando la formazione di microgoccioline di 1-ottanolo.

Prelievo e trattamento dei campioni

43.

Prima di effettuare i prelievi, spegnere l’agitatore e attendere che i liquidi si immobilizzino. Una volta effettuato il campionamento, riavviare delicatamente l’agitatore, come sopra descritto, e quindi aumentare progressivamente la velocità di agitazione.

44.

I campioni di fase acquosa sono prelevati da un rubinetto posto alla base del recipiente di reazione. Scartare sempre il volume morto di acqua contenuto nei rubinetti (circa 5 ml per il contenitore illustrato nell’appendice 2). L’acqua contenuta nei rubinetti non è stata sottoposta ad agitazione e non è pertanto in equilibrio con il resto del liquido. Prendere nota del volume dei campioni di acqua e, al momento di determinare il bilancio di massa, assicurarsi di tener conto della quantità di sostanza di prova presente nell’acqua eliminata. Ridurre al minimo le perdite dovute a evaporazione facendo scorrere delicatamente l’acqua nell’imbuto separatore in modo da non perturbare lo strato acqua/1-ottanolo.

45.

I campioni di 1-ottanolo sono ottenuti aspirando una piccola parte (circa 100 μl) dello strato di 1-ottanolo con una siringa da 100 μl in vetro e metallo, evitando accuratamente di agitare l’interfaccia. Prendere nota del volume di liquido prelevato. È sufficiente una piccola quota, dato che il campione di 1-ottanolo sarà diluito.

46.

Si devono evitare i trasferimenti inutili dei campioni. A tal fine è opportuno determinare il volume dei campioni mediante analisi gravimetrica. Nel caso di campioni di acqua, il volume è determinato mediante la raccolta del campione in un imbuto di separazione che contiene già il volume di solvente richiesto.

DATI E RELAZIONE

47.

Nel presente metodo di prova il valore POW è determinato effettuando tre esperimenti ad agitazione lenta (tre unità sperimentali) con il composto in esame, in condizioni sperimentali identiche. La regressione utilizzata per dimostrare il raggiungimento dell’equilibrio deve basarsi sui risultati di almeno quattro determinazioni CO/CW effettuate in momenti consecutivi. Ciò consente di calcolare la varianza, come misura dell’incertezza del valore medio ottenuto in ciascuna unità sperimentale.

48.

Il POW può essere caratterizzato dalla varianza dei dati ottenuti in ciascuna unità sperimentale. Tali informazioni sono utilizzate per calcolare il POW come la media ponderata dei risultati di ciascuna unità sperimentale. A tal fine, come coefficiente di ponderazione è utilizzato l’inverso della varianza dei risultati delle unità sperimentali. Di conseguenza, i dati che presentano una accentuata variazione (espressa in termini di varianza), e che sono pertanto meno affidabili, incideranno in misura minore sul risultato finale rispetto ai dati con varianza limitata.

49.

La deviazione standard ponderata è calcolata in modo analogo. Caratterizza la ripetibilità della misurazione del POW. Una deviazione standard ponderata con valore basso sta a indicare una ripetibilità elevata della determinazione del POW in uno stesso laboratorio. L’elaborazione statistica formale dei dati è riassunta come illustrato qui di seguito.

Trattamento dei risultati

Dimostrazione del conseguimento dell’equilibrio

50.

Il logaritmo della relazione delle concentrazioni della sostanza in esame in 1-ottanolo e in acqua (log CO/CW) è calcolato per ciascun tempo di prelievo. Il raggiungimento dell’equilibrio chimico si dimostra tracciando una curva di questa relazione in funzione del tempo. Una fase di plateau in questo tracciato, in corrispondenza di almeno quattro punti consecutivi sull’asse del tempo, indica che l’equilibrio è stato raggiunto e che il composto è completamente disciolto in 1-ottanolo. In caso contrario, si deve proseguire la prova fino ad ottenere, per quattro punti consecutivi sull’asse del tempo, una pendenza non significativamente diversa da zero per un livello p uguale a 0,05, che dimostra che il log CO/CW è indipendente dal tempo.

Calcolo del log POW

51.

Il valore del log POW dell’unità sperimentale corrisponde alla media ponderata del logaritmo CO/CW per la parte della curva del logaritmo CO/CW in funzione del tempo per la quale è stato dimostrato che l’equilibrio è stato raggiunto. Questa media è calcolata ponderando i dati con l’inverso della varianza, in modo che l’influenza dei dati sul risultato finale sia inversamente proporzionale alla loro incertezza.

Media del log POW

52.

Il valore medio del log POW di varie unità sperimentali corrisponde alla media dei risultati di ciascuna unità sperimentale ponderati con le loro rispettive varianze.

Il calcolo è effettuato secondo la formula seguente:

Formula

dove:

log POW,i

=

valore log POW di ciascuna unità sperimentale i;

log POW,Av

=

valore medio ponderato di ciascuna determinazione di log POW;

wi

=

ponderazione statistica attribuita al valore log POW dell’unità sperimentale i.

L’inverso della varianza del log POW,i è utilizzata come wi Formula.

53.

La stima dell’errore della media del log POW corrisponde alla ripetibilità del log CO/CW determinato durante la fase di equilibrio in ciascuna unità sperimentale. È espressa come la deviazione ponderata standard del POW,Avlog Pow,Av) che a sua volta misura l’errore associato al log POW,Av. La deviazione ponderata può essere calcolata a partire dalla varianza ponderata (varlog Pow,Av) nel modo seguente:

Formula

Formula

dove “n” rappresenta il numero di unità sperimentali.

Relazione sulla prova

54.

La relazione sulla prova deve riportare le informazioni seguenti:

 

Sostanza in esame:

nome comune, nome chimico, numero CAS, formula strutturale (eventualmente, con indicazione della posizione in caso di sostanze radiomarcate) e proprietà fisico-chimiche pertinenti (cfr. paragrafo 17),

purezza (impurità) della sostanza in esame,

purezza radiochimica delle sostanze marcate e attività molare (se del caso),

stima preliminare del log POW e metodo utilizzato per calcolare questo valore.

 

Condizioni sperimentali:

date di realizzazione degli studi,

temperatura nel corso dell’esperimento,

volumi di 1-ottanolo e di acqua all’inizio della prova,

volumi dei campioni di 1-ottanolo e di acqua prelevati,

volumi di 1-ottanolo e di acqua che restano nei recipienti di prova,

descrizione dei recipienti di prova e delle condizioni di agitazione (la geometria della barra di agitazione e del recipiente di prova, altezza del vortice in mm, e quando disponibile:

metodi analitici utilizzati per determinare la sostanza in esame e loro limite di quantificazione,

tempi di campionamento,

pH della fase acquosa e tamponi utilizzati quando si regola il pH in presenza di molecole ionizzabili,

numero di ripetizioni.

 

Risultati:

ripetibilità e sensibilità dei metodi analitici usati,

concentrazioni della sostanza di prova determinate in 1-ottanolo e in acqua in funzione del tempo,

dimostrazione del bilancio di massa,

temperatura e deviazione standard della temperatura o intervallo delle temperature, durante la prova,

regressione del rapporto delle concentrazioni in funzione del tempo,

valore medio del log Pow,Av e suo errore standard,

analisi e interpretazione dei risultati,

esempi di dati grezzi di analisi rappresentative (tutti i dati grezzi devono essere conservati conformemente alle buone pratiche di laboratorio), in particolare il tasso di recupero dei surrogati, il numero di livelli utilizzato nella calibrazione (oltre ai criteri per il coefficiente di correlazione della curva di taratura) e risultati del GQ/CQ,

se è disponibile: relazione di validazione del protocollo sperimentale (da citare nei riferimenti bibliografici).

BIBLIOGRAFIA:

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De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the ‘slow-stirring’ method. Environ. Toxicol. Chem., 8: 499-512.

(2)

Capitolo A.8 del presente allegato, Coefficiente di partizione.

(3)

Capitolo A.8 del presente allegato, Coefficiente di partizione.

(4)

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Boethling R.S., Mackay D. (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.

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(9)

OCSE (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Parigi.

(10)

Capitolo A.6 del presente allegato, Idrosolubilità.

(11)

Capitolo C.7 del presente allegato, Degradazione — Idrolisi della degradazione abiotica in funzione del pH.

(12)

Capitolo C.4 — parti da II a VII (Metodi da A a F) del presente allegato, Determinazione della pronta biodegradabilità.

(13)

Capitolo A.4 del presente allegato, Tensione di vapore.

(14)

Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623-626.

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(22)

Jübermann O. (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386-390.

Appendice 1

Tabelle di calcolo dei volumi minimi di acqua richiesti per l’individuazione delle sostanze in esame con valori log POW diversi in fase acquosa

Ipotesi:

Volume massimo di ciascuna aliquota = 10 % del volume totale; 5 aliquote = 50 % del volume totale

Formula. Se le concentrazioni sono inferiori, si dovranno utilizzare volumi maggiori

Volume utilizzato per la determinazione del limite di rivelabilità (LOD) = 100 ml

Il rapporto del log POW in funzione di log SW e del log POW in funzione di SR (solubilità relativa, Soct/Sw) sono rappresentazioni ragionevoli dei rapporti per le sostanze in esame

Stima di Sw

log Pow

equazione

log Sw

Sw (mg/l)

4

Formula

0,496

3,133E+00

4,5

Formula

0,035

1,084E+00

5

Formula

–0,426

3,750E-01

5,5

Formula

–0,887

1,297E-01

6

Formula

–1,348

4,487E-02

6,5

Formula

–1,809

1,552E-02

7

Formula

–2,270

5,370E-03

7,5

Formula

–2,731

1,858E-03

8

Formula

–3,192

6,427E-04

Stima di Soc

log Pow

equazione

Soct (mg/l)

4

Formula

3,763E+04

4,5

Formula

4,816E+04

5

Formula

6,165E+04

5,5

Formula

7,890E+04

6

Formula

1,010E+05

6,5

Formula

1,293E+05

7

Formula

1,654E+05

7,5

Formula

2,117E+05

8

Formula

2,710E+05


Massa totale della sostanza in esame

(mg)

Massoct/Masswater

MassH2O

(mg)

ConcH2O

(mg/l)

Massoct

(mg)

Concoct

(mg/l)

1 319

526

2,5017

2,6333

1 317

26 333

1 686

1 664

1,0127

1,0660

1 685

33 709

2 158

5 263

0,4099

0,4315

2 157

43 149

2 762

16 644

0,1659

0,1747

2 762

55 230

3 535

52 632

0,0672

0,0707

3 535

70 691

4 524

1664 36

0,0272

0,0286

4 524

90 480

5 790

5263 16

0,0110

0,0116

5 790

115 807

7 411

1 664 357

0,0045

0,0047

7 411

148 223

9 486

5 263 158

0,0018

0,0019

9 486

189 713

Calcolo dei volumi

Volume minimo richiesto per la fase H2O a ciascuna concentrazione del limite di rivelabilità (LOD)

log Kow

LOD (microgrammi/l)→

0,001

0,01

0,10

1,00

10

4

 

0,04

0,38

3,80

38

380

4,5

 

0,09

0,94

9,38

94

938

5

 

0,23

2,32

23,18

232

2 318

5,5

 

0,57

5,73

57,26

573

5 726

6

 

1,41

14,15

141

1 415

14 146

6,5

 

3,50

34,95

350

3 495

34 950

7

 

8,64

86,35

864

8 635

86 351

7,5

 

21,33

213

2 133

21 335

213 346

8

 

52,71

527

5 271

52 711

527 111

Volume usato per LOD (l)

0,1

 

 

 

 

 

Legenda

Rappresenta < 10 % del volume totale della fase acquosa, recipiente di equilibrazione da 1 litro.

Rappresenta < 10 % del volume totale della fase acquosa, recipiente di equilibrazione da 2 litri.

Rappresenta < 10 % del volume totale della fase acquosa, recipiente di equilibrazione da 5 litri.

Rappresenta < 10 % del volume totale della fase acquosa, recipiente di equilibrazione da 10 litri.

Supera del 10 % anche il recipiente di equilibrazione da 10 litri.

Tabella riassuntiva dei volumi necessari, in funzione della solubilità dell’acqua e del Log POW

Volume minimo richiesto per la fase H2O ad ogni concentrazione LOD (ml)

log Pow

Sw (mg/l)

LOD (microgrammi/l)→

0,001

0,01

0,10

1,00

10

4

10

 

0,01

0,12

1,19

11,90

118,99

 

5

 

0,02

0,24

2,38

23,80

237,97

 

3

 

0,04

0,40

3,97

39,66

396,62

 

1

 

0,12

1,19

11,90

118,99

1 189,86

4,5

5

 

0,02

0,20

2,03

20,34

203,37

 

2

 

0,05

0,51

5,08

50,84

508,42

 

1

 

0,10

1,02

10,17

101,68

1 016,83

 

0,5

 

0,20

2,03

20,34

203,37

2 033,67

5

1

 

0,09

0,87

8,69

86,90

869,01

 

0,5

 

0,17

1,74

17,38

173,80

1 738,02

 

0,375

 

0,23

2,32

23,18

231,75

2 317,53

 

0,2

 

0,43

4,35

43,45

434,51

4 345,05

5,5

0,4

 

0,19

1,86

18,57

185,68

1 856,79

 

0,2

 

0,37

3,71

37,14

371,36

3 713,59

 

0,1

 

0,74

7,43

74,27

742,72

7 427,17

 

0,05

 

1,49

14,85

148,54

1 485,43

14 854,35

6

0,1

 

0,63

6,35

63,48

634,80

6 347,95

 

0,05

 

1,27

12,70

126,96

1 269,59

12 695,91

 

0,025

 

2,54

25,39

253,92

2 539,18

25 391,82

 

0,0125

 

5,08

50,78

507,84

5 078,36

50 783,64

6,5

0,025

 

2,17

21,70

217,02

2 170,25

21 702,46

 

0,0125

 

4,34

43,40

434,05

4 340,49

43 404,93

 

0,006

 

9,04

90,43

904,27

9 042,69

90 426,93

 

0,003

 

18,09

180,85

1 808,54

18 085,39

180 853,86

7

0,006

 

7,73

77,29

772,89

7 728,85

77 288,50

 

0,003

 

15,46

154,58

1 545,77

15 457,70

154 577,01

 

0,0015

 

23,19

231,87

2 318,66

23 186,55

231 865,51

 

0,001

 

46,37

463,73

4 637,31

46 373,10

463 731,03

7,5

0,002

 

19,82

198,18

1 981,77

19 817,73

198 177,33

 

0,001

 

39,64

396,35

3 963,55

39 635,47

396 354,66

 

0,0005

 

79,27

792,71

7 927,09

79 270,93

792 709,32

 

0,00025

 

158,54

1 585,42

15 854,19

158 541,86

1 585 418,63

8

0,001

 

33,88

338,77

3 387,68

33 876,77

338 767,72

 

0,0005

 

67,75

677,54

6 775,35

67 753,54

677 535,44

 

0,00025

 

135,51

1 355,07

13 550,71

135 507,09

1 355 070,89

 

0,000125

 

271,01

2 710,14

27 101,42

271 014,18

2 710 141,77

Volume usato per la determinazione del LOD (l)

0,1

 

 

 

 

 

Appendice 2

Esempio di recipiente di prova con rivestimento esterno in vetro per il metodo dell’agitazione lenta al fine di determinare il POW

Image

»

3)

il capitolo B.2 è sostituito dal seguente:

«B.2.   TOSSICITÀ ACUTA PER INALAZIONE

INTRODUZIONE

1.

Questo metodo di prova equivale alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 403 (2009) (1). La prima linea guida sulla tossicità acuta per inalazione n. 403 è stata adottata nel 1981. Questo metodo di prova rivisto B.2 (equivalente alla linea guida n. 403 rivista) è stato concepito per offrire una maggior flessibilità, ridurre l’utilizzo di animali e rispondere alle prescrizioni normative. Questo metodo di prova prevede due tipi di studi: un protocollo tradizionale di determinazione della LC50 e un protocollo “concentrazione × tempo” (C × t). Le caratteristiche principali di questo metodo di prova sono la capacità di ottenere un rapporto concentrazione/risposta che va da “letale” a “non letale” al fine del calcolo della mediana della concentrazione letale (CL50), della soglia di concentrazione non letale (come la CL01) e della pendenza, nonché la capacità di determinare un’eventuale sensibilità legata al sesso. Il protocollo C × t deve essere utilizzato quando sussiste una particolare esigenza scientifica o normativa che preveda una prova su animali per varie durate di esposizione, ad esempio per la pianificazione territoriale o la pianificazione della risposta di emergenza [per ottenere, ad esempio, i livelli guida di esposizione acuta (Acute Exposure Guideline Levels — AEGL), le raccomandazioni per la pianificazione delle misure di emergenza (Emergency Response Planning Guidelines — ERPG), o i livelli soglia di esposizione acuta (Acute Exposure Threshold Levels — AETL)].

2.

Nel documento d’orientamento sulla prove di tossicità acuta per inalazione (documento d’orientamento n. 39) (2) sono riportate indicazioni sulla realizzazione e l’interpretazione degli studi legati a questo metodo di prova.

3.

Le definizioni usate nel contesto del presente metodo di prova sono specificate alla fine del capitolo e nel documento di orientamento n. 39 (2).

4.

Questo metodo di prova consente di caratterizzare le sostanze in esame, di sottoporle ad una valutazione quantitativa dei rischi e di classificarle a norma del regolamento (CE) n. 1272/2008 (3). Il documento di orientamento n. 39 (2) fornisce indicazioni per la scelta del metodo di prova adeguato per le prove di tossicità acuta. Quando sono necessarie solo informazioni sulla classificazione e l’etichettatura, si raccomanda di far riferimento al capitolo B.52 del presente allegato (4) [cfr. documento d’orientamento n. 39 (2)]. Questo metodo di prova B.2 non è specificamente destinato a testare materiali speciali come le sostanze isometriche o fibrose poco solubili o i nanomateriali di sintesi.

CONSIDERAZIONI INIZIALI

5.

Prima di decidere di avvalersi di questo metodo di prova, il laboratorio che esegue la prova deve esaminare tutte le informazioni disponibili sulla sostanza chimica in esame, ivi compresi gli studi esistenti [ad esempio capitolo B.52 del presente allegato (4)] i cui risultati renderebbero inutili prove aggiuntive, al fine di ricorrere il meno possibile agli animali. Tra le informazioni utili per la scelta della specie, del ceppo, del sesso, della modalità di esposizione e delle concentrazioni più adeguati, rientrano l’identità, la struttura chimica e le proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame; i risultati di eventuali altre prove di tossicità in vitro o in vivo; gli impieghi previsti e il potenziale in termini di esposizione umana; dati (Q)SAR e dati tossicologici disponibili su sostanze chimiche di struttura affine [cfr. documento d’orientamento n. 39 (2)].

6.

Occorre evitare il più possibile di testare sostanze chimiche corrosive o gravemente irritanti a concentrazioni che possono provocare dolore e sofferenza intensi. Per stabilire se sia possibile evitare prove aggiuntive, occorre valutare il potenziale di corrosione/irritazione secondo i criteri degli specialisti in funzione degli elementi seguenti: dati sperimentali sull’uomo e l’animale (provenienti, ad esempio, da prove a dosi ripetute realizzate a concentrazioni non corrosive né irritanti), dati in vitro disponibili [ad esempio dai capitoli B.40 (5), B.40 bis (6) del presente allegato o dalla linea guida dell’OCSE n. 435 (7)], valori del pH, informazioni concernenti sostanze analoghe o qualsiasi altro dato pertinente. Per specifiche esigenze normative (ad esempio per la pianificazione di emergenza), questo metodo di prova può essere utilizzato per esporre animali a sostanze di questo tipo in quanto consente al responsabile dello studio o al ricercatore principale di scegliere le concentrazioni. Tuttavia le concentrazioni auspicate non devono avere effetti corrosivi/irritanti gravi, pur essendo sufficienti a prolungare la curva concentrazione-risposta fino a livelli corrispondenti all’obiettivo scientifico e normativo della prova. Occorre sempre giustificare le concentrazioni scelte [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)].

PRINCIPIO DELLA PROVA

7.

Questo metodo di prova rivisto B.2 è stato concepito per ottenere informazioni sufficienti sulla tossicità acuta di una sostanza chimica al fine di consentirne la classificazione e fornire dati sulla letalità (CL50, CL01 e inclinazione) per uno o entrambi i sessi. Questi dati sono necessari per le valutazioni quantitative dei rischi. Il metodo in questione prevede due procedure diverse. La prima è un protocollo tradizionale in cui gruppi di animali sono esposti ad una concentrazione limite (prova limite) o a una serie di concentrazioni secondo una procedura articolata in fasi successive per una durata prestabilita, di solito pari a 4 ore. Se necessario per motivi regolamentari, la durata dell’esposizione può essere diversa. La seconda procedura è un protocollo (“C × t”) in cui gruppi di animali sono esposti ad una concentrazione (concentrazione limite) o a una serie di concentrazioni diverse per durate diverse.

8.

Ai fini dell’interpretazione dei risultati della prova, gli animali moribondi o che manifestano segni evidenti di dolore o di sofferenza grave e persistente devono essere sottoposti a eutanasia e considerati alla stregua degli animali morti naturalmente nel corso della prova. I criteri da applicare per decidere in merito all’eutanasia degli animali moribondi o in stato di grave sofferenza sono oggetto di uno documento d’orientamento specifico, che contiene anche indicazioni su come riconoscere i segni di morte prevedibile o imminente (8).

DESCRIZIONE DEL METODO

Selezione delle specie animali

9.

Si devono utilizzare animali adulti giovani e sani appartenenti a ceppi comunemente usati in laboratorio. La specie generalmente utilizzata è il ratto e occorre motivare l’eventuale scelta di una specie diversa.

Preparazione degli animali

10.

Le femmine devono essere nullipare e non gravide. Il giorno dell’esposizione, gli animali selezionati devono essere giovani adulti di età compresa tra 8 e 12 settimane il cui peso corporeo non deve superare, per ciascun sesso, ± 20 % del peso medio degli animali di ciascun sesso della stessa età precedentemente esposti. Gli animali sono scelti a caso e marcati per l’identificazione individuale. Affinché si adattino alle condizioni di laboratorio, devono essere lasciati nelle gabbie per almeno 5 giorni prima dell’inizio della prova e, poco prima della prova, vanno anche acclimatati alle apparecchiature di prova per attenuare la tensione causata dal nuovo ambiente.

Condizioni di allevamento degli animali

11.

La temperatura dello stabulario deve essere di 22 ± 3 °C. L’umidità relativa va idealmente mantenuta tra 30 e 70 %, anche se ciò potrebbe non essere possibile quando si utilizza l’acqua come veicolo. Prima e dopo l’esposizione, gli animali sono generalmente tenuti in gabbia, suddivisi per sesso e concentrazione, ma il numero di animali per gabbia non deve interferire con un’agevole osservazione di ogni singolo animale e deve ridurre al minimo le perdite dovute a cannibalismo e combattimenti. Se l’esposizione avviene unicamente per via nasale, potrebbe essere necessario abituarli ai dispositivi di contenzione, che non devono provocare agli animali eccessivi stress fisici, termici o dinamici. La contenzione può incidere sugli effetti misurati (endpoint) fisiologici, come la temperatura corporea (ipertermia) e/o il volume respiratorio al minuto. Se si dispone di dati generici che dimostrano che nessuna di queste alterazioni avviene a un livello apprezzabile, il periodo di adattamento ai dispositivi di contenzione non è necessario. Gli animali esposti “a corpo intero” ad un aerosol devono essere stabulati separatamente per la durata dell’esposizione per evitare che filtrino l’aerosol attraverso il pelo degli altri animali presenti nella gabbia. Salvo nei periodi di esposizione, gli animali possono essere nutriti in base a diete convenzionali e certificate da laboratorio, accompagnate da acqua a volontà. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità.

Camere di inalazione

12.

La scelta della camera di inalazione dipende dalla natura della sostanza chimica in esame e dalla finalità della prova. Il metodo preferito di esposizione è quello per via nasale (con cui s’intende l’esposizione unicamente della testa, del naso o del muso). Di norma si predilige l’esposizione “a naso solo” per gli studi di aerosol liquidi o solidi e per i vapori che si possono condensare sotto forma di aerosol. L’esposizione “a corpo intero” può essere più indicata per conseguire obiettivi di studio particolari, ma tale scelta deve essere giustificata nella relazione sullo studio. Per garantire la stabilità atmosferica di una camera di esposizione “a corpo intero”, il volume complessivo degli animali sottoposti alla prova non deve superare il 5 % del volume della camera. Il documento di orientamento n. 39 (2) descrive i principi delle tecniche di esposizione “a corpo intero” e per sola via nasale, nonché i relativi vantaggi e svantaggi.

CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE

Somministrazione delle concentrazioni

13.

Le esposizioni “a naso solo” possono durare fino a 6 ore per i ratti. Nel caso dei topi, questa forma di esposizione deve durare al massimo 4 ore. Qualora siano necessari esposizioni di più lunga durata, occorre spiegarne il motivo [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Gli animali esposti agli aerosol in camere “a corpo intero” devono essere sistemati individualmente per evitare l’ingestione della sostanza in esame nel corso della pulizia degli altri animali presenti nella stessa gabbia. Durante il periodo di esposizione l’alimentazione va sospesa. Nel corso dell’esposizione “a corpo intero” si può continuare a somministrare acqua.

14.

Gli animali sono esposti alla sostanza in esame sotto forma di gas, vapore, aerosol o una loro miscela. Lo stato fisico da testare dipende dalle proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame, dalla concentrazione prescelta e/o dalla forma fisica nella quale è più probabile che si presenti nel corso della sua manipolazione e del suo utilizzo. Le sostanze igroscopiche e reattive dal punto di vista chimico devono essere saggiate in atmosfera secca. Occorre prestare attenzione al fine di evitare concentrazioni esplosive.

Distribuzione granulometrica

15.

La granulometria deve essere effettuata per tutti gli aerosol e i vapori che potrebbero condensarsi e formare aerosol. Per consentire l’esposizione di tutte le zone pertinenti delle vie respiratorie, si raccomanda di utilizzare degli aerosol con diametro aerodinamico mediano di massa (DAMM) compreso tra 1 e 4 μm con una deviazione standard geometrica (σg) compresa tra 1,5 e 3,0 (2) (9) (10). Occorre fare quanto possibile per rispettare queste condizioni, ma qualora non ci si riuscisse è necessario il parere di uno specialista. Ad esempio, le particelle dei fumi metallici possono essere più piccole del limite inferiore sopraindicato, e le particelle caricate, le fibre e i materiali igroscopici (le cui dimensioni aumentano nell’ambiente umido delle vie respiratorie) possono oltrepassare il limite superiore.

Preparazione della sostanza in esame in un veicolo

16.

Per ottenere la concentrazione e la granulometria adeguate della sostanza in esame nell’atmosfera si può utilizzare un veicolo. Di norma è preferibile utilizzare l’acqua. Le particelle possono essere sottoposte a processi meccanici per ottenere la distribuzione granulometrica voluta, tuttavia occorre prestare attenzione a non decomporre o alterare la sostanza in esame. Qualora si ritenga che i processi meccanici abbiano alterato la composizione della sostanza in esame (temperatura estrema dovuta alla frizione da eccessiva macinazione), occorrerà verificare mediante analisi la composizione della sostanza in esame. Occorre prestare particolare attenzione a non contaminare la sostanza in esame. Non è necessario testare le materie granulari non friabili, appositamente concepite per essere non inalabili. Per dimostrare che la manipolazione del materiale granulare non produce particelle respirabili, effettuare una prova di logorio per attrito. Se la prova di logorio produce sostanze respirabili, occorre effettuare una prova di tossicità per inalazione.

Animali di controllo

17.

Non è necessario un gruppo di controllo negativo (aria) in parallelo. Se per produrre l’atmosfera di prova si utilizza un veicolo diverso dall’acqua, è necessario allestire un gruppo di controllo del veicolo solo se non si dispone di dati storici sulla tossicità. Se in uno studio di tossicità della sostanza in esame in un mezzo non si rileva tossicità, ciò significa che il mezzo non è tossico alla concentrazione in questione; pertanto non occorre un gruppo di controllo del veicolo.

MONITORAGGIO DELLE CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE

Flusso d’aria nella camera di esposizione

18.

Durante ogni esposizione è necessario regolare attentamente, monitorare in continuo e registrare almeno una volta l’ora il flusso d’aria nella camera. Il monitoraggio della concentrazione (o stabilità) dell’atmosfera di prova costituisce una misurazione permanente di tutti i parametri dinamici e un modo indiretto di controllare quelli che regolano la produzione dell’atmosfera di prova. Nelle camere d’esposizione “a naso solo”, si farà il possibile, per evitare la reinalazione qualora il flusso d’aria attraverso il sistema di esposizione non sia in grado di garantire una circolazione dinamica dell’atmosfera di prova. Esistono metodi specifici cui si può ricorrere per dimostrare che non si verificano reinalazioni nelle condizioni sperimentali prescelte (2) (11). La concentrazione di ossigeno deve essere pari ad almeno il 19 % e la concentrazione di biossido di carbonio non deve superare l’1 %. Qualora si ritenga di non poter rispettare questi standard, è necessario misurarle.

Temperatura e umidità relativa della camera

19.

La temperatura della camera deve essere mantenuta a 22 °C ± 3 °C. L’umidità relativa nella zona in cui respira l’animale, sia per le esposizioni “a naso solo” che per quelle “a corpo intero”, è monitorata e registrata almeno tre volte (per le prove che durano fino a 4 ore) e tutte le ore per le durate più brevi. L’umidità relativa deve idealmente essere mantenuta tra 30 e 70 % ma può accadere che questi valori non siano raggiungibili (ad esempio, quando si testano miscele acquose) o che l’umidità non possa essere misurata per via delle interferenze della sostanza in esame con il metodo di prova.

Sostanza chimica in esame: Concentrazione nominale

20.

Laddove possibile, si deve calcolare e registrare la concentrazione nominale nella camera di esposizione. La concentrazione nominale è data dalla divisione della massa generata dalla sostanza in esame per il volume totale di aria circolata nella camera. La concentrazione nominale non serve a caratterizzare l’esposizione degli animali, ma un confronto tra la concentrazione nominale e la concentrazione reale dà un’indicazione dell’efficienza di produzione del sistema di prova e può essere utile per individuare eventuali problemi a questo livello.

Sostanza chimica in esame: Concentrazione reale

21.

La concentrazione reale è la concentrazione della sostanza in esame nella zona della camera di inalazione in cui gli animali respirano. Le concentrazioni reali possono essere determinate con metodi specifici (ad esempio campionamento diretto, metodi di adsorbimento o di reazione chimica, e successiva caratterizzazione analitica) o con metodi non specifici come l’analisi gravimetrica mediante filtrazione. Il ricorso all’analisi gravimetrica è accettabile solo per gli aerosol di polveri che contengono un unico componente o per gli aerosol di liquidi poco volatili e deve fondarsi su opportune caratterizzazioni, specifiche per la sostanza in esame, effettuate prima dello studio. È possibile ricorrere all’analisi gravimetrica per determinare la concentrazione di un aerosol che contiene varie componenti in polvere, ma occorrono dati analitici che dimostrino che la composizione del materiale in sospensione nell’aria è analoga a quella del materiale di partenza. In assenza di questi dati, può essere necessario rianalizzare periodicamente la sostanza in esame (idealmente sotto forma di aerosol) durante lo studio. Per gli agenti aerosolizzati che possono evaporare o sublimarsi, occorre dimostrare che tutte le fasi sono state raccolte con il metodo prescelto. Le concentrazioni bersaglio nominali e reali devono essere riportate nella relazione, ma nell’analisi statistica per il calcolo dei valori delle concentrazioni letali sono utilizzate solo le concentrazioni reali.

22.

Si deve utilizzare, se possibile, un unico lotto della sostanza in esame e il campione allo studio va conservato in condizioni che ne mantengano la purezza, l’omogeneità e la stabilità. Prima di iniziare lo studio, occorre caratterizzare la sostanza in esame, valutandone anche la purezza e, se tecnicamente fattibile, l’identità e le quantità di contaminanti e di impurità individuati. A tal fine occorre conoscere quanto meno i dati seguenti: tempo di ritenzione e relativa area di picco, peso molecolare risultante dalla spettroscopia di massa o dalla gascromatografia, o altre stime. Il laboratorio che effettua la prova non è responsabile dell’identità del campione in esame, tuttavia per precauzione è opportuno che confermi almeno in parte la caratterizzazione del cliente (colore, natura fisica ecc.).

23.

L’atmosfera di esposizione è mantenuta il più costante possibile e monitorata in continuo e/o in modo intermittente secondo il metodo di analisi. Quando si procede ad un campionamento intermittente, in uno studio di quattro ore si devono raccogliere campioni dell’atmosfera della camera almeno due volte. Se ciò non è possibile, per via di limitazioni inerenti al flusso d’aria o delle basse concentrazioni, è possibile prelevare un solo campione nell’intero periodo di esposizione. Se si osservano evidenti fluttuazioni da un campione all’altro, per le concentrazioni successive si devono prelevare quattro campioni per esposizione. Gli scarti di concentrazione in ogni camera e la concentrazione media non devono superare ± 10 % per i gas e i vapori o ± 20 % per gli aerosol liquidi o solidi. Occorre calcolare e prender nota del tempo necessario per raggiungere l’equilibrio nella camera di esposizione (t95) La durata di un’esposizione coincide con il tempo di produzione della sostanza in esame, ivi compreso il tempo necessario per ottenere il t95. Il documento di orientamento n. 39 (2) contiene indicazioni per la stima di t95.

24.

Per le miscele molto complesse costituite da gas o vapori e da aerosol (atmosfere di combustione o sostanze di prova propulse da prodotti/dispositivi specializzati, ad esempio), ogni fase può comportarsi diversamente nella camera di inalazione. Per ciascuna fase (gas/vapore e aerosol) occorre pertanto scegliere una sostanza indicatrice (analita). Quando la sostanza in esame è una miscela, la concentrazione analitica dovrà essere indicata per la preparazione e non solo per la sostanza attiva o il componente (analita). Informazioni aggiuntive sulle concentrazioni reali sono reperibili nel documento d’orientamento n. 39 (2).

Sostanza chimica in esame: Distribuzione granulometrica

25.

La distribuzione granulometrica degli aerosol deve essere determinata almeno due volte nel corso di ciascuna esposizione di 4 ore, utilizzando un impattore a cascata o un altro strumento, come uno spettrometro APS (Aerodynamic Particle Sizer). Se i risultati ottenuti con l’impattore a cascata e con un altro strumento risultano equivalenti, quest’ultimo può essere utilizzato nel corso dell’intero studio. Per confermare l’efficienza di estrazione dello strumento principale, occorre utilizzare parallelamente un secondo strumento, come un filtro gravimetrico o un impinger/gorgogliatore. La concentrazione massica ottenuta dall’analisi granulometrica deve avvicinarsi, con scarti ragionevoli, a quella ottenuta mediante l’analisi su filtro [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Se questa equivalenza viene stabilita nella fase iniziale dello studio, non è necessario effettuare ulteriori misurazioni di conferma. Per il benessere degli animali occorre ridurre il più possibile i dati incerti che potrebbero comportare la necessità di ripetere un’esposizione. È necessario effettuare un’analisi granulometrica nel caso di vapori che possono condensarsi e formare aerosol o se, in un’atmosfera di vapore, si rilevano particelle che si presume possano formare fasi miste (cfr. paragrafo 15).

PROCEDURA

26.

Qui di seguito sono descritti due tipi di studio: il protocollo tradizionale e il protocollo C × t. Entrambi i protocolli possono comprendere uno studio di osservazione, uno studio principale e/o una prova limite (protocollo tradizionale) o una prova a concentrazione limite (C × t). Se uno dei due sessi è notoriamente più sensibile, il responsabile dello studio può scegliere di effettuare queste prove solo con animali di questo sesso. Se per l’esposizione “a naso solo” s’impiegano specie di roditori diverse dai ratti, è possibile adeguare la durata massima d’esposizione per ridurre al minimo lo stress tollerato dalla specie in causa. Prima di iniziare lo studio, è opportuno esaminare tutti i dati disponibili al fine di ridurre al minimo l’utilizzo di animali. Ad esempio, i dati ottenuti sulla base del capitolo B.52 del presente allegato (4) possono rendere superfluo lo studio di osservazione e dimostrare anche se uno dei due sessi è più sensibile [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)].

PROTOCOLLO TRADIZIONALE:

Osservazioni generali: Protocollo tradizionale

27.

In uno studio tradizionale, gruppi di animali sono esposti a una sostanza di prova per un periodo stabilito di tempo (generalmente 4 ore) in una camera di esposizione “a naso solo” o “a corpo intero”. Gli animali sono esposti ad una concentrazione limite (prova limite) o ad almeno tre concentrazioni in fasi successive (studio principale). Lo studio principale può essere preceduto da uno studio di osservazione, a meno che non si disponga già di alcune informazioni sulla sostanza in esame, tratte da uno studio B.52 precedente [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)].

Studio di osservazione: Protocollo tradizionale

28.

Uno studio di osservazione consente di stimare l’attività della sostanza in esame, di individuare le differenze tra i sessi in termini di sensibilità alla sostanza, e di scegliere più agevolmente i livelli di concentrazione per lo studio principale o la prova limite. Al momento della scelta dei livelli di concentrazione per lo studio di osservazione, è opportuno utilizzare tutte le informazioni disponibili, ivi compresi i dati (Q)SAR e i dati relativi a sostanze chimiche analoghe. Per ogni concentrazione, è opportuno esporre al massimo tre maschi e tre femmine (può essere necessario utilizzare tre animali per sesso per stabilire una differenza di sensibilità tra i sessi). Uno studio di osservazione può essere effettuato con un’unica concentrazione, ma se necessario si possono testare più concentrazioni. Questo studio non deve vertere su un numero di animali e di concentrazioni analogo a quello utilizzato per uno studio principale. Invece di effettuare uno studio di osservazione, è possibile utilizzare i risultati di uno studio B.52 (4) precedente [cfr. documento di orientamento n. 39(2)].

Prova limite: Protocollo tradizionale

29.

Un prova limite viene effettuata quando si sa per certo o si prevede che la sostanza di prova sarà praticamente non tossica, ossia determinerà una reazione di tossicità solo al di sopra della concentrazione limite regolamentare. In una prova limite, un solo gruppo di tre maschi e tre femmine è esposto alla sostanza in esame ad una concentrazione limite. Le informazioni sulla tossicità della sostanza in esame possono essere ricavate da conoscenze relative a sostanze simili testate, tenendo conto dell’identità e della percentuale dei componenti dei quali è nota la rilevanza tossicologica. Nel caso in cui le informazioni sulla tossicità della sostanza siano scarse o nulle, o in cui ci si attenda che la sostanza in esame sia tossica, occorre eseguire la prova principale.

30.

La scelta delle concentrazioni limite dipende in genere dagli obblighi normativi. Quando si utilizza il regolamento (CE) n. 1272/2008, le concentrazioni limite per i gas, i vapori e gli aerosol sono rispettivamente di 20 000 ppm, 20 mg/l e 5 mg/l (o, altrimenti, la concentrazione massima raggiungibile) (3). Può risultare tecnicamente difficile raggiungere le concentrazioni limite di alcune sostanze, in particolare se si tratta di vapori e aerosol. Per le prove con aerosol, l’obiettivo principale è giungere ad una dimensione delle particelle che sia respirabile (ossia DAMM da 1 a 4 μm), il che è possibile con la maggior parte delle sostanze testate ad una concentrazione di 2 mg/l. [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Il regolamento (CE) n. 1272/2008 sconsiglia di effettuare delle prove a concentrazioni superiori alla concentrazione limite per ragioni di benessere degli animali. Le prove con concentrazioni limite devono essere prese in considerazione solo quando è molto probabile che i loro risultati rivestano un interesse diretto per la protezione della salute umana (3) e, in tal caso, occorre spiegarlo nella relazione. Nel caso di sostanze potenzialmente esplosive si devono adottare precauzioni per evitare condizioni che favoriscano un’esplosione. Per evitare il ricorso inutile ad animali, occorre effettuare una prova senza animali prima della prova limite, per accertarsi che sia possibile ottenere le condizioni di prova nella camera.

31.

Se alla concentrazione limite si registrano mortalità o stati di agonia, i risultati della prova limite possono fungere da studio di osservazione per ulteriori prove a concentrazioni diverse (cfr. studio principale). Se le proprietà fisiche o chimiche di una sostanza in esame impediscono di raggiungere una concentrazione limite, occorrerà testare la massima concentrazione raggiungibile. Se la letalità a questa concentrazione è inferiore al 50 %, non occorre proseguire la prova. Qualora non sia stato possibile raggiungere la concentrazione massima, occorre fornire, nella relazione di studio, una spiegazione e dati giustificativi. Se la concentrazione massima raggiungibile per un vapore non comporta tossicità, può essere necessario produrre la sostanza in esame sotto forma di aerosol liquido.

Studio principale: Protocollo tradizionale

32.

In uno studio principale di norma si utilizzano cinque maschi e cinque femmine (o cinque animali del sesso più sensibile, se noto) per livello di concentrazione, con almeno tre livelli diversi di concentrazione. Per effettuare un’adeguata analisi statistica, occorre prevedere un numero sufficiente di livelli di concentrazione. L’intervallo di tempo tra l’esposizione dei vari gruppi è determinato dalla comparsa, dalla durata e dalla gravità dei segni di tossicità rilevati. L’esposizione al livello di concentrazione superiore deve essere ritardata fino a quando non si abbia la ragionevole certezza che gli animali già sottoposti alla prova siano sopravvissuti. Il responsabile dello studio può in tal caso adeguare la concentrazione “bersaglio” per il gruppo successivo. Per gli studi sulla tossicità per inalazione, che richiedono tecnologie sofisticate, non sarà sempre possibile procedere in questo modo; in tal caso l’esposizione degli animali alla concentrazione superiore si dovrà basare sull’esperienza acquisita e sui pareri di esperti. Per le prove riguardanti le miscele, è opportuno fare riferimento al documento di orientamento n. 39 (2).

PROTOCOLLO “CONCENTRAZIONE × TEMPO” (C × T)

Osservazioni generali: Protocollo C × t

33.

Uno studio sequenziale “concentrazione × tempo” (C × t) può costituire un’alternativa al protocollo tradizionale quando si tratta di valutare la tossicità per inalazione (12) (13) (14). Nell’ambito di questo approccio gli animali sono esposti alla sostanza in esame a vari livelli di concentrazione e per durate di esposizioni variabili. Tutte le prove sono effettuate in camere di esposizione “a naso solo”, in quanto le camere “a corpo intero” non sono adatte a questo protocollo. Il diagramma di flusso all’appendice 1 illustra questo protocollo. Un’analisi di simulazione ha evidenziato che il protocollo tradizionale e il protocollo C × t erano entrambi in grado di fornire valori affidabili della CL50 ma che il protocollo C × t consentiva generalmente di ottenere valori più affidabili per la CL01 e la CL10 (15).

34.

Un’analisi di simulazione ha evidenziato che generalmente è opportuno utilizzare due animali per intervallo di C × t (un animale di ciascun sesso o due animali del sesso più sensibile) per testare 4 concentrazioni e 5 durate di esposizione nel corso di uno studio principale. Il responsabile dello studio, in determinate circostanze, può decidere di utilizzare due ratti per sesso per intervallo di C × t (15). L’utilizzo di 2 animali per sesso, per punto di concentrazione e di tempo può contribuire a ridurre gli errori sistematici e la variabilità delle stime, aumentare il tasso di precisione delle stime e migliorare la copertura dell’intervallo di confidenza. Tuttavia in caso di correlazione insufficiente dei dati (quando si utilizza un animale di ciascun sesso o due animali del sesso più sensibile), può bastare anche una quinta concentrazione di esposizione. Per ulteriori informazioni sul numero di animali e le concentrazioni da utilizzare per uno studio C × t, cfr. il documento di orientamento n. 39 (2).

Studio di osservazione: Protocollo C × t

35.

Uno studio di osservazione consente di stimare l’attività della sostanza in esame, e di scegliere più agevolmente i livelli di concentrazione per l’esposizione nello studio principale. Uno studio di osservazione con al massimo tre animali per sesso e per concentrazione può essere utile per scegliere un’adeguata concentrazione di partenza per lo studio principale e ridurre il numero di animali utilizzati, [per maggiori informazioni cfr. l’appendice III del documento di orientamento n. 39 (2)]. Per stabilire la differenza di sensibilità tra i sessi possono essere necessari tre animali per sesso. Questi animali devono essere oggetto di una sola esposizione, in genere di 240 minuti. La possibilità di generare atmosfere di prova adeguate deve essere valutata nel corso di prove tecniche preliminari senza animali. Di norma non occorre effettuare uno studio di osservazione se i dati sulla mortalità sono già disponibili [tratti da uno studio B.52 (4)]. Nel selezionare la concentrazione iniziale auspicata in uno studio B.2, il responsabile dello studio tiene conto dei profili di mortalità osservati in un qualsiasi studio B.52 (4) disponibile, per entrambi i sessi e per tutte le concentrazioni testate [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)].

Concentrazione iniziale: Protocollo C × t

36.

La concentrazione iniziale (sessione di esposizione I) (appendice 1) è una concentrazione limite o una concentrazione scelta dal responsabile dello studio in base allo studio di osservazione. Dei gruppi formati da un animale di ciascun sesso sono esposti a questa concentrazione per periodi di durata variabile (15, 30, 60, 120 o 240 minuti) per un totale di 10 animali per quella che viene denominata “sessione di esposizione I” (appendice 1).

37.

La scelta delle concentrazioni limite dipende in genere dagli obblighi normativi. Quando si utilizza il regolamento (CE) n. 1272/2008, le concentrazioni limite per i gas, i vapori e gli aerosol sono rispettivamente di 20 000 ppm, 20 mg/l e 5 mg/l (o, altrimenti, la concentrazione massima raggiungibile) (3). Può risultare tecnicamente difficile raggiungere le concentrazioni limite di alcune sostanze, in particolare se si tratta di vapori e aerosol. Per le prove su aerosol, l’obiettivo è giungere ad una dimensione delle particelle che sia respirabile (ossia DAMM da 1 a 4 μm) a una concentrazione limite di 2 mg/l. Ciò è possibile con la maggior parte delle sostanze chimiche in esame. Le prove con aerosol a concentrazioni superiori a 2 mg/l sono eseguite solo se si è riusciti a generare particelle di dimensioni respirabili [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Il regolamento (CE) n. 1272/2008 sconsiglia di effettuare delle prove a concentrazioni superiori alla concentrazione limite per ragioni di benessere degli animali (3). Le prove effettuate superando il limite di concentrazione vanno prese in considerazione solo se è altamente probabile che i loro risultati rivestano un interesse diretto per la protezione della salute umana (3) e occorre giustificare questa scelta nella relazione di studio. Nel caso di sostanze potenzialmente esplosive si devono adottare precauzioni per evitare condizioni che favoriscano un’esplosione. Per evitare l’uso inutile di animali, occorre effettuare una prova senza animali prima della prova alla concentrazione iniziale per accertarsi che è possibile ottenere nella camera le condizioni sperimentali di una prova a tale concentrazione.

38.

Se alla concentrazione iniziale si verificano mortalità o agonie, i risultati a questa concentrazione possono fungere da punto di partenza per ulteriori prove ad altre concentrazioni (cfr. studio principale). Se la concentrazione limite non è raggiungibile per via delle proprietà fisiche o chimiche della sostanza in esame, si effettueranno le prove in questione alla concentrazione massima raggiungibile. Se la letalità a questa concentrazione è inferiore al 50 %, non occorre proseguire la prova. Qualora non sia stato possibile raggiungere la concentrazione massima, occorre fornire, nella relazione di studio, una spiegazione e dati giustificativi. Se la concentrazione massima raggiungibile per un vapore non comporta tossicità, può essere necessario produrre la sostanza in esame sotto forma di aerosol liquido.

Studio principale: Protocollo C × t

39.

La concentrazione iniziale (sessione di esposizione I) (appendice 1) testata nello studio principale è una concentrazione limite o una concentrazione scelta dal responsabile dello studio in base allo studio di osservazione. Se nel corso o successivamente alla sessione di esposizione I si riscontrano casi di mortalità, l’esposizione minima (C × t) che ha provocato la mortalità funge da parametro per stabilire la concentrazione e i periodi di esposizione per la sessione di esposizione II. Ciascuna sessione di esposizione successiva dipenderà dalla sessione precedente (cfr. appendice 1).

40.

Per molte sostanze i risultati ottenuti alla concentrazione iniziale, insieme a quelli ottenuti nelle tre sessioni di esposizione supplementari su una scala temporale più corta (la durata dei periodi di esposizione successivi secondo una progressione geometrica di fattore √2), sono sufficienti per stabilire il rapporto di mortalità C × t (15), anche se può essere utile ricorrere ad una quinta concentrazione di esposizione [cfr. appendice 1 e documento di orientamento n. 39 (2)]. Per il trattamento matematico dei risultati per il protocollo C × T, cfr. appendice 1.

OSSERVAZIONI

41.

Durante il periodo di esposizione è necessario eseguire frequenti esami clinici degli animali. Dopo l’esposizione, l’esame clinico va effettuato almeno due volte il giorno stesso dell’esposizione, o più spesso a seconda della risposta degli animali al trattamento, e almeno una volta al giorno nei successivi 14 giorni. Il periodo di osservazione non ha durata fissa, in quanto dipende dalla natura dei segni clinici, dal momento della loro comparsa e dalla durata del periodo di recupero. Un elemento importante è rappresentato dal momento della comparsa e della scomparsa dei segni di tossicità, soprattutto se negli animali è rilevabile una tendenza a manifestare segni di tossicità tardiva. Tutte le osservazioni vanno registrate sistematicamente e riportate singolarmente per ciascun animale. Gli animali moribondi o che manifestano dolore intenso e/o segni di sofferenza grave e persistente devono essere sottoposti a eutanasia, per ragioni legate al loro benessere. Occorre fare attenzione, quando si effettuano gli esami clinici alla ricerca di segni di tossicità, a non confondere un cattivo aspetto iniziale e alterazioni respiratorie passeggere, imputabili al procedimento di esposizione, con la tossicità delle sostanze in esame che richiederebbe un’uccisione prematura degli animali. Si devono tenere in considerazione i principi e i criteri riassunti nel documento di orientamento OCSE (19) citato in bibliografia al punto (7). Nel caso di animali sottoposti a eutanasia o rinvenuti morti, il momento del decesso deve essere registrato con la massima precisione possibile.

42.

Si osserveranno eventuali alterazioni della cute e del pelo, degli occhi e delle mucose, del sistema respiratorio e circolatorio, del sistema nervoso autonomo e centrale, dell’attività somatomotoria e del comportamento. Si annoterà, laddove possibile, l’eventuale differenziazione tra gli effetti locali e sistemici. Particolare attenzione deve essere rivolta all’osservazione di tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma. La misura della temperatura rettale può corroborare una bradipnea riflessa o un’ipo/ipertermia causate dal trattamento o dal confinamento.

Peso corporeo

43.

Il peso di ciascun animale è rilevato e annotato una volta durante il periodo di adattamento, il giorno dell’esposizione, prima che questa abbia inizio (giorno 0), e almeno nei giorni 1, 3 e 7 (e successivamente una volta la settimana), così come al momento del decesso o dell’eutanasia, se posteriore al giorno 1. Il peso corporeo è manifestamente uno degli indici fondamentali di tossicità, pertanto gli animali che mostrano un calo ≥ 20 % rispetto al peso anteriore allo studio devono essere monitorati attentamente. Alla fine del periodo post esposizione si pesano e si sottopongono a eutanasia gli animali sopravvissuti.

Patologia

44.

Tutti gli animali utilizzati (compresi quelli che muoiono nel corso della prova o che sono sottoposti a eutanasia e ritirati dallo studio per motivi legati al loro benessere) devono essere sottoposti a autopsia macroscopica. Se non è possibile eseguire l’autopsia subito dopo il rilevamento del decesso, l’animale deve essere refrigerato (non congelato) ad una temperatura sufficientemente bassa da ridurre al minimo l’autolisi. L’autopsia deve essere eseguita non appena possibile, di norma entro un giorno o due dal decesso. Per ogni animale si annoteranno tutte le alterazioni patologiche macroscopiche, prestando particolare attenzione a quelle delle vie respiratorie.

45.

È possibile effettuare altri esami previamente inclusi nel disegno sperimentale, per ampliare il valore interpretativo dello studio, quali, ad esempio, la determinazione del peso polmonare nei ratti sopravvissuti e/o la ricerca, per esame microscopico, di irritazioni delle vie respiratorie. Si possono anche esaminare gli organi che mostrano macropatologie negli animali che sopravvivono più di 24 ore, così come gli organi per i quali si ha la certezza o il sospetto che siano stati colpiti. L’esame microscopico dell’intero apparato respiratorio può fornire informazioni utili sulle sostanze in esame che reagiscono con l’acqua, come gli acidi e le sostanze chimiche igroscopiche.

DATI E RELAZIONE

Dati

46.

Si devono indicare il peso corporeo e i risultati dell’autopsia per ciascun animale. I dati degli esami clinici devono essere riassunti in una tabella indicante, per ogni gruppo sottoposto alla prova, il numero di animali utilizzati, il numero di animali che hanno manifestato segni specifici di tossicità, il numero di animali rinvenuti morti durante la prova o sottoposti a eutanasia, il momento del decesso di ciascun animale, la descrizione degli effetti tossici con indicazioni sul decorso e sulla reversibilità, e l’esito dell’autopsia.

Relazione sulla prova

47.

La relazione deve contenere le seguenti informazioni, a seconda dei casi:

 

Animali sperimentali e condizioni di allevamento:

descrizione delle condizioni di stabulazione, tra cui: numero (o modifica del numero) di animali per gabbia, materiale utilizzato per la lettiera, temperatura ambiente e umidità relativa, fotoperiodo e dieta,

specie/ceppo utilizzati e giustificazione dell’impiego di specie diverse dal ratto,

numero, età e sesso degli animali,

metodo di randomizzazione,

dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua (compresi tipo/origine della dieta e origine dell’acqua),

descrizione dell’eventuale condizionamento prima della prova, in particolare per quanto concerne dieta, quarantena e terapie.

 

Sostanza chimica in esame:

natura fisica, purezza e, se del caso, proprietà fisico-chimiche (compresa l’isomerizzazione),

dati di identificazione e numero CAS (Chemical Abstract Services), se noto.

 

Veicolo:

motivazione dell’utilizzo di un veicolo e giustificazione della scelta del veicolo utilizzato (se diverso dall’acqua),

dati storici o paralleli che dimostrano che il veicolo non interferisce con i risultati dello studio.

 

Camera di inalazione:

descrizione della camera di inalazione, che includa le dimensioni e il volume,

provenienza e descrizione delle apparecchiature utilizzate per l’esposizione degli animali e per la generazione dell’atmosfera,

apparecchi di misurazione della temperatura, dell’umidità, della granulometria e della concentrazione reale,

fonte dell’aria, trattamento dell’aria immessa/estratta e sistema di climatizzazione utilizzato,

metodi utilizzati per tarare l’apparecchiatura al fine di garantire l’omogeneità dell’atmosfera di prova,

differenza di pressione (positiva o negativa),

bocchette di esposizione per camera (“a naso solo”); ubicazione degli animali nel sistema (camera di esposizione “a corpo intero”),

omogeneità/stabilità nel tempo dell’atmosfera di prova,

ubicazione dei sensori termometrici e igrometrici e dei punti di campionamento dell’atmosfera di prova nella camera,

velocità del flusso d’aria, velocità del flusso d’aria in ogni bocchetta di esposizione (“a naso solo”) o rapporto tra il volume occupato dagli animali e il volume della camera (“a corpo intero”),

informazioni sull’apparecchiatura utilizzata per misurare l’ossigeno e il diossido di carbonio, se applicabile,

tempo necessario per raggiungere l’equilibrio nella camera (t95),

numero di ricambi del volume per ora,

dosatori (se applicabile).

 

Dati sull’esposizione:

giustificazione della scelta della concentrazione bersaglio dello studio principale,

concentrazioni nominali (ottenute dividendo la massa della sostanza in esame immessa nella camera d’inalazione per il volume dell’aria fatta circolare nella camera),

concentrazioni reali ottenute nella zona in cui respirano gli animali; per le miscele in esame che producono forme fisiche eterogenee (gas, vapori, aerosol), si può analizzare separatamente ciascuna di esse,

esprimere le concentrazioni atmosferiche in unità di massa (ad esempio, mg/l, mg/m3 ecc.), indicando facoltativamente tra parentesi le unità di volume (ad esempio, ppm, ppb ecc.),

distribuzione delle dimensioni delle particelle, diametro aerodinamico mediano di massa (DAMM) e deviazione standard geometrica (σg), con relativi metodi di calcolo; devono essere indicate anche le singole analisi granulometriche.

 

Condizioni sperimentali

ragguagli sulla preparazione della sostanza chimica in esame, precisando le eventuali procedure impiegate per ridurre la granulometria delle sostanze solide o per preparare soluzioni della sostanza in esame. Qualora i processi meccanici abbiano alterato la composizione della sostanza, includere i risultati delle analisi eseguite per verificare la composizione,

descrizione (di preferenza corredata di uno schema) dell’apparecchiatura utilizzata per generare l’atmosfera sperimentale e per esporvi gli animali,

ragguagli sul metodo d’analisi chimica impiegato e sulla convalida di tale metodo (specificando l’efficienza di recupero della sostanza in esame dal mezzo campionato),

giustificazione della scelta delle concentrazioni sperimentali.

 

Risultati

tabella con la temperatura, l’umidità e il flusso d’aria nella camera,

tabella con le concentrazioni nominali e reali nella camera,

tabella con i dati granulometrici, ivi compresi i dati analitici sul campionamento, sulla distribuzione granulometrica e i calcoli del DAMM e della σg,

tabella con i dati sulle risposte e il livello di concentrazione per ciascun animale (vale a dire animali che manifestano segni di tossicità, mortalità compresa, natura, gravità, inizio e durata degli effetti),

peso corporeo di ciascun animale oggetto dello studio; data e ora della morte se avviene prima dell’eutanasia prevista, momento dell’insorgenza e evoluzione dei segni di tossicità e, se del caso, loro reversibilità,

reperti necroscopici ed eventuali reperti istopatologici per ciascun animale,

stime della letalità (CL50, DL01), con limiti di confidenza del 95 % e inclinazione (se fornita dal metodo di valutazione),

relazione statistica, ivi compresa la stima del fattore n (per il protocollo C × t). Occorre fornire il nome del software statistico utilizzato.

 

Discussione e interpretazione dei risultati

dare particolare importanza alla descrizione dei metodi impiegati per soddisfare i criteri del presente metodo di prova, ad esempio per quanto concerne la concentrazione limite o la granulometria,

esaminare la respirabilità delle particelle alla luce dei risultati complessivi, in special modo se i criteri granulometrici non sono stati soddisfatti,

spiegare perché è stato necessario sottoporre ad eutanasia animali che manifestavano dolore intenso e/o segni di sofferenza grave e persistente, in base ai criteri illustrati nel documento di orientamento dell’OCSE citato in bibliografia al punto (8),

se una prova in base al capitolo B.52 del presente allegato (4) ha dovuto essere interrotta in favore del presente metodo B.2 occorre spiegare il motivo,

nella valutazione globale dello studio, occorre tener conto della coerenza dei metodi utilizzati per determinare le concentrazioni nominali e reali e del rapporto tra loro,

occorre esaminare la causa probabile di decesso e il meccanismo d’azione prevalente (sistemico o locale).

BIBLIOGRAFIA:

(1)

OCSE (2009). Determinazione della tossicità acuta per inalazione. Linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 403, OCSE, Parigi. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguidelines

(2)

OCSE (2009). Documento di orientamento per la determinazione della tossicità acuta per inalazione. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OCSE, Parigi. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguidelines

(3)

Regolamento (CE) n. 1272/2008 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 16 dicembre 2008, relativo alla classificazione, all’etichettatura e all’imballaggio delle sostanze e delle miscele che modifica e abroga le direttive 67/548/CEE e 1999/45/CE e che reca modifica al regolamento (CE) n. 1907/2006 (GU L 353 del 31.12.2008, pag. 1).

(4)

Capitolo B.52 del presente allegato. Tossicità acuta per inalazione — Metodo della classe di tossicità acuta.

(5)

Capitolo B.40 del presente allegato, Corrosione cutanea in vitro: Test di resistenza elettrica transcutanea (TER).

(6)

Capitolo B.40 bis testguidelines del presente allegato, Corrosione cutanea in vitro: Test su modelli di pelle umana.

(7)

OCSE (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. Linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 435 OCSE, Parigi. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguidelines

(8)

OCSE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OCSE, Parigi. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguidelines

(9)

SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Appl. Toxicol. Toxicol. 18: 321-327.

(10)

Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.

(11)

Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167.

(12)

Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.

(13)

Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.

(14)

Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71.

(15)

OCSE (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C x t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OCSE, Parigi. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguidelines

(16)

Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, Londra/New York.

DEFINIZIONE

Sostanza chimica in esame: Qualsiasi sostanza o miscela testata seguendo il presente metodo di prova.

Appendice 1

Protocollo C × t

1.

Uno studio sequenziale “concentrazione × tempo” (C × t) può costituire un’alternativa al protocollo tradizionale quando si tratta di valutare la tossicità per inalazione (12) (13) (14). Va eseguito di preferenza quando sussiste una particolare esigenza normativa o scientifica che richiede prove su animali per varie durate di esposizione, ad esempio per la pianificazione della risposta di emergenza o la pianificazione territoriale. Si inizia solitamente con una prova alla concentrazione limite (sessione di esposizione I) nel corso della quale gli animali sono esposti alla sostanza in esame per cinque durate diverse (ad esempio 15, 30, 60, 120 e 240 minuti) in modo da ottenere varie durate di esposizione nel corso di una stessa sessione (cfr. figura 1). Quando si utilizza il regolamento (CE) n. 1272/2008, le concentrazioni limite per i gas, i vapori e gli aerosol sono rispettivamente di 20 000 ppm, 20 mg/l e 5 mg/l. Questi livelli possono essere superati solo se esistono motivi di carattere normativo o scientifico per effettuare delle prove a questi livelli di concentrazione (cfr. paragrafo 37 del capitolo B.2).

2.

Qualora si abbiano poche o nessuna informazione sulla tossicità della sostanza in esame, occorre seguire uno studio di osservazione in cui gruppi di almeno tre animali per sesso sono esposti a concentrazioni bersaglio selezionate dal responsabile dello studio, di norma per 240 minuti.

3.

Se nel corso della sessione di esposizione I è saggiata una concentrazione limite e si osserva una mortalità inferiore al 50 %, non occorre effettuare prove aggiuntive. Se, per motivi regolamentari o scientifici, occorre stabilire la relazione concentrazione/tempo/reazione per livelli più elevati rispetto alla concentrazione limite indicata, l’esposizione successiva è effettuata, ad esempio, al doppio della concentrazione limite (2L nella figura 1).

4.

Se, alla concentrazione limite, viene osservata una tossicità, sono necessarie prove aggiuntive (studio principale). Queste esposizioni aggiuntive sono effettuate a concentrazioni inferiori (figura 1: sessioni di esposizione II, III o IV) o a concentrazioni superiori per periodi più brevi (figura 1: sessione di esposizione IV) adeguati e meno distanziati.

5.

La prova (concentrazione iniziale e concentrazioni aggiuntive) è realizzata con 1 animale di ciascun sesso per punto concentrazione/tempo o con due animali del sesso più sensibile alla sostanza in esame per punto concentrazione/tempo. Il responsabile dello studio, in determinate circostanze, può decidere di utilizzare 2 ratti di ciascun sesso per punto concentrazione/tempo (o 4 animali del sesso più sensibile per punto concentrazione/tempo) (15). L’utilizzo di 2 animali per sesso, per punto di concentrazione e di tempo generalmente riduce le distorsioni e la variabilità delle stime, aumenta il tasso di precisione delle stime e migliora la copertura dell’intervallo di confidenza legato al presente protocollo. Ulteriori informazioni sono riportate nel documento di orientamento n. 39 (2).

6.

Idealmente ciascuna sessione di esposizione è effettuata in una sola giornata. Ciò consente di ritardare l’esposizione successiva fino a quando non si abbia la ragionevole certezza che gli animali già sottoposti alla prova siano sopravvissuti e permette al responsabile dello studio di adattare la concentrazione e la durata per la successiva sessione di esposizione. È consigliabile iniziare ogni sessione di esposizione con il gruppo che sarà esposto più a lungo, ossia il gruppo destinato ad un’esposizione di 240 minuti, seguito dal gruppo di 120 minuti e via dicendo. Se, ad esempio, gli animali del gruppo di 240 minuti dopo 90 minuti iniziano a morire o mostrano segni evidenti di tossicità (ad esempio variazioni estreme nel pattern respiratorio come la respirazione difficoltosa), non avrebbe senso esporre un gruppo per 120 minuti perché la mortalità sarebbe probabilmente del 100 %. In tal caso il responsabile dello studio deve optare per durate di esposizione più brevi per la concentrazione in questione (ad esempio, 90, 65, 45, 33 e 25 minuti).

7.

La concentrazione nella camera deve essere misurata spesso per determinare la concentrazione media ponderata per il tempo per ogni durata di esposizione. Laddove possibile, nell’analisi statistica occorre utilizzare l’orario della morte di ciascun animale (più che la durata di esposizione).

8.

Occorre esaminare i risultati delle quattro prime sessioni di esposizione per individuare gli eventuali dati mancanti nella curva concentrazione-tempo (cfr. figura 1). Se mancano dei dati, si può realizzare un’esposizione supplementare (5a concentrazione). La concentrazione e le durate di esposizione di questa 5a esposizione sono scelte per colmare questa lacuna.

9.

Tutte le sessioni di esposizione (ivi compresa la prima) sono utilizzate per calcolare il rapporto concentrazione-tempo-risposta mediante un’analisi statistica (16). Se possibile, per ciascun intervallo C × t si utilizzerà la concentrazione media ponderata in funzione del tempo e la durata di esposizione fino alla morte (se questa si verifica nel corso dell’esposizione).

Figura 1

Illustrazione ipotetica di un rapporto concentrazione-tempo-mortalità nei ratti

Image

Simboli vuoti = animali sopravissuti. Simboli pieni = animali morti

Triangoli = femmine; Cerchi = maschi

Linea piena = valori di CL50 (da 7,5 a 240 min.) per i maschi n = 1

Linea tratteggiata = valori di CL50 (da 7,5 a 240 min.) per le femmine n = 1

Linee punteggiate = valori della CL50 ipotetica per i maschi e le femmine se n fosse stato pari a 2 (12).

Legenda

Concentrazione:

Tempo di esposizione:

10.

Qui di seguito è riportato un esempio della procedura per fasi:

Sessione di esposizione I —   Prova alla concentrazione limite (cfr. figura 1)

1 animale/sesso per punto concentrazione/tempo, 10 animali in tutto (2)

Concentrazione bersaglio (3) = concentrazione limite

Esporre cinque gruppi di animali a questa concentrazione bersaglio per, rispettivamente, 15, 30, 60, 120 e 240 minuti.

Sessione di esposizione II  (4)    Studio principale

1 animale/sesso per punto concentrazione/tempo, 10 animali in tutto

Esporre cinque gruppi di animali ad una concentrazione inferiore (5) (1/2L) per durate di esposizione leggermente più lunghe (spaziatura di √2; cfr. figura 1).

Sessione di esposizione III —   Studio principale

1 animale/sesso per punto concentrazione/tempo, 10 animali in tutto

Esporre cinque gruppi di animali ad una concentrazione inferiore (5) (1/4L) per durate di esposizione leggermente più lunghe (spaziatura di √2; cfr. figura 1).

Sessione di esposizione IV’ —   Studio principale

1 animale/sesso per punto concentrazione/tempo; 10 animali in tutto

Esporre cinque gruppi di animali ad una concentrazione inferiore (5) (1/8L) per durate di esposizione leggermente più lunghe (spaziatura di √2; cfr. figura 1).

oppure

Sessione di esposizione IV —   Studio principale

1 animale/sesso per punto concentrazione/tempo; 10 animali in tutto

Esporre cinque gruppi animali ad una concentrazione superiore (6) (2L) per durate di esposizione leggermente più brevi (spaziatura di √2; cfr. figura 1).

Trattamento matematico dei risultati per il protocollo C × t

11.

Una procedura C × t costituita da 4 o 5 concentrazioni di esposizione e 5 durate di esposizione genera 20 o 25 valori, rispettivamente. Con questi valori, la relazione C × t può essere calcolata con un’analisi statistica (16):

Equazione 1:

Formula

in cui C = concentrazione; t = durata di esposizione, o

Equazione 2:

Formula

in cui Formula

Con l’equazione 1, il valore CL50 può essere calcolato per un determinato periodo di tempo (ad esempio 4 ore, 1 ora, 30 minuti, o qualsiasi altro periodo compreso nell’intervallo dei periodi testati) utilizzando P = 5 (50 % di risposta). La regola di Haber si applica solo quando n = 1. La CL01 può essere calcolata con P = 2,67.

»

4)

i capitoli B.7 e B.8 sono sostituiti dal capitolo seguente:

«B.7.   TOSSICITÀ A DOSE RIPETUTA (28 GIORNI) PER VIA ORALE NEI RODITORI

INTRODUZIONE

1.

Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 407 (2008). La prima linea guida n. 407 è stata adottata nel 1981. Nel 1995 è stata adottata una versione rivista per ottenere informazioni aggiuntive dagli animali utilizzati nello studio, in particolare in materia di neurotossicità e immunotossicità.

2.

Nel 1998 l’OCSE ha avviato un’attività prioritaria relativa alla revisione delle linee guida esistenti e all’elaborazione di nuove linee guida per lo screening e le prove dei potenziali interferenti endocrini (8). Uno degli obiettivi era aggiornare la linea guida dell’OCSE n. 407 “Tossicità a dose ripetuta (28 giorni) per via orale nei roditori” introducendo dei parametri adatti per l’individuazione dell’attività endocrina delle sostanze in esame. Questo protocollo è stato sottoposto a un programma internazionale mirante a valutare la pertinenza e la praticabilità dei parametri addizionali, la prestazione di questi parametri per le sostanze chimiche con attività (anti)estrogenica, (anti)androgenica e (anti)tiroidea, la loro riproducibilità intra e inter-laboratori e la loro interferenza con i parametri richiesti dalla versione precedente della linea guida n. 407. I numerosi dati ottenuti sono stati raccolti e valutati attentamente in una relazione esaustiva dell’OCSE (9). Il presente metodo di prova B.7 (equivalente alla linea guida n. 407) è frutto dell’esperienza e dei risultati ottenuti nel corso del programma internazionale di prova. Consente di contestualizzare alcuni effetti endocrino-mediati con altri effetti tossicologici.

CONSIDERAZIONI INIZIALI E LIMITI

3.

Nella valutazione e nell’esame delle caratteristiche tossiche di una sostanza chimica è possibile determinare la tossicità orale utilizzando dosi ripetute dopo aver ottenuto dati preliminari sulla tossicità mediante test di tossicità acuta. Il presente metodo di prova mira a studiare gli effetti su una gamma molto ampia di potenziali bersagli di tossicità. Fornisce informazioni sui potenziali rischi per la salute che un’esposizione ripetuta può comportare in un arco di tempo relativamente limitato, tra cui gli effetti sul sistema nervoso, immunologico ed endocrino. In relazione a questi endpoint specifici, il metodo deve consentire di individuare le sostanze chimiche potenzialmente neurotossiche che potrebbero giustificare studi più approfonditi di questo aspetto, e le sostanze chimiche che interferiscono con la fisiologia della tiroide. Questo metodo può inoltre fornire dati sulle sostanze chimiche che incidono sugli organi riproduttivi maschili e/o femminili dei giovani animali adulti, evidenziando anche eventuali effetti immunologici.

4.

I risultati del metodo di prova B.7 devono essere utilizzati per individuare i pericoli e valutare i rischi. I risultati ottenuti per quanto riguarda i parametri endocrini devono essere interpretati alla luce del “Quadro concettuale dell’OCSE per le prove e la valutazione delle sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino” (11). Il metodo prevede uno studio di base della tossicità a dosi ripetute che può essere utilizzato per le sostanze chimiche per le quali uno studio di 90 giorni non si giustifica (ad esempio quando il volume di produzione non supera determinate quantità) o prima di uno studio a lungo termine. Il periodo di esposizione deve essere di 28 giorni.

5.

Il programma internazionale realizzato per la convalida di parametri in grado di individuare l’attività endocrina di una sostanza in esame ha evidenziato che la qualità dei dati ottenuti con questo metodo di prova dipende in ampia misura dall’esperienza del laboratorio che effettua le prove. Ciò vale soprattutto per la determinazione istopatologica di cambiamenti ciclici negli organi riproduttori femminili e la determinazione del peso dei piccoli organi ormono-dipendenti che sono difficili da dissecare. È stato messo a punto un documento di orientamento sull’istopatologia (19), che è disponibile sul sito dell’OCSE nella rubrica relativa alle linee guida per le prove sulle sostanze chimiche. Il documento è destinato ad aiutare i patologi nelle loro analisi e a migliorare la sensibilità delle prove. Nel metodo di prova sono stati integrati svariati parametri indicativi di una tossicità per il sistema endocrino. Gli endpoint per i quali non sono disponibili dati sufficienti a dimostrane l’utilità o che, nell’ambito del programma di convalida, hanno dimostrato una scarsa capacità di individuare gli interferenti endocrini sono proposti come endpoint opzionali (cfr. appendice 2).

6.

Sulla base dei dati generati nel corso del processo di validazione, occorre sottolineare che la sensibilità di questo saggio non è sufficiente per individuare tutte le sostanze caratterizzate da un’attività (anti)androgenica o (anti)estrogenica (9). Il presente metodo di prova deve essere eseguito in una fase della vita estremamente sensibile alle interferenze endocrine. Tuttavia questo metodo ha permesso, nel corso del processo di convalida, di individuare delle sostanze con un forte o un debole impatto sulla funzione tiroidea e delle sostanze che agiscono fortemente o in misura ridotta sul sistema endocrino mediante recettori dell’estrogeno o dell’androgeno; nella maggior parte dei casi, tuttavia, non ha consentito di individuare le sostanze con effetti endocrini che incidono in misura limitata su questi recettori. Questo metodo non può pertanto essere descritto come prova di screening dell’attività endocrina.

7.

Di conseguenza l’assenza di effetti legati a questi meccanismi di azione non può essere considerata una prova dell’assenza di effetti sul sistema endocrino. Per quanto riguarda gli effetti endocrini-mediati, la caratterizzazione delle sostanze non deve basarsi unicamente sui risultati del presente metodo di prova ma deve essere utilizzata nell’ambito di un approccio fondato sull’“onere della prova” che integri tutti i dati esistenti su una sostanza chimica per caratterizzarne la potenziale attività endocrina. Per questa ragione, le decisioni di tipo regolamentare relative all’attività endocrina delle sostanze chimiche (caratterizzazione dei composti) devono avvalersi di un approccio di ampio respiro, e non fondarsi solo sui risultati di questo metodo di prova.

8.

Naturalmente tutte le procedure che prevedono l’utilizzo di animali rispetteranno le norme locali in materia di cura degli animali. Le descrizioni delle cure e dei trattamenti riportate qui di seguito corrispondono a norme di prestazione minime che, se del caso, sono sostituite dalla regolamentazione locale, qualora questa sia più rigorosa. Ulteriori indicazioni sul trattamento umano degli animali sono fornite dall’OCSE (14).

9.

L’appendice 1 contiene le definizioni di termini utili ai fini del presente metodo.

PRINCIPIO DELLA PROVA

10.

Ogni giorno, per un periodo di 28 giorni, si somministra per via orale la sostanza in esame in dosi crescenti a vari gruppi di animali da esperimento, laddove ad ogni gruppo corrisponde un determinato livello di dose. Durante il periodo di somministrazione gli animali vengono esaminati attentamente e quotidianamente al fine di rilevare eventuali segni di tossicità. Gli animali deceduti o oggetto di eutanasia durante la prova vengono sottoposti a autopsia. Al termine della prova gli animali superstiti vengono soppressi e sottoposti a autopsia. Uno studio a 28 giorni fornisce informazioni sugli effetti di un’esposizione ripetuta per via orale e può dimostrare la necessità di condurre ulteriori studi a più lungo termine. Può inoltre fornire informazioni sulla selezione delle concentrazioni in vista di studi a più lungo termine. I dati tratti dal metodo di prova devono permettere di caratterizzare la tossicità della sostanza in esame, avere un’indicazione sul rapporto dosaggio-risposta e determinare il NOAEL (no-observed-adverse effects — livello fino al quale non si osservano effetti dannosi).

DESCRIZIONE DEL METODO

Selezione delle specie animali

11.

Il ratto è la specie preferita, ma sono ammesse anche altre specie di roditori. Se i parametri specificati nel metodo di prova B.7 sono studiati in un’altra specie di roditori occorre fornire una giustificazione dettagliata. Benché dal punto di vista biologico sia plausibile che altre specie rispondano ai prodotti tossici in modo simile ai ratti, l’utilizzo di specie più piccole può causare una maggiore variabilità dei risultati vista la difficoltà tecnica a sezionare organi di dimensioni inferiori. Nel programma internazionale di convalida per l’individuazione degli interferenti endocrini, il ratto è stata l’unica specie animale utilizzata. Si devono utilizzare animali adulti giovani e sani appartenenti a ceppi comunemente usati in laboratorio. Le femmine devono essere nullipare e non gravide. La somministrazione deve iniziare il più presto possibile dopo lo svezzamento e comunque prima che gli animali abbiano raggiunto le nove settimane di vita. All’inizio dello studio la variazione di peso degli animali deve essere minima e non superare il ± 20 % del peso medio per ciascun sesso. Se uno studio di tossicità orale a dose ripetuta costituisce una tappa preliminare di uno studio a lungo termine, si utilizzano di preferenza animali provenienti dallo stesso ceppo e aventi la medesima origine in entrambi gli studi.

Stabulazione e alimentazione

12.

Tutte le procedure devono attenersi agli standard locali in materia di cura degli animali da esperimento. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 oC (± 3 oC). L’umidità relativa deve essere almeno del 30 % e preferibilmente non superiore al 70 %, tranne durante la pulizia del laboratorio, ma l’obiettivo da raggiungere è un’umidità del 50-60 %. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità. Per quanto concerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata d’acqua potabile. La scelta della dieta può essere influenzata dalla necessità di garantire un’adeguata miscela della sostanza in esame, se somministrata con questo metodo. Gli animali devono essere sistemati nelle gabbie in piccoli gruppi dello stesso sesso; possono essere sistemati in gabbie individuali se necessario per ragioni scientifiche. Ciascuna gabbia non deve ospitare più di cinque animali.

13.

L’alimentazione deve essere analizzata periodicamente per verificare la presenza di contaminanti. Un campione del mangime somministrato deve essere conservato fino al completamento della relazione.

Preparazione degli animali

14.

Gli animali adulti, sani e giovani vengono suddivisi a caso in gruppi di controllo e di trattamento. Le gabbie devono essere sistemate in modo da ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla loro collocazione. Gli animali devono essere identificati in modo univoco e tenuti nelle gabbie per almeno 5 giorni prima dell’inizio dello studio, in modo da consentirne l’adattamento alle condizioni di laboratorio.

Preparazione delle dosi

15.

La sostanza di prova viene somministrata per via intragastrica, oppure con la dieta o l’acqua. Il metodo di somministrazione orale dipende dallo scopo dello studio e dalle caratteristiche fisiche/chimiche/tossico-cinetiche della sostanza in esame.

16.

Ove necessario, la sostanza di prova è disciolta o sospesa in un veicolo adeguato. Si raccomanda di prendere in considerazione, in primis e ogni qualvolta possibile, l’uso di una soluzione/sospensione acquosa, e in seconda battuta l’uso di una soluzione/sospensione in olio (ad esempio olio di semi di mais) e infine la possibile soluzione in altri veicoli. Se si usano veicoli diversi dall’acqua è necessario conoscerne le caratteristiche tossiche. È necessario determinare la stabilità della sostanza di prova nel veicolo.

PROCEDURA

Numero e sesso degli animali

17.

Per ciascun livello di dosaggio dovranno essere utilizzati almeno 10 animali (5 di sesso femminile e 5 di sesso maschile). Se si prevedono sacrifici intermedi, il numero deve essere aumentato del numero di animali che si prevede di sottoporre a eutanasia prima del completamento dello studio. Si può considerare di includere un gruppo satellite supplementare di dieci animali (5 per sesso) nel gruppo di controllo e nel gruppo trattato con la dose più elevata al fine di monitorare la reversibilità, la persistenza, l’insorgenza ritardata di effetti tossici, per almeno 14 giorni dopo il trattamento.

Dosaggio

18.

In genere si devono utilizzare almeno tre gruppi di trattamento e un gruppo di controllo; tuttavia, se la valutazione di altri dati porta a prevedere l’assenza di effetti a una dose ripetuta di 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno, può essere eseguito un saggio limite. Per stabilire le dosi da utilizzare, in mancanza di dati adeguati si può effettuare uno studio preliminare di tipo “range finding”. Fatta eccezione per la somministrazione della sostanza in esame, gli animali del gruppo di controllo devono essere trattati in modo identico agli esemplari del gruppo di trattamento. Se si usa un veicolo per la somministrazione della sostanza in esame, al gruppo di controllo verrà somministrato il medesimo veicolo nel volume massimo utilizzato.

19.

I livelli di dosaggio devono essere selezionati tenendo conto di tutti i dati esistenti sulla tossicità e le caratteristiche (tossico-)cinetiche della sostanza in esame o di sostanze affini. Il livello massimo di dosaggio deve essere tale da indurre effetti tossici senza cagionare la morte o sofferenze gravi. Deve inoltre essere selezionata una serie decrescente di dosaggi al fine di individuare eventuali risposte dosi-correlate e il livello fino al quale non si osservano effetti dannosi (NOAEL). In genere, per determinare i livelli decrescenti di dosaggio si consiglia un intervallo con un fattore compreso tra 2 e 4 e spesso è preferibile aggiungere un quarto gruppo di prova piuttosto che avere un intervallo eccessivamente lungo (ad esempio superiore a un fattore 10) fra un dosaggio e l’altro.

20.

Nel caso di tossicità generale osservata (ad esempio riduzione del peso corporeo, effetti a livello epatico, cardiaco, polmonare o renale ecc.) o di altri cambiamenti che potrebbero non essere dovuti ad effetti tossici (diminuzione dell’assunzione di alimenti, dilatazione del fegato), gli effetti rilevati sugli endpoint neurologici, endocrini o legati al sistema immunitario devono essere interpretati con cautela.

Prova limite

21.

Se una prova, effettuata secondo le procedure descritte per il presente studio, con un livello di dose di almeno 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno o in caso di somministrazione con gli alimenti o l’acqua, ad una concentrazione equivalente (in funzione del peso corporeo), non produce effetti tossici osservabili e se i dati relativi a sostanze di struttura analoga non indicano tossicità, si può considerare che non è necessario eseguire uno studio completo utilizzando tre livelli di dose. Si effettua il saggio limite, tranne quando i dati sull’esposizione umana indicano la necessità di utilizzare un livello di dose più elevato.

Somministrazione delle dosi

22.

La sostanza in esame è somministrata agli animali giornalmente, sette giorni su sette, per un periodo di 28 giorni. Se viene effettuata per via intragastrica, la somministrazione deve avvenire in dose singola mediante sonda gastrica o idonea cannula per intubazione. Il volume massimo di liquido somministrabile in una volta sola dipende dalla taglia dell’animale, ma non deve superare 1 ml/100 g di peso corporeo, tranne nel caso delle soluzioni acquose per le quali si possono prevedere fino a 2 ml/100 g di peso corporeo. Salvo nel caso di sostanze chimiche irritanti o corrosive, i cui effetti di norma tendono a esacerbarsi con l’aumentare della concentrazione, la variabilità del volume somministrato deve essere ridotta al minimo adeguando la concentrazione, in modo da mantenere un volume costante per tutti i livelli di dose.

23.

Per le sostanze somministrate con la dieta o l’acqua è importante impedire che la quantità della sostanza in esame interferisca con la normale alimentazione o il normale bilancio dei liquidi. Se la sostanza in esame è somministrata con la dieta, si può utilizzare una concentrazione costante nella dieta (ppm) o un livello di dose costante in funzione del peso corporeo di ciascun animale, avendo cura di specificare quale sia l’alternativa prescelta. Se la sostanza è somministrata per via intragastrica, la dose deve essere somministrata ogni giorno alla stessa ora e all’occorrenza modificata per mantenere costante il livello di dose rispetto al peso dell’animale. Qualora, prima di uno studio a lungo termine, si effettui uno studio preliminare a dose ripetuta, la dieta degli animali deve essere identica nei due studi.

Osservazioni

24.

Il periodo di osservazione ha una durata di 28 giorni. Gli animali del gruppo satellite destinato al monitoraggio di follow up devono essere esaminati per almeno ulteriori 14 giorni senza alcun trattamento, al fine di individuare l’insorgenza tardiva, la persistenza o la scomparsa degli effetti tossici.

25.

Le osservazioni cliniche generali devono essere effettuate almeno una volta al giorno, preferibilmente alla stessa ora e tenendo conto del periodo di massima intensità degli effetti previsti dopo la somministrazione. Si registrano le informazioni concernenti le condizioni di salute degli animali. Almeno due volte al giorno, tutti gli animali vengono esaminati al fine di determinare la morbilità e la mortalità.

26.

Una volta prima dell’esposizione iniziale (per consentire un confronto sullo stesso soggetto) e, successivamente, almeno una volta la settimana tutti gli animali vengono sottoposti ad osservazioni cliniche particolareggiate. Queste osservazioni devono essere eseguite fuori dalle gabbie, collocando gli animali in un recinto standard, di preferenza sempre alla stessa ora. Occorre registrare con cura le osservazioni, preferibilmente usando sistemi di punteggio statistico definiti appositamente dal laboratorio di prova. Si avrà cura di ridurre al minimo le variazioni delle condizioni sperimentali; le osservazioni devono essere effettuate da persone che non sono a conoscenza del trattamento somministrato. Si terrà conto, tra l’altro, di tutte le alterazioni della cute, del pelo, degli occhi, delle mucose, della comparsa di secrezioni ed escrezioni e dell’attività autonomica (per esempio lacrimazione, piloerezione, ampiezza pupillare, ritmo respiratorio insolito). Vanno inoltre registrati cambiamenti dell’andatura, della postura e della risposta alla manipolazione, nonché la presenza di movimenti clonici o tonici, stereotipie (ad esempio tolettatura eccessiva, continuo girare in cerchio) o comportamenti insoliti (ad esempio automutilazione, marcia a ritroso) (2).

27.

Nella quarta settimana di esposizione si procede alla valutazione della reattività sensoriale a diversi tipi di stimolo (2) (per esempio uditivi, visivi e propriocettivi) (3) (4) (5), della forza prensile (6) e dell’attività motoria (7). Ulteriori indicazioni sulle procedure utilizzabili sono contenute nelle voci bibliografiche citate. Tuttavia possono essere applicate procedure alternative non indicate nella bibliografia.

28.

Le osservazioni funzionali previste per la quarta settimana di esposizione possono essere evitate nel caso di uno studio preliminare ad un successivo studio subcronico (90 giorni). In questa eventualità, le osservazioni funzionali devono essere incluse nello studio complementare. D’altro canto, le informazioni ricavate dalle osservazioni funzionali nel corso dello studio a dose ripetuta possono essere utili nella determinazione dei livelli di dosaggio per un successivo studio subcronico.

29.

Eccezionalmente è possibile omettere le osservazioni funzionali per i gruppi che evidenzino comunque segni di tossicità tali da interferire in modo significativo con l’esecuzione degli esami funzionali.

30.

Nel corso dell’autopsia, si può (eventualmente) determinare il ciclo estrale per tutte le femmine mediante un Paptest. Queste osservazioni forniscono informazioni sullo stadio del ciclo estrale al momento dell’eutanasia e agevoleranno la valutazione istologica dei tessuti sensibili agli estrogeni [cfr. Linee guida sull’istopatologia (19)].

Peso corporeo e consumo di cibo/acqua

31.

Tutti gli animali devono essere pesati almeno una volta la settimana e il consumo di cibo deve essere determinato almeno una volta la settimana. Se la sostanza in esame viene somministrata con l’acqua, anche il consumo di acqua va misurato almeno una volta la settimana.

Ematologia

32.

Al termine del periodo di prova, occorre procedere agli esami ematologici seguenti: ematocrito, concentrazioni di emoglobina, conteggio degli eritrociti, reticulociti, conteggio totale e differenziale dei leucociti, numero di placchette e misura del tempo e del potenziale di coagulazione. Se la sostanza in esame o i suoi metaboliti putativi hanno o possono avere proprietà ossidanti occorre effettuare altre analisi, relative tra l’altro alla concentrazione di metaemoglobine o ai corpi di Heinz.

33.

I campioni di sangue devono essere prelevati da un determinato sito immediatamente prima o durante l’eutanasia degli animali e conservati in condizioni adeguate. Gli animali devono essere a digiuno la notte prima dell’eutanasia (7).

Biochimica clinica

34.

Gli esami biochimico-clinici finalizzati allo studio dei principali effetti tossici sui tessuti e, in particolare, sui reni e sul fegato devono essere effettuati su campioni di sangue prelevati da tutti gli animali immediatamente prima o durante la loro soppressione (eccetto gli animali trovati moribondi e/o soppressi nel corso dello studio). Le analisi sul plasma o sul siero comprenderanno il sodio, il potassio, il glucosio, il colesterolo totale, l’urea, la creatinina, le proteine totali e l’albumina, almeno due enzimi indicatori degli effetti epatocellulari (come l’alanina aminotransferasi, l’aspartato aminotransferasi, la fosfatasi alcalina, la gamma-glutamil transpeptidasi e la glutammato-deidrogenasi). Le determinazioni di altri enzimi (di origine epatica o di altro tipo) e della bilirubina possono talvolta fornire indicazioni utili.

35.

A titolo facoltativo, nel corso dell’ultima settimana dello studio, si possono effettuare le seguenti analisi delle urine su campioni raccolti in momenti specifici: aspetto, volume, osmolalità o densità relativa, pH, proteine, glucosio e sangue/cellule ematiche.

36.

È inoltre necessario considerare la possibilità di condurre studi sul plasma o sui marker sierologici dei danni generici ai tessuti. Altre determinazioni dovranno essere eseguite qualora si abbia motivo di ritenere o di sospettare che le proprietà della sostanza in esame possano alterare i profili metabolici riguardanti il calcio, il fosfato, i trigliceridi, gli ormoni specifici e la colinesterasi. Queste analisi vanno effettuate per alcune classi di sostanze chimiche oppure caso per caso.

37.

Anche se la valutazione internazionale degli endpoint legati al sistema endocrino non è riuscita a stabilire in modo chiaro il vantaggio dell’analisi degli ormoni tirodei (T3, T4) e della TSH, potrebbe essere utile conservare dei campioni di plasma o di siero per misurare la T3, la T4 e la TSH (opzionale) se vi sono indicazioni di un effetto sull’asse ipofiso-tiroideo. Per lo stoccaggio questi campioni possono essere congelati a - 20°. I fattori seguenti possono influenzare la variabilità e le concentrazioni assolute delle analisi ormonali:

momento dell’eutanasia, per via della variazione diurna delle concentrazioni ormonali,

metodi di eutanasia, evitando di stressare inutilmente gli animali in quanto ciò potrebbe incidere sulle concentrazioni ormonali,

kit per le analisi ormonali che possono differire per le loro curve standard.

L’identificazione definitiva delle sostanze chimiche che agiscono sul sistema tiroideo è più affidabile se si fonda sull’analisi istopatologica più che sui livelli ormonali.

38.

I campioni di plasma destinati specificatamente all’analisi ormonale devono essere prelevati nelle stesse ore della giornata. Si raccomanda di tenere conto dei tassi di T3, T4 e TSH provocati da alterazioni dell’istopatologia della tiroide. I valori numerici ottenuti dalle analisi delle concentrazioni ormonali differiscono in funzione dei kit disponibili in commercio utilizzati. Pertanto non è sempre possibile fornire criteri di prestazione fondati su dati storici omogenei. In alternativa, i laboratori devono fare il possibile per mantenere i coefficienti di variazione al di sotto di 25 per la T3 e la T4 e di 35 per la TSH. Tutte le concentrazioni devono essere annotate in ng/ml.

39.

Se i dati di riferimento storici sono inadeguati, occorre tenere conto delle variabili ematologiche e di biochimica clinica prima di iniziare i dosaggi, di preferenza su un gruppo di animali diverso dal gruppo in esame.

PATOLOGIA

Autopsia macroscopica

40.

Tutti gli animali dello studio vanno sottoposti ad un’autopsia macroscopica completa e dettagliata che comprenda un attento esame della superficie esterna del corpo, di tutti gli orifizi e delle cavità cranica, toracica e addominale e del loro contenuto. Il fegato, i reni, le ghiandole surrenali, i testicoli, gli epididimi, l’insieme composto dalla prostata e le vescicole seminali con le ghiandole della coagulazione, il timo, la milza, il cervello e il cuore di tutti gli animali (tranne quelli trovati moribondi e/o sacrificati prima del completamento dello studio) vanno opportunamente liberati da eventuali tessuti aderenti e pesati immediatamente dopo l’ablazione, per evitare l’essiccamento. Occorre prelevare con cautela l’insieme della prostata in modo da evitare di perforare le vescicole seminali piene di liquido. In alternativa si può liberare la vescicola seminale e la prostata dai tessuti aderenti e pesarli previa fissazione.

41.

Eventualmente, per evitare il disseccamento, subito dopo la dissezione si possono pesare due altri organi: le due ovaie (peso a umido) e l’utero, ivi compreso il collo dell’utero [gli orientamenti sull’ablazione e la preparazione dei tessuti uterini ai fini del loro peso sono contenuti nella linea guida dell’OCSE n. 440 (18)].

42.

Il peso della tiroide (facoltativo) può essere stabilito dopo la fissazione. Anche in questo caso l’ablazione deve essere eseguita con cautela e solo previa fissazione per evitare di danneggiare i tessuti. L’eventuale danneggiamento dei tessuti infatti potrebbe compromettere l’analisi istopatologica.

43.

I seguenti tessuti vanno conservati nel mezzo di fissazione più appropriato sia per il tipo di tessuto, sia per l’esame istopatologico che si intende effettuare successivamente (cfr. paragrafo 47): tutte le lesioni macroscopiche, cervello (porzioni rappresentative comprendenti cervello, cervelletto, bulbo e ponte), midollo spinale, occhi, stomaco, intestino tenue e crasso (comprese le placche di Peyer), fegato, reni, ghiandole surrenali, milza, cuore, trachea e polmoni (conservati con dilatazione mediante fissativo e poi immersione), gonadi (testicoli e ovaie), organi sessuali accessori (utero e collo dell’utero, epididimi, prostata + vescicole seminali con ghiandole della coagulazione), vagina, vescica e linfonodi [oltre al linfonodo più vicino un altro linfonodo, in funzione dell’esperienza del laboratorio (15)], nervo periferico (sciatico o tibiale) preferibilmente in prossimità del muscolo, muscolo e osso dello scheletro con il midollo osseo (una sezione/o un preparato fresco di midollo osseo aspirato). Si raccomanda di fissare i testicoli mediante immersione in un fissativo di Bouin o di Davidson modificato (16) (17). La tunica albuginea deve essere perforata, con un ago, con delicatezza e superficialmente in entrambi i poli dell’organo per consentire la rapida penetrazione del fissativo. I reperti clinici e di altro tipo possono evidenziare la necessità di esaminare altri tessuti. Vanno inoltre conservati tutti gli organi considerati organi bersaglio in base alle proprietà note della sostanza in esame.

44.

I tessuti elencati qui di seguito possono apportare informazioni utili sugli effetti endocrini: gonadi (ovaie e testicoli), organi sessuali accessori (utero, collo dell’utero, epididimi, vescicole seminali con ghiandole di coagulazione, prostata dorso laterale e ventrale), vagina, ipofisi, ghiandola mammaria maschile, tiroide e ghiandola surrenale. Non ci sono sufficienti riscontri di alterazioni nelle ghiandole mammarie maschili, ma questo parametro può essere molto sensibile alle sostanze con attività estrogenica. L’osservazione degli organi/tessuti non ripresi nel paragrafo 43 è facoltativa (cfr. appendice 2).

45.

Il documento di orientamento sull’istopatologia (19) fornisce informazioni supplementari sulla dissezione, la fissazione, l’asportazione e l’istopatologia dei tessuti endocrini.

46.

Nel corso del programma internazionale di prove, è stato rilevato che gli effetti endocrini poco evidenti, dovuti a sostanze chimiche in grado di squilibrare leggermente l’omeostasi degli ormoni sessuali, possono essere individuati dalla loro capacità di interferire sulla sincronizzazione del ciclo estrale in vari tessuti più che da evidenti alterazioni istopatologiche degli organi sessuali femminili. Sebbene non vi siano prove inconfutabili in tal senso, si raccomanda di tenere conto, nell’interpretazione dell’esame istologico delle ovaie, di una possibile asincronia del ciclo estrale (cellule follicolari, tecali e della granulosa). Se si esamina la fase del ciclo mediante un Paptest, si può tenere conto anche di questo dato come elemento di confronto aggiuntivo.

Esame istopatologico

47.

Gli organi e i tessuti conservati di tutti gli animali del gruppo di controllo e del gruppo trattato con la dose più elevata vanno sottoposti a un esame istopatologico completo. Si procede a questi esami anche sugli animali degli altri gruppi se nel gruppo cui viene somministrata la dose più elevata si osservano alterazioni correlate al trattamento.

48.

Si procederà all’esame di tutte le lesioni macroscopiche.

49.

Quando si utilizza un gruppo satellite l’esame istopatologico va eseguito sui tessuti e sugli organi per i quali sono stati osservati effetti nei gruppi trattati.

DATI E RELAZIONE

Dati

50.

Devono essere riportati i dati individuali su ciascun animale. Inoltre, tutti i dati vanno riassunti sotto forma di tabelle che indichino per ogni gruppo di trattamento il numero di animali all’inizio della prova, il numero di animali trovati morti durante la prova o sottoposti a eutanasia per motivi umanitari e il momento di tutti i decessi/soppressioni, il numero di animali che manifestano segni di tossicità, una descrizione dei segni di tossicità osservati con indicazione del momento dell’insorgenza, della durata e della gravità di tutti gli effetti tossici, il numero di animali che presentano lesioni, il tipo di lesioni e la percentuale di animali che manifesta ciascun tipo di lesione.

51.

Se possibile, i risultati numerici devono essere valutati sulla base di un metodo statistico appropriato e comunemente accettato. I confronti degli effetti osservati nell’ambito di un intervallo di dosaggio deve rendere inutile l’utilizzo di prove t multiple. I metodi statistici devono essere selezionati durante la fase di progettazione dello studio.

52.

Ai fini del controllo di qualità, si suggerisce di raccogliere dati di controllo storici e di calcolare i coefficienti di variazione per i dati numerici, in particolare per i parametri legati all’individuazione degli interferenti endocrini. Questi dati possono essere utilizzati, a fini di confronto, in fase di valutazione degli studi effettivamente realizzati.

Relazione sulla prova

53.

La relazione deve contenere le seguenti informazioni:

 

Sostanza chimica in esame:

natura fisica, purezza e proprietà fisico-chimiche,

dati identificativi.

 

Veicolo (se del caso):

motivazione della scelta del veicolo, se diverso dall’acqua.

 

Animali sperimentali:

specie/ceppo impiegati,

numero, età e sesso degli animali,

provenienza, stabulazione, dieta ecc.,

peso di ciascun animale all’inizio della prova,

qualora non siano stati utilizzati ratti, occorre spiegarne il motivo.

 

Condizioni sperimentali:

criteri di selezione delle dosi,

informazioni dettagliate sulla formulazione della sostanza chimica in esame/preparazione della dieta, sulla concentrazione utilizzata, sulla stabilità e sull’omogeneità del preparato,

modalità precise di somministrazione della sostanza chimica in esame,

se del caso, conversione della concentrazione della sostanza nella dieta o nell’acqua (ppm) in dose effettiva (mg/kg di peso corporeo/giorno),

informazioni dettagliate sulla qualità degli alimenti e dell’acqua.

 

Endpoint facoltativi esaminati:

elenco degli endpoint facoltativi esaminati.

 

Risultati:

peso corporeo/variazioni del peso corporeo,

assunzione di cibo, ed eventualmente di acqua,

dati sulla risposta tossica per sesso e livello di dose, compresi segni di tossicità,

natura, gravità e durata degli effetti clinici (sia reversibili che non reversibili),

valutazione dell’attività sensoriale, della forza prensile e dell’attività motoria,

test ematologici con i relativi valori basali,

test biochimici clinici con i relativi valori basali,

peso corporeo al momento dell’eutanasia e dati sul peso degli organi,

referti autoptici,

descrizione dettagliata di tutti i risultati istopatologici,

dati sull’assorbimento, se disponibili,

elaborazione statistica dei risultati, se del caso.

 

Discussione dei risultati

 

Conclusioni

Appendice 1

DEFINIZIONI

 

Androgenicità: la capacità di una sostanza chimica di agire come un ormone androgenico naturale (ad esempio il testosterone) in un mammifero.

 

Antiandrogenicità: la capacità di una sostanza chimica di inibire l’attività di un ormone androgenico naturale (ad esempio il testosterone) in un mammifero.

 

Antiestrogenicità: la capacità di una sostanza chimica di inibire l’attività di un ormone estrogenico naturale (ad esempio estradiolo 17ß) in un mammifero.

 

Attività antitiroidea: la capacità di una sostanza chimica di inibire l’attività di un ormone tiroideo naturale (ad es T3.) in un mammifero.

 

Dosaggio: termine generale che indica la dose, la frequenza e la durata della somministrazione.

 

Dose: quantità di sostanza somministrata. La dose è espressa col peso della sostanza in esame per unità di peso corporeo dell’animale testato per giorno (mg/kg peso corporeo/giorno) o come una concentrazione costante nella dieta.

 

Tossicità evidente: termine generale che designa i segnali evidenti di tossicità a seguito della somministrazione di una sostanza. Questi segni devono essere sufficienti per consentire la valutazione dei pericoli ed essere tali che si possa prevedere che l’aumento della dose somministrata comporti la comparsa di segni di tossicità grave e probabilmente la mortalità.

 

NOAEL è l’abbreviazione di no-observed-adverse-effect level, ossia la dose più elevata alla quale non si osservano effetti avversi legati al trattamento.

 

Estrogenicità: la capacità di una sostanza chimica di agire come un ormone estrogenico naturale (ad esempio estradiolo 17ß) in un mammifero.

 

Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela testata seguendo il presente metodo di prova.

 

Attività tiroidea: la capacità di una sostanza chimica di agire come un ormone tiroideo naturale (ad es T3.) in un mammifero.

 

Validazione è un processo scientifico destinato a caratterizzare le prescrizioni e i limiti operativi di un metodo di prova e a dimostrarne l’affidabilità e la pertinenza per un obiettivo specifico.

Appendice 2

Endpoint raccomandati nel metodo di prova B.7 per l’individuazione degli interferenti endocrini

Endpoint obbligatori

Endpoint facoltativi

Peso

Testicoli

Epididimi

Ghiandole surrenali

Prostata + vescicole seminali con ghiandole della coagulazione

Ovaie

Utero, ivi compreso il collo dell’utero

Tiroide

Esame istopatologico

Gonadi:

Testicoli e

Ovaie

Organi sessuali accessori:

Epididimi,

Prostata + vescicole seminali con ghiandole della coagulazione

Utero, ivi compreso il collo dell’utero

Ghiandole surrenali

Tiroide

Vagina

Paptest

Ghiandole mammarie maschili

Ipofisi

Dosaggi ormonali

 

Livelli di T3 e T4 circolanti

Livelli di TSH circolante

BIBLIOGRAFIA

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OCSE (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.

B.8.   TOSSICITÀ SUBACUTA PER INALAZIONE: STUDIO A 28 GIORNI

SINTESI

Il presente metodo di prova rivisto B.8 è stato concepito per caratterizzare pienamente la tossicità per inalazione della sostanza in esame a seguito di un’esposizione ripetuta per un periodo di tempo limitato (28 giorni) e fornire dati per valutazioni quantitative dei rischi legati all’inalazione. Dei gruppi di roditori, composti da almeno 5 maschi e 5 femmine, sono esposti per 6 ore al giorno per 28 giorni a: a) la sostanza in esame a tre o più livelli di concentrazione; b) all’aria filtrata (controllo negativo); e/o c) al veicolo (gruppi di controllo del veicolo). Di norma gli animali sono esposti alla sostanza in esame per 5 giorni ma è possibile anche esporli 7 giorni su 7. Vengono sempre testati sia maschi che femmine, ma possono essere esposti a livelli di concentrazione diversi se uno dei due sessi è notoriamente più sensibile ad una determinata sostanza. Per caratterizzare in modo più adeguato la tossicità della sostanza in esame, il presente metodo consente al responsabile dello studio di includere dei gruppi satellite (reversibilità), lavaggio bronchioalveolare, esami neurologici e ulteriori valutazioni istopatologiche o di patologia clinica.

INTRODUZIONE

1.

Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 412 (2009). La prima linea guida dell’OCSE sulla tossicità acuta per inalazione n. 412 è stata adottata nel 1981 (1). Questo metodo di prova B.8 (che corrisponde alla linea guida n. 412 rivista) è stato aggiornato per tenere conto dei progressi scientifici e rispondere alle esigenze normative attuali e future.

2.

Il presente metodo consente di caratterizzare gli effetti avversi risultanti da un’esposizione quotidiana ripetuta, per inalazione, ad una sostanza per 28 giorni. I dati tratti da uno studio sulla tossicità subacuta per inalazione (a 28 giorni) possono essere utilizzati per le stime quantitative dei rischi [se lo studio non è seguito da una prova di tossicità subcronica per inalazione a 90 giorni (capitolo B.29 del presente allegato)]. Questi dati possono fornire informazioni che consentono di determinare le concentrazioni per studi a più lungo termine come lo studio sulla tossicità subcronica per inalazione a 90 giorni. Il presente metodo di prova non è destinato specificatamente ai test sui nanomateriali. Le definizioni usate nel contesto del presente metodo di prova sono riportate alla fine del capitolo e nel documento di orientamento n. 39 (2).

CONSIDERAZIONI INIZIALI

3.

Il laboratorio incaricato della prova deve tenere conto di tutte le informazioni disponibili sulla sostanza in esame prima di svolgere lo studio, in modo da migliorare la qualità dello studio e ridurre al minimo l’utilizzo di animali. Tre le informazioni utili per la scelta delle concentrazioni adeguate saranno considerate l’identità, la struttura chimica e le proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame, i risultati di eventuali altre prove di tossicità in vitro o in vivo; l’impiego o gli impieghi previsti per l’esposizione umana, dati (Q)SAR disponibili e dati tossicologici in merito a sostanze chimiche di struttura affine; e dati tratti da prove sulla tossicità acuta per inalazione. Se si prevedono o si constatano effetti neurotossici nel corso dello studio, il responsabile dello studio può decidere di includere le valutazioni ritenute necessarie come una serie di osservazioni funzionali (functional observational battery — fob) e la misurazione dell’attività motoria. Lo svolgimento di questi esami aggiuntivi non interferisce con l’impostazione di base dello studio, anche se la durata delle esposizioni può essere fondamentale in relazione ad alcuni esami specifici.

4.

Le diluzioni di sostanze corrosive o irritanti possono essere saggiate a concentrazioni che non consentono di conseguire il grado di tossicità auspicato [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Nell’esposizione degli animali a questa sostanze, le concentrazioni auspicate devono essere sufficientemente basse da non provocare dolore e stress intensi, pur essendo sufficienti a prolungare la curva concentrazione-risposta fino a dei livelli corrispondenti all’obiettivo scientifico e regolamentare della prova. La scelta di queste concentrazioni deve avvenire caso per caso, di preferenza in base ad uno studio di tipo “range finding” adeguatamente impostato che fornisca informazioni sull’endpoint, l’eventuale soglia di irritazione e il momento dell’insorgenza (cfr. punti da 11 a 13). Occorre fornire la giustificazione della scelta delle concentrazioni.

5.

Gli animali moribondi o chiaramente sofferenti o recanti segni gravi e persistenti di sofferenza devono essere sottoposti a eutanasia. Gli animali moribondi sono considerati alla stregua degli animali che muoiono nel corso della prova. I criteri da applicare per decidere in merito all’eutanasia degli animali moribondi o in stato di grave sofferenza sono oggetto di uno documento d’orientamento dell’OCSE, che contiene anche indicazioni su come riconoscere i segni di morte prevedibile o imminente (3).

DESCRIZIONE DEL METODO

Selezione delle specie animali

6.

Si devono utilizzare roditori adulti giovani e sani appartenenti a ceppi comunemente usati in laboratorio. La specie preferita è il ratto. In caso di utilizzo di un’altra specie è necessario motivarne la scelta.

Preparazione degli animali

7.

Le femmine devono essere nullipare e non gravide. Il giorno della randomizzazione gli animali selezionati devono essere giovani adulti di età compresa tra 7 e 9 settimane. Il loro peso corporeo non deve superare di ± 20 % del peso medio per ciascun sesso. Gli animali sono scelti in modo casuale, marchiati per consentire l’individuazione dei singoli esemplari e tenuti nelle gabbie per almeno 5 giorni prima dell’inizio della prova, affinché si adattino alle condizioni di laboratorio.

Condizioni di allevamento degli animali

8.

Gli animali devono essere identificati individualmente, possibilmente mediante dispositivi subcutanei al fine di agevolarne l’osservazione e evitare qualsiasi confusione. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 ± 3 °C. L’umidità relativa va idealmente mantenuta tra 30 e 70 %, anche se ciò potrebbe non essere possibile quando si utilizza l’acqua come veicolo. Prima e dopo l’esposizione, gli animali sono generalmente tenuti in gabbia, suddivisi per sesso e concentrazione, ma il numero di animali per gabbia non deve interferire con un’agevole osservazione di ogni singolo animale e deve ridurre al minimo le perdite dovute a cannibalismo e combattimenti. Se l’esposizione avviene “a naso solo”, potrebbe essere necessario abituarli ai dispositivi di contenzione, che non devono provocare agli animali eccessivi stress fisici, termici o dinamici. La contenzione può incidere sugli endpoint fisiologici, come la temperatura corporea (ipertermia) e/o il volume respiratorio al minuto. Se si dispone di dati generici che dimostrano che nessuna di queste alterazioni avviene a un livello apprezzabile, il periodo di adattamento ai dispositivi di contenzione non è necessario. Gli animali esposti “a corpo intero” ad un aerosol devono essere stabulati separatamente per la durata dell’esposizione per evitare che filtrino l’aerosol attraverso il pelo degli altri animali presenti nella gabbia. Salvo nei periodi di esposizione, gli animali possono essere nutriti in base a diete convenzionali e certificate da laboratorio, accompagnate da acqua potabile a volontà. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità.

Camere di inalazione

9.

La scelta della camera di inalazione dipende dalla natura della sostanza chimica in esame e dalla finalità della prova. Il metodo preferito di esposizione è quello per via nasale (con cui s’intende l’esposizione unicamente della testa, del naso o del muso). Di norma si predilige l’esposizione per via nasale per gli studi di aerosol liquidi o solidi e di vapori che si possono condensare sotto forma di aerosol. L’esposizione “a corpo intero” può essere più indicata per conseguire obiettivi di studio particolari, ma tale scelta deve essere giustificata nella relazione sullo studio. Per garantire la stabilità atmosferica di una camera di esposizione “a corpo intero”, il volume complessivo degli animali sottoposti alla prova non deve superare il 5 % del volume della camera. Il documento di orientamento n. 39 (2) descrive i principi delle tecniche di esposizione “a naso solo”e “a corpo intero”, nonché i relativi vantaggi e svantaggi.

STUDI DI TOSSICITÀ

Concentrazioni limite

10.

A differenza degli studi di tossicità acuta, per gli studi di tossicità subacuta per inalazione a 28 giorni non è definita la concentrazione massima. La concentrazione massima testata deve tenere conto di: 1) la concentrazione massima raggiungibile; 2) il livello di esposizione umana corrispondente al “peggiore dei casi”; 3) la necessità di mantenere un’adeguata alimentazione di ossigeno; e/o 4) il benessere degli animali. In assenza di limiti basati sui dati, si possono utilizzare i valori limite del regolamento (CE) n. 1272/2008 (13) (ossia una concentrazione massima di 5 mg/l per gli aerosol, di 20 mg/l per i vapori e 20 000 ppm per i gas); cfr. documento di orientamento n. 39 (2). Qualora sia necessario superare questi valori limite, per le prove con gas o sostanze fortemente volatili (ad esempio i refrigeranti), occorre giustificare questo superamento. La concentrazione limite deve provocare una chiara tossicità, senza causare stress eccessivo per gli animali né incidere sulla loro longevità (3).

Studio per la determinazione dell’intervallo di dosi (range finding)

11.

Prima di iniziare lo studio principale, occorre generalmente effettuare uno studio preliminare di tipo range finding. Uno studio di questo tipo è più completo di uno studio di osservazione perché non si limita alla scelta delle concentrazioni. Le conoscenze acquisite grazie a questo tipo di studio possono determinare il buon esito dello studio principale. Uno studio per determinare l’adeguato intervallo di dosi può, ad esempio, fornire informazioni tecniche sul metodo di analisi, la granulometria delle particelle, la scoperta di meccanismi di tossicità, i dati istopatologici e di patologia clinica e le stime circa le concentrazioni NOAEL e MTC (concentrazione massima tollerata) nello studio principale. Il responsabile dello studio può decidere di utilizzare uno studio di tipo range finding per individuare: la soglia di irritazione dell’apparato respiratorio (ad esempio mediante istopatologia dell’apparato respiratorio, test sulla funzionalità polmonare e lavaggi broncoalveolari), la concentrazione massima tollerata dagli animali senza che risentano uno stress eccessivo e i parametri che consentono di caratterizzare al meglio la tossicità della sostanza in esame.

12.

Uno studio per la determinazione degli intervalli di dose può comportare uno o più livelli di concentrazione. Per ogni livello di concentrazione sono esposti al massimo tre maschi e tre femmine. Lo studio in questione deve durare da un minimo di 5 giorni ad un massimo di 14 giorni. Nella relazione sullo studio è opportuno illustrare la ragione della scelta delle concentrazioni per lo studio principale, il cui scopo è dimostrare una relazione concentrazione-risposta sulla base dell’endpoint ritenuto a priori più sensibile La concentrazione inferiore deve essere del tipo NOAEL mentre la concentrazione più elevata deve comportare una chiara tossicità, senza causare stress eccessivo per gli animali né incidere sulla loro longevità (3).

13.

Nello studio di tipo range finding, al momento della scelta dei livelli di concentrazione, occorre tener conto di tutte le informazioni disponibili, anche quelle relative alle relazioni struttura-attività e i dati concernenti sostanze chimiche analoghe (cfr. paragrafo 3). Lo studio di determinazione dell’intervallo di dosi può confermare o invalidare la scelta degli endpoint più sensibili secondo criteri meccanicistici, come l’inibizione della colinesterasi dovuta a organofosfati, la formazione di metaemoglobine da parte di agenti eritrotossici, gli ormoni tiroidei (T3 e T4) nel caso degli agenti i tireotossici, le proteine, la LDH, la presenza di neutrofili nei lavaggi broncoalveolari nel caso di particelle inoffensive scarsamente solubili o di aerosol irritanti per i polmoni.

Studio principale

14.

Uno studio principale di tossicità subcronica di norma comprende tre livelli di concentrazione e un controllo negativo (aria) e/o un controllo del veicolo, se necessario (cfr. paragrafo 17). Per scegliere i livelli di esposizione adeguati, occorre avvalersi di tutte le informazioni disponibili, ivi compresi i risultati degli studi sistemici di tossicità, il metabolismo e la cinetica (occorre fare il possibile per evitare i livelli di concentrazione elevati caratterizzati da processi cinetici di saturazione). Ogni gruppo comprende almeno 10 roditori (5 maschi e 5 femmine) che sono esposti alla sostanza in esame per 6 ore al giorno, 5 giorni la settimana per 4 settimane (per una durata totale dello studio di 28 giorni). Gli animali possono anche essere esposti per 7 giorni la settimana (ad esempio nel caso di prove su prodotti farmaceutici inalati). Se uno dei due sessi è notoriamente più sensibile alla sostanza in esame, i livelli di concentrazione possono differire secondo il sesso al fine di ottimizzare la concentrazione-risposta come indicato al paragrafo 15. Se per l’esposizione solo per via nasale s’impiegano specie di roditori diverse dai ratti, è possibile adeguare la durata massima d’esposizione per ridurre al minimo lo stress tollerato dalla specie in causa. La scelta di una durata di esposizione inferiore a 6 ore o superiore (ad esempio 22 ore al giorno) deve essere debitamente motivata. [cfr. il documento di orientamento n. 39 (2)]. Durante il periodo di esposizione l’alimentazione va sospesa, a meno che l’esposizione quotidiana sia superiore a 6 ore. Nel corso dell’esposizione “a corpo intero” si può continuare a somministrare acqua.

15.

Le concentrazioni bersaglio selezionate devono consentire di individuare l’organo o gli organi bersaglio e evidenziare una concentrazione-risposta chiara.

Il livello di concentrazione elevato deve ridurre gli effetti tossici senza provocare segni persistenti o la morte che impedirebbero una valutazione significativa dei risultati

Il o i livelli di concentrazione medi devono essere intervallati in modo da produrre una graduazione degli effetti tossici tra la bassa e l’alta concentrazione

Il livello di dose inferiore non deve produrre effetti tossici o al massimo produrre effetti poco rilevanti.

Studio satellite (studio di reversibilità)

16.

Uno studio di reversibilità può essere utilizzato per evidenziare il carattere reversibile, persistente o ritardato della tossicità, per un periodo post-trattamento di una durata adeguata, e comunque di almeno 14 giorni. I gruppi satellite sono costituiti da cinque maschi e cinque femmine esposti contemporaneamente agli animali in esame nell’ambito dello studio principale. Questi gruppi devono essere esposti alla concentrazione più elevata della sostanza in esame. Sarebbe opportuno utilizzare anche un gruppo di controllo (aria) e/o un gruppo di controllo del mezzo (cfr. paragrafo 17).

Animali di controllo

17.

Gli animali del controllo negativo (aria) devono essere trattati come gli animali del gruppo soggetto alla prova, ad eccezione del fatto che sono esposti ad aria filtrata e non alla sostanza in esame. Quando per produrre l’atmosfera di prova si utilizza acqua o un’altra sostanza, occorre integrare nello studio un gruppo di controllo del veicolo al posto del gruppo di controllo negativo (aria). Laddove possibile è opportuno utilizzare l’acqua come veicolo. In tal caso, gli animali del gruppo di controllo devono essere esposti all’aria caratterizzata dalla stessa umidità relativa dell’aria del gruppo in esame. La selezione di un veicolo adeguato deve basarsi su dati dello studio preliminare o storici adeguati. Qualora non si disponga di informazioni sufficienti sulla tossicità di un veicolo, il responsabile dello studio può utilizzare un gruppo di controllo negativo (aria) e un gruppo di controllo del veicolo, anche se questa opzione è vivamente sconsigliata. Se i dati storici indicano che un veicolo non è tossico, non occorre ricorrere a un gruppo di controllo negativo (aria) ma basta utilizzare un gruppo di controllo del veicolo. Se uno studio preliminare effettuato su una sostanza in esame incorporata in un veicolo non rileva nessuna tossicità, significa che il veicolo non è tossico alla concentrazione in questione e che si deve utilizzare questo gruppo di controllo del veicolo.

CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE

Somministrazione delle concentrazioni

18.

Gli animali sono esposti alla sostanza in esame sotto forma di gas, vapore, aerosol o una loro miscela. Lo stato fisico da testare dipende dalle proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame, dalla concentrazione prescelta e/o dalla forma fisica nella quale è più probabile che essa si presenti nel corso della manipolazione e dell’utilizzo. Le sostanze igroscopiche e reattive dal punto di vista chimico devono essere testate in atmosfera secca. Occorre prestare attenzione al fine di evitare concentrazioni esplosive. Per ridurre la granulometria, il materiale particolato può essere sottoposto a processi meccanici. Ulteriori informazioni sono riportate nel documento di orientamento n. 39 (2).

Distribuzione granulometrica

19.

La granulometria deve essere effettuata per tutti gli aerosol e i vapori che potrebbero condensarsi e formare aerosol. Per consentire l’esposizione di tutte le zone pertinenti delle vie respiratorie, si raccomanda di utilizzare degli aerosol con diametro aerodinamico mediano di massa (DAMM) da 1 a 3 μm con una deviazione standard geometrica (σg) compresa tra 1,5 e 3,0 (4). Occorre fare quanto possibile per rispettare queste condizioni, ma qualora non ci si riuscisse è necessario presentare il parere di un esperto. Ad esempio le particelle dei fumi metallici possono essere più piccole dello standard indicato, mentre le particelle caricate e le fibre possono superare questo standard.

Preparazione della sostanza in esame in un veicolo

20.

Idealmente la sostanza deve essere testata senza un veicolo. Qualora sia necessario utilizzare un veicolo per ottenere la concentrazione e la granulometria adeguate della sostanza in esame, è preferibile utilizzare l’acqua. Quando una sostanza è disciolta in un veicolo, occorre verificarne la stabilità.

MONITORAGGIO DELLE CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE

Flusso d’aria nella camera di esposizione

21.

Durante ogni esposizione è necessario regolare attentamente, monitorare in continuo e registrare almeno una volta l’ora il flusso d’aria nella camera. Il monitoraggio in tempo reale della concentrazione (o stabilità temporale) dell’atmosfera di prova costituisce una misura integrale di tutti i parametri dinamici e un modo indiretto di controllare tutti i parametri dinamici di inalazione. Se la concentrazione è monitorata in tempo reale, la frequenza di misurazione dei flussi d’aria può essere diminuita ad un’unica misurazione per giorno di esposizione. Si farà il possibile, nelle camere d’esposizione “a naso solo”, per evitare la reinalazione. La concentrazione di ossigeno deve essere pari ad almeno il 19 % e la concentrazione di biossido di carbonio non deve superare l’1 %. Qualora si ritenga di non poter rispettare queste concentrazioni, è necessario misurare le concentrazioni di ossigeno e di anidride carbonica. Se le misurazioni effettuate il primo giorno di esposizione dimostrano che i livelli di questi gas sono corretti, non occorrono altre misurazioni.

Temperatura e umidità relativa della camera

22.

La temperatura della camera deve essere mantenuta a 22 °C ± 3 °C. Sia nel caso delle esposizioni “a naso solo” che per le esposizioni “a corpo intero”, l’umidità relativa nella zona in cui respira l’animale è costantemente monitorata e registrata ogni ora nel corso di ciascuna esposizione, se possibile. L’umidità relativa deve preferibilmente essere mantenuta tra 30 e 70 % ma può accadere che questi valori non siano raggiungibili (ad esempio, nel caso delle miscele acquose) o che l’umidità non possa essere misurata per via delle interferenze della sostanza con il presente metodo di prova.

Sostanza chimica in esame: Concentrazione nominale

23.

Laddove possibile, si deve calcolare e registrare la concentrazione nominale nella camera di esposizione. La concentrazione nominale è data dalla massa della sostanza in esame generata divisa per il volume di aria che è passato nel sistema della camera di inalazione. La concentrazione nominale non serve a caratterizzare l’esposizione degli animali, ma un confronto tra la concentrazione nominale e la concentrazione reale dà un’indicazione dell’efficienza di produzione del sistema di prova e può essere utile per individuare eventuali problemi di produzione.

Sostanza chimica in esame: Concentrazione reale

24.

La concentrazione reale è la concentrazione della sostanza in esame prelevata nella zona della camera di inalazione in cui gli animali respirano. Le concentrazioni reali possono essere determinate con metodi specifici (ad esempio campionamento diretto, metodi di adsorbimento o di reazione chimica, e successiva caratterizzazione analitica) o con metodi non specifici, come l’analisi gravimetrica mediante filtrazione. Il ricorso all’analisi gravimetrica è ammissibile solo per gli aerosol di polveri che contengono un unico componente o per gli aerosol di liquidi poco volatili e deve fondarsi su opportune caratterizzazioni specifiche della sostanza in esame effettuate prima dello studio in corso. È possibile ricorrere all’analisi gravimetrica per determinare la concentrazione di un aerosol che contiene varie componenti in polvere, ma occorrono dati analitici che dimostrino che la composizione del materiale in sospensione nell’aria è analoga a quella del materiale di partenza. In assenza di questi dati, può essere necessario rianalizzare periodicamente la sostanza in esame (idealmente in sospensione nell’aria) durante lo studio. Per gli agenti aerosolizzati che possono evaporare o sublimarsi, occorre dimostrare che tutte le fasi sono state raccolte con il metodo prescelto.

25.

Nel corso dell’intero studio, è opportuno utilizzare, se possibile, un unico lotto della sostanza in esame e il campione va conservato in condizioni che ne mantengano la purezza, l’omogeneità e la stabilità. Prima di iniziare lo studio, occorre caratterizzare la sostanza in esame, valutandone anche la purezza e, se tecnicamente fattibile, l’identità e le quantità dei contaminanti e delle impurità individuati. A tal fine occorre conoscere quanto meno i dati seguenti: tempo di ritenzione e relativa area del picco, peso molecolare risultante dalla spettroscopia di massa o dalla gascromatografia, oppure altre stime. Il laboratorio che effettua la prova non è responsabile dell’identità del campione in esame, tuttavia per precauzione il laboratorio potrebbe confermare almeno una parte delle caratteristiche fornite dallo sponsor (colore, natura fisica ecc.).

26.

L’atmosfera di esposizione deve essere mantenuta costante nei limiti del possibile. Per verificare la stabilità delle condizioni di esposizione si può utilizzare un dispositivo di monitoraggio in tempo reale, come un fotometro per aerosol o un analizzatore di idrocarburi totali per i vapori. La concentrazione reale della camera deve essere misurata almeno 3 volte nel corso di ogni giorno di esposizione per ciascun livello di esposizione. Se ciò non è possibile, per via di limitazioni inerenti al flusso d’aria o delle basse concentrazioni, è possibile prelevare un campione per periodo di esposizione. Idealmente si deve prelevare questo campione per l’intero periodo di esposizione. La concentrazione dei singoli campioni prelevati nella camera non deve deviare dalla concentrazione media della camera più del ± 10 %, nel caso di gas e vapori, o ± 20 % nel caso degli aerosol liquidi o solidi. Occorre calcolare e prender nota del tempo necessario affinché la camera di esposizione raggiunga l’equilibrio (t95). La durata di un’esposizione copre il tempo di produzione della sostanza in esame, ivi compreso il tempo necessario per raggiungere l’equilibrio delle concentrazioni nella camera (t95) e il loro declino. Il documento di orientamento n. 39 (2) contiene indicazioni per la stima di t95.

27.

Per miscele molto complesse costituite da gas/vapori e aerosol (ad esempio, atmosfere di combustione e sostanze chimiche generate per propulsione da appositi prodotti/dispositivi finali), ogni fase può comportarsi diversamente nella camera di inalazione. Per ciascuna fase (gas/vapore e aerosol) occorre pertanto scegliere almeno una sostanza indicatrice (analita), normalmente il principio attivo principale della miscela. Quando la sostanza chimica in esame è una miscela, nella relazione dovrà essere indicata la concentrazione analitica per l’intera miscela e non solo quella del principio attivo o della sostanza indicatrice (analita). Informazioni aggiuntive sulle concentrazioni reali sono reperibili nel documento d’orientamento n. 39 (2).

Sostanza chimica in esame: Distribuzione granulometrica

28.

La distribuzione granulometrica degli aerosol deve essere determinata almeno una volta la settimana per ciascuna concentrazione, utilizzando un impattore a cascata o un altro strumento, come uno spettrometro APS (Aerodynamic Particle Sizer). Se i risultati ottenuti con l’impattore a cascata e con l’altro strumento risultano equivalenti, quest’ultimo può essere utilizzato nel corso dell’intero studio.

29.

Per confermare l’efficienza di estrazione dello strumento principale, occorre utilizzare parallelamente un secondo strumento, come un filtro gravimetrico o un impinger/gorgogliatore. La concentrazione massica ottenuta dall’analisi granulometrica deve avvicinarsi, con scarti ragionevoli, a quella ottenuta con l’analisi su filtri [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Se questa equivalenza può essere dimostrata a tutte le concentrazioni saggiate nella fase iniziale dello studio, non è necessario effettuare ulteriori misurazioni di conferma. Per il benessere degli animali occorre ridurre il più possibile i dati incerti che potrebbero comportare la necessità di ripetere uno studio.

30.

È necessario effettuare un’analisi granulometrica nel caso di vapori che rischiano di condensarsi e formare aerosol o se si rilevano particelle in un’atmosfera di vapori che si presume possano formare fasi miste.

OSSERVAZIONI

31.

Prima e dopo il periodo di esposizione è necessario eseguire frequenti esami clinici degli animali. Osservazioni più frequenti possono essere utili in funzione della risposta degli animali nel corso dell’esposizione. Quando l’osservazione degli animali è ostacolata dai tubi di contenzione, dalla scarsa illuminazione nella camere “a corpo intero” o da atmosfere opache, gli animali vanno attentamente osservati dopo l’esposizione. Le osservazioni fatte prima dell’esposizione del giorno successivo possono rilevare l’eventuale reversibilità o esacerbazione degli effetti tossici.

32.

Tutte le osservazioni vanno registrate e riportate singolarmente per ciascun animale. Nel caso di animali sottoposti a eutanasia o rinvenuti morti, il momento del decesso deve essere registrato con la massima precisione possibile.

33.

Si osserveranno eventuali alterazioni della cute e del pelo, degli occhi e delle mucose, del sistema respiratorio e circolatorio, del sistema nervoso, dell’attività somatomotoria e del comportamento. Particolare attenzione deve essere rivolta all’osservazione di tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma. La misura della temperatura rettale può corroborare una bradipnea riflessa o un’ipo/ipertermia causate dall’esposizione o dalla reclusione. Lo studio può prevedere ulteriori valutazioni riguardanti: cinetica, biomonitoraggio, funzione polmonare, ritenzione di materiali scarsamente solubili che si accumulano nel tessuto polmonare e variazioni comportamentali.

PESO CORPOREO

34.

Il peso di ogni singolo animale deve essere registrato immediatamente prima dell’esposizione (giorno 0), e due volte la settimana successivamente (ad esempio: il venerdì e il lunedì per verificare il recupero dopo un fine settimana senza esposizione, o a intervalli di tempo che consentano di valutare la tossicità sistemica) e al momento della morte o dell’eutanasia. In assenza di effetti nel corso delle prime 2 settimane, il peso corporeo può essere misurato ogni settimana fino al termine dello studio. Gli animali del gruppo satellite (studio di reversibilità) devono continuare ad essere pesati a cadenza settimanale per l’intero periodo di recupero. Al termine dello studio, tutti gli animali devono essere pesati prima dell’eutanasia per non falsare il calcolo del rapporto tra il peso degli organi e il peso corporeo.

CONSUMO DI ALIMENTI E DI ACQUA

35.

Si deve procedere settimanalmente alla misura del consumo alimentare, anche il consumo di acqua può essere misurato.

PATOLOGIA CLINICA

36.

Tutti gli animali, ivi compresi quelli dei gruppi di controllo e dei gruppi satelliti, una volta sacrificati devono essere sottoposti a esami clinici. L’intervallo di tempo tra la fine dell’esposizione e il prelievo di sangue deve essere annotato, soprattutto quando la ricostituzione dell’endpoint è rapida. Alla fine dell’esposizione, si raccomanda il campionamento per i parametri caratterizzati da una breve emivita del plasma (COHb, CHE e MetHb).

37.

Nella tabella 1 sono elencati i parametri di patologia clinica generalmente necessari per gli esami tossicologici. L’esame delle urine non è sempre richiesto, ma può essere effettuato se ritenuto utile in funzione della tossicità prevista o osservata. Per caratterizzare meglio la tossicità della sostanza in esame, il responsabile dello studio può decidere di valutare ulteriori parametri (ad esempio attività colinesterasica, lipidi, ormoni, equilibrio acido/base, metaemoglobina o corpi di Heinz, creatinina chinasi, rapporto mieloide/eritroide, troponina, emogas, lattato deidrogenasi, sorbitolo deidrogenasi, glutammato-deidrogenasi e gamma-glutamil transpeptidasi).

Tabella 1

Parametri standard di patologia clinica

Ematologia

Conteggio eritrocitario

Ematocrito

Concentrazione dell’emoglobina

Tenore globulare medio in emoglobina

Volume medio corpuscolare

Concentrazione di emoglobina corpuscolare media

Reticolociti

Conta totale dei globuli bianchi

Conta differenziale dei globuli bianchi

Conta delle piastrine

Coagulabilità (scegliere un parametro):

Tempo di protrombina

Tempo di coagulazione

Tempo di tromboplastina parziale attivata

Chimica clinica

Glucosio (8)

Colesterolo totale

Trigliceridi

Azoto ureico ematico

Bilirubina totale

Creatinina

Proteina totale

Albumina

Globulina

Alanina-aminotransferasi

Aspartato amminotransferasi

Fosfatasi alcalina

Potassio

Sodio

Calcio

Fosforo

Cloruro

Esame delle urine (facoltativo)

Aspetto (colore e torbidità)

Volume

Densità relativa o osmolalità

pH

Proteina totale

Glucosio

Sangue/cellule ematiche

38.

Qualora esista la prova che le vie respiratorie inferiori (gli alveoli) sono il principale sito di deposito e ritenzione, si può ricorrere al lavaggio broncoalveolare (BAL) come tecnica migliore per analizzare quantitativamente i parametri del rapporto dose-effetto, incentrandosi soprattutto sull’alveolite, l’infiammazione polmonare e la fosfolipidosi. Questo esame consente di analizzare adeguatamente l’evoluzione del rapporto dose-effetto e del decorso temporale di una lesione alveolare. Il fluido del lavaggio può essere analizzato basandosi sul numero totale e differenziale di leucociti, proteine totali e lattato deidrogenasi. Altri parametri da considerare sono quelli indicativi di lesione lisosomiale, fosfolipidosi, fibrosi, e infiammazione irritativa o allergica che può comprendere la determinazione di citochine o di chemiochine proinfiammatorie. Le misure legate al BAL spesso integrano i risultati degli esami istopatologici senza tuttavia sostituirli. Il documento di orientamento n. 39 (2) contiene le indicazioni su come effettuare il lavaggio dei polmoni.

PATOLOGIA MACROSCOPICA E PESO DEGLI ORGANI

39.

Tutti gli animali utilizzati (compresi quelli che muoiono nel corso della prova e quelli che sono ritirati dallo studio per motivi legati al loro benessere) devono essere sottoposti al dissanguamento totale (se fattibile) e autopsia macroscopica. Occorre annotare il tempo trascorso tra la fine dell’ultima esposizione di ogni animale e il loro sacrificio. Se non è possibile eseguire l’autopsia subito dopo il rilevamento del decesso, l’animale deve essere refrigerato (non congelato) ad una temperatura sufficientemente bassa da ridurre al minimo l’autolisi. L’autopsia deve essere eseguita non appena possibile, di norma entro un giorno o due dal decesso. Per ogni animale si annoteranno tutte le alterazioni patologiche macroscopiche, prestando particolare attenzione a quelle delle vie respiratorie.

40.

Nella tabella 2 sono elencati gli organi e i tessuti che devono essere conservati in un ambiente adeguato nel corso dell’autopsia macroscopica ai fini dell’esame istopatologico. La conservazione degli organi e dei tessuti [tra parentesi quadre] e di qualsiasi altro organo o tessuto sono a discrezione del responsabile dello studio. Gli organi indicati in grassetto devono essere espiantati e pesati allo stato umido, appena possibile dopo la dissezione, per evitare l’essiccamento. La tiroide e gli epididimi devono essere pesati solo se necessario in quanto la loro asportazione può ostacolare la valutazione istopatologica. Gli organi e i tessuti sono fissati mediante formalina tamponata al 10 % o un altro fissativo adeguato, non appena finita l’autopsia e non meno di 24-48 ore prima dell’ablazione, in funzione del fissativo utilizzato.

Tabella 2

Organi e tessuti preservati nel corso dell’autopsia macroscopica

Ghiandole surrenali

Midollo osseo (e/o aspirato fresco di midollo)

Cervello (incluse le sezioni di cervello, cervelletto, bulbo/ponte)

[Occhi (retina, nervo ottico) e palpebre]

Cuore

Reni

Laringe (3 livelli, 1 livello per comprendere la base dell’epiglottide)

Fegato

Polmone (tutti i lobi ad un livello, compresi i bronchi principali)

Linfonodi della regione ilare del polmone, soprattutto per il particolato di sostanze chimiche poco solubile. Per esami più approfonditi e/o studi incentrati sull’aspetto immunologico, si possono esaminare anche altri linfonodi, ad esempio quelli delle regioni mediastinale, cervicale/submandibolare e/o auricolare.

Tessuti nasofaringei (almeno 4 livelli; 1 livello per comprendere il dotto nasofaringeo e il tessuto associato al naso — Nasal Associated Lymphoid Tissue — NALT)

Esofago

[Bulbo olfattivo]

Ovaie

Vescicole seminali

Midollo spinale (cervicale, mediotoracico e lombare)

Milza

Stomaco

Testicoli

Timo

Tiroide

Trachea almeno a 2 livelli, ivi comprese 1 sezione longitudinale attraverso la carena e 1 sezione trasversale)

[Vescica]

Utero

Tutte le lesioni macroscopiche

41.

I polmoni devono essere asportati intatti, pesati e trattati con un fissativo idoneo ad una pressione di 20-30 cm di acqua per garantire che la struttura dei polmoni venga preservata (5). Le sezioni sono prelevate per tutti i lobi ad un livello, ivi inclusi i bronchi principali, ma se si effettua un lavaggio polmonare, il lobo che non è stato lavato è sezionato su tre livelli (non sezioni in serie)

42.

Si devono esaminare almeno 4 livelli di tessuti rinofaringei, uno dei quali deve comportare il canale rinofaringeo (5) (6) (7) (8) (9) per permettere un esame adeguato dell’epitelio squamoso, transizionale (respiratorio non cigliato), respiratorio (respiratorio cigliato) e olfattivo, nonché del tessuto linfatico (NALT) (10) (11). Occorre inoltre esaminare tre livelli della laringe, tra cui uno che comprenda la base dell’epiglottide (12). Occorre esaminare almeno due livelli della trachea, ivi compresa una sezione longitudinale lungo la carena della biforcazione dei bronchi extrapolmonari e una sezione trasversale.

ESAME ISTOPATOLOGICO

43.

Una valutazione istopatologica di tutti gli organi e i tessuti di cui alla tabella 2 è necessaria per i gruppi di controllo e i gruppi trattati con la concentrazione più elevata, e per tutti gli animali che muoiono o subiscono l’eutanasia nel corso dello studio. Occorre prestare particolare attenzione all’apparato respiratorio, agli organi bersaglio e alle lesioni macroscopiche. Gli organi e tessuti sui quali si riscontrano delle lesioni nel gruppo trattato con la concentrazione più elevata devono essere esaminati in tutti i gruppi. Il responsabile dello studio può decidere di effettuare valutazioni istopatologiche anche per altri gruppi al fine di dimostrare una chiara risposta alle concentrazioni Quando si utilizza un gruppo satellite (reversibilità), la valutazione istopatologica va eseguita su tutti i tessuti e gli organi per i quali sono stati osservati effetti nei gruppi trattati. Se nel gruppo trattato con la concentrazione più elevata si registra un numero eccessivo di morti premature o altri tipi di problemi che possono compromettere il significato dei dati, occorre effettuare una valutazione istopatologica del livello di concentrazione immediatamente inferiore. Si deve cercare di correlare le osservazioni macroscopiche con i risultati degli esami microscopici.

DATI E RELAZIONE

Dati

44.

Per i singoli animali occorre fornire i dati riguardanti il peso corporeo, il consumo di cibo, la patologia clinica, la patologia macroscopica, il peso degli organi e l’istopatologia. I dati di osservazione clinica devono essere riassunti in una tabella indicante, per ogni gruppo di prova, il numero di animali utilizzati, il numero di animali che hanno manifestato segni specifici di tossicità, il numero di animali rinvenuti morti durante la prova o sottoposti a eutanasia, il momento del decesso di ciascun animale, la descrizione degli effetti tossici con indicazioni sul decorso e la reversibilità, e i risultati dell’autopsia. Tutti i risultati, quantitativi e descrittivi, devono essere valutati con un metodo statistico idoneo. Può essere utilizzato qualsiasi metodo statistico generalmente riconosciuto. I metodi statistici devono essere stabiliti nella fase di concezione dello studio.

Relazione sulla prova

45.

La relazione deve contenere le seguenti informazioni, a seconda dei casi:

 

Animali sperimentali e condizioni di allevamento:

descrizione delle condizioni di stabulazione, tra cui: numero (o modifica del numero) di animali per gabbia, materiale utilizzato per la lettiera, temperatura ambiente e umidità relativa, fotoperiodo e dieta,

specie/ceppo utilizzati e giustificazione dell’impiego di specie diverse dal ratto; Possono essere forniti dati di origine e storici se riguardano animali esposti a condizioni di esposizione, di stabulazione e di digiuno simili,

numero, età e sesso degli animali,

metodo di randomizzazione,

descrizione dell’eventuale condizionamento prima della prova, in particolare per quanto concerne dieta, quarantena e terapie.

 

Sostanza chimica in esame:

natura fisica, purezza e, se del caso, proprietà fisico-chimiche (compresa l’isomerizzazione),

dati di identificazione e numero CAS (Chemical Abstract Services), se noto.

 

Veicolo:

motivazione dell’utilizzo di un veicolo e giustificazione per la scelta del veicolo (se diverso dall’acqua),

dati storici o paralleli che dimostrano che il veicolo non interferisce con i risultati dello studio.

 

Camera di inalazione:

descrizione dettagliata della camera di inalazione, comprendente il volume e un diagramma,

provenienza e descrizione delle apparecchiature utilizzate per l’esposizione degli animali e per la generazione dell’atmosfera,

apparecchi di misurazione della temperatura, dell’umidità, della granulometria e della concentrazione reale,

fonte dell’aria e sistema di climatizzazione utilizzato,

metodi utilizzati per calibrare l’apparecchiatura al fine di garantire l’omogeneità dell’atmosfera di prova,

differenza di pressione (positiva o negativa),

bocchette di esposizione per camera (“a naso solo”); ubicazione degli animali nella camera (“a corpo intero”),

stabilità dell’atmosfera di prova,

ubicazione dei sensori termometrici e igrometrici e dei punti di campionamento dell’atmosfera della prova nella camera,

trattamento dell’aria fornita/estratta,

portate dell’aria, portata dell’aria in ogni punto di esposizione (“a naso solo”) o rapporto tra il volume occupato dagli animali e il volume della camera (“a corpo intero”),

tempo necessario per raggiungere l’equilibrio nella camera (t95),

numero di sostituzioni del volume per ora,

dispositivi di misurazione (se applicabile).

 

Dati sull’esposizione:

giustificazione della scelta della concentrazione bersaglio dello studio principale,

concentrazioni nominali (ottenute dividendo la massa della sostanza in esame immessa nella camera d’inalazione per il volume dell’aria fatta circolare nella camera),

concentrazioni reali ottenute nella zona in cui respirano gli animali; per le miscele in esame che producono forme fisiche eterogenee (gas, vapori, aerosol), si può analizzare separatamente ciascuna di esse,

riportare le concentrazioni atmosferiche in unità di massa (ad esempio, mg/l, mg/m3 ecc.), più che in unità di volume (ad esempio, ppm, ppb ecc.),

distribuzione della dimensione delle particelle, diametro aerodinamico mediano di massa (DAMM) e deviazione standard geometrica (σg), con relativi metodi di calcolo. Occorre indicare anche le singole analisi granulometriche.

 

Condizioni sperimentali:

indicazioni sulla preparazione della sostanza chimica in esame, precisando i dettagli delle procedure impiegate per ridurre la granulometria dei solidi o per preparare soluzioni della sostanza in esame,

una descrizione (di preferenza corredata di uno schema) dell’apparecchiatura utilizzata per generare l’atmosfera sperimentale e per esporvi gli animali,

ragguagli sull’apparecchiatura utilizzata per monitorare la temperatura, l’umidità e il flusso d’aria nella camera (ad esempio sviluppo di una curva di calibrazione),

informazioni sull’apparecchiatura utilizzata per raccogliere campioni per la determinazione della concentrazione e della distribuzione della dimensione delle particelle nella camera,

dettagli sul metodo d’analisi chimica impiegato e sulla convalida di tale metodo (specificando l’efficienza di recupero della sostanza in esame dal mezzo campionato),

metodo di randomizzazione per l’assegnazione degli animali nei gruppi sperimentali e di controllo,

dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua (compresi tipo/origine della dieta, origine dell’acqua),

giustificazione della scelta delle concentrazioni sperimentali.

 

Risultati:

tabella con la temperatura, l’umidità e il flusso d’aria nella camera,

tabella con le concentrazioni nominali e reali nella camera,

tabella con i dati granulometrici, ivi compresi i dati analitici sul campionamento, sulla distribuzione granulometrica e i calcoli del DAMM e della σg,

tabella con i dati di risposta e livello di concentrazione per ciascun animale (vale a dire animali che manifestano segni di tossicità, mortalità compresa, natura, gravità, inizio e durata degli effetti),

tabella con il peso dei singoli animali,

tabella con il consumo di cibo,

tabella con i dati clinico-patologici,

reperti necroscopici ed reperti istopatologici per ciascun animale, se disponibili,

tabella con altri eventuali parametri misurati.

 

Discussione e interpretazione dei risultati:

occorre dare particolare importanza alla descrizione dei metodi impiegati per soddisfare i criteri del presente metodo di prova, ad esempio per quanto concerne la concentrazione limite o la granulometria,

occorre esaminare la respirabilità delle particelle alla luce dei risultati complessivi, in special modo se i criteri granulometrici non sono stati soddisfatti,

si deve tenere conto, nella valutazione globale dello studio, della coerenza dei metodi utilizzati per determinare le concentrazioni nominali e reali e considerare il rapporto tra di esse,

si deve esaminare la causa probabile di decesso e il meccanismo d’azione prevalente (sistemico o locale),

occorre fornire delle spiegazioni qualora sia stato necessario sottoporre ad eutanasia animali che manifestavano dolore intenso e/o segni di sofferenza grave e persistente, in base ai criteri illustrati nel documento di orientamento dell’OCSE citato in bibliografia al punto (3),

occorre individuare gli organi bersaglio,

occorre definire il livello fino al quale non si osservano effetti dannosi (NOAEL) e la dose minima con effetto avverso osservabile (LOAEL).

BIBLIOGRAFIA:

(1)

OCSE (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris.

(2)

OCSE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.

(3)

OCSE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.

(4)

Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.

(5)

Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pagg. 229-258.

(6)

Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.

(7)

Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238.

(8)

Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.

(9)

Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.

(10)

Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.

(11)

Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.

(12)

Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428.

(13)

Regolamento (CE) n. 1272/2008 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 16 dicembre 2008, relativo alla classificazione, all’etichettatura e all’imballaggio delle sostanze e delle miscele che modifica e abroga le direttive 67/548/CEE e 1999/45/CE e che reca modifica al regolamento (CE) n. 1907/2006 (GU L 353 del 31.12.2008, pag. 1).

Appendice 1

DEFINIZIONI

Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova.

»

5)

i capitoli B.29 e B.30 sono sostituiti dai seguenti:

«B.29.   TOSSICITÀ SUBACUTA PER INALAZIONE: STUDIO A 90 GIORNI

SINTESI

Il presente metodo di prova rivisto B.29 è stato concepito per caratterizzare pienamente la tossicità per inalazione della sostanza per una durata subcronica (90 giorni) e fornire dati affidabili per valutazioni quantitative dei rischi legati all’inalazione. Dei gruppi di roditori, composti da almeno 10 maschi e 10 femmine, sono esposti per 6 ore al giorno per 90 giorni (13 settimane) a: a) la sostanza in esame a tre livelli di concentrazione o più; b) all’aria filtrata (controllo negativo); e/o c) al veicolo (gruppi di controllo del veicolo). Di norma gli animali sono esposti alla sostanza in esame per 5 giorni la settimana ma è possibile anche esporli 7 giorni su 7. Vengono sempre testati sia maschi che femmine, ma possono essere esposti a livelli di concentrazione diversi se uno dei due sessi è notoriamente più sensibile ad una determinata sostanza. Per caratterizzare in modo più adeguato la tossicità della sostanza in esame, il presente metodo consente al responsabile dello studio di includere dei gruppi satellite (reversibilità), sacrifici intermedi, lavaggio bronchioalveolare (BAL), esami neurologici e ulteriori valutazioni istopatologiche o di patologia clinica.

INTRODUZIONE

1.

Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche 413 (2009). La prima linea guida dell’OCSE sulla tossicità subcronica per inalazione n. 413 è stata adottata nel 1981 (1). Questo metodo di prova B.29 (che corrisponde alla linea guida n. 413 rivista del 2009) è stato aggiornato per tenere conto dei progressi scientifici e rispondere alle esigenze normative attuali e future.

2.

Gli studi di tossicità subcronica per inalazione sono utilizzati principalmente per calcolare le concentrazioni stabilite dalla normativa per valutare i rischi per i lavoratori nell’ambiente professionale. Servono anche a valutare i rischi per le persone nelle abitazioni, i trasporti e l’ambiente. Il presente metodo consente di caratterizzare gli effetti avversi risultanti da un’esposizione quotidiana ripetuta, per inalazione, ad una sostanza per 90 giorni (che corrisponde a circa 10 % della durata di vita di un ratto). I dati tratti dagli studi sulla tossicità subcronica per inalazione possono servire per le stime quantitative dei rischi e la scelta delle concentrazioni negli studi di tossicità cronica. Il presente metodo di prova non è destinato specificatamente ai test sui nanomateriali. Le definizioni usate nel contesto del presente metodo di prova sono riportate alla fine del capitolo e nel documento di orientamento n. 39 (2).

CONSIDERAZIONI INIZIALI

3.

Il laboratorio deve tenere conto di tutte le informazioni disponibili sulla sostanza in esame prima di svolgere la prove, in modo da migliorare la qualità dello studio e ridurre al minimo l’utilizzo di animali. Tre le informazioni utili per la scelta delle concentrazioni adeguate si annoverano: l’identità, la struttura chimica e le proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame, i risultati di eventuali altre prove di tossicità in vitro o in vivo; gli impieghi previsti o i rischi di esposizione umana, i dati (Q)SAR disponibili e i dati tossicologici in merito a sostanze chimiche di struttura affine; o dati tratti da altri studi di esposizione ripetuta. Se nel corso dello studio si prevedono o si constatano effetti neurotossici, il responsabile dello studio può decidere di includere le valutazioni ritenute necessarie e anche una serie di osservazioni funzionali (functional observational battery — fob) e misurazioni dell’attività motoria. Lo svolgimento di questi esami aggiuntivi non interferisce con l’impostazione di base dello studio, anche se la durata delle esposizioni può essere fondamentale in relazione ad alcuni esami specifici.

4.

Le diluzioni di sostanze corrosive o irritanti possono essere saggiate a concentrazioni che consentono di conseguire il grado di tossicità auspicato. Per ulteriori informazioni si invita a consultare il documento di orientamento n. 39 (2). Nell’esposizione degli animali a questa sostanze, le concentrazioni auspicate devono essere sufficientemente basse da non provocare dolore e stress intensi, pur essendo sufficienti a prolungare la curva concentrazione-risposta fino a dei livelli corrispondenti all’obiettivo scientifico e regolamentare della prova. La scelta di queste concentrazioni deve avvenire caso per caso, di preferenza in base ad uno studio di tipo range finding adeguatamente impostato che fornisca informazioni sull’endpoint critico, le eventuali soglie di irritazione e il momento dell’insorgenza degli effetti (cfr. paragrafi da 11 a 13). Occorre fornire la giustificazione della scelta delle concentrazioni.

5.

Gli animali moribondi o chiaramente sofferenti o recanti segni gravi e persistenti di sofferenza devono essere sottoposti a eutanasia. Gli animali moribondi sono considerati alla stregua degli animali che muoiono nel corso della prova. I criteri da applicare per decidere in merito all’eutanasia degli animali moribondi o in stato di grave sofferenza sono oggetto di un documento d’orientamento dell’OCSE, che contiene anche indicazioni su come riconoscere i segni di morte prevedibile o imminente (3).

DESCRIZIONE DEL METODO

Selezione delle specie animali

6.

Si devono utilizzare roditori adulti giovani e sani appartenenti a ceppi comunemente usati in laboratorio. La specie preferita è il ratto. In caso di utilizzo di un’altra specie è necessario motivarne la scelta.

Preparazione degli animali

7.

Le femmine devono essere nullipare e non gravide. Il giorno della randomizzazione gli animali selezionati devono essere giovani adulti di età compresa tra 7 e 9 settimane. Il loro peso corporeo non deve superare di ± 20 % del peso medio per ciascun sesso. Gli animali sono scelti in modo casuale, marchiati per consentire l’individuazione dei singoli esemplari e tenuti nelle gabbie per almeno 5 giorni prima dell’inizio della prova, affinché si acclimatino alle condizioni di laboratorio,.

Condizioni di allevamento degli animali

8.

Gli animali devono essere identificati individualmente, possibilmente mediante dispositivi subcutanei al fine di agevolarne l’osservazione e evitare qualsiasi confusione. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 ± 3 °C. L’umidità relativa va idealmente mantenuta tra 30 e 70 %, anche se ciò potrebbe non essere possibile quando si utilizza l’acqua come veicolo. Prima e dopo l’esposizione, gli animali sono generalmente tenuti in gabbia, suddivisi per sesso e concentrazione, ma il numero di animali per gabbia non deve interferire con un’agevole osservazione di ogni singolo animale e deve ridurre al minimo le perdite dovute a cannibalismo e combattimenti. Se l’esposizione avviene “a naso solo”, potrebbe essere necessario abituarli ai dispositivi di contenzione, che non devono provocare agli animali eccessivi stress fisici, termici o dinamici. La contenzione può incidere sui parametri fisiologici, come la temperatura corporea (ipertermia) e/o il volume respiratorio al minuto. Se si dispone di dati generici che dimostrano che nessuna di queste alterazioni avviene a un livello apprezzabile, il periodo di adattamento ai dispositivi di contenzione non è necessario. Gli animali esposti “a corpo intero” ad un aerosol devono essere stabulati separatamente per la durata dell’esposizione per evitare che filtrino l’aerosol attraverso il pelo degli altri animali presenti nella gabbia. Salvo nei periodi di esposizione, gli animali possono essere nutriti in base a diete convenzionali e certificate da laboratorio, accompagnate da acqua potabile a volontà. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità.

Camere di inalazione

9.

La scelta della camera di inalazione dipende dalla natura della sostanza chimica in esame e dalla finalità della prova. Il metodo preferito di esposizione è quello per via nasale (con cui s’intende l’esposizione unicamente della testa, del naso o del muso). Di norma si predilige l’esposizione per via nasale per gli studi di aerosol liquidi o solidi e di vapori che si possono condensare sotto forma di aerosol. L’esposizione “a corpo intero” può essere più indicata per conseguire obiettivi di studio particolari, ma tale scelta deve essere giustificata nella relazione sullo studio. Per garantire la stabilità atmosferica di una camera di esposizione “a corpo intero”, il volume complessivo degli animali sottoposti alla prova non deve superare il 5 % del volume della camera. Il documento di orientamento n. 39 (2) descrive i principi delle tecniche di esposizione “a corpo intero” e per sola via nasale, nonché i relativi vantaggi e svantaggi.

STUDI DI TOSSICITÀ

Concentrazioni limite

10.

A differenza degli studi di tossicità acuta, per gli studi di tossicità subcronica per inalazione non è definita la concentrazione massima. La concentrazione massima testata deve tenere conto di: 1) la concentrazione massima raggiungibile; 2) il livello di esposizione umana corrispondente al “peggiore dei casi”; 3) la necessità di mantenere un’adeguata alimentazione di ossigeno; e/o 4) il benessere degli animali. In assenza di limiti basati sui dati, si possono utilizzare i valori limite del regolamento (CE) n. 1272/2008 (13) (ossia una concentrazione massima di 5 mg/l per gli aerosol, di 20 mg/l per i vapori e 20 000 ppm per i gas); cfr. documento di orientamento n. 39 (2). Qualora sia necessario superare questi valori limite, per le prove con gas o sostanze fortemente volatili (ad esempio i refrigeranti), occorre giustificare questo superamento. La concentrazione limite deve provocare una chiara tossicità, senza causare stress eccessivo per gli animali né incidere sulla loro longevità (3).

Studio per la determinazione dell’intervallo di dosi (range finding)

11.

Prima di iniziare lo studio principale, è di norma necessario effettuare uno studio preliminare di tipo range finding. Uno studio di questo tipo è più completo di uno studio di osservazione perché non si limita alla scelta delle concentrazioni. Le conoscenze acquisite grazie a questo tipo di studio possono determinare il buon esito dello studio principale. Uno studio per determinare l’adeguato intervallo di dosi può, ad esempio, fornire informazioni tecniche sul metodo di analisi, la dimensione delle particelle, la scoperta di meccanismi di tossicità, i dati istopatologici e di patologia clinica e le stime circa le concentrazioni NOAEL e MTC nello studio principale. Il responsabile dello studio può decidere di utilizzare uno studio di tipo range finding per individuare: la soglia di irritazione dell’apparato respiratorio (ad esempio mediante istopatologia dell’apparato respiratorio, test sulla funzionalità polmonare e lavaggi broncoalveolari), la concentrazione più alta tollerata dagli animali senza provocare stress eccessivo e i parametri che permetteranno di caratterizzare al meglio la tossicità della sostanza in esame.

12.

Uno studio per la determinazione degli intervalli di dose può comportare uno o più livelli di concentrazione. In funzione degli effetti da misurare selezionati si devono esporre da tre a sei maschi e da tre a sei femmine a ciascun livello di concentrazione. Lo studio in questione deve durare da un minimo di 5 giorni ad un massimo di 28 giorni. Nella relazione sullo studio è opportuno illustrare la ragione della scelta delle concentrazioni per lo studio principale. il cui scopo è dimostrare una relazione concentrazione-risposta sulla base dell’endpoint ritenuto a priori più sensibile La concentrazione inferiore deve essere del tipo NOAEL mentre la concentrazione più elevata deve comportare una chiara tossicità, senza causare stress eccessivo per gli animali né incidere sulla loro longevità (3).

13.

Nello studio di tipo range finding, al momento della scelta dei livelli di concentrazione occorre tener conto di tutte le informazioni disponibili, anche quelle relative alle relazioni struttura-attività e i dati concernenti sostanze chimiche analoghe (cfr. paragrafo 3). Lo studio di determinazione dell’intervallo di dosi può confermare o invalidare la scelta degli endpoint ritenuti più sensibili secondo criteri meccanicisti, come l’inibizione della colinesterasi dovuta a organofosfati, la formazione di metaemoglobine da parte di agenti eritrotossici, gli ormoni tiroidei (T3 e T4) per i tireotossici, le proteine, la LDH, i neutrofili nei lavaggi broncoalveolari nel caso di particelle inoffensive scarsamente solubili o di aerosol irritanti per i polmoni.

Studio principale

14.

Uno studio principale di tossicità subcronica di norma comprende tre livelli di concentrazione e, parallelamente, controlli negativi (aria) e/o del veicolo, se necessario (cfr. paragrafo 18). Per scegliere i livelli di esposizione adeguati, occorre avvalersi di tutte le informazioni disponibili, ivi compresi i risultati degli studi di tossicità sistemica, studi sul metabolismo e la cinetica (occorre fare il possibile per evitare livelli di concentrazione elevati caratterizzati da processi cinetici di saturazione). Ogni gruppo comprende 20 roditori (10 maschi e 10 femmine) che sono esposti alla sostanza in esame per 6 ore al giorno, 5 giorni la settimana per 13 settimane (per una durata totale dello studio di 90 giorni). Gli animali possono anche essere esposti per 7 giorni su 7 (ad esempio nel caso di prove su prodotti farmaceutici inalati). Se uno dei due sessi è notoriamente più sensibile alla sostanza in esame, i livelli di concentrazione possono differire secondo il sesso al fine di ottimizzare la concentrazione-risposta come indicato al paragrafo 15. Se per l’esposizione “a naso solo” s’impiegano specie di roditori diverse dai ratti, è possibile adeguare la durata massima d’esposizione per ridurre al minimo lo stress tollerato dalla specie in causa. La scelta di una durata di esposizione inferiore a 6 ore o superiore (ad esempio 22 ore al giorno) deve essere debitamente motivata. [cfr. il documento di orientamento n. 39 (2)]. Durante il periodo di esposizione l’alimentazione va sospesa, a meno che l’esposizione quotidiana sia superiore a 6 ore. Nel corso dell’esposizione “a corpo intero” si può continuare a somministrare acqua.

15.

Le concentrazioni bersaglio selezionate devono consentire di individuare l’organo o gli organi bersaglio e di evidenziare una concentrazione-risposta chiara.

Il livello di concentrazione elevato deve produrre effetti tossici senza provocare segni persistenti o la morte che impedirebbero una valutazione significativa dei risultati

Il o i livelli di concentrazione medi devono essere intervallati in modo da produrre una graduazione degli effetti tossici tra la bassa e l’alta concentrazione

Il livello di dose inferiore non deve produrre effetti tossici o al massimo effetti poco rilevanti.

Sacrifici intermedi

16.

Se si prevedono sacrifici intermedi, ad ogni esposizione il numero di animali deve essere aumentato del numero di animali che si prevede di sacrificare prima del completamento dello studio. Occorre fornire la giustificazione del ricorso ai sacrifici intermedi di cui si deve tenere adeguatamente conto nelle analisi statistiche.

Studio di gruppi satelliti (studio di reversibilità)

17.

Uno studio di reversibilità può essere utilizzato per evidenziare il carattere reversibile persistente o ritardato della tossicità, per un periodo post-trattamento di una durata adeguata, e comunque di almeno 14 giorni. I gruppi satellite sono costituiti da 10 maschi e 10 femmine esposti contemporaneamente agli animali in esame nell’ambito dello studio principale. Questi gruppi devono essere esposti alla concentrazione più elevata della sostanza in esame. Sarebbe opportuno utilizzare anche un gruppo di controllo dell’aria e/o un gruppo di controllo del mezzo (cfr. paragrafo 18).

Animali di controllo

18.

Gli animali del controllo negativo (aria) devono essere trattati come gli animali del gruppo soggetto alla prova, con la sola differenza che sono esposti ad aria filtrata e non alla sostanza in esame. Quando per produrre l’atmosfera di prova si utilizza acqua o un’altra sostanza, occorre integrare nello studio un gruppo di controllo del veicolo al posto del gruppo di controllo negativo (aria). Laddove possibile è opportuno utilizzare l’acqua come veicolo. In tal caso, gli animali del gruppo di controllo devono essere esposti all’aria caratterizzata dalla stessa umidità relativa dell’aria del gruppo in esame. La selezione di un veicolo adeguato deve basarsi su dati dello studio preliminare o storici adeguati. Qualora non si disponga di informazioni sufficienti sulla tossicità di un veicolo, il responsabile dello studio può utilizzare un gruppo di controllo negativo (aria) e un gruppo di controllo del veicolo, anche se questa opzione è vivamente sconsigliata. Se i dati storici indicano che un veicolo non è tossico, non occorre ricorrere a un gruppo di controllo negativo (aria) ma basta utilizzare un gruppo di controllo del veicolo. Se uno studio preliminare effettuato su una sostanza in esame incorporata in un veicolo non evidenzia nessuna tossicità, significa che il veicolo non è tossico alla concentrazione testata e che si deve utilizzare questo gruppo di controllo del veicolo.

CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE

Somministrazione delle concentrazioni

19.

Gli animali sono esposti alla sostanza in esame sotto forma di gas, vapore, aerosol o una loro miscela. Lo stato fisico da testare dipende dalle proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame, dalle concentrazioni prescelte e/o dalla forma fisica nella quale è più probabile che si presenti nel corso della manipolazione e dell’utilizzo. Le sostanze igroscopiche e reattive dal punto di vista chimico devono essere testate in atmosfera secca. Occorre prestare attenzione al fine di evitare concentrazioni esplosive. Per ridurre la granulometria, il materiale particolato può essere sottoposto a processi meccanici. Ulteriori informazioni sono riportate nel documento di orientamento n. 39 (2).

Distribuzione granulometrica

20.

La granulometria deve essere effettuata per tutti gli aerosol e i vapori che potrebbero condensarsi e formare aerosol. Per consentire l’esposizione di tutte le zone pertinenti delle vie respiratorie, si raccomanda di utilizzare degli aerosol con diametro aerodinamico mediano di massa (DAMM) da 1 a 3 μm, con una deviazione standard geometrica (σg) compresa tra 1,5 e 3 (4). Occorre fare quanto possibile per rispettare queste condizioni, ma qualora non ci si riuscisse è necessario fornire il parere di un esperto. Ad esempio le particelle dei fumi metallici possono essere più piccole dello standard indicato, mentre le particelle caricate e le fibre possono essere più grandi rispetto a tale standard.

Preparazione della sostanza in esame in un veicolo

21.

Idealmente la sostanza deve essere testata senza un veicolo. Qualora sia necessario utilizzare un veicolo per ottenere la concentrazione e la granulometria adeguate della sostanza in esame, è preferibile utilizzare l’acqua. Quando una sostanza è disciolta in un veicolo, occorre verificarne la stabilità.

MONITORAGGIO DELLE CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE

Flusso d’aria nella camera di esposizione

22.

Durante ogni esposizione è necessario regolare attentamente, monitorare in continuo e registrare almeno una volta l’ora il flusso d’aria nella camera. Il monitoraggio in tempo reale della concentrazione (o stabilità temporale) dell’atmosfera di prova costituisce una misura permanente di tutti i parametri dinamici e un modo indiretto di controllarle tutti i parametri importanti per l’inalazione. Se la concentrazione è monitorata in tempo reale, la frequenza di misurazione della portata dell’aria può essere diminuita ad un’unica misurazione per giorno di esposizione. Si farà il possibile, nelle camere d’esposizione “a naso solo”, per evitare la reinalazione. La concentrazione di ossigeno deve essere pari ad almeno il 19 % e la concentrazione di biossido di carbonio non deve superare l’1 %. Qualora si ritenga di non poter rispettare queste concentrazioni, è necessario misurare le concentrazioni di ossigeno e di anidride carbonica. Se le misurazioni effettuate il primo giorno di esposizione dimostrano che i livelli di questi gas sono corretti, non occorrono altre misurazioni.

Temperatura e umidità relativa della camera

23.

La temperatura della camera deve essere mantenuta a 22 °C ± 3 °C. Sia nel caso delle esposizioni “a naso solo” che per le esposizioni “a corpo intero”, l’umidità relativa nella zona in cui respira l’animale è costantemente monitorata e registrata ogni ora nel corso di ciascuna esposizione, se possibile. L’umidità relativa deve preferibilmente essere mantenuta tra 30 e 70 % ma può accadere che questi valori non siano raggiungibili (ad esempio, quando si studiano miscele acquose) o che non possa essere misurata per via delle interferenze della sostanza con il presente metodo di prova.

Sostanza chimica in esame: Concentrazione nominale

24.

Laddove possibile, si deve calcolare e registrare la concentrazione nominale nella camera di esposizione. La concentrazione nominale è data dalla divisione della massa della sostanza in esame generata per il volume di aria che è passato nel sistema della camera di inalazione. La concentrazione nominale non serve a caratterizzare l’esposizione degli animali, ma un confronto tra la concentrazione nominale e la concentrazione reale dà un’indicazione dell’efficienza di produzione del sistema di prova e può essere utile per individuare eventuali problemi di produzione.

Sostanza chimica in esame: Concentrazione reale

25.

La concentrazione reale è la concentrazione della sostanza in esame prelevata nella zona della camera di inalazione in cui gli animali respirano. Le concentrazioni reali possono essere determinate con metodi specifici (ad esempio campionamento diretto, metodi di adsorbimento o di reazione chimica, e successiva caratterizzazione analitica) o con metodi non specifici, come l’analisi gravimetrica mediante filtrazione. Il ricorso all’analisi gravimetrica è ammissibile solo per gli aerosol di polveri che contengono un unico componente o per gli aerosol di liquidi poco volatili e deve fondarsi su opportune caratterizzazioni specifiche della sostanza in esame effettuate prima dello studio in corso. È possibile ricorrere all’analisi gravimetrica per determinare la concentrazione di un aerosol che contiene varie componenti in polvere, ma in tal caso occorrono dati analitici che dimostrino che la composizione del prodotto in sospensione nell’aria è analoga a quella del prodotto di partenza. In assenza di questi dati, può essere necessario rianalizzare periodicamente la sostanza in esame (idealmente in sospensione nell’aria) durante lo studio. Per gli agenti aerosolizzati che possono evaporare o sublimarsi, occorre dimostrare che tutte le fasi sono state raccolte con il metodo prescelto.

26.

Nel corso dell’intero studio, si deve utilizzare, se possibile, un unico lotto della sostanza in esame e il campione va conservato in condizioni che ne mantengano la purezza, l’omogeneità e la stabilità. Prima di iniziare lo studio, occorre caratterizzare la sostanza in esame, valutandone anche la purezza e, se tecnicamente fattibile, l’identità e le quantità dei contaminanti e delle impurità individuati. A tal fine occorre conoscere quanto meno i dati seguenti: tempo di ritenzione e relativa area del picco, peso molecolare risultante dalla spettroscopia di massa o dalla gascromatografia, oppure altre stime. Il laboratorio che effettua la prova non è responsabile dell’identità del campione in esame, tuttavia per precauzione potrebbe confermare almeno in parte le caratteristiche fornite dallo sponsor (colore, natura fisica ecc.).

27.

L’atmosfera di concentrazione deve essere mantenuta costante nei limiti del possibile. Per verificare la stabilità delle condizioni di esposizione si può utilizzare un dispositivo di monitoraggio in tempo reale, come un fotometro per aerosol o un analizzatore di idrocarburi totali per i vapori. La concentrazione reale della camera deve essere misurata almeno 3 volte nel corso di ogni giorno di esposizione per ciascun livello di esposizione. Se ciò non è possibile, per via di limitazioni inerenti al flusso d’aria o delle basse concentrazioni, è possibile prelevare un campione per periodo di esposizione. Idealmente si deve prelevare questo campione per l’intero periodo di esposizione. La concentrazione dei singoli campioni prelevati nella camera non deve deviare dalla concentrazione media della camera più del ± 10 %, nel caso di gas e vapori, o ± 20 % nel caso degli aerosol liquidi o solidi. Occorre calcolare e prender nota del tempo necessario affinché la camera di esposizione raggiunga l’equilibrio (t95). La durata di un’esposizione copre il tempo di produzione della sostanza in esame, ivi compreso il tempo necessario affinché la camera raggiunga l’equilibrio (t95) e la degradazione. Il documento di orientamento n. 39 (2) contiene indicazioni per la stima di t95.

28.

Per miscele molto complesse costituite da gas o vapori e da aerosol (ad esempio, atmosfere di combustione e sostanze chimiche generate per propulsione da appositi prodotti/dispositivi finali), ogni fase può comportarsi diversamente nella camera di inalazione. Per ciascuna fase (gas/vapore e aerosol) occorre pertanto scegliere almeno una sostanza indicatrice (analita), usualmente il principio attivo principale della miscela. Quando la sostanza chimica in esame è una miscela, nella relazione deve essere indicata la concentrazione analitica corrispondente alla miscela e non solo quella del principio attivo o della sostanza indicatrice (analita). Informazioni aggiuntive sulle concentrazioni effettive sono reperibili nel documento d’orientamento n. 39 (2).

Sostanza chimica in esame: Distribuzione granulometrica

29.

La distribuzione granulometrica degli aerosol deve essere determinata almeno una volta la settimana per ciascuna concentrazione, utilizzando un impattore a cascata o un altro strumento, come uno spettrometro APS (Aerodynamic Particle Sizer). Se i risultati ottenuti con l’impattore a cascata e con l’altro strumento risultano equivalenti, quest’ultimo può essere utilizzato nel corso dell’intero studio.

30.

Per confermare l’efficienza di estrazione dello strumento principale, occorre utilizzare parallelamente un secondo strumento, come un filtro gravimetrico o un impinger/gorgogliatore. La concentrazione massica ottenuta dall’analisi granulometrica deve avvicinarsi, con scarti ragionevoli, a quella ottenuta con l’analisi su filtri [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Se questa equivalenza può essere dimostrata a tutte le concentrazioni saggiate nella fase iniziale dello studio, non è necessario effettuare ulteriori misure di conferma. Per il benessere degli animali occorre ridurre il più possibile i dati incerti che potrebbero comportare la necessità di ripetere uno studio.

31.

È necessario effettuare un’analisi granulometrica nel caso di vapori che rischiano di condensarsi e formare aerosol o se si rilevano particelle in un’atmosfera di vapori che si presume possano formare fasi miste.

OSSERVAZIONI

32.

Prima, durante e dopo il periodo di esposizione è necessario eseguire frequenti esami clinici degli animali. Osservazioni più frequenti possono essere utili in funzione della risposta degli animali nel corso dell’esposizione. Quando l’osservazione degli animali è ostacolata dai tubi di contenzione, dalla scarsa illuminazione nelle camere “a corpo intero” o da atmosfere opache, gli animali vanno attentamente osservati dopo l’esposizione. Le osservazioni fatte prima dell’esposizione del giorno successivo possono rilevare l’eventuale reversibilità o esacerbazione degli effetti tossici.

33.

Tutte le osservazioni vanno registrate e riportate singolarmente per ciascun animale. Nel caso di animali sottoposti a eutanasia o rinvenuti morti, il momento del decesso deve essere registrato con la massima precisione possibile.

34.

Si osserveranno eventuali alterazioni della cute e del pelo, degli occhi e delle mucose, del sistema respiratorio e circolatorio, del sistema nervoso, e dell’attività somatomotoria e del comportamento. Particolare attenzione deve essere rivolta all’osservazione di tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma. La misura della temperatura rettale può corroborare una bradipnea riflessa o un’ipo/ipertermia causate dall’esposizione o dalla reclusione. Lo studio può prevedere ulteriori valutazioni riguardanti: cinetica, biomonitoraggio, funzione polmonare, ritenzione di materiali scarsamente solubili che si accumulano nel tessuto polmonare e variazioni comportamentali.

PESO CORPOREO

35.

Il peso di ogni singolo animale deve essere registrato immediatamente prima dell’esposizione (giorno 0), e due volte la settimana successivamente (ad esempio: il venerdì e il lunedì per verificare il recupero dopo un fine settimana senza esposizione, o a intervalli di tempo che consentano di valutare la tossicità sistemica) e al momento del decesso o dell’eutanasia. In assenza di effetti nel corso delle prime 4 settimane, il peso corporeo può essere misurato ogni settimana fino al termine dello studio. Gli animali del gruppo satellite (studio di reversibilità) devono continuare ad essere pesati a cadenza settimanale per l’intero periodo di recupero. Al termine dello studio, tutti gli animali devono essere pesati prima dell’eutanasia per non falsare il calcolo del rapporto tra il peso degli organi e il peso corporeo.

CONSUMO DI ALIMENTI E DI ACQUA

36.

Si deve procedere settimanalmente alla misura del consumo alimentare, anche il consumo di acqua può essere misurato.

PATOLOGIA CLINICA

37.

Tutti gli animali, ivi compresi quelli dei gruppi di controllo e dei gruppi satelliti, una volta sacrificati devono essere sottoposti a esami clinici. L’intervallo di tempo tra la fine dell’esposizione e il prelievo di sangue deve essere annotato, soprattutto quando la ricostituzione dell’endpoint è rapida. Alla fine dell’esposizione, si raccomanda il campionamento per i parametri caratterizzati da una breve emivita del plasma (COHb, CHE e MetHb).

38.

Nella tabella 1 sono elencati i parametri di patologia clinica generalmente necessari per gli esami tossicologici. L’esame delle urine non è sempre richiesto, ma può essere effettuato se ritenuto utile in funzione della tossicità prevista o osservata. Per caratterizzare meglio la tossicità della sostanza in esame, il responsabile dello studio può decidere di valutare ulteriori parametri (ad esempio attività colinesterasica, lipidi, ormoni, equilibrio acido/base, metaemoglobina o corpi di Heinz, creatinina chinasi, rapporto mieloide/eritroide, troponina, emogas, lattato deidrogenasi, sorbitolo deidrogenasi, glutammato-deidrogenasi e gamma-glutamil transpeptidasi).

Tabella 1

Parametri standard di patologia clinica

Ematologia

Conta eritrocitaria

Ematocrito

Concentrazione dell’emoglobina

Tenore globulare medio in emoglobina

Volume medio corpuscolare

Concentrazione di emoglobina corpuscolare media

Reticolociti

Conteggio dei globuli bianchi

Conta differenziale dei globuli bianchi

Conta delle piastrine

Coagulabilità (scegliere un parametro):

Tempo di protrombina

Tempo di coagulazione

Tempo di tromboplastina parziale attivata

Chimica clinica

Glucosio (9)

Colesterolo totale

Trigliceridi

Azoto ureico ematico

Bilirubina totale

Creatinina

Proteina totale

Albumina

Globulina

Alanina-aminotransferasi

Aspartato amminotransferasi

Fosfatasi alcalina

Potassio

Sodio

Calcio

Fosforo

Cloruro

Esame delle urine (facoltativo)

Aspetto (colore e torbidità)

Volume

Densità relativa o osmolalità

pH

Proteina totale

Glucosio

Sangue/cellule ematiche

39.

Qualora esista la prova che le vie respiratorie inferiori (gli alveoli) sono il principale sito di deposito e ritenzione, si può ricorrere al lavaggio broncoalveolare (BAL) come tecnica migliore per analizzare quantitativamente i parametri del rapporto dose-effetto, incentrandosi soprattutto sull’alveolite, l’infiammazione polmonare e la fosfolipidosi. Questo esame consente di analizzare adeguatamente l’evoluzione del rapporto dose-effetto e del decorso temporale di una lesione alveolare. Il fluido di lavaggio può essere analizzato basandosi sul numero totale e differenziale di leucociti, proteine totali e lattato deidrogenasi. Altri parametri da considerare sono quelli indicativi di lesione lisosomiale, fosfolipidosi, fibrosi e infiammazione irritativa o allergica, che possono comprendere la determinazione di citochine o di chemiochine proinfiammatorie. Le misure legate al BAL spesso integrano i risultati degli esami istopatologici senza tuttavia sostituirli. Il documento di orientamento n. 39 (2) contiene le indicazioni su come effettuare il lavaggio dei polmoni.

ESAME OFTALMOLOGICO

40.

Prima della somministrazione della sostanza in esame e al termine dello studio per tutti i gruppi trattati con una concentrazione elevata, occorre effettuare, avvalendosi di un oftalmoscopio o di un dispositivo equivalente, un esame oftalmologico del fondo dell’occhio, dei mezzi di rifrazione, dell’iride, della congiuntiva. Se sono individuate delle alterazioni a livello degli occhi, occorre esaminare tutti gli animali degli altri gruppi, ivi compreso il gruppo satellite (reversibilità).

PATOLOGIA MACROSCOPICA E PESO DEGLI ORGANI

41.

Tutti gli animali utilizzati (compresi quelli che muoiono nel corso della prova e quelli che sono ritirati dallo studio per motivi legati al loro benessere) devono essere sottoposti al dissanguamento totale (se fattibile) e autopsia macroscopica. Occorre annotare il tempo trascorso tra la fine dell’ultima esposizione di ogni animale e il suo sacrificio. Se non è possibile eseguire l’autopsia subito dopo il rilevamento del decesso, l’animale deve essere refrigerato (non congelato) ad una temperatura sufficientemente bassa da ridurre al minimo l’autolisi. L’autopsia deve essere effettuata non appena possibile, di norma entro un giorno o due dal decesso. Per ogni animale si annoteranno tutte le alterazioni patologiche macroscopiche, prestando particolare attenzione a quelle delle vie respiratorie.

42.

Nella tabella 2 sono elencati gli organi e i tessuti che devono essere conservati in un ambiente adeguato nel corso dell’autopsia macroscopica ai fini dell’esame istopatologico. La conservazione degli organi e dei tessuti [tra parentesi quadre] e di qualsiasi altro organo o tessuto sono a discrezione del responsabile dello studio. Gli organi indicati in grassetto devono essere esportati e pesati umidi, appena possibile dopo la dissezione, per evitare l’essiccamento. La tiroide e gli epididimi devono essere pesati solo se necessario in quanto la loro asportazione può ostacolare la valutazione istopatologica. Gli organi e i tessuti sono fissati mediante formalina tamponata al 10 % o un altro fissativo adeguato, non appena finita l’autopsia e non meno di 24-48 ore prima dell’ablazione, in funzione del fissativo utilizzato.

Tabella 2

Organi e tessuti preservati nel corso dell’autopsia macroscopica

Ghiandole surrenali

Aorta

Midollo osseo (e/o aspirato fresco di midollo)

Cervello (incluse le sezioni di cervello, cervelletto, bulbo/ponte)

Intestino cieco

Colon

Duodeno

[Epididimi]

[Occhi (retina, nervo ottico) e palpebre]

Femore e grassella

Cistifellea (se presente)

[Ghiandole di Harder]

Cuore

Ileo

Digiuno

Reni

[Ghiandole lacrimali (extraorbitali)]

Laringe (3 livelli, ivi compresa la base dell’epiglottide)

Fegato

Polmone (tutti i lobi ad un livello, compresi i bronchi principali)

Linfonodi della regione ilare del polmone, soprattutto per il particolato di sostanze chimiche poco solubile. Per esami più approfonditi e/o studi incentrati sull’aspetto immunologico, si possono esaminare anche altri linfonodi, ad esempio quelli delle regioni mediastinale, cervicale/submandibolare e/o auricolare.

Linfonodi (distali dal punto di ingresso)

Ghiandola mammaria (femminile)

Muscolo (coscia)

Tessuti rinofaringei (almeno 4 livelli; 1 livello per comprendere il canale rinofaringeo e il tessuto associato al naso — Nasal Associated Lymphoid Tissue — NALT)

Esofago

[Bulbo olfattivo]

Ovaie

Pancreas

Paratiroidi

Nervo periferico (sciatico o tibiale, di preferenza vicino al muscolo)

Pituitaria

Prostata

Retto

Ghiandole salivari

Vescicole seminali

Pelle

Midollo spinale (cervicale, mediotoracico e lombare)

Milza

Sterno

Stomaco

Denti

Testicoli

Timo

Tiroidi

[Lingua]

Trachea (almeno 2 livelli, tra cui 1 sezione longitudinale attraverso la carena e 1 sezione trasversale)

[Uretere]

[Uretra]

Vescica

Utero

Organi bersaglio

Tutte le lesioni macroscopiche e le masse

43.

I polmoni devono essere asportati intatti, pesati e trattati con un fissativo idoneo ad una pressione di 20-30 cm di acqua per garantire che la struttura dei polmoni venga preservata (5). Le sezioni sono prelevate per tutti i lobi ad un livello, ivi inclusi i bronchi principali, ma se si effettua un lavaggio polmonare, il lobo che non è stato lavato è sezionato su tre livelli (non sezioni in serie).

44.

Si devono esaminare almeno 4 livelli di tessuti rinofaringei, uno dei quali deve comportare il canale rinofaringeo (5) (6) (7) (8) (9) per permettere un esame adeguato dell’epitelio squamoso, transizionale (respiratorio non cigliato), respiratorio (respiratorio cigliato) e olfattivo, nonché del tessuto linfatico (NALT) (10) (11). Occorre inoltre esaminare tre livelli della laringe, e uno di questi deve includere la base dell’epiglottide (12). Occorre esaminare almeno due livelli della trachea, ivi compresa una sezione longitudinale lungo la carena della biforcazione dei bronchi extrapolmonari e una sezione trasversale.

ESAME ISTOPATOLOGICO

45.

Una valutazione istopatologica di tutti gli organi e i tessuti di cui alla tabella 2 è necessaria per i gruppi di controllo e i gruppi trattati con la concentrazione più elevata, e per tutti gli animali che muoiono o subiscono l’eutanasia nel corso dello studio. Occorre prestare particolare attenzione all’apparato respiratorio, agli organi bersaglio e alle lesioni macroscopiche. Gli organi e tessuti sui quali si riscontrano delle lesioni nel gruppo trattato con la concentrazione più elevata devono essere esaminati in tutti i gruppi. Il responsabile dello studio può decidere di effettuare valutazioni istopatologiche anche per altri gruppi al fine di dimostrare una chiara risposta alle concentrazioni Quando si utilizza un gruppo satellite (reversibilità), la valutazione istopatologica va eseguita su tutti i tessuti e gli organi per i quali sono stati osservati effetti nei gruppi trattati. Se nel gruppo trattato con la concentrazione più elevata si registra un numero eccessivo di morti premature o altri tipi di problemi che possono compromettere il significato dei dati, occorre effettuare una valutazione istopatologica del livello di concentrazione immediatamente inferiore. Si deve cercare di correlare le osservazioni macroscopiche con i risultati degli esami microscopici.

DATI E RELAZIONE

Dati

46.

Per i singoli animali occorre fornire i dati riguardanti il peso corporeo, il consumo di cibo, la patologia clinica, la patologia macroscopica, il peso degli organi e l’istopatologia. I dati di osservazione clinica devono essere riassunti in una tabella indicante, per ogni gruppo di prova, il numero di animali utilizzati, il numero di animali che hanno manifestato segni specifici di tossicità, il numero di animali rinvenuti morti durante la prova o sottoposti a eutanasia, il momento del decesso di ciascun animale, la descrizione degli effetti tossici con indicazioni sul decorso e sulla reversibilità, e i risultati dell’autopsia. Tutti i risultati, quantitativi e descrittivi, devono essere valutati con un metodo statistico idoneo. Può essere utilizzato qualsiasi metodo statistico generalmente riconosciuto. I metodi statistici devono essere stabiliti nella fase di concezione dello studio.

Relazione sulla prova

47.

La relazione deve contenere le seguenti informazioni, a seconda dei casi:

 

Animali sperimentali e condizioni di allevamento:

descrizione delle condizioni di stabulazione, tra cui: numero (o modifica del numero) di animali per gabbia, materiale utilizzato per la lettiera, temperatura ambiente e umidità relativa, fotoperiodo e dieta,

specie/ceppo utilizzati e giustificazione dell’impiego di specie diverse dal ratto; possono essere forniti dati di origine o dati storici se riguardano animali esposti a condizioni di esposizione, di stabulazione e di digiuno simili,

numero, età e sesso degli animali,

metodo di randomizzazione,

descrizione dell’eventuale condizionamento prima della prova, in particolare per quanto concerne dieta, quarantena e terapie.

 

Sostanza chimica in esame:

natura fisica, purezza e, se del caso, proprietà fisico-chimiche (compresa l’isomerizzazione),

dati di identificazione e numero CAS (Chemical Abstract Services), se noto.

 

Veicolo:

motivazione dell’utilizzo di un veicolo e giustificazione per la scelta del veicolo (se diverso dall’acqua),

dati storici o paralleli che dimostrano che il veicolo non interferisce con i risultati dello studio.

 

Camera di inalazione:

descrizione dettagliata della camera di inalazione, comprendente il volume e un diagramma,

provenienza e descrizione delle apparecchiature utilizzate per l’esposizione degli animali e per la generazione dell’atmosfera,

apparecchi di misurazione della temperatura, dell’umidità, della granulometria e della concentrazione reale,

fonte dell’aria e sistema di climatizzazione utilizzato,

metodi utilizzati per calibrare l’apparecchiatura al fine di garantire l’omogeneità dell’atmosfera di prova,

differenza di pressione (positiva o negativa),

bocchette di esposizione per camera (“a naso solo”); ubicazione degli animali nella camera (“a corpo intero”),

stabilità dell’atmosfera di prova,

ubicazione dei sensori termometrici e igrometrici e dei punti di campionamento dell’atmosfera della prova nella camera,

trattamento dell’aria fornita/estratta,

flussi d’aria, portata dell’aria in ogni bocchetta di esposizione (“a naso solo”) o rapporto tra il volume occupato dagli animali e il volume della camera (“a corpo intero”),

tempo necessario per raggiungere l’equilibrio nella camera (t95),

numero di sostituzioni del volume per ora,

dispositivi di misurazione (se applicabile).

 

Dati sull’esposizione:

giustificazione della scelta della concentrazione bersaglio dello studio principale,

concentrazioni nominali (ottenute dividendo la massa della sostanza in esame immessa nella camera d’inalazione per il volume dell’aria fatta circolare nella camera),

concentrazioni reali ottenute nella zona in cui respirano gli animali; per le miscele in esame che producono forme fisiche eterogenee (gas, vapori, aerosol), si può analizzare separatamente ciascuna di esse,

riportare le concentrazioni atmosferiche in unità di massa (ad esempio, mg/l, mg/m3 ecc.), più che in unità di volume (ad esempio, ppm, ppb ecc.),

distribuzione della dimensione delle particelle, diametro aerodinamico mediano di massa (DAMM) e deviazione standard geometrica (σg), con relativi metodi di calcolo. Occorre indicare anche le singole analisi granulometriche.

 

Condizioni sperimentali:

indicazioni sulla preparazione della sostanza chimica in esame, precisando i dettagli delle procedure impiegate per ridurre la granulometria dei materiali solidi o per preparare soluzioni della sostanza in esame,

una descrizione (di preferenza corredata di uno schema) dell’apparecchiatura utilizzata per generare l’atmosfera sperimentale e per esporvi gli animali,

ragguagli sull’apparecchiatura utilizzata per monitorare la temperatura, l’umidità e il flusso d’aria nella camera (ad esempio sviluppo di una curva di calibrazione),

informazioni sull’apparecchiatura utilizzata per raccogliere campioni per la determinazione della concentrazione e della distribuzione della dimensione delle particelle nella camera,

dettagli sul metodo d’analisi chimica impiegato e sulla convalida di tale metodo (specificando l’efficienza di recupero della sostanza in esame dal mezzo campionato),

metodo di randomizzazione per l’assegnazione degli animali nei gruppi sperimentali e di controllo,

dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua (compresi tipo/origine della dieta, origine dell’acqua),

giustificazione della scelta delle concentrazioni sperimentali.

 

Risultati:

tabella con la temperatura, l’umidità e il flusso d’aria nella camera,

tabella con le concentrazioni nominali e reali nella camera,

tabella con i dati granulometrici, ivi compresi i dati analitici sul campionamento, sulla distribuzione granulometrica e i calcoli del DAMM e della σg,

tabella con i dati di risposta e livello di concentrazione per ciascun animale (vale a dire animali che manifestano segni di tossicità, mortalità compresa, natura, gravità, inizio e durata degli effetti),

tabella con il peso dei singoli animali,

tabella con il consumo di cibo,

tabella con i dati clinico-patologici,

reperti necroscopici e reperti istopatologici per ciascun animale, se disponibili.

 

Discussione e interpretazione dei risultati:

occorre dare particolare importanza alla descrizione dei metodi impiegati per soddisfare i criteri del presente metodo di prova, ad esempio per quanto concerne la concentrazione limite o la granulometria,

occorre esaminare la respirabilità delle particelle alla luce dei risultati complessivi, in special modo se i criteri granulometrici non sono stati soddisfatti,

si deve tenere conto, nella valutazione globale dello studio, della coerenza dei metodi utilizzati per determinare le concentrazioni nominali ed effettive e considerare il rapporto tra esse,

si deve esaminare la causa probabile di decesso e il meccanismo d’azione prevalente (sistemico o locale),

occorre fornire delle spiegazioni qualora sia stato necessario sottoporre ad eutanasia animali che manifestavano dolore intenso e/o segni di sofferenza grave e persistente, in base ai criteri illustrati nel documento di orientamento dell’OCSE citato in bibliografia al punto (3),

occorre individuare gli organi bersaglio,

occorre definire il livello fino al quale non si osservano effetti dannosi (NOAEL) e il livello più basso al quale si osserva un effetto avverso (LOAEL).

BIBLIOGRAFIA:

(1)

OCSE (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris.

(2)

OCSE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.

(3)

OCSE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.

(4)

Whalan.E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.

(5)

Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pagg. 229-258.

(6)

Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.

(7)

Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238.

(8)

Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.

(9)

Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.

(10)

Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.

(11)

Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.

(12)

Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428.

(13)

Regolamento (CE) n. 1272/2008 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 16 dicembre 2008, relativo alla classificazione, all’etichettatura e all’imballaggio delle sostanze e delle miscele che modifica e abroga le direttive 67/548/CEE e 1999/45/CE e che reca modifica al regolamento (CE) n. 1907/2006 (GU L 353 del 31.12.2008, pag. 1).

Appendice 1

DEFINIZIONI

Sostanza chimica in esame: Qualsiasi sostanza o miscela testata secondo il presente metodo di prova.

B.30.   STUDI DI TOSSICITÀ CRONICA

INTRODUZIONE

1.

Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 452 (2009). La prima linea guida 452 è stata adottata nel 1981. Si è ritenuto necessario sviluppare questa versione riveduta del metodo di prova B.30 alla luce dei recenti progressi nell’ambito del benessere animale e degli obblighi normativi (1) (2) (3) (4). L’aggiornamento del presente metodo di prova B.30 si è svolto in parallelo alle revisioni del capitolo B.32 del presente allegato, studi di cancerogenesi, e del capitolo B.33 del presente allegato, studi combinati di tossicità cronica/cancerogenesi, con l’obiettivo di integrare le informazioni in relazione agli animali usati nello studio e di fornire maggiori dettagli sulla scelta delle dosi. Il presente metodo di prova è concepito per testare un’ampia serie di sostanze chimiche, tra cui pesticidi e sostanze chimiche industriali.

2.

La maggior parte degli studi di tossicità cronica è svolta su specie di roditori, pertanto il presente metodo di prova è destinato ad applicarsi in primo luogo agli studi che hanno ad oggetto queste specie. Se dovesse risultare necessario condurre tali studi sui non roditori, possono trovare applicazione, con le opportune modifiche, anche i principi e le procedure esposti nel presente metodo di prova, congiuntamente a quelli specificati al capitolo B.27 del presente allegato (Studio della tossicità orale con somministrazione ripetuta di dosi per 90 giorni sui non roditori) (5), come indicato nel documento di orientamento n. 116 dell’OCSE — Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies (6).

3.

Le tre vie principali di somministrazione usate in relazione alla tossicità cronica sono: orale, cutanea e per inalazione. La scelta della via di somministrazione è fatta in funzione delle caratteristiche chimico-fisiche della sostanza in esame e della più probabile via di esposizione degli esseri umani. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) fornisce ulteriori informazioni in merito alla scelta della via di esposizione.

4.

Questo metodo di prova è incentrato sull’esposizione per via orale, ossia la via più usata negli studi di tossicità cronica. Gli studi sulla tossicità cronica che prevedono un’esposizione per via cutanea o per inalazione possono essere necessari anche per la valutazione del rischio per la salute umana e/o possono essere richiesti da determinati quadri normativi, ma entrambe le vie di esposizione evidenziano una complessità considerevole sul piano tecnico. Questo tipo di studi dovrà essere impostato caso per caso, ma il metodo di prova qui esposto per la valutazione e l’esame della tossicità cronica con somministrazione orale potrebbe costituire la base di un protocollo per studi per inalazione e/o cutanei, per quanto riguarda le raccomandazioni per i periodi di trattamento, i parametri clinici e patologici ecc. L’OCSE ha pubblicato documenti di orientamento sulla somministrazione di sostanze chimiche in esame per inalazione (6) (7) e per via cutanea (6). Il capitolo B.8 del presente allegato (8) e il capitolo B.29 del presente allegato (9), insieme al documento di orientamento dell’OCSE — Acute inhalation testing (7) vanno consultati in particolare nell’impostazione di studi a lungo termine che prevedono l’esposizione per inalazione. Il capitolo B.9 del presente allegato (10) va consultato nel caso di prove svolte per via cutanea.

5.

Lo studio della tossicità cronica fornisce informazioni sui possibili rischi per la salute che potrebbero derivare dall’esposizione ripetuta nell’arco di un periodo considerevole della vita delle specie usate. Con questo studio sarà possibile ottenere informazioni sugli effetti tossici della sostanza chimica in esame, oltre ad indicare gli organi bersaglio e la possibilità di accumulo. Esso può inoltre fornire indicazioni sul cosiddetto no-observed-adverse-effect level (livello fino al quale non si osservano effetti dannosi) applicabile per la determinazione di criteri di sicurezza per l’esposizione umana. Si sottolinea inoltre la necessità di sottoporre gli animali ad attente osservazioni cliniche, allo scopo di ottenere il maggior numero possibile di informazioni.

6.

Tra gli obiettivi degli studi condotti con questo metodo di prova figurano:

l’individuazione della tossicità cronica di una sostanza chimica in esame,

l’individuazione degli organi bersaglio,

la caratterizzazione del rapporto dose-risposta,

l’individuazione di un no-observed-adverse-effect level (NOAEL), ossia il livello fino al quale non si osservano effetti dannosi, o di un punto di partenza per la determinazione di una dose di riferimento (BMD),

la previsione degli effetti di tossicità cronica ai livelli di esposizione umana,

la produzione di dati per verificare le ipotesi relative alle modalità di azione (6).

CONSIDERAZIONI INIZIALI

7.

Nella valutazione e nell’esame delle caratteristiche tossicologiche di una sostanza chimica in esame, prima di condurre lo studio i laboratori che eseguono la prova devono considerare tutte le informazioni disponibili sulla sostanza chimica in esame al fine di orientare il disegno sperimentale nella maniera più efficiente per valutare il potenziale di tossicità cronica limitando al minimo necessario l’uso di animali. Tre le informazioni utili per il disegno sperimentale saranno considerate l’identità, la struttura chimica e le proprietà fisico-chimiche della sostanza chimica in esame, le informazioni sulle modalità di azione, i risultati di eventuali altre prove di tossicità in vitro o in vivo, l’impiego o gli impieghi previsti per l’esposizione umana, dati (Q)SAR e i dati tossicologici disponibili in merito a sostanze chimiche di struttura affine, i dati tossicocinetici disponibili (dose unica e dose ripetuta, laddove disponibile) e i risultati di altri studi a dose ripetuta. La determinazione della tossicità cronica si effettua solamente una volta ottenuti i primi risultati delle prove di tossicità a dose ripetuta su 28 giorni e/o 90 giorni. È opportuno prendere in considerazione un approccio a tappe nello svolgimento delle prove di tossicità svolti nel quadro della valutazione generale degli effetti potenzialmente nocivi di una particolare sostanza chimica in esame (11) (12) (13) (14).

8.

I metodi statistici più adeguati per l’analisi dei risultati, tenuto conto del disegno sperimentale e degli obiettivi, sono stabiliti prima dell’inizio dello studio. Occorre inoltre determinare se le statistiche debbano o meno tenere conto dell’aggiustamento in funzione della sopravvivenza e dell’analisi effettuata in caso di morte prematura degli animali di uno o più gruppi. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) e il documento di orientamento dell’OCSE n. 35 — Analysis and evaluation of chronic toxicity and carcinogenicity studies (15) forniscono indicazioni sulle analisi statistiche appropriate e sui riferimenti fondamentali a metodi statistici riconosciuti a livello internazionale.

9.

Nella realizzazione di uno studio di tossicità cronica è opportuno seguire sempre i principi guida e le considerazioni specificati nel documento di orientamento dell’OCSE n. 19 — Recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation (16), in particolare nel paragrafo 62. Tale paragrafo precisa che negli studi che prevedono la somministrazione ripetuta di dosi, se un animale manifesta segnali clinici progressivi, che conducano a un ulteriore peggioramento delle sue condizioni, è necessario decidere con cognizione di causa se sottoporre l’animale ad eutanasia. In questa decisione va soppesato anche il valore delle informazioni che possono essere ottenute continuando a includere tale animale nello studio e il suo stato in generale. Se si decide di continuare a mantenere l’animale nello studio occorre aumentare la frequenza delle osservazioni, a seconda del caso. È anche possibile, senza pregiudicare il fine della prova, sospendere temporaneamente la somministrazione delle dosi se ciò allevia il dolore o riduce lo stress cui è sottoposto l’animale, oppure ancora ridurre le dosi.

10.

Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) e due pubblicazioni dell’International Life Sciences Institute (17) (18) forniscono ragguagli dettagliati in merito ai dibattiti sulla selezione delle dosi per gli studi di tossicità cronica e cancerogenesi. La strategia di base per la scelta delle dosi dipende dal o dagli obiettivi fondamentali dello studio (paragrafo 6). Nel selezionare il livello adeguato delle dosi sarebbe opportuno trovare un equilibrio tra, da un lato, l’individuazione dei rischi e, dall’altro, la caratterizzazione e la rilevanza delle risposte alle basse dosi. Ciò assume particolare importanza nella situazione in cui si deve svolgere uno studio combinato di tossicità cronica e di cancerogenesi (capitolo B.33 del presente allegato) (paragrafo 11).

11.

È opportuno valutare l’opportunità di svolgere uno studio combinato di tossicità cronica e cancerogenesi (capitolo B.33 del presente allegato) piuttosto che eseguire in separata sede uno studio di tossicità cronica (il presente metodo di prova B.30) e uno studio di cancerogenesi (capitolo B.32 del presente allegato). La prova combinata è più efficiente sotto il profilo della gestione dei tempi e dei costi rispetto alla conduzione di due studi distinti, pur senza compromettere la qualità dei dati nella fase che verifica la cronicità e nella fase che verifica la cancerogenesi. Nello svolgimento di uno studio combinato di tossicità cronica e cancerogenesi (capitolo B.33 del presente allegato) occorre tuttavia tenere opportunamente in considerazione i principi della selezione delle dosi (paragrafi 9 e 20-25). È inoltre riconosciuto che determinati quadri normativi richiedono la conduzione di studi ben distinti.

12.

Le definizioni usate nel contesto del presente metodo di prova sono specificate alla fine del capitolo e nel documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6).

PRINCIPIO DELLA PROVA

13.

La sostanza chimica in esame è somministrata giornalmente in dosi graduali a diversi gruppi di animali sperimentali, di norma per un periodo di 12 mesi, ma a seconda degli obblighi normativi possono essere scelti anche periodi più lunghi o più corti (cfr. paragrafo 33). La durata scelta deve essere sufficientemente lunga da garantire la manifestazione degli effetti della tossicità cumulata senza che insorgano gli effetti distorsivi dei cambiamenti geriatrici. È opportuno che gli scostamenti da una durata di esposizione di 12 mesi siano giustificati, in particolare in caso di periodi di durata inferiore. La sostanza chimica in esame di norma è somministrata per via orale, ma può essere opportuno anche ricorrere alla via inalatoria o cutanea. Il disegno sperimentale può anche prevedere uno o più sacrifici intermedi, ad esempio dopo 3 e 6 mesi, e a tale fine possono essere introdotti nello studio ulteriori animali (cfr. paragrafo 19). Durante il periodo di somministrazione si tengono gli animali sotto attenta osservazione per individuare eventuali segni di tossicità. Gli animali deceduti o soppressi durante l’esperimento vengono sottoposti a necroscopia. Al termine della prova gli animali superstiti vengono soppressi e sottoposti a necroscopia.

DESCRIZIONE DEL METODO

Selezione delle specie animali

14.

Il presente metodo di prova riguarda innanzitutto la valutazione e l’esame della tossicità cronica nei roditori (cfr. paragrafo 2), sebbene sia riconosciuto che determinati regimi normativi possano richiedere studi analoghi su non roditori. La scelta delle specie deve essere motivata. Il disegno e lo svolgimento di studi di tossicità cronica su specie di non roditori, se richieste, vanno basate sui principi indicati nel presente metodo di prova e in quelli specificati nel capitolo B.27 del presente allegato (Studio della tossicità orale con somministrazione ripetuta di dosi per 90 giorni sui non roditori) (5). Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) fornisce ulteriori informazioni in merito alla scelta delle specie e del ceppo.

15.

Nel presente metodo di prova la specie di roditore di elezione è il ratto, sebbene si possano utilizzare anche altre specie di roditori, come il topo. I ratti e i topi costituiscono i modelli sperimentali preferibili in ragione della loro aspettativa di vita relativamente breve, del loro uso diffuso in studi farmacologici e tossicologici, della loro sensibilità all’induzione di tumori e della disponibilità di ceppi sufficientemente caratterizzati. Viste queste caratteristiche, è disponibile una grande quantità di informazioni di carattere fisiologico e patologico. Occorre utilizzare animali adulti giovani e sani appartenenti a ceppi comunemente usati in laboratorio. Lo studio di tossicità cronica va svolto su animali dello stesso ceppo e della medesima provenienza di quelli utilizzati in uno o più studi preliminari di tossicità di durata inferiore. Le femmine devono essere nullipare e non gravide.

Condizioni di stabulazione e alimentazione

16.

Gli animali devono essere alloggiati in gabbie individuali o contenenti piccoli gruppi dello stesso sesso. La sistemazione individuale va considerata soltanto se scientificamente giustificata (19) (20) (21). Le gabbie devono essere sistemate in modo da ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla loro collocazione. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 °C (± 3 °C). L’umidità relativa deve essere almeno del 30 % e preferibilmente non superiore al 70 %; tranne durante la pulizia del laboratorio, con l’obiettivo del 50-60 %. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità. Per quanto concerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata d’acqua di abbeveraggio. La dieta deve corrispondere a tutti i requisiti nutrizionali delle specie in esame e il tenore di contaminanti dietetici, tra cui anche i residui di pesticidi, inquinanti organici persistenti, fitoestrogeni, metalli pesanti e micotossine, che potrebbero influenzare l’esito della prova, deve essere il più basso possibile. Le informazioni analitiche sui livelli di nutrienti e di contaminanti dietetici devono essere prodotte periodicamente, quantomeno all’inizio dello studio e in caso di cambio del lotto impiegato, e vanno riportate nella relazione finale. Analogamente, devono essere fornite anche informazioni analitiche sull’acqua di abbeveraggio usata nello studio. La scelta della dieta può essere condizionata dalla necessità di garantire una combinazione adeguata tra una data sostanza chimica in esame e l’esigenza di rispettare i requisiti nutrizionali degli animali nel momento in cui la sostanza chimica è somministrata con il cibo.

Preparazione degli animali

17.

Si utilizzano animali sani, che siano stati acclimatati alle condizioni di laboratorio per almeno 7 giorni e non siano stati precedentemente sottoposti ad altre procedure sperimentali. Nel caso dei roditori, la somministrazione delle dosi agli animali deve iniziare il più presto possibile in seguito allo svezzamento e all’acclimatazione e preferibilmente prima che gli animali raggiungano le 8 settimane di età. Gli animali usati per la prova devono essere caratterizzati per quanto concerne specie, ceppo, provenienza, sesso, peso ed età. All’inizio dello studio la variazione ponderale degli animali di ciascun sesso utilizzati deve essere minima e non superare il ± 20 % del peso medio di tutti gli animali interessati dallo studio, operando un distinguo a seconda del sesso. L’assegnazione degli animali al gruppo di controllo e di trattamento avviene mediante randomizzazione. In seguito all’assegnazione randomizzata, non dovrebbero esserci più differenze significative nel peso medio corporeo tra gruppi dello stesso sesso. Se sono presenti differenze statisticamente rilevanti, la fase di randomizzazione va ripetuta, nei limiti del possibile. Ad ogni animale va assegnato un numero di identificazione univoco, che sarà riportato sull’animale in maniera indelebile tramite tatuaggio, impianto di un microchip o un altro metodo analogo.

PROCEDURA

Numero e sesso degli animali

18.

È opportuno usare animali di entrambi i sessi. E necessario impiegare un numero di animali tale da consentire che alla fine dello studio sia disponibile una quantità di animali in ogni gruppo sufficiente per effettuare una valutazione biologica e statistica. Per quanto riguarda i roditori, per ciascun livello di dose di norma si usano almeno 20 esemplari per sesso in ogni gruppo, mentre per i non roditori si raccomanda un minimo di 4 esemplari per sesso in ciascun gruppo. Negli studi che prevedono la presenza di topi potrebbero essere necessari ulteriori animali in ciascun gruppo-dose per poter eseguire tutti gli esami ematologici del caso.

Disposizioni relative ai sacrifici intermedi, a gruppi satellite e ad animali sentinella

19.

Lo studio può prevedere disposizioni relative ai sacrifici intermedi (almeno 10 animali/sesso/gruppo), ad esempio dopo 6 mesi, al fine di reperire informazioni sull’evoluzione di alterazioni tossicologiche e dati meccanicistici. Se tali informazioni sono già disponibili sulla base di studi sulla tossicità a dose ripetuta sulla sostanza chimica in esame, tali sacrifici intermedi possono non essere scientificamente giustificati. Ai fini del monitoraggio della reversibilità dei cambiamenti tossicologici indotti dalla sostanza chimica in esame possono essere previsti anche gruppi satellite. Tali gruppi di norma saranno limitati al livello di dose più elevato dello studio e ai gruppi di controllo. Al fine di monitorare lo stato della patologia, se necessario durante lo studio è possibile aggiungere un altro gruppo di animali sentinella (solitamente 5 esemplari per sesso) (22). Se sono previsti sacrifici intermedi o inclusioni di gruppi satellite o di animali sentinella, il numero di animali previsto dal disegno sperimentale va aumentato della quantità di animali che si intende sacrificare prima della conclusione dello studio. Gli animali interessati di norma sono sottoposti alle medesime osservazioni, tra cui il controllo del peso corporeo, il consumo di cibo/acqua, analisi ematologiche e biochimico-cliniche ed esami patologici degli animali coinvolti nella fase di esame della tossicità cronica dello studio principale, sebbene sia possibile disporre anche che (per i gruppi che saranno sacrificati nel corso dello studio) le osservazioni siano limitate a parametri essenziali specifici, come la neurotossicità o l’immunotossicità.

Gruppi-dose e dosaggi

20.

Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) fornisce indicazioni in merito a tutti gli aspetti legati alla scelta delle dosi e all’intervallo tra i livelli di dose. Occorre utilizzare almeno tre livelli di dose e un controllo parallelo, tranne quando si esegue una prova limite (cfr. paragrafo 27). I livelli di dose sono generalmente basati sui risultati di precedenti studi di durata inferiore con dosi ripetute o di determinazione degli intervalli di dose e devono tenere conto dei dati tossicologici e tossicocinetici esistenti disponibili relativi alla sostanza chimica in esame o a sostanze chimiche analoghe.

21.

A meno che la natura fisico-chimica o gli effetti biologici della sostanza chimica in esame non impongano limiti in tal senso, il livello di dose più elevato di norma va scelto con l’obiettivo di individuare gli organi bersaglio e gli effetti tossici senza provocare sofferenza, tossicità grave, morbilità o morte. In considerazione dei fattori di cui al paragrafo 22 sottostante, il livello di dose più elevato è scelto per rendere manifesta la tossicità, ad esempio con un calo dell’aumento del peso (circa del 10 %).

22.

Tuttavia, a seconda degli obiettivi dello studio (cfr. paragrafo 6), si può optare per una dose massima inferiore alla dose che renda manifesta la tossicità, ad esempio se una dose provoca un effetto indesiderato preoccupante che però ha un impatto lieve sull’aspettativa di vita o sul peso corporeo. La dose massima non può essere superiore a 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno (dose limite, cfr. paragrafo 27).

23.

I livelli di dose e l’intervallo tra i livelli di dose possono essere scelti per stabilire un rapporto dose-risposta e un NOAEL o altri risultati attesi dello studio, ad esempio una dose di riferimento (BMD, benchmark dose, cfr. paragrafo 25) al livello di dose più basso. Tra i fattori da tenere in considerazione nella scelta delle dosi più basse rientrano anche la curva attesa del rapporto dose-risposta, le dosi alle quali possono subentrare dei cambiamenti nel metabolismo o nella modalità di azione tossica, il livello a cui si prevede una soglia o il livello che si prevede possa costituire un punto di partenza per un’estrapolazione a basse dosi.

24.

L’intervallo tra i livelli di dose scelto dipenderà dalle caratteristiche della sostanza chimica di prova e non può essere imposto dal presente metodo di prova, ma di frequente fattori tra due e quattro forniscono buoni risultati delle prove se applicati per determinare dosi a livelli discendenti, mentre spesso è preferibile aggiungere un quarto gruppo di prova piuttosto che utilizzare intervalli molto distanziati (ad esempio oltre un fattore di circa 6-10) tra le dosi. In linea generale va evitato l’uso di fattori superiori a 10 e se vi si ricorre è opportuno giustificare tale scelta.

25.

Come illustrato ulteriormente nel documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6), nella scelta della dose vanno tenuti in considerazione, tra l’altro, i seguenti aspetti:

non linearità o punti di flesso presunti o riscontrati nella curva dose-risposta,

aspetti tossicocinetici e range di dosi a cui subentra o meno induzione metabolica, saturazione o non linearità tra dosi esterne e interne,

lesioni precursive, indicatori degli effetti o indicatori di processi biologici fondamentali sottostanti in corso,

aspetti principali (o presunti) delle modalità di azione, ad esempio dosi alle quali inizia a subentrare citotossicità, i livelli ormonali sono perturbati, i meccanismi di omeostasi sono superati ecc.,

regioni della curva dose-risposta per cui è necessaria una stima particolarmente precisa, ad esempio nell’ambito della dose di riferimento prevista o di una soglia ipotizzata,

considerazione dei livelli previsti di esposizione umana.

26.

Il gruppo di controllo deve essere non trattato o trattato solo con il veicolo nel caso si utilizzi un veicolo per somministrare la sostanza chimica in esame. Salvo il trattamento con la sostanza chimica in esame, gli animali del gruppo di controllo vanno manipolati esattamente come quelli dei gruppi sperimentali. Se si utilizza un veicolo, il gruppo di controllo riceverà il veicolo al volume più elevato dei gruppi-dose. Se una sostanza chimica è somministrata con la dieta e comporta una riduzione dell’assunzione di cibo significativa a causa di una minore palatabilità, può essere utile aggiungere un ulteriore gruppo di controllo alimentato allo stesso modo che si presterà di più a tale scopo.

27.

Se, basandosi sulle informazioni degli studi preliminari, è possibile prevedere che una prova a un livello di dose equivalente ad almeno 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno probabilmente non produce effetti avversi e se, sulla base dei dati relativi a sostanze chimiche strutturalmente affini, non si prevede tossicità, uno studio completo con tre livelli di dose può non essere ritenuto necessario. Si può applicare un limite di 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno eccetto nei casi in cui l’esposizione umana indica la necessità di utilizzare un livello di dose più elevato.

Preparazione delle dosi e somministrazione della sostanza chimica in esame

28.

La sostanza chimica in esame di norma viene somministrata con il cibo, l’acqua di abbeveraggio o per via intragastrica. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) fornisce ulteriori informazioni in merito alle vie e ai metodi di somministrazione. La via di somministrazione dipende dall’obiettivo dello studio, dalle caratteristiche chimico-fisiche della sostanza chimica in esame, dalla sua biodisponibilità e dalla via e dal metodo predominanti di esposizione degli esseri umani. È necessario giustificare la scelta della via e del metodo di somministrazione. Nell’interesse della salute animale, la somministrazione mediante sonda orale di norma va scelta solo per le sostanze per cui questa via e questo metodo di somministrazione corrispondono ragionevolmente a una potenziale esposizione umana (ad esempio farmaci). Per le sostanze chimiche ingerite con gli alimenti o presenti nell’ambiente, inclusi i pesticidi, la somministrazione avviene solitamente con il cibo o l’acqua di abbeveraggio. Tuttavia in alcune circostanze, ad esempio nel caso dell’esposizione professionale, può essere opportuna la somministrazione per altre vie.

29.

Ove necessario, la sostanza chimica di prova è disciolta o sospesa in un veicolo adeguato. È opportuno tenere conto, a seconda del caso, delle seguenti caratteristiche del veicolo e di altri additivi: effetti sull’assorbimento, sulla distribuzione, sul metabolismo o sulla ritenzione della sostanza chimica in esame, effetti sulle proprietà chimiche della sostanza chimica in esame che possono alterarne le caratteristiche tossiche ed effetti sulla consumazione di cibo o acqua sullo stato nutrizionale degli animali. Si raccomanda di prendere anzitutto in considerazione, ogni qualvolta possibile, l’uso di una soluzione/sospensione acquosa, e in seconda battuta quello di una soluzione/emulsione in olio (ad esempio olio di semi di mais) e infine la possibile soluzione in altri veicoli. Dei veicoli diversi dall’acqua devono essere note le caratteristiche tossiche. Devono essere disponibili informazioni in merito alla stabilità della sostanza chimica in esame e all’omogeneità delle soluzioni o razioni di dosaggio (a seconda del caso) nelle condizioni di somministrazione (ad esempio dieta).

30.

Per le sostanze chimiche somministrate con la dieta o l’acqua di abbeveraggio è importante impedire che le quantità della sostanza chimica in esame interferiscano con la normale alimentazione o il normale bilancio dei liquidi. In studi a lungo termine che ricorrono alla somministrazione con la dieta, la concentrazione nel cibo della sostanza chimica in esame di norma non può superare la soglia massima del 5 % della dieta totale, al fine di evitare degli squilibri alimentari. Se la sostanza chimica in esame è somministrata con la dieta, si può ricorrere sia a una concentrazione alimentare costante (mg/kg di cibo o ppm), sia a dosi di livello costante in funzione del peso dell’animale (mg/kg di peso corporeo), con calcolo su base settimanale. La scelta di eventuali alternative va specificata.

31.

In caso di somministrazione per via orale, agli animali viene somministrata una dose giornaliera della sostanza chimica in esame (sette giorni la settimana), di norma per un periodo di 12 mesi (cfr. anche paragrafo 33), sebbene a seconda degli obblighi normativi possa essere richiesta una durata superiore. Occorre giustificare la scelta di eventuali altri regimi di dosaggio, ad esempio cinque giorni la settimana. In caso di somministrazione per via cutanea, di norma gli animali sono trattati con la sostanza chimica in esame per almeno 6 ore al giorno, 7 giorni la settimana, così come specificato nel capitolo B.9 del presente allegato (10), per un periodo di 12 mesi. L’esposizione per via inalatoria si protrae per 6 ore al giorno, 7 giorni la settimana, ma, se giustificata, può essere scelta un’esposizione di 5 giorni la settimana. La durata del periodo di somministrazione di norma è di 12 mesi. Se delle specie di roditori diverse dai ratti sono sottoposte a esposizione “a naso solo”, è possibile adeguare la durata massima di esposizione per ridurre al minimo il loro stress. La scelta di una durata di esposizione inferiore a 6 ore al giorno deve essere debitamente motivata. Cfr. anche il capitolo B.8 del presente allegato (8).

32.

Se la somministrazione della sostanza chimica in esame avviene per via intragastrica, deve avvenire per mezzo di una sonda gastrica o una cannula per intubazione ogni giorno all’incirca allo stesso orario. Di norma viene somministrata una dose singola una volta al giorno, ma laddove, ad esempio, la sostanza chimica in esame fosse un irritante locale, è possibile mantenere la dose giornaliera ripartendola su due momenti diversi (due volte al giorno). Il massimo volume di liquido che può essere somministrato in un’unica soluzione dipende dalle dimensioni dell’animale. Il volume deve essere limitato il più possibile e per i roditori non può superare, di norma, 1 ml/100 g di peso corporeo (22). La variabilità dei volumi somministrati va ridotta al minimo regolando la concentrazione in modo da assicurare un volume costante in tutti i livelli di dose. Sostanze chimiche potenzialmente corrosive o irritanti sono considerate un’eccezione e devono essere diluite per evitare effetti locali gravi. Va evitato lo svolgimento di prove con concentrazioni che rischiano di essere corrosive o irritanti per il tratto gastrointestinale.

Durata dello studio

33.

Sebbene il presente metodo di prova sia impostato in primo luogo come uno studio di tossicità cronica della durata di 12 mesi, il disegno sperimentale rende possibile e può essere applicato anche a studi dalla durata più breve (ad esempio 6 o 9 mesi) o più lunga (ad esempio 18 o 24 mesi), a seconda delle disposizioni di regimi normativi specifici o dagli specifici fini meccanicistici. È opportuno che gli scostamenti da una durata di esposizione di 12 mesi siano giustificati, in particolare in caso di periodi di durata inferiore. I gruppi satellite inclusi nello studio per monitorare la reversibilità dei cambiamenti a livello tossicologico indotti dalla sostanza chimica in esame sono tenuti senza trattamento per un periodo non inferiore a 4 settimane e non oltre un terzo della durata dello studio una volta terminata l’esposizione. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) fornisce ulteriori indicazioni, tra cui considerazioni in merito alla sopravvivenza nello studio.

OSSERVAZIONI

34.

Tutti gli animali vanno osservati per identificare segni di morbilità e mortalità, in genere all’inizio e alla fine della giornata, weekend e giorni festivi inclusi. Le osservazioni cliniche vanno effettuate almeno una volta al giorno, preferibilmente alla/e stessa/e ora/e, tenendo conto del periodo di picco degli effetti previsti dopo la somministrazione nel caso in cui questa avvenga per via intragastrica.

35.

Tutti gli animali vanno sottoposti a dettagliate osservazioni cliniche almeno una volta prima della prima esposizione (per consentire il confronto all’interno dei gruppi di soggetti) e, successivamente, al termine della prima settimana dello studio e successivamente a cadenza mensile. Le osservazioni devono rispettare un protocollo che limiti al minimo indispensabile le differenze tra i singoli e non devono dipendere dai risultati del gruppo esaminato. Le osservazioni del caso vanno eseguite fuori dalla gabbia di stabulazione, preferibilmente in un ambiente standard e all’incirca sempre allo stesso orario. Occorre registrare con cura le osservazioni, preferibilmente usando sistemi di punteggio statistico definiti appositamente dal laboratorio che esegue la prova. Occorre adottare ogni misura per ridurre al minimo le variazioni delle condizioni di osservazione. Si terrà conto, tra l’altro, di tutte le alterazioni della cute, del pelo, degli occhi, delle membrane mucose, della comparsa di secrezioni ed escrezioni e dell’attività del sistema nervoso autonomo (per esempio lacrimazione, piloerezione, ampiezza pupillare, ritmo respiratorio insolito). Verranno inoltre registrate le modifiche osservate nel comportamento, nella postura e nella risposta alla manipolazione, come pure la presenza di movimenti clonici o tonici, stereotipi (per esempio tolettatura eccessiva, continuo girare in tondo) o comportamenti insoliti (per esempio automutilazione, marcia a ritroso) (24).

36.

Tutti gli animali devono essere sottoposti a un esame oftalmologico con un oftalmoscopio o un altro dispositivo idoneo, prima della prima somministrazione della sostanza chimica in esame. Al termine dello studio, questo esame deve essere condotto preferibilmente su tutti gli animali, ma almeno sui gruppi ad alta dose e di controllo. Se si riscontrano alterazioni degli occhi correlate al trattamento è necessario esaminare tutti gli animali. Se da un’analisi strutturale o da altre informazioni si riscontra una tossicità oculare, la frequenza degli esami oculari va intensificata.

37.

Per le sostanze chimiche per cui prove precedenti di tossicità a dose ripetuta a 28 giorni e/o a 90 giorni hanno indicato potenziali effetti neurotossici, possono essere svolte valutazioni facoltative della reattività sensoriale a stimoli di vario tipo (24) (ad esempio stimoli uditivi, visivi e propriocettivi) (25), (26), (27), della forza di presa (28) e dell’attività motoria (29) prima dell’inizio dello studio e a cadenza trimestrale dopo l’inizio dello studio fino al 12° mese incluso, così come alla fine dello studio (se più lungo di 12 mesi). Ulteriori indicazioni sui procedimenti utilizzabili sono contenute nelle voci bibliografiche citate. Tuttavia possono essere applicate anche procedure alternative non indicate nella bibliografia.

38.

Le sostanze chimiche per cui prove di tossicità a dose ripetuta a 28 giorni e/o a 90 giorni hanno indicato effetti potenzialmente immunotossici, alla fine dello studio possono essere sottoposte ad ulteriori analisi facoltative di tale parametro.

Peso corporeo, consumo di cibo/acqua ed efficienza alimentare

39.

Tutti gli animali devono essere pesati all’inizio del trattamento, almeno una volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. Le misurazioni del consumo di cibo e dell’efficienza alimentare devono essere effettuati almeno una volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. Se la sostanza chimica è somministrata con l’acqua di abbeveraggio, il consumo di acqua deve essere misurato almeno una volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. È utile tener conto della misurazione del consumo di acqua anche negli studi in cui quest’ultimo è alterato.

Esami ematologici e biochimico-clinici

40.

Negli studi che prevedono la presenza di roditori, vanno svolti esami ematologici su almeno 10 animali di sesso maschile e 10 animali di sesso femminile per gruppo, a 3, 6 e 12 mesi, così come alla fine dello studio (se di durata superiore a 12 mesi), sempre sugli stessi animali. Se sono previsti dei topi, può essere necessario prevedere animali satellite per poter eseguire tutti gli esami ematologici del caso (cfr. paragrafo 18). Negli studi con non roditori, saranno presi dei campioni da quantità minori di animali (ad esempio 4 animali per sesso per ciascun gruppo negli studi con cani), a stadi intermedi e alla fine dello studio, analogamente ai roditori. Le misurazioni a 3 mesi, sia per i roditori, sia per i non roditori, non devono necessariamente essere condotte se non è stato riscontrato nessun effetto in base ai parametri ematologici in uno studio precedente della durata di 90 giorni condotto con livelli di dose comparabili. Occorre prelevare campioni di sangue da un sito specifico, ad esempio con punture cardiache o dal seno retro-orbitale, sotto anestesia.

41.

Vanno esaminati i seguenti parametri (30): conteggio totale e differenziato dei leucociti, conteggio degli eritrociti, conteggio delle piastrine, ematocrito (volume sanguigno occupato dalla componente eritrocitaria), volume corpuscolare medio, emoglobina corpuscolare media, concentrazione di emoglobina corpuscolare media, tempo di prototrombina e tempo di tromboplastina parziale attivata. Possono essere misurati anche altri parametri ematologici come i corpi di Heinz o un’altra morfologia eritrocitaria atipica o metaemoglobina, se del caso, a seconda della tossicità della sostanza chimica in esame. Nel complesso è necessario adottare un approccio flessibile, in funzione dell’effetto osservato e/o previsto relativo ad una data sostanza chimica in esame. Se la sostanza chimica in esame ha un effetto sul sistema ematopoietico, possono essere indicati anche il conteggio dei reticolociti e la citologia del midollo osseo, sebbene questi non siano necessariamente esami di routine.

42.

Le determinazioni biochimiche cliniche per lo studio degli effetti tossici gravi sui tessuti e, specificamente, gli effetti su reni e fegato, vanno condotte su campioni di sangue prelevati da almeno 10 animali di sesso maschile e 10 animali di sesso femminile per gruppo, ai medesimi intervalli di tempo specificati per gli esami ematologici e sempre sugli stessi animali. Se sono previsti dei topi, può essere necessario prevedere animali satellite per poter eseguire tutte le determinazioni biochimiche cliniche del caso. Negli studi con non roditori, saranno presi dei campioni da quantità minori di animali (ad esempio 4 animali per sesso per ciascun gruppo negli studi con cani), a stadi intermedi e alla fine dello studio, analogamente ai roditori. Le misurazioni a 3 mesi, sia per i roditori, sia per i non roditori, non devono essere necessariamente condotte se non è stato riscontrato nessun effetto in base ai parametri di biochimica clinica in uno studio precedente della durata di 90 giorni condotto con livelli di dose comparabili. Si raccomanda di lasciare gli animali a digiuno la notte precedente la raccolta dei campioni (ad eccezione dei topi). Vanno esaminati i seguenti parametri (30): glucosio, urea (azoto ureico), creatinina, proteine totali, albumina, calcio, sodio, potassio, colesterolo totale, almeno due esami idonei alla valutazione epatocellulare (alanina aminotransferasi, aspartato aminotransferasi, glutammato deidrogenasi, acidi biliari totali) (31) e almeno due esami idonei alla valutazione epatobiliare (fosfatasi alcalina, gamma-glutamil transferasi, 5’-nucleotidasi, bilirubina totale, acidi biliari totali) (31). Se opportuno possono essere misurati anche altri parametri di chimica clinica, come i trigliceridi a digiuno, ormoni specifici e colinesterasi, a seconda della tossicità della sostanza chimica in esame. Nel complesso è necessario adottare un approccio flessibile, in funzione dell’effetto osservato e/o previsto relativo ad una data sostanza chimica in esame.

43.

L’esame delle urine va effettuato su almeno 10 esemplari di sesso maschile e 10 esemplari di sesso femminile per gruppo sui campioni raccolti seguendo gli stessi intervalli applicati in ambito ematologico e di chimica clinica. Le misurazioni a 3 mesi, sia per i roditori, sia per i non roditori, non devono essere necessariamente condotte se non è stato riscontrato nessun effetto sull’esame delle urine in uno studio precedente della durata di 90 giorni condotto con livelli di dose comparabili. I seguenti parametri sono stati inclusi in una raccomandazione di esperti su studi di patologia clinica (30): aspetto, volume, osmolalità o densità relativa, pH, proteine totali e glucosio. Altre determinazioni riguardano il chetone, l’urobilinogeno, la bilirubina e il sangue occulto. Se necessario, per ampliare lo studio dell’effetto o degli effetti osservato/i è possibile impiegare ulteriori parametri.

44.

Generalmente si considera necessario determinare le variabili di riferimento di natura ematologica e di biochimica clinica prima di iniziare un trattamento in studi che coinvolgono dei cani, ma ciò non è ritenuto necessario negli studi che prevedono l’uso di roditori (30). Tuttavia se non si dispone di dati storici di riferimento adeguati (cfr. paragrafo 50), si dovrebbe considerare di produrre tali dati.

Patologia

Necroscopia macroscopica

45.

Di norma tutti gli animali dello studio vanno sottoposti a completa e dettagliata necroscopia macroscopica che comprende un attento esame della superficie esterna del corpo, di tutti gli orifizi e delle cavità cranica, toracica e addominale e del loro contenuto. Tuttavia si può anche disporre (per i gruppi che saranno sacrificati nel corso dello studio o per i gruppi satellite) che le osservazioni siano limitate a parametri specifici essenziali, come la neurotossicità o l’immunotossicità (cfr. paragrafo 19). Gli animali in oggetto non devono necessariamente essere sottoposti ad autopsia e alle procedure successive descritte nei seguenti paragrafi. Per gli animali sentinella, valutando caso per caso può essere necessaria un’autopsia, a discrezione del responsabile scientifico dello studio.

46.

Va misurato il peso degli organi di ciascun animale, tranne di quelli esclusi dall’ultima parte del paragrafo 45. Le ghiandole surrenali, il cervello, l’epididimo, il cuore, i reni, il fegato, le ovaie, la milza, i testicoli, la tiroide (pesata post-fissazione, con paratiroidi) e l’utero di tutti gli animali (tranne quelli trovati moribondi e/o sacrificati nel frattempo) vanno opportunamente liberati da eventuali tessuti aderenti e pesati umidi immediatamente dopo la dissezione, per evitare l’essiccamento. In studi che prevedono l’uso di topi, la misurazione del peso delle ghiandole surrenali è facoltativa.

47.

I seguenti tessuti vanno conservati nel mezzo di fissazione più appropriato sia per il tipo di tessuto, sia per il previsto esame istopatologico successivo (32) (i tessuti tra parentesi quadre sono facoltativi):

tutte le lesioni macroscopiche

cuore

pancreas

stomaco (prestomaco, stomaco ghiandolare)

ghiandole surrenali

ileo

ghiandola paratiroidea

[denti]

aorta

digiuno

nervo periferico

testicoli

cervello (incluse le sezioni di cervello, cervelletto, bulbo/ponte)

reni

pituitaria

timo

intestino cieco

ghiandola lacrimale (esorbitale)

prostata

tiroide

cervice

fegato

retto

[lingua]

ghiandola della coagulazione

polmone

ghiandola salivare

trachea

colon

linfonodi (superficiali e profondi)

vescicola seminale

vescica

duodeno

ghiandola mammaria (obbligatoria per esemplari di sesso femminile e, se visibile ai fini della la dissezione, anche per quelli di sesso maschile)

muscolo scheletrico

utero (cervice inclusa)

epididimo

[tratto respiratorio superiore, incluso il naso, i turbinati e i seni paranasali]

pelle

[uretere]

occhi (retina inclusa)

esofago

midollo spinale (a tre livelli: cervicale, mediotoracico e lombare)

[uretra]

[femore con articolazione]

[bulbo olfattivo]

milza

vagina

cistifellea (eccetto per i topi)

ovaia

[sterno]

sezione di midollo osseo e/o un aspirato di midollo osseo fresco

ghiandola di Harder

 

 

 

In caso di organi pari, ad esempio i reni o le ghiandole surrenali, vanno conservati entrambi gli organi. I reperti clinici e di altro tipo possono evidenziare la necessità di esaminare altri tessuti. Vanno inoltre conservati tutti gli organi considerati organi bersaglio in base alle proprietà note della sostanza chimica in esame. Negli studi che prevedono una somministrazione per via cutanea, vanno preservati gli organi di cui all’elenco riferito alla via orale. In particolare, sono essenziali il campionamento e la conservazione della pelle della zona di applicazione della sostanza. In studi che prevedono la via inalatoria come metodo di somministrazione, l’elenco dei tessuti da conservare ed esaminare in relazione al tratto respiratorio deve corrispondere alle raccomandazioni contenute nel capitolo B.8 del presente allegato (8) e del capitolo B.29 del presente allegato (9). Per altri organi/tessuti (oltre ai tessuti conservati specificamente del tratto respiratorio) va esaminato l’elenco degli organi relativo alla via orale.

Esame istopatologico

48.

Sono disponibili orientamenti sulle buone pratiche nella conduzione di studi di patologia tossicologica (32). Come minimo, gli esami istopatologici devono prevedere quanto segue:

tutti i tessuti dei gruppi ad alta dose e di controllo,

tutti i tessuti degli animali che sono morti o sono stati sacrificati nel corso dello studio,

tutti i tessuti che evidenziano anomalie macroscopiche,

tessuti bersaglio o tessuti che hanno evidenziato cambiamenti legati al trattamento nel gruppo ad alta dose, di tutti gli animali in tutti gli altri gruppi-dose,

in caso di organi pari, ad esempio i reni o le ghiandole surrenali, vanno esaminati entrambi gli organi.

DATI E RELAZIONE

Dati

49.

Devono essere forniti dati individuali su ciascun animale. Inoltre, tutti i dati vanno riassunti sotto forma di tabelle che indichino per ogni gruppo sperimentale il numero di animali presenti all’inizio della prova, il numero di animali trovati morti durante il test o sacrificati per motivi umanitari e il momento di tutti i decessi/soppressioni, il numero di animali che presentano segni di tossicità, una descrizione dei segni di tossicità osservati, quali momento dell’esordio, durata e gravità di tutti gli effetti tossici, il numero di animali che presentano lesioni, il tipo di lesioni e la percentuale di animali rapportata al tipo di lesione. Le tabelle riassuntive dei dati devono fornire le medie e le deviazioni standard (per dati raccolti in via continuativa) relative agli animali che evidenziano effetti tossici o lesioni, oltre all’indicazione dell’entità delle lesioni.

50.

I dati storici di controllo possono essere utili per interpretare i risultati dello studio, ad esempio quando i dati forniti da gruppi di controllo paralleli sembrano divergere significativamente da dati recenti relativi ad animali di controllo dello stesso centro di prova/della stessa colonia. Se valutati, i dati storici di controllo vanno trasmessi dallo stesso laboratorio e devono riferirsi ad animali della medesima età e dello stesso ceppo, nonché essere generati nei cinque anni che precedono lo studio in questione.

51.

I risultati numerici vanno valutati mediante un metodo statistico adeguato e generalmente accettabile. I metodi statistici e i dati da analizzare vanno scelti già in sede di determinazione del disegno sperimentale (paragrafo 8). Questa scelta deve rendere possibili degli aggiustamenti in funzione del grado di sopravvivenza, se necessario.

Relazione sulla prova

52.

La relazione sulla prova deve riportare le informazioni seguenti:

 

Sostanza chimica in esame:

natura fisica, purezza e proprietà fisico-chimiche,

dati identificativi,

origine della sostanza chimica,

numero del lotto,

certificazione dell’analisi chimica.

 

Veicolo (se del caso):

giustificazione della scelta del veicolo (se diverso dall’acqua).

 

Animali sperimentali:

specie/ceppo utilizzato e giustificazione della scelta effettuata,

numero, età e sesso degli animali all’inizio della prova,

origine, condizioni di stabulazione, dieta ecc.,

peso di ciascun animale all’inizio della prova.

 

Condizioni sperimentali:

criteri di scelta della via di somministrazione e della dose,

laddove opportuno, metodi statistici usati per analizzare i dati,

dettagli sulla formulazione della sostanza chimica in esame/la preparazione della dieta,

dati di analisi sulla concentrazione, la stabilità e l’omogeneità della preparazione,

via di somministrazione e relativi dettagli della sostanza chimica in esame,