ALLEGATO

Programma di test per la verifica del raggiungimento dell'obiettivo dell'Unione di riduzione della prevalenza dei sierotipi di salmonella rilevanti nei gruppi di riproduttori adulti della specie Gallus gallus

1.   BASE DI CAMPIONAMENTO

La base di campionamento per l'individuazione della presenza di Salmonella enteritidis, Salmonella infantis, Salmonella hadar, Salmonella typhimurium e Salmonella virchow («sierotipi di salmonella rilevanti») è costituita da tutti i gruppi di polli domestici (Gallus gallus) adulti da riproduzione comprendenti almeno 250 capi («gruppi di riproduttori»). Restano salve le disposizioni del regolamento (CE) n. 2160/2003 e della direttiva 2003/99/CE relative agli obblighi di monitoraggio per altre popolazioni animali o altri sierotipi.

2.   MONITORAGGIO DEI GRUPPI DI RIPRODUTTORI

2.1.   Luogo, frequenza e tipologia del prelievo di campioni

Il prelievo di campioni nei gruppi di riproduttori avviene ad iniziativa dell’operatore del settore alimentare e nel quadro dei controlli ufficiali.

2.1.1.   Prelievo di campioni ad iniziativa dell’operatore del settore alimentare

Il prelievo dei campioni è effettuato ogni 2 settimane nel luogo scelto dall’autorità competente tra le seguenti 2 possibilità:

a)	nell'incubatoio; o

b)	nell'azienda.

L’autorità competente può decidere di applicare una delle opzioni suindicate all’intero programma di test per tutti i gruppi di riproduttori di polli da carne e una di tali opzioni per tutti i gruppi di riproduttori di galline ovaiole. Tuttavia, nel caso dei gruppi di riproduttori di galline ovaiole che producono uova da cova destinate al commercio all'interno dell'Unione, il prelievo dei campioni deve essere effettuato nell'azienda.

È stabilita una procedura in base alla quale il laboratorio che esegue le analisi notifica immediatamente all’autorità competente il rilevamento della presenza dei sierotipi di salmonella rilevanti nei campioni prelevati ad iniziativa dell'operatore del settore alimentare. La responsabilità della sollecita notifica del rilevamento della presenza dei sierotipi di salmonella rilevanti è dell'operatore del settore alimentare e del laboratorio che esegue le analisi.

In deroga a quanto disposto nel primo comma, se l’obiettivo dell'Unione è stato raggiunto per almeno due anni civili consecutivi, il prelievo dei campioni nell'azienda può aver luogo, a discrezione dell’autorità competente, ogni tre settimane. L'autorità competente può tuttavia decidere di mantenere o di ripristinare un intervallo di due settimane tra i prelievi nel caso in cui sia stata rilevata la presenza dei sierotipi di salmonella rilevanti in un gruppo di riproduttori nell'azienda e/o in ogni altro caso in cui l'autorità competente lo ritenga opportuno.

2.1.2.   Prelievo di campioni nel quadro dei controlli ufficiali

Il prelievo di campioni nel quadro dei controlli ufficiali consiste in:

2.1.2.1.   se il prelievo di campioni ad iniziativa dell'operatore del settore alimentare avviene nell'incubatoio:

a)	un prelievo di routine ogni 16 settimane nell'incubatoio;

b)

un prelievo di routine nell'azienda in due occasioni durante il ciclo di produzione: il primo entro le quattro settimane seguenti l'entrata in deposizione o il trasferimento all’unità di deposizione; il secondo verso la fine del periodo di deposizione, al più presto otto settimane prima della fine del ciclo di produzione;

c)	un prelievo di conferma nell'azienda, quando nei campioni prelevati nell'incubatoio sia stata individuata la presenza dei sierotipi di salmonella rilevanti.

2.1.2.2.   Se il prelievo di campioni ad iniziativa dell’operatore del settore alimentare ha luogo nell'azienda, il prelievo di routine è effettuato in tre occasioni durante il ciclo di produzione:

a)	entro le quattro settimane seguenti l'entrata in deposizione o il trasferimento all’unità di deposizione;

b)	verso la fine del periodo di deposizione, al più presto otto settimane prima della fine del ciclo di produzione;

c)	in qualsiasi momento del ciclo di produzione sufficientemente distante dai momenti in cui hanno luogo i prelievi di cui alle lettere a) e b).

2.1.2.3.   In deroga ai punti 2.1.2.1. e 2.1.2.2. e se l’obiettivo dell'Unione è stato raggiunto per almeno 2 anni civili consecutivi, l’autorità competente può sostituire i prelievi di routine con:

a)	un prelievo unico nell'azienda effettuato in un momento qualsiasi del ciclo di produzione e un prelievo annuale nell'incubatoio; o

b)	due prelievi nell'azienda effettuati nel corso del ciclo di produzione in momenti sufficientemente distanti l'uno dall'altro.

L'autorità competente può tuttavia decidere di mantenere o di ripristinare i prelievi di campioni di cui ai punti 2.1.2.1. o 2.1.2.2. nel caso in cui sia stata rilevata la presenza dei sierotipi di salmonella rilevanti in un gruppo di riproduttori nell'azienda e/o in ogni altro caso in cui l'autorità competente lo ritenga opportuno.

Un prelievo di campioni effettuato dall’autorità competente può sostituire un prelievo di campioni ad iniziativa dell’operatore del settore alimentare.

2.2.   Protocollo di prelievo dei campioni

2.2.1.   Prelievo di campioni nell'incubatoio

Ad ogni prelievo è prelevato almeno un campione per gruppo di riproduttori.

Il prelievo deve essere effettuato in un giorno di schiusa, quando sono disponibili campioni di tutti i gruppi di riproduttori. Se questo non è possibile, deve essere garantito il prelievo di campioni da ogni gruppo almeno alla frequenza indicata al punto 2.1.

Tutto il materiale di tutti gli incubatoi da cui il giorno del prelievo sono ritirati pulcini schiusi è rappresentato proporzionalmente nell'insieme dei campioni.

Se gli incubatoi contengono più di 50 000 uova di un gruppo di riproduttori, un secondo campione è prelevato da quel gruppo.

Il campione è composto almeno da:

a)

un campione composito di rivestimenti di ceste dell'incubatoio visibilmente sporchi, prelevato a caso da cinque diverse ceste o diversi punti dell'incubatoio, per una superficie totale di almeno 1 m2; se però le uova da cova di un gruppo di riproduttori occupano più incubatoi, il campione composito è prelevato da ciascuno di essi, fino a un massimo di cinque incubatoi; o

b)

un campione prelevato per mezzo di uno o più tamponi di tessuto umidi, con superficie totale di almeno 900 cm2, immediatamente dopo il trasferimento dei polli, sull’intera superficie del fondo di almeno cinque ceste dell'incubatoio o su lanugine raccolta in cinque punti, anche a terra, in ciascuno degli incubatoi (al massimo cinque) contenenti uova schiuse del gruppo; almeno un campione è prelevato da ciascuno dei gruppi da cui provengono le uova; o

c)	10 g di gusci d’uovo rotti raccolti da 25 ceste diverse (cioè un campione iniziale di 250 g) in un massimo di cinque incubatoi contenenti uova schiuse del gruppo, frantumati e mescolati per formare un sottocampione di 25 g per il test.

La procedura descritta alle lettere a), b) e c) è seguita per i prelievi di campioni effettuati ad iniziativa dell’operatore del settore alimentare e per quelli effettuati nel quadro dei controlli ufficiali. Non è però obbligatorio includere un incubatoio contenente uova di gruppi diversi se almeno l’80 % delle uova si trova in altri incubatoi da cui sono prelevati campioni.

2.2.2.   Prelievo di campioni nell'azienda

2.2.2.1.   Prelievo di campioni di routine ad iniziativa dell'operatore del settore alimentare

I campioni prelevati sono costituiti principalmente da materie fecali. Lo scopo è di individuare una prevalenza dell’1 % nel gruppo, con un limite di affidabilità del 95 %. I campioni presentano una delle seguenti forme:

a)

Campioni compositi ottenuti mescolando campioni distinti di materie fecali fresche, ciascuno di peso non inferiore a 1 g, prelevati a caso da più punti del pollaio in cui è tenuto il gruppo di riproduttori o, se in un’azienda il gruppo di riproduttori può accedere a più pollai, da ciascun gruppo di pollai dell’azienda in cui è tenuto il gruppo di riproduttori. Le materie fecali possono essere miscelate per l’analisi formando almeno due campioni compositi. Nella tabella che segue è indicato il numero dei punti in cui sono prelevati campioni distinti di materie fecali per costituire un campione composito: Numero di capi nel gruppo di riproduttori Numero di campioni di materie fecali da prelevare nel gruppo di riproduttori 250-349 200 350-449 220 450-799 250 800-999 260 1 000 o più 300

b)

Tamponi da stivale e/o campioni di polvere:   I tamponi da stivale utilizzati devono poter assorbire l'umidità in misura sufficiente. Possono essere utilizzate anche «calze» di garza tubolare.   La superficie del tampone da stivale è umidificata con idonei diluenti (0,8 % di cloruro di sodio, 0,1 % di peptone in acqua deionizzata sterile, acqua sterile o altro diluente approvato dall’autorità competente).   I campioni sono prelevati camminando nel pollaio secondo una traiettoria che permetta di raccogliere campioni rappresentativi di tutte le parti del pollaio o del settore interessato, comprese le zone coperte da lettiera e da assi, purché vi si possa camminare sopra in sicurezza. Il prelievo avviene in tutte le stie del pollaio. Una volta ultimato il prelievo nel settore prescelto, i tamponi da stivale vanno rimossi con precauzione, in modo da evitare perdite di materiale aderente. I campioni sono costituiti da: i) cinque paia di tamponi da stivale, rappresentanti ciascuno il 20 % circa della superficie del pollaio; per l’analisi i tamponi possono essere raggruppati in almeno 2 campioni compositi; o ii) almeno un paio di tamponi da stivale rappresentanti l’intera superficie del pollaio e un campione di polvere supplementare prelevato in più punti del pollaio da superfici sulle quali è visibile la presenza di polvere; per prelevare questo campione di polvere devono essere utilizzati uno o più tamponi di tessuto umidi con superficie totale di almeno 900 cm2.

c)

Se i gruppi di riproduttori sono tenuti in gabbie, i campioni possono essere costituiti da materie fecali naturalmente mescolate prelevate dai nastri per lo scarico delle deiezioni, dai raschiatoi o dalle fosse di raccolta, secondo il tipo di pollaio. Sono prelevati almeno due campioni di almeno 150 g da analizzare singolarmente: i) nastri per l'asportazione delle deiezioni sottostanti ogni fila di gabbie azionati regolarmente e scaricati in un convogliatore a coclea o in un nastro trasportatore; ii) sistema di fossa di raccolta delle deiezioni nel quale deflettori posti sotto le gabbie sono raschiati in una fossa profonda sottostante il pollaio; iii) sistema di fossa di raccolta delle deiezioni in un pollaio a gabbie sovrapposte nel quale le deiezioni cadono direttamente nella fossa. In un pollaio le gabbie sono abitualmente disposte su più piani. Il campione composito complessivo contiene materie fecali prelevate da ogni piano. Due campioni compositi sono prelevati da ogni gruppo di riproduttori nel modo descritto nei quattro commi seguenti. Nei sistemi che ne sono provvisti, i nastri o i raschiatoi sono messi in funzione il giorno del prelievo, prima che esso sia effettuato. Nei sistemi provvisti di deflettori sotto le gabbie e di raschiatoi, sono raccolte le materie fecali mescolate che si sono depositate sul raschiatoio dopo che questo è stato messo in funzione. Nelle batterie di gabbie a piramide non attrezzate con nastri trasportatori o raschiatoi è necessario raccogliere le materie fecali mescolate nella fossa di raccolta. Nei sistemi attrezzati con nastri per l'asportazione delle deiezioni le materie fecali mescolate sono raccolte nei punti di scarico all'estremità dei nastri.

2.2.2.2.   Prelievi di campioni nel quadro dei controlli ufficiali

a)	Il prelievo di routine è effettuato nei modi indicati al punto 2.2.2.1.

b)

Un prelievo di conferma, quando nei campioni prelevati nell'incubatoio sia stata individuata la presenza dei sierotipi di salmonella rilevanti, è effettuato nei modi indicati al punto 2.2.2.1. Campioni supplementari possono essere raccolti per eventuali test per l'individuazione della presenza di antimicrobici o di inibitori della crescita batterica, nel modo seguente: i volatili sono prelevati a caso da ogni pollaio dell’azienda; di norma sono prelevati fino a cinque volatili per pollaio, a meno che l’autorità competente non ritenga necessario prelevare un numero di volatili più elevato. Se la fonte d’infezione non è confermata, prima di abolire le restrizioni commerciali è effettuato sul gruppo di riproduttori o sulla sua progenie un test antimicrobico o un nuovo test batteriologico per individuare la presenza dei sierotipi di salmonella rilevanti. Se è individuata la presenza di agenti antimicrobici o di inibitori della crescita batterica, l’infezione di salmonella è considerata confermata.

c)	Sospetto di risultati errati In casi eccezionali l’autorità competente, se ha ragione di dubitare dei risultati dei test (falsi positivi o falsi negativi), può decidere di ripetere i test nei modi indicati alla lettera b).

3.   ESAME DEI CAMPIONI

3.1.   Trasporto e preparazione dei campioni

3.1.1.   Trasporto

I campioni sono inviati entro 24 ore dal prelievo, di preferenza per posta celere o corriere, ai laboratori di cui agli articoli 11 e 12 del regolamento (CE) n. 2160/2003. Se non sono inviati entro 24 ore, i campioni sono conservati refrigerati. Il trasporto può avvenire a temperatura ambiente purché siano evitate condizioni di calore eccessivo (oltre 25 °C) e di esposizione alla luce del sole. In laboratorio i campioni sono conservati refrigerati fino all’esame, che ha inizio entro 48 ore dal ricevimento ed entro 96 ore dal prelievo.

3.1.2.   Rivestimenti delle ceste degli incubatoi:

a)	immergere il campione in un litro di acqua peptonata tamponata preriscaldata a temperatura ambiente e mescolare delicatamente;

b)	continuare la coltura del campione seguendo il metodo descritto al punto 3.2.

3.1.3.   Tamponi da stivale e campioni di polvere:

a)	i tamponi da stivale/soprascarpe e il campione di polvere (tampone di tessuto) sono rimossi con cautela per evitare perdite di materie fecali aderenti o di polvere e immersi in 225 ml di acqua peptonata tamponata preriscaldata a temperatura ambiente;

b)

i tamponi da stivale/soprascarpe e il tampone di tessuto devono essere immersi completamente nell'acqua peptonata tamponata e la quantità di liquido deve essere sufficiente a permettere alla salmonella di migrare liberamente dal campione; se necessario può essere aggiunta acqua peptonata tamponata. Per i tamponi da stivale e il tampone di tessuto devono essere realizzate preparazioni separate;

c)

se due campioni compositi sono formati utilizzando cinque paia di tamponi da stivale/soprascarpe, ciascuno dei campioni compositi deve essere immerso in 225 ml, o più se necessario, di acqua peptonata tamponata; la quantità di liquido deve essere sufficiente a permettere alla salmonella di migrare liberamente dal campione;

d)	agitare per saturare completamente il campione e continuare la coltura seguendo il metodo descritto al punto 3.2.

3.1.4.   Altri campioni di materie fecali:

a)	i campioni di materie fecali sono riuniti e accuratamente mescolati ed è prelevato un sottocampione di 25 g per la coltura;

b)	i sottocampione di 25 g è immerso in 225 ml acqua peptonata tamponata preriscaldata a temperatura ambiente;

c)	la coltura del campione prosegue con il metodo descritto al punto 3.2.

Qualora siano approvate norme ISO relative alla preparazione dei campioni utilizzati per l'individuazione di salmonella, sono applicate e sostituiscono le disposizioni relative alla preparazione dei campioni di cui ai punti 3.1.2., 3.1.3. e 3.1.4.

3.2.   Metodo di rilevazione

La rilevazione dei sierotipi di salmonella rilevanti è effettuata secondo la norma EN/ISO 6579-2002/Amd1:2007, «Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of Salmonella spp. — Amendment 1: Annex D: Detection of Salmonella spp. in animal faeces and in environmental samples from the primary production stage».

Per quanto riguarda i campioni dei tamponi da stivale, i campioni di polvere e gli altri campioni di materie fecali di cui al punto 3.1, è possibile raggruppare il brodo di arricchimento di acqua peptonata tamponata incubato per colture future. Per fare questo, incubare i due campioni in acqua peptonata tamponata, come indicato al punto 3.1.3. Prelevare 1 ml di brodo incubato da ogni campione e mescolare accuratamente; poi prelevare 1 ml di miscela e inoculare le piastre di MSRV (Modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis).

Non scuotere e non agitare i campioni in acqua peptonata tamponata dopo l’incubazione perché questo libera particelle inibitrici e riduce il successivo isolamento in MSRV.

3.3.   Sierotipizzazione

È tipizzato, secondo lo schema di Kaufmann-White, almeno un isolato di ogni campione che abbia presentato una reazione positiva.

3.4.   Metodi alternativi

Per quanto riguarda i campioni prelevati ad iniziativa dell’operatore del settore alimentare, anziché i metodi di preparazione dei campioni, di rilevazione e di sierotipizzazione di cui ai punti 3.1., 3.2. e 3.3. del presente allegato possono essere utilizzati altri metodi, purché convalidati in conformità della versione più recente della norma EN/ISO 1614.

3.5.   Conservazione dei ceppi

Almeno un ceppo isolato dei sierotipi di salmonella rilevanti provenienti dai prelievi effettuati nel quadro dei controlli ufficiali, per pollaio e per anno, è conservato in vista dell'eventuale futura tipizzazione fagica o dell'effettuazione di un test di suscettibilità antimicrobica, utilizzando i metodi abituali di raccolta delle colture, che devono garantire l’integrità dei ceppi per almeno due anni. Se l'autorità competente lo decide, sono conservati per questi scopi anche i ceppi isolati da campioni prelevati ad iniziativa di operatori del settore alimentare.

4.   RISULTATI E TRASMISSIONE DI INFORMAZIONI

Un gruppo di riproduttori è considerato positivo, ai fini della verifica del raggiungimento dell’obiettivo dell'Unione,

—	se è individuata la presenza dei sierotipi di salmonella rilevanti (diversi dai ceppi vaccinali) in uno o più campioni prelevati nel gruppo, anche se i sierotipi di salmonella rilevanti sono individuati solo nel campione di polvere, o

—	se il prelievo di campioni di conferma effettuato nel quadro dei controlli ufficiali, di cui al punto 2.2.2.2., lettera b), non conferma l'individuazione dei sierotipi di salmonella rilevanti, ma nel gruppo sono individuati agenti antimicrobici o inibitori della crescita batterica.

Questa regola non si applica nei casi eccezionali descritti al punto 2.2.2.2., lettera c), in cui il risultato positivo iniziale nei campioni prelevati ad iniziativa dell'operatore del settore alimentare non è stato confermato dal prelievo effettuato nel quadro dei controlli ufficiali.

Un gruppo di riproduttori positivo è conteggiato una sola volta, indipendentemente dalla frequenza con la quale i sierotipi di salmonella rilevanti sono stati individuati in tale gruppo nel corso del periodo di produzione, e dal fatto che il prelievo sia stato effettuato ad iniziativa dell'operatore del settore alimentare o dell'autorità competente. Se però il prelievo dei campioni nel corso del periodo di produzione si estende su due anni civili, i risultati relativi a ciascun anno sono comunicati separatamente.

Le informazioni da trasmettere sono:

a)	una descrizione dettagliata delle scelte operate per il piano di campionamento e, se del caso, del tipo di campioni prelevati;

b)	il numero totale dei gruppi di riproduttori adulti comprendenti almeno 250 capi che sono stati oggetto di test almeno una volta nel corso dell'anno considerato;

c)

i risultati dei test: i) il numero totale dei gruppi di riproduttori positivi alla salmonella nello Stato membro; ii) il numero dei gruppi di riproduttori positivi ad almeno uno dei sierotipi di salmonella rilevanti; iii) il numero dei gruppi di riproduttori positivi a ciascuno dei sierotipi di salmonella o a una salmonella non specificata (isolati non tipizzabili o non sierotipizzati);

d)	il numero dei casi in cui la positività del campione iniziale prelevato ad iniziativa dell'operatore del settore alimentare non è stata confermata dal campione prelevato nel quadro dei controlli ufficiali;

e)	chiarimenti circa i risultati, in particolare riguardo ai casi eccezionali.

I risultati e ogni altra informazione pertinente sono comunicati nella relazione sulle tendenze e le fonti delle zoonosi, degli agenti zoonotici e della resistenza agli antimicrobici di cui all'articolo 9, paragrafo 1, della direttiva 2003/99/CE.