1.

Koeficijent razdjeljenja (P) definira se kao omjer uravnoteženih koncentracija otopljene tvari u dvofaznom sustavu koji obuhvaća dva otapala koja uglavnom nije moguće miješati. U slučaju n-oktanola i vode:

Budući da je koeficijent razdjeljenja količnik dviju koncentracija, nema dimenzija i najčešće se navodi kao logaritam s bazom 10.

2.

Pow je ključni parametar u studijama o ostanku kemijskih tvari u okolišu. Utvrđeno je da postoji vrlo značajan odnos između vrijednosti Pow neioniziranog oblika tvari i njihove bioakumulacije u ribama. Isto je tako utvrđeno da je Pow koristan parametar u predviđanju adsorpcije na tlo i sedimente te za utvrđivanje kvantitativnih odnosa strukture i aktivnosti za široki raspon bioloških učinaka.

3.

Izvorni prijedlog ove ispitne metode temeljio se na članku C. V. Eadsfortha i P. Mosera (1). Tijekom 1986. Savezni ured za okoliš (Umweltbundesamt) Savezne Republike Njemačke koordinirao je razvoj ispitne metode i OECD-ovo međulaboratorijsko poredbeno ispitivanje (2).

4.

Vrijednosti log Pow u rasponu od –2 do 4 (povremeno do 5 i više) (1) mogu se odrediti pokusom primjenom metode protresanja tikvice (poglavlje A.8. ovog Priloga, OECD-ova smjernica za ispitivanje 107). Metoda HPLC obuhvaća vrijednosti log Pow u rasponu od 0 do 6 (1) (2) (3) (4) (5). U okviru te metode može biti nužno procijeniti vrijednosti Pow kako bi se dodijelile prikladne referentne tvari i potkrijepili svi zaključci temeljeni na podacima dobivenima ispitivanjem. O metodama izračuna ukratko se govori u Dodatku ovoj ispitnoj metodi. Metoda HPLC ima izokratičan način djelovanja.

5.

Vrijednosti Pow ovise o okolišnim uvjetima, kao što su temperatura, pH, ionska jakost itd., koji moraju biti utvrđeni u pokusu radi ispravnog tumačenja podataka o vrijednostima Pow. Druga metoda, koja bi se mogla primijeniti kao alternativna (npr. nacrt OECD-ove smjernice o pH-metrijskoj metodi za ionizirajuće tvari (6)), može postati dostupna za ionizirajuće tvari. Iako navedeni nacrt OECD-ove smjernice može biti prikladan za određivanje vrijednosti Pow za ionizirajuće tvari, u nekim je slučajevima primjerenije primijeniti metodu HPLC pri pH-vrijednosti koja je relevantna za okoliš (vidjeti stavak 9.).

6.

HPLC obrnutih faza provodi se na analitičkim kolonama koje su napunjene komercijalno dostupnom krutom fazom koja sadržava duge lance ugljikovodika (npr. C8, C18), kemijski vezane na silicijev dioksid.

7.

Kemikalija ubrizgana u takvu kolonu prenosi se duž kolone mobilnom fazom te se razdjeljuje između mobilne faze otapala i stacionarne faze ugljikovodika. Tvari se zadržavaju proporcionalno svojem koeficijentu razdjeljenja ugljikovodik/voda, pri čemu hidrofilne tvari eluiraju prve, a lipofilne posljednje. Vrijeme zadržavanja opisuje se faktorom kapaciteta k, koji se izražava kao:

gdje je tR vrijeme zadržavanja ispitivane tvari, a t0 mrtvo vrijeme, tj. prosječno vrijeme koje je molekuli otapala potrebno za prolaz kroz kolonu. Ne zahtijevaju se kvantitativne analitičke metode i potrebno je samo odrediti vremena zadržavanja.

8.

Koeficijent razdjeljenja ispitivane tvari između oktanola i vode može se izračunati tako da se pokusom odredi njezin faktor kapaciteta k, koji se potom uvrštava u sljedeću jednadžbu:

gdje su

Navedena jednadžba može se dobiti linearnom regresijom logaritma koeficijenata razdjeljenja referentnih tvari između oktanola i vode u donosu na logaritam faktora kapaciteta referentnih tvari.

9.

Metoda HPLC obrnutih faza omogućuje procjenu koeficijenata razdjeljenja u području log Pow od 0 do 6, ali se u iznimnim slučajevima to područje može proširiti tako da obuhvaća i vrijednosti log Pow u rasponu od 6 do 10. To može zahtijevati modificiranje mobilne faze (3). Metoda nije primjenjiva na jake kiseline i baze, metalne komplekse, tvari koje reagiraju s eluensom ili površinski aktivna sredstva. Mjerenja se mogu provoditi na ionizirajućim tvarima kad su u neioniziranom obliku (slobodne kiseline ili slobodne baze) jedino primjenom odgovarajućeg pufera čija je pH-vrijednost manja od vrijednosti pKa ako je riječ o slobodnoj kiselini ili je veća od pKa vrijednosti ako je riječ o slobodnoj bazi. Alternativno, može postati dostupna pH-metrijska metoda za ispitivanje ionizirajućih tvari (6) koja bi se mogla primijeniti kao alternativna metoda (6). Ako se vrijednost log Pow određuje za primjenu u klasifikaciji opasnosti za okoliš ili u procjeni rizika za okoliš, ispitivanje treba provesti u rasponu pH-vrijednosti relevantnom za prirodni okoliš, tj. za pH-vrijednosti od 5,0 do 9.

10.

U nekim slučajevima nečistoće mogu otežati tumačenje rezultata jer nije moguće sa sigurnošću odrediti pikove. Za smjese koje daju nerazlučeni pojas treba navesti gornju i donju granicu vrijednosti log Pow te postotak površine svakog pika vrijednosti log Pow. Za smjese koje se sastoje od skupine homologa treba navesti i ponderirani prosječni log Pow (7), izračunan na temelju pojedinačnih vrijednosti Pow i odgovarajućih postotaka površine (8). Pri izračunu treba uzeti u obzir sve pikove koji čine 5 % ili više ukupne površine svih pikova (9):

Ponderirana prosječna vrijednost log Pow valjana je jedino za tvari ili smjese (npr. talova ulja) koje se sastoje od homologa (npr. niza alkana). Mjerenjem smjesa mogu se dobiti smisleni rezultati pod uvjetom da je upotrijebljeni analitički detektor jednako osjetljiv na sve tvari u smjesi i da se može razlučiti. na odgovarajući način

11.

Prije primjene metode moraju biti poznati konstanta disocijacije, strukturna formula i topljivost u mobilnoj fazi. Osim toga, bile bi korisne i informacije o hidrolizi.

12.

Da bi se povećala pouzdanost mjerenja, moraju se provoditi dvostruka određivanja.

13.

Međulaboratorijsko poredbeno ispitivanje pokazalo je da se metodom HPLC mogu dobiti vrijednosti log Pow koje su unutar ± 0,5 jedinica vrijednosti dobivenih metodom protresanja u tikvici (2). Ostale se usporedbe mogu pronaći u literaturi (4) (5) (10) (11) (12). Najtočnije rezultate pružaju korelacijski grafovi koji se temelje na strukturno srodnim referentnim tvarima (13).

14.

Radi postavljanja korelacije između izmjerenog faktora kapaciteta k neke tvari i njezine vrijednosti Pow, potrebno je uspostaviti kalibracijsku krivulju s pomoću najmanje šest točaka (vidjeti stavak 24.). Odgovarajuće referentne tvari odabire korisnik. Referentne tvari obično moraju imati vrijednosti log Pow koje obuhvaćaju log Pow ispitivane tvari, tj. najmanje jedna referentna tvar mora imati vrijednost Pow veću od vrijednosti Pow ispitivane tvari, a vrijednost Pow druge tvari mora biti manja od vrijednosti Pow ispitivane tvari. Ekstrapolaciju bi trebalo primjenjivati samo u iznimnim slučajevima. Poželjno je da referentne tvari budu strukturno srodne s ispitivanom tvari. Vrijednosti log Pow referentnih tvari koje se upotrebljavaju za kalibraciju moraju se temeljiti na pouzdanim pokusnim podacima. Međutim, za tvari koje imaju visoki log Pow (obično veći od 4) mogu se upotrebljavati izračunane vrijednosti, osim ako su dostupni pouzdani pokusni podaci. Ako se upotrebljavaju ekstrapolirane vrijednosti, treba navesti graničnu vrijednost.

15.

Dostupni su iscrpni popisi vrijednosti log Pow za mnoge skupine kemikalija (14)(15). Ako podaci o koeficijentima razdjeljenja strukturno srodnih tvari nisu dostupni, može se primijeniti općenitija kalibracija utvrđena s drugim referentnim tvarima. Preporučene referentne tvari i njihove vrijednosti Pow navedene su u tablici 1. Kod ionizirajućih tvari navedene se vrijednosti primjenjuje na njihov neionizirani oblik. Vjerodostojnost i kvaliteta vrijednosti provjereni su međulaboratorijskim poredbenim ispitivanjem.

Tablica 1.

Preporučene referentne tvari

16.

Ako je potrebno, koeficijent razdjeljenja ispitivane tvari može se procijeniti, i to po mogućnosti metodom izračuna (vidjeti Dodatak) ili, kad je to primjereno, primjenom omjera topljivosti ispitivane tvari u čistim otapalima.

17.

Potreban je tekućinski kromatograf opremljen pumpom niske pulsacije i prikladnim sustavom za detektiranje. UV detektor s valnom duljinom detekcije od 210 nm ili RI detektor primjenjivi su za široki spektar kemijskih skupina. Prisutnost polarnih skupina u stacionarnoj fazi može ozbiljno ugroziti rad kolone HPLC-a. Stoga bi stacionarna faza trebala sadržavati minimalni postotak polarnih skupina (16). Mogu se upotrebljavati trgovačka pakiranja mikročestica inverzne faze ili gotove kolone. Između sustava za ubrizgavanje i analitičke kolone može se postaviti pretkolona.

18.

Za pripremu eluacijskog otapala, koje se prije uporabe otplinjava, upotrebljava se metanol HPLC čistoće i destilirana ili deionizirana voda. Treba primijeniti izokratičku eluaciju. Treba upotrijebiti omjere metanola i vode s minimalnim udjelom vode od 25 %. Obično je omjer mješavine metanola i vode 3: 1 (v/v) zadovoljavajući za eluiranje tvari s vrijednošću log P 6 unutar jednog sata kod brzine protoka od 1 ml/min. Za tvari čiji je log P veći od 6 možda će trebati skratiti vrijeme eluiranja (i vrijeme eluiranja referentnih tvari) smanjivanjem polariteta mobilne faze ili duljine kolone.

19.

Ispitivana tvar i referentne tvari trebale bi biti topljive u mobilnoj fazi u koncentracijama koje su dovoljne za njihovu detekciju. S mješavinom metanola i vode smiju se upotrebljavati aditivi, ali samo u iznimnim slučajevima, jer aditivi mijenjaju svojstva kolone. U tim se slučajevima mora potvrditi da nema utjecaja na vrijeme zadržavanja ispitivane tvari i referentnih tvari. Ako mješavina metanola i vode nije prikladna, mogu se upotrebljavati mješavine drugih organskih otapala i vode, npr. etanola i vode, acetonitrila i vode ili izopropil alkohola (2-propanola) i vode.

20.

pH eluensa od kritične je važnosti za ionizirajuće tvari. pH-vrijednost mora biti u radnom području pH-vrijednosti kolone, obično između 2 i 8. Preporučuje se puferiranje. Treba paziti da ne dođe do taloženja soli i propadanja kolone, što se događa kod nekih smjesa organske faze i pufera. Kod stacionarnih faza koje se temelje na silicijevu dioksidu s pH-vrijednošću iznad 8 ne preporučuje se mjerenje kromatografijom HPLC, jer upotreba alkalne mobilne faze može brzo uzrokovati slabije funkcioniranje kolone.

21.

Ispitivane i referentne tvari moraju biti dovoljno čiste kako bi se na kromatogramima mogli odrediti pikovi odgovarajućih tvari. Tvari koje se upotrebljavaju za ispitivanje ili u svrhu kalibracije otapaju se po mogućnosti u mobilnoj fazi. Ako se za otapanje ispitivanih i referentnih tvari upotrebljava neko drugo otapalo, a ne mobilna faza, mobilnu fazu treba upotrijebiti za konačno razrjeđivanje prije ubrizgavanja.

22.

Za vrijeme mjerenja temperatura ne bi smjela varirati za više od ± 1 °C.

23.

Mrtvo vrijeme t0 može se izmjeriti uporabom nezadržanih organskih tvari (npr. tiouree ili formamida). Preciznije mrtvo vrijeme može se odrediti iz izmjerenih vremena zadržavanja ili seta od približno sedam članova homolognog niza (npr. n-alkil metil ketona) (17). Vremena zadržavanja tR (nC + 1) ucrtavaju se kao funkcija vremena tR (nC), gdje je nC broj atoma ugljika. Dobiva se pravac tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, gdje je A, koji predstavlja k(nC + 1)/k(nC), konstanta. Mrtvo vrijeme t0 dobiva se iz sjecišta (1 – A)t0 i nagiba A.

24.

Sljedeći je korak konstruiranje korelacijske krivulje vrijednosti log k u odnosu na log P za odgovarajuće referentne tvari s vrijednostima log P koje su u blizini vrijednosti koja se očekuje za ispitivanu tvar. U praksi se istodobno ubrizgava od 6 do 10 referentnih tvari. Određuju se vremena zadržavanja, poželjno na integratoru za bilježenje rezultata spojenom na sustav za detekciju. Odgovarajući logaritmi faktora kapaciteta, log k, ucrtavaju se kao funkcija vrijednosti log P. Regresijska jednadžba izvodi se u redovitim razmacima, najmanje jednom dnevno, kako bi se mogle uzeti u obzir moguće promjene u funkcioniranju kolone.

25.

Ispitivana tvar ubrizgava se u najmanjim količinama koje se mogu detektirati. Vrijeme zadržavanja određuje se dva puta. Koeficijent razdjeljenja ispitivane tvari dobiva se interpolacijom izračunanog faktora kapaciteta na kalibracijski graf. Za vrlo male i vrlo velike koeficijente razdjeljenja nužna je ekstrapolacija. U tim slučajevima treba posebno voditi računa o granicama pouzdanosti linije regresije. Ako je vrijeme zadržavanja uzorka izvan raspona vremena zadržavanja dobivenih za standarde, potrebno je navesti graničnu vrijednost.

26.

U izvješću mora biti navedeno sljedeće:

(1)

C. V. Eadsforth i P. Moser. (1983.) Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss i H. J. Poremski. (1988.) Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

(3)

C. V. Eadsforth. (1986.) Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

(4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt i R. Fuerer (1981.) Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.

(5)

B. McDuffie (1981.) Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

(6)

OECD (2000.) Guideline for Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Draft Guideline, November 2000.

(7)

OSPAR (1995.) ‚Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995’, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Annex 10, Oviedo, 20–24 February 1995.

(8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez i C. C. Karman. (1999.) An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3. August.

(9)

E. A. Vik, S. Bakke i K. Bansal. (1998.) Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, str. 529 – 537.

(10)

L. O. Renberg, S. G. Sundstroem i K. Sundh-Nygård. (1980.) Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

(11)

W. E. Hammers, G. J. Meurs i C. L. De-Ligny. (1982.) Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

(12)

J. E. Haky i A. M. Young. (1984.) Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

(13)

S. Fujisawa i E. Masuhara. (1981.) Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

(14)

C. Hansch i A. J. Leo. (1979.) Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, New York.

(15)

C. Hansch, chairman; A. J. Leo, dir. (1982.) Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity – Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979.) The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(17)

G. E. Berendsen, P. J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony i J. Inczédy. (1980.) On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

1.

Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 201 (2006., prilog ispravljen 2011.). Bilo je utvrđeno da je ispitnu metodu potrebno proširiti kako bi se uključile još neke vrste i ispunili zahtjevi ocjenjivanja opasnosti i razvrstavanja kemikalija. Revizija je provedena na temelju širokog praktičnog iskustva, znanstvenog napretka u području toksikoloških istraživanja s algama i široke regulatorne primjene koja je uslijedila nakon njezina donošenja.

2.

Upotrijebljene definicije navedene su u Dodatku 1.

3.

Svrha je ispitivanja odrediti učinke kemikalije na rast slatkovodnih mikroalgi i/ili cijanobakterija. Eksponencijalno rastući ispitni organizmi izlažu se ispitivanoj kemikaliji u šaržnim kulturama, u pravilu tijekom 72 sata. Unatoč relativno kratkom trajanju ispitivanja, mogu se ocijeniti učinci na nekoliko generacija.

4.

Odgovor sustava sastoji se u smanjenju rasta niza kultura algi (ispitnih jedinica) koje su izložene različitim koncentracijama ispitivane kemikalije. Odgovor se ocjenjuje kao funkcija koncentracije izlaganja u odnosu na prosječni rast ponavljanih, neizloženih kontrolnih kultura. Da bi se u punoj mjeri izrazila reakcija sustava na toksične učinke (optimalna osjetljivost), kulturama treba prije mjerenja smanjenja specifične brzine rasta ostaviti dovoljno vremena da postignu neograničeni eksponencijalni rast, uz dovoljno nutrijenata i neprekidno osvjetljenje.

5.

Rast i inhibicija rasta kvantificiraju se mjerenjima biomase algi u ovisnosti o vremenu. Biomasa algi definirana je kao suha masa po volumenu, npr. mg algi / l ispitne otopine. Ipak, suhu je masu teško mjeriti pa se stoga primjenjuju zamjenski parametri. Od zamjenskih parametara najčešće se upotrebljava broj stanica. Ostali su zamjenski parametri volumen stanica, fluorescencija, optička gustoća itd. Mora biti poznat faktor pretvorbe za prevođenje izmjerenih zamjenskih parametara u biomasu.

6.

Krajnja je točka ispitivanja inhibicija rasta, izražena kao logaritamsko povećanje biomase (prosječna specifična brzina rasta) u razdoblju izlaganja. Iz prosječnih specifičnih brzina rasta zabilježenih u nizu ispitnih otopina određuje se koncentracija koja izaziva određeno x-postotno smanjenje brzine rasta (npr. 50 %), koja se izražava kao ErCx (npr. ErC50).

7.

U ovoj se ispitnoj metodi upotrebljava i prirast kao dodatna varijabla odgovora koja je potrebna da bi se ispunili određeni regulatorni zahtjevi u nekim državama. Prirast se definira kao biomasa na kraju razdoblja izlaganja umanjena za biomasu na početku razdoblja izlaganja. Iz prirasta zabilježenog u nizu ispitnih otopina izračunava se koncentracija koja izaziva određeno x-postotno smanjenje prirasta (npr. 50 %), koja se izražava kao EyCx (npr. EyC50).

8.

Osim toga, može se statistički odrediti najniža koncentracija s vidljivim učinkom (LOEC) i najviša koncentracija bez vidljivog učinka (NOEC).

9.

Za određivanje ispitnih uvjeta korisno je imati informacije o ispitivanoj kemikaliji kao što su strukturna formula, čistoća, stabilnost na svjetlosti, stabilnost u uvjetima ispitivanja, svojstva apsorpcije svjetlosti, pKa i rezultati istraživanja pretvorbe, uključujući biorazgradivost u vodi.

10.

Treba biti poznata topljivost u vodi, koeficijent razdjeljenja oktanol/voda (Pow) i tlak pare ispitivane kemikalije te biti raspoloživa validirana metoda za kvantifikaciju kemikalije u ispitnim otopinama s dokumentiranim iskorištenjem i granicom detekcije.

11.

Da bi ispitivanje bilo valjano, mora ispuniti sljedeće kriterije:

12.

Jedna ili više referentnih kemikalija, kao što je 3,5-diklorfenol koji je upotrijebljen u međulaboratorijskom ispitivanju usporedivosti (1), mogu se ispitati radi provjere postupka. Kao referentna kemikalija za zelene alge može se upotrijebiti i kalijev dikromat. Poželjno je da se referentna kemikalija ispita najmanje dvaput godišnje.

13.

Ova se ispitna metoda najlakše primjenjuje kod kemikalija topljivih u vodi za koje se može pretpostaviti da će u ispitnim uvjetima ostati u vodi. Opisani postupak ponekad je potrebno izmijeniti (npr. zatvoreni sustav, kondicioniranje ispitnih posuda) kad se ispituju kemikalije koje su hlapljive, vrlo adsorptivne, obojene, slabo topljive u vodi ili kemikalije koje mogu utjecati na raspoloživost nutrijenata ili minerala u ispitnom mediju. Smjernice za neke izmjene mogu se pronaći u literaturi pod (2), (3) i (4).

14.

Ispitne posude i druga aparatura koja dolazi u dodir s ispitnim otopinama moraju biti u cijelosti izrađeni od stakla ili drugog kemijski inertnog materijala. Aparaturu je potrebno temeljito oprati kako organski i anorganski onečišćivači ne bi utjecali na rast algi ili na sastav ispitnih otopina.

15.

Ispitne su posude u pravilu staklene tikvice dovoljnih dimenzija da se osigura potreban volumen kulture za mjerenja tijekom ispitivanja i dovoljan prijenos mase CO2 iz atmosfere (vidjeti stavak 30.). Valja napomenuti da volumen tekućine mora biti dovoljan za analitička određivanja (vidjeti stavak 37.).

16.

Osim toga, potrebna je sljedeća oprema (djelomično ili u cijelosti):

17.

Može se upotrijebiti nekoliko vrsta slobodnoplivajućih mikroalgi i cijanobakterija. Za sojeve navedene u Dodatku 2. dokazano je da su prikladni za ispitni postupak iz ove ispitne metode.

18.

Ako se upotrebljavaju druge vrste, treba navesti soj i/ili podrijetlo. Treba se uvjeriti da se eksponencijalni rast odabranih ispitnih algi može održati tijekom cjelokupnog razdoblja ispitivanja u odgovarajućim ispitnim uvjetima.

19.

Preporučuju se dva alternativna uzgojna medija, OECD i AAP. Sastav tih medija prikazan je u Dodatku 3. Valja napomenuti da ta dva medija imaju različitu početnu pH-vrijednost i puferski kapacitet (za regulaciju povećanja pH-vrijednosti). Stoga se kod ispitivanja mogu dobiti različiti rezultati ovisno o mediju koji se upotrebljava, posebno kad se ispituju ionizirajuće kemikalije.

20.

U određenim je slučajevima potrebno izmijeniti uzgojni medij, npr. kad se ispituju metali i kelatna sredstva ili kad se ispitivanje provodi s različitim pH-vrijednostima. Uporabu izmijenjenog medija treba detaljno opisati i obrazložiti (3) (4).

21.

Početna biomasa mora biti jednaka u svim ispitnim kulturama i mora biti dovoljno niska da se može postići eksponencijalni rast tijekom čitavog razdoblja inkubacije bez bojazni da bi se mogle iscrpiti zalihe nutrijenata. Početna biomasa ne smije biti viša od 0,5 mg/l suhe mase. Preporučuju se sljedeće početne koncentracije stanica:

22.

Raspon koncentracija u kojemu se mogu očekivati učinci može se odrediti na temelju rezultata ispitivanja za određivanje raspona. Za konačno, glavno ispitivanje treba odabrati najmanje pet koncentracija raspoređenih u geometrijskom nizu uz faktor do najviše 3,2. Kod ispitivanih kemikalija čija je krivulja koncentracija-odgovor ravna ponekad je opravdano upotrebljavati viši faktor. Niz koncentracija trebao bi po mogućnosti obuhvatiti područje u kojemu se javlja inhibicija rasta algi od 5 do 75 %.

23.

U planu ispitivanja treba predvidjeti po tri ponavljanja pri svakoj ispitnoj koncentraciji. Ako nije potrebno odrediti NOEC, plan ispitivanja može se promijeniti tako da se poveća broj koncentracija i smanji broj ponavljanja po koncentraciji. Broj kontrolnih ponavljanja mora biti najmanje tri, a u idealnom slučaju dvostruko veći od broja ponavljanja za svaku ispitnu koncentraciju.

24.

Za analitička određivanja koncentracija ispitivane kemikalije može se pripremiti zaseban niz ispitnih otopina (vidjeti stavke 36. i 38.).

25.

Ako se za otapanje ispitivane kemikalije upotrebljava otapalo, potrebno je predvidjeti dodatne kontrole koje sadržavaju istu koncentraciju otapala kao ispitne kulture.

26.

Kulturu inokuluma u ispitnom mediju treba pripremiti dva do četiri dana prije početka ispitivanja, kako bi se ispitne alge prilagodile uvjetima ispitivanja i bile u fazi eksponencijalnog rasta u trenutku kad se primjenjuju za inokulaciju ispitnih otopina. Biomasu algi treba prilagoditi tako da kultura inokuluma može eksponencijalno rasti do početka ispitivanja. Kulturu inokuluma potrebno je inkubirati u istim uvjetima kao ispitne kulture. Mjerenjem povećanja biomase u kulturi inokuluma treba se uvjeriti da je rast u granicama normale za ispitivani soj u uvjetima uzgoja. Primjer postupka uzgoja kulture algi opisan je u Dodatku 4. Ponekad može biti potrebno provesti još jedan korak razmnožavanja kulture inokuluma da bi se izbjegla istodobna dijeljenja stanica za vrijeme ispitivanja.

27.

Sve ispitne otopine moraju sadržavati istu koncentraciju uzgojnog medija i istu početnu biomasu ispitnih algi. Ispitne otopine odabranih koncentracija uglavnom se pripremaju miješanjem radne otopine ispitivane kemikalije s uzgojnim medijem i kulturom inokuluma. Radne otopine u pravilu se pripremaju otapanjem kemikalije u ispitnom mediju.

28.

Ako je ispitivana kemikalija slabo topljiva u vodi, kao nosači za dodavanje kemikalije u ispitni medij mogu se upotrebljavati otapala, npr. aceton, t-butil alkohol i dimetilformamid (2) (3). Koncentracija otapala ne smije biti viša od 100 μm/l i mora biti jednaka u svim kulturama u ispitnom nizu (uključujući kontrole).

29.

Ispitne se posude začepe zrakopropusnim čepovima. Posude se protresu i stave u inkubator za uzgoj. Alge se tijekom ispitivanja moraju držati u suspenziji i mora se omogućiti prijenos CO2. To se postiže stalnim tresenjem ili miješanjem. Kulture treba držati na temperaturi između 21 i 24 °C, uz toleranciju ± 2 °C. Kod vrsta koje nisu navedene u Dodatku 2., npr. tropskih vrsta, mogu biti primjerene više temperature, pod uvjetom da se mogu ispuniti kriteriji valjanosti. Preporučuje se da se tikvice nasumično rasporede u inkubatoru i svakodnevno razmještaju.

30.

pH-vrijednost kontrolnog medija tijekom ispitivanja ne smije se povećati za više od 1,5 jedinica. Kod metala i kemikalija koji djelomično ioniziraju pri pH-vrijednosti koja je približna ispitnoj pH-vrijednosti ponekad je nužno ograničiti pomak pH-vrijednosti kako bi se dobili obnovljivi i dobro definirani rezultati. Pomak od < 0,5 pH jedinica tehnički je izvediv i može se postići osiguravanjem odgovarajućeg prijenosa mase CO2 iz okolnog zraka u ispitnu otopinu, npr. povećanjem brzine tresenja. Druga je mogućnost da se smanji potrošnja CO2 smanjenjem početne biomase ili trajanja ispitivanja.

31.

Površina na kojoj se kulture inkubiraju mora primati neprekidno i ravnomjerno fluorescentno svjetlo, npr. hladno bijelo ili dnevno svjetlo. Različiti sojevi algi i cijanobakterija imaju različite potrebe za svjetlošću. Intenzitet svjetlosti potrebno je prilagoditi ispitnim organizmima. Intenzitet svjetlosti na razini ispitnih otopina za preporučene vrste zelenih algi treba odabrati unutar područja od 60 do 120 · μE m– 2 s– 1, mjereno u fotosintetički učinkovitom spektralnom području od 400 do 700 nm primjenom odgovarajućeg prijamnika. Neke vrste, posebno Anabena flos-aquae, dobro rastu na svjetlosti slabijeg intenziteta i jaka ih svjetlost može oštetiti. Kod tih vrsta treba odabrati prosječni intenzitet svjetlosti u području od 40 do 60 μE m– 2 s– 1. (Kod instrumenata za mjerenje intenziteta svjetlosti baždarenih u luksima područje od 4 440 do 8 880 luksa za hladno bijelo svjetlo približno odgovara preporučenom intenzitetu svjetlosti od 60 do 120 μE m– 2 s– 1). Intenzitet svjetlosti treba održavati unutar ±15 % prosječnog intenziteta svjetlosti na inkubacijskom području.

32.

Ispitivanje u pravilu traje 72 sata. Ipak, ispitivanje može trajati i duže ili kraće, pod uvjetom da su zadovoljeni svi kriteriji valjanosti iz stavka 11.

33.

Biomasa algi u svakoj tikvici određuje se najmanje jedanput dnevno tijekom ispitivanja. Ako se mjerenja provode na malom volumenu pipetiranom iz ispitne otopine, izvađenu otopinu nije potrebno nadomjestiti.

34.

Mjerenje biomase provodi se ručnim brojenjem stanica pod mikroskopom ili elektroničkim brojačem čestica (za broj stanica i/ili biovolumen). Mogu se primjenjivati i alternativne tehnike, npr. protočna citometrija, flourescencija klorofila in vitro ili in vivo (5) (6) ili optička gustoća, pod uvjetom da se može dokazati zadovoljavajuća korelacija s biomasom unutar područja biomasa koje se javljaju u ispitivanju.

35.

pH-vrijednost otopina potrebno je izmjeriti na početku i na kraju ispitivanja.

36.

Ako je raspoloživ analitički postupak za određivanje ispitivane kemikalije u rasponu koncentracija koje se upotrebljavaju u ispitivanju, ispitne otopine potrebno je analizirati kako bi se provjerile početne koncentracije i ujednačenost koncentracija izloženosti tijekom ispitivanja.

37.

Ponekad je dovoljno analizirati koncentraciju ispitivane kemikalije u jednoj niskoj i jednoj visokoj ispitnoj koncentraciji na početku i na kraju ispitivanja te koncentraciju oko očekivane vrijednosti EC50 ako se očekuje da će koncentracije izloženosti tijekom ispitivanja odstupati manje od 20 % od nazivnih vrijednosti. Ako nije vjerojatno da će koncentracije ostati unutar 80 do 120 % nazivne vrijednosti, preporučuje se analiza svih ispitnih koncentracija na početku i na kraju ispitivanja. U slučaju hlapljivih, nestabilnih i vrlo adsorptivnih ispitivanih kemikalija preporučuje se da se tijekom razdoblja izloženosti obave dodatna uzorkovanja za analizu u razmacima od 24 sata kako bi se mogao bolje odrediti gubitak ispitivane kemikalije. Kod takvih kemikalija mogu biti potrebna dodatna ponavljanja. U svakom slučaju, koncentraciju ispitivane kemikalije treba određivati samo na jednoj posudi u svakoj ispitnoj koncentraciji (ili na združenom sadržaju posuda ponavljanja).

38.

S ispitnim medijima koji su posebno pripremljeni za analizu koncentracija izlaganja tijekom ispitivanja treba postupati jednako kao s medijima na kojima se provodi ispitivanje, tj. treba ih inokulirati algama i inkubirati u jednakim uvjetima. Ponekad je za analizu koncentracije otopljene ispitivane kemikalije potrebno odvojiti alge od medija. Odvajanje se po mogućnosti provodi laganim centrifugiranjem gdje je g-sila tek tolika da se postigne taloženje algi.

39.

Ako je moguće dokazati da se koncentracija ispitivane kemikalije tijekom ukupnog trajanja ispitivanja na zadovoljavajući način održava u granicama ± 20 % nazivne ili izmjerene početne koncentracije, analiza rezultata može se temeljiti na nazivnim ili izmjerenim početnim vrijednostima. Ako odstupanje od nazivne ili izmjerene početne koncentracije nije unutar područja od ± 20 %, analiza rezultata mora se temeljiti na srednjoj geometrijskoj koncentraciji tijekom izlaganja ili modelima koji opisuju opadanje koncentracije ispitivane kemikalije (20) (8).

40.

Test inhibicije rasta algi dinamičniji je ispitni sustav nego što je to većina testova kratkotrajne toksičnosti u vodi. Stoga je ponekad teško odrediti stvarne koncentracije izlaganja, što posebno vrijedi za ispitivanja adsorptivnih kemikalija u niskim koncentracijama. U tom slučaju nestanak ispitivane kemikalije iz otopine adsorpcijom na rastuću biomasu algi ne znači gubitak kemikalije iz ispitnog sustava. Kod analize rezultata ispitivanja treba provjeriti je li smanjenje koncentracije ispitivane kemikalije tijekom ispitivanja praćeno smanjenjem inhibicija rasta. Ako je to slučaj, može se razmotriti primjena prikladnog modela koji opisuje opadanje koncentracije ispitivane kemikalije (7). U protivnom će možda biti primjereno provesti analizu rezultata na temelju početnih (nazivnih ili izmjerenih) koncentracija.

41.

Mikroskopskim pregledom trebalo bi se uvjeriti u normalan i zdrav izgled kulture inokuluma te uočiti eventualne promjene u izgledu algi (one koje mogu biti posljedica izlaganja ispitivanoj kemikaliji) na kraju ispitivanja.

42.

U određenim okolnostima, npr. kad preliminarno ispitivanje ukazuje na to da ispitivana kemikalija nema toksično djelovanje pri koncentraciji do 100 mg/l ili do granice topljivosti u ispitnom mediju (ovisno o tomu što je manje), može se provesti granično ispitivanje za usporedbu odgovora kontrolne skupine s jednom ispitnom skupinom (100 mg/l ili koncentracija koja odgovara granici topljivosti). Preporučuje se da se uz granično ispitivanje svakako napravi analiza koncentracije izloženosti. Za granično ispitivanje vrijede svi prethodno opisani ispitni uvjeti i kriteriji valjanosti, s time da broj ponavljanja u ispitnoj skupini ne smije biti manji od šest. Varijable odgovora u kontrolnoj i ispitnoj skupini mogu se analizirati statističkim testom za usporedbu srednjih vrijednosti, npr. Studentovim t-testom. Ako su varijance dviju skupina nejednake, potrebno je provesti prilagođeni t-test za nejednake varijance.

43.

Biomasa u ispitnim posudama može se izraziti u jedinicama mjerenog zamjenskog parametra (npr. broj stanica, fluorescencija).

44.

Da bi se dobio grafički prikaz krivulja rasta, potrebno je izraditi tablicu procijenjenih koncentracija biomase u ispitnim i kontrolnim kulturama, zajedno s koncentracijama ispitivanog materijala, koje se bilježe s razlučljivošću od najmanje jednog cijelog sata, i vremenima mjerenja. U ovoj prvoj fazi mogu biti korisne i logaritamske i linearne skale; međutim, logaritamske su skale obvezatne i općenito daju bolji prikaz promjena uzorka rasta u razdoblju ispitivanja. Valja napomenuti da kad se eksponencijalni rast prikaže na logaritamskoj skali kao rezultat se dobiva pravac, a nagib pravca pokazuje specifičnu brzinu rasta.

45.

Na grafičkim prikazima treba provjeriti rastu li kontrolne kulture tijekom ispitivanja eksponencijalno i očekivanom brzinom. Treba kritički preispitati sve točke podataka i izgled grafova te provjeriti sirove podatke i postupke kako bi se utvrdile eventualne pogreške. Potrebno je posebno provjeriti one točke podataka kod kojih se čini da su odstupanja posljedica sustavne pogreške. Ako je očito i/ili vrlo vjerojatno da je riječ o pogreškama u postupku, odgovarajuću točku treba označiti kao stršeću vrijednost i isključiti iz kasnije statističke analize. (Nulta koncentracija algi u jednoj od dvije ili tri posude ponavljanja može ukazivati na to da posuda nije pravilno inokulirana ili da nije bila dobro očišćena.) U izvješću o ispitivanju treba jasno navesti zašto je određena točka odbačena kao stršeća vrijednost. Prihvatljivi su razlozi samo (rijetke) pogreške u postupku, ali ne i loša preciznost. Statistički postupci za utvrđivanje stršećih vrijednosti imaju kod ove vrste problema ograničenu primjenu i ne mogu zamijeniti stručnu prosudbu. Stršeće vrijednosti (koje su označene kao takve) treba po mogućnosti zadržati među točkama podataka u kasnijim grafičkim ili tabličnim prikazima podataka.

46.

Svrha je ispitivanja utvrditi učinke ispitivane kemikalije na rast algi. U ovoj su ispitnoj metodi opisane dvije varijable odgovora, budući da različite jurisdikcije imaju različite preferencije i regulatorne zahtjeve. Da bi rezultati ispitivanja bili prihvatljivi u svim jurisdikcijama, učinke treba ocijeniti primjenom obiju varijabli odgovora opisanih u nastavku pod točkama (a) i (b).

(a)    Prosječna specifična brzina rasta : ova se varijabla odgovora izračunava na temelju logaritamskog povećanja biomase u razdoblju ispitivanja, izraženog po danu

(b)    Prirast : ova varijabla odgovora predstavlja biomasu na kraju ispitivanja umanjenu za početnu biomasu.

47.

Valja napomenuti da vrijednosti toksičnosti izračunane primjenom tih dviju varijabli odgovora nisu usporedive i tu razliku treba uzeti u obzir kod uporabe rezultata ispitivanja. Ako su ispoštovani ispitni uvjeti ove metode, vrijednosti ECx na temelju prosječne specifične brzine rasta (ErCx) općenito su više od rezultata na temelju prirasta (EyCx) zbog razlike u matematičkoj osnovi tih dvaju pristupa. To ne treba tumačiti kao razliku u osjetljivosti dviju varijabli odgovora, nego jednostavno prihvatiti da su te vrijednosti matematički različite. Pojam prosječne specifične brzine rasta temelji se na općenitom obrascu eksponencijalnog rasta algi u neograničenim kulturama, gdje se toksičnost procjenjuje na temelju učinaka na brzinu rasta neovisno o apsolutnoj vrijednosti specifične brzine rasta u kontrolnoj skupini, nagibu krivulje koncentracija-odgovor i trajanju ispitivanja. Za razliku od toga, rezultati koji se temelje na varijabli odgovora ‚prirast’ ovise o svim tim drugim varijablama. EyCx ovisi o specifičnoj brzini rasta vrsta algi upotrijebljenih u svakom ispitivanju i o maksimalnoj specifičnoj brzini rasta, koja se može razlikovati između vrsta, pa čak i između sojeva algi. Ovu varijablu odgovora ne treba upotrebljavati za usporedbu osjetljivosti na toksine među vrstama algi, pa čak ni među sojevima algi. Iako se, sa znanstvenog stajališta, procjeni toksičnosti na temelju prosječne specifične brzine rasta daje prednost, u ovu su ispitnu metodu uključene i procjene toksičnosti na temelju prirasta kako bi se zadovoljili trenutačni regulatorni zahtjevi u nekim državama.

48.

Prosječna specifična brzina rasta u određenom razdoblju izračunava se kao logaritamsko povećanje biomase za svaku kontrolnu i ispitnu posudu primjenom sljedeće jednadžbe:

gdje je:

Za svaku ispitnu i kontrolnu skupinu treba izračunati srednju vrijednost brzine rasta s procjenom varijance.

49.

Izračuna se prosječna specifična brzina rasta za ukupno vrijeme ispitivanja (obično dana 0 – 3); pritom se umjesto izmjerene početne vrijednosti kao početna vrijednost uzima nazivna inokulirana biomasa, jer se na taj način u pravilu postiže veća preciznost. Ako oprema koja se upotrebljava za mjerenje biomase dopušta dovoljno precizno određivanje male biomase inokuluma (npr. protočni citometar), može se upotrijebiti izmjerena početna koncentracija biomase. Isto tako, treba odrediti etapnu brzinu rasta, koja se izračunava kao specifična brzina rasta za svaki dan ispitivanja (dani 0 – 1, 1 – 2 i 2 – 3), te provjeriti je li kontrolna brzina rasta stalna (vidjeti kriterije valjanosti, stavak 11.). Ako je specifična brzina rasta prvoga dana znatno niža od ukupne prosječne specifične brzine rasta, to može ukazivati na fazu prilagodbe. Dok se faza prilagodbe u kontrolnim kulturama može smanjiti i gotovo eliminirati pravilnim razmnožavanjem pretkulture, faza prilagodbe kod izloženih kultura može biti znak oporavka nakon prvobitnog toksičnog šoka ili smanjenog izlaganja zbog gubitka ispitivane kemikalije (uključujući sorpciju na biomasu algi) nakon početnog izlaganja. Stoga se može ocijeniti etapna brzina rasta kako bi se ocijenili učinci ispitivane kemikalije koji se javljaju tijekom razdoblja izlaganja. Značajne razlike između etapne brzine rasta i prosječne brzine rasta ukazuju na odstupanje od stalnog eksponencijalnog rasta i zahtijevaju temeljito preispitivanje krivulja rasta.

50.

Postotak inhibicije brzine rasta za pojedina ponavljanja u ispitnim skupinama izračunava se pomoću sljedeće jednadžbe [2]:

gdje je:

51.

Ako se za pripremu ispitnih otopina upotrebljavaju otapala, za izračun postotka inhibicije treba upotrebljavati kontrole s otapalom, a ne bez otapala.

52.

Prirast se izračunava kao biomasa na kraju ispitivanja umanjena za početnu biomasu za svaku kontrolnu i ispitnu posudu. Za svaku ispitnu koncentraciju i kontrolu treba izračunati srednju vrijednost prirasta s procjenama varijance. Postotak inhibicije prirasta ( % Iy) za pojedina ponavljanja u ispitnoj skupini može se izračunati na sljedeći način:

gdje je:

53.

Napravi se grafički prikaz postotka inhibicije u odnosu na logaritam koncentracije ispitivane kemikalije i dobiveni se graf detaljno pregleda, zanemarujući sve točke podataka koje su u prvoj fazi izdvojene kao stršeće vrijednosti. Točkama podataka prostim okom ili računalnom interpolacijom prilagodi se glatka krivulja kako bi se dobio prvi dojam o odnosu koncentracija-odgovor te se potom nastavlja detaljnijom metodom, po mogućnosti računalnom statističkom metodom. Ovisno o predviđenoj uporabi podataka, kvaliteti (preciznosti) i količini podataka te raspoloživosti alata za analizu podataka, može se donijeti odluka (koja je u određenim slučajevima posve opravdana) da se u ovoj fazi prekine analiza podataka i jednostavno očitaju ključne vrijednosti EC50 i EC10 (i/ili EC20) s krivulje podešene prostim okom (vidjeti i odjeljak u nastavku o stimulirajućim učincima). Neki su od valjanih razloga za neupotrebu statističke metode:

54.

Cilj je dobiti kvantitativni odnos koncentracija-odgovor regresijskom analizom. Ako se provede linearizacijska pretvorba podataka odgovora – npr. u jedinice probit, logit ili Weibullova modela (8) – može se provesti ponderirana linearna regresija; ipak, prednost se daje postupcima nelinearne regresije koji se bolje nose s neizbježnim nepravilnostima podataka i odstupanjima od pravilnih razdioba. S približavanjem nultoj ili potpunoj inhibiciji te se nepravilnosti mogu pretvorbom i dodatno povećati te tako otežati analizu (8). Valja napomenuti da su standardne metode analize za vrijednosti dobivene pretvorbom (probit, logit ili Weibull) namijenjene kvantalnim podacima (npr. smrtnost ili preživljavanje) i moraju se prilagoditi da bi se mogle primijeniti na podatke o rastu ili biomasi. Konkretni postupci za određivanje vrijednosti ECx iz kontinuiranih podataka mogu se pronaći u literaturi pod (9) (10) i (11). Primjena nelinearne regresijske analize podrobnije je opisana u Dodatku 5.

55.

Za svaku varijablu odgovora koja se analizira potrebno je izračunati procjene točaka za vrijednosti ECx na temelju odnosa koncentracija-odgovor. Po mogućnosti, za sve procjene treba odrediti granice pouzdanosti 95 %. Valjanost podudaranja podataka odgovora s regresijskim modelom procjenjuje se grafički ili statistički. Regresijsku analizu potrebno je provesti na temelju pojedinačnih odgovora u ponavljanjima, a ne na temelju srednjih vrijednosti ispitnih skupina. Ipak, ako je nelinearno prilagođavanje krivulje teško ili nemoguće zbog velike raspršenosti podataka, problem se može zaobići provođenjem regresije na srednjim vrijednostima po skupinama kao praktičnim načinom smanjenja utjecaja mogućih stršećih vrijednosti. Ako se primjenjuje ova opcija, to treba navesti u izvješću o ispitivanju kao odstupanje od uobičajenog postupka uz napomenu da prilagođavanje krivulje pojedinačnim ponavljanjima nije dalo dobar rezultat.

56.

Ako raspoloživi regresijski modeli/metode nisu prikladni za podatke, procjene EC50 i granice pouzdanosti mogu se dobiti i linearnom interpolacijom sa samonadopunjavanjem (‚bootstrapping’) (13).

57.

Za procjenu LOEC-a, a time i NOEC-a, u vezi s učincima ispitivane kemikalije na brzinu rasta potrebno je usporediti srednje vrijednosti obrada primjenom tehnika analize varijance (ANOVA). Zatim srednju vrijednost za svaku koncentraciju treba usporediti s kontrolnom srednjom vrijednošću primjenom odgovarajuće metode višestruke usporedbe ili testa trenda. Ovdje može biti koristan Dunnettov ili Williamsov test (12) (14) (15) (16) (17). Potrebno je provjeriti vrijedi li pretpostavka homogenosti varijanci ANOVA-e. To se može učiniti grafički ili formalnim testom (17). Prikladni su Leveneov i Bartlettov test. Ako pretpostavka homogenosti varijanci nije zadovoljena, to se ponekad može ispraviti logaritamskom pretvorbom podataka. Ako je heterogenost varijance prevelika da bi se mogla ispraviti pretvorbom, trebalo bi razmotriti mogućnost analize metodama kao što su Jonckheereovi testovi trenda postupnim snižavanjem. Dodatne smjernice za određivanje NOEC-a mogu se pronaći u literaturi (11).

58.

Novije znanstvene spoznaje rezultirale su preporukom da se pojam NOEC-a napusti i zamijeni procjenama točaka ECx dobivenih regresijom. Za ovaj test s algama nije utvrđena određena vrijednost x. Čini se da je primjereno područje od 10 do 20 % (ovisno o odabranoj varijabli odgovora), a poželjno je da se navedu obje vrijednosti, EC10 i EC20.

59.

Ponekad se pri niskim koncentracijama može zapaziti stimulacija rasta (negativna inhibicija). To može biti posljedica hormeze (toksička stimulacija) ili unošenja stimulirajućih faktora rasta s ispitivanim materijalom u upotrijebljeni minimalni medij. Dodavanje anorganskih nutrijenata ne bi smjelo imati nikakav izravan utjecaj budući da ispitni medij tijekom ispitivanja mora stalno sadržavati višak nutrijenata. Stimulacija pri niskim dozama u pravilu se može zanemariti kod izračunavanja EC50, osim ako je ekstremno visoka. U slučaju ekstremne stimulacije, ili kad je potrebno izračunati ECx za niske vrijednosti x, ponekad je potrebno primijeniti posebne postupke. Pojave stimulacije rasta potrebno je kad je god to moguće uključiti u analizu podataka, a ako raspoloživi softver za prilagođavanje krivulje ne može prihvatiti male vrijednosti stimulacije, može se primijeniti linearna interpolacija sa samonadopunjavanjem (‚bootstrapping’). U slučaju ekstremne stimulacije može se razmotriti primjena modela hormeze (18).

60.

Ispitivani materijali koji apsorbiraju svjetlost mogu izazvati smanjenje brzine rasta stvaranjem sjene, koja smanjuje raspoloživu količinu svjetlosti. Ove i druge slične fizikalne učinke treba odvojiti od toksičnih učinaka izmjenom ispitnih uvjeta i treba ih posebno navesti u izvješću o ispitivanju. Smjernice se mogu pronaći u literaturi pod (2) i (3).

61.

Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljedeće:

(1)

International Organisation for Standardisation (1993.) ISO 8692 Water quality – Algal growth inhibition test.

(2)

International Organisation for Standardisation (1998.) ISO/DIS 14442. Water quality – Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

(3)

OECD (2000.) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, br. 23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(4)

International Organisation for Standardisation (1998.) ISO 5667-16 Water quality – Sampling – Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R. i Nyholm, N. (1997.) A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525 – 2531.

(6)

Slovacey, R. E. i Hanna, P. J. (1997.) In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925

(7)

Simpson, S. L., Roland, M. G. E., Stauber, J. L. i Batley, G. E. (2003.) Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073 – 2079.

(8)

Christensen, E. R., Nyholm, N. (1984.) Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713 – 718.

(9)

Nyholm, N. Sørensen, P. S., Kusk, K. O. i Christensen, E. R. (1992.) Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157 – 167.

(10)

Bruce, R. D. i Versteeg, D. J. (1992.) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485 – 1494.

(11)

OECD (2006.) Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(12)

Dunnett, C. W. (1955.) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121

(13)

Norberg-King, T. J. (1988.) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C. W. (1964.) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482 – 491.

(15)

Williams, D. A. (1971.) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103 – 117.

(16)

Williams, D. A. (1972.) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519 – 531.

(17)

Draper, N. R. i Smith, H. (1981.) Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

(18)

Brain, P. i Cousens, R. (1989.) An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93 – 96.

1.

Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 209 (2010.). Ovom se ispitnom metodom opisuje način određivanja učinaka kemikalije na mikroorganizme iz aktivnog mulja (uglavnom bakterije) mjerenjem njihove stope disanja (oksidacije ugljika i/ili amonijaka) u definiranim uvjetima u prisutnosti različitih koncentracija ispitivane kemikalije. Ova se ispitna metoda temelji na testu ETAD-a (engl. Ecological and Toxicological Association of the Dyestuffs Manufacturing industry – Ekološko i toksikološko udruženje industrijskih proizvođača bojila) (1) (2), na prethodnoj smjernici TG 209 OECD-a (3) postojećem poglavlju C.11 ovog Priloga (3) i na revidiranoj normi ISO 8192 (4). Svrha je ispitivanja osigurati brzu orijentacijsku metodu za procjenu učinaka kemikalija na mikroorganizme iz aktivnog mulja tijekom biološke (aerobne) faze obrade otpadnih voda u postrojenjima za pročišćavanje. Rezultati ispitivanja mogu poslužiti i kao pokazatelj prikladnih neinhibitornih koncentracija ispitivanih kemikalija koje će se upotrebljavati u ispitivanjima biorazgradivosti (na primjer, poglavlja C.4 A – F, C.9, C.10, C12 i C.29 ovog Priloga, OECD TG302C). U tom se slučaju ispitivanje može provesti kao test probira, slično kao test za određivanje raspona ili granični test (vidjeti stavak 39.), uzimajući u obzir samo sveukupno disanje. Međutim, te podatke treba pažljivo uzimati u obzir za testove lake biorazgradivosti (poglavlja C.4 A – F i C.29 ovog Priloga) za koje je koncentracija inokuluma znatno niža od one koja se upotrebljava u ovoj ispitnoj metodi. Zapravo, odsutnost inhibicije u ovom testu disanja ne znači automatski postojanje neinhibitornih uvjeta u testu lake biorazgradivosti iz poglavlja C.4 A – F ili C.29 ovog Priloga.

2.

Iako se općenito čini da se test inhibicije disanja uspješno primjenjuje od kada je prvi put objavljen, u nekim su slučajevima zabilježeni netočni rezultati, npr. (2) (4) i (5). Tako su u nekim slučajevima krivulje disanja koje su povezane s koncentracijom dvofazne, grafički prikazi doza-odgovor iskrivljeni i vrijednosti EC50 neočekivano niske (5). Istraživanja su pokazala da se takvi rezultati dobiju kada dolazi do znatne nitrifikacije aktivnog mulja koji se upotrebljava u ispitivanju i kada ispitivana kemikalija ima veći učinak na oksidaciju amonijaka nego na opću heterotrofnu oksidaciju. Stoga se ti netočni rezultati mogu ispraviti dodatnim ispitivanjem uporabom specifičnog inhibitora nitrifikacije. Mjerenjem brzina potrošnje kisika u prisutnosti i odsutnosti takvog inhibitora, npr. N-aliltiouree (ATU), mogu se odvojeno izračunati brzina ukupne potrošnje kisika, heterotrofne potrošnje kisika i potrošnje kisika nitrifikacijom (4) (7) (8). Tako se mogu odrediti inhibitorni učinci ispitivane kemikalije na oba procesa te se na uobičajen način mogu izračunati vrijednosti EC50 za oksidaciju organskog ugljika (heterotrofnu) i za oksidaciju amonijaka (nitrifikaciju). Valja napomenuti da u nekim rijetkim slučajevima inhibitorni učinak N-aliltiouree može biti djelomično ili u cijelosti poništen zbog stvaranja kompleksa s ispitivanim kemikalijama ili dodacima mediju, npr. s ionima Cu++ (6). Ioni Cu++ ključni su za Nitrosomonas, ali su toksični pri većim koncentracijama.

3.

Nitrifikacija kod aerobne obrade otpadnih voda, kao nužan korak u postupku uklanjanja dušikovih spojeva iz otpadnih voda denitrifikacijom do plinovitih oblika, postala je prijeko potrebna, posebno u europskim državama; EU je sada odredio niže granice za koncentraciju dušika u pročišćenim otpadnim vodama koje se ispuštaju u prihvatne vode (5).

4.

U većini slučajeva dostatna je metoda koja se sastoji od procjene učinka samo na procese oksidacije organskog ugljika. Međutim, u nekim je slučajevima za tumačenje rezultata i razumijevanje učinaka potrebno ispitati učinak samo na nitrifikaciju, ili zasebno na nitrifikaciju i na oksidaciju organskog ugljika.

5.

Stope disanja uzoraka aktivnog mulja hranjenog sintetičkim otpadnim vodama mjere se u zatvorenoj ćeliji s kisikovom elektrodom nakon vremena kontakta od tri sata. Ovisno o stvarnom scenariju izloženosti, može biti primjeren i dulji kontakt. Ako se ispitivana kemikalija brzo razgrađuje, npr. abiotički hidrolizom, ili je hlapljiva te joj se koncentracija ne može održati na odgovarajući način, može se primijeniti i kraće vrijeme izloženosti, npr. 30 minuta. Odgovarajućom referentnom kemikalijom potrebno je provjeriti osjetljivost svake šarže aktivnog mulja na dan izloženosti. Ispitivanje se obično primjenjuje za određivanje vrijednosti ECx (npr. EC50) ispitivane kemikalije i/ili najviše koncentracije bez vidljivog učinka (NOEC).

6.

Inhibicija potrošnje kisika mikroorganizama koji oksidiraju organski ugljik može se izraziti odvojeno od inhibicije potrošnje kisika mikroorganizama koji oksidiraju amonijak, i to mjerenjem brzine potrošnje kisika u odsutnosti i u prisutnosti N-aliltiouree, specifičnog inhibitora oksidacije amonijaka u nitrite koju u prvoj fazi provode nitrificirajuće bakterije. U tom slučaju postotak inhibicije brzine potrošnje kisika izračunava se tako da se brzina potrošnje kisika u prisutnosti ispitivane kemikalije usporedi sa srednjom brzinom potrošnje kisika odgovarajućih kontrola koje ne sadržavaju ispitivanu kemikaliju u prisutnosti i u odsutnosti specifičnog inhibitora, N-aliltiouree.

7.

Određivanjem brzine potrošnje kisika u mješavinama koje sadržavaju ispitivanu kemikaliju, vodu i sintetičku otpadnu vodu, bez aktivnog mulja, može se otkriti svaka potrošnja kisika koja proizlazi iz abiotičkih procesa.

8.

Trebali bi biti poznati identifikacijski podaci (poželjno je da to bude CAS broj), naziv (IUPAC), čistoća, topljivost u vodi, tlak para, hlapljivost i adsorpcijska svojstva ispitivane kemikalije, kako bi se omogućilo ispravno tumačenje rezultata. Obično se hlapljive kemikalije ne mogu primjereno ispitivati ako se ne poduzmu posebne mjere opreza (vidjeti stavak 21.).

9.

Ova se ispitna metoda može primijeniti na kemikalije topljive u vodi, slabo topljive kemikalije i hlapljive kemikalije. Međutim, možda neće uvijek biti moguće dobiti vrijednosti EC50 s kemikalijama ograničene topljivosti, a valjani rezultati s hlapljivim kemikalijama mogu se dobiti jedino pod uvjetom da veliki dio (na primjer > 80 %) ispitivane kemikalije ostane u reakcijskoj smjesi na kraju razdoblja izloženosti. Potrebno je dostaviti dodatne analitičke podatke radi bolje procjene vrijednosti koncentracije ECx ako postoji ikakva nesigurnost u pogledu stabilnosti ili hlapljivosti ispitivane kemikalije.

10.

Referentne kemikalije potrebno je periodično ispitivati kako bi se osiguralo da ispitna metoda i uvjeti ispitivanja budu pouzdani te kako bi se provjerila osjetljivost svake šarže aktiviranog mulja koje se upotrebljava kao mikrobni inokulum na dan izloženosti. Kemikalija 3,5-diklorfenol (3,5-DCP) preporučuje se kao referentna inhibitorna kemikalija jer je poznati inhibitor disanja i upotrebljava se u mnogim vrstama testova inhibicije/toksičnosti (4). Kao referentna kemikalija za inhibiciju ukupnog disanja može se upotrijebiti i bakrov (II) sulfat pentahidrat (9). Kao specifični referentni inhibitor nitrifikacije može se upotrijebiti N-metilanilin (4).

11.

Brzina potrošnje kisika slijepih proba (bez ispitivane kemikalije ili referentne kemikalije) ne bi smjela biti manja od 20 mg kisika po gramu aktivnog mulja (suha masa suspendirane krute tvari) u jednom satu. Ako je brzina manja, test je potrebno ponoviti s ispranim aktivnim muljem ili s muljem iz drugog izvora Koeficijent varijacije brzine potrošnje kisika u kontrolnim ponavljanjima ne bi smio biti veći od 30 % na kraju konačnog testa.

12.

Međunarodnim prstenastim testom koji je 2004. organizirao ISO (4) i pri kojemu je upotrijebljen aktivni mulj iz komunalnih otpadnih voda utvrđeno je da se EC50 za 3,5-DCP kreće u rasponu od 2 mg/l do 25 mg/l za ukupno disanje, od 5 mg/l do 40 mg/l za heterotrofno disanje i od 0,1 mg/l do 10 mg/l za disanje povezano s nitrifikacijom. Ako EC50 za 3,5-DCP nije u očekivanom rasponu, test treba ponoviti s aktivnim muljem iz drugog izvora. EC50 za bakrov (II) sulfat pentahidrat mora biti u rasponu od 53 do 155 mg/l za ukupno disanje (9).

13.

Potrebno je upotrebljavati uobičajenu laboratorijsku opremu te sljedeće:

14.

Tijekom cijelog testa potrebno je upotrebljavati reagense analitičke čistoće.

15.

Potrebno je upotrebljavati destiliranu ili deioniziranu vodu koja sadržava manje od 1 mg/l DOC-a, osim ako se nalaže uporaba vode iz slavine koja ne sadržava klor.

16.

Medij se pripremi tako da sadržava sljedeće sastojke u navedenim količinama:

17.

pH ove otopine mora biti 7,5 ± 0,5. Ako se pripremljeni medij ne upotrijebi odmah, treba ga čuvati u mraku na temperaturi od 0 °C do 4 °C najviše tjedan dana ili u uvjetima koji neće promijeniti njegov sastav. Valja napomenuti da je ova sintetička otpadna voda stostruki koncentrat vode opisane u tehničkom izvješću OECD-a ‚Predložena metoda za određivanje biorazgradivosti surfaktanata koji se upotrebljavaju u sintetičkim deterdžentima’ od 11. lipnja 1976. s dodatkom dikalijevog hidrogenfosfata.

18.

Druga je mogućnost da se sastojci medija pojedinačno steriliziraju prije skladištenja ili da se pepton i mesni ekstrakt dodaju neposredno prije ispitivanja. Prije uporabe medij je potrebno temeljito promiješati i njegov pH prema potrebi prilagoditi na pH 7,5 ± 0,5.

19.

Radna se otopina priprema za ispitivane tvari koje su lako topljive u vodi, i to samo do maksimalne topljivosti u vodi (taloženje nije prihvatljivo). Tvari koje se slabo otapaju u vodi, smjese čiji sastojci imaju različitu topljivost u vodi i adsorptivne tvari potrebno je odmjeriti izravno u ispitne posude. U tim slučajevima uporaba radnih otopina može biti valjana opcija ako se otopljene koncentracije ispitivanih kemikalija analitički određuju u ispitnim posudama (prije dodavanja aktivnog mulja). Analitičko određivanje otopljenih koncentracija ispitivanih kemikalija u ispitnim posudama ključno je i u slučaju kad se pripremaju frakcije WAF (engl. water accommodated fractions, WAF). Treba izbjegavati uporabu organskih otapala, dispergenata/emulgatora za pospješivanje topljivosti. Obrada radnih otopina i suspenzija ultrazvukom, npr. preko noći, moguća je ako postoje odgovarajući podaci koji govore o stabilnosti ispitivane kemikalije u takvim uvjetima.

20.

Ispitivana kemikalija može štetno utjecati na pH unutar ispitnog sustava. Prije postavljanja testa potrebno je provesti preliminarni pokus za određivanje pH-vrijednosti smjese kojoj je dodana ispitivana kemikalija kako bi se utvrdilo hoće li trebati prilagoditi pH prije glavnog testa i ponovno na dan glavnog testa. Vodene otopine / suspenzije ispitivane kemikalije treba prema potrebi neutralizirati prije dodavanja inokuluma. Međutim, s obzirom na to da neutralizacija može promijeniti kemijska svojstva kemikalije, mogu se provesti dodatna ispitivanja, ovisno o svrsi istraživanja, kako bi se procijenio učinak ispitivane kemikalije na mulj bez prilagođavanja pH-vrijednosti.

21.

Toksični učinci hlapljivih kemikalija, posebno u testovima u kojima se kroz sustav upuhuju mjehurići zraka, mogu biti različitog intenziteta zbog gubitka tvari tijekom razdoblja izloženosti. Kod takvih je tvari potreban oprez, što znači da je kontrolne smjese koje sadržavaju predmetnu tvar potrebno podvrgnuti analizi specifičnoj za tu tvar te prilagoditi režim dozračivanja.

22.

Ako se kao referentna kemikalija upotrebljava 3,5-diklofenol, treba pripremiti otopinu od 1,00 g 3,5-diklofenola u 1 000 ml vode (15). Treba primijeniti toplu vodu i/ili ultrazvuk kako bi se ubrzalo otapanje i kako bi otopina dobila konačan volumen nakon što se ohladi na sobnu temperaturu. Međutim, treba osigurati da struktura referentne kemikalija ostane nepromijenjena. Treba provjeriti pH otopine i prema potrebi ga prilagoditi s NaOH ili H2SO4 na pH 7 – 8.

23.

Ako se kao referentna kemikalija upotrebljava bakrov (II) sulfat pentahidrat, upotrebljavaju se koncentracije od 58 mg/l, 100 mg/l i 180 mg/l (faktor 1,8). Tvar je potrebno odvagati izravno u ispitne posude (29 – 50 – 90 mg za 500 ml ukupnog volumena). Potom se otapa s 234 ml vode iz slavine sterilizirane u autoklavu. Bakrov (II) sulfat pentahidrat lako se otapa. Kad započne test, dodaje se 16 ml sintetičke otpadne vode i 250 ml aktivnog mulja.

24.

Treba pripremiti radnu otopinu N-aliltiouree (ATU) u koncentraciji od 2,32 g/l. Dodavanjem 2,5 ml te radne otopine u inkubacijsku smjesu konačnog volumena 500 ml dobije se konačna koncentracija od 11,6 mg ATU/l (10– 4 mol/l), za koju je poznato da je dovoljna (4) za izazivanje 100-postotne inhibicije nitrifikacije u nitrificirajućem aktivnom mulju koji sadržava 1,5 g/l suspendirane krute tvari.

25.

U nekim rijetkim uvjetima ispitivana kemikalija s jakim reducirajućim svojstvima može uzrokovati mjerljivu abiotičku potrošnju kisika. U tim su slučajevima potrebne abiotičke kontrole kako bi se mogla razlikovati abiotička potrošnja kisika ispitivane kemikalije i mikrobno disanje. Abiotičke kontrole mogu se pripremiti izostavljanjem inokuluma iz ispitne smjese. Isto tako, abiotičke kontrole bez inokuluma mogu se uključiti i pri dodatnim analitičkim mjerenjima koja se provode radi određivanja koncentracije postignute tijekom ispitne faze izloženosti, npr. kad se upotrebljavaju radne otopine kemikalija koje su slabo topljive u vodi s komponentama različite topljivosti u vodi. U nekim posebnim slučajevima možda će biti potrebno pripremiti abiotičku kontrolu sa steriliziranim inokulumom (npr. obradom u autoklavu ili dodavanjem sterilizirajućih toksikanata). Neke kemikalije mogu proizvoditi ili trošiti kisik jedino ako je površina dovoljno velika za reakciju, čak i ako im je za to obično potrebna mnogo veća temperatura ili tlak. U tom pogledu posebnu pozornost treba posvetiti peroksi-tvarima. Sterilizirani inokulum predstavlja veliku površinu.

26.

Za opću je uporabu aktivni mulj potrebno prikupiti na izlazu iz aeracijskog bazena ili u blizini izlaza iz aeracijskog bazena ispravnog postrojenja za pročišćavanje koje pretežno pročišćava komunalne otpadne vode. Ovisno o svrsi ispitivanja, mogu se upotrebljavati i druge odgovarajuće vrste ili izvori aktivnog mulja, npr. mulj uzgojen u laboratoriju, s odgovarajućom koncentracijom suspendirane krute tvari od 2 g/l do 4 g/l. Međutim, muljevi iz različitih postrojenja za pročišćavanje vjerojatno će imati različita svojstva i različitu osjetljivost.

27.

Mulj se može upotrijebiti onakav kakav je sakupljen, ali se grube čestice moraju ukloniti kratkim taloženjem, npr. pet do 15 minuta, i pretakanjem gornjeg sloja koji sadržava finije čestice ili prosijavanjem (npr. kroz sito veličine otvora 1 mm2 ). Druga je mogućnost da se mulj homogenizira u miješalici oko 15 sekundi ili dulje, pri čemu je potreban oprez u pogledu smičnih sila i promjene temperature do koje može doći pri dugotrajnom miješanju.

28.

Često je potrebno oprati mulj, npr. ako je stopa endogenog disanja niska. Mulj je prvo potrebno centrifugirati dovoljno dugo da nastane jasan supernatant i talog krute tvari mulja, npr. deset minuta brzinom od oko 10 000 m/s2. Tekući supernatant treba ukloniti te mulj ponovno suspendirati tresenjem u vodi iz slavine koja ne sadržava klor; vodu za pranje potom treba ponovno centrifugirati i odbaciti te je time ukloniti. Ako je potrebno, postupak centrifugiranja i pranja može se ponoviti. Treba odrediti suhu masu poznatog volumena resuspendiranog mulja te mulj koncentrirati uklanjanjem tekuće frakcije ili dodatnim razrjeđivanjem u vodi iz slavine koja ne sadržava klor da se dobije potrebna koncentracija suhe tvari mulja od 3 g/l. Aktivni mulj treba neprestano dozračivati (npr. brzinom od 2 l/min) na ispitnoj temperaturi i, ako je moguće, upotrijebiti na dan skupljanja. Ako to nije moguće, mulj je potrebno još dva dana svakodnevno hraniti sintetičkom otpadnom vodom (50 ml sintetičke otpadne vode / l l aktivnog mulja). Mulj se potom upotrebljava za ispitivanje i rezultati se prihvaćaju kao valjani pod uvjetom da se aktivnost mulja nije značajno promijenila, što se procjenjuje brzinom endogenog heterotrofnog disanja i brzinom disanja povezanog s nitrifikacijom.

29.

Poteškoće se mogu javiti ako tijekom inkubacije dođe do tolikog pjenjenja da pjena i krute tvari nošene njome izlaze iz posuda za dozračivanje. Ponekad je pjenjenje jednostavno posljedica prisutnosti sintetičke otpadne vode pa ga treba predvidjeti ako je ispitivana kemikalija površinski aktivna tvar ili sadržava površinski aktivnu tvar. Gubitak krute tvari mulja iz ispitivanih smjesa dovest će do umjetno sniženih stopa disanja koje bi se mogle pogrešno tumačiti kao učinak inhibicije. Osim toga, dozračivanje otopine površinski aktivne tvari dovodi do skupljanja površinski aktivne tvari u sloju pjene; gubitak pjene iz ispitnog sustava imat će za posljedicu smanjenje koncentracija izlaganja. Pjenjenje se može kontrolirati jednostavnim mehaničkim metodama (npr. povremenim ručnim miješanjem s pomoću staklenog štapića) ili dodavanjem sredstva protiv pjenjenja u obliku silikonske emulzije koja ne sadržava površinski aktivne tvari i/ili primjenom metode dozračivanja protresanjem u tikvici. Ako je problem povezan s prisutnošću sintetičke otpadne vode, treba promijeniti sastav otpadne vode dodavanjem reagensa protiv pjenjenja u količini od npr. 50 μl/l. Ako je ispitivana kemikalija ta koja uzrokuje pjenjenje, količinu potrebnu za smanjenje pjene treba odrediti pri maksimalnoj ispitivanoj koncentraciji i potom svaku pojedinačnu posudu za dozračivanje treba tretirati istom količinom (uključujući i one kod kojih nema pjene, npr. slijepe probe i referentne posude). Ako se upotrebljavaju sredstva protiv pjenjenja, ne smije postojati interakcija s inokulumom i/ili ispitivanom kemikalijom.

30.

Može se odrediti inhibicija triju različitih vrsta potrošnje kisika, i to ukupne potrošnje, samo heterotrofne i one do koje dolazi zbog nitrifikacije. Obično je dovoljno izmjeriti inhibiciju ukupne potrošnje kisika. Učinke na heterotrofnu potrošnju kisika koja je povezana s oksidacijom organskog ugljika i onu koja nastaje zbog oksidacije amonijaka potrebno je odrediti ako se za određenu kemikaliju posebno zahtijeva određivanje tih dviju odvojenih krajnjih točaka ili (neobvezatno) kako bi se objasnile atipične krivulje doza-odgovor dobivene mjerenjem inhibicije ukupne potrošnje kisika.

31.

Ispitivanje je potrebno provoditi na temperaturi od 20 ± 2 °C.

32.

Ispitne smjese (FT kao u tablici 1.) koje sadržavaju vodu, sintetičku otpadnu vodu i ispitivanu kemikaliju treba pripremiti tako da se dobiju različite nazivne koncentracije ispitivane kemikalije (u tablici 1. vidjeti primjere volumena sastojaka). Prema potrebi, pH bi trebalo prilagoditi na 7,5 ± 0,5; smjese treba razrijediti vodom te dodati inokulum tako da se dobiju jednaki konačni volumeni u posudama i da se započne s dozračivanjem.

33.

Smjese (FR) treba pripremiti na isti način kao i ispitne smjese, s tim da se ispitivana kemikalija zamijeni referentnom kemikalijom, npr. 3,5-diklorfenolom.

34.

Kod ispitivanja u kojima se ispitne čaše pripremaju jedna poslije druge u određenim vremenskim razmacima, slijepe probe (FB) treba pripremiti na početku i na kraju razdoblja izlaganja. U ispitivanjima koja se provode s pomoću opreme koja omogućuje istodobna mjerenja različitih potrošnja kisika u svaku seriju istodobne analize treba uključiti najmanje dvije slijepe probe. Slijepe probe sadržavaju jednak volumen aktivnog mulja i sintetičkog medija, ali ne sadržavaju ispitivanu ili referentnu kemikaliju. Treba ih razrijediti vodom do istog volumena kao i ispitne i referentne smjese.

35.

Ako je potrebno, primjerice ako je poznato ili se sumnja da ispitivana kemikalija ima jaka reducirajuća svojstva, treba pripremiti smjesu FA za mjerenje abiotičke potrošnje kisika. Smjesa mora imati iste količine ispitivane kemikalije i sintetičke otpadne vode te isti volumen kao ispitivane smjese, ali ne smije sadržavati aktivni mulj.

36.

Ispitne smjese, referentne smjese, slijepe probe i abiotičke kontrole inkubiraju se na ispitnoj temperaturi u uvjetima prisilnog dozračivanja (0,5 do 1 l/min) tako da se koncentracija otopljenog kisika održi iznad 60 do 70 % zasićenosti te da se pahulje mulja zadrže u suspenziji. Da bi se pahulje mulja zadržale u suspenziji, potrebno je isto tako promiješati kulture. Smatra se da inkubacija započinje u trenutku kada inokulum od aktivnog mulja dođe u dodir s ostalim sastojcima konačne smjese. Na kraju inkubacije, to jest nakon vremena izloženosti koje se obično utvrđuje na tri sata, uzimaju se uzorci kako bi se izmjerila brzina smanjenja koncentracije otopljenog kisika u ćeliji predviđenoj za tu svrhu (slika 2. u Dodatku 3.) ili u potpuno napunjenoj boci BPK. Način započinjanja inkubacija ovisi i o kapacitetu opreme koja se upotrebljava za mjerenje stope potrošnje kisika. Na primjer, ako oprema uključuje samo jednu sondu za mjerenje kisika, mjerenja se provode pojedinačno. U tom slučaju različite smjese potrebne za ispitivanje treba pripremiti sa sintetičkom otpadnom vodom bez dodavanja inokuluma te potom u svaku posudu serije treba dodati potrebnu količinu mulja. Inkubacije treba započinjati jednu za drugom, u prikladnim vremenskim razmacima od npr. 10 do 15 minuta. Alternativno, sustav mjerenja može se sastojati od više sondi koje omogućuju više istodobnih mjerenja; u tom se slučaju inokulum može istodobno dodati u odgovarajuće skupine posuda.

37.

Nazivna koncentracija aktivnog mulja u svim ispitnim smjesama, referentnim smjesama i smjesama za slijepu probu (ali ne za abiotičku kontrolu) iznosi 1,5 g suspendirane krute tvari po litri. Potrošnju kisika treba izmjeriti nakon tri sata izloženosti. Prema potrebi treba provesti dodatna mjerenja nakon 30-minutne izloženosti, i to kako je opisano u stavku 5.

38.

Da bi se odredilo dolazi li do nitrifikacije mulja te, ako dolazi, kojom brzinom, treba pripremiti smjese (FB) kao kod slijepe probe i dodatne ‚kontrolne’ smjese (FN) koje sadržavaju i N-aliltioureu u količini od 11,6 mg/l. Smjese treba dozračiti i inkubirati na 20° ± 2 °C tri sata. Potom treba izmjeriti brzine potrošnje kisika te izračunati brzinu potrošnje kisika zbog nitrifikacije.

39.

Kada je to potrebno, provodi se preliminarno ispitivanje kako bi se procijenio raspon koncentracija ispitivane kemikalije koje će se upotrebljavati u glavnom ispitivanju za određivanje inhibicije potrošnje kisika. Alternativno, odsutnost inhibicije potrošnje kisika ispitivane kemikalije u preliminarnom ispitivanju može ukazati na to da nije potrebno provoditi glavno ispitivanje, ali moraju biti uključena tri ponavljanja s najvećom ispitivanom koncentracijom iz preliminarnog ispitivanja (obično 1 000 mg/l, ali ta vrijednost ovisi o zahtijevanim podacima).

Tablica 1.

Primjeri smjesa za preliminarno ispitivanje

40.

Ispitivanje je potrebno provesti s najmanje tri koncentracije ispitivane kemikalije, na primjer, 10 mg/l, 100 mg/l i 1 000 mg/l sa slijepom probom i, ako je potrebno, s najmanje tri abiotičke kontrole s najvećim koncentracijama ispitivane kemikalije (kao primjer vidjeti tablicu 1.). U idealnom slučaju najniža koncentracija ne smije utjecati na potrošnju kisika. Treba izračunati brzine potrošnje kisika i brzinu nitrifikacije, prema potrebi; potom se izračunava postotak inhibicije. Ovisno o svrsi ispitivanja, moguće je jednostavno odrediti toksičnost granične koncentracije, npr. 1 000 mg/l. Ako se pri toj koncentraciji ne javlja statistički značajan učinak, nije potrebno daljnje ispitivanje s višim ili nižim koncentracijama. Valja napomenuti da tvari koje se slabo otapaju u vodi, smjese čiji sastojci imaju različitu topljivost u vodi i adsorptivne tvari treba odvagati izravno u ispitne posude. U tom slučaju volumen rezerviran za radnu otopinu ispitne tvari treba zamijeniti vodom za razrjeđivanje.

41.

Za ispitivanje treba upotrijebiti raspon koncentracija određen preliminarnim ispitivanjem. Da bi se dobili NOEC i ECx (npr. EC50), u većini slučajeva preporučuje se šest kontrola i pet ispitnih koncentracija raspoređenih u geometrijskom nizu, s pet ponavljanja. Abiotičku kontrolu nije potrebno ponavljati ako u preliminarnom testu nije bilo potrošnje kisika; međutim, u slučaju značajne potrošnje kisika abiotičke kontrole treba uključiti za svaku koncentraciju ispitivane kemikalije. Osjetljivost mulja treba provjeriti uporabom referentne kemikalije, 3,5-diklorfenola. Osjetljivost mulja treba provjeriti za svaki ispitni niz jer je poznato da osjetljivost nije postojana. U svakom slučaju, uzorci se uzimaju iz ispitnih posuda nakon tri sata, i prema potrebi nakon dodatnih 30 minuta, kako bi se izmjerila brzina potrošnje kisika u ćeliji s kisikovom elektrodom. Iz prikupljenih podataka izračunavaju se specifične stope disanja kontrolnih i ispitnih smjesa; potom se prema jednadžbi 7. navedenoj u nastavku izračunava postotak inhibicije.

42.

Uporaba specifičnog inhibitora nitrifikacije, ATU-a, omogućuje izravnu procjenu inhibitornih učinaka ispitivanih kemikalija na heterotrofnu oksidaciju te se oduzimanjem brzine potrošnje kisika u prisutnosti ATU-a od brzine ukupne potrošnje (kad nije prisutan ATU) mogu izračunati učinci na stopu nitrifikacije. Treba pripremiti dva seta reakcijskih smjesa prema planovima ispitivanja za ECx ili NOEC opisanima u stavku 41., s tim da u svaku smjesu jednog seta treba k tome dodati ATU u konačnoj koncentraciji od 11,6 mg/l, za koju je dokazano da u potpunosti inhibira nitrifikaciju u mulju koji sadržava koncentracije suspendirane krute tvari do 3 000 mg/l (4). Brzinu potrošnje kisika treba izmjeriti nakon razdoblja izloženosti; te izravne vrijednosti predstavljaju samo heterotrofno disanje, a razlika između tih vrijednosti i odgovarajuće stope ukupnog disanja predstavlja nitrifikaciju. Potom se izračunavaju različiti stupnjevi inhibicije.

43.

Nakon razdoblja izloženosti uzorak iz prve posude za dozračivanje treba prenijeti u ćeliju opremljenu kisikovom elektrodom (slika 1. u Dodatku 2.) i treba odmah izmjeriti koncentraciju otopljenog kisika. Ako je na raspolaganju sustav s više elektroda, mjerenja se mogu izvršiti istodobno. Ključno je da miješanje (s pomoću obloženog magneta) bude istom brzinom kao što je ona koja je primijenjena pri kalibraciji elektrode, kako bi se osiguralo da sonda reagira s najmanjim mogućim zakašnjenjem na promjene koncentracije kisika te kako bi se omogućila redovita i ponovljiva mjerenja kisika u mjernoj posudi. Obično je prikladan sustav kisikove elektrode koji se sastoji od samomiješajuće sonde. Ćeliju je između mjerenja potrebno isprati vodom. Druga je mogućnost da se uzorak stavi u bocu BPK (slika 2. u Dodatku 3.) postavljenu na magnetsku miješalicu. Potom se u grlo boce umetne kisikova sonda s cijevnim adapterom te se pokrene magnetska miješalica. U oba slučaja koncentraciju otopljenog kisika treba neprestano mjeriti i bilježiti u razdoblju od obično pet do deset minuta ili dok koncentracija kisika ne padne ispod 2 mg/l. Elektroda se potom uklanja i smjesa se vraća u posudu za dozračivanje, u kojoj se nastavlja s dozračivanjem i miješanjem ako je potrebno mjerenje nakon duljih razdoblja izloženosti.

44.

Za neke je svrhe ponekad potrebno izmjeriti koncentraciju ispitivane kemikalije u ispitnim posudama. Valja napomenuti da ako se upotrebljavaju radne otopine:

otopljena frakcija nije poznata te je nepoznata i stvarna koncentracija ispitivane kemikalije prenesene u ispitne posude. Kako bi se odredila svojstva izloženosti, potrebno je analitički procijeniti koncentracije ispitivane kemikalije u ispitnim posudama. Radi jednostavnosti, analitičku procjenu treba izvršiti prije dodavanja inokuluma. Zbog činjenice da se u ispitne posude prenose samo otopljene frakcije, izmjerene koncentracije mogu biti vrlo niske.

45.

Da bi se izbjegle dugotrajne i skupe analize, preporučuje se jednostavno odmjeriti ispitivanu kemikaliju izravno u ispitne posude te se u kasnijim izračunima oslanjati na ponderiranu početnu nazivnu koncentraciju. Nije potrebno razlikovanje između otopljenih, neotopljenih i adsorbiranih frakcija, jer se u stvarnim uvjetima sve te frakcije slično javljaju u postrojenju za pročišćavanje otpadnih voda i mogu varirati ovisno o sastavu otpadne vode. Cilj je ove ispitne metode realno procijeniti neinhibitornu koncentraciju i nije prikladna za detaljno istraživanje o tome koje frakcije pridonose inhibiciji organizama u aktivnom mulju. Naposljetku, i tvari koje imaju adsorpcijska svojstva treba odmjeriti izravno u ispitne posude; posude moraju biti silanizirane kako bi se gubitak adsorpcijom sveo na najmanju moguću mjeru.

46.

Brzinu potrošnje kisika treba izračunati iz srednje vrijednosti izmjerenih veličina, npr. iz linearnog dijela grafa koji prikazuje koncentraciju kisika u odnosu na vrijeme, pri čemu se izračun ograničava na koncentracije kisika između 2,0 mg/l i 7,0 mg/l, jer više i niže koncentracije same po sebi mogu utjecati na brzinu potrošnje. Ponekad je neizbježno i potrebno upotrijebiti vrijednosti koncentracije koje su ispod ili iznad navedenih granica, na primjer kada je disanje jako suprimirano i stoga vrlo sporo ili ako određeni aktivni mulj diše vrlo brzo. To je prihvatljivo pod uvjetom da su predmetni dijelovi grafa potrošnje linearni i da se njihovi gradijenti ne mijenjanju dok prolaze kroz granične vrijednosti od 2,0 mg/l ili 7,0 mg/l O2. Svi nelinearni dijelovi grafa ukazuju na to da se sustav mjerenja stabilizira ili da se brzina potrošnje mijenja te ih se ne smije upotrijebiti za izračun brzina potrošnje. Brzinu potrošnje kisika treba izraziti u miligramima po litri po satu (mg/lh) ili miligramima po gramu suhog mulja po satu (mg/gh). Brzina potrošnje kisika, R, u mg/lh, može se izračunati ili interpolirati iz linearnog dijela zabilježenog grafa smanjenja kisika prema jednadžbi (1):

gdje je:

47.

Specifična stopa disanja (Rs) iskazuje se kao količina kisika potrošenog po gramu suhe mase mulja po satu (mg/gh) prema jednadžbi (2):

gdje je SS koncentracija suspendirane krute tvari u ispitnoj smjesi (g/l).

48.

Mogu se kombinirati sljedeći pokazatelji za R:

49.

Odnos između ukupnog disanja (RT), disanja povezanog s nitrifikacijom (RN) i heterotrofnog disanja (RH) prikazan je jednadžbom (3):

gdje je:

50.

Navedeni odnos vrijedi za vrijednosti slijepih proba (RNB, RTB, RHB), abiotičke kontrole (RNA, RTA, RHA) i pokuse s ispitivanim kemikalijama (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). Specifične stope disanja izračunavaju se iz:

51.

Ako je u preliminarnom testu RN značajan (npr. < 5 % RT-a slijepih proba), može se pretpostaviti da je heterotrofna potrošnja kisika jednaka ukupnoj potrošnji i da nema nitrifikacije. Ako je ispitivanjima potrebno razmotriti učinke na heterotrofne i nitrificirajuće mikroorganizme, potreban je drugi izvor aktivnog mulja. Glavno se ispitivanje provodi ako postoje dokazi o supresiji brzina potrošnje kisika ovisno o koncentracijama ispitivane kemikalije.

52.

Postotak inhibicije, IT, ukupne potrošnje kisika pri svakoj koncentraciji ispitivane kemikalije prikazan je jednadžbom (7):

53.

Isto tako, postotak inhibicije heterotrofne potrošnje kisika, IH, pri svakoj koncentraciji ispitivane kemikalije prikazan je jednadžbom (8):

54.

Konačno, inhibicija potrošnje kisika zbog nitrifikacije, IN, pri svakoj koncentraciji prikazana je jednadžbom (9):

55.

Postotak inhibicije potrošnje kisika potrebno je grafički prikazati u odnosu prema logaritmu koncentracije ispitivane kemikalije (krivulja inhibicije, vidjeti sliku 3. u Dodatku 4.). Krivulje inhibicije grafički se prikazuju za svako razdoblje dozračivanja od tri sata ili dodatno nakon 30 minuta. Koncentraciju ispitivane kemikalije koja inhibira potrošnju kisika za 50 % (EC50) treba izračunati ili interpolirati iz grafa. Ako su na raspolaganju odgovarajući podaci, mogu se izračunati ili interpolirati 95-postotne granice pouzdanosti za EC50, nagib krivulje te odgovarajuće vrijednosti koje označuju početak inhibicije (na primjer EC10 ili EC20) i kraj inhibicije (na primjer EC80 ili EC90).

56.

Valja napomenuti da zbog često uočavane varijabilnosti rezultata u mnogim slučajevima može biti dovoljno iskazati rezultate prema redu veličine, na primjer:

57.

Vrijednosti ECx te njihove niže i više 95-postotne granice pouzdanosti za parametar izračunavaju se odgovarajućim statističkim metodama (npr. probit-analizom, logističkom ili Weibullovom funkcijom, modificiranom Spearman-Karberovom metodom ili jednostavnom interpolacijom (11)). ECx se dobiva tako da se u dobivenu jednadžbu uvrsti vrijednost koja odgovara x % kontrolne srednje vrijednosti. Da bi se izračunao EC50 ili bilo koji drugi ECx, srednje vrijednosti izračunane za svaki tretman (x) potrebno je podvrgnuti regresijskoj analizi.

58.

Ako se za određivanje NOEC-a namjerava primijeniti statistička analiza, potrebni su statistički podaci za svaku posudu (pojedinačne posude smatraju se ponavljanjima). Treba primijeniti odgovarajuće statističke metode u skladu s OECD-ovim dokumentom ‚Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application’ (11). Općenito, štetni učinci ispitivane kemikalije u usporedbi s kontrolom istražuju se jednosmjernim testiranjem hipoteza za p ≤ 0,05.

59.

Izvješće o ispitivanju mora obuhvaćati sljedeće podatke:

(1)

Brown, D., Hitz, H. R. i Schäfer, L. (1981.) The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245 – 261.

(2)

King, E. F. i Painter H. A. (1986.). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27 – 39.

(3)

OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Water Quality – Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, International Organization for Standardization.

(5)

Bealing, D. J. (2003.) Document ISO/TC147/WGI/N.183, International Organization for Standardization.

(6)

Painter, H. A, Jones, K. (1963.) The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471 – 483.

(7)

Painter, H. A. (1986.) Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.

(8)

Robra, B. (1976.) Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig S. i Noack, U. (2004.) The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test – acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556 – 1557.

(10)

ISO (1995.) ISO 10634 Water Quality – Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, International Organization for Standardization.

(11)

OECD (2006.) Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Pariz.

1.

Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 221 (2006.). Ova je ispitna metoda namijenjena ocjenjivanju toksičnosti kemikalija za slatkovodne biljke roda Lemna (vodena leća). Temelji se na postojećim metodama (1) (2) (3) (4) (5) (6), ali uključuje neke izmjene tih metoda u svjetlu posljednjih istraživanja i savjetovanja o nizu ključnih pitanja. Ova je ispitna metoda validirana međunarodnim prstenastim testom (7).

2.

U ovoj su ispitnoj metodi opisana toksikološka ispitivanja s vrstama Lemna gibba i Lemna minor koje su do sada već znatno proučavane i predmet su navedenih normi. Taksonomija Lemna spp. složena je zbog velikog broja različitih fenotipa. Iako se u odgovoru na toksično djelovanje kod vrsta Lemna može javiti određena genetska varijabilnost, trenutačno nema dovoljno podataka o tom izvoru varijabilnosti da bi se mogao preporučiti neki određeni klon za ovu ispitnu metodu. Valja napomenuti da se ispitivanje ne provodi aksenično, ali se u pojedinim fazama ispitnog postupka poduzimaju koraci kako bi se onečišćenje drugim organizmima svelo na najmanju moguću mjeru.

3.

Opisani su detalji ispitivanja s obnavljanjem (polustatičko i protočno) i bez obnavljanja (statičko) ispitne otopine. Ovisno o ciljevima ispitivanja i regulatornim zahtjevima, preporučuje se da se ispita mogućnost primjene polustatičkih i protočnih metoda, npr. kod kemikalija koje se brzo gube iz otopine zbog isparavanja, fotokemijske razgradnje, taloženja ili biorazgradnje. Dodatne smjernice mogu se pronaći u literaturi (8).

4.

Upotrijebljene definicije navedene su u Dodatku 1.

5.

Eksponencijalno rastuće biljne kulture roda Lemna puste se da rastu kao monokulture u različitim koncentracijama ispitivane kemikalije u razdoblju od sedam dana. Cilj je ispitivanja kvantificirati učinke kemikalije na vegetativni rast tijekom toga razdoblja ocjenjivanjem odabranih mjernih varijabli. Broj listova primarna je mjerna varijabla. Osim toga, mjeri se barem još jedna mjerna varijabla (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa), budući da neke kemikalije znatno više utječu na neke druge mjerne varijable nego na broj listova. Da bi se kvantificirali učinci kemikalije, rast u ispitnim otopinama uspoređuje se s rastom u kontrolama i određuje koncentracija koja izaziva određeni postotak (x %) inhibicije rasta (npr. 50 %), koja se izražava kao ECx (npr. EC50).

6.

Krajnja je točka ispitivanja inhibicija rasta koja se izražava kao logaritamsko povećanje mjerne varijable (prosječna specifična brzina rasta) u razdoblju izlaganja. Iz prosječnih specifičnih brzina rasta zabilježenih u nizu ispitnih otopina određuje se koncentracija koja izaziva određeni postotak (x %) inhibicije brzine rasta (npr. 50 %) koja se izražava kao ErCx (npr. ErC50).

7.

U ovoj se ispitnoj metodi upotrebljava i prirast kao dodatna varijabla odgovora koja je potrebna da bi se ispunili određeni regulatorni zahtjevi u nekim državama. Definiran je kao razlika između mjernih varijabli na kraju razdoblja izlaganja i mjernih varijabli na početku razdoblja izlaganja. Iz prirasta zabilježenog u nizu ispitnih otopina izračunava se koncentracija koja izaziva određeni postotak (x %) inhibicije prirasta (npr. 50 %), koja se izražava kao EyCx (npr. EyC50).

8.

Osim toga, može se statistički odrediti najniža koncentracija s vidljivim učinkom (LOEC) i najviša koncentracija bez vidljivog učinka (NOEC).

9.

Mora biti raspoloživa analitička metoda odgovarajuće osjetljivosti za kvantifikaciju kemikalije u ispitnom mediju.

10.

Za određivanje ispitnih uvjeta korisno je imati informacije o ispitivanoj kemikaliji kao što su strukturna formula, čistoća, topljivost u vodi, stabilnost u vodi i na svjetlosti, pKa, Kow, tlak pare i biorazgradivost. Topljivost u vodi i tlak pare mogu se upotrijebiti za izračunavanje konstante Henryjeva zakona, iz koje se može zaključiti treba li u razdoblju ispitivanja očekivati značajne gubitke ispitivane kemikalije. Na taj se način prema potrebi mogu poduzeti određene mjere za nadzor tih gubitaka. Ako su informacije o topljivosti i stabilnosti ispitivane kemikalije nesigurne, preporučuje se da se topljivost i stabilnost ispitivane kemikalije ocijene u uvjetima ispitivanja, tj. u uzgojnom mediju te pri temperaturi i režimu rasvjete koji će se upotrebljavati tijekom ispitivanja.

11.

U slučajevima kad je nadziranje pH-vrijednosti ispitnog medija posebno važno, npr. kod ispitivanja metala ili kemikalija koje su hidrolitički nestabilne, preporučuje se dodavanje pufera u uzgojni medij (vidjeti stavak 21.). Dodatne smjernice za ispitivanje kemikalija čija fizikalno-kemijska svojstva otežavaju ispitivanje nalaze se u literaturi pod (8).

12.

Da bi ispitivanje bilo valjano, vrijeme potrebno da se broj listova u kontrolnom uzorku udvostruči mora biti kraće od 2,5 dana (60 sati), što približno odgovara sedmerostrukom povećanju u sedam dana i prosječnoj specifičnoj brzini rasta od 0,275 d– 1. Uz medije i ispitne uvjete opisane u metodi taj se kriterij može zadovoljiti primjenom statičkog režima ispitivanja (5). Također se očekuje da će se taj kriterij moći ispuniti u polustatičkim i protočnim uvjetima ispitivanja. Izračunavanje vremena potrebnog za udvostručenje prikazano je u stavku 49.

13.

Jedna ili više referentnih kemikalija, kao što je 3,5-diklorfenol koji je upotrijebljen u međulaboratorijskom ispitivanju (7), mogu se ispitati radi provjere postupka ispitivanja. Preporučljivo je da se referentna kemikalija ispita barem dvaput godišnje ili, ako se ispitivanje provodi rjeđe, istovremeno s određivanjem toksičnosti ispitivane kemikalije.

14.

Sva oprema koja dolazi u dodir s ispitnim medijima mora biti izrađena od stakla ili drugog kemijski inertnog materijala. Staklena oprema koja se upotrebljava za uzgoj i ispitivanje mora biti sterilna i potrebno ju je očistiti od kemijskih onečišćivača koji bi mogli dospjeti u ispitni medij. Ispitne posude moraju biti dovoljno široke da listovi različitih kolonija u kontrolnim posudama mogu rasti tako da na kraju ispitivanja ne dođe do preklapanja među listovima. Ne smeta ako korijenje dodiruje dno ispitne posude, ali preporučuje se da sve posude imaju dubinu od najmanje 20 mm i volumen od najmanje 100 ml. Vrsta ispitnih posuda nije važna sve dok su ti zahtjevi ispunjeni. Prikladnima su se pokazale staklene čaše, zdjelice za kristalizaciju i staklene Petrijeve zdjelice odgovarajućih dimenzija. Ispitne posude treba prekriti kako bi se smanjilo isparavanje i slučajna onečišćenja, ali pritom treba omogućiti nužan protok zraka. Ispitne posude, a posebno poklopci, ne smiju stvarati sjenu niti izazivati promjene u spektralnim svojstvima svjetlosti.

15.

Kulture i ispitne posude ne smiju se držati zajedno. To je najlakše postići ako se upotrijebe odvojene uzgojne komore, inkubatori ili prostorije. Osvjetljenje i temperaturu treba nadzirati i održavati na stalnoj razini (vidjeti stavke 35. i 36.).

16.

Organizmi koji se upotrebljavaju za ovo ispitivanje su Lemna gibba ili Lemna minor. Kratak opis vrsta vodenih leća koje se upotrebljavaju u toksikološkim ispitivanjima nalazi se u Dodatku 2. Biljni se materijal može nabaviti u zbirkama kultura, od drugog laboratorija ili se može prikupiti na terenu. Ako se materijal prikuplja na terenu, biljke treba držati u kulturi u mediju kakav će se upotrebljavati u ispitivanju najmanje osam tjedana prije uporabe. Mjesta na kojima se prikupljaju polazne kulture ne smiju biti onečišćena očitim izvorima onečišćenja. Ako se kulture nabavljaju od drugog laboratorija ili iz zbirke kultura, treba ih držati u sličnim uvjetima najmanje tri tjedna. Izvor biljnog materijala te vrstu i klon (ako je poznat) koji se upotrebljavaju kod ispitivanja treba svaki puta dokumentirati.

17.

Primjenjuju se monokulture kod kojih nisu prisutna vidljiva onečišćenja drugim organizmima kao što su alge i praživotinje. Zdrave biljke L. minor sastoje se od kolonija koje sadržavaju između dva i pet listova, dok zdrave kolonije L. gibba mogu imati i do sedam listova.

18.

Biljke treba pažljivo odabrati jer kakvoća i jednolikost biljaka koje se upotrebljavaju u ispitivanju imaju značajan utjecaj na rezultate ispitivanja. Treba upotrijebiti mlade brzorastuće biljke bez vidljivih oštećenja i promjena boje (kloroza). Osobina je kvalitetnih kultura visok udio kolonija koje sadržavaju najmanje dva lista. Velik broj kolonija s jednim listom ukazuje na okolišni stres, npr. ograničene nutrijente, pa se biljni materijal iz takvih kultura ne bi smio upotrebljavati za ispitivanja.

19.

Da bi se smanjili zahtjevi održavanja (npr. kad određeno vrijeme nisu planirana ispitivanja s vodenom lećom), kulture se mogu držati pod smanjenim osvjetljenjem i na nižoj temperaturi (od 4 do 10 °C). Informacije o uzgoju nalaze se u Dodatku 3. U slučaju očitih znakova onečišćenja algama i drugim organizmima, poduzorak listova Lemna treba podvrgnuti površinskoj sterilizaciji i prenijeti ga u svježi medij (vidjeti Dodatak 3.). U tom slučaju ostatak onečišćene kulture treba baciti.

20.

Najmanje sedam dana prije ispitivanja dovoljno kolonija treba aseptički prenijeti u svježi sterilni medij i uzgajati sedam do deset dana u uvjetima ispitivanja.

21.

Za vrste Lemna minor i Lemna gibba preporučuju se različiti mediji, kako je opisano u nastavku. Treba dobro razmisliti prije nego što se u ispitni medij doda pH pufer (MOPS (4-morfolinpropan-sulfonska kiselina, CAS br. 1132-61-2) u medij za L. minor i NaHCO3 u medij za L. gibba) ako se sumnja da bi pufer mogao reagirati s ispitivanom kemikalijom i utjecati na očitovanje njezinih toksičnih svojstava. Prihvatljiv je i medij Steinberg (9) pod uvjetom da su zadovoljeni kriteriji valjanosti.

22.

Za uzgoj kulture i ispitivanje s L. minor preporučuje se izmijenjena varijanta uzgojnog medija Lemna prema švedskoj normi (SIS). Sastav tog medija naveden je u Dodatku 4.

23.

Uzgojni medij 20X – AAP, kako je opisan u Dodatku 4., preporučuje se za uzgoj kulture i ispitivanja s L. gibba.

24.

Medij Steinberg koji je opisan u Dodatku 4. također je prikladan za L. minor, ali se može upotrijebiti i za L. gibba pod uvjetom da su zadovoljeni kriteriji valjanosti.

25.

Ispitne se otopine obično pripremaju razrjeđivanjem radne otopine. Radne otopine ispitivane kemikalije u pravilu se pripremaju otapanjem kemikalije u uzgojnom mediju.

26.

Najviša ispitna koncentracija ispitivane kemikalije u pravilu ne smije biti viša od topljivosti kemikalije u vodi u ispitnim uvjetima. Ipak, valja napomenuti da Lemna spp. plutaju na površini i mogu biti izložene kemikalijama koje se skupljaju u sučelju voda-zrak (npr. tvari koje su slabo topljive u vodi, hidrofobne kemikalije ili površinski aktivne kemikalije). U tim su uvjetima organizmi izloženi materijalu koji se nalazi izvan otopine i ispitne koncentracije mogu, ovisno o svojstvima ispitivane kemikalije, biti više od topljivosti u vodi. Kod ispitivanih kemikalija niske topljivosti u vodi ponekad je potrebno pripremiti koncentriranu radnu otopinu ili disperziju kemikalije upotrebljavajući organsko otapalo ili dispergent kako bi se olakšalo dodavanje točnih količina ispitivane kemikalije u ispitni medij i ubrzalo njezino dispergiranje i otapanje. U svakom slučaju, treba nastojati izbjeći primjenu takvih materijala kad god je to moguće. Upotrijebljena pomoćna otapala odnosno dispergenti ne bi smjeli imati fitotoksično djelovanje. Primjeri su otapala u širokoj uporabi koja nemaju fitotoksično djelovanje u koncentracijama do 100 μl/l aceton i dimetilformamid. Ako se upotrebljava otapalo ili dispergent, treba navesti njegovu konačnu koncentraciju, koju u svakom slučaju treba svesti na najmanju moguću mjeru (≤ 100 μl/l) i voditi računa o tome da sve obrade i kontrole sadrže istu koncentraciju otapala odnosno dispergenta.. Dodatne smjernice o uporabi dispergenata navedene su u literaturi pod (8).

27.

Prethodna saznanja o toksičnosti ispitivane kemikalije za vodenu leću, npr. na temelju ispitivanja za određivanje raspona, mogu pomoći u odabiru prikladnih ispitnih koncentracija. Kod glavnog ispitivanja toksičnosti u pravilu je potrebno najmanje pet ispitnih koncentracija raspoređenih u geometrijskom nizu. Ispitne se koncentracije po mogućnosti ne bi smjele razlikovati za faktor viši od 3,2, ali može se upotrijebiti i viša vrijednost ako je krivulja koncentracija-odgovor ravna. Ako se upotrebljava manje od pet koncentracija, treba dati obrazloženje. Pri svakoj su koncentraciji potrebna najmanje tri ponavljanja.

28.

Kod određivanja raspona ispitnih koncentracija (za ispitivanje za određivanje raspona i/ili glavno ispitivanje toksičnosti) treba uzeti u obzir sljedeće:

29.

Svako ispitivanje uključuje kontrole s istim hranjivim medijem, istim brojem listova i kolonija, okolnim uvjetima te postupcima kao kod ispitnih posuda, ali bez ispitivane kemikalije. Ako se upotrebljava pomoćno otapalo ili dispergent, potrebna je dodatna kontrola koja sadržava istu koncentraciju otapala/dispergenta kao posude s ispitivanom kemikalijom. Broj ponavljanja kontrolnih posuda (i posuda s otapalom, ako se upotrebljava) mora biti barem jednak broju posuda upotrijebljenih za svaku ispitnu koncentraciju, a po mogućnosti i dvostruko veći.

30.

Ako nije potrebno odrediti NOEC, plan ispitivanja može se izmijeniti tako da se poveća broj koncentracija i smanji broj ponavljanja po koncentraciji. Ipak, broj kontrolnih ponavljanja mora biti najmanje tri.

31.

Kolonije koje se sastoje od dva do četiri vidljiva lista prenesu se iz kulture inokuluma i nasumce raspodijele po ispitnim posudama u aseptičnim uvjetima. Svaka ispitna posuda mora sadržavati ukupno devet do 12 listova. Broj listova i kolonija mora biti jednak u svim ispitnim posudama. Iskustva s ovom metodom i podaci iz međulaboratorijskog ispitivanja pokazuju da je dovoljno upotrijebiti tri ponavljanja po obradi, od kojih svako u početku sadržava devet do 12 listova, da se između obrada utvrde razlike u rastu na razini inhibicije od približno 4 do 7 %, izračunano na temelju brzine rasta (10 do 15 % izračunano na temelju prirasta) (7).

32.

Ispitne posude treba nasumce rasporediti po inkubatoru kako bi se smanjio utjecaj prostornih razlika u svjetlosti i temperaturi. Osim toga, kod promatranja treba primijeniti blokni raspored ili slučajno razmještanje posuda (ili češće razmještanje).

33.

Ako preliminarno ispitivanje stabilnosti pokaže da se koncentracija ispitivane kemikalije ne može održati (tj. izmjerena koncentracija padne ispod 80 % izmjerene početne koncentracije) tijekom razdoblja ispitivanja (sedam dana), preporučuje se polustatički ispitni režim. U tom slučaju kolonije treba izložiti svježe pripremljenim ispitnim i kontrolnim otopinama najmanje dvaput tijekom ispitivanja (npr. trećeg i petog dana). Učestalost izlaganja svježem mediju ovisit će o stabilnosti ispitivane kemikalije; u slučaju vrlo nestabilnih i hlapljivih kemikalija potrebno je češće izlaganje da bi se održale približno stalne koncentracije. U određenim okolnostima može biti potrebna primjena protočnog postupka (8) (10).

34.

Ova ispitna metoda ne uključuje scenarij izlaganja kod folijarne primjene (raspršivanje); umjesto toga, vidjeti (11).

35.

Potrebna je neprekidna toplo ili hladno bijela fluorescentna rasvjeta čiji intenzitet treba odabrati unutar područja od 85 do 135 μE · m– 2s– 1, mjereno u području fotosintetički aktivnog zračenja (400 – 700 nm) u točkama koje su na istoj udaljenosti od izvora svjetlosti kao i listovi Lemna (što odgovara 6 500 – 10 000 lx). Odstupanja od odabranog intenziteta svjetlosti u ispitnom prostoru ne smiju biti viša od ± 15 %. Metoda detekcije i mjerenja svjetlosti, posebno vrsta senzora, utječu na izmjerenu vrijednost. Sferičnim senzorima (koji reagiraju na svjetlost iz svih kutova iznad i ispod mjerne ravnine) i ‚kosinusnim’ senzorima (koji reagiraju na svjetlost iz svih kutova iznad mjerne ravnine) daje se prednost u odnosu na usmjerene senzore jer daju više mjerne vrijednosti kod višetočkastog izvora svjetlosti kakav je ovdje opisan.

36.

Temperatura u ispitnim posudama mora biti 24 ± 2 °C. pH-vrijednost kontrolnog medija tijekom ispitivanja ne smije se povećati za više od 1,5 jedinica. Ipak, odstupanje za više od 1,5 jedinica ne dovodi u pitanje valjanost ispitivanja ako se može dokazati da su zadovoljeni kriteriji valjanosti. Pomak pH-vrijednosti ipak u nekim posebnim slučajevima zahtijeva povećanu pozornost, npr. kad se ispituju nestabilne kemikalije ili metali. Za dodatne smjernice vidjeti (8).

37.

Ispitivanje se prekida sedam dana nakon što se biljke prenesu u ispitne posude.

38.

Na početku ispitivanja izbroje se listovi u ispitnim posudama i zabilježi se broj listova, pazeći da se uzmu u obzir svi istureni, jasno vidljivi listovi. Broj listova normalnog i promijenjenog izgleda određuje se na početku ispitivanja, najmanje jedanput svaka tri dana u razdoblju izlaganja (tj. najmanje dva puta u razdoblju od sedam dana) i po završetku ispitivanja. Treba zabilježiti sve promjene u razvoju biljaka, npr. promjene u veličini listova ili izgledu, naznake nekroze, kloroze ili nabrekline, raspadanje kolonija ili gubitak sposobnosti plivanja te promjene dužine i izgleda korijenja. Također treba zabilježiti značajna svojstva ispitnog medija (npr. prisutnost neotopljenog materijala, rast algi u ispitnoj posudi).

39.

Osim određivanja broja listova tijekom ispitivanja, ocjenjuju se i učinci ispitivane kemikalije na jednu (ili više) sljedećih mjernih varijabli:

40.

Ukupna lisna površina ima prednost u tome da se može odrediti za svaku ispitnu i kontrolnu posudu na početku, za vrijeme i na kraju ispitivanja. Suhu odnosno svježu masu treba odrediti na početku ispitivanja, i to na uzorku kulture inokuluma koja je reprezentativna za materijal upotrijebljen na početku ispitivanja, te na kraju ispitivanja na biljnom materijalu iz svake ispitne i kontrolne posude. Ako se ne mjeri lisna površina, suhoj se masi daje prednost u odnosu na svježu masu.

41.

Ukupna lisna površina, suha masa i svježa masa mogu se odrediti na sljedeći način:

42.

Ako se primjenjuje statički postupak, pH-vrijednost treba izmjeriti u svakoj obradi na početku i na kraju ispitivanja. U slučaju polustatičkog postupka pH treba izmjeriti u svakoj šarži ‚svježe’ ispitne otopine prije svakog obnavljanja te u odgovarajućim ‚potrošenim’ otopinama.

43.

Intenzitet svjetlosti treba izmjeriti u uzgojnoj komori, inkubatoru odnosno prostoriji u točkama koje su na istoj udaljenosti od izvora svjetlosti kao i listovi vodene leće. Mjerenja se provode najmanje jedanput tijekom ispitivanja. Najmanje jedanput dnevno treba bilježiti temperaturu medija u jednoj zamjenskoj (‚surogat’) posudi koja se drži u istim uvjetima u uzgojnoj komori, inkubatoru odnosno prostoriji.

44.

Koncentracije ispitivane kemikalije određuju se u prikladnim razmacima tijekom ispitivanja. Kod statičkog se ispitivanja koncentracije moraju odrediti barem na početku i na kraju ispitivanja.

45.

U slučaju polustatičkih ispitivanja kod kojih se ne očekuje da će koncentracija ispitivane kemikalije ostati u granicama ± 20 % nazivne koncentracije potrebno je analizirati sve svježe pripremljene ispitne otopine i zatim ponoviti analizu kod svakog obnavljanja (vidjeti stavak 33.). Ipak, kod ispitivanja u kojima izmjerena početna koncentracija ispitivane kemikalije nije u granicama ± 20 % nazivne koncentracije, ali ima dovoljno dokaza da su početne koncentracije ponovljive i stabilne (tj. unutar područja od 80 do 120 % početne koncentracije), kemijska se određivanja mogu provoditi samo na najvišoj i najnižoj ispitnoj koncentraciji. U svakom slučaju, određivanje koncentracija ispitivane kemikalije prije obnavljanja treba provesti samo na jednoj posudi u svakoj ispitnoj koncentraciji (ili na združenom sadržaju posuda ponavljanja).

46.

Ako se primjenjuje protočni postupak, može se primijeniti sličan režim uzorkovanja poput onoga koji je opisan za polustatička ispitivanja, uključujući analizu na početku, u sredini i na kraju ispitivanja, ali u tom slučaju nije primjereno mjerenje ‚potrošenih’ otopina. Kod ovakvih ispitivanja treba svakodnevno provjeravati brzinu protoka vode za razrjeđivanje i ispitivane kemikalije odnosno radne otopine ispitivane kemikalije.

47.

Ako postoje dokazi da se koncentracija ispitivane kemikalije tijekom ukupnog trajanja ispitivanja na zadovoljavajući način održava u granicama ± 20 % nazivne ili izmjerene početne koncentracije, analiza rezultata može se temeljiti na nazivnim ili izmjerenim početnim vrijednostima. Ako je odstupanje od nazivne ili izmjerene početne koncentracije veće od ± 20 %, analiza rezultata mora se temeljiti na srednjoj geometrijskoj koncentraciji tijekom izlaganja ili modelima koji opisuju opadanje koncentracije ispitivane kemikalije (8).

48.

U određenim okolnostima, npr. kad preliminarno ispitivanje ukazuje na to da ispitivana kemikalija nema toksično djelovanje u koncentraciji do 100 mg/l ili do granice topljivosti u ispitnom mediju (ovisno o tomu što je manje), može se provesti granično ispitivanje za usporedbu odgovora kontrolne skupine s jednom ispitnom skupinom (100 mg/l ili koncentracija koja odgovara granici topljivosti). Preporučuje se da se uz granično ispitivanje svakako napravi analiza koncentracije izloženosti. Za granično ispitivanje vrijede svi navedeni ispitni uvjeti i kriteriji valjanosti, s time da je potrebno udvostručiti broj ponavljanja u ispitnoj skupini. Rast u kontrolnoj i ispitnoj skupini može se analizirati statističkim testom za usporedbu srednjih vrijednosti, npr. Studentovim t-testom.

49.

Da bi se odredilo vrijeme koje je potrebno da se broj listova udvostruči (Td) i utvrdilo ispunjuje li istraživanje ovaj kriterij valjanosti (stavak 12.), dobivene podatke za kontrolne posude treba uvrstiti u sljedeću formulu:

Td = ln 2/μ

gdje je μ prosječna specifična brzina rasta određena onako kako je opisano u stavcima 54. i 55.

50.

Svrha je ispitivanja odrediti učinke ispitivane kemikalije na vegetativni rast vrsta roda Lemna. U ovoj su ispitnoj metodi opisane dvije varijable odgovora, budući da različite jurisdikcije imaju različite preferencije i regulatorne zahtjeve. Da bi rezultati ispitivanja bili prihvatljivi u svim jurisdikcijama, učinke treba ocijeniti primjenom obiju varijabli odgovora opisanih u nastavku pod točkama (a) i (b).

51.

Valja napomenuti da vrijednosti toksičnosti izračunane primjenom tih dviju varijabli odgovora nisu usporedive i tu razliku treba uzeti u obzir kod primjene rezultata ispitivanja. Ako su ispoštovani ispitni uvjeti ove metode, vrijednosti ECx na temelju prosječne specifične brzine rasta (ErCx) općenito su više od rezultata na temelju prirasta (EyCx) zbog razlike u matematičkoj osnovi tih dvaju pristupa. To ne treba tumačiti kao razliku u osjetljivosti dviju varijabli odgovora, nego naprosto prihvatiti da su te vrijednosti matematički različite. Pojam prosječne specifične brzine rasta temelji se na općenitom obrascu eksponencijalnog rasta vodene leće u neograničenim kulturama, gdje se toksičnost procjenjuje na temelju učinaka na brzinu rasta neovisno o apsolutnoj vrijednosti specifične brzine rasta u kontrolnoj skupini, nagibu krivulje koncentracija-odgovor ili trajanju ispitivanja. Za razliku od toga, rezultati koji se temelje na varijabli odgovora ‚prirast’ ovise o svim tim drugim varijablama. EyCx ovisi o specifičnoj brzini rasta vrsta vodene leće koje se upotrebljavaju u ispitivanju i o maksimalnoj specifičnoj brzini rasta, koja se može razlikovati među vrstama, pa čak i različitim klonovima. Ovu varijablu odgovora ne treba upotrebljavati za usporedbu osjetljivosti na toksine među vrstama vodene leće, pa čak ni među klonovima. Iako se, sa znanstvenog stajališta, procjeni toksičnosti na temelju prosječne specifične brzine rasta daje prednost, u ovu su ispitnu metodu uključene i procjene na temelju prirasta kako bi se zadovoljili trenutačni regulatorni zahtjevi u nekim jurisdikcijama.

52.

Procjene toksičnosti treba temeljiti na broju listova i jednoj dodatnoj mjernoj varijabli (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa), jer neke kemikalije mogu znatno više utjecati na neke druge mjerne varijable nego na broj listova. Taj bi utjecaj ostao neotkriven kad bi se samo računao broj listova.

53.

Broj listova, kao i sve druge dokumentirane mjerne varijable, tj. ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa, treba uvrstiti u tablicu zajedno s koncentracijama ispitivane kemikalije pri svakom mjerenju. Kasnija analiza podataka, npr. za procjenu vrijednosti LOEC, NOEC ili ECx, mora se temeljiti na vrijednostima pojedinačnih ponavljanja, a ne na izračunanim srednjim vrijednostima po ispitnim skupinama.

54.

Prosječna specifična brzina rasta za određeno razdoblje izračunava se kao logaritamsko povećanje varijabli rasta – broj listova i još jedna mjerna varijabla (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa) – primjenom formule u nastavku za svako ponavljanje u kontrolama i obradama:

gdje je:

Za svaku ispitnu i kontrolnu skupinu treba izračunati srednju vrijednost brzine rasta s procjenom varijance.

55.

Prosječnu specifičnu brzinu rasta treba izračunati za čitavo razdoblje ispitivanja (vrijeme ‚i’ u gornjoj formuli početak je ispitivanja, a vrijeme ‚j’ je kraj ispitivanja). Izračuna se srednja vrijednost prosječne specifične brzine rasta s procjenom varijance za svaku ispitnu koncentraciju i kontrolu. Osim toga, odredi se etapna brzina rasta kako bi se ocijenili učinci ispitivane kemikalije koji se javljaju tijekom razdoblja izlaganja (npr. pregledom logaritamski transformiranih krivulja rasta). Značajne razlike između etapne brzine rasta i prosječne brzine rasta ukazuju na odstupanje od stalnog eksponencijalnog rasta i u tom slučaju treba temeljito preispitati krivulju rasta. Konzervativniji pristup u ovakvim bi slučajevima bio usporediti specifične brzine rasta obrađenih kultura u razdoblju maksimalne inhibicije sa specifičnim brzinama rasta kontrolnih kultura tijekom istog razdoblja.

56.

Postotak inhibicije brzine rasta (Ir) tada se može izračunati za svaku ispitnu koncentraciju (ispitnu skupinu) prema sljedećoj formuli:

gdje je:

57.

Učinci na prirast određuju se na temelju dviju mjernih varijabli, broja listova i još jedne mjerne varijable (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa) u svakoj ispitnoj posudi na početku i na kraju ispitivanja. Početna biomasa za suhu i svježu masu određuje se na temelju uzorka listova uzetog iz iste šarže koja je upotrijebljena za inokulaciju ispitnih posuda (vidjeti stavak 20.). Za svaku ispitnu koncentraciju i kontrolu treba izračunati srednju vrijednost prirasta s procjenama varijance. Srednji postotak inhibicije prirasta ( % Iy) za svaku ispitnu skupinu može se izračunati na sljedeći način:

gdje je: