32008R0273

UREDBA KOMISIJE (EZ) br. 273/2008

od 5. ožujka 2008.

o utvrđivanju detaljnih pravila za primjenu Uredbe Vijeća (EZ) br. 1255/1999 o metodama analize i ocjenjivanja kvalitete mlijeka i mliječnih proizvoda

KOMISIJA EUROPSKIH ZAJEDNICA,

uzimajući u obzir Ugovor o osnivanju Europske zajednice,

uzimajući u obzir Uredbu Vijeća (EZ) br. 1255/1999 od 17. svibnja 1999. o zajedničkoj organizaciji tržišta mlijeka i mliječnih proizvoda (1), a posebno njezine članke 10. i 15. i članak 26. stavak 3., članak 29. stavak 1. i članak 31. stavak 4.,

budući da:

DONIJELA JE OVU UREDBU:

POGLAVLJE I.

OPĆE ODREDBE

Članak 1.

Predmet i područje primjene

1.   Ovom se Uredbom utvrđuju neke referentne metode za kemijsku, fizikalnu i mikrobiološku analizu te za senzorsko ocjenjivanje mlijeka i mliječnih proizvoda, koje treba koristiti u skladu s režimima predviđenim u okviru zajedničke organizacije tržišta mlijeka i mliječnih proizvoda uspostavljenim Uredbom (EZ) br. 1255/1999 te s pravilima za primjenu tih metoda.

2.   Popis referentnih metoda koje se primjenjuju za analize iz stavka 1. utvrđen je u Prilogu I. ove Uredbe.

3.   Komisija taj popis ažurira u skladu s postupkom utvrđenim u članku 42. Uredbe (EZ) br. 1255/1999.

Članak 2.

Rutinske metode

Za analize koje nalažu pravila Zajednice mogu se primjenjivati rutinske metode, pod uvjetom da ih se pravilno kalibrira i redovito provjerava prema referentnoj metodi. Kod usporedbe rezultata uzima se u obzir stalna pristranost, ponovljivost i obnovljivost.

U slučaju spornih rezultata, odlučujući je rezultat dobiven referentnom metodom.

O primjeni rutinskih metoda u analizama iz članka 1. države članice obavješćuju Komisiju.

POGLAVLJE II.

METODE ANALIZE

Članak 3.

Ocjenjivanje sukladnosti pošiljke sa zakonskim ograničenjima

Prilog II. ove Uredbe primjenjuje se za utvrđivanje sukladnosti sa zakonskim zahtjevima u pogledu sastava, osim za analizu markera.

Članak 4.

Senzorsko ocjenjivanje

1.   Za mlijeko i mliječne proizvode, osim maslaca za javno skladištenje, kao referentnu metodu za senzorsko ocjenjivanje države članice koriste ili standard IDF 99C:1997 ili druge usporedive metode, o kojima službeno obavješćuju Komisiju.

Za provjeru rada ocjenjivača i pouzdanosti rezultata senzorskih analiza primjenjuju se postupci opisani u Prilogu III.

2.   Za maslac za javno skladištenje, za provjeru rada ocjenjivača i pouzdanosti rezultata senzorskih analiza primjenjuju se postupci opisani u Prilogu III.

Postupak utvrđen u Prilogu IV. primjenjuje se kao referentna metoda za senzorsko ocjenjivanje.

Članak 5.

Markeri

1.   Metoda analize utvrđena Prilogom V. koristi se kao referentna metoda za određivanje sadržaja triglicerida enantne kiseline u maslacu, maslu i vrhnju.

2.   Metoda analize utvrđena u Prilogu VI. koristi se kao referentna metoda za određivanje sadržaja vanilina u koncentriranom maslacu, maslacu i vrhnju.

3.   Metoda analize utvrđena u Prilogu VII. koristi se kao referentna metoda za određivanje sadržaja etil estera beta-apo-8’ karotenske kisline u koncentriranom maslacu, maslacu i vrhnju.

4.   Metoda analize utvrđena u Prilogu VIII. koristi se kao referentna metoda za određivanje sadržaja β-sitosterola ili stigmasterola u maslacu i koncentriranom maslacu.

5.   Smatra se da su koncentriranom maslacu, maslacu i vrhnju dodani markeri u skladu s relevantnim pravilima Zajednice ako su dobiveni rezultati u skladu sa specifikacijama iz točaka 10. i 11. Priloga V. i točke 8. priloga VI., VII. i VIII.

Članak 6.

Detekcija kazeina kravljeg mlijeka

1.   Referentna metoda analize utvrđena u Prilogu IX. koristi se da bi se osiguralo da sir napravljen isključivo od ovčjeg, kozjeg ili bivoljeg mlijeka ne sadrži kazein kravljeg mlijeka.

Ako je udio kazeina kravljeg mlijeka u analiziranom uzorku jednak ili viši od udjela u referentnom uzorku koji sadrži 1 % kravljeg mlijeka, kako je utvrđeno u Prilogu IX., smatra se da je kazein kravljeg mlijeka prisutan.

2.   Rutinske metode za detekciju kazeina kravljeg mlijeka u sirevima iz stavka 1. mogu se koristiti pod uvjetom da:

Ako bilo koji od gore navedenih zahtjeva nije ispunjen, koriste se referentne metode navedene u Prilogu IX.

Članak 7.

Detekcija koliforma

Koliformi u maslacu, obranom mlijeku u prahu, kazeinu i kazeinatima detektiraju se u skladu s referentnom metodom navedenom u Prilogu X.

Članak 8.

Određivanje sadržaja laktoze

Sadržaj laktoze u proizvodima koji spadaju pod oznaku KN 2309 određuje se u skladu s referentnom metodom navedenom u Prilogu XI.

Članak 9.

Detekcija slatke sirutke

1.   Slatka sirutka u obranom mlijeku u prahu namijenjenom za javno skladištenje detektira se u skladu s referentnom metodom navedenom u Prilogu XII.

2.   Slatka sirutka u obranom mlijeku i smjesama namijenjenim za hranu za životinje detektira se u skladu s referentnom metodom navedenom u Prilogu XII. U slučaju detekcije slatke sirutke treba primijeniti Prilog XIII.

Članak 10.

Detekcija mlaćenice

Mlaćenica u obranom mlijeku u prahu detektira se u skladu s referentnom metodom navedenom u Prilogu XIV.

Članak 11.

Detekcija antimikrobnih ostataka

Antimikrobni ostaci u obranom mlijeku u prahu detektiraju se u skladu s referentnom metodom navedenom u Prilogu XV.

Članak 12.

Određivanje sadržaja obranog mlijeka u prahu

Sadržaj obranog mlijeka u prahu u krmnim smjesama određuje se u skladu s referentnom metodom navedenom u Prilogu XVI.

Članak 13.

Detekcija škroba

Škrob u denaturiranom mliječnom prahu i krmnim smjesama detektira se u skladu s referentnom metodom navedenom u Prilogu XVII.

Članak 14.

Određivanje sadržaja vlage u vrhnju u prahu

Sadržaj vlage u vrhnju u prahu određuje se u skladu s referentnom metodom navedenom u Prilogu XVIII.

Članak 15.

Određivanje sadržaja vlage u kiseloj mlaćenici u prahu

Sadržaj vlage u vrhnju u prahu za uporabu u hrani za životinje određuje se u skladu s referentnom metodom navedenom u Prilogu XIX.

Članak 16.

Određivanje čistoće mliječne masti

Čistoća mliječne masti određuje se u skladu s referentnom metodom navedenom u Prilogu XX.

POGLAVLJE III.

OPĆE I ZAVRŠNE ODREDBE

Članak 17.

Osiguranje kvalitete

Analize se provode u laboratorijima koji imaju sustav osiguranja analitičke čistoće, koji obuhvaća i postupke interne kontrole kvalitete. Laboratoriji koji nisu akreditirani najmanje jednom godišnje sudjeluju u programima ispitivanja osposobljenosti laboratorija i njihovi rezultati ne smiju odstupati za više od 2σR (standardna devijacija obnovljivosti referentne metode) od konsenzusne vrijednosti. Detaljan opis korištenog sustava može se dobiti na uvid u predmetnom laboratoriju.

Laboratoriji koji su akreditirani u skladu sa standardima navedenim u članku 12. Uredbe (EZ) br. 882/2004 Europskog parlamenta i Vijeća od 29. travnja 2004. o službenom nadzoru koji se provodi radi provjere pridržavanja propisa o hrani i hrani za životinje te pravila o zdravlju i dobrobiti životinja (6), izuzeti su od obveze sudjelovanja u ispitivanjima osposobljenosti.

Članak 18.

Uzorkovanje i sporovi vezani uz rezultate analiza

1.   Uzorkovanje se provodi u skladu s uredbom koja je relevantna za predmetni proizvod. Ako ona ne sadrži odredbe o uzorkovanju, primjenjuje se odredba iz standarda ISO 707 | IDF 50, Mlijeko i mliječni proizvodi – Smjernice za uzorkovanje.

2.   Laboratorijski izvještaji o rezultatima analiza moraju sadržavati dovoljno informacija za ocjenjivanje rezultata koje se provodi u skladu s Prilogom II. i Prilogom XXI.

3.   Za analize koje se traže u skladu s pravilima Zajednice uzorke obvezno treba uzimati u duplikatu.

4.   Postupak opisan u Prilogu XXI. primjenjuje se u slučajevima kad operator ne prihvaća rezultate analize.

5.   Ako proizvođač u roku od pet radnih dana nakon uzorkovanja može dokazati da postupak uzorkovanja nije bio ispravno proveden, uzorkovanje u slučajevima kad je to moguće treba ponoviti. Ako se uzorkovanje ne može ponoviti, pošiljka se mora prihvatiti.

Članak 19.

Prijelazno razdoblje

Ocjenjivanje sukladnosti prema Prilogu II. ove Uredbe provodi se u roku od 12 mjeseci nakon stupanja Uredbe na snagu. Države članice prema potrebi odmah izvještavaju Komisiju ako se tijekom tog razdoblja pojavi neki veći problem vezan uz postupak statističke kontrole.

Članak 20.

Stavljanje izvan snage

Uredba (EZ) br. 213/2001 stavlja se izvan snage.

Upute na Uredbu koja je stavljena izvan snage smatraju se uputama na ovu Uredbu i tumače se u skladu s korelacijskom tablicom iz Priloga XXII.

Članak 21.

Stupanje na snagu

Ova Uredba stupa na snagu trećeg dana nakon objave u Službenom listu Europske unije.

Primjenjuje se od 31. ožujka 2008.

(1)  SL L 160, 26.6.1999., str. 48. Uredba kako je zadnje izmijenjena Uredbom (EZ) br. 1152/2007 (SL L 258, 4.10.2007., str. 3.). Uredba (EZ) br. 1255/1999 bit će 1. srpnja 2008. zamijenjena Uredbom (EZ) br. 1234/2007 (SL L 299, 16.11.2007., str. 1.).

(2)  SL L 37, 7.2.2001., str. 1.

(3)  SL L 308, 25.11.2005., str. 1. Uredba kako je zadnje izmijenjena Uredbom (EZ) br. 1546/2007 (SL L 337, 21.12.2007., str. 68.).

(4)  SL L 279, 11.10.1990., str. 22. Uredba kako je zadnje izmijenjena Uredbom (EZ) br. 1487/2006 (SL L 278, 10.10.2006., str. 8.).

(5)  SL L 256, 7.9.1987., str. 1. Uredba kako je zadnje izmijenjena Uredbom (EZ) br. 1352/2007 (SL L 303, 21.11.2007., str. 3.).

(6)  SL L 165, 30.4.2004., str. 1.

PRILOG I.

(Članak 1.)

POPIS REFERENTNIH METODA

Indeks Min. = minimum, Maks. = maksimum, Prilog = prilog navedenoj uredbi, BST = bezmasna suha tvar, PB = peroksidni broj, I = izgled, O = okus, K = konzistencija, UBB = ukupan broj bakterija, Term. = broj termofilnih bakterija, DČ = država članica, IDF = Međunarodna mljekarska federacija, ISO = Međunarodna organizacija za standardizaciju, IUPAC = Međunarodna unija za čistu i primijenjenu kemiju, ADPI = Američki institut za mliječne proizvode, ZKM = zaslađeno kondenzirano mlijeko, EMV = evaporirano mlijeko ili vrhnje.

DIO A

DIO B

Referentne metode navedene u dijelu B mogu se koristiti za analizu proizvoda obuhvaćenih bilo kojom od uredaba navedenih u stupcu 1.

Napomene uz popis referentnih metoda Europske unije:

Napomena 1.: Izdvajanje mliječne masti, kako je opisano u standardu ISO 1740:1991 (zaštita od svjetla).

Napomena 2.: Nije utvrđena referentna metoda. Metode koje odobrava nadležno tijelo.

Napomena 3.: Uzorak treba pripremiti u skladu sa standardom ISO 8261:2001|IDF 122:2001.

Napomena 4.: Inkubacija 48 sati na temperaturi od 55 °C, treba se pobrinuti da ne dođe do isušivanja hranjive podloge za uzgoj kulture.

Napomena 5.: % m/m BST = % m/m suhe tvari – % m/m masti.

Napomena 6.: Direktiva Komisije 84/4/EEZ.

Napomena 7.: Uredba Komisije (EZ) br. 2799/1999 (SL L 340, 31.12.1999., str. 3.-27.).

Napomena 8.: Direktiva Komisije 78/633/EEZ.

(1)  Ne dovodeći u pitanje zahtjeve iz odgovarajuće Uredbe.

(2)  1. rujna 2009. minimalni sadržaj bjelančevina bio bi 34 %.

PRILOG II.

(Članak 3.)

OCJENJIVANJE SUKLADNOSTI POŠILJKE S PROPISANIM OGRANIČENJIMA

1.   NAČELO

U slučajevima kad su detaljni postupci uzorkovanja utvrđeni relevantnim zakonodavstvom, primjenjuju se ti postupci. U svim drugim slučajevima uzima se uzorak koji se sastoji od najmanje 3 uzorkovne jedinice koje se nasumično uzmu iz pošiljke koja je dana na pregled. Može se pripremiti i kompozitni uzorak. Dobiveni rezultat uspoređuje se s propisanim graničnim vrijednostima na temelju izračuna 95 %-tnog intervala pouzdanosti kao dvostruke standardne devijacije, pri čemu relevantna standardna devijacija ovisi o tome (1) je li metoda potvrđena u okviru međunarodne suradnje kroz vrijednosti za σr i σR ili je (2), u slučaju interne validacije, izračunana interna obnovljivost. Ovaj interval pouzdanosti bit će tada jednak mjernoj nesigurnosti rezultata.

2.   METODA SE VALIDIRA KROZ MEĐUNARODNU SURADNJU

U ovom slučaju standardna devijacija ponovljivosti σr i standardna devijacija obnovljivosti σR utvrđene su i laboratorij može dokazati sukladnost s izvedbenim karakteristikama validirane metode.

Izračunajte aritmetičku sredinu za n ponovljenih mjerenja.

Izračunajte proširenu nesigurnost (k = 2) kao

Ako se konačni rezultat mjerenja izračuna pomoću formule x = y1 + y2, x = y1 – y2, x = y1 · y2 ili x = y1 / y2, treba primijeniti uobičajene postupke za kombiniranje standardnih odstupanja u takvim slučajevima.

Pošiljka se ocjenjuje kao nesukladna s propisanom gornjom graničnom vrijednošću UL ako je

;

inače se ocjenjuje kao sukladna s propisanom gornjom graničnom vrijednošću UL.

Pošiljka se ocjenjuje kao nesukladna s propisanom donjom graničnom vrijednošću LL ako je

;

inače se ocjenjuje kao sukladna s LL.

3.   INTERNA VALIDACIJA IZRAČUNOM STANDARDNE DEVIJACIJE INTERNE OBNOVLJIVOSTI

U slučajevima kad se koriste metode koje nisu navedene u ovoj Uredbi i kad nisu utvrđene mjere za preciznost, mora se provesti interna validacija. U formuli za izračun proširene nesigurnosti U, umjesto σr i σR treba uporabiti standardnu devijaciju interne ponovljivosti sir, odnosno standardnu devijaciju interne obnovljivosti siR.

Pritom važe pravila odlučivanja u skladu s točkom 1. Međutim, ako se pošiljka ocijeni kao nesukladna s propisanim ograničenjem, mjerenja se moraju ponoviti uz primjenu metode navedene u ovoj Uredbi, a odluka se donosi u skladu s točkom 1.

PRILOG III.

(Članak 4.)

OCJENJIVANJE OCJENJIVAČA I POUZDANOST REZULTATA SENZORSKE ANALIZE

Kod primjene metode bodovanja provode se sljedeći postupci (standard IDF 99C:1997).

A.   ODREĐIVANJE „INDEKSA PONOVLJIVOSTI”

Ocjenjivač ispituje najmanje 10 uzoraka slijepih proba tijekom razdoblja od 12 mjeseci. To se obično obavlja u nekoliko navrata. Rezultati za svojstva pojedinačnih proizvoda ocjenjuju se na temelju sljedeće formule:

gdje je:

Uzorci koji se ocjenjuju trebaju pokazati širok raspon kvalitete. w1 ne smije premašiti 1,5 (na ljestvici od 5 bodova).

B.   ODREĐIVANJE INDEKSA ODSTUPANJA

Pomoću ovog indeksa treba provjeriti koristi li ocjenjivač istu skalu za ocjenu kvalitete kao iskusna skupina ocjenjivača. Bodovi koje postigne ocjenjivač uspoređuju se s prosječnim brojem bodova postignutim unutar skupine ocjenjivača.

Za ocjenjivanje rezultata koristi se sljedeća formula:

Gdje je:

Uzorci koji se ocjenjuju trebaju pokazivati širok raspon kvalitete. DI ne smije prekoračiti 1,5 (na ljestvici od 5 bodova).

Države članice moraju prijaviti sve probleme s kojima se susreću kod primjene ovog postupka.

Ako se ustanovi da su pojedinačni ocjenjivači prekoračili graničnu vrijednost 1,5 za indekse devijacije ili ponovljivosti, stručnjak/stručnjaci nadležnog tijela mora(ju) provesti jednu ili više nasumičnih naknadnih provjera uzoraka koje ti ocjenjivači ocijene u sljedećih nekoliko tjedana, ili provesti jednu ili više „praćenih” provjera zajedno s tim ocjenjivačima. Za donošenje odluke o zadržavanju njihovih usluga potrebno je pomno praćenje. Nalaze treba dokumentirati i zadržati kao dokaz o daljnjim mjerama.

C.   USPOREDBA REZULTATA DOBIVENIH U RAZLIČITIM REGIJAMA DRŽAVE ČLANICE I RAZLIČITIM DRŽAVAMA ČLANICAMA

Ako je to primjenjivo, najmanje jednom godišnje organizira se ispitivanje radi usporedbe rezultata koje su dobili ocjenjivači u različitim regijama. Ako se uoče značajne razlike, treba poduzeti potrebne mjere da bi se utvrdili razlozi i da bi se došlo do usporedivih rezultata.

Države članice mogu organizirati ispitivanja za usporedbu rezultata koje su dobili njihovi vlastiti ocjenjivači i ocjenjivači u susjednim državama članicama. Značajnije razlike razlog su za detaljno istraživanje s ciljem postizanja usporedivih rezultata.

O rezultatima tih usporedbi države članice obavješćuju Komisiju.

PRILOG IV.

(Članak 4.)

SENZORSKO OCJENJIVANJE MASLACA

1.   PODRUČJE PRIMJENE

Svrha je ovog postupka za senzorsko ocjenjivanje maslaca osigurati jedinstvenu metodu koja će se primjenjivati u svim državama članicama.

Detaljnije informacije potražite u važećem IDF-ovom međunarodnom standardu za mlijeko i mliječne proizvode, IDF 99 – dijelovi 1., 2., 3., o senzorskom ocjenjivanju.

2.   DEFINICIJE

„Senzorsko ocjenjivanje” (procjenjivanje) znači ispitivanje svojstava proizvoda osjetilnim organima.

„Panel” znači skupinu odabranih ocjenjivača koji tijekom ocjenjivanja međusobno ne komuniciraju i ne utječu jedni na druge.

„Ocjenjivač” znači osoba odabrana zbog njezine sposobnosti da izvodi senzorsko ispitivanje. Ova vrsta ocjenjivača može imati ograničeno iskustvo.

„Stručni ocjenjivač” znači osoba s visokom razinom senzorske osjetljivosti i iskustva sa senzorskom metodologijom koja može raditi dosljedne i pouzdane senzorske procjene različitih proizvoda. Ova vrsta ocjenjivača ima dobru i dugotrajnu senzorsku memoriju.

„Bodovanje” znači senzorsko ocjenjivanje koje provodi panel primjenjujući brojčanu ljestvicu. Pritom treba koristiti nomenklaturu nedostatka.

„Klasificiranje” znači razvrstavanje proizvoda po kvaliteti, koje se obavlja na temelju bodovanja.

„Ocjenjivački list”: dokument koji se upotrebljava za zapisivanje pojedinih ocjena za svako svojstvo i konačne ocjene proizvoda. (Ovaj se dokument može koristiti i za bilježenje kemijskog sastava).

3.   PROSTORIJA ZA ISPITIVANJE

Više detalja potražite u standardima ISO 8589 i ISO/DIS 22935-2 | IDF 99-2 stavak 7.

Treba poduzeti mjere opreza da na ocjenjivače u prostoriji za ocjenjivanje ne bi utjecali vanjski faktori.

U prostoriji za ocjenjivanje ne smije biti stranih mirisa te mora biti jednostavna za čišćenje. Zidovi moraju biti svijetle boje bez odsjaja.

Prostorija za ocjenjivanje i osvjetljenje u njoj moraju biti takvi da ne utječu na svojstva proizvoda koji se ocjenjuju.

Prostorija mora biti opremljena odgovarajućim uređajem za regulaciju temperature koji omogućuje održavanje stalne temperature maslaca. Dok se obavlja klasifikacija, temperatura maslaca treba biti 12 °C (± 2 °C).

4.   ODABIR OCJENJIVAČA

Ocjenjivač mora poznavati proizvode od maslaca i mora biti osposobljen za senzorsko ocjenjivanje. Nadležno tijelo redovito provjerava njegovu osposobljenost (barem jedanput godišnje).

4.1.   Detaljne informacije o općim zahtjevima i probirnim testovima koji se mogu primjenjivati prije službenog zapošljavanja novog ocjenjivača potražite u standardu ISO/DIS 22935-1 | IDF 99-1 stavku 4. i stavku 5.1.

Bitno je da se osposobljavanje odvija kontinuirano i da se redovito održavaju opća zasjedanja. Informacije o osposobljavanju panela potražite u standardu ISO 8586-1.

4.2.   Početna obuka treba obuhvatiti sljedeće:

5.   ZAHTJEVI U POGLEDU PANELA

Broj ocjenjivača u panelu mora biti neparan, najmanje tri. Većinu moraju činiti zaposlenici nadležnog tijela ili ovlaštene osobe koje nisu zaposlene u mliječnoj industriji.

Vođa panela odgovoran je za cijeli postupak i smije sudjelovati u radu panela.

Da bi članovi panela postigli optimalnu učinkovitost, prije ocjenjivanja treba uzeti u obzir više čimbenika:

6.   UČINKOVITOST

Svi ocjenjivači trebaju redovito sudjelovati u panelima za senzorsko ocjenjivanje radi održavanja osposobljenosti. Koliko će to biti često, ovisi o količinama i protoku maslaca, no, ako je moguće, najmanje jednom mjesečno.

Viši ocjenjivači isto tako trebaju sudjelovati u panelima svake godine, po mogućnosti najmanje jednom u tromjesečju.

7.   UZORKOVANJE I PRIPREMA UZORAKA

Bitno je da identitet uzoraka tijekom ocjenjivanja bude prikriven da bi se izbjegla svaka pristranost. Uzorke treba označiti šiframa.

To treba organizirati prije ocjenjivanja. Treba utvrditi zahtijevanu temperaturu maslaca tijekom prijevoza do prostorije za ispitivanje (6 °C ± 2 °C).

Ako se senzorsko ocjenjivanje provodi u hladnjači, uzorak se uzima pomoću naprave za uzorkovanje maslaca. Ako se senzorsko ocjenjivanje provodi na nekom drugom mjestu, a ne u hladnjači, treba uzeti najmanje 500 g uzorka. Tijekom ocjenjivanja temperatura maslaca mora biti 12 °C (± 2 °C) (vidjeti: u standardu ISO/DIS 22935-2 | IDF 99-2 temperatura za ocjenjivanje maslaca je 14 °C ± 2 °C). Pod svaku cijenu treba izbjegavati veće devijacije.

8.   OCJENJIVANJE VRIJEDNOSTI POJEDINAČNIH SVOJSTAVA

8.1.   Senzorsko ocjenjivanje obuhvaća tri svojstva: izgled, konzistenciju i okus:

„Izgled” obuhvaća sljedeća svojstva: boju, vidljivu čistoću, odsutnost fizičkog onečišćenja, odsutnost vidljivog rasta plijesni i ujednačenost disperzije vode. Disperzija vode ispituje se u skladu sa standardom IDF 112A/1989.

„Konzinstencija” obuhvaća sljedeća svojstva: gustoću, teksturu i čvrstoću. Mazivost se može pratiti fizikalnim sredstvima ako to neka država članica želi da bi zadovoljila zahtjeve kupaca. Komisije može odlučiti o usklađivanju te metodologije u budućnosti.

„Gustoća” je pojam koji se odnosi na kohezivnost proizvoda pri konzumaciji. Obično se povezuje s čvrstoćom i mazivošću i mora biti ujednačena u cijelom proizvodu. Usko je povezana s teksturom i predstavlja sposobnost proizvoda da može stajati i nositi vlastitu težinu. Pokazuje ju otpor kod rezanja, a može se izmjeriti mehanički ili na temelju osjeta u ustima ili dodira prstom.

„Okus” je svojstvo koje se osjeća u ustima, pretežno pomoću okusnih pupoljaka na jeziku.

„Aroma” je svojstvo koje se osjeća nosom i osjetom njuha.

Značajnije odstupanje od preporučene temperature sprečava pouzdano ocjenjivanje konzistencije ili okusa. Temperatura je od ključne važnosti.

Ako je temperatura izvan preporučenih okvira, klasifikaciju maslaca treba odgoditi.

8.2.   Svako se svojstvo mora senzorski ocjenjivati zasebno. Bodovanje se provodi prema tablici 1.

8.3.   Bilo bi poželjno da prije početka ocjenjivanja ocjenjivači zajednički ocijene jedan ili više referentnih uzoraka s obzirom na izgled, konzistenciju i okus da bi se postigla ujednačenost.

8.4.   Za prihvaćanje su potrebni sljedeći bodovi:

Vidjeti dio 7. – Nomenklatura i opis kriterija za bodovanje.

9.   NADZOR

Vođa panela, koji mora biti službeni zaposlenik nadležnog tijela i može biti član panela, mora biti općenito odgovoran za čitav postupak. On/ona mora zasebno upisati bodove za svako svojstvo u ocjenjivački list i potvrditi da je proizvod prihvaćen ili odbijen.

10.   NOMENKLATURA

Vidjeti priloženu tablicu 2.

11.   REFERENTNA DOKUMENTACIJA

FIL-IDF 99C:1997 Senzorsko ocjenjivanje mliječnih proizvoda bodovanjem – Referentna metoda

ISO/DIS 22935 | IDF 99 Međunarodni standard za mlijeko i mliječne proizvode – Senzorska analiza – dijelovi 1. – 3.

ISO 8586-1 Senzorska analiza – Opće smjernice za odabir, osposobljavanje i praćenje ocjenjivača – dio 1.

ISO 8589 Senzorska analiza – Opće uputstvo za projektiranje prostorija za ispitivanje

FIL-IDF 112A:1989 Maslac – Određivanje vrijednosti za disperziju vode

Tablica 1.

Ocjenjivanje maslaca

Tablica 2.

Tablica nedostataka maslaca

I.   Izgled

II.   Konzistencija

III.   Okus i miris

(1)  Tablica 2.

(2)  Nedostaci navedeni pod „Dobar” predstavljaju samo mala odstupanja od idealnog tipa.

(3)  Ovu oznaku treba koristiti što je rjeđe moguće i samo onda kad se nedostatak ne može točnije opisati.

PRILOG V.

(Članak 5.)

ODREĐIVANJE SADRŽAJA TRIGLICERIDA ENANTNE KISELINE U MASLACU, MASLU I VRHNJU PLINSKOM KROMATOGRAFSKOM ANALIZOM TRIGLICERIDA

1.   PODRUČJE PRIMJENE

Ovom metodom utvrđen je način određivanja sadržaja triglicerida enantne kiseline u maslacu, maslu i vrhnju.

2.   POJMOVI I DEFINICIJA

Sadržaj enantne kiseline: sadržaj triglicerida enantne kiseline određen postupkom utvrđenim u toj metodi.

Napomena: sadržaj enantne kiseline izražava se za maslo i maslac u kg po toni proizvoda, a za vrhnje u kg po toni mlijeka.

3.   NAČELO

Mliječna se mast ekstrahira iz različitih proizvoda prema standardu ISO 14156 | IDF 172:2001. Kvantitativno određivanje sadržaja triglicerida enantne kiseline u ekstrahiranoj masti provodi se kapilarnom plinskom kromatografijom (GC). Rezultat dobiven za uzorak ocjenjuje se prema trigliceridima kapronske kiseline kao internom standardu.

Napomena: Tributrin se isto tako pokazao kao zadovoljavajući interni standard.

4.   REAGENSI

Koristite samo reagense priznate analitičke čistoće.

4.1.   N-heksan.

4.2.   Standardni triglicerid kapronske kiseline, čistoće najmanje 99 %.

4.3.   Standardni triglicerid enantne kiseline, čistoće najmanje 99 %.

4.4.   Bezvodni natrijev sulfat (Na2SO4).

5.   OPREMA

Uobičajena laboratorijska oprema, a posebno sljedeće:

5.1.   Analitička vaga s točnošću od 1 mg.

5.2.   Odmjerne tikvice zapremine 10 ml i 20 ml.

5.3.   Epruvete za centrifugiranje zapremine 30 ml.

5.4.   Rotacijski evaporator.

5.5.   Sušionik koji može održavati temperaturu od 50 °C ± 5 °C.

5.6.   Filtar-papir, srednje poroznosti, promjera oko 15 cm.

5.7.   Oprema za plinsku kromatografiju.

5.7.1.   Plinski kromatograf opremljen split/splitless ili on-column injektorom kao i plamenoionizacijskim detektorom (FID).

5.7.2.   Kolona plinskog kromatografa (GC) sa stacionarnom fazom, koja je uspješno uporabljena za razdvajanje triglicerida (100 % dimetilpolisiloksan ili 5 % fenil-95 % metilpolisiloksan). Odaberite stacionarnu fazu, duljinu kolone (između 4 m i 15 m), unutarnji promjer (između 0,22 mm i 0,50 mm) i debljinu nanosa (0,12 μm ili više), uzimajući u obzir laboratorijska iskustva i injektorski sustav koji koristite. U svakom slučaju, u odabranoj koloni mora doći do potpunog razdvajanja pikova otapala i triglicerida kapronske kiseline i rezolucije pikova triglicerida kapronske i enantne kiseline po baznoj liniji. Primjeri važećih uvjeta navedeni su dalje u tekstu.

5.7.2.1.   Primjer važećih uvjeta pri uporabi split injektora:

5.7.2.2.   Primjer važećih uvjeta pri uporabi on-column injektora:

5.8.   Šprica za ubrizgavanje, zapremine 5 μl.

6.   UZORKOVANJE

Važno je da laboratorij dobije uzorak koji je zaista reprezentativan i koji nije bio oštećen ili promijenjen tijekom prijevoza ili skladištenja.

Uzorkovanje nije dio metode utvrđene u ovom međunarodnom standardu. Preporučena metoda uzorkovanja navedena je u standardima IDF 50C:1995 ili ISO 707-1997 – Mlijeko i mliječni proizvodi – Metode uzorkovanja.

7.   POSTUPAK

7.1.   Priprema ispitnog uzorka i uzorka za analizu

Postupajte u skladu sa standardima ISO 14156 | IDF 172:2001.

7.1.1.   Maslo, maslac

7.1.1.1.   U sušioniku (5.5.) otopite 50 do 100 g ispitnog uzorka.

7.1.1.2.   Stavite 0,5 do 1,0 g bezvodnog natrijevog sulfata u naborani filtar-papir.

7.1.1.3.   Profiltrirajte mast kroz filtar-papir s bezvodnim natrijevim sulfatom, pri čemu se filtrat skuplja u laboratorijskoj čaši u sušioniku (5.5.). Pri dekantiranju otopljenog maslaca na filtar-papir pazite da se ne prenese serum.

7.1.2.   Vrhnje

7.1.2.1.   Ispitni uzorak zagrijte na temperaturu 20 °C ± 2 °C.

7.1.2.2.   Uzorak dobro promućkajte ili promiješajte.

7.1.2.3.   Razrijedite odgovarajuću količinu ispitnog uzorka da biste dobili uzorak za analizu od 100 ml s masenim udjelom masti od približno 4 %.

7.1.2.4.   Za ekstrakciju masti iz vrhnja nastavite postupak kao kod sirovog i homogeniziranog mlijeka (vidjeti standard ISO 14156 | IDF 172:2001, stavak 8.3.).

7.1.2.5.   U odmjernoj tikvici od 10 ml (5.2.) odvagnite 1 g ekstrahirane masti, s točnošću od 1 mg. Dodajte 1 ml otopine 7.2.2. Do oznake 10 ml dolijte n-heksan (4.1.) i promiješajte.

7.1.2.6.   U odmjernu tikvicu od 10 ml (5.2.) stavite 1 ml otopine 7.1.1.2. i do oznake 10 ml razrijedite n-heksanom (4.1.).

7.2.   Priprema kalibracijskih standarda

7.2.1.   Otopite 100 mg triglicerida enantne kiseline (4.3.) u 10 ml n-heksana (4.1.).

7.2.2.   Otopite 100 mg triglicerida kapronske kiseline (4.2.) u 10 ml n-heksana (4.1.).

7.2.3.   U 10-mililitarsku odmjernu tikvicu (5.2.) stavite 1 ml otopine 7.2.2. Do oznake 10 ml dolijte n-heksan (4.1.).

7.2.4   U 10-mililitarsku odmjernu tikvicu (5.2.) stavite 1 ml otopine 7.2.1. i 1 ml otopine 7.2.2. Do oznake 10 ml dolijte n-heksan (4.1.).

7.2.5   U 10-mililitarsku odmjernu tikvicu (5.2.) stavite 1 ml otopine 7.2.4. i do oznake 10 ml dolijte n-heksan (4.1.).

7.3.   Kromatografsko određivanje

7.3.1.   Dvaput ubrizgajte po 1 μl standardne otopine 7.2.5.

7.3.2.   Ubrizgajte po 1 μl otopine svakog uzorka.

Napomena: Ako se koristi on-column injektorski sustav, treba primijeniti veći stupanj razrjeđenja i na standardnu otopinu i na otopine uzoraka.

7.3.3.   Postupak 7.3.1. ponovite na svaka 3 uzorka da biste obuhvatili uzorke između dva ubrizgavanja standardne otopine. Rezultati se temelje na prosječnoj srednjoj vrijednosti faktora odziva iz standardnih kromatograma.

8.   IZRAČUN REZULTATA

Za svaki kromatogram povežite površine pikova koji se odnose na trigliceride enantne i kapronske kiseline.

Slijedite te upute za svaki obuhvaćeni niz tj. za seriju obuhvaćenih uzoraka; standardna otopina ubrizgana dvaput neposredno prije njih je STD1, a standardna otopina ubrizgana dvaput neposredno iza njih je STD2.

8.1.   Kalibracija

8.1.1.   Izračunajte faktor odziva za svaki duplikat STD1, Rf1(a) i Rf1(b)

Rf1 (a) ili (b) = (površina pika triglicerida kapronske kiseline / površina pika triglicerida enantne kiseline) × 100

Izračunajte prosječnu srednju vrijednost faktora odziva Rf1

Rf1 = (Rf1 (a) + Rf1 (b)) / 2

8.1.2.   Na sličan način izračunajte prosječnu srednju vrijednost faktora odziva STD2, Rf2

8.1.3.   Izračunajte prosječnu srednju vrijednost faktora odziva Rf

Rf = (Rf1 + Rf2) / 2

8.2.   Ispitni uzorci

Za svaki kromatogram uzoraka dobiven između STD1 i STD2 izračunajte sadržaj enantne kiseline, C (kg/t):

C = (površina pika triglicerida enantne kiseline × Rf × 100)/(površina pika triglicerida kapronske kiseline × Wt × 1 000)

gdje je:

Za uzorke maslaca uzmite u obzir sadržaj maslaca i izračunajte korigiranu vrijednost koncentracije, Cmaslac (kg/t maslaca)

Cmaslac = Cmast × F

gdje je F sadržaj masti u maslacu.

9.   PRECIZNOST

Detalji o međulaboratorijskom ispitivanju maslaca u skladu sa standardima ISO 5725-1 i ISO 5725-2 o preciznosti metode navedeni su u točki 12.

Granične vrijednosti za ponovljivost i obnovljivost izražene su za razinu vjerojatnosti od 95 % i možda neće biti primjenjive na raspon koncentracija i matrice koje se razlikuju od navedenih.

9.1.   Ponovljivost

Apsolutna razlika između rezultata dvaju pojedinačnih ispitivanja, koja istom metodom na jednakom ispitnom materijalu u istom laboratoriju dobije isti analitičar koristeći istu opremu u kratkom vremenskom intervalu, ne smije u više od 5 % slučajeva biti veća od 0,35 kg/t.

9.2   Obnovljivost

Apsolutna razlika između rezultata dvaju pojedinačnih ispitivanja, koja istom metodom na jednakom ispitnom materijalu u različitim laboratorijima dobiju različiti analitičari koristeći različitu opremu, ne smije u više od 5 % slučajeva biti veća od 0,66 kg/t.

10.   GRANICE DOPUŠTENOG ODSTUPANJA: DONJE GRANICE (SLUČAJ NEDOSTATNIH KOLIČINA)

10.1.   Od proizvoda s dodanim markerom obvezno treba uzeti po tri uzorka radi provjere pravilnosti dodavanja

10.2.   Maslac i koncentrirani maslac

10.2.1.   Stupanj inkorporacije je 11 kg triglicerida enantne kiseline minimalne čistoće 95 % po toni maslaca, tj. 10,45 kg/t.

10.2.2.   Rezultati analize proizvoda dobiveni na tri uzorka koriste se za provjeru stope i homogenosti inkorporacije markera, a najniži od tih rezultata uspoređuje se sa sljedećim graničnim vrijednostima:

10.3.   Vrhnje

10.3.1.   Stupanj inkorporacije je 10 kg triglicerida enantne kiseline minimalne čistoće 95 % po toni mliječne masti, tj. 9,50 kg/t mliječne masti s dodanim markerom.

10.3.2.   Rezultati analize proizvoda dobiveni na tri uzorka koriste se za provjeru stupnja homogenosti inkorporacije markera, a najniži od tih rezultata uspoređuje se sa sljedećim graničnim vrijednostima:

11.   GRANICE DOPUŠTENOG ODSTUPANJA: GORNJE GRANICE (SLUČAJ PREKORAČENJA KOLIČINE ZA VIŠE OD 20 %)

11.1.   Od proizvoda s dodanim markerom treba uzeti po tri uzorka radi provjere pravilnosti dodavanja markera

11.2.   Maslac i koncentrirani maslac

11.2.1.   Rezultati analize proizvoda dobiveni na tri uzorka koriste se za provjeru stope i homogenosti inkorporacije markera, a srednja vrijednost tih rezultata uspoređuje se sa sljedećim graničnim vrijednostima:

11.3   Vrhnje

11.3.1.   Rezultati analize proizvoda dobiveni na tri uzorka koriste se za provjeru stope i homogenosti inkorporacije markera, a srednja vrijednost tih rezultata uspoređuje se sa sljedećim graničnim vrijednostima:

12.   DODATNI PODACI: STATISTIČKA ANALIZA REZULTATA ODREĐIVANJA TRIENANTOATA U MLIJEČNOJ MASTI ANALIZOM TRIGLICERIDA

Za određivanje sadržaja trienantoata u maslacu bila su izvedena četiri međulaboratorijska ispitivanja.

U prvom ring testu sudjelovalo je devet laboratorija, a specifikacije o metodama analize nisu bile dane.

U drugom ring testu sudjelovalo je deset laboratorija uz primjenu četiri različite metode:

Osim toga, za analizu metilnih estera masnih kiselina (FAME) bila su primijenjena dva različita postupka metilacije (De Francesco te Christopherson i Glass).

S obzirom na dobivene rezultate, za treći ring test odabrane su dvije metode:

Rezultati sedam laboratorija pokazali su da je metoda FAME proizvela veću varijabilnost pa je stoga odlučeno da se primijeni samo određivanje trienantoata kao triglicerida prema postupku kvantifikacije q za trienantoat uz korištenje trikaproata kao internog standarda. Osim toga, za analizu triglicerida treba koristiti kapilarnu kolonu.

U četvrtom ring testu radilo se na četiri uzorka (A, B, C, D) i devet laboratorija je dalo rezultate (tablice 1.-2.).

Dva su laboratorija (DE i UE) analizirala uzorke primjenjujući metodu FAME.

Zbog manjeg broja laboratorija, statistički je izračun napravljen za cijeli komplet podataka (slike 1.-2.), uključujući rezultate FAME, kao i za podatke dobivene analizom triglicerida (TG).

Testovi za ekstremne vrijednosti:

Ekstremne su vrijednosti isključene iz izračuna.

Važno je napomenuti da se kod tih testova rezultati dobiveni metodom FAME nikad nisu smatrali ekstremnim vrijednostima.

Parametri preciznosti

Tablice 1. i 2. prikazuju rezultate svih laboratorija i parametre preciznosti koji su izračunani za prihvatljivi broj (8) laboratorija, no nažalost nisu dobiveni istom metodom analize.

Tablice 3. i 4. prikazuju rezultate koji su dobiveni samo metodom analize triglicerida i odgovarajuće parametre preciznosti. Prihvaćanje ovih parametara uvjetovano je malim brojem laboratorija (6).

Slike 2. i 3. prikazuju trend Sr i SR izračunan za četiri uzorka dvaju gore opisanih setova podataka.

Tablica 5. prikazuje vrijednosti Sr i SR zajedno s odgovarajućim združenim vrijednostima i sveukupne parametre r i R.

Na kraju je izračunana kritična razlika na razini vjerojatnosti od 95 %.

Tablica 1.

Statistički rezultati metoda TG + FAME*

Tablica 2.

Statistički rezultati metoda TG + FAME*

Tablica 3.

Statistički rezultati metoda TG + FAME*

Tablica 4.

Statistički rezultati metode TG

Tablica 5.

Ponovljivost i obnovljivost (metodom FAME)

Ponovljivost i obnovljivost (bez metode FAME)

Slika 1.  (1)

Rezultati ispitivanja: uzorak A

Rezultati ispitivanja: uzorak B

Rezultati ispitivanja: uzorak C

Rezultati ispitivanja: uzorak D

Slika 2.

Standardna devijacija ponovljivosti i obnovljivosti na različitim razinama (TG + FAME)

Slika 3.

Standardna devijacija ponovljivosti i obnovljivosti na različitim razinama (TG)

Slika 4.

Primjer primjene on-column injektora

(1)  = metoda FAME

PRILOG VI.

(Članak 5.)

ODREĐIVANJE SADRŽAJA VANILINA U KONCENTRIRANOM MASLACU, MASLACU ILI VRHNJU METODOM TEKUĆINSKE KROMATOGRAFIJE VISOKE DJELOTVORNOSTI

1.   OPSEG I PODRUČJE PRIMJENE

U metodi je opisan postupak za kvantitativno određivanje vanilina u koncentriranom maslacu, maslacu ili vrhnju.

2.   NAČELO

Ekstrakcija znane količine uzorka mješavinom izopropanola/etanola/acetonitrila (1:1:2). Precipitacija većine masti rashlađivanjem između –15 °C i –20 °C, iza čega slijedi centrifugiranje.

Nakon razrjeđivanja vodom, određivanje sadržaja vanilina metodom tekućinske kromatografije visoke djelotvornosti (HPLC).

3.   OPREMA

Uobičajena laboratorijska oprema, a posebno sljedeća:

3.1.   Zamrzivač koji radi unutar temperaturnog raspona od –15 °C do –20 °C.

3.2.   Šprice za jednokratu uporabu, zapremine 2 ml.

3.3.   Membranski mikrofiltri s porama od 0,45 μm, otporni na otopinu koja sadrži 5 % ekstrakcijske otopine (4.4.).

3.4.   Sustav tekućinske kromatografije koji se sastoji od pumpe (protok 1,0 ml/min), injektora (kapacitet ubrizganja 20 μl, automatski ili ručni), UV detektora (koji radi pri 306 nm, 0,01 Å punog opsega), mjerača ili integratora i grijača kolone koji radi na 25 °C.

3.5.   Analitička kolona (250 mm × 4,6 mm ID) punjena LiChrospherom RP 18 (Merck, 5 μm) ili ekvivalentnim punilom.

3.6.   Predkolona (oko 20 mm × 3 mm ID) suho punjena LiChrospherom RP 18 (5 do 10 μm) ili ekvivalentnim punilom.

3.7.   Centrifuga brzine 2 000 o/min.

4.   REAGENSI

Svi reagensi koji se koriste moraju biti priznate analitičke čistoće.

4.1.   Izopropanol

4.2.   Etanol 96 % (v/v)

4.3.   Acetonitril

4.4.   Ekstrakcijska otopina

Izmiješajte izopropanol (4.1.), etanol (4.2.) i acetonitril (4.3.) u omjeru 1:1:2 (v/v).

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksibenzaldehid) ≥ 98 %

4.5.1.   Osnovna otopina vanilina (= 500 μg/ml)

U odmjernu tikvicu od 100 ml odvagnite oko 50 mg (CM mg) vanilina (4.5.) s točnošću od 0,1 mg, dodajte 25 ml ekstrakcijske otopine (4.4.) i dopunite vodom.

4.5.2.   Standardna otopina vanilina (= 10 μg/ml)

U odmjernu tikvicu od 250 ml otpipetirajte 5 ml osnovne otopine vanilina (4.5.1.) i dopunite vodom.

4.5.3.   Metanol, HPLC čistoće

4.5.4.   Ledena octena kiselina

4.5.5.   Voda, HPLC čistoće

4.5.6.   Mobilna faza HPLC-a

U odmjernoj tikvici od 1 000 ml pomiješajte 300 ml metanola (4.5.3.) s približno 500 ml vode (4.5.5.) i 20 ml octene kiseline (4.5.4.) te dopunite vodom (4.5.5.). Mješavinu profiltrirajte kroz filtar od 0,45 μm (3.3.).

5.   POSTUPAK

5.1.   Priprema ispitnog uzorka

5.1.1.   Maslac

Zagrijavajte uzorak dok se ne počne topiti. Izbjegavajte mjestimično pregrijavanje iznad 30 °C. Ni u kojem slučaju maslac se ne smije razdvojiti u dvije faze. Kad uzorak postane dovoljno plastičan, homogenizirajte ga mućkanjem. Prije nego što uzmete uzorak, maslac miješajte 15 s. U odmjernu tikvicu od 100 ml odvagnite oko 5 g (SM g) maslaca s točnošću od 1 mg.

5.1.2.   Koncentrirani maslac

Neposredno prije uzorkovanja posudu s koncentriranim maslacem stavite u sušionik zagrijan na 40 do 50 °C dok se maslac potpuno ne rastopi. Izmiješajte maslac vrtloženjem ili miješanjem, izbjegavajući stvaranje zračnih mjehurića zbog prejakog miješanja. U odmjernu tikvicu od 100 ml odvagnite oko 4 g (SM g) koncentriranog maslaca s točnošću od 1 mg.

5.1.3.   Vrhnje

Uzorak zagrijte u vodenoj kupelji ili inkubatoru na temperaturu 35 do 40 °C. Mast jednakomjerno raspršite vrtloženjem ili, prema potrebi, miješanjem. Uzorak brzo ohladite na 20 ± 2 °C. Uzorak treba izgledati homogeno; u protivnom postupak treba ponoviti. U odmjernu tikvicu od 100 ml odvagnite oko 10 g (SM g) vrhnja s točnošću od 1 mg.

5.2.   Priprema ispitne otopine

U uzorak za analizu (5.1.1., 5.1.2. ili 5.1.3.) dodajte oko 75 ml ekstrakcijske otopine (4.4.), miješajte ili energično mućkajte 15 minuta i dopunite ekstrakcijskom otopinom. (4.4.). Pretočite oko 10 ml ovog ekstrakta u epruvetu s čepom. Stavite epruvetu u zamrzivač (3.1.) i ostavite oko 30 minuta. Ohlađeni ekstrakt centrifugirajte 5 minuta na oko 2 000 o/min i odmah dekantirajte. Ostavite dekantiranu otopinu da se prilagodi sobnoj temperaturi. Otpipetirajte 5 ml dekantirane otopine u odmjernu tikvicu od 100 ml i dopunite vodom. Profiltrirajte alikvot kroz membranski mikrofiltar (3.3.) koristeći špricu (3.2.). Filtrat je spreman za HPLC analizu.

5.3.   Kalibracija

U odmjernu tikvicu od 100 ml otpipetirajte 5 ml standardne otopine (4.5.2.). Dodajte 5 ml ekstrakcijske otopine (4.4.) i do oznake dopunite vodom. Ova otopina sadrži 0,5 μg/ml vanilina.

5.4.   Određivanje HPLC metodom

Ostavite kromatografski sustav oko 30 minuta da se stabilizira. Ubrizgajte standardnu otopinu (5.3.). Ponavljajte ovaj postupak dok razlika u površini ili visini pika između dva uzastopna ubrizgavanja ne bude iznosila manje od 2 %. Vrijeme zadržavanja vanilina u opisanim uvjetima iznosi oko 9 minuta. Analizirajte standardnu otopinu (5.3.) u duplikatu, ubrizgavanjem 20 μl. Ubrizgajte 20 μl ispitne otopine (5.2.). Odredite površinu ili visinu dobivenog pika vanilina. Nakon 10 ubrizgavanja ispitnog uzorka (5.2.) ponovite dvostruko ubrizgavanje standardne otopine (5.3.).

6.   IZRAČUNAVANJE REZULTATA

Izračunajte prosječnu vrijednost površine (ili visine) (AC) pikova vanilina u vezi s dvostrukim ubrizgavanjem prije i nakon svake serije ispitnih otopina (ukupno četiri površine ili visine).

Izračunajte faktor odziva (R):

gdje je CM masa vanilina u mg (4.5.1.).

Sadržaj (mg/kg) vanilina (C) u ispitnom uzorku izračunava se prema formuli:

gdje je:

Napomena: Ako se u vrhnju analizira sadržaj vanilina, koncentracija markera mora biti izražena u mg markera/kg mliječne masti. To se radi tako da se C pomnoži sa 100/f. f je sadržaj masti u vrhnju izražen u masenom postotku (m/m);

Napomena: Umjesto površine pika mogu se koristiti visine pika (vidjeti 8.3.).

7.   PRECIZNOST METODE

7.1.   Ponovljivost (r)

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja je u najkraćem mogućem vremenskom intervalu izvršio isti analitičar, koristeći istu opremu na jednakom ispitnom materijalu, ne smije biti veća od 16 mg/kg.

7.2.   Obnovljivost (R)

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja su izvršili analitičari u različitim laboratorijima, koristeći različitu opremu na jednakom ispitnom materijalu, ne smije biti veća od 27 mg/kg.

8.   GRANICE DOPUŠTENOG ODSTUPANJA

8.1.   Od uzorka proizvoda s dodanim markerom treba uzeti tri uzorka radi provjere homogenosti.

8.2.   Marker dobiven iz vanilije ili sintetičkog vanilina:

8.2.1.   Stopa inkorporacije za 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehid iznosi 250 g po toni koncentriranog maslaca ili maslaca. Ako se dodaje vrhnju, stopa inkorporacije iznosi 250 g po toni mliječne masti.

8.2.2.   Rezultati analize proizvoda dobiveni na tri uzorka koriste se za provjeru stope i homogenosti inkorporacije markera, a najniži od tih rezultata uspoređuje se sa sljedećim graničnim vrijednostima:

Koncentracija markera u uzorku koji je dao najniži rezultat koristi se u vezi s interpolacijom između 220,8 mg/kg i 158,3 mg/kg.

8.3.   Marker dobiven isključivo iz zrna vanilije ili njihovih integralnih ekstrakata:

8.3.1.   Stopa inkorporacije 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida iznosi 100 g po toni koncentriranog maslaca ili maslaca. Ako se dodaje vrhnju, stopa inkorporacije iznosi 100 g po toni mliječne masti.

8.3.2.   Rezultati analize proizvoda dobiveni na tri uzorka koriste se za provjeru stope i homogenosti inkorporacije markera, a najniži od tih rezultata uspoređuje se sa sljedećim graničnim vrijednostima:

Koncentracija markera u uzorku koji je dao najniži rezultat koristi se u vezi s interpolacijom između 78,3 mg/kg i 53,3 mg/kg.

9.   NAPOMENE

9.1.   Obnavljanje dodanog vanilina na razini od 250 mg/kg masla varira od 97,0 do 103,8. Prosječni utvrđeni sadržaj iznosi 99,9 % uz standardnu devijaciju od 2,7 %.

9.2.   Standardna otopina sadrži 5 % ekstrakcijske otopine koja kompenzira širenje pika uzrokovanog sadržajem od 5 % ekstrakcijske otopine u ispitnim uzorcima. Ova pojava omogućuje kvantifikaciju prema visini pika.

9.3.   Analiza se temelji na linearnoj kalibracijskoj krivulji sa sjecištem u nuli.

9.4.   Linearnost treba provjeriti pomoću odgovarajućih razrjeđenja standardnih otopina (4.5.2.) kad se analiza radi prvi put, a potom u redovitim vremenskim razmacima, kao i nakon izmjena ili popravaka HPLC opreme. Vanilin se može razgraditi na vanilinsku kiselinu, divanilin i druge spojeve djelovanjem intrinzičnih enzima u nepasteriziranom vrhnju ili proizvodima od njega.

PRILOG VII.

(Članak 5.)

ODREĐIVANJE ETIL ESTERA BETA-APO-8’-KAROTENSKE KISELINE U KONCENTRIRANOM MASLACU I MASLACU METODOM SPEKTROMETRIJE

1.   OPSEG I PODRUČJE PRIMJENE

Ova metoda opisuje postupak za količinsko određivanje etil-estera beta-apo-8’-karotenske kiseline (apo-karotenskog estera) u koncentriranom maslacu i maslacu. Apo-karotenski ester je zbroj svih tvari prisutnih u ekstraktu uzoraka uzetih u skladu s uvjetima opisanim u metodi, koji apsorbiraju svjetlost valne duljine 440 nm.

2.   NAČELO

Mliječna se mast otapa u eteru i apsorbancija se mjeri na 440 nm. Sadržaj apo-karotenskog estera utvrđuje se na temelju vanjskih standarda.

3.   OPREMA

3.1.   Pipete — graduirane, zapremine 0,25, 0,50, 0,75 i 1,0 ml.

3.2.   Spektrofotometar — prikladan za uporabu na 440 nm (i između 447 i 449 nm), s kivetom optičkog puta duljine 1 cm.

3.3.   Odmjerne tikvice, 20 ml i 100 ml.

3.4.   Analitička vaga osjetljivosti 0,1 mg, koja može vagati s točnošću od 1 mg, uz mogućnost očitanja od 0,1 mg.

3.5.   Sušionik, 45 °C ± 1 °C.

3.6.   Filtri za brzo filtriranje bez pepela.

4.   REAGENSI

Svi reagensi moraju biti priznate analitičke čistoće.

Suspenzija apo-karotenskog estera (oko 20 %)

4.1.1.   Utvrdite sadržaj suspenzije na sljedeći način:

Zagrijte suspenziju na temperaturu između 45 °C i 50 °C i homogenizirajte u neotvorenoj originalnoj posudi. Odvagnite oko 400 mg u odmjernu tikvicu (100 ml), otopite u 20 ml kloroforma (4.4.) i do potrebne količine nadopunite cikloheksanom (4.5.). 5 ml ove otopine razrijedite do količine 100 ml cikloheksanom (otopina A). Razrijedite 5 ml otopine A do količine 100 ml ciklohekasnom. Izmjerite apsorbanciju na 447-449 nm (izmjerite maksimalnu vrijednost u odnosu na cikloheksan koji se koristi kao slijepa proba, pomoću kivete optičkog puta duljine 1 cm).

Sadržaj apo-karotenskog estera P (%) = (Absmaks × 40 000) / (Msusp × 2 550) ili: (Absmaks / 2 550) × (100 / 5) × (100 / 5) × (100 / Msusp)

Napomena: Suspenzija apo-karotenskog estera osjetljiva je na zrak, toplinu i svjetlo. U neotvorenoj, originalnoj posudi (zapečaćenoj pod dušikom) i na hladnom mjestu može se čuvati oko 12 mjeseci. Nakon otvaranja sadržaj treba uporabiti u kratkom roku.

4.1.2.   Standardna otopina apo-karotenskog estera, oko 0,2 mg/ml

Odvagnite oko 0,100 g suspenzije apo-karotenskog estera (4.1.1.) (W) s točnošću od 0,1 mg, otopite u petroleteru (4.2.), kvantitativno prenesite u odmjernu tikvicu zapremine 100 ml i do oznake nadopunite petroleterom.

Ova otopina sadrži (W × P) / 10 mg/ml apo-karotenskog estera.

Napomena: Otopina se čuva na tamnom i hladnom mjestu. Neuporabljenu otopinu bacite nakon mjesec dana.

4.2.   Petroleter (40-60 °C)

4.3.   Natrijev sulfat, bezvodni, zrnat, prethodno sušen dva sata na temperaturi od 102 °C

4.4.   Kloroform

4.5.   Cikloheksan

5.   POSTUPAK

5.1.   Priprema ispitnog uzorka

5.1.1.   Koncentrirani maslac

Otopite uzorak u sušioniku na oko 45 °C.

5.1.2.   Maslac

Otopite uzorak u sušioniku na oko 45 °C i filtrirajte reprezentativni dio pomoću filtra koji sadrži oko 10 g bezvodnog natrijevog sulfata (4.3.) u ambijentu zaštićenom od jakog prirodnog i umjetnog svjetla, na temperaturi od 45 °C. Sakupite odgovarajuću količinu mliječne masti.

5.2.   Određivanje

Odvagnite oko 1 g koncentriranog maslaca (ili ekstrahirane mliječne masti (5.1.2.)) (M) s točnošću od 1 mg. Kvantitativno prenesite u odmjernu tikvicu od 20 ml (V) pomoću petroletera (4.2.), dopunite do oznake i dobro promiješajte.

Prenesite alikvot u kivetu od 1 cm i izmjerite apsorbanciju na 440 nm u odnosu na petroleter koji se koristi kao slijepa proba. Odredite koncentraciju apo-karotenskog estera u otopini prema dobivenoj standardnoj krivulji (C μ/ml).

5.3.   Kalibracija

Otpipetirajte 0, 0,25, 0,5, 0,75 i 1,0 ml standardne otopine apo-karotenskog estera (4.1.2.) u 5 odmjernih tikvica od po 100 ml. Razrijedite do potrebne količine petroleterom (4.2.) i promiješajte.

Približne koncentracije otopina iznose od 0 do 2 μg/ml i precizno se računaju prema koncentraciji standardne otopine (4.1.2.) (W × P) / 10 mg/ml. Izmjerite apsorbancije na 440 nm u odnosu na petroleter koji se koristi kao slijepa proba. (4.2.).

Ucrtajte vrijednosti apsorbancije na os y, a koncentraciju apo-karotenskog estera na os x. Izračunajte jednadžbu standardne krivulje.

6.   IZRAČUNAVANJE REZULTATA

6.1.   Sadržaj apo-karotenskog estera, izražen u mg/kg proizvoda, računa se u:

koncentriranom maslacu: (C × V)/M

maslacu: 0,82 (C × V)/M

gdje je:

7.   PRECIZNOST METODE

7.1.   Ponovljivost

7.1.1.   Analiza maslaca

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja je u najkraćem mogućem vremenskom intervalu izvršio isti analitičar, koristeći istu opremu na jednakom ispitnom materijalu, ne smije biti veća od 1,4 mg/kg.

7.1.2.   Analiza koncentriranog maslaca

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja je u najkraćem mogućem vremenskom intervalu izvršio isti analitičar, koristeći istu opremu na jednakom ispitnom materijalu, ne smije biti veća od 1,6 mg/kg.

7.2.   Obnovljivost

7.2.1.   Analiza maslaca

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja su izvršili djelatnici u različitim laboratorijima, koristeći različitu opremu na jednakom ispitnom materijalu, ne smije biti veća od 4,7 mg/kg.

7.3.   Analiza koncentriranog maslaca

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja su izvršili djelatnici u različitim laboratorijima, koristeći različitu opremu na jednakom ispitnom materijalu, ne smije biti veća od 5,3 mg/kg.

7.4.   Izvor podataka o preciznosti

Podaci o preciznosti dobiveni su pokusom izvedenim 1995., kojim je bilo obuhvaćeno 11 laboratorija i 12 uzoraka s dodanim markerima (šest slijepih proba u duplikatu) za maslac i 12 uzoraka s dodanim markerima (šest slijepih proba u duplikatu) za koncentrirani maslac.

8.   GRANICE DOPUŠTENOG ODSTUPANJA

8.1.   Od proizvoda s dodanim markerom obvezno treba uzeti po tri uzorka radi provjere pravilnosti dodavanja.

8.2.   Maslac

8.2.1.   Stopa inkorporacije za maslac, uzimajući u obzir apsorbanciju podloge, iznosi 22 mg/kg.

8.2.2.   Rezultati analize proizvoda dobiveni na tri uzorka koriste se za provjeru stope i homogenosti inkorporacije markera, a najniži od tih rezultata uspoređuje se sa sljedećim graničnim vrijednostima:

Koncentracija markera u uzorku s najnižim rezultatom koristi se u vezi s interpolacijom između 17,7 mg/kg i 12,2 mg/kg.

8.3.   Koncentrirani maslac

8.3.1.   Stopa inkorporacije za koncentrirani maslac, uzimajući u obzir apsorbanciju podloge, iznosi 24 mg/kg.

Rezultati analize proizvoda dobiveni na tri uzorka koriste se za provjeru stope i homogenosti inkorporacije markera, a najniži od tih rezultata uspoređuje se sa sljedećim graničnim vrijednostima:

Koncentracija markera u uzorku s najnižim rezultatom koristi se u vezi s interpolacijom između 19,2 mg/kg i 13,2 mg/kg.

PRILOG VIII.

(Članak 5.)

ODREĐIVANJE SITOSTEROLA ILI STIGMASTEROLA U MASLACU ILI KONCENTRIRANOM MASLACU PUTEM KAPILARNE PLINSKE KROMATOGRAFIJE

1.   OPSEG I PODRUČJE PRIMJENE

Ova metoda opisuje postupak za kvantitativno određivanje sitosterola ili stigmasterola u maslacu i koncentriranom maslacu. Sitosterolom se smatra zbroj β-sitosterola i 22-dihidro-β-sitosterola, dok se ostali sitosteroli smatraju nevažnima.

2.   NAČELO

Maslac ili koncentrirani maslac saponificira se kalijevim hidroksidom u etanolskoj otopini, a tvari koje se ne mogu saponificirati ekstrahiraju se pomoću dietil etera.

Steroli se pretvaraju u trimetil-silil etere i analiziraju metodom kapilarne plinske kromatografije s obzirom na interni standard/betulin.

3.   OPREMA

3.1.   Tikvica za saponifikaciju od 150 ml s povratnim kondenzatorom sa spojevima od brušenog stakla.

3.2.   Lijevci za odvajanje od 500 ml.

3.3.   Tikvice od 250 ml.

3.4.   Lijevci za izjednačavanje tlaka od 250 ml ili slično, za sakupljanje otpadnog dietil etera.

3.5.   Staklena kolona, 350 mm × 20 mm, sa staklenim čepom.

3.6.   Vodena kupelj ili suhi grijač s izolacijskom oblogom.

3.7.   Reakcijske bočice od 2 ml.

Plinski kromatograf koji se može koristiti s kapilarnom kolonom, s razdjelnim sustavom koji se sastoji od:

3.8.1.   termostatske komore za kolone, koja može održavati željenu temperaturu s točnošću od ±1 °C;

3.8.2.   isparivača s podesivom temperaturom;

3.8.3.   plameno-ionizacijskog detektora i pretvarača-pojačala;

3.8.4.   integratora-mjerača za uporabu s pretvaračem-pojačalom (3.8.3.).

3.9.   Kapilarna kolona od taljenog silicijevog dioksida potpuno obložena slojem BP1 ili ekvivalentnog materijala (ili bilo kakva druga kolona najmanje jednake rezolucije) ujednačene debljine od 0,25 μm; kolona mora biti u stanju odvojiti derivate trimetil-silila od lanosterola i sitosterola. Primjerena je kolona duljine 12 m, unutarnjeg promjera 0,2 mm.

3.10.   Mikrošprica od 1 μl za plinsku kromatografiju s čvrsto fiksiranom iglom.

4.   REAGENSI

Svi reagensi moraju biti priznate analitičke čistoće. Voda koja se koristi mora biti destilirana voda ili voda barem jednake čistoće.

4.1.   Etanol, čistoće najmanje 95 %.

4.2.   Kalijev hidroksid, 60 %-tna otopina; otopite 600 g kalijevog hidroksida (najmanje 85 %) u vodi i dopunite vodom do jedne litre.

Betulin, čistoće najmanje 99 %.

Otopine betulina u dietil eteru (4.4.).

4.3.1.1.   Koncentracija otopine betulina koja se koristi za određivanje sitosterola mora iznositi 1,0 mg/ml.

4.3.1.2.   Koncentracija otopine betulina koja se koristi za određivanje stigmasterola mora iznositi 0,4 mg/ml.

4.4.   Dietil eter analitičke čistoće (bez peroksida ili ostataka).

4.5.   Natrijev sulfat, bezvodni, zrnati, prethodno sušen dva sata na 102 °C.

4.6.   Sililacijski reagens, npr. TRI-SIL (može se nabaviti od Pierce Chemical Co, kat. br. 49001) ili ekvivalentni reagens. (Važno: TRI-SIL je zapaljiv, toksičan, korozivan i potencijalno kancerogen. Osoblje laboratorija mora biti upoznato sa sigurnosnim podacima o TRI-SIL-u i poduzeti odgovarajuće mjere predostrožnosti).

4.7.   Lanosterol.

Sitosterol poznate čistoće (P) od najmanje 90 %.

Napomena 1.: Čistoća standardnih materijala korištenih za kalibraciju utvrđuje se metodom normalizacije. Pretpostavlja se da su svi steroli prisutni u uzorku vidljivi na kromatogramu, da ukupna površina pikova predstavlja 100 % sastojaka sterola i da je za sve sterole odziv detektora jednak. Linearnost sustava validira se za raspon koncentracija relevantan za analizu.

4.8.1.   Standardna otopina sitosterola – pripremite otopinu koja sadrži oko 0,5 mg/ml (W1) sitosterola (4.8.) u dietil eteru (4.4.) uz točnost od 0,001 mg/ml.

Stigmasterol poznate čistoće (P) ne manje od 90 %.

4.9.1.   Standardna otopina stigmasterola – pripremite otopinu koja sadrži oko 0,2 mg/ml (W1) stigmasterola (4.9.) u dietil eteru (4.4.) uz točnost od 0,001 mg/ml.

4.10.   Mješavina za ispitivanje rezolucije. Pripremite otopinu koja sadrži 0,05 mg/ml lanosterola (4.7.) i 0,5 mg/ml sitosterola (4.8.) u dietil eteru (4.4.).

5.   METODA

5.1.   Priprema standardnih otopina za kromatografiju

Interna standarnda otopina (4.3.1.) dodaje se odgovarajućoj standardnoj otopini sterola istovremeno kad i saponificiranom uzorku (vidjeti 5.2.2.).

5.1.1.   Standardna kromatografska otopina sitosterola: 1 ml standardne otopine sitosterola (4.8.1.) prenesite u svaku od dvije reakcijske bočice (3.7.) i uklonite dietil eter u struji dušika. Dodajte 1 ml interne otopine (4.3.1.1.) i uklonite dietil eter u struji dušika.

5.1.2.   Standardna kromatografska otopina stigmasterola: 1 ml standardne otopine stigmasterola (4.9.1.) prenesite u svaku od dvije reakcijske bočice (3.7.) i uklonite dietil eter u struji dušika. Dodajte 1 ml interne standardne otopine (4.3.1.2.) i uklonite dietil eter u struji dušika.

5.2.   Priprema tvari koje se ne mogu saponificirati

5.2.1.   Otopite uzorak maslaca na temperaturi do 35 °C i dobro promiješajte.

Odvagnite oko 1 g maslaca (W2) ili koncentriranog maslaca (W2) u tikvicu od 150 ml (3.1.) s točnošću od 1 mg. Dodajte 50 mg etanola (4.1.) i 10 ml otopine kalijevog hidroksida (4.2.). Namjestite povratni kondenzator i zagrijavajte 30 minuta na temperaturi od oko 75 °C. Skinite kondenzator i ohladite tikvicu približno na sobnu temperaturu.

5.2.2.   Dodajte u tikvicu 1,0 ml interne standardne otopine (4.3.1.1.) ako se određuje sitosterol, ili (4.3.1.2.) ako se određuje stigmasterol. Dobro promiješajte. Sadržaj tikvice kvantitativno prenesite u lijevak za odvajanje zapremine 500 ml (3.2.) i naizmjence isperite tikvicu s 50 ml vode i 250 ml dietil etera (4.4.). Lijevak za odvajanje snažno tresite dvije minute i pričekajte da se faze odvoje. Ocijedite donji vodenasti sloj i isperite sloj etera protresanjem uz dodavanje četiri uzastopna alikvota od 100 ml vode.

Napomena 2.: Da bi se spriječilo stvaranje emulzije, prva se dva ispiranja vodom izvode lagano (10 preokretanja). Treće se ispiranje izvodi snažnim protresanjem u trajanju od 30 sekundi. Ako se emulzija ipak formira, može se odstraniti dodavanjem 5-10 ml etanola. Ako se dodaje etanol, vrlo je važno još dvaput ponoviti ispiranje vodom uz energično protresanje.

5.2.3.   Bistri sloj etera bez sadržaja sapuna propustite kroz staklenu kolonu (3.5.) koja sadrži 30 g bezvodnog natrijevog sulfata (4.5.). Skupite eter u tikvicu od 250 ml (3.3.). Dodajte jedan kamenčić za vrenje i otparite gotovo do suhoga u vodenoj kupelji ili suhom grijaču s oblogom te skupite otpadna otapala.

Napomena 3.: Ako se ekstrakti uzorka potpuno posuše na previsokoj temperaturi, može doći do gubitka sterola.

5.3.   Priprema trimetil-silil etera

5.3.1.   Preostalu otopinu etera pretočite iz tikvice u reakcijsku bočicu od 2 ml (3.7.) s 2 ml dietil etera i uklonite eter u struji dušika. Tikvicu isperite još dva puta alikvotima od 2 ml dietil etera, svaki uz pretakanje u reakcijsku bočicu i uklanjanje etera dušikom.

5.3.2.   Sililirajte uzorak dodavanjem 1 ml TRI-SIL-a (4.6.). Zatvorite reakcijsku bočicu i snažnim protresanjem otopite sadržaj. Ako otapanje nije potpuno, zagrijte na 65-70 °C. Ostavite da odstoji najmanje pet minuta prije ubrizgavanja u plinski kromatograf. Sililirajte standarde na isti način kao i uzorke. Sililirajte mješavinu za ispitivanje odvajanja (4.10.) na isti način kao i uzorke.

Napomena 4.: Sililacija se vrši u suhom okruženju. Na nepotpunu sililaciju betulina ukazuje drugi pik na kromatogramu, pored pika betulina.

Prisutnost etanola u fazi sililacije ometa sililaciju. Ta pojava može biti posljedica nedovoljnog ispiranja u fazi ekstrakcije. Ako se navedeni problem nastavi pojavljivati, može se dodati i peto ispiranje u fazi ekstrakcije, uz jako protresanje u trajanju od 30 sekundi.

5.4.   Plinsko-kromatografska analiza

5.4.1.   Odabir uvjeta za provođenje analize

Instalirajte plinski kromatograf prema uputama proizvođača.

Smjernice u pogledu uvjeta za provođenje analize jesu sljedeće:

Pije početka analize ostavite sustav da se uravnoteži i postigne zadovoljavajuću stabilnost odziva.

Navedene uvjete treba varirati s obzirom na karakteristike kolone i plinskog kromatografa da bi dobiveni kromatogrami udovoljavali sljedećim zahtjevima:

5.4.2.   Analitički postupak

Ubrizgajte 1 μl sililirane standardne otopine (stigmasterola ili sitosterola) i podesite parametre za kalibraciju integratora.

Ubrizgajte dodatni 1 μl sililirane standardne otopine radi utvrđivanja faktora odziva za betulin.

Ubrizgajte 1 μl sililirane otopine uzorka i na kromatogramu izmjerite površine pikova. Svaka kromatografska identifikacija mora biti omeđena ubrizgavanjem standarda.

Kao smjernica se može navesti da bi između dva ubrizgavanja standarda trebalo šest puta ubrizgati uzorak.

Napomena 6.: Integracija pika stigmasterola na kromatogramu treba obuhvatiti sve krajeve signala kako su definirani točkama 1., 2. i 3. na slici 2.b.

Kod procjene ukupnog sitosterola integracija pika stigmasterola na kromatogramu treba obuhvatiti i površinu pika 22-dihidro-β-sitosterola (stigmastanola) koji eluira odmah nakon sitosterola (vidjeti sliku 3.b).

6.   IZRAČUNAVANJE REZULTATA

6.1.   Odredite površinu pikova sterola i betulina u oba standarda koji omeđuju jednu seriju i izračunajte R1:

R1 = (prosječna površina pika sterola u standardu)/(prosječna površina pika betulina u standardu).

Odredite površinu pikova sterola (stigmasterola i sitosterola) i betulina u uzorku i izračunajte R2:

R2 = (površina pika sterola u uzorku)/(površina pika betulina u uzorku);

Sadržaj sterola u uzorku (mg/kg) = ((R 2) / (R 1)) × ((W 1) / (W 2)) × P × 10.

7.   PRECIZNOST METODE

7.1.   Maslac

7.1.1.   Ponovljivost

7.1.1.1.   Stigmasterol

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja je u najkraćem mogućem vremenskom intervalu izvršio isti analitičar, koristeći istu opremu na jednakom ispitnom materijalu, ne smije biti veća od 19,3 mg/kg.

7.1.1.2.   Sitosterol

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja je u najkraćem mogućem vremenskom intervalu izvršio isti analitičar, koristeći istu opremu na jednakom ispitnom materijalu, ne smije biti veća od 23,0 mg/kg.

7.1.2.   Obnovljivost

7.1.2.1.   Stigmasterol

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja su izvršili analitičari u različitim laboratorijima, koristeći različitu opremu na jednakom ispitnom materijalu, ne smije biti veća od 31,9 mg/kg.

7.1.2.2.   Sitosterol

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja su izvršili analitičari u različitim laboratorijima, koristeći različitu opremu na jednakom ispitnom materijalu, ne smije biti veća od 8,7 % u odnosu na srednju vrijednost određivanja.

7.1.3.   Izvor podataka o preciznosti

Podaci o preciznosti potječu iz eksperimenta provedenog 1992. kojim je bilo obuhvaćeno osam laboratorija i šest uzoraka (tri slijepe probe u duplikatu) za stigmasterol i šest uzoraka (tri slijepe probe u duplikatu) za sitosterol.

7.2.   Koncentrirani maslac

7.2.1.   Ponovljivost

7.2.1.1.   Stigmasterol

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja je u najkraćem mogućem vremenskom intervalu izvršio isti analitičar, koristeći istu opremu na jednakom ispitnom materijalu, ne smije biti veća od 10,2 mg/kg.

7.2.1.2.   Sitosterol

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja je u najkraćem mogućem vremenskom intervalu izvršio isti analitičar, koristeći istu opremu na jednakom ispitnom materijalu, ne smije biti veća od 3,6 % u odnosu na srednju vrijednost određivanja.

7.2.2.   Obnovljivost

7.2.2.1.   Stigmasterol

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja su izvršili analitičari u različitim laboratorijima, koristeći različitu opremu na jednakom ispitnom materijalu, ne smije biti veća od 25,3 mg/kg.

7.2.2.2.   Sitosterol

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja su izvršili analitičari u različitim laboratorijima, koristeći različitu opremu na jednakom ispitnom materijalu, ne smije biti veća od 8,9 % u odnosu na srednju vrijednost određivanja.

7.2.3.   Izvor podataka o preciznosti

Podaci o preciznosti potječu iz eksperimenta provedenog 1991. kojim je bilo obuhvaćeno devet laboratorija i šest uzoraka (tri slijepe probe u duplikatu) za stigmasterol i šest uzoraka (tri slijepe probe u duplikatu) za sitosterol.

8.   GRANIČNE VRIJEDNOSTI DOPUŠTENOG ODSTUPANJA

8.1.   Od proizvoda s dodanim markerom obvezno treba uzeti po tri uzorka radi provjere preciznosti.

8.2.   Maslac

8.2.1.   Stigmasterol

8.2.1.1.   Stopa inkorporacije za stigmasterol iznosi 150 g stigmasterola minimalne čistoće 95 % po toni maslaca, odnosno 142,5 mg/kg, ili 170 g stigmasterola minimalne čistoće 85 % po toni maslaca, odnosno 144,5 mg/kg.

8.2.1.2.   Rezultati analize proizvoda dobiveni na tri uzorka koriste se za provjeru stope i homogenosti inkorporacije markera, a najniži od tih rezultata uspoređuje se sa sljedećim graničnim vrijednostima:

Koncentracija markera u uzorku koji je dao najniži rezultat koristi se u vezi s interpolacijom između 115,8 mg/kg i 80,1 mg/kg, odnosno 117,7 mg/kg i 81,5 mg/kg.

8.2.2.   Sitosterol

8.2.2.1.   Stopa inkorporacije za sitosterol iznosi 600 g sitosterola minimalne čistoće 90 % po toni maslaca, odnosno 540 mg/kg.

8.2.2.2.   Rezultati analize proizvoda dobiveni na tri uzorka koriste se za provjeru stope i homogenosti inkorporacije markera, a najniži od tih rezultata uspoređuje se sa sljedećim graničnim vrijednostima:

Koncentracija markera u uzorku koji je dao najniži rezultat koristi se u vezi s interpolacijom između 482,6 mg/kg i 347,6 mg/kg.

8.3.   Koncentrirani maslac

8.3.1.   Stigmasterol

8.3.1.1.   Stopa inkorporacije za stigmasterol iznosi 150 g stigmasterola minimalne čistoće 95 % po toni koncentriranog maslaca, odnosno 142,5 mg/kg, ili 170 g stigmasterola minimalne čistoće 85 % po toni maslaca, odnosno 144,5 mg/kg.

8.3.1.2.   Rezultati analize proizvoda dobiveni na tri uzorka koriste se za provjeru stope i homogenosti inkorporacije markera, a najniži od tih rezultata uspoređuje se sa sljedećim graničnim vrijednostima:

Koncentracija markera u uzorku koji je dao najniži rezultat koristi se u vezi s interpolacijom između 118,5 mg/kg i 82,9 mg/kg, odnosno 120,4 mg/kg i 84,3 mg/kg.

8.3.2.   Sitosterol

8.3.2.1.   Stopa inkorporacije za sitosterol iznosi 600 g sitosterola minimalne čistoće 90 % po toni maslaca, odnosno 540 mg/kg.

8.2.2.2.   Rezultati analize proizvoda dobiveni na tri uzorka koriste se za provjeru stope i homogenosti inkorporacije markera, a najniži od tih rezultata uspoređuje se sa sljedećim graničnim vrijednostima:

Koncentracija markera u uzorku koji je dao najniži rezultat koristi se u vezi s interpolacijom između 480,9 mg/kg i 345,9 mg/kg.

Slika 1.

Kromatogram mješavine za testiranje rezolucije

Poželjna je potpuna rezolucija, odnosno pik krivulje za lanosterol trebao bi se vratiti na baznu liniju prije nego se podigne prema piku sitosterola, iako je nepotpuna rezolucija dopuštena.

PRILOG IX.

(Članak 6.)

REFERENTNA METODA ZA DETEKCIJU KRAVLJEG MLIJEKA I KAZEINATA U SIREVIMA OD OVČJEG, KOZJEG ILI BIVOLJEG MLIJEKA ILI OD MJEŠAVINA OVČJEG, KOZJEG I BIVOLJEG MLIJEKA

1.   PODRUČJE PRIMJENE

Detekcija kravljeg mlijeka i kazeinata u sirevima od ovčjeg, kozjeg ili bivoljeg mlijeka ili od mješavina ovčjeg, kozjeg i bivoljeg mlijeka izoelektričnim fokusiranjem γ-kazeina nakon plazminolize.

2.   PODRUČJE PRIMJENE

Metoda je prikladna za osjetljivu i specifičnu detekciju sirovog i toplinski obrađenog kravljeg mlijeka i kazeinata u svježim ili zrelim sirevima od ovčjeg, kozjeg i bivoljeg mlijeka, ili od mješavina ovčjeg, kozjeg i bivoljeg mlijeka. Nije primjerena za otkrivanje patvorenja mlijeka i sira toplinski obrađenim koncentratima bjelančevina sirutke od kravljeg mlijeka.

3.   NAČELO METODE

3.1.   Izolacija kazeina iz sira i referentni standardi.

3.2.   Otapanje izoliranih kazeina i njihovo podvrgavanje plazminskom cijepanju (EC.3.4.21.7).

3.3.   Izoelektrično fokusiranje plazminski obrađenih kazeina u prisutnosti ureje i bojenje proteina.

3.4.   Ocjenjivanje obojenih obrazaca γ3- i γ2-kazeina (dokaz kravljeg mlijeka) na temelju usporedbe obrasca dobivenog iz uzorka s obrascima dobivenim u istom gelu iz referentnih standarda koji sadrže 0 % i 1 % kravljeg mlijeka.

4.   REAGENSI

Ako nije navedeno drukčije, moraju se koristiti kemikalije analitičke čistoće. Voda mora biti dvostruko destilirana ili ekvivalentne čistoće.

Napomena: Sljedeći detalji odnose se na laboratorijski pripravljene poliakrilamidne gelove koji sadrže ureju, dimenzija 265 × 125 × 0,25 mm. U slučajevima kad se koriste druge veličine i vrste gelova, možda treba podesiti uvjete razdvajanja.

Izoelektrično fokusiranje

4.1.   Reagensi za proizvodnju poliakrilamidnih gelova koji sadrže ureju

4.1.1.   Osnovna otopina gela

Otopite:

4,85 g akrilamida,

0,15 g N, N′-metilen-bis-akrilamida (BIS),

48,05 g ureje,

15,00 g glicerola (87 % w/w)

u vodi, dopunite do 100 ml i pohranite u smeđoj staklenoj bočici u hladnjak.

Napomena: Umjesto navedenih fiksnih masa neurotoksičnih akrilamida može se koristiti gotova mješavina otopina akrilamida/BIS-a, koja je dostupna na tržištu. Ako takva otopina sadrži 30 % w/v akrilamida i 0,8 % w/v BIS-a, umjesto navedenih fiksnih masa za pripravak treba upotrijebiti količinu od 16,2 ml. Rok valjanosti osnovne otopine je najviše 10 dana; ako je njena vodljivost veća od 5 μS, otopinu treba deionizirati miješajući je 30 minuta s 2 g Amberlita MB-3 i potom profiltrirati kroz membranu od 0,45 μm.

4.1.2.   Otopina gela

Pripremite otopinu gela miješanjem aditiva i amfolita s osnovnom otopinom gela (vidjeti 4.1.1.).

9,0 ml osnovne otopine

24 mg β-alanina

500 μl amfolita pH 3,5-9,5 (1)

250 μl amfolita pH 5-7 (1)

250 μl amfolita pH 6-8 (1).

Otopinu gela pomiješajte i otplinjavajte dvije do tri minute u ultrazvučnoj kupelji ili vakuumu.

Napomena: Otopinu gela pripremite neposredno prije uporabe (vidjeti 6.2.).

4.1.3.   Otopine katalizatora

4.1.3.1.   N, N, N′ N′ – tetrametiletilendiamin (Temed).

4.1.3.2.   40 % w/v amonijev persulfat (PER):

Otopite 800 mg PER-a u vodi i dopunite do 2 ml.

Napomena: Uvijek koristite svježe pripremljenu otopinu PER-a.

4.2.   Kontaktna tekućina

Kerozin ili tekući parafin

4.3.   Anodna otopina

Otopite 5,77 g fosforne kiseline (85 % w/w) u vodi i razrijedite do 100 ml.

4.4.   Katodna otopina

Otopite 2,00 g natrijevog hidroksida u vodi i razrijedite vodom do 100 ml.

Priprema uzorka

4.5.   Reagensi za izolaciju proteina

4.5.1.   Razrijeđena octena kiselina (25,0 ml ledene octene kiseline razrijedite vodom do 100 ml)

4.5.2.   Diklorometan

4.5.3.   Aceton

4.6.   Pufer za rastapanje proteina

Otopite:

5,75 g glicerola (87 % w/w),

24,03 g ureje,

250 mg ditiotreitola

u vodi i nadopunite do 50 ml.

Napomena: Spremite pufer u hladnjak, maksimalni rok trajanja je tjedan dana.

4.7.   Reagensi za plazminsko cijepanje kazeina

4.7.1.   Pufer amonijevog karbonata

Titrirajte 0,2 mol/l otopine amonijevog hidrogen-karbonata (1,58 g/100 ml vode), koja sadrži 0,05 mol/l etilen-diamin-tetraoctene kiseline (EDTA, 1,46 g/100 ml), s 0,2 mol/l otopine amonijevog karbonata (1,92 g/100 ml vode), koja sadrži 0,05 mol/l kiseline EDTA do pH 8.

4.7.2.   Plazmin kravljeg mlijeka (EC. 3.4.21.7), aktivnosti najmanje 5 U/ml

4.7.3.   Otopina ε-aminokapronske kiseline za inhibiranje enzima

Otopite 2,624 g ε-aminokapronske kiseline (6-amino-n-heksanske kiseline) u 100 ml 40 %-tnog (v/v) etanola.

4.8.   Standardi

4.8.1.   Potvrđeni referentni standardi za mješavine usirenog obranog ovčjeg i kozjeg mlijeka, koje sadrže 0 % i 1 % kravljeg mlijeka, dostupni su na Institutu Komisije za referentne materijale i mjerenja, B-2440, Geel, Belgija.

4.8.2.   Priprema privremenih laboratorijskih standarda za usireno bivolje mlijeko koje sadrži 0 % i 1 % kravljeg mlijeka.

Obrano se mlijeko priprema centrifugiranjem 2 500 g bivoljeg ili kravljeg sirovog mlijeka na temperaturi od 37 °C u trajanju od 20 minuta. Nakon brzog hlađenja epruvete i sadržaja na 6 do 8 °C, potpuno uklonite gornji sloj masti. Za pripremu standarda od 1 % dodajte 5,00 ml obranog kravljeg mlijeka u 495 ml obranog bivoljeg mlijeka u laboratorijskoj čaši od 1 l, podesite pH na 6,4 dodavanjem razrijeđene mliječne kiseline (10 % w/v). Podesite temperaturu na 35 °C i dodajte 100 μl telećeg sirila (aktivnost sirila 1:10 000, oko 3 000 U/ml), miješajte 1 minutu i potom ostavite posudu pokrivenu aluminijskom pločom jedan sat na temperaturi od 35 °C da bi se mogao formirati gruš. Nakon formiranja gruša, cijelo usireno mlijeko se liofilizira bez prethodne homogenizacije ili cijeđenja sirutke. Nakon liofilizacije, sitno ga sameljite da biste dobili homogeni prah. Za pripremu standarda od 0 % provodi se isti postupak uz uporabu isključivo obranog bivoljeg mlijeka. Standardi se čuvaju na temperaturi od – 20 °C.

Napomena: Prije pripreme standarda preporuča se provjeriti čistoću bivoljeg mlijeka metodom izoelektričnog fokusiranja kazeina razgrađenih djelovanjem plazmina.

Reagensi za bojenje proteina

4.9.   Fiksator

Otopite 150 g triklorooctene kiseline u vodi i dopunite do 1 000 ml.

4.10.   Otopina za odbojavanje

Razrijedite 500 ml metanola i 200 ml ledene octene kiseline destiliranom vodom do količine od 2 000 ml.

Napomena: Svaki dan pripremite svježu otopinu za odbojavanje; možete je pripremiti miješanjem jednakih količina osnovnih otopina 50 %-tnog (v/v) metanola i 20 %-tne (v/v) ledene octene kiseline.

4.11.   Otopine za bojenje

4.11.1.   Otopina za bojenje (osnovna otopina 1)

Otopite 3,0 g boje Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) u 1 000 ml 90 %-tnog (v/v) metanola pomoću magnetske miješalice (oko 45 minuta), filtrirajte kroz dva naborana filtra srednje brzine.

4.11.2.   Otopina za bojenje (osnovna otopina 2)

Otopite 5,0 g bakrenog sulfata pentahidrata u 1 000 ml 20 %-tne (v/v) octene kiseline.

4.11.3.   Otopina za bojenje (radna otopina)

Pomiješajte po 125 ml od svake osnovne otopine (4.11.1., 4.11.2.) neposredno prije bojenja.

Napomena: Otopina za bojenje priprema se na dan kad se koristi.

5.   OPREMA

5.1.   Staklene ploče (265 × 125 × 4 mm); gumeni valjak (širine 15 cm); stol s nagibnom radnom površinom.

5.2.   Noseća ploča za gel (265 × 125 mm).

5.3.   Pokrivna ploča (280 × 125 mm). Na sve duge bridove (vidjeti sliku 1.) nanesite ljepljivu traku (280 × 6 × 0,25 mm).

5.4.   Komora za elektrofokusiranje s rashladnom pločom (npr. 265 × 125 mm) i odgovarajućim električnim napajanjem (≥ 2,5 kV) ili uređajem za automatsku elektroforezu.

5.5.   Cirkulacijski kriostat, termostatski reguliran na 12 ± 0,5 °C.

5.6.   Centrifuga, podesiva do 3 000 g.

5.7.   Elektrodne trake (duljine ≥ 265 mm).

5.8.   Plastične boce s kapaljkom za anodnu i katodnu otopinu.

5.9.   Aplikatori za uzorke (10 × 5 mm, od viskoze ili od filtar-papira koji slabo adsorbira bjelančevine).

5.10.   Škare, skalpeli i pincete od nehrđajućeg čelika.

5.11.   Posude za bojenje i odbojavanje od nehrđajućeg čelika ili stakla (npr. plitice za instrumente dimenzija 280 × 150 mm).

5.12.   Podesivi štapni homogenizator (promjera osovine 10 mm), raspona brzine od 8 000 do 20 000 o/min.

5.13.   Magnetska miješalica.

5.14.   Ultrazvučna kupelj.

5.15.   Uređaj za zavarivanje ploče.

5.16.   Mikropipete od 25 μl.

5.17.   Vakuumski koncentrator ili liofilizator.

5.18.   Vodena kupelj, termostatski regulirana između 35 i 40 ± 1 °C s vibracijskom miješalicom.

5.19.   Denzitometar za očitavanje na valnoj duljini λ = 634 nm.

6.   POSTUPAK

6.1.   Priprema uzoraka

6.1.1.   Izolacija kazeina

Odvagnite količinu koja je ekvivalent 5 g suhe mase sira ili referentnih standarda u epruvetu za centrifugiranje od 100 ml, dodajte 60 ml destilirane vode i homogenizirajte štapnim homogenizatorom (8 000 do 10 000 o/min). Podesite pH na 4,6 pomoću razrijeđene octene kiseline (4.5.1.) i centrifugirajte (5 minuta, 3 000 g). Dekantirajte mast i sirutku, ostatak homogenizirajte na 20 000 o/min u 40 ml destilirane vode čija je pH vrijednost od 4,5 podešena pomoću razrijeđene octene kiseline (4.5.1.); dodajte 20 ml diklorometana (4.5.2.), ponovno homogenizirajte i centrifugirajte (5 minuta, 3 000 g). Špatulom uklonite sloj kazeina koji se nalazi između vodene i organske faze (vidjeti sliku 2.) i dekantirajte obje faze. Kazein ponovo homogenizirajte u 40 ml destilirane vode (vidjeti gore) i 20 ml diklorometana (4.5.2.) i centrifugirajte. Ponavljajte postupak sve dok obje faze ekstrakcije ne postanu bezbojne (dva do tri puta). Ostatak bjelančevina homogenizirajte pomoću 50 ml acetona (4.5.3.) i filtrirajte kroz naborani filtar-papir srednje brzine filtracije. Ostatak na filtru isperite dva puta, svaki put koristeći po 25 ml acetona, ostavite da se osuši na zraku ili u struji dušika te fino usitnite u tarioniku.

Napomena: Suhe izolate kazeina treba držati na temperaturi od – 20 °C.

6.1.2.   Plazminsko cijepanje β-kazeina radi intenzifikacije γ-kazeina

Disperzirajte 25 mg izoliranih kazeina (6.1.1.) u 0,5 ml puferske otopine amonijevog karbonata (4.7.1.) i homogenizirajte 20 minuta, npr. ultrazvučnim postupkom. Zagrijte do 40 °C i dodajte 10 μl plazmina (4.7.2.), promiješajte i inkubirajte jedan sat na 40 °C uz neprestano tresenje. Radi inhibicije enzima dodajte 20 μl otopine ε-aminokapronske kiseline (4.7.3.) te potom dodajte 200 mg ureje u krutom obliku i 2 mg ditiotreitola.

Napomena: Radi postizanja veće simetrije fokusiranih kazeinskih vrpci, preporuča se liofiliziranje otopine nakon dodavanja ε-aminokapronske kiseline i potom otapanje ostatka u 0,5 ml pufera za otapanje bjelančevina (4.6.).

6.2.   Priprema poliakrilamidnih gelova koji sadrže ureju

Pomoću nekoliko kapi vode i valjka noseću ploču za gel (5.2.) stavite na staklenu ploču (5.1.), a višak vode uklonite papirnatim ubrusom ili ručnikom. Na isti način pokrivnu ploču (5.3.) s odstojnicima (0,25 mm) stavite na drugu staklenu ploču. Položite ploču vodoravno na stol s nagibnom radnom površinom.

Dodajte 10 μl Temeda (4.1.3.1.) u pripremljenu i deaeriranu otopinu gela (4.1.2.), promiješajte i dodajte 10 μl otopine PER (4.1.3.2.), dobro izmiješajte i jednakomjerno razlijte po sredini pokrivne ploče. Stavite jedan rub noseće ploče za gel (ploča okrenuta prema dolje) na pokrivnu ploču i preostali dio polagano spuštajte tako da se između dvije plohe stvori tanki sloj gela koji će se jednakomjerno raširiti bez stvaranja mjehurića (slika 3.). Pažljivo spustite noseću ploču do kraja, koristeći pritom tanku špatulu, i na nju položite još tri staklene ploče koje će poslužiti kao utezi. Po završetku polimerizacije (oko 60 minuta), gel koji se polimerizirao na nosećoj ploči maknite zajedno s pokrivnom pločom, laganim nakretanjem staklenih ploča. Pažljivo očistite naličje noseće ploče da biste uklonili ostatake gela i ureje. Zatvorite „gel-sendvič” u cjevastu foliju i pohranite u hladnjak (najviše šest tjedana).

Napomena: Pokrivna ploča s odstojnicima može se ponovo koristiti. Poliakrilamidni gel može se razrezati na manje dijelove, što se preporuča u slučaju manjeg broja uzoraka ili ako se koristi uređaj za automatsku elektroforezu (dva gela, dimenzija 4,5 × 5 cm).

6.3.   Izoelektrično fokusiranje

Termostat za hlađenje podesite na 12 °C. Kerozinom očistite stražnju stranu noseće ploče za gel i potom dodajte nekoliko kapljica kerozina (4.2.) u sredinu rashladnog bloka. Zatim na njega stavite gel-sendvič s nosećom stranom okrenutom prema dolje i povaljajte ga valjkom, pazeći da se pritom ne stvaraju mjehurići. Obrišite višak kerozina i skinite pokrivnu ploču. Elektrodne trake natopite elektrodnim otopinama (4.3., 4.4.), izrežite ih prema duljini gela i položite na predviđena mjesta (razmak između elektroda 9,5 cm).

Uvjeti za izoelektrično fokusiranje:

6.3.1.   Veličina gela 265 × 125 × 0,25 mm

Napomena: Ako se promijeni debljina ili širina gela, vrijednosti za jakost i snagu treba podesiti u skladu s promjenom (npr. udvostručiti vrijednosti jakosti i snage ako se koristi gel dimenzija 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2.   Primjer naponskog režima za uređaj za automatsku elektroforezu (2 gela dimenzija 5,0 × 4,5 cm); elektrode bez traka nanesene izravno na gel