Décision de la Commission

du 22 février 2001

fixant les plans d'échantillonnage et les méthodes de diagnostic pour la détection et la confirmation de certaines maladies des poissons et abrogeant la décision 92/532/CEE

[notifiée sous le numéro C(2001) 426]

(Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)

(2001/183/CE)

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté européenne,

vu la directive 91/67/CEE du Conseil du 28 janvier 1991 relative aux conditions de police sanitaire régissant la mise sur le marché d'animaux et de produits d'aquaculture(1), modifiée en dernier lieu par la directive 98/45/CE(2), et notamment son article 15,

considérant ce qui suit:

(1) Les plans d'échantillonnage et les méthodes de diagnostic pour la détection et la confirmation de certaines maladies des poissons ont été fixés dans la décision 92/532/CEE de la Commission(3), modifiée par la décision 96/240/CE(4).

(2) Depuis l'adoption de la décision 92/532/CEE, des progrès pratiques et scientifiques ont été réalisés et la directive 91/67/CEE a été modifiée. Cette évolution requiert une mise à jour des plans d'échantillonnage et des méthodes de diagnostic.

(3) Cette mise à jour concerne l'examen et l'identification des virus responsables de la septicémie hémorragique virale (SHV) et de la nécrose hématopoïétique infectieuse (NHI) et les adaptations conformément aux dernières modifications de la directive 91/67/CEE.

(4) Le laboratoire communautaire de référence pour les maladies des poissons, institué par la directive 93/53/CEE du Conseil(5), a été consulté.

(5) Pour des raisons de clarté, il convient d'abroger la décision 92/532/CEE fixant les plans d'échantillonnage et les méthodes de diagnostic pour la détection et la confirmation de la présence de certaines maladies des poissons.

(6) Les mesures prévues par la présente décision sont conformes à l'avis du comité vétérinaire permanent,

A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DÉCISION:

Article premier

Les plans d'échantillonnage et les méthodes de diagnostic pour la détection et la confirmation de la présence de la septicémie hémorragique virale (SHV) et de la nécrose hématopoïétique infectieuse (NHI) sont fixés à l'annexe de la présente décision.

Article 2

La décision 92/532/CEE est abrogée.

Article 3

Les États membres sont destinataires de la présente décision.

Fait à Bruxelles, le 22 février 2001.

Par la Commission

David Byrne

Membre de la Commission

(1) JO L 46 du 19.2.1991, p. 1.

(2) JO L 189 du 3.7.1998, p. 12.

(3) JO L 337 du 21.11.1992, p. 18.

(4) JO L 79 du 29.3.1996, p. 19.

(5) JO L 175 du 19.7.1993, p. 23.

ANNEXE

PLANS D'ÉCHANTILLONNAGE ET MÉTHODES DE DIAGNOSTIC POUR LA DÉTECTION ET LA CONFIRMATION DE LA PRÉSENCE DE LA SEPTICÉMIE HÉMORRAGIQUE VIRALE (SHV) ET DE LA NÉCROSE HÉMAPOÏÉTIQUE INFECTIEUSE (NHI)

INTRODUCTION

La présente annexe:

a) prévoit des lignes directrices et des exigences minimales applicables aux plans d'échantillonnage et aux méthodes de diagnostic pour la détection et la confirmation de la présence de la septicémie hémorragique virale (SHV) et de la nécrose hématopoïétique infectieuse (NHI);

b) intègre les dispositions des annexes B et C de la directive 91/67/CEE concernant l'agrément et le maintien de l'agrément de zones et d'exploitations dans des zones non agréées;

c) établit des dispositions visant au diagnostic correct de la SHV et de la NHI et à la reconnaissance officielle du statut de zones agréées et d'exploitations agréées dans des zones non agréées, conformément aux articles 5 et 6 de la directive 91/67/CEE;

d) est destinée tant aux autorités responsables du contrôle de la SHV et de la NHI qu'au personnel des laboratoires effectuant les tests concernant ces maladies. En conséquence, l'accent est mis sur les procédures d'échantillonnage, les principes et les applications des tests de laboratoire et l'évaluation de leurs résultats, ainsi que sur les techniques de laboratoire détaillées. Toutefois, au besoin, les laboratoires peuvent apporter des modifications aux tests décrits dans la présente annexe ou utiliser des tests différents, à condition qu'une sensibilité et une spécificité équivalentes puissent être prouvées.

La partie I fixe les plans d'échantillonnage et les méthodes de diagnostic pour la surveillance de la SHV et de la NHI afin d'obtenir et de maintenir le statut de zone agréée ou d'exploitation agréée dans une zone non agréée.

La partie II décrit les procédures de diagnostic pour la confirmation de la SHV et de la NHI en cas de suspicion.

La partie III fixe les critères et lignes directrices applicables à un programme d'inspections sanitaires officielles prouvant l'absence antérieure de SHV et/ou de NHI.

La partie IV fournit des recommandations sur la procédure applicable au titrage des virus de la SHV et de la NHI afin de vérifier la sensibilité des cultures cellulaires à l'infection.

Les acronymes et abréviations sont énumérés dans la partie V.

PARTIE I

Plans d'échantillonnage et méthodes de diagnostic pour la surveillance de la SHV et de la NHI afin d'obtenir et de maintenir l'agrément d'une zone ou d'une exploitation dans une zone non agréée

I. Inspections et échantillonnage

1. Dispositions générales relatives aux inspections sanitaires cliniques, à la collecte et à la sélection des échantillons pour la surveillance des zones ou des exploitations situées dans des zones non agréées afin d'obtenir ou de maintenir l'agrément en ce qui concerne la SHV et/ou la NHI

Les inspections sanitaires cliniques et l'échantillonnage de tissus de poisson et/ou de liquide ovarien à effectuer dans des zones ou des exploitations situées dans des zones non agréées afin d'obtenir ou de maintenir l'agrément en ce qui concerne la SHV et/ou la NHI, conformément aux annexes B et C de la directive 91/67/CEE, sont résumés dans les tableaux 1A, 1B et 1C. D'autres modalités sont fixées dans la partie I I 2-I I 4. Les tableaux 1A et 1B ne s'appliquent pas aux nouvelles exploitations ni aux exploitations qui recommencent leurs activités avec des poissons, des oeufs ou des gamètes provenant d'une zone agréée ou d'une exploitation agréée dans une zone non agréée, à condition qu'elles remplissent les exigences fixées dans la directive 91/67/CEE, annexe C, partie I A 6 a) ou I A 6 b) ou II A 3 a) ou II A 3 b).

Les inspections cliniques doivent être effectuées au cours de la période comprise entre octobre et juin ou à n'importe quel moment où la température de l'eau est inférieure à 14 °C. Lorsque les exploitations doivent faire l'objet d'une inspection clinique au moins deux fois par an, les intervalles entre les inspections doivent être d'au moins quatre mois. Toutes les unités de production (étangs, cuves, cages, etc.) doivent être soumises à une inspection destinée à établir la présence de poissons morts, faibles ou au comportement anormal. Une attention particulière doit être accordée au point d'évacuation des eaux, où les poissons faibles ont tendance à s'accumuler en raison du courant.

Les poissons à échantillonner sont sélectionnés comme suit:

- Si des truites arc-en-ciel sont présentes, seuls des poissons de cette espèce sont sélectionnés pour l'échantillonnage. Si des truites arc-en-ciel ne sont pas présentes, l'échantillon doit être composé de poissons de toutes les autres espèces présentes, dans la mesure où ces espèces sont sensibles aux virus de la SHV et/ou de la NHI (définies à l'annexe A de la directive 91/67/CEE du Conseil). Les espèces doivent être représentées proportionnellement dans l'échantillon.

- Si plus d'une source d'eau est utilisée pour la production du poisson, les poissons représentant toutes les sources d'eau doivent être inclus dans l'échantillon.

- Si des poissons faibles, au comportement anormal ou qui viennent de mourir (non encore décomposés) sont présents, ils doivent être sélectionnés en premier lieu. Si ces poissons ne sont pas présents, l'échantillon doit être composé de poissons à l'aspect normal, en bonne santé, collectés de telle manière que toutes les parties de l'exploitation ainsi que toutes les classes d'âge par année soient représentées proportionnellement dans l'échantillon.

2. Dispositions spécifiques, y compris en matière d'échantillonnage, relatives à la surveillance des zones ou des exploitations de zones non agréées afin d'obtenir ou de maintenir l'agrément en ce qui concerne la SHV et/ou la NHI

1. Une zone ou une exploitation dans une zone non agréée, placée sous le contrôle des services officiels, peut obtenir l'agrément en ce qui concerne la SHV et/ou la NHI, à condition de se soumettre à un des deux programmes suivants:

a) Modèle A - Programme de surveillance de deux années

Après au moins deux ans d'absence de tout signe clinique ou autre de SHV et/ou de NHI, l'ensemble des exploitations de la zone ou toute exploitation d'une zone non agréée, destinées à être agréées, doivent faire l'objet d'une inspection sanitaire deux fois par an pendant deux ans. Au cours de cette période de contrôle de deux ans précédant l'obtention de l'agrément, l'absence de signes cliniques ou autres de SHV et/ou de NHI doit s'être poursuivie et des échantillons doivent être prélevés pour examen, conformément au tableau 1A. En outre, les échantillons doivent être sélectionnés, préparés et examinés conformément aux dispositions de la partie I I à I IV et les examens de laboratoire doivent avoir fourni des résultats négatifs au regard de la SHV et/ou de la NHI.

ou

b) Modèle B - Programme de surveillance de deux années avec taille d'échantillon réduite

À la suite d'un programme d'inspections sanitaires officielles prouvant l'absence de SHV et/ou de NHI au cours des quatre dernières années au moins, l'ensemble des exploitations de la zone ou toute exploitation d'une zone non agréée, destinées à être agréées, doivent faire l'objet d'une inspection sanitaire deux fois par an pendant deux ans. Au cours de cette période de contrôle de deux ans précédant l'obtention de l'agrément, l'absence de signes cliniques ou autres de SHV et/ou de NHI doit s'être poursuivie et des échantillons doivent être prélevés pour examen, conformément au tableau 1B. En outre, les échantillons doivent être sélectionnés, préparés et examinés conformément aux dispositions de la partie I I à I IV et les examens de laboratoire doivent avoir fourni des résultats négatifs au regard de la SHV et/ou de la NHI. Afin qu'un programme d'inspections sanitaires puisse être reconnu par les services officiels comme prouvant l'absence antérieure de SHV et/ou de NHI, il doit remplir les critères et respecter les lignes directrices établies dans la partie III.

2. Dispositions spéciales applicables à l'agrément de nouvelles exploitations et d'exploitations qui recommencent leurs activités avec des poissons, des oeufs ou des gamètes provenant d'une zone agréée ou d'une exploitation agréée dans une zone non agréée

Les nouvelles exploitations et les exploitations qui recommencent leurs activités avec des poissons, des oeufs ou des gamètes provenant d'une zone agréée ou d'une exploitation agréée d'une zone non agréée peuvent obtenir l'agrément, conformément aux exigences fixées dans la directive 91/67/CEE, annexe C, partie I A 6 a)/b) ou II A 3 a) ou II A 3 a)/b). En conséquence, les dispositions d'échantillonnage établies dans les modèles A et B qui précèdent [parties I I 2 1 a) et I I 2 1 b)] ne s'appliquent pas à ces exploitations.

3. Programme de surveillance pour le maintien de l'agrément en ce qui concerne la SHV et/ou la NHI

Afin de maintenir l'agrément d'une zone ou d'une exploitation dans une zone non agréée en ce qui concerne la SHV et/ou la NHI, des inspections et le prélèvement d'échantillons pour examen doivent être effectués conformément au tableau 1C. Les échantillons doivent être sélectionnés, préparés et examinés conformément aux dispositions de la partie I I à I IV et les résultats des examens de laboratoire doivent être négatifs au regard de la SHV et/ou la NHI.

3. Préparation et expédition des échantillons de poissons

Avant d'être envoyés ou transférés vers le laboratoire, les morceaux d'organes à examiner doivent être prélevés sur le poisson à l'aide d'instruments de dissection placés dans des tubes en plastique stériles contenant le milieu de transport, c'est-à-dire du milieu de culture cellulaire contenant 10 % de sérum de veau et d'antibiotiques. La combinaison de 200 UI de pénicilline, 200 μg de streptomycine et 200 μg de kanamycine par millilitre (ml) peut être recommandée, mais d'autres antibiotiques à l'efficacité éprouvée peuvent également être utilisés. Les tissus à examiner sont la rate, le rein antérieur et, en outre, soit le coeur, soit l'encéphale. Dans certains cas, le liquide ovarien doit être examiné (tableaux 1A à 1C).

Du liquide ovarien ou des morceaux d'organes de dix poissons au maximum (tableaux 1A à 1C) peuvent être réunis dans un tube stérile contenant au moins 4 ml de milieu de transport et représentant un échantillon global. Les tissus de chaque échantillon doivent peser au moins 0,5 gramme.

Les tubes devraient être placés dans des récipients isolés (par exemple, des boîtes en polystyrène à parois épaisses) avec une quantité suffisante de glace ou de "blocs réfrigérants" pour garantir la réfrigération des échantillons pendant le transport vers le laboratoire. Éviter la congélation des échantillons. La température d'un échantillon pendant son transport ne doit jamais dépasser 10 °C et le récipient de transport doit encore contenir de la glace lors de sa réception, ou un ou plusieurs blocs réfrigérants doivent encore être partiellement ou totalement congelés.

L'examen virologique doit commencer le plus rapidement possible et au plus tard 48 heures après la collecte des échantillons. Dans des cas exceptionnels(1), l'examen virologique peut commencer au plus tard 72 heures après la collecte du matériel à examiner, à condition que celui-ci soit protégé par le milieu de transport et que les conditions de température au cours du transport aient été respectées (partie I I 3, point 3).

Des poissons entiers peuvent être envoyés au laboratoire si les conditions de température pendant le transport peuvent être respectées. Le poisson entier peut être enveloppé dans du papier absorbant et doit finalement être expédié dans un sac en plastique, réfrigéré comme indiqué ci-dessus. Des poissons vivants peuvent également être expédiés.

Le conditionnement et l'étiquetage doivent respecter les réglementations nationales et internationales en vigueur en matière de transport, le cas échéant.

4. Collecte de matériel diagnostic supplémentaire

En accord avec le laboratoire de diagnostic considéré, d'autres tissus de poissons peuvent être collectés également et préparés en vue d'examens supplémentaires.

II. Préparation des échantillons en vue de l'examen virologique

1. Congélation dans des cas exceptionnels

S'il se présente des difficultés pratiques (par exemple, mauvaises conditions climatiques, jours non ouvrés, problèmes de laboratoire, etc.) qui empêchent d'inoculer des cellules dans les 48 heures suivant la collecte des échantillons de tissus, il est admis que ces échantillons de tissus soient congelés dans un milieu de culture cellulaire à - 20 °C ou à une température inférieure et qu'un examen virologique soit pratiqué dans les quatorze jours. Toutefois, les tissus ne peuvent être congelés et décongelés qu'une seule fois avant leur examen. Des registres doivent être tenus, qui indiquent la raison de chaque congélation d'échantillons de tissus (par exemple, tempête, lignées cellulaires mortes, etc.).

2. Homogénéisation des organes

Au laboratoire, les tissus contenus dans les tubes doivent être complètement homogénéisés (à l'aide d'un broyeur stomacher, d'un mixeur ou d'un ensemble pilon-mortier et de sable stérile) et placés ensuite en suspension dans le milieu de transport d'origine.

Si un échantillon est constitué de poissons entiers de moins de 4 cm de long, ceux-ci devraient être réduits en petits fragments à l'aide de ciseaux stériles ou d'un scalpel après élimination de la partie du corps se situant à l'arrière de l'ouverture ventrale. Si un échantillon est constitué de poissons entiers de 4 à 6 cm de long, les viscères, y compris les reins, devraient être collectés. Si un échantillon est constitué de poissons entiers de plus de 6 cm de long, les échantillons de tissus devraient être collectés comme décrit dans la partie I I 3. Les échantillons de tissus devraient être réduits en petits fragments à l'aide de ciseaux stériles ou d'un scalpel et homogénéisés comme décrit ci-dessus et placés en suspension dans le milieu de transport.

Le rapport final entre le matériel tissulaire et le milieu de transport doit être ajusté au laboratoire à 1:10.

3. Centrifugation de l'homogénat

L'homogénat est centrifugé dans une centrifugeuse réfrigérée à une température comprise entre 2 et 5 °C, à 2000-4000 x g pendant 15 minutes, et le liquide surnageant est collecté et traité, soit pendant 4 heures à 15 °C, soit pendant une nuit à 4 °C avec des antibiotiques (par exemple, 1 mg/ml de gentamicine peut être utile à ce stade).

Si l'échantillon a été expédié dans un milieu de transport (c'est-à-dire sous antibiotiques), le traitement du liquide surnageant par les antibiotiques n'est pas nécessaire.

Le traitement aux antibiotiques vise à maîtriser la contamination bactérienne des échantillons et rend superflue toute filtration à travers des filtres à membranes.

Si le liquide surnageant collecté est conservé à - 80 °C au cours des 48 heures suivant l'échantillonnage, il peut être réutilisé une seule fois pour un examen virologique.

S'il se présente des difficultés pratiques (par exemple, panne d'incubateur, problèmes de cultures cellulaires, etc.) qui empêchent d'inoculer des cellules dans les 48 heures suivant la collecte des échantillons de tissus, il est admis que le liquide surnageant soit congelé à - 80 °C et qu'un examen virologique soit pratiqué dans les quatorze jours.

Avant d'inoculer les cellules, mélanger le liquide surnageant en parties égales avec un pool d'antisérums contre les sérotypes indigènes du virus NPI, dilués de façon appropriée, et incuber ainsi au minimum pendant une heure à 15 °C ou au maximum pendant 18 heures à 4 °C. Le titre de l'antisérum doit être d'au moins 1/2000 dans un test de neutralisation en plages à 50 %.

Le traitement de tous les inocula par un sérum antivirus NPI (virus qui, dans certaines régions d'Europe, est présent dans 50 % des échantillons de poissons) vise à empêcher l'apparition, dans des cultures cellulaires inoculées, d'un ECP résultant du virus NPI. Ce traitement permet de réduire la durée des examens virologiques ainsi que le nombre de cas où l'apparition d'un ECP devrait être considérée comme une indication potentielle de SHV ou de NHI.

Lorsque des échantillons proviennent d'unités de production considérées comme indemnes de NPI, le traitement des inoculums par le sérum antivirus NPI peut être omis.

III. Examen virologique

1. Cultures cellulaires et milieux

Des cellules BF-2 ou RTG-2 et EPC ou FHM sont cultivées à des températures de 20 à 30 °C dans un milieu approprié, par exemple un milieu Eagle's MEM (ou des versions modifiées), additionné de 10 % de sérum de foetus de bovin et d'antibiotiques à des concentrations standard.

Lorsque les cellules sont cultivées dans des flacons fermés, il est recommandé de tamponner le milieu à l'aide de bicarbonate. Le milieu utilisé pour la culture cellulaire en unités ouvertes peut être tamponné à l'aide de Tris-HCl (23 mM) et de bicarbonate de sodium (6 mM). Le pH doit être de 7,6 +- 0,2.

Les cultures cellulaires à utiliser pour l'inoculation avec du matériel tissulaire devraient être jeunes (de quatre à 48 heures) et en phase de croissance active (non confluentes) au moment de l'inoculation.

2. Inoculation des cultures cellulaires

Inoculer une suspension d'organes traitée aux antibiotiques dans des cultures cellulaires à raison de deux dilutions: la dilution initiale et une dilution de celle-ci au 1:10, donnant respectivement des dilutions finales du matériel tissulaire dans un milieu de culture cellulaires au 1:100 et 1:1000 (de manière à éviter des interférences homologues). Deux lignées cellulaires au moins doivent être inoculées (voir la partie I III 1). Le rapport entre la taille de l'inoculum et le volume du milieu de culture cellulaire devrait être d'environ 1:10.

Pour chaque dilution et chaque lignée cellulaire, il y a lieu d'utiliser un minimum d'environ 2 cm2 de cellules, ce qui correspond à une cupule dans une plaque de culture cellulaire à 24 cupules. L'utilisation de plaques de culture cellulaire est recommandée, mais d'autres supports présentant une surface de croissance similaire ou supérieure peuvent également convenir.

3. Incubation des cultures cellulaires

Incuber les cultures cellulaires inoculées à 15 °C pendant sept à dix jours. Si la couleur du milieu de culture cellulaire vire du rouge au jaune, indiquant une acidification du milieu, ajuster le pH à l'aide d'une solution stérile de bicarbonate ou à l'aide de substances équivalentes pour garantir la sensibilité de la cellule à l'infection virale.

Tous les six mois au moins ou si une baisse de la sensibilité cellulaire est suspectée, effectuer le titrage des stocks de virus SHV et NHI congelés, afin de vérifier la sensibilité des cultures cellulaires à l'infection. Une procédure recommandée est indiquée dans la partie IV.

4. Microscopie

Les cultures cellulaires inoculées doivent être inspectées régulièrement (au moins trois fois par semaine), afin de déceler l'apparition d'un ECP à un grossissement de 40 à 150 fois. Si un ECP se produit nettement, engager immédiatement les procédures d'identification du virus conformément à la partie I IV.

5. Sous-culture

S'il ne s'est produit aucun ECP après une première incubation de sept à dix jours, procéder à une sous-culture avec des cultures cellulaires fraîches en utilisant une superficie cellulaire similaire à celle de la culture primaire.

Des parties aliquotes du milieu (liquide surnageant) provenant de toutes les cultures/cupules constituant la culture primaire sont poolées selon la lignée cellulaire sept à dix jours après l'inoculation. Les pools sont ensuite inoculés dans des cultures cellulaires homologues, non dilués et dilués au 1:10 (donnant respectivement des dilutions finales du liquide surnageant au 1:10 et 1:100), comme décrit à la partie I III 2. Des parties aliquotes de 10 % du milieu constituant la culture primaire peuvent également être inoculées directement dans une cupule avec des cultures cellulaires fraîches (sous-culture de cupule à cupule). L' inoculation peut être précédée d'une préincubation des dilutions avec l'antisérum contre le virus NPI à une dilution appropriée, comme décrit à la partie I II 3.

Incuber ensuite les cultures inoculées pendant sept à dix jours à 15 °C, compte tenu des dispositions de la partie I III 4.

S'il se produit un ECP toxique au cours des trois premiers jours suivant l'incubation, une sous-culture peut être réalisée à ce stade, mais les cellules doivent alors être incubées pendant sept jours et soumises à une nouvelle sous-culture suivie de sept autres jours d'incubation. Lorsqu'un ECP toxique se produit après trois jours, les cellules peuvent être passées une fois et incubées pour parvenir au nombre total de quatorze jours à partir de l'inoculation primaire. Il ne doit pas y avoir de signe de toxicité au cours des sept derniers jours d'incubation.

Si une contamination bactérienne se produit malgré le traitement aux antibiotiques, la sous-culture doit être précédée d'une centrifugation à 2000-4000 x g pendant 15 à 30 minutes, à une température de 2 à 5 °C, et/ou d'une filtration du liquide surnageant à travers un filtre de 0,45 μm (membrane à faible taux d'adsorption des protéines). Outre cette sous-culture, les procédures sont les mêmes que celles qui sont appliquées aux ECP toxiques.

IV. Identification du virus

1. Tests d'identification du virus

Si un ECP s'est produit dans une culture cellulaire, le milieu (liquide surnageant) est collecté et examiné selon une ou plusieurs des techniques suivantes: neutralisation, IF, ELISA. Si les tests n'ont pas permis d'identifier le virus de façon définitive en une semaine, le liquide surnageant doit être transféré à un laboratoire de référence national ou au laboratoire communautaire de référence pour les maladies des poissons, afin d'être identifié immédiatement.

2. Neutralisation

Éliminer les cellules du liquide surnageant collecté par centrifugation (2000-4000 x g) ou par filtration sur filtre à membrane (0,45 μm) avec une membrane à faible taux d'adsorption des protéines, puis diluer le liquide surnageant à 1:100 et 1:10000 dans un milieu de culture cellulaire.

Mélanger des parties aliquotes des deux dilutions du liquide surnageant et les incuber séparément pendant 60 minutes à 15 °C en parties égales avec les réactifs suivants:

- sérum contenant un groupe d'anticorps spécifiques contre le virus de la SHV à une dilution de 1:50 (vol:vol)(2),

- sérum contenant un groupe d'anticorps spécifiques contre le virus de la NHI à une dilution de 1:50 (vol:vol)(3),

- groupe d'antisérums contre les sérotypes indigènes du virus NPI à une dilution de 1:50 (vol:vol)(4),

- milieu de culture uniquement (contrôle positif).

Pour chacun des mélanges surnageant viral-sérum, inoculer au moins deux cultures cellulaires avec chacune 50 μl de mélange de liquide supernageant et de sérum et incuber à 15 °C. Contrôler l'apparition d'un ECP conformément à la partie I III 4.

Certaines souches du virus SHV ne réagissent pas dans des tests de neutralisation. Ces isolats doivent être identifiés par les techniques IF ou ELISA.

D'autres tests de neutralisation peuvent être appliqués si leur efficacité est prouvée.

3. IF

Pour chaque isolat de virus à identifier, ensemencer au moins huit lamelles couvre-objets ou l'équivalent à l'aide de cellules à une densité engendrant une confluence d'environ 60 à 90 % après 24 heures de culture. Les cellules EPC sont recommandées à cette fin en raison de leur forte adhérence aux surfaces de verre mais d'autres lignées cellulaires, telles que BF-2, RTG-2 ou FHM, peuvent également être utilisées.

Lorsque les cellules se sont déposées sur la surface du verre (environ une heure après l'ensemencement) ou lorsque les cultures ont été incubées pendant 24 heures au maximum, inoculer le virus à identifier. Inoculer quatre cultures suivant le rapport de volume à volume de 1:10 et quatre cultures suivant le rapport 1:1000. Celles-ci sont ensuite incubées à 15 °C pendant 20 à 30 heures.

Après l'incubation, rincer par deux fois les cultures à l'aide de milieu Eagle's MEM sans sérum, fixer par une solution à 80 % d'acétone glacée et effectuer alors la réaction IF. La première couche de réactif se compose d'anticorps poly- ou monoclonaux de référence de qualité. Le second réactif est un antisérum conjugué au fluorochrome préparé contre les immunoglobulines du premier sérum. Pour chacun des antisérums testés, utiliser au moins une culture inoculée à dose élevée et une culture inoculée à faible dose. Inclure dans le test des témoins négatifs et positifs appropriés. Des fluorochromes tels que le FITC ou le TRITC sont recommandés.

Monter les lames de cultures en utilisant une solution salée glycérolée. Examiner aux ultraviolets incidents. Utiliser des oculaires 10 x ou 12 x et des lentilles d'objectif x 25 ou x 40, dont les ouvertures numériques sont respectivement > 0,7 et > 1,3.

La technique d'IF décrite ci-dessus est indiquée à titre d'exemple. D'autres techniques d'IF (concernant les cultures cellulaires, la fixation et les anticorps de référence de qualité) peuvent être appliquées si leur efficacité est prouvée.

4. ELISA

Recouvrir les cupules des plaques de microtitration pendant une nuit avec les dilutions recommandées de fractions d'immunoglobulines purifiées provenant de sérums de référence de qualité.

Rincer les cupules à l'aide d'un tampon PBS-Tween-20, y ajouter le virus à identifier, dilué de deux en deux ou de quatre en quatre, et laisser réagir avec l'anticorps capteur pendant 60 minutes à 37 °C. Après rinçage à l'aide du tampon PBS-Tween-20, ajouter les anticorps biotinylés, dont la spécificité correspond à celle des anticorps capteurs, et laisser réagir pendant 60 minutes à 20 °C. Après un dernier rinçage, la visualisation de l'enzyme fixée est effectuée à l'aide de substrats ELISA appropriés (OPD ou autres).

La technique ELISA décrite ci-dessus, basée sur la biotine-avidine, est donnée à titre d'exemple. Elle peut être remplacée par d'autres variantes de la technique ELISA dont l'efficacité a été éprouvée.

TABLEAU 1A

Plan d'inspection et d'échantillonnage pour les zones et les exploitations de zones non agréées pour la période de contrôle de deux ans précédant l'obtention de l'agrément en ce qui concerne la SHV et/ou la NHI

(conformément à la directive 91/67/CEE, annexes B et C, et aux dispositions établies dans la partie I de la présente annexe)

>TABLE>

Nombre maximal de poissons par pool: 10.

TABLEAU 1B

Plan d'inspection et d'échantillonnage pour la période de contrôle de deux ans précédant l'obtention de l'agrément en ce qui concerne la SHV et/ou la NHI dans les zones et les exploitations de zones non agréées pour lesquelles l'absence antérieure de ces maladies est prouvée officiellement

(conformément à la directive 91/67/CEE, annexes B et C, et aux dispositions établies dans la partie I et III de la présente annexe)

>TABLE>

Nombre maximal de poissons par pool: 10.

TABLEAU 1C

Plan d'inspection et d'échantillonnage pour les zones et les exploitations de zones non agréées afin de maintenir l'agrément en ce qui concerne la SHV et/ou la NHI

(conformément à la directive 91/67/CEE, annexes B et C, et aux dispositions établies dans la partie I de la présente annexe)

>TABLE>

Nombre maximal de poissons par pool: 10.

PARTIE II

Procédures de diagnostic permettant de confirmer la SHV et la NHI en cas de suspicion

Une ou plusieurs des techniques suivantes sont appliquées pour le diagnostic de la SHV et de la NHI:

- A. Isolement conventionnel du virus suivi d'une identification sérologique du virus,

- B. Isolement du virus avec identification sérologique simultanée du virus,

- C. Autres techniques de diagnostic (IFAT, ELISA).

La confirmation du premier cas de SHV et/ou de NHI dans les exploitations de zones agréées ne peut reposer uniquement sur la méthode C. Il faut également appliquer soit la méthode A, soit la méthode B.

Le matériel tissulaire destiné à l'examen virologique peut dans certains cas devoir être accompagné de matériel supplémentaire en vue d'un examen bactériologique, parasitologique, histologique ou autre, afin de permettre un diagnostic différentiel.

A. Isolement conventionnel du virus suivi d'une identification sérologique du virus

I.1. Sélection des échantillons

Il y a lieu de sélectionner pour examen au moins dix poissons présentant des signes typiques de NHI ou de SHV.

I.2. Préparation et expédition des échantillons de poissons

Voir partie I I 3.

I.3. Collecte de matériel diagnostic supplémentaire

Voir partie I I 4.

II. Préparation d'échantillons pour examen virologique

Voir partie I II.

III. Examen virologique

Voir partie I III.

IV. Identification du virus

Voir partie I IV.

B. Isolement du virus avec identification sérologique simultanée du virus

I.1. Sélection des échantillons

Voir partie II A I 1.

I.2. Préparation et expédition des échantillons de poissons

Voir partie I I 3.

I.3. Collecte de matériel diagnostic supplémentaire

Voir partie I I 4.

II.1. Homogénéisation des organes

Voir partie I II 2.

II.2. Centrifugation de l'homogénat

L'homogénat est centrifugé dans une centrifugeuse réfrigérée à une température comprise entre 2 et 5 °C, à 2000-4000 x g pendant 15 minutes, et le liquide surnageant est collecté et traité pendant quatre heures à 15 °C avec des antibiotiques (par exemple, avec 1 mg/ml de gentamicine) ou passé à travers un filtre à membrane (0,45 μm) (membrane à faible taux d'adsorption des protéines).

II.3. Traitement du liquide surnageant à l'aide des antisérums de diagnostic)

La suspension d'organes traitée aux antibiotiques ou passée à travers un filtre à membrane est diluée à 1:10 et à 1:1000 dans un milieu de culture cellulaire et des parties aliquotes sont mélangées et incubées pendant 60 minutes à 15 °C avec des parties égales des réactifs énumérés à la partie I IV 2.

III.1. Cultures cellulaires et milieux

Voir partie I III 1.

III.2. Inoculation des cultures cellulaires

À partir de chaque mélange virus-sérum (préparé conformément à la partie II B II 3), inoculer au moins deux cupules de cultures cellulaires par lignée cellulaire avec 50 μl chacune.

III.3. Incubation des cultures cellulaires

Voir partie I III 3.

III.4. Microscopie

Inspecter chaque jour les cultures cellulaires inoculées afin de déceler l'apparition d'un ECP à un grossissement de 40-150 fois. Si la formation d'un ECP est inhibée par un des antisérums utilisés, le virus peut être considéré comme ayant été identifié en conséquence.

Si l'apparition d'un ECP n'est pas inhibée par un des antisérums, il y a lieu de mettre en oeuvre les procédures d'identification du virus conformément à la partie I IV.

III.5. Sous-culture

S'il ne s'est produit aucun ECP après sept à dix jours, une sous-culture doit être mise en oeuvre à partir de cultures inoculées avec le liquide surnageant plus le milieu (partie II B II 3) conformément à la partie I III 5.

C. Autres techniques de diagnostic

Le liquide surnageant préparé comme indiqué dans la partie I II 2 peut être soumis aux techniques IFAT ou ELISA, respectivement conformément à la partie I IV 3 ou à la partie I IV 4. Ces techniques rapides doivent être complétées par un examen virologique, conformément à A ou B, moins de 48 heures après l'échantillonnage, si:

a) un résultat négatif a été obtenu

ou si

b) un résultat positif a été obtenu avec des échantillons représentant le premier cas de NHI ou SHV dans une zone agréée.

Du matériel tissulaire peut être soumis à d'autres techniques de diagnostic, telles que les techniques RT-PCR ou IF sur des éléments congelés ou l'immunohistochimie sur du matériel tissulaire fixé au formol. Ces techniques doivent toujours être accompagnées d'une inoculation de matériel tissulaire non fixé sur des cultures cellulaires.

PARTIE III

Preuve de l'absence antérieure de SHV et/ou de NHI dans des zones ou des exploitations de zones non agréées

Lignes directrices et critères applicables à un programme d'inspections sanitaires officielles

1. Un programme d'inspections sanitaires peut uniquement être mis en oeuvre:

- après exécution d'un programme d'éradication de la SHV et/ou de la NHI, reconnu officiellement, impliquant l'élimination de tous les poissons de l'exploitation, le nettoyage, la désinfection et la mise à sec avant repeuplement avec des poissons provenant d'exploitations agréées

ou

- dans des exploitations piscicoles où n'est apparue antérieurement aucune infection liée aux virus SHV ou NHI.

2. Le programme d'inspections sanitaires officielles doit se fonder sur des inspections cliniques et des examens de laboratoire.

3. Le programme doit comprendre deux inspections sanitaires cliniques annuelles, conformément aux lignes directrices indiquées dans la partie I.

4. Au moins lors d'une des inspections annuelles, 30 échantillons de tissus de poisson et/ou de liquide ovarien sont collectés dans chaque exploitation. Les échantillons sont sélectionnés, préparés et soumis à un examen de laboratoire, conformément aux parties I, II et IV.

5. Le programme d'inspections sanitaires est appliqué pendant quatre ans au moins dans l'ensemble des exploitations de la zone ou dans l'exploitation (d'une zone non agréée) destinées à être agréées.

6. Pour que le programme puisse être reconnu officiellement, aucun cas de SHV ou de NHI ne doit se produire ni être détecté (ni infection clinique, ni isolement de virus).

PARTIE IV

Titrage destiné à vérifier la sensibilité des cultures cellulaires à l'infection

Des procédures recommandées pour le titrage visé à la partie I III 3 sont indiquées ci-dessous.

Il convient d'utiliser au moins deux isolats de virus SHV et un isolat de virus NHI. Ces isolats doivent être représentatifs des principaux virus de l'UE (par exemple, en ce qui concerne le virus SHV, un isolat pathogène provenant de truite arc-en-ciel en eau douce et un isolat marin pathogène pour le turbot en eau de mer et, en ce qui concerne le virus NHI, une souche pathogène de truite arc-en-ciel provenant d'Europe). Il convient d'utiliser des isolats bien définis provenant des États membres. Des isolats de référence sont disponibles auprès du laboratoire communautaire de référence pour les maladies des poissons.

Des lots de virus ayant un faible nombre de passages en des cultures cellulaires sont cultivés dans des flacons de cultures cellulaires sur des cellules BF-2 ou RTG-2 pour le virus SHV et sur des cellules EPC pour le virus NHI. Il convient d'utiliser un milieu de culture cellulaire additionné d'au moins 10 % de sérum. Utiliser une faible multiplicité d'infection (MOI) pour l'inoculation (< 1).

Lorsque l'ECP est total, le virus est collecté par centrifugation du surnageant de culture cellulaire à 2000 x g pendant quinze minutes, stérilisé par filtration à travers une membrane de 0,45 ìm et réparti dans des cryotubes étiquetés. Le virus est conservé à - 80 °C.

Une semaine après la congélation, trois fioles de chaque virus sont décongelées sous eau froide et titrées sur leurs lignées cellulaires respectives. Chaque isolat de virus est décongelé et titré au moins tous les six mois ou si une baisse de la sensibilité des lignées cellulaires est suspectée.

Les procédures de titrage doivent être décrites en détail et la même procédure doit être appliquée à chaque fois.

Le titrage par dilution limite doit comprendre au moins six réplicats de chaque série de dilutions. Les titres sont comparés avec les titres obtenus antérieurement. Si le titre d'un des trois isolats viraux baisse d'un facteur de 2 logs ou plus, par rapport au titre initial, la lignée cellulaire ne doit plus être utilisée à des fins de surveillance.

Si différentes lignées cellulaires sont conservées au laboratoire, chaque lignée doit être examinée séparément.

Des registres sont conservés pendant dix ans au moins.

PARTIE V

Acronymes et abréviations

BF-2 BF-2 Bluegill fry-2 (lignée cellulaire)

ECP Effet cytopathogène

LCR Laboratoire communautaire de référence pour les maladies des poissons

ELISA Méthode immuno-enzymatique

EPC Epithelioma papulosum cyprinii (lignée cellulaire)

FHM Tête de boule (lignée cellulaire)

FITC Isothiocyanate de fluorescéine

Hepes Acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'2-éthane sulfonique

HRP Peroxydase de raifort

IF Immunofluorescence

IFAT Test d'immunofluorescence indirecte

NHI(V) Nécrose hématopoïétique infectieuse (virus)

NPI(V) Nécrose pancréatique infectieuse (virus)

MEM Milieu essentiel minimal

MOI Multiplicité de l'infection (nombre de particules virales infectieuses ajoutées par rapport à un nombre connu de cellules dans une culture)

OPD Ortho-phénylène diamine

PBS Solution tamponnée au phosphate

RTG-2 Gonade de truite arc-en-ciel (lignée cellulaire)

RT-PCR Transcription inverse - réaction en chaîne de la polymérase

Tris-HCl Tris(hydroxyméthyl) aminométhane - HCl

TRITC Tétraméthyl-rhodamine-isothiocyanate

SHV(V) Septicémie hémorragique virale (virus)

(1) Par exemple, lorsque les poissons proviennent de zones très éloignées et ne peuvent être expédiés quotidiennement.

(2) Ou comme spécifié par le laboratoire de référence en ce qui concerne la cytotoxicité des antisérums.

(3) Ou comme spécifié par le laboratoire de référence en ce qui concerne la cytotoxicité des antisérums.

(4) Ou comme spécifié par le laboratoire de référence en ce qui concerne la cytotoxicité des antisérums.