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Document 32016R0266

Title and reference
Reglamento (UE) 2016/266 de la Comisión, de 7 de diciembre de 2015, que modifica, con vistas a su adaptación al progreso técnico, el Reglamento (CE) n.° 440/2008, por el que se establecen métodos de ensayo de acuerdo con el Reglamento (CE) n.° 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y mezclas químicas (REACH) (Texto pertinente a efectos del EEE)

C/2015/8529

OJ L 54, 1.3.2016, p. 1–446 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2016/266/oj
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Text

1.3.2016   

ES

Diario Oficial de la Unión Europea

L 54/1


REGLAMENTO (UE) 2016/266 DE LA COMISIÓN

de 7 de diciembre de 2015

que modifica, con vistas a su adaptación al progreso técnico, el Reglamento (CE) n.o 440/2008, por el que se establecen métodos de ensayo de acuerdo con el Reglamento (CE) n.o 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y mezclas químicas (REACH)

(Texto pertinente a efectos del EEE)

LA COMISIÓN EUROPEA,

Visto el Tratado de Funcionamiento de la Unión Europea,

Visto el Reglamento (CE) n.o 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 18 de diciembre de 2006, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y mezclas químicas (REACH), por el que se crea la Agencia Europea de Sustancias y Mezclas Químicas, se modifica la Directiva 1999/45/CE y se derogan el Reglamento (CEE) n.o 793/93 del Consejo y el Reglamento (CE) n.o 1488/94 de la Comisión, así como la Directiva 76/769/CEE del Consejo y las Directivas 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE y 2000/21/CE de la Comisión (1), y, en particular, su artículo 13, apartado 2,

Considerando lo siguiente:

(1)

El Reglamento (CE) n.o 440/2008 de la Comisión (2) incluye los métodos de ensayo para la determinación de las propiedades fisicoquímicas, toxicológicas y ecotoxicológicas de las sustancias, que deben aplicarse a efectos del Reglamento (CE) n.o 1907/2006.

(2)

Es necesario actualizar el Reglamento (CE) n.o 440/2008 a fin de incluir métodos de ensayo nuevos y actualizados que han sido adoptados recientemente por la OCDE con el fin de tener en cuenta el progreso técnico, y de garantizar la reducción del número de animales utilizados en los experimentos, de acuerdo con la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo (3). Se ha consultado a los interesados sobre el presente proyecto.

(3)

La adaptación contiene veinte métodos de ensayo: un nuevo método para la determinación de una de las propiedades fisicoquímicas, once métodos de ensayo nuevos y tres métodos de ensayo actualizados para la evaluación de la ecotoxicidad, y cinco métodos de ensayo nuevos para evaluar el destino y el comportamiento en el medio ambiente.

(4)

Por tanto, procede modificar el Reglamento (CE) n.o 440/2008 en consecuencia.

(5)

Las medidas previstas en el presente Reglamento se ajustan al dictamen del Comité establecido en virtud del artículo 133 del Reglamento (CE) n.o 1907/2006.

HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO:

Artículo 1

El anexo del Reglamento (CE) n.o 440/2008 queda modificado de conformidad con el anexo del presente Reglamento.

Artículo 2

El presente Reglamento entrará en vigor el tercer día siguiente al de su publicación en el Diario Oficial de la Unión Europea.

El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro.

Hecho en Bruselas, el 7 de diciembre de 2015.

Por la Comisión

El Presidente

Jean-Claude JUNCKER


(1)  DO L 396 de 30.12.2006, p. 1.

(2)  Reglamento (CE) n.o 440/2008 de la Comisión, de 30 de mayo de 2008, por el que se establecen métodos de ensayo de acuerdo con el Reglamento (CE) n.o 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y mezclas químicas (REACH) (DO L 142 de 31.5.2008, p. 1).

(3)  Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010 relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos (DO L 276 de 20.10.2010, p. 33).


ANEXO

El anexo del Reglamento (CE) n.o 440/2008 queda modificado como sigue:

1)

Se añade una nota al principio del anexo, antes de la parte A:

«Nota:

Antes de utilizar cualquiera de los siguientes métodos de ensayo con una sustancia de componentes múltiples (MCS), con una sustancia de composición desconocida o variable, producto complejo de reacción o material biológico (UVCB), o con una mezcla, y en caso de que en el respectivo método de ensayo no se indique la aplicabilidad del mismo para estas MCS, UVCB o mezclas, deberá sopesarse si el método es adecuado para alcanzar el objetivo reglamentario previsto.

Si el método se utiliza para ensayar una MCS, UVCB o una mezcla, debe disponerse de información suficiente sobre su composición, en la medida de lo posible, como, por ejemplo, mediante la identidad química de sus componentes, las cantidades en que están presentes, y las propiedades pertinentes de los componentes.».

2)

Se añade el capítulo A.24 siguiente:

«

A. 24.   COEFICIENTE DE REPARTO (N-OCTANOL/AGUA), MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

INTRODUCCIÓN

El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 117 (2004).

1.

El coeficiente de reparto (P) se define como la relación de las concentraciones en equilibrio de una sustancia disuelta en un sistema bifásico consistente en dos disolventes considerablemente inmiscibles. En el caso del n-octanol y del agua:

Formula

Como el coeficiente de reparto es el cociente de dos concentraciones, carece de dimensiones y se indica generalmente en forma de su logaritmo decimal.

2.

El Pow es un parámetro clave en los estudios sobre el destino en el medio ambiente de las sustancias. Se ha comprobado que existe una relación muy significativa entre el Pow de la forma no ionizada de las sustancias y su bioacumulación en los peces. También se ha demostrado que el Pow es un parámetro útil en la predicción de la adsorción al suelo y a los sedimentos, y para establecer relaciones cuantitativas estructura/actividad en una amplia gama de efectos biológicos.

3.

La propuesta original del presente método de ensayo se basaba en un artículo de C.V. Eadsforth y P. Moser (1). El desarrollo del método de ensayo y un ensayo de comparación interlaboratorios de la OCDE fueron coordinados por el Umweltbundesamt de la República Federal de Alemania en 1986 (2).

CONSIDERACIONES INICIALES

4.

Pueden determinarse empíricamente valores de log Pow en el intervalo de – 2 a 4 (a veces, hasta 5 y más) (1) por el método de frasco de agitación (capítulo A.8 del presente anexo, TG 107 de la OCDE). El método de HPLC cubre el log Pow en el intervalo de 0 a 6 (1)(2)(3)(4)(5). Este método puede exigir una estimación del Pow para asignar las sustancias de referencia adecuadas y apoyar las eventuales conclusiones a las que se llegue a partir de los datos generados en el ensayo. Los métodos de cálculo se tratan brevemente en el apéndice del presente método de ensayo. El modo de funcionamiento de la HPLC es isocrático.

5.

Los valores de Pow dependen de las condiciones ambientales, como la temperatura, el pH, la fuerza iónica, etc., y estas deben estar definidas en el experimento para que los datos de Pow se puedan interpretar correctamente. Cuando se trate de sustancias ionizables, puede disponerse de otro método [por ejemplo, el proyecto de directrices de la OCDE sobre un método pH-métrico para sustancias ionizadas (6)], que podría utilizarse como método alternativo. Aunque dicho proyecto de directrices de la OCDE puede ser adecuado para determinar el Pow de esas sustancias ionizables, en algunos casos es más conveniente utilizar el método de HPLC a un pH pertinente para el medio ambiente (véase el punto 9).

PRINCIPIO DEL MÉTODO

6.

La HPLC de fase inversa se realiza en columnas analíticas rellenas de una fase sólida comercial con cadenas hidrocarbonadas largas (C8, C18, por ejemplo) unidas por enlaces químicos a la sílice.

7.

Las sustancias inyectadas en una de estas columnas se reparten entre la fase de disolvente móvil y la fase estacionaria de hidrocarburos, y son transportadas a lo largo de la columna por la fase móvil. Las sustancias se retienen en función de su coeficiente de reparto hidrocarburo-agua, de manera que en primer lugar eluyen las sustancias hidrófilas y en último lugar las sustancias lipófilas. El tiempo de retención se describe mediante el factor de capacidad k, dado por la expresión:

Formula

donde tR es el tiempo de retención de la sustancia problema, y t0 es el tiempo muerto, es decir, el tiempo medio que tarda en atravesar la columna una molécula de disolvente. No es necesario utilizar métodos analíticos cuantitativos, sino solo determinar los tiempos de retención.

8.

El coeficiente de reparto octanol/agua de una sustancia problema puede calcularse mediante la determinación experimental de su factor de capacidad k, que se introduce a continuación en la ecuación siguiente:

Formula

donde

a, b

=

coeficientes de regresión lineal.

La ecuación anterior puede obtenerse por regresión lineal del logaritmo del coeficiente de reparto octanol/agua de sustancias de referencia frente al logaritmo de los factores de capacidad de las sustancias de referencia.

9.

El método de HPLC de fase inversa permite la estimación de coeficientes de reparto en el intervalo de log Pow entre 0 y 6, pero en casos excepcionales puede ampliarse para cubrir el intervalo de log Pow entre 6 y 10. Esto puede requerir que se modifique la fase móvil (3). El método no es aplicable a los ácidos y bases fuertes, a los complejos metálicos, a las sustancias que reaccionen con el eluyente, ni a los agentes tensioactivos. Con las sustancias ionizables pueden realizarse mediciones en su forma no ionizada (ácido libre o base libre) solo utilizando un amortiguador adecuado con un pH por debajo del pKa en caso de un ácido libre, o por encima del pKa si se trata de una base libre. Si se llegara a disponer del método pH-métrico para el ensayo de sustancias ionizables (6), se podría utilizar como método alternativo. Si se determina el valor de log Pow para utilizarlo en la clasificación de los peligros para el medio ambiente o en la evaluación del riesgo para el medio ambiente, el ensayo debe realizarse en el intervalo de pH pertinente para el medio natural, es decir, en el intervalo de pH de 5,0 a 9.

10.

Las impurezas pueden hacer en algunos casos que la interpretación de los resultados sea difícil debido a la incertidumbre en la asignación de los picos. En el caso de mezclas que den lugar a una banda sin resolver, deben indicarse los límites superior e inferior de log Pow, y el porcentaje del área de cada pico de log Pow. En el caso de mezclas que sean un grupo de homólogos, deberá indicarse asimismo la media ponderada de log Pow (7), calculada sobre la base de los valores de los distintos Pow y los valores correspondientes de porcentaje del área (8). En el cálculo deben tomarse en consideración todos los picos a los que corresponda un área superior o igual al 5 % del área total de los picos (9):

Formula

La media ponderada de log Pow solo es válida en caso de sustancias o mezclas (por ejemplo, tall oils) compuestas por homólogos (como, por ejemplo, una serie de alcanos). Las mezclas pueden medirse con resultados significativos, a condición de que el detector analítico utilizado tenga la misma sensibilidad respecto a todas las sustancias de la mezcla y la resolución sea adecuada.

INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA

11.

Antes de utilizar el método, deben conocerse la constante de disociación, la fórmula estructural y la solubilidad en la fase móvil. Además, sería útil disponer de información sobre la hidrólisis.

CRITERIOS DE CALIDAD

12.

Para aumentar la confianza de la medida, deben hacerse las determinaciones por duplicado.

Repetibilidad: Los valores de log Pow derivados de las mediciones repetidas efectuadas en condiciones idénticas y utilizando el mismo conjunto de sustancias de referencia debe estar dentro de un intervalo de ± 0,1 unidades logarítmicas.

Reproducibilidad: Si se repiten las mediciones con un conjunto diferente de sustancias de referencia, los resultados pueden ser diferentes. Típicamente, el coeficiente de correlación R correspondiente a la relación entre log k y log Pow de un conjunto de sustancias problema es de alrededor de 0,9, correspondiente a unos coeficientes de reparto octanol/agua de log Pow ± 0,5 unidades logarítmicas.

13.

El ensayo comparativo interlaboratorios ha mostrado que con el método de HPLC pueden obtenerse valores de log Pow en el margen de ± 0,5 unidades de los valores obtenidos con el método de frasco de agitación (2). Pueden encontrarse otras comparaciones en la bibliografía (4) (5) (10) (11) (12). Las gráficas de correlación basadas en sustancias de referencia relacionadas estructuralmente dan los resultados más exactos (13).

SUSTANCIAS DE REFERENCIA

14.

Con el fin de correlacionar el factor de capacidad k medido de una sustancia con su Pow, tiene que establecerse una curva de calibración utilizando al menos seis puntos (véase el punto 24). La selección de las sustancias de referencia adecuadas depende del criterio del analista. Las sustancias de referencia deben tener normalmente valores de log Pow que rodeen al log Pow de la sustancia problema, es decir, al menos una sustancia de referencia debe tener un Pow superior al de la sustancia problema y otra un Pow inferior al de la sustancia problema. La extrapolación debe utilizarse solo en casos excepcionales. Es preferible que estas sustancias de referencia estén relacionadas estructuralmente con la sustancia problema. Los valores de log Pow de las sustancias de referencia utilizados para la calibración deben basarse en datos experimentales fiables. No obstante, en el caso de sustancias con log Pow elevado (normalmente más de 4) podrán utilizarse valores calculados, a menos que se disponga de datos experimentales fiables. Si se utilizan valores extrapolados, se citará un valor límite.

15.

Se dispone de amplias listas de valores de log Pow de muchos grupos de sustancias (14) (15). Si no se tienen datos sobre los coeficientes de reparto de sustancias relacionadas estructuralmente, puede utilizarse una calibración más general, establecida con otras sustancias de referencia. En el cuadro 1 se recogen sustancias de referencia recomendadas y sus valores de Pow. En el caso de las sustancias ionizables, se dan los valores correspondientes a la forma no ionizada. En el ensayo comparativo interlaboratorios se comprobaron la verosimilitud y la calidad de los valores.

Cuadro 1.

Sustancias de referencias recomendadas

 

Número CAS

Sustancia de referencia

log Pow

pKa

1

78-93-3

2-Butanona

(metiletilcetona)

0,3

 

2

1122-54-9

4-Acetilpiridina

0,5

 

3

62-53-3

Anilina

0,9

 

4

103-84-4

Acetanilida

1,0

 

5

100-51-6

Alcohol bencílico

1,1

 

6

150-76-5

4-Metoxifenol

1,3

pKa = 10,26

7

122-59-8

Ácido fenoxiacético

1,4

pKa = 3,12

8

108-95-2

Fenol

1,5

pKa = 9,92

9

51-28-5

2,4-Dinitrofenol

1,5

pKa = 3,96

10

100-47-0

Benzonitrilo

1,6

 

11

140-29-4

Fenilacetonitrilo

1,6

 

12

589-18-4

Alcohol 4-metilbencílico

1,6

 

13

98-86-2

Acetofenona

1,7

 

14

88-75-5

2-Nitrofenol

1,8

pKa = 7,17

15

121-92-6

Ácido 3-nitrobenzoico

1,8

pKa = 3,47

16

106-47-8

4-Cloroanilina

1,8

pKa = 4,15

17

98-95-3

Nitrobenceno

1,9

 

18

104-54-1

Alcohol cinamílico

(alcohol cinámico)

1,9

 

19

65-85-0

Ácido benzoico

1,9

pKa = 4,19

20

106-44-5

p-Cresol

1,9

pKa = 10,17

21

140-10-3

(trans)

Ácido cinámico

2,1

pKa = 3,89 (cis)

4,44 (trans)

22

100-66-3

Anisol

2,1

 

23

93-58-3

Benzoato de metilo

2,1

 

24

71-43-2

Benceno

2,1

 

25

99-04-7

Ácido 3-metilbenzoico

2,4

pKa = 4,27

26

106-48-9

4-Clorofenol

2,4

pKa = 9,1

27

79-01-6

Tricloroetileno

2,4

 

28

1912-24-9

Atrazina

2,6

 

29

93-89-0

Benzoato de etilo

2,6

 

30

1194-65-6

2,6-Diclorobenzonitrilo

2,6

 

31

535-80-8

Ácido 3-clorobenzoico

2,7

pKa = 3,82

32

108-88-3

Tolueno

2,7

 

33

90-15-3

1-Naftol

2,7

pKa = 9,34

34

608-27-5

2,3-Dicloroanilina

2,8

 

35

108-90-7

Clorobenceno

2,8

 

36

1746-13-0

Éter de alilo y fenilo

2,9

 

37

108-86-1

Bromobenceno

3,0

 

38

100-41-4

Etilbenceno

3,2

 

39

119-61-9

Benzofenona

3,2

 

40

92-69-3

4-Fenilfenol

3,2

pKa = 9,54

41

89-83-8

Timol

3,3

 

42

106-46-7

1,4-Diclorobenceno

3,4

 

43

122-39-4

Difenilamina

3,4

pKa = 0,79

44

91-20-3

Naftaleno

3,6

 

45

93-99-2

Benzoato de fenilo

3,6

 

46

98-82-8

Isopropilbenceno

3,7

 

47

88-06-2

2,4,6-Triclorofenol

3,7

pKa = 6

48

92-52-4

Bifenilo

4,0

 

49

120-51-4

Benzoato de bencilo

4,0

 

50

88-85-7

2,4-Dinitro-6-sec-butilfenol

4,1

 

51

120-82-1

1,2,4-Triclorobenceno

4,2

 

52

143-07-7

Ácido dodecanoico

4,2

pKa = 5,3

53

101-84-8

Éter difenílico

4,2

 

54

85-01-8

Fenantreno

4,5

 

55

104-51-8

n-Butilbenceno

4,6

 

56

103-29-7

Dibencilo

4,8

 

57

3558-69-8

2,6-Difenilpiridina

4,9

 

58

206-44-0

Fluoranteno

5,1

 

59

603-34-9

Trifenilamina

5,7

 

60

50-29-3

DDT

6,5

 

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

Estimación previa del coeficiente de reparto

16.

Si es necesario, puede estimarse el coeficiente de reparto de la sustancia problema, preferentemente mediante un método de cálculo (véase el apéndice), o bien, cuando sea adecuado, utilizando la relación de las solubilidades de la sustancia problema en los disolventes puros.

Equipo

17.

Se debe disponer de un cromatógrafo de líquidos provisto de una bomba de baja pulsación y un sistema adecuado de detección. Un detector de UV, con una longitud de onda de 210 nm, o un detector de índice de refracción, es aplicable a una amplia variedad de grupos químicos. La presencia de grupos polares en la fase estacionaria puede afectar gravemente al funcionamiento de la columna de HPLC; por tanto, las fases estacionarias deben presentar la mínima proporción posible de grupos polares (16). Pueden utilizarse rellenos de fase inversa con micropartículas o columnas ya rellenas, disponibles comercialmente. Puede ponerse una precolumna entre el sistema de inyección y la columna de análisis.

Fase móvil

18.

Para preparar el disolvente de elución, se utilizan metanol de grado HPLC y agua destilada o desionizada; el disolvente se desgasifica antes de utilizarse. Se debe utilizar una elución isocrática. Deben utilizarse mezclas de metanol/agua con un contenido mínimo de agua del 25 %. La mezcla típica de metanol-agua en la proporción de 3:1 (v/v) es satisfactoria para eluir sustancias de log P igual a 6 en el plazo de una hora, con un caudal de 1 ml/min. En el caso de sustancias de log P mayor de 6, puede ser necesario abreviar su tiempo de elución (y el de las sustancias de referencia) disminuyendo la polaridad de la fase móvil o la longitud de la columna.

19.

La sustancia problema y las sustancias de referencia deben ser solubles en la fase móvil en concentración suficiente para permitir su detección. Se podrán utilizar aditivos con la mezcla metanol-agua solo en casos excepcionales, ya que cambian las propiedades de la columna. En estos casos, debe comprobarse que los tiempos de retención de las sustancias problema y de referencia no se ven afectados. Si la mezcla metanol-agua no es adecuada, pueden utilizarse mezclas de agua con otros disolventes orgánicos, como etanol, acetonitrilo, o 2-propanol (alcohol isopropílico).

20.

El pH del eluyente es fundamental para las sustancias ionizables. Debe situarse en el intervalo de pH de funcionamiento de la columna, que suele estar entre 2 y 8. Se recomienda el uso de soluciones amortiguadoras. Hay que evitar la precipitación de sales y el deterioro de la columna que se producen con algunas mezclas de fase orgánica con soluciones amortiguadoras. Las medidas de HPLC con fases estacionarias a base de sílice con pH superior a 8 no suelen ser recomendables porque el uso de una fase móvil alcalina puede provocar una rápida alteración de las características de la columna.

Solutos

21.

Las sustancias problema y de referencia deben ser suficientemente puras a fin de asignar los picos de los cromatogramas a las sustancias respectivas. Si es posible, las sustancias que se vayan a utilizar en el ensayo o en la calibración se disolverán en la fase móvil. Si se utiliza un disolvente distinto de la fase móvil para disolver las sustancias problema y de referencia, la fase móvil debe utilizarse para la dilución final antes de la inyección.

Condiciones de ensayo

22.

La temperatura durante las medidas no debe variar más de ± 1 °C.

Determinación del tiempo muerto t0

23.

El tiempo muerto t0 puede medirse utilizando sustancias orgánicas que no se retienen (p. ej., tiourea o formamida). Puede obtenerse el tiempo muerto con más precisión a partir de los tiempos de retención medidos del conjunto de unos siete miembros de una serie homóloga (por ejemplo, n-alquil-metil-cetonas) (17). Se representan los tiempos de retención tR (nC+ 1) frente a tR (nC), donde nC es el número de átomos de carbono. Se obtiene una línea recta, tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, donde A, que representa a k(nC + 1)/k(nC), es una constante. El tiempo muerto t0 se obtiene a partir de la ordenada en el origen (1 – A)t0 y de la pendiente A.

Ecuación de regresión

24.

El siguiente paso es representar la correlación entre log k y log P de sustancias de referencia adecuadas, con valores de log P cercanos al valor previsto de la sustancia problema. En la práctica, se inyectan simultáneamente de 6 a 10 sustancias de referencia. Se determinan los tiempos de retención, de preferencia con un integrador-registrador unido al sistema de detección. Se representan en función de log P los correspondientes logaritmos de los factores de capacidad, log k. La ecuación de regresión se realiza a intervalos regulares, al menos una vez al día, de forma que puedan tenerse en cuenta los posibles cambios de las características de la columna.

DETERMINACIÓN DEL POW DE LA SUSTANCIA PROBLEMA

25.

Se inyectan las cantidades más pequeñas detectables de la sustancia problema. Se determina por duplicado el tiempo de retención. El coeficiente de reparto de la sustancia problema se obtiene por interpolación del factor de capacidad calculado en la curva de calibración. En caso de coeficientes de reparto muy bajos y muy altos, es necesario hacer una extrapolación. Especialmente en estos casos debe prestarse atención a los límites de confianza de la línea de regresión. Si el tiempo de retención de la muestra se sitúa fuera de la gama de tiempos de retención obtenidos con los patrones, tiene que darse un valor límite.

DATOS E INFORME

Informe del ensayo

26.

Los siguientes elementos deberán incluirse en el informe:

si se ha efectuado una estimación previa del coeficiente de reparto, los valores estimados y el método utilizado; y, si se ha utilizado un método de cálculo, su descripción completa, incluida la identificación de la base de datos e información detallada sobre la selección de los fragmentos;

sustancias problema y de referencia: pureza, fórmula estructural y número CAS;

descripción del equipo y de las condiciones de funcionamiento: columna de análisis, precolumna;

fase móvil, medio de detección, intervalo de temperatura, pH;

perfiles de elución (cromatogramas);

tiempo muerto y método para medirlo;

datos de la retención y valores de log Pow de la bibliografía correspondientes a las sustancias de referencia utilizadas en la calibración;

datos de la recta de regresión ajustada (log k frente a log Pow) y coeficiente de correlación de la recta, incluidos los intervalos de confianza;

datos de retención media y valor interpolado de log Pow de la sustancia problema;

en el caso de una mezcla: cromatograma del perfil de elución con indicación de los valores de corte;

valores de log Pow en relación con el porcentaje del área del pico de log Pow;

cálculo utilizando una recta de regresión;

media ponderada calculada de los valores de log Pow, cuando corresponda.

BIBLIOGRAFÍA

(1)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss and H.J. Poremski. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

(3)

C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

(4)

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(5)

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Apéndice

Métodos de cálculo del POW

INTRODUCCIÓN

1.

El presente apéndice proporciona una breve introducción al cálculo del Pow. Para más información, se remite al lector a los libros de texto (1) (2).

2.

Los valores calculados de Pow se utilizan para:

decidir qué método experimental se debe utilizar: método de frasco de agitación para log Pow entre – 2 y 4, y método de HPLC para log Pow entre 0 y 6;

seleccionar las condiciones que deben utilizarse en la HPLC (sustancias de referencia, proporción metanol/agua);

controlar la verosimilitud de los valores obtenidos mediante métodos experimentales;

proporcionar una estimación cuando no puedan aplicarse los métodos experimentales.

Principio de los métodos de cálculo

3.

Los métodos de cálculo aquí sugeridos se basan en la fragmentación teórica de la molécula en subestructuras adecuadas de las que se conocen incrementos fiables de log Pow. El log Pow se obtiene sumando los valores de los fragmentos y los términos de corrección por las interacciones intramoleculares. Existen listas de constantes de fragmentos y términos de corrección (1) (2) (3) (4) (5) (6). Algunas se actualizan periódicamente (3).

Fiabilidad de los valores calculados

4.

En general, la fiabilidad de los métodos de cálculo disminuye según aumenta la complejidad de la sustancia estudiada. En el caso de las moléculas simples de bajo peso molecular y uno o dos grupos funcionales, puede esperarse una desviación de 0,1 a 0,3 unidades de log Pow entre los resultados de los diferentes métodos de fragmentación y los valores medidos. El margen de error dependerá de la fiabilidad de las constantes de fragmentos utilizadas, de la capacidad de reconocer interacciones intramoleculares (p. ej., enlaces de hidrógeno) y del uso adecuado de los términos de corrección. En el caso de sustancias que se ionizan, han de tenerse en cuenta la carga y el grado de ionización (10).

Método de π de Fujita-Hansch

5.

La constante de hidrofobicidad del sustituyente, π, introducida originalmente por Fujita et al. (7) se define de la manera siguiente:

πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH)

donde PhX es un derivado aromático y PhH es la sustancia original,

p. ej.,

πCl

= log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6)

= 2,84 – 2,13

= 0,71

El método de π es interesante sobre todo para sustancias aromáticas. Se dispone de los valores de π de un gran número de sustituyentes (4) (5).

Método de Rekker

6.

Con el método de Rekker (8), el valor de log Pow se calcula de la forma siguiente:

Formula

donde ai es el número de veces que un fragmento dado aparece en la molécula y fi es el incremento de log Pow del fragmento. Los términos de interacción pueden expresarse como integral múltiple de una sola constante Cm (llamada “constante mágica”). Las constantes de fragmento fi y Cm se han obtenido a partir de una lista de 1 054 valores experimentales de Pow de 825 sustancias mediante análisis de regresión múltiple (6) (8). La determinación de los términos de interacción se lleva a cabo según normas establecidas (6) (8) (9).

Método de Hansch-Leo

7.

Con el método de Hansch y Leo (4), el valor de log Pow se calcula de la forma siguiente:

Formula

donde fi es una constante de fragmento, Fj es un término de corrección (factor), y ai y bj son la frecuencia correspondiente de presencia. Las listas de valores de fragmentos (de átomos y de grupos) y de términos de corrección Fj se obtuvieron por tanteo a partir de valores experimentales de Pow. Los términos de corrección se han dividido en varias clases diferentes (1) (4). Se han desarrollado paquetes de programas informáticos para tener en cuenta todas las normas y términos de corrección (3).

MÉTODO COMBINADO

8.

El cálculo de log Pow de moléculas complejas puede mejorarse considerablemente si se divide la molécula en grandes subestructuras de las que se conozcan valores fiables de log Pow, bien a partir de listas (3) (4) o bien por mediciones previas. Estos fragmentos (p. ej., heterociclos, antraquinona, azobenceno) pueden combinarse con los valores π de Hansch o con las constantes de fragmento de Rekker o Leo.

Observaciones

i)

Los métodos de cálculo son aplicables a las sustancias parcial o completamente ionizadas solo cuando se tienen en cuenta los necesarios factores de corrección.

ii)

Si puede suponerse la presencia de enlaces de hidrógeno intramoleculares, hay que añadir los correspondientes términos de corrección (aproximadamente, de + 0,6 a + 1,0 unidades de log Pow) (1). Pueden obtenerse indicaciones sobre la presencia de tales enlaces a partir de modelos estéricos o datos espectroscópicos.

iii)

Si son posibles varias formas tautoméricas, debe usarse como base para el cálculo la forma más probable.

iv)

Hay que seguir cuidadosamente las revisiones de las listas de constantes de fragmento.

BIBLIOGRAFÍA SOBRE MÉTODOS DE CÁLCULO

(1)

W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, Nueva York (1982).

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(9)

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(10)

R.A. Scherrer. ACS — Symposium Series 255, p. 225, American Chemical Society, Washington, D.C. (1984).

»

3)

El capítulo C.3 se sustituye por el texto siguiente:

«

C. 3.   PRUEBA DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE ALGAS Y CIANOBACTERIAS DE AGUA DULCE

INTRODUCCIÓN

1.

El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 201 (2006, anexo corregido en 2011). Se ha señalado la necesidad de ampliar el método de ensayo para incluir más especies y actualizarlo para cumplir los requisitos de evaluación del peligro y clasificación de sustancias. Esta revisión se ha efectuado basándose en la amplia experiencia práctica, en los avances científicos en el campo de los estudios toxicológicos de las algas y en la amplia aplicación con fines reglamentarios que ha tenido lugar desde la adopción inicial.

2.

En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

3.

El objeto de este ensayo es determinar los efectos de una sustancia sobre el crecimiento de microalgas o cianobacterias de agua dulce. Los organismos del ensayo, en fase de crecimiento exponencial, se exponen a la sustancia problema en cultivos discontinuos, normalmente durante un plazo de 72 horas. A pesar de la relativamente reducida duración del ensayo, es posible evaluar los efectos sobre varias generaciones.

4.

La respuesta del sistema es la reducción del crecimiento en una serie de cultivos de algas (unidades de ensayo) expuestos a distintas concentraciones de una sustancia problema. La respuesta se evalúa como función de la concentración de exposición comparándola con el crecimiento medio en cultivos de control (sin exposición) replicados. Para que se exprese plenamente la respuesta del sistema a los efectos tóxicos (sensibilidad óptima), se permite que los cultivos crezcan exponencialmente sin ninguna restricción, con la presencia de suficientes nutrientes y luz continua durante un tiempo suficiente para medir la reducción de la tasa de crecimiento específico.

5.

El crecimiento y su inhibición se cuantifican midiendo la biomasa de las algas en función del tiempo. La biomasa de las algas se define como el peso seco por volumen, por ejemplo mg de algas/litro de solución problema. Sin embargo, es difícil medir el peso seco, por lo que se utilizan parámetros indicadores. De estos indicadores los más utilizados son los recuentos celulares. Otros parámetros indicadores son el volumen celular, la fluorescencia, la densidad óptica, etc. Debe disponerse de un factor de conversión entre el parámetro indicador y la biomasa.

6.

El efecto estudiado es la inhibición del crecimiento, expresado como aumento logarítmico de la biomasa (tasa media de crecimiento específico) durante el tiempo de exposición. A partir de las tasas medias de crecimiento específico registradas en una serie de soluciones de ensayo, se determina la concentración que produce una inhibición especificada del x % de la tasa de crecimiento (por ejemplo, del 50 %) y se expresa como ErCx (por ejemplo, ErC50).

7.

Otra variable de respuesta utilizada en este método de ensayo es el rendimiento, lo que puede ser necesario en algunos países para cumplir obligaciones específicas derivadas de la normativa. Se define como la biomasa al final del tiempo de exposición menos la biomasa al inicio de este tiempo. A partir del rendimiento registrado en una serie de soluciones de ensayo, se calcula la concentración que produce una inhibición especificada del x % del rendimiento (por ejemplo, del 50 %) y se expresa como EyCx (por ejemplo, EyC50).

8.

Además, pueden determinarse estadísticamente la concentración mínima con efecto observado (LOEC) y la concentración sin efecto observado (NOEC).

INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA

9.

Entre la información sobre la sustancia problema que puede ser útil para establecer las condiciones del ensayo figuran su fórmula estructural, pureza, estabilidad ante la luz, estabilidad en las condiciones del ensayo, propiedades de absorción de la luz, pKa y resultados de estudios de transformación, incluida la biodegradabilidad en el agua.

10.

Deben conocerse la hidrosolubilidad, el coeficiente de reparto octanol/agua (Pow) y la presión de vapor de la sustancia problema, y debe disponerse de un método validado para cuantificar la sustancia en las soluciones problema con una eficiencia de recuperación y un límite de detección establecidos.

VALIDEZ DEL ENSAYO

11.

Para que un ensayo sea válido, su realización debe cumplir los siguientes criterios:

La biomasa de los cultivos de control debe haber aumentado exponencialmente con un factor de al menos 16 en el plazo de las 72 horas del ensayo. Esto corresponde a una tasa de crecimiento específico de 0,92 días– 1. Con las especies más utilizadas, la tasa de crecimiento suele ser mucho mayor (véase el apéndice 2). Este criterio puede no cumplirse si se utilizan especies de crecimiento más lento que las indicadas en el apéndice 2. En tal caso, debe prolongarse el plazo de ensayo hasta obtener un crecimiento por un factor de al menos 16 en los cultivos de control, siendo exponencial el crecimiento durante todo este tiempo. El plazo de ensayo puede reducirse hasta un mínimo de 48 horas para mantener el crecimiento exponencial sin límites durante el ensayo, siempre que se cumpla el requisito de un factor de multiplicación mínimo de 16.

El coeficiente promedio de variación de las tasas de crecimiento específico de cada sección (días 0-1, 1-2 y 2-3, en caso de ensayo de 72 horas) en los cultivos de control (véase “Coeficiente de variación” en el apéndice 1) no debe pasar del 35 %. Para el cálculo de la tasa de crecimiento específico de cada sección, véase el punto 49. Este criterio se aplica al valor promedio de los coeficientes de variación calculados de los cultivos de control replicados.

El coeficiente de variación de las tasas medias de crecimiento específico durante toda la duración del ensayo en los cultivos de control replicados no debe superar el 7 % en ensayos con Pseudokirchneriella subcapitata y Desmodesmus subspicatus. Con otras especies menos utilizadas, el valor no debe superar el 10 %.

SUSTANCIA DE REFERENCIA

12.

Para comprobar el procedimiento del ensayo pueden someterse a ensayo una o varias sustancias de referencia, como el 3,5-diclorofenol utilizado en el ensayo interlaboratorios internacional (1). También puede utilizarse el dicromato de potasio como sustancia de referencia con algas verdes. Es aconsejable someter a ensayo una sustancia de referencia al menos dos veces al año.

APLICABILIDAD DEL ENSAYO

13.

Este método de ensayo se aplica más fácilmente a las sustancias hidrosolubles que, en las condiciones del ensayo, tienen probabilidad de permanecer en el agua. Para el ensayo de sustancias volátiles, que se adsorben fuertemente, coloreadas, poco hidrosolubles o que pueden afectar a la disponibilidad de nutrientes o minerales en el medio de ensayo, puede ser necesario modificar el procedimiento descrito (por ejemplo, sistema cerrado, acondicionamiento de los recipientes de ensayo). En las referencias (2), (3) y (4) se dan orientaciones sobre algunas modificaciones pertinentes.

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO

Equipo

14.

Los recipientes de ensayo y demás instrumentos que hayan de entrar en contacto con las soluciones de ensayo serán íntegramente de vidrio o de otro material químicamente inerte. Todos los artículos se lavarán cuidadosamente para que no tengan contaminantes orgánicos ni inorgánicos que puedan interferir con el crecimiento de las algas o con la composición de las soluciones problema.

15.

Los recipientes de ensayo serán en principio matraces de vidrio de dimensiones que permitan acoger un volumen suficiente de cultivo para la realización de mediciones durante el ensayo y la entrada de una masa suficiente de CO2 desde la atmósfera (véase el punto 30). Téngase en cuenta que el volumen de líquido debe ser suficiente para que se efectúen las determinaciones analíticas (véase el punto 37).

16.

Además, puede hacer falta el siguiente equipo, en todo o en parte:

Dispositivo de cultivo: se recomienda una cámara o recinto en que se pueda mantener la temperatura elegida de incubación con una precisión de ± 2 °C.

Instrumentos de medición de la luz: es importante tener en cuenta que el método de medición de la intensidad luminosa y, en particular, el tipo de receptor (colector) pueden afectar al valor medido. Las mediciones deben hacerse preferentemente utilizando un receptor esférico (4 π) (que responda a la luz directa y reflejada desde todos los ángulos por encima y por debajo del plano de medición) o un receptor 2 π (que responda a la luz desde todos los ángulos por encima del plano de medición).

Dispositivo para determinar la biomasa de las algas. El recuento celular, que es el parámetro indicador más utilizado para determinar la biomasa de las algas, puede efectuarse con un contador electrónico de partículas, un microscopio con cámara de recuento, o un citómetro de flujo. Es posible medir otros parámetros indicadores con un citómetro de flujo, un fluorímetro, un espectrofotómetro o un colorímetro. Es útil calcular un factor de conversión que relacione el recuento celular con el peso seco. Para obtener mediciones útiles con bajas concentraciones de biomasa cuando se utilice un espectrofotómetro, puede ser necesario utilizar cubetas con un paso de luz de 4 cm como mínimo.

Organismos de ensayo

17.

Pueden utilizarse diversas especies de microalgas y cianobacterias sueltas. Se ha visto que las cepas citadas en el apéndice 2 son adecuadas para el procedimiento especificado en este método de ensayo.

18.

Si se utilizan otras especies, debe mencionarse en el informe el nombre o el origen de las cepas. Ha de confirmarse que el crecimiento exponencial de las algas seleccionadas puede mantenerse durante toda la duración del ensayo en las condiciones reinantes.

Medio de cultivo

19.

Se recomiendan dos medios de cultivo: el medio de la OCDE y el medio AAP. Sus composiciones se muestran en el apéndice 3. Téngase en cuenta que el valor inicial de pH y la capacidad de amortiguación (regulación del aumento del pH) son diferentes en los dos medios. Por tanto, los resultados de los ensayos pueden ser diferentes según el medio utilizado, en particular cuando se estudien sustancias que se ionizan.

20.

Puede ser necesario modificar los medios de cultivo en ciertos casos, por ejemplo para estudiar metales y agentes quelantes o para efectuar el ensayo a diferentes valores de pH. Si se modifica un medio, es necesario describir con detalle y justificar la modificación (3) (4).

Concentración inicial de biomasa

21.

La biomasa inicial de los cultivos de ensayo debe ser la misma en todos ellos y lo bastante baja para que pueda darse crecimiento exponencial a lo largo de todo el período de incubación sin peligro de que se agoten los nutrientes. La biomasa inicial no debe superar los 0,5 mg/l en peso seco. Se recomiendan las siguientes concentraciones celulares al inicio:

Pseudokirchneriella subcapitata:

5 × 103 – 104 células/ml

Desmodesmus subspicatus:

2-5 × 103 células/ml

Navicula pelliculosa:

104 células/ml

Anabaena flos-aquae:

104 células/ml

Synechococcus leopoliensis:

5 × 104 – 105 células/ml

Concentraciones de la sustancia problema

22.

Se pueden efectuar pruebas preliminares para determinar el intervalo de concentraciones en el que es previsible que ocurran los efectos. Para el ensayo definitivo deben seleccionarse al menos cinco concentraciones dispuestas en una progresión geométrica de razón no superior a 3,2. En caso de sustancias problema que presenten una curva concentración-respuesta plana, puede justificarse una razón más elevada. La serie de concentraciones debe abarcar preferentemente el intervalo que provoca una inhibición del 5 a 75 % de la tasa de crecimiento de las algas.

Réplicas y controles

23.

Cada concentración de ensayo contará con tres réplicas. Si no es necesario determinar la NOEC, el diseño de la prueba puede modificarse para aumentar el número de concentraciones y reducir el número de réplicas por concentración. El número de réplicas de control debe ser como mínimo de tres, aunque se recomienda que sea el doble del número de réplicas utilizadas con cada concentración de ensayo.

24.

Puede prepararse una serie aparte de soluciones problema para efectuar las determinaciones analíticas de las concentraciones de la sustancia problema (véanse los puntos 36 y 38).

25.

Cuando se utiliza un disolvente para solubilizar la sustancia problema, el diseño del ensayo debe incluir controles adicionales con el disolvente a la misma concentración utilizada en los cultivos de ensayo.

Preparación del cultivo de inóculo

26.

Para adaptar las algas a las condiciones del ensayo y garantizar que se encuentran en fase de crecimiento exponencial cuando se utilicen para inocular las soluciones problema, debe prepararse un cultivo de inóculo en el medio de ensayo de 2 a 4 días antes del inicio del ensayo. La biomasa de las algas debe ajustarse para que se dé crecimiento exponencial en el cultivo de inóculo hasta que empiece el ensayo. El cultivo de inóculo se incuba en las mismas condiciones que los cultivos de ensayo. Ha de medirse el aumento de la biomasa en el cultivo de inóculo para asegurarse de que el crecimiento está en el intervalo normal de la cepa utilizada en las condiciones de cultivo aplicadas. En el apéndice 4 se describe un ejemplo de procedimiento de cultivo de algas. Para evitar divisiones celulares sincrónicas durante el ensayo, puede ser necesario efectuar una segunda fase de propagación del cultivo de inóculo.

Preparación de las soluciones problema

27.

Todas las soluciones problema deben contener las mismas concentraciones de medio de cultivo y la misma biomasa inicial de algas. Las soluciones problema de las concentraciones elegidas se preparan normalmente mezclando una solución madre de la sustancia problema con medio de cultivo y con cultivo de inóculo. En principio, estas soluciones madre se preparan disolviendo la sustancia en medio de ensayo.

28.

Pueden utilizarse disolventes (por ejemplo, acetona, alcohol t-butílico y dimetil-formamida) como vehículo para añadir al medio de ensayo sustancias poco hidrosolubles (2) (3). La concentración del disolvente no debe superar los 100 μl/l, y debe ser igual en todos los cultivos (incluidos los controles) de la serie de ensayo.

Incubación

29.

Los recipientes de ensayo deben taparse con tapones permeables al aire. Se agitan los recipientes y se colocan en el dispositivo de cultivo. Durante el ensayo es necesario mantener las algas en suspensión y facilitar el paso del CO2, por lo que debe efectuarse una agitación constante. Los cultivos deben mantenerse a una temperatura entre los 21 y los 24 °C, con variaciones máximas de ± 2 °C. En caso de especies distintas de las indicadas en el apéndice 2 como, por ejemplo, especies tropicales, puede ser apropiada una temperatura superior, siempre que se puedan cumplir los criterios de validez. Se recomienda distribuir aleatoriamente los matraces en la incubadora y cambiarlos de posición cada día.

30.

El pH del medio de control no debe subir más de 1,5 unidades durante el ensayo. En caso de metales y sustancias que se ionicen parcialmente a un pH próximo al del ensayo, puede ser necesario limitar la variación de pH para obtener unos resultados reproducibles y bien definidos. Técnicamente puede conseguirse una variación < 0,5 unidades de pH procurando una entrada suficiente de CO2 a la solución problema desde la atmósfera ambiente, por ejemplo aumentando la intensidad de la agitación. Otra posibilidad es contener la demanda de CO2 reduciendo la biomasa inicial o la duración del ensayo.

31.

La superficie en que se incuban los cultivos debe recibir una iluminación fluorescente uniforme y continua, por ejemplo del tipo “blanca fría” o “diurna”. Las necesidades de luz de las algas y cianobacterias varían con la cepa. Debe seleccionarse la intensidad luminosa que sea más adecuada para el organismo utilizado en el ensayo. Si se utilizan las especies recomendadas de algas verdes, la intensidad luminosa al nivel de las soluciones problema debe estar en el intervalo de 60 a 120 μE · m– 2 · s– 1 cuando se mide en la banda de longitudes de onda correspondiente a la fotosíntesis (400 - 700 nm) utilizando un receptor adecuado. Algunas especies, en particular Anabaena flos-aquae, crecen bien con intensidades luminosas más bajas y pueden sufrir daños con intensidades superiores. Para tales especies debe elegirse una intensidad luminosa media en el intervalo de 40 a 60 μE · m– 2· s– 1. (Con instrumentos de medición de la luz calibrados en luxes, una gama equivalente de 4 440 a 8 880 lux con luz blanca fría corresponde aproximadamente a la intensidad luminosa recomendada de 60 a 120 μE · m– 2 · s– 1.) En toda la superficie de incubación debe mantenerse la intensidad luminosa dentro de un margen de ± 15 % respecto a la intensidad luminosa media.

Duración del ensayo

32.

La duración del ensayo es en principio de 72 horas. Sin embargo, pueden elegirse duraciones más largas o más breves, siempre que se puedan cumplir todos los criterios de validez del punto 11.

Mediciones y determinaciones analíticas

33.

La biomasa de las algas de cada matraz se determina al menos una vez al día mientras dure el ensayo. Si se toman con pipeta pequeños volúmenes de la solución problema para efectuar mediciones, dichos volúmenes no deben reponerse.

34.

La medición de la biomasa se efectúa por recuento manual de células con microscopio o bien con un contador electrónico de partículas (por recuento de células o biovolumen). Pueden utilizarse otras técnicas como, por ejemplo, la citometría de flujo, la fluorescencia clorofílica in vitro o in vivo (5) (6), o la densidad óptica, siempre que se pueda demostrar una correlación satisfactoria con la biomasa en todo el intervalo de biomasas correspondiente al ensayo.

35.

El pH de las soluciones debe medirse tanto al principio como al final del ensayo.

36.

Siempre que se disponga de un método analítico para la determinación de la sustancia problema en el intervalo de concentraciones utilizadas, debe procederse a analizar las soluciones problema para verificar las concentraciones iniciales y el mantenimiento de las concentraciones de exposición durante el ensayo.

37.

Puede ser suficiente analizar la concentración de la sustancia problema al inicio y al final del ensayo a una concentración de ensayo baja y a otra alta, así como a una concentración próxima a la EC50 prevista, si es probable que las concentraciones de exposición varíen durante el ensayo en menos del 20 % respecto a sus valores nominales. Se recomienda el análisis a todas las concentraciones de ensayo al inicio y al final del ensayo si es poco probable que las concentraciones permanezcan en la banda del 80 al 120 % de su valor nominal. En caso de sustancias problema que sean volátiles, inestables o se adsorban fuertemente, se recomienda tomar muestras adicionales para analizarlas a intervalos de 24 horas durante el período de exposición, a fin de definir mejor las pérdidas de sustancia problema. Para estas sustancias es posible que se necesiten más réplicas. En todos los casos, la determinación de las concentraciones de la sustancia problema solo tendrá que efectuarse en uno de los recipientes replicados de cada concentración de ensayo (o en los contenidos de los recipientes reunidos por replicado).

38.

Los medios de ensayo preparados específicamente para el análisis de las concentraciones de exposición durante el ensayo se tratarán de la misma forma que los empleados para el ensayo, es decir, se inocularán con algas y se incubarán en condiciones idénticas. Si hace falta analizar la concentración de la sustancia problema disuelta, puede ser necesario separar las algas del medio. Se recomienda hacer la separación por centrifugación con una fuerza g baja, suficiente para sedimentar las algas.

39.

Si está demostrado que la concentración de la sustancia problema se ha mantenido satisfactoriamente a lo largo de todo el ensayo dentro de un intervalo de ± 20 % de la concentración nominal o de la medida inicialmente, el análisis de los resultados puede basarse en los valores nominales o medidos inicialmente. Si la desviación respecto a la concentración nominal o medida inicialmente no está dentro del intervalo de ± 20 %, el análisis de los resultados debe basarse en la media geométrica de la concentración durante la exposición o en modelos que describan el descenso de la concentración de la sustancia problema (3) (7).

40.

El ensayo de inhibición del crecimiento de las algas es un sistema de ensayo más dinámico que la mayoría de los otros ensayos de toxicidad acuática a corto plazo. En consecuencia, puede ser difícil definir las concentraciones reales de exposición, especialmente cuando se estudian a baja concentración sustancias que se adsorben. En tales casos, la desaparición de la sustancia problema de la solución por su adsorción a la biomasa de las algas en aumento no significa que se haya separado del sistema de ensayo. Cuando se analice el resultado del ensayo, debe comprobarse si un descenso en la concentración de la sustancia problema a lo largo del ensayo va acompañado por un descenso de la inhibición del crecimiento. En caso afirmativo, puede estudiarse la aplicación de un modelo adecuado que describa el descenso de la concentración de la sustancia problema (7). En caso negativo, puede ser adecuado basar el análisis de los resultados en las concentraciones iniciales (nominales o medidas).

Otras observaciones

41.

Debe procederse a una observación microscópica para verificar que el aspecto del cultivo de inóculo es normal y sano y detectar un eventual aspecto anormal de las algas (que podría ser debido a la exposición a la sustancia problema) al final del ensayo.

Ensayo límite

42.

Bajo ciertas circunstancias, por ejemplo cuando un ensayo preliminar indica que la sustancia problema no tiene efectos tóxicos a concentraciones de hasta 100 mg/l, o hasta su límite de solubilidad en el medio de ensayo si este valor es más bajo, puede efectuarse un ensayo límite comparando las respuestas de un grupo de control y de un único grupo de tratamiento (100 mg/l o una concentración igual al límite de solubilidad). Se recomienda vivamente que esto se apoye en un análisis de la concentración de exposición. Todas las condiciones de ensayo y criterios de validez antes descritos son aplicables al ensayo límite, con la excepción de que el número de réplicas de tratamiento ha de ser como mínimo de seis. Las variables de respuesta en el grupo de control y en el de tratamiento pueden analizarse mediante un estudio estadístico para comparar las medias, por ejemplo una prueba t de Student. Si las varianzas de los dos grupos son desiguales, debe procederse a una prueba t ajustada para varianzas desiguales.

DATOS E INFORME

Trazado de las curvas de crecimiento

43.

La biomasa de los recipientes de ensayo puede expresarse en unidades del parámetro indicador utilizado para la medición (por ejemplo, número de células, fluorescencia).

44.

Ha de ponerse en un cuadro la concentración estimada de biomasa en los cultivos de ensayo y en los controles, junto con las concentraciones de la sustancia problema y los tiempos de las mediciones, registrados con una resolución mínima de horas completas, para trazar las curvas de crecimiento. En esta primera fase pueden ser útiles tanto las escalas logarítmicas como las lineales, pero las logarítmicas son obligatorias y en general presentan mejor las variaciones del ritmo de crecimiento durante el período de ensayo. Téngase en cuenta que el crecimiento exponencial da una línea recta cuando se representa en escala logarítmica, y que la inclinación de la línea (pendiente) indica la tasa de crecimiento específico.

45.

Utilizando las gráficas, ha de comprobarse si los cultivos de control crecen durante todo el ensayo exponencialmente y a la tasa prevista. Deben examinarse críticamente todos los puntos de datos y el aspecto de las gráficas, y ha de comprobarse que no hay errores en los datos en bruto ni en los procedimientos. Se deben comprobar en particular los puntos que parezcan desviarse por un error sistemático. Si está claro que pueden señalarse errores de procedimiento (o considerarse muy probable que los haya habido), el punto de datos concreto se marcará como anómalo y no se incluirá en el posterior análisis estadístico. (Una concentración de algas igual a cero en uno de dos o tres recipientes replicados puede indicar que el recipiente no se había inoculado correctamente, o que se había limpiado mal.) En el informe del ensayo deben constar claramente los motivos para rechazar un punto de datos por ser anómalo. Los motivos aceptados son solo los errores de procedimiento (raros), y no simplemente una mala precisión. Los métodos estadísticos para la detección de puntos anómalos tienen una utilidad limitada con este tipo de problema y no pueden sustituir al juicio de un experto. Es preferible mantener los puntos anómalos (señalados como tales) entre los puntos recogidos en cualquier presentación posterior de los datos en forma de gráfica o de cuadro.

Variables de respuesta

46.

El objetivo del ensayo es determinar los efectos de la sustancia problema sobre el crecimiento de las algas. El presente método de ensayo describe dos variables de respuesta, ya que las distintas jurisdicciones tienen distintas preferencias y necesidades reglamentarias. Para que los resultados del ensayo sean aceptables en todas las jurisdicciones, los efectos deben evaluarse utilizando las dos variables de respuesta a) y b) que se describen a continuación:

a)    Tasa media de crecimiento específico : esta variable de respuesta se calcula basándose en el aumento logarítmico de la biomasa durante el período de ensayo, expresado por día.

b)    Rendimiento : esta variable de respuesta es la biomasa al final del ensayo menos la biomasa al inicio.

47.

Ha de señalarse que los valores de toxicidad calculados a partir de estas dos variables de respuesta no son comparables y es necesario tener en cuenta esta diferencia cuando se utilicen los resultados del ensayo. Los valores de ECx basados en la tasa media de crecimiento específico (ErCx) son normalmente más elevados que los basados en el rendimiento (EyCx) si se respetan las condiciones del presente método de ensayo, debido al fundamento matemático de los planteamientos respectivos. Esto no debe interpretarse como una diferencia en la sensibilidad de las dos variables de respuesta, sino como una diferencia puramente matemática entre los valores. El concepto de tasa media de crecimiento específico se basa en el modelo general de crecimiento exponencial de las algas en cultivos no limitados, en el que la toxicidad se estima en función de los efectos sobre la tasa de crecimiento, sin depender del nivel absoluto de la tasa de crecimiento específico del control, de la pendiente de la curva concentración-respuesta ni de la duración del ensayo. Por el contrario, los resultados basados en la variable de respuesta “rendimiento” dependen de todas estas otras variables. La EyCx depende de la tasa de crecimiento específico de la especie de algas utilizada en cada ensayo y de la tasa máxima de crecimiento específico, que puede variar de una especie a otra e incluso de una cepa a otra. Esta variable de respuesta no debe utilizarse para comparar la sensibilidad de distintas especies o incluso distintas cepas ante un agente tóxico. Aunque científicamente se prefiere el uso de la tasa media de crecimiento específico para estimar la toxicidad, en el presente método de ensayo se incluye también la estimación a partir del rendimiento para cumplir los requisitos reglamentarios vigentes en ciertos países.

Tasa media de crecimiento

48.

La tasa media de crecimiento específico durante un período determinado se calcula como el incremento logarítmico de la biomasa en cada uno de los recipientes de control y de tratamiento, mediante la siguiente ecuación [1]:

Formula

[1],

donde:

μi – j

es la tasa media de crecimiento específico entre el tiempo i y el j;

Xi

es la biomasa en el tiempo i;

Xj

es la biomasa en el tiempo j.

Respecto a cada grupo de tratamiento y de control ha de calcularse un valor medio de la tasa de crecimiento y una estimación de la varianza.

49.

La tasa media de crecimiento específico a lo largo de toda la duración del ensayo (en principio, días 0-3) se calcula utilizando como valor inicial la biomasa teórica inoculada en vez de un valor inicial medido, ya que de esta manera puede obtenerse normalmente una precisión mayor. Si el equipo utilizado para la medición de la biomasa permite una determinación suficientemente precisa de la baja biomasa del inóculo (p. ej., citómetro de flujo), entonces puede utilizarse la concentración de biomasa inicial medida. También se determinará la tasa de crecimiento de cada sección, calculada como las tasas de crecimiento específico de cada día durante la realización del ensayo (días 0-1, 1-2 y 2-3) y se examinará si la tasa de crecimiento de los controles permanece constante (véanse los criterios de validez, punto 11). Una tasa específica de crecimiento del día 1 significativamente menor que la tasa media de crecimiento específico total puede indicar que hay una fase de latencia. Aunque es posible minimizar y eliminar prácticamente la fase de latencia en los cultivos de control mediante la propagación adecuada de un precultivo, una fase de latencia en los cultivos de tratamiento puede indicar que se produce una recuperación tras la agresión tóxica inicial o una reducción de la exposición por pérdida de sustancia problema (incluida la sorción en la biomasa de las algas) tras la exposición inicial. Por tanto, puede considerarse la tasa de crecimiento de cada sección para evaluar el efecto de la sustancia problema presente durante el período de exposición. Una diferencia importante entre la tasa de crecimiento de cada sección y la tasa media de crecimiento indica una desviación respecto al crecimiento exponencial constante e impone el examen en detalle de las curvas de crecimiento.

50.

El porcentaje de inhibición de la tasa de crecimiento de cada réplica de tratamiento se calcula con la siguiente ecuación [2]:

Formula

[2],

donde:

% Ir

es el porcentaje de inhibición de la tasa media de crecimiento específico;

μC

es el valor promedio de la tasa media de crecimiento específico (μ) en el grupo de control;

μT

es la tasa media de crecimiento específico en la réplica de tratamiento.

51.

Si se utilizan disolventes en la preparación de las soluciones problema, para el cálculo del porcentaje de inhibición deben emplearse controles con disolvente en vez de controles sin disolvente.

Rendimiento

52.

El rendimiento se calcula restando a la biomasa presente al final del ensayo la biomasa presente al inicio en cada recipiente de los controles y de los tratamientos. Respecto a cada concentración de ensayo y control ha de calcularse un valor promedio del rendimiento con una estimación de la varianza. El porcentaje de inhibición del rendimiento ( % Iy) puede calcularse de la manera siguiente con cada réplica de tratamiento:

Formula

[3],

donde:

% Iy

es el porcentaje de inhibición del rendimiento;

YC

es el valor promedio del rendimiento en el grupo de control;

YT

es el valor del rendimiento en la réplica de tratamiento.

Trazado de la curva concentración-respuesta

53.

Se representa el porcentaje de inhibición frente al logaritmo de la concentración de sustancia problema y se examina la gráfica obtenida, desechando los puntos de datos que se hayan marcado como anómalos en la primera fase. Se ajusta una línea regular a los puntos de datos, visualmente o mediante interpolación con ordenador, para obtener una primera impresión de la relación concentración-respuesta; después se aplica un método más detallado, de preferencia uno estadístico informatizado. En función del uso previsto de los datos, de la calidad (precisión) y cantidad de los mismos, así como de la disponibilidad de herramientas de análisis de los datos, puede decidirse (y a veces justificarse plenamente) terminar en esta fase el análisis de los datos para leer simplemente las cifras clave EC50 y EC10 (o EC20) a partir de la curva ajustada visualmente (véase también el punto siguiente sobre los efectos de estimulación). Pueden considerarse válidas las siguientes razones para no utilizar un método estadístico:

Los datos no son adecuados para producir, con métodos informatizados, resultados más fiables que los obtenidos por el juicio de un experto; en tales situaciones, es posible incluso que algunos programas informáticos no puedan proporcionar una solución fiable (las iteraciones pueden no converger, etc.).

Las respuestas de estimulación del crecimiento no pueden tratarse adecuadamente con los programas informáticos disponibles (véase más abajo).

Procedimientos estadísticos

54.

El objetivo es obtener una relación concentración-respuesta cuantitativa mediante análisis de regresión. Es posible utilizar una regresión lineal ponderada después de haber efectuado una transformación linealizante de los datos de respuesta como, por ejemplo, en probit o logit o unidades Weibull (8), pero son preferibles los procedimientos de regresión no lineal porque con ellos se tratan mejor las inevitables irregularidades de los datos y las desviaciones respecto a distribuciones regulares. Si la inhibición está próxima al 0 o al 100 %, la transformación puede magnificar tales irregularidades, interfiriendo así con el análisis (8). Debe señalarse que los métodos normales de análisis que utilizan las transformaciones en probit, logit o de Weibull están previstos para aplicarse a datos cuánticos (por ejemplo, mortalidad o supervivencia), y que es necesario modificarlos para aplicarlos a datos de crecimiento o biomasa. En las referencias (9), (10) y (11) pueden encontrarse métodos específicos de determinación de los valores de ECx a partir de datos continuos. En el apéndice 5 se da más información sobre el uso del análisis de regresión no lineal.

55.

Respecto a cada variable de respuesta que haya de analizarse, se utilizará la relación concentración-respuesta para calcular estimaciones puntuales de los valores de ECx. Cuando sea posible, se determinarán los límites de confianza del 95 % de cada estimación. La bondad del ajuste de los datos de respuesta al modelo de regresión se evaluará de forma gráfica o estadística. El análisis de regresión se efectuará utilizando las respuestas de las distintas réplicas y no los promedios de los grupos de tratamiento. Si, no obstante, es difícil o imposible el ajuste de una curva no lineal, debido a una dispersión demasiado grande de los datos, el problema puede evitarse efectuando la regresión con promedios de grupos como forma práctica de reducir la influencia de los puntos anómalos sospechados. El recurso a esta opción debe indicarse en el informe del ensayo como desviación del procedimiento normal porque el ajuste de la curva con los valores de las distintas réplicas no llevaba a un buen resultado.

56.

Las estimaciones de la EC50 y los límites de confianza pueden obtenerse también utilizando la interpolación lineal con remuestreo (bootstrapping) (13) si los métodos o modelos de regresión disponibles no son adecuados para los datos.

57.

Para la estimación de los valores de LOEC y, por tanto, de NOEC, en relación con los efectos de la sustancia problema sobre la tasa de crecimiento, es necesario comparar los promedios de tratamiento utilizando técnicas de análisis de la varianza (ANOVA). A continuación se ha de comparar el promedio obtenido a cada concentración con el del control, aplicando un método apropiado de comparación múltiple o de prueba de tendencia. Pueden ser útiles las pruebas de Dunnett o Williams (12) (14) (15) (16) (17). Hay que comprobar si se sostiene la hipótesis del ANOVA de homogeneidad de la varianza. Esta comprobación puede realizarse gráficamente o mediante una prueba en regla (17). Son adecuadas las pruebas de Levene o Bartlett. El incumplimiento de la hipótesis de homogeneidad de las varianzas puede corregirse a veces mediante la transformación logarítmica de los datos. Si la heterogeneidad de la varianza es extrema y no puede corregirse mediante transformación, ha de considerarse la posibilidad de efectuar un análisis por métodos como las pruebas de tendencia de Jonkheere de ajuste secuencial. En (11) puede encontrarse más información sobre la determinación de la NOEC.

58.

Los recientes avances científicos han llevado a recomendar el abandono del concepto de NOEC para sustituirlo por el de estimaciones puntuales de ECx basadas en la regresión. Aún no se ha determinado un valor adecuado de x para esta prueba con algas. Parece que es apropiado el intervalo del 10 al 20 % (según la variable de respuesta elegida) y lo mejor es indicar tanto la EC10 como la EC20.

Estimulación del crecimiento

59.

A veces se observa una estimulación del crecimiento (inhibición negativa) a bajas concentraciones. Esto puede deberse a la hormesis (“estimulación tóxica”) o a la adición de factores estimulantes del crecimiento al poner el material problema en el medio mínimo utilizado. Téngase en cuenta que la adición de nutrientes inorgánicos no debería tener ningún efecto directo porque el medio de ensayo ha de presentar un exceso de nutrientes a lo largo de todo ensayo. Normalmente, la estimulación a dosis bajas puede ignorarse al calcular la EC50, salvo en casos extremos. Sin embargo, cuando sea extrema o deba calcularse un valor de ECx para una x baja, puede ser necesario aplicar algún procedimiento especial. Siempre que sea posible debe evitarse la eliminación de las respuestas de estimulación del análisis de datos, y, si los programas informáticos disponibles para el ajuste de las curvas no son capaces de aceptar una estimulación poco importante, puede utilizarse la interpolación lineal con remuestreo (bootstrapping). Si la estimulación es extrema, puede considerarse la aplicación de un modelo de hormesis (18).

Inhibición del crecimiento de origen no tóxico

60.

Los materiales problema que absorben la luz pueden producir una reducción de la tasa de crecimiento porque el sombreado que provocan reduce la cantidad disponible de luz. Tales efectos de tipo físico deben distinguirse de los efectos tóxicos mediante la modificación de las condiciones del ensayo y deben figurar aparte en los informes. Puede encontrarse información al respecto en las referencias (2) y (3).

INFORME DEL ENSAYO

61.

El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

 

Sustancia problema:

naturaleza física y propiedades fisicoquímicas pertinentes, incluido el límite de hidrosolubilidad,

datos de identificación de la sustancia (por ejemplo, número CAS), incluida la pureza (impurezas).

 

Especie de ensayo:

cepa, proveedor u origen y condiciones de cultivo aplicadas.

 

Condiciones de ensayo:

fecha de inicio y duración del ensayo;

descripción del diseño del ensayo: recipientes de ensayo, volúmenes de cultivo, densidad de biomasa al inicio del ensayo,

composición del medio,

concentraciones de ensayo y réplicas (por ejemplo, número de réplicas en paralelo, número de concentraciones de ensayo y progresión geométrica utilizada),

descripción de la preparación de las soluciones de ensayo, incluido el uso de disolventes, etc.,

dispositivo de cultivo,

intensidad y calidad de la luz (fuente, homogeneidad),

temperatura,

concentraciones estudiadas: concentraciones nominales de ensayo y eventuales resultados de análisis para determinar la concentración de la sustancia problema en los recipientes de ensayo; deben comunicarse la eficiencia de recuperación del método y el límite de cuantificación de la matriz de ensayo,

todas las desviaciones respecto al presente método de ensayo,

método de determinación de la biomasa y pruebas de la correlación entre el parámetro medido y el peso seco.

 

Resultados:

valores de pH al inicio y al final del ensayo en todos los recipientes de tratamiento,

biomasa de cada matraz en cada punto de medida y método de medición de la biomasa,

curvas de crecimiento (gráfica de la biomasa frente al tiempo),

variables de respuesta calculadas de cada réplica de tratamiento, con valores medios y coeficiente de variación de las réplicas;

representación gráfica de la relación concentración-efecto,

estimaciones de la toxicidad correspondientes a las variables de respuesta como, p. ej., EC50, EC10, EC20, e intervalos de confianza asociados; en caso de que se calculen la LOEC y la NOEC, se indicarán sus valores y los métodos estadísticos utilizados en su determinación,

si se ha utilizado el ANOVA, el tamaño del efecto que puede observarse (por ejemplo, la diferencia significativa mínima),

la eventual estimulación del crecimiento que se haya observado en cualquier recipiente de tratamiento;

cualquier otro efecto observado como, por ejemplo, cambios morfológicos de las algas,

discusión de los resultados, incluida la eventual influencia que tengan sobre ellos las desviaciones respecto al presente método de ensayo.

BIBLIOGRAFÍA

(1)

Organización Internacional de Normalización (1993). ISO 8692. Calidad del agua. Ensayo de inhibición del crecimiento de algas.

(2)

Organización Internacional de Normalización (1998). ISO/DIS 14442. Calidad del agua. Guía general para los ensayos de inhibición del crecimiento de algas con materiales poco solubles, compuestos volátiles, metales y agua residual.

(3)

OCDE (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, No. 23. Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos, París.

(4)

Organización Internacional de Normalización (1998). ISO 5667-16: Calidad del agua. Muestreo. Parte 16: Orientaciones sobre el bioensayo de las muestras.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.

(6)

Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925.

(7)

Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L., and Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Microbiol. Lett., Suppl. Chem. 22: 2073-2079.

(8)

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713-718.

(9)

Nyholm, N., Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.

(10)

Bruce, R.D. and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485-1494.

(11)

OCDE (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos, París.

(12)

Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121.

(13)

Norberg-King, T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.

(15)

Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.

(16)

Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.

(17)

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, Nueva York.

(18)

Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

Apéndice 1

Definiciones

En relación con el presente método de ensayo se aplicarán las siguientes definiciones y abreviaturas:

Biomasa : peso seco de materia viva presente en una población y expresado en términos de un volumen dado como, por ejemplo, mg de algas por litro de solución problema. Generalmente, la “biomasa” se define como masa, pero en este ensayo la palabra se refiere a masa por volumen. También en este ensayo, lo que se mide normalmente son indicadores de la biomasa, como recuentos celulares, fluorescencia, etc., por lo que el término de “biomasa” se refiere también a estos indicadores.

Sustancia : sustancia o mezcla.

Coeficiente de variación : medida adimensional de la variabilidad de un parámetro, definida como el cociente entre la desviación típica y la media. Puede expresarse también como valor porcentual. El valor promedio del coeficiente de variación de una tasa media de crecimiento específico en cultivos de control replicados (en paralelo) debe calcularse de la manera siguiente:

1.

Se calcula el coeficiente de variación porcentual de la tasa media de crecimiento específico a partir de las tasas de crecimiento diarias (de cada sección) en las réplicas respectivas.

2.

Se calcula el valor medio de todos los valores calculados según el guion anterior para obtener el coeficiente medio de variación de la tasa de crecimiento específico diaria (de cada sección) en las réplicas de los cultivos de control.

ECx : concentración de la sustancia problema disuelta en el medio de ensayo que produce una reducción del x % (por ejemplo, del 50 %) en el crecimiento del organismo de ensayo dentro de un plazo de exposición definido (que debe indicarse explícitamente si es distinto de la duración completa o normal del ensayo). Para expresar de forma inequívoca el valor de EC obtenido a partir de la tasa de crecimiento o del rendimiento, se usan respectivamente los símbolos “ErC” y “EyC”.

Medio de cultivo : medio de cultivo sintético y completo en que crecen las algas del ensayo cuando se exponen a la sustancia problema. Esta se disuelve en principio en el medio de ensayo.

Tasa de crecimiento (tasa media de crecimiento específico): aumento logarítmico de la biomasa durante el período de exposición.

Concentración mínima con efecto observado (LOEC) : concentración estudiada mínima a la que se observa que la sustancia ejerce un efecto estadísticamente significativo de reducción del crecimiento (con p < 0,05) cuando se compara con el control, dentro de un tiempo de exposición dado. Sin embargo, es necesario también que todas las concentraciones de ensayo superiores a la LOEC ejerzan un efecto nocivo superior o igual al que se observa con dicha concentración. Si no se cumplen estas dos condiciones, es preciso dar una explicación completa sobre cómo se ha elegido la LOEC (y, por tanto, la NOEC).

Concentración sin efecto observado (NOEC) : concentración estudiada que se encuentra inmediatamente por debajo de la LOEC.

Variable de respuesta : variable para la estimación de la toxicidad derivada de cualquier parámetro medido que describa la biomasa por distintos métodos de cálculo. A efectos del presente método, las tasas de crecimiento y el rendimiento son variables de respuesta obtenidas midiendo la biomasa directamente o bien mediante alguno de los parámetros indicadores mencionados.

Tasa de crecimiento específico : variable de respuesta definida como el cociente de la diferencia de los logaritmos neperianos de un parámetro de observación (en el presente método de ensayo, la biomasa) y el respectivo plazo de tiempo.

Sustancia problema : sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.

Rendimiento : valor de una variable de medición al final del período de exposición menos el valor de la variable de medición al inicio del período de exposición; indica el aumento de biomasa durante el ensayo.

Apéndice 2

Cepas conocidas por ser adecuadas para el ensayo

Algas verdes

 

Pseudokirchneriella subcapitata (antes conocida como Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG

 

Desmodesmus subspicatus (antes conocida como Scenedesmus subspicatus) 86.81 SAG

Diatomeas

Navicula pelliculosa, UTEX 664

Cianobacterias

 

Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A

 

Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1

Orígenes de las cepas

Las cepas recomendadas pueden conseguirse en forma de cultivos procedentes de una sola célula de alga en las siguientes colecciones (por orden alfabético):

 

ATCC: American Type Culture Collection

10801 University Boulevard

Manassas, Virginia 20110-2209

Estados Unidos

 

CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa

Institute of Freshwater Ecology

Windermere Laboratory

Far Sawrey, Amblerside

Cumbria LA22 0LP

Reino Unido

 

SAG: Collection of Algal Cultures

Inst. Plant Physiology

Universität Göttingen

Nikolausberger Weg 18

37073 Gotinga

ALEMANIA

 

UTEX Culture Collection of Algae

Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology

School of Biological Sciences

The University of Texas at Austin

Austin, Tejas 78712

EE.UU.

Aspecto y características de las especies recomendadas

 

P. subcapitata

D. subspicatus

N. pelliculosa

A. flos-aquae

S. leopoliensis

Aspecto

Células curvadas y retorcidas, aisladas

Células ovales, en su mayoría aisladas

Barras o varillas

Cadenas de células ovales

Barras o varillas

Tamaño (longitud × anchura) μm

8-14 × 2-3

7-15 × 3-12

7,1 × 3,7

4,5 × 3

6 × 1

Volumen celular (μm3/célula)

40-60 (2)

60-80 (2)

40-50 (2)

30-40 (2)

2,5 (3)

Peso seco celular (mg/célula)

2-3 × 10– 8

3-4 × 10– 8

3-4 × 10– 8

1-2 × 10– 8

2-3 × 10– 9

Tasa de crecimiento (4) (día– 1)

1,5-1,7

1,2-1,5

1,4

1,1-1,4

2,0-2,4

Recomendaciones específicas de cultivo y manipulación de las especies de ensayo recomendadas

Pseudokirchneriella subcapitata y Desmodesmus subspicatus

Generalmente es fácil mantener estas algas verdes en diversos medios de cultivo. Las colecciones de cultivos proveen de información sobre los medios adecuados. Las células están normalmente aisladas, y las mediciones de la densidad celular pueden efectuarse fácilmente con un contador electrónico de partículas o un microscopio.

Anabaena flos-aquae

Pueden utilizarse diversos medios de cultivo para mantener un cultivo madre. Es especialmente importante evitar que el cultivo discontinuo pase de la fase logarítmica de crecimiento al renovarse, ya que la recuperación es difícil después.

Anabaena flos-aquae forma agregados de cadenas encajadas de células. El tamaño de estos agregados puede cambiar según las condiciones de cultivo. Puede ser necesario romper estos agregados si, para determinar la biomasa, se hace un recuento con microscopio o se utiliza un contador electrónico de partículas.

Es posible someter submuestras a un baño de ultrasonidos para romper las cadenas, a fin de reducir la variabilidad del recuento. Si el baño dura más tiempo del necesario para romper las cadenas en segmentos más cortos, puede que se destruyan las células. La intensidad y la duración del baño de ultrasonidos deben ser las mismas con todos los recipientes de tratamiento.

Debe contarse un número suficiente de campos en el hemocitómetro (al menos 400 células) para compensar la variabilidad. Así mejora la fiabilidad de las determinaciones de densidad efectuadas con el microscopio.

Para la determinación del volumen celular total de Anabaena puede utilizarse un contador electrónico de partículas tras romper las cadenas de células mediante un baño de ultrasonidos aplicado cuidadosamente. Es necesario ajustar la energía de los ultrasonidos para evitar destruir las células.

Utilícese un agitador vórtex o un método similar adecuado a fin de que la suspensión de algas utilizada para inocular los recipientes de ensayo esté bien mezclada y sea homogénea.

Los recipientes de ensayo deben colocarse en un agitador orbital o recíproco, a unas 150 revoluciones por minuto. Otra posibilidad es utilizar una agitación intermitente para reducir la tendencia de Anabaena a agregarse. Si se produce la agregación, hay que tener cuidado para tomar muestras representativas con el fin de medir la biomasa. Para romper los agregados de algas puede ser necesario agitar vigorosamente antes de tomar la muestra.

Synechococcus leopoliensis

Pueden utilizarse diversos medios de cultivo para mantener un cultivo madre. Las colecciones de cultivos proveen de información sobre los medios adecuados.

Synechococcus leopoliensis crece en forma de células aisladas de forma cilíndrica. Las células son muy pequeñas, lo que hace difícil utilizar el recuento con microscopio para medir la biomasa. Son útiles los contadores electrónicos de partículas equipados para contar partículas de hasta un tamaño aproximado de 1 μm. También puede aplicarse la técnica de medición fluorométrica in vitro.

Navicula pelliculosa

Pueden utilizarse diversos medios de cultivo para mantener un cultivo madre. Las colecciones de cultivos proveen de información sobre los medios adecuados. Obsérvese el requisito de que el medio tenga silicato.

Navicula pelliculosa puede formar agregados en ciertas condiciones de crecimiento. Debido a la producción de lípidos, las células de las algas tienden a veces a acumularse en la película superficial. En tales circunstancias, hay que adoptar medidas especiales cuando se toman submuestras para la determinación de la biomasa a fin de que las muestras sean representativas. Puede ser necesario agitar enérgicamente, por ejemplo utilizando un mezclador vórtex.

Apéndice 3

Medios de cultivo

Puede utilizarse uno de los dos medios de cultivo siguientes:

Medio de la OCDE: medio original de las directrices de ensayo de la OCDE TG 201, también de acuerdo con la norma ISO 8692

Medio AAP de la EPA de Estados Unidos, también de acuerdo con la ASTM.

Para preparar estos medios deben utilizarse sustancias de grado analítico o reactivo y agua desionizada.

Composición del medio AAP (EPA de Estados Unidos) y del medio OCDE TG 201

Componente

AAP

OCDE

 

mg/l

mM

mg/l

mM

NaHCO3

15,0

0,179

50,0

0,595

NaNO3

25,5

0,300

 

 

NH4Cl

 

 

15,0

0,280

MgCl2 · 6(H2O)

12,16

0,0598

12,0

0,0590

CaCl2 · 2(H2O)

4,41

0,0300

18,0

0,122

MgSO4 · 7(H2O)

14,6

0,0592

15,0

0,0609

K2HPO4

1,044

0,00599

 

 

KH2PO4

 

 

1,60

0,00919

FeCl3 · 6(H2O)

0,160

0,000591

0,0640

0,000237

Na2EDTA · 2(H2O)

0,300

0,000806

0,100

0,000269*

H3BO3

0,186

0,00300

0,185

0,00299

MnCl2 · 4(H2O)

0,415

0,00201

0,415

0,00210

ZnCl2

0,00327

0,000024

0,00300

0,0000220

CoCl2 · 6(H2O)

0,00143

0,000006

0,00150

0,00000630

Na2MoO4 · 2(H2O)

0,00726

0,000030

0,00700

0,0000289

CuCl2 · 2(H2O)

0,000012

0,00000007

0,00001

0,00000006

pH

7,5

8,1

La proporción molar del EDTA respecto al hierro sobrepasa ligeramente la unidad. Así se evita la precipitación del hierro y, a la vez, se reduce al mínimo la quelación de iones de metales pesados.

En el ensayo con la diatomea Navicula pelliculosa, ambos medios deben recibir un suplemento de Na2SiO3 · 9H20 para obtener una concentración de 1,4 mg Si/l.

El pH del medio se mide cuando se ha alcanzado el equilibrio entre el carbonato del medio y la presión parcial de CO2 del aire atmosférico. He aquí la relación aproximada entre el pH a 25 °C y la concentración molar de bicarbonato:

pHeq = 11,30 + log [HCO3]

Con 15 mg NaHCO3/l, pHeq = 7,5 (medio de la EPA de Estados Unidos) y con 50 mg NaHCO3/l, pHeq = 8,1 (medio de la OCDE).

Composición en elementos de los medios de ensayo

Elemento

AAP

OCDE

 

mg/l

mg/l

C

2,144

7,148

N

4,202

3,927

P

0,186

0,285

K

0,469

0,459

Na

11,044

13,704

Ca

1,202

4,905

Mg

2,909

2,913

Fe

0,033

0,017

Mn

0,115

0,115

Preparación del medio de la OCDE

Nutriente

Concentración en la solución madre

Solución madre 1:

macronutrientes

NH4Cl

1,5 g/l

MgCl2 · 6H2O

1,2 g/l

CaCl2 · 2H2O

1,8 g/l

MgSO4 · 7H2O

1,5 g/l

KH2PO4

0,16 g/l

Solución madre 2:

hierro

FeCl3 · 6H2O

64 mg/l

Na2EDTA · 2H2O

100 mg/l

Solución madre 3:

oligoelementos

H3BO3

185 mg/l

MnCl2 · 4H2O

415 mg/l

ZnCl2

3 mg/l

CoCl2 · 6H2O

1,5 mg/l

CuCl2 · 2H2O

0,01 mg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7 mg/l

Solución madre 4:

bicarbonato

NaHCO3

50 g/l

Na2SiO3 · 9H20

 

Las soluciones madre se esterilizan mediante filtración por membrana (diámetro medio de poro 0,2 μm) o en autoclave (120 °C, 15 min). Las soluciones se guardan en la oscuridad a 4 °C.

Las soluciones madre 2 y 4 no deben esterilizarse en autoclave, sino mediante filtración por membrana.

El medio de cultivo se prepara añadiendo a agua un volumen adecuado de las soluciones madre 1 a 4:

 

A 500 ml de agua esterilizada se añaden:

 

10 ml de solución madre 1,

 

1 ml de solución madre 2,

 

1 ml de solución madre 3,

 

1 ml de solución madre 4,

 

Se enrasa a 1 000 ml con agua esterilizada.

Hay que dejar un tiempo suficiente para que el medio llegue al equilibrio con el CO2 de la atmósfera, en caso necesario burbujeando durante varias horas aire esterilizado por filtración.

Preparación del medio de la EPA de Estados Unidos

1.

Se añade 1 ml de cada solución madre de 2.1-2.7 a unos 900 ml de agua destilada o desionizada y después se diluye hasta 1 litro.

2.

Se preparan soluciones madre de macronutrientes disolviendo las siguientes sustancias en 500 ml de agua destilada o desionizada. Los reactivos 2.1, 2.2, 2.3 y 2.4 pueden combinarse en una única solución madre.

2.1.

NaNO3

12,750 g

2.2.

MgCl2 · 6H2O

6,082 g

2.3.

CaCl2 · 2H2O

2,205 g

2.4.

Solución madre de micronutrientes (véase 3).

2.5.

MgSO4 · 7H2O

7,350 g

2.6.

K2HPO4

0,522 g

2.7.

NaHCO3

7,500 g

2.8.

Na2SiO3 · 9H20

Véase la nota 1.

Nota 1: Utilícese solo para el ensayo con especies de diatomeas. Puede añadirse directamente (202,4 mg) o en forma de solución madre para dar una concentración final de Si en el medio de 20 mg/l.

3.

La solución madre de micronutrientes se prepara disolviendo las siguientes sustancias en 500 ml de agua destilada o desionizada:

3.1.

H3BO3

92,760 mg

3.2.

MnCl2 · 4H2O

207,690 mg

3.3.

ZnCl2

1,635 mg

3.4.

FeCl3 · 6H2O

79,880 mg

3.5.

CoCl2 · 6H2O

0,714 mg

3.6.

CaCl4 · 2H2O

3,630 mg

3.7.

CuCl2 · 2H2O

0,006 mg

3.8.

Na2EDTA · 2H2O

150,000 mg [(etilendinitrilo)tetraacetato de disodio].

3.9.

Na2SeO4 · 5H2O

0,005 mg. Véase la nota 2.

Nota 2: Utilícese solo en el medio para los cultivos madre de especies de diatomeas.

4.

Se ajusta el pH a 7,5 ± 0,1 con NaOH o HCl 0,1 N o 1,0 N.

5.

Se pasan los medios a un recipiente estéril a través de un filtro de membrana de 0,22 μm si se va a utilizar un contador de partículas o de un filtro de 0,45 μm en caso contrario.

6.

Los medios se guardan en la oscuridad a unos 4 °C hasta que se vayan a utilizar.

Apéndice 4

Ejemplo de procedimiento para el cultivo de algas

Observaciones generales

El objetivo del cultivo mediante el siguiente procedimiento es el de obtener cultivos de algas para ensayos de toxicidad.

Utilícense métodos apropiados que garanticen que los cultivos de algas no están infectados con bacterias. Puede ser conveniente utilizar cultivos axénicos, pero se deben obtener y utilizar cultivos procedentes de una sola célula de alga.

Todas las operaciones deben llevarse a cabo en condiciones estériles, con el fin de evitar la contaminación con bacterias u otras algas.

Equipo y material

Véase el epígrafe “Equipo” del método de ensayo.

Procedimiento para la obtención de algas

Preparación de soluciones nutritivas (medios)

Todas las sales nutrientes del medio se preparan como soluciones madre concentradas y se mantienen en lugar fresco y oscuro. Estas soluciones se esterilizan por filtración o en autoclave.

El medio se prepara añadiendo a agua destilada estéril la cantidad correcta de solución madre, teniendo cuidado de que no se produzca ninguna contaminación. Para conseguir un medio sólido se añade un 0,8 % de agar.

Cultivos madre

Los cultivos madre son pequeños cultivos de algas que se trasfieren periódicamente a un medio fresco para hacer de material inicial del ensayo. Si los cultivos no se utilizan regularmente, se extienden en tubos de agar inclinado. Estos cultivos se transfieren a medio fresco al menos cada dos meses.

Los cultivos madre se cultivan en matraces Erlenmeyer que contienen un volumen de unos 100 ml de medio apropiado. Cuando las algas se incuban a 20 °C con iluminación continua, será necesario hacer una transferencia semanal.

En este pase se transfiere una cantidad del cultivo “viejo” con pipetas estériles a un matraz de medio fresco, de forma que la concentración inicial en caso de una especie de rápido crecimiento sea unas 100 veces menor que en el cultivo viejo.

La tasa de crecimiento de una especie puede determinarse a partir de la curva de crecimiento. Si se conoce, será posible calcular la densidad a la cual deberá transferirse el cultivo al medio nuevo. Esto deberá realizarse antes de que el cultivo alcance su fase letal.

Precultivo

El objetivo del precultivo es obtener una cantidad apropiada de algas para la inoculación de los cultivos de ensayo. Dicho precultivo debe incubarse en las condiciones del ensayo y utilizarse cuando esté aún en fase de crecimiento exponencial, normalmente después de un período de incubación de 2 a 4 días. Si los cultivos de algas contienen células deformadas o anormales, deberán eliminarse.

Apéndice 5

Análisis de datos por regresión no lineal

Consideraciones generales

La respuesta en los ensayos con algas y otros ensayos de crecimiento microbiano (incremento de biomasa) es por su naturaleza una variable continua o métrica: la tasa de un proceso si se utiliza la tasa de crecimiento, o su integral a lo largo del tiempo si se elige la biomasa. Ambas tienen como referencia la respuesta promedio correspondiente de unos controles no expuestos, en réplicas paralelas, que muestran una respuesta máxima en las condiciones aplicadas, siendo la luz y la temperatura los principales factores que influyen en el ensayo de las algas. El sistema es distribuido u homogéneo y la biomasa puede considerarse como un continuo sin tener en cuenta las células en sí. La distribución de la varianza del tipo de respuesta de un sistema de estas características depende solo de los factores experimentales (lo que se describe típicamente con una distribución de errores normal o logarítmico-normal). Esto contrasta con las respuestas típicas de bioensayos con datos cuánticos, respecto a los cuales se supone con frecuencia que el componente dominante de la varianza es la tolerancia (con una distribución típicamente binomial) de cada uno de los organismos. Las respuestas del control en este caso son nulas o están a nivel de fondo.

En la situación sin complicación, la respuesta normalizada o relativa, r, disminuye de forma monótona desde 1 (inhibición nula) hasta 0 (inhibición del 100 %). Obsérvese que todas las respuestas tienen un error asociado, y que es posible calcular inhibiciones negativas aparentes solo como resultado de errores aleatorios.

Análisis de regresión

Modelos:

El objeto de un análisis de regresión es describir cuantitativamente la curva concentración-respuesta en forma de una función de regresión matemática Y = f (C) o, más frecuentemente, F (Z), donde Z = log C. De forma inversa C = f– 1 (Y) permite calcular valores de ECx, como las EC50, EC10 y EC20, y sus límites de confianza del 95 %. Se ha visto que algunas funciones matemáticas simples describen bien las relaciones concentración-respuesta obtenidas en los ensayos de inhibición del crecimiento de las algas. Entre estas funciones figuran, por ejemplo, la ecuación logística, la ecuación asimétrica de Weibull y la función de distribución logarítmico-normal, todas las cuales son curvas sigmoideas que se aproximan asintóticamente a cero cuando C → 0, y a uno cuando C → infinito.

Recientemente se ha propuesto el uso de modelos de función de umbral continua (por ejemplo, el modelo de Kooijman “de inhibición del crecimiento de la población”, Kooijman et al., 1996) como alternativa a los modelos asintóticos Este modelo supone que no hay efectos a concentraciones por debajo de cierto umbral, EC0+, que se estima mediante extrapolación de la relación concentración-respuesta hasta su intersección con el eje de las concentraciones utilizando una función continua simple que no es diferenciable en el punto inicial.

Obsérvese que el análisis puede ser una simple minimización de las sumas de los cuadrados residuales (suponiendo una varianza constante) o cuadrados ponderados si se compensa la heterogeneidad de la varianza.

Procedimiento

El procedimiento puede describirse de la manera siguiente. Se selecciona una ecuación funcional apropiada, Y = f (C), y se ajusta a los datos mediante regresión no lineal. Es mejor utilizar las mediciones de cada matraz en lugar de los promedios de las réplicas, a fin de obtener de los datos el máximo de información posible. Por otra parte, si la varianza es alta, la experiencia práctica sugiere que los valores promedios de las réplicas pueden dar una estimación matemática más sólida, menos influida por los errores sistemáticos de los datos, que si se atiende a cada uno de los puntos de datos.

Se representan la curva ajustada y los datos medidos, y se examina si es adecuado el ajuste de la curva. El análisis de los valores residuales puede ser una herramienta muy útil a este respecto. Si la relación funcional elegida para ajustar la relación concentración-respuesta no describe bien toda la curva o alguna parte fundamental de ella, como la respuesta a concentraciones bajas, debe elegirse otra opción de ajuste de la curva como, por ejemplo, una curva asimétrica del tipo de la función de Weibull, en lugar de una simétrica. Las inhibiciones negativas pueden ser un problema, por ejemplo con la función de distribución logarítmico-normal, y también en este caso ha de aplicarse otra función de regresión. No se recomienda asignar un valor cero ni uno positivo pequeño a tales valores negativos porque así se distorsiona la distribución del error. Puede ser adecuado hacer ajustes distintos en partes de la curva tales como la de inhibición baja para calcular ECx con bajos valores de x. A partir de la ecuación ajustada se calculan [por “estimación inversa”, C = f– 1(Y)] unas estimaciones de varias ECx en puntos característicos y se comunican como mínimo las estimaciones de EC50 y de una o dos ECx con x bajo. La experiencia en la práctica demuestra que la precisión del ensayo de las algas suele permitir una estimación razonablemente exacta del nivel de inhibición del 10 % si hay suficientes puntos de datos, salvo que haya estimulación a bajas concentraciones, lo que sería un factor de confusión. La precisión de una estimación de EC20 suele ser bastante mejor que la de una EC10, porque la EC20 suele corresponder a la parte aproximadamente lineal del centro de la curva concentración-respuesta. A veces es difícil interpretar la EC10 debido a una estimulación del crecimiento. Así pues, aunque la EC10 se puede obtener normalmente con suficiente exactitud, se recomienda asimismo indicar siempre la EC20.

Factores de ponderación

La varianza experimental no es constante en general e incluye típicamente un componente proporcional, por lo que es mejor efectuar sistemáticamente una regresión ponderada. Se acepta normalmente que los factores de ponderación de un análisis de este tipo son inversamente proporcionales a la varianza:

Wi = 1/Var(ri)

Muchos programas de regresión permiten la opción de hacer un análisis de regresión ponderada con los factores de ponderación incluidos en un cuadro. Es conveniente normalizar los factores de ponderación multiplicándolos por n/Σ wi (n es el número de puntos de datos) de forma que su suma sea igual a uno.

Respuestas de normalización

La normalización por la respuesta promedio de control plantea varios problemas de principio y ocasiona una estructura de varianza bastante compleja. Al dividir las respuestas por la respuesta promedio del control para obtener el porcentaje de inhibición, se introduce un error más debido al error del promedio del control. Salvo que este error sea despreciable, es necesario corregir los factores de ponderación de la regresión y los límites de confianza para tener en cuenta la covarianza con el control (Draper y Smith, 1981). Obsérvese que es importante una elevada precisión del promedio estimado de la respuesta del control a fin de minimizar la varianza general de la respuesta relativa. La varianza se indica a continuación:

(el subíndice i se refiere al nivel de concentración i y el subíndice 0 a los controles)

Yi = Respuesta relativa = ri/r0 = 1 – I = f(Ci)

con una varianza Var(Y i) = Var( ri/r0) ≅ (∂Yi / ∂ ri)2 · Var(ri) + ((∂ Yi/ ∂ r0)2 · Var(r0)

y como (∂ Yi/ ∂ ri) = 1/r0 y (∂ Y i/ ∂ r0) = ri/r0 2

con una distribución normal de los datos y las réplicas mi y m0: Var(ri ) = σ2/mi

la varianza total de la respuesta relativa, Yi, se convierte entonces en:

Var(Yi) = σ2/(r0 2 · mi) + ri 2 · σ2/r0 4 · m0

El error en el promedio del control es inversamente proporcional a la raíz cuadrada del número de réplicas del control contabilizadas para la media, y a veces se puede justificar la inclusión de datos de antecedentes y, así, reducir mucho el error. Otra posibilidad consiste en no normalizar los datos y ajustar las respuestas absolutas, con inclusión de los datos de la respuesta del control, pero introduciendo el valor de la respuesta del control como parámetro adicional que debe ajustarse con regresión no lineal. Con una ecuación usual de regresión de 2 parámetros, este método necesita el ajuste de 3 parámetros, por lo que exige más puntos de datos que la regresión no lineal de datos que se normalizan mediante una respuesta del control preestablecida.

Intervalos de confianza inversos

El cálculo de intervalos de confianza de regresión no lineal por estimación inversa es bastante complejo y no es una opción frecuentemente disponible en los paquetes normales de programas informáticos de estadística. Pueden obtenerse unos límites de confianza aproximados con programas normales de regresión no lineal con reparametrización (Bruce y Versteeg, 1992), lo que implica reescribir la ecuación matemática con las estimaciones de los puntos deseados, por ejemplo, la EC10 y la EC50 como parámetros que deben estimarse. [Sea la función I = f (α, β, concentración) y utilícense las relaciones de la definición f (α, β, EC10) = 0,1 y f (α, β, EC50) = 0,5 para sustituir f (α, β, concentración) por una función equivalente g (EC10, EC50, concentración.]

Se realiza un cálculo más directo (Andersen et al., 1998) manteniendo la ecuación original y utilizando un desarrollo de Taylor en torno a los promedios de ri y r0.

Últimamente se han popularizado los “métodos de remuestreo” (bootstrap). Tales métodos utilizan los datos medidos y un remuestreo frecuente dirigido por un generador de números aleatorios para calcular una distribución empírica de la varianza.

BIBLIOGRAFÍA

Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632.

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, Nueva York.

Bruce, R.D. and Versteeg, D.J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Ecotoxicity Data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494.

Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. (1998). Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.

»

4)

El capítulo C.11 se sustituye por el texto siguiente:

«

C. 11.   LODO ACTIVADO: PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA RESPIRACIÓN (OXIDACIÓN DE CARBONO Y DE AMONIO)

INTRODUCCIÓN

1.

El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 209 (2010). El presente método de ensayo describe un método para determinar los efectos de una sustancia sobre los microorganismos del lodo activado (en gran medida, bacterias) midiendo su tasa de respiración (oxidación de carbono o de amonio) en unas condiciones determinadas y en presencia de concentraciones diferentes de la sustancia problema. El método se basa en el ensayo de la ETAD (asociación ecológica y toxicológica de fabricantes de colorantes) (1) (2), en la versión anterior de las directrices de ensayo de la OCDE TG 209 (3) y en la norma ISO 8192 revisada (4). El objetivo de este ensayo consiste en establecer un método de cribado rápido para evaluar los efectos de las sustancias sobre los microorganismos del lodo activado de la fase biológica (aerobia) de las plantas de tratamiento de aguas residuales. Los resultados de este ensayo podrán servir también como indicador de las concentraciones no inhibitorias apropiadas de las sustancias problema que hayan de utilizarse en las pruebas de biodegradabilidad (por ejemplo, los capítulos C.4 A-F, C.9, C.10, C.12 y C. 29 del presente anexo, OCDE TG 302C). En este caso, el ensayo puede realizarse como ensayo de cribado, similar a un ensayo de determinación del intervalo o un ensayo límite (véase el punto 39), teniendo en cuenta solamente el conjunto de la respiración. Sin embargo, esta información debe tomarse con precaución en relación con los ensayos de la biodegradabilidad fácil (capítulos C.4 A-F y C.29 del presente anexo) en los que la concentración de inóculo es significativamente inferior a la utilizada en el presente método de ensayo. En efecto, la ausencia de inhibición en esta prueba de respiración no conduce automáticamente a unas condiciones no inhibitorias en el ensayo de biodegradabilidad fácil de los capítulos C.4 A-F o C.29 del presente anexo.

2.

En general, parece que el ensayo de inhibición de la respiración se ha aplicado con éxito desde su primera publicación, pero en algunas ocasiones se han notificado resultados engañosos, como, por ejemplo, en las referencias (2), (4) o (5). Las curvas de respiración en función de la concentración son a veces bifásicas, las gráficas dosis-respuesta se distorsionan y los valores de EC50 son inesperadamente bajos (5). Las investigaciones han puesto de manifiesto que estos resultados se obtienen cuando el lodo activado utilizado en el ensayo es fuertemente nitrificante y la sustancia problema tiene un impacto mayor en la oxidación del amonio que en la oxidación heterotrófica en general. Por lo tanto, estos resultados engañosos pueden superarse mediante la realización de ensayos adicionales con un inhibidor específico de la nitrificación. Por medición de las tasas de absorción de oxígeno en presencia y en ausencia de un inhibidor de este tipo como, por ejemplo, la N-aliltiourea (ATU), es posible calcular las distintas tasas de absorción de oxígeno total, heterotrófica y de nitrificación (4) (7) (8). Así pues, se pueden calcular los efectos inhibidores de una sustancia problema en los dos procesos y se pueden calcular de la forma habitual los valores de la EC50, en relación tanto con la oxidación (heterotrófica) del carbono orgánico como con la oxidación del amonio (nitrificación). Debe señalarse que, en algunos raros casos, el efecto inhibitorio de la N-aliltiourea puede ser parcial o totalmente anulado como consecuencia de la complejación con sustancias problema o suplementos del medio como, por ejemplo, iones Cu++ (6). Los iones Cu++ son esenciales para Nitrosomonas, pero son tóxicos a concentración superior.

3.

Se ha hecho urgente, sobre todo en los países europeos, la necesidad de la nitrificación en el tratamiento aeróbico de las aguas residuales, como paso necesario en el proceso de eliminación de los compuestos nitrogenados de las aguas residuales por desnitrificación para formar productos gaseosos; ahora, la UE ha fijado límites más bajos para la concentración de nitrógeno en los efluentes tratados vertidos a las aguas receptoras (5).

4.

Para la mayoría de los fines, es adecuado utilizar el método para evaluar el efecto solo sobre los procesos de oxidación de carbono orgánico. No obstante, para la interpretación de los resultados y la comprensión de los efectos es necesario en algunos casos un examen del efecto solo sobre la nitrificación o sobre tanto la nitrificación como la oxidación del carbono orgánico por separado.

PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO

5.

Las tasas de respiración de las muestras de lodo activado alimentado con agua residual sintética se miden en una celda cerrada que contiene un electrodo de oxígeno después de un tiempo de contacto de 3 horas. Teniendo en cuenta el escenario realista de exposición, podrían ser adecuados unos tiempos de contacto más prolongados. Si la sustancia problema se degrada rápidamente mediante hidrólisis abiótica, por ejemplo, o es volátil y la concentración no puede mantenerse adecuadamente, puede utilizarse además un período de exposición más corto, por ejemplo de 30 minutos. La sensibilidad de cada lote de lodo activado debe comprobarse el día de la exposición con una sustancia de referencia apropiada. El ensayo se utiliza típicamente para determinar la ECx (p. ej., la EC50) de la sustancia problema o la concentración sin efecto observado (NOEC).

6.

La inhibición de la absorción de oxígeno por microorganismos que oxidan el carbono orgánico puede expresarse aparte de la correspondiente a los microorganismos que oxidan el amonio, a través de mediciones de las tasas de absorción de oxígeno en ausencia y en presencia de N-aliltiourea, que es un inhibidor específico de la oxidación del amonio a nitrito por las bacterias nitrificantes de la primera fase. En este caso, el porcentaje de inhibición de la tasa de absorción de oxígeno se calcula mediante comparación de la tasa de absorción de oxígeno en presencia de la sustancia problema con la tasa media de absorción de oxígeno de los correspondientes controles sin sustancia problema, en ambas ocasiones tanto en presencia como en ausencia del inhibidor específico, la N-aliltiourea.

7.

La eventual absorción de oxígeno debida a procesos abióticos puede detectarse mediante la determinación de la tasa en mezclas de sustancia problema, medio de agua residual sintética y agua, prescindiendo del lodo activado.

INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA

8.

Para poder interpretar correctamente los resultados, es necesario conocer la identidad (de preferencia, el número CAS), el nombre (IUPAC) y las características de pureza, hidrosolubilidad, presión de vapor, volatilidad y adsorción de la sustancia problema. Normalmente no es posible hacer el ensayo de manera adecuada con sustancias volátiles, salvo que se adopten precauciones especiales (véase el punto 21).

APLICABILIDAD DEL MÉTODO DE ENSAYO

9.

El método de ensayo puede aplicarse a sustancias hidrosolubles, poco solubles y volátiles. Sin embargo, puede que no siempre sea posible obtener valores de EC50 con sustancias de solubilidad limitada, y solo pueden obtenerse resultados válidos con sustancias volátiles si la mayor parte (por ejemplo, > 80 %) de la sustancia problema permanece en la mezcla de reacción al final del período o períodos de exposición. Deben presentarse datos analíticos adicionales de apoyo para afinar la concentración ECx cuando exista incertidumbre acerca de la estabilidad de la sustancia problema o de su volatilidad.

SUSTANCIAS DE REFERENCIA

10.

Deben someterse al ensayo periódicamente sustancias de referencia, con el fin de garantizar que son fiables el método de ensayo y las condiciones de ensayo, y para comprobar la sensibilidad de cada lote de lodo activado utilizado como inóculo microbiano el día de la exposición. Se recomienda como sustancia inhibidora de referencia el 3,5-diclorofenol (3,5-DCP) puesto que es un conocido inhibidor de la respiración y se utiliza en numerosos tipos de ensayo de inhibición/toxicidad (4). Asimismo, puede utilizarse el sulfato de cobre (II) pentahidratado como sustancia de referencia para la inhibición de la respiración total (9). La N-metilanilina puede utilizarse como inhibidor específico de referencia de la nitrificación (4).

CRITERIOS DE VALIDEZ Y REPRODUCIBILIDAD

11.

La tasa de consumo de oxígeno de los controles en blanco (sin la sustancia problema ni la sustancia de referencia) no debe ser inferior a 20 mg de oxígeno por gramo de lodo activado (peso seco de los sólidos en suspensión) en una hora. Si la tasa es inferior, debe repetirse el ensayo con lodo activado lavado o con lodo de otra fuente. El coeficiente de variación de la tasa de absorción de oxígeno en las réplicas de los controles no debe ser superior al 30 % al final del ensayo definitivo.

12.

En un ensayo interlaboratorios internacional de 2004, organizado por la ISO (4) con fangos activados procedentes de aguas residuales domésticas, se observó que la EC50 del 3,5-DCP se halla en el intervalo de 2 mg/l a 25 mg/l para la respiración total, de 5 mg/l a 40 mg/l para la respiración heterotrófica y de 0,1 mg/l a 10 mg/l para la respiración de nitrificación. Si la EC50 del 3,5-DCP no está en el intervalo esperado, hay que repetir el ensayo con lodo activado procedente de otra fuente. La EC50 del sulfato de cobre (II) pentahidratado debe situarse en el intervalo de 53- 155 mg/l para la respiración total (9).

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO

Recipientes y equipo del ensayo

13.

Se utilizará material habitual de laboratorio, además de lo siguiente:

a)

recipientes de ensayo como, por ejemplo, vasos de 1 000 ml que contengan 500 ml de la mezcla de reacción (véase 5 en la figura 1);

b)

celda y accesorios para medir la concentración de oxígeno disuelto, un electrodo de oxígeno adecuado, una celda cerrada para contener la muestra sin espacio libre y un registrador (por ejemplo, 7, 8, 9 en la figura 1 del apéndice 2); otra posibilidad es utilizar un frasco de DBO con un adaptador de manguito adecuado para sellar el electrodo de oxígeno con el cuello del frasco (véase la figura 2 del apéndice 3); a fin de evitar la pérdida de líquido desplazado cuando se inserte el electrodo de oxígeno, es aconsejable introducir primero un embudo o tubo de vidrio a través del manguito, o utilizar recipientes de bordes ensanchados; en ambos casos debe utilizarse un agitador magnético u otro método de agitación como, por ejemplo, una sonda de agitación propia;

c)

agitadores magnéticos con sus barritas, revestidas de material inerte, para su uso en la cámara de medición o en los recipientes de ensayo;

d)

dispositivo de aireación: en caso necesario, debe pasarse aire comprimido a través de un filtro adecuado, para eliminar el polvo y el aceite, y a través de frascos de lavado con agua para humidificarlo; el contenido de los recipientes debe airearse con pipetas Pasteur, u otros dispositivos de aireación que no adsorban las sustancias; puede utilizarse un agitador orbital a una velocidad de entre 150 y 250 rpm con frascos de, por ejemplo, 2 000 ml de capacidad, para satisfacer la demanda de oxígeno del lodo y superar las dificultades planteadas por las sustancias que producen espuma excesiva, que son volátiles y, por lo tanto, se pierden, o que son difíciles de dispersar cuando se airean por corriente de aire; el sistema de ensayo es, por lo general, una serie de vasos aireados permanentemente, establecidos de forma secuencial (por ejemplo, a intervalos de unos 10 o 15 minutos), y analizados después de manera secuencial; también puede utilizarse instrumentación validada que permita simultáneamente la aireación y la medición de la tasa de absorción de oxígeno en las mezclas;

e)

pH-metro;

f)

centrifugadora general de sobremesa para lodo, capaz de funcionar a 10 000 m/s2.

Reactivos

14.

Deben utilizarse siempre reactivos de grado analítico.

Agua

15.

Debe utilizarse agua destilada o desionizada, con menos de 1 mg/l de COD, salvo en caso de que se especifique agua del grifo exenta de cloro.

Agua residual sintética

16.

El medio debe prepararse de forma que contenga los siguientes componentes en las cantidades indicadas:

peptona

16 g

extracto de carne (o extracto vegetal comparable)

11 g

urea

3 g

cloruro de sodio (NaCl)

0,7 g

cloruro de calcio dihidratado (CaC12 · 2H2O)

0,4 g

sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4 · 7H2O)

0,2 g

monohidrogenofosfato de potasio anhidro (K2HPO4)

2,8 g

agua destilada o desionizada hasta enrasar a 1 litro.

 

17.

El pH de esta solución debe ser 7,5 ± 0,5. Si el medio así preparado no va a utilizarse inmediatamente, debe conservarse en la oscuridad y a una temperatura de 0 a 4 °C, durante una semana como máximo, o en condiciones que no cambien su composición. Ha de tenerse en cuenta que esta agua residual sintética está 100 veces más concentrada que la descrita en el Informe Técnico de la OCDE, “Método propuesto para la determinación de la biodegradabilidad de los tensioactivos utilizados en los detergentes sintéticos” de 11 de junio de 1976; además se le ha añadido hidrogenofosfato dipotásico.

18.

Otra posibilidad es esterilizar los distintos componentes por separado, antes de su almacenamiento, o añadir la peptona y el extracto de carne poco antes de efectuar el ensayo. Antes de su utilización, el medio debe homogeneizarse bien y el pH ajustarse en caso necesario a un valor de 7,5 ± 0,5.

Sustancia problema

19.

En el caso de las sustancias problema fácilmente hidrosolubles, debe prepararse una solución madre solo hasta el límite de solubilidad (no es aceptable la presencia de precipitado). Las sustancias poco hidrosolubles, las mezclas con componentes de diferentes hidrosolubilidades y las sustancias adsorbentes deben pesarse directamente en los recipientes de ensayo. En estos casos, el uso de soluciones madre puede ser una alternativa si se determinan analíticamente en los recipientes de ensayo las concentraciones disueltas de las sustancias problema (antes de la adición de lodo activado). Si se preparan fracciones acomodadas en agua (WAF), es también esencial una determinación analítica de la concentración disuelta de las sustancias problema en los recipientes de ensayo. Debe evitarse recurrir a disolventes orgánicos, emulgentes o dispersantes para mejorar la solubilidad. Es posible aplicar ultrasonidos a las soluciones madre y someter las suspensiones a una agitación previa, por ejemplo durante la noche, cuando se disponga de información adecuada sobre la estabilidad de la sustancia problema en tales condiciones.

20.

La sustancia problema puede afectar negativamente al pH del sistema de ensayo. El pH de las mezclas tratadas con la sustancia problema debe determinarse antes de la prueba, en un ensayo preliminar, para determinar si es necesario un ajuste del pH antes de la prueba principal, y de nuevo el día de la prueba principal. Las soluciones o suspensiones de la sustancia problema en el agua deben neutralizarse antes de la adición del inóculo, si fuera necesario. No obstante, dado que la neutralización puede modificar las propiedades químicas de la sustancia, pueden efectuarse otros ensayos, en función de los objetivos del estudio, para evaluar el efecto de la sustancia problema sobre el lodo sin ajuste del pH.

21.

Los efectos tóxicos de las sustancias volátiles, especialmente en ensayos en los que se burbujea aire a través del sistema, pueden dar lugar a niveles de efectos variables debido a pérdidas de la sustancia durante el período de exposición. Hay que tener cuidado con tales sustancias realizando análisis específicos de ellas en mezclas de control que las contengan y modificando el régimen de aireación.

Sustancia de referencia

22.

Si se utiliza como sustancia de referencia el 3,5-diclorofenol, debe prepararse una solución de 1,00 g de 3,5-diclorofenol en 1 000 ml de agua (15). Para acelerar la disolución se debe utilizar agua caliente o aplicar ultrasonidos; se lleva al volumen final una vez se haya enfriado a temperatura ambiente. Sin embargo, debe garantizarse que la sustancia de referencia no se modifica estructuralmente. El pH de la solución debe comprobarse y, en caso necesario, ajustarse con NaOH o H2SO4 a un pH de 7 — 8.

23.

Si se utiliza como sustancia de referencia el sulfato de cobre (II) pentahidratado, se emplean las concentraciones de 58 mg/l, 100 mg/l y 180 mg/l (factor de 1,8). La sustancia se pesa directamente en los recipientes de ensayo (29 - 50 - 90 mg para 500 ml de volumen total). A continuación se disuelve con 234 ml de agua del grifo tratada en autoclave. El sulfato de cobre (II) pentahidratado es fácilmente soluble. Cuando se inicia el ensayo, se añaden 16 ml de agua residual sintética y 250 ml de lodo activado.

Inhibidor específico de la nitrificación

24.

Debe prepararse una solución madre de 2,32 g/l de N-aliltiourea (ATU). La adición de 2,5 ml de esta solución madre a una mezcla de incubación de 500 ml de volumen final da lugar a una concentración final de 11,6 mg de ATU/l (10– 4 mol/l), de la que se sabe (4) que es suficiente para causar una inhibición del 100 % de la nitrificación en un lodo activado nitrificante que contenga 1,5 g/l de sólidos suspendidos.

Control abiótico

25.

En algunas circunstancias poco frecuentes, una sustancia problema con fuertes propiedades reductoras puede provocar un consumo abiótico mensurable de oxígeno. En tales casos, es necesario contar con controles abióticos para discriminar entre absorción abiótica de oxígeno por la sustancia problema y respiración microbiana. Los controles abióticos pueden prepararse omitiendo el inóculo de las mezclas de ensayo. Del mismo modo, pueden incluirse controles abióticos sin inóculo cuando se llevan a cabo mediciones analíticas de apoyo para determinar la concentración obtenida durante la fase de exposición del ensayo, por ejemplo en caso de utilización de soluciones madre de sustancias poco hidrosolubles con componentes con diferente hidrosolubilidad. En casos concretos, puede ser necesario preparar un control abiótico con inóculo esterilizado (por ejemplo, mediante tratamiento en autoclave o añadiendo sustancias tóxicas esterilizadoras). Algunas sustancias pueden producir o consumir oxígeno solo si la superficie es lo suficientemente grande para reaccionar, incluso aunque en general necesiten una presión o temperatura mucho más elevada para hacerlo. A este respecto debe prestarse especial atención a los peróxidos. Un inóculo esterilizado ofrece una gran superficie.

Inóculo

26.

Para el uso general, debe recogerse lodo activado a la salida del tanque de aireación, o cerca de la salida del tanque, de una planta de tratamiento de aguas residuales con funcionamiento adecuado alimentada predominantemente con aguas residuales domésticas. En función del objetivo del ensayo, pueden ser adecuados también otros tipos de lodo activado como, por ejemplo, lodo cultivado en el laboratorio, con unas concentraciones adecuadas de sólidos en suspensión (de 2 a 4 g/l). Sin embargo, es probable que los lodos procedentes de distintas plantas de tratamiento presenten distintas características y sensibilidades.

27.

El lodo puede utilizarse tal como se recoge, pero deben retirarse las partículas gruesas dejando sedimentar un poco tiempo, por ejemplo de 5 a 15 minutos, y decantando la capa superior de sólidos más finos, o tamizando (p. ej., con una luz de malla de 1 mm2). Otra alternativa es homogeneizar el lodo en un mezclador durante al menos 15 segundos, pero hay que prestar atención a las fuerzas de cizalla y al cambio de temperatura que pueden producirse si dura mucho la operación de mezclado.

28.

A menudo es necesario lavar el lodo como, por ejemplo, cuando es baja la tasa de respiración endógena. En primer lugar, el lodo debe centrifugarse durante un tiempo para producir un sobrenadante claro y un precipitado de sólidos de agua residual, por ejemplo 10 minutos a aproximadamente 10 000 m/s2. El líquido sobrenadante debe desecharse y el lodo se vuelve a suspender en agua del grifo sin cloro, con agitación, y esta agua de lavado se elimina después volviendo a centrifugar y desechándola de nuevo. El proceso de lavado y centrifugado debe repetirse en caso necesario. Debe determinarse la masa seca de un volumen conocido de lodo resuspendido, y el lodo se concentra eliminando líquido o bien se diluye más en agua del grifo sin cloro, según sea necesario para obtener la concentración requerida de sólidos en el lodo, de 3 g/l. El lodo activado debe airearse continuamente (p. ej., 2 l/min) a la temperatura del ensayo y, cuando sea posible, utilizarse el mismo día de su recogida. Si esto no es posible, el lodo debe alimentarse diariamente con el agua residual sintética (50 ml de agua residual sintética por litro de lodo activado) durante dos días adicionales. El lodo se utiliza a continuación para el ensayo y los resultados se aceptan como válidos, a condición de que no se produzca ningún cambio significativo en su actividad, evaluada por su tasa de respiración endógena heterotrófica y de nitrificación.

29.

Pueden surgir dificultades si se forma espuma durante la incubación hasta el punto de que la espuma y los sólidos del lodo en ella transportados salen de los recipientes de aireación. En ocasiones, la formación de espuma puede resultar simplemente de la presencia de agua residual sintética, pero debe contarse con esta formación de espuma si la sustancia problema es, o contiene, un tensioactivo. La pérdida de sólidos del lodo de las mezclas de ensayo tendrá como resultado unas tasas de respiración reducidas artificialmente, que podrían interpretarse indebidamente como debidas a la inhibición. Además, la aireación de la solución del tensioactivo concentra a este en la capa de espuma; la pérdida de espuma del sistema de ensayo conducirá a una disminución de las concentraciones de exposición. La formación de espuma puede controlarse mediante métodos mecánicos simples (por ejemplo, agitación manual esporádica con una varilla de vidrio) o mediante la adición de un agente antiespumante en emulsión de silicona exenta de tensioactivos, y/o utilizando el método de aireación en frascos de agitación. Si el problema está asociado con la presencia del agua residual sintética, la composición de esta puede modificarse con la inclusión de un agente antiespumante en la proporción de, p. ej., 50 μl/l. Si la espuma se debe a la sustancia problema, hay que determinar la cantidad necesaria para su supresión a la concentración máxima de ensayo, y a continuación hay que tratar todos los distintos recipientes de aireación de la misma manera (incluidos también los controles en blanco y los recipientes de referencia en los que no hay espuma). Si se emplean agentes antiespumantes, no debería producirse ninguna interacción con el inóculo ni con la sustancia problema.

PROCEDIMIENTO DE ENSAYO

30.

Puede determinarse la inhibición de tres absorciones de oxígeno diferentes: la total, la solo heterotrófica y la debida a la nitrificación. Normalmente debe ser adecuada la medición de la inhibición de la absorción total de oxígeno. Es necesario determinar los efectos sobre la absorción heterotrófica de oxígeno debida a la oxidación del carbono orgánico, y sobre la debida a la oxidación del amonio cuando exista un requisito específico de estos dos parámetros por separado en relación con una sustancia particular, o (de forma optativa) para explicar las eventuales curvas dosis-respuesta atípicas obtenidas en el estudio de la inhibición de la absorción total de oxígeno.

Condiciones de ensayo

31.

El ensayo debe realizarse a la temperatura de 20 ± 2 °C.

Mezclas de ensayo

32.

Deben prepararse mezclas de ensayo (indicadas como FT en el cuadro 1) con agua, agua residual sintética y la sustancia problema para obtener diferentes concentraciones nominales de la sustancia problema (véanse en el cuadro 1 ejemplos de volúmenes de los componentes). Hay que ajustar el pH a 7,5 ± 0,5, si es necesario; las mezclas deben diluirse con agua y se añade el inóculo para obtener el mismo volumen final en los recipientes y comenzar la aireación.

Mezclas de referencia

33.

Deben prepararse mezclas (FR) con la sustancia de referencia, por ejemplo, 3,5-diclorofenol, en lugar de la sustancia problema, de la misma manera que las mezclas de ensayo.

Controles en blanco

34.

Deben prepararse controles en blanco (FB) al comienzo y al final del período de exposición en ensayos en los que se establecen los vasos del ensayo secuencialmente a intervalos. En los ensayos efectuados con equipo que permita la medición simultánea del consumo de oxígeno, se deben incluir al menos dos controles en blanco en cada lote de análisis simultáneo. Los controles en blanco contienen volúmenes iguales de lodo activado y de medio sintético, pero no tienen sustancia problema ni sustancia de referencia. Deben diluirse con agua hasta el mismo volumen que las mezclas de ensayo y de referencia.

Control abiótico

35.

En caso necesario, por ejemplo si se sabe o sospecha que la sustancia problema presenta propiedades reductoras fuertes, debe prepararse una mezcla FA para medir el consumo abiótico de oxígeno. La mezcla debe tener las mismas cantidades de sustancia problema y de agua residual sintética, y el mismo volumen que las mezclas de ensayo, pero sin lodo activado.

Procedimiento general y mediciones

36.

Las mezclas de ensayo, las mezclas de referencia y los controles en blanco y abióticos se incuban a la temperatura de ensayo en condiciones de aireación forzada (de 0,5 a 1 l/min) para mantener la concentración de oxígeno disuelto por encima del 60 — 70 % de la saturación y mantener en suspensión los flóculos de lodo. También es necesario agitar los cultivos para mantener en suspensión los flóculos de lodo. Se considera que la incubación empieza con el contacto inicial del inóculo de lodo activado con los demás componentes de la mezcla final. Al final de la incubación, después de los períodos de exposición especificados, que suelen ser de 3 horas, se toman muestras para medir la tasa de disminución de la concentración de oxígeno disuelto en la celda diseñada a tal fin (figura 2 del apéndice 3) o en un frasco de DBO completamente lleno. La manera de empezar la incubación también depende de la capacidad del equipo empleado para medir las tasas de consumo del oxígeno. Por ejemplo, en el caso de que comprenda una única sonda de oxígeno, las mediciones se efectuarán de forma individual. En este caso, deben prepararse las diversas mezclas necesarias para el ensayo con agua residual sintética pero sin el inóculo, y a cada recipiente de la serie se le añaden las cantidades necesarias de lodo. Las incubaciones deben iniciarse por turnos, a intervalos establecidos de forma conveniente, por ejemplo de 10 a 15 minutos. Otra posibilidad es que el sistema de medición cuente con varias sondas que faciliten la realización de múltiples mediciones simultáneas; en este caso, el inóculo puede añadirse al mismo tiempo a los grupos pertinentes de recipientes.

37.

La concentración de lodo activado en todas las mezclas de ensayo, de referencia y en blanco (pero no en el control abiótico) es nominalmente de 1,5 g/l de sólidos en suspensión. El consumo de oxígeno debe medirse tras 3 horas de exposición. Deben efectuarse mediciones también tras una exposición de 30 minutos, cuando proceda y según se describe en el punto 5.

Potencial de nitrificación del lodo

38.

Con el fin de decidir si el lodo es nitrificante y, en caso afirmativo, a qué tasa, deben prepararse mezclas (FB) como la del control en blanco y otras mezclas de “control” (FN) que también contengan N-aliltiourea a la concentración de 11,6 mg/l. Las mezclas deben airearse e incubarse a 20° ± 2 °C durante 3 horas. A continuación, deben medirse las tasas de absorción de oxígeno y calcularse la tasa de absorción de oxígeno debida a la nitrificación.

Diseños del ensayo

Ensayo de determinación del intervalo

39.

Se utiliza un ensayo preliminar, cuando sea necesario, para hacer una estimación del intervalo de concentraciones de la sustancia problema necesario en un ensayo definitivo para determinar la inhibición del consumo de oxígeno. De manera alternativa, la inexistencia de inhibición del consumo de oxígeno por la sustancia problema en un ensayo preliminar puede demostrar que es innecesario un ensayo definitivo, pero debe estudiarse por triplicado la concentración de ensayo más elevada del ensayo preliminar (normalmente de 1 000 mg/l, aunque esto depende de los requisitos de datos).

Cuadro 1.

Ejemplos de mezclas del ensayo preliminar.

Reactivo

Concentración original

Solución madre de sustancia problema

10 g/l

Solución madre de medio sintético

Véase el punto 16.

Suspensión madre de lodo activado

3 g/l of suspended solids

Componentes de las mezclas

Dosificación en los recipientes de ensayo (6)

FT1

FT2

FT3-5

FB1-2

FA

Solución madre de sustancia problema (ml)

(puntos 19 a 21)

0,5

5

50

0

50

Solución madre de agua residual sintética (ml)

(punto 16).

16

16

16

16

16

Suspensión de lodo activado (ml)

(puntos 26 a 29)

250

250

250

250

0

Agua

(punto 15)

233,5

229

184

234

434

Volumen total de las mezclas (ml)

500

500

500

500

500

Concentrations in the mixture

 

 

 

 

 

Suspensión de ensayo (mg/l)

Lodo activado

10

100

1 000

0

1 000

(sólidos en suspensión) (mg/l)

1 500

1 500

1 500

1 500

0

40.

El ensayo se debe realizar utilizando un mínimo de tres concentraciones de la sustancia problema, por ejemplo de 10 mg/l, 100 mg/l y 1 000 mg/l, con un control en blanco y, en caso necesario, un mínimo de tres controles abióticos con las concentraciones más elevadas de la sustancia problema (véase, a título de ejemplo, el cuadro 1). Lo ideal es que la concentración más baja no tenga ningún efecto en el consumo de oxígeno. Deben calcularse las tasas de absorción de oxígeno y la tasa de nitrificación, en su caso; después debe calcularse el porcentaje de inhibición. Según el objetivo del ensayo, también es posible determinar simplemente la toxicidad de una concentración límite como, p. ej., 1 000 mg/l. Si a esta concentración no se dan efectos tóxicos estadísticamente significativos, no es necesario efectuar más ensayos a concentraciones más altas ni más bajas. Ha de señalarse que las sustancias poco hidrosolubles, las mezclas con componentes de diferentes hidrosolubilidades y las sustancias adsorbentes deben pesarse directamente en los recipientes de ensayo. En este caso, el volumen reservado para la solución madre de sustancia problema debe sustituirse con agua de dilución.

Ensayo definitivo

Inhibición de la absorción de oxígeno total

41.

El ensayo debe realizarse con un intervalo de concentraciones deducido del ensayo preliminar. A fin de obtener tanto una NOEC como una ECx (p. ej., EC50), se recomienda utilizar en la mayoría de los casos seis controles y cinco concentraciones de tratamiento en progresión geométrica, con cinco réplicas. El control abiótico no tiene que repetirse si no hay absorción de oxígeno en el ensayo preliminar, pero si se produce una absorción significativa deben incluirse controles abióticos con cada concentración de sustancia problema. La sensibilidad del lodo debe comprobarse utilizando la sustancia de referencia 3,5-diclorofenol. La sensibilidad del lodo debe comprobarse con cada serie de ensayos, ya que se sabe que la sensibilidad fluctúa. En todos los casos, se retiran muestras de los recipientes de ensayo después de 3 horas, y también después de 30 minutos en caso necesario, para medir la tasa de absorción de oxígeno en la celda del electrodo de oxígeno. A partir de los datos obtenidos, se calculan las tasas de respiración específicas del control y de las mezclas de ensayo; el porcentaje de inhibición se calcula a partir de la ecuación 7 que figura más abajo.

Diferenciación entre inhibición de la respiración heterotrófica y de la nitrificación

42.

La utilización del inhibidor específico de la nitrificación, la ATU, permite la evaluación directa de los efectos inhibidores de la sustancia problema sobre la oxidación heterotrófica y, restando la tasa de absorción de oxígeno en presencia de ATU de la tasa de absorción total (sin presencia de ATU), pueden calcularse los efectos sobre la tasa de nitrificación. Deben prepararse dos conjuntos de mezclas de reacción de acuerdo con los diseños del ensayo respecto a la CEx o la NOEC descritos en el punto 41, pero, además, debe añadirse ATU a cada mezcla de uno de los conjuntos a una concentración final de 11,6 mg/l, que se ha demostrado que inhibe completamente la nitrificación en lodos con unas concentraciones de sólidos en suspensión de hasta 3 000 mg/l (4). Las tasas de absorción de oxígeno deben medirse tras el período de exposición; estos valores directos representan solo la respiración heterotrófica, y las diferencias entre estos y las tasas de respiración total correspondientes representan la nitrificación. A partir de estos datos se calculan los diversos grados de inhibición.

Mediciones

43.

Tras el período o períodos de exposición, debe transferirse una muestra del primer recipiente de aireación a la celda del electrodo de oxígeno (figura 1 del apéndice 2) y debe medirse inmediatamente la concentración de oxígeno disuelto. Si se dispone de un sistema de electrodos múltiples, las mediciones podrán efectuarse simultáneamente. Es esencial agitar (mediante un imán recubierto) a la misma velocidad que cuando se calibra el electrodo para garantizar que la sonda responde con un retraso mínimo a la evolución de las concentraciones de oxígeno, y para permitir mediciones regulares y reproducibles del oxígeno en el recipiente de medición. Por lo general, es adecuado el sistema de sonda de agitación propia que tienen algunos electrodos de oxígeno. La celda debe lavarse con agua entre medición y medición. Como alternativa, puede utilizarse la muestra para llenar un frasco de DBO (figura 2 del apéndice 3) provisto de un agitador magnético. A continuación debe insertarse en el cuello del frasco una sonda de oxígeno con un adaptador de manguito y debe ponerse en funcionamiento el agitador magnético. En ambos casos, la concentración de oxígeno disuelto debe medirse de forma continua y registrarse durante un tiempo, generalmente de 5 a 10 minutos, o hasta que la concentración de oxígeno descienda por debajo de 2 mg/l. Se debe extraer el electrodo, devolver la mezcla al recipiente de aireación y continuar la aireación y agitación, si resulta necesario efectuar mediciones tras un tiempo de exposición más prolongado.

Verificación de la concentración de la sustancia problema

44.

En algunos casos puede ser necesario medir la concentración de la sustancia problema en los recipientes de ensayo. Hay que señalar que, si se utilizan soluciones madre de:

sustancias poco hidrosolubles,

mezclas con componentes con diferentes hidrosolubilidades, o

sustancias con buena hidrosolubilidad pero cuya concentración en la solución madre está cercana al máximo de hidrosolubilidad,

entonces no se conoce la fracción disuelta, y tampoco se conoce la concentración real de la sustancia problema que se transfiere a los recipientes de ensayo. Con el fin de caracterizar la exposición, es necesaria una estimación analítica de las concentraciones de la sustancia problema en los recipientes de ensayo. Por razones de simplificación, la estimación analítica debe efectuarse antes de la adición del inóculo. Debido a que a los recipientes de ensayo solamente se transfieren fracciones disueltas, las concentraciones medidas pueden ser muy bajas.

45.

Para evitar lentos y costosos análisis, se recomienda pesar simplemente la sustancia problema directamente en los recipientes de ensayo y referirse a la concentración nominal inicial pesada para los cálculos posteriores. No es necesario diferenciar entre fracciones disueltas, no disueltas o adsorbidas de la sustancia problema, ya que todas estas fracciones aparecen igualmente en condiciones reales en una planta de tratamiento de aguas residuales, y estas fracciones pueden variar en función de la composición de las aguas residuales. La finalidad del método de ensayo es estimar de forma realista una concentración no inhibidora, y no es adecuado investigar con más detalle qué fracciones aportan su contribución a la inhibición de los microorganismos del lodo activado. Por último, conviene pesar directamente en los recipientes de ensayo también las sustancias adsorbentes, y los recipientes deben silanizarse para reducir al mínimo las pérdidas por adsorción.

DATOS E INFORME

Cálculo de las tasas de absorción de oxígeno

46.

Las tasas de absorción de oxígeno se deben calcular a partir de la media de los valores medidos, por ejemplo de la parte lineal de las gráficas de la concentración de oxígeno frente al tiempo, limitándose los cálculos a las concentraciones de oxígeno entre 2,0 mg/l y 7,0 mg/l, ya que unas concentraciones superiores e inferiores pueden influir en la tasa de consumo. A veces es inevitable y necesario llegar a bandas de concentración por debajo o por encima de estos valores, por ejemplo cuando la respiración se suprime intensamente y, por lo tanto, es muy lenta, o si un lodo activado particular respira con gran rapidez. Esto es aceptable a condición de que las secciones ampliadas de la curva de absorción sean rectas y sus gradientes no cambien al pasar por los límites de 2,0 mg/l o 7,0 mg/l de O2. Las eventuales secciones en curva de la gráfica indican que el sistema de medición se está estabilizando o que la tasa de absorción está cambiando, y no deben utilizarse para el cálculo de las tasas de respiración. La tasa de absorción de oxígeno se debe expresar en miligramos por litro por hora (mg/lh) o miligramos por gramo de lodo seco por hora (mg/gh). La tasa de consumo de oxígeno, R, en mg/lh, puede ser calculada o interpolada a partir de la parte lineal de la curva registrada de disminución del oxígeno de acuerdo con la ecuación 1:

R = (Q1 – Q2)/Δt × 60

(1)

donde:

Q1

es la concentración de oxígeno al inicio de la sección seleccionada de la fase lineal (mg/l);

Q2

es la concentración de oxígeno al final de la sección seleccionada de la fase lineal (mg/l);

Δt

es el intervalo de tiempo entre estas dos mediciones (min).

47.

La tasa de respiración específica (RS) se expresa como la cantidad de oxígeno consumido por gramo de peso seco de lodo en una hora (mg/gh) de acuerdo con la ecuación 2:

Rs = R/SS

(2)

donde SS es la concentración de sólidos en suspensión en la mezcla de ensayo (g/l).

48.

Los diferentes subíndices de R, que pueden combinarse, son:

S

tasa específica

T

tasa de respiración total

N

tasa debida a la respiración de nitrificación

H

tasa debida a la respiración heterotrófica

A

tasa debida a procesos abióticos

B

tasa de los ensayos en blanco (media).

Cálculo de la tasa de absorción de oxígeno debida a la nitrificación

49.

La relación entre la respiración total (RT), la respiración de nitrificación (RN) y la respiración heterotrófica (RH) viene dada por la ecuación 3:

RN = RT – RH

(3)

donde:

RN

es la tasa de absorción de oxígeno debida a la nitrificación (mg/lh);

RT

es la tasa medida de absorción de oxígeno por el control en blanco (sin ATU; FB) (mg/lh);

RH

es la tasa medida de absorción de oxígeno por el control en blanco al que se ha añadido ATU (FN) (mg/lh).

50.

Esta relación es válida para los valores del blanco (RNB, RTB, RHB), de los controles abióticos (RNA, RTA, RHA) y de los ensayos con sustancias problema (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). Las tasas de respiración específicas se calculan de la forma siguiente:

RNS = RN/SS

(4)

RTS = RT/SS

(5)

RHS = RH/SS

(6)

51.

Si RN es insignificante (por ejemplo, < 5 % de RT en los controles en blanco) en un ensayo preliminar, puede considerarse que la absorción heterotrófica de oxígeno es igual a la absorción total y que no se está produciendo nitrificación. Sería necesario recurrir a una fuente alternativa de lodo activado en caso de que los ensayos hubieran de considerar los efectos sobre microorganismos heterotróficos y nitrificantes. Se realiza un ensayo definitivo si hay pruebas de que se reducen las tasas de absorción de oxígeno con diferentes concentraciones de sustancia problema.

Cálculo del porcentaje de inhibición

52.

El porcentaje de inhibición del consumo de oxígeno total, IT, a cada concentración de la sustancia problema se determina mediante la ecuación 7:

IT = [1 – (RT – RTA)/RTB] × 100 %

(7)

53.

Análogamente, el porcentaje de inhibición de la absorción de oxígeno heterotrófica, IH, a cada concentración de la sustancia problema se determina mediante la ecuación 8:

IH = [1 – (RH – RHA)/RHB] × 100 %

(8)

54.

Finalmente, el porcentaje de inhibición de la absorción de oxígeno debida a la nitrificación, IN, a cada concentración de la sustancia problema se determina mediante la ecuación 9:

IN = [1 – (RT – RH)/(RTB – RHB)] × 100 %

(9)

55.

El porcentaje de inhibición de la absorción de oxígeno se debe representar gráficamente frente al logaritmo de la concentración de la sustancia problema (curva de inhibición, véase la figura 3 del apéndice 4). Se representan las curvas de inhibición para cada período de aireación de 3 h o con carácter adicional después de 30 minutos. La concentración de la sustancia problema que inhibe la absorción de oxígeno en un 50 % (EC50) debe calcularse o interpolarse a partir de la gráfica. Si se dispone de datos adecuados, pueden calcularse o interpolarse los límites de confianza del 95 % de la EC50, la pendiente de la curva y los valores adecuados para marcar el inicio de la inhibición (por ejemplo, EC10 o EC20) y el final del intervalo de inhibición (por ejemplo, EC80 o EC90).

56.

Ha de señalarse que, en vista de las variaciones observadas con frecuencia en los resultados, en muchos casos puede ser suficiente expresar los resultados además por orden de magnitud, por ejemplo:

EC50

< 1 mg/l

EC50

1 mg/l a 10 mg/l

EC50

10 mg/l a 100 mg/l

EC50

> 100 mg/l

Interpretación de los resultados

ECx

57.

Los valores de ECx junto con sus correspondientes límites de confianza del 95 % inferior y superior para el parámetro se calculan utilizando métodos estadísticos apropiados [por ejemplo, análisis de probit, función logística o de Weibull, método de Spearman-Karber recortado o interpolación simple (11)]. Se obtiene una ECx insertando en la ecuación encontrada un valor correspondiente al x % de la media del control. Para calcular la EC50 o alguna otra ECx, las medias por tratamiento (x) deben someterse a análisis de regresión.

Estimación de la NOEC

58.

Cuando se pretende determinar la NOEC mediante análisis estadístico, es necesario disponer de estadísticas por recipiente (se considera que cada uno de los recipientes es una réplica). Se deben utilizar métodos estadísticos apropiados según el documento de la OCDE sobre Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application (11). En general, los efectos adversos de la sustancia problema en comparación con el control se investigan utilizando contrastes de hipótesis unilaterales (más pequeños) a p ≤ 0,05.

Informe del ensayo

59.

El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

 

Sustancia problema

nombre común, nombre químico, número CAS, pureza;

propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema (por ejemplo, log Kow, hidrosolubilidad, presión de vapor, constante de Henry (H) y posible información sobre el destino de la sustancia problema como, por ejemplo, adsorción al lodo activado);

 

Sistema de ensayo

procedencia, condiciones de funcionamiento de la planta de tratamiento de aguas residuales y afluente que recibe, concentración, pretratamiento y mantenimiento del lodo activado;

 

Condiciones de ensayo

temperatura de ensayo, pH durante el ensayo y duración de la fase o fases de exposición;

 

Resultados

consumo específico de oxígeno en los controles (mg O2 /(g lodo × h);

todos los datos medidos, curva o curvas de inhibición y método para calcular el valor de EC50;

EC50 y, si es posible, límites de confianza del 95 por ciento, en su caso EC20, EC80; eventualmente, la NOEC y los métodos estadísticos utilizados, si no puede determinarse la EC50;

resultados de la inhibición total y, si procede, heterotrófica y de nitrificación;

absorción abiótica de oxígeno en el control fisicoquímico (si se utiliza);

nombre de la sustancia de referencia y resultados con la misma;

todas las observaciones y desviaciones del procedimiento normal que puedan haber influido sobre el resultado.

BIBLIOGRAFÍA

(1)

Brown, D., Hitz, H.R. and Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245-261.

(2)

King, E. F. and Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27-39.

(3)

OCDE (1984). Activated sludge. Respiration inhibition test. Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OCDE, París.

(4)

ISO (2007). ISO 8192. Calidad del agua. Ensayo de inhibición del consumo de oxígeno por lodos activados por oxidación del carbono y del amonio. Organización Internacional de Normalización.

(5)

Bealing, D. J. (2003). Documento ISO/TC147/WGI/N.183, Organización Internacional de Normalización.

(6)

Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-organisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471-483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.

(8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig, S. and Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test — acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.

(10)

ISO (1995). ISO 10634. Calidad del agua. Líneas directrices para la preparación y tratamiento de los compuestos orgánicos poco solubles en agua para la subsecuente evaluación de su biodegradabilidad en medio acuoso. Organización Internacional de Normalización.

(11)

OCDE (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OCDE, París.

Apéndice 1

Definiciones

En el presente método de ensayo se aplican las siguientes definiciones:

Sustancia : sustancia o mezcla.

ECx (concentración con efecto al x %) : concentración que provoca el x % de un efecto sobre los organismos de ensayo dentro de un determinado período de exposición cuando se compara con un control. Por ejemplo, una EC50 es una concentración de la que se estima que causa un efecto sobre un parámetro de un ensayo en el 50 % de una población expuesta a lo largo de un determinado período de exposición.

NOEC (concentración sin efecto observado) : concentración de la sustancia problema a la que no se observa ningún efecto. En este ensayo, la concentración correspondiente a la NOEC no ejerce ningún efecto estadísticamente significativo (p < 0,05) dentro de un determinado período de exposición en comparación con el control.

Sustancia problema : sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.

Apéndice 2

Figura 1.   Ejemplos de dispositivo de medición

Image

Leyenda

1

Lodo activado

2

Medio sintético

3

Sustancia problema

4

Aire

5

Recipiente de mezclado

6

Agitador magnético

7

Celda de medición de oxígeno

8

Electrodo de oxígeno

9

Instrumento de medición de oxígeno

10

Registrador

Apéndice 3

Figura 2.   Ejemplo de dispositivo de medición, con utilización de frasco de DBO

Image

Leyenda

1

Recipiente de ensayo

2

Electrodo de oxígeno

3

Instrumento de medición de oxígeno

Apéndice 4

Figura 3.   Ejemplo de curvas de inhibición

Image

Leyenda

X

Concentración de 3,5-diclorofenol (mg/l)

Y

Inhibición ( %)

Image

inhibición de la respiración heterotrófica con un lodo nitrificante

Image

inhibición de la nitrificación con un lodo nitrificante.

»

5)

El capítulo C.26 se sustituye por el texto siguiente:

«

C. 26.   PRUEBA DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE LEMNA SPP.

INTRODUCCIÓN

1.

El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 221 (2006). Está diseñado para evaluar la toxicidad de las sustancias para las plantas de agua dulce del género Lemna (lenteja de agua). Se basa en métodos anteriores (1)(2)(3)(4)(5)(6), pero incluye modificaciones de tales métodos para tener en cuenta los resultados de recientes investigaciones y consultas sobre diversos aspectos fundamentales. El método de ensayo se ha validado mediante un ensayo interlaboratorios internacional (7).

2.

Este método describe el ensayo de toxicidad con Lemna gibba y Lemna minor, dos especies que han sido estudiadas ampliamente y son objeto de las normas arriba citadas. La taxonomía de Lemna spp. es difícil y se ve complicada por la existencia de una amplia gama de fenotipos. Aunque puede aparecer variabilidad genética en la respuesta de Lemna a los agentes tóxicos, actualmente no se tienen datos suficientes sobre esta fuente de variabilidad como para recomendar el uso de un clon determinado en el presente método de ensayo. Ha de señalarse que el ensayo no se realiza en condiciones axénicas, pero se toman medidas en distintas fases del procedimiento del ensayo para reducir al mínimo la contaminación por otros organismos.

3.

Se incluyen pormenores de los ensayos con renovación (semiestáticos y dinámicos) y sin renovación (estáticos) de la solución de ensayo. En función de los objetivos del ensayo y de las imposiciones normativas, se recomienda considerar la aplicación de métodos semiestáticos y dinámicos, por ejemplo en caso de sustancias que desparezcan rápidamente de la solución por volatilización, fotodegradación, precipitación o biodegradación. En la referencia (8) se dan más orientaciones.

4.

En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

5.

Se cultivan plantas del género Lemna en fase de crecimiento exponencial como monocultivos expuestos a diferentes concentraciones de la sustancia problema durante un plazo de siete días. El objetivo del ensayo es cuantificar los efectos relacionados con la sustancia sobre el crecimiento vegetativo a lo largo de este plazo, a partir de la evaluación de unas variables de medición seleccionadas. La variable de medición primaria es el número de frondas. Se mide también al menos otra variable de medición (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco), ya que algunas sustancias pueden afectar a otras variables de medición mucho más que al número de frondas. Para cuantificar los efectos relacionados con la sustancia, se compara el crecimiento en las soluciones de ensayo con el de los controles y se determina la concentración que ocasiona una inhibición del crecimiento de un porcentaje especificado (por ejemplo, 50 %), la cual se expresa como ECx (por ejemplo, EC50).

6.

El parámetro del ensayo es la inhibición del crecimiento, expresado como incremento logarítmico de la variable de medición (tasa media de crecimiento específico) durante el tiempo de exposición. A partir de las tasas medias de crecimiento específico registradas en una serie de soluciones de ensayo, se determina la concentración que produce una inhibición especificada del x % de la tasa de crecimiento (por ejemplo, del 50 %) y se expresa como ErCx (por ejemplo, ErC50).

7.

Otra variable de respuesta utilizada en este método de ensayo es el rendimiento, lo que puede ser necesario en algunos países para cumplir obligaciones específicas derivadas de la normativa. Se define como el valor de las variables de medición al final del tiempo de exposición menos el valor de las variables de medición al inicio de este tiempo. A partir del rendimiento registrado en una serie de soluciones de ensayo, se determina la concentración que produce una inhibición especificada del x % del rendimiento (por ejemplo, del 50 %) y se expresa como EyCx (por ejemplo, EyC50).

8.

Además, pueden determinarse estadísticamente la concentración mínima con efecto observado (LOEC) y la concentración sin efecto observado (NOEC).

INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA

9.

Debe contarse con un método analítico que tenga la sensibilidad adecuada para cuantificar la sustancia en el medio de ensayo.

10.

Entre la información sobre la sustancia problema que puede ser útil para establecer las condiciones del ensayo están los siguientes datos: fórmula estructural, pureza, hidrosolubilidad, estabilidad en el agua y a la luz, pKa, Kow, presión de vapor y biodegradabilidad. La hidrosolubilidad y la presión de vapor pueden utilizarse para calcular la constante de la ley de Henry, que indicará la probabilidad de la pérdida de cantidades significativas de sustancia problema durante el tiempo del ensayo. Esto contribuirá a indicar si deben tomarse medidas particulares para limitar tal pérdida. Cuando sea dudosa la información sobre la solubilidad y estabilidad de la sustancia problema, se recomienda que se evalúen dichos aspectos en las condiciones del ensayo, es decir, con el medio de cultivo, la temperatura y el régimen de iluminación que se vayan a utilizar en el ensayo.

11.

Cuando sea particularmente importante el control del pH del medio de ensayo, por ejemplo cuando se estudien metales o sustancias hidrolíticamente inestables, se recomienda añadir un amortiguador al medio de cultivo (véase el punto 21). En la referencia (8) se ofrece más orientación sobre los ensayos de sustancias con propiedades fisicoquímicas que dificultan estos ensayos.

VALIDEZ DEL ENSAYO

12.

Para que el ensayo sea válido, el tiempo de duplicación del número de frondas en el control debe ser inferior a 2,5 días (60 h), lo que corresponde a una multiplicación por siete en el plazo de siete días y a una tasa media de crecimiento específico de 0,275 d– 1. Con los medios y condiciones de ensayo descritos en el presente método, este criterio puede cumplirse utilizando un régimen estático (5). También se prevé que este criterio se pueda cumplir en condiciones semiestáticas y dinámicas. En el punto 49 se muestra cómo calcular el tiempo de duplicación.

SUSTANCIA DE REFERENCIA

13.

Para comprobar el procedimiento del ensayo pueden someterse a ensayo una o varias sustancias de referencia, como el 3,5-diclorofenol utilizado en el ensayo interlaboratorios internacional (7). Se recomienda efectuar un ensayo con una sustancia de referencia al menos dos veces al año o, si la frecuencia de los ensayos es menor, en paralelo con la determinación de la toxicidad de una sustancia problema.

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

Equipo

14.

Todo el equipo que entre en contacto con los medios de ensayo será de vidrio o de otro material químicamente inerte. El material de vidrio utilizado para el cultivo y el ensayo estará limpio de contaminantes químicos que puedan pasar al medio de ensayo y además será estéril. Los recipientes de ensayo tendrán la anchura suficiente para que las frondas de las diferentes colonias de los recipientes de control puedan crecer sin solaparse al final del ensayo. No importa si las raíces tocan el fondo de los recipientes de ensayo, pero se recomienda una profundidad mínima de 20 mm y un volumen mínimo de 100 ml en cada recipiente de ensayo. Siempre que se respeten estas normas, no es fundamental el tipo de recipiente de ensayo. Se ha visto que son válidos tanto los vasos de precipitados como los cristalizadores o las placas Petri de vidrio de dimensiones adecuadas. Los recipientes de ensayo estarán cubiertos para minimizar la evaporación y la contaminación accidental, pero sin impedir el necesario intercambio de gases. Los recipientes de ensayo y, en particular, las tapas serán tales que eviten la formación de sombras o la modificación de las características espectrales de la luz.

15.

No se tendrán juntos los cultivos y los recipientes de ensayo, y la mejor forma de conseguirlo es utilizar cámaras, incubadoras o salas de cultivo aparte. Debe ser posible regular la iluminación y la temperatura, y mantenerlas a nivel constante (véanse los puntos 35-36).

Organismo de ensayo

16.

El organismo utilizado para este ensayo es Lemna gibba o Lemna minor. En el apéndice 2 se recogen breves descripciones de especies de lenteja de agua que se han utilizado en ensayos de toxicidad. El material vegetal puede obtenerse de una colección de cultivos, de otro laboratorio o del campo. Si se recogen del campo, las plantas deben mantenerse cultivadas en el mismo medio que se vaya a utilizar para el ensayo al menos en las ocho semanas anteriores a esta utilización. Los lugares del campo utilizados para recoger los cultivos iniciales deben estar libres de fuentes de contaminación evidentes. Si se obtienen de otro laboratorio o de una colección de cultivos, los cultivos deben mantenerse similarmente durante un mínimo de tres semanas. En el informe han de indicarse siempre el origen, la especie y el clon (si se conoce) del material vegetal utilizado para el ensayo.

17.

Deben utilizarse monocultivos que estén claramente exentos de contaminación con otros organismos, como algas o protozoos. Las plantas sanas de L. minor consisten en colonias formadas por entre dos y cinco frondas, mientras que las colonias sanas de L. gibba pueden tener hasta siete frondas.

18.

La calidad y la uniformidad de las plantas empleadas en el ensayo tendrán una influencia significativa sobre el resultado del mismo, por lo que deben seleccionarse con cuidado. Han de utilizarse plantas jóvenes, en fase de crecimiento rápido, que no presenten lesiones visibles ni cambios de color (clorosis). La buena calidad de un cultivo viene indicada por una elevada frecuencia de colonias con un mínimo de dos frondas. Un gran número de frondas aisladas indica tensión ambiental como, por ejemplo, limitación de nutrientes, y el material vegetal de estos cultivos no debe utilizarse en los ensayos.

Cultivo

19.

Para reducir la frecuencia del mantenimiento del cultivo (por ejemplo, cuando no esté previsto efectuar ensayos con Lemna durante cierto tiempo), es posible mantener los cultivos en condiciones de iluminación y temperatura reducidas (4 a 10 °C). En el apéndice 3 se recoge información sobre el mantenimiento de los cultivos. La presencia de signos evidentes de contaminación por algas u otros organismos puede hacer necesaria la esterilización superficial de una submuestra de frondas de Lemna, seguida por su transferencia a medio fresco (véase el apéndice 3). En tal caso, se desechará el resto del cultivo contaminado.

20.

Al menos siete días antes del ensayo, debe transferirse asépticamente a medio estéril fresco un número suficiente de colonias, que se cultivarán durante 7 a 10 días en las condiciones del ensayo.

Medio de ensayo

21.

Se recomienda el uso de medios diferentes para Lemna minor y Lemna gibba, como se describe más abajo. Debe estudiarse cuidadosamente la inclusión de un amortiguador de pH en el medio de ensayo [ácido 4-morfolinopropano-sulfónico (MOPS), no CAS 1132-61-2) en medio de L. minor, y NaHCO3 en medio de L. gibba] si se sospecha que puede reaccionar con la sustancia problema e influir en la expresión de su toxicidad. También es aceptable el medio de Steinberg (9), siempre que se cumplan los criterios de validez.

22.

Para el cultivo de L. minor y los ensayos con ella, se recomienda una modificación del medio de cultivo normal de Suecia (SIS) para Lemna, cuya composición figura en el apéndice 4.

23.

Para el cultivo de L. gibba y los ensayos con ella, se recomienda el medio de cultivo 20X — AAP, tal como se describe en el apéndice 4.

24.

El medio de Steinberg, como se describe en el apéndice 4, es también adecuado para L. minor, aunque puede utilizarse asimismo con L. gibba siempre que se cumplan los criterios de validez.

Soluciones de ensayo

25.

Las soluciones de ensayo se preparan normalmente diluyendo una solución madre. En principio, las soluciones madre de la sustancia problema se preparan disolviendo la sustancia en medio de cultivo.

26.

La mayor concentración estudiada de la sustancia problema no debe superar como norma su hidrosolubilidad en las condiciones de ensayo. No obstante, ha de señalarse que Lemna spp. flota en la superficie y puede exponerse a sustancias que se acumulan en la interfase agua-aire (por ejemplo, sustancias hidrofóbicas o poco hidrosolubles, o sustancias tensioactivas). En tales circunstancias, habrá exposición debida a material que no está disuelto y las concentraciones de ensayo podrán superar la hidrosolubilidad, según las características de la sustancia problema. En caso de sustancias problema de escasa hidrosolubilidad, puede ser necesario preparar una dispersión o solución madre concentrada de la sustancia con un dispersante o disolvente orgánico para facilitar la adición de cantidades exactas de la sustancia problema al medio de ensayo y ayudar a su dispersión y disolución. No obstante, debe evitarse en la mayor medida posible el empleo de tales materiales. El uso de disolventes o dispersantes auxiliares no debe provocar fitotoxicidad. Por ejemplo, entre los disolventes utilizados frecuentemente que no causan fitotoxicidad a concentraciones de hasta 100 μl/l figuran la acetona y la dimetilformamida. Si se utiliza un disolvente o dispersante, su concentración final se indicará en el informe y se mantendrá a un nivel mínimo (≤ 100 μl/l), y todos los recipientes de tratamiento y de control contendrán la misma concentración de disolvente o dispersante. En la referencia (8) se da más información sobre el uso de dispersantes.

Grupos de ensayo y controles

27.

Para seleccionar las concentraciones de ensayo adecuadas es útil disponer de datos anteriores sobre la toxicidad de la sustancia problema para Lemna, como, por ejemplo, datos procedentes de un ensayo de determinación del intervalo. En el ensayo definitivo de toxicidad deben emplearse al menos cinco concentraciones de ensayo dispuestas en progresión geométrica. Lo mejor es que la razón entre las concentraciones de ensayo no sea más de 3,2, pero puede utilizarse un valor superior si la curva concentración-respuesta es plana. Si se usan menos de cinco concentraciones, hay que justificarlo. De cada concentración de ensayo se utilizarán al menos tres réplicas en paralelo.

28.

Al fijar el abanico de concentraciones de ensayo (para el ensayo de determinación del intervalo o para el ensayo definitivo de toxicidad), debe tenerse en cuenta lo siguiente:

Para determinar una ECx, es necesario que las concentraciones de ensayo abarquen el valor de ECx a fin de asegurar un nivel adecuado de confianza. Por ejemplo, si se estima la EC50, la mayor concentración de ensayo debe ser superior al valor de EC50. Si el valor de EC50 se encuentra fuera del intervalo de las concentraciones de ensayo, los intervalos de confianza asociados serán amplios y quizá no sea posible efectuar una evaluación adecuada del ajuste estadístico del modelo.

Si el objetivo es estimar la LOEC/NOEC, la menor concentración de ensayo debe ser tan baja que el crecimiento correspondiente no sea significativamente inferior al del control. Por otra parte, la mayor concentración de ensayo debe ser tan alta que el crecimiento correspondiente sea significativamente inferior al del control. Si no es así, habrá que repetir el ensayo utilizando un intervalo diferente de concentraciones (salvo que la mayor concentración sea el límite de solubilidad o la concentración límite requerida máxima, por ejemplo 100 mg/l).

29.

Cada ensayo debe incluir controles con un medio nutritivo, número de frondas y colonias, condiciones ambientales y procedimientos iguales que los de los recipientes de ensayo, pero sin la sustancia problema. Si se utiliza un disolvente o dispersante auxiliar, se incluirá un control adicional con el disolvente o dispersante presente en la misma concentración que en los recipientes con la sustancia problema. El número de réplicas de los recipientes de control (y recipientes de disolventes, en su caso) será al menos igual al número de recipientes utilizados con cada concentración de ensayo, y preferentemente el doble de este número.

30.

Si no es necesario determinar la NOEC, el diseño del ensayo puede modificarse para aumentar el número de concentraciones y reducir el número de réplicas por concentración. Sin embargo, el número de réplicas de los controles será al menos de tres.

Exposición

31.

Se transfieren desde el cultivo de inóculo colonias formadas por entre 2 y 4 frondas visibles, repartiéndose aleatoriamente entre los recipientes de ensayo en condiciones asépticas. Cada recipiente de ensayo debe contar con un total de 9 a 12 frondas. En cada uno de ellos habrá el mismo número de frondas y colonias. La experiencia obtenida con este método y los datos del ensayo interlaboratorios indican que el uso de tres réplicas por tratamiento, contando cada una de ellas inicialmente con entre 9 y 12 frondas, es suficiente para detectar diferencias en el crecimiento del orden del 4 al 7 % de la inhibición calculada en tasa de crecimiento (del 10 al 15 % calculada en rendimiento) entre tratamientos (7).

32.

Es necesario un diseño aleatorio de la distribución de los recipientes de ensayo en la incubadora para minimizar la influencia de las diferencias espaciales de intensidad luminosa o temperatura. También es necesario un diseño en bloques o una redistribución aleatoria de los recipientes cuando se hacen observaciones (o una redistribución más frecuente).

33.

Si un ensayo preliminar de estabilidad indica que la concentración de sustancia problema no puede mantenerse (es decir, que la concentración medida cae por debajo del 80 % de la concentración medida inicialmente) a lo largo de la duración del ensayo (7 días), se recomienda un régimen de ensayo semiestático. En tal caso, las colonias deben exponerse a soluciones de ensayo y control recién preparadas en al menos dos ocasiones durante el ensayo (por ejemplo, en los días 3 y 5). La frecuencia de la exposición al medio fresco dependerá de la estabilidad de la sustancia problema; puede ser necesaria una frecuencia mayor para mantener concentraciones cuasiconstantes de sustancias muy inestables o volátiles. En ciertas circunstancias puede hacer falta un procedimiento dinámico (8)(10).

34.

La posibilidad de exposición mediante aplicación foliar (aerosol) no se contempla en el presente método de ensayo; véase en cambio la referencia (11).

Condiciones de incubación

35.

Debe utilizarse continuamente una luz fluorescente blanca fría o cálida que dé una intensidad luminosa seleccionada en el intervalo de 85 a 135 μE · m– 2s– 1 cuando se mide en una radiación activa para la fotosíntesis (400 a 700 nm) en puntos situados a la misma distancia de la fuente luminosa que las frondas de Lemna (equivalente a entre 6 500 y 10 000 lux). Las eventuales diferencias respecto a la intensidad luminosa seleccionada no deben superar el ± 15 % en toda la superficie de ensayo. El método de detección y medición de la luz, en particular el tipo de sensor, influye en el valor medido. La utilización de sensores esféricos (que responden a la luz desde todos los ángulos por encima y por debajo del plano de medición) y de sensores de “coseno” (que responden a la luz desde todos los ángulos por encima del plano de medición) es mejor que la de sensores unidireccionales, y proporciona lecturas más elevadas con una fuente luminosa multipuntual del tipo que se describe aquí.

36.

La temperatura de los recipientes de ensayo debe ser de 24 ± 2 °C. El pH del medio de control no debe subir más de 1,5 unidades durante el ensayo. Sin embargo, una desviación superior a 1,5 unidades no invalida el ensayo si puede demostrarse que se cumplen los criterios de validez. Es necesario prestar atención particular a la deriva del pH en casos especiales, como cuando se estudian metales o sustancias inestables. En la referencia (8) puede encontrarse más información al respecto.

Duración

37.

El ensayo termina a los siete días de la transferencia de las plantas a los recipientes de ensayo.

Mediciones y determinaciones analíticas

38.

Al inicio del ensayo, se cuenta y registra el número de frondas de los recipientes de ensayo, velando por tener en cuenta las frondas prominentes y claramente visibles. Es necesario determinar el número de frondas de aspecto normal o anormal al inicio del ensayo, al menos una vez cada tres días durante el plazo de exposición (es decir, al menos dos veces durante el período de 7 días) y al final del ensayo. Deben anotarse los cambios observados en el desarrollo de las plantas como, por ejemplo, en el tamaño, aspecto, indicación de necrosis, clorosis o protuberancias, rotura de colonias o pérdida de flotabilidad de las frondas, así como en la longitud y aspecto de las raíces. Deben registrarse también las características significativas del medio de ensayo (por ejemplo, presencia de material sin disolver o crecimiento de algas en el recipiente de ensayo).

39.

Además del recuento del número de frondas durante el ensayo, hay que evaluar los efectos de la sustancia problema sobre una o más de las siguientes variables de medición:

i)

superficie total de las frondas;

ii)

peso seco;

iii)

peso fresco.

40.

La superficie total de las frondas tiene la ventaja de que puede determinarse en cada recipiente de ensayo y de control al principio y al final del ensayo, así como durante el mismo. El peso seco o fresco debe determinarse al principio del ensayo a partir de una muestra de cultivo de inóculo representativa del utilizado para empezar el ensayo, y al final de este con el material vegetal de cada recipiente de ensayo y de control. Si no se mide la superficie de las frondas, es mejor determinar el peso seco que el peso fresco.

41.

La superficie total de las frondas, el peso seco y el peso fresco pueden determinarse de la forma siguiente:

i)

Superficie total de las frondas: La superficie total de las frondas de todas las colonias puede determinarse por análisis de imágenes. Puede captarse el contorno del recipiente de ensayo y de las plantas mediante una cámara de vídeo (es decir, poniendo el recipiente en una caja de luz), y después se digitaliza la imagen resultante. A continuación puede determinarse la superficie total de las frondas de un recipiente de ensayo calibrando con plantillas de superficie conocida. Debe procurarse evitar las interferencias debidas al borde del recipiente de ensayo. Otra posibilidad, pero más laboriosa, consiste en fotografiar los recipientes de ensayo y las plantas, recortar el contorno obtenido de las colonias y determinar su superficie mediante un analizador de superficie de hojas o papel milimetrado. También pueden ser adecuadas otras técnicas (por ejemplo, el cociente entre el peso del papel correspondiente a la superficie del contorno de las colonias y el de la superficie unitaria).

ii)

Peso seco: Se recogen todas las colonias de cada uno de los recipientes de ensayo y se lavan con agua destilada o desionizada. Se secan con material absorbente para eliminar el exceso de agua y después se calientan a 60 °C hasta llegar a peso constante. Deben incluirse los eventuales fragmentos de raíces. El peso seco se expresará con una precisión mínima de 0,1 mg.

iii)

Peso fresco: Todas las colonias se transfieren a tubos de poliestireno (u otro material inerte), pesados previamente, con pequeños agujeros (de 1 mm) en los fondos redondeados. A continuación se centrifugan los tubos a 3 000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después se vuelven a pesar los tubos, que contienen las colonias ahora secadas, y el peso fresco se calcula restando el peso del tubo vacío.

Frecuencia de las mediciones y determinaciones analíticas

42.

Si se utiliza un diseño de ensayo estático, debe medirse el pH de cada tratamiento al inicio y al final del ensayo. Si el ensayo es semiestático, el pH debe medirse en cada lote de solución de ensayo “fresca” antes de cada renovación y también en las correspondientes soluciones “gastadas”.

43.

Debe medirse la intensidad luminosa en la cámara, incubadora o sala de cultivo, en puntos situados a la misma distancia de la fuente luminosa que las frondas de Lemna. Esta medición debe efectuarse al menos una vez durante el ensayo. Debe registrarse al menos una vez al día la temperatura del medio en un recipiente indicador mantenido en las mismas condiciones en la cámara, incubadora o sala de cultivo.

44.

Las concentraciones de la sustancia problema se determinan durante el ensayo a intervalos adecuados. Con ensayos estáticos, el requisito mínimo es determinar las concentraciones al inicio y al final del ensayo.

45.

Con ensayos semiestáticos en que no se prevea que la concentración de sustancia problema permanezca en el intervalo del ± 20 % de la concentración nominal, habrá que analizar todas las soluciones de ensayo recién preparadas y las mismas soluciones en cada renovación (véase el punto 33). No obstante, en los ensayos en los que la concentración inicial medida de la sustancia problema no esté dentro del intervalo del ± 20 % de la concentración nominal, pero en los que puedan aportarse pruebas suficientes de que las concentraciones iniciales son repetibles y estables (es decir, que están dentro del intervalo del 80-120 % de la concentración inicial), las determinaciones químicas podrían limitarse a las concentraciones de ensayo máxima y mínima. En todos los casos, la determinación de las concentraciones de la sustancia problema antes de la renovación solo tendrá que efectuarse en uno de los recipientes replicados de cada concentración de ensayo (o en los contenidos reunidos de los recipientes replicados).

46.

Si se utiliza un ensayo dinámico, será adecuado un régimen de muestreo similar al descrito para los ensayos semiestáticos, incluido el análisis al inicio, a la mitad y al final del ensayo, pero en este caso no será apropiado efectuar mediciones de las soluciones “gastadas”. En este tipo de ensayo habrá que comprobar diariamente el caudal de solución madre de sustancia problema o de diluyente y sustancia problema.

47.

Si está demostrado que la concentración de la sustancia problema se ha mantenido satisfactoriamente a lo largo de todo el ensayo dentro de un intervalo de ± 20 % de la concentración nominal o de la medida inicialmente, el análisis de los resultados puede basarse en los valores nominales o medidos inicialmente. Si la desviación respecto a la concentración nominal o medida inicialmente es superior al ± 20 %, el análisis de los resultados deberá basarse en la media geométrica de la concentración durante la exposición o en modelos que describan el descenso de la concentración de la sustancia problema (8).

Ensayo límite

48.

Bajo ciertas circunstancias, por ejemplo cuando un ensayo preliminar indica que la sustancia problema no tiene efectos tóxicos a concentraciones de hasta 100 mg/l, o hasta su límite de solubilidad en el medio de ensayo si este valor es más bajo, puede efectuarse un ensayo límite comparando las respuestas de un grupo de control y de un único grupo de tratamiento (100 mg/l o una concentración igual al límite de solubilidad). Se recomienda vivamente que esto se apoye en un análisis de la concentración de exposición. Todas las condiciones de ensayo y criterios de validez antes descritos son aplicables al ensayo límite, con la excepción de que el número de réplicas de tratamiento ha de duplicarse. El crecimiento en el grupo de control y en el de tratamiento pueden analizarse mediante un método estadístico para comparar las medias como, por ejemplo, una prueba t de Student.

DATOS E INFORME

Tiempo de duplicación

49.

Para determinar el tiempo de duplicación (Td ) del número de frondas y el cumplimiento de este criterio de validez por el estudio (punto 12), se aplicará la fórmula siguiente con datos obtenidos de los recipientes de control:

Td = ln 2/μ

donde μ es la tasa media de crecimiento específico determinada como se describe en los puntos 54-55.

Variables de respuesta

50.

El objetivo del ensayo es determinar los efectos de la sustancia problema sobre el crecimiento vegetativo de Lemna. El presente método de ensayo describe dos variables de respuesta, ya que las distintas jurisdicciones tienen distintas preferencias y necesidades reglamentarias. Para que los resultados del ensayo sean aceptables en todas las jurisdicciones, los efectos deben evaluarse utilizando las dos variables de respuesta a) y b) que se describen a continuación:

a)

Tasa media de crecimiento específico: Esta variable de respuesta se calcula a partir del cambio del logaritmo del número de frondas y, además, a partir del cambio del logaritmo de otro parámetro de medición (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco) a lo largo del tiempo (expresado en días) en los controles y en cada grupo de tratamiento. A veces se denomina tasa de crecimiento relativa (12).

b)

Rendimiento: Esta variable de respuesta se calcula a partir del cambio del número de frondas y, además, a partir del cambio de otro parámetro de medición (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco) en los controles y en cada grupo de tratamiento hasta el final del ensayo.

51.

Ha de señalarse que los valores de toxicidad calculados a partir de estas dos variables de respuesta no son comparables y es necesario tener en cuenta esta diferencia cuando se utilicen los resultados del ensayo. Los valores de ECx basados en la tasa media de crecimiento específico (ErCx) son normalmente más elevados que los basados en el rendimiento (EyCx) si se respetan las condiciones del presente método de ensayo, debido al fundamento matemático de los planteamientos respectivos. Esto no debe interpretarse como una diferencia en la sensibilidad de las dos variables de respuesta, sino como una diferencia puramente matemática entre los valores. El concepto de tasa media de crecimiento específico se basa en el modelo general de crecimiento exponencial de la lenteja de agua en cultivos no limitados, estimándose la toxicidad en función de los efectos sobre la tasa de crecimiento, sin depender del nivel absoluto de la tasa de crecimiento específico del control, de la pendiente de la curva concentración-respuesta ni de la duración del ensayo. Por el contrario, los resultados basados en la variable de respuesta “rendimiento” dependen de todas estas otras variables. La EyCx depende de la tasa de crecimiento específico de la especie de lenteja de agua utilizada en cada ensayo y de la tasa máxima de crecimiento específico, que puede variar de una especie a otra e incluso de un clon a otro. Esta variable de respuesta no debe utilizarse para comparar la sensibilidad de distintas especies, o incluso distintos clones, de lenteja de agua ante un agente tóxico. Aunque científicamente se prefiere el uso de la tasa media de crecimiento específico para estimar la toxicidad, en el presente método de ensayo se incluye también la estimación a partir del rendimiento para cumplir los requisitos reglamentarios vigentes en ciertas jurisdicciones.

52.

Las estimaciones de la toxicidad deben basarse en el número de frondas y en otra variable de medición más (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco), porque ciertas sustancias pueden afectar a otras variables de medición mucho más que al número de frondas. Este efecto no se detectaría si solo se calculara el número de frondas.

53.

El número de frondas y las otras variables de medición registradas (es decir, la superficie total de las frondas, el peso seco o el peso fresco) se tabulan junto con las concentraciones de la sustancia problema correspondientes a cada punto de medición. Todo análisis posterior de los datos, por ejemplo para estimar la LOEC, NOEC o ECx, se basará en los valores de las distintas réplicas y no en los promedios calculados de cada grupo de tratamiento.

Tasa media de crecimiento específico

54.

La tasa media de crecimiento específico correspondiente a un periodo específico se calcula como el incremento logarítmico de las variables de crecimiento, es decir, número de frondas y otra variable de medición (área total de las frondas, peso seco o peso fresco), aplicando la fórmula siguiente a cada réplica de control y de tratamiento:

Formula

donde:

μi-j

es la tasa media de crecimiento específico entre el tiempo i y el j

Ni

es la variable de medición del recipiente de ensayo o de control en el tiempo i

Nj

es la variable de medición del recipiente de ensayo o de control en el tiempo j

t

es el tiempo transcurrido entre i y j.

Respecto a cada grupo de tratamiento y de control ha de calcularse un valor medio de la tasa de crecimiento y una estimación de la varianza.

55.

Debe calcularse la tasa media de crecimiento específico correspondiente a toda la duración del ensayo (el tiempo i en la fórmula anterior es el principio del ensayo y el tiempo j es el final del mismo). Respecto a cada concentración de ensayo y control ha de calcularse un valor promedio de la tasa media de crecimiento específico con una estimación de la varianza. Por otra parte, debe considerarse la tasa de crecimiento de cada sección para evaluar el efecto de la sustancia problema presente durante el período de exposición (por ejemplo, examinando curvas logarítmicas de crecimiento). Una diferencia importante entre la tasa de crecimiento de cada sección y la tasa media de crecimiento indica una desviación respecto al crecimiento exponencial constante e impone el examen en detalle de las curvas de crecimiento. En este caso, un enfoque conservador sería comparar las tasas de crecimiento específico de cultivos tratados durante el tiempo de inhibición máxima con las correspondientes a los controles durante el mismo tiempo.

56.

Después puede calcularse el porcentaje de inhibición en tasa de crecimiento (It) correspondiente a cada concentración de ensayo (grupo de tratamiento) aplicando la fórmula siguiente:

Formula

donde:

:

% Ir

:

es el porcentaje de inhibición en tasa media de crecimiento específico

:

μC

:

es el valor medio de μ en el control

:

μT

:

es el valor medio de μ en el grupo de tratamiento

Rendimiento

57.

Los efectos sobre el rendimiento se determinan a partir de dos variables de medición, el número de frondas y otra variable de medición (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco) observadas en cada recipiente de ensayo al inicio y al final del ensayo. En el caso del peso seco o del peso fresco, la biomasa inicial se determina a partir de una muestra de frondas tomada del mismo lote utilizado para inocular los recipientes de ensayo (véase el punto 20). Respecto a cada concentración de ensayo y control ha de calcularse un valor promedio del rendimiento con una estimación de la varianza. El porcentaje medio de inhibición en rendimiento ( % Iy) puede calcularse de la manera siguiente con cada réplica de tratamiento:

Formula

donde:

% Iy

es el porcentaje de reducción en rendimiento

b

es la biomasa final menos la biomasa inicial correspondiente al grupo de control

bT

es la biomasa final menos la biomasa inicial correspondiente al grupo de tratamiento.

Trazado de las curvas concentración-respuesta

58.

Se deben trazar las curvas concentración-respuesta que relacionan el porcentaje medio de inhibición de la variable de respuesta (Ir o Iy, calculado como se indica en los puntos 56 o 57) con el logaritmo de la concentración de la sustancia problema.

Estimación de ECx

59.

Las estimaciones de ECx (por ejemplo, EC50) deben basarse tanto en la tasa media de crecimiento específico (ErCx) como en el rendimiento (EyCx), cada uno de los cuales debe basarse, a su vez, en el número de frondas y en una variable de medición más (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco). El motivo es que ciertas sustancias problema influyen de forma diferente en el número de frondas y en otras variables de medición. Por tanto, los parámetros buscados de la toxicidad son cuatro valores de ECx por cada nivel de inhibición x calculado: ErCx (número de frondas), ErCx (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco), EyCx (número de frondas), y EyCx (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco).

Procedimientos estadísticos

60.

El objetivo es obtener una relación cuantitativa concentración-respuesta mediante análisis de regresión. Es posible utilizar una regresión lineal ponderada después de haber efectuado una transformación linealizante de los datos de respuesta como, por ejemplo, en probit o logit o unidades Weibull (13), pero son preferibles los procedimientos de regresión no lineal porque con ellos se tratan mejor las inevitables irregularidades de los datos y las desviaciones respecto a distribuciones regulares. Si la inhibición está próxima al 0 o al 100 %, la transformación puede magnificar tales irregularidades, interfiriendo así con el análisis (13). Debe señalarse que los métodos normales de análisis que utilizan las transformaciones en probit, logit o de Weibull están previstos para aplicarse a datos cuánticos (por ejemplo, mortalidad o supervivencia), y que es necesario modificarlos para aplicarlos a datos de tasas de crecimiento o rendimiento. En las referencias (14), (15) y (16) pueden encontrarse métodos específicos de determinación de los valores de ECx a partir de datos continuos.

61.

Respecto a cada variable de respuesta que haya de analizarse, se utilizará la relación concentración-respuesta para calcular estimaciones puntuales de los valores de ECx. Cuando sea posible, se determinarán los límites de confianza del 95 % de cada estimación. La bondad del ajuste de los datos de respuesta al modelo de regresión se evaluará de forma gráfica o estadística. El análisis de regresión se efectuará utilizando las respuestas de las distintas réplicas y no los promedios de los grupos de tratamiento.

62.

Las estimaciones de la EC50 y los límites de confianza pueden obtenerse también utilizando la interpolación lineal con remuestreo (bootstrapping) (17) si los métodos o modelos de regresión disponibles no son adecuados para los datos.

63.

Para la estimación de los valores de LOEC y, por tanto, de NOEC, es necesario comparar los promedios de tratamiento utilizando técnicas de análisis de la varianza (ANOVA). A continuación se ha de comparar el promedio obtenido a cada concentración con el del control, aplicando un método apropiado de comparación múltiple o de prueba de tendencia. Las pruebas de Dunnett o Williams pueden ser útiles (18)(19)(20)(21). Hay que comprobar si se sostiene la hipótesis del ANOVA de homogeneidad de la varianza. Esta comprobación puede realizarse gráficamente o mediante una prueba en regla (22). Son adecuadas las pruebas de Levene o Bartlett. El incumplimiento de la hipótesis de homogeneidad de las varianzas puede corregirse a veces mediante la transformación logarítmica de los datos. Si la heterogeneidad de la varianza es extrema y no puede corregirse mediante transformación, ha de considerarse la posibilidad de efectuar un análisis por métodos como las pruebas de tendencia de Jonkheere de ajuste secuencial. En (16) puede encontrarse más información sobre la determinación de la NOEC.

64.

Los recientes avances científicos han llevado a recomendar el abandono del concepto de NOEC para sustituirlo por el de estimaciones puntuales de ECx basadas en la regresión. Aún no se ha determinado un valor adecuado de x para esta prueba con Lemna. Sin embargo, parece que es apropiado el intervalo del 10 al 20 % (según la variable de respuesta elegida) y lo mejor es indicar tanto la EC10 como la EC20.

Elaboración de informes

65.

El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

 

Sustancia problema:

naturaleza física y propiedades fisicoquímicas, incluido el límite de hidrosolubilidad;

datos de identificación de la sustancia (por ejemplo, número CAS), incluida la pureza (impurezas).

 

Especie de ensayo:

nombre científico, clon (si se conoce) y procedencia.

 

Condiciones de ensayo:

procedimiento de ensayo aplicado (estático, semiestático o dinámico);

fecha de inicio y duración del ensayo;

medio de ensayo;

descripción del diseño experimental: recipientes de ensayo y sus tapas, volúmenes de solución, número de colonias y de frondas por recipiente de ensayo al inicio del ensayo;

concentraciones de ensayo (nominales y medidas, según proceda) y número de réplicas por concentración;

métodos de preparación de las soluciones madre y problema, incluido el eventual uso de disolventes o dispersantes;

temperatura durante el ensayo;

fuente, intensidad y homogeneidad de la luz;

valores de pH de los medios de ensayo y de control;

concentraciones de la sustancia problema y método de análisis con datos adecuados de evaluación de la calidad (estudios de validación, desviaciones típicas o límites de confianza de los análisis);

métodos de determinación del número de frondas y otras variables de medición como, por ejemplo, el peso seco, el peso fresco o la superficie de las frondas;

todas las desviaciones respecto al presente método de ensayo.

 

Resultados:

datos en bruto: número de frondas y otras variables de medición en cada recipiente de ensayo y de control en cada observación y momento de análisis;

medias y desviaciones típicas de cada variable de medición;

curvas de crecimiento de cada concentración (se recomienda con transformación logarítmica de la variable de medición, véase el punto 55);

tiempo de duplicación / tasa de crecimiento en el control según el número de frondas;

variables de respuesta calculadas para cada réplica de tratamiento, con valores medios y coeficiente de variación de las réplicas;

representación gráfica de la relación concentración-efecto;

estimaciones de parámetros de la toxicidad correspondientes a variables de respuesta como, p. ej., EC50, EC10, EC20, e intervalos de confianza asociados; en caso de que se calculen la LOEC o la NOEC, se indicarán sus valores y los métodos estadísticos utilizados en su determinación;

si se ha utilizado el ANOVA, el tamaño del efecto que puede observarse (por ejemplo, la diferencia significativa mínima);

la eventual estimulación del crecimiento que se haya observado en cualquier recipiente de tratamiento;

los eventuales signos visibles de fitotoxicidad así como observaciones de las soluciones de ensayo;

discusión de los resultados del ensayo, incluida la eventual influencia que tengan sobre ellos las desviaciones respecto al presente método de ensayo.

BIBLIOGRAFÍA

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Apéndice 1

Definiciones

En relación con el presente método de ensayo se aplicarán las siguientes definiciones y abreviaturas:

Biomasa : peso seco de materia viva presente en una población. En este ensayo, lo que se mide normalmente son indicadores de la biomasa, como el número de frondas o la superficie de las frondas, por lo que el término de “biomasa” se refiere también a estos indicadores.

Sustancia : sustancia o mezcla.

Clorosis : amarilleamiento del tejido de la fronda.

Clon : organismos o células procedentes de un solo individuo por reproducción asexual. Los individuos del mismo clon son, por tanto, genéticamente idénticos.

Colonia : conjunto de frondas madre e hijas (generalmente de 2 a 4) unidas entre sí. A veces se le da el nombre de planta.

ECx : concentración de la sustancia problema disuelta en el medio de ensayo que produce una reducción del x % (por ejemplo, del 50 %) en el crecimiento de Lemna dentro de un plazo de exposición definido (que debe indicarse explícitamente si es distinto de la duración completa o normal del ensayo). Para expresar de forma inequívoca el valor de EC obtenido a partir de la tasa de crecimiento o del rendimiento, se usan respectivamente los símbolos “ErC” y “EyC”, seguidos de la variable de medición que se ha utilizado, por ejemplo ErC (número de frondas).

Ensayo dinámico : ensayo en que las soluciones de ensayo se renuevan continuamente.

Fronda : cada una de las estructuras “foliáceas” simples de una planta de lenteja de agua. Es la unidad mínima, es decir, individuo, capaz de reproducirse.

Deformación : presencia de frondas con protuberancias o aspecto hinchado.

Crecimiento : aumento de la variable de medición, por ejemplo el número de frondas, el peso seco, el peso húmedo o la superficie de las frondas, a lo largo de la duración del ensayo.

Tasa de crecimiento (tasa media de crecimiento específico): aumento logarítmico de la biomasa durante el período de exposición.

Concentración mínima con efecto observado (LOEC) : concentración estudiada mínima a la que se observa que la sustancia ejerce un efecto estadísticamente significativo de reducción del crecimiento (con p < 0,05) cuando se compara con el control, dentro de un tiempo de exposición dado. Sin embargo, es necesario también que todas las concentraciones de ensayo superiores a la LOEC ejerzan un efecto nocivo superior o igual al que se observa con dicha concentración. Si no se cumplen estas dos condiciones, es preciso dar una explicación completa sobre cómo se ha elegido la LOEC (y, por tanto, la NOEC).

Variables de medición : variables de cualquier tipo que se miden para expresar el parámetro del ensayo utilizando una o más variables de respuesta diferentes. En este método se consideran variables de medición el número de frondas, la superficie de las frondas, el peso fresco y el peso seco.

Monocultivo : cultivo con una sola especie vegetal.

Necrosis : tejido de la fronda muerto (es decir, blanco o saturado de agua).

Concentración sin efecto observado (NOEC) : concentración estudiada que se encuentra inmediatamente por debajo de la LOEC.

Fenotipo : características observables de un organismo determinadas por la interacción de sus genes con su entorno.

Variables de respuesta : variables para la estimación de la toxicidad derivadas de cualquier variable de medición que describa la biomasa por distintos métodos de cálculo. A efectos del presente método de ensayo, las tasas de crecimiento y el rendimiento son variables de respuesta derivadas de variables de medición como el número de frondas, la superficie de las frondas, el peso fresco o el peso seco.

Ensayo semiestático (de renovación) : ensayo en que, a lo largo de su duración, la solución de ensayo se sustituye periódicamente, a intervalos específicos.

Ensayo estático : ensayo en que, a lo largo de su duración, no hay renovación de la solución de ensayo.

Sustancia problema : sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.

Parámetro del ensayo : factor general que, como objetivo del ensayo, es modificado por la sustancia problema respecto al control. En este método el parámetro del ensayo es la inhibición del crecimiento, que se puede expresar mediante diferentes variables de respuesta, basadas en una o más variables de medición.

Medio de ensayo : medio de cultivo sintético y completo en que crecen las plantas del ensayo cuando se exponen a la sustancia problema. Esta se disuelve en principio en el medio de ensayo.

Rendimiento : valor de una variable de medición para expresar la biomasa al final del período de exposición menos el valor de la variable de medición al inicio del período de exposición.

Apéndice 2

Descripción de Lemna spp.

La planta acuática denominada vulgarmente lenteja de agua, Lemna spp., pertenece a la familia Lemnaceae, que tiene varias especies de distribución mundial recogidas en cuatro géneros. Se han descrito exhaustivamente sus diferencias de aspecto y taxonomía (1)(2). Lemna gibba y Lemna minor son especies representativas de las zonas templadas y se utilizan frecuentemente en estudios de toxicidad. Ambas especies tienen un tallo discoidal (fronda) flotante o sumergido y una raíz muy fina que sale del centro de la superficie inferior de cada fronda. Las especies de Lemna no suelen echar flores, y las plantas se reproducen vegetativamente haciendo nuevas frondas (3). En comparación con las plantas viejas, las jóvenes tienden a ser más pálidas, tener raíces más cortas y consistir en dos o tres frondas de distintos tamaños. El pequeño tamaño, la sencillez de la estructura, la reproducción asexual y el breve tiempo de generación de Lemna son características que convierten a las plantas de este género en idóneas para los ensayos de laboratorio (4)(5).

Debido a la probabilidad de que haya diferencias de sensibilidad entre las especies, solo son válidas las comparaciones de sensibilidad dentro de una misma especie.

Ejemplos de especies de Lemna que se utilizan en los ensayos: referencias bibliográficas de las especies

 

Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.

 

Lemna major : Clark, N.A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. Phys. Chem., 29: 935-941.

 

Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (US EPA) (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., “Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8 pp.

Association Française de Normalisation (AFNOR) (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10 pp.

Swedish Standards Institute (SIS) (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15 pp. (en sueco).

 

Lemna gibba : ASTM International (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998), pp. 733-742.

United States Environmental Protection Agency (US EPA) (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., “Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8 pp.

 

Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.

 

Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.

 

Lemna trisulca : Huebert, D.B., Shay, J.M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481- 483.

 

Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.

Fuentes de las especies de Lemna

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria

Department of Botany, University of Toronto, Toronto, Ontario

Canadá, M5S 3 B2

Tel: +1-416-978-3641

Fax:+1-416-978-5878

Correo electrónico: jacreman@botany.utoronto.ca

North Carolina State University

Forestry Dept

Duckweed Culture Collection

Campus Box 8002

Raleigh, NC 27695-8002

Estados Unidos

Teléfono: 001 (919) 515-7572

astomp@unity.ncsu.edu

Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University

SE-106 91

Estocolmo

Suecia

Tel: +46 8 674 7240

Fax: +46 8 674 7636

Umweltbundesamt (UBA)

FG III 3.4

Schichauweg 58

12307 Berlín

Alemania

Correo electrónico: lemna@uba.de

BIBLIOGRAFÍA

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(5)

Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52:7-22.

Apéndice 3

Mantenimiento de cultivos madre

Los cultivos madre pueden mantenerse a temperaturas bajas (4-10 oC) durante tiempos prolongados sin tener que volver a reestablecerlos. El medio de cultivo de Lemna puede ser el mismo que se utilice en los ensayos, pero es posible utilizar otros medios ricos en nutrientes para los cultivos madre.

Periódicamente se pasan varias plantas jóvenes, de color verde claro, a nuevos recipientes de cultivo con medio fresco, aplicando una técnica aséptica. En las condiciones de baja temperatura que se indican, pueden hacerse subcultivos a intervalos de hasta tres meses.

Para los cultivos deben utilizarse recipientes estériles de vidrio, químicamente limpios (lavados con ácido); su manipulación se hará asépticamente. En caso de contaminación del cultivo madre, por ejemplo con algas u hongos, se tomarán medidas para eliminar los organismos contaminantes. En relación con las algas y la mayoría de otros organismos contaminantes, esto puede efectuarse mediante esterilización superficial. Se toma una muestra del material vegetal contaminado y se cortan las raíces. A continuación se agita enérgicamente el material en agua limpia, y después se sumerge en solución de hipoclorito sódico al 0,5 % (v/v) durante un tiempo comprendido entre 30 segundos y 5 minutos. Seguidamente se enjuaga el material vegetal con agua estéril y se transfiere, en una serie de lotes, a recipientes de cultivo con medio de cultivo fresco. Aunque este tratamiento puede ocasionar la muerte de muchas frondas, especialmente con tiempos largos de exposición, algunas de las frondas supervivientes estarán normalmente libres de contaminación y podrán utilizarse para reinocular nuevos cultivos.

Apéndice 4

Medios

Se recomiendan medios de cultivo distintos para L. minor y L. gibba. Para L. minor se recomienda una modificación del medio de cultivo normal de Suecia (SIS), y para L. gibba, el medio 20X AAP. A continuación se indican las composiciones de ambos medios. Para preparar estos medios deben utilizarse sustancias de grado analítico o reactivo y agua desionizada.

Medio de cultivo normal de Suecia (SIS) para Lemna

Las soluciones madre I – V se esterilizan en autoclave (120 °C, 15 minutos) o mediante filtración por membrana (de unos 0,2 μm de diámetro de poro).

Las soluciones madre VI y, en su caso, VII se esterilizan solo mediante filtración por membrana; no deben tratarse en autoclave.

Las soluciones madre estériles deben conservarse en lugar fresco y oscuro. Las soluciones madre I – V pueden conservarse hasta seis meses, mientras que las soluciones madre VI y, en su caso, VII deben desecharse al cabo de un solo mes.

Solución madre no

Sustancia

Concentración en la solución madre

(g/l)

Concentración en el medio preparado

(gl/l)

Medio preparado

 

 

 

 

Elemento

Concentración

(mg/l)

I

NaNO3

8,50

85

Na; N

32; 14

KH2PO4

1,34

13,4

K; P

6,0; 2,4

II

MgSO4 · 7H2O

15

75

Mg; S

7,4; 9,8

III

CaCl2 · 2H2O

7,2

36

Ca; Cl

9,8; 17,5

IV

Na2CO3

4,0

20

C

2,3

V

H3BO3

1,0

1,00

B

0,17

MnCl2 · 4H2O

0,20

0,20

Mn

0,056

Na2MoO4 · 2H2O

0,010

0,010

Mo

0,0040

ZnSO4 · 7H2O

0,050

0,050

Zn

0,011

CuSO4 · 5H2O

0,0050

0,0050

Cu

0,0013

Co(NO3)2 · 6H2O

0,010

0,010

Co

0,0020

VI

FeCl3 · 6H2O

0,17

0,84

Fe

0,17

Na2EDTA · 2H2O

0,28

1,4

VII

MOPS (amortiguador)

490

490

Para preparar un litro de medio SIS, se añaden los volúmenes siguientes a 900 ml de agua desionizada:

10 ml de solución madre I

5 ml de solución madre II

5 ml de solución madre III

5 ml de solución madre IV

1 ml de solución madre V

5 ml de solución madre VI

1 ml de solución madre VII (facultativo)

Nota: Con ciertas sustancias problema (véase el punto 11) puede ser necesaria además la solución madre VII (amortiguador de MOPS).

El pH se ajusta a 6,5 ± 0,2 con HCl o NaOH 0,1 o 1 M, y el volumen se lleva a un litro con agua desionizada.

Medio de cultivo 20X AAP

Las soluciones madre se preparan con agua destilada o desionizada estéril.

Las soluciones madre estériles deben conservarse en lugar fresco y oscuro. En estas condiciones pueden mantenerse durante al menos 6 u 8 semanas.

Para obtener este medio 20X AAP se necesitan cinco soluciones madre de nutrientes (A1, A2, A3, B y C), preparadas con sustancias de grado reactivo. A unos 850 ml de agua desionizada se añaden 20 ml de cada solución madre de nutrientes para obtener el medio de cultivo. El pH se ajusta a 7,5 ± 0,1 con HCl o NaOH 0,1 o 1 M, y el volumen se lleva a un litro con agua desionizada. Después se pasa el medio a un recipiente estéril a través de un filtro de membrana de unos 0,2 μm.

El medio de cultivo destinado a los ensayos debe prepararse uno o dos días antes de usarlo, a fin de que el pH pueda estabilizarse. Antes de utilizar el medio de cultivo, se comprobará su pH y, en caso necesario, se ajustará añadiendo NaOH o HCl 0,1 o 1 M, como se describe más arriba.

Solución madre no

Sustancia

Concentración en la solución madre

(g/ߦl) (7)

Concentración en el medio preparado

(mg/ߦl) (7)

Medio preparado

 

 

 

 

Elemento

Concentración

(mg/ߦl) (7)

A1

NaNO3

26

510

Na; N

190; 84

MgCl2 · 6H2O

12

240

Mg

58,08

CaCl2 · 2H2O

4,4

90

Ca

24,04

A2

MgSO4 · 7H2O

15

290

S

38,22

A3

K2HPO4 · 3H2O

1,4

30

K; P

9,4; 3,7

B

H3BO3

0,19

3,7

B

0,65

MnCl2 · 4H2O

0,42

8,3

Mn

2,3

FeCl3 · 6H2O

0,16

3,2

Fe

0,66

Na2EDTA · 2H2O

0,30

6,0

ZnCl2

3,3 mg/l

66 μg/l

Zn

31 μg/l

CoCl2 · 6H2O

1,4 mg/l

29 μg/l

Co

7,1 μg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7,3 mg/l

145 μg/l

Mo

58 μg/l

CuCl2 · 2H2O

0,012 mg/l

0,24 μg/l

Cu

0,080 μg/l

C

NaHCO3

15

300

Na; C

220; 43

Medio de Steinberg (según ISO 20079)

Concentraciones y soluciones madre

El medio modificado de Steinberg se utiliza según la norma ISO 20079 con Lemna minor solo (ya que en esa norma solo se contempla esta especie), pero los ensayos muestran que pueden obtenerse buenos resultados también con Lemna gibba.

Para preparar el medio deben utilizarse sustancias de grado analítico o reactivo y agua desionizada.

El medio nutritivo se prepara a partir de soluciones madre o del medio diez veces más concentrado, que permite una concentración máxima del medio sin precipitación.

Cuadro 1.

Medio de Steinberg con pH estabilizado (modificado según Altenburger)

Componente

Medio nutritivo

Macroelementos

Peso molecular

mg/l

mmol/l

KNO3

101,12

350,00

3,46

Ca(NO3)2 · 4H2O

236,15

295,00

1,25

KH2PO4

136,09

90,00

0,66

K2HPO4

174,18

12,60

0,072

MgSO4 · 7H2O

246,37

100,00

0,41

Microelementos

Peso molecular

μg/l

μmol/l

H3BO3

61,83

120,00

1,94

ZnSO4 · 7H2O

287,43

180,00

0,63

Na2MoO4 · 2H2O

241,92

44,00

0,18

MnCl2 · 4H2O

197,84

180,00

0,91

FeCl3 · 6H2O

270,21

760,00

2,81

EDTA disódico dihidratado

372,24

1 500,00

4,03


Cuadro 2.

Soluciones madre (macroelementos)

1.

Macroelementos (concentración 50 veces mayor)

g/l

Solución madre 1:

KNO3

17,50

KH2PO4

4,5

K2HPO4

0,63

Solución madre 2:

MgSO4 · 7H2O

5,00

Solución madre 3:

Ca(NO3)2 · 4H2O

14,75


Cuadro 3.

Soluciones madre (microelementos)

2.

Microelementos (concentración 1 000 veces mayor)

mg/l

Solución madre 4:

H3BO3

120,0

Solución madre 5:

ZnSO4 · 7H2O

180,0

Solución madre 6:

Na2MoO4 · 2H2O

44,0

Solución madre 7:

MnCl2 · 4H2O

180,0

Solución madre 8:

FeCl3 · 6H2O

760,00

EDTA disódico dihidratado

1 500,00

Pueden reunirse las soluciones madre 2 y 3 por un lado y, por otro, de la 4 a la 7 (teniendo en cuenta las concentraciones establecidas).

Para poder conservarlas más tiempo, hay que tratar las soluciones madre en autoclave a 121 °C durante 20 min o bien someterlas a esterilización por filtración (0,2 μm). Se recomienda vivamente someter la solución madre 8 a esterilización por filtración (0,2 μm).

Preparación del medio de Steinberg (modificado) a la concentración final

Se añaden 20 ml de las soluciones madre 1, 2 y 3 (véase el cuadro 2) a unos 900 ml de agua desionizada para evitar la precipitación.

Se añade 1,0 ml de las soluciones madre 4, 5, 6, 7 y 8 (véase el cuadro 3).

El pH debe ser de 5,5 ± 0,2 (se ajusta añadiendo un volumen mínimo de solución de NaOH o HCl).

Se completa con agua hasta 1 000 ml.

Si las soluciones madres están esterilizadas y se utiliza agua adecuada, no es necesario proceder a otra esterilización. Si se efectúa la esterilización del medio final, la solución madre 8 se añadirá después del pase por autoclave (a 121 °C durante 20 min).

Preparación del medio de Steinberg (modificado) a concentración 10 veces mayor para su conservación intermedia

Se añaden 20 ml de las soluciones madre 1, 2 y 3 (véase el cuadro 2) a unos 30 ml de agua para evitar la precipitación.

Se añade 1,0 ml de las soluciones madre 4, 5, 6, 7 y 8 (véase el cuadro 3). Se completa con agua hasta 100 ml.

Si las soluciones madres están esterilizadas y se utiliza agua adecuada, no es necesario proceder a otra esterilización. Si se efectúa la esterilización del medio final, la solución madre 8 se añadirá después del pase por autoclave (a 121 °C durante 20 min).

El pH del medio (concentración final) debe ser de 5,5 ± 0,2.

»

6)

Se añaden los siguientes capítulos C.31 a C.46:

«

C.31.   ENSAYO CON PLANTAS TERRESTRES: ENSAYO DE EMERGENCIA Y CRECIMIENTO DE PLÁNTULAS

INTRODUCCIÓN

1.

El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 208 (2006). Los métodos de ensayo se revisan periódicamente en función de los avances científicos y de su aplicabilidad con fines reglamentarios. La presente actualización del método de ensayo está diseñada para evaluar los efectos potenciales de las sustancias sobre la emergencia y el crecimiento de plántulas. Sin embargo, no cubre los efectos crónicos ni los efectos sobre la función reproductora (es decir, semillas, formación de las flores, maduración de los frutos). Deben considerarse las condiciones de exposición y las propiedades de la sustancia problema, a fin de garantizar que se utilizan los métodos de ensayo apropiados (por ejemplo, cuando se estudian metales o compuestos metálicos, deben considerarse los efectos del pH y los contra-iones asociados) (1). Este método de ensayo no se ocupa de las plantas expuestas a vapores de las sustancias. El método de ensayo es aplicable a los ensayos de sustancias y mezclas en general, biocidas y productos fitosanitarios (también conocidos como plaguicidas o pesticidas). Se ha desarrollado sobre la base de métodos existentes (2) (3) (4) (5) (6) (7). También se han tenido en cuenta otras referencias pertinentes para los ensayos con plantas (8) (9) (10). En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

2.

El ensayo evalúa los efectos sobre la emergencia y el crecimiento inicial de las plántulas de vegetales superiores tras su exposición a la sustancia problema en el suelo (u otra matriz de suelo adecuada). Las semillas se ponen en contacto con suelo que se ha tratado con la sustancia problema y se evalúan los efectos que presenten después de, generalmente, entre 14 y 21 días tras la emergencia del 50 % de las plántulas del grupo de control. Los parámetros medidos son la evaluación visual de la emergencia de plántulas, el peso seco de los brotes (o el peso fresco de los brotes) y, en algunos casos, la altura de los brotes, así como una evaluación de los efectos nocivos sobre diferentes partes de la planta. Estas mediciones y observaciones se comparan con las de las plantas de control sin tratar.

3.

En función de la vía de exposición prevista, la sustancia problema se incorpora al suelo (o bien a una matriz de suelo artificial) o se aplica a la superficie del suelo, de forma que se represente adecuadamente la posible vía de exposición a la sustancia. La incorporación al suelo se realiza por tratamiento de suelo bruto. Después de la aplicación, el suelo se transfiere a macetas y, a continuación, se siembran en el suelo semillas de la especie vegetal seleccionada. Las aplicaciones en superficie se hacen con suelo en macetas en el que ya se han sembrado las semillas. Las unidades de ensayo (controles y suelos tratados más semillas) se colocan entonces en condiciones adecuadas que permitan la germinación o el crecimiento de las plantas.

4.

El ensayo puede efectuarse con el fin de determinar la curva dosis-respuesta, o a una sola concentración/tasa como ensayo límite, en función del objetivo del estudio. Si los resultados del ensayo a concentración/tasa única superan un determinado nivel de toxicidad (por ejemplo, si se observan efectos superiores a un x %), se lleva a cabo un ensayo de determinación del intervalo para establecer los límites inferior y superior de toxicidad, seguido de un ensayo a concentración/tasa múltiple para generar una curva dosis-respuesta. Se efectúa un análisis estadístico apropiado para obtener una concentración con efecto x ECx o una tasa de aplicación con efecto x ERx (p. ej., EC25, ER25, EC50, ER50) en relación con el parámetro o parámetros de interés más sensibles. Asimismo, en esta prueba pueden calcularse la concentración sin efecto observado (NOEC) y la concentración mínima con efecto observado (LOEC).

INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA

5.

La siguiente información es útil para la identificación de la vía prevista de exposición a la sustancia y para el diseño del ensayo: fórmula estructural, pureza, hidrosolubilidad, solubilidad en disolventes orgánicos, coeficiente de reparto 1-octanol/agua, comportamiento de sorción del suelo, presión de vapor, estabilidad de la sustancia en el agua y a la luz, y biodegradabilidad.

VALIDEZ DEL ENSAYO

6.

Para que el ensayo se considere válido, los controles deben cumplir los criterios de comportamiento siguientes:

la emergencia de las plántulas es de al menos un 70 %;

las plántulas no presentan efectos fitotóxicos visibles (p. ej., clorosis, necrosis, marchitamiento, deformaciones de las hojas y tallos) y las plantas presentan solo variaciones en el crecimiento y morfología que son normales para la especie concreta de que se trate;

la supervivencia media de las plántulas de control emergidas es de al menos el 90 % a lo largo de todo el estudio;

las condiciones ambientales de una determinada especie son idénticas y los medios de cultivo contienen la misma cantidad de matriz de suelo, medio de apoyo, o sustrato de la misma fuente.

SUSTANCIA DE REFERENCIA

7.

Puede someterse a ensayo una sustancia de referencia a intervalos regulares, con el fin de comprobar que el comportamiento del ensayo y la respuesta de las plantas concretas del ensayo, así como las condiciones de ensayo no han cambiado de forma significativa a lo largo del tiempo. Los datos anteriores de biomasa o de crecimiento de los controles pueden utilizarse también para evaluar el comportamiento del sistema de ensayo en laboratorios concretos, y pueden constituir una medida de control de la calidad intralaboratorio.

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

Suelo natural — sustrato artificial

8.

Se pueden cultivar las plantas en macetas con suelo de limo arenoso, de arena limosa, o de limo arenoso y arcilloso, que contenga hasta un 1,5 % de carbono orgánico (alrededor del 3 % de materia orgánica). También puede utilizarse tierra comercial para macetas o mezcla de suelo sintético que contenga hasta un 1,5 % de carbono orgánico. No deben utilizarse suelos arcillosos si se sabe que la sustancia problema tiene elevada afinidad por la arcilla. El suelo de campo debe pasarse por un tamiz de 2 mm de luz para homogeneizarlo y eliminar las partículas gruesas. Deben indicarse el tipo y la textura, el porcentaje de carbono orgánico, el pH y el contenido de sal, así como la conductividad electrónica del suelo preparado final. El suelo debe clasificarse con arreglo a un sistema de clasificación normal (11). El suelo puede pasteurizarse o someterse a tratamiento térmico para reducir el efecto de los patógenos del suelo.

9.

El suelo natural puede complicar la interpretación de los resultados y aumentar la variabilidad debido a su diversidad de propiedades físicas y químicas y de poblaciones microbianas. Estas variables, a su vez, alteran la capacidad de retención de humedad, la capacidad de formar enlaces químicos, la aireación y el contenido de nutrientes y de oligoelementos. Además de las variaciones de estos factores físicos, también habrá variaciones en sus propiedades químicas, tales como el pH y el potencial redox, lo que puede afectar a la biodisponibilidad de la sustancia problema (12) (13) (14).

10.

Los sustratos artificiales no se emplean normalmente para los ensayos de productos fitosanitarios, pero pueden ser de utilidad para los ensayos de sustancias o mezclas en general o cuando se desee reducir al mínimo la variabilidad de los suelos naturales y aumentar la comparabilidad de los resultados de los ensayos. Los sustratos utilizados deben estar compuestos de materiales inertes que minimicen la interacción con la sustancia problema, con el vehículo disolvente, o con ambos. Se ha visto que la arena de cuarzo lavada con ácido, la lana mineral y las perlas de vidrio (por ejemplo, de 0,35 a 0,85 mm de diámetro) son materiales inertes adecuados que absorben mínimamente la sustancia problema (15), garantizando así un máximo de disponibilidad de la sustancia para las plántulas a través de la absorción radicular. Entre los sustratos inadecuados figuran la vermiculita, la perlita y otros materiales muy absorbentes. Deben facilitarse nutrientes para el crecimiento vegetal, a fin de asegurarse de que las plantas no sufren deficiencias nutricionales, y, siempre que sea posible, este aspecto debe evaluarse mediante análisis químico o por examen visual de las plantas de control.

Criterios de selección de las especies de ensayo

11.

Las especies seleccionadas deben ser suficientemente amplias, p. ej., teniendo en cuenta su diversidad taxonómica en el reino vegetal, su distribución, abundancia, las características del ciclo de vida específico de la especie y la región de presencia natural, a fin de desarrollar una gama de respuestas (8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). Para la selección deben tenerse en cuenta las siguientes características de las posibles especies de ensayo:

las especies tienen semillas uniformes que están fácilmente disponibles a partir de fuentes normales fiables y que presentan una germinación regular, fiable y homogénea, y las plántulas tienen un crecimiento uniforme;

las plantas son aptas para el ensayo en laboratorio, y pueden dar resultados fiables y reproducibles, tanto dentro de una misma instalación como en una serie de instalaciones;

la sensibilidad de las especies sometidas a ensayo debe ser coherente con las respuestas de las plantas observadas en el medio ambiente expuestas a la sustancia;